KR102037969B1 - 신규한 펩타이드 - Google Patents

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KR102037969B1
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Abstract

본 발명은 신규한 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 펩타이드를 포함하는 약학 조성물, 의약외품 조성물 및 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.

Description

신규한 펩타이드{Novel peptide}
본 발명은 신규한 펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 경조직 및/또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 치료용 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 펩타이드를 포함하는 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물 및 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
치수는 치아의 내부에 있는 치수강을 채우고 있는 부드러운 결합조직으로 신경과 혈관이 풍부하게 분포되어 있으며 상아질의 표층에까지 이르는 곳을 말한다. 이런 치수에 생기는 병변을 치수질환이라 한다.
치수질환의 원인은 매우 다양하나, 대부분의 경우는 충치에 의한 세균감염과 치아의 천공, 파절, 균열, 치주낭을 통해서 치수내부로의 감염에 의해 발생한다. 또한 외상, 마모, 치아 균열, 치료 시 치과용 기구에서 나오는 열과 마찰 등도 유발할 수 있다. 세균감염에 의한 치수염은 치근단 질환과 치주질환으로 확대될 수 있다. 치수질환이 발생하였을 때, 치수 충혈, 치수염, 치수 괴사의 순으로 진행된다. 치수 괴사의 경우, 치수가 죽어서 치수에 혈액공급이 전혀 안되기 때문에 전체 치주 조직이 사라져서 나중에는 치근단 질환 또는 치아전체의 이상이 초래될 수 있다.
치수, 치근단 질환의 치료는 치수 복제제와 치근관 충전재를 사용하는데, 일반적으로 칼슘 히드록사이드, MTA(Mineral Trioxide Aggregate), 거타퍼차(Gutta-percha) 등이 이용되어 왔다. MTA의 경우, 밀봉력과 생체친화적인 성질을 가지고 있어서 치료에 효과를 보이나, 상대적으로 치과 치료제로써 높은 비용문제가 발생하고, 변색이 되어 심미적 문제가 발생한다. 거타퍼차의 경우, 비용이 경제적이고 유동성이 좋으나, 치수생활력이 상실하게 되는, 생리적이지 못한 치료방법이다. 현재까지 상아질-치수 질환을 치료하는 보존적인 치료 방법은 치료한 치아가 약해지거나, 부서지기 쉬우며, 재감염의 위험을 가지게 된다.
치주조직(periodontium)은 상피조직, 연조직성 결합조직 및 석회화된 결합조직으로 구성된 복합기관이다. 치주조직의 구조로는 치은(gingiva), 치주인대(PDL: periodontal ligament), 백악질(cementum) 및 치조골(alveolarbone)이 있다. 치은 섬유아세포(gingival fibroblast)와 치주인대 섬유아세포 (periodontal ligament fibroblast)는 치은연조직성 결합조직의 주요 세포 구성 성분이며, 세포외 기질(extracellular matrix)을 형성하고 이를 유지하는 역할을 한다. 이 중 치은 섬유아세포는 주로 치은 결합조직을 유지하는 데 관여하는 반면, 치주인대 섬유아세포는 그 특유 기능으로 치주인대를 형성할 뿐만 아니라 생체 내에서의 인접 치조골 및 백악질의 수복과 재생에 관여하는 것으로 알려져 있다. 치주질환이 발생하면 임상적으로 치은 출혈과 종창, 치주낭의 형성 및 치조골의 파괴 등으로 치아의 상실을 가져오게 된다.
치주질환을 치료하는 궁극적인 결과는 손상된 결합조직, 백악질 및 치조골을 복원하는 것이므로, 이를 위하여는 치조골을 지지하는 치주인대를 재생시켜야 할 뿐만 아니라, 치주인대가 부착할 수 있는 치조골과 백악질의 재생이 필요하다.
이에 따라, 상기 상아질-치수질환 또는 치주질환을 효과적으로 치료할 수 있는 치료제를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 한국공개특허 제2012-0089547호에는 법랑모세포, 애피컬 버드세포 또는 이들의 배양액을 유효성분으로 포함하는 경조직 형성 및, 상아질 또는 치수조직 재생용 조성물이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2009-0033643호에는 새로운 치소낭 유래의 치아 줄기세포 및 그의 배양 방법이 개시되어 있다. 또한, 한국공개특허 제2016-0105627호에는 법랑모세포 배양액을 포함하는 치주질환 치료용 조성물이 개시되어 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 보다 효과적으로 상아질-치수질환 및/또는 치조골과 백악질 손상을 유발하는 치주질환을 치료할 수 있는 제제를 개발하기 위하여, 예의 연구 노력한 결과, 상아질, 뼈 및 백악질을 포함하는 경조직 및/또는 치수조직의 재생촉진용 세포치료 및 상아질-치수질환 및/또는 치주질환 치료 효과를 나타내는 펩타이드를 개발하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 경조직 및/또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질-치수질환 및/또는 치주질환 치료용 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
*11본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는, 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는, 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는, 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상아질, 뼈 및 백악질을 포함하는 경조직 및/또는 치수조직의 재생을 촉진하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 것으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는, 경조직 및/또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 치료용 펩타이드를 제공한다.
K-Y-R1-R2-R3-R4-R5 (일반식 1)
상기 일반식 1에서, R1 및 R2는 각각 아르기닌(R), 리신(K), 글루타민(Q) 또는 아스파라긴산(N)이고; R3, R4 및 R5는 각각 아르기닌(R) 또는 리신(K)이다.
일 실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 128 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 서열번호 25 내지 48 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 N-말단 또는 C-말단의 아세틸화, 아미드화 또는 메틸화; D-아미노산 도입; CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O 또는 CH2-CH2와 같은 펩타이드 결합 변형; 백본 변형; 또는 측쇄 변형된 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 경조직은 상아질, 뼈 및 백악질을 포함하는 것일 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 상아질-치수질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
일 실시예에 따르면, 상기 상아질-치수질환은 상아질 지각과민증, 치수충혈, 치수염, 치수변성 또는 치수의 괴사 및 괴저증일 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 치주질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
일 실시예에 따르면, 상기 치주질환은 치은염, 치주염, 치주낭 또는 치주농양일 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상아질-치수질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 치주질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상아질, 뼈 및 백악질을 포함하는 경조직 및/또는 치수조직의 재생을 촉진하는 방법을 제공한다.
본 발명의 경조직 및/또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질-치수질환 및/또는 치주질환 치료용 펩타이드는 경조직 및/또는 치수조직의 우수한 재생촉진 효과를 나타내므로, 다양한 상아질-치수질환의 예방 또는 치료를 위한 제재의 개발에 널리 활용되거나, 뼈 및/또는 백악질의 손상을 유발하는 치주질환의 예방 또는 치료를 위한 제제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1a는 본 발명의 신규 펩타이드가 처리된 인간 치수세포(hDPCs)에서 상아모세포 분화 마커 유전자인 Dspp(Dentin sialophosphoprotein)의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1b는 본 발명의 신규 펩타이드가 처리된 인간 치수세포(hDPCs)에서 상아모세포 분화 마커 유전자인 Dspp의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 다른 그래프이다.
도 1c는 본 발명의 펩타이드가 처리된 인간 치수세포(hDPCs)에서 상아모세포 분화 마커 유전자인 Nestin 유전자의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2a는 본 발명의 신규 펩타이드가 처리된 사람유래 중간엽 줄기세포(hBMSCs)에서 뼈 및 백악질의 분화 마커 유전자인 BSP 유전자의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2b는 본 발명의 신규 펩타이드가 처리된 사람유래 중간엽 줄기세포(hBMSCs)에서 뼈 및 백악질의 분화 마커 유전자인 BSP 유전자의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 다른 그래프이다.
도 3은 인비보에서 6주 동안 인간 치수세포(hDPCs)를 사용하여 새롭게 형성한 경조직의 양을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 인비보에서 6주 동안 인간 치수세포(hDPCs)를 사용하여 형성한 경조직을 조직형태학적으로 분석한 것을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 D는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 대조군의 이식물을, E 내지 H는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 10 ㎍의 그룹 3의 펩타이드와 함께, 각각 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 이식물을 면역시스템이 약화된 마우스에 6주 동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: A, E 500㎛, B, F 200㎛, C, G 100㎛, D, H 50㎛).
도 5는 인비보에서 6주 동안 인간 치수세포(hDPCs)를 사용하여 형성한 경조직에 포함된 콜라겐의 형성 수준을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 D는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 대조군의 이식물을, E 내지 H는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 10 ㎍의 그룹 3의 펩타이드와 함께, 각각 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 이식물을 면역시스템이 약화된 마우스에 6주 동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: A, E 500㎛, B, F 200㎛, C, G 100㎛, D, H 50㎛).
도 6은 인비보에서 6주 동안 인간 치수세포(hDPCs)를 사용하여 형성한 경조직을 면역 염색법을 이용하여 상아모세포 분화 마커인 DSP의 발현 수준을 분석한 것을 나타내는 면역염색 사진으로서, A는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 대조군의 이식물을, B는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 10 ㎍의 그룹 3의 펩타이드와 함께, 각각 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 이식물을 면역시스템이 약화된 마우스에 6주 동안 이식한 결과를 나타낸다. A 및 B는 형성된 경조직을 항-DSP 항체를 이용하여 면역 염색하였다. C는 이차항체만 처리한 면역조직화학적 분석의 음성대조군이다. A 및 B의 화살표는 새롭게 형성된 석회화된 조직에서 DSP의 발현을 나타낸다. 크기바는 50㎛이다.
