ES2896154T3

ES2896154T3 - Péptido que tiene actividad blanqueadora de la piel y uso del mismo

Info

Publication number: ES2896154T3
Application number: ES17761001T
Authority: ES
Inventors: Yong Ji Chung; Eun Mi Kim; Eung-Ji Lee; Jan Di Kim
Original assignee: Caregen Co Ltd
Current assignee: Caregen Co Ltd
Priority date: 2017-04-27
Filing date: 2017-04-27
Publication date: 2022-02-24
Anticipated expiration: 2037-04-27
Also published as: US20190328642A1; EP3412275A1; BR112017018828A2; JP2019524635A; EP3412275A4; US10695279B2; BR112017018828B1; JP6787911B2; EP3412275B1; CN109152718B; WO2018199358A1; CN109152718A

Abstract

Un péptido que tiene actividad blanqueadora de la piel, consistiendo el péptido que tiene un resto de ácido ferúlico unido a través de su grupo carboxilo al grupo amina del extremo N de Ile de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, en la siguiente secuencia: Feruloil-Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-COOH.

Description

DESCRIPCIÓN

Péptido que tiene actividad blanqueadora de la piel y uso del mismo

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un péptido que tiene una actividad blanqueadora de la piel y a una composición para blanquear la piel que lo contiene como principio activo.

Antecedentes técnicos

El factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-p1, por las siglas del inglés transforming growth factor beta 1), es un factor que induce el desarrollo de los tejidos o el mantenimiento de la homeostasis mediante el control del crecimiento, la diferenciación y la apoptosis en varios tipos de células. Se sabe que el factor de crecimiento transformante beta 1 presenta un efecto inhibidor de la melanogénesis en los melanocitos (THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY vol. 272, n.° 7, publicación del 14 de febrero, págs. 3967-3972, 1997).

Se ha demostrado que el factor de crecimiento transformante beta 1 funciona aumentando la degradación de la tirosinasa, que es una enzima importante para la melanogénesis. Además, el factor de crecimiento transformante beta 1 a menudo inhibe la melanogénesis al promover la actividad de ERK1/2, que promueve la degradación del factor de transcripción asociado a microftalmia (MITF, por las siglas del inglés microphthalmia-associated transcription factor), que es un factor de transcripción que regula la expresión de enzimas implicadas en la melanogénesis, tales como la tirosinasa, el gen 1 asociado a la tirosinasa y el gen 2 asociado a la tirosinasa.

Los presentes inventores, a través de estudios previos, han desarrollado un péptido basado en una parte de la secuencia de aminoácidos del factor de crecimiento transformante beta 1, y han verificado el efecto blanqueador del péptido en los melanocitos (véase el documento KR20080094296 A). Después de eso, los presentes inventores han investigado la mejora estructural a través de la unión con varios compuestos químicos para maximizar las funciones del péptido, y han descubierto un material de la presente invención que tiene un efecto blanqueador mejorado en comparación con el de los péptidos existentes a través de un proceso de exploración de efectos.

Descripción detallada de la invención

Problema técnico

Los presentes inventores se han esforzado por desarrollar un péptido que tenga una excelente actividad blanqueadora de la piel. Como resultado, los presentes inventores han establecido que, un péptido que consiste en un péptido que tiene un resto de ácido ferúlico unido a través de su grupo carboxilo al grupo amina del extremo N de JJe de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, presenta un excelente efecto blanqueador de la piel al inhibir la melanogénesis, inhibiendo la actividad de tirosinasa e inhibiendo la expresión de factores asociados a la melanogénesis, y así los presentes inventores han completado la presente invención.

Por lo tanto, un aspecto de la presente invención, es proporcionar un péptido que tiene actividad blanqueadora de la piel, consistiendo el péptido, en un péptido que tiene un resto de ácido ferúlico unido a través de su grupo carboxilo al grupo amina del extremo N de Ile de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar una composición para blanquear la piel, conteniendo la composición el péptido.

Otro aspecto más de la presente invención es proporcionar un uso del péptido para blanquear la piel.

Otro aspecto más de la presente invención es proporcionar un método para blanquear la piel usando el péptido. Otros propósitos y ventajas de la presente invención serán más obvios con la siguiente descripción detallada de la invención, las reivindicaciones y los dibujos.

