JP2021001157A - メラニンの生成を促進するペプチドおよびその方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ほ乳類の個体において退化した色素細胞に存在する潜在性メラニン細胞に適切な刺激を与え、メラニンを生成する能力を有する健康なメラニン細胞に分化させ、メラニンの生成を促進する単離または合成したペプチド、その組成物の調製、及びその用途の提供。【解決手段】メラニンの生成を促進する単離または合成したペプチドであって、特定の配列からなるペプチド。【選択図】図１

Description

本発明はペプチドに関し、特にメラニンの生成を促進するペプチドである。

頭髪の色は、毛包中のメラニン（Ｍｅｌａｎｉｎ）に影響される。メラニンはユーメラニンおよびフェオメラニンに分けられ、両者の比率が毛髪の色に影響を及ぼす主な原因である。ユーメラニンの比率が比較的多いとき、毛髪は黒色または暗褐色を呈し；フェオメラニンの比率が少し多い場合、毛髪の色は黄色または赤色を呈する。遺伝子が２つのメラニンの比率を決定する。東洋人は比較的多くが黒髪であり、西洋人は比較的多くが金髪または赤褐色の髪である。

年齢を重ねるのに伴い、毛包中の色素細胞が老化し始め、メラニンの生成量が低下し、毛髪は次第に白くなる。毛髪が次第に白くなる原因は多くあるが、色素細胞が退化する本当の原因は依然として明確でない。次第に白くなる髪色は、人々に容易に自信を失わせる。あるいは、アジア人の審美的な基準に符合しない。

ある文献では、以前、頭髪全体が白髪の人がセリアック病を罹患し、グルテンフリー食を行うと、髪色が次第に黒くなったことを指摘している。近年の研究では、退化した色素細胞には依然として潜在性メラニン細胞が存在し；これらの潜在性細胞は通常メラニンを生成しないが、適切な刺激を与えると、メラニンを生成する能力を有する健康なメラニン細胞に分化することができることをさらに指摘している。

メラニンの生成を促進する上記の目的を達成するため、本発明はメラニンの生成を促進する単離または合成したペプチドを提供する。これはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列からなり、メラニンの生成を刺激することができる。

本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列を含み、メラニンの生成を促進する組成物の調製に用いるペプチドおよび用途をさらに提供する。

本発明は、メラニンの生成を促進する方法をさらに提供し、これは本発明のペプチドの有効量を必要な個体または細胞に投与して、前記個体のメラニンの生成を刺激することを含む。前記有効量は、前記必要な個体に顕著にメラニンを生成させることができる用量である。前記必要な個体とは、白髪を黒髪に変化させる個体、生まれつき髪色が薄い個体、および／または皮膚の色をより濃くしたい個体でよい。

本発明は、本発明のペプチドを使用してメラニンの生成を促進する組成物を調製することをさらに提供する。前記組成物は、本発明が提供するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および許容可能な担体を含む。前記組成物の剤形は、軟膏、乳液、クリーム、ゲル、滴剤、スプレー、液剤、シャンプー剤またはトリートメント剤を含むことができる。

図１は、細胞を遠心分離して凝集させた細胞の塊である。 図２は、メラニン（Ｍｅｌａｎｉｎ）含量の分析結果である（*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１）。 図３は、チロシナーゼ活性の分析結果である。 図４は、細胞生存率の結果である。

本発明の上記および／またはその他の目的、効果、特徴をより明確にわかりやすくするため、特に具体的な実施例を挙げて詳細に以下のように説明する。ただ、本発明は下記の実施例によりさらに説明するが、本発明の内容を制限するものではない。

本発明の方法の一実例において、前記ペプチドは前記個体に部分的に投与される。

このほか、本発明はメラニンの生成を促進する組成物を提供し、これはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有するペプチドを有効量含む。前記組成物は、メラニンの生成を効果的に促進する。

本発明の特定の具体的な実施例において、前記組成物は生理的に許容可能な担体をさらに含む。

他に定義していなければ、本文で使用するすべての技術および科学用語は、当業者が理解するのと同じ意味を有する。

「一」または「１個」という語を特許請求の範囲および／または明細書中で「含む」という語と共に使用するとき、その意味は「１個」でよいが、「１つまたは複数」、「少なくとも１個」および「１個以上」の意味とも一致する。

「ペプチド」という語は、本文中でその通常の意味で使用される。つまり一種の重合体であり、その単体はアミノ酸であり、アミド結合により相互に連結し、他にポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を選択的に指すことができる。前記アミノ酸がα−アミノ酸であるとき、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体を使用することができる。このほか、非天然アミノ酸、例えばβ−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンを含むこともできる。アミノ酸の標準的な略号を使用する。