도 7은 인비보에서 12주 동안 인간 치수세포(hDPCs)를 사용하여 새롭게 형성한 경조직의 양을 측정한 결과를 나타낸다.
도 8은 인비보에서 12주 동안 인간 치수세포(hDPCs)를 사용하여 형성한 경조직을 조직형태학적으로 분석한 것을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 D는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 대조군의 이식물을, E 내지 H는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 10 ㎍의 그룹 3의 펩타이드와 함께, 각각 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 이식물을 면역시스템이 약화된 마우스에 12주 동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: A, E 500㎛, B, F 200㎛, C, G 100㎛, D, H 50㎛).
도 9는 인비보에서 12주 동안 인간 치수세포(hDPCs)를 사용하여 형성한 경조직에 포함된 콜라겐의 형성 수준을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 D는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 대조군의 이식물을, E 내지 H는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 10 ㎍의 그룹 3의 펩타이드와 함께, 각각 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 이식물을 면역시스템이 약화된 마우스에 12주 동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: A, E 500㎛, B, F 200㎛, C, G 100㎛, D, H 50㎛).
도 10은 인비보에서 12주 동안 인간 치수세포(hDPCs)를 사용하여 형성한 경조직을 면역 염색법을 이용하여 상아모세포 분화 마커인 DSP의 발현 수준을 분석한 것을 나타내는 면역염색 사진으로서, A는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 대조군의 이식물을, B는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 10 ㎍의 그룹 3의 펩타이드와 함께, 각각 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 이식물을 면역시스템이 약화된 마우스에 12주 동안 이식한 결과를 나타낸다. A 및 B는 형성된 경조직을 항-DSP 항체를 이용하여 면역 염색하였다. C는 이차항체만 처리한 면역조직화학적 분석의 음성대조군이다. A 및 B의 화살표는 새롭게 형성된 석회화된 조직에서 DSP의 발현을 나타낸다. 크기바는 50㎛이다.
도 11은 인비보에서 12주 동안 인간 치수세포(hDPCs)를 사용하여 형성한 경조직을 주사 전자 현미경(Scanning Electron Microscope : SEM)을 이용하여 분석한 것을 나타내는 SEM 사진으로서, A는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 대조군의 이식물을, B와 C는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 10 ㎍의 그룹 3의 펩타이드와 함께, 각각 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 이식물을 면역시스템이 약화된 마우스에 12주 동안 이식한 결과를 나타낸다. 크기바는 10 ㎛ 이다.
본 발명자들은 보다 효과적으로 상아질-치수질환 및/또는 치주질환을 치료할 수 있는 제제를 개발하기 위하여, 다양한 연구를 수행한 결과, 7개의 아미노산으로 구성된 신규한 펩타이드를 개발하였다.
상기 개발된 신규한 펩타이드는 상아질-치수질환 및/또는 치주질환 치료효과를 나타낼 수 있는 펩타이드의 아미노산 서열을 일부 치환하여 제작된 것으로서, 상아모세포 분화 마커 유전자인 Dspp(Dentin sialophosphoprotein) 유전자 및 Nestin 유전자의 발현수준을 증가시킬 수 있어 상아질 재생을 촉진하는 효과를 나타냄과 더불어, 뼈모세포 및 백악모세포의 분화 마커 유전자인 BSP(Bone sialoprotein) 유전자의 발현수준을 증가시킬 수 있어 뼈와 백악질 재생을 촉진하는 효과를 나타낼 수 있다.
또한, 인간 치수세포와 함께 상기 펩타이드를 포함하는 이식물을 제작하고, 상기 제작된 이식물을 면역시스템이 손상된 마우스의 피하조직에 이식하고, 6주 또는 12주가 경과된 후, 이식된 조직을 분석한 결과, 생체 내 상아질-치수조직 가장 유사한 형태의 상아질-치수 유사 조직이 형성되고, 생체 내 뼈 조직과 가장 유사한 형태의 뼈 유사 조직이 형성되며, 콜라겐의 형성수준이 증가하고, 상아모세포 특이적 분화 마커 유전자인 DSP의 발현수준이 증가하는 것을 확인하였다.
아울러, 상기 이식된 조직의 형상을 주사 전자 현미경을 통해 분석한 결과, 형성된 경조직을 따라 상아모세포-유사 세포가 관찰되었고, 상아모세포 돌기 또한 형성된 경조직 방향으로 확장되어 있음을 확인하였다. 또한, 형성된 경조직의 표면에 입방형의 세포가 부착되어 있는 전형적인 뼈모세포 및/또는 백악모세포의 특징을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 펩타이드는 경조직 및/또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질-치수질환 및/또는 치주질환 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있었다. 이러한 효과를 나타내는 본 발명의 펩타이드는 지금까지 전혀 보고되지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다.
일 실시양태로서, 본 발명은 하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는, 경조직 및/또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질-치수질환 및/또는 치주질환 치료용 펩타이드를 제공한다.
K-Y-R1-R2-R3-R4-R5 (일반식 1)
상기 일반식 1에서, R1 및 R2는 각각 아르기닌(R), 리신(K), 글루타민(Q) 또는 아스파라긴산(N)이고; R3, R4 및 R5는 각각 아르기닌(R) 또는 리신(K)이다. 또, 상기 일반식 1에서, K는 리신을 의미하고, Y는 티로신을 의미한다.
본 발명의 용어, "경조직(hard tissue)"이란, 골(뼈), 초자 연골 (hyaline cartilage), 그리고 섬유 연골을 포함하는 상대적으로 단단한 골격 조직을 의미한다. 본 발명에 따른 일 실시예에서, 상기 경조직은 상아질, 뼈 및 백악질을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "상아질(dentine)"이란, "치질(齒質)"이라고도 호칭되고, 치아의 대부분을 이루고 있는, 노란 빛을 띤 흰색의 단단한 조직을 의미한다. 상기 상아질은 치관부(齒冠部)에서는 에나멜질, 치근부(齒根部)에서는 백악질로 덮여 있으므로 치아의 표면으로는 드러나지 않으나, 나이가 많아짐에 따라 에나멜질이 마멸되면 치관의 선단부나 교합면(咬合面)에 상아질이 노출될 수 있다. 상기 상아질은 일종의 뼈-유사 조직이지만 상아질을 만들고 있는 세포의 본체는 치수(齒髓) 속에 있고, 그 돌기만 상아질 속으로 뻗어 나온다는 점에서 일반적인 뼈조직과 구별된다.
본 발명의 용어 "백악질(cementum, 白堊質)"이란, 포유동물의 치아 뿌리(치근齒根)와 기타 일부를 덮고 있는 뼈가 약간 변형된 형태의 얇은 막을 의미한다. 상기 백악질은 50%의 무기질 및 50%의 수분-유기질로 구성되고, 노란색을 띠고 있으며 상아질이나 에나멜질보다 낮은 경도를 나타낸다. 상기 백악질은 치아를 치조골에 고정시키는 치주인대 섬유질을 포함하는데, 세균이 잇몸에 감염되면 치아를 둘러싼 백악질의 변성이 일어나고, 변성된 백악질에는 치아와 치조골을 연결해주는 치주인대 섬유질이 달라붙지 못해서 치아가 흔들리게 된다. 이러한 백악질의 변성을 치료하기 위하여는 변성된 백악질을 제거하고 새로운 백악질의 형성을 촉진하는 방법이 사용되고 있다.
본 발명에서 제공하는 펩타이드는 상아모세포 분화 마커 유전자인 Dspp 및 Nestin 유전자와, 뼈모세포 및 백악모세포 분화 마커 유전자인 BSP 유전자의 발현수준을 증가시킬 수 있으며, 인간 치수세포와 함께 생체 내에 이식할 경우, 상기 인간 치수세포가 상아질/치수조직-유사 조직 및 뼈 유사 조직을 형성하는 특징을 나타낼 수 있다.
본 발명에서 제공하는 펩타이드는, 상아질, 뼈 및 백악질을 포함하는 경조직 및/또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질-치수질환 및/또는 치주질환 치료효과를 나타낼 수 있는 한, 이를 구성하는 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 변이체 펩타이드도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 범주에 포함된다.
일반적으로, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 펩타이드의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나, 상아질, 뼈 및 백악질을 포함하는 경조직 및/또는 치수조직의 재생 촉진능이 증가한 펩타이드를 포함할 수 있다.
아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 본 발명의 펩타이드를 구성하는 7개의 아미노산은 모두 친수성 아미노산에 해당하므로, 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성이 높다. 이에 따라, 서열번호 1의 펩타이드를 구성하는 아미노산은 친수성 성질을 갖는 다양한 아미노산으로 치환되어도, 그 구조적 유사성에 기인하여 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있다.
