WO2018199358A1

WO2018199358A1 - 피부 미백 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: WO2018199358A1
Application number: PCT/KR2017/004499
Authority: WO
Inventors: 정용지; 김은미; 이응지; 김잔디
Original assignee: (주)케어젠
Priority date: 2017-04-27
Filing date: 2017-04-27
Publication date: 2018-11-01
Also published as: EP3412275B1; JP6787911B2; EP3412275A4; CN109152718B; EP3412275A1; ES2896154T3; BR112017018828A2; CN109152718A; US10695279B2; BR112017018828B1; US20190328642A1; JP2019524635A

Abstract

본 발명은 피부 미백 활성을 갖는 펩타이드를 제공한다. 본 발명의 멜라닌 생성을 억제하고, 티로시네이즈의 활성을 억제하며, 멜라닌 형성과 관련된 인자들의 발현을 억제하고, 멜라노좀 이동을 억제함으로써 피부 미백에 대하여 우수한 효과를 나타낸다. 본 발명의 펩타이드는 크기가 작기 때문에 피부 투과도가 매우 뛰어나다. 상술한 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있다.

Description

피부 미백 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도

본 발명은 피부 미백 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

형질전환 성장인자 베타1(Transforming growth factor beta 1, TGF-β1)은 다양한 종류의 세포에서 성장, 분화 및 사멸 조절을 통해 조직의 발달이나 항상성 유지를 시키는 인자이다. 형질전환 성장인자 베타1은 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성에 대한 억제 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 272, No. 7, Issue of February 14, pp. 3967-3972, 1997).

형질전환 성장인자 베타1의 이러한 기능은 멜라닌 생성에 중요한 효소인 티로시네이즈의 분해를 증가시켜 나타낸다. 또한, 티로시네이즈, 티로시네이즈 연관 유전자-1, 티로시네이즈 연관 유전자-2와 같은 멜라닌 생성 관여 효소들의 발현을 조절하는 전사인자인 MITF (Microphthalmia- associated transcription factor)의 분해를 촉진시키는 ERK1/2 활성을 촉진시켜 멜라닌 형성 억제를 나타내기도 한다(Physiol Rev 84: 1155-1228, 2004; 10.1152/physrev.00044.2003.).

본 발명자들은 선행 연구를 통해 형질전환 성장인자 베타1의 일부 아미노산 서열을 토대로한 펩타이드를 개발하였고 멜라닌 세포에서의 미백 효능을 검증한 바 있다. 이 후 이 펩타이드의 기능을 극대화하기 위해 다양한 화학 합성물과의 결합을 통한 구조 개선 연구를 진행하였고 효능 스크리닝 과정을 통해 기존 펩타이드 보다 미백 효능이 향상된 본 발명의 소재를 발굴하게 되었다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 우수한 피부 미백 활성을 갖는 펩타이드를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 멜라닌 생성을 억제하고, 티로시네이즈의 활성을 억제하며, 멜라닌 형성과 관련된 인자들의 발현을 억제함으로써 피부 미백에 대하여 우수한 효과를 나타낸다는 것을 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 피부 미백 활성을 갖는 펩타이드를 제공하는 것 이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드의 피부 미백 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 이용한 피부 미백 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명자들은 우수한 피부 미백 활성을 갖는 펩타이드를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 멜라닌 생성을 억제하고, 티로시네이즈의 활성을 억제하며, 멜라닌 형성과 관련된 인자들의 발현을 억제하고, 멜라노좀 이동을 억제함으로써 피부 미백에 대하여 우수한 효과를 나타낸다는 것을 규명하였다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 피부 미백 활성을 갖는 펩타이드에 관한 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 펩타이드는 멜라닌 생성을 억제하며, 트로시네이즈의 활성 및 발현을 억제하고, 멜라닌 형성에 관여하는 인자인 MITF, PAR2, TRP1의 발현을 억제하며, 펩타이드는 멜라닌 형성에 관여하는 신호전달물질인 CREB의 인산화를 억제하고, 피부 미백에 관여하는 멜라노좀 이동을 억제할 뿐 아니라, 멜라노좀 분해를 촉진한다. 이러한 결과는 본 발명의 펩타이드가 피부 미백에 매우 우수한 효능을 가진다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer . Chem . Soc . 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성 기술 (미국등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 아미노산 서열의 일부 부위를 선정하고 그 활성을 증가시키기 위해 N-말단 및/또는 C-말단에 변형을 유도할 수 있다.

