CN113633585A - 具有防脱发、生发及黑发功效的外用护发组合物、制剂及其制备方法 - Google Patents
具有防脱发、生发及黑发功效的外用护发组合物、制剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有防脱发、生发及黑发功效的外用护发组合物，由下述重量百分比的原料制成：纤连蛋白0.005～0.5％、生物素三肽‑10.001％～0.5％、烟酰胺0.1％～5％、三肽‑1铜0.005％～5％，还包括化妆品领域可接受的防腐剂及pH调节剂，余量为水。本发明中，核心配方及增效配方均可促进毛囊增长，增加新生毛发的长度、重量和直径，可增加毛发中氨基酸含量，使新生毛发质量更佳。配方之间协同起效增加产品渗透率，进而增强产品功效。本发明可以显著促进黑素瘤细胞的增殖作用，激活酪氨酸酶活性，对黑色素生成量有提升功效，证实本发明具有预防和减少白发生成的效果。本发明的配方中所使用的各原料安全无副作用，具有很好的应用前景和市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种外用护发组合物，具体地说是一种具有防脱发、生发及黑发功效的外用护发组合物及由该组合物制备得到的护肤添加剂及护发制剂。
背景技术
脱发的原因是复杂多样的，最常见的是雄性脱发(脂溢性脱发)，其主要原因是DHT(双氢睾酮)对毛囊的刺激。除此之外，还有多种复杂原因引发脱发，比如毛囊处微循环不足，头发休眠期延长，毛囊周围炎症，毛囊萎缩，皮下脂肪层减少，洗发剂、烫发剂、染发剂等使用不当也会损伤头皮和头发等，甚至过早出现白发等。
毛发的生长与脱落具有周期性。正常情况下，每一个毛囊内的头发生长遵循周期性的规律，生长期、退行期和休止期。针对毛发的生长规律和过程，以及脱发的复杂原因，防脱育发组合物需要从几个方面协同作用，包括降低DHT水平，增加毛囊处微循环，对抗毛囊炎症，增厚皮下脂肪，促进毛囊细胞增值，增大毛囊，促进毛囊从向生长期转化等。
目前，临床上防止脱发使用的主要是Minoxidil(米诺地尔)外擦，或者内服非那雄胺。这些产品长期使用多对头皮有刺激性或存在副作用，例如米诺地尔虽有较好的防脱表现，但临床试验有一些副作用，包括眼睛的灼热或刺激，治疗区域的过敏或者刺激，以及身体其他部位的不必要的毛发生长。并且，米诺地尔并没有被列入我国《已使用化妆品目录》，不能在日常护发产品中应用。市场上的其他防脱产品以及预防和治疗白发的产品大多以中草药提取物为主，其功效较为单一，作用机理有待深入研究，防脱发及生发效果不理想。现有防脱发剂或生发剂虽有一定的生发效果，但生发质量不理想，生发细软居多，不能达到使用者预期。
因此，获得防脱发及生发效果好、生发质量高且安全有效的护发产品，仍然是本领域技术人员研究的热点。
发明内容
本发明所要解决的首要技术问题在于提出一种具有防脱发及黑发功效的外用护发组合物。
本发明所要解决的另一技术问题在于提出一种上述外用护发组合物的制备方法。
本发明的发明思路为：
本发明通过补充天然蛋白质和多肽等激活毛囊细胞自身的修复能力，同时辅助以植物提取物，从多维度协同作用，防止脱发，强健毛囊，促进头发生长，加强新生发发质，预防和治疗白发。本发明选择纤连蛋白、生物素三肽-1、烟酰胺、三肽-1铜作为核心成分制备得到具有良好生发效果的生发剂。也可继续协以咖啡因、红参提取物、龙胆提取物，使各成分协同起效，强健毛囊，实现更好的防脱发、生发及黑发功效。
各成分功效简介如下：