예를 들어, 본 발명에서 제공하는 서열번호 1의 펩타이드의 3번에 위치한 산성 아미노산인 글루타민은 산성 아미노산인 아스파라긴산으로 치환되거나 염기성 아미노산인 아르기닌 또는 리신으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있고; 서열번호 1의 펩타이드의 4번에 위치한 염기성 아미노산인 아르기닌은 염기성 아미노산인 리신으로 치환되거나 산성 아미노산인 글루타민 또는 아스파라긴산으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있으며; 서열번호 1의 펩타이드의 5번에 위치한 염기성 아미노산인 아르기닌은 염기성 아미노산인 리신으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있으며; 서열번호 1의 펩타이드의 6번 또는 7번에 위치한 염기성 아미노산인 리신은 염기성 아미노산인 아르기닌으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있다.
이처럼, 본원발명의 펩타이드를 구성하는 산성 아미노산 또는 염기성 아미노산은 각각 이와 다른 산성 아미노산 또는 염기성 아미노산으로 치환되어도, 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 펩타이드를 구성하는 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 변이체 펩타이드도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 범주에 포함됨은 자명하다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 그의 N-말단 또는 C-말단에 임의의 아미노산이 부가된 형태를 갖더라도, 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있으므로, 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 범주에 포함된다. 일 예로서, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 1 내지 300개의 아미노산이 부가된 형태가 될 수 있고, 다른 예로서, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 1 내지 100개의 아미노산이 부가된 형태가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 1 내지 24개의 아미노산이 부가된 형태가 될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는, 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위하여 이의 N-말단 또는/및 C-말단 등이 화학적으로 수식되거나 유기단으로 보호되거나, 또는 펩타이드 말단 등에 아미노산이 추가되어 변형된 형태일 수 있다. 특히, 화학적으로 합성한 펩타이드의 경우, N- 및 C-말단이 전하를 띠고 있기 때문에, 이러한 전하를 제거하기 위하여 N-말단을 아세틸화(acetylation), N-말단을 메틸화(metylation) 및/또는 C- 말단을 아미드화(amidation) 할 수 있고, 또는 D-아미노산 도입, CH2-NH, CH2-S, CH2S=O, CH2-CH2와 같은 펩타이드 결합 변형, 백본 변형, 측쇄 변형을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 펩타이드 모방체 화합물을 제조하는 방법은 기술분야에 공지된 것으로, 예를 들면, Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Choplin Pergamon Press (1992)에 기재된 내용을 참조할 수 있다.
본 발명의 용어 "백본 변형"이란, 펩타이드를 구성하는 아미노산의 주가 되는 사슬 모양 또는 고리 모양의 골격을 백본(주사슬: backbone)이라 하며, 이들 펩타이드 백본을 구성하는 아미노산을 아미노산 유사체로 직접 변형하는 것을 백본 변형이라 한다. 아미노산 유사체란, 아미노산 백본의 질소 또는 α-탄소에서 수소원자를 치환작용에 의해 변형시킨 아미노산을 말한다.
본 발명의 용어 "측쇄 변형"이란, 펩타이드를 구성하는 아미노산의 주가 되는 사슬 모양 또는 고리 모양의 골격으로부터 가지처럼 갈라져 나간 원자단을 아미노산의 측쇄(곁사슬: side-chains)라 하며, 이들 측쇄를 화학물질을 이용하여 변형하는 것을 측쇄 변형이라 한다. 펩타이드 측쇄 변형의 예로, 환원 알킬화 반응; 메틸아세티미데이트에 의한 아미디화; 아세틱 언하이드라이에 의한 알킬화; 시아네이트에 의한 아미노 그룹의 카르바모릴레이션; 2,4,6-트리니트로벤젠 술포닉산(TNBS)에 의한 아미노산의 트리니트로벤질레이션; 숙신 언하이드라이드에 의한 아미노 그룹의 알킬화; 또는 피리독살-5포스페이트 처리 후 NaBH4로 환원된 피리도실레이션과 같은 아미노그룹의 변형 등을 포함한다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 단독으로 사용될 수 있으나, 유기용매와 같이 약제로 허가된 캐리어(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성 및 효능의 증대를 위해 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트. 아스코르빅산(ascorbic acid), 또는 글루타치온(glutathione)과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅제(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers) 등을 포함하여 사용하는 것도 가능하다.
본 발명의 일 실시 예에 의하면, 본 발명에서 제공하는 일반식 1에 해당하는 128종의 펩타이드를 합성하고, 상기 합성된 펩타이드가 상아모세포 분화 마커 유전자인 Dspp 유전자의 발현수준에 미치는 영향을 검증하였다. 그 결과, 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 인간 치수세포(대조군)에서 측정된 상아모세포 분화 마커인 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 비하여, 상기 128종의 펩타이드를 처리한 인간 치수세포에서 상기 Dspp 유전자의 mRNA 수준이 8배 이상의 값, 또는 6배 이상의 값, 또는 3배 이상의 값, 또는 적어도 약 1.5배 이상의 값을 나타냄을 확인하였다(도 1a, 도 1b 및 표 18 내지 표 33).
지금까지 보고된 바에 의하면, Dspp의 mRNA발현 수준이 증가되면, 상아모세포 분화 및 상아질 재생이 촉진된다고 알려져 있으므로, 상기 Dspp 유전자의 mRNA 수준을 증가시키는 효과를 나타내는 상기 128종의 펩타이드는 상아모세포 분화 및 상아질 재생을 촉진하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다(Taduru Sreenath et al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, No. 27, Issue of J㎕y 4, pp. 24874-24880, 2003; William T. Butler et al, Connective Tissue Research, 44(Suppl. 1): 171178, 2003).
또한, 상기 합성된 펩타이드가 뼈모세포/백악모세포 분화 마커 유전자인 BSP 유전자의 발현수준에 미치는 영향을 검증하였다. 그 결과, 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 인간 치수세포(대조군)에서 측정된 뼈모세포/ 백악모세포 분화 마커인 BSP 유전자의 mRNA 수준에 비하여, 상기 128종의 펩타이드를 처리한 인간 치수세포에서 상기 BSP 유전자의 mRNA 수준이 13배 이상의 값, 또는 12배 이상의 값, 또는 9배 이상의 값, 또는 적어도 약 3배 이상의 값을 나타냄을 확인하였다(도 2a 및 도 2b).
이에 따라, BSP의 mRNA발현 수준이 증가되면, 뼈모세포/백악모세포 분화 및 뼈와 백악질의 재생이 촉진된다고 알려져 있으므로, 상기 BSP 유전자의 mRNA 수준을 증가시키는 효과를 나타내는 상기 128종의 펩타이드는 뼈모세포/백악모세포 분화 및 뼈와 백악질의 재생을 촉진하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 이용하여 합성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기서열을 포함할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터를 포함하는 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 상기 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "발현벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되고, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내어야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.
본 발명의 용어 "작동 가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 펩타이드의 분리를 촉진하기 위하여 상기 펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널 및 개시코돈은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.
아울러, 상기 발현벡터는 상기 펩타이드의 검출이 용이하도록 하기 위하여, 임의로 엔도펩티다아제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "태그(tag)"란, 정량 가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 의미하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광분자일 수도 있고; Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그, 스트랩타비딘 태그 등의 에피톱 태그일 수도 있다. 특히, 에피톱 태그를 사용할 경우, 바람직하게는 6개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 보다 바람직하게는 8개 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 태그를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 상술한 본 발명의 상아질, 뼈 및 백악질을 포함하는 경조직 및/또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질-치수질환 및/또는 치주질환 치료용 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는데, 이때 사용되는 벡터는 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(bac㎕ovirus) 등)가 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.
본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 본 발명에서 제공하는 발현벡터를 숙주에 도입하여 형질전환시킴으로서 제작될 수 있고, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 상기 펩타이드를 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl suloxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 형질전환제의 제작에 사용되는 숙주 역시 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균, 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로소필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
상기 형질전환체는 또한 본 발명의 상아질, 뼈 및 백악질을 포함하는 경조직 및/또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질-치수질환 및/또는 치주질환 치료용 펩타이드를 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 상아질, 뼈 및 백악질을 포함하는 경조직 및/또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질-치수질환 및/또는 치주질환 치료용 펩타이드를 생산하는 방법은 (a) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 배양물로부터 본 발명의 펩타이드를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당 업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 상아질, 뼈 및 백악질을 포함하는 경조직 및/또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질-치수질환 및/또는 치주질환 치료용 펩타이드를 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산 암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.
또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.
또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 상기 펩타이드의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 100 시간에서 달성된다.
아울러, 배양물로부터 상기 펩타이드를 회수하는 단계는 당 업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 상기 펩타이드의 회수에 사용될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 상아질-치수질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 상아질, 뼈 및 백악질을 포함하는 경조직 및/또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질-치수질환 및/또는 치주질환 치료용 펩타이드는 인간 치수세포와 함께 생체 내에 이식할 경우, 상기 인간 치수세포가 상아질/치수조직-유사 조직을 형성하는 것을 촉진시킬 수 있으므로, 치수조직이 손상되어 발생하는 상아질-치수질환 치료용 약학 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물에 포함되는 펩타이드는 펩타이드 단독의 형태로 사용될 수도 있고, 상기 펩타이드가 2회 이상 반복되어 연결된 폴리펩타이드의 형태로 사용될 수도 있으며, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 상아질-치수질환 치료효과를 나타내는 약물이 결합된 복합체 형태로 사용될 수도 있다.
