KR102522134B1 - Cpne7 유래 펩타이드를 포함하는 상아질 접착용 조성물 및 치수복조용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명에 따른 상아질 접착용 조성물은 하기 일반식 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 포함한다: K-Y-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 (일반식 1), 상기 일반식 1에서, R1은 아르기닌(R), 리신(K) 또는 글루타민(Q)이고; R2는 아르기닌(R) 또는 글루타민(Q)이며; R3, R4 및 R5는 각각 아르기닌(R) 또는 리신(K)이고; R6는 아스파라긴(N) 또는 세린(S)이며; 및 R7 및 R8은 리신(K) 또는 타이로신(Y)이다. 본 발명에 따른 조성물은 치아우식증, 파절 등 손상된 치질의 치료에 사용되어 치료 이후 발생가능한 치수의 괴사, 치아 삭제 또는 치아 손실을 방지할 수 있다.

Description

CPNE7 유래 펩타이드를 포함하는 상아질 접착용 조성물 및 치수복조용 조성물{COMPOSITION FOR DENTIN ADHESION AND COMPOSITION FOR PULP RESTORATION COMPRISING CPNE7-DERIVED PEPTIDE}

본 발명은 상아질 접착제 및 치수복조용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생체친화적인 세관 상아질과 연속적인 구조를 갖는 세관 상아질을 형성해주는 CPNE7 유래 펩타이드를 포함하는 상아질 접착제 및 치수복조용 조성물에 대한 것이다.

다양한 치과용 수복 재료들은 치아 그 자체와 여러 가지 물성 (열팽창계수, 강도, 미모도, 탄성계수 등)이 다르고, 해당 재료들을 치아에 물리 화학적으로 적합 시키기 위한 과정으로 치아의 삭제 및 치아의 화학적 처리 등의 과정을 수반한다. 보존, 보철 수복용 치과재료의 화학적 자극, 미세누출 및 치료 과정 중의 자극은 기존의 병적인 치아 문제(파절, 과민증, 우식 등)에 지각 과민증 및 치수의 병변을 약화시키거나 발생시킬 수 있다. 이는 치아 내 살아있는 조직의 치수의 괴사를 야기하여, 치수를 제거하는 근관 치료와 추가적 치아 삭제 및 손실로 연결된다. 또한 다양한 원인에 의해 치아의 상아질이 손상되어 상아세관들이 외부로 노출되는 경우 이가 시린 증상이 발생하게 된다. 치과 치료 과정에서 치질 삭제가 일어난 경우에도 이러한 증상이 발생하기도 한다.

노출된 상아세관으로 인한 시린 증상을 감소하기 위해서는 상아세관 폐쇄 및 생리적인 광화가 필요하다. 이러한 한계점을 극복하기 위해 생리적 상아질 봉쇄 개념이 소개되었으며, 상아질 분비를 담당하는 상아모세포의 회복을 촉진하는 생리활성을 지닌 새로운 수복재료가 필요한 상황이다.

최근 심각하게 사회문제로 대두되고 있는 고령화에 따른 노인성 치과질환은 노령인구 국민건강보험 확대적용에 따라 치과분야에 있어서도 영향을 미치고 있다. 노년의 자연치의 수는 연령이 증가함에 따라 감소하는 경향을 보이고 자연치의 수가 적을수록 삶의 질이 떨어진다는 여러 연구 결과가 있다. 그러므로 가능한 환자의 자연치를 보존하는 술식 및 재료에 대한 요구가 늘어나는 상황이다.

치아는 경조직인 법랑질, 상아질, 백악질 그리고 내부의 연조직인 치수로 이루어져 있다. 치수는 신경과 혈관이 발달되어 있으며, 치수와 상아질의 경계부에는 상아질을 형성하는 상아모세포가 위치한다. 치아우식증, 파절 등 여러 이유로 인해 치질이 손상된 경우 손상의 정도에 따라 환자가 느끼는 증상과 필요한 치료 술식이 달라지게 된다. 치아의 손상이 법랑질 혹은 상아질에 국한된 경우 약화된 치질을 제거한 후 수복재로 채워 넣게 된다. 손상의 범위가 치수에 가깝거나 치수를 침범했을 때, 노출된 치수의 범위가 작은 경우에는 직접 치수복조재를 이용하여 치수를 봉쇄하고 수복을 진행한다.

치아의 손상으로부터 치아의 구조 및 기능을 회복하기 위해 아말감, 글라스아이오노머 시멘트, 복합 레진, 금, 도재 등 다양한 성분으로 구성된 보존, 보철용 수복재료들이 사용되고 있다. 이 중 현재 직접 수복을 위해 가장 보편적으로 쓰이는 재료는 레진으로, 레진을 치질에 부착하기 위해 상아질 접착제를 사용한다. 현재는 도포 단계를 축약한 8세대 접착제가 가장 보편적이며, 대표적인 8세대 접착재로 비스코 덴탈(Bisco Dental)사의 All-Bond Universal제품이 있다. 레진으로 수복 시 손상된 상아질의 두께를 회복, 미세누출 방지, 손상된 상아질 두께를 회복을 유도하는 생물학적인 효과를 가진 접착재가 개발된다면 추후 자연치의 보호에 도움을 줄 수 있을 것이며 이는 전반적인 구강 건강 및 삶의 질을 증진시킬 것이다.

작은 범위의 치수가 노출되거나 남은 치질의 두께가 얇아 치수에 근접할 때 치수의 생활력을 유지하기 위해 치수복조술이 적용된다. 이상적인 치수복조재는 치수의 염증을 유발하지 않고 치질과 결합하여 미세누출이 없으며, 상아질교를 형성하고, 임상적으로 사용하기 편한 것이다. 성공적인 치수복조술을 위해 수산화 칼슘, MTA(Mineral Trioxide Aggregate), 접착성 레진 등의 많은 약재들이 연구되고 있지만 이들 중 MTA가 생체친화성으로 인해 가장 다양한 용도로 활용되고 있다. 직접 치수복조재의 중요한 기능 중 하나는 치수 내에 있는 상아모세포를 자극하여 새로운 상아질 형성을 유도하는 생물학적인 효과이다. 이러한 효과는 노출된 치수의 밀폐를 가능케하여 신경치료로 넘어가는 것을 방지한다. 신경치료를 하는 경우 치아 내부의 치수를 모두 제거하기 때문에 결과적으로 자연치의 보존을 어렵게 한다. 그러므로 상아질 형성 유도 기능을 가진 직접 치수복조재의 개발은 전반적인 구강 건강의 증진을 위해서도 필요로 하다.

