KR20180076996A - 신규한 펩타이드 - Google Patents

신규한 펩타이드 Download PDF

Info

Publication number
KR20180076996A
KR20180076996A KR1020170077348A KR20170077348A KR20180076996A KR 20180076996 A KR20180076996 A KR 20180076996A KR 1020170077348 A KR1020170077348 A KR 1020170077348A KR 20170077348 A KR20170077348 A KR 20170077348A KR 20180076996 A KR20180076996 A KR 20180076996A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peptide
lys
tissue
dentin
pulp
Prior art date
Application number
KR1020170077348A
Other languages
English (en)
Inventor
박주황
이지현
Original Assignee
주식회사 하이센스바이오
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 하이센스바이오 filed Critical 주식회사 하이센스바이오
Priority to KR1020170077348A priority Critical patent/KR20180076996A/ko
Publication of KR20180076996A publication Critical patent/KR20180076996A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K4/00—Peptides having up to 20 amino acids in an undefined or only partially defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/03—Peptides having up to 20 amino acids in an undefined or only partially defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/312—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on dental health
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 신규한 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 펩타이드를 포함하는 약학 조성물, 의약외품 조성물 및 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.

Description

신규한 펩타이드{Novel peptide}
본 발명은 신규한 펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 신규한 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 펩타이드를 포함하는 치수질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 치수질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물 및 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
치수는 치아의 내부에 있는 치수강을 채우고 있는 부드러운 결합조직으로 신경과 혈관이 풍부하게 분포되어 있으며 상아질의 표층에까지 이르는 곳을 말한다. 이런 치수에 생기는 병변을 치수질환이라 한다.
치수 질환의 원인은 매우 다양하나, 대부분의 경우는 충치에 의한 세균감염과 치아의 천공, 파절, 균열, 치주낭을 통해서 치수내부로의 감염에 의해 발생한다. 또한 외상, 마모, 치아 균열, 치료 시 치과용 기구에서 나오는 열과 마찰 등도 유발할 수 있다. 세균감염에 의한 치수염은 치근단 질환과 치주질환으로 확대 될 수 있다. 치수질환이 발생 하였을 때, 치수 충혈, 치수염, 치수 괴사의 순으로 진행된다. 치수 괴사의 경우, 치수가 죽어서 치수에 혈액공급이 전혀 안되기 때문에 전체 치주 조직이 사라져서 나중에는 치근단 질환 또는 치아전체의 이상이 초래 될 수 있다.
치수, 치근단 질환의 치료는 치수 복제제와 치근관 충전재를 사용하는데, 일반적으로 칼슘 히드록사이드, MTA(Mineral Trioxide Aggregate), 거타퍼차(Gutta-percha) 등이 이용되어 왔다. MTA의 경우, 밀봉력과 생체친화적인 성질을 가지고 있어서 치료에 효과를 보이나, 상대적으로 치과 치료제로써 높은 비용문제가 발생하고, 변색이 되어 심미적 문제가 발생한다. 거타퍼차의 경우, 비용이 경제적이고 유동성이 좋으나, 치수생활력을 상실하게 되는, 생리적이지 못한 치료방법이다. 현재까지 상아질-치수 질환을 치료하는 보존적인 치료 방법은 치료한 치아가 약해지거나, 부서지기 쉬우며, 재감염의 위험을 가지게 된다.
이에 따라, 상기 치수질환을 효과적으로 치료할 수 있는 치료제를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 한국공개특허 제2012-0089547호에는 법랑모세포, 애피컬 버드세포 또는 이들의 배양액을 유효성분으로 포함하는 경조직 형성 및, 상아질 또는 치수조직 재생용 조성물이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2009-0033643호에는 새로운 치소낭 유래의 치아 줄기세포 및 그의 배양 방법이 개시되어 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 보다 효과적으로 치수질환을 치료할 수 있는 제제를 개발하기 위하여, 예의 연구노력한 결과, 상아질 또는 치수조직의 재생촉진용 세포치료 및 상아질 지각과민증 치료 효과를 나타내는 펩타이드를 개발하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 신규한 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 치수질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 치수질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 치수질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 보다 효과적으로 치수질환을 치료할 수 있는 제제를 개발하기 위하여, 다양한 연구를 수행한 결과, 10개의 아미노산으로 구성된 신규한 펩타이드를 개발하였다.
상기 개발된 신규한 펩타이드는 치수질환 치료효과를 나타낼 수 있는 펩타이드의 아미노산 서열을 일부 치환하여 제작된 것으로서, 상아모세포 분화마커 유전자인 Dspp, Dmp1 및 Nestin 유전자의 발현수준을 증가시킬 수 있어, 상아질 재생을 촉진하는 효과를 나타내면서도, 치수조직의 세포에 대하여는 어떠한 세포독성도 나타내지 않음을 확인하였다.
또한, 상기 펩타이드를 치수조직세포와 함께 포함하는 이식물을 제작하고, 상기 제작된 이식물을 면역시스템이 손상된 마우스의 피하조직에 이식하고, 6주 내지 12주가 경과된 후, 이식된 조직을 분석한 결과, 생체내 상아질-치수조직과 가장 유사한 형태의 상아질-치수 유사 조직이 형성되고, 콜라겐의 형성수준이 증가하며, 상아모세포 특이적 분화 마커 유전자인 DSP의 발현수준이 증가하는 반면, 골모세포 특이적 분화 마커인 BSP의 발현수준은 특별히 증가되지 않음을 확인하였다.
아울러, 상기 이식된 조직의 형상을 주사 전자현미경을 통해 분석한 결과, 기존의 상아질 벽에 상아모세포-유사 세포가 울타리배열로 존재하였고, 이들의 세포 돌기는, 늘어난 핵과 함께, 기존의 상아질 세관을 향해 확장됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 펩타이드는 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있었다. 이러한 효과를 나타내는 본 발명의 펩타이드는 지금까지 전혀 보고되지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다.
상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는, 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드를 제공한다.
K-Y-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 (일반식 1)
상기 일반식 1에서,
R1은 아르기닌(R), 리신(K) 또는 글루타민(Q)이고;
R2는 아르기닌(R) 또는 글루타민(Q)이며;
R3, R4 및 R5는 각각 아르기닌(R) 또는 리신(K)이고;
R6는 아스파라긴(N) 또는 세린(S)이며; 및
R7 및 R8은 리신(K) 또는 타이로신(Y)이다.
본 발명의 용어, "상아질(dentine)"이란, "치질(齒質)"이라고도 호칭되고, 치아의 대부분을 이루고있는, 노란 빛을 띤 흰색의 단단한 조직을 의미한다. 상기 상아질은 치관부(齒冠部)에서는 에나멜질, 치근부(齒根部)에서는 시멘트질로 덮여 있으므로 치아의 표면으로는 드러나지 않으나, 나이가 많아짐에 따라 에나멜질이 마멸되면 치관의 선단부나 교합면(咬合面)에 상아질이 노출될 수 있다. 상기 상아질은 일종의 골조직이지만 상아질을 만들고 있는 세포의 본체는 치수(齒髓) 속에 있고, 그 돌기만 상아질 속으로 뻗어 나온다는 점에서 일반적인 골조직과 구별된다.
본 발명의 용어, "치수조직(dental pulp)"이란, "치수"라고도 하며, 치아의 내부에 있는 치수강을 채우고 있는 부드러운 결합조직을 의미한다. 해부학적으로는, 신경과 혈관이 풍부하게 분포되어 있으며 상아질의 표층에까지 이르는 곳까지의 영역을 의미할 수도 있다.
본 발명에서 제공하는 펩타이드는 세포독성을 나타내지 않으면서도, 상아모세포 분화마커 유전자인 Dspp, Dmp1 및 Nestin 유전자의 발현수준을 증가시킬 수 있으며, 치수조직 세포와 함께 생체내에 이식할 경우, 상기 치수조직 세포가 상아질/치수조직-유사 조직을 형성하는 특징을 나타낼 수 있다.
본 발명에서 제공하는 펩타이드는, 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료효과를 나타낼 수 있는 한, 이를 구성하는 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 변이체 펩타이드도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 범주에 포함된다.
일반적으로, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 펩타이드의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 상아질 또는 치수조직의 재생촉진능이 증가한 펩타이드를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에서 제공하는 서열번호 1의 펩타이드의 3번에 위치한 산성 아미노산인 글루타민은 염기성 아미노산인 리신 또는 아르기닌으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있고; 서열번호 1의 펩타이드의 4번 또는 5번에 위치한 염기성 아미노산인 아르기닌은 산성 아미노산인 글루타민 또는 염기성 아미노산인 리신으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있으며; 서열번호 1의 펩타이드의 6번, 7번 또는 9번에 위치한 염기성 아미노산인 리신은 염기성 아미노산인 아르기닌 또는 방향족 아미노산인 타이로신으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있고; 서열번호 1의 펩타이드의 8번에 위치한 산성 아미노산인 아스파라긴은 중성 아미노산인 세린으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있으며; 서열번호 1의 펩타이드의 10번에 위치한 방향족 아미노산인 타이로신은 염기성 아미노산인 리신으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있다.
이처럼, 본원발명의 펩타이드를 구성하는 산성 아미노산, 염기성 아미노산 또는 방향족 아미노산은 각각 이와 다른 산성 아미노산, 염기성 아미노산, 중성 아미노산 또는 방향족 아미노산으로 치환되어도, 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 펩타이드를 구성하는 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 변이체 펩타이드도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 범주에 포함됨은 자명하다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 그의 N-말단 또는 C-말단에 임의의 아미노산이 부가된 형태를 갖더라도, 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있으므로, 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 범주에 포함된다. 일 예로서, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 1 내지 300개의 아미노산이 부가된 형태가 될 수 있고, 다른 예로서, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 1 내지 100개의 아미노산이 부가된 형태가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 1 내지 24개의 아미노산이 부가된 형태가 될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명에서 제공하는 일반식 1에 해당하는 96종의 펩타이드를 합성하고, 상기 합성된 펩타이드가 상아모세포 분화마커 유전자인 Dspp 유전자의 발현수준에 미치는 영향을 검증하였다. 그 결과, 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 MDPC-23 세포(대조군)에서 측정된 상아모세포 분화마커인 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 비하여, 상기 96종의 펩타이드를 처리한 MDPC-23 세포에서 상기 Dspp 유전자의 mRNA 수준이 모두 1.3배 이상의 값을 나타냄을 확인하였다(표 13 내지 24).
지금까지 보고된 바에 의하면, DSPP의 mRNA발현 수준이 증가되면, 상아모세포 분화 및 상아질 재생이 촉진된다고 알려져 있으므로, 상기 Dspp 유전자의 mRNA 수준을 증가시키는 효과를 나타내는 상기 96종의 펩타이드는 상아모세포 분화 및 상아질 재생을 촉진하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다(Taduru Sreenath et al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, No. 27, Issue of July 4, pp. 24874?24880, 2003; William T. Butler et al, Connective Tissue Research, 44(Suppl. 1): 171?178, 2003).
