KR20240032212A

KR20240032212A - 티로시나아제 활성을 촉진하는 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20240032212A
Application number: KR1020220109842A
Authority: KR
Inventors: 박정범; 박주황
Original assignee: 주식회사 하이센스바이오
Priority date: 2022-08-31
Filing date: 2022-08-31
Publication date: 2024-03-12
Also published as: WO2024049238A1

Abstract

본 발명에 따른 티로시나아제 활성 촉진용 조성물은 하기 일반식 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 포함한다: K-Y-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 (일반식 1), 상기 일반식 1에서, R1은 아르기닌(R), 리신(K) 또는 글루타민(Q)이고; R2는 아르기닌(R) 또는 글루타민(Q)이며; R3, R4 및 R5는 각각 아르기닌(R) 또는 리신(K)이고; R6는 아스파라긴(N) 또는 세린(S)이며; 및 R7 및 R8은 리신(K) 또는 타이로신(Y)이다. 본 발명에 따른 조성물은 멜라닌 세포 내에서의 멜라닌 생성을 촉진함으로써 멜라닌 저색소증을 예방, 개선하거나 또는 치료할 수 있다.

Description

티로시나아제 활성을 촉진하는 펩타이드 및 이의 용도{PEPTIDES FOR PROMOTING ACTIVITY OF TYROSINASE AND USE THEREOF}

본 발명은 티로시나아제의 활성을 촉진하는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 멜라닌 저색소증을 예방하거나 또는 치료하기 위한 멜라닌 세포 내에서의 티로시나아제의 활성을 촉진하는 펩타이드 및 이의 용도에 대한 것이다.

멜라닌 세포(melanocyte)는 피부 표피층에 존재한다. 멜라닌(melaine)은 자연계에 널리 분포하는 페놀류의 고분자 물질로 검은 색소와 단백질의 복합체이다. 멜라닌생성과정(melangenesis)을 살펴보면 멜라닌은 멜라닌 세포 내의 소기관인 멜라노좀(melanosome)에서 합성된다.

멜라닌 세포는 가지형(dendrite)으로 뻗어 있으며, 그 주위를 각질세포(keratinocyte)가 둘러싸고 있다. 멜라닌 세포는 멜라노좀을 형성하고 이것을 각질세포로 전달하게 된다. 멜라닌 색소가 축적된 멜라노좀은 멜라닌 세포의 수지상 돌기를 통해 올라가 피부세포를 만드는 각질세포를 감싸도록 배열됨으로써 각질세포의 DNA가 자외선 등에 의하여 파괴되는 것을 방지하는 역할을 한다.

멜라닌은 멜라닌 세포 내에서 티로신(tyrosine)이라는 아미노산으로부터 출발하여 엘도파(L-DOPA; 3,4-dihydrocyphenylalanin)로, 그리고 엘도파가 다시 산화하여 도파퀴논(DOPA-quinone)이 생성되는 단계를 통하여 합성된다. 도파퀴논은 시스테닐도파(cysteinyDOPA)를 거쳐 페오멜라닌(Pheomelanin)이 된다. 그러나 시스테인(Cystein)의 결핍 조건에서는 도파퀴논은 비효소적 작용으로 도파크롬(DOPAchrome)이 된다. 도파크롬은 두 가지의 방법을 통하여 유멜라닌(eumelanin)이 되는데 하나는 TRP1과 TRP2가 작용하는 효소적인 과정이고 다른 하나는 비효소적 과정이다. 이렇게 생성된 멜라닌은 멜라닌 세포의 수지상돌기(dendrite)에 의해 멜라노좀이라는 소포체 형태로 주변의 각질형성세포로 전달이 되어 표피에 골고루 퍼지게 된다.

한편, 백반증은 피부의 멜라닌 세포 결핍으로 피부의 색깔이 소실되어 피부에 흰색으로 보이는 탈색반이 나타나는 피부 질환으로 후천적으로 발현하는 병이다. 백반증의 임상적인 특징은 흰색 반점이 발달하는 것이다. 이는 멜라닌 세포의 손상에 의한 것이지만 멜라닌 세포가 손상되는 명확한 원인은 불분명하며, 원인에 대한 다양한 가설이 존재하는데, 유전적 요인, 자가면역, 산화스트레스 혹은 유해 화학물질들이 원인으로 추정되고 있다.