예를 들어, 상기 펩타이드의 C-말단은 히드록시기(-OH), 아미노기(-NH₂), 아자이드(-NHNH₂) 등으로 변형된 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이러한 N-말단 및/또는 C-말단의 변형을 통해 본 발명의 펩타이드의 반감기를 증가시켜 생체 내 투여 시 높은 반감기를 가질 수 있으며, 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "안정성"은 인 비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예를 들어, 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.

본 발명의 다른 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

상기 피부 미백용 조성물은 상술한 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 피부 미백용 조성물은 화장품 조성물로 제조될 수 있다.

상기 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으며, 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 및/또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장품 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 및/또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

또한, 상기 화장품 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 및/또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있다.

또한, 상기 화장품 조성물의 제형이 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 및/또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 화장품 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 및/또는 유탁화제가 이용될 수 있으며, 예를 들어, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 소르비탄의 지방산 에스테르를 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장품 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 및/또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및/또는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 및/또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장품 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 및/또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 및 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 항산화제, 정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및/또는 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 피부 미백 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 상기 펩타이드는 멜라닌 생성을 억제하고, 티로시네이즈의 활성을 억제하며, 멜라닌 형성과 관련된 인자들의 발현을 억제하고, 멜라노좀 이동을 억제함으로써 피부 미백에 대하여 우수한 효과를 나타낸다. 또한, 상기 펩타이드는 크기가 작기 때문에 피부 투과도가 매우 뛰어나며, 우수한 활성 및 안정성에 의해 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드의 세포 독성을 평가한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 흑색종 세포주(B16F10)에 처리하고 멜라닌 생성량을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 흑색종 세포주(B16F10)에 처리하고 멜라닌 생성량을 측정한 결과를 보여주는 사진이다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 흑색종 세포주(B16F10)에 처리하고 광학현미경을 통해 멜라닌 생성을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 흑색종 세포주(B16F10)에 처리하고 세포 내 티로시네이즈 활성을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 흑색종 세포주(B16F10)에 처리하고 티로시나아제 항체를 이용하여 세포 내 티로시나아제 발현 정도를 확인한 결과를 보여주는 사진이다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 흑색종 세포주(B16F10)에 처리하고 멜라닌 형성 인자의 유전자 발현 변화를 PCR로 확인한 결과를 보여주는 사진이다.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 흑색종 세포주(B16F10)에 처리하고 멜라닌 형성 인자의 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 이들의 발현 변화를 확인한 결과를 보여주는 사진이다.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 흑색종 세포주(B16F10)에 처리하고 멜라닌 형성 인자 신호전달물질인 CREB의 인산화 정도를 특이적인 항체를 이용하여 확인한 결과를 보여주는 사진이다.

도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 인간각질형성세포주(HaCat)에 처리하고 각질형성세포 활성 및 식균작용에 관련된 유전자 발현 변화를 PCR로 확인한 결과를 보여주는 사진이다.

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 인간각질형성세포주(HaCat)에 처리하고 각질형성세포로의 멜라노좀 유입 억제를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 인간각질형성세포주(HaCat)에 처리하고 각질형성세포의 멜라노좀 식균작용 억제를 현미경을 통해 확인한 결과를 보여주는 사진이다.

도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 멜라노좀 유입 억제 효과를 관찰하기 위해 형광-결합 생입자(bioparticles)를 이용하여 각질세포 식균작용 어세이를 수행한 결과를 보여주는 사진이다.

도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 인간각질형성세포주(HaCat)에 처리하고 각질형성세포에서의 멜라노좀 분해능을 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 14a는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 리포좀화하여 C57BL/6 마우스 꼬리에 도포하고 생체 내 미백효능 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.

도 14b는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 리포좀화하여 C57BL/6 마우스 꼬리에 도포하고 생체 내 미백효능 관찰한 결과(비교예)를 보여주는 사진이다.

도 14c는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 리포좀화하여 C57BL/6 마우스 꼬리에 도포하고 생체 내 미백효능 관찰한 결과(실시예)를 보여주는 사진이다.

