WO2017155232A2

WO2017155232A2 - 발모 촉진 활성 및/또는 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타내는 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: WO2017155232A2
Application number: PCT/KR2017/002047
Authority: WO
Inventors: 정용지; 김은미; 이응지
Original assignee: 케어젠
Priority date: 2016-03-09
Filing date: 2017-02-24
Publication date: 2017-09-14
Also published as: KR101831887B1; KR20170105697A; JP2019508490A; US20190092821A1; EP3428177A2; EP3428177B1; US10344061B2; EP3428177A4; CN108699112B; ES2886965T3; JP6629995B2; WO2017155232A3; CN108699112A

Abstract

본 발명은 발모 촉진 활성 및/또는 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타내는 펩타이드, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 및/또는 개선용 조성물, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 발모 및/또는 육모 촉진용 조성물, 상기 펩타이드의 탈모 방지 및/또는 개선 용도, 상기 펩타이드의 발모 및/또는 육모 촉진 용도, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저색소증 예방 및/또는 치료용 약제학적 조성물, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저색소증의 예방 및/또는 개선용 화자품 조성물 및 상기 펩타이드의 멜라닌 저색소증 예방, 개선 및/또는 치료 용도에 관한 것이다. 상기 펩타이드는 모낭 세포 성장을 촉진하며, 발모 관련 성장인자 및 발모 관련 인자들의 발현을 증가시킴으로써 발모에 우수한 효과를 나타낸다. 또한, 상기 펩타이드는 티로시나아제의 활성 및 발현을 증가시키고, 멜라닌 형성에 관여하는 인자들의 발현을 증가시킴으로써 멜라닌 생성에 있어서 우수한 효과를 나타낸다. 상술한 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성에 의해 상기 펩타이드는 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있다.

Description

발모 촉진 활성 및/또는 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타내는 펩타이드 및 이의 용도

본 발명은 발모 촉진 활성 및/또는 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타내는 펩타이드, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 및/또는 개선용 조성물, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 발모 및/또는 육모 촉진용 조성물, 상기 펩타이드의 탈모 방지 및/또는 개선 용도, 상기 펩타이드의 발모 및/또는 육모 촉진 용도, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저색소증 예방 및/또는 치료용 약제학적 조성물, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저색소증의 예방 및/또는 개선용 화장품 조성물 및 상기 펩타이드의 멜라닌 저색소증 예방, 개선 및/또는 치료 용도에 관한 것이다.

모낭은 포유동물 피부의 독특한 기관으로서 원시 표피의 하부가 성장하여 보다 깊은 피부층으로 신장된 기관이다. 모낭의 기부에는 소낭 또는 진피 유두 세포로서 알려진 세포의 플러그가 존재하며(Stenn and Paus, Physiol. Rev., 81: 449 (2002)) 유두는 모낭의 정상적인 순환(Oliver, Embryol. Exp. Morph. 15: 3311 (1966); Oliver, Embryol. Exp. Morph. 16: 231 (1966)) 및 모간의 성장에 필수적이다. 모간은 케라틴 필라멘트와 필라멘트 응집 단백질로 충전된 단단하게 밀착된 상피 세포로 제조된 트레드 형상의 구조이다.

인간의 모발은 주기적으로 생장기, 퇴행기, 휴지기를 반복하며 모발이 빠지고 다시 생성되는 과정을 거치게 된다. 모발 주기의 결정은 호르몬 조절이나 많은 성장인자 등의 조절을 통하여 이루어진다. 한편, 모발은 심한 스트레스나 영양 결핍 등에 의해 일찍 퇴행기를 거쳐 휴지기로 접어들어 심한 탈모가 유발될 수 있다(American Journal of Pathology, 162(3)(2003), (Arck, Petra Clara; Handjiski, Bori)).

남성형 대머리에 있어서 두피의 전면 및 상부의 모낭은 안드로겐에 대해 감수성을 나타낸다. 그래서 남성형 대머리의 경우, 모낭의 파괴보다는 모낭의 소형화에 해당하는데 남성 호르몬인 안드로겐의 과도한 분비가 원인이다. 안드로겐 과다 분비로 인해 5-알파 환원효소가 활성화되어 테스토스테론이 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone,DHT)으로 변형되며, 이렇게 생성된 디하이드로테스토스테론은 모발이 자라는 기간을 단축시키고, 모낭을 소형화시켜 굵고 튼튼한 성모의 수를 감소시킴으로써 탈모를 유발시킨다.

