KR101903461B1 - 신규한 피부상태 개선 및 피부재생 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 피부상태 개선 및 피부재생 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 피부의 이상개선 및 피부 재생용 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 펩타이드를 포함하는 피부이상 예방 또는 치료 및 피부재생 유도용 약학 조성물 및 피부이상 예방 또는 치료 및 피부재생 유도용 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 피부의 이상개선 및 피부 재생용 펩타이드는 우수한 피부건조증, 노화 및 염증완화 효과 및 피부세포의 재생촉진 효과를 나타내므로, 인간의 피부의 나타나는 질환의 예방 또는 치료를 위한 제제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

신규한 피부상태 개선 및 피부재생 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 {Novel peptide for promoting skin condition and regeneration of skin tissue and Uses Thereof}
본 발명은 본 발명은 피부상태 개선 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 피부상태 개선 및 피부재생 활성을 갖는 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 펩타이드를 포함하는 피부상태 개선 및 피부재생 활성을 갖는 예방 또는 개선용 화장품, 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
인간의 피부는 끊임없이 변화를 겪게 되며, 그 중 가장 대표적인 것이 노화에 의한 피부의 기능 저하 및 시각적인 아름다움의 감소이다. 피부의 노화는 크게 유전적 요소에 따른 내적 노화와 태양광선 등의 외부 환경적 요소에 따른 외적 노화로 구분된다. 이러한 외적 노화는 피부의 주름을 형성시키며, 대표적인 주름 형성의 인자로서 활성 산소, 자외선 및 콜라겐의 생합성 감소 등을 들 수 있다(Danielle, A study in the epidermiology of crow's feet., Ann. Intern. Med., 75:873-880(1971); Grove et al., Optical profilometry; an objective method for quantification of facial wrinkles., J. Am. Acad. Dermatol., 21:631-637(1989)). 피부의 내적 노화의 경우 인위적인 조절이 불가능하나, 외적 노화의 경우 활성산소 제거, 케라틴형성세포의 증식 및 콜라겐의 생합성 촉진 등을 통하여 노화를 예방, 치료 또는 지연시킬 수 있다(Schwartz et al., Topical all-trans retinoic acid stimulates collagen synthesis in vivo., J. Invest. Dermatol., 96(6):975-978(1991)).
우리의 피부에서 각질층은 피부 최외곽 층을 형성하고 있으며, 건조한 외부환경으로부터 피부 내부의 수분 손실을 막아주는 중요한 역할을 수행하고 있다. 그와 동시에 그 자신도 적당한 수분을 보유하여 유연성 내지 탄력성을 보이게 된다. 보통 촉촉한 피부라고 느껴지는 정도는 각질층의 수분 함량이 15% 정도임에 반하여, 10%이하인 경우는 건성 피부로 불리운다. 그러나 노화, 호르몬 분비 불균형과 같은 내인성 변화를 비롯하여 바람, 기온, 햇빛 등과 같은 외부의 환경적 요인에 의해 각질층의 수분이 손실되게 된다. 이렇게 수분이 손실된 경우 피부의 탄력성 및 유연성이 소실되며, 궁극적으로는 피부의 고유한 보호기능이 사라져 피부조직의 갈라짐, 홍반, 모세 혈관 확장증, 가려움증 등이 유발되고, 이러한 증상들이 더욱 심해지면 건선, 아토피 등과 같은 난치성 염증성 피부질환들이 발생하게 된다. 그러므로 이와 같은 문제를 해결하기 위하여 피부 각질층에 인위적인 보습막을 형성시키 기 위한 연구들이 지속적으로 진행되고 있다. 또한 이러한 인위적인 보습막의 형성에도 불구하고 피부에 부작용을 일으키지 않는 등의 안전성도 수반되어져야 한다. 그리하여 최근에는 이러한 화학제제가 아닌 생물학적 제제를 활용하여 보습 효과가 우수한 피부 보습막을 형성시키려는 노력이 계속 되고 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 보다 효과적으로 피부상태 개선 및 피부재생 활성을 갖는 펩타이드 제제를 개발하기 위하여, 예의 연구노력한 결과, 피부상태 개선 및 피부재생 활성 효과를 나타내는 펩타이드를 개발하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 피부상태 개선 및 피부재생 활성을 갖는 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 피부상태 개선 및 피부재생 활성을 갖는 화장품 및 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 피부상태 개선 및 피부재생 활성을 갖는 건강기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다
본 발명자들은 보다 효과적으로 치수질환을 치료할 수 있는 제제를 개발하기 위하여, 다양한 연구를 수행한 결과, 10개의 아미노산으로 구성된 신규한 펩타이드를 개발하였다.
상기 개발된 신규한 펩타이드는 피부상태 개선 및 피부재생 활성을 갖는 펩타이드의 아미노산 서열을 일부 치환하여 제작된 것으로서, 케라틴형성세포(Keratinocyte) 분화마커 유전자인 Keratin 2(KT 2), Keratin 10(KT 10) 및 Filaggrin 유전자의 발현수준을 증가시킬 수 있어, 피부 재생을 촉진하는 효과를 나타내면서도, 피부의 세포에 대하여는 낮은 세포독성 및 염증활성을 보임을 확인하였다.
또한, 상기 펩타이드를 콜라겐(Collagen) 포함하는 지지체를 이용한 이식물을 제작하고, 상기 제작된 이식물을 면역시스템이 손상된 마우스의 피하조직에 이식하고, 6주 내지 12주가 경과된 후, 이식된 조직을 분석한 결과, 생체내 피부 조직 또는 피부와 가장 유사한 형태의 피부 유사 조직(피부/피부-유사조직)이 형성되고, 콜라겐의 형성수준이 증가하며, 케라틴형성세포 특이적 분화 마커 유전자인 KT2/10의 발현수준이 증가하는 반면, 염증 관련 마커인 ERK/P38/JNK MAPkinase (MAPK)의 발현수준은 특별히 증가되지 않음을 확인하였다.
