CN110467650B

CN110467650B - 促进黑色素生成的肽及其方法

Info

Publication number: CN110467650B
Application number: CN201910639421.1A
Authority: CN
Inventors: 徐和; 徐频; 黄敏铨
Original assignee: Hehe Industrial Co ltd
Current assignee: Hehe Industrial Co ltd
Priority date: 2019-07-16
Filing date: 2019-07-16
Publication date: 2022-12-30
Anticipated expiration: 2039-07-16
Also published as: CN110467650A

Abstract

本发明关于一种促进黑色素生成的肽及其方法。该用于在哺乳类个体中促进黑色素生成的分离或合成的肽是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所组成。本发明亦关于该肽用促进黑色素生成的方法、组合物、及用途。

Description

促进黑色素生成的肽及其方法

技术领域

本发明关于一种肽(peptide)，特别是用于促进黑色素生成的肽。

背景技术

头发的颜色是由毛囊里的黑色素(Melanin)所影响。黑色素分成真黑色素及嗜铬黑色素，两者的比例便是影响毛发颜色的主因。若真黑色素比例较多时，毛发呈现黑色或深褐色；若嗜铬黑色素比例多一些，则毛发颜色呈现黄色或红色。而基因便决定了两黑色素的比例。以东方人而言，较多为黑发，而西方人则较多金发或是红褐色发。

随着年纪增长，毛囊里的色素细胞开始老化，黑色素产量降低，毛发渐白。尽管造成毛发渐白的原因许多，但造成色素细胞退化的真正原因仍然不清楚。逐渐变白的发色易让人失去自信心，或是不符合亚洲人的审美标准。

有文献指出，过去曾有人的整头白发在罹患了乳麋泻并经过无麸质饮食之后发色逐渐变黑。近年来研究还指出，退化的色素细胞其实仍存在着潜伏性黑色素细胞；这些潜伏性细胞平常不制造黑色素，但予以适当的刺激后可分化成具制造黑色素能力的健康黑色素细胞。

发明内容

为达上述促进黑色素生长的目的，本发明提供一种用于促进黑色素生成的分离或合成的肽，是由SEQ ID NO:1的序列所组成，可刺激黑色素的生成。

本发明又提供一种包含SEQ ID NO:1的序列的肽用于制备促进黑色素生成的组合物及其用途。

本发明再提供一种促进黑色素生成的方法，包含将本发明的肽对一所需个体或细胞投予有效剂量，以刺激该个体生成黑色素。该有效剂量为可促使该所需个体显著产生黑色素的剂量。该所需个体可以为白发转为黑发的个体、天生发色偏浅的个体、及/或希望使肌肤肤色更深的个体。

本发明进一步提供一种使用本发明的肽制备促进黑色素生成的组合物。该组合物包含本发明所提供的SEQ ID NO:1及可接受的载体。该组合物的形式可包括软膏、乳液、乳霜、凝胶、滴剂、喷雾、液剂、洗发剂或护发剂。

本发明的优点在于：本发明所提供的包含SEQ ID NO：1的肽的组合物能够刺激黑色素生成，并且增加个体内黑色素细胞中的黑色素含量。

附图说明

图1为细胞经离心后聚集成细胞团块图；

图2为黑色素(Melanin)含量分析结果(*P＜0.05；**P＜0.01)；

图3为酪氨酸酶活性分析结果；及

图4为细胞存活率的结果。

具体实施方式

为让本发明上述及/或其他目的、功效、特征更明显易懂，特举具体实施例详细说明于下。惟，本发明是经由下列实施例为进一步说明，但并非用以限制本发明的内容。

在本发明的方法的一实例中，该肽是局部地投予至该个体。

在另一方面，本发明提供一种用于促进生成黑色素的组合物，其包含有效量的具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽。该组合物可以有效促进黑色素生成。