일반적으로 나이가 들어감에 따라 탈모가 확산된다. 예를 들면, 흉터 탈모증, 화상 또는 압박 상해와 관련된 흉터 형성 상태와 같은 상이한 질환 상태가 현저한 탈모를 일으킬 수 있다. 이런 탈모현상을 치료하기 위해 지금까지는 의약품으로 여러 가지 물질 등이 사용되어 왔으나 가격이 너무 비싸고, 여러 가지 부작용들이 유발된다.

또한, 이런 의약품들은 지속적인 사용이 필요하며, 사용을 중단하였을 때에는 다시 탈모가 유발되고 효능에 대한 개개인의 차이가 심하며, 부작용도 개개인 마다 차이가 난다는 단점이 있다.

그 외 화장품으로 이용되고 있는 원료들은 가격이 저렴하다는 장점이 있지만, 식물 추출물 유래 성분들로 구성되어 있기 때문에 실제 그 효능은 크지 않다는 단점이 있다. 따라서 효과적이면서 비용적인 측면에서도 보다 경제적인 새로운 유효성분에 대한 요구가 당업계에 대두하고 있다.

지금까지 알려진 2가지 이용 가능한 약물(미녹시딜 및 피나스테라이드)은 추가 탈모를 지연시킬 수는 있지만, 새로운 모낭의 재생을 유도하지는 못했다. 또한, 두발 화장품 중에서 식물 추출물 등을 이용한 탈모방지 제품이 많이 출시되었다.

예를 들어, 고삼, 고추, 당약, 상백피, 상엽, 임삼, 감초, 작약, 지황, 회향, 산수유, 마늘 등의 추출물을 함유한 제품, 크산틴 및 성장호르몬을 함유하는 조성물을 첨가하여 디하이드로테스토스테론의 과잉에 따른 세포 대사 억제를 개선함과 동시에 성장 호르몬이 모발성장을 촉진함으로써 탈모방지 및 모발을 재생하여 모발성장 촉진 효과를 나타내는 제품, 발모 및 모발의 성장을 촉진하기 위해 미네랄 및 비타민류, 녹차, 로즈마리, 쑥, 감초 추출액을 함유한 제품을 개발하여 두피와 모발에 영양을 공급하며 탈모의 예방 및 모발 성장 촉진에 효과가 있는 발모 촉진용 제품, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 니코틴산, 판토텐산, 비오틴 및 엽산 등의 물질과 식물추출물을 혼합하여 인체 내의 5-알파 환원효소를 억제하여 남성호르몬의 대사과정에서 디하이드로테스토스테론이 형성되지 않도록 하며 머리카락의 신진대사작용을 돕는 남성형 탈모제품들이 개발되었으나 신생모발의 생성까지 영향을 미치는 제품은 찾기 어려웠다.

피부 세포는 자외선이나 환경오염, 그 밖의 외부 요인의 자극에 대해 방어기전으로 표피 기저층에 존재하는 멜라닌 세포(melanocyte)의 멜라닌소체(melanosome)에서 멜라닌을 생성한다. 멜라닌은 동물들의 피부, 눈동자, 머리카락의 색을 결정하는 중요한 요인이다. 저색소증은 피부암의 위험인자로도 알려졌다.

동양인들은 멜라닌이 과다로 생성되는 것에 민감하여 멜라닌 생성을 억제하는 미백 관련 연구가 많이 수행되었다. 하지만, 최근에는 멜라닌 생성이 억제되어 나타나는 백반증(Vitiligo)에 대한 요구도 증가하고 있어 이에 대한 연구도 진행되고 있다.

백반증은 멜라닌 세포의 사멸이나 괴사로 인한 여러 가지 크기 및 형태의 백색반이 피부에 나타나는 후천성 탈색소 질환이다. 전 세계적으로 인구의 약 1%에서 나타나는 비교적 흔한 질환으로, 인종이나 지역에 따른 차이는 없다. 발생 연령은 10~30세에 가장 많고, 95%의 경우 40세 이전에 발병하고, 환자의 30%에서 가족력이 있다.

백반증이 생기는 원인에 대해서 아직 정확히 밝혀진 바는 없으나, 자가 면역설, 신경체액설, 멜라닌 세포 자가 파괴설 등 여러 가지 설이 제시되고 있다. 자가 면역설은 멜라닌 세포계 항원에 대한 자가항체의 발현으로 멜라닌 세포의 파괴 또는 기능 이상이 초래되거나 세포 독성 림프구나 활성화된 림프구가 분비한 림포카인에 멜라닌 세포가 파괴된다는 설이다. 신경체액설은 카테콜아민 생합성의 이상과 모노아민 산화효소의 증가 등으로 인하여 스트레스와 관련된 과산화수소가 만들어지고 이로 인해 멜라닌 세포가 파괴된다는 설로, 백반증이 신경절을 따라 발생하거나 신경 손상이나 스트레스 후에 발병할 수도 있다. 멜라닌 세포 자가 파괴설은 멜라닌 형성 과정에서 생기는 중간대사 물질이나 최종대사 물질인 페놀 복합체가 멜라닌 세포 내에 축적되어 세포를 파괴한다는 설이다. 그 외 고유세포 결손(inherent cellular defect), 유전요인, 세포사멸, 칼슘 대사 이상 등의 다양한 인자들이 제시되고 있다.

