KR102158036B1 - Pseudin-2 펩타이드로부터 유래한 신규 항균 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Pseudin-2 펩타이드로부터 유래한 신규 항균 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서, i) 1번째 및 20번째부터 24번째 아미노산이 결실되거나, ⅱ) 1번째 및 20번째부터 24번째 아미노산이 결실되고, 11번째 또는 18번째 아미노산이 리신(lysine, K)으로 치환되거나, ⅲ) 1번째 및 20번째부터 24번째 아미노산이 결실되고, 11번째 및 18번째 아미노산이 리신으로 치환된 항균 펩타이드에 관한 것이다.

Description

Pseudin-2 펩타이드로부터 유래한 신규 항균 펩타이드 및 이의 용도{Novel antimicrobial peptide derived from Pseudin-2 peptide and uses thereof}
본 발명은 Pseudin-2 펩타이드로부터 유래한 신규 항균 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
세균 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중 하나인데, 불행하게도 항생제의 남용으로 인하여 세균의 항생제 저항성(resistance)이 야기되었다. 실제로, 세균이 새로운 항생제에 저항성을 나타내는 속도는 새로운 항생제의 유사체가 개발되는 속도보다 훨씬 더 빨리 일어난다. 예를 들면, 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 및 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 등의 세균 종들은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 저항력을 키워왔다.
항생제 내성(tolerance)은 항생제에 대한 저항성(resistance)과는 구별되는 현상인데, 1970년대에 뉴모코커스(Pneumococcus sp.)에서 최초로 발견되었으며 페니실린의 작용 기작에 대한 중요한 단서를 제공하였다. 내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재하에서는 성장을 멈추지만 죽지는 않는다. 내성은 항생제가 세포벽 합성 효소를 저해할 때 오토라이신(autolysin) 등과 같은 세균의 자가분해(autolytic) 효소의 활성이 일어나지 않기 때문에 생기는데, 이러한 사실은 페니실린이 내인성 가수분해 효소(endogenous hydrolytic enzyme)를 활성화시킴으로써 세균을 죽이며 세균은 또한 이들의 활성을 억제해서 항생제 치료시에도 생존하는 결과를 나타내게 된다.
세균이 여러 가지 항생제에 대해 내성을 가지는 것은 임상적으로 대단히 중요한데, 이는 내성 세균을 박멸하는 것이 불가능하게 되면 임상적인 감염에서 항생제 치료의 효용이 떨어지기 때문이다. 아울러, 내성이 생기는 것은 항생제에 대한 저항성이 생기게 되는 선행조건이라고 간주되는데 이것은 항생제 치료에도 불구하고 살아남는 균주가 생기기 때문이다. 이러한 균주는 항생제에 저항성을 가지는 새로운 유전 요소를 획득해서 항생제의 존재 하에서도 계속 성장하게 된다. 실제로 모든 저항성을 보이는 세균들은 내성도 가지고 있는 것으로 알려져 있으므로, 이러한 항생제 저항성을 가지는 세균을 죽일 수 있는 신규한 항생제의 개발이 필요하다.
작용 기작의 측면에서 항생제 내성은 크게 두가지 경로로 이루어지는데, 첫 번째는 모든 세균에 있어서 성장속도가 감소할 때 일어나는 외형적(phenotypic) 내성이며, 두 번째는 특정 세균에서 일어나는 돌연변이에 의한 유전적인 내성이다. 두 가지 경우 모두 기본적인 현상은 오토라이신 활성의 하부조절(down regulation)이 일어난다는 것인데, 이러한 하부조절은 외부자극에 대한 외형적인 내성일 경우에는 일시적이며, 세포 용혈을 조절하는 경로의 변화를 야기하는 돌연변이가 일어난 유전적인 내성의 경우에는 영구적이다. 가장 간단한 유전적인 내성의 경우는 오토라이신 효소에 결손이 일어나는 것인데, 확실하지 않은 여러 가지 이유로 인해서 이러한 자살 효소의 결손에 의해 내성을 가지는 균주가 임상적으로 발견된 적은 없으며, 오히려 임상적인 내성은 오토라이신의 활성을 조절함으로써 이루어진다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 항생제에 저항성을 나타내는 세균들과 싸우기 위해서는 새로운 항생제의 개발이 필요하며, 아울러 오토라이신 활성과는 독립적으로 작용하는 새로운 항생제의 개발이 필요하다.
한편, 세균은 펩타이드나 작은 유기물 분자들을 합성해서 이웃하는 세균을 죽일 수 있는데, 이러한 박테리오신(bacteriocin)들은 구조적으로 세 부류로 분류된다. 첫 번째는 란티바이오틱스(lantibiotics)이며, 두 번째는 비란티바이오틱스(nonlantibiotics)이고, 세 번째는 신호 펩타이드(signal peptide)에 의해 분비되는 것들이다. 곤충을 포함하는 동물들 역시 자연적으로 생성되는 펩타이드 항생제를 생산하는데, 상기 펩타이드 항생제는 구조적으로 세 개의 그룹으로 나누어진다. 첫 번째는 시스테인이 풍부한(cysteine-rich) β-쉬트(sheet) 펩타이드이고, 두 번째는 α-나선형(helical)의 양친화성 분자이며, 세 번째는 프롤린이 풍부한(proline-rich) 펩타이드이다. 이들 항균 펩타이드들은 숙주방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있는데, 이러한 항균 펩타이드들은 아미노산 서열에 따라 다양한 구조를 가진다.
한편, 한국공개특허 제2010-0042768호에는 슈딘-2 또는 이의 유사체를 지속제어방출할 수 있는 '생분해성 고분자 미립구 및 그 제조방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1038542호에는 '라이신과 프롤린 잔기 치환으로 박테리아 선택성을 높인 새로운 수딘 유도체 항생 펩타이드 및 그 용도'가 개시되어 있으나, 서열번호 12 내지 15의 아미노산 서열로 이루어진 본 발명의 Pseudin-2 펩타이드로부터 유래한 신규 항균 펩타이드 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 기존에 보고된 항균 펩타이드로부터 항균활성이 증진된 신규한 합성 펩타이드를 제조하기 위하여 양친화성을 갖는 Pseudin-2 항균 펩타이드를 주형으로 하여, 14종의 Pseudin-2 유사체(서열번호 2 내지 서열번호 15) 펩타이드를 합성하였고, 상기 합성된 펩타이드 유사체 중, Pse-T1, Pse-T2, Pse-T3 및 Pse-T4 펩타이드(서열번호 12 내지 서열번호 15)가 모체 펩타이드인 Pseudin-2에 비해 그람 양성균, 그람 음성균, 효모균 및 항생제 내성균에 대한 항균 활성이 우수하며, 쥐 적혈구 및 인간 정상 세포주에 대하여 낮은 세포독성을 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서, i) 1번째 및 20번째부터 24번째 아미노산이 결실되거나, ⅱ) 1번째 및 20번째부터 24번째 아미노산이 결실되고, 11번째 또는 18번째 아미노산이 리신(lysine, K)으로 치환되거나, ⅲ) 1번째 및 20번째부터 24번째 아미노산이 결실되고, 11번째 및 18번째 아미노산이 리신으로 치환된 항균 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 식품 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 사료 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 생물 농약을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 의약외품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 항균 펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체 내 항균 방법을 제공한다.