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 이용하여 합성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기서열을 포함할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터를 포함하는 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 상기 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "발현벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되고, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내어야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.
본 발명의 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 펩타이드의 분리를 촉진하기 위하여 상기 펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널 및 개시코돈은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.
아울러, 상기 발현벡터는 상기 펩타이드의 검출이 용이하도록 하기 위하여, 임의로 엔도펩티다아제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "태그(tag)"란, 정량가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 의미하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광분자일 수도 있고; Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그, 스트랩타비딘 태그 등의 에피톱 태그일 수도 있다. 특히, 에피톱 태그를 사용할 경우, 바람직하게는 6개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 보다 바람직하게는 8개 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 태그를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 상술한 본 발명의 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는데, 이때 사용되는 벡터는 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등)가 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.
본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 본 발명에서 제공하는 발현벡터를 숙주에 도입하여 형질전환시킴으로써 제작될 수 있고, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 상기 펩타이드를 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 형질전환제의 제작에 사용되는 숙주 역시 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균, 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로소필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
상기 형질전환체는 또한 본 발명의 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드를 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드를 생산하는 방법은 (a) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 배양물로부터 본 발명의 펩타이드를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드를 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산 암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.
또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.
또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 상기 펩타이드의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 100 시간에서 달성된다.
아울러, 배양물로부터 상기 펩타이드를 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 상기 펩타이드의 회수에 사용될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 치수질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드는 치수조직 세포와 함께 생체내에 이식할 경우, 상기 치수조직 세포가 상아질/치수조직-유사 조직을 형성하는 것을 촉진시킬 수 있으므로, 치수조직이 손상되어 발생하는 치수질환 치료용 약학 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물에 포함되는 펩타이드는 펩타이드 단독의 형태로 사용될 수도 있고, 상기 펩타이드가 2회 이상 반복되어 연결된 폴리펩타이드의 형태로 사용될 수도 있으며, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 치수질환 치료효과를 나타내는 약물이 결합된 복합체 형태로 사용될 수도 있다.
본 발명의 용어 "치수질환"이란, 상기 치수조직의 손상으로 인하여, 치수조직과 이에 결합된 상아질이 손상되어 발병되는 질환을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 치수질환은 본 발명의 펩타이드에 의하여 치료효과를 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 상아질 지각과민증, 치수충혈, 치수염, 치수변성, 치수의 괴사 및 괴저증 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "예방"이란, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 치수질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여로 치수질환의 발생을 저해 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "치료"란, 본 발명의 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물을 치수질환의 치료가 요구되는 개체에 투여하여 상아질 또는 치수조직의 재생을 촉진함으로써, 치수질환의 치료가 수행되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은, 상기 펩타이드에 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체(자연적 또는 비자연적 담체), 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 치수질환 치료용 약학 조성물의 형태로 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 치수질환이 유발된 부위에 투여할 수 있는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 콜라겐 등을 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 특히, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제, 연고제(예를 들어, 치수이장재 등) 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함된 상기 펩타이드의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로로 투여하거나 공지된 치수질환 치료용 약학 조성물과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng 내지 약 100 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 10 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서 상기 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 치수질환이 발병된 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 치수질환 치료방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "개체"란 치수질환의 치료가 요구되는 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물 등을 제한 없이 포함할 수 있으나, 상기 질환이 발병된 개체 중에서 인간을 제외한다.
본 발명의 치수질환 치료용 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 구강내 투여 또는 구강내 주사 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 치수질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "개선"이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 개선은 본 발명의 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물을 치수질환의 치료가 요구되는 개체에 투여하여 상아질 또는 치수조직의 재생을 촉진함으로써, 치수질환의 증상이 호전되거나 또는 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 용어 "의약외품"이란, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유ㆍ고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병을 막기 위한 살균ㆍ살충제 등이 이에 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드를 포함하는 의약외품 조성물의 종류나 제형은 특별히 제한되지 않으나, 일 예로서, 구강용 소독 청결제, 구강청정용품, 치약, 치실, 구강용 연고제 등일 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 치수질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 식품은 치수질환의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다.
구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 본 발명의 펩타이드를 음료, 차류, 향신료, 껌류, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져 오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
본 발명의 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 치수질환의 예방 또는 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있으므로, 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 내지 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 내지 0.03 g이 될 수 있다.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 식품 조성물은 치수질환의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 구체적으로 본 발명의 펩타이드를 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드는 우수한 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 효과를 나타내므로, 다양한 상아질과 치수 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 제제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1a는 본 발명에서 제공하는 각 펩타이드가 상아모세포 분화 마커 유전자인 DSPP 발현에 미치는 영향을 그룹별로 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1b는 본 발명의 펩타이드가 처리된 MDPC-23 세포에서 상아모세포 분화마커인 Dspp 유전자의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1c는 본 발명의 그룹 11 및 12의 펩타이드가 처리된 MDPC-23 세포에서 상아모세포 분화마커 유전자인 Dspp, Dmp1 및 Nestin 유전자의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1d는 치수조직 세포에 대한 본 발명의 펩타이드의 세포독성을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식한 다음, 이에 의해 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 C는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: A 200㎛, B 100㎛, C 50㎛)이고; D 내지 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: D 200㎛, E 100㎛, F 50㎛)이며; G 내지 I는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: G 200㎛, H 100㎛, I 50㎛)이고; J 내지 L은 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: J 200㎛, K 100㎛, L 50㎛)이다.
도 3은 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 6주동안 이식하여 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직에 포함된 콜라겐의 형성 수준을 나타내는 현미경사진으로서, A 내지 C는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: A 500㎛, B 200㎛, C 50㎛), D 내지 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내며(크기바: D 500㎛, E 200㎛, F 50㎛), G 내지 I는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: G 500㎛, H 200㎛, I 50㎛), J 내지 L은 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: J 500㎛, K 200㎛, L 50㎛).