아울러, 상기 형성된 조직의 형상을 현미경을 통해 분석한 결과, 기존의 피부 벽에 케라틴형성세포가 울타리배열로 존재하였고, 이들의 세포 돌기는, 늘어난 핵과 함께, 기존의 피부를 향해 확장됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 펩타이드는 피부 또는 피부의 재생촉진 및 피부 치료효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있었다. 이러한 효과를 나타내는 본 발명의 펩타이드는 지금까지 전혀 보고되지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다.
상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는, 피부 또는 피부의 상태 개선 및 피부 재생용 펩타이드를 제공한다.
G-A-R1-R2-K-K-R3-R4-R5-Y (일반식 1)
상기 일반식 1에서,
R1은 아르기닌(R), 리신(K) 또는 글루타민(Q)이고;
R2는 아르기닌(R) 또는 글루타민(Q)이며;
R3, R4는 각각 아르기닌(R) 또는 리신(K)이고;
R5는 아스파라긴(N) 또는 세린(S)이다.
본 발명의 용어, "피부(Skin)"이란, "표피(epidermis)"이라고도 호칭되고, 인체의 외형 대부분을 이루고있는 연조직을 의미한다.
본 발명의 용어, "피부이상"이란, 피부 및 피부조직을 구성하고 있는 표피조직 및 연관 하부 조직의 정상적이지 않은 손상상태를 의미한다. 정상적이지 않은 손상상태는 과도한 수분 부족(건조), 스트레스, 기계적 손상 등 유해 자극에 의하거나 노화, 유전적 결함 등에 의해 발생할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 펩타이드는 세포독성을 나타내지 않으면서도, 케라틴형성세포 분화마커 유전자인 Keratin 2, Keratin 10 및 Filaggrin 유전자의 발현수준을 증가시킬 수 있으며, 케라틴형성세포 쪽에 생체 내에 이식할 경우, 상기 피부 세포가 피부/피부-유사 조직을 형성하는 특징을 나타낼 수 있다.
본 발명에서 제공하는 펩타이드는, 피부 또는 피부의 재생촉진 및 피부 재생효과를 나타낼 수 있는 한, 이를 구성하는 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 변이체 펩타이드도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 범주에 포함된다.
일반적으로, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 펩타이드의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 피부 또는 피부의 재생촉진능이 증가한 펩타이드를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에서 제공하는 서열번호 1의 펩타이드의 3번에 위치한 산성 아미노산인 글루타민은 염기성 아미노산인 리신 또는 아르기닌으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있고; 서열번호 1의 펩타이드의 7번 또는 8번에 위치한 염기성 아미노산인 아르기닌은 산성 아미노산인 글루타민 또는 염기성 아미노산인 리신으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있으며; 서열번호 1의 펩타이드의 3번, 5번, 6번, 7번 또는 8번에 위치한 염기성 아미노산인 리신은 염기성 아미노산인 아르기닌 또는 방향족 아미노산인 타이로신으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있고; 서열번호 1의 펩타이드의 9번에 위치한 산성 아미노산인 아스파라긴은 중성 아미노산인 세린으로 치환되어도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있다.
이처럼, 본원발명의 펩타이드를 구성하는 산성 아미노산, 염기성 아미노산 또는 방향족 아미노산은 각각 이와 다른 산성 아미노산, 염기성 아미노산, 중성 아미노산 또는 방향족 아미노산으로 치환되어도, 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 펩타이드를 구성하는 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 변이체 펩타이드도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 범주에 포함됨은 자명하다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 그의 N-말단 또는 C-말단에 임의의 아미노산이 부가된 형태를 갖더라도, 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 효과를 그대로 나타낼 수 있으므로, 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 범주에 포함된다. 일 예로서, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 1 내지 300개의 아미노산이 부가된 형태가 될 수 있고, 다른 예로서, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 1 내지 100개의 아미노산이 부가된 형태가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 1 내지 24개의 아미노산이 부가된 형태가 될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 이용하여 합성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기서열을 포함할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터를 포함하는 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 상기 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "발현벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되고, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내어야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.
본 발명의 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 펩타이드의 분리를 촉진하기 위하여 상기 펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널 및 개시코돈은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.
아울러, 상기 발현벡터는 상기 펩타이드의 검출이 용이하도록 하기 위하여, 임의로 엔도펩티다아제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "태그(tag)"란, 정량가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 의미하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광분자일 수도 있고; Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그, 스트랩타비딘 태그 등의 에피톱 태그일 수도 있다. 특히, 에피톱 태그를 사용할 경우, 바람직하게는 6개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 보다 바람직하게는 8개 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 태그를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 상술한 본 발명의 피부의 이상개선 및 피부 재생용 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는데, 이때 사용되는 벡터는 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등)가 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.
본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 본 발명에서 제공하는 발현벡터를 숙주에 도입하여 형질전환시킴으로써 제작될 수 있고, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 상기 펩타이드를 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 형질전환제의 제작에 사용되는 숙주 역시 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균, 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로소필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
상기 형질전환체는 또한 본 발명의 피부의 이상개선 및 피부 재생용 펩타이드를 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 피부의 이상개선 및 피부 재생용 펩타이드를 생산하는 방법은 (a) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 배양물로부터 본 발명의 펩타이드를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 피부의 이상개선 및 피부 재생용 펩타이드를 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산 암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.
또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.
또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 상기 펩타이드의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 100 시간에서 달성된다.