在本发明的特定具体实施例中，该组合物进一步包含一生理上可接受的载体。

除非另有定义，本文使用的所有技术及科学术语具有与本发明所属领域中的通常知识者所理解相同的含义。

用语「一」或「一个」在申请专利范围及/或说明书中与术语「包含」一起使用时，其意思可为「一个」，但其亦与「一或多个」、「至少一个」以及「一或多于一个」的含义一致。

用语「肽」在本文中是以其常规含义而被使用，亦即为一种聚合物，其单体为氨基酸，并藉由酰胺键而互相连结在一起，另可选择地，其是指多肽(polypeptide)。当该氨基酸为α-氨基酸时，可使用L-光学异构物或D-光学异构物。此外，亦可包含非天然的氨基酸，例如，β-丙氨酸、苯甘氨酸及高精氨酸。使用氨基酸的标准缩写。

本文中所使用的术语「载体」是指一般用于调制可增进稳定性、无菌性、递送性的药物或化妆品组合物的材料。当肽递送系统调制为一种溶液或悬浮液时，该递送系统是于一可接受载体中，较佳地为水性载体。可使用多种水性载体，例如，水、缓冲液、0.8％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。该组合物可含有如所需要而可接近生理条件的生理上可接受的辅助物质，例如pH调整及缓冲剂、溶液张力调节剂、润湿剂及其类似物，例如，乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨醇酐单月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。

用语「局部的」或「局部地」在本文中是以其常规含义而被使用，其是指可以在身体任何部位内或上的位置，包括但不限定于表皮、任何其他真皮、或任何其他身体组织。局部地投予或施予意指使该肽直接与组织接触，例如含有黑色素生成细胞的皮肤、膜、毛囊。

本发明使用具有SEQ ID NO:1的肽作为针对各种用途的活性成分。在一具体实施例中，本发明的肽是与一可接受的载体组合而形成一种可置放于毛发或皮肤上的局部用制剂。局部用制剂可包括软膏、乳液、糊剂、乳霜、凝胶、滴剂、塞剂、喷雾、液剂、洗发剂、护发剂、粉末及经皮贴片。根据需要，可使用增稠剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂。较佳地，载体的功能为增加本发明肽的皮肤渗透性，并且在体内条件下应能将该肽递送至黑色素细胞。对于本领域技术人员而言，合适的载体为习知，且其包括但不限于水、二甲基亚砜、乙醇、脂质体、液体石蜡、石蜡、二甲基甲酰胺、2-吡咯烷酮、油酸、渗透增进剂。

通过以下实例进一步说明本发明，所述实例是以提供例示性的目的提供而非限制。

细胞培养

解冻细胞

使用的细胞为B16F10小鼠色素瘤细胞株。开启水浴槽使其温度到达37℃，并准备已回温(37℃)的培养液，从液态氮桶取出冷冻小管，并快速移至水浴槽解冻。将1ml培养液加入冷冻小管内充分混匀，并吸取至15ml离心管。接着以700-800rpm/5分钟离心该离心管，除去上清液后加入1ml培养液使之混匀，再移到10cm培养皿。接着补9ml培养液到培养皿中，放置于37℃含5％CO₂的细胞培养箱。

细胞传代

首先，先吸除10cm培养皿中的培养液，再用1X PBS润洗细胞两次。于培养皿中央加1ml的Trypsin-EDTA并轻摇培养皿使Trypsin-EDTA均匀覆盖表面，接着放于培养箱5分钟。拿出培养皿并轻拍，肉眼可观察到黑色团块(细胞)被打下。加1ml培养液于该培养皿以中和Trypsin-EDTA作用，并将细胞收集至15ml离心管。以700-800rpm室温离心2分钟，移除上清液并轻拍管子，视实验需求加适量培养液。最后将混匀的细胞悬浮液分配到新的培养容器，放回37℃含5％CO₂细胞培养箱中。

细胞计数

移除培养液的细胞经润洗、Trypsin-EDTA和离心后悬浮在适量培养液中，取10μl的细胞液至1.8ml微量管，再注入到细胞计数器。在显微镜100倍视野下有九大格面积1mm²，深度为0.1mm的正方形，因此总体积为0.1mm³＝1×10⁴ml。选取其中两格细胞分布较平均做计数，将数值除以2再乘以10⁴，得出的数值即为1ml细胞液中所含细胞数量。