본 발명의 Pseudin-2 유사체 항균 펩타이드들 중 아미노산 결실 및/또는 치환된 펩타이드(Pse-T1, Pse-T2, Pse-T3 및 Pse-T4)는 우수한 항균 활성와 동시에 낮은 세포 독성을 가지고 있으므로, 항생제, 화장료 조성물, 식품 첨가제, 사료 첨가제, 생물 농약 및 의약외품 등의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 항균 펩타이드인 Pseudin-2(대조군) 및 C-말단이 결여되고 일부 아미노산 잔기가 치환된 Pseudin-2 유사체 신규 펩타이드들인 Pse-T1, Pse-T2, Pse-T3 및 Pse-T4(실험군)의 막 유사환경에서 2차 구조를 확인한 결과로, 왼쪽 도면은 수용액 상태(10 mM PBS 용액), 가운데 도면은 PE/PG(7/3)로 구성된 박테리아 막 모방 인공막 및 오른쪽 도면은 PC/CH/SM(1/1/1)로 구성된 진핵세포 막 모방 인공막을 의미한다.
도 2는 대조군인 Pseudin-2 펩타이드 및 신규 펩타이드 Pse-T1, Pse-T2, Pse-T3 및 Pse-T4의 대장균(Escherichia coli) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 막에 대한 작용 여부를 유세포분석기(FACS)로 확인한 결과이다.
도 3은 대조군인 Pseudin-2 펩타이드 및 신규 펩타이드 Pse-T1, Pse-T2, Pse-T3 및 Pse-T4의 박테리아 내부 물질인 DNA에 대한 결합능을 확인한 결과로, 펩타이드:DNA 비율은 각각 DNA 단독(0), 0.25:1, 0.5:1, 1:1, 1.5:1, 2:1, 3:1, 4:1 이다.
도 4는 대조군인 Pseudin-2 펩타이드 및 신규 펩타이드 Pse-T1, Pse-T2, Pse-T3 및 Pse-T4의 대장균(A) 및 스타필로코커스 아우레우스(B) 막에 대한 작용을 주사전자현미경(SEM)으로 확인한 결과이다.
도 5는 다재 내성 균주인 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 4891에 감염된 상처에 대한 Pse-T2 펩타이드의 치유 효과를 확인한 결과이다. Cip: 시프로플록사신(ciprofloxacin).
도 6은 다재 내성 균주인 슈도모나스 에루지노사 4891에 감염된 상처의 크기의 변화를 확인한 결과이다.
도 7은 다재 내성 균주인 슈도모나스 에루지노사 4891에 감염된 상처부분을 회수하여 회복되는 총 균수(CFU/g)를 확인한 결과이다.
도 8은 다재 내성 균주인 슈도모나스 에루지노사 4891에 감염된 상처 조직에서 염증반응에 관련된 유전자의 상대적인 발현율을 확인한 결과이다. IL-1β: 인터루킨-1 베타, IL-6: 인터루킨-6, TNF-α: 종양괴사인자-알파.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서, i) 1번째 및 20번째부터 24번째 아미노산이 결실되거나, ⅱ) 1번째 및 20번째부터 24번째 아미노산이 결실되고, 11번째 또는 18번째 아미노산이 리신(lysine, K)으로 치환되거나, ⅲ) 1번째 및 20번째부터 24번째 아미노산이 결실되고, 11번째 및 18번째 아미노산이 리신으로 치환된 항균 펩타이드를 제공한다.
기존의 알려진 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 모체 펩타이드인 Pseudin-2는 패러독스 개구리(frog Pseudis paradoxa)에서 분리된 항균 펩타이드로, 항균 펩타이드로 알려져 있다. 상기 Pseudin-2 펩타이드는 당업계에 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법에 의해 제조가 가능하며, 제조 방법에 특별히 한정되지 않는다. 상기 합성을 위한 방법으로 당업계의 통상적인 펩타이드의 화학적 합성 방법으로 합성하는 것이 바람직하며, 구체적으로는 액상 펩타이드 합성법(solution-phase peptide synthesis), 고상 펩타이드 합성법(solid-phase peptide synthesis), 단편 응축법 및 F-moc 또는 T-BOC 화학법으로 합성하는 것이 보다 바람직하고, 더욱 구체적으로는 액상 펩타이드 합성법(Merrifield, RB., J.Am. Chem. Soc., 85, 2149, 196)으로 합성하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항균 펩타이드는 상기 i), ⅱ) 또는 ⅲ) 조건을 만족해야 하는데, 구체적으로 i) 조건은 서열번호 1의 모체 펩타이드에서 1번째 및 20번째부터 24번째 아미노산이 모두 결실되어야 하는 것이며, ⅱ) 조건은 서열번호 1의 모체 펩타이드에서 1번째 및 20번째부터 24번째 아미노산이 모두 결실되고, 11번째 아미노산인 글리신(Glycine, G) 또는 18번째 아미노산인 루신(Leucine, L)이 양전하를 갖는 염기성의 아미노산인 리신(lysine, K)으로 치환되어야 하는 것이며, ⅲ) 조건은 서열번호 1의 모체 펩타이드에서 1번째 및 20번째부터 24번째 아미노산이 모두 결실되고, 11번째 아미노산인 글리신(G) 및 18번째 아미노산인 루신(L)이 리신(K)으로 치환되어야 하는 것이다.
본 발명의 항균 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 12 내지 15의 아미노산 서열을 가질 수 있는데, 서열번호 12의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 모체 펩타이드인 Pseudin-2로부터 1번째 및 20번째부터 24번째 아미노산이 모두 결실된 펩타이드로 Pse-T1으로 명명하였고, 서열번호 13의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 모체 펩타이드인 Pseudin-2로부터 1번째 및 20번째부터 24번째 아미노산이 모두 결실되고, 11번째 아미노산인 글리신이 리신으로 치환된 펩타이드로 Pse-T2로 명명하였고, 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 모체 펩타이드인 Pseudin-2로부터 1번째 및 20번째부터 24번째 아미노산이 모두 결실되고, 18번째 아미노산인 루신이 리신으로 치환된 펩타이드로 Pse-T3으로 명명하였고, 서열번호 15의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 모체 펩타이드인 Pseudin-2로부터 1번째 및 20번째부터 24번째 아미노산이 모두 결실되고, 11번째 아미노산인 글리신 및 18번째 아미노산인 루신이 리신으로 치환된 펩타이드로 Pse-T4로 명명하였다. 상기 치환은 전극의 증/감을 이용하여 세포독성을 낮추며, 그람 양성균, 그람 음성균, 효모균 및 항생제 내성균에 대하여 항균활성을 증가 또는 유지하기 위해 수행될 수 있다.