인체에서 백반증이 나타나는 흔한 부위는 얼굴과 신체 말단이다. 백반증으로 인한 피부의 탈색은 외모에 영향을 미치므로 대인관계 등에 있어서 스트레스의 원인이 될 수 있는데, 실제로 백반증으로 인한 스트레스가 정신질환의 위험을 상당히 증가시키는 것으로도 알려져 있다. 백반증의 전세계적인 유병율은 약 0.5 ~ 1% 정도이고, 남성과 여성의 유병률은 거의 동일한 수준으로 알려져 있으며, 성별에 따른 차이가 존재하는데 여성의 경우 남성에 비하여 좀더 더 이른 시기에 발병한다고 알려져 있다.

멜라닌의 축적은 자외선 등 광에 의하여 촉진되기도 하므로 이러한 원리를 이용한 광선치료법은 1800년대부터 백반증 환자를 치료하는데 사용되었다. 광선치료법은 피부 표피층의 멜라닌 세포의 이동 및 증식을 촉진하여 멜라닌 세포 성장에 유리한 환경을 제공하며 자가면역을 억제한다는 몇몇 연구결과가 있다. 자외선(UVB)을 조사하는 광선요법은 가려움증, 작열감, 홍반, 일시적인 과색소침착, 수포, 건조증 등의 부작용이 있으며, 모든 광선요법은 조기 광노화를 유발할 수 있다고 알려져 있으므로 장기적인 치료방법으로 사용이 곤란하다.

백반증은 코르티코스테로이드(corticosteroid) 요법을 통하여 알려져 있다. 코르티코스테로이드는 항염증 작용을 하는 모든 스테로이드를 일컫는 용어이다. 앞서 기술한 광선치료와 같이 사용하였을 때 더 좋은 결과를 보여준다. 코르티코스테로이드 요법은 색소침착을 유발하고 병의 진행을 중단시킨다. 그러나 표피위축, 스테로이드 모낭염, 모세혈관 확장증 등의 부작용이 발생하며 전신요법으로 사용하였을 시는 불면증, 여드름, 월경장애, 체중증가 등의 부작용이 나타날 수 있다. 이러한 부작용의 우려로 인해 코르티코스테로이드 요법은 정기적인 휴식기를 필요로 한다.

또다른 치료방법은 외과적 치료법으로 표피이식술, 세포이식술 등이 시도되지만 아직 보편적으로 사용되지는 않으며 넓은 범위를 치료할 수가 없고, 흉터, 감염, 이식 실패 등의 부작용이 있다. 이식한 세포에서도 다시 백반증이 일어나는 경우에는 이러한 요법은 백반증을 더 악화시킬 수 있다.

본 발명은 멜라닌 세포 내에서의 티로시나아제의 활성을 촉진함으로써 멜라노좀의 형성을 촉진하는 펩타이드 및 이의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 멜라닌 세포 내에서의 티로시나아제의 활성을 조절하여 피부에 탈색반이 형성되는 멜라닌 저색소증을 예방할 수 있는 펩타이드 및 이의 용도를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

본 발명은 멜라닌 세포 내에서의 멜라닌 생성을 촉진함으로써 멜라닌 저색소증을 개선하거나 또는 치료할 수 있는 펩타이드 및 이의 용도를 제공하는 것을 또다른 목적으로 한다.

본 발명은 멜라닌 세포 내에서의 멜라닌 합성과정에서 엘도파가 도파퀴논으로 산화되는 과정을 촉진하도록 하는 펩타이드 및 이의 용도를 제공하는 것을 또다른 목적으로 한다.

본 발명의 목적은 이상에서 언급한 것으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 기술적 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 양상에 따르면, 하기 일반식 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 포함하는, 티로시나아제 활성 촉진용 조성물이 제공된다:

K-Y-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 (일반식 1)

상기 일반식 1에서,

R1은 아르기닌(R), 리신(K) 또는 글루타민(Q)이고;

R2는 아르기닌(R) 또는 글루타민(Q)이며;

R3, R4 및 R5는 각각 아르기닌(R) 또는 리신(K)이고;

R6는 아스파라긴(N) 또는 세린(S)이며; 및

R7 및 R8은 리신(K) 또는 타이로신(Y)이다.

본 발명의 다른 양상에 따르면, 일반식 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 포함하는, 멜라닌 합성 조절용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또다른 양상에 따르면, 일반식 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 포함하는, 멜라닌 저색소증 예방, 개선 또는 치료용 조성물이 제공된다.