본 발명의 용어 "상아질-치수질환"이란, 상기 치수조직의 손상으로 인하여, 치수조직과 이에 결합된 상아질이 손상되어 발병되는 질환을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 상아질-치수질환은 본 발명의 펩타이드에 의하여 치료 효과를 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 상아질 지각과민증, 치수충혈, 치수염, 치수변성, 치수의 괴사 및 괴저증 등이 될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 치주질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 상아질, 뼈 및 백악질을 포함하는 경조직 및/또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질-치수질환 및/또는 치주질환 치료용 펩타이드는 인간 치수세포와 함께 생체 내에 이식할 경우, 상기 인간 치수세포가 뼈 유사 조직을 형성하는 것을 촉진시킬 수 있으므로, 뼈 및/또는 백악질의 손상을 유발하는 치주질환 치료용 약학 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물에 포함되는 펩타이드는 펩타이드 단독의 형태로 사용될 수도 있고, 상기 펩타이드가 2회 이상 반복되어 연결된 폴리펩타이드의 형태로 사용될 수도 있으며, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 치주질환 치료효과를 나타내는 약물이 결합된 복합체 형태로 사용될 수도 있다.
본 발명의 용어 "치주질환(periodontal disease)" 이란, 풍치라고도 하며, 치은(잇몸)과 치아 사이의 틈에 박테리아가 감염되어 치주인대와 인접조직을 손상시키는 질환을 의미하는데, 병증의 정도에 따라 치은염과 치주염으로 구분된다. 상기 치주질환의 발병시 염증이 진행되어 더 많은 조직이 손상되면서 치주낭(periodontal pocket)이 형성되고, 치주염이 심할수록 치주낭의 깊이가 깊어지게 되는데, 치주낭이 깊어지면서 치주인대에 염증이 생기게 되고 최종적으로는 뼈소실이 유발된다고 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 치주질환은 본 발명의 펩타이드에 의하여 치료 효과를 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 치은염(gingivitis), 치주염(periodontitis), 치주낭(periodontal pocket) 또는 치주농양(periodontal abscess) 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "예방"이란, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 상아질-치수질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여로 상아질-치수질환의 발생을 저해 또는 지연시키는 모든 행위, 또는 본 발명의 펩타이드를 포함하는 치주질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여로 치주질환의 발생을 저해 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "치료"란, 본 발명의 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물을 상아질-치수질환의 치료가 요구되는 개체에 투여하여 상아질 또는 치수조직의 재생을 촉진함으로써 치수질환의 치료가 수행되도록 하는 모든 행위, 또는 본 발명의 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물을 치주질환의 치료가 요구되는 개체에 투여하여 뼈 및/또는 백악질의 재생을 촉진함으로써 치주질환의 치료가 수행되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은, 상기 펩타이드에 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체(자연적 또는 비자연적 담체), 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 상아질-치수질환 및/또는 치주질환 치료용 약학 조성물의 형태로 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 상아질-치수질환 및/또는 치주질환이 유발된 부위에 투여할 수 있는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 콜라겐 등을 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 특히, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제, 연고제(예를 들어, 치수이장재 등) 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함된 상기 펩타이드의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 상아질-치수질환 및/또는 치주질환 치료용 약학 조성물과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng 내지 약 100 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 10 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서 상기 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 상아질-치수질환이 발병된, 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상아질-치수질환 치료방법을 제공한다. 또 다른 하나의 양태로서, 양태로서 상기 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 치주질환이 발병된, 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 치주질환 치료방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "개체"란 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 치료가 요구되는 인간, 또는 인간을 제외한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물 등을 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명의 상아질-치수질환 및/또는 치주질환 치료용 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 구강내 투여 또는 구강내 주사 등의 경로를 통해 투여될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 상아질-치수질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물, 또는 상기 펩타이드를 포함하는 치주질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "개선"이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 개선은 본 발명의 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물을 상아질-치수질환의 치료가 요구되는 개체에 투여하여 상아질 또는 치수조직의 재생을 촉진함으로써, 상아질-치수질환의 증상이 호전되거나 또는 이롭게 되도록 하는 모든 행위, 또는 본 발명의 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물을 치주질환의 치료가 요구되는 개체에 투여하여 뼈 및/또는 백악질의 재생을 촉진함으로써, 치주질환의 증상이 호전되거나 또는 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 용어 "의약외품"이란, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유ㆍ고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병을 막기 위한 살균ㆍ살충제 등이 이에 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드를 포함하는 의약외품 조성물의 종류나 제형은 특별히 제한되지 않으나, 일 예로서, 구강용 소독 청결제, 구강청정용품, 치약, 치실, 구강용 연고제 등일 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 식품은 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다.
구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 본 발명의 펩타이드를 음료, 차류, 향신료, 껌류, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
본 발명의 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 예방 또는 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있으므로, 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 0.01 내지 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 내지 0.03 g이 될 수 있다.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 식품 조성물은 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 구체적으로 본 발명의 펩타이드를 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 상기의 펩타이드를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상아질-치수질환의 예방 또는 치료 방법, 및/또는 치주질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또 다른 하나의 양태로서, 상기의 펩타이드를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상아질 또는 치수조직의 재생을 촉진하는 방법, 및/또는 뼈 또는 백악질의 재생을 촉진하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 상기 펩타이드를 포함하는 조성물의 상아질, 뼈 및 백악질을 포함하는 경조직 및/또는 치수조직의 재생 촉진 용도 및 상아질-치수질환 또는 치주질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
K-Y-R1-R2-R3-R4-R5 (일반식 1)
상기 일반식 1에서, R1 및 R2는 각각 아르기닌(R), 리신(K), 글루타민(Q) 또는 아스파라긴산(N)이고; R3, R4 및 R5는 각각 아르기닌(R) 또는 리신(K)이다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 128 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 상기 펩타이드를 포함하는 조성물의 상아질, 뼈 및 백악질을 포함하는 경조직 및/또는 치수조직의 재생 촉진 용도 및 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한 본 발명의 일 실시예로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 24 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 상기 펩타이드를 포함하는 조성물의 상아질, 뼈 및 백악질을 포함하는 경조직 및/또는 치수조직의 재생 촉진 용도 및 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
이하 본 발명을 실시 예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 실험 방법 및 재료
실시예 1-1. 상아질, 뼈 및 백악질을 포함하는 경조직 및/또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질-치수질환 및/또는 치주질환 치료용 펩타이드의 합성
본 발명자들은 상아질, 뼈 및 백악질을 포함하는 경조직 및/또는 치수조직의 재생촉진 효과를 나타내는 펩타이드(서열번호 1)를 9-플루오르닐메틸옥시카보닐(9-fluorenylmethyloxycarbonyl, Fmoc) 방법으로 합성하고, 상기 합성된 펩타이드의 아미노산을 치환하여 대표적인 그룹의 펩타이드를 합성하였다(표 1 내지 표 16).
N-KYQRRKK-C(서열번호 1)
먼저, 그룹 1의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드 또는 상기 서열번호 1의 펩타이드의 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 1).
그룹 1의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열 (N-C)
1 KYQRRKK
2 KYQRRKR
3 KYQRRRK
4 KYQRRRR
5 KYQRKKK
6 KYQRKRK
7 KYQRKKR
8 KYQRKRR
다음으로, 그룹 2의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아르기닌으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 2).
그룹 2의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열 (N-C)
9 KYRQRKK
10 KYRQRKR
11 KYRQRRK
12 KYRQRRR
13 KYRQKKK
14 KYRQKRK
15 KYRQKKR
16 KYRQKRR
다음으로, 그룹 3의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 리신으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 3).
그룹 3의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열 (N-C)
17 KYKQRKK
18 KYKQRKR
19 KYKQRRK
20 KYKQRRR
21 KYKQKKK
22 KYKQKRK
23 KYKQKKR
24 KYKQKRR
다음으로, 그룹 4의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하고, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 4).
그룹 4의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열 (N-C)
25 KYQQRKK
26 KYQQRKR
27 KYQQRRK
28 KYQQRRR
29 KYQQKKK
30 KYQQKRK
31 KYQQKKR
32 KYQQKRR
다음으로, 그룹 5의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아르기닌으로 치환하고, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 5).
그룹 5의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열 (N-C)
33 KYRRRKK
34 KYRRRKR
35 KYRRRRK
36 KYRRRRR
37 KYRRKKK
38 KYRRKRK
39 KYRRKKR
40 KYRRKRR
다음으로, 그룹 6의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 리신으로 치환하고, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 6).
그룹 6의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열 (N-C)
41 KYKRRKK
42 KYKRRKR
43 KYKRRRK
44 KYKRRRR
45 KYKRKKK
46 KYKRKRK
47 KYKRKKR
48 KYKRKRR
다음으로, 그룹 7의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 4번 아미노산을 리신으로 치환하고, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 7).