아울러, 배양물로부터 상기 펩타이드를 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 상기 펩타이드의 회수에 사용될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 피부의 이상개선 및 피부 재생용 조성물을 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 피부의 이상개선 및 피부 재생용 펩타이드는 생체내에 주입할 경우, 해당 부위에 피부와 동일한 조직 또는 피부와 생물학적/조직학적으로 유사한 조직(피부/피부-유사 조직)을 형성하는 것을 촉진시킬 수 있으므로, 피부가 손상될 때 사용 가능한 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "피부이상 질환"이란, 상기 피부의 손상으로 인하여, 피부와 이에 결합된 피부가 손상되어 발병되는 질환을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 손상은 본 발명의 펩타이드에 의하여 치료효과를 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 주름개선, 피부재생, 피부탄력 개선, 피부노화 억제, 상처 재생, 피부 재생, 자외선에 의한 피부 손상 개선 및 염증성 피부질환의 완화를 포함하는 피부상태 개선 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "예방"이란, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 피부손상의 발생을 저해 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "치료"란, 본 발명의 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물을 피부손상 치료가 요구되는 개체에 투여 또는 도포하여 피부 또는 피부의 재생을 촉진함으로써, 치료가 수행되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은, 상기 펩타이드에 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체(자연적 또는 비자연적 담체), 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 약학 조성물의 형태로 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 치수질환이 유발된 부위에 투여할 수 있는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 콜라겐 등을 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 특히, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제, 연고제(예를 들어, 치수이장재 등) 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 펩타이드와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물 및 화장품, 피부외용제에 포함된 상기 펩타이드의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로로 투여하거나 공지된 치수질환 치료용 약학 조성물과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng 내지 약 100 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 10 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "개선"이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 개선은 본 발명의 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물을 치료가 요구되는 개체에 투여하여 피부 이상개선 또는 피부의 재생을 촉진함으로써, 증상이 호전되거나 또는 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 용어 "의약외품"이란, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유ㆍ고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병을 막기 위한 살균ㆍ살충제 등이 이에 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드를 포함하는 의약외품 조성물의 종류나 제형은 특별히 제한되지 않으나, 일 예로서, 아토피용 치료제 또는 건선 치료제 등일 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 식품은 피부 개선을 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다.
구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 본 발명의 펩타이드를 음료, 차류, 향신료, 껌류, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져 오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
본 발명의 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 피부이상 개선 또는 재생 촉진에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있으므로, 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 내지 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 내지 0.03 g이 될 수 있다.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 식품 조성물은 피부이상 개선 또는 재생 촉진 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 구체적으로 본 발명의 펩타이드를 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 피부의 이상개선 및 피부 재생용 펩타이드는 우수한 피부이상 개선 또는 재생 촉진 효과를 나타내므로, 다양한 피부 상태이상의 예방 또는 치료를 위한 화장품, 피부외용제 및 건강기능식품의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1a는 본 발명에서 제공하는 각 펩타이드가 케라틴형성세포 분화 마커 유전자인 Keratin 2 발현에 미치는 영향을 그룹별로 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1b는 본 발명의 펩타이드가 처리된 세포에서 케라틴형성세포 분화 마커인 Keratin 2 유전자의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1c는 본 발명의 그룹 2 및 6의 펩타이드가 처리된 keratinocyte 세포에서 케라틴형성세포 분화마커 유전자인 Keratin 2, Keratin 10 및 Filaggrin 유전자의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1d는 피부 세포에 대한 본 발명의 펩타이드의 세포독성을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다. 본 발명의 그룹 2 및 그룹 6의 펩타이드를 처리한 세포는 생리식염수 만을 처리한 세포와 동일한 성장 곡선을 나타내는 것을 나타내고 있다.
도 2는 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식한 다음, 이에 의해 생체내에서 생성된 피부/피부-유사 조직을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 C는 대조군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: A 200㎛, B 100㎛, C 50㎛)이고; D 내지 F는 collagen 및 그룹 2의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: D 200㎛, E 100㎛, F 50㎛)이며; G 내지 I는 피부 세포, collagen 및 그룹 6의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: G 200㎛, H 100㎛, I 50㎛)이고; J 내지 L은 collagen 및 EGF(epidermal growth factor)를 포함하는 비교군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: J 200㎛, K 100㎛, L 50㎛)이다.
도 3은 피부 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 6주동안 이식하여 생체내에서 생성된 피부/피부-유사 조직에 포함된 콜라겐의 형성 수준을 나타내는 현미경사진으로서, A 내지 C는 collagen 만을 포함하는 대조군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: A 500㎛, B 200㎛, C 50㎛), D 내지 F는 collagen 및 그룹 2의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내며(크기바: D 500㎛, E 200㎛, F 50㎛), G 내지 I는 collagen 및 그룹 6의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: G 500㎛, H 200㎛, I 50㎛), J 내지 L은 collagen 및 EGF를 포함하는 비교군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: J 500㎛, K 200㎛, L 50㎛).
도 4는 피부 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 6주동안 이식하여 생체내에서 생성된 피부/피부-유사 조직에서, 케라틴형성세포 특이적 분화 마커 유전자와 염증 특이적 마커인 MAPK의 발현수준을 평가한 결과를 나타내는 면역염색 사진으로서, A 및 E는 collagen 만을 포함하는 대조군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고, B 및 F는 collagen 및 그룹 2의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내며, C 및 G는 collagen 및 그룹 6의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고, D 및 H는 collagen 및 EGF를 포함하는 비교군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내며, A, B, C 및 D의 화살표는 새롭게 형성된 피부-유사 조직에서 KT2가 발현된 부분을 나타내고, E, F, G 및 H의 화살촉은 새롭게 형성된 조직에서 MAPK가 발현된 부분을 나타낸다. 크기바는 50㎛이다.
도 5는 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식한 다음, 이에 의해 생체내에서 생성된 피부/피부-유사 조직을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 C는 collagen 만을 포함하는 대조군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: A 500㎛, B 200㎛, C 50㎛)이고; D 내지 F는 collagen 및 그룹 2의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: D 500㎛, E 200㎛, F 50㎛)이며; G 내지 I는 collagen 및 그룹 6의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: G 500㎛, H 200㎛, I 50㎛)이고; J 내지 L은 collagen 및 EGF를 포함하는 비교군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: J 500㎛, K 200㎛, L 50㎛)이다.