Solución técnica

Los presentes inventores se han esforzado por desarrollar un péptido que tenga una excelente actividad blanqueadora de la piel. Como resultado, los presentes inventores han establecido que, un péptido que consiste en un péptido que tiene un resto de ácido ferúlico unido a través de su grupo carboxilo al grupo amina del extremo N de Ie de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, presenta un excelente efecto blanqueador de la piel al inhibir la melanogénesis, inhibiendo la actividad de tirosinasa e inhibiendo la expresión de factores asociados a la melanogénesis.

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá en detalle.

Un aspecto de la presente invención, es proporcionar un péptido que tiene actividad blanqueadora de la piel, consistiendo el péptido, en un péptido que tiene un resto de ácido ferúlico unido a través de su grupo carboxilo al grupo amina del extremo N de Ile de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

De acuerdo con una realización de la presente invención, el péptido inhibe la melanogénesis, inhibe la actividad y expresión de la tirosinasa, inhibe la expresión de MITF, PAR2 y TRP1, que son factores implicados en la melanogénesis, inhibe la fosforilación de CREB (por las siglas del inglés cAMP response element-binding, unión al elemento de respuesta al AMPc), que es un material de señalización implicado en la melanogénesis, inhibe la transferencia de melanosomas implicada en el blanqueamiento de la piel, y promueve la degradación de los melanosomas. Estos resultados indican que el péptido de la presente invención tiene un efecto excelente en el blanqueamiento de la piel.

Como se usa en el presente documento, el término "péptido" se refiere a una molécula lineal formada al permitir que los residuos de aminoácidos se unan entre sí a través de enlaces peptídicos. El péptido de la presente invención puede prepararse mediante métodos de síntesis química conocidos en la técnica, especialmente, técnicas de síntesis en fase sólida (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) o técnicas de síntesis en fase líquida (patente de Estados Unidos N.° 5.516.891).

El péptido de la presente invención puede seleccionar una región parcial de la secuencia de aminoácidos e inducir una modificación en el extremo N y/o C de la misma para aumentar su actividad.

Por ejemplo, el extremo C del péptido puede modificarse con un grupo hidroxilo (-OH), un grupo amino (-NH²), un grupo azida (-NHNH²), o grupos similares, pero sin limitarse a estos. Además, un grupo protector seleccionado del grupo que consiste en un grupo acetilo, un grupo fluorenil metoxi carbonilo, un grupo formilo, un grupo palmitoílo, un grupo miristilo, un grupo estearilo y polietilenglicol (PEG) se puede unir al extremo N del péptido.

Dicha modificación del extremo N y/o C aumenta la semivida del péptido de la presente invención, lo que conduce a elevar la semivida para la administración in vivo, mejorando así en gran medida la estabilidad del péptido.

Como se usa en el presente documento, el término "estabilidad" se refiere a la estabilidad al almacenamiento (por ejemplo, estabilidad al almacenamiento a temperatura ambiente), así como a la estabilidad in vivo. El grupo protector anterior protege al péptido de la presente invención del ataque de las enzimas de escisión de proteínas in vivo. Un aspecto de la presente invención, está dirigido a una composición para blanquear la piel, conteniendo la composición, como principio activo, un péptido que consiste en un péptido que tiene un resto de ácido ferúlico unido a través de su grupo carboxilo al grupo amina del extremo N de Ile de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Dado que la composición para el blanqueamiento de la piel de la presente invención contiene el péptido de la presente invención como principio activo, se omitirá la descripción de los contenidos superpuestos entre sí para evitar una complejidad excesiva de la presente memoria descriptiva.

La composición para el blanqueamiento de la piel de la presente invención se puede preparar como una composición cosmética.

La composición cosmética se puede preparar en cualquier forma farmacéutica que se prepare habitualmente en la técnica. Por ejemplo, la composición farmacéutica se pueden formular como una solución, una suspensión, una emulsión, una pasta, un gel, una crema, una loción, un polvo, un jabón, un limpiador que contenga tensioactivos, un aceite, una base en polvo, una base en emulsión, una base cerúlea, una pulverización, o similares, y más específicamente, en la forma farmacéutica de una loción emoliente, loción nutritiva, crema nutritiva, crema para masaje, una esencia, crema para los ojos, crema limpiadora, espuma limpiadora, agua limpiadora, una compresa, una pulverización y/o un polvo, pero sin limitarse a estos.

En los casos en que la forma de dosificación de la composición cosmética sea una pasta, una crema o un gel, pueden ser ejemplos útiles del ingrediente transportador un aceite animal, un aceite vegetal, cera, parafina, almidón, goma tragacanto, un derivado de celulosa, polietilenglicol, silicona, bentonita, sílice, talco y/u óxido de cinc.

