CN109134609B

CN109134609B - 抗老化胜肽，其组合物和其使用方法

Info

Publication number: CN109134609B
Application number: CN201710590350.1A
Authority: CN
Inventors: 黄敏铨; 陈学亭; 刘玉春
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-06-19
Filing date: 2017-07-19
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2037-07-19
Also published as: CN109134609A; US10258556B2; US20180360720A1

Abstract

本发明的揭露是涉及抗老化胜肽，其组合物和其使用方法。具体地涉及一种抗老化的胜肽，其具有ProAspSerThrGluAlaLys(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列。本发明还提供包含胜肽和使用胜肽的个人护理方法的抗老化组合物。

Description

抗老化胜肽，其组合物和其使用方法

技术领域

本发明整体而言是涉及一种抗老化胜肽，其使用方法和其组合物。

背景技术

一般的皮肤损害包括随着年龄而自然发生的皮肤变薄。供应皮肤的细胞和血管减少以及真皮厚度的减少。老化或损害皮肤的损害或变化包括皱纹、细纹、色素沉着过度、肤色蜡黄、黑眼圈、眼睛浮肿、更换率降低，以及异常脱屑或脱落。一些其他损害包括能见的死皮，如剥落，鳞屑，干燥，粗糙。随着皮肤老化，真皮中总胶原蛋白含量减少，剩余的胶原纤维逐渐变厚，导致交联增加，溶解性、延展性等降低。此外，弹性蛋白变得更厚并且更多交联。另外，真皮中纤维母细胞的增殖活性降低，而胶原蛋白合成能力下降，降解能力增强。随着表皮的再生，真皮等变得缓慢，表皮和真皮之间的粘附性变弱，皮肤弹性迅速降低。

虽然已经开发了一些产品以改善皮肤老化的情况，但仍然需要用于治疗老化或皮肤老化的变化引起的损伤(例如皮肤损伤)的组合物和方法。

发明内容

本发明非预期地发现具有ProAspSerThrGluAlaLys(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的胜肽有效增强胶原蛋白和/或弹性蛋白的含量以及个体中纤维母细胞的迁移。

因此，在一方面，本发明提供一种抗老化胜肽，其是由SEQ ID NO：1的氨基酸序列所组成的合成胜肽。所述胜肽提供了增强纤维母细胞中胶原蛋白或弹性蛋白的表达以及纤维母细胞的迁移的功效。

在另一方面，本发明提供一种个人护理组合物。所述组合物包含有效量的SEQ IDNO:1的胜肽。

在本发明的特定具体实施例中，所述组合物能够进一步包含一能够接受的载体，并能够调制为一种局部用制剂，例如，化妆品制剂。

根据本发明，所述局部用制剂能包含软膏、乳液、乳霜、凝胶、滴剂、喷雾、液剂或面膜。在一较佳具体实施例中，所述组合物是调制为乳霜或面膜。

在另一方面，本发明提供一种用于治疗由老化引起的损伤的个人护理方法，其特征在于，对一有需要的个体施用具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的胜肽，其量能够有效增强纤维母细胞中胶原蛋白或弹性蛋白的表达或增强所述个体中的纤维母细胞的迁移。

在本发明的所述方法的一具体实施例中，所述胜肽局部地施用至所述个体。

在本发明的一实施例中，所述方法特别用于皮肤护理。

根据本发明，所述方法是用于提供抗老化、增亮皮肤的功效和一功效。

应理解的是，前述的一般性说明和以下的详细说明皆只是例示性和解释性的，并不限制本发明。

附图说明

配合附图一起阅读将能够更佳地理解前述的发明内容，以及下述的详细说明。为了说明本发明的目的，在附图中显示目前较佳的具体实施例。

在附图中：

图1A和图1B显示SEQ ID NO：1的胜肽在增加CCD-966SK纤维母细胞中胶原蛋和弹性蛋白的表达的功效；通过即时RT-PCR分析以不同浓度的SEQ ID NO：1的胜肽处理CCD-966SK纤维母细胞中的胶原蛋白(COL1A1、COL1A2和COL3A1)和弹性蛋白(ELN)的mRNA含量24小时(图1A)或48小时(图1B)(*P<0.05；**P<0.01)。