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 피부 미백 활성을 갖는 펩타이드를 제공하는 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

합성예 1: 펩타이드 합성

클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ml를 가하여 3분간 교반하였다. 그 다음, 용액을 제거하고 디메틸포름아마이드(DMF) 10 ml를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ml의 디클로로메탄용액을 넣고 Fmoc-Asp(OtBu)-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM(dichloromethane)에 녹여 10분간 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF)를 10 ml 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine)/DMF) 10 ml를 반응용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, DMF로 1회 세척하여 Asp-CTL 레진(Resin)을 제조하였다. 새로운 반응기에 10 ml의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Gly-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrin Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Gly-Asp-CTL 레진을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음, 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Trp-OH 및 Fmoc-Ile-OH 순으로 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 이어 활성화된 페룰산(Ferulic acid)을 결합시킨 뒤 제조된 펩티딜 레진을 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P₂O₅하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액[트리플로로화 초산(Trifluroacetic acid) 81.5%, 증류수 5%, 티오아니졸(Thioanisole) 5%, 페놀(Phenol) 5%, EDT 2.5% 및 TIS 1%] 30 ml을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심 분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 Feruloyl-Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-COOH 펩타이드 1(서열목록 1)을 0.77 g 합성(수율: 88.0 %)하였다. 분자량 측정기를 이용하여 측정 시 상기 펩타이드의 분자량 1643.7(이론값: 1643.7)을 얻을 수 있었다.

서열번호	아미노산 서열 (5'->3')	분석 값(질량분석기)
		분석치	이론치
1	FC-IWSLDTQYGGRGD	1643.7	1643.7

실시예 1: 세포 독성 실험

48-웰 배양용 평판에 분주된 멜라닌형성 세포(B16F10 cell line)를 37 배양기에서 24시간 배양한 후, 각 판의 배지를 제거하고 무혈청 배지로 교체 후 본 펩타이드를 농도별(1, 10, 50, 100, 150, 200 uM)로 처리하였다. 그 다음, 72시간 동안 배양 한 후 MTT 시약을 넣고 4시간 반응 시킨 뒤, 생성된 포르마잔을 DMSO로 녹이고 560 nm에서 흡광도를 측정하여, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 멜라닌 세포에 대한 세포 독성 여부를 확인하기 위해 MTT 어세이를 진행하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 확인할 수 있듯이, 1 uM 부터 200 uM 처리군 까지 세포 독성을 보이지 않는 것을 확인하였다.

실시예 2: 멜라닌 생성량 측정

6-웰 배양용 평판에 분주된 멜라닌형성 세포(B16F10 cell line)를 37배양기에서 24시간 배양한 후, 각 판의 배지를 제거하고 새로운 배지(2% 혈청 배지)로 교체 후 α-MSH(200 ng/ml), 알부틴(200, 500 uM) 및 본 펩타이드를 농도별(50, 100, 200 uM)로 처리하였다. 그 다음, 72시간 동안 배양한 후 배양액을 제거하고 세포를 떼어 낸 뒤 1.5 ml 튜브로 옮겨 13,000 rpm에서 3분간 원심분리 하여 상층액을 제거하고, 세포 펠렛을 회수하여 멜라닌을 관찰하였다. 세포 펠렛을 2 M NaOH 150 ul씩 넣어 60에서 30분 동안 세포 내 멜라닌을 용해시킨다. 96-웰 평판 각 웰에 용해시켜 얻은 상층액을 100 ul씩 넣어 490 nm에서 흡광도를 측정하여, 그 결과를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.

도 2a 및 도 2b에서 확인할 수 있듯이, 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 펩타이드의 농도 의존적인 멜라닌 생성 억제 효과를 확인하였다(**P≤ 0.01).

실시예 3: 멜라닌 생성량 육안 관찰

6-웰 배양용 평판에 분주된 멜라닌형성 세포(B16F10 cell line)를 37 배양기에서 24시간 배양한 후, 각 판의 배지를 제거하고 새로운 배지(10% 혈청 배지)로 교체 후 α-MSH(200 ng/ml), 알부틴(500 uM) 및 본 펩타이드를 농도별(50, 100, 200 uM)로 처리하였다. 그 다음, 72시간 동안 배양한 후 광학현미경을 통해 형성된 멜라닌을 관찰한 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 확인할 수 있듯이, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 농도 의존적인 멜라닌 생성 억제 효과를 세포 형태로 확인하였다.