티로시나아제의 활성을 촉진할 수 있는 효과를 나타낼 수 있는 한, 이를 구성하는 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 변이체 펩타이드도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 범주에 포함된다.

일반적으로, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 펩타이드의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 멜라노좀의 합성촉진능이 증가한 펩타이드를 포함할 수 있다.

예를 들어, 본 발명에서 제공하는 서열번호 1의 펩타이드의 3번에 위치한 산성 아미노산인 글루타민은 염기성 아미노산인 리신 또는 아르기닌으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있고; 서열번호 1의 펩타이드의 4번 또는 5번에 위치한 염기성 아미노산인 아르기닌은 산성 아미노산인 글루타민 또는 염기성 아미노산인 리신으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있으며; 서열번호 1의 펩타이드의 6번, 7번 또는 9번에 위치한 염기성 아미노산인 리신은 염기성 아미노산인 아르기닌 또는 방향족 아미노산인 타이로신으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있고; 서열번호 1의 펩타이드의 8번에 위치한 산성 아미노산인 아스파라긴은 중성 아미노산인 세린으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있으며; 서열번호 1의 펩타이드의 10번에 위치한 방향족 아미노산인 타이로신은 염기성 아미노산인 리신으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있다.

이처럼, 본원발명의 펩타이드를 구성하는 산성 아미노산, 염기성 아미노산 또는 방향족 아미노산은 각각 이와 다른 산성 아미노산, 염기성 아미노산, 중성 아미노산 또는 방향족 아미노산으로 치환되어도, 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 펩타이드를 구성하는 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 변이체 펩타이드도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 범주에 포함됨은 자명하다.

또한, 본 발명의 펩타이드는 그의 N-말단 또는 C-말단에 임의의 아미노산이 부가된 형태를 갖더라도, 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있으므로, 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 범주에 포함된다. 일 예로서, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 1 내지 300개의 아미노산이 부가된 형태가 될 수 있고, 다른 예로서, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 1 내지 100개의 아미노산이 부가된 형태가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 1 내지 24개의 아미노산이 부가된 형태가 될 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 이용하여 합성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기서열을 포함할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터를 포함하는 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 상기 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "발현벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되고, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내어야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

본 발명의 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 펩타이드의 분리를 촉진하기 위하여 상기 펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널 및 개시코돈은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.

아울러, 상기 발현벡터는 상기 펩타이드의 검출이 용이하도록 하기 위하여, 임의로 엔도펩티다아제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "태그(tag)"란, 정량가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 의미하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광분자일 수도 있고; Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그, 스트랩타비딘 태그 등의 에피톱 태그일 수도 있다. 특히, 에피톱 태그를 사용할 경우, 바람직하게는 6개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 보다 바람직하게는 8개 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 태그를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 상술한 본 발명의 티로시나아제의 활성을 촉진하는 효과를 제공하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는데, 이때 사용되는 벡터는 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등)가 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.

본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 본 발명에서 제공하는 발현벡터를 숙주에 도입하여 형질전환시킴으로써 제작될 수 있고, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 상기 펩타이드를 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 형질전환제의 제작에 사용되는 숙주 역시 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균, 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로소필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.

상기 형질전환체는 또한 본 발명의 티로시나아제의 활성을 촉진하는 효과를 제공하는 펩타이드를 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 티로시나아제의 활성을 촉진하는 효과를 제공하는 펩타이드를 생산하는 방법은 (a) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 배양물로부터 본 발명의 펩타이드를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 티로시나아제의 활성을 촉진하는 효과를 제공하는 펩타이드를 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산 암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 상기 펩타이드의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 100 시간에서 달성된다.

아울러, 배양물로부터 상기 펩타이드를 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 상기 펩타이드의 회수에 사용될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 용어 "예방"이란, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 멜라닌 저색소증 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여로 멜라닌 저색소증의 발생을 저해 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어 "치료"란, 본 발명의 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물을 멜라닌 저색소증의 치료가 요구되는 개체에 투여하여 멜라노좀의 합성을 촉진함으로써, 멜라닌 저색소증의 치료가 수행되도록 하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 약학 조성물은, 상기 펩타이드에 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체(자연적 또는 비자연적 담체), 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 멜라닌 저색소증 치료용 약학 조성물의 형태로 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 멜라닌 저색소증이 유발된 부위에 투여할 수 있는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 콜라겐 등을 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 특히, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제, 연고제(예를 들어, 치수이장재 등) 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 포함된 상기 펩타이드의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.

