TWI742389B

TWI742389B - 促進黑色素生成的胜肽及其方法

Info

Publication number: TWI742389B
Application number: TW108121710A
Authority: TW
Inventors: 徐和; 頻徐; 黃敏銓
Original assignee: 和和實業股份有限公司
Priority date: 2019-06-21
Filing date: 2019-06-21
Publication date: 2021-10-11
Also published as: JP6892903B2; JP2021001157A; TW202100537A

Abstract

本發明關於一種用於在哺乳類個體中促進黑色素生成的單離或合成的胜肽，係由SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列所組成。本發明亦關於該胜肽用促進黑色素生成的方法、組合物、及用途。

Description

促進黑色素生成的胜肽及其方法

本發明關於一種胜肽，特別是用於促進黑色素生成之胜肽。

頭髮的顏色是由毛囊裡的黑色素（Melanin）所影響。黑色素分成真黑色素及嗜鉻黑色素，兩者的比例便是影響毛髮顏色的主因。若真黑色素比例較多時，毛髮呈現黑色或深褐色；若嗜鉻黑色素比例多一些，則毛髮顏色呈現黃色或紅色。而基因便決定了兩黑色素的比例。以東方人而言，較多為黑髮，而西方人則較多金髮或是紅褐色髮。

隨著年紀增長，毛囊裡的色素細胞開始老化，黑色素產量降低，毛髮漸白。儘管造成毛髮漸白的原因許多，但造成色素細胞退化的真正原因仍然不清楚。逐漸變白的髮色易讓人失去自信心，或是不符合亞洲人的審美標準。

有文獻指出，過去曾有人的整頭白髮在罹患了乳麋瀉並經過無麩質飲食之後髮色逐漸變黑。近年來研究還指出，退化的色素細胞其實仍存在著潛伏性黑色素細胞；這些潛伏性細胞平常不製造黑色素，但予以適當的刺激後可分化成具製造黑色素能力的健康黑色素細胞。

為達上述促進黑色素生長之目的，本發明提供一種用於促進黑色素生成之單離或合成之胜肽，係由SEQ ID NO: 1之序列所組成，可刺激黑色素的生成。

本發明又提供一種包含SEQ ID NO: 1之序列的胜肽用於製備促進黑色素生成之組合物及用途。

本發明再提供一種促進黑色素生成的方法，包含將本發明之胜肽對一所需個體或細胞投予有效劑量，以刺激該個體生成黑色素。該有效劑量為可促使該所需個體顯著產生黑色素之劑量。該所需個體可以為白髮轉為黑髮之個體、天生髮色偏淺之個體、及/或希望使肌膚膚色更深之個體。

本發明進一步提供一種使用本發明之胜肽製備促進黑色素生成之組合物。該組合物包含本發明所提供的SEQ ID NO: 1及可接受的載體。該組合物之形式可包括軟膏、乳液、乳霜、凝膠、滴劑、噴霧、液劑、洗髮劑或護髮劑。

為讓本發明上述及/或其他目的、功效、特徵更明顯易懂，特舉具體實施例詳細說明於下。惟，本發明係經由下列實施例為進一步說明，但並非用以限制本發明的內容。

在本發明的方法之一實例中，該胜肽係局部地投予至該個體。

在另一方面，本發明提供一種用於促進生成黑色素的組合物，其包含有效量之具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的胜肽。該組合物係有效促進黑色素生成。

在本發明的特定具體實施例中，該組合物進一步包含一生理上可接受的載體。

除非另有定義，本文使用的所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域中的通常知識者所理解相同的含義。

用語「一」或「一個」在申請專利範圍及/或說明書中與術語「包含」一起使用時，其意思可為「一個」，但其亦與「一或多個」、「至少一個」以及「一或多於一個」的含義一致。

用語「胜肽」在本文中係以其常規含義而被使用，亦即為一種聚合物，其單體為胺基酸，並藉由醯胺鍵而互相連結在一起，另可選擇地，其係指多肽（polypeptide）。當該胺基酸為α-胺基酸時，可使用L-光學異構物或D-光學異構物。此外，亦可包含非天然的胺基酸，例如，β-丙胺酸、苯甘胺酸及高精胺酸。使用胺基酸的標準縮寫。