纤连蛋白：纤连蛋白存在于多种动物细胞表面的大分子细胞外膜蛋白，是细胞外基质和基底膜中的主要非胶原性糖蛋白。在细胞黏附中起中心作用，可调节细胞极性、分化和生长。经局限性蛋白酶解可切割为几个结构域，可与血纤蛋白、肝素、胶原、DNA以及细胞表面受体等结合。纤连蛋白广泛参与细胞迁移、黏附、增殖、止血及组织修复等过程，调动单核吞噬细胞系统清除损伤组织处有害物质，具有生长因子作用。在毛囊生长期，纤连蛋白在真皮乳头，真皮鞘和基底膜中均匀表达，而进入休止期，纤连蛋白则大大减少。因此，发明人选择纤连蛋白参与毛囊生长周期的调节。皮肤表面有一层物质屏障，阻止了绝大多数大分子有效成分通过皮肤发挥作用。在这个组合物中，特别是纤连蛋白和多肽，透皮能力低，因而在头部皮肤屏障完整或部分完整情形下应用效果不佳。本发明优选使用透皮纤连蛋白，其自身携带“透皮增强肽”可以提升纤连蛋白透皮吸收效果。发明人经试验发现，透皮纤连蛋白的“透皮增强肽”不仅可以增强纤连蛋白的渗透性还可以促进本发明所述组合物中其他有效成分的透皮渗透，增强功效。
三肽-1铜：又名三胜铜肽，蓝铜胜肽。铜肽及其铜复合物可以作为组织重塑的激活剂和抗氧化剂，其也是一个信号肽，促进伤疤外部大量胶原蛋白集聚物的降解，皮肤正常胶原蛋白的合成、弹力蛋白、蛋白聚糖和葡萄胺聚糖的生成、不同细胞类型的生长速度和迁移、抗炎、抗氧化反应天然存在于人体中的多肽，具有多重作用。毛囊是皮肤多能干细胞的主要来源，干细胞的分化可以潜在地更新皮肤并恢复毛囊，发明人选择三肽-1铜用以修复干细胞，刺激毛发生成，抑制5-α-还原酶活性的活性，减少DHT的形成，改善血液微循环，对抗炎症和氧化，增大毛囊等作用。
烟酰胺：是细胞能量代谢的主要辅酶，在活细胞中，它能转化成烟酸，刺激和改善血液的微循环，是细胞能量因子，为一种新型的活发元素。发明人选择烟酰胺用于改善毛囊血液循环，增加细胞能量银子。
生物素三肽-1：生物素是动物机体许多酶的辅助因子，在改善物质代谢、提高动物繁殖性能、防治疾病等方面发挥重要作用，是动物机体维持正常生理机能必不可少的维生素之一。发明人选择生物素三肽-1用于促进皮肤及毛发的正常运作和生长，有效改善皮肤的炎症状况。头发的黑色素，是由毛囊中的黑色素细胞生成的。受损萎缩的毛囊不仅造成脱发，有的还会引发白发。同时，头发黑色素生成过程中起重要作用的酪氨酸酶是一种含铜酶，如果头发中缺乏铜会影响酪氨酸酶的活性，也会引起白发，上述组合，促进了毛囊的修复和再生，加强了毛囊营养，并且为毛囊补充了铜离子，也可以有效的预防和治疗白发。
除上述核心成分外，发明人还选择添加了植物提取物，协同增效。优选的植物提取物为红参提取物和龙胆提取物，主要利用人参皂苷和龙胆苦苷，促进毛发的生长和毛囊的强健，红参提取物和龙胆提取物中人参皂苷和龙胆苦苷的含量较多，有利于产品的增效，但其他含有人参皂苷和龙胆苦苷的提取物也可以用于本案。
红参提取物：红参中富含人参皂苷，糖类，蛋白质，黄酮类，氨基酸等，对毛发有很好的保护作用，特别是富含Rg2，Rg3，Rg5，Rk1等稀有人参皂苷。发明人选择红参提取物用于促进毛发从休止期向生长期的转变,并且增加毛囊的尺寸和深度，进而促进毛发的生长。
龙胆提取物：富含功效成分龙胆苦苷。发明人选择龙胆提取物用于对抗毛囊炎症，及其引发的头皮敏感，瘙痒。
咖啡提取物：在雄激素脱发(脂溢性脱发)的治疗中，咖啡因显示了很大的潜力。咖啡因是一种磷酸二酯酶抑制剂，它能增加细胞内的环磷酸腺苷水平，从而促进毛囊处细胞生长，对抗DHT诱导的毛囊小型化，防止脱发。同时，咖啡因具有很好的吸收和毛囊渗透性。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种具有防脱发及黑发功效的外用护发组合物，由下述重量百分比的原料制成：
纤连蛋白0.005～0.5％、生物素三肽-1 0.001％～0.5％、烟酰胺0.1％～5％、三肽-1铜0.005％～5％，还包括化妆品领域可接受的防腐剂及pH调节剂，余量为水。
一种上述外用护发组合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)常温配置，加入上述用量的生物素三肽-1、烟酰胺、三肽-1铜和所述防腐剂，在20～60转/分钟转速下搅拌至均匀；