상기 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로로 투여하거나 공지된 멜라닌 저색소증 치료용 약학 조성물과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng 내지 약 100 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 10 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명은 다른 하나의 양태로서 상기 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 멜라닌 저색소증이 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 멜라닌 저색소증 치료방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "백반증(vitiligo)"이란 색소세포의 파괴로 인하여 여러 가지 크기와 형태의 백색 반점이 피부에 나타나는 후천적 탈색소성 질환을 의미한다.

본 발명의 용어 "백모증(poliosis)”이란 머리카락, 눈썹, 속눈썹에서 멜라닌(또는 색소)이 감소하거나 사라지는 탈색소성 질환을 의미한다.

본 발명의 용어 "개체"란 멜라닌 저색소증의 치료가 요구되는 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물 등을 제한 없이 포함할 수 있으나, 상기 질환이 발병된 개체 중에서 인간을 제외할 수 있다.

본 발명의 멜라닌 저색소증 치료용 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 경구, 경피(trandermally), 정맥, 근육, 피하주사에 의해 투여될 수 있다. 상기 약학 조성물은 주사제, 피부 외용 용액제, 현탁제, 유액제, 겔, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제형은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있으며, 계면 활성제, 부형제, 수화제, 유화 촉진제, 현탁제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제, 착색제, 향신료, 안정화제, 방부제, 보존제 또는 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 멜라닌 저색소증 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어, "개선"이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 개선은 본 발명의 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물을 멜라닌 저색소증의 치료가 요구되는 개체에 투여하여 멜라노좀의 합성을 촉진함으로써, 멜라닌 저색소증의 증상이 호전되거나 또는 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명의 용어 "의약외품"이란, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유ㆍ고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병을 막기 위한 살균ㆍ살충제 등이 이에 포함된다.

본 발명에 있어서, 상기 펩타이드를 포함하는 의약외품 조성물의 종류나 제형은 특별히 제한되지 않으나, 일 예로서, 피부 또는 모발용 소독 청결제, 피부 또는 모발 청정용품, 비누, 샴푸, 피부용 연고제 등일 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 멜라닌 저색소증 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어, "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 식품은 멜라닌 저색소증의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다.

구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 본 발명의 펩타이드를 음료, 차류, 향신료, 껌류, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.

본 발명의 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 멜라닌 저색소증의 예방 또는 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있으므로, 매우 유용하게 사용될 수 있다.

상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 내지 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 내지 0.03 g이 될 수 있다.

상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 식품 조성물은 멜라닌 저색소증의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 구체적으로 본 발명의 펩타이드를 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 실시예에 따른 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물은 멜라닌 세포 내에서 멜라노좀의 형성에 관여하는 티로시나아제의 활성을 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물은 멜라닌 세포 내에서의 티로시나아제의 활성을 조절하여 피부에 탈색반이 형성되는 멜라닌 저색소증을 예방할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물은 멜라닌 세포 내에서의 멜라닌 생성을 촉진함으로써 멜라닌 저색소증을 개선하거나 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물은 멜라닌 세포 내에서의 멜라닌 합성과정에서 엘도파가 도파퀴논으로 산화되는 과정을 촉진할 수 있다.

