TWI627186B - 刺激黑色素生成之胜肽 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種刺激黑色素生成的合成胜肽。該合成胜肽係由AsnSerAlaThrGluArgGlu的胺基酸序列所組成。本發明亦提供用於在個體中刺激黑色素生成的方法及組合物。
Description
本發明整體而言係關於一種用於增加黑色素生成或增加黑色素細胞中之黑色素含量的胜肽，以及其組合物。
頭髮的顏色是由毛囊黑色素細胞中棕黑色的真黑色素以及紅黃色的褐黑色素的相對含量決定。增進黑色素生成會導致黑色素細胞中黑色素含量的增加，並因此使皮膚、頭髮或毛髮具有增加的色素形成或加深的顏色。
美國專利案第5,352,440號涉及藉由某些二醯基甘油化合物的投予而增加黑素細胞中黑色素的合成以及增加色素形成的方法。美國專利案第5,532,001號涉及藉由某些DNA片段的投予而增進哺乳類的皮膚的色素形成的方法。美國專利案第5,554,359號涉及藉由向溶酶體劑（lysosomotropic agents）的投予來增加黑色素細胞中的黑色素含量的方法。
雖然已經做了一些努力來改善黑色素的合成，但仍然需要用於刺激黑素生成的組合物及方法。
本發明係非預期性地發現具有序列為AsnSerAlaThrGluArgGlu (SEQ ID NO: 1)的新合成胜肽係有效刺激黑色素生成。
因此，在一方面，本發明提供一種胜肽，用於刺激黑色素生成或增加黑色素細胞中的黑色素含量。該胜肽係由SEQ ID NO: 1的胺基酸序列所組成的合成胜肽。
在另一方面，本發明的特徵在於一種用於在個體中加深毛髮顏色的方法，其包含對該個體投予根據本發明的胜肽，其量係有效刺激黑色素生成或在個體中增加黑色素細胞中的黑色素含量。
在本發明的一具體實施例中，可藉由根據本發明的胜肽刺激黑色素生成而增加黑色素細胞中的黑色素含量。在本發明的一實例中，本發明的胜肽可用於加深個體（例如，人類個體）的毛髮顏色，其中該胜肽係局部地投予至該個體。
在又一方面，本發明提供一種用於增加黑色素細胞中的黑色素含量的組合物。該組合物包含有效量的具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的胜肽，其量可有效刺激黑色素生成。在本發明的特定具體實施例中，該組合物進一步包含一生理上可接受的載體，且可調製為局部用製劑。
根據本發明，所述局部製劑可包含軟膏、乳液、乳霜、凝膠、滴劑、噴霧、液劑、洗髮劑或護髮劑。在一較佳具體實施例中，該組合物系調製為洗髮劑或護髮劑。
應理解的是，前述的一般性說明及以下的詳細說明皆只是例示性及解釋性的，並不限制本發明。
在一方面，本發明的特徵在於一種用於刺激黑色素生成的胜肽。該胜肽係由AsnSerAlaThrGluArgGlu (SEQ ID NO: 1)的胺基酸序列所組成的合成胜肽。
在本發明的一具體實施例中，該胜肽係有效增加黑色素細胞中的黑色素含量。
在另一方面，本發明提供一種用於在個體中加深毛髮顏色的方法，其包含對該個體投予具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的胜肽，其量係有效刺激黑色素生成或在該個體中增加黑色素細胞中的黑色素含量。
在本發明的方法之一實例中，該胜肽係局部地投予至該個體。
在又一方面，本發明提供一種用於增加黑色素細胞中的黑色素含量的組合物，其包含有效量之具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的胜肽。該組合物係有效刺激黑色素生成。該組合物可用於美容目的，例如，加深毛髮顏色。
在本發明的特定具體實施例中，該組合物進一步包含一生理上可接受的載體。
在本發明的一實例中，該組合物被調製成一種局部用製劑。
除非另有定義，本文使用的所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域中的通常知識者所理解相同的含義。
用語「一」或「一個」在申請專利範圍及/或說明書中與術語「包含」一起使用時，其意思可為「一個」，但其亦與「一或多個」、「至少一個」以及「一或多於一個」的含義一致。
術語「胜肽」在本文中係以其常規含義而被使用，亦即為一種聚合物，其單體為胺基酸，並藉由醯胺鍵而互相連結在一起，另可選擇地，其係指多態（polypeptide）。當該胺基酸為α-胺基酸時，可使用L-光學異構物或D-光學異構物。此外，亦可包含非天然的胺基酸，例如，β-丙胺酸、苯甘胺酸及高精胺酸。使用胺基酸的標準縮寫。