멜라닌은 멜라닌 생성세포(melanocytes)로부터 합성되고 자외선 조사나 독성 물질과 화학물질을 흡수함으로써 피부를 보호하는데 중요한 역할을 한다. 그러므로 멜라닌 합성이 정상적으로 일어나지 않는 사람들에게서는 모든 피부가 백색으로 되기보다는 부분적으로 백색으로 변해 얼룩이 생기는 외형적인 문제점도 있고 외부 자극에 민감해지는 것이 더 문제이다.

멜라닌 합성에 중요한 효소인 티로시나아제(tyrosinase)와 TRP-1(tyrosinase related protein-1), TRP-2(tyrosinase related protein-2)는 산화적 반응에 촉매로 작용한다(Pigment Cell Res. 14 (6): 43744).

티로시나아제는 티로신(tyrosine)을 DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine)로, DOPA를 DOPA 퀴논(quinone)으로 산화시키는 작용을 하고, TRP-1은 디히드록시인돌 카복실산 옥시다제(dihydroxyindole carboxylic acid oxidase)로서 5,6-디히드록시인돌-2-카복실산(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid; DHICA)를 인돌-5,6-퀴논-2-카복실산(indol-5,6-quinone-2-carboxylic acid)로 변화시키는데 관여한다.

또한, TRP-1은 티로시나아제를 안정화시키고 활성을 조절하는 역할을 하며, TRP-2는 DOPA 크롬 타우토머라아제로써 DOPA 크롬을 DHICA로 변화시켜 멜라닌세포를 이루는 유멜라논(eumelanon)과 페오멜라논(pheomelanon)을 형성하고 이들의 비율에 따라 피부, 머리카락, 눈동자의 색깔 등이 결정된다.

멜라닌 합성은 자외선 조사와 MSH(α-melanocyte stimulating hormone)로 인해 활성화된다. α-MSH는 펩타이드 호르몬으로 자외선에 의해 생성되며 뇌하수체 및 피부를 포함한 여러 세포에서 만들어지는 것으로 알려져있다.

α-MSH는 측분비(paracrine)에 의해 멜라닌 생성세포의 MCR(melanocortin receptor)에 작용하여 전사인자인 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)의 활성을 조절하여 멜라닌 합성에 중요한 역할을 하는 티로시나아제, TRP-1(DHICA oxidase), TRP-2(DOPAchrome tautomerase) 등의 활성을 조절한다(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 273, No. 31, Issue of July 31, pp. 195609565, 1998).

멜라닌 형성세포가 UV 또는 α-MSH에 의해서 자극이 되면 각각 p38이나 PKA(protein kinase A)에 의해서 티로시나아제가 활성화된다고 보고되었다. 그런데 이 두 가지 경로 중 특히 α-MSH -> cAMP -> PKA 과정이 멜라닌 합성에 중요한 역할을 하는데, cAMP의 증가는 CREB(cAMP-responsive element binding protein) 인산화를 촉진시키고, 이것이 전사인자인 MITF의 발현을 증가시키고, 이것은 티로시나아제의 활성을 향상시키며, 티로시나아제 mRNA 발현을 증가시킨다는 보고들이 있다(Nucleic Acids Res. 30 (14): 3096106, Pigment Cell Melanoma Res 21 (6): 66576).

한편, 우리나라를 비롯한 동양인들은 누구나 하얀 피부색을 가지기를 원하기 때문에 멜라닌 생성을 억제하는 미백 성분에 대한 연구를 많이 수행해 왔다. 그러나 멜라닌은 피부의 멜라닌 생성세포로부터 합성되며 자외선조사나 독성 물질과 화학물질을 흡수함으로써 피부를 보호하는데 중요한 역할을 한다. 멜라닌의 정상적인 합성이 나타나지 않는 경우는 피부가 외부 자극에 민감하고 외형적으로도 비정상적으로 보이므로 멜라닌 합성이 정상화될 수 있도록 치료하는 것이 필요하고 이에 대한 연구도 수행된 것들이 있다. 그러나 아직까지 멜라닌 합성을 촉진시키는 것에 대한 기술개발이 충분히 수행되지 않았다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 펩타이드를 개발하고자 노력한 결과, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 우수한 발모 효능 및/또는 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타낸다는 것을 확인하고, 이들이 탈모 방지 또는 개선, 및 멜라닌 저색소증의 예방 및/또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 발모 촉진 활성을 나타내는 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 및/또는 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 발모 및/또는 육모 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타내는 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저색소증의 예방 및/또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저색소증의 예방 및/또는 개선용 화장품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 펩타이드를 개발하고자 노력한 결과, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 우수한 발모 효능 및/또는 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타낸다는 것을 확인하고, 상기 펩타이드가 탈모 방지 및/또는 개선, 및 멜라닌 저색소증의 예방 및/또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 규명하였다.