도 6은 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식하여 생체내에서 생성된 피부/피부-유사 조직에 포함된 콜라겐의 형성 수준을 나타내는 현미경사진으로서, A 내지 C는 collagen 만을 포함하는 대조군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: A 500㎛, B 200㎛, C 50㎛), D 내지 F는 collagen 및 그룹 2의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내며(크기바: D 500㎛, E 200㎛, F 50㎛), G 내지 I는 collagen 및 그룹 6의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: G 500㎛, H 200㎛, I 50㎛), J 내지 L은 collagen 및 EGF를 포함하는 비교군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: J 500㎛, K 200㎛, L 50㎛).
도 7은 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식하여 생체내에서 생성된 피부/피부-유사 조직에서, 케라틴형성세포 특이적 분화 마커 유전자와 염증 특이적 마커인 MAPK의 발현수준을 평가한 결과를 나타내는 면역염색 사진으로서, A 및 E는 collagen 만을 포함하는 대조군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고; B 및 F는 collagen 및 그룹 2의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내며; C 및 G는 collagen 및 그룹 6의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고; D 및 H는 collagen 및 EGF를 포함하는 비교군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내며; A, B, C 및 D의 화살표는 새롭게 형성된 피부-유사 조직에서 마커가 발현된 부분을 나타내고; E, F, G 및 H의 화살촉은 새롭게 형성된 피부/피부 유사 조직에서 MAPK가 발현된 부분을 나타낸다. 크기바는 50㎛이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 피부의 이상개선 및 피부 재생용 펩타이드의 합성
본 발명자들은 피부이상 개선 또는 재생 촉진 효과를 나타내는 펩타이드(서열번호 1)를 9-플루오르닐메틸옥시카보닐(9-fluorenylmethyloxycarbonyl, Fmoc) 방법으로 합성하고, 상기 합성된 펩타이드의 아미노산을 치환하여 각 그룹의 펩타이드를 합성하였다(표 1 내지 6).
N-GAQRKKKNKY-C(서열번호 1)
먼저, 그룹 1의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드 또는 상기 서열번호 1의 펩타이드의 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 1).
그룹 1의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
1
2		 GA QRKK KNKY
GA QRKK RNKY
다음으로, 그룹 2의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하여 합성하였다(표 2).
그룹 2의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
3
4		 GA QRKK KSKY
GA QRKK RSKY
다음으로, 그룹 3의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아르기닌으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 3).
그룹 3의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
5
6		 GA RQKK KNKY
GA RQKK RNKY
다음으로, 그룹 4의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 아르기닌으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하여 합성하였다(표 4).
그룹 4의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
7
8		 GA RQKK KSKY
GA RQKK RSKY
다음으로, 그룹 5의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 리신으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하여 합성하였다(표 5).
그룹 5의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
9
10		 GA KQKK KNKY
GA KQKK RNKY
다음으로, 그룹 6의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 3번 아미노산을 리신으로 치환하고, 4번 아미노산을 글루타민으로 치환하며, 7번 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환하고, 8번 아미노산을 세린으로 치환하여 합성하였다(표 6).
그룹 6의 펩타이드
서열번호 아미노산 서열(N-C)
11
12		 GA KQKK KSKY
GA KQKK RSKY
실시예 2: 케라틴형성세포를 이용한 피부의 이상개선 및 피부 재생용 펩타이드의 효과검증
실시예 2-1: Keratin 2 프로모터 활성에 미치는 피부의 이상개선 및 피부 재생용 펩타이드의 영향
먼저, 케라틴형성전구세포인 keratinocyte 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서, 5%의 CO2 및 37℃ 조건으로 배양하였다.
다음으로, 상기 배양된 keratinocyte 세포를 24웰 플레이트에 각 웰당 5 X 104 세포수로 분주하고, 24시간 동안 배양한 다음, 리포펙타민 Plus™ 시약을 이용하여 상기 배양된 세포에, pGL3 벡터에 Keratin 2 프로모터와 루시퍼라제 유전자가 도입된 재조합 벡터를 도입하여 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 keratinocyte 세포에 상기 실시예 1에서 합성된 그룹 1 내지 6의 펩타이드를 각각 처리하고 48시간 동안 배양한 다음, 상기 각각의 형질전환된 keratinocyte 세포에서 루시퍼라제 활성을 측정하고, 각 그룹별로 산출된 평균수준을 비교하였다(도 1a). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 keratinocyte 세포를 사용하였다.
도 1a는 본 발명에서 제공하는 각 펩타이드가 케라틴형성세포 분화 마커 유전자인 Keratin 2 발현에 미치는 영향을 그룹별로 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1a에서 보듯이, 본 발명에서 제공하는 각 펩타이드는 전체적으로 대조군에서 측정된 루시퍼라제 활성수준의 약 1.3 배이상의 값을 나타내었으나, 각 그룹별로 차이를 나타내며, 그룹 3의 펩타이드가 가장 높은 수준의 루시퍼라제 활성을 나타내고, 다음으로 높은 수준의 루시퍼라제 활성을 나타내는 펩타이드는 그룹 4의 펩타이드임을 확인하였으며, 각 실험군 중 가장 낮은 수준이나 활성수준이 1.3배 이상을 나타내는 그룹 2 와 그룹 6이 차후 실험군으로 선정되었다. 이는 가장 낮은 수준의 활성을 보이는 그룹에서도 효과가 나타난다면 그 이상의 활성수준을 보이는 개별 그룹에서도 효과가 나타날 것임은 자명하기 때문이다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 Keratin 2 프로모터를 활성화시키는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 2-2: 케라틴형성세포 분화마커 유전자인 Keratin 2 유전자의 발현수준에 미치는 피부의 이상개선 및 피부 재생용 펩타이드의 영향
상기 실시예 2-1에서 배양한 keratinocyte 세포에 상기 실시예 1에서 합성된 각 그룹의 펩타이드를 처리하고, 48시간 동안 배양한 다음, 상기 keratinocyte 세포에서 발현되는 케라틴형성세포 분화마커 유전자인 Keratin 2 유전자의 mRNA 수준을 측정하고(표 14 내지 25), 각 그룹별로 산출된 평균수준을 비교하였다(도 1b).