본 발명의 상기 항균 펩타이드는 그람 음성균, 그람 양성균, 효모균 또는 항생제 내성균에 대해 항균 활성을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 그람 음성균은 슈도모나스 속(Pseudomonas), 대장균 속(Escherichia), 살모넬라 속(Salmonella), 렙토스피라 속(Leptospira) 및 리케치아 속(Rickettsia)을 포함하는 그람 음성균으로 당업계에 공지된 모든 그람 음성균인 것이 바람직하며, 구체적으로 슈도모나스 속(Pseudomonas), 살모넬라 속(Salmonella) 또는 대장균 속(Escherichia)인 것이 보다 바람직하고, 더욱 구체적으로 대장균(Escherichia coli), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 그람 양성균은 스타필로코커스 속(Staphylococcus), 리스테리아 속(Listeria), 코리네박테리움 속(Corynebacterium), 락토바실러스 속(Lactobacillus) 및 바실러스 속(Bacillus)을 포함하는 그람 양성균으로 당업계에 공지된 모든 그람 양성균인 것이 바람직하며, 구체적으로 스타필로코커스 속(Staphylococcus), 바실러스 속(Bacillus) 또는 리스테리아 속(Listeria)인 것이 보다 바람직하고, 더욱 구체적으로 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes)인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 효모균은 구체적으로 캔디다 속(Candida) 또는 트리코스포론 속(Trichosporon)인 것이 바람직하고, 더욱 구체적으로는 캔디다 알비칸스(Candida albicans) 또는 트리코스포론 베이젤리(Trichosporon beigelii)인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 항생제 내성균은 항생제 내성을 갖는 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 대장균(Escherichia coli) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 항생제는 이에 제한되지는 않으나, 아미노글리코사이드 계열(아미노글리코사이드, 겐타마이신, 네오마이신 등), 페니실린 계열(앰피실린 등), 술폰아미드 계열, 베타-락탐 계열(베타-락탐, 아목시실린/클라불란산 등), 클로람페니콜 계열, 에리트로마이신 계열, 플로르페니콜 계열, 포스포마이신 계열, 카나마이신 계열, 린코마이신 계열, 메티실린 계열, 퀴놀론 계열, 스트렙토마이신 계열, 테트라사이클린 계열, 트리메소프림 계열 및 반코마이신 계열의 항생제를 포함한다.
본 발명의 상기 항균 펩타이드는 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 가진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제를 제공한다. 상기 항균 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 12 내지 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로 전술한 바와 같다.
본 발명의 Pseudin-2 항균 펩타이드로부터 유래된 유사체 항균 펩타이드인 Pse-T1(서열번호 12), Pse-T2(서열번호 13), Pse-T3(서열번호 14) 및 Pse-T4(서열번호 15) 펩타이드는 그람 양성균, 그람 음성균, 효모균 및 항생제 내성균에 대해 강한 항균 활성을 나타내면서, 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내므로, 본 발명의 항균 펩타이드는 항균용 항생제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 임상투여시 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여는 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강(nasal), 흡입, 안구 및 피하와 같은 경구 이외의 투여경로를 통한 투여를 의미할 수 있다. 본 발명의 항균 펩타이드를 의약품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
즉, 본 발명의 항균 펩타이드는 실제의 비경구의 여러가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 항균 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트화제(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
본 발명의 항균 펩타이드의 유효용량은 0.1 내지 2 mg/kg이고, 바람직하게는 0.5 내지는 1 mg/kg이며, 하루 1 회 내지 3 회 투여될 수 있다.
본 발명의 항생제에서 본 발명의 신규한 펩타이드의 총 유효량은 볼루스(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 주입(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 신규한 펩타이드의 항생제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 항균 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 12 내지 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로 전술한 바와 같다. 상기 펩타이드는 강한 항균 활성을 나타내면서, 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내므로, 본 발명의 항균 펩타이드는 화장료 조성물될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 항균 펩타이드 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들이 포함되며, 예켠대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 통상적으로 함유되는 화장료 조성물에 본 발명의 펩타이드는 0.1 내지 50 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수(스킨), 영양 화장수(밀크로션), 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸타, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸타 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 식품 첨가제를 제공한다.
상기 항균 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 12 내지 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로, 상기 펩타이드는 강한 항균 활성을 나타내면서, 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내므로, 본 발명의 항균 펩타이드는 식품 첨가제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드를 식품 첨가물로 사용하는 경우, 상기 펩타이드를 그대로 첨가하거나 다른 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적절하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 펩타이드는 원료에 대하여 15 중량부이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안정성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
본 발명은 또한, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 사료 첨가제를 제공한다.
상기 항균 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 12 내지 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로 전술한 바와 같다. 상기 펩타이드는 강한 항균 활성을 나타내면서, 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내므로, 본 발명의 항생 펩타이드는 사료 첨가제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 사료 조성물은 기존의 항생제를 대체하고 유해한 식품 병원성균의 생장을 억제하여 동물체의 건강상태를 양호하게 하고, 가축의 증체량과 육질을 개선시키며, 산유량 및 면역력을 증가시키는 효과가 있다. 본 발명의 사료 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛 형태 및 사일레지 등의 형태로 제조될 수 있다.
상기 발효사료는 본 발명의 펩타이드 이외의 여러 가지 미생물군 또는 효소들을 첨가함으로서 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며, 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 펩타이드를 혼합하여 제조할 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 배합사료 등을 펠렛기에서 열과 압력을 가하여 제조할 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 미생물로 발효시킴으로써 제조할 수 있다. 습식발효사료는 음식물 쓰레기 등과 같은 유기물을 수집 및 운반하여 살균과정과 수분조절을 위한 부형제를 일정비율로 혼합한 후, 발효에 적당한 온도에서 24시간 이상 발효하여, 수분함량이 약 70%로 포함되도록 조절하여 제조할 수 있다. 발효건조사료는 습식발효사료를 건조과정을 추가로 거쳐 수분함량이 30% 내지 40% 정도 함유되도록 조절하여 제조할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 방부 조성물, 항균용 생물 농약, 및 항균용 의약외품 조성물을 제공한다.