도 4는 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 6주동안 이식하여 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직에서, 상아모세포 특이적 분화 마커 유전자인 DSP와 골모세포 특이적 분화 마커인 BSP의 발현수준을 평가한 결과를 나타내는 면역염색 사진으로서, A 및 E는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고, B 및 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내며, C 및 G는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고, D 및 H는 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내며, A, B, C 및 D의 화살표는 새롭게 형성된 상아질-유사 조직에서 DSP가 발현된 부분을 나타내고, E, F, G 및 H의 화살촉은 새롭게 형성된 뼈 유사 조직에서 BSP가 발현된 부분을 나타낸다. 크기바는 50㎛이다.
도 5는 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식한 다음, 이에 의해 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 C는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: A 500㎛, B 200㎛, C 50㎛)이고; D 내지 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: D 500㎛, E 200㎛, F 50㎛)이며; G 내지 I는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: G 500㎛, H 200㎛, I 50㎛)이고; J 내지 L은 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: J 500㎛, K 200㎛, L 50㎛)이다.
도 6은 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식하여 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직에 포함된 콜라겐의 형성 수준을 나타내는 현미경사진으로서, A 내지 C는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: A 500㎛, B 200㎛, C 50㎛), D 내지 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내며(크기바: D 500㎛, E 200㎛, F 50㎛), G 내지 I는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: G 500㎛, H 200㎛, I 50㎛), J 내지 L은 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: J 500㎛, K 200㎛, L 50㎛).
도 7은 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식하여 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직에서, 상아모세포 특이적 분화 마커 유전자인 DSP와 골모세포 특이적 분화 마커인 BSP의 발현수준을 평가한 결과를 나타내는 면역염색 사진으로서, A 및 E는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고; B 및 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내며; C 및 G는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고; D 및 H는 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내며; A, B, C 및 D의 화살표는 새롭게 형성된 상아질-유사 조직에서 DSP가 발현된 부분을 나타내고; E, F, G 및 H의 화살촉은 새롭게 형성된 뼈 유사 조직에서 BSP가 발현된 부분을 나타낸다. 크기바는 50㎛이다.
도 8은 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식하여 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직의 내부 구조를 나타내는 주사형 전자 현미경 사진으로서, A 및 B는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: A 50㎛, B 20㎛); C 및 D는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드(서열번호 96)를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: C 50㎛, D 20㎛); E 및 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: E 50㎛, F 20㎛).
도 9는 본 발명의 펩타이드를 포함하는 이식물을 인간 치아의 치근관 공간에 이식한 후, 이로부터 형성되는 상아아모세포/치수조직-유사 조직을 분석한 결과를 나타내는 현미경 사진 및 주사형 전자현미경 사진으로서, A 및 B는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물이 이식된 조직을 염색한 결과를 나타내고(크기바: A 500㎛, B 50㎛); C, D 및 D'은 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드(서열번호 96)를 포함하는 이식물이 이식된 조직을 염색한 결과를 나타내며, D는 C의 1번 박스의 확대도이고, D'은 C의 2번 박스의 확대도이며(크기바: C 500㎛, D 50㎛, D' 50㎛); E 및 F는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물이 이식된 조직을 주사형 전자 현미경으로 촬영한 결과를 나타내고(크기바: E 50㎛, F 10㎛); G 및 H는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드(서열번호 96)를 포함하는 이식물이 이식된 조직을 주사형 전자 현미경으로 촬영한 결과를 나타내며(크기바: G 50㎛, H 10㎛); P는 재생된 치수조직을 나타내고, De는 기존의 상아질 벽을 나타내며, DT는 기존의 상아질 세관을 나타내고, Od는 상아모세포를 나타내며, OP는 상아모세포 돌기를 나타내고, D에 있는 화살표는 상아모세포 돌기와 함께 상아모세포-유사 세포가 재생된 것을 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드의 합성
본 발명자들은 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 효과를 나타내는 펩타이드(서열번호 1)를 9-플루오르닐메틸옥시카보닐(9-fluorenylmethyloxycarbonyl, Fmoc) 방법으로 합성하고, 상기 합성된 펩타이드의 아미노산을 치환하여 각 그룹의 펩타이드를 합성하였다(표 1 내지 12).
N-KYQRRKKNKY-C(서열번호 1)
먼저, 그룹 1의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드 또는 상기 서열번호 1의 펩타이드의 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 1).
그룹 1의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
1
2
3
4
5
6
7
8		 KYQRRKKNKY
KYQRRKRNKY
KYQRRRKNKY
KYQRRRRNKY
KYQRKKKNKY
KYQRKRKNKY
KYQRKKRNKY
KYQRKRRNKY
다음으로, 그룹 2의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하여 합성하였다(표 2).
그룹 2의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
9
10
11
12
13
14
15
16		 KYQRRKKSKY
KYQRRKRSKY
KYQRRRKSKY
KYQRRRRSKY
KYQRKKKSKY
KYQRKRKSKY
KYQRKKRSKY
KYQRKRRSKY
다음으로, 그룹 3의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하여 합성하였다(표 3).
그룹 3의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
17
18
19
20
21
22
23
24		 KYQRRKKNYK
KYQRRKRNYK
KYQRRRKNYK
KYQRRRRNYK
KYQRKKKNYK
KYQRKRKNYK
KYQRKKRNYK
KYQRKRRNYK
다음으로, 그룹 4의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하며, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하고, 10번 아미노산을 리신으로 치환하여 합성하였다(표 4).
그룹 4의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
25
26
27
28
29
30
31
32		 KYQRRKKSYK
KYQRRKRSYK
KYQRRRKSYK
KYQRRRRSYK
KYQRKKKSYK
KYQRKRKSYK
KYQRKKRSYK
KYQRKRRSYK
다음으로, 그룹 5의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아르기닌으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 5).
그룹 5의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
33
34
35
36
37
38
39
40		 KYRQRKKNKY
KYRQRKRNKY
KYRQRRKNKY
KYRQRRRNKY
KYRQKKKNKY
KYRQKRKNKY
KYRQKKRNKY
KYRQKRRNKY
다음으로, 그룹 6의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아르기닌으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하여 합성하였다(표 6).
그룹 6의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
41
42
43
44
45
46
47
48		 KYRQRKKSKY
KYRQRKRSKY
KYRQRRKSKY
KYRQRRRSKY
KYRQKKKSKY
KYRQKRKSKY
KYRQKKRSKY
KYRQKRRSKY
다음으로, 그룹 7의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아르기닌으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하며, 10번 아미노산을 리신으로 치환하여 합성하였다(표 7).
그룹 7의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
49
50
51
52
53
54
55
56		 KYRQRKKNYK
KYRQRKRNYK
KYRQRRKNYK
KYRQRRRNYK
KYRQKKKNYK
KYRQKRKNYK
KYRQKKRNYK
KYRQKRRNYK
다음으로, 그룹 8의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아르기닌으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하며, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하고, 10번 아미노산을 리신으로 치환하여 합성하였다(표 8).
그룹 8의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
57
58
59
60
61
62
63
64		 KYRQRKKSYK
KYRQRKRSYK
KYRQRRKSYK
KYRQRRRSYK
KYRQKKKSYK
KYRQKRKSYK
KYRQKKRSYK
KYRQKRRSYK
다음으로, 그룹 9의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 리신으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 9).
그룹 9의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
65
66
67
68
69
70
71
72		 KYKQRKKNKY
KYKQRKRNKY
KYKQRRKNKY
KYKQRRRNKY
KYKQKKKNKY
KYKQKRKNKY
KYKQKKRNKY
KYKQKRRNKY
다음으로, 그룹 10의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 리신으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하여 합성하였다(표 10).
그룹 10의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
73
74
75
76
77
78
79
80		 KYKQRKKSKY
KYKQRKRSKY
KYKQRRKSKY
KYKQRRRSKY
KYKQKKKSKY
KYKQKRKSKY
KYKQKKRSKY
KYKQKRRSKY
다음으로, 그룹 11의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 리신으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하며, 10번 아미노산을 리신으로 치환하여 합성하였다(표 11).
그룹 11의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
81
82
83
84
85
86
87
88		 KYKQRKKNYK
KYKQRKRNYK
KYKQRRKNYK
KYKQRRRNYK
KYKQKKKNYK
KYKQKRKNYK
KYKQKKRNYK
KYKQKRRNYK
끝으로, 그룹 12의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 리신으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하며, 9번 아미노산을 타이로신으로 치환하고, 10번 아미노산을 리신으로 치환하여 합성하였다(표 12).
그룹 12의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
89
90
91
92
93
94
95
96		 KYKQRKKSYK
KYKQRKRSYK
KYKQRRKSYK
KYKQRRRSYK
KYKQKKKSYK
KYKQKRKSYK
KYKQKKRSYK
KYKQKRRSYK
실시예 2: 상아모세포를 이용한 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드의 효과검증