그룹 7의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열 (N-C)
49 KYQKRKK
50 KYQKRKR
51 KYQKRRK
52 KYQKRRR
53 KYQKKKK
54 KYQKKRK
55 KYQKKKR
56 KYQKKRR
다음으로, 그룹 8의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아스파라긴산으로 치환하고, 4번 아미노산을 리신으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 8).
그룹 8의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열 (N-C)
57 KYNKRKK
58 KYNKRKR
59 KYNKRRK
60 KYNKRRR
61 KYNKKKK
62 KYNKKRK
63 KYNKKKR
64 KYNKKRR
다음으로, 그룹 9의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아스파라긴산으로 치환하고, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 9).
그룹 9의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열 (N-C)
65 KYNRRKK
66 KYNRRKR
67 KYNRRRK
68 KYNRRRR
69 KYNRKKK
70 KYNRKRK
71 KYNRKKR
72 KYNRKRR
다음으로, 그룹 10의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아르기닌으로 치환하고, 4번 아미노산으로 아스파라긴산으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 10).
그룹 10의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열 (N-C)
73 KYRNRKK
74 KYRNRKR
75 KYRNRRK
76 KYRNRRR
77 KYRNKKK
78 KYRNKRK
79 KYRNKKR
80 KYRNKRR
다음으로, 그룹 11의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 리신으로 치환하고, 4번 아미노산으로 아스파라긴산으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 11).
그룹 11의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열 (N-C)
81 KYKNRKK
82 KYKNRKR
83 KYKNRRK
84 KYKNRRR
85 KYKNKKK
86 KYKNKRK
87 KYKNKKR
88 KYKNKRR
다음으로, 그룹 12의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 4번 아미노산을 아스파라긴산으로 치환하고, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 12).
그룹 12의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열 (N-C)
89 KYQNRKK
90 KYQNRKR
91 KYQNRRK
92 KYQNRRR
93 KYQNKKK
94 KYQNKRK
95 KYQNKKR
96 KYQNKRR
다음으로, 그룹 13의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아스파라긴산으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 13).
그룹 13의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열 (N-C)
97 KYNQRKK
98 KYNQRKR
99 KYNQRRK
100 KYNQRRR
101 KYNQKKK
102 KYNQKRK
103 KYNQKKR
104 KYNQKRR
다음으로, 그룹 14의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산과 4번 아미노산을 아스파라긴산으로 치환하고, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 14).
그룹 14의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열 (N-C)
105 KYNNRKK
106 KYNNRKR
107 KYNNRRK
108 KYNNRRR
109 KYNNKKK
110 KYNNKRK
111 KYNNKKR
112 KYNNKRR
다음으로, 그룹 15의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아르기닌으로 치환하고, 4번 아미노산을 리신 또는 아스파라긴산으로 치환하고, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 15).
그룹 15의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열 (N-C)
113 KYRKRKK
114 KYRKRKR
115 KYRKRRK
116 KYRKRRR
117 KYRKKKK
118 KYRKKRK
119 KYRKKKR
120 KYRKKRR
끝으로, 그룹 16의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산과 4번 아미노산을 리신으로 치환하고, 5번 내지 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 16).
그룹 16의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열 (N-C)
121 KYKKRKK
122 KYKKRKR
123 KYKKRRK
124 KYKKRRR
125 KYKKKKK
126 KYKKKRK
127 KYKKKKR
128 KYKKKRR
실시예 1-2. 세포 배양5%의 CO2를 포함하는 습윤된 공기 37℃ 조건에서 배양되어 실험에 사용되었다. 인간 골수 중간엽 줄기세포(human bone marrow mesenchymal stem cell; hBMSCs)는 론자(LONZA, 스위스)에서 구입하여 사용하였다. hBMSCs는 10% 열 불활성화된 소의 혈청이 첨가된 알파-엠이엠(a-MEM, Invitrogen) 배양액에서 배양하였다.
실시예 1-3. 사람유래 치수세포 분리 및 배양
*165인간 치수세포(hDPCs)(즉, 사람유래 치수세포)는 서울대학교 치과병원에서 성인 10명(18-22세)의 사랑니에서 인간 치수세포를 분리하였다. 구체적으로, 모든 실험은 임상연구심의위원회(hospital's Institutional Review Board)에서 승인을 받은 후 환 자의 동의를 받아 실험을 수행하였으며, Jung HS et al(J Mol Histol.(2011))의 방법에 따라 사랑니는 절단하여, 치수를 노출시켜 포셉으로 치수를 분리하였다. 분리한 치수를 양면도로 잘게 자르고, 60 mm 접시에 넣고, 커버 슬립으로 덮은 후 둘베코의 수정 이글 배지에서 배양하였다. 인간 치수세포는 다양한 조건에서 상아모세포, 뼈모세포, 백악모세포 및 치주인대 세포로 분화할 수 있다고 알려져 있다(Tissue Eng Part A. 2014 Apr;20(7-8):1342-51).
실시예 1-4. 역전사-폴리머라아제 체인 반응(RT-PCR) 및 실시간 PCR 분석
TRIzol 시약을 이용하여 인간 치수세포(hDPCs)와 인간 골수 중간엽 줄기세포(hBMSCs)의 전체(total) RNA를 분리하였다. 2 ㎍의 전체 RNA와 역전사효소 1 ㎕와 0.5 ㎍의 올리고(oligo; dT)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 실시간 중합효소 연쇄반응에 이용하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응은 SYBR GREEN PCR Master Mix(Takara, Japan)를 이용하여 ABI PRISM 7500 시퀀스 검출 시스템(sequence detection system, Applied Biosystems)에서 진행되었다. 실시간 중합효소 연쇄반응은 94℃, 1 분; 95℃, 15 초; 60℃, 34 초를 40 사이클(cycles) 반복하는 조건으로 진행하였다. 결과의 분석은 비교 역치 싸이클(comparative cycle threshold; CT) 방법을 이용하여 평가하였고, 프라이머 염기서열은 하기 표 17에 기재되어 있다.
<Complete lists of human real time PCR primers>
Gene Primer (5'-3')
hDspp forward CAACCATAGAGAAAGCAAACGCG
reverse TTTCTGTTGCCACTGCTGGGAC
hNESTIN forward AGC CCT GAC CAC TCC AGT TTA G
reverse CCC TCT ATG GCT GTT TCT TTC TCT
hBSP forward GAATGGCCTGTGCTTTCTCAA
reverse TCGGATGAGTCACTACTGCCC
hGAPDH forward CCATGGAGAAGGCTGGGG
reverse CAAAGTTCTCATGGATGACC
실시예 1-5. 인비보 이식 및 조직학적 분석인간 치수세포(hDPCs)를 분리하여 인비보 이식 실험에 사용하였다. hDPCs(2 x 106 세포)를 100 mg의 히드록시 에퍼타이트(hydroxy apatite)/트리칼슘 포스페이트(tricalcium phosphate)(HA/TCP) 세라믹 파우더(Zimmer, USA) 단독, 또는 본 발명의 펩타이드(10 ㎍)와 함께, 각각 0.5% 피브린 겔과 함께 혼합한 후, 면역시스템이 손상된 마우스(NIH-bg-nu-xid; Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)에 6주와 12주 동안 이식하였다.
이 후, 샘플을 하베스트하여 4% 파라포름알데히드에 고정하여, 10% EDTA(pH 7.4)에서 탈회시켜, 파라핀에 포매(embedding)하여, 헤마톡실린-에오신(H-E)(Vector Labs)으로 염색하거나 또는 면역조직화학적 분석을 진행시켰다. 면역조직화학적 분석을 수행하기 위하여, 1차 항원으로 1:150로 희석한 항-DSP 항체, 그리고 2차 항원으로 비오틴 라벨을 한 염소 항-래빗 IgG (Vector Labs)과 함께 단백질을 탐지하였다.
콜라겐 염색(Masson's Trichrome Stain)은 Polysciences사의 Masson's Trichrome Stain Kit(Cat. 25088-100)를 이용하여 제공된 실험 방법에 준하여 실시하였다.
새롭게 형성된 경조직의 정량적 분석은 LS starter 프로그램(OLYMPUS Soft Imaging Solution, Muster, Germany)을 사용하여 분석하였다. 새롭게 형성된 경조직의 비율은 총 면적에서 새롭게 형성된 경조직의 면적을 퍼센트 비율로 계산하였다.
실시예 1-6. 주사 전자 현미경 분석(Scanning Electron Microscope analysis)
샘플 조직을 2.5% Glutaraldehyde/0.1 M Cacodylate buffer에 30분간 고정하고, 0.1 M Cacodylate buffer에 1% osmium tetroxide가 포함된 용액에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음 샘플은 에탄올을 이용하여 빠르게 탈수 및 건조시킨 후 시료를 금으로 코팅하고, 주사 전자현미경(S-4700, HITACHI, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
실시예 1-7. 통계 분석
스튜던트 t-테스트를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 모든 통계 분석은 SPSS software ver. 19.0를 사용하여 수행하였다.