상기 Keratin 2 유전자의 발현수준은 RT-PCR 및 실시간 PCR 분석을 통해 측정하였다: 구체적으로, TRIzol 시약을 이용하여 상기 keratinocyte 세포로부터 전체(total) RNA를 분리하였다. 2 ㎍의 전체 RNA와 역전사효소 1 ul와 0.5 ㎍의 올리고(oligo; dT)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 실시간 중합효소 연쇄반응에 이용하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응은 하기 각 프라이머와 SYBR GREEN PCR Master Mix(Takara, 일본)를 이용하여 ABI PRISM 7500 시퀀스 검출 시스템(sequence detection system)(Applied Biosystems)에서 진행되었다. 실시간 중합효소 연쇄반응은 94℃, 1 분 ; 95℃, 15 초 - 60℃, 34 초를 40 사이클(cycles) 반복하는 조건으로 진행하였다. 결과의 분석은 comparative cycle threshold(CT) 방법을 이용하여 평가하였다. 이때, 내부대조군으로는 Gapdh 유전자를 사용하였고, 측정값은 3회 반복실험을 수행한 후, 이의 평균값 및 표준편차 값을 사용하였다.
Keratin 2_R: 5'-CTGTTGCTAGTGGTGCTGTT-3'(서열번호 105)
Keratin 10_F: 5'-CATTCTCCTTGTGTTCCTTTGGG-3'(서열번호 106)
Gapdh_F: 5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'(서열번호 107)
Gapdh_R: 5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'(서열번호 108)
그룹 1의 펩타이드가 Keratin 2 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Keratin 2 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
1
2		 1.754
1.646		 0.132
0.092
그룹 2의 펩타이드가 Keratin 2 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Keratin 2 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
3
4		 1.854
1.746		 0.032
0.052
그룹 3의 펩타이드가 Keratin 2 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Keratin 2 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
5
6		 2.117
2.319		 0.209
0.092
그룹 4의 펩타이드가 Keratin 2 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Keratin 2 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
7
8		 2.371
2.193		 0.089
0.052
그룹 5의 펩타이드가 Keratin 2 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Keratin 2 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
9
10		 1.712
1.931		 0.091
0.172
그룹 6의 펩타이드가 Keratin 2 유전자의 mRNA 수준에 미치는 효과
서열번호 Keratin 2 유전자의 mRNA 수준
평균 표준편차
11
12		 1.546
1.586		 0.091
0.103
상기 표 13 내지 18에서 보듯이, 본 발명의 펩타이드를 처리할 경우, 케라틴형성세포 분화마커인 Keratin 2 유전자의 mRNA 수준에 비하여 모두 1.3배 이상의 값을 나타냄을 확인하였다.
특히, 그룹 3의 모든 펩타이드는 Keratin 2 유전자의 mRNA 수준에 비하여 3배 이상의 값을 나타내었고, 그룹 2의 모든 펩타이드는 Keratin 2 유전자의 mRNA 수준에 비하여 3.8배 이상의 값을 나타냄을 확인하였다.
아울러, 도 1b는 본 발명의 펩타이드가 처리된 keratinocyte 세포에서 케라틴형성세포 분화마커인 Keratin 2 유전자의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1b에서 보듯이, 본 발명의 펩타이드를 처리할 경우, 케라틴형성세포 분화마커인 Keratin 2 유전자의 mRNA 수준이 증가되고, 도 1a의 것과 비슷하게, 대조군에서 측정된 Keratin 2 유전자 mRNA 수준의 약 1.3 배이상의 값을 나타냄을 확인하였다.
실시예 2-3: 케라틴형성세포 분화마커 유전자인 Keratin 2, Keratin 10 및 Filaggrin 유전자의 발현수준에 미치는 피부의 이상개선 및 피부 재생용 펩타이드의 영향
상기 실시예 2-2의 결과로부터, 본 발명의 펩타이드는 Keratin 2 유전자의 mRNA 수준을 증가시킬 수 있고, 특히, 그룹 2 및 6의 펩타이드는 Keratin 2 유전자의 mRNA 수준이 최소 1.3배이고 타 그룹보다 낮은 수준이지만 유의미한 수준으로 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
이에 따라, 상기 그룹 2 및 6의 펩타이드가 다른 케라틴형성세포 분화마커 유전자인 Keratin 10 및 Filaggrin 유전자의 mRNA 수준도 증가시킬 수 있는지 확인하였다.
대략적으로, 하기 각 프라이머를 사용하고, 펩타이드로서 그룹 2 및 6의 펩타이드를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-2와 동일한 방법을 수행하여, Keratin 10 및 Filaggrin 유전자의 발현수준에 미치는 본 발명의 펩타이드의 효과를 측정하고, 각 그룹별로 산출된 평균수준을 비교하였다(도 1c). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 처리하지 않은 keratinocyte 세포를 사용하였고, 비교군으로서 Keratin 2 유전자의 mRNA 수준을 사용하였다.