실시예 2-1: DSPP (dentin sialophosphoprotein ) 프로모터 활성에 미치는 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드의 영향
먼저, 마우스 유래 상아모세포인 MDPC-23 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서, 5%의 CO2 및 37℃ 조건으로 배양하였다.
다음으로, 상기 배양된 MDPC-23 세포를 24웰 플레이트에 각 웰당 5 X 104 세포수로 분주하고, 24시간 동안 배양한 다음, 리포펙타민 Plus™ 시약을 이용하여 상기 배양된 세포에, pGL3 벡터에 DSPP 프로모터와 루시퍼라제 유전자가 도입된 재조합 벡터를 도입하여 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 MDPC-23 세포에 상기 실시예 1에서 합성된 그룹 1 내지 12의 펩타이드를 각각 처리하고 48시간 동안 배양한 다음, 상기 각각의 형질전환된 MDPC-23 세포에서 루시퍼라제 활성을 측정하고, 각 그룹별로 산출된 평균수준을 비교하였다(도 1a). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 형질전환된 MDPC-23 세포를 사용하였다.
도 1a는 본 발명에서 제공하는 각 펩타이드가 상아모세포 분화 마커 유전자인 DSPP 발현에 미치는 영향을 그룹별로 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1a에서 보듯이, 본 발명에서 제공하는 각 펩타이드는 전체적으로 대조군에서 측정된 루시퍼라제 활성수준의 약 1.3 배이상의 값을 나타내었으나, 각 그룹별로 차이를 나타내며, 그룹 12의 펩타이드가 가장 높은 수준의 루시퍼라제 활성을 나타내고, 다음으로 높은 수준의 루시퍼라제 활성을 나타내는 펩타이드는 그룹 11의 펩타이드임을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 Dspp 프로모터를 활성화시키는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 2-2: 상아모세포 분화마커 유전자인 Dspp 유전자의 발현수준에 미치는 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드의 영향
상기 실시예 2-1에서 배양한 MDPC-23 세포에 상기 실시예 1에서 합성된 각 그룹의 펩타이드를 처리하고, 48시간 동안 배양한 다음, 상기 MDPC-23 세포에서 발현되는 상아모세포 분화마커 유전자인 Dspp 유전자의 mRNA 수준을 측정하고, 상기 측정된 각각의 Dspp 유전자의 mRNA 수준을, 대조군에서 측정된 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 대한 상대적 비율로 환산하였다(표 13 내지 24). 또한, 각 그룹의 펩타이드에 따라 측정된 Dspp 유전자의 mRNA 수준의 평균값을 각 그룹별로 비교하였다(도 1b). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 MDPC-23 세포를 사용하였다.
상기 Dspp 유전자의 발현수준은 RT-PCR 및 실시간 PCR 분석을 통해 측정하였다: 구체적으로, TRIzol 시약을 이용하여 상기 MDPC-23 세포로부터 전체(total) RNA를 분리하였다. 2 ㎍의 전체 RNA와 역전사효소 1 ul와 0.5 ㎍의 올리고(oligo; dT)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 실시간 중합효소 연쇄반응에 이용하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응은 하기 각 프라이머와 SYBR GREEN PCR Master Mix(Takara, 일본)를 이용하여 ABI PRISM 7500 시퀀스 검출 시스템(sequence detection system)(Applied Biosystems)에서 진행되었다. 실시간 중합효소 연쇄반응은 94℃, 1 분 ; 95℃, 15 초 - 60℃, 34 초를 40 사이클(cycles) 반복하는 조건으로 진행하였다. 결과의 분석은 comparative cycle threshold(CT) 방법을 이용하여 평가하였다. 이때, 내부대조군으로는 Gapdh 유전자를 사용하였고, 측정값은 3회 반복실험을 수행한 후, 이의 평균값 및 표준편차 값을 사용하였다.
Dspp_R: 5'-CTGTTGCTAGTGGTGCTGTT-3'(서열번호 97)
Dmp1_F: 5'-CATTCTCCTTGTGTTCCTTTGGG-3'(서열번호 98)
Gapdh_F: 5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'(서열번호 99)
Gapdh_R: 5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'(서열번호 100)
그룹 1의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
1
2
3
4
5
6
7
8		 1.754
1.646
1.464
1.855
1.639
1.746
1.864
1.639		 0.132
0.092
0.221
0.102
0.057
0.091
0.132
0.032
그룹 2의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
9
10
11
12
13
14
15
16		 1.854
1.746
1.639
1.548
1.685
1.846
1.964
1.739		 0.032
0.052
0.201
0.027
0.077
0.141
0.279
0.092
그룹 3의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
17
18
19
20
21
22
23
24		 2.117
2.319
1.931
2.553
1.893
2.412
2.171
2.212		 0.209
0.092
0.102
0.099
0.132
0.072
0.281
0.111
그룹 4의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
25
26
27
28
29
30
31
32		 2.371
2.193
1.993
2.453
1.883
2.512
2.371
2.219		 0.089
0.052
0.202
0.192
0.101
0.209
0.139
0.302
그룹 5의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
33
34
35
36
37
38
39
40		 1.712
1.931
1.983
2.319
1.597
2.116
1.712
2.219		 0.091
0.172
0.102
0.292
0.301
0.211
0.191
0.212
그룹 6의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
41
42
43
44
45
46
47
48		 1.546
1.586
1.669
1.793
1.532
1.887
1.697
1.558		 0.091
0.103
0.095
0.203
0.310
0.077
0.009
0.201
그룹 7의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
49
50
51
52
53
54
55
56		 1.923
1.887
1.601
2.019
1.592
1.437
1.663
1.701		 0.192
0.007
0.082
0.135
0.222
0.341
0.094
0.109
그룹 8의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
57
58
59
60
61
62
63
64		 2.039
1.998
1.792
2.107
2.301
1.672
1.769
1.967		 0.082
0.172
0.007
0.201
0.019
0.308
0.085
0.039
그룹 9의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
65
66
67
68
69
70
71
72		 1.723
1.627
1.777
1.432
2.011
1.927
1.879
2.011		 0.072
0.291
0.027
0.410
0.081
0.105
0.060
0.009
그룹 10의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
73
74
75
76
77
78
79
80		 2.035
2.011
1.997
2.351
1.729
2.635
2.231
1.837		 0.021
0.063
0.059
0.109
0.111
0.091
0.077
0.201
그룹 11의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
81
82
83
84
85
86
87
88		 3.092
3.361
3.572
3.702
3.670
3.705
3.888
4.021		 0.152
0.098
0.209
0.301
0.088
0.137
0.072
0.301
그룹 12의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Dspp 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
89
90
91
92
93
94
95
96		 4.211
4.811
4.362
4.211
4.525
3.836
4.620
5.211		 0.413
0.302
0.182
0.287
0.250
0.099
0.401
0.371
상기 표 13 내지 24에서 보듯이, 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 MDPC-23 세포(대조군)에서 측정된 상아모세포 분화마커인 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 비하여, 본 발명의 펩타이드를 처리할 경우, 상기 Dspp 유전자의 mRNA 수준이 모두 1.3배 이상의 값을 나타냄을 확인하였다.
특히, 그룹 11의 모든 펩타이드는 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 비하여 3배 이상의 값을 나타내었고, 그룹 12의 모든 펩타이드는 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 비하여 3.8배 이상의 값을 나타냄을 확인하였다.
아울러, 도 1b는 본 발명의 펩타이드가 처리된 MDPC-23 세포에서 상아모세포 분화마커인 Dspp 유전자의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1b에서 보듯이, 본 발명의 펩타이드를 처리할 경우, 상아모세포 분화마커인 Dspp 유전자의 mRNA 수준이 증가되고, 도 1a의 것과 비슷하게, 대조군에서 측정된 Dspp 유전자 mRNA 수준의 약 1.3 배이상의 값을 나타냄을 확인하였다.
실시예 2-3: 상아모세포 분화마커 유전자인 Dspp , Dmp1 및 Nestin 유전자의 발현수준에 미치는 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드의 영향
상기 실시예 2-2의 결과로부터, 본 발명의 펩타이드는 Dspp 유전자의 mRNA 수준을 증가시킬 수 있고, 특히, 그룹 11 및 12의 펩타이드는 Dspp 유전자의 mRNA 수준을 적어도 3배 이상 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
이에 따라, 상기 그룹 11 및 12의 펩타이드가 다른 상아모세포 분화마커 유전자인 Dmp1 및 Nestin 유전자의 mRNA 수준도 증가시킬 수 있는지 확인하였다.
대략적으로, 하기 각 프라이머를 사용하고, 펩타이드로서 그룹 11 및 12의 펩타이드를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-2와 동일한 방법을 수행하여, Dmp1 및 Nestin 유전자의 발현수준에 미치는 본 발명의 펩타이드의 효과를 측정하고, 각 그룹별로 산출된 평균수준을 비교하였다(도 1c). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 MDPC-23 세포를 사용하였고, 비교군으로서 Dspp 유전자의 mRNA 수준을 사용하였다.
Dmp1_F: 5'-CATTCTCCTTGTGTTCCTTTGGG-3'(서열번호 101)
Dmp1_R: 5'-TGTGGTCACTATTTGCCTGTG-3'(서열번호 102)
Nestin_F: 5'-CCCTGAAGTCGAGGAGCTG-3'(서열번호 103)
Nestin_R: 5'-CTGCTGCACCTCTAAGCGA-3'(서열번호 104)
도 1c는 본 발명의 그룹 11 및 12의 펩타이드가 처리된 MDPC-23 세포에서 상아모세포 분화마커 유전자인 Dspp, Dmp1 및 Nestin 유전자의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1c에서 보듯이, 본 발명의 펩타이드를 처리하면, 상아모세포 분화마커 유전자인 Dspp, Dmp1 및 Nestin 유전자의 발현수준이 모두 증가되었으나, 각 유전자별로 증가수준에 차이를 나타내고, 그룹 11의 펩타이드 보다는 그룹 12의 펩타이드가 더욱 높은 수준으로 증가시킴을 확인하였다.
상기 각 분화마커 유전자는 상아모세포 분화와 상아질의 석회화 과정에 관여하는 유전자로 알려져 있으므로, 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 상아질 재생을 촉진하는 효과를 나타낼 것으로 분석되었다.
실시예 2-4: 치수조직 세포에 대한 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드의 세포독성 평가
먼저, 사람 치수 줄기세포는 서울대학교 치과병원에서 성인 10명(18-22세)의 사랑니에서 치수조직 세포를 분리하였다. 구체적으로, 모든 실험은 임상연구심의위원회(hospital's Institutional Review Board)에서 승인을 받은 후 환 자의 동의를 받아 실험을 수행하였으며, Jung HS et al(J Mol Histol.(2011))의 방법에 따라 사랑니는 절단하여, 치수를 노출시켜 포셉으로 치수조직을 분리하였다. 상기 분리된 치수조직을 양면도로 잘게 세절하고, 60 mm 접시에 넣고, 커버 슬립으로 덮은 후, DMEM 배지에서 배양하여, 배양된 치수조직 세포를 수득하였다.
다음으로, 상기 수득한 치수조직 세포를 96웰 플레이트에 각 웰당 3 × 103 세포수가 되도록 분주하고, 24시간 동안 배양한 다음, 그룹 11 또는 12의 펩타이드를 10 또는 50㎍/㎖ 농도로 처리하고, 다시 1, 3 또는 5일 동안 배양하였다. 상기 배양이 종료된 후, 배양된 세포를 PBS로 세척하고, 20㎕의 MTT 용액을 가하였으며, 이후 37℃에서 4시간 반응시켰다. 반응이 종료된 후, MTT 용액을 제거하고, 100㎕의 DMSO를 가한 후, 540nm 파장에서 흡광도를 측정하였다(도 1d). 이때, 대조군으로는 상기 펩타이드를 처리하지 않고 배양한 치수조직 세포를 사용하였다.
도 1d는 치수조직 세포에 대한 본 발명의 펩타이드의 세포독성을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1d에서 보듯이, 본 발명의 펩타이드를 가하여도 치수조직 세포의 생존율은 대조군과 동일한 수준을 나타냄을 확인하였다.