상기 항균 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 12 내지 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로서 전술한 바와 같다. 상기 펩타이드는 그람 음성균, 그람 양성균, 효모균 및 항생제 내성균에 대해 강한 항균 활성을 나타내면서, 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내므로, 본 발명의 항균 펩타이드는 항균용 생물 농약, 방부 조성물 및 의약외품 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
상기 방부 조성물에는 화장품 보존제 또는 의약품 보존제 등이 있다. 상기 식품의 방부제, 화장품 보존제 및 의약품 보존제는 의약품의 변질, 부패, 변색 및 화학변화를 방지하기 위해 사용되는 첨가물로서 살균제, 산화방지제가 이에 포함되며 세균, 곰팡이, 효모 등 미생물의 증식을 억제하여 식품 및 의약품에서 부패미생물의 발육저지 또는 살균작용을 하는 등의 기능성 항생제도 포함된다. 이러한 방부 조성물의 이상적인 조건으로는 독성이 없어야 하며, 미량으로도 효과가 있어야 한다.
본 발명의 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 펩타이드를 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제, 패치, 또는 필터 충진제일 수 있다.
본 발명은 또한, 약학적으로 유효한 양의 상기 항균 펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체 내 항균 방법을 제공한다. 상기 개체는 인간을 제외한 포유류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 펩타이드의 합성 및 분리정제
본 발명자들은 메리필드(Merrifield)의 액상 펩타이드 합성법(Merrifield, RB., J.Am. Chem. Soc., 85, 2149, 196)에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재된 모체 펩타이드인 Pseudin-2의 아미노산 서열에서 11번째와 18번째의 아미노산 잔기를 단독 또는 2개 모두 리신(lysine, K)으로, 1번째, 9번째, 20번째, 22번째 아미노산 잔기를 단독 또는 2개, 3개 또는 4개 모두 트립토판(tryptophan, W)으로, 9번째와 15번째 아미노산 잔기를 단독 또는 2개 모두 세린(serine, S)으로, 1번째와 20번째 아미노산 잔기는 알라닌(alanine, A)으로, 9번째 아미노산 잔기는 세린(S)으로 치환하여 신규한 항균 펩타이드를 합성하였다. 또한 아미노산 잔기가 결여된 신규 펩타이드 합성은 Pseudin-2, Pse-11G-K, Pse-18L-K, Pse-11G/18L-K의 서열에서 1번째와 20 내지 24번째 아미노산을 결실시켜 펩타이드를 합성하였다(표 1).
구체적으로, 본 발명에서 설계한 펩타이드의 카르복실 말단이 NH2 형태인 펩타이드는 링크 아미드 MBHA-레진(Rink Amide MBHA-Resin)을 출발물질로 사용하였으며, 카르복실 말단이 OH 형태의 펩타이드는 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-아미노산-Wang Resin을 출발물질로 사용하였다.
Fmoc-아미노산의 커플링(coupling)에 의한 펩타이드 사슬(chain)의 연장은 DCC(N-hydroxybenzo trizole(HOBt)-dicyclo-hexycarbodiimide)법에 의해 실시하였다. 각 펩타이드의 아미노 말단의 Fmoc-아미노산을 커플링시킨 후, NMP(20% piperidine/N-methyl pyrolidone) 용액으로 Fmoc기를 제거하고, NMP 및 DCM(dichoromethane)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 건조시켰다. 여기에 TFA(trifluoroacetic acid), 페놀(phenol), 씨오아니졸(thioanisole), H2O 및 트리이소프로필실레인(triisopropylsilane)을 각각 85:5:5:2.5:2.5(v/v)의 비율로 혼합한 용액을 가하고 2~3시간 동안 반응시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 후, 디에틸에테르(diethylether)로 펩타이드를 침전하여 이를 수득하였다. 상기 수득한 크루드(crude) 펩타이드는 0.05% TFA가 포함된 아세토니트릴 농도구배(acetonitrile gradient)에서 정제형 역상(reverse phase, RP)-HPLC 컬럼(Delta Pak, C18300Å,15,19.0mm×30 cm, Waters, USA)을 이용하여 정제하였다. 합성 펩타이드를 6N 염산으로 110℃에서 가수분해한 후 잔사를 감압 농축하고, 0.02N 염산에 녹여서 아미노산 분석기(Hitachi 8500 A)로 아미노산 조성을 측정한 후, 펩타이드의 순도 및 분자량을 확인하기 위하여 MALDI 질량 분석법(Hill, et al., Rapid Commun. Mass Spectrometry, 5: 395, 1991)을 수행하였다.
그 결과, 하기 표 1에서 나타난 바와 같이, 서열번호 1 내지 서열번호 15의 아미노산 서열로 기재되는 펩타이드를 95% 이상의 순도로 합성하였고, 이의 분자량은 예상한 분자량과 동일한 분자량을 나타내는 것을 확인하였다.
Figure 112019030216589-pat00001
실시예 2. 항균 활성 측정
본 발명자들은 상기 실시예 1의 방법으로 제조된 펩타이드들의 항균 활성을 비교하기 위하여, 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소 농도인 생육 최소저해농도(Minimal Inhibitory Concentration, MIC) 값을 측정하였다.
구체적으로, 하기 표 2에 기재된 균주를 구입하여, 각 균주에 적합한 조성의 배지에서 중간-로그 상(mid-log phase)까지 배양한 다음, 2×104 세포/100 ㎕의 농도로 희석하여 마이크로 적정 플레이트(Nunc, USA)에 준비하였다. 그런 다음, 상기 실시예 1에서 합성한 Pse-11G-K, Pse-18L-K, Pse-11G/18L-K, Pse-Anal1, Pse-Anal2, Pse-Anal3, Pse-Anal4, Pse-Anal5, Pse-Anal6, Pse-Anal7, Pse-T1, Pse-T2, Pse-T3 또는 Pse-T4 펩타이드를 각 웰에 1/2배씩 계열 희석(serial dilution)하여 첨가한 후 37℃에서 18시간 동안 배양하였고, 마이크로 적정 플레이트 판독기(Merck Elisa reader, 독일)를 이용하여 600nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 각 균주에 대한 MIC 값을 결정하였다. 모체 펩타이드인 Pseudin-2를 대조군으로 사용하였다.
