WO2020050427A1 - 아디포넥틴 유래 펩티드 및 이를 포함하는 피부노화 방지 또는 피부주름 개선용 조성물 - Google Patents

아디포넥틴 유래 펩티드 및 이를 포함하는 피부노화 방지 또는 피부주름 개선용 조성물 Download PDF

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adiponectin
present
peptide
derived
skin
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정진호
김은주
이동훈
김연경
김지은
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(주)정진호이펙트
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    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a peptide fragment or small peptide derived from adiponectin and a composition for preventing skin aging or improving skin wrinkles comprising the same.
  • Skin aging is often caused by external and internal processes related to increased wrinkles, sagging, and sagging. External aging is usually referred to as 'photoaging' because it is mainly caused by repeated exposure to ultraviolet rays (UV). . Naturally aged skin is smooth, pale, and has fine lines, but photo-aged skin has thick skin lines and causes pigmentation and telangiectasia.
  • UV ultraviolet rays
  • MMP matrix metalloproteinases
  • Subcutaneous fat plays an important role in maintaining energy homeostasis by secreting adipokine and hormones that regulate metabolism of other tissues. Recently, fat content in human subcutaneous tissue is reduced by UV, an environmental factor that causes various diseases such as photoaging, inflammation, immune suppression, and cancer, and adiponectin, a fat-derived product, has been reduced in aged skin, and MMP-1 It is known that the increase and decrease of collagen are induced.
  • Extracellular matrix such as collagen I, III (Type I, III collagen), elastin, and fibronectin present in the skin in order to maintain its elasticity and strength without regeneration or destruction of the connective tissue of the skin.
  • ECM Extracellular matrix
  • Natural aging or chronic exposure to UV rays reduces the loss of ECM protein and the elasticity and strength of the skin tissue, and these phenomena are strongly associated with characteristic skin aging such as skin wrinkle formation.
  • Substrate metalloproteinase acts as an important enzyme in degrading dermal ECM. Under stress conditions such as UV irradiation, overexpression of MMP in keratinocytes and dermal fibroblasts contributes to decomposition of ECM proteins, thereby forming skin wrinkles on the skin.
  • adiponectin is a type of adipocaine, a protein hormone specifically secreted by fat cells. It improves insulin function and induces insulin resistance, thereby regulating cardiovascular diseases such as hyperglycemia, hyperinsulinemia, obesity, and atherosclerosis. Plays an important role in adiponectin has a function of suppressing metastasis and inflammatory reactions of cancer cells. Adiponectin not only promotes keratinocyte proliferation, but also promotes the expression of filarggrin, hyaluronic acid and extracellular matrix in the skin, thereby performing functions such as wound healing, suppressing fibrosis, improving skin wrinkles, and moisturizing (Korea) Published Patent Publication No. 10-2015-0032401).
  • Adiponectin consists of 244 amino acids and consists of a signal sequence, a collagen-like domain located at the N-terminal and a C1q-like globular domain located at the C-terminus.
  • the hexamer and the 400 kDa polymer complex are the major oligomers, and the polymer complex is known to have higher activity than the low molecular complex (LMW complex).
  • adiponectin-derived peptides which have been known to have various physiological activities, has been the target of many researchers and pharmaceutical companies at home and abroad, but the possibility of final success is relatively low due to difficulty in forming polymers in the body. Therefore, there is a need to develop a short peptide derived from adiponectin that can be applied to the skin and has excellent physiological activity.
  • An object of the present invention is to provide a composition for preventing skin aging or improving skin wrinkles containing adiponectin-derived peptide.
  • the present invention provides an adiponectin derived peptide for preventing skin aging or improving skin wrinkles selected from the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 21.
  • the present invention provides a cosmetic composition or pharmaceutical composition for preventing skin aging or improving skin wrinkles containing at least one of adiponectin-derived peptides selected from the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 21 as an active ingredient. .
