KR100837517B1

KR100837517B1 - 멜라닌 생성 억제 펩티드, 그 제조방법, 및 이를함유하는 피부 외용제 조성물

Info

Publication number: KR100837517B1
Application number: KR1020020016298A
Authority: KR
Inventors: 신현정; 황재성; 최현정; 이병곤
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2002-03-26
Filing date: 2002-03-26
Publication date: 2008-06-12
Also published as: KR20030077271A

Abstract

본 발명은 티로시나제 저해 활성을 가지는 펩티드, 그 제조방법, 및 이를 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 화학적으로 합성된 펩티드 라이브러리(펩티드 무작위 서열 혼합물)로부터 선별되는 네개의 아미노산으로 이루어진 펩티드로서, 구체적으로 첫번째 아미노산 및 두번째 아미노산이 티로신 또는 트립토판에서 선택되고, 세번째 아미노산이 트립토판, 네번째 아미노산이 아르기닌으로 구성되는 서열을 가지는, 티로시나제 억제 작용을 가지는 펩티드 및 그 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효 성분으로 함유한 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의한 멜라닌 생성 억제 펩티드는 멜라닌 생성 세포에 존재하는 티로시나제의 활성을 억제하며, 세포에도 매우 안전하다. 따라서, 상기 펩티드를 유효 성분으로 함유하는 본 발명의 피부 외용제 조성물은, 멜라닌 생성의 효과적인 억제로 피부 미백 효과에 있어 탁월하며, 기미, 주근깨, 태양 광선에 의한 피부 그을림 등의 피부 색소 침착을 효과적으로 개선 및 방지할 수 있다.

미백, 멜라닌 생성 억제, 아미노산 서열, 펩티드, 티로시나제, 피부 외용제 조성물

Description

멜라닌 생성 억제 펩티드, 그 제조방법, 및 이를 함유하는 피부 외용제 조성물{Peptide for suppressing melanogenesis, preparation method, and skin external application composition comprising the said peptide}

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 펩티드 무작위 서열 혼합물을 사용하여 실시한 1차 선별과정의 결과를 도시한 것이다.

도 2은 본 발명에 따라 펩티드 무작위 서열 혼합물로부터 선별한 각 혼합물들에 대한, 농도 의존적인 티로시나제 활성 억제능의 관찰 결과를 도시한 것이다.

도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 각 펩티드의 활성을 검색한 결과이다.

도 4는 본 발명에 따라 멜라노마 세포에서 측정된 서열번호 1 및 2의 티로시나제 활성을 도시한 것이다.

도 5는 본 발명에 따라 인간 정상 색소 생성 세포에서 측정된 서열번호 1 및 2의 티로시나제 활성을 도시한 것이다.

도 6a은 본 발명에 따른 서열번호 1이 세포 성장에 미치는 영향을 시험한 결과이다.

도 6b는 본 발명에 따른 서열번호 2가 세포 성장에 미치는 영향을 시험한 결과이다.

본 발명은 티로시나제 저해 활성을 가지는 펩티드, 그 제조방법, 및 이를 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 화학적으로 합성된 펩티드 라이브러리(펩티드 무작위 서열 혼합물)로부터 선별되는 네개의 아미노산으로 이루어진 펩티드로서, 구체적으로 첫번째 아미노산 및 두번째 아미노산이 티로신 또는 트립토판에서 선택되고, 세번째 아미노산이 트립토판, 네번째 아미노산이 아르기닌으로 구성되는 서열을 가지는, 티로시나제 억제 작용을 가지는 펩티드 및 그 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효 성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

신체 피부의 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 색소는 검은 색소와 단백질의 복합체 형태를 갖는 페놀계 고분자 물질로서, 태양으로부터 조사되는 자외선을 차단하여 진피 이하의 피부기관을 보호해주는 동시에 피부 생체 내에 생겨난 자유 라디칼 등을 잡아주는 등 피부내 단백질과 유전자들을 보호해주는 유용한 역할을 담당한다. 이렇게 피부 내, 외부의 스트레스적 자극에 의해 생겨난 멜라닌은, 스트레스가 사라져도 피부 각질화를 통해서 외부로 배출되기 전까지는 없어지지 않는 안정한 물질이다. 그러나, 멜라닌의 과잉 합성 및 축적은 피부에 기미, 주근깨 및 노인성 흑자(senile lentigo)등 심각한 미적 문제를 일으킬 뿐만 아니라, 피부노화를 촉진하며 피부암을 유발하기도 한다. 또한 식물에 있어서도 멜라닌은 사과, 감자, 바나나 등의 과육이 공기 중에 노출될 때 발생하는 갈변현상의 원인이 되기도 하 여, 채소 및 과일 등의 품질을 저하시키는 작용을 한다.