주로 레진 수복제가 많이 사용되는데, 레진 수복재는 치질에 대한 접착력은 좋지만 모노머가 가지는 독성 때문에 수복 후에 환자들이 불편한 증상을 느끼는 경우가 종종 있다. 치료에 수반된 부작용을 최소화하기 위하여 노출된 상아세관을 막아주고 손상된 상아질의 두께를 회복시켜 모노머가 치수에 미치는 영향을 최소화하는 것이 필요하다. 치수복조재로 널리 쓰이는 MTA 역시 생체친화성 및 밀폐력은 좋지만 기존의 세관상아질과는 다른 수복 상아질을 형성한다. 이러한 수복 상아질을 장기적으로 봤을 때 기존의 상아질과의 경계에서 미세누출이 발생한다.

본 발명은 다양한 치과용 수복재료를 치아에 적용함에 있어서 발생할 수 있는 치수의 괴사, 치아 삭제 또는 치아 손실을 방지하는 상아질 접착제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 치아의 손상 범위가 치수에 가깝거나 치수를 침범했을 때, 노출된 치수의 범위가 작은 경우 직접 적용하여 치수를 봉쇄하고 수복을 진행하는 치수복조용 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

본 발명의 목적은 이상에서 언급한 것으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 기술적 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 양상에 따르면, 하기 일반식 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 포함하는, 상아질 접착용 조성물이 제공된다:

K-Y-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 (일반식 1)

상기 일반식 1에서,

R1은 아르기닌(R), 리신(K) 또는 글루타민(Q)이고;

R2는 아르기닌(R) 또는 글루타민(Q)이며;

R3, R4 및 R5는 각각 아르기닌(R) 또는 리신(K)이고;

R6는 아스파라긴(N) 또는 세린(S)이며; 및

R7 및 R8은 리신(K) 또는 타이로신(Y)이다.

상아질 접착과 관련하여 상아질의 생리적 광화를 촉진할 수 있는 효과를 나타낼 수 있는 한, 이를 구성하는 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 변이체 펩타이드도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 범주에 포함된다.

일반적으로, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 펩타이드의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 상아질의 합성촉진능이 증가한 펩타이드를 포함할 수 있다.

예를 들어, 본 발명에서 제공하는 서열번호 1의 펩타이드의 3번에 위치한 산성 아미노산인 글루타민은 염기성 아미노산인 리신 또는 아르기닌으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있고; 서열번호 1의 펩타이드의 4번 또는 5번에 위치한 염기성 아미노산인 아르기닌은 산성 아미노산인 글루타민 또는 염기성 아미노산인 리신으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있으며; 서열번호 1의 펩타이드의 6번, 7번 또는 9번에 위치한 염기성 아미노산인 리신은 염기성 아미노산인 아르기닌 또는 방향족 아미노산인 타이로신으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있고; 서열번호 1의 펩타이드의 8번에 위치한 산성 아미노산인 아스파라긴은 중성 아미노산인 세린으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있으며; 서열번호 1의 펩타이드의 10번에 위치한 방향족 아미노산인 타이로신은 염기성 아미노산인 리신으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있다.

이처럼, 본원발명의 펩타이드를 구성하는 산성 아미노산, 염기성 아미노산 또는 방향족 아미노산은 각각 이와 다른 산성 아미노산, 염기성 아미노산, 중성 아미노산 또는 방향족 아미노산으로 치환되어도, 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 펩타이드를 구성하는 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 변이체 펩타이드도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 범주에 포함됨은 자명하다.

또한, 본 발명의 펩타이드는 그의 N-말단 또는 C-말단에 임의의 아미노산이 부가된 형태를 갖더라도, 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있으므로, 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 범주에 포함된다. 일 예로서, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 1 내지 300개의 아미노산이 부가된 형태가 될 수 있고, 다른 예로서, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 1 내지 100개의 아미노산이 부가된 형태가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 1 내지 24개의 아미노산이 부가된 형태가 될 수 있다.

구체적으로 일반식 1에 따른 펩타이드는 하기 표 1 내지 표 12로 표현될 수 있다.

예를 들면, 펩타이드(서열번호 1)를 9-플루오르닐메틸옥시카보닐(9-fluorenylmethyloxycarbonyl, Fmoc) 방법으로 합성하고, 상기 합성된 펩타이드의 아미노산을 치환하여 각 그룹의 펩타이드를 합성할 수 있다(표 1 내지 12).

N-KYQRRKKNKY-C(서열번호 1)

먼저, 그룹 1의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드 또는 상기 서열번호 1의 펩타이드의 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성할 수 있다(표 1).

서열번호	아미노산 서열(N-C)
1 2 3 4 5 6 7 8	KYQRRKKNKY KYQRRKRNKY KYQRRRKNKY KYQRRRRNKY KYQRKKKNKY KYQRKRKNKY KYQRKKRNKY KYQRKRRNKY

다음으로, 그룹 2의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하여 합성할 수 있다(표 2).

서열번호	아미노산 서열(N-C)
9 10 11 12 13 14 15 16	KYQRRKKSKY KYQRRKRSKY KYQRRRKSKY KYQRRRRSKY KYQRKKKSKY KYQRKRKSKY KYQRKKRSKY KYQRKRRSKY

다음으로, 그룹 3의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하여 합성할 수 있다(표 3).

서열번호	아미노산 서열(N-C)
17 18 19 20 21 22 23 24	KYQRRKKNYK KYQRRKRNYK KYQRRRKNYK KYQRRRRNYK KYQRKKKNYK KYQRKRKNYK KYQRKKRNYK KYQRKRRNYK

다음으로, 그룹 4의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하며, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하고, 10번 아미노산을 리신으로 치환하여 합성할 수 있다(표 4).