Keratin 10_F: 5'-CATTCTCCTTGTGTTCCTTTGGG-3'(서열번호 109)
Keratin 10_R: 5'-TGTGGTCACTATTTGCCTGTG-3'(서열번호 110)
Filaggrin_F: 5'-CCCTGAAGTCGAGGAGCTG-3'(서열번호 111)
Filaggrin_R: 5'-CTGCTGCACCTCTAAGCGA-3'(서열번호 112)
도 1c는 본 발명의 그룹 2 및 6의 펩타이드가 처리된 keratinocyte 세포에서 케라틴형성세포 분화마커 유전자인 Keratin 2, Keratin 10 및 Filaggrin 유전자의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1c에서 보듯이, 본 발명의 펩타이드를 처리하면, 케라틴형성세포 분화마커 유전자인 Keratin 2, Keratin 10 및 Filaggrin 유전자의 발현수준이 모두 증가되었으나, 각 유전자별로 증가수준에 차이를 나타내고, 그룹 2의 펩타이드 보다는 그룹 6의 펩타이드가 더욱 높은 수준으로 증가시킴을 확인하였다.
상기 각 분화마커 유전자는 케라틴형성세포 분화와 피부의 재생 과정에 관여하는 유전자로 알려져 있으므로, 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 피부 재생을 촉진하는 효과를 나타낼 것으로 분석되었다.
실시예 2-4: 피부 세포에 대한 피부의 이상개선 및 피부 재생용 펩타이드의 세포독성 평가
A-431 세포는 인간 피부세포 세포주로서 하기 세포독성평가를 위해 사용되었다. 먼저, 상기 세포주는 60 mm 접시에서, DMEM 배지에서 배양하여, 배양된 피부 세포를 수득하였다.
다음으로, 상기 수득한 피부 세포를 96웰 플레이트에 각 웰당 3 × 103 세포수가 되도록 분주하고, 24시간 동안 배양한 다음, 그룹 2 또는 6의 펩타이드를 10 또는 50㎍/㎖ 농도로 처리하고, 다시 1, 3 또는 5일 동안 배양하였다. 상기 배양이 종료된 후, 배양된 세포를 PBS로 세척하고, 20㎕의 MTT 용액을 가하였으며, 이후 37℃에서 4시간 반응시켰다. 반응이 종료된 후, MTT 용액을 제거하고, 100㎕의 DMSO를 가한 후, 540nm 파장에서 흡광도를 측정하였다(도 1d). 이때, 대조군으로는 상기 펩타이드를 처리하지 않고 배양한 피부 세포를 사용하였다.
도 1d는 피부 세포에 대한 본 발명의 펩타이드의 세포독성을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1d에서 보듯이, 본 발명의 펩타이드를 가하여도 피부 세포의 생존율은 대조군과 동일한 수준을 나타냄을 확인하였다.
실시예 3: 생체내에서 피부/피부 유사조직 형성에 미치는 피부의 이상개선 및 피부 재생용 펩타이드의 영향
실시예 3-1: 6주동안 사육된 동물에서 유래된 이식조직의 형태적 분석
각 펩타이드 또는 대조군은 0.5% 콜라겐 겔과 혼합하여 이식물을 제작하였다. 이때, 콜라겐 겔(Zimmer, USA)은 이식을 위한 지지체로 사용되었으며, 상기 콜라겐 겔은 10 ㎍의 그룹 2의 펩타이드(서열번호 3), 그룹 6의 펩타이드(서열번호 11) 또는 2㎍의 EGF를 포함하도록 제조하였다. 상기 제작된 이식물을 면역시스템이 손상된 마우스(NIH-bg-nu-xid; Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)의 피하조직에 이식 하고, 상기 마우스를 6주 동안 사육한 후, 이식물로부터 형성된 피부/피부-유사 조직을 적출하였다. 적출된 조직을 4% 파라포름알데히드에 고정하고, 파라핀에 포매하고, 헤마톡실린-에오신(H-E) (Vector Labs)으로 염색하여, 상기 피부/피부-유사 조직의 수준을 평가하였다(도 2). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않는 이식물이 이식된 것을 사용하였다.
도 2는 피부 세포와 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식한 다음, 이에 의해 생체내에서 생성된 피부/피부-유사 조직을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 C는 collagen 만을 포함하는 대조군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: A 200㎛, B 100㎛, C 50㎛)이고; D 내지 F는 collagen 및 그룹 2의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: D 200㎛, E 100㎛, F 50㎛)이며; G 내지 I는 collagen 및 그룹 6의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: G 200㎛, H 100㎛, I 50㎛)이고; J 내지 L은 collagen 및 EGF를 포함하는 비교군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: J 200㎛, K 100㎛, L 50㎛)이다.
도 2에서 보듯이, 본 발명의 펩타이드를 포함하거나 또는 포함하지 않는 이식물을 이식한 경우(A 내지 I)에는 이식부위 주변에 피부/피부 유사 조직이 발생됨을 확인하였으며, EGF를 포함하는 비교군의 이식물을 이식한 경우(J 내지 L)에도 이식 부위 주변에 피부 조직과 피부 유사 조직이 발생됨을 확인하였다.
아울러, 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않은 이식물을 이식한 경우(A 내지 C)에는 피부/피부 유사조직이 거의 생성되지 않는데 비하여, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 이식물을 이식한 경우(D 내지 I)에는 높은 수준으로 생체내 피부 조직과 유사한 형태의 피부/피부 유사 조직이 형성됨을 확인하였다.
실시예 3-2: 6주동안 사육된 동물에서 유래된 이식조직의 콜라겐 염색 분석
콜라겐은 피부와 뼈에서 가장 풍부하게 존재하는 유기바탕질(organic matrix) 이며, 피부의 재생에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.
이에 따라, 상기 실시예 3-1에서 적출된 각 조직에서 콜라겐 단백질의 형성 수준을 확인하기 위하여, 상기 조직을 대상으로, Polysciences사의 Masson's Trichrome Stain Kit (Cat. 25088-100)를 이용하여, 콜라겐 염색(Masson's Trichrome Stain)을 수행하였다(도 3). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않는 이식물이 이식된 것을 사용하였다.