  • the skin aging may be photoaging or natural aging, and the photoaging may be due to UV exposure, but is not limited thereto.
  • the adiponectin-derived peptide may be contained in a cosmetic composition or pharmaceutical composition at a concentration of 0.001 to 20 mM, but is not limited thereto.
  • the cosmetic composition may be selected from the group consisting of lotion, essence, lotion, cream, pack, gel, ointment, patch or spray formulation, but is not limited thereto.
  • the present invention prevents skin aging comprising the step of treating or administering to a subject at least one of adiponectin-derived peptides selected from the group consisting of a pharmaceutically or cosmetically effective amount of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 21. Or it provides a method for improving skin wrinkles.
  • the individual may be a human, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a novel peptide derived from adiponectin having the effect of preventing skin aging and improving skin wrinkles, the peptide inhibits the expression of MMP and pro-inflammatory cytokines in human skin cells and in vivo, and expresses procollagen. Since it increases, it can improve skin wrinkles and elasticity according to skin aging and can be effectively used as an effective substance of an anti-aging composition.
  • FIG. 1 is a photograph showing the skin permeability test results of the peptide derived from adiponectin of the present invention.
  • Figure 2 is a graph showing the effect of the adiponectin-derived peptide of the present invention on the expression of adiponectin in mouse adipocytes, 'CNT' represents a normal control.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of the adiponectin-derived peptide of the present invention on the activity of AMPK in mouse adipocytes, 'CNT' represents a normal control.
  • Figure 4 is a graph showing the effect of the adiponectin-derived peptide of the present invention on the activity of AMPK in human adipocytes, 'CNT' represents a normal control.
  • FIG. 5 is an electrophoresis photograph showing the effect of the adiponectin-derived peptide of the present invention on the expression of procollagen in human-derived fibroblasts
  • C is a control
  • V is a vehicle
  • AQ is adiponectin of full length
  • gAQ is spherical Adiponectin.
  • Figure 6 is an electrophoresis photograph showing the effect of the adiponectin-derived peptide of the present invention on the expression of MMP-1 in human-derived fibroblasts
  • C is a control
  • V is a vehicle
  • P1 ', P2', etc. are four of the present invention It shows the peptide derived from adiponectin of amino acid length.
  • V represents the control group, P9, P10, etc., the adiponectin-derived peptides 9 and 10 of the 5 amino acid length of the present invention, c1 represents 5 ng / ml, and c2 represents 5 ⁇ g / ml.
  • FIG. 8 is a photograph showing the effect of the adiponectin-derived peptide of the present invention on the development of erythema in the human body.
  • 9A to 9C are immunohistochemistry and Western blot electrophoresis pictures showing the effects of the adiponectin-derived peptide of the present invention on the expression of adiponectin and phosphorylation of AMPK in the human body.
  • 10A to 10C are immunohistochemistry and Western blot electrophoresis pictures showing the effect of the adiponectin-derived peptide of the present invention on the expression of TNF- ⁇ , procollagen type I and elastic fibers in the human body.
  • Figure 11 shows the crystal structure for the structural position of the adiponectin peptide of the present invention in the adiponectin protein.
  • the present invention prevents skin aging or wrinkles containing any one or more of adiponectin-derived peptides and adiponectin-derived peptides selected from the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 21.
  • a cosmetic composition or pharmaceutical composition for improvement is provided.
  • the peptide derived from adiponectin of the present invention is a peptide fragment having a length of 4 amino acids (4-mer) or 5 amino acids (5-mer) derived from adiponectin, and has an amino acid sequence shown in Table 1 below.
  • skin wrinkles refers to skin wrinkles formed on the skin without limitation, which are skin wrinkles caused by intrinsic and external factors, for example, skin wrinkles accompanying skin photoaging due to ultraviolet stimulation.
  • the prevention of skin aging refers to the action of inhibiting skin aging by photoaging or natural aging, but the skin aging is particularly preferably photoaging by UV exposure.