멜라닌 생합성에는 멜라닌 세포에 존재하는 티로시나제의 작용이 가장 중요한 것으로 알려져 있다. 티로시나제는 구리를 조효소로 갖는 효소로서, 사람을 포함하여 각종 동물, 식물, 미생물에 넓게 분포하며, 아미노산 중 L-티로신을 L-도파(L-DOPA)로 하이드록실화 하고, 이를 다시 도파퀴논으로 산화시키는 폴리페놀 옥시다제의 일종이다. 이후 도파퀴논은 여러 단계의 산화와 중합 과정을 거친 후 단백질과 결합하여 멜라닌을 생성하게 되는데, 멜라닌 과생성 및 침착 저해를 통한 피부 미백 및 피부암 예방을 위한 연구의 대부분이 티로시나제의 활성 저해에 초점을 맞추고 있다.

현재까지 개발된 티로시나제 활성 저해제로는, 티로시나제 활성자리의 구리 이온에 대한 킬레이트 형성 물질, 퀴논류를 페놀류로 환원시키는 비타민 C 또는 코지산 등의 환원제, 그리고 글루타치온 등이 알려져 있다. 대표적인 미백제로 사용되는 하이드로퀴논은 티로시나제에 대해 강한 저해 효과를 나타내는 반면, 멜라닌 세포의 변성 또는 치사를 유발하는 등 세포 독성으로 인한 피부자극 또는 피부염증을 유발하므로 그 이용이 제한적이다.

본 발명은 상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은, 펩티드 라이브러리를 스크리닝하여 티로시나제 활성 억제 효과를 가지는 펩티드를 선별하고, 상기 멜라닌 생성 억제제인 펩티드를 함유시킴으로써 자극성, 감작성, 변이원성 등의 측면에서 피부에 안전한 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 멜라닌 생성 억제 펩티드는 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 한 서열을 갖는 펩티드들로 이루어진 군으로부터 선택되고, 사람 색소 생성 세포에서 티로시나제의 활성을 억제시키는 것을 특징으로 한다.

특히, 본 발명에 의한 멜라닌 생성 억제 펩티드는, 바람직하게는, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 상기 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 한 서열을 갖는 펩티드들로 이루어진 군으로부터 선택되는 멜라닌 생성 억제 펩티드를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 멜라닌 생성 억제 펩티드 제조방법은, 4개의 아미노산이 연결된 펩티드로서, 4개의 위치마다 19개의 아미노산이 각각 특정되어 총 76 (4 × 19)가지의 경우의 수를 갖는 화학적 펩티드 무작위 서열 혼합물을 준비하는 단계(a); 버섯 유래의 티로시나제를 이용하여 상기 단계(a)의 펩티드 무작위 서열 혼합물로부터 펩티드의 각 위치마다 효소 활성 억제 효과를 가지는 2~3개의 특정 아미노산을 1차 선별하는 단계(b); 상기 단계(b)에서 선별된 펩티드 서열을 바탕으로 2차 펩티드를 합성하는 단계(c); 및 상기 단계(c)에서 합성된 2차 펩티드의 미백효과여부 및 세포안정성을 시험하여 티로시나제 활성을 억제시키는 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 한 서열을 갖는 펩티드를 최종 선정하는 단계(d)를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.

본 발명자 등은 종래의 기술적 과제를 해결하기 위하여 펩티드 무작위 혼합물(펩티드 라이브러리)로부터 티로시나제 활성 억제 효과를 가지는 펩티드를 검색하였다. 본 발명에서 사용되는 화학적 펩티드 무작위 서열 혼합물은 포항공과대학교를 통해서 합성하였고, 이로부터 티로시나제 활성 억제 작용을 가지는 펩티드를 선별하였다.

본 발명에서 사용되는 펩티드 무작위 서열 혼합물은, 구체적으로 4개의 아미노산이 연결된 펩티드로서, 4개의 위치마다 19개의 아미노산이 각각 특정되어 총 76 (4 × 19)가지의 경우의 수를 갖는다. 즉, 특정된 위치에서 특정된 아미노산을 O라 표현하고 혼합물로 합성된 나머지 위치는 X로 표현하면, OXXX, XOXX, XXOX, XXXO 가 된다. 이러한 펩티드 무작위 서열 혼합물로부터 버섯 유래의 티로시나제를 이용하여 효소 활성 억제 효과가 우수한 펩티드를 1차 선별하였고, 선별된 펩티드 서열을 바탕으로 새로이 2차 펩티드를 합성한 뒤, 티로시나제 활성 억제 효과가 뛰어난 서열을 최종 선정하였다(실시예 1 참조).