En los casos en que la forma de dosificación de la composición cosmética sea un polvo o una pulverización, pueden ser ejemplos útiles del componente transportador la lactosa, el talco, la sílice, el hidróxido de aluminio, el polvo de silicato de calcio y/o poliamida.

En los casos en que la forma de dosificación de la composición cosmética sea una pulverización, la pulverización puede contener además un propulsor, tal como clorofluorohidrocarburo, propano, butano y/o dimetiléter.

En los casos en que la forma de dosificación de la composición cosmética sea una solución o una emulsión, pueden ser ejemplos útiles del ingrediente transportador un disolvente, un solubilizante y/o un emulsionante, y por ejemplo, puede utilizarse agua, etanol, isopropanol, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, aceite de 1,3-butilglicol, ésteres grasos de glicerol, polietilenglicol y/o ésteres de ácidos grasos de sorbitano, aunque sin limitarse a estos.

En los casos en que la forma de dosificación de la composición cosmética sea una suspensión, pueden ser ejemplos útiles del ingrediente transportador un diluyente líquido (tal como agua, etanol y/o propilenglicol), un agente de suspensión (tal como alcohol isoestearílico etoxilado, éster de polioxietilensorbitol y/o éster de polioxietilen sorbitán), celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar y/o tragacanto, aunque sin limitarse a estos. En los casos en que la forma de dosificación de la composición cosmética sea un limpiador que contenga tensioactivos, pueden ser ejemplos útiles del ingrediente transportador sulfato de alcohol alifático, éter sulfato de alcohol alifático, monoéster de sulfosuccinato, isetionato, derivados de imidazolio, taurato de metilo, sarcosinato, éter sulfato de amida de ácidos grasos, alquil amido betaína, alcohol alifático, glicéridos de ácidos grasos, dietanolamida de ácidos grasos, aceite vegetal, derivados de lanolina y/o éster de ácidos grasos con glicerol etoxilado, aunque sin limitarse a estos.

Los ingredientes contenidos en la composición cosmética de la presente invención pueden incluir, además del ingrediente transportador y del péptido que consiste en un péptido que, como principio activo, tiene un resto de ácido ferúlico unido a través de su grupo carboxilo al grupo amina del extremo N de Ile de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ingredientes normalmente utilizados en composiciones cosméticas, por ejemplo, complemento habituales, tales como un antioxidante, un purificador, un solubilizante, vitaminas, un pigmento y/o un aromatizante, aunque sin limitarse a estos.

Efectos ventajosos

La presente invención está dirigida a un péptido que tiene actividad blanqueadora de la piel y a una composición para blanquear la piel que, como principio activo, lo contiene, y el péptido inhibe la melanogénesis, inhibe la actividad de tirosinasa, inhibe la expresión de factores implicados en la melanogénesis e inhibe la transferencia de melanosomas, presentando así un excelente efecto blanqueador de la piel. Además, el péptido tiene una excelente permeabilidad cutánea debido a su pequeño tamaño y puede aplicarse muy favorablemente a los cosméticos debido a su excelente actividad y estabilidad.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un gráfico que muestra los resultados de la evaluación de la citotoxicidad de un péptido según una realización de la presente invención.

La figura 2a es un gráfico que muestra los resultados de la medición de la producción de melanina cuando la línea celular de melanoma (B16F10) se trató con un péptido según una realización de la presente invención. La figura 2b es una imagen que muestra los resultados de la medición de la producción de melanina cuando la línea celular de melanoma (B16F10) se trató con un péptido según una realización de la presente invención. La figura 3 proporciona imágenes que muestran los resultados de la observación de la melanogénesis cuando la línea celular de melanoma (B16F10) se trató con un péptido según una realización de la presente invención. La figura 4 es un gráfico que muestra los resultados de la medición de la actividad tirosinasa en células cuando la línea celular de melanoma (B16F10) se trató con un péptido según una realización de la presente invención. La figura 5 proporciona imágenes que muestran los resultados de la confirmación del nivel de expresión de tirosinasa en células usando anticuerpo de tirosinasa cuando la línea celular de melanoma (B16F10) se trató con un péptido según una realización de la presente invención.

La figura 6 proporciona imágenes que muestran resultados de la PCR que confirman el cambio de expresión génica de los factores de melanogénesis cuando la línea celular de melanoma (B16F10) se trató con un péptido según una realización de la presente invención.