本文中所使用的術語「載體」係指一般用於調製可增進穩定性、無菌性、遞送性的藥物或化妝品組合物的材料。當胜肽遞送系統調製為一種溶液或懸浮液時，該遞送系統係於一可接受載體中，較佳地為水性載體。可使用多種水性載體，例如，水、緩衝液、0.8%鹽水、0.3%甘胺酸、透明質酸等。該組合物可含有如所需要而可接近生理條件的生理上可接受的輔助物質，例如pH調整及緩衝劑、溶液張力調節劑、潤濕劑及其類似物，例如，乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、山梨醇酐單月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。

用語「局部的」或「局部地」在本文中係以其常規含義而被使用，其係指可以在身體任何部位內或上的位置，包括但不限定於表皮、任何其他真皮、或任何其他身體組織。局部地投予或施予意指使該胜肽直接與組織接觸，例如含有黑色素生成細胞的皮膚、膜、毛囊。

本發明使用具有SEQ ID NO: 1之胜肽做為針對各種用途的活性成分。在一具體實施例中，本發明的胜肽係與一可接受的載體組合而形成一種可置放於毛髮或皮膚上的局部用製劑。局部用製劑可包括軟膏、乳液、糊劑、乳霜、凝膠、滴劑、塞劑、噴霧、液劑、洗髮劑、護髮劑、粉末及經皮貼片。根據需要，可使用增稠劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑。較佳地，載體的功能為增加本發明胜肽的皮膚滲透性，並且在體內條件下應能將該胜肽遞送至黑色素細胞。對於本領域技術人員而言，合適的載體為習知，且其包括但不限於水、二甲基亞碸、乙醇、脂質體、液體石蠟、石蠟、二甲基甲醯胺、2-吡咯烷酮、油酸、滲透增進劑。

通過以下實例進一步說明本發明，所述實例係以提供例示性之目的提供而非限制。細胞培養

解凍細胞

使用的細胞為B16F10小鼠色素瘤細胞株。開啟水浴槽使其溫度到達37℃，並準備已回溫（37℃）的培養液，從液態氮桶取出冷凍小管，並快速移至水浴槽解凍。將1 ml培養液加入冷凍小管內充分混勻，並吸取至15 ml離心管。接著以700-800 rpm/5分鐘離心該離心管，除去上清液後加入1 ml培養液使之混勻，再移到10 cm培養皿。接著補9 ml培養液到培養皿中，放置於37℃含5% CO₂ 的細胞培養箱。

細胞繼代

首先，先吸除10 cm培養皿中的培養液，再用1X PBS潤洗細胞兩次。於培養皿中央加1 ml的Trypsin-EDTA並輕搖培養皿使Trypsin-EDTA均勻覆蓋表面，接著放於培養箱5分鐘。拿出培養皿並輕拍，肉眼可觀察到黑色團塊（細胞）被打下。加1 ml培養液於該培養皿以中和Trypsin-EDTA作用，並將細胞收集至15 ml離心管。以700-800 rpm室溫離心2分鐘，移除上清液並輕拍管子，視實驗需求加適量培養液。最後將混勻的細胞懸浮液分配到新的培養容器，放回37℃含5% CO₂ 細胞培養箱中。

細胞計數

移除培養液的細胞經潤洗、Trypsin-EDTA和離心後懸浮在適量培養液中，取10 μl的細胞液至1.8 ml微量管，再注入到細胞計數器。在顯微鏡100倍視野下有九大格面積1 mm² ，深度為0.1 mm的正方形，因此總體積為0.1 mm³ = 1 × 10⁴ ml。選取其中兩格細胞分佈較平均做計數，將數值除以2再乘以10⁴ ，得出的數值即為1 ml細胞液中所含細胞數量。胜肽製備