Figure 112019030216589-pat00002
그 결과, 하기 표 3에서 나타난 바와 같이 Pse-11G-K, Pse-18L-K, Pse-11G/18L-K, Pse-Anal1, Pse-Anal2, Pse-Anal3, Pse-Anal4, Pse-Anal5, Pse-Anal6, Pse-Anal7, Pse-T1, Pse-T2, Pse-T3 또는 Pse-T4 펩타이드는 대조군인 모체 펩타이드 Pseudin-2에 비해 그람 양성균, 그람음성균 및 효모균에 대해 유사하거나 우수한 항균활성을 나타내는 것을 확인하였다. 특히, Pse-T1, Pse-T2, Pse-T3 또는 Pse-T4 펩타이드는 효모균에 대해서 모체 펩타이드 및 다른 신규 펩타이드들에 비해 현저히 우수한 항균활성을 보여주었다.
Figure 112019030216589-pat00003
실시예 3. 용혈 활성 측정
상기 실시예 1의 방법으로 제조된 펩타이드들의 세포독성을 비교하기 위하여, 합성한 펩타이드들의 적혈구 용혈 활성을 측정하였다.
구체적으로, 쥐(Balb/c, 6주령, 암컷) 적혈구를 8%의 농도가 되도록 PBS(pH 7.0)로 희석하고, Pseudin-2, Pse-11G-K, Pse-18L-K, Pse-11G/18L-K, Pse-Anal1, Pse-Anal2, Pse-Anal3, Pse-Anal4, Pse-Anal5, Pse-Anal6, Pse-Anal7, Pse-T1, Pse-T2, Pse-T3 또는 Pse-T4 펩타이드를 각각 6.25, 12.5, 25.0, 50.0, 및 100.0 μM/웰의 농도로 처리하여, 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 그런 다음, 1,000 x g로 원심 분리하여 수득한 상등액 속에 포함된 헤모글로빈 량을 414 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여 확인하였다. 세포 파괴 정도의 기준이 되는 대조군으로, 1% 트리톤 X-100(sigma, USA)을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 반응한 후 수득한 상등액의 흡광도를 측정하였고, 상기 흡광도 값을 적혈구 용혈활성 100%로 하여, 하기 수학식 1을 사용하여 각 펩타이드의 용혈활성(hemolysis)을 계산하였다.
[수학식 1]
적혈구 파괴능(%) = (흡광도 A-흡광도 B)/(흡광도 C-흡광도 B) × 100
(상기 식에 있어서, 흡광도 A는 414㎚ 파장에서 측정한 각 펩타이드를 처리한 반응 용액의 흡광도를 나타내며; 흡광도 B는 414㎚ 파장에서 측정한 PBS를 처리한 반응 용액의 흡광도를 나타내며; 흡광도 C는 414㎚ 파장에서 측정한 1% 트리톤 X-100를 처리한 반응 용액의 흡광도를 나타낸다.)
그 결과, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이 모체 펩타이드인 Pseudin-2 펩타이드는 100μM 농도를 처리하였을 때 쥐 적혈구에 대하여 10%의 용혈작용만 나타나는 것을 확인한 것에 비해, Pse-11G-K, Pse-Anal1, Pse-Anal2, Pse-Anal3 및 Pse-Anal4, 펩타이드는 100 μM 농도에서도 적혈구에 대한 100% 용혈작용이 유발되는 것으로 확인하여 독성이 증가됨을 확인하였다. 그러나, 아미노산이 결실된 펩타이드인 Pse-T1, Pse-T2, Pse-T3 및 Pse-T4는 모체 펩타이드와 비슷하거나 낮은 용혈작용이 나타나는 것을 확인하여, 본 발명의 항균 펩타이드가 모체 펩타이드에 비해 항균활성이 증가되고, 세포독성은 비슷하거나 감소한 것을 확인하였다.
Figure 112019030216589-pat00004
실시예 4. 정상 세포주에서 세포독성 확인
상기 실시예 1의 방법으로 제조된 펩타이드들의 정상 세포주에서의 세포독성을 확인하기 위해, 사람의 각질 형성 세포주(HaCaT cell line, Dr. NE. Fusenig, Heidelberg, Germany)을 이용하여 독성을 측정하였다.
구체적으로, 10% FBS(Fetal Bovine Serum)가 함유된 DMEM 배지에서 배양된 HaCaT 세포를 2×105 세포/웰로 마이크로 적정 플레이트에 분주하고 24시간 배양한 후, Pseudin-2, Pse-11G-K, Pse-18L-K, Pse-11G/18L-K, Pse-Anal1, Pse-Anal2, Pse-Anal3, Pse-Anal4, Pse-Anal5, Pse-Anal6, Pse-Anal7, Pse-T1, Pse-T2, Pse-T3 또는 Pse-T4 펩타이드를 각각 6.25, 12.5, 25.0, 50.0 또는 100.0 μM/웰의 농도로 처리하여, 24시간 동안 5% CO2 인큐베이터에서 반응시켰다. 24시간 후, 인산 완충액 생리식염수(phosphate buffered saline; PBS)에 0.5 mg/㎖ MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide)를 녹인 반응 용액 100 ㎕를 각 웰에 넣고 4시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 상층액을 제거하고, 200 ㎕의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 넣어 형성된 MTT 크리스탈을 녹인 후, 560 nm에서 파장을 확인하여 세포 생존능을 확인하였다.
그 결과, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이 100 μM의 모체 Pseudin-2 펩타이드를 처리했을 때, HaCaT 세포는 82.1%의 세포 생존력을 나타내어 낮은 세포독성을 나타내는 것을 확인하였다. 이에 반해, Pse-11G-K, Pse-Anal1, Pse-Anal2, Pse-Anal3 및 Pse-Anal4는 펩타이드는 100 μM 농도에서도 세포 생존력이 각각 36.4%, 1.8%, 5.1%, 10.8% 및 10.1%의 매우 높은 세포 독성을 나타내는 것을 확인하였다. 그러나, 아미노산이 결실된 펩타이드인 Pse-T1, Pse-T2, Pse-T3 및 Pse-T4는 모체 펩타이드와 비슷하거나 낮은 세포독성이 나타나는 것을 확인하여, 본 발명의 항균 펩타이드가 모체 펩타이드에 비해 항균활성이 증가되고, 세포독성은 비슷하거나 감소한 것을 확인하였다.
Figure 112019030216589-pat00005
실시예 5. 원이색법 스펙트럼 측정
상기 실시예 1의 방법으로 제조된 펩타이드를 이용하여 2차 구조인 α-나선형 구조를 유도하는지 확인하고자 원이색법(circular dichroism) 방법을 이용하여 측정하였다.