실시예 3: 생체내에서 상아질/치수조직 유사조직 형성에 미치는 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드의 영향
실시예 3- 1: 6주동안 사육된 동물에서 유래된 이식조직의 형태적 분석
2 x 106 세포수의 치수조직 세포에 100mg의 상아질 대용품을 가하고, 0.5% 피브린 겔과 혼합하여 이식물을 제작하였다. 이때, 상기 상아질 대용품으로는 히드록시 에퍼타이트(hydroxy apatite)/트리칼슘 포스페이트 (HA/TCP) 세라믹 파우더(Zimmer, USA)를 사용하였고, 상기 피브린 겔은 10 ㎍의 그룹 11의 펩타이드(서열번호 87), 그룹 12의 펩타이드(서열번호 96) 또는 2㎍의 BMP-2를 포함하도록 제조하였다. 상기 제작된 이식물을 면역시스템이 손상된 마우스(NIH-bg-nu-xid; Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)의 피하조직에 이식 하고, 상기 마우스를 6주 동안 사육한 후, 이식물로부터 형성된 상아질/치수조직-유사 조직을 적출하였다. 적출된 조직을 4% 파라포름알데히드에 고정하고, 10% EDTA(pH 7.4)에서 탈회시켰으며, 파라핀에 포매하고, 헤마톡실린-에오신(H-E) (Vector Labs)으로 염색하여, 상기 상아질/치수조직-유사 조직의 수준을 평가하였다(도 2). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않는 이식물이 이식된 것을 사용하였다.
도 2는 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식한 다음, 이에 의해 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 C는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: A 200㎛, B 100㎛, C 50㎛)이고; D 내지 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: D 200㎛, E 100㎛, F 50㎛)이며; G 내지 I는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: G 200㎛, H 100㎛, I 50㎛)이고; J 내지 L은 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: J 200㎛, K 100㎛, L 50㎛)이다.
도 2에서 보듯이, 본 발명의 펩타이드를 포함하거나 또는 포함하지 않는 이식물을 이식한 경우(A 내지 I)에는 HA/TCP 입자의 주변에 상아질-치수 유사 조직이 발생됨을 확인하였으나, rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 이식한 경우(J 내지 L)에는 HA/TCP 입자의 주변에 뼈-유사 석회화된 조직과 골수 유사 조직이 발생됨을 확인하였다.
아울러, 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않은 이식물을 이식한 경우(A 내지 C)에 비하여, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 이식물을 이식한 경우(D 내지 I)에는 상대적으로 높은 수준으로 생체내 상아질-치수조직과 가장 유사한 형태의 상아질-치수 유사 조직이 형성됨을 확인하였다.
실시예 3- 2: 6주동안 사육된 동물에서 유래된 이식조직의 콜라겐 염색 분석
콜라겐은 상아질과 뼈에서 가장 풍부하게 존재하는 유기바탕질(organic matrix) 이며, 침착되는 무기질을 수용하여 상아질의 재생에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.
이에 따라, 상기 실시예 3-1에서 적출된 각 조직에서 콜라겐 단백질의 형성 수준을 확인하기 위하여, 상기 조직을 대상으로, Polysciences사의 Masson's Trichrome Stain Kit (Cat. 25088-100)를 이용하여, 콜라겐 염색(Masson's Trichrome Stain)을 수행하였다(도 3). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않는 이식물이 이식된 것을 사용하였다.
도 3은 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 6주동안 이식하여 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직에 포함된 콜라겐의 형성 수준을 나타내는 현미경사진으로서, A 내지 C는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: A 500㎛, B 200㎛, C 50㎛), D 내지 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내며(크기바: D 500㎛, E 200㎛, F 50㎛), G 내지 I는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: G 500㎛, H 200㎛, I 50㎛), J 내지 L은 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: J 500㎛, K 200㎛, L 50㎛).
도 3에서 보듯이, 대조군의 이식물을 이식한 결과에 비하여, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 이식물을 이식한 경우에는, 콜라겐의 형성수준이 증가됨을 확인하였다.
실시예 3- 3: 6주동안 사육된 동물에서 유래된 이식조직의 면역염색 분석
상기 실시예 3-1에서 적출된 각 조직에서 상아모세포 특이적 분화 마커 유전자인 DSP와 골모세포 특이적 분화 마커인 BSP의 발현수준을 평가하기 위하여, 면역염색 분석을 수행하였다.
대략적으로, 상기 적출된 조직을 4% 파라포름알데히드에 고정하고, 10% EDTA(pH 7.4)에서 탈회시켰으며, 파라핀에 포매한 다음, 1차 항원으로 1:150로 희석한 항-DSP와 항-BSP 항체를 사용하여 면역염색한 후, 2차 항원으로 비오틴 라벨을 한 염소 항-래빗 IgG (Vector Labs)로 면역반응을 수행하여, DSP와 BSP의 수준을 측정하였다(도 4). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않는 이식물이 이식된 것을 사용하였다.
도 4는 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 6주동안 이식하여 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직에서, 상아모세포 특이적 분화 마커 유전자인 DSP와 골모세포 특이적 분화 마커인 BSP의 발현수준을 평가한 결과를 나타내는 면역염색 사진으로서, A 및 E는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고, B 및 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내며, C 및 G는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고, D 및 H는 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내며, A, B, C 및 D의 화살표는 새롭게 형성된 상아질-유사 조직에서 DSP가 발현된 부분을 나타내고, E, F, G 및 H의 화살촉은 새롭게 형성된 뼈 유사 조직에서 BSP가 발현된 부분을 나타낸다. 크기바는 50㎛이다.
도 4에서 보듯이, 대조군의 이식물이 이식된 경우에는 새롭게 형성된 상아질-치수 유사 조직에서 DSP가 낮은 수준으로 발현되었지만(A), 그룹 11 또는 12의 펩타이드를 포함하는 이식물이 이식된 경우에는 DSP가 새롭게 형성된 석회화된 조직에서 상대적으로 매우 높은 수준으로 발현되었으나(B 및 C), rhBMP2를 포함하는 이식물이 이식된 경우에는 DSP가 거의 발현되지 않음을 확인하였다(D).
또한, 대조군의 이식물(E), 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물(F) 또는 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물(G)이 이식된 경우에는, 형성된 석회화된 조직에서 BSP가 낮은 수준으로 발현되었으나, rhBMP2를 포함하는 이식물(H)이 이식된 경우에는 형성된 석회화된 조직과 석회화된 조직에 함입된 골세포 유사세포에서 BSP가 상대적으로 매우 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다.
실시예 3- 4: 12주동안 사육된 동물에서 유래된 이식조직의 형태적 분석
이식물이 이식된 마우스를 12주 동안 사육하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1의 방법을 수행하여, 상아질/치수조직-유사 조직의 수준을 평가하였다(도 5).
도 5는 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식한 다음, 이에 의해 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 C는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: A 500㎛, B 200㎛, C 50㎛)이고; D 내지 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: D 500㎛, E 200㎛, F 50㎛)이며; G 내지 I는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: G 500㎛, H 200㎛, I 50㎛)이고; J 내지 L은 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: J 500㎛, K 200㎛, L 50㎛)이다.
도 5에서 보듯이, 이식후 12주 동안 사육한 경우, 본 발명의 펩타이드를 포함하거나 또는 포함하지 않는 이식물을 이식한 경우(A 내지 I)에는 이식후 6주 동안 사육한 경우와 유사하게 HA/TCP 입자의 주변에 상아질-치수 유사 조직과 상아모세포 돌기가 발생됨을 확인하였으나, rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 이식한 경우(J 내지 L)에는 HA/TCP 입자의 주변에 기질에 세포가 함임된 뼈-유사 조직과 골수 유사 조직이 형성됨을 확인하였다.
아울러, 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않은 이식물을 이식한 경우(A 내지 C)에 비하여, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 이식물을 이식한 경우(D 내지 I)에는 생체내의 것과 유사성이 높은 상아모세포와 상아질/치수조직 복합체가 형성됨을 확인하였다.
실시예 3- 5: 12주동안 사육된 동물에서 유래된 이식조직의 콜라겐 염색 분석
상기 실시예 3-4에서 적출된 각 조직에서 콜라겐 단백질의 형성 수준을 확인하기 위하여, 상기 조직을 대상으로, Polysciences사의 Masson's Trichrome Stain Kit (Cat. 25088-100)를 이용하여, 콜라겐 염색(Masson's Trichrome Stain)을 수행하였다(도 6). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않는 이식물이 이식된 것을 사용하였다.
도 6은 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식하여 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직에 포함된 콜라겐의 형성 수준을 나타내는 현미경사진으로서, A 내지 C는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: A 500㎛, B 200㎛, C 50㎛), D 내지 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내며(크기바: D 500㎛, E 200㎛, F 50㎛), G 내지 I는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: G 500㎛, H 200㎛, I 50㎛), J 내지 L은 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: J 500㎛, K 200㎛, L 50㎛).
도 6에서 보듯이, 대조군의 이식물을 이식한 결과에 비하여, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주 동안 이식한 경우에는, 6주동안 이식한 경우와 유사하게 콜라겐의 형성수준이 증가됨을 확인하였다.
실시예 3- 6: 12주동안 사육된 동물에서 유래된 이식조직의 면역염색 분석
상기 실시예 3-1에서 적출된 각 조직 대신에, 상기 실시예 3-4에서 적출된 각 조직을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-3의 방법에 따라 면역염색 분석을 수행하였다(도 7). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않는 이식물이 이식된 것을 사용하였다.
도 7은 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식하여 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직에서, 상아모세포 특이적 분화 마커 유전자인 DSP와 골모세포 특이적 분화 마커인 BSP의 발현수준을 평가한 결과를 나타내는 면역염색 사진으로서, A 및 E는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고; B 및 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내며; C 및 G는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고; D 및 H는 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내며; A, B, C 및 D의 화살표는 새롭게 형성된 상아질-유사 조직에서 DSP가 발현된 부분을 나타내고; E, F, G 및 H의 화살촉은 새롭게 형성된 뼈 유사 조직에서 BSP가 발현된 부분을 나타낸다. 크기바는 50㎛이다.
도 7에서 보듯이, 6주 동안 이식한 경우와 유사하게 12주 동안 이식한 경우에도, 대조군의 이식물(A) 또는 rhBMP2를 포함하는 이식물(D)이 이식된 경우에는 새롭게 형성된 상아질-치수 유사 조직에서 DSP가 낮은 수준으로 발현되었지만, 그룹 11 또는 12의 펩타이드를 포함하는 이식물(B 및 C)이 이식된 경우에는 DSP가 새롭게 형성된 석회화된 조직에서 상대적으로 매우 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다.
또한, 대조군의 이식물(E), 그룹 11의 펩타이드를 포함하는 이식물(F) 또는 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물(G)이 이식된 경우에는, 형성된 석회화된 조직에서 BSP가 낮은 수준으로 발현되었으나, rhBMP2를 포함하는 이식물(H)이 이식된 경우에는 형성된 석회화된 조직과 석회화된 조직에 함입된 골세포 유사세포에서 BSP가 상대적으로 매우 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 펩타이드는 상아질/치수조직 복합체의 재생을 촉진할 수 있는 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