실시예 4: 세포 내 티로시네이즈 활성 측정

흑색종 세포주(B16F10) 세포를 6-웰 배양용 평판에 24시간 배양하고 α-MSH(200 ng/ml)와 농도별 펩타이드(50, 100, 200 uM) 또는 양성 대조군인 알부틴(200, 500 uM)을 처리하여 72시간 배양하였다. 그 다음, 얼음 위에 6-웰 배양용 평판을 올리고 차가운 PBS으로 세척한 후 1% Triton X-100가 함유된 0.1 M 인산 나트륨 버퍼(pH 6.8, 용해 버퍼)를 300 uL 넣고 세포를 1.5 mL 튜브에 모아 -270에 급속 냉동시킨 후 해동시키는 반응을 5번 반복하여 세포막을 파괴하였다. 그 다음, 13,000 rpm에서 20분간 원심분리한 후 상층액을 다른 1.5 mL 튜브에 모으고 이 시료들의 단백질을 정량하였다. 시료들의 단백질 농도가 같은 농도가 되게 희석하여 96-웰 배양용 평판에 3개 웰씩 분주하고 10 mM L-dopa 20 uL를 첨가하여 37에서 1시간 배양 후 475 nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 확인할 수 있듯이, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 농도 의존적인 티로시네이즈 활성 억제 효과를 확인하였다(**P≤ 0.01).

실시예 5: 티로시나아제 발현량 측정

6-웰 배양용 평판에 분주된멜라닌형성 세포(B16F10 cell line)를 37 배양기에서 24시간 배양한 후, 각 판의 배지를 제거하고 새로운 배지(10% 혈청 배지)로 교체 후 α-MSH(200 ng/ml) 및 본 펩타이드를 농도별(50, 100 uM)로 처리하였다. 그 다음, 48시간 동안 배양한 후 FITC가 부착된 티로시나아제 항체(Santa cruz biotechnology, 미국) 및 FITC 부착 2차 IgG 항체(Santa cruz biotechnology, 미국)를 이용하여 세포 내 발현 단백질을 염색하고 형광 현미경을 통해 발현 정도를 측정하여, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 확인할 수 있듯이, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 농도 의존적인 티로시네이즈 발현 억제 효과를 확인하였다.

실시예 6: 멜라닌 형성 인자의 유전자 발현 변화 관찰

멜라닌형성 세포 (B16F10 cell line)를 6-웰 배양용 평판에 24시간 배양 후 α-MSH(200 ng/ml), 알부틴(500 uM) 및 본 펩타이드를 농도별(100, 200 uM)로 처리한다. 24시간 동안 배양된 세포의 RNA 추출 후 cDNA를 제작하였다. 멜라닌 형성에 관여하는 인자인 MITF, 티로시네이즈 및 TRP1에 대한 각각의 특이적인 하기 표 2의 프라이머를 이용하여 PCR하여 각 유전자의 발현 변화를 관찰하여, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

서열번호	명명	서열목록(5'->3')	비고
2	MITF_F	CCAGCCTGGCGATCATGTCAT	어닐링 온도, 60
3	MITF_R	GGTCTGGACAGGAGTTGCTG	어닐링 온도, 60
4	Tyrosinase_F	GGCCAGCTTTCAGGCAGAGG	어닐링 온도, 60
5	Tyrosinase_R	TGGTGCTTCATGGGCAAAAT	어닐링 온도, 60
6	TRP1_F	TCTGTGAAGGTGTGCAGGAG	어닐링 온도, 60
7	TRP1_R	CCGAAACAGAGTGGAAGGTT	어닐링 온도, 60

도 6에서 확인할 수 있듯이, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 높은 MITF, 티로시네이즈, TRP1 유전자 발현 억제 효과를 확인하였다.

실시예 7: 멜라닌 형성 인자의 단백질 발현 변화 관찰

멜라닌형성 세포(B16F10 cell line)를 6-웰 배양용 평판에 24시간 배양 후, α-MSH(200 ng/ml) 및 본 펩타이드를 농도별(50, 100 uM)로 처리하였다. 그 다음, 72시간 동안 배양한 후 세포를 용해하여 멜라닌 형성에 관여하는 핵심 인자인 MITF(Santa cruz biotechnology, 미국) 및 티로시네이즈(Santa cruz biotechnology, 미국)의 발현을 특이적인 항체를 이용한 웨스턴 블롯 방법을 이용하여 관찰하여, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에서 확인할 수 있듯이, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 MITF 및 티로시네이즈 단백질 발현 억제 효과를 확인하였다.