本文中所使用的術語「個體」係指脊椎動物，較佳地為哺乳動物，尤佳地為人。在下文中，作為個體的人特別被稱為「人類個體」。
本文中所使用的術語「載體」係指一般用於調製可增進穩定性、無菌性、遞送性的藥物或化妝品組合物的材料。當胜肽遞送系統調製為一種溶液或懸浮液時，該遞送系統係於一可接受載體中，較佳地為水性載體。可使用多種水性載體，例如，水、緩衝液、0.8%鹽水、0.3%甘胺酸、透明質酸等。該組合物可含有如所需要而可接近生理條件的生理上可接受的輔助物質，例如pH調整及緩衝劑、溶液張力調節劑、潤濕劑及其類似物，例如，乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、山梨醇酐單月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。
術語「局部的」或「局部地」在本文中係以其常規含義而被使用，其係指可以在身體任何部位內或上的位置，包括但不限定於表皮、任何其他真皮、或任何其他身體組織。局部地投予或施予意指使該胜肽直接與組織接觸，例如含有黑色素生成細胞的皮膚或膜。
本發明思及使用具有SEQ ID NO: 1之胜肽做為針對各種用途的活性成分。在一具體實施例中，本發明的胜肽係與一可接受的載體組合而形成一種可置放於毛髮或皮膚上的局部用製劑。局部用製劑可包括軟膏、乳液、糊劑、乳霜、凝膠、滴劑、塞劑、噴霧、液劑、洗髮劑、護髮劑、粉末及經皮貼片。根據需要，可使用增稠劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑。較佳地，載體的功能為增加本發明胜肽的皮膚滲透性，並且在體內條件下應能將該胜肽遞送至黑色素細胞。對於本領域技術人員而言，合適的載體為習知，且其包括但不限於水、二甲基亞碸、乙醇、脂質體、液體石蠟、石蠟、二甲基甲醯胺、2-吡咯烷酮、油酸、以及品牌Azone®的滲透增進劑。
通過以下實例進一步說明本發明，所述實例係以提供例示性之目的提供而非限制。
實例
實例1： SEQ ID NO: 1之胜肽的製備
具有SEQ ID NO：1（AsnSerAlaThrGluArgGlu）的胺基酸序列的胜肽係由生工有限公司（MDBio, Inc.）（台北，台灣）所合成，並藉由高效能液相層析（HPLC）及質譜法確認胜肽的純度及組成。將10mg凍乾胜肽粉末溶解於500μl雙去離子水（ddH
2O）中後，將胜肽原料儲存在-20℃。
實例2：細胞培養
B16F10係分離自小鼠皮膚分離的黑素瘤細胞株（美國典型培養物保藏中心， ATCC，美國），並在37℃且含有5％CO
2下，培養於無酚紅而含有10％（v / v）FBS及青黴素/鏈黴素（100 IU/50 g每ml）的DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）中。
實例3：黑色素含量檢測
將B16F10細胞（2×10
4）種於6孔培養盤中並培養過夜。以不同濃度之SEQ ID NO：1的胜肽處理細胞48小時或72小時，然後以胰蛋白酶處理。於埃彭道夫管（Eppendorf tube）中拍攝細胞沉澱後，將細胞在80℃下，於1N NaOH中溶解30分鐘。藉由比較測試樣品在405nm處的吸光值和使用合成黑色素獲得的標準曲線來分析黑色素含量。其結果來自三個獨立實驗，顯示為平均值±SE pg /細胞。
其結果顯示於圖1A及圖1B。發現SEQ ID NO：1的胜肽係以濃度依賴的方式顯著地增加黑色素的合成（參見圖1A及1B）。
實例4：酪胺酸酶檢測
將B16F10細胞（2×10
4）種於6孔培養盤中並培養過夜。以不同濃度之SEQ ID NO：1的胜肽處理細胞48小時或72小時，然後以胰蛋白酶處理。將細胞沉澱物與含有1％Triton X-100的磷酸鹽緩衝液（pH 6.8）再懸浮並在80℃下培養60分鐘。藉由14000 rpm離心10分鐘除去細胞碎片，並使用Bradford蛋白質檢測染料（Bio-Rad）測定蛋白質含量。至於反應，係將100μg細胞溶解物加入到200μl的2.5mM L-DOPA中，然後在37℃下培養20分鐘。以分光光度計測定在490nm下的吸光值。
其結果顯示於圖2。發現以5-50μg/ ml量之SEQ ID NO：1的胜肽處理的細胞顯示出顯著增加的酪胺酸酶活性。