본 발명의 효과는 이상에서 언급한 것으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 B16F10세포를 6well plate에 230,000cell/well로 분주하고 37도 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한후, 이어서 펩타이드 KH001(서열번호 96)를 농도별로 72시간 처리하여 세포를 준비하였고, 세포 pellet을 강염기 용액에 녹인 후 405nm 흡광도에서 측정한 결과를 도시한 것으로 (a) 펩타이드의 처리 농도별 멜라닌 함량(%) 및 (b) 펩타이드의 처리 농도별 멜라닌 생성정도를 비교한 것이다.
도 2는 B16F10세포를 6well plate에 230,000cell/well로 분주하고 37도 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한후, 이어서 펩타이드 KH001(서열번호 96)를 농도별로 72시간 처리하여 세포를 준비하였고, 이어서 세포를 고정하고 L-DOPA와 반응시켜 생성된 생성물을 광학현미경으로 관찰하여 티로시나아제 활성(Tyrosinase activity)을 나타내는 것이다.
도 3은 B16F10세포를 6well plate에 230,000cell/well로 분주하고 37도 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, KH001 펩타이드를 농도별로 50uM, 100uM, 200uM 처리하고 72시간 배양하고, 세포를 PBS로 세척하고 1% triton X가 함유된 0.1M potassium phosphate buffer(pH 6.8) 100μl로 세포를 모두 용해시킨 후 1.5ml tube에 담아 12000rpm에서 20min 원심분리 하여 상층액을 40μl를 취하여 2mg/ml L-DOPA 용액(0.1M potassium phosphat pH7.0) 200μl과 37도에서 30분 반응시킨 후 이어서 475nm에서 흡광도를 측정하여 티로시나아제 활성(tyrosinse activity)을 측정한 값(세포 용해액의 단백질 농도로 보정하였음)이다.
도 4는 B16F10세포를 6well plate에 230,000cell/well로 분주하고 37도 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, KH001 펩타이드를 농도별로 50uM, 100uM, 200uM 처리하고 72시간 배양한 것으로, 이때 각 well의 media의 흡광도를 405nm에서 측정하여 분비된 멜라닌(secreted melanin)을 정량한 결과이다.
도 5는 KH001 펩타이드를 B16F10 세포에 50uM, 100uM, 200uM의 농도로 처리한 한 후 72시간 째에 MTT Assay를 하여 cell viability를 측정한 결과이다.

본 발명의 목적 및 효과, 그리고 그것들을 달성하기 위한 기술적 구성들은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 본 발명을 설명함에 있어서 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다. 그리고 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기증을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있다.

그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있다. 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.

이하에서는 본 발명의 실시예에 대하여 구체적으로 설명하기로 한다.

실시예 1: 펩타이드의 합성

본 발명자들은 티로시나아제 활성 촉진 효과를 나타내는 펩타이드(서열번호 1)를 9-플루오르닐메틸옥시카보닐(9-fluorenylmethyloxycarbonyl, Fmoc) 방법으로 합성하고, 상기 합성된 펩타이드의 아미노산을 치환하여 각 그룹의 펩타이드를 합성하였다(표 1 내지 12).

N-KYQRRKKNKY-C(서열번호 1)

먼저, 그룹 1의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드 또는 상기 서열번호 1의 펩타이드의 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 1).

서열번호	아미노산 서열(N-C)
1 2 3 4 5 6 7 8	KYQRRKKNKY KYQRRKRNKY KYQRRRKNKY KYQRRRRNKY KYQRKKKNKY KYQRKRKNKY KYQRKKRNKY KYQRKRRNKY

다음으로, 그룹 2의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하여 합성하였다(표 2).

서열번호	아미노산 서열(N-C)
9 10 11 12 13 14 15 16	KYQRRKKSKY KYQRRKRSKY KYQRRRKSKY KYQRRRRSKY KYQRKKKSKY KYQRKRKSKY KYQRKKRSKY KYQRKRRSKY

다음으로, 그룹 3의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하여 합성하였다(표 3).

서열번호	아미노산 서열(N-C)
17 18 19 20 21 22 23 24	KYQRRKKNYK KYQRRKRNYK KYQRRRKNYK KYQRRRRNYK KYQRKKKNYK KYQRKRKNYK KYQRKKRNYK KYQRKRRNYK

다음으로, 그룹 4의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하며, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하고, 10번 아미노산을 리신으로 치환하여 합성하였다(표 4).

서열번호	아미노산 서열(N-C)
25 26 27 28 29 30 31 32	KYQRRKKSYK KYQRRKRSYK KYQRRRKSYK KYQRRRRSYK KYQRKKKSYK KYQRKRKSYK KYQRKKRSYK KYQRKRRSYK

다음으로, 그룹 5의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아르기닌으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 5).

서열번호	아미노산 서열(N-C)
33 34 35 36 37 38 39 40	KYRQRKKNKY KYRQRKRNKY KYRQRRKNKY KYRQRRRNKY KYRQKKKNKY KYRQKRKNKY KYRQKKRNKY KYRQKRRNKY

다음으로, 그룹 6의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아르기닌으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하여 합성하였다(표 6).

그룹 6의 펩타이드

서열번호	아미노산 서열(N-C)
41 42 43 44 45 46 47 48	KYRQRKKSKY KYRQRKRSKY KYRQRRKSKY KYRQRRRSKY KYRQKKKSKY KYRQKRKSKY KYRQKKRSKY KYRQKRRSKY

다음으로, 그룹 7의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아르기닌으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하며, 10번 아미노산을 리신으로 치환하여 합성하였다(표 7).