실시예 3-7: 이식조직의 상아모세포로의 분화분석
상기 실시예 3-4에서 적출된 각 조직에서, 이식물에 포함된 치수조직 세포가 상아모세포로 분화되었는지의 여부를 주사형 전자 현미경을 이용하여 확인하였다(도 8). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않는 이식물이 이식된 것을 사용하였다.
대략적으로, 상기 각 조직을 2.5% 글루타르알데히드/0.1 M 카코딜레이트 완충액(Cacodylate buffer)에 침지하여 30분동안 고정시키고, 고정된 조직을 1% 오스뮴테트라옥사이드를 포함하는 카코딜레이트 완충액에 1시간 동안 침지하여 반응시켰다. 이어, 상기 조직을 에탄올에 침지하여 탈수 및 건조시킨 다음, 건조된 조직을 금으로 코팅하고, 주사형 전자 현미경(S-4700, HITACHI, Tokyo, Japan)으로 촬영하였다.
도 8은 치수조직 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식하여 생체내에서 생성된 상아질/치수조직-유사 조직의 내부 구조를 나타내는 주사형 전자 현미경 사진으로서, A 및 B는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: A 50㎛, B 20㎛); C 및 D는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드(서열번호 96)를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: C 50㎛, D 20㎛); E 및 F는 치수조직 세포, HA/TCP 및 rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: E 50㎛, F 20㎛).
도 8에서 보듯이, 대조군의 이식물(A 및 B)이 이식된 경우에는 형성된 경조직 주위에서 상아모세포 돌기가 형성된 상아모세포-유사 세포가 일부 관찰되었고, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 이식물(C 및 D)이 이식된 경우에는 형성된 경조직을 따라 많은 수의 상아모세포-유사 세포가 관찰되었고, 상아모세포 돌기 또한 형성된 경조직 방향으로 확장됨을 확인하였으나, rhBMP-2를 포함하는 비교군의 이식물(E 및 F)이 이식된 경우에는 형성된 경조직의 표면에 입방형의 세포가 부착되어 있는 전형적인 골모세포의 특징을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 펩타이드는 상아모세포를 보다 효과적으로 형성할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4: 인간의 치아에서 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지 각과민증 치료용 펩타이드의 효과
알려진 바에 의하면, 자연적 치아의 상아질 벽 및 빈 치수 공간은, 치수세포에 의한 상아질/치수 유사 조직의 재생에 특이적인 국소 환경을 만들어준다고 알려져 있다(Huang GT, et al. (2010) Tissue engineering. Part A 16(2):605-615). 이에 따라, 치근관 공간에서의 상아질-치수조직 유사 조직 형성을 평가하고자 하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3-1에서 제조한 각각의 이식물 중에서, 대조군의 이식물 또는 10㎍/㎖의 농도로 그룹 12의 펩타이드(서열번호 96)를 포함하는 이식물을 각각 6주 동안 인간 치아 부분의 빈 근관공간인 치근관 공간(root canal space)에 이식하고, 각 이식물에서 형성되는 상아질/치수조직-유사 조직을 대상으로, 실시예 3-1의 방법에 따라 헤마톡실린-에오신(H-E)으로 염색하고, 실시예 3-7의 방법에 따라 주사형 전자 현미경으로 촬영하였다(도 9).
도 9는 본 발명의 펩타이드를 포함하는 이식물을 인간 치아의 치근관 공간에 이식한 후, 이로부터 형성되는 상아아모세포/치수조직-유사 조직을 분석한 결과를 나타내는 현미경 사진 및 주사형 전자현미경 사진으로서, A 및 B는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물이 이식된 조직을 염색한 결과를 나타내고(크기바: A 500㎛, B 50㎛); C, D 및 D'은 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드(서열번호 96)를 포함하는 이식물이 이식된 조직을 염색한 결과를 나타내며, D는 C의 1번 박스의 확대도이고, D'은 C의 2번 박스의 확대도이며(크기바: C 500㎛, D 50㎛, D' 50㎛); E 및 F는 치수조직 세포 및 HA/TCP 만을 포함하는 대조군의 이식물이 이식된 조직을 주사형 전자 현미경으로 촬영한 결과를 나타내고(크기바: E 50㎛, F 10㎛); G 및 H는 치수조직 세포, HA/TCP 및 그룹 12의 펩타이드(서열번호 96)를 포함하는 이식물이 이식된 조직을 주사형 전자 현미경으로 촬영한 결과를 나타내며(크기바: G 50㎛, H 10㎛); P는 재생된 치수조직을 나타내고, De는 기존의 상아질 벽을 나타내며, DT는 기존의 상아질 세관을 나타내고, Od는 상아모세포를 나타내며, OP는 상아모세포 돌기를 나타내고, D에 있는 화살표는 상아모세포 돌기와 함께 상아모세포-유사 세포가 재생된 것을 나타낸다.
도 9에서 보듯이, 대조군의 이식물과 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물이 이식된 치근관 내부에서는 모두 혈관이 발달된 치수조직-유사 조직이 형성됨을 확인하였다.
그러나, 본 발명의 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물이 이식된 경우에는, 기존의 상아질 벽에 상아모세포-유사 세포가 울타리배열로 존재하였고, 이들의 세포 돌기는, 늘어난 핵과 함께, 기존의 상아질 세관을 향해 확장되었으며, 기존의 상아질 벽에 새로운 상아질이 형성된 조직이 존재함을 확인하였다(C, D 및 D').
특히, 주사형 전자현미경 사진(E 내지 H)에서 보듯이, 대조군의 이식물(E 및 F)이 이식된 경우에 비하여, 그룹 12의 펩타이드를 포함하는 이식물(G 및 H)이 이식된 경우에는 기존의 상아질 벽에 상아모세포-유사 세포가 울타리배열로 존재하였고, 이들의 세포 돌기는, 늘어난 핵과 함께, 기존의 상아질 세관을 향해 확장됨을 확인하였다.
상기 실시예의 결과를 종합하면, 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 상아모세포 특이적 분화 마커 유전자인 Dspp, Dmp1 및 Nestin 유전자의 발현수준을 증가시키고, 치수조직 세포와 함께 생체에 이식할 경우에는 상아모세포의 형성을 촉진하며, 특히 치근관 공간에 이식할 경우에는 상기 치수조직 세포가 상아질/치수조직-유사조직으로 형성되는 것을 촉진하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 치주질환을 치료하는데 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
<110> HysensBio <120> Novel peptide <130> KPA161103-KR-D1 <160> 104 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 1 Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Lys Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 2 Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Arg Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 3 Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Lys Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 4 Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Arg Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 5 Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Lys Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 6 Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Lys Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 7 Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Arg Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 8 Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Arg Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 9 Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Lys Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 10 Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Arg Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 11 Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Lys Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 12 Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Arg Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 13 Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Lys Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 14 Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Lys Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 15 Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Arg Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 16 Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Arg Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 17 Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Lys Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 18 Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Arg Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 19 Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Lys Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 20 Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Arg Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 21 Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Lys Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 22 Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Lys Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 23 Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Arg Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 24 Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Arg Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 25 Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Lys Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 26 Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Arg Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 27 Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Lys Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 28 Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Arg Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 29 Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Lys Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 30 Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Lys Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 31 Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Arg Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 32 Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Arg Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 33 Lys Tyr Arg Gln Arg Lys Lys Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 34 Lys Tyr Arg Gln Arg Lys Arg Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 35 Lys Tyr Arg Gln Arg Arg