도 3은 다양한 성분이 포함된 이식물을 6주동안 이식하여 생체내에서 생성된 피부/피부-유사 조직에 포함된 콜라겐의 형성 수준을 나타내는 현미경사진으로서, A 내지 C는 collagen 만을 포함하는 대조군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: A 500㎛, B 200㎛, C 50㎛), D 내지 F는 collagen 및 그룹 2의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내며(크기바: D 500㎛, E 200㎛, F 50㎛), G 내지 I는 collagen 및 그룹 6의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: G 500㎛, H 200㎛, I 50㎛), J 내지 L은 collagen 및 EGF를 포함하는 비교군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: J 500㎛, K 200㎛, L 50㎛).
도 3에서 보듯이, 대조군의 이식물을 이식한 결과에 비하여, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 이식물을 이식한 경우에는, 피부 재생에 필수적인 콜라겐의 형성수준이 증가됨을 확인하였다.
실시예 3-3: 6주동안 사육된 동물에서 유래된 이식조직의 면역염색 분석
상기 실시예 3-1에서 적출된 각 조직에서 피부 세포 특이적 분화 마커 유전자인 KT2, 10과 염증세포 특이적 분화 마커인 MAPK의 발현수준을 평가하기 위하여, 면역염색 분석을 수행하였다.
대략적으로, 상기 적출된 조직을 4% 파라포름알데히드에 고정하고, 파라핀에 포매한 다음, 1차 항원으로 1:150로 희석한 항-KT2 와 항-MAPK 항체를 사용하여 면역염색한 후, 2차 항원으로 비오틴 라벨을 한 염소 항-래빗 IgG (Vector Labs)로 면역반응을 수행하여, KT2와 MAPK의 수준을 측정하였다(도 4). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않는 이식물이 이식된 것을 사용하였다.
도 4는 다양한 성분이 포함된 이식물을 6주동안 이식하여 생체내에서 생성된 피부/피부-유사 조직에서, 케라틴형성세포 특이적 분화 마커 유전자인 KT2와 염증세포 특이적 마커인 MAPK의 발현수준을 평가한 결과를 나타내는 면역염색 사진으로서, A 및 E는 collagen 만을 포함하는 대조군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고, B 및 F는 collagen 및 그룹 2의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내며, C 및 G는 collagen 및 그룹 6의 펩타이드를 포함하는 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내고, D 및 H는 collagen 및 EGF를 포함하는 비교군의 이식물을 6주동안 이식한 결과를 나타내며, A, B, C 및 D의 화살표는 새롭게 형성된 피부/피부 유사 조직에서 KT2가 발현된 부분을 나타내고, E, F, G 및 H의 화살촉은 새롭게 형성된 피부/피부 유사 조직에서 MAPK가 발현된 부분을 나타낸다. 크기바는 50㎛이다.
도 4에서 보듯이, 대조군의 이식물이 이식된 경우에는 새롭게 형성된 피부/피부 유사 조직에서 KT2가 낮은 수준으로 발현되었지만(A), 그룹 2 또는 6의 펩타이드를 포함하는 이식물이 이식된 경우에는 KT2가 새롭게 형성된 피부/피부 유사 조직에서 상대적으로 매우 낮은 수준으로 발현되었고(B 및 C), EGF를 포함하는 이식물이 이식된 경우에는 KT2가 발현 됨을 확인하였다(D).
또한, 대조군의 이식물(E), 그룹 2의 펩타이드를 포함하는 이식물(F) 또는 그룹 6의 펩타이드를 포함하는 이식물(G)이 이식된 경우에 조직 재생을 방해하는 염증 발현 수준을 확인해 보았을 때, 형성된 조직에서 MAPK가 낮은 수준으로 발현되었으나, 대조군을 포함하는 이식물(E)이 이식된 경우에는 형성된 조직에서 MAPK가 상대적으로 매우 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다.
실시예 3-4: 12주동안 사육된 동물에서 유래된 이식조직의 형태적 분석
이식물이 이식된 마우스를 12주 동안 사육하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1의 방법을 수행하여, 피부/피부-유사 조직의 수준을 평가하였다(도 5).
도 5는 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식한 다음, 이에 의해 생체 내에서 생성된 피부/피부-유사 조직을 나타내는 현미경 사진으로서, A 내지 C는 collagen 만을 포함하는 대조군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: A 500㎛, B 200㎛, C 50㎛)이고; D 내지 F는 collagen 및 그룹 2의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: D 500㎛, E 200㎛, F 50㎛)이며; G 내지 I는 collagen 및 그룹 6의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: G 500㎛, H 200㎛, I 50㎛)이고; J 내지 L은 피부 세포, collagen 및 EGF를 포함하는 비교군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내는 현미경 사진(크기바: J 500㎛, K 200㎛, L 50㎛)이다.
도 5에서 보듯이, 이식후 12주 동안 사육한 경우, 본 발명의 펩타이드를 포함하거나 또는 포함하지 않고 EGF를 포함하는 이식물을 이식한 경우(D 내지 L)에는 이식후 6주 동안 사육한 경우와 유사하게 collagen 입자의 주변에 피부/피부 유사 조직과 케라틴형성이 발생됨을 확인하였으나, 대조군(A)의 이식물을 이식한 경우(A 내지 C)에는 collagen 입자의 주변에 기질에 세포가 함임된 섬유상/섬유상 유사 조직이 형성됨을 확인하였다.
아울러, 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않은 이식물을 이식한 경우(A 내지 C)에 비하여, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 이식물을 이식한 경우(D 내지 I)에는 생체내의 것과 유사성이 높은 케라틴형성세포와 피부/피부 유사 조직이 형성됨을 확인하였다.