서열번호	아미노산 서열(N-C)
49 50 51 52 53 54 55 56	KYRQRKKNYK KYRQRKRNYK KYRQRRKNYK KYRQRRRNYK KYRQKKKNYK KYRQKRKNYK KYRQKKRNYK KYRQKRRNYK

다음으로, 그룹 8의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아르기닌으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하며, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하고, 10번 아미노산을 리신으로 치환하여 합성하였다(표 8).

서열번호	아미노산 서열(N-C)
57 58 59 60 61 62 63 64	KYRQRKKSYK KYRQRKRSYK KYRQRRKSYK KYRQRRRSYK KYRQKKKSYK KYRQKRKSYK KYRQKKRSYK KYRQKRRSYK

다음으로, 그룹 9의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 리신으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 9).

서열번호	아미노산 서열(N-C)
65 66 67 68 69 70 71 72	KYKQRKKNKY KYKQRKRNKY KYKQRRKNKY KYKQRRRNKY KYKQKKKNKY KYKQKRKNKY KYKQKKRNKY KYKQKRRNKY

다음으로, 그룹 10의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 리신으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하여 합성하였다(표 10).

서열번호	아미노산 서열(N-C)
73 74 75 76 77 78 79 80	KYKQRKKSKY KYKQRKRSKY KYKQRRKSKY KYKQRRRSKY KYKQKKKSKY KYKQKRKSKY KYKQKKRSKY KYKQKRRSKY

다음으로, 그룹 11의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 리신으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하며, 10번 아미노산을 리신으로 치환하여 합성하였다(표 11).

서열번호	아미노산 서열(N-C)
81 82 83 84 85 86 87 88	KYKQRKKNYK KYKQRKRNYK KYKQRRKNYK KYKQRRRNYK KYKQKKKNYK KYKQKRKNYK KYKQKKRNYK KYKQKRRNYK

끝으로, 그룹 12의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 리신으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하며, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하고, 10번 아미노산을 리신으로 치환하여 합성하였다(표 12).

서열번호	아미노산 서열(N-C)
89 90 91 92 93 94 95 96	KYKQRKKSYK KYKQRKRSYK KYKQRRKSYK KYKQRRRSYK KYKQKKKSYK KYKQKRKSYK KYKQKKRSYK KYKQKRRSYK

실시예 2: 재료 및 방법

실시예 2-1 멜라닌 세포의 배양

멜라닌 세포(Melanocyte B16F10) 세포주를 10% FBS, 1% PS(penicillin/streptomycin)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37도, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터에서 배양하였다.

실시예 2-2 MTT 에세이(MTT Assay)

MTT reagent는 0.5mg/ml의 농도로 DMEM에 희석하여 사용한다.

B16F10세포를 6well plate에 230,000cell/well로 분주하고 37도 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 이어서 펩타이드 KH001(서열번호 96)를 농도별로 72시간 처리하여 세포를 준비하였고, MTT reagent를 분주하고 차광하여 37도 인큐베이터 조건에서 1시간 반응시킨다. Media를 모두 제거 후 생성된 formazan을 DMSO에 녹인 후에 560nm 흡광도에서 측정한다.

실시예 2-3 멜라닌 함량(melanin contents) 정량

B16F10세포를 6well plate에 230,000cell/well로 분주하고 37도 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 여기에 KH001 펩타이드를 농도별로 50uM, 100uM, 200uM 처리하고 72시간 배양하였다. 세포를 PBS로 세척 후에 1N NaOH에 10% DMSO를 첨가한 용액으로 세포를 용해시켰다. 용해액은 405nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌의 양을 측정하였고, 용해액의 단백질 농도값으로 보정하였다.

Melanin contents(%) = (펩타이드 처리군의 흡광도 / PBS 처리군의 흡광도) X 100

실시예 2-4 분비된 멜라닌(secreted melanin) 정량

B16F10세포를 6well plate에 230,000cell/well로 분주하고 37도 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 여기에 KH001 펩타이드를 농도별로 50uM, 100uM, 200uM 처리하고 72시간 배양하였다. 이때 각 well의 media의 흡광도를 405nm에서 측정하여 secreted melanin을 정량하였다.