Lys Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 36 Lys Tyr Arg Gln Arg Arg Arg Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 37 Lys Tyr Arg Gln Lys Lys Lys Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 38 Lys Tyr Arg Gln Lys Arg Lys Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 39 Lys Tyr Arg Gln Lys Lys Arg Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 40 Lys Tyr Arg Gln Lys Arg Arg Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 41 Lys Tyr Arg Gln Arg Lys Lys Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 42 Lys Tyr Arg Gln Arg Lys Arg Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 43 Lys Tyr Arg Gln Arg Arg Lys Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 44 Lys Tyr Arg Gln Arg Arg Arg Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 45 Lys Tyr Arg Gln Lys Lys Lys Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 46 Lys Tyr Arg Gln Lys Arg Lys Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 47 Lys Tyr Arg Gln Lys Lys Arg Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 48 Lys Tyr Arg Gln Lys Arg Arg Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 49 Lys Tyr Arg Gln Arg Lys Lys Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 50 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 50 Lys Tyr Arg Gln Arg Lys Arg Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 51 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 51 Lys Tyr Arg Gln Arg Arg Lys Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 52 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 52 Lys Tyr Arg Gln Arg Arg Arg Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 53 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 53 Lys Tyr Arg Gln Lys Lys Lys Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 54 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 54 Lys Tyr Arg Gln Lys Arg Lys Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 55 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 55 Lys Tyr Arg Gln Lys Lys Arg Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 56 Lys Tyr Arg Gln Lys Arg Arg Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 57 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 57 Lys Tyr Arg Gln Arg Lys Lys Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 58 Lys Tyr Arg Gln Arg Lys Arg Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 59 Lys Tyr Arg Gln Arg Arg Lys Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 60 Lys Tyr Arg Gln Arg Arg Arg Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 61 Lys Tyr Arg Gln Lys Lys Lys Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 62 Lys Tyr Arg Gln Lys Arg Lys Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 63 Lys Tyr Arg Gln Lys Lys Arg Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 64 Lys Tyr Arg Gln Lys Arg Arg Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 65 Lys Tyr Lys Gln Arg Lys Lys Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 66 Lys Tyr Lys Gln Arg Lys Arg Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 67 Lys Tyr Lys Gln Arg Arg Lys Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 68 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 68 Lys Tyr Lys Gln Arg Arg Arg Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 69 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 69 Lys Tyr Lys Gln Lys Lys Lys Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 70 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 70 Lys Tyr Lys Gln Lys Arg Lys Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 71 Lys Tyr Lys Gln Lys Lys Arg Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 72 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 72 Lys Tyr Lys Gln Lys Arg Arg Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 73 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 73 Lys Tyr Lys Gln Arg Lys Lys Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 74 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 74 Lys Tyr Lys Gln Arg Lys Arg Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 75 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 75 Lys Tyr Lys Gln Arg Arg Lys Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 76 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 76 Lys Tyr Lys Gln Arg Arg Arg Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 77 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 77 Lys Tyr Lys Gln Lys Lys Lys Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 78 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 78 Lys Tyr Lys Gln Lys Arg Lys Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 79 Lys Tyr Lys Gln Lys Lys Arg Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 80 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 80 Lys Tyr Lys Gln Lys Arg Arg Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 81 Lys Tyr Lys Gln Arg Lys Lys Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 82 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 82 Lys Tyr Lys Gln Arg Lys Arg Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 83 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 83 Lys Tyr Lys Gln Arg Arg Lys Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 84 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 84 Lys Tyr Lys Gln Arg Arg Arg Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 85 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 85 Lys Tyr Lys Gln Lys Lys Lys Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 86 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 86 Lys Tyr Lys Gln Lys Arg Lys Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 87 Lys Tyr Lys Gln Lys Lys Arg Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 88 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 88 Lys Tyr Lys Gln Lys Arg Arg Asn Tyr Lys 1 5 10 <210> 89 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 89 Lys Tyr Lys Gln Arg Lys Lys Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 90 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 90 Lys Tyr Lys Gln Arg Lys Arg Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 91 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 91 Lys Tyr Lys Gln Arg Arg Lys Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 92 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 92 Lys Tyr Lys Gln Arg Arg Arg Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 93 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 93 Lys Tyr Lys Gln Lys Lys Lys Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 94 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 94 Lys Tyr Lys Gln Lys Arg Lys Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 95 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 95 Lys Tyr Lys Gln Lys Lys Arg Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 96 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 96 Lys Tyr Lys Gln Lys Arg Arg Ser Tyr Lys 1 5 10 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 97 ctgttgctag tggtgctgtt 20 <210> 98 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 98 cattctcctt gtgttccttt ggg 23 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 99 aggtcggtgt gaacggattt g 21 <210> 100 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 100 tgtagaccat gtagttgagg tca 23 <210> 101 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 101 cattctcctt gtgttccttt ggg 23 <210> 102 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 102 tgtggtcact atttgcctgt g 21 <210> 103 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 103 ccctgaagtc gaggagctg 19 <210> 104 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 104 ctgctgcacc tctaagcga 19