實例5：MTT檢測
將100μl之完全DMEM中的細胞（2×103）種於96孔盤中，並用不同濃度的SEQ ID NO：1的胜肽處理。用ddH
2O處理的細胞作為對照組。在每個孔中加入10微升的5mg / ml 3-（4,5-二甲基-2-噻唑基）-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物溶液（MTT; Sigma），並在37℃下培養3小時。在那之後，加入100μl之於0.01N HCl中的10％SDS以溶解MTT甲䐶結晶。以分光光度計測定在550及630nm之雙波長下的所得光密度。
經SEQ ID NO：1的胜肽處理24小時（上圖），48小時（中圖）或72小時（下圖）的細胞之細胞存活力的量顯示於圖3。發現SEQ ID NO：1的胜肽不顯著影響B16F10細胞的存活力。鑑於上述，其指出SEQ ID NO：1的胜肽確實能夠刺激黑色素生成，並且增加個體內黑色素細胞中的黑色素含量，但並非由B16F10細胞之存活力的改善而引起。
本領域技術人員會理解在不脫離本發明的廣義發明概念的情況下，可修改上述具體實施例。因此，可理解的是，本發明並不局限於所揭示的特定具體實施例，而旨在於涵蓋由所附申請專利範圍所定義的本發明精神及範圍內的修飾。
無
配合附圖一起閱讀將可更佳地理解前述的發明內容，以及下述的詳細說明。
在圖式中：
圖1A提供以不同劑量之具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列的胜肽在處理48或72小時後B16F10黑素瘤細胞的細胞沉澱的圖像（比例尺= 1公分）。
圖1B顯示藉由分光光度計在波長450nm下測定的黑色素含量；其中該結果指出以具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列的胜肽處理24小時（上圖）及48小時（下圖）的細胞中黑色素含量的倍數變化；以不具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列之胜肽的ddH
2O處理的細胞中之黑色素含量為1；統計結果係從三個獨立實驗獲得。 （* P ＜0.05；** P ＜0.01。顯示在細胞中由本發明的胜肽所致的黑色素形成）。
圖2顯示SEQ ID NO：1的胜肽增加B16F10細胞中的酪胺酸酶活性；其中，以不同濃度之具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列的胜肽（也稱為「NO.11胜肽」）處理B16F10細胞；如所示，48小時（上圖）或72小時（下圖）；細胞溶解液用於分析酪胺酸酶活性，其結果顯示三次獨立實驗中酪胺酸酶活性呈現倍數變化（* P ＜0.05）。
圖3顯示具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列的胜肽在影響B16F10的存活力上並不顯著；其中，分別以不同濃度之具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列的胜肽處理B16F10細胞24小時（上圖），48小時（中圖）或72小時（下圖）；藉由MTT檢測分析細胞存活力，並從三個獨立實驗中獲得結果。
無
Claims (10)
- 一種刺激黑色素生成的胜肽，其係由SEQ ID NO: 1的胺基酸序列所組成的合成胜肽。
- 如請求項1的胜肽，其係有效增加黑色素細胞中的黑色素含量。
- 一種用於在個體中加深毛髮顏色的方法，其包含對該個體投予如請求項1的胜肽，其量可有效刺激黑色素生成或在個體中增加黑色素細胞中的黑色素含量。
- 如請求項3的方法，其中如請求項1的胜肽係局部地投予至該個體。
- 一種用於增加黑色素細胞中的黑色素含量的組合物，其包含有效量的如請求項1的胜肽。
- 如請求項5的組合物，其進一步包含一生理上可接受的載體。
- 如請求項5的組合物，其係被調製成一種局部用製劑。
- 如請求項7的組合物，其中該局部用製劑包含軟膏、乳液、乳霜、凝膠、滴劑、噴霧、液劑、洗髮劑或護髮劑。
- 如請求項8的組合物，其中該局部用製劑為洗髮劑。
- 如請求項8的組合物，其中該局部用製劑為護髮劑。
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