(2)加入pH调节剂调节pH值至5.0～7.0，然后加入所述纤连蛋白，维持20～60转/分钟转速搅拌至均匀，注意操作需轻柔，避免产生泡沫，搅拌均匀出料即得。
上述配方为本发明的核心配方，该核心配方可以实现本发明所述功效。
在上述核心配方基础上，发明人又提出一种增效配方，如下所述，增效配方各组分之间协同起效，可以提升核心配方的功效。
一种其中较优地具有防脱发及黑发功效的外用护发组合物，由下述重量百分比的原料制成：
纤连蛋白0.005～0.5％、生物素三肽-1 0.001％～0.5％、烟酰胺0.1％～5％、三肽-1铜0.005％～5％、咖啡提取物0.01～5％、红参提取物1～5％、龙胆提取物1～10％，还包括化妆品领域可接受的防腐剂及pH调节剂，余量为水。
其中较优地，所述纤连蛋白为透皮纤连蛋白。
其中较优地，所述咖啡因为咖啡提取物,其中咖啡因含量不低于50％，这样保证咖啡提取物带入的咖啡因含量不低于0.005％，充分满足本案各成分之间协同增效的作用，咖啡因含量低于50％的情况也是可行的，功效较含量高于或等于50％的情况略差。
一种上述优选外用护肤组合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将上述用量的水加入真空搅拌锅中加热至50～60℃，加入所述咖啡提取物和防腐剂，保温搅拌至完全溶解；
(2)搅拌速度20～60转/分钟，冷却降温至40度以下，加入权利要求3所述重量百分比的生物素三肽-1、烟酰胺、三肽-1铜、红参提取物和龙胆提取物和防腐剂，搅拌均匀；
(3)加入pH调节剂调节pH值至5.0～7.0，然后加入所述纤连蛋白，维持20～60转/分钟转速搅拌至均匀，出料即得。
一种具有防脱发及黑发功效的外用护发制剂添加剂，其中，所述添加剂由上述方法制备得到。
上述添加剂在制备具有防脱发及黑发功效的外用护发制剂中的用途。
其中较优地，所述护发制剂为洗发水、护发素、发膜、精华液、喷雾或头皮护理营养液。
一种具有防脱发及黑发功效的外用护发制剂，其中，所述护发制剂含有上述添加剂，所述添加剂在所述护发制剂中的添加量为5～90％。本发明添加量在5％时即可实现本发明所述功效，随着添加量逐渐增加至90％，功效随之增加且呈线性增长。鉴于成本等多方面原因考虑，发明人推荐在制剂中较佳添加量为10％～30％。
上述制备方法为发明人推荐的较佳制备方法，也可以利用本领域技术人员公知的其他制备方法制备得到本发明所述添加剂。利用本发明所述添加剂及化妆品领域常规基质可以制备得到多种护发剂型，如洗发水、洗发膏护发素、发膜、头部精华液、头部喷雾、或头皮营养液等。
本发明所用防腐剂为本领域公知成分，可以选择本领域常规防腐剂，如己二醇、1,2-戊二醇、丙二醇、苯氧乙醇、对羟基苯乙酮、辛酰羟肟酸和甘油辛酸酯等化妆品中常见防腐剂，使用剂量符合化妆品领域要求即可。本发明使用的pH调节剂为本领域公知成分，可以选择本领域常规pH调节剂，如柠檬酸钠，盐酸，三乙醇胺，氢氧化钠，氢氧化钾等，使用剂量以体系pH值调节至5～7为止。
本发明所述制剂的推荐使用方法为：本发明所述护肤组合物直接施于人体头部皮肤，也可制成喷雾剂喷洒于人体头部皮肤表面，轻轻按摩直至吸收。连续使用3至6个月效果最佳。
本发明的有益结果如下：
本发明中，核心配方及增效配方经实验证实可以促进毛囊增长，进而促进新发生长。其中，核心配方及增效配方均可增加新生毛发的长度、重量和直径，可以增加毛发中氨基酸含量，使新生毛发质量更佳。配方之间协同起效增加产品渗透率，显著增加产品渗透吸收效果，进而增强产品功效。本发明可以显著促进黑素瘤细胞的增殖作用，激活酪氨酸酶活性，对黑色素生成量有提升功效，证实本发明具有预防和减少白发生成的效果。本发明的配方中使用的各个原料均安全无副作用，具有很好的应用前景和市场前景。
附图说明