本文中で使用する「担体」という語は、一般的に安定性、無菌性、輸送性を増進することができる薬物または化粧品組成物の調製に用いられる材料を指す。ペプチド輸送システムが溶液または懸濁液に調製されるとき、前記輸送システムは許容可能な担体のうち、好ましくは水性担体である。いくつかの水性担体、例えば水、緩衝液、０．８％塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などを使用することができる。前記組成物は、必要な場合、生理的条件に近い生理的に許容可能な補助物質を含むことができ、例えばｐＨ調整および緩衝剤、溶液の張力調整剤、湿潤剤およびその類似物であり、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウラート、オレイン酸トリエタノールアミンなどである。

「部分的な」または「部分的に」という語は、本文中でその通常の意味で使用され、これは身体のいかなる部位内または部位上の位置を指し、表皮、その他のいかなる真皮、またはその他のいかなる身体組織を含むがこれに限定されない。部分的に投与または与えるというのは、前記ペプチドを例えばメラニン生成細胞を含む皮膚、膜、毛包などの組織と直接接触させることを意味する。

本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を有するペプチドを各種用途に対する活性成分として使用する。具体的な実施例において、本発明のペプチドは、許容可能な担体と組み合わせて毛髪または皮膚に用いることができる部分用製剤を形成する。部分用製剤は軟膏、乳液、ペースト剤、クリーム、ゲル、滴剤、座薬、スプレー、液剤、シャンプー剤、トリートメント剤、粉末および経皮パッチを含むことができる。需要に基づいて、増粘剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または接着剤を使用することができる。好ましくは、担体の機能は本発明のペプチドの皮膚浸透性を高め、さらに体内条件下で、前記ペプチドをメラニン細胞に輸送することができることである。当業者にとって、適した担体は既知であり、水、ジメチルスルホキシド、エタノール、リポソーム、液体パラフィン、パラフィン、ジメチルホルムアミド、２−ピロリドン、オレイン酸、浸透増進剤を含むが、これに限定されない。

以下の実例により本発明をさらに説明する。前記実例は具体的な例を提供する目的のために提供され、制限するものではない。

細胞培養
細胞の解凍
使用する細胞はＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞株である。水浴を起動して温度を３７℃にし、温めた（３７℃）培養液を準備する。液体窒素容器から凍結チューブを取り出し、素早く水浴に移して解凍する。１ｍｌの培養液を凍結チューブ内に添加して充分に混合し、１５ｍｌの遠心管に移す。続いて、７００〜８００ｒｐｍ／５分間、前記遠心管を遠心分離し、上清液を除去後、１ｍｌの培養液を添加して混合し、さらに１０ｃｍのシャーレに移す。続いて９ｍｌの培養液をシャーレ中に補充し、３７℃、５％ＣＯ_２の細胞培養器でインキュベートする。

細胞の継代
まず、１０ｃｍシャーレ中の培養液を吸引し、１ＸＰＢＳで細胞を２回洗浄する。シャーレの中央に１ｍｌのＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡを添加して、シャーレを軽く揺らし、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡが表面を均等に覆うようにし、続いて培養器で５分間インキュベートする。シャーレを取り出して軽くたたくと、肉眼で黒色の塊（細胞）が出来ていることを観察することができる。１ｍｌの培養液を前記シャーレに添加してＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡの作用を中和し、細胞を１５ｍｌ遠心管に集める。７００〜８００ｒｐｍ、室温で２分間遠心分離し、上清液を除いてチューブを軽くたたき、実験に必要な量を判断して適量の培養液を添加する。最後に、混合した細胞懸濁液を新しい培養容器に分注し、３７℃、５％ＣＯ_２の細胞培養器に戻す。

細胞のカウント
培養液を除いた細胞を洗浄し、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ処理を行い、遠心分離後に適量の培養液中に懸濁させ、１０μｌの細胞液を１．８ｍｌマイクロチューブに移し、さらに細胞計数盤に注入する。顕微鏡の１００倍視野に面積が１ｍｍ^２である９つの大きい格子を有し、深さは０．１ｍｍの正方形であるため、総体積は０．１ｍｍ^３＝１×１０^４ｍｌである。このうち細胞分布が比較的平均的な２つの格子を選択してカウントを行い、数値を２で割り、さらに１０^４を乗じて、得られた数値が１ｍｌ細胞液中に含まれる細胞数である。

ペプチドの調製
ペプチド配列はＤＩＨＭＫＱＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）であり、その組成および純度は高速液体クロマトグラフィー質量分析器で確認する。５ｍｇペプチド粉末を０．１ｍｌの二重脱イオン水（５０ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、−２０℃の冷凍庫に保存する。