Secreted melanin (%) = (펩타이드 처리군의 흡광도 / PBS 처리군의 흡광도) X 100

실시예 2-5 티로시나아제 활성(tyrosinase activity)의 측정

B16F10세포를 6well plate에 230,000cell/well로 분주하고 37도 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 여기에 KH001 펩타이드를 농도별로 50uM, 100uM, 200uM 처리하고 72시간 배양하였다. 이어서 세포를 PBS로 세척하고 1% triton X가 함유된 0.1M potassium phosphate buffer(pH 6.8) 100μl로 세포를 모두 용해시킨 후 1.5ml tube에 담아 12000rpm에서 20min 원심분리 하였다. 여기서 상층액을 40μl를 취하여 2mg/ml L-DOPA 용액(0.1M potassium phosphat pH7.0) 200μl과 37도에서 30분 반응시킨다. 이어서 475nm에서 흡광도를 측정하여 tyrosinse activity를 측정하였다. 이 값은 세포 용해액의 단백질 농도로 보정하였다.

Tyrosinase acitvity (%) = (펩타이드 처리군의 흡광도 / PBS 처리군의 흡광도) X 100

실시예 2-6 티로시나아제 활성(tyrosinase activity)의 측정 2

B16F10세포를 6well plate에 230,000cell/well로 분주하고 37도 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 여기에 KH001 펩타이드를 농도별로 50uM, 100uM, 200uM 처리하고 72시간 배양하였다. PBS로 세포를 세척 후에 2% Para-formaldehyde로 20min 동안 고정한다. 이어서 세포를 PBS로 3회 세척 후 well마다 0.1% L-DOPA(0.1M potassium phosphat pH7.0)를 분주한다. 이어서 37도 인큐베이터에서 3시간 동안 반응시키고 광학현미경으로 사진을 촬영하였다.

실시예 3: 결과

실시예 3-1. 펩타이드 KH001이 B16F10 멜라닌 세포 내 멜라닌 생성에 미치는 효과

KH001 펩타이드를 B16F10 세포에 농도별로 처리하였다. 펩타이드 처리 72시간 째에 Cell pellet을 강염기로 용해시킨 후 405nm에서 흡광도 측정하여 세포 내 멜라닌의 양을 정량 하였으며, BSA Assay를 통해 단백질 값으로 보정되었다. 도 1을참고하면, KH001을 50uM, 100uM, 200uM의 농도로 처리한 결과 대조군에 대비하여 멜라닌 생성이 38%, 81%, 176% 증가하였다. 따라서 KH001 펩타이드는 농도의존적으로 멜라닌 합성을 유도하고 있음을 알 수가 있다.

실시예 3-2. 펩타이드 KH001이 B16F10 멜라닌 세포의 티로시나아제 활성(Tyrosinase activity)에 미치는 효과 1

멜라닌의 합성과정에서 L-DOPA가 DOPA quinone으로 산화되는 과정이 필요한데 이는 tyrosinase의 활성이 필요한 과정이다. 따라서 본 연구에서는 KH001 펩타이드를 처리한 B16F10세포의 lysate를 L-DOPA와 반응시켜 생성되는 DOPA quinone을 정량 하는 것으로 Tyrosinase Activity를 측정하였다. 도 2를 참고하면, KH001 펩타이드를 처리한 결과 대조군에 대비하여 티로시나아제 활성(Tyrosinase activity)은 KH001의 처리농도 50uM, 100uM, 200Um에 대하여 각각 농도별로 101%, 443%, 433% 증가하였다. 따라서 KH001 펩타이드는 티로시나아제 활성(tyrosinase activity)을 증가시켜 멜라닌 합성을 유도함을 알 수 있다.

실시예 3-3. 펩타이드 KH001이 B16F10 멜라닌 세포의 티로시나아제 활성(Tyrosinase Activity)에 미치는 효과 2

KH001 펩타이드를 B16F10 세포에 농도별로 72시간 처리하고 세포를 고정하여 L-DOPA 시약과 반응시켰다. 세포 내 Tyrosinase는 L-DOPA와 반응하여 검은 빛을 띠는데, 검은빛을 더 많이 띠는 것은 더 높은 tyrosinase activity를 나타낸다. 도 2를 참고하면, 실험결과 대조군과 비교하여 KH001 펩타이드 처리한 군에서 티로시나아제 활성(Tyrosinase activity)이 현저히 증가한 것을 알 수 있었다.