서열번호	아미노산 서열(N-C)
25 26 27 28 29 30 31 32	KYQRRKKSYK KYQRRKRSYK KYQRRRKSYK KYQRRRRSYK KYQRKKKSYK KYQRKRKSYK KYQRKKRSYK KYQRKRRSYK

다음으로, 그룹 5의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아르기닌으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성할 수 있다(표 5).

서열번호	아미노산 서열(N-C)
33 34 35 36 37 38 39 40	KYRQRKKNKY KYRQRKRNKY KYRQRRKNKY KYRQRRRNKY KYRQKKKNKY KYRQKRKNKY KYRQKKRNKY KYRQKRRNKY

다음으로, 그룹 6의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아르기닌으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하여 합성할 수 있다(표 6).

그룹 6의 펩타이드

서열번호	아미노산 서열(N-C)
41 42 43 44 45 46 47 48	KYRQRKKSKY KYRQRKRSKY KYRQRRKSKY KYRQRRRSKY KYRQKKKSKY KYRQKRKSKY KYRQKKRSKY KYRQKRRSKY

다음으로, 그룹 7의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아르기닌으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하며, 10번 아미노산을 리신으로 치환하여 합성할 수 있다(표 7).

서열번호	아미노산 서열(N-C)
49 50 51 52 53 54 55 56	KYRQRKKNYK KYRQRKRNYK KYRQRRKNYK KYRQRRRNYK KYRQKKKNYK KYRQKRKNYK KYRQKKRNYK KYRQKRRNYK

다음으로, 그룹 8의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아르기닌으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하며, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하고, 10번 아미노산을 리신으로 치환하여 합성할 수 있다(표 8).

서열번호	아미노산 서열(N-C)
57 58 59 60 61 62 63 64	KYRQRKKSYK KYRQRKRSYK KYRQRRKSYK KYRQRRRSYK KYRQKKKSYK KYRQKRKSYK KYRQKKRSYK KYRQKRRSYK

다음으로, 그룹 9의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 리신으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성할 수 있다(표 9).

서열번호	아미노산 서열(N-C)
65 66 67 68 69 70 71 72	KYKQRKKNKY KYKQRKRNKY KYKQRRKNKY KYKQRRRNKY KYKQKKKNKY KYKQKRKNKY KYKQKKRNKY KYKQKRRNKY

다음으로, 그룹 10의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 리신으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하여 합성할 수 있다(표 10).

서열번호	아미노산 서열(N-C)
73 74 75 76 77 78 79 80	KYKQRKKSKY KYKQRKRSKY KYKQRRKSKY KYKQRRRSKY KYKQKKKSKY KYKQKRKSKY KYKQKKRSKY KYKQKRRSKY

다음으로, 그룹 11의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 리신으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하며, 10번 아미노산을 리신으로 치환하여 합성할 수 있다(표 11).

서열번호	아미노산 서열(N-C)
81 82 83 84 85 86 87 88	KYKQRKKNYK KYKQRKRNYK KYKQRRKNYK KYKQRRRNYK KYKQKKKNYK KYKQKRKNYK KYKQKKRNYK KYKQKRRNYK

끝으로, 그룹 12의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 리신으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하며, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하고, 10번 아미노산을 리신으로 치환하여 합성할 수 있다(표 12).

서열번호	아미노산 서열(N-C)
89 90 91 92 93 94 95 96	KYKQRKKSYK KYKQRKRSYK KYKQRRKSYK KYKQRRRSYK KYKQKKKSYK KYKQKRKSYK KYKQKKRSYK KYKQKRRSYK

본 발명의 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 이용하여 합성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기서열을 포함할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터를 포함하는 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 상기 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "발현벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되고, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내어야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

본 발명의 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 펩타이드의 분리를 촉진하기 위하여 상기 펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널 및 개시코돈은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.

아울러, 상기 발현벡터는 상기 펩타이드의 검출이 용이하도록 하기 위하여, 임의로 엔도펩티다아제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "태그(tag)"란, 정량가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 의미하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광분자일 수도 있고; Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그, 스트랩타비딘 태그 등의 에피톱 태그일 수도 있다. 특히, 에피톱 태그를 사용할 경우, 바람직하게는 6개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 보다 바람직하게는 8개 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 태그를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 상술한 본 발명의 상아질의 생리적 광화를 촉진하는 효과를 제공하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는데, 이때 사용되는 벡터는 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등)가 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.

본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 본 발명에서 제공하는 발현벡터를 숙주에 도입하여 형질전환시킴으로써 제작될 수 있고, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 상기 펩타이드를 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 형질전환제의 제작에 사용되는 숙주 역시 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균, 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로소필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.

상기 형질전환체는 또한 본 발명의 상아질의 생리적 광화를 촉진하는 효과를 제공하는 펩타이드를 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 상아질의 생리적 광화를 촉진하는 효과를 제공하는 펩타이드를 생산하는 방법은 (a) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 배양물로부터 본 발명의 펩타이드를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 상아질의 생리적 광화를 촉진하는 효과를 제공하는 펩타이드를 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산 암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 상기 펩타이드의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 100 시간에서 달성된다.