图1为各组合对小鼠B16F1黑素瘤细胞的增殖作用示意图；
图2为各组合对小鼠B16F1黑素瘤细胞酪氨酸酶活力的影响示意图；
图3为各组合处理后细胞中黑色素的生成量比较示意图。
具体实施方式
本实施例所用原料均为本领域公知原料，可通过市售购买获得，符合化妆品领域原料标准。本发明使用原料的来源见表1，本发明所用的仪器名称及厂家见表2。
本实施例中所述的“常温”也叫一般温度或者室温，一般定义为25℃。化工工艺中常用AMB表示，即ambiance。我国工程上常温是按20℃计的，这是我国大多数地方春秋天的温度，如循水温度(自然水温)。
表1
表2
实施例1本发明所述外用护发组合物的制备
组分及用量见表3：
表3
| 序号 | 原料名称 | 含量(wt％) |
| 1 | 透皮纤连蛋白 | 0.005 |
| 2 | 生物素三肽-1 | 0.001 |
| 3 | 烟酰胺 | 0.1 |
| 4 | 三肽-1铜 | 0.005 |
| 5 | 防腐剂A631 | 0.5 |
| 6 | 柠檬酸 | 0.2 |
| 7 | 去离子水 | To100 |
制备方法：
(1)常温配置，加入生物素三肽-1、烟酰胺、三肽-1铜和预配防腐剂，20转/分钟搅拌至均匀；
(3)加入二水合柠檬酸三钠和柠檬酸搅拌至完全溶解，调节pH至5.0左右，然后缓慢加入所述纤连蛋白，维持20转/分钟搅拌至均匀，注意操作需轻柔，避免产生泡沫，搅拌均匀出料即得。
实施例2本发明所述外用护发组合物的制备
组分及用量见表4：
表4
制备方法：
(1)常温配置，加入生物素三肽-1、烟酰胺、三肽-1铜和防腐剂A631，40转/分钟搅拌至均匀；
(2)加入二水柠檬酸三钠和柠檬酸搅拌至完全溶解，调节pH至6.0左右，然后缓慢加入所述纤连蛋白，维持40转/分钟搅拌至均匀，注意操作需轻柔，避免产生泡沫，搅拌均匀出料即得。
实施例3本发明所述外用护发组合物的制备
组分及用量见表5：
表5
| 序号 | 原料名称 | 含量(wt％) |
| 1 | 透皮纤连蛋白 | 0.5 |
| 2 | 生物素三肽-1 | 0.5 |
| 3 | 烟酰胺 | 5 |
| 4 | 三肽-1铜 | 5 |
| 5 | 防腐剂A631 | 0.5 |
| 6 | 二水合柠檬酸三钠 | 0.3 |
| 7 | 柠檬酸 | 0.2 |
| 8 | 去离子水 | To100 |
制备方法：
(1)常温配置，加入生物素三肽-1、烟酰胺、三肽-1铜和防腐剂A631，60转/分钟搅拌至均匀；
(2)加入二水合柠檬酸三钠和柠檬酸搅拌至完全溶解，调节pH至7.0左右，然后缓慢加入所述纤连蛋白，维持60转/分钟搅拌至均匀，注意操作需轻柔，避免产生泡沫，搅拌均匀出料即得
实施例4本发明所述外用护发组合物的制备
组分及用量见表6：
表6
| 序号 | 原料名称 | 含量(wt％) |
| 1 | 透皮纤连蛋白 | 0.005 |
| 2 | 生物素三肽-1 | 0.001 |
| 3 | 烟酰胺 | 0.1 |
| 4 | 三肽-1铜 | 0.005 |
| 5 | 咖啡提取物 | 0.01 |
| 6 | 红参提取物 | 1 |
| 7 | 龙胆提取物 | 1 |
| 8 | 防腐剂A631 | 0.5 |
| 9 | 二水合柠檬酸三钠 | 0.3 |
| 10 | 柠檬酸 | 0.2 |
| 11 | 去离子水 | To100 |
制备方法：
(1)取余量去离子水，加入真空搅拌锅中，加热到50℃，加入咖啡提取物粉末，50转/分钟，保温搅拌至完全溶解；
(2)降低搅拌速度至30转/分钟，并冷却降温至40度以下，缓慢加入生物素三肽-1、烟酰胺、三肽-1铜、红参提取物和龙胆提取物及防腐剂A631，缓慢搅拌至均匀；
(3)加入pH调节剂，搅拌至完全溶解，调节pH至5.0左右，降温到40度以下，然后缓慢加入透皮纤连蛋白，维持30转/分钟搅拌，注意操作需轻柔，避免产生泡沫，搅拌均匀，出料，分装即得。