본 발명의 펩타이드는 본 발명자들이 보유하고 있는 펩타이드 라이브러리 가운데 세포 증식 실험을 통해 발모 효능이 우수한 펩타이드를 스크리닝한 것으로써, 총 2종이 본 발명의 펩타이드로 제공된다.

본 발명의 일 양태는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 발모 촉진 활성을 나타내는 펩타이드에 관한 것이다.

상기 펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 것일 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 아미노산 서열의 일부 부위를 선정하고 그 활성을 증가시키기 위해 N-말단 또는 C-말단에 변형을 유도할 수 있다.

예를 들어, 상기 C-말단 변형은 펩타이드의 C-말단이 히드록시기(-OH), 아미노기(-NH₂), 아자이드(-NHNH₂) 등으로 변형되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 N-말단 변형은 펩타이드의 N-말단이 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 보호기가 결합되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.

상기 펩타이드의 N-말단 및/또는 C-말단 변형은 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 하며, 이러한 변형을 통해 본 발명의 펩타이드는 생체 내 투여시의 반감기를 증가시켜 높은 반감기를 가질 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 모낭 세포 성장을 촉진하며, 모발 성장 관련 인자인 β-카테닌의 활성을 증가시키고, 발모 관련 성장인자인 KGF, VEGF의 발현을 증가시키며, 발모 시그널링 분자인 PI3K의 발현을 증가시키고, ERK의 인산화를 증가시키며, 모발 성장 관련 인자인 MSX2, 및 카라틴-14의 발현을 증가시키고, 모발 성장 지연과 관련된 TGF-β1의 발현을 감소시키며, 세포 사멸 억제 단백질인 Bcl-2의 발현 증가 및 세포 사멸 관련 단백질인 Bax의 발현 감소를 유도한다.

이러한 결과는 본 발명의 펩타이드가 발모에 대하여 매우 우수한 효능을 가진다는 것을 의미한다. 따라서 본 발명의 펩타이드는 탈모 방지 및/또는 개선, 발모 및/또는 육모 촉진 용도로 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 및/또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 펩타이드는 모근을 생성할 수 있게 하는 피부조직의 머리카락 난포(hair follicle)에 있는 세포의 증식을 유도하여 새로운 모낭이 생성할 수 있게 한다. 더욱이 β-카테닌(beta-catenin)의 시그널을 활성화 시켜 발모 촉진 유전자를 발현시키며, 발모에 관여하는 성장인자들의 발현을 증가시킨다.

본 펩타이드는 모발이 생성되고 성장되는 시기인 생장기를 촉진시키는 역할을 하며 여러 가지 환경적인 요인으로 인해 퇴행기로 가는 모발의 주기를 생장기에 유지하도록 함으로써 탈모억제 효과를 나타내고 정상 모발에서는 모발에 영양분을 공급하여 모발 건강을 유지할 수 있도록 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 탈모 방지 및/또는 개선에 매우 효과적이다.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 발모 및/또는 육모촉진용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 화장품 조성물로 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장품 조성물은 상술한 본 발명의 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount)을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 화장품 조성물은 화장품학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및/또는 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 예를 들어, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 및/또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 화장품 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 및/또는 산화아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장품 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 및/또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장품 조성물의 제형이 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 및/또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장품 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 및/또는 유탁화제가 이용될 수 있으며, 예를 들어, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장품 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 및/또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및/또는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 및/또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장품 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 및/또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서의 펩타이드류와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및/또는 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 탈모 방지 및/또는 개선 용도에 관한 것이다.

상기 펩타이드는 상술한 펩타이드와 동일하기 때문에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 발모 및/또는 육모 촉진 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타내는 펩타이드에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 멜라닌 형성 세포에서 멜라닌 생성을 증가시키며, 멜라닌 합성을 조절하는 효소인 티로시나아제의 발현을 증가시키고, 멜라닌 형성에 관여하는 인자인 MITF, TRP1의 발현을 증가시킨다.