실시예 3-5: 12주동안 사육된 동물에서 유래된 이식조직의 콜라겐 염색 분석
상기 실시예 3-4에서 적출된 각 조직에서 콜라겐 단백질의 형성 수준을 확인하기 위하여, 상기 조직을 대상으로, Polysciences사의 Masson's Trichrome Stain Kit (Cat. 25088-100)를 이용하여, 콜라겐 염색(Masson's Trichrome Stain)을 수행하였다(도 6). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않는 이식물이 이식된 것을 사용하였다.
도 6은 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식하여 생체내에서 생성된 피부/피부-유사 조직에 포함된 콜라겐의 형성 수준을 나타내는 현미경사진으로서, A 내지 C는 collagen 만을 포함하는 대조군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: A 500㎛, B 200㎛, C 50㎛), D 내지 F는 collagen 및 그룹 2의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내며(크기바: D 500㎛, E 200㎛, F 50㎛), G 내지 I는 collagen 및 그룹 6의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고(크기바: G 500㎛, H 200㎛, I 50㎛), J 내지 L은 collagen 및 EGF를 포함하는 비교군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타낸다(크기바: J 500㎛, K 200㎛, L 50㎛).
도 6에서 보듯이, 대조군의 이식물을 이식한 결과에 비하여, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주 동안 이식한 경우에는, 6주동안 이식한 경우와 유사하게 콜라겐의 형성수준이 증가됨을 확인하였다.
실시예 3-6: 12주동안 사육된 동물에서 유래된 이식조직의 면역염색 분석
상기 실시예 3-1에서 적출된 각 조직 대신에, 상기 실시예 3-4에서 적출된 각 조직을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-3의 방법에 따라 면역염색 분석을 수행하였다(도 7). 이때, 대조군으로는 본 발명의 펩타이드를 포함하지 않는 이식물이 이식된 것을 사용하였다.
도 7은 다양한 성분이 포함된 이식물을 12주동안 이식하여 생체내에서 생성된 피부/피부-유사 조직에서, 케라틴형성세포 특이적 분화 마커 유전자인 KT2와 염증 마커인 MAPK의 발현수준을 평가한 결과를 나타내는 면역염색 사진으로서, A 및 E는 collagen 만을 포함하는 대조군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고; B 및 F는 collagen 및 그룹 2의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내며; C 및 G는 collagen 및 그룹 6의 펩타이드를 포함하는 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내고; D 및 H는 collagen 및 EGF를 포함하는 비교군의 이식물을 12주동안 이식한 결과를 나타내며; A, B, C 및 D의 화살표는 새롭게 형성된 피부/피부-유사 조직에서 KT2가 발현된 부분을 나타내고; E, F, G 및 H의 화살촉은 새롭게 형성된 조직에서 염증 발현 여부를 나타내는 MAPK가 발현된 부분을 나타낸다. 크기바는 50㎛이다.
도 7에서 보듯이, 6주 동안 이식한 경우와 유사하게 12주 동안 이식한 경우에도, 대조군의 이식물(A)이 이식된 경우에는 새롭게 형성된 피부/피부 유사 조직에서 MAPK가 낮은 수준으로 발현되었지만, 그룹 2 또는 6의 펩타이드를 포함하는 이식물(B 및 C)이 이식된 경우에는 KT2가 새롭게 형성된 조직에서 상대적으로 매우 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다.
또한, 대조군의 이식물(E)이 이식된 경우에는, 형성된 조직에서 MAPK가 높은 수준으로 발현되었으나, 그룹 2의 펩타이드를 포함하는 이식물(F), 그룹 6의 펩타이드를 포함하는 이식물(G) 또는 EGF를 포함하는 이식물(H)이 이식된 경우에는 형성된 조직에서 MAPK가 상대적으로 매우 낮은 수준으로 발현됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 펩타이드는 피부/피부 복합체의 재생을 촉진할 수 있는 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
<110> BIOSTANDARD inc <120> novel peptide <130> 101 <140> 10-2017-0048474 <141> 2017-04-14 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 1 Gly Ala Gln Arg Lys Lys Lys Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 2 Gly Ala Gln Arg Lys Lys Arg Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 3 Gly Ala Gln Arg Lys Lys Lys Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 4 Gly Ala Gln Arg Lys Lys Arg Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 5 Gly Ala Arg Gln Lys Lys Lys Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 6 Gly Ala Arg Gln Lys Lys Arg Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 7 Gly Ala Arg Gln Lys Lys Lys Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 8 Gly Ala Arg Gln Lys Lys Arg Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 9 Gly Ala Lys Gln Lys Lys Lys Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 10 Gly Ala Lys Gln Lys Lys Arg Asn Lys Tyr 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 11 Gly Ala Lys Gln Lys Lys Lys Ser Lys Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 12 Gly Ala Lys Gln Lys Lys Arg Ser Lys Tyr 1 5 10

Claims (9)

  1. 하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는, 피부의 이상개선 및 피부 재생용 펩타이드:

    G-A-R1-R2-K-K-R3-R4-R5-Y (일반식 1)

    상기 일반식 1에서,
    R1은 아르기닌(R), 리신(K) 또는 글루타민(Q)이고;
    R2는 아르기닌(R) 또는 글루타민(Q)이며;
    R3 및 R4 는 각각 아르기닌(R) 또는 리신(K)이고;
    R5는 아스파라긴(N) 또는 세린(S)이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 12 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 것인 펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
  5. 제1항 또는 제2항의 펩타이드를 포함하는 피부의 건조증에 의한 주름, 피부탄력 악화, 피부노화, 자외선에 의한 피부 손상 또는 염증성 피부질환인 것인 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 약학 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항의 펩타이드를 포함하는 피부의 건조증에 의한 주름, 피부탄력 악화, 피부노화, 자외선에 의한 피부 손상 또는 아토피성 피부염 개선을 위한 식품 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 식품 조성물은 음료, 차류, 향신료, 껌류 또는 과자류의 제조에 사용되는 것인 식품 조성물.
  9. 삭제
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