구체적으로, 10mM PBS(pH 7.4), PE/PG (L-α-Phosphatidylethanolamine/L-α-Phosphatidyl-DL-glycerol; 7/3, w/w) 또는 PC/CH/SM (L-α-phosphatidylcholine/cholesterol/sphingomyelin; 1/1/1, w/w/w)로 구성된 1 mM의 큰 단일 라멜라 소포(Large unilamellar vesicles, LUV)의 현탁액에 Pseudin-2, Pse-11G-K, Pse-18L-K, Pse-11G/18L-K, Pse-Anal1, Pse-Anal2, Pse-Anal3, Pse-Anal4, Pse-Anal5, Pse-Anal6, Pse-Anal7, Pse-T1, Pse-T2, Pse-T3 또는 Pse-T4 펩타이드를 40 μM로 0.1 cm 길이(path-length)의 셀에 가한 후, jasco 810 분광광도계(spectrophotometer)에 온도를 25℃로 고정하여 원이색법 스펙트럼을 측정하였다. 상기 원이색법 스펙트럼을 위한 α-나선형 구조 계산식은 하기 수학식 2를 사용하였다.
[수학식 2]
Figure 112019030216589-pat00006
그 결과, 10 mM PBS 용액에 펩타이드를 첨가하였을 때에는 구조를 형성하지 않은 반면, PE/PG(7/3) 또는 PC/CH/SM(1/1/1)로 구성된 LUV 용액에 펩타이드를 첨가하였을 때에는 정도의 차이를 보이지만 모든 펩타이드에서 2차 구조인 α-나선형 구조를 형성하는 것을 확인하였다. 이의 결과를 통해, 본 발명의 항균 펩타이드는 미생물인 박테리아 막과 유사한 PE/PG(7/3)와 진핵세포의 막과 유사한 PC/CH/SM(1/1/1)용액 상에서 α-나선형 구조를 형성하는 것을 확인하였다(도 1).
실시예 6. 유세포분석기(Flow cytometry) 측정
상기 실시예 1의 방법으로 제조된 펩타이드가 박테리아 막에 작용하는지 여부를 확인하기 위하여, 모체 펩타이드보다 항균활성이 우수하고, 고농도에서도 세포 독성을 나타내지 않는 것으로 확인된 Pse-T1, Pse-T2, Pse-T3 및 Pse-T4 펩타이드를 유세포분석기(Flow cytometry)를 이용하여 분석하였다.
구체적으로, 모체 Pseudin-2 펩타이드 또는 Pse-T1, Pse-T2, Pse-T3 및 Pse-T4 펩타이드의 최소저해농도(MIC) 값을 대장균과 스타필로코커스 아우레우스에 처리한 후 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 그 후, 원심분리기(10,000rpm)를 이용해 상층액을 제거한 다음 10 ㎍/㎖ 농도의 프로피디움 요오드화물(Propidium iodide, PI)로 4℃에서 30분간 염색하였다. 그런 다음, 결합하지 않은 프로피디움 요오드화물을 원심분리기를 이용해 제거하고 생리식염수(PBS) 1 ㎖를 첨가하여 세포의 뭉침 현상을 제거한 후, Bechman 유세포분석기를 이용하여 박테리아 막에 대한 펩타이드의 영향을 확인하였다.
그 결과, 대장균과 스타필로코커스 아우레우스 세포에서 Pseudin-2 보다 Pse-T1, Pse-T2, Pse-T3 및 Pse-T4 펩타이드가 막 파괴능이 뛰어남을 확인하였다. 또한, 상기 펩타이드들 중 Pse-T2는 대장균(92%) 및 스타필로코커스 아우레우스(96%)에 대해서 세포막 파괴능이 가장 높았다. 이의 결과를 통해, 본 발명의 신규 펩타이드는 대조군인 모체 펩타이드에 비해 박테리아 막을 손상시키는 능력이 증가했음을 알 수 있었다.
실시예 7. 항균 펩타이드와 DNA의 결합 유무 분석
본 발명의 합성 펩타이드가 항균활성을 나타내는 기작이 무엇인지 구체적으로 확인하기 위하여, Pseudin-2, Pse-T1, Pse-T2, Pse-T3 및 Pse-T4 합성 펩타이드가 박테리아 내부 물질인 DNA와 결합하는지 여부를 전기영동을 통해 확인하였다.
구체적으로, 300 ng의 플라스미드 DNA(pRSETB)를 펩타이드와 비율별(펩타이드/DNA 비율은 각각 DNA 단독, 0.25:1, 0.5:1, 1:1, 1.5:1, 2:1, 3:1, 4:1로 실시)로 37℃에서 10분 동안 반응시킨 후, 1% 아가로스 겔에 전기영동을 수행하여 브로민화 에티듐(Ethidium bromide, EtBr)으로 염색하고 UV로 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 Pseudin-2 펩타이드는 DNA와 어떠한 결합도 하지 않았으며 Pse-T1, Pse-T2, Pse-T3 및 Pse-T4는 정도의 차이는 있지만 모두 DNA와 결합하는 결과를 보여주었다(도 3). 상기 결과를 통해, Pse-T1, Pse-T2, Pse-T3 및 Pse-T4 펩타이드가 일부 아미노산 잔기의 결실 또는 치환으로 인해, 박테리아 막에 작용하여 항균활성을 나타내는 모체 펩타이드인 Pseudin-2와는 달리, 박테리아 내부 물질인 DNA와 결합하여 항균활성을 나타내는 것임을 확인할 수 있었다.
실시예 8. 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM) 분석
본 발명의 합성 펩타이드가 세균의 세포막에 손상을 주는지 확인하기 위해서 주사전자현미경을 통해 확인하였다.
구체적으로, 대장균과 스타필로코커스 아우레우스 세포를 OD600에서 0.2의 농도로 PBS에 현탁시킨 후, 모체 Pseudin-2 펩타이드 또는 Pse-T1, Pse-T2, Pse-T3 및 Pse-T4 펩타이드를 최소저해농도(MIC)로 처리하고 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 대조군은 펩타이드가 없는 균주를 사용하였다. 배양 후, 세포를 회수하고, 2.5% 글루타르알데하이드로 4℃에서 18시간 처리한 후 PBS 완충용액으로 2회 세척하였다. 고정된 세포를 100% 에탄올 및 희석된 에탄올(50%, 70%, 90% 및 100%)을 이용하여 순차적으로 10분 동안 탈수시킨 후 표본을 건조시키고 백금으로 코팅한 후 저진공 주사형 전자현미경을 사용하여 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 처리되지 않은 대조군 세포는 밝고 매끄러운 표면을 가지는 반면, 펩타이드를 처리한 세포는 상당한 막 손상이 일어났음을 확인하였다. Pse-T2 또는 Pse-T3 펩타이드를 처리한 대장균의 표면은 Pseudin-2를 처리한 세포보다 더 거칠고 더 많은 소포를 확인할 수 있었다. 펩타이드에 노출된 세포 표면은 구멍이 생기면서 물집모양의 손상을 입은 모양이 관찰되었고, 일부 경우에는 세포질 내 내용물의 누출이 관찰되었다. 스타필로코커스 아우레우스 세포에서도 대장균과 유사하게 Pseudin-2, Pse-T1 및 Pse-T4 보다 Pse-T2 또는 Pse-T3를 처리했을 때 세포막의 손상 및 파괴가 심하게 일어남을 확인할 수 있었다.