아울러, 배양물로부터 상기 펩타이드를 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 상기 펩타이드의 회수에 사용될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 용어 "예방"이란, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 상아질 접착용 조성물 및 치수복조용 조성물의 투여로 치수의 괴사, 치아 삭제 또는 치아 손실의 발생 또는 치과용 수복재료로 인해 발생할 수 있는 이차 우식 또는 치수염을 저해 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어 "치료"란, 본 발명의 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 상아질 접착용 조성물을 포함하는 수복재료, 상아질 접착용 조성물 또는 치수복조용 조성물을 치아의 수복의 치료가 요구되는 개체에 투여하여 치아와 수복재료 사이에서 상아질의 생리적 재광화를 촉진함으로써, 치아의 수복치료가 수행되도록 하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물은, 상기 치아의 수복용 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체(자연적 또는 비자연적 담체), 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 치아우식증, 파절 등 손상된 치질의 치료용 조성물의 형태로 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 치아우식증, 파절 등 치질의 손상이 유발된 부위에 투여할 수 있는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 콜라겐 등을 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 특히, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제, 연고제(예를 들어, 치수이장재 등) 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함된 상기 펩타이드의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독으로로 투여하거나 공지된 치아우식증, 파절 등 손상된 치질의 치료용 조성물과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

본 발명의 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng 내지 약 100 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 10 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명은 다른 하나의 양태로서 상기 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 치아우식증, 파절 등 손상된 치질의가 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 치아우식증, 파절 등 손상된 치질의 치료방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "개체"란 치아우식증, 파절 등 손상된 치질의 치료가 요구되는 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물 등을 제한 없이 포함할 수 있으나, 상기 질환이 발병된 개체 중에서 인간을 제외할 수 있다.

본 발명의 치아우식증, 파절 등 손상된 치질의 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 경구, 경피(trandermally), 정맥, 근육, 피하주사에 의해 투여될 수 있다. 상기 조성물은 주사제, 피부 외용 용액제, 현탁제, 유액제, 겔, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제형은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있으며, 계면 활성제, 부형제, 수화제, 유화 촉진제, 현탁제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제, 착색제, 향신료, 안정화제, 방부제, 보존제 또는 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 치아우식증, 파절 등 손상된 치질의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어, "개선"이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 개선은 본 발명의 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 조성물을 치아우식증, 파절 등 손상된 치질의 치료가 요구되는 개체에 투여하여 상아질의 합성을 촉진함으로써, 치아우식증, 파절 등 손상된 치질의 증상이 호전되거나 또는 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명의 용어 "의약외품"이란, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유ㆍ고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병을 막기 위한 살균ㆍ살충제 등이 이에 포함된다.

본 발명에 있어서, 상기 펩타이드를 포함하는 의약외품 조성물의 종류나 제형은 특별히 제한되지 않으나, 일 예로서, 피부 또는 모발용 소독 청결제, 피부 또는 모발 청정용품, 비누, 샴푸, 피부용 연고제 등일 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 치아우식증, 파절 등 손상된 치질의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어, "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 식품은 치아우식증, 파절 등 손상된 치질의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다.

구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 본 발명의 펩타이드를 음료, 차류, 향신료, 껌류, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.

본 발명의 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 치아우식증, 파절 등 손상된 치질의 예방 또는 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있으므로, 매우 유용하게 사용될 수 있다.

상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 내지 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 내지 0.03 g이 될 수 있다.

상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 식품 조성물은 치아우식증, 파절 등 손상된 치질의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 구체적으로 본 발명의 펩타이드를 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 실시예에 따른 상아질 접착제는 다양한 치과용 수복재료를 치아에 적용함에 있어서 발생할 수 있는 치수의 괴사, 치아 삭제 또는 치아 손실을 예방하거나 방지함으로써 치과용 수복재료로 인해 발생할 수 있는 이차 우식 또는 치수염을 예방 또는 억제할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 치수복조용 조성물은 치아의 손상 범위가 치수에 가깝거나 치수를 침범했을 때, 노출된 치수의 범위가 작은 경우 직접 적용하여 치수를 봉쇄하고 수복을 진행함으로써 치수의 밀폐를 가능케하여 수복 상아질의 경계에서 발생할 수 있는 미세누출을 예방하거나 억제하여 치아 손상의 치료에 대한 높은 신뢰성과 지속성을 제공할 수 있다.

본 발명의 효과는 이상에서 언급한 것으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 상아질 접착제와 KH001의 혼합용액이 사람치수세포의 상아모세포 분화(odontogenic differentiation) 마커 유전자 발현에 미치는 영향이다. 마커 유전자로는 DSPP, DMP1, BSP가 있으며 유전자의 발현은 RT-PCR로 측정하였다. 아래 결과의 모든 값은 세번의 실험 결과 값의 평균 및 표준편차로 표시되었으며, *p<0.05는 대조군과 비교한 결과이다.
도 2는 상아질 접착제와 KH001의 혼합용액을 상아질이 노출된 사람 치아에 처리하였을 때 KH001이 치수까지 잘 도달하는지 상아세관 투과도를 측정한 결과이다. A는 상아세관 투과도를 측정하기 위한 시료의 준비과정 모식도이고 B-D는 공초점 현미경으로 현미경 사진을 촬영한 결과이다.
도 3은 상아질 접착제와 KH001의 혼합용액의 세관 상아질 재생 능력을 조직학적으로 평가한 결과이다. 비글견의 치아의 치경부에 접시 형태의 손상을 주어 상아질을 노출시킨 후 대조군은 KH001이 들어가지 않은 상아질 접착제를 바른 후 레진으로 수복하였고 실험군은 KH001이 함유된 상아질 접착제를 도포한 후 레진 수복을 진행하였다. 그 후 세관 상아질의 형성을 조사하기 위해 H&E staining을 통해 조직학적 평가를 진행한 결과이다. 점선은 새롭게 형성된 세관 상아질의 경계를 보여주며 그림의 TD(tertiary dentin)는 세관상아질을 지칭한다.
도 4는 MTA conditioned medium 조건 하에서 KH001의 농도별 odontogenic differentiation 마커 유전자의 사람치수세포에서 발현량을 살펴본 결과이다. 마커 유전자로는 DSPP, DMP1, BSP가 있으며 유전자의 발현은 RT-PCR로 측정하였다. 아래 결과의 모든 값은 세번의 실험 결과 값의 평균 및 표준편차로 표시되었으며, *p<0.05, **p<0.01는 대조군과 비교한 결과이다.
도 5는 MTA-conditioned media를 처리한 사람 치수 세포 실험에서 KH001의 효능을 확인하기 위해 상아모세포 분화 유전자 마커의 발현 변화를 분화 일자별로 살펴본 결과이다.
도 6은 MTA-conditioned media를 처리한 사람 치수 세포 실험에서 KH001의 효능을 확인하기 위해 상아모세포 분화 및 광화능 변화를 살펴본 결과이다.
도 7은 MTA-conditioned media를 처리한 사람 치수 세포 실험에서 KH001의 효능을 확인하기 위해 상처 치유능 및 세포 이동능 변화를 살펴본 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 치수복조용 조성물의 상아질의 상아질 세관 투과 능력을 살펴보기 위해 공초점 현미경으로 찍은 사진이다.
도 9는 상아질 접착용 조성물과 치수복조용 조성물이 손상된 치아를 치료하는 과정에서 적용되는 부위와 적용 전 후의 모습을 도시한 모식도이다.

