JP6892903B2 - メラニンの生成を促進するペプチドおよびその方法 - Google Patents
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Description
細胞の解凍
使用する細胞はB16F10マウスメラノーマ細胞株である。水浴を起動して温度を37℃にし、温めた(37℃)培養液を準備する。液体窒素容器から凍結チューブを取り出し、素早く水浴に移して解凍する。1mlの培養液を凍結チューブ内に添加して充分に混合し、15mlの遠心管に移す。続いて、700〜800rpm/5分間、前記遠心管を遠心分離し、上清液を除去後、1mlの培養液を添加して混合し、さらに10cmのシャーレに移す。続いて9mlの培養液をシャーレ中に補充し、37℃、5%CO2の細胞培養器でインキュベートする。
まず、10cmシャーレ中の培養液を吸引し、1XPBSで細胞を2回洗浄する。シャーレの中央に1mlのTrypsin−EDTAを添加して、シャーレを軽く揺らし、Trypsin−EDTAが表面を均等に覆うようにし、続いて培養器で5分間インキュベートする。シャーレを取り出して軽くたたくと、肉眼で黒色の塊(細胞)が出来ていることを観察することができる。1mlの培養液を前記シャーレに添加してTrypsin−EDTAの作用を中和し、細胞を15ml遠心管に集める。700〜800rpm、室温で2分間遠心分離し、上清液を除いてチューブを軽くたたき、実験に必要な量を判断して適量の培養液を添加する。最後に、混合した細胞懸濁液を新しい培養容器に分注し、37℃、5%CO2の細胞培養器に戻す。
培養液を除いた細胞を洗浄し、Trypsin−EDTA処理を行い、遠心分離後に適量の培養液中に懸濁させ、10μlの細胞液を1.8mlマイクロチューブに移し、さらに細胞計数盤に注入する。顕微鏡の100倍視野に面積が1mm2である9つの大きい格子を有し、深さは0.1mmの正方形であるため、総体積は0.1mm3=1×104mlである。このうち細胞分布が比較的平均的な2つの格子を選択してカウントを行い、数値を2で割り、さらに104を乗じて、得られた数値が1ml細胞液中に含まれる細胞数である。
ペプチド配列はDIHMKQV(SEQ ID NO:1)であり、その組成および純度は高速液体クロマトグラフィー質量分析器で確認する。5mgペプチド粉末を0.1mlの二重脱イオン水(50mg/ml)に溶解し、−20℃の冷凍庫に保存する。
8×103のB16F10細胞を24ウェルプレートに接種し、翌日、濃度が1、2、5、10μg/mlのSEQ ID NO:1のペプチドを添加して72時間作用させる。その後培養液を除き、細胞を洗浄し、Trypsin−EDTAで1.8mlマイクロチューブに集め、2500rpm、室温で5分間遠心分離する。細胞の塊を撮影して記録した後、各マイクロチューブに2NのNaOHを200μl添加し、100℃の加熱器で1時間作用させ、405nmで吸光度を測定する。試験サンプルの405nm部分の吸光度と、合成メラニンを使用して得られる標準曲線とを比較することにより、メラニン含量を分析する。
4×104のB16F10細胞を6ウェルプレートに接種し、翌日、濃度5、10μg/mlのSEQ ID NO:1を含むペプチドを添加して72時間作用させる。その後、培養液を吸引して、細胞を1%Triton X−100を含むphosphate buffer(pH6.8)200μlに溶解し、1.8mlマイクロチューブに集め、−80℃中に1時間置いた後取り出す。それを解凍後、14000rpm/4℃で10分間遠心分離する。タンパク質を含む上清液を集め、Bradford assayでタンパク質濃度を測定する。等量のタンパク質を取り、96ウェルプレートで100μlのタンパク質液に調製する。続いて、各ウェルに5mMのL−DOPAを100μl添加し、37℃の培養器で30分間反応させ、450nmで吸光度を測定する。
1×103の細胞を96ウェルプレートに接種し、翌日、濃度10、50、100、200μg/mlのSEQ ID NO:1のペプチドを添加して48時間作用させた後、100μlのThiazolyl Blue Tetrazolium Bromide(MTT)を添加し、最終濃度を0.5mg/mlとする。3時間作用させた後、0.01のHClを含む10%SDSを100μl添加する。翌日、結晶が完全に溶解されたことを確認した後、550〜630nm下の吸光度を測定する。
Claims (6)
- メラニンの生成を促進する単離または合成したペプチドであって、SEQ ID NO:1の配列からなるペプチド。
- メラニンの生成を促進する組成物の調製における請求項1に記載のペプチドの使用。
- 前記ペプチドは前記メラニンを顕著に生成させる有効量を有する、請求項2に記載の使用。
- 請求項1に記載のペプチド、および生物体が許容可能な支持剤を含む、組成物。
- 前記組成物の剤形が、軟膏、乳液、クリーム、ゲル、滴剤、スプレー、液剤、シャンプー剤またはトリートメント剤を含む、請求項4に記載の組成物。
- 必要な細胞にin vitroで有効量のペプチドを投与することを含み、前記ペプチドはSEQ ID NO:1の配列からなる、メラニンの生成を促進する方法。
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