实施例5本发明所述外用护发组合物的制备
组分及用量见表7：
表7
制备方法：
(1)取余量去离子水，加入真空搅拌锅中，加热到55℃，加入咖啡提取物粉末，50转/分钟，保温至完全溶解；
(2)降低搅拌速度至20转/分钟，并冷却降温至40度以下，缓慢加入生物素三肽-1、烟酰胺、三肽-1铜、红参提取物、龙胆提取物及防腐剂A631，缓慢搅拌至均匀；
(3)加入pH调节剂，搅拌至完全溶解，调节pH至6.0左右，然后缓慢加入透皮纤连蛋白，维持20转/分钟搅拌，注意操作需轻柔，避免产生泡沫，搅拌均匀，出料，分装即得。
实施例6本发明所述外用护发组合物的制备
组分及用量见表8：
表8
| 序号 | 原料名称 | 含量(wt％) |
| 1 | 透皮纤连蛋白 | 0.5 |
| 2 | 生物素三肽-1 | 0.5 |
| 3 | 烟酰胺 | 5 |
| 4 | 三肽-1铜 | 5 |
| 5 | 咖啡提取物 | 5 |
| 6 | 红参提取物 | 5 |
| 7 | 龙胆提取物 | 10 |
| 8 | 防腐剂A631 | 0.5 |
| 9 | 二水柠檬酸三钠 | 0.3 |
| 10 | 去离子水 | To100 |
制备方法：
(1)取余量去离子水，加入真空搅拌锅中，加热到60℃，加入咖啡提取物粉末，50转/分钟，保温至完全溶解；
(2)降低搅拌速度至60转/分钟，并冷却降温至40度以下，缓慢加入生物素三肽-1、烟酰胺、三肽-1铜、红参提取物、龙胆提取物及防腐剂A631，缓慢搅拌至均匀；
(3)加入pH调节剂，搅拌至完全溶解，调节pH至7.0左右，然后缓慢加入透皮纤连蛋白，维持60转/分钟搅拌，注意操作需轻柔，避免产生泡沫，搅拌均匀，出料，分装即得。
实施例7本发明所述喷雾剂的制备(含有实施例6的喷雾剂)
表9
| 序号 | 原料名称 | 含量(wt％) |
| 1 | 实施例6制备提取物 | 10 |
| 2 | 1,3-丁二醇 | 2 |
| 3 | 薄荷脑 | 0.03 |
| 4 | D-泛醇 | 0.5 |
| 5 | 乙醇 | 2 |
| 6 | 防腐剂A631 | 0.4 |
| 7 | 柠檬酸 | 0.2 |
| 8 | 去离子水 | To100 |
制备方法：
(1)将薄荷脑加入1,3-丁二醇，常温下混合,搅拌至薄荷脑完全溶解，得到薄荷脑溶液，待用；
(2)常温配置，加入配置好的薄荷脑溶液，D-泛醇，乙醇和防腐剂A631，60转/分钟搅拌至均匀；
(3)加入pH调节剂，搅拌至完全溶解，调节pH至5.0左右，然后缓慢加入实施例6添加剂，维持60转/分钟搅拌，注意操作需轻柔，避免产生泡沫，搅拌均匀出料即得。
本发明的功效实验
一、配方筛选实验：
1.入组成分及配伍
入组成分配方及用量见表9。
制备方法：常温配置，按照所述重量百分比将除纤连蛋白的其他成分及防腐剂在30转/分钟转速下搅拌至均匀；
(2)加入所述pH调节剂调节pH至6.0左右，然后加入所述纤连蛋白，维持转速搅拌至均匀，出料即得。
表10
2.对上述配方进行小鼠触须毛囊培养测试：
(1)小鼠触须毛囊的分离：取出生一周的SPF级乳鼠，雄性，体重5.0～7.0g。断脊椎处死小鼠，无菌条件下剪取双侧胡须垫，解剖显微镜下将毛囊与周围组织钝性分离，选取完整生长期早期毛囊(毛乳头大、光滑圆润、真皮组织鞘完整且与外皮根鞘无分离者用于培养。
(2)离体毛囊的培养：在24孔培养板培养毛囊。每孔1个毛囊，并加入0.5mLWilliamsE无血清培养基，每组6复孔，在37℃、5％CO2条件下培养，24h后选取生长明显的毛囊≧(0.1mm)加入10％实验组制剂(将实验组制剂用去离子水稀释并过滤)继续培养8d，无需换液。分别于培养的第1d和第8d，在立体显微镜下，通过目镜标尺测量毛囊底部到毛发顶部的长度，两次测量结果相减为毛囊生长长度，并计算出毛囊增长率。