La figura 7 proporciona imágenes que muestran resultados de la confirmación de cambios en la expresión de proteínas de factores de melanogénesis usando anticuerpos específicos contra proteínas de los factores de melanogénesis cuando la línea celular de melanoma (B16F10) se trató con un péptido según una realización de la presente invención.

La figura 8 proporciona imágenes que muestran los resultados de la confirmación del grado de fosforilación de CREB, que es un material de señalización del factor de melanogénesis, cuando la línea celular de melanoma (B16F10) se trató con un péptido según una realización de la presente invención.

La figura 9 proporciona imágenes que muestran resultados de la PCR que confirman el cambio en la expresión de un gen implicado en la actividad y fagocitosis de queratinocitos cuando la línea celular (HaCat) de queratinocitos humanos se trató con un péptido según una realización de la presente invención.

La figura 10 es un gráfico que muestra los resultados de confirmar la inhibición de la transferencia de melanosomas a queratinocitos cuando la línea celular (HaCat) de queratinocitos humanos se trató con un péptido según una realización de la presente invención.

La figura 11 proporciona imágenes que muestran los resultados de confirmar la inhibición de la fagocitosis melanosómica por los queratinocitos cuando la línea celular (HaCat) de queratinocitos humanos se trató con un péptido según una realización de la presente invención.

La figura 12 proporciona imágenes que muestran los resultados de un ensayo de fagocitosis de queratinocitos usando biopartículas conjugadas con fluorescencia para observar el efecto inhibidor de la transferencia de melanosomas según una realización de la presente invención.

La figura 13 es un gráfico que muestra los resultados de confirmar la capacidad de degradación de melanosomas en los queratinocitos cuando la línea celular (HaCat) de queratinocitos humanos se trató con un péptido según una realización de la presente invención.

La figura 14a proporciona una imagen que muestra los resultados de la observación del efecto blanqueador in vivo cuando un péptido según una realización de la presente invención se liposomizó y se aplicó a la cola de ratones C57BL/6.

La figura 14b proporciona una imagen que muestra los resultados (ejemplo comparativo) de la observación del efecto blanqueador in vivo cuando un péptido según una realización de la presente invención se liposomizó y se aplicó a la cola de ratones C57BL/6.

La figura 14c proporciona una imagen que muestra resultados (ejemplo) de la observación del efecto blanqueador in vivo cuando un péptido según una realización de la presente invención se liposomizó y se aplicó a la cola de ratones C57BL/6.

Modo para llevar a cabo la invención

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá en detalle con referencia a los ejemplos. Estos ejemplos son solamente para ilustrar la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo de síntesis 1: Síntesis de péptidos