그리고, 티로시나제 활성 억제 효과가 우수한 펩티드에 대하여 더욱 구체적으로, 세포 내의 티로시나제 활성에 미치는 영향 시험(실시예 2 참조), 멜라노마 세포 성장에의 영향 조사(실시예 3 참조) 및 멜라노덤을 활용한 인공 피부 조직 시험(실시예 4 참조) 등을 실시하여 상기 선별된 펩티드의 미백 효과 여부와 세포 안전성을 판정하였다.

이하 본 발명의 실시예 및 시험예를 들어 본 발명의 구성 및 작용에 대하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명이 이들 예에만 국한되는 것은 아니다.

<실시예 1: 티로시나제 활성 억제 펩티드 서열 검색>

(단계 1) 1차 펩티드 서열 검색

[시험방법]

펩티드 무작위 서열 혼합물로부터 티로시나제 활성을 억제하는 펩티드를 선별하기 위해 다음과 같은 실험을 실시하였다.

반응액을 만드는데 필요한 물질들은 0.1M 포타슘 포스페이트 완충액 (pH6.8), 0.03% L-티로신 기질 용액 (0.3 mg/㎖ in D.W), 1.42 units/㎕ 티로시나제 효소 용액 (포스페이트 완충액)이다. 반응액은 0.1M 포스페이트 완충액 500 ㎕, L-티로신 15 ㎍, 실험시료 50 ㎕를 넣은 후, 최종 부피가 1500 ㎕가 되도록 증류수를 첨가하여 만들었다. 이 때 펩티드 서열 혼합물은 증류수에 원하는 농도대로 녹이고, 펩티드 서열 혼합물이 포함되지 않은 반응액을 대조군으로 하여 동일한 과정을 실행하도록 한다. 위의 반응액에 버섯 유래의 티로시나제를 10 유니트(units)로 넣고 37 ℃에서 10 분간 반응시킨 후, 신속하게 얼음에서 5분간 방치하여 반응을 중단시킨다. 반응 생성물인 도파크롬의 합성율을 보기위해 475 nm에서 흡광도를 측정하였다.

[시험결과]

상기와 같은 선별 과정에 의하여 분리한 펩티드 혼합물은 각 위치마다 2-3개의 아미노산으로 특정되며, 그 결과는 하기 표1에 나타내었다.

아마노산 위치	1	2	3	4
아미노산	Tyr	Tyr	Trp	Arg
	Trp	Trp	Tyr	Tyr
			Arg

* Tyr: 티로신 (Y) Trp: 트립토판(W) Arg: 아르기닌(R)

도 1은 500 μM의 농도로 펩티드 무작위 서열 혼합물을 사용하여 실시한 1차 선별과정의 결과이다.

이 결과를 바탕으로 상기 표 1에 나타낸 것과 같이 각 위치에 따라 2-3개의 아미노산을 선택하였다. 도 2는 펩티드 무작위 서열 혼합물로부터 선별한 각 혼합물들에 대한, 농도 의존적인 티로시나제 활성 억제능을 살펴보기 위하여 다양한 농도(10, 50, 100, 200, 500, 1000 μM)에서의 저해율을 관찰한 결과이다.

도 2에서 보는 바와 같이, 펩티드 서열 중에서 세번째 아미노산이 트립토판, 네번째 아미노산이 아르기닌일때 티로시나제 효소 활성 억제능이 가장 높은 것을 알 수 있으며, 각 혼합물들은 농도 의존적으로 효소의 활성을 저해하는 것으로 나타났다.

(단계 2) 2차 펩티드 서열 검색

[시험방법]

상기의 1차 선별과정의 결과를 토대로 하여 2차 펩티드를 하기 표 2와 같이 4가지 조합의 펩티드를 합성하여 버섯 유래의 티로시나제 활성을 저해하는 정도를 조사하였고 그 결과를 도 3에 나타내었다. 시험 방법은 1차 검색 과정에서 실시한 것과 동일하며, 4가지 종류의 펩티드를 사용한 농도는 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μM 이다. 또한 양성 대조군으로는 코지산을 사용하였다.