Claims (12)

  1. 하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는, 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질 지각과민증 치료용 펩타이드:

    K-Y-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 (일반식 1)

    상기 일반식 1에서,
    R1은 아르기닌(R), 리신(K) 또는 글루타민(Q)이고;
    R2는 아르기닌(R) 또는 글루타민(Q)이며;
    R3, R4 및 R5는 각각 아르기닌(R) 또는 리신(K)이고;
    R6는 아스파라긴(N) 또는 세린(S)이며; 및
    R7 및 R8은 리신(K) 또는 타이로신(Y)이다.
  2. 제1항의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
  4. 제1항의 펩타이드를 포함하는 치수질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 약학 조성물은 상기 펩타이드가 반복되어 연결된 폴리펩타이드를 포함하는 것인, 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 약학 조성물은 상기 펩타이드에 치수질환 치료효과를 나타내는 약물이 결합된 복합체를 포함하는 것인, 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  8. 제4항에 있어서, 상기 치수질환은 상아질 지각과민증, 치수충혈, 치수염, 치수변성 또는 치수의 괴사 및 괴저증인 것인, 조성물.
  9. 제1항의 펩타이드를 포함하는 치수질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 의약외품 조성물은 구강용 소독 청결제, 구강청정용품, 치약, 치실 또는 구강용 연고제인 것인, 조성물.
  11. 제1항의 펩타이드를 포함하는 치수질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 건강기능성 식품 조성물은 음료, 차류, 향신료, 껌류 또는 과자류의 제조에 사용되는 것인, 조성물.



KR1020170077348A 2017-06-19 2017-06-19 신규한 펩타이드 KR20180076996A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170077348A KR20180076996A (ko) 2017-06-19 2017-06-19 신규한 펩타이드

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170077348A KR20180076996A (ko) 2017-06-19 2017-06-19 신규한 펩타이드

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160180408A Division KR101772449B1 (ko) 2016-12-27 2016-12-27 신규한 펩타이드

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20180076996A true KR20180076996A (ko) 2018-07-06

Family

ID=62921192

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170077348A KR20180076996A (ko) 2017-06-19 2017-06-19 신규한 펩타이드

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20180076996A (ko)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210152677A (ko) * 2020-06-09 2021-12-16 주식회사 하이센스바이오 치주질환 또는 탈구성 외상 치아의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR102522134B1 (ko) * 2022-09-15 2023-04-21 주식회사 하이센스바이오 Cpne7 유래 펩타이드를 포함하는 상아질 접착용 조성물 및 치수복조용 조성물
WO2023171900A1 (ko) * 2022-03-08 2023-09-14 주식회사 하이센스바이오 치아우식증 예방 또는 치료용 조성물
KR102596392B1 (ko) * 2022-12-08 2023-11-01 주식회사 하이센스바이오 신규한 펩타이드
WO2023249458A1 (ko) * 2022-06-24 2023-12-28 주식회사 하이센스바이오 Cpne7 단백질 또는 cpne7단백질 유래 펩타이드를 포함하는 세포 내 활성산소 제거용 조성물

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210152677A (ko) * 2020-06-09 2021-12-16 주식회사 하이센스바이오 치주질환 또는 탈구성 외상 치아의 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2023171900A1 (ko) * 2022-03-08 2023-09-14 주식회사 하이센스바이오 치아우식증 예방 또는 치료용 조성물
WO2023249458A1 (ko) * 2022-06-24 2023-12-28 주식회사 하이센스바이오 Cpne7 단백질 또는 cpne7단백질 유래 펩타이드를 포함하는 세포 내 활성산소 제거용 조성물
KR102522134B1 (ko) * 2022-09-15 2023-04-21 주식회사 하이센스바이오 Cpne7 유래 펩타이드를 포함하는 상아질 접착용 조성물 및 치수복조용 조성물
WO2024058315A1 (ko) * 2022-09-15 2024-03-21 주식회사 하이센스바이오 Cpne7 유래 펩타이드를 포함하는 상아질 접착용 조성물 및 치수복조용 조성물
KR102596392B1 (ko) * 2022-12-08 2023-11-01 주식회사 하이센스바이오 신규한 펩타이드

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101772449B1 (ko) 신규한 펩타이드
KR101943978B1 (ko) 신규한 펩타이드
KR20180076996A (ko) 신규한 펩타이드
KR102006862B1 (ko) 신규한 펩타이드
KR102037969B1 (ko) 신규한 펩타이드
US11376310B2 (en) Pharmaceutical composition for preventing or treating dentin-dental pulp diseases or periodontal disease including CPNE4 protein
KR102596392B1 (ko) 신규한 펩타이드
CA3004869C (en) Novel peptide
KR102522134B1 (ko) Cpne7 유래 펩타이드를 포함하는 상아질 접착용 조성물 및 치수복조용 조성물
KR101903461B1 (ko) 신규한 피부상태 개선 및 피부재생 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도
KR20230132249A (ko) 치아우식증 예방 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application