실시예 2: 실험 결과
실시예 2-1. 상아모세포 분화 마커 유전자인 Dspp 유전자의 발현수준에 미치는 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질-치수질환 치료용 펩타이드의 영향
Dspp 유전자는 상아모세포 분화 마커로 사용되며 상아질의 석회화에 중요한 유전자로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드가 상아모세포 분화 마커 유전자인 Dspp 유전자의 발현을 증가시켜 상아모세포 분화와 상아질 형성을 촉진하는 효과를 갖는지 확인하였다.
상기 실시예 1-3의 방법을 수행하여 배양한 인간 치수세포(hDPCs)에 상기 실시예 1-1에서 합성된 각 그룹의 펩타이드를 10 ㎍/㎖의 농도로 처리하고, 48시간 동안 배양한 다음, 상기 인간 치수세포에서 발현되는 상아모세포 분화 마커 유전자인 Dspp 유전자의 mRNA 수준을 측정하고, 상기 측정된 각각의 Dspp 유전자의 mRNA 수준을, 대조군에서 측정된 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 대한 상대적 비율로 환산하였다(표 18 내지 33).
또, 상기 표 1 내지 표 3의 각 그룹의 펩타이드에 따라 측정된 Dspp 유전자의 mRNA 수준의 평균값을 각 그룹별로 비교하였다(도 1a). 구체적으로, 아미노산 염기서열의 치환 또는 일부 서열이 결여된 본 발명의 신규 펩타이드를 표 1 내지 표 3과 같이 그룹화하고, 각 그룹의 신규 펩타이드가 인간 치수세포에서 상아모세포 분화 마커 유전자인 Dspp의 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과로서, 인간 치수세포에서 Dspp mRNA의 레벨을 정량적 실시간 PCR로 측정한 각 그룹의 평균 값을 보여주는 그래프를 도 1a에 나타내었다. 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 인간 치수세포를 사용하였다.
또한, 상기 표 4 내지 표 16의 각 그룹의 펩타이드에 따라 측정된 Dspp 유전자의 mRNA 수준의 평균값을 각 그룹별로 비교하였다(도 1b). 구체적으로, 아미노산 염기서열의 치환 또는 일부 서열이 결여된 본 발명의 신규 펩타이드를 표 4 내지 표 16과 같이 그룹화하고, 각 그룹의 신규 펩타이드가 인간 치수세포에서 상아모세포 분화 마커 유전자인 Dspp의 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과로서, 인간 치수세포에서 Dspp mRNA의 레벨을 정량적 실시간 PCR로 측정한 각 그룹의 평균 값을 보여주는 그래프를 도 1b에 나타내었다. 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 인간 치수세포를 사용하였다.
상기 Dspp 유전자의 발현수준은 상기 실시예 1-4에서 설명한 RT-PCR 및 실시간 PCR 분석을 통해 측정하였다. 이때, 내부대조군으로는 Gapdh 유전자를 사용하였고, 측정값은 3회 반복실험을 수행한 후, 이의 평균값 및 표준편차 값을 사용하였다. 프라이머의 염기서열은 상기 표 17에 기재되어 있다.
그룹 1의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
DSPP 유전자의 mRNA 수준
서열번호 평균 표준편차
1 7.371 0.093
2 7.171 0.121
3 6.512 0.209
4 7.071 0.192
5 6.893 0.07
6 6.931 0.119
7 6.881 0.321
8 6.531 0.2025
그룹 2의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
DSPP 유전자의 mRNA 수준
서열번호 평균 표준편차
9 7.543 0.132
10 6.996 0.352
11 7.385 0.271
12 7.548 0.327
13 6.655 0.377
14 6.839 0.241
15 6.764 0.289
16 7.739 0.357
그룹 3의 펩타이드가 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
DSPP 유전자의 mRNA 수준
서열번호 평균 표준편차
17 7.712 0.219
18 7.319 0.192
19 7.931 0.192
20 7.553 0.299
21 7.893 0.132
22 7.412 0.372
23 9.171 0.381
24 8.512 0.411
그룹 4의 펩타이드가 DSPP 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
DSPP 유전자의 mRNA 수준
서열번호 평균 표준편차
25 2.491 0.453
26 2.623 0.273
27 2.213 0.302
28 2.781 0.5
29 2.926 0.292
30 2.011 0.311
31 2.432 0.52
32 2.303 0.299
그룹 5의 펩타이드가 DSPP 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
DSPP 유전자의 mRNA 수준
서열번호 평균 표준편차
33 3.615 0.53
34 3.727 0.495
35 3.017 0.293
36 3.256 0.444
37 3.303 0.671
38 2.099 0.506
39 3.412 0.279
40 3.109 0.395
그룹 6의 펩타이드가 DSPP 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
DSPP 유전자의 mRNA 수준
서열번호 평균 표준편차
41 2.937 0.333
42 2.808 0.501
43 2.435 0.432
44 2.517 0.296
45 3.051 0.433
46 2.733 0.198
47 2.439 0.287
48 2.602 0.333
그룹 7의 펩타이드가 DSPP 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
DSPP 유전자의 mRNA 수준
서열번호 평균 표준편차
49 1.631 0.137
50 1.803 0.208
51 1.569 0.111
52 1.949 0.327
53 1.422 0.09
54 1.638 0.214
55 2 0.396
56 1.909 0.55
그룹 8의 펩타이드가 DSPP 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
DSPP 유전자의 mRNA 수준
서열번호 평균 표준편차
57 2.415 0.375
58 2.677 0.601
59 2.463 0.222
60 2.089 0.163
61 1.909 0.307
62 2.752 0.482
63 2.373 0.394
64 1.829 0.201
그룹 9의 펩타이드가 DSPP 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
DSPP 유전자의 mRNA 수준
서열번호 평균 표준편차
65 2.201 0.461
66 2.072 0.366
67 2.452 0.509
68 2.343 0.419
69 1.899 0.382
70 1.947 0.247
71 2.052 0.233
72 1.739 0.188
그룹 10의 펩타이드가 DSPP 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
DSPP 유전자의 mRNA 수준
서열번호 평균 표준편차
73 2.208 0.366
74 2.105 0.273
75 2.624 0.522
76 2.394 0.432
77 1.939 0.337
78 2.109 0.159
79 2.403 0.601
80 2.636 0.573
그룹 11의 펩타이드가 DSPP 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
DSPP 유전자의 mRNA 수준
서열번호 평균 표준편차
81 1.757 0.372
82 1.909 0.269
83 2.001 0.227
84 2.101 0.373
85 1.838 0.401
86 1.736 0.317
87 1.888 0.444
88 1.539 0.132
그룹 12의 펩타이드가 DSPP 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
DSPP 유전자의 mRNA 수준
서열번호 평균 표준편차
89 1.635 0.214
90 1.797 0.323
91 1.913 0.333
92 1.498 0.111
93 1.892 0.274
94 1.487 0.099
95 1.939 0.295
96 2.011 0.199
그룹 13의 펩타이드가 DSPP 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
DSPP 유전자의 mRNA 수준
서열번호 평균 표준편차
97 1.515 0.107
98 1.479 0.106
99 1.737 0.207
100 1.599 0.166
101 1.674 0.109
102 1.855 0.299
103 1.737 0.107
104 1.878 0.201
그룹 14의 펩타이드가 DSPP 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
DSPP 유전자의 mRNA 수준
서열번호 평균 표준편차
105 1.664 0.085
106 1.673 0.207
107 1.935 0.372
108 1.495 0.091
109 1.756 0.201
110 1.595 0.099
111 1.918 0.175
112 1.699 0.143
그룹 15의 펩타이드가 DSPP 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
DSPP 유전자의 mRNA 수준
서열번호 평균 표준편차
113 1.778 0.205
114 1.849 0.337
115 1.707 0.199
116 1.693 0.075
117 1.929 0.193
118 2.015 0.151
119 2.121 0.337
120 1.878 0.116
그룹 16의 펩타이드가 DSPP 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
DSPP 유전자의 mRNA 수준
서열번호 평균 표준편차
121 2.024 0.298
122 1.979 0.303
123 1.837 0.111
124 2.017 0.402
125 2.082 0.377
126 1.798 0.163
127 1.888 0.099
128 1.765 0.375
도 1a는 본 발명의 펩타이드가 처리된 인간 치수세포(hDPCs)에서 상아모세포 분화 마커인 Dspp 유전자의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1a 및 표 18 내지 표 20을 참조하면, 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 인간 치수세포(대조군, Control)에서 측정된 상아모세포 분화 마커인 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 비하여, 본 발명의 펩타이드를 처리할 경우, Dspp 유전자의 mRNA 수준이 모두 약 6배 내지 8배 이상 증가한 것을 확인할 수 있다. 특히 그룹 3의 펩타이드로 처리된 경우, 가장 높은 Dspp mRNA 발현 값을 보여주었다. 도 1b는 본 발명의 펩타이드가 처리된 인간 치수세포에서 상아모세포 분화 마커인 Dspp 유전자의 발현 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1b 및 표 21 내지 표 33을 참조하면, 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 인간 치수세포(대조군, Control)에서 측정된 상아모세포 분화 마커인 Dspp 유전자의 mRNA 수준에 비하여, 본 발명의 펩타이드를 처리할 경우, Dspp 유전자의 mRNA 수준이 모두 약 1.5배 내지 3배 이상 증가한 것을 확인할 수 있다.