본 발명의 목적 및 효과, 그리고 그것들을 달성하기 위한 기술적 구성들은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 본 발명을 설명함에 있어서 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다. 그리고 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기증을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있다.

그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있다. 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.

이하에서는 본 발명의 실시예에 대하여 구체적으로 설명하기로 한다.

실시예 1: 재료 및 방법

실시예 1-1: 펩타이드의 준비

KH001 펩타이드(서열번호 96)는 hCPNE7 단백질의 10개 아미노산 잔기 344-353 단편(KYKQKRRSYK)에 해당하는 합성 펩타이드로 구성된다. 펩타이드 KH001은 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-기반 고체상-방법을 사용하여 합성된 펩타이드 KH001의 순도는 고성능 액체 크로마토그래피로 측정한 결과 97% 이상이었음.

실시예 1-2: 세포의 배양

MDPC-23(mouse pre-odontoblast cell line)세포는 Dr. J.E. Nor(University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA)에 의해 제공되었고 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM; Gibco BRL., Carlsbad, CA, USA)에서 배양되었고, C3H10T1/2 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 입수하였고 RPMI 1640 배지(Gibco BRL)에서 배양되었다. 두 세포주 모두 5% CO₂ 분위기에서 37℃에서 10% 열불활성화 소태아혈청(FBS; Gibco BRL)과 항생제-항진균제(Gibco BRL)로 보충되었다.

세포는 시험관 내(in vitro) 및 생체 외(ex vivo) 실험에서 사용하기 위해 최소 필수 배지 α(MEM-α; Gibco BRL)에서 배양되었다. 인간 치수 세포(hDPC) 및 MDPC-23 세포 분화를 위해 80-90% 융합 세포를 5% FBS, 아스코르브산(50μg/mL) 및 β-글리세로포스페이트(10mM)가 보충된 해당 배지에서 3주 동안 배양하였다. 2 내지 4까지의 계대는 hDPSC에 사용되었고 23 내지 25까지는 MDPC-23 세포에 사용되었다.

실시예 2-1-1: 상아질 접착용 조성물의 제조

KH001과 비스코 덴탈사(Bisco Dental^TM)사의 상아질 접착제ABU(All-Bond Universal)를 ABU 1mL 당 KH001 2mg을 첨가하여 감압조건 (-750mmHg) 하에 교반기에서 약 40분간 교반한다 (교반 조건 : PADDLE 10~30 rpm, DISPERSE 500-600 rpm, HOMO 2400-3200 rpm). 그 후 차광이 되는 용기에 보관한다. 제조된 상아질 접착용 조성물은 제조후 4℃에서 약 3개월 간 냉장보관하였으며 실시예 2-3, 실시예 2-4에 적용하였으며 표 13에 이를 기재하였다.

실시예 2-1-2: 상아질 접착용 조성물의 제조

실시예 1-2에서 준비된 인간 치수 세포(hDPC)에 대한 세포 실험에서는 상아질 접착제 단량체의 독성으로 인한 세포의 사멸 등 부작용을 방지하기 위하여 ABU를 10% α-MEM에 1:5000의 비율로 희석하여 상아질 접착용 조성물을 제조하는데 이용하였다. 상기 희석액에 KH001 펩타이드 파우더를 녹여 각각 5ug/ml, 10ug/ml를 포함하도록 제조하였으며 이렇게 제조된 상아질 접착용 조성물을 실시예 2-2에 적용하였다. 제조된 상아질 접착용 조성물은 제조후 4℃에 냉장보관하였다.

실시예 2-2: 상아모세포 분화 마커 유전자 발현 조절 분석

실시예 1-2에서 준비된 인간 치수 세포(hDPC)에 대하여 실시예 2-1-2의 상아질 접착용 조성물을 처리한 후 역전사-폴리머라아제 체인 반응(RT-PCR) 및 실시간 PCR 분석에 의하여 DSPP, DMP1, BSP 유전자의 발현을 측정하였다. 도 1에 도시된 유전자 발현 값은 세번의 실험 결과 값의 평균 및 표준편차로 표시되었으며, *p<0.05, **p<0.01는 대조군과 비교한 결과이다.

도 1을 참고하면, KH001의 농도가 증가할수록 상아모세포 분화 마커 유전자인 DSPP, BSP, DMP1의 발현량이 증가하였으며, KH001을 10ug/ml의 농도로 처리하였을 때 DSPP, DMP1, BSP mRNA 발현이 2.5배 이상 증가하였다.

실시예 2-3: 상아세관 투과도 관찰

본 발명의 실시예 2-1-1에 의하여 제조된 상아질 접착용 조성물을 발치된 사람의 치아에 처리하여 상아세관 투과도를 관찰였다. 발치된 사람의 치아는 18세에서 22세 사이 환자의 매복된 인간의 세번째 어금니(impacted human third molars)는 서울대학교 치과병원에서 제공되었다. 실험 프로토콜은 기관 검토 위원회(Institutional Review Board)의 승인을 받았고(IRB 번호: S-D20140007), 모든 환자로부터 사전 동의를 받았다.

발치된 사람의 치아의 치관부를 다이아몬드 톱을 이용하여 가로로 절단하여 상아세관을 노출한 다음, 노출된 사람 치아에 처리하였다. 발치 된 사람의 치아의 관상면에 형광염색시약으로 로다민(Rhodamine)이 붙은 KH001펩타이드(서열번호 96)가 함유된 실시예 2-1-1에 의하여 제조된 상아질 접착용 조성물을 도포하였다.