图2A显示48小时的迁移细胞的代表性影像；通过透孔(transwell)迁移检测，分析以不同浓度的SEQ ID NO：1的胜肽处理CCD-966SK纤维母细胞的迁移(比例尺＝100μm)。

图2B和图2C显示SEQ ID NO：1的胜肽在增强CCD-966SK细胞的迁移经24小时(图2B)和48小时(图2C)的功效；结果是由两个独立实验获得(*P<0.05；**P<0.01)。

图3A至图3C显示SEQ ID NO：1的胜肽并未显著影响CCD-966SK纤维母细胞的存活力；CCD-966SK细胞以不同浓度的SEQ ID NO：1的胜肽处理24小时(图3A)、48小时(图3B)和72小时(图3C)；通过MTT检测分析细胞活力，并自三个独立实验获得结果。

具体实施方式

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中的技术人员所理解相同的含义。

用语“一”或“一个”在权利要求书和/或说明书中与术语“包含”一起使用时，其意思能够为“一个”，但其也与“一或多个”、“至少一个”以及“一或多于一个”的含义一致。

术语“胜肽”在本文中是以其常规含义而被使用，也即为一种聚合物，其单体为氨基酸，并通过酰胺键而互相连结在一起，另能够选择地，其是指多肽(polypeptide)。当所述氨基酸为α-氨基酸时，能够使用L-光学异构物或D-光学异构物。此外，还能够包含非天然的氨基酸，例如，β-丙氨酸、苯甘氨酸和高精氨酸。使用氨基酸的标准缩写。

本文中所使用的术语“个体”是指脊椎动物，较佳地为哺乳动物，尤佳地为人。在下文中，作为个体的人特别被称为“人类个体”。

本文中所使用的术语“载体”是指一般用于调制能够增进稳定性、无菌性、递送性的药物或化妆品组合物的材料。当胜肽递送系统调制为一种溶液或悬浮液时，所述递送系统是在一能够接受的载体中，较佳地为水性载体。能够使用多种水性载体，例如，水、缓冲液、0.8％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。所述组合物能够含有如所需要而能够接近生理条件的生理上能够接受的辅助物质，例如pH调整和缓冲剂、溶液张力调节剂、润湿剂和其类似物，例如，乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨醇酐单月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。

术语“局部的”或“局部地”在本文中是以其常规含义而被使用，其是指能够在身体任何部位内或上的位置，包括但不限定于表皮、任何其他真皮、或任何其他身体组织。局部地施用或施予意指使所述胜肽直接与组织接触，例如含有黑色素生成细胞的皮肤或膜。

根据本发明，所述抗老化胜肽是由SEQ ID NO:1的氨基酸序列所组成的合成胜肽，也即ProAspSerThrGluAlaLys序列。所述胜肽能够通过标准方法或以任何一般在使用或所属领域技术人员已知的方式合成。

如实施例显示，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的胜肽证实具有增强胶原蛋白或弹性蛋白的表达和纤维母细胞的迁移的功效。因此，本发明还提供了一种个人护理方法，其特征在于，对一有需要的个体施用具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的胜肽，其量能够有效增强纤维母细胞中胶原蛋白或弹性蛋白的表达和纤维母细胞的迁移。

另一方面，本发明提供一种抗老化组合物。所述组合物包含有效量的具有SEQ IDNO：1的氨基酸序列的胜肽。所述组合物通过增强胶原蛋白和/或弹性蛋白含量和个体中纤维母细胞的迁移，提供例如，皮肤中的抗老化功效。所述组合物能够用于化妆品为目的，例如，护肤品。

本发明涉及使用SEQ ID NO：1的胜肽作为针对各种用途的活性成分。在一较佳具体实施例中，本发明的胜肽是与能够接受的载体组合而形成一种能够放于皮肤上的局部用制剂。局部用制剂，例如化妆品制剂，能够包含软膏、乳液、糊剂、乳霜、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾、液剂、粉剂和透皮贴剂。根据需要，能够使用增稠剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂。较佳地，载体的一个功能为增强本发明的胜肽的皮肤渗透性，并且应能在体内条件下将胜肽递送到纤维母细胞。对于所属领域技术人员而言，合适的载体为现有的，且其包括但不限于水、二甲基亚砜、乙醇、脂质体、液体石蜡、石蜡、二甲基甲酰胺、2-吡咯烷酮、油酸等。