이러한 결과는 본 발명의 펩타이드가 멜라닌 생성을 증가시킴으로써 멜라닌 저색소증이 완화되도록 하는 효과를 가진다는 것을 의미한다. 따라서 본 발명의 펩타이드는 멜라닌 저색소증의 예방, 개선 및/또는 치료 용도로 이용될 수 있다.

상기 멜라닌 저색소증은 백반증, 백색증, 탈색소 모반, 백색 비강진, 어루러기, 염증 후 탈색증, 반상 경피증, 부분 백피증, 특발성 적상 저색소증 또는 점상 백피증인ㅇ 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저색소증의 예방 및/또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조될 경우, 상술한 본 발명의 펩타이드의 약제학적 유효량(pharmaceutically effective amount)을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제화 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및/또는 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 및/또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약제학적 조성물은 비경구로 투여하는 것이 바람직하며, 예를 들어, 피부 국소 투여에 의해 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-1000 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 및/또는 젤(예를 들어, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 및/또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저색소증의 예방 및/또는 개선용 화장품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물이 화장품 조성물로 제조될 경우, 상술한 본 발명의 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount)을 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer . Chem . Soc . 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성 기술(US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "안정성"은 인 비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예를 들어, 상온 저장 안정성)도 의미한다.

본 발명에 있어서, "탈모 방지"는 모낭 또는 두피에서 모발이 탈락되는 현상이 저지되거나 약화되는 것을 의미한다.

본 발명에서 "발모 촉진"은 모발이 생성되는 것을 의미하며, 모발 생성 속도 및 생성량을 증가시키는 넓은 의미로 사용된다. 또한, 모근 기능이 강화되거나, 모발의 탈락 및 생성 주기가 짧아져 모낭에서 자라는 모발의 수가 증가되는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, "모발 성장" 또는 "육모"는 생성된 모발(머리카락)의 굵기가 증가되거나 길이 자람 속도에 영향을 미치는 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어 "화장품학적 유효량"은 상술한 본 발명의 조성물의 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 인간 모유두 세포(Human hair follicle dermal papilla cells, HHFDPC) 성장 촉진 효과를 나타낸 그래프이다.

도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 인간 모유두 세포(Human hair follicle dermal papilla cells, HHFDPC) 성장 촉진 효과를 나타낸 그래프이다.

도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 의해 β-카테닌 및 P-GSK3β의 발현이 증가되는 것을 확인한 결과를 보여주는 그림이다.

도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 의해 β-카테닌 및 P-GSK3β의 발현이 증가되는 것을 확인한 결과를 보여주는 그림이다.

도 3a는 본 발명의 일 실시예예 따른 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 의한 PI3K 발현 증가 및 ERK 인산화 증가를 확인한 결과를 보여주는 그림이다.

도 3b는 본 발명의 일 실시예예 따른 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 의한 PI3K 발현 증가 및 ERK 인산화 증가를 확인한 결과를 보여주는 그림이다.

도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 의한 Bcl-2의 발현 증가 및 Bax의 발현 감소를 확인한 결과를 보여주는 그림이다.

도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 의한 Bcl-2의 발현 증가 및 Bax의 발현 감소를 확인한 결과를 보여주는 그림이다.

도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 의한 케라틴-14의 발현 증가를 확인한 결과를 보여주는 그림이다.

도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 의한 케라틴-14의 발현 증가를 확인한 결과를 보여주는 그림이다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 의한 VEGF 및 KGF의 발현 증가를 확인한 결과를 보여주는 그림이다.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 의한 TGF-β1 발현 억제를 확인한 결과를 보여주는 그림이다.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 의한 MSX2 발현 증가를 확인한 결과를 보여주는 그림이다.

도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 의한 멜라닌 형성 증가 효과를 확인한 결과를 보여주는 그림이다.

도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 의한 멜라닌 형성 증가 효과를 확인한 결과를 보여주는 그림이다.

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 의해 MITF, 티로시나아제 및 TRP1의 mRNA 발현이 증가되는 것을 확인한 결과를 보여주는 그림이다.

도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 의해 MITF 및 티로시나아제의 단백질 발현이 증가되는 것을 확인한 결과를 보여주는 그림이다.