실시예 3-4. 펩타이드 KH001이 B16F10 멜라닌 세포의 멜라닌 분비에 미치는 효과

KH001 펩타이드를 B16F10 세포에 농도별로 처리한 후, KH001 펩타이드를 처리하고 72시간 후에 culture media로 분비된 멜라닌의 양을 405nm의 흡광도에서 측정하여 media로 분비된 멜라닌의 양을 정량한 것으로, 도 3을 참고하면 KH001 펩타이드를 처리한 결과 대조군에 대비하여 멜라닌 생성이 농도 의존적으로 각각 17%, 31%, 37% 증가하였다. 따라서 KH001 펩타이드의 효과에 의해 B16F10 세포는 더 많은 멜라닌을 농도 의존적으로 분비하는 것을 알 수 있다.

실시예 3-5. 펩타이드 KH001의 B16F10 멜라닌 세포에서 독성평가

KH001 펩타이드를 B16F10 세포에 농도별로 처리하였다. KH001 펩타이드 처리 72시간 째에 MTT Assay를 하여 cell viability를 측정하였다. 도 5를 참고하면, KH001을 50uM, 100uM, 200uM의 농도로 처리한 결과 대조군에 대비하여 Cell viability은 유의한 차이를 보이지 않았다.

따라서 설정한 농도 내에서 KH001 펩타이드는 독성이 없는 것으로 확인되었다.

본 명세서와 도면에는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 개시하였으며, 비록 특정 용어들이 사용되었으나, 이는 단지 본 발명의 기술 내용을 쉽게 설명하고 발명의 이해를 돕기 위한 일반적인 의미에서 사용된 것이지, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 여기에 개시된 실시예 외에도 본 발명의 기술적 사상에 바탕을 둔 다른 변형예들이 실시 가능하다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것이다.

Claims

하기 일반식 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 포함하는, 티로시나아제 활성 촉진용 조성물:
K-Y-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 (일반식 1)
상기 일반식 1에서,
R1은 아르기닌(R), 리신(K) 또는 글루타민(Q)이고;
R2는 아르기닌(R) 또는 글루타민(Q)이며;
R3, R4 및 R5는 각각 아르기닌(R) 또는 리신(K)이고;
R6는 아스파라긴(N) 또는 세린(S)이며; 및
R7 및 R8은 리신(K) 또는 타이로신(Y)이다.
하기 일반식 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 포함하는, 멜라닌 합성 조절용 조성물:
K-Y-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 (일반식 1)
상기 일반식 1에서,
R1은 아르기닌(R), 리신(K) 또는 글루타민(Q)이고;
R2는 아르기닌(R) 또는 글루타민(Q)이며;
R3, R4 및 R5는 각각 아르기닌(R) 또는 리신(K)이고;
R6는 아스파라긴(N) 또는 세린(S)이며; 및
R7 및 R8은 리신(K) 또는 타이로신(Y)이다.
하기 일반식 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 포함하는, 멜라닌 저색소증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물:
K-Y-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 (일반식 1)
상기 일반식 1에서,
R1은 아르기닌(R), 리신(K) 또는 글루타민(Q)이고;
R2는 아르기닌(R) 또는 글루타민(Q)이며;
R3, R4 및 R5는 각각 아르기닌(R) 또는 리신(K)이고;
R6는 아스파라긴(N) 또는 세린(S)이며; 및
R7 및 R8은 리신(K) 또는 타이로신(Y)이다.
하기 일반식 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 포함하는, 멜라닌 저색소증의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물:
K-Y-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 (일반식 1)
상기 일반식 1에서,
R1은 아르기닌(R), 리신(K) 또는 글루타민(Q)이고;
R2는 아르기닌(R) 또는 글루타민(Q)이며;
R3, R4 및 R5는 각각 아르기닌(R) 또는 리신(K)이고;
R6는 아스파라긴(N) 또는 세린(S)이며; 및
R7 및 R8은 리신(K) 또는 타이로신(Y)이다.
제1항에 있어서,
상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 96 중 어느 하나의 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항의 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 상기 펩타이드가 반복되어 연결된 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서,
상기 멜라닌 저색소증은　백반증 또는 백모증인 것을 특징으로 하는 멜라닌 저색소증의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
제3항에 있어서,
상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항의 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하여 멜라닌 저색소증을 예방, 개선 또는 치료하는 방법.