아마노산 위치	1	2	3	4
서열 1	Tyr	Trp	Trp	Arg
서열 2	Tyr	Tyr	Trp	Arg
서열 3	Trp	Trp	Trp	Arg
서열 4	Trp	Tyr	Trp	Arg

* Tyr: 티로신 (Y) Trp: 트립토판(W) Arg: 아르기닌(R)

[시험결과]

4가지의 펩티드 중에서, 펩티드 서열의 첫번째 위치를 티로신으로 고정한 것이 트립토판으로 고정한 것보다 더 효과적으로 티로시나제 효소의 활성을 저해하는 것으로 나타났다. 각 펩티드의 활성을 검색한 결과는 도 3에 나타내었다. 효과를 나타낸 두개의 펩티드의 IC50 값은 각각 33.1, 41μM 이며, 이는 양성대조군인 코지산(33.6 μM )과 거의 유사한 수준이었다

<실시예 2: 색소 생성 세포 내에서, 검색된 펩티드의 티로시나제 활성에 대한 영향>

[시험방법]

사람으로부터 유래한 멜라노마 세포인 HM3KO 세포와 정상 색소 생성 세포인 멜라노사이트 내에서, 펩티드 무작위 서열 혼합물로부터 검색된 서열번호 1 및 서열번호 2의 펩티드가 티로시나제 활성에 미치는 영향은 Pomerantz(Oikawa 외)의 방법을 따라 다음과 같이 측정하였다. 먼저 세포를 12 well 배양접시에 2 X 10⁵ 세포가 되도록 깔고 하루 동안 바닥에 잘 붙게 놔둔다. 펩티드가 들어 있는 새 배지로 갈아주고 실험을 끝내기 24시간 전에 ml당 2 Ci의 [³H]티로신을 넣어준다. 24시간 뒤에 배양액을 취해서 ³H₂O 양을 액체섬광계수기(Liquid scintillation counter)로 측정한다.

[시험결과]

선별된 두가지의 펩티드가 세포 내 티로시나제의 활성에 미치는 영향을 조사한 결과는 세포별로 하기 표 3(멜라노마)과 표 4(멜라노사이트)에 나타내었으며, 멜라노마 세포에서의 티로시나제 활성은 도 4에, 인간 정상 색소 생성 세포에서의 활성은 도 5에 도시하였다.

시험 결과 각각의 서열번호 1 및 2는 세포의 종류에 따라 티로시나제 활성을 저해하는 정도에서 차이를 보였으나, 양성 대조군으로 사용한 코지산에 비해 약 1.5배 이상의 억제 효능을 보였다.

시험 물질	티로시나제 활성도 (%)
대조구	100
코지산(200ppm)	70
서열번호 1(100μM)	60
서열번호 2(100μM)	48

시험 물질	티로시나제 활성도 (%)
대조구	100
코지산(200ppm)	75
서열번호 1(100μM)	67
서열번호 2(100μM)	60

<실시예 3: 검색된 펩티드가 인간 멜라노마 세포의 성장에 미치는 영향>

[시험방법]

티로시나제 저해 작용이 있는 펩티드들이 인간 멜라노마 세포의 성장에 직접적인 영향이 있는지 여부를 다음과 같은 실험을 통해 알아보았다. HM3KO 세포 (3 × 10³ cells/well)를 배양용기(96 well, Nunc)에 넣고 하루간 배양한 후 여러 농도의 검색된 펩티드가 들어 있는 배지를 가하여 배양하였다. 50 ㎕의 테트라졸리움 염색약을 가하여 37 ℃에서 4시간 배양한 후, 살아 있는 세포에 의해 생성된 포마잔 양을, 150 ㎕의 용해 용액에 넣고 용해시켜 570 nm에서 흡광도를 측정함으로써, 시간별(24, 48, 72 시간)로 살아 있는 세포의 수를 측정하였다. 즉, 용해된 포마잔에 의한 흡광도는 살아 있는 세포 수에 비례한다.

[시험결과]

서열번호 1이 세포 성장에 미치는 영향에 대한 시험 결과는 도 6a에, 서열번호 2에 대한 시험 결과는 도 6b에 나타내었다.

도 6a 및 6b에서 보는 바와 같이, 검색된 펩티드 모두 10~300 μM 의 농도에서 인간 멜라노마 세포의 성장에 전혀 영향을 주지않았다. 상기의 결과로부터 펩티드에 의한 티로시나제 저해 현상은 멜라노마 세포에 대한 펩티드의 직접적인 독성에 의해 일어난 것이 아님을 알 수 있으며, 나아가 검색된 펩티드가 세포에 매우 안전한 물질이라는 것을 알 수 있다.

<실시예 4: 재생 인간 표피(에피더미스)에서 멜라닌 억제 효과 검증>

[시험방법]

Mattek사의 melanoderm™실험방법을 이용하였다. 멜라노덤 조직을 배양용기(6-well)에 넣고 배지를 넣은 뒤 시험물질을 처리한 후 10일, 14일에 조직을 유리 분쇄기에 넣고 분쇄한 후 클로로폼:메탄올 = 3:2 용액으로 멜라닌을 추출한 후 670nm에서 흡광도를 측정한다.