브러싱 과정 또는 에어드라잉 과정 없이 상아질 접착용 조성물을 도포한 후 약 30초 동안 방치한 상태로 광중합을 한 후에 공초점 이미지(confocal image)를 찍은 결과이다.

도 2는 상아질 접착제와 KH001의 혼합용액을 약 30초간 상아질이 노출된 사람 치아에 처리하였을 때 KH001이 치수까지 잘 도달하는지 상아세관 투과도를 측정한 결과이다. 도 2를 참고하면, A는 상아세관 투과도를 측정하기 위한 시료의 준비과정 모식도이다. 도 2의 B-D는 공초점 현미경으로 현미경 사진을 촬영한 것으로 관찰 결과 펩타이드 KH001가 상아세관을 따라 치수강 내부까지 잘 흘러 들어간 것이 확인되었다.

실시예 2-4. 세관 상아질 재생 능력의 조직학적 평가

비글견의 치아의 치경부에 접시 형태의 손상을 주어 상아질을 노출시킨 후 대조군은 펩타이드 KH001과 혼합되지 않은 상아질 접착제를 바른 후 레진으로 수복하였고, 실험군은 KH001이 함유된 상아질 접착제를 도포한 후 레진 수복을 진행하였다. 그 후 세관 상아질의 형성을 조사하기 위해 H&E staining을 통해 조직학적 평가를 진행하였다.

도 3은 실시예 2-1-1의 상아질 접착용 조성물의 세관 상아질 재생 능력을 조직학적으로 평가한 결과이다. 도 3을 참고하면, 점선은 새롭게 형성된 세관 상아질의 경계를 보여주며 TD(newly formed tertiary dentin)는 새롭게 형성된 상아세관을 가진 상아질이다.

도 3을 참고하면, 상아질 접착제(ABU)만을 도포한 대조군(I)에서는 상아질 손상부위 하방에 세관 상아질이 형성되지 않았지만, 실시예 2-1-2에 의하여 제조된 KH001이 적용된 상아질 접착용 조성물을 도포한 시험군(II)(KH001을 5 ug/ml 포함) 및 시험군(III)(KH001을 10 ug/ml포함)에서는 상아질 손상부위 하방의 치수 쪽으로 세관 상아질이 형성된 것을 확인하였다. 또한 새로 형성된 세관 상아질에 인접한 치수에서 상아모세포가 울타리양으로 나열 되어있어 활성화된 건강한 치수임을 알 수 있다.

표 13은 실시예 2-1-1에 의하여 제조된 KH001이 함유된 상아질 접착용 조성물의 치질과의 접착력을 확인하기 위해 전단결합강도(shear bond strength test)를 울트라덴트(Ultradent) 방법을 이용하여 진행한 결과이다. 상아질을 320 그리트(grit) 사포 및 600 그리트 사포로 표면을 다듬은 후 대조군인 Bisco사의 ABU와 실험군인 KH001이 2mg/mL의 농도로 함유된 상아질 접착제를 셀프 에칭(self-etch) 방식으로 약 10~15초간 도포하고 1000mW/cm2 세기의 광원으로 광중합 후 스크러빙을 하여 Duo-Link Universal ™(DLU, Bisco사) 를 같은 세기의 광원으로 20초간 조사하여 접착하였다. 그 후 시편들을 37℃ 순수(DI water)에 보관한 후 측정을 진행한 결과이다. 각각의 군에는 10개의 시료가 포함되었다.

Adhesive + Cement	SBS, Mpa (SD)
ABU + DLU	34.20 (8.22)
ABU w/KH001 + DLU	33.43 (8.36)

표 13은 실시예 2-1-1에 의하여 제조된 상아질 접착용 조성물의 접착력을 표로 나타낸 것이다. 표 13을 참고하면 KH001가 유효 농도 대비 약 200배로 고농도로 포함되었음에도 상아질 접착용 조성물의 접착력이 기존 상아질 접착제에 비하여 유사한 수준의 접착력을 제공하였다. 이러한 결과는 상아질 접착용 조성물에 약 2mg/mL 이하의 농도로 KH001이 포함되더라도 종래 상아질 접착제와 동등 수준의 접착력을 제공할 수 있음을 시사한다.

실시예 3-1: 치수복조용 조성물의 제조

MTA(ProRoot MTA; Dentsply Sirona, New York, PA, USA)를 제조사의 지시에 따라 powder/liquid 비율을 맞춰 멸균된 유리판 위에서 메탈 슬랩을 사용하여 섞은 후 완전한 경화를 위해 1시간 동안 실온에서 경화시켰다.

경화가 완료된 후 멸균된 막자사발에서 MTA를 갈아 파우더 형태로 만들고 24시간 동안 사람 치수 세포의 배양 배지인 a-MEM(MEM-α; Gibco BRL)에 담근 후 약 37℃ 환경에서 보관하여 조절 배지(conditioned media)를 제작하였다.

그 후 x1/5의 비율로 희석된 조절 배지에 KH001을 각각 5ug/mL 및 10ug/mL의 농도로 처리하여 치수복조용 조성물을 제조하였다.

실시예 3-2: 치수복조용 조성물의 KH001의 농도별 상아모세포 분화(odontogenic differentiation) 마커 유전자(DSPP, DMP1, BSP) 및 CPNE7 유전자의 발현량 평가

Tri-Reagent^TM를 사용하여 사람치수세포의 전체 RNA(total RNA)를 추출한 후 역전사 효소(reverse transcriptase) 및 oligo (dT) primer (Invtrogen)를 처리하여 cDNA를 합성하였다.

유전자 증폭 과정을 위해서는 1μL의 역전사된 cDNA와 각 유전자에 상응하는 프라이머, SYBR Green Supermix를 96-well plate에서 섞은 후 제조사의 지시에 따라 quick cycle을 수행하였다.