此外，本发明提供一种用于治疗由年龄引起的损害的个人护理方法。所述方法包括对一有需要的个体施用具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的胜肽，其量能够有效增强纤维母细胞中胶原蛋白或弹性蛋白的表达，或增强个体中纤维母细胞的迁移。根据本发明，所述方法用于所述个体，特别是人类个体的抗老化、增亮皮肤、减少皮肤皱纹和细纹。

通过以下实施例进一步说明本发明，所述实施例是以提供例示性的目的提供而非限制。

实施例

实施例1 SEQ ID NO:1的胜肽的制备

具有SEQ ID NO：1(序列：ProAspSerThrGluAlaLys)的胜肽是由生工有限公司(MDBio,Inc.)(中国台湾，台北)所合成，并通过高效能液相层析(HPLC)和质谱法确认胜肽的纯度和组成。将10mg冻干胜肽粉末溶解于250μl双去离子水(ddH2O)中后，将胜肽原料储存在-20℃。

实施例2 细胞培养

CCD-966SK是从人的胸部分离出的皮肤纤维母细胞，其是购自生物资源保存和研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC)(中国台湾，新竹)。在37℃且含有5％CO₂下，培养于含有10％(v/v)FBS和青霉素/链霉素(100IU/50μg/ml)的DMEM(Dulbecco'sModified Eagle Medium)中，在5％CO₂中。

实施例3 合成cDNA和定量即时PCR

根据制造商协定，使用TRIzol试剂(Invitrogen)分离总RNA。cDNA合成是使用大容量cDNA逆转录试剂盒(AB，USA)，在20μl逆转录反应中使用2μg总RNA。QuantStudio 3即时PCR系统(Thermo Fisher)是用于即时PCR反应。反应是在20μl体积中以1μl cDNA和10μlSensiFAST SYBR Lo-ROX Mix(BIOLINE)进行。对cDNA进行即时PCR。

使用以下引物：

1)COL1A1正义，5'-GAACATCCGGAGCCCAGAGG-3'(SEQ ID NO：2)和反义，5'-TCCATGTTGCAGAAGACTTT-3'(SEQ ID NO：3)；

2)COL1A2正义5'-GGTGAAGATGGTCACCCTGG-3'(SEQ ID NO：4)和反义，5'-GGGGCACCAGGTTCACCCTT-3'(SEQ ID NO：5)；

3)COL3A1正义，5'-CGCCCTCCTAATGGTCAAGG-3'(SEQ ID NO：6)和反义，5'-TTCTGAGGACCAGTAGGGCA-3'(SEQ ID NO：7)；

4)ELN正义，5'-CCTTCCCCGCAGTTACCTTT-3'(SEQ ID NO：8)和反义，5'-TGCAGACACTCCTAAGCCAC-3'(SEQ ID NO：9)；

5)β-肌动蛋白正义，5'-CGTGCGTGACATTAAGGAGA-3'(SEQ ID NO：10)和反义，5'-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3'(SEQ ID NO：11)。

以不同浓度(0、2、5ug/ml)的SEQ ID NO：1的胜肽处理CCD-966SK纤维母细胞24小时或48小时。通过即时RT-PCR分析细胞的胶原蛋白(COL1A1、COL1A2和COL3A1)和弹性蛋白(ELN)的mRNA含量。如图1A和图1B显示指出，SEQ ID NO：1的胜肽增加CCD-966SK纤维母细胞中胶原蛋白和弹性蛋白的表达。