양성대조군으로 코지산 1%를 사용하였고, 펩티드는 1% 사용하였다. 비히클은 D.W.:에탄올:프로필렌 글리콜(PG)=2:3:5 의 비율로 섞어 사용하였다.

[시험결과]

각 시료는 국소도포로 처리하였고, 물질처리 후 10일, 14일에 멜라닌을 정량한 결과, 하기 표 5에서와 같이 서열번호 1 및 2는 각각 약 40, 32%의 멜라닌 생성저해효과를 보였다. 현미경으로 멜라닌 형성 세포를 관찰한 결과, 음성 대조군에 비해 색소 형성이 적은 것을 볼 수 있었다.

*비히클 대비 멜라닌함량(%)*
날짜	날짜
10	14	평균

78

76

77

65

55

60

71

68

69.5

상기에서 보는 바와 같이, 본 발명에서 선별된 멜라닌 생성 억제 펩티드는 티로시나제 활성을 효과적으로 억제하기 때문에, 상기 펩티드를 피부 외용제 조성물에 적용하면 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 피부 잡티 등의 피부 색소 이상증에 의한 피부 색소 과침착 현상을 치료, 개선 또는 예방할 수 있다.

본 발명의 피부 외용제 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양크림, 맛사지크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우더, 엣센스, 팩 등의 제형을 가질 수 있다.

<제형예 1: 영양화장수(밀크스킨로숀)>

본 발명에 따른 영양화장수를 하기 표 6의 조성으로 제조하였다.

<제형예 2: 영양크림>

본 발명에 따른 영양크림을 하기 표 7의 조성으로 제조하였다.

<제형예 3: 맛사지 크림>

본 발명에 따른 맛사지 크림을 하기 표 8의 조성으로 제조하였다.

<제형예 4: 팩>

본 발명에 따른 팩을 하기 표 9의 조성으로 제조하였다.

<제형예 5: 피부외용제 중 연고>

본 발명에 따른 피부외용제 중 연고를 하기 표 10의 조성으로 제조하였다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의한 멜라닌 생성 억제 펩티드는 멜 라닌 생성 세포에 존재하는 티로시나제의 활성을 억제하며, 세포에도 매우 안전하다. 따라서, 상기 펩티드를 유효 성분으로 함유하는 본 발명의 피부 외용제 조성물은, 멜라닌 생성의 효과적인 억제로 피부 미백 효과에 있어 탁월하며, 기미, 주근깨, 태양 광선에 의한 피부 그을림 등의 피부 색소 침착을 효과적으로 개선 및 방지할 수 있다.

<110> PACIFIC CORPORATION <120> Peptide for suppressing melanogenesis and skin-whitening composition comprising the said peptide <130> 1 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for suppressing melanogenesis <400> 1 Tyr Trp Trp Arg 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for suppressing melanogenesis <400> 2 Tyr Tyr Trp Arg 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for suppressing melanogenesis <400> 3 Trp Trp Trp Arg 1 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for suppressing melanogenesis <400> 4 Trp Tyr Trp Arg 1

Claims

서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 한 서열을 갖는 펩티드들로 이루어진 군으로부터 선택된, 사람 색소 생성 세포에서 티로시나제의 활성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 멜라닌 생성 억제 펩티드.
제1항에 있어서,

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 멜라닌 생성 억제 펩티드.
제1항에 있어서,

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 멜라닌 생성 억제 펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
4개의 아미노산이 연결된 펩티드로서, 4개의 위치마다 19개의 아미노산이 각각 특정되어 총 76 (4 × 19)가지의 경우의 수를 갖는 화학적 펩티드 무작위 서열 혼합물을 준비하는 단계(a);

버섯 유래의 티로시나제를 이용하여 상기 단계(a)의 펩티드 무작위 서열 혼합물로부터 펩티드의 각 위치마다 효소 활성 억제 효과를 가지는 2~3개의 특정 아미노산을 1차 선별하는 단계(b);

상기 단계(b)에서 선별된 펩티드 서열을 바탕으로 2차 펩티드를 합성하는 단계(c); 및

상기 단계(c)에서 합성된 2차 펩티드의 미백효과여부 및 세포안정성을 시험하여 티로시나제 활성을 억제시키는 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 한 서열을 갖는 펩티드를 최종 선정하는 단계(d)를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 멜라닌 생성 억제 펩티드 제조방법.