PCR 결과물의 양은 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)에 대한 비율로 측정하였으며, CT(comparative threshold cycle) 방법을 이용하여 상대적인 발현량을 비교하였다.

도 4는 사람치수세포에서 치수복조용 조성물의 KH001(MTA conditioned medium 조건 하에서 KH001)의 농도별 상아모세포 분화(odontogenic differentiation) 마커 유전자의 발현량 및 CPNE7 유전자의 발현량을 RT-PCR로 측정한 결과이다. 결과의 모든 값은 세번의 실험 결과 값의 평균 및 표준편차로 표시되었으며, *p<0.05, **p<0.01는 대조군과 비교한 결과이다.

실시예 3-3: 치수복조용 조성물(MTA-조정배지 조건 하에서 KH001 10ug/ml)의 처리에 따른 일자별 상아모세포 분화마커 유전자(DSPP, DMP1, BSP) 및 CPNE7 유전자의 분화 발현량 평가

실시예 3-1에 의하여 제조된 KH001 10 ug/ml를 포함한 치수복조용 조성물의 사람 치수 세포를 상아모세포로 분화 유도하는 기능을 비교 측정하기 위해 분화 배지만 처리한 대조군(Ctrl), MTA-conditioned 분화 배지 처리한 군(MTA), 치수복조용 조성물(MTA-conditioned/CPNE7 기능성 펩타이드를 같이 처리한 군, MTA+KHOO1)을 비교하였다.

분화 배지의 조성은 기본적으로 5% FBS가 첨가된 α-MEM에 1% 항생제, 10mM beta-glycerophosphate, 50 μg/mL ascorbic acid을 함유하도록 제조되었다.

각각의 배지를 사람 치수 세포에 처리한 후 각각 0일, 7일, 14일에 상아 모세포 분화 유전자 마커의 발현 변화를 보기 위해 RT-PCR을 진행하였다.

도 5는 MTA-conditioned media를 처리한 사람 치수 세포 실험에서 KH001(MTA+KH001)의 효능을 확인하기 위해 상아모세포 분화 유전자 마커의 발현 변화를 분화 일자별로 살펴본 결과이다. MTA는 치수가 노출되거나 치수가 노출은 안 되었지만 얇은 두께의 상아질만 남아 치수에 손상이 갈 것으로 예상하는 경우에 적용하는 제재이다. 그러므로 노출된 치수 부위에 원래 존재하던 상아모세포는 사멸할 가능성이 크며 이를 회복하여 노출된 치수 부분에 삼차 상아질을 형성하기 위해서는 치수 세포가 상아모세포로 분화하도록 유도하는 기능이 중요하다.

도 5를 참고하면 사람 치수 세포의 분화 과정에서 상아모세포 마커 및 광화 관련 유전자의 발현을 살펴보았을 때 분화 7일 차에 MTA와 CPNE7 기능성 펩타이드를 같이 처리한 군의 DMP1, CPNE7의 발현량이 MTA만 처리한 군에 비해 유의미하게 증가하였다. 그러나, 14일 차에는 DSPP, DMP1, CPNE7 유전자의 발현이 MTA와 CPNE7 기능성 펩타이드를 같이 처리한 군에서 MTA만 처리한 군보다 유의미하게 높게 관찰되었다. BSP는 뼈양 상아질의 형성에 관여하는 유전자로써 7일 차와 14일 차에 모두 MTA만 처리한 군보다 유의미하게 증가하지는 않았으며, MTA만을 처리하는 경우와 동등한 정도로 발현되는 것으로 관찰되었다.

실시예 3-4: MTA-조정배지 처리에 따른 상아모세포 분화 및 광화능 평가

MTA가 처리된 환경하에서 CPNE7 기능성 펩타이드가 상아모세포의 분화 및 광화능에 미치는 영향을 알아보기 위해 Alizarin red staining(ARS)을 시행하였다.

사람 치수 세포(계대수 2-4)를 6-well plate에 1 × 10⁵ cells/well의 밀도로 접종한 후 80% 정도의 confluency를 도달하면 각각의 대조군 및 실험군에 해당하는 분화 배지를 7일, 14일, 21일간 처리하였고 분화 배지는 2일마다 교환하였다.

세포의 고정을 위해 4% 파라폼알데하이드를 4°C에서 15분 동안 처리하고 Alizarin red S staining Quantification kit를 이용하여 40 mM의 Alizarin red S를 상온에서 30분간 처리하여 광화 물을 염색하였다.

그 후 정량적 분석을 위해 10% 아세트산을 실온에서 30분간 처리한 후 원심분리하여 상층액을 500 μL만큼 추출하여 중성화를 위해 10% ammonium hydroxide를 200 μL 더해 주었다.

그 후 ARS standard와 함께 흡광도를 405nm에서 측정하였으며 모든 실험은 세 개의 세트로 진행하였다.

도 6은 MTA-conditioned media를 처리한 사람 치수 세포 실험에서 KH001(치수복조용 조성물)의 효능을 확인하기 위해 상아모세포 분화 및 광화능 변화를 살펴본 결과이다.

MTA를 적용하는 임상적인 상황은 치수가 노출되어 상아모세포가 사멸한 상황으로, 이러한 상황에서 치수를 유지하기 위해서는 치수 세포를 상아모세포로 분화를 유도하는 것과 더불어 분화된 상아모세포가 광화 물질을 잘 분비하여야 한다. 이러한 과정을 통해 노출된 치수 부위가 삼차 상아질로 메워질 수 있으며 삼차 상아질의 형성을 유도하므로 MTA는 생리활성물질로 여겨진다. 그러나 MTA는 상아세관을 가지는 생리적 상아질 또는 반응성 상아질과는 다르게 뼈와 유사한 수복 상아질의 형성을 유도하는 것을 알 수 있다.

도 6을 참고하면, 7일 차, 14일 차 모든 시점에서 대조군 대비 MTA와 KH001을 같이 처리한 군이 대조군에 비하여 통계적으로 유의미하게 흡광도가 증가한 것을 확인할 수 있다. 14일 차에는 MTA만 처리한 군 대비 MTA와 KH001을 같이 처리한 군의 광화능 정도가 통계적으로 유의미하게 차이를 보임을 알 수 있다.