실시예 9. 항생물막 활성 측정
본 발명자들은 상기 실시예 1의 방법으로 제조된 펩타이드들 중 항균활성이 가장 우수한 펩타이드인 Pse-T2의 생물막 억제 농도값을 측정하였다.
구체적으로, 상기 표 2에 기재된 균주 중 스타필로코커스 아우레우스, 대장균, 슈도모나스 에루지노사 균을 각 배지에서 중간-로그 상(mid-log phase)까지 배양한 다음, 5×104 세포/100 ㎕의 균체 농도로 희석하여 마이크로 플레이트(SPL)에 접종하였다. 그런 다음, Pse-T2 펩타이드를 각 웰에 1/10배씩 10 mM PBS 용액(pH 7.2)으로 희석하여 10 ㎕ 첨가한 후 37℃에서 24시간 배양하였다. 상층액을 완벽히 제거한 후 100% 메탄올로 15분간 고정시키고 크리스탈 바이올렛 염색용액으로 1시간 염색시킨 후, 3번 세척한 뒤 95% 에탄올로 용해하여 마이크로 적정 플레이드 판독기를 이용하여 595 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 각 균주에 대한 생물막 최소억제 농도값을 확인하였다.
그 결과, 하기 표 6에 개시된 바와 같이 대조 항생제인 시프로플록사신(ciprofloxacin)에 비해 모든 균주에서 Pse-T2 펩타이드가 강한 생물막 저해활성을 나타내는 것을 확인하였다.
Figure 112019030216589-pat00007
실시예 10. 다제 내성 슈도모나스 에루지노사에 감염된 상처의 치유능 측정
본 발명자들은 상기 실시예 1의 방법으로 제조된 펩타이드들 중 항균활성이 가장 우수한 펩타이드인 Pse-T2의 효능을 마우스 모델을 사용하여 in vivo에서 평가했다.
구체적으로, 6-7 주령의 BALB/c 마우스 상처는 사포를 이용하여 뒷면(등쪽)의 표피를 연마하여 유도하였다. 슈도모나스 에루지노사(P. aeruginosa) 4891 (1×108 CFU/20㎕ PBS)을 생성된 상처에 감염시켰다. 감염 2시간 후 항생펩타이드 Pse-T2 (0.2 ㎎/㎏, 20㎕)를 주입하였다. 대조군 마우스에는 펩타이드가 없는 동량의 PBS(20㎕)를 주입하였다. 처리 후 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 및 10일에 상처의 형태를 촬영하고 상처 크기를 측정한 후, 상처 및 주변 조직을 회수하였다. 상처 조직은 조직 분쇄기를 사용하여 멸균된 PBS 500㎕에서 균질화 시켰다. 한천 플레이트에 상기 균질화물의 연속 희석액을 플레이팅하여 24시간 동안 배양하여 슈도모나스 에루지노사 4891 균주를 정량화하였다.
그 결과, 슈도모나스 에루지노사 4891 균주의 감염이 없는, PBS만 주입한 실험군, Pse-T2만 주입한 실험군 및 시프로플록사신(ciprofloxacin)만 주입한 실험군에서는 모두 6-8일 이내에 상처가 완전히 치유됨을 확인할 수 있었다(도 5). 반면, 슈도모나스 에루지노사 4891을 감염시킨 상처는 균주의 감염이 없는 경우보다 동일 날짜에서 상처가 보다 컸고, 감염된 상처는 6일차까지 크기가 감소하지 않았고, 상처에 심한 염증이 생겼음을 알 수 있었다. 그러나, 슈도모나스 에루지노사 4891 감염 후, Pse-T2 펩타이드를 처리한 실험군에서는 6일 후에 상처가 약 41-54% 수준 치유되었으며, 10일 후에는 90-92% 수준 치유됨을 알 수 있었다(도 5 및 도 6). 상처 조직의 균질화물을 배양하여 박테리아 수를 확인한 결과에서도, 세균 감염 후 Pse-T2 펩타이드를 처리한 조건이 세균 감염 후 PBS를 조건에 비해 3일째에는 80%, 6일째에는 95% 이상 슈도모나스 에루지노사 4891 균주의 수가 낮게 확인되었다(도 7). 상기 결과를 통해, Pse-T2 펩타이드가 상처치유에 효과적임을 알 수 있었다.
실시예 11. 정량적 실시간 PCR을 이용한 전염증성 사이토카인 유전자 발현 분석
인터루킨-1 베타 (IL-1β), 인터루킨-6 (IL-6), 종양괴사인자-알파 (TNF-α)와 같은 염증 매개체의 mRNA 발현은 피부 감염 및 상처 치유시 변화가 일어난다. 세균이 감염되지 않은 마우스와 감염된 마우스, 감염 후 Pse-T2 펩타이드를 투여한 마우스에서 염증 유전자의 발현을 측정하여 Pse-T2의 효능을 검증하였다.
구체적으로, 트리졸 시약을 사용하여 상처 조직으로부터 총 RNA를 분리하였다. 준비된 총 RNA는 cDNA 합성 키트를 사용하여 cDNA를 합성하였다. qPCR은 qPCR 2x premix (SYBR Green)를 이용하여 수행하였고, 염증 유전자들 중 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 발현양을 확인하였다. 발현 수준은 β-액틴을 기준으로 정량화 하였고, PCR 수행 과정은 50℃에서 2분, 95℃에서 10분; 95℃에서 15초, 60℃에서 1분, 40 사이클; 95℃에서 15초, 60℃에서 1분 및 95℃에서 30초, 60℃에서 15초로 진행하였다.
IL-1β, IL-6, TNF-α의 mRNA 발현을 확인한 결과, 슈도모나스 에루지노사 4891 균주가 감염된 피부 상처에서 상기 각 염증성 사이토카인의 발현이 증가됨이 관찰되었고, 세균에 감염된 피부 상처에 Pse-T2 펩타이드를 처리한 조건에서는 염증성 사이토카인의 발현이 억제되는 것이 확인되었다(도 8). 이를 통해 Pse-T2 펩타이드가 세균 감염에 의해 마우스에서 유도된 염증성 사이토카인의 발현을 억제함을 알 수 있었다. 따라서 Pse-T2 처리는 생체 내에서 슈도모나스 에루지노사 4891에 대해 항균 효과를 발휘하고, 세균 감염에 대한 반응으로 보이는 염증을 억제함을 확인할 수 있었다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 예시한다.