서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 발모 촉진 활성을 나타내는 펩타이드에 관한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

합성예 1: 펩타이드의 합성

클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ml를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF) 10 ml를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ml의 디클로로메탄용액을 넣고 Fmoc-Cys(Trt)-OH (Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM(dechloromethane)에 녹여 10분간 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF)를 10 ml 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine)/DMF) 10ml를 반응 용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, DMF로 1회 세척하여 Cys(Trt)-CTL Resin을 제조하였다. 새로운 반응기에 10 ml의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Ser(tBu)-OH (Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrin Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Ser(tBu)-Cys(Trt)-CTL Resin을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH 순으로 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 무수초산과 DIEA, HoBt를 넣어 한시간동안 아세틸화를 수행한 뒤 제조된 펩티딜 레진을 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P2O5 하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액[트리플로로화 초산(Trifluroacetic acid) 95%, 증류수 2.5%, 티오아니졸(Thioanisole) 2.5%] 30 ml을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2 시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를(Ala-Cys-Thr-Ser-Ser-Gln-Leu-Arg-Ser-Cys) 0.73 g 합성하였다(수율: 87.1%). 분자량 측정기를 이용하여 측정 시 분자량 1055.2 (이론값: 1055.19)를 얻을 수 있었다. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드도 위와 같은 방법으로 합성을 진행하였다.

서열 번호	서열 목록(5'->3')	분석값(질량분석기)
서열 번호	서열 목록(5'->3')	분석치	이론치
1	ACTSSQLRSC	1055.2	1055.19
2	KYLLVHRPYYRR	1664.0	1663.97

실시예 1: DPC 증식 어세이

인간 모유두 세포(Human hair follicle dermal papilla cells)를 2x103 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩한 후 밤새 배양하였다. 무혈청 배지로 바꿔준 후 펩타이드를 처리하여 3일간 배양하고 4 mg/ml MTT 용액을 100 ul씩 웰에 처리하여 4시간 반응시켰다. 생성된 포마잔을 DMSO 처리를 통해 녹여낸 후 마이크로플레이트 리더를 사용하여 560 nm에서의 흡광도를 측정하여, 그 결과를 도 1a 및 도 1b에 나타내었다.

도 1a 및 도 1b에서 확인할 수 있듯이, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 처리에 의해 인간 모유두 세포의 성장이 농도 의존적으로 촉진되는 것을 확인하였다.

실시예 2: β-카테닌 활성 시험

인간 모유두 세포를 4x105 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩한 후 밤새 배양하였다. 무혈청 배지로 바꿔준 후 펩타이드를 처리하여 15, 30분 배양하고 세포를 회수하여 핵과 세포질 단백질을 각각 분리하였다. β-카테닌 항체(santacruz biotechnology, USA)를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하여 β-카테닌 발현 양상을 비교하여, 그 결과를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.

도 2a 및 도 2b에서 확인할 수 있듯이, 인간 모유두 세포에서 β-카테닌의 활성 및 GSK3β 인산화 수준이 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 처리에 의해 증가되었다. β-카테닌 활성은 GSKβ 인산화에 따른 분해에 의해 복합체로부터 유리되면서 나타나는 반응으로 모발 성장 관련 분자의 발현을 증가시킨다.

실시예 3: PI3K & p-ERK WB

인간 모유두 세포를 4x105 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩한 후 밤새 배양하였다. 무혈청 배지로 바꿔준 후 펩타이드를 처리하여 15, 30분 배양하고 세포를 회수하여 세포 용해물을 준비하였다. PI3K 항체(santacruz biotechnology, USA) 및 phospho-ERK 항체(Cell Signaling Technology, USA)를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하여 단백질 발현 양상을 비교하여, 도 3a 및 도 3b에 나타내었다.

도 3a 및 도 3b에서 확인할 수 있듯이, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 처리에 의해 인간 모유두 세포의 성장에 영향을 주는 PI3K 발현 및 ERK 인산화 레벨이 증가되었다.

실시예 4: Bcl-2/Bax WB

인간 모유두 세포를 4x105 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩한 후 밤새 배양하였다. 무혈청 배지로 바꿔준 후 펩타이드를 처리하여 24시간 배양하고 세포를 회수하여 세포 용해물을 준비하였다. Bcl-2 및 Bax 항체(santacruz biotechnology, USA)를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하여 단백질 발현 양상을 비교하여, 그 결과를 도 4a 및 도 4b에 나타내었다.

도 4a 및 도 4b에서 확인할 수 있듯이, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 처리에 의해 인간 모유두 세포에서 항-세포사멸 단백질인 Bcl-2의 발현이 증가되었고, 세포 사멸 관련 단백질인 Bax의 발현이 감소되었다.