表11各组毛囊培养第8天毛囊增长率
| 编号 | 毛囊增长率(％) |
| 对比例 | 15.8+3.15 |
| 实验组1 | 30.0+3.18** |
| 实验组2 | 65.2+5.12** |
| 实验组3 | 60.2+5.12** |
| 实验组4 | 80.8+3.98** |
| 实验组5 | 156+6.02** |
| 实验组6 | 212+4.06** |
注：**表明与对照组相比有显著性差异，且差异为促进毛囊生长
由上表中的实验结果可以看出，棕榈酰三肽-1、六肽-11、透明质酸具有促进细胞增殖和层粘连蛋白合成，修复头皮受损细胞，保护胶原蛋白等作用。但是在此配方筛选中，它们对于毛囊生长的影响不如透皮纤连蛋白，三肽-1铜，生物素三肽-1和烟酰胺的组合，即本发明的技术方案。本发明的技术方案相较其他配方显示了更优异的促进毛囊增长的效果，并且呈现计量相关性。发明人利用本发明其他实施例重复上述实验结论同上述。
3.基于上述实验组5，添加不同剂量的咖啡因提取物、红参提取物和龙胆提取物，测试其对小鼠毛发长度的影响。
添加剂量及分组见表12。
表12
(1)取C57BL/6小鼠100只按体重编号，分为五组：空白对照组(涂抹对比例)，阳性对照组(2％米诺地尔溶液)实验组5、7、8(涂抹试验组)，每组10只。6％硫化钠溶液处理小鼠背部约2cm×3cm区域，脱毛后该区域无毛发，皮肤无破损，光滑无水肿。
(2)次日，将对比例，实验组5，实验组7，实验组8，以及对照(米诺地尔喷雾)组溶液分别涂抹于对应组别老鼠的脱毛区，每日2次，每次0.1mL/只，连续19日。
(3)于第20日在每鼠脱毛区拔毛10根，显微镜下测量其长度，取10根毛平均长度代表每只鼠的毛长，并求出各组小鼠毛长的均值。同时，在电子显微镜下测量毛发的直径，取10根毛发的平均直径代表每只鼠的毛发直径。在组间处理采用t检验判断均数差异的显著性，p＜0.05表示组间差异有统计学意义。
(4)随后处死小鼠，将背部脱毛区毛皮剪下，用14mm打孔器于每鼠脱毛区相同位置取圆形皮片，用手术刀刮下皮片上所有体毛，精密称定毛发重量。之后，将这些毛发用盐酸将头发中角蛋白水解成氨基酸，再经Waters AccQ-Fluor衍生剂衍生后，通过HPLC检测17种氨基酸含量。新生毛发的好坏取决于毛发的结构和组分。毛发的主要组成是角蛋白，角蛋白的基本单位是氨基酸。这些氨基酸的含量会影响毛发的质量，比如毛发的软硬度，粗细程度等。我们通过测量新生毛发中氨基酸的含量，以及新生毛发的直径来评价各组合物对新生毛发质量的影响。
(5)取脱毛区皮肤组织，10％甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察毛囊组织学变化并对毛囊进行形态学分期。依据国际毛发周期评分法，对各期毛囊作以下评分：生长Ⅵ期为100分，退行早期为200分，退行中期为300分，退行晚期为400分。每只小鼠随机选择10个毛囊，确定各组毛囊所处的周期，计算平均毛发周期评分。
表13第20天时，测试各组对小鼠毛发长度、重量、直径和生长周期的影响
*表示：与对比例比较，P＜0.05
结果显示，与空白组(对比例)对比，各实验组均明显增加了小鼠毛发的长度和重量，降低了毛囊周期评分，延长其生长期，效果接近甚至略超过2％米诺地尔溶液(米诺地尔是被美国FDA批准的防脱药物，在防脱测试中经常被作为阳性对照)。可以显示出，本发明不仅具有促进毛囊增长的功效，可以有效延长毛发生长期，在防脱及生发的基础上，显著增加新生毛发的质量，即本发明生发的毛发长度、毛发重量及毛发直径均有很好的提升。其中，在实验组5的基础上，实验组7和8比实验组5添加了咖啡提取物、红参提取物和龙胆提取物，协同核心成分起效，对小鼠毛发生长有进一步增效促进作用。使用米诺地尔和实施例5,7,8，毛发周期评分为170-180，提示毛囊处于生长VI期和退行早期。而对比例毛发周期评分为288分，对应于毛囊处于退行中晚期。提示本发明可以明显延长毛囊生长期，促进毛发生长。发明人利用本发明其他实施例重复上述实验结论同上述。