실시예 8: 멜라닌 형성 신호 전달 물질 관찰

멜라닌형성 세포 (B16F10 cell line)를 6-웰 배양용 평판에 24시간 배양 후, α-MSH(200 ng/ml) 및 본 펩타이드를 농도별(50, 100 uM)로 처리하였다. 그 다음, 10분간 세포를 배양한 후 세포를 용해하여 멜라닌 형성에 관여하는 신호전달 물질인 CREB의 인산화 정도를 특이적인 항체(Santa cruz biotechnology, 미국)를 이용한 웨스턴 블롯 방법을 이용하여 관찰하여, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에서 확인할 수 있듯이, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 CREB 인산화 억제 효과를 확인하였다.

상기 결과를 통해 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 α-MSH로 활성화된 MC1R 신호전달 경로를 저해하여 멜라닌 생성 억제 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 9: 각질형성세포 활성 및 식균작용에 관련된 유전자 발현 변화 관찰

인간각질형성세포주(HaCaT)를 6-웰 배양용 평판에 24시간 배양 후 활성을 유도하는 물질인 트립신 및 본 펩타이드를 농도별(100, 200 uM)로 처리하였다. 그 다음, 16시간 동안 배양된 세포의 RNA 추출 후 cDNA를 제작하였다. 트립신 작용에 의해 활성화된 각질형성세포의 표면 수용체 중 하나인 PAR2 대한 특이적인 프라이머 쌍(하기 표 3 참조)을 이용하여 PCR하여 각 유전자의 발현 변화를 관찰하여, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

서열번호	명명	서열목록(5'->3')	비고
8	PAR2_F	TGCTAGCAGCCTCTCTCTCC	어닐링 온도, 60
9	PAR2_R	CTTCAAGGGGAACC AGATGA	어닐링 온도, 60

도 9에서 확인할 수 있듯이, 세린 프로테아제인 트립신 처리에 의한 각질세포의 PAR2 활성화에 따라 유전자 발현이 유도되었으며 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 처리를 통하여 농도 의존적으로 PAR2 유전자 발현이 감소되는 것을 관찰하였다.

실시예 10: 각질형성세포로의 멜라노좀 유입 억제 확인(분리된 멜라노좀 사용)

인간각질형성세포주(HaCaT)를 6-웰 배양용 평판에 24시간 배양하고 무혈청 배양배지에 마우스 흑색종 세포주(B16F10)에서 분리한 멜라노좀을 3시간 전처리하고 농도 별 펩타이드(10, 50, 100, 200 uM) 또는 양성 대조군인 알부틴(200 uM)을 처리하여 48시간 배양하였다. 그 다음, PBS로 세척하여 유입되지 않은 멜라노좀을 제거하고 각질형성세포를 수집, 침전한 후 얻은 펠렛에 1 M NaOH를 첨가하고 80 오븐에서 펠렛을 용해시킨 후 490 nm에서 OD 값을 측정한다. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 농도별 멜라노좀 유입 억제 효과를 관찰하기 위해 멜라노마에서 분리한 멜라노좀을 이용하여 각질세포 식균작용 어세이를 수행하여, 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에서 확인할 수 있듯이, 흡광도 측정을 통해 각질세포 내로 유입된 멜라노좀의 양을 확인한 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 식균작용 억제 효과를 확인할 수 있었다.

실시예 11: 각질형성세포로의 멜라노좀 유입 억제 확인(분리된 멜라노좀 사용)

인간각질형성세포주(HaCaT)를 6-웰 배양용 평판에 24시간 배양하고 무혈청 배양배지에 마우스 흑색종 세포주(B16F10)에서 분리한 멜라노좀을 3시간 전처리하고 농도별 펩타이드(10, 50, 100, 200 uM) 또는 양성 대조군인 알부틴(200 uM)을 처리하여 48시간 배양하였다. 그 다음, 후에 PBS로 세척하여 유입되지 않은 멜라노좀을 제거하고 폰타나-마손 염색(fontana-masson stain) 하여 각질형성세포의 멜라노좀 식균작용 억제를 현미경을 통하여 관찰하였다. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 농도별 멜라노좀 유입 억제 효과를 관찰하기 위해 흑색종에서 분리한 멜라노좀을 이용하여 각질세포 식균작용 어세이를 수행하여, 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에서 확인할 수 있듯이, 광학현미경 이미지 분석을 통해 각질세포 내로 유입된 멜라노좀의 양을 확인한 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 농도 의존적인 식균작용 억제 효과를 확인할 수 있었다.