실시예 5: 케라틴-14 RT-PCR

인간 모유두 세포를 5x105 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩한 후 밤새 배양하였다. 무혈청 배지로 바꿔준 후 펩타이드를 처리하여 24시간 동안 배양하고 세포를 회수하여 RNA를 분리하였다. RNA 정량 후 cDNA 합성 키트(Intron, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하고 PCR 프리믹스(Intron, Korea) 및 케라틴-14 프라이머를 이용하여 PCR 진행 후 5% 아가로스 겔에 전기영동하여 각 샘플 처리 조건에서 상기 성장인자의 mRNA 발현 정도를 비교하여, 도 5a 및 도 5b에 나타내었다.

서열번호	프라이머 명명	서열목록(5'-3')
3	Keratin-14_F	CCACCTTTCATCTTCCCAATTCTC
4	Keratin-14_R	GTGCGGATCTGGCGGTTG

도 5a 및 도 5b에서 확인할 수 있듯이, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 처리에 의해 인간 모유두 세포에서 모발 성장 관련 인자인 케라틴-14의 mRNA 발현이 증가되는 것을 확인하였다.

실시예 6: KGF, VEGF RT-PCR

인간 모유두 세포를 4x10⁵ 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩한 후 밤새 배양하였다. 무혈청 배지로 바꿔준 후 펩타이드를 처리하여 24시간 동안 배양하고 세포를 회수하여 RNA를 분리하였다. RNA 정량 후 cDNA 합성 키트(Intron, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하고 PCR 프리믹스(Intron, Korea) 및 KGF, VEGF 각각의 프라이머를 이용하여 PCR 진행 후 5% 아가로스 겔에 전기영동하여 각 샘플 처리 조건에서 상기 성장인자들의 mRNA 발현 정도를 비교하여, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

서열번호	프라이머 명명	서열목록(5'-3')
5	KGF_F	TCTGTCGAACACAGTGGTACCT
6	KGF_R	GTGTGTCCATTTAGCTGATGCAT
7	VEGF_F	CCATGAACTTTCTGCTGTCTT
8	VEGF_R	TCGATCGTTCTGTATCAGTCT

도 6에서 확인할 수 있듯이, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 처리에 의해 인간 모유두 세포의 성장에 영향을 주는 VEGF 및 KGF의 발현이 증가되는 것을 확인하였다.

실시예 7: TGF-β1 RT-PCR

인간 모유두 세포를 4x10⁵ 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩한 후 밤새 배양하였다. 무혈청 배지로 바꿔준 후 펩타이드를 처리하여 24시간 동안 배양하고 세포를 회수하여 RNA를 분리하였다. RNA 정량 후 cDNA 합성 키트(Intron, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하고 PCR 프리믹스(Intron, Korea) 및 TGF-β1 프라이머를 이용하여 PCR 진행 후 5% 아가로스 겔에 전기영동하여 각 샘플 처리 조건에서 상기 성장인자들의 mRNA 발현 정도를 비교하여, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

서열번호	프라이머 명명	서열목록(5'-3')
9	TGF-β1_F	GCCCTGGATACCAACTATTGC
10	TGF-β1_R	TCAGCACTTGCAGGAGTAGCG

도 7에서 확인할 수 있듯이, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 처리에 의해 인간 모유두 세포에서 모발 성장 억제 인자 중 하나인 TGF-β1의 발현이 억제되는 것을 확인하였다.

실시예 8: MSX2 RT-PCR

인간 모유두 세포를 4x10⁵ 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩한 후 밤새 배양하였다. 무혈청 배지로 바꿔준 후 펩타이드를 처리하여 24시간 동안 배양하고 세포를 회수하여 RNA를 분리하였다. RNA 정량 후 cDNA 합성 키트(Intron, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하고 PCR 프리믹스(Intron, Korea) 및 MSX2 프라이머를 이용하여 PCR 진행 후 5% 아가로스 겔에 전기영동하여 각 샘플 처리 조건에서 상기 성장인자들의 mRNA 발현 정도를 비교하여, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

서열번호	프라이머 명명	서열목록(5'-3')
11	MSX2_F	AACACAAGACCAACCGGAAG
12	MSX2_R	GCAGCCATTTTCAGCTTTTC

도 8에서 확인할 수 있듯이, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 처리에 의해 인간 모유두 세포에서 모간(hair shaft) 신장(elongation)에 영향을 주는 인자인 MSX2의 발현이 증가되었다.

실시예 9: 멜라닌 측정 어세이

6-웰 배양용 평판에 멜라닌형성 세포(B16F10 cell line)를 37 배양기에서 24시간 배양한 후, 각 판의 배지를 제거하고 새로운 배지로 교체 후 본 펩타이드를 농도 별로 처리하였다. 72시간 동안 배양한 후 배양액을 제거하고 세포를 떼어 낸 뒤 1.5 ml 튜브로 옮겨 13,000rpm에서 3분간 원심분리 하여 상층액을 제거하고, 세포 펠렛을 회수하여 멜라닌을 관찰하였다. 세포 펠렛을 2 M NaOH 150 ul씩 넣어 60에서 30분 동안 세포 내 멜라닌을 용해시켰다. 96-웰 평판 각 웰에 용해시켜 얻은 상층액을 100 ul씩 넣어 490 nm에서 흡광도를 측정하여, 그 결과를 도 9a 및 도 9b에 나타내었다.