胜肽序列為 DIHMKQV（SEQ ID NO: 1），其組成和純度由高效液相層析質譜儀做確認。以5 mg胜肽粉末溶在 0.1 ml的二次去離子水（50 mg/ml），並儲存在-20℃冰箱。黑色素含量分析

將 8×10³ 之B16F10細胞接種至 24孔盤，隔天加入濃度 1、2、5、10 μg/ml之SEQ ID NO：1的胜肽作用 72小時後移除培養液細胞經潤洗、 Trypsin-EDTA收集到 1.8 ml微量管，並以 2500 rpm室溫離心5分鐘。拍照記錄細胞團塊後，每管微量加入 200 μl的 2N NaOH，並在 100℃加熱器作用 1小時，以405 nm測吸光值。藉由比較測試樣品在405nm處的吸光值和使用合成黑色素獲得的標準曲線來分析黑色素含量。

其結果如圖1所示，細胞經離心後聚集成細胞團塊，顯示SEQ ID NO：1的胜肽係以濃度依賴的方式顯著地促使黑色素生成。控制組為未加入本發明之胜肽處理的組別；以磷酸二酯酶抑制劑（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）（100 μM）作為正控制組。

圖2為黑色素的含量分析。將細胞用2N的NaOH溶解後，測吸光值405 nm，實驗結果發現，濃度1和2 μg/ml處理的組別相較控制組會分別促進了31.2%及42.5 %的黑色素生成；而濃度5以及10 μg/ml則是更顯著地分別促進了55.6%和76.6 %的黑色素生成，且黑色素生成量會隨著胜肽濃度增加而增加。酪胺酸酶（ Tyrosinase ） 活性分析

將 4×10⁴ 之B16F10細胞接種至 6孔盤，隔天加入濃度 5、10 μg/ml之含SEQ ID NO：1的胜肽作用72小時後，吸除培養液後將細胞溶在 200 μl含1%Triton X-100的 phosphate buffer（pH 6.8），並收集到 1.8 ml微量管，置於-80℃中1小時後取出。待其解凍後以 14000 rpm/4℃離心 10分鐘。收集含蛋白質的上清液，並用 Bradford assay測定蛋白質濃度。取等量蛋白質在 96孔盤配成 100 μl的蛋白質液，接著每孔加 100 μl的5 mM L-DOPA，於 37℃培養箱中反應 30分鐘，再以 450 nm測吸光值。

結果如圖3所示，以5及10 μg/ ml量之SEQ ID NO：1的胜肽處理的細胞顯著增加酪胺酸酶活性。細胞存活率分析（ MTT assay ）

將 1×10³ 之細胞接種至 96孔盤，隔天加入濃度10、50、100、200 μg/ml之SEQ ID NO：1的胜肽作用 48小時後，加入 100 μl的Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide（MTT），使最終濃度為0.5 mg/ml。作用3小時後加入 100 μl含有 0.01 的HCl之10 % SDS。隔天確認結晶徹底溶解後，測定在550-630 nm下的吸光值。

結果如圖4所示，經SEQ ID NO：1的胜肽處理不影響B16F10細胞的存活力。

綜合上述可知SEQ ID NO：1的胜肽確實能夠刺激黑色素生成，並且增加個體內黑色素細胞中的黑色素含量，但並非由B16F10細胞之存活力的改善而引起。

無

圖1為細胞經離心後聚集成細胞團塊圖；圖2為黑色素（Melanin）含量分析結果（* P ＜0.05；** P ＜0.01）；圖3為酪胺酸酶活性分析結果；及圖4為細胞存活率之結果。

無

Claims

一種用於促進黑色素生成之單離或合成之胜肽，係由SEQ ID NO：1之序列所組成。
一種如請求項1所述之胜肽用於製備促進黑色素生成之組合物的用途。
如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該胜肽具有一使該黑色素顯著地生成之有效劑量。
一種組合物，包含如請求項1所述之胜肽，及一生物體可接受之載劑。
如申請專利範圍第4項所述之組合物，該組合物之形式包含軟膏、乳液、乳霜、凝膠、滴劑、噴霧、液劑、洗髮劑或護髮劑。