表14第20天时测试各组处理小鼠新生毛发中氨基酸含量(％)
脱发者毛囊会越来越小，导致头发变细软。消费者使用大多数市售的防脱发产品后，经常反映新生发和正常头发相比，更细软易脱落。表11和表12结果显示，本发明所述产品使用后，新生毛发长度、重量和直径显著提高，氨基酸含量更高，提示发质更好。说明本发明可以从多个维度强效修复毛囊，激活毛囊细胞活力，增大毛囊，同时改善毛囊处的血液微循环，多效合一促进毛囊处的生发活力和营养，因此新生的毛发直径更粗，氨基酸含量更高，发质更好。发明人利用本发明其他实施例重复上述实验结论同上述。
4.Franz扩散池透皮吸收实验测试对有效物的渗透吸收
(1)将制备好的鼠皮用铁夹子固定在两室扩散池之间，向垂直扩散池的接受池内加入5mL PBS，搅拌速度为400r·min－1，水温(37±0.1)℃。向3个供给池内分别加入1毫升水，对照溶液(实验组8去除透皮纤连蛋白)，以及实验组8溶液，以保鲜膜封住。当样品渗透8h时，在接收槽中从接收槽中收集样品，离心后用ICP-OES(感应耦合等离子体发射光谱)法测试铜离子的浓度，以铜离子的渗透率来表征透皮纤连蛋白中透皮技术，对于以三肽-1铜的促渗作用。同时，取离心后样品用高效液相色谱法测定烟酰胺和龙胆苦苷的浓度。
表15铜离子、烟酰胺和龙胆苦苷的透皮吸收测试结果
结果显示，与对照溶液相比，当添加透皮纤连蛋白后，蓝铜肽、烟酰胺和龙胆苦苷的渗透率分别显著提高了9倍、12倍和7倍左右，提示这些功效成分的利用率随之升高，整个配方的防脱功效也会协同增强。之前有报道透皮纤连蛋白自身携带的透皮序列目的是用以提高大分子纤连蛋白的渗透率，但是其对化妆品配方中其他组分渗透率的影响未有研究。发明人基于化妆品成分的分子量，分子形状及亲水亲油性等物理化学性质，选择与透皮纤连蛋白复配可被透皮序列协同促渗效果最佳的成分，此次研究对于更好的发挥透皮纤连蛋白对整个配发的促渗作用，事半功倍的提升产品技术功效、优化化妆品配方和成本有很重要的意义。
发明人利用本发明其他实施例重复上述实验结论同上述。
5.测试本发明所述组合物对黑色素细胞增殖、酪氨酸酶活力、以及黑色素生成的影响
(a)各组合对B16F1黑色素瘤细胞增值的影响
培养小鼠B16F1黑素瘤细胞，使用甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)来检测黑素细胞的增殖状况。用含有10％的对比例，实验组5和实验组8的培养液分别处理体外培养的黑素瘤细胞，在处理细胞24h、48h、72h、96h之后，用MTT法来检测药物对细胞增殖的效果。结果见图1所示，从图1结果可以看出，实验组5和8具有显著的促进小鼠B16F1黑素瘤细胞的增殖的作用。
(b)各组合对酪氨酸酶活力的影响
将配制的小鼠B16F1黑素瘤细胞悬液加入96孔培养板，观察到细胞呈贴壁生长后，分别加入含有10％的对比例，实验组5和实验组8的培养基培养1d后，倒掉培养基，用pH 7.4的磷酸缓冲液洗涤2次，每孔加1％Triton X-100溶液50μl，迅速降温到-30℃冻存1h后，在室温下融化使细胞全部破裂，每孔加入100μl的1％L-DoPA溶液，37℃条件下反应2h，酶标仪测定495nm波长下的吸光度值。以不含有各测试组的培养液为对照组每个测试样品设立3个重复，取平均值。
结果见图2，从图2结果可以看出，实验组5和8对酪氨酸酶的活力有显著的激活作用。实验组5和8之间没有显著的区别，表明添加咖啡提取物、红参提取物和龙胆提取物并没有进一步激活酪氨酸酶的协同效应。