도 9a 및 도 9b에서 확인할 수 있듯이, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 처리에 의해 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성이 증가되었다.

실시예 10: 멜라닌 생성 관련 유전자 RT-PCR

멜라닌형성 세포(B16F10 세포주)를 6-웰 배양용 평판에 24시간 배양 후 펩타이드를 농도별로 처리하였다. 72시간 동안 배양된 세포의 RNA 추출 후 cDNA를 제작하였다. 멜라닌 형성에 관여하는 인자인 MITF 및 티로시나아제에 대한 각각의 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR 하여 각 유전자의 발현 변화를 관찰하여, 도 10에 나타내었다.

서열번호	프라이머 명명	서열목록(5'-3')
13	MITF_F	CCAGCCTGGCGATCATGTCAT
14	MITF_R	GGTCTGGACAGGAGTTGCTG
15	tyrosinase_F	GGCCAGCTTTCAGGCAGAGG
16	tyrosinase_R	TGGTGCTTCATGGGCAAAAT
17	TRP1_F	TCTGTGAAGGTGTGCAGGAG
18	TRP1_R	CCGAAACAGAGTGGAAGGTT

도 10에서 확인할 수 있듯이, 멜라닌 세포에 서열목록 제1서열의 펩타이드 처리 시 멜라닌 형성 과정에 관여하는 전사인자인 MITF 및 효소인 티로시나아제의 mRNA 발현이 증가되었다.

실시예 11: 멜라닌 생성 관련 단백질 웨스턴 블롯팅

멜라닌형성 세포(B16F10 세포주)를 6-웰 배양용 평판에 24시간 배양 후, 본 펩타이드를 농도별로 처리하였다. 72시간 동안 배양한 후 세포를 용해하여 멜라닌 형성에 관여하는 인자인 MITF 및 티로시나아제의 발현을 특이적인 항체(2종류 모두 Santacruz biotechnology, USA)를 이용하여 웨스턴 블롯으로 확인하여, 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에서 확인할 수 있듯이, 멜라닌 세포에 서열목록 제1서열의 펩타이드 처리 시 멜라닌 형성 과정에 관여하는 전사인자인 MITF 및 효소인 티로시나아제의 단백질 발현이 증가되었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명은 발모 촉진 활성 및/또는 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타내는 펩타이드, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 및/또는 개선용 조성물, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 발모 및/또는 육모 촉진용 조성물, 상기 펩타이드의 탈모 방지 및/또는 개선 용도, 상기 펩타이드의 발모 및/또는 육모 촉진 용도, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저색소증 예방 및/또는 치료용 약제학적 조성물, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저색소증의 예방 및/또는 개선용 화자품 조성물 및 상기 펩타이드의 멜라닌 저색소증 예방, 개선 및/또는 치료 용도에 관한 것이다.

Claims

서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 발모 촉진 활성을 나타내는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 모낭 세포 성장을 촉진하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 ?-카테닌 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 KGF(Keratinocyte Growth Factor) 및 VEGF(Vascular endothelial growth factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 발모 관련 성장인자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 PI3K(Phosphoinositide 3-kinase)의 발현 및 ERK(Extracellular Signal-regulated Kinase) 인산화를 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 MSX2(Msh homeobox 2) 및 케라틴-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 발모 관련 인자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 TGF-β1(transforming growth factor beta 1)의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 Bcl-2(B-cell lymphoma 2)의 발현을 증가시키고 Bax(BCL2-associated X protein)의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 개선용 조성물.
서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 발모 또는 육모 촉진용 조성물.
서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타내는 펩타이드.
제11항에 있어서, 상기 펩타이드는 MITF(Microphthalmia-associated transcription factor) 및 TRP1(Tyrosinase-related protein 1)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 멜라닌 합성 관련 인자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제11항에 있어서, 상기 펩타이드는 티로시나아제의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저색소증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제14항에 있어서, 상기 저색소증은 백반증, 백색증, 탈색소 모반, 백색 비강진, 어루러기, 염증후 탈색증, 반상 경피증, 부분 백피증, 특발성 적상 저색소증 또는 점상 백피증인 것을 특징으로 하는 멜라닌 저색소증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.