En un recipiente de reacción, se colocaron 700 mg de resina de cloruro de tritilo (resina CTL, Nova Biochem Cat N.° 01-64-0021) y se añadieron 10 ml de cloruro de metileno (MC), seguido de agitación durante 3 minutos. Después de eso, se eliminó la solución, se añadieron 10 ml de dimetilformamida (DMF), seguido de agitación durante 3 minutos, y a continuación se eliminó de nuevo el disolvente. En un reactor, se colocaron 10 ml de una solución de diclorometano y se añadieron 200 mmoles de Fmoc-Asp(OtBu)-OH (Bachem, Suiza) y 400 mmoles de diisopropiletilamina (DIEA). La mezcla se disolvió completamente con agitación, y la reacción se realizó con agitación durante 1 hora. Después de la reacción, el material resultante se lavó y el metanol y la DIEA (2:1) se disolvieron en DCM, seguido de reacción durante 10 minutos, y a continuación el material resultante se lavó con exceso de DCM/DMF (1:1). Después de eliminar la solución, se añadieron 10 ml de dimetilformamida (DMF), seguido de agitación durante 3 minutos, y a continuación se eliminó de nuevo el disolvente. En un recipiente de reacción, se colocaron 10 ml de una solución de desprotección (piperidina al 20 %/DMF), seguido de agitación a temperatura ambiente durante 10 minutos, y a continuación se eliminó la solución. Se añadió la misma cantidad de una solución de desprotección y se dejó que la reacción continuara de nuevo durante 10 minutos, seguido de la eliminación de la solución. El material resultante se lavó dos veces con DMF, una vez con MC y otra DMF, durante 3 minutos cada vez, preparando así la resina Asp-CTL. En un nuevo reactor, se colocaron 10 ml de una solución de DMF y 200 mmol de Fmoc-Gly-OH (Bachem, Suiza), se añadieron 200 mmol de HoBt y 200 mmol de Bop, y la mezcla se disolvió completamente con agitación. En un reactor, se añadieron 400 mmol de DIEA en dos partes divididas y después se agitó durante al menos 5 minutos hasta que se disolvieron todos los sólidos. La solución mixta de aminoácidos disueltos se puso en el reactor que contenía la resina desprotegida, y la reacción se realizó con agitación a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de eliminar el líquido de reacción, la agitación se realizó usando una solución de DMF tres veces durante 5 minutos cada vez, seguido de la eliminación de la solución de DMF. Se tomó una pequeña cantidad de la resina de reacción para comprobar el grado de reacción usando la prueba de Kaiser (prueba de ninhidrina). Usando la solución de desprotección, la reacción de desprotección se realizó dos veces de la misma manera que la descrita anteriormente para preparar la resina Gly-Asp-CTL. Después de un lavado suficiente con DMF y MC, se realizó de nuevo la prueba de Kaiser, y a continuación se realizó la siguiente prueba de unión de aminoácidos de la misma manera que la descrita anteriormente. Basándose en la secuencia de aminoácidos seleccionada, se realizó una reacción en cadena en el orden de Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Trp-OH y Fmoc-Ile-OH. El grupo protector Fmoc se hizo reaccionar dos veces con una solución de desprotección durante 10 minutos cada vez y después se lavó minuciosamente. Después de eso, el ácido ferúlico activado se unió y después la resina de peptidilo preparada se lavó tres veces cada vez con DMF, MC y metanol, se secó con gas nitrógeno a flujo lento y se secó completamente al vacío con P2O5. Después, se añadieron 30 ml de una solución de mezcla (ácido trifluoroacético (TFA) al 81,5%, agua destilada al 5%, tioanisol al 5 %, fenol al 5 %, EDT al 2,5 % y TIS al 1 %), y se dejó que la reacción continuara durante 2 horas mientras la mezcla se agitaba intermitentemente a temperatura ambiente. La resina se obtuvo a través de filtración y se lavó con una pequeña cantidad de una solución de TFA y después se mezcló con la solución madre. La destilación se llevó a cabo a presión reducida para dejar aproximadamente la mitad del volumen total, y después se añadieron 50 ml de éter frío para inducir la precipitación. Después de eso, el precipitado se recogió por centrifugación, seguido de lavado dos veces con éter frío. Se eliminó la solución madre y el precipitado se secó suficientemente con nitrógeno, para sintetizar 0,77 g de Feruloil-Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-COOH, péptido 1 (SEQ ID No. 1) antes de la purificación (rendimiento: 88,0%). Se encontró que el peso molecular del péptido era de 1643,7 (valor teórico: 1643,7) cuando se midió usando un medidor de peso molecular.

T l 11

Ejemplo 1: Prueba de citotoxicidad

Después de incubar en una incubadora a 37 °C durante 24 horas células formadoras de melanina (línea celular B16F10) distribuidas en placas de cultivo de 48 pocillos, el medio de cada placa se retiró y se reemplazó por medio asérico, y después, las células se trataron con el péptido de la presente invención a diferentes concentraciones (1, 10, 50, 100, 150, 200 uM). Después de incubar las células durante 72 horas, se añadió el reactivo MTT, seguido de reacción durante 4 horas. Después, el formazán generado se disolvió en DMSO y la absorbancia se midió a 560 nm. Para examinar la citotoxicidad del péptido, que consiste en un péptido que tiene un resto de ácido ferúlico unido a través de su grupo carboxilo al grupo amina del extremo N de Ile de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, sobre los melanocitos, se realizó un ensayo con MTT y los resultados se muestran en la figura 1.

Como puede observarse en la figura 1, se verificó que, en los grupos tratados con 1 uM a 200 uM, no se observaba citotoxicidad.

Ejemplo 2: Medición de la producción de melanina

Después de incubar en una incubadora a 37 °C durante 24 horas células formadoras de melanina (línea celular B16F10) distribuidas en placas de cultivo de 6 pocillos, el medio de cada placa se retiró y después se reemplazó por medio nuevo (medio de suero al 2 %). Después, las células se trataron con a-MSH (200 ng/ml), con arbutina (200, 500 uM) o con el péptido de la presente invención a diferentes concentraciones (50, 100, 200 uM). Después de eso, las células se incubaron durante 72 horas y después se retiró el medio de cultivo. Las células se separaron y después se transfirieron a un tubo de 1,5 ml, seguido de centrifugación a 13000 rpm durante 3 minutos. Se retiró el sobrenadante y se recogieron sedimentos celulares para observar la melanina. Después, se añadieron 150 pl de NaOH 2 M a los sedimentos celulares para someter a lisis la melanina intracelular a 60 °C durante 30 minutos. Después, se añadieron 100 pl del sobrenadante obtenido de la lisis en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se midió la absorbancia a 490 nm. Los resultados se muestran en las figuras 2a y 2b.