实施例4 透孔迁移检测

将0.25ml无血清DMEM中的细胞(5×10³)以8μm孔径的膜(Corning，USA)种于上室中。将含有或不含有MUC20胜肽NO.10的无血清DMEM(0.5ml)加载至24孔培养盘的孔中的下室中。培养24小时或48小时后，将细胞固定并以含有20％(v/v)甲醇的0.5％(w/v)结晶紫(Sigma)染色。在相差显微镜下计数来自5个随机场的迁移细胞数。其结果以学生t检验分析，并绘制为平均值±标准差。结果是由两个独立实验获得。

通过透孔迁移检测分析CCD-966SK纤维母细胞的迁移。如图2A、图2B和图2C所示，其指出SEQ ID NO：1的胜肽具有增强CCD-966SK纤维母细胞的迁移的功效。

实施例5 MTT检测

将100μl完全DMEM中的细胞(3×10³)种于含有或不含有MUC20胜肽NO.10的96孔盘中。向每个孔中加入10微升5mg/ml 3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物溶液(MTT；Sigma)，并在37℃下培养3小时。在那之后，加入100μl的在0.01N HCl中的10％SDS以溶解MTT甲

结晶。以分光光度计测定在550和630nm的双波长下的所得光密度。

通过MTT检测分析CCD-966SK纤维母细胞的细胞存活力。结果是由三个独立实验获得。以SEQ ID NO：1的胜肽处理细胞24小时(图3A)、48小时(图3B)和72小时(图3C)的结果显示在图3A至图3C中。发现SEQ ID NO：1的胜肽不显著影响CCD-966SK纤维母细胞的存活力。

鉴于上述，推断SEQ ID NO：1的胜肽是通过增强纤维母细胞中胶原蛋白和/或弹性蛋白的表达和纤维母细胞的迁移以提供抗老化功效，而不是通过细胞纤维母细胞的存活力。

所属领域技术人员会理解在不脱离本发明的广义发明概念的情况下，能够修改上述具体实施例。因此，能够理解的是，本发明并不局限于所揭示的特定具体实施例，而旨在于涵盖由所附权利要求书所定义的本发明精神和范围内的修饰。

序列表

<110> 刘玉春

<120> 抗老化胜肽，其组合物和其使用方法

<130> ASB0002CN

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Pro Asp Ser Thr Glu Ala Lys

1 5

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

GAACATCCGG AGCCCAGAGG 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

TCCATGTTGC AGAAGACTTT 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

GGTGAAGATG GTCACCCTGG 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

GGGGCACCAG GTTCACCCTT 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

CGCCCTCCTA ATGGTCAAGG 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

TTCTGAGGAC CAGTAGGGCA 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

CCTTCCCCGC AGTTACCTTT 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

TGCAGACACT CCTAAGCCAC 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

CGTGCGTGAC ATTAAGGAGA 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

GAAGGAAGGC TGGAAGAGTG 20

Claims

1.一种抗老化胜肽，其是由SEQ ID NO:1的氨基酸序列所组成的合成胜肽。

2.一种抗老化组合物，其特征在于，包含有效量的如权利要求1所述的抗老化胜肽和一能够接受的载体。

3.根据权利要求2所述的抗老化组合物，其被调制成一种局部用制剂。

4.根据权利要求2所述的抗老化组合物，其特征在于，所述的抗老化胜肽的量能够有效增强纤维母细胞中胶原蛋白或弹性蛋白的表达或增强纤维母细胞的迁移。

5.根据权利要求3所述的抗老化组合物，其特征在于，所述局部用制剂包含软膏、乳液、乳霜、凝胶、滴剂、喷雾、液剂或面膜。

6.根据权利要求5所述的抗老化组合物，其特征在于，所述局部用制剂为乳霜。

7.根据权利要求5所述的抗老化组合物，其特征在于，所述局部用制剂为面膜。

8.根据权利要求1所述的抗老化胜肽在制备用于治疗由年龄引起的损伤的的药物的用途，其特征在于，该药物组合物能够有效增强纤维母细胞中胶原蛋白或弹性蛋白的表达或增强所述个体中的纤维母细胞的迁移。

9.根据权利要求8所述的用途，其中该药物组合物用于皮肤护理。

10.根据权利要求9所述的用途，其中该药物组合物用于抗老化、增亮皮肤和减少皱纹和细纹。