실시예 2-2. 상아모세포 분화 마커 유전자인 Nestin 유전자의 발현수준에 미치는 상아질 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질-치수질환 치료용 펩타이드의 영향
상기 실시예 2-1의 결과로부터, 본 발명의 펩타이드는 Dspp 유전자의 mRNA 수준을 증가시킬 수 있고, 예를 들어, 모든 그룹의 펩타이드는 Dspp 유전자의 mRNA 수준을 1.5배 이상, 나아가 3배 이상 증가시킬 수 있고, 특히 그룹 1 내지 그룹 3의 펩타이드는 Dspp 유전자의 mRNA 수준을 6배 이상 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
이에 따라, 상기 그룹 1 내지 3의 펩타이드가 다른 상아모세포 분화 마커 유전자인 Nestin 유전자의 mRNA 수준도 증가시킬 수 있는지 확인하였다.
대략적으로, 프라이머를 달리 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일, 유사한 방법을 수행하여, Nestin 유전자의 발현수준에 미치는 본 발명의 펩타이드의 효과를 측정하고, 각 그룹별로 산출된 평균수준을 비교하였다(도 1c). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 인간 치수세포를 사용하였다.
도 1c는 본 발명의 펩타이드가 처리된 인간 치수세포(hDPCs)에서 상아모세포 분화 마커 유전자인 Nestin 유전자의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1c에서 보여주듯이, 본 발명의 펩타이드를 처리한 군(Group 1, 2, 3)은, 대조군(Control)에 비해 상아모세포 분화 마커 유전자인 Nestin 유전자의 발현수준이 모두 5배 이상 증가된 것을 확인할 수 있다.
상기 Dspp 및 Nsetin 유전자는 상아모세포 분화 마커로 사용되며 상아질의 석회화 과정에 관여하는 유전자로 알려져 있으므로, 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 상아질 재생을 촉진하는 효과를 나타낼 것으로 분석되었다.
실시예 2-3. 뼈모세포 및 백악모세포 분화 마커 유전자인 BSP 유전자의 발현수준에 미치는 뼈 및/또는 백악질의 재생촉진 및 치주질환 치료용 펩타이드의 영향
BSP 유전자는 뼈모세포 및 백악모세포 분화 마커로 사용되며 뼈와 백악질의 석회화에 중요한 유전자로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 신규한 펩타이드가 뼈모세포와 백악모세포 분화 마커 유전자인 BSP 유전자의 발현에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-2의 방법을 수행하여 배양한 사람유래 중간엽 줄기세포(즉, 인간 골수 중간엽 줄기세포, hBMSCs)에 각 그룹의 펩타이드를 처리한 후 BSP 유전자 발현을 실시간 PCR로 확인하였다.
대략적으로, 프라이머를 달리 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일, 유사한 방법을 수행하여, BSP 유전자의 발현수준에 미치는 본 발명의 펩타이드의 효과를 측정하고, 각 그룹별로 산출된 평균수준을 비교하였다(도 2a, 도 2b). 구체적으로, 표 1 내지 표 3과 같이 그룹화한 본 발명의 신규 펩타이드에서, 각 그룹의 신규 펩타이드가 사람유래 중간엽 줄기세포(hBMSCs)에서 뼈와 백악질 분화 마커 유전자인 BSP(Bone sialoprotein)의 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과로서, 사람유래 중간엽 줄기세포에서 BSP mRNA의 레벨을 정량적 실시간 PCR로 측정한 결과 그래프를 도 2a에 나타내었다. 또, 표 4 내지 표 16과 같이 그룹화한 본 발명의 신규 펩타이드에서, 각 그룹의 신규 펩타이드가 사람유래 중간엽 줄기세포에서 뼈와 백악질 분화 마커 유전자인 BSP의 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과로서, 사람유래 중간엽 줄기세포에서 BSP mRNA의 레벨을 정량적 실시간 PCR로 측정한 결과 그래프를 도 2b에 나타내었다.
이때, 펩타이드는 10 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 그리고 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 인간 골수 중간엽 줄기세포를 사용하였다.
도 2a는 본 발명의 펩타이드가 처리된 사람유래 중간엽 줄기세포(hBMSCs)에서 뼈 및 백악질의 분화 마커 유전자인 BSP 유전자의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2a에서 보여주듯이, 본 발명의 펩타이드를 처리한 군(Group 1, 2, 3)은, 대조군(Control)에 비해 BSP 유전자 발현이 약 9배 내지 13배 이상 증가된 것을 확인할 수 있다. 특히 그룹 3의 펩타이드로 처리된 경우, 가장 높은 BSP mRNA 발현 값을 보여주었다.
도 2b는 본 발명의 펩타이드가 처리된 사람유래 중간엽 줄기세포(hBMSCs)에서 뼈 및 백악질의 분화 마커 유전자인 BSP 유전자의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2b에서 보여주듯이, 본 발명의 펩타이드를 처리한 군(Group 4 내지 Group 16)은, 대조군(Control)에 비해 BSP 유전자 발현이 약 3배 내지 9배 이상, 나아가 12배 이상 증가된 것을 확인할 수 있다. 특히 그룹 11의 펩타이드로 처리된 경우, 가장 높은 BSP mRNA 발현 값을 보여주었다.
상기 BSP 유전자는 뼈모세포와 백악모세포 분화 마커로 사용되며 뼈와 백악질의 석회화 과정에 관여하는 유전자로 알려져 있으므로, 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 뼈와 백악질의 재생을 촉진하는 효과를 나타낼 것으로 분석되었다.
실시예 2-4. 6주 동안 생체 내에서 신규한 펩타이드에 의한 인간 치수세포(hDPCs)의 경조직 형성
(1) 조직형태학적 분석
도 1a, 도 1b, 도 1c, 도 2a 및 도 2b에 나타난 인비트로 실험 결과에 근거하여, 인비보에서 경조직 형성에 대한 본 발명의 펩타이드의 효과를 측정하기 위하여, 상기 실시예 1-5에서 설명한 바와 같이, 인간 치수세포(hDPCs) 및 100 mg의 히드록시아파타이트/트리칼슘 포스페이트(HA/TCP)를 10 ㎍의 그룹 3의 펩타이드(예컨대, 서열번호 24)와 함께, 각각 0.5% 피브린 겔과 혼합하여 이식물을 제작하였다. 상기 이식물을 면역시스템이 손상된 마우스의 피하조직에 이식하였다. 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않는 이식물이 이식된 것을 사용하였다. 이식 6주 후, 상기 실시예 1-5에서 설명한 바와 같이, 샘플을 채취한 후 LS starter 프로그램을 이용하여 새롭게 형성된 경조직을 정량 분석하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 인비보에서 6주 동안 인간 치수세포(hDPCs)를 사용하여 새롭게 형성한 경조직의 양을 측정한 결과를 나타낸다. 도 3에서 보여주듯이, 이식 6주 후 경조직 형성 비율은, 대조군(Control, 13.5%)과 비교하여 신규한 펩타이드를 처리한 군(Group 3, 29.6%)이 약 2배 이상 증가되었다.
도 4는 인비보에서 6주 동안 인간 치수세포(hDPCs)를 사용하여 형성한 경조직을 조직형태학적으로 분석한 것을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 D는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 대조군의 이식물을, E 내지 H는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 10 ㎍의 그룹 3의 펩타이드와 함께, 각각 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 이식물을 면역시스템이 약화된 마우스에 6주 동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: A, E 500㎛, B, F 200㎛, C, G 100㎛, D, H 50㎛). 형성된 경조직은 헤마톡신에오신(H-E)으로 염색하였다.
도 4에서 보여주듯이, 헤마톡실린-에오신 염색을 통한 조직형태학적 분석 결과, 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않는 대조군(도 4의 A-D) 및 본 발명의 펩타이드를 포함하는 군(도 4의 E-H) 모두에서 HA/TCP 입자 주변의 석회화된 조직의 기질에 세포가 함입된 뼈 유사 조직과 상아질-치수 유사 조직이 형성됨을 관찰되었다.
(2) 콜라겐 염색 분석
콜라겐은 상아질, 뼈 및 백악질에서 가장 풍부하게 존재하는 유기바탕질 (organic matrix)이며, 침착되는 무기질을 수용하는 역할을 한다. 이에 따라, 상기 조직형태학적 분석의 각 실험군에서 형성된 석회화된 조직에서 콜라겐 단백질의 축적을 확인하기 위하여 콜라겐 염색을 시행하였다.
도 5는 인비보에서 6주 동안 인간 치수세포(hDPCs)를 사용하여 형성한 경조직에 포함된 콜라겐의 형성 수준을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 D는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 대조군의 이식물을, E 내지 H는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 10 ㎍의 그룹 3의 펩타이드와 함께, 각각 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 이식물을 면역시스템이 약화된 마우스에 6주 동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: A, E 500㎛, B, F 200㎛, C, G 100㎛, D, H 50㎛). 형성된 경조직은 콜라겐 염색(Masson's trichrome stain)방법으로 염색하였다.