<제조예 1> 약학적 제제의 제조
<1-1> 산제의 제조
본 발명의 펩타이드 20㎎
유당 20㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<1-2> 정제의 제조
본 발명의 펩타이드 10㎎
옥수수전분 100㎎
유당 100㎎
스테아린산 마그네슘 2㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<1-3> 캡슐제의 제조
본 발명의 펩타이드 10㎎
결정성 셀룰로오스 3㎎
락토오스 14.8㎎
스테아린산 마그네슘 0.2㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<1-4> 액제의 제조
본 발명의 펩타이드 20㎎
이성화당 10g
만니톨 5g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.
<1-5> 주사제의 제조
본 발명의 펩타이드 10㎍/㎖
묽은 염산 BP pH 7.6로 될 때까지
주이용 염화나트륨 BP 최대 1㎖
적당한 용적의 주이용 염화나트륨 BP 중에 본 발명의 펩타이드를 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 이용하여 pH 7.6로 조절하고, 주이용 염화나트륨 BP를 이용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120℃에서 15분 이상 고압증기멸균기로 살균하여 주사액제를 제조하였다.
<제조예 2> 화장품의 제조
<2-1> 유연화장수(스킨)
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 유연화장수를 제조하기 위해 하기 표 7에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조할 수 있다.
유연화장수 조성
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 0.1~30
1,3-부틸렌글리콜 3.0
글리세린 5.0
폴리옥시에틸렌(60) 경화피마자유 0.2
에탄올 8.0
구연산 0.02
구연산나트륨 0.06
방부제 미량
향료 미량
정제수 To 100
<2-2> 영양화장수(로션)
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 영양화장수를 제조하기 위해 하기 표 8에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조할 수 있다.
영양화장수 조성
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 0.1~30
스쿠알란 10.0
모노올레인산폴리옥시에틸렌소르비탄 2.0
유창목오일 0.1~30
1,3-부틸렌글리콜 8.0
글리세린 5.0
폴리옥시에틸렌(60) 경화피마자유 0.2
에탄올 8.0
구연산 0.02
구연산나트륨 0.06
방부제 미량
향료 미량
정제수 To 100
<2-3> 에센스
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 에센스를 제조하기 위해 하기 표 9에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조할 수 있다.
에센스 조성
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 0.1~30
시토스테롤 1.7
플리글리세릴2-올레이트 1.5
세라마이드 0.7
세테아레스-4 1.2
콜레스테롤 1.5
디세틸포스페이트 0.4
농글리세린 5.0
카르복시비닐폴리머 0.2
산탄검 0.2
방부제 미량
향료 미량
정제수 To 100
<2-4> 세안제(클렌징폼)
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 세안제(클렌징폼)를 제조하기 위해 하기 표 10에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
세안제 조성
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 0.1~30
N-아실글루타민산나트륨 20.0
글리세린 10.0
PEG-400 15.0
프로필렌글리콜 10.0
POE(15) 올레일알코올에테르 3.0
라우린유도체 2.0
메틸파라벤 0.2
EDTA-4Na 0.03
향료 0.2
정제수 To 100
<2-5> 영양크림
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 영양크림을 제조하기 위해 하기 표 11에 기재된 것처럼 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조한다.
영양크림 조성
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 0.1~30
바셀린 7.0
유동파라핀 10.0
밀납 2.0
폴리솔베이트60 2.5
솔비탄세스퀴올레이트 1.5
스쿠알란 3.0
프로필렌글리콜 6.0
글리세린 4.0
트리에탄올아민 0.5
산탄검 0.5
토코페닐아세테이트 0.1
향료, 방부제 미량
정제수 To 100
<2-6> 마사지크림
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 마사지크림을 제조하기 위해 하기 표 12에 기재된 것처럼 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조한다.
마사지크림 조성
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 0.1~30
프로필렌글리콜 6.0
글리세린 4.0
트리에탄올아민 0.5
밀납 2.0
토코페닐아세테이트 0.1
폴리솔베이트60 3.0
솔비탄세스퀴올레이트 2.5
세테아릴알코올 2.0
유동파라핀 30.0
산탄검 0.5
향료, 방부제 미량
정제수 To 100
<2-7> 팩
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 팩을 제조하기 위해 하기 표 13에 기재된 것처럼 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조한다.
팩 조성
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 0.1~30
프로필렌글리콜 2.0
글리세린 4.0
폴리비닐알코올 10.0
에탄올 7.0
파이지-40 히드로게비이티드캐스터오일 0.8
트리에탄올아민 0.3
향료, 방부제 미량
정제수 To 100
이상의 본 발명은 상기에 기술된 실시예 및 제조예에 의해 한정되지 않고, 통상의 기술자들에 의해 다양한 변형 및 변경을 가져올 수 있으며, 그외의 색조 화장품을 포함하는 다양한 용도의 화장품에 적용될 수 있는 것이고, 그 효능에 따라 인체에 얇게 도포하여 바를 수 있는 약제 즉, 연고로 제조에 이용될 수 있고, 이는 첨부된 청구항에서 정의되는 본 발명의 취지와 범위에 포함된다.
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Claims (14)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서,
    i) 1번째 및 20번째부터 24번째 아미노산이 결실되거나,
    ⅱ) 1번째 및 20번째부터 24번째 아미노산이 결실되고, 11번째 또는 18번째 아미노산이 리신(lysine, K)으로 치환되거나,
    ⅲ) 1번째 및 20번째부터 24번째 아미노산이 결실되고, 11번째 및 18번째 아미노산이 리신으로 치환된 항균 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항균 펩타이드는 그람 양성균, 그람 음성균, 효모균 또는 항생제 내성균에 대해 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 그람 양성균은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes)인 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
  4. 제2항에 있어서, 상기 그람 음성균은 대장균(Escherichia coli), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)인 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
  5. 제2항에 있어서, 상기 효모균은 캔디다 알비칸스(Candida albicans) 또는 트리코스포론 베이젤리(Trichosporon beigelii)인 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
  6. 제2항에 있어서, 상기 항생제 내성균은 항생제 내성을 갖는 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus), 대장균(E. coli) 또는 슈도모나스 에루지노사(P. aeruginosa)인 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항균 펩타이드는 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
  8. 제1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제.
  9. 제1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 화장료 조성물.
  10. 제1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 식품 첨가제.
  11. 제1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 사료 첨가제.
  12. 제1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 생물 농약.
  13. 제1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 의약외품 조성물.
  14. 약학적으로 유효한 양의 제1항의 항균 펩타이드를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 개체 내 항균 방법.
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