실시예 12: 각질형성세포로의 멜라노좀 유입 억제 확인( 생입자 사용)

인간각질형성세포주(HaCaT)를 24-웰 배양용 평판에 24시간 배양하고 0.5% FBS 배양배지에 농도별 펩타이드(100, 200 uM) 또는 양성 대조군인 알부틴(200 uM)을 처리하여 24시간 배양하였다. 그 다음, Vybrant. Phagocytosis Assay Kit(V-6694)를 사용하여 인간각질형성세포주의 식균작용(phagocytosis) 억제를 형광현미경을 통하여 관찰하였다. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 농도별 멜라노좀 유입 억제 효과를 관찰하기 위해 형광-결합 생입자(bioparticles)를 이용하여 각질세포 식균작용 어세이를 수행하여, 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에서 확인할 수 있듯이, 형광현미경 이미지 분석을 통해 각질세포 내로 유입된 생입자의 양을 확인한 결과 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 뚜렷한 식균작용 억제 효과를 확인할 수 있었다.

실시예 13: 각질형성세포에서의 멜라노좀 분해능 관찰

인간각질형성세포주(HaCaT)를 6-웰 배양용 평판에 24시간 배양하고 무혈청 배양배지에 마우스 흑색종 세포주(B16F10)에서 분리한 멜라노좀을 48시간 처리한 후 PBS로 세척하여 유입되지 않은 멜라노좀을 제거한고 농도별 펩타이드(100, 200 uM) 또는 양성대조군인 알부틴(200 uM) 및 TGFβ-1을 처리하여 72시간 배양하였다. 각질형성세포로 식균작용된 멜라노좀의 분해를 측정하기 위하여 각질형성세포를 수집, 침전한 후 얻은 펠렛에 1 M NaOH를 첨가하고 80 오븐에서 펠렛을 용해시킨 후 490 nm에서 OD 값을 측정하여, 그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에서 확인할 수 있듯이, 각질세포로 유입된 멜라노좀에 대한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 분해 촉진 효능을 관찰한 결과, 농도 의존적인 효과가 확인되었다.

실시예 14: 생체 내 미백효능 관찰( in vivo )

8주령의 C57BL/6 쥐의 꼬리에 리포좀화된 펩타이드(5,000 ppm) 및 양성대조군인 알부틴을 하루에 한 번씩 도포하여 약 8주간 실험을 진행하였다. 실험 종료 후에 쥐를 희생하여 꼬리피부조직을 적출하고 이를 파라핀으로 포매하여 파라핀 블록을 제작하였다. 그 다음, 파라핀 절편으로 만들어 폰타나-마손 염색(fontana-masson stain)하여 형태학적으로 관찰하여, 그 결과를 도 14a 내지 도 14c에 나타내었다.

도 14a에서 확인할 수 있듯이, 8주간 도포 실험을 진행한 결과 대조군에 비해 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함한 리포좀 처리군의 꼬리 색이 밝아지는 것을 관찰할 수 있었다.

또한, 도 14b 및 도 14c의 F&M 염색을 통한 멜라닌 분포 확인 결과, 대조군 표피의 기저층에 분포된 멜라닌에 비해 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 처리군의 분포량이 현저히 적은 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 피부 미백 활성을 갖는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 멜라닌 합성을 억제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 티로시네이즈(tyrosinase)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 멜라닌 형성에 관여하는 인자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제4항에 있어서, 상기 멜라닌 형성에 관여하는 인자는 MITF(microphthalmia-associated transcription factor), TRP1(tyrosinase-related protein 1) 및 PAR2(proteinase-activated receptor 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 멜라닌 형성에 관여하는 신호전달물질인인 CREB(cAMP response element-binding protein)의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 멜라노좀 이동(melanosome transfer)을 억제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 멜라노좀 분해 촉진능을 나타내는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물.