도 5에서 보듯이, 대조군(도 5의 A-D)와 비교하여, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 군(도 5의 E-H)에서, 콜라겐의 형성수준이 증가됨을 확인하였다.
(3) 면역조직화학적 분석
상아모세포 특이적 분화 마커 유전자인 DSP의 발현을 면역조직화학적 분석을 통하여 확인하였다.
도 6은 인비보에서 6주 동안 인간 치수세포(hDPCs)를 사용하여 형성한 경조직을 면역 염색법을 이용하여 상아모세포 분화 마커인 DSP의 발현 수준을 분석한 것을 나타내는 면역염색 사진으로서, A는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 대조군의 이식물을, B는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 10 ㎍의 그룹 3의 펩타이드와 함께, 각각 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 이식물을 면역시스템이 약화된 마우스에 6주 동안 이식한 결과를 나타낸다. A 및 B는 형성된 경조직을 항-DSP 항체를 이용하여 면역 염색하였다. C는 이차항체만 처리한 면역조직화학적 분석의 음성대조군이다. A 및 B의 화살표는 새롭게 형성된 석회화된 조직에서 DSP의 발현을 나타낸다. 크기바는 50㎛이다.
도 6에서 보여주듯이, 대조군(도 6의 A)은 새롭게 형성된 상아질-치수 유사 조직에서 DSP가 약하게 발현하였지만, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 군(도 6의 B)에서 DSP가 새롭게 형성된 석회화된 조직에서 강하게 발현되었다. 도 6의 C는 면역조직화학적 분석에서 이차항체만 처리한 음성대조군으로 DSP 염색이 되지 않은 것을 보여준다.
실시예 2-5. 12주 동안 생체 내에서 신규한 펩타이드에 의한 인간 치수세포(hDPCs)의 경조직 형성
(1) 조직형태학적 분석
이식물이 이식된 마우스를 12주 동안 사육하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-4의 방법을 수행하여, 인간 치수세포의 경조직 형성을 분석하였다.
도 7은 인비보에서 12주 동안 인간 치수세포(hDPCs)를 사용하여 새롭게 형성한 경조직의 양을 측정한 결과를 나타낸다. 도 7에서 보여주듯이, 이식 12주 후 경조직 형성 비율은, 대조군(Control, 23.7%)과 비교하여 신규한 펩타이드를 처리한 군(Group3, 39.5%)이 약 1.6배 이상 증가되었다.
도 8은 인비보에서 12주 동안 인간 치수세포(hDPCs)를 사용하여 형성한 경조직을 조직형태학적으로 분석한 것을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 D는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 대조군의 이식물을, E 내지 H는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 10 ㎍의 그룹 3의 펩타이드와 함께, 각각 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 이식물을 면역시스템이 약화된 마우스에 12주 동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: A, E 500㎛, B, F 200㎛, C, G 100㎛, D, H 50㎛). 형성된 경조직은 헤마톡신에오신(H-E)으로 염색하였다.
도 8에서 보여주듯이, 헤마톡실린-에오신 염색을 통한 조직형태학적 분석 결과, 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않는 대조군(도 8의 A-D) 및 본 발명의 펩타이드를 포함하는 군(도 8의 E-H) 모두, 도 4의 경우(6주 이식)와 유사하게, HA/TCP 입자 주변의 석회화된 조직의 기질에 세포가 함입된 뼈 유사 조직과 상아질-치수 유사 조직이 형성됨을 관찰되었다.
(2) 콜라겐 염색 분석
상기 실시예 2-5의 조직형태학적 분석의 각 실험군에서 형성된 석회화된 조직에서 콜라겐 단백질의 축적을 확인하기 위하여 콜라겐 염색을 시행하였다.
도 9는 인비보에서 12주 동안 인간 치수세포(hDPCs)를 사용하여 형성한 경조직에 포함된 콜라겐의 형성 수준을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 D는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 대조군의 이식물을, E 내지 H는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 10 ㎍의 그룹 3의 펩타이드와 함께, 각각 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 이식물을 면역시스템이 약화된 마우스에 12주 동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: A, E 500㎛, B, F 200㎛, C, G 100㎛, D, H 50㎛). 형성된 경조직은 콜라겐 염색(Masson's trichrome stain)방법으로 염색하였다.
도 9에서 보듯이, 대조군(도 9의 A-D)와 비교하여, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 군(도 9의 E-H)에서, 콜라겐의 형성수준이 증가됨을 확인하였다.
(3) 면역조직화학적 분석
상아모세포 특이적 분화 마커 유전자인 DSP의 발현을 면역조직화학적 분석을 통하여 확인하였다.
도 10은 인비보에서 12주 동안 인간 치수세포(hDPCs)를 사용하여 형성한 경조직을 면역 염색법을 이용하여 상아모세포 분화 마커인 DSP의 발현 수준을 분석한 것을 나타내는 면역염색 사진으로서, A는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 대조군의 이식물을, B는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 10 ㎍의 그룹 3의 펩타이드와 함께, 각각 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 이식물을 면역시스템이 약화된 마우스에 12주 동안 이식한 결과를 나타낸다. A 및 B는 형성된 경조직을 항-DSP 항체를 이용하여 면역 염색하였다. C는 이차항체만 처리한 면역조직화학적 분석의 음성대조군이다. A 및 B의 화살표는 새롭게 형성된 석회화된 조직에서 DSP의 발현을 나타낸다. 크기바는 50㎛이다.
도 10에서 보여주듯이, 대조군(도 6의 A)은 새롭게 형성된 상아질-치수 유사 조직에서 DSP가 약하게 발현하였지만, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 군(도 6의 B)에서 DSP가 새롭게 형성된 석회화된 조직에서 강하게 발현되었다. 도 10의 C는 면역조직화학적 분석에서 이차항체만 처리한 음성대조군으로 DSP 염색이 되지 않은 것을 보여준다.
상기 실시예 2-4 및 2-5의 결과를 종합하면, 본 발명의 신규한 펩타이드는 상아질/치수조직 복합체 및 뼈/백악질 유사조직의 재생을 촉진할 수 있는 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
실시예 2-6. 이식 조직의 주사 전자 현미경을 이용한 세포 분석
이식 12주 후의 대조군과 신규한 펩타이드를 처리한 실험군에서 인간 치수세포(hDPCs)의 상아모세포 또는 뼈모세포/백악모세포로의 분화를 확인하기 위하여 상기 실시예 1-6의 방법으로 주사 전자 현미경 분석을 수행하였다.
도 11은 인비보에서 12주 동안 인간 치수세포(hDPCs)를 사용하여 형성한 경조직을 주사 전자 현미경(Scanning Electron Microscope : SEM)을 이용하여 분석한 것을 나타내는 SEM 사진으로서, A는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 대조군의 이식물을, B와 C는 hDPCs 및 100 mg HA/TCP을 10 ㎍의 그룹 3의 펩타이드와 함께, 각각 0.5% 피브린 겔에 혼합하여 제조한 이식물을 면역시스템이 약화된 마우스에 12주 동안 이식한 결과를 나타낸다. 크기바는 10 ㎛ 이다. 형성된 경조직은 주사형 전자현미경으로 세포를 관찰하였다.
도 11에서 보여주듯이, hDPCs-단독으로 처리한 대조군에서는 형성된 경조직 주위에서 상아모세포 돌기가 불완전하게 형성된 상아모세포-유사 세포가 일부 관찰되었다(도 11의 A). 본 발명의 펩타이드(예컨대, 그룹 3의 펩타이드)를 처리한 군에서는 형성된 경조직을 따라 상아모세포-유사 세포가 관찰되었고, 상아모세포 돌기 또한 형성된 경조직 방향으로 확장되어 있었다(도 11의 B). 또한, 본 발명의 펩타이드를 처리한 군에서는 형성된 경조직의 표면에 입방형의 세포가 부착되어 있는 전형적인 뼈모세포/백악모세포의 특징을 나타냄을 확인하였다(도 11의 C).
따라서, 본 발명의 펩타이드는 상아모세포 및 뼈모세포/백악모세포를 보다 효과적으로 형성할 수 있음을 알 수 있었다.
이 연구는 2017년도 산업통상자원부 및 산업기술평가관리원(KEIT) 연구비 지원에 의한 연구임(10078369, "치아 상아질의 재생을 유도하는 기능성 펩타이드를 이용한 시린이 치료 원천기술 개발")
이상, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 실시 예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예들에는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> HysensBio <120> Novel peptide <130> LP171007KRPRIG1 <160> 128 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 1 Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Lys 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 2 Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Arg 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 3 Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Lys 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 4 Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 5 Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Lys 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 6 Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Lys 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 7 Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Arg 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel peptide <400> 8 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Claims (6)

  1. 서열번호 25 내지 48 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 N-말단 또는 C-말단의 아세틸화, 아미드화 또는 메틸화; D-아미노산 도입; CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O 또는 CH2-CH2와 같은 펩타이드 결합 변형; 백본 변형; 또는 측쇄 변형된 것인, 펩타이드.
  3. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
  5. 서열번호 25 내지 48 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드를 포함하는 경조직 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질-치수질환 또는 치주질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 경조직 또는 치수조직의 재생촉진 및 상아질-치수질환 또는 치주질환의 예방 또는 치료 방법.
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