(c)各组合对B16F1细胞中黑色素生成的影响
将B16F1黑素瘤细胞培养至对数期，以1×104个/cm2加入6孔的细胞培养板，1天后更换培养液，细胞呈贴壁生长状态后，在细胞培养板中分别加入含有10％的对比例，实验组5和实验组8的培养液，1mL/孔。培养72h后，用含有胰蛋白酶的消化液消化细胞6-8min，然后收集细胞加入用NaOH裂解法裂解细胞，完全溶解出黑色素颗粒，在96孔板中用酶标仪测定465nm波长下的吸光度值。黑色素的含量以加各测试溶液的A465值除以无任何测试组的培养液的A465值的百分率来表示。
结果如图3所示，图3结果可以看出，实验组5和实验组8有上调黑色素生物合成量的功效，细胞中黑色素生成量有了明显的提高。相比实验组5，添加了咖啡提取物，红参提取物和龙胆提取物后，黑色素的生成量有了进一步的提高。
综合上述三个实验结果，可以看出实验组5和8显著提高了黑色素细胞的增值，酪氨酸酶的活力和黑色素的生成量，从而使头发由毛囊道发尾转黑，预防和减少白发生成。
Claims (10)
1.一种具有防脱发、生发及黑发功效的外用护发组合物，其特征在于由下述重量百分比的原料制成：
纤连蛋白0.005～0.5％、生物素三肽-1 0.001％～0.5％、烟酰胺0.1％～5％、三肽-1铜0.005％～5％，还包括化妆品领域可接受的防腐剂及pH调节剂，余量为水。
2.一种权利要求1所述外用护发组合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)常温配置，按照权利要求1所述重量百分比将所述生物素三肽-1、所述烟酰胺、所述三肽-1铜和所述防腐剂，在20～60转/分钟转速下搅拌至均匀；
(2)加入所述pH调节剂调节pH至5.0～7.0，然后加入所述纤连蛋白，维持20～60转/分钟转速搅拌至均匀，出料即得。
3.一种具有防脱发、生发及黑发功效的外用护发组合物，其特征在于由下述重量百分比的原料制成：
纤连蛋白0.005～0.5％、生物素三肽-1 0.001％～0.5％、烟酰胺0.1％～5％、三肽-1铜0.005％～5％、咖啡提取物0.01～5％、红参提取物1～5％、龙胆提取物1～10％，还包括化妆品领域可接受的防腐剂及pH调节剂，余量为水。
4.如权利要求1或3所述的外用护发组合物，其特征在于：
所述纤连蛋白为透皮纤连蛋白。
5.如权利要求1或3所述的外用护发组合物，其特征在于：
所述咖啡提取物中，咖啡因含量为不低于50％。
6.一种权利要求3所述外用护肤组合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将权利要求3所述重量百分比的水加入真空搅拌锅中加热至50～60℃，加入所述咖啡提取物保温搅拌至完全溶解；
(2)搅拌速度20～60转/分钟，冷却降温至40度以下，加入权利要求3所述重量百分比的生物素三肽-1、烟酰胺、三肽-1铜、红参提取物、龙胆提取物和防腐剂，搅拌均匀；
(3)加入pH调节剂调节pH值至5.0～7.0，然后加入所述纤连蛋白，维持20～60转/分钟转速搅拌至均匀，出料即得。
7.一种具有防脱发、生发及黑发功效的外用护发制剂添加剂，其特征在于由权利要求2或6所述方法制备得到。
8.权利要求7所述外用护发制剂添加剂在制备具有防脱发、生发及黑发功效的外用护发制剂中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于：所述外用护发制剂为洗发水、护发素、发膜、精华液、喷雾或头皮护理营养液。
10.一种具有防脱发、生发及黑发功效的外用护发制剂，其特征在于：
所述外用护发制剂含有权利要求7所述外用护发制剂添加剂，所述外用护发制剂添加剂在所述外用护发制剂中的添加量为5～90％。
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