メラニン含量の分析
８×１０^３のＢ１６Ｆ１０細胞を２４ウェルプレートに接種し、翌日、濃度が１、２、５、１０μｇ／ｍｌのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のペプチドを添加して７２時間作用させる。その後培養液を除き、細胞を洗浄し、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡで１．８ｍｌマイクロチューブに集め、２５００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離する。細胞の塊を撮影して記録した後、各マイクロチューブに２ＮのＮａＯＨを２００μｌ添加し、１００℃の加熱器で１時間作用させ、４０５ｎｍで吸光度を測定する。試験サンプルの４０５ｎｍ部分の吸光度と、合成メラニンを使用して得られる標準曲線とを比較することにより、メラニン含量を分析する。

その結果は図１に示す通りであり、細胞を遠心分離して凝集させた細胞の塊であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のペプチドは濃度依存的に明らかにメラニンの生成を促進することを示している。コントロール群は本発明のペプチドを添加せずに処理した群であり；ホスホジエステラーゼ阻害剤（３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ、ＩＢＭＸ）（１００μＭ）をポジティブコントロール群とする。

図２は、メラニン含量の分析である。細胞を２ＮのＮａＯＨで溶解後、吸光度４０５ｎｍを測定する。実験結果から、濃度１および２μｇ／ｍｌで処理した群は、コントロール群と比較してそれぞれ３１．２％および４２．５％のメラニンの生成を促進し；濃度５および１０μｇ／ｍｌはそれぞれ５５．６％および７６．６％のメラニンの生成をより顕著に促進し、メラニンの生成量はペプチド濃度の増加に伴って増加することを発見した。

チロシナーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）活性の分析
４×１０^４のＢ１６Ｆ１０細胞を６ウェルプレートに接種し、翌日、濃度５、１０μｇ／ｍｌのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を含むペプチドを添加して７２時間作用させる。その後、培養液を吸引して、細胞を１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．８）２００μｌに溶解し、１．８ｍｌマイクロチューブに集め、−８０℃中に１時間置いた後取り出す。それを解凍後、１４０００ｒｐｍ／４℃で１０分間遠心分離する。タンパク質を含む上清液を集め、Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙでタンパク質濃度を測定する。等量のタンパク質を取り、９６ウェルプレートで１００μｌのタンパク質液に調製する。続いて、各ウェルに５ｍＭのＬ−ＤＯＰＡを１００μｌ添加し、３７℃の培養器で３０分間反応させ、４５０ｎｍで吸光度を測定する。

結果は図３に示す通りであり、５および１０μｇ／ｍｌ量のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のペプチドで処理した細胞は、チロシナーゼ活性が明らかに増加する。

細胞生存率の分析（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）
１×１０^３の細胞を９６ウェルプレートに接種し、翌日、濃度１０、５０、１００、２００μｇ／ｍｌのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のペプチドを添加して４８時間作用させた後、１００μｌのＴｈｉａｚｏｌｙｌ Ｂｌｕｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）を添加し、最終濃度を０．５ｍｇ／ｍｌとする。３時間作用させた後、０．０１のＨＣｌを含む１０％ＳＤＳを１００μｌ添加する。翌日、結晶が完全に溶解されたことを確認した後、５５０〜６３０ｎｍ下の吸光度を測定する。

結果は図４に示す通りであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のペプチドで処理しても、Ｂ１６Ｆ１０細胞の生存力に影響を及ぼさない。

上記をまとめると、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のペプチドはメラニンの生成を確実に刺激することができ、さらに個体内のメラニン細胞中のメラニン含量を増加させるが、Ｂ１６Ｆ１０細胞の生存力は改善されないことがわかる。

Claims (9)

1. メラニンの生成を促進する単離または合成したペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列からなるペプチド。
2. メラニンの生成を促進する組成物の調製における請求項１に記載のペプチドの用途。
3. 前記ペプチドは前記メラニンを顕著に生成させる有効量を有する、請求項２に記載の用途。
4. 請求項１に記載のペプチド、および生物体が許容可能な支持剤を含む、組成物。
5. 前記組成物の剤形が、軟膏、乳液、クリーム、ゲル、滴剤、スプレー、液剤、シャンプー剤またはトリートメント剤を含む、請求項４に記載の組成物。
6. 必要な個体または細胞に有効量のペプチドを投与することを含み、前記ペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列からなる、メラニンの生成を促進する方法。
7. 前記必要な個体が白髪を有する個体である、請求項６に記載の方法。
8. 前記有効量は前記個体に顕著にメラニンを生成させることができる用量である、請求項６に記載の方法。
9. 前記投与の方法が部分投与である、請求項６に記載の方法。