Como puede observarse en las figuras 2a y 2b, el efecto inhibidor de la melanogénesis del péptido que consiste en un péptido que tiene un resto de ácido ferúlico unido a través de su grupo carboxilo al grupo amina del extremo N de le de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, se verificó de una manera dependiente de la dosis (**P< 0,01).

Ejemplo 3: Observación visual de la producción de melanina

Después de incubar en una incubadora a 37 °C durante 24 horas células formadoras de melanina (línea celular B16F10) distribuidas en placas de cultivo de 6 pocillos, el medio de cada placa se retiró y se reemplazó por medio nuevo (medio de suero al 10 %). Después, las células se trataron con a-MSH (200 ng/ml), con arbutina (500 uM) o con el péptido de la presente invención a diferentes concentraciones (50, 100, 200 uM). Las células se incubaron durante 72 horas y después la melanina formada se observó a través de un microscopio óptico. Los resultados se muestran en la figura 3.

Como puede observarse en la figura 3, el efecto inhibidor de la melanogénesis del péptido que consiste en un péptido que tiene un resto de ácido ferúlico unido a través de su grupo carboxilo al grupo amina del extremo N de Ile de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, se verificó de una manera dependiente de la dosis a través de morfología celular.

Ejemplo 4: Medición de la actividad de tirosinasa intercelular

Las células de melanoma (B16F10) se incubaron en placas de cultivo de 6 pocillos y después se trataron con a-MSH (200 ng/ml), con el péptido a diferentes concentraciones (50, 100, 200 uM) o con arbutina (200, 500 uM) como control positivo, seguido de incubación durante 72 horas. Las placas de cultivo de 6 pocillos se cargaron en hielo y se lavaron con PBS frío, y después se añadieron 300 pl de tampón fosfato sódico 0,1 M (tampón de lisis pH 6,8) que contenía Triton X-100 al 1 %. Las células se recogieron en un tubo de 1,5 ml y después se alteraron las membranas celulares repitiendo la congelación rápida a -270 °C y la descongelación, cinco veces. Después, el tubo se centrifugó a 13000 rpm durante 20 minutos y a continuación se recogió el sobrenadante en otro tubo de 1,5 ml y se cuantificó el contenido proteico de las muestras. Las muestras se diluyeron hasta tener la misma concentración de proteína y después se distribuyeron en tres pocillos cada uno en una placa de cultivo de 96 pocillos, y después se añadieron 20 |jl de L-dopa 10 mM, seguido de incubación a 37 °C durante 1 hora. La absorbancia se midió a 475 nm y los resultados se muestran en la figura 4.

Como puede observarse en la figura 4, el efecto inhibidor de la actividad tirosinasa del péptido que consiste en un péptido que tiene un resto de ácido ferúlico unido a través de su grupo carboxilo al grupo amino del extremo N de Ile de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, se verificó de una manera dependiente de la dosis (**P<0,01). Ejemplo 5: Medición del nivel de expresión de tirosinasa

Después de incubar en una incubadora a 37 °C durante 24 horas células formadoras de melanina (línea celular B16F10) distribuidas en placas de cultivo de 6 pocillos, el medio de cada placa se retiró y se reemplazó por medio nuevo (medio de suero al 10%). Después, las células se trataron con a-MSH (200 ng/ml) o con el péptido de la presente invención a diferentes concentraciones (50, 100 uM). Después, las células se incubaron durante 48 horas y la proteína de expresión intracelular se tiñó con anticuerpo de tirosinasa conjugado con FITC (Santa Cruz biotechnology, EE. UU.) y anticuerpo de IgG secundario conjugado con FITC (Santa Cruz biotechnology, EE. UU.). Su nivel de expresión se midió a través de un microscopio de fluorescencia y los resultados se muestran en la figura 5.

Como puede observarse en la figura 5, el efecto inhibidor de la expresión de tirosinasa del péptido que consiste en un péptido que tiene un resto de ácido ferúlico unido a través de su grupo carboxilo al grupo amina del extremo N de Ie de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, se verificó de una manera dependiente de la dosis.