실시예 3-5. 치수복조용 조성물 처리에 따른 상처 치유능 및 세포 이동능의 평가

사람 치수 세포(계대수 2-4)를 6-well plate에 1 × 10⁵ cells/well의 밀도로 접종한 후 10% α-MEM에 세포를 배양하였다.

세포를 접종한 다음 날 각각의 well의 중앙부위를 200 μL의 파이펫 팁을 이용하여 긁어내 세포가 없는 '상처 부위'를 만들었다.

그 후 24시간 후에 정립 현미경의 10배율 대물렌즈를 사용하여 촬영한 후 각각의 사진들은 ImageJ 프로그램을 이용하여 분석하였다. 모든 실험은 세 번의 세트로 구성하였다.

도 7은 MTA-conditioned media를 처리한 사람 치수 세포 실험에서 KH001의 효능을 확인하기 위해 상처 치유능 및 세포 이동능 변화를 살펴본 결과이다.

MTA가 적용되는 치수 복조술은 상아모세포 및 치수 세포에 손상이 가 있는 상태에서 적용하는데, 이러한 상태는 치수에 일종의 '상처'가 나 있는 상태로 세포가 손실되거나 손상된 부위로 주변의 세포가 모여드는 과정이 선행되어야 하므로 이러한 과정을 모방한 세포 실험 모델로써 상처치유 모델을 통하여 치수복조용 조성물에 의한 상처 치유능 및 세포 이동능 변화를 살펴본 것이다.

도 7을 참고하면 MTA가 처리된 환경하에서 KH001이 상아모세포의 상처 치유능 및 세포 이동능에 미치는 영향을 알아보기 위해 상처치유분석을 시행한 결과 통계적으로 유의하지는 않았지만, MTA를 처리한 군이 대조군(Ctrl) 대비 세포 이동능이 떨어지는 경향성을 보였다. 이에 반하여 MTA와 KH001을 같이 처리한 군에서는 대조군과 유사한 수준까지 세포 이동능이 회복되는 경향을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 치수가 노출된 상황에 MTA만 적용하기보다 MTA에 KH001이 함께 복합된 제품을 처리하는 것이 유리함을 알 수 있다.

실시예 3-6. 치수복조용 조성물(MTA 시작품)의 상아질 세관 투과 능력 평가

가. 비글견의 준비

In vivo 테스트를 위해 총 10마리의 비글견(만 2살)이 사용되었다. 각각의 비글견의 치주 상태에 따라 4~6개의 상악 소구치와 6개의 하악 소구치가 사용되었다.

대조군과 실험군은 각각의 비글견에 할당되어 개별 영양, 행동 및 치수 상태로 인해 발생할 수 있는 오차를 제거하였다. 동물을 이용한 모든 실험은 서울대학교 동물병원 동물관리위원회(SNU-180416-2-1, SNU-171020-5-2)에서 승인한 프로토콜을 따라 수행되었다.

나. 세포투과능력 평가

생체 내에서 10μg/mL의 CPNE7 기능성 펩타이드(KH001)가 함유된 액체와 ENDOCEM MTA 파우더를 제조사의 지시에 따라 섞은 후 비글견 치아의 치수에 가까운 치경부 와동에 적용한 후 치수복조용 조성물(MTA 시작품)의 상아질 세관 투과 능력을 살펴보았다.

비글견의 치경부에 #4 round bur의 지름의 절반만큼의 깊이로 접시 모양의 Class V 와동을 형성한 후 형광을 띄는 로다민을 연결한 CPNE7 기능성 펩타이드(KH001)가 함유된 MTA를 적용한 후 4% PFA로 고정하고 디지털 저속 다이아몬드 절단기를 이용하여 시상면 방향, 0.1mm의 두께로 시편을 제작하였다.

도 8은 치수복조용 조성물의 상아질 세관 투과 능력을 살펴보기 위해 공초점 현미경으로 찍은 사진이다. 도 8의 A는 시편 제작 과정에 대한 모식도이고 B와 C는 각각 상아질 및 치수에서의 KH001의 도달 유무를 살펴본 결과이다

도 8을 참고하면 10 ug/mL의 CPNE7 기능성 펩타이드를 그대로 ENDOCEM MTA 파우더와 섞었을 때 CPNE7 기능성 펩타이드가 상아세관을 따라 잘 흘러 들어갔으며 치수까지 잘 도달한 것을 볼 수 있다.

실제 MTA를 적용하는 경우인 치수가 노출되거나 치수에 가까울 정도로 얇게 상아질이 남겨져 있는 상황보다 훨씬 두꺼운 상아질이 남겨져 있음에도 불구하고 CPNE7 기능성 펩타이드가 상아세관을 통해 치수까지 잘 도달하였으므로, 치수 복조술을 시행할 때 CPNE7 기능성 펩타이드가 적용된 치수복조용 조성물이 노출된 치수를 봉쇄하고 효과적인 수복효과를 제공할 것임을 예상할 수 있다.

본 명세서와 도면에는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 개시하였으며, 비록 특정 용어들이 사용되었으나, 이는 단지 본 발명의 기술 내용을 쉽게 설명하고 발명의 이해를 돕기 위한 일반적인 의미에서 사용된 것이지, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 여기에 개시된 실시예 외에도 본 발명의 기술적 사상에 바탕을 둔 다른 변형예들이 실시 가능하다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것이다.

Claims (11)

1. 서열번호 96의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는, 상아질 접착용 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
   
6. 제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 상기 펩타이드가 반복되어 연결된 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 치과용 수복 재료를 손상된 치질에 접착하기 위하여 사용되는 것인 상아질 접착용 조성물.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 손상된 치질은 치아우식증 또는 파절된 치질인 것을 특징으로 하는 상아질 접착용 조성물.
   
10. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
11. 제1항의 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하여 손상된 치질을 개선 또는 치료함으로써 치료이후의 치질의 괴사, 치아 삭제 또는 치아 손실을 방지하는 하는 방법.

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