肽制备

肽序列为DIHMKQV(SEQ ID NO:1)，其组成和纯度由高效液相层析质谱仪做确认。以5mg肽粉末溶在0.1ml的二次去离子水(50mg/ml)，并储存在-20℃冰箱。

黑色素含量分析

将8×10³的B16F10细胞接种至24孔盘，隔天加入浓度1、2、5、10μg/ml的SEQ IDNO：1的肽，作用72小时后移除培养液细胞，经润洗、Trypsin-EDTA收集到1.8ml微量管，并以2500rpm室温离心5分钟。拍照记录细胞团块后，每管微量加入200μl的2N NaOH，并在100℃加热器作用1小时，以405nm测吸光值。藉由比较测试样品在405nm处的吸光值和使用合成黑色素获得的标准曲线来分析黑色素含量。

其结果如图1所示，细胞经离心后聚集成细胞团块，显示SEQ ID NO：1的肽是以浓度依赖的方式显著地促使黑色素生成。控制组为未加入本发明的肽处理的组别；以磷酸二酯酶抑制剂(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)(100μM)作为正控制组。

图2为黑色素的含量分析。将细胞用2N的NaOH溶解后，测吸光值405nm，实验结果发现，浓度1和2μg/ml处理的组别相较控制组会分别促进了31.2％及42.5％的黑色素生成；而浓度5以及10μg/ml则是更显著地分别促进了55.6％和76.6％的黑色素生成，且黑色素生成量会随着肽浓度增加而增加。

酪氨酸酶(Tyrosinase)活性分析

将4×10⁴的B16F10细胞接种至6孔盘，隔天加入浓度5、10μg/ml的含SEQ ID NO：1的肽作用72小时后，吸除培养液后将细胞溶在200μl含1％Triton X-100的phosphatebuffer(pH 6.8)，并收集到1.8ml微量管，置于-80℃中1小时后取出。待其解冻后以14000rpm/4℃离心10分钟。收集含蛋白质的上清液，并用Bradford assay测定蛋白质浓度。取等量蛋白质在96孔盘配成100μl的蛋白质液，接着每孔加100μl的5mM L-DOPA，于37℃培养箱中反应30分钟，再以450nm测吸光值。

结果如图3所示，以5及10μg/ml量的SEQ ID NO：1的肽处理的细胞显著增加酪氨酸酶活性。

细胞存活率分析(MTT assay)

将1×10³的细胞接种至96孔盘，隔天加入浓度10、50、100、200μg/ml的SEQ ID NO：1的肽作用48小时后，加入100μl的Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide(MTT)，使最终浓度为0.5mg/ml。作用3小时后加入100μl含有0.01的HCl的10％SDS。隔天确认结晶彻底溶解后，测定在550-630nm下的吸光值。

结果如图4所示，经SEQ ID NO：1的肽处理不影响B16F10细胞的存活力。

综合上述可知SEQ ID NO：1的肽确实能够刺激黑色素生成，并且增加个体内黑色素细胞中的黑色素含量，但并非由B16F10细胞的存活力的改善而引起。

SEQUENCE LISTING

<110> 和和实业股份有限公司

<120> 促进黑色素生成的肽及其方法

<130> 2217-001.19P1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 促进黑色素生成的肽

<400> 1

Asp Ile His Met Lys Gln Val

1 5

Claims

1.一种用于促进黑色素生成的分离或合成的肽，是由SEQ ID NO:1的序列所组成。

2.一种如权利要求1所述的肽用于制备促进黑色素生成的组合物的用途。

3.如权利要求2所述的用途，其中该肽具有一使该黑色素显著地生成的有效剂量。

4.一种组合物，包含如权利要求1所述的肽，及一生物体可接受的载剂。

5.如权利要求4所述的组合物，该组合物的形式包含软膏、乳液、乳霜、凝胶、滴剂、喷雾、液剂、洗发剂或护发剂。