Ejemplo 6: Observación del cambio en la expresión génica de los factores formadores de melanina Después de incubar células formadoras de melanina (línea celular B16F10) en placas de cultivo de 6 pocillos durante 24 horas, las células se trataron con a-MSH (200 ng/ml), con arbutina (500 uM) o con el péptido de la presente invención a diferentes concentraciones (100, 200 uM). Después de extraer ARN de las células incubadas durante 24 horas, se preparó ADNc. Después, se realizó PCR utilizando los cebadores que se muestran en la Tabla 2 a continuación, que son específicos de MITF, de tirosinasa y de TRP1, respectivamente, como factores implicados en la melanogénesis, y después se observó el cambio en la expresión de cada gen. Los resultados se muestran en la figura 6.

T l 2

Como puede observarse en la figura 6, se verificó que el péptido que consistía en un péptido que tiene un resto de ácido ferúlico unido a través de su grupo carboxilo al grupo amina del extremo N de Ile de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, tenía fuertes efectos de inhibición de los genes de MITF, de tirosinasa y de TRP1. Ejemplo 7: Observación del cambio en la expresión de proteínas de los factores formadores de melanina Después de incubar células formadoras de melanina (línea celular B16F10) en placas de cultivo de 6 pocillos durante 24 horas, las células se trataron con a-MSH (200 ng/ml) o con el presente péptido a diferentes concentraciones (50, 100 uM). Después de incubar las células durante 72 horas, las células se sometieron a lisis y la expresión de MITF (Santa Cruz Biotechnology, EE. UU.) y de tirosinasa (Santa Cruz Biotechnology, EE. UU.), que son factores esenciales implicados en la melanogénesis, se observó usando un método de transferencia Western usando anticuerpos específicos. Los resultados se muestran en la figura 7.

Como puede observarse en la figura 7, se verificaron los efectos inhibidores de la expresión de MITF y de la proteína tirosinasa del péptido que consiste en un péptido que tiene un resto de ácido ferúlico unido a través de su grupo carboxilo al grupo amina del extremo N de Ile de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Ejemplo 8: Observación del material de señalización de melanogénesis

Después de incubar células formadoras de melanina (línea celular B16F10) en placas de cultivo de 6 pocillos durante 24 horas, las células se trataron con a-MSH (200 ng/ml) o con el presente péptido a diferentes concentraciones (50, 100 uM). Después de incubar las células durante 10 minutos, éstas se sometieron a lisis y el grado de fosforilación de CREB, que es un material de señalización implicado en la melanogénesis, se observó usando un método de transferencia Western usando un anticuerpo específico (Santa Cruz Biotechnology, EE. UU.). Los resultados se muestran en la figura 8.

Como puede observarse en la figura 8, se verificó el efecto inhibidor de la fosforilación de CREB del péptido que consiste en un péptido que tiene un resto de ácido ferúlico unido a través de su grupo carboxilo al grupo amino del extremo N de Ile de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

A través de los resultados anteriores, el péptido que consiste en un péptido que tiene un resto de ácido ferúlico unido a través de su grupo carboxilo al grupo amina del extremo N de Ile de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, inhibe la vía de señalización de MC1R activada por a-MSH, presentando así un efecto inhibidor de la melanogénesis.

Ejemplo 9: Observación del cambio en la expresión del gen implicado en la actividad y fagocitosis de los queratinocitos

Después de incubar una línea de queratinocitos humanos (HaCaT) en placas de cultivo de 6 pocillos durante 24 horas, las células se trataron con tripsina como material inductor de actividad y con el presente péptido a diferentes concentraciones (100, 200 uM). Después de extraer ARN de las células incubadas durante 16 horas, se preparó ADNc.

Se realizó PCR utilizando un par de cebadores (véase la tabla 3 a continuación) específico para PAR2, que es uno de los receptores de superficie de los queratinocitos activados por la acción de la tripsina, y después se observó el cambio en la expresión de cada gen. Los resultados se muestran en la figura 9.

T l

Como puede observarse en la figura 9, la expresión génica se indujo por la activación de PAR2 de los queratinocitos, resultante del tratamiento con tripsina como serina proteasa, y se observó que el tratamiento con el péptido que consiste en un péptido que tiene un resto de ácido ferúlico unido a través de su grupo carboxilo al grupo amina del extremo N de Ile de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, redujo la expresión del gen de PAR2 de una manera dependiente de la dosis.

Ejemplo 10: Verificación de la inhibición de la transferencia de melanosomas a queratinocitos (utilizando melanosomas aislados)

Después de cultivar la línea de queratinocitos humanos (HaCaT) en placas de cultivo de 6 pocillos durante 24 horas, melanosomas aislados de la línea celular de melanoma de ratón (B16F10) se trataron previamente durante 3 horas en medio de cultivo asérico, y después, las células se trataron con el presente péptido a diferentes concentraciones (10, 50, 100, 200 uM) o con arbutina (200 uM) como control positivo, seguido de incubación durante 48 horas. Después, las placas se lavaron con PBS para eliminar los melanosomas no transferidos y se añadió NaOH 1 N a los sedimentos, que se habían obtenido recogiendo y precipitando las células. Después, se añadió NaOH 1 M a los sedimentos y estos disolvieron en un horno a 80 °C y posteriormente se midió el valor de la DO a 490 nm. Para observar el efecto inhibidor de la transferencia de melanosomas del péptido que consiste en un péptido que tiene un resto de ácido ferúlico unido a través de su grupo carboxilo al grupo amina del extremo N de Ile de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, según la concentración, se realizó un ensayo de fagocitosis de queratinocitos utilizando los melanosomas aislados de melanoma. Los resultados se muestran en la figura 10.

Como puede observarse en la figura 10, como resultado de examinar la cantidad de melanosomas transferidos a los queratinocitos a través de la medición de la absorbancia, se verificó el efecto inhibidor de la fagocitosis del péptido que consiste en un péptido que tiene un resto de ácido ferúlico unido a través de su grupo carboxilo al grupo amino del extremo N de Ile de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Ejemplo 11: Verificación de la inhibición de la transferencia de melanosomas a queratinocitos (utilizando melanosomas aislados)

Después de cultivar la línea de queratinocitos humanos (HaCaT) en placas de cultivo de 6 pocillos durante 24 horas, melanosomas aislados de la línea celular de melanoma de ratón (B16F10) se trataron previamente durante 3 horas en medio de cultivo asérico. Después, las células se trataron con el presente péptido a diferentes concentraciones (10, 50, 100, 200 uM) o con arbutina (200 uM) como control positivo, seguido de incubación durante 48 horas. Después, las placas se lavaron con PBS para eliminar los melanosomas no transferidos y se sometieron a tinción de Fontana-Masson para observar, a través de un microscopio, la inhibición de la fagocitosis melanosómica por los queratinocitos. Para observar el efecto inhibidor de la transferencia de melanosomas del péptido que consiste en un

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un péptido que tiene actividad blanqueadora de la piel, consistiendo el péptido que tiene un resto de ácido ferúlico unido a través de su grupo carboxilo al grupo amina del extremo N de Ile de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, en la siguiente secuencia: Feruloil-Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-COOH.

2. El péptido de la reivindicación 1, en donde el péptido inhibe la melanogénesis.

3. El péptido de la reivindicación 1, en donde el péptido inhibe la actividad de tirosinasa.

4. El péptido de la reivindicación 1, en donde el péptido inhibe la expresión de un factor implicado en la melanogénesis.

5. El péptido de la reivindicación 4, en donde el factor implicado en la melanogénesis se selecciona del grupo que consiste en factor de transcripción asociado a microftalmia (MITF), proteína 1 relacionada con tirosinasa (TRP1) y receptor 2 activado por proteinasa (PAR2).

6. El péptido de la reivindicación 1, en donde el péptido inhibe la fosforilación de la proteína de unión al elemento de respuesta al AMPc (CREB) que es un material de señalización implicado en la melanogénesis.

7. El péptido de la reivindicación 1, en donde el péptido inhibe la transferencia de melanosomas.

8. El péptido de la reivindicación 1, en donde el péptido presenta la capacidad de promover la degradación de melanosomas.

9. Una composición para blanquear la piel, conteniendo la composición, como principio activo, el péptido que tiene un resto de ácido ferúlico unido a través de su grupo carboxilo al grupo amina del extremo N de Ile de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, que consiste en la siguiente secuencia: Feruloil-Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-COOH.

10. Un péptido que consiste en la siguiente secuencia que tiene un resto de ácido ferúlico unido a través de su grupo carboxilo al grupo amina del extremo N de Ile de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, para su uso en el blanqueamiento de la piel: Feruloil-Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-COOH.

11. Un péptido que consiste en la siguiente secuencia que tiene un resto de ácido ferúlico unido a través de su grupo carboxilo al grupo amina del extremo N de Ile de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, para su uso en cosmética: Feruloil-Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-COOH.