  • the skin wrinkles may be by photoaging or natural aging, more preferably by photoaging, and more preferably photoaging by UV exposure, but are not limited thereto.
  • the peptide is preferably contained in a concentration of 0.001 to 20 mM in the cosmetic composition, and more preferably contained in a concentration of 0.01 to 10 mM, but is not limited thereto. If the concentration of the peptide is less than 0.001 mM, it is difficult to obtain an anti-aging and skin wrinkle improvement effect, and when it exceeds 20 mM, there is no obvious increase in effect due to an increase in content, and thus there is a problem in that production economics is poor.
  • the peptides of the present invention can be prepared by general chemical synthesis, for example, solid-phase peptide synthesis, and cultured with a recombinant vector containing a nucleic acid encoding the peptide to transform the microorganism.
  • the peptide may be expressed and then purified by a conventional method, but is not limited thereto.
  • the cosmetic composition according to the present invention may contain, in addition to the above peptides, other ingredients that can give a synergistic effect to the effects of the peptides, within a range that does not impair the desired effect of the present invention.
  • the cosmetic composition of the present invention may include conventional adjuvants such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and fragrances, or carriers.
  • the cosmetic composition of the present invention is not particularly limited in its formulation, and may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art, for example, solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions , Powder, soap, surfactant-containing cleansing, oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray, and the like. On the other hand, it can also be prepared in the form of a lotion, essence, lotion, cream, pack, gel, ointment, patch or spray.
  • the formulation of the cosmetic composition is a paste, cream or gel
  • animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide are used as carrier components.
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder can be used as a carrier component, especially in the case of a spray, additionally chlorofluorohydrocarbon, propane / And propellants such as butane or dimethyl ether.
  • a solvent, solubilizing agent or emulsifying agent may be used as a carrier component, for example, water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, Propylene glycol, 1,3-butylglycol oil, glycerol aliphatic esters, polyethylene glycol or fatty acid esters of sorbitan.
  • liquid diluents such as water, ethanol or propylene glycol as carrier components
  • suspensions such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, micro Crystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracant, etc.
  • surfactant-containing cleansing can be used, and in the case of surfactant-containing cleansing, as a carrier component, aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate , Imidazolinium derivatives, methyltaurate, sarcosinate, fatty acid amide ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters, etc. To be used There.
  • the adiponectin-derived peptide of the present invention has remarkably excellent permeability to the skin (see FIG. 1), increases the expression of adiponectin in adipocytes (see FIG. 2), and is also derived from mice and humans. Can significantly increase the AMPK activity associated with the activity of adiponectin receptors in adipocytes (see FIGS. 3 and 4).
  • the adiponectin-derived peptide of the present invention increases the expression of procollagen decreased by TNF ⁇ (see FIG. 5), and decreases the expression of MMP-1 increased by TNF ⁇ (FIG. 6), and can also increase the expression of anti-inflammatory cytokines while reducing the expression of inflammatory cytokines increased by TNF ⁇ (see FIG. 7).
  • the novel adiponectin-derived peptide of the present invention not only suppresses skin aging phenomenon, but also suppresses MMP expression and activity and improves the expression of procollagen, thus contributing to improving skin wrinkles and elasticity.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition for preventing skin aging or improving skin wrinkles is skin, oral cavity, intravenous, intramuscular, intraarterial, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or Rectal is included, and oral or parenteral administration is preferred, but not limited to.
  • the 'parenteral' includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intralesional injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar function to the adiponectin derived peptide according to the present invention.
  • the composition may be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to a conventional method.
  • Solid preparations for oral administration include powders, granules, tablets, capsules, soft capsules, pills, and the like.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration include external preparations and sterile injections such as powders, granules, tablets, capsules, sterilized aqueous solutions, liquids, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, syrups, suppositories, aerosols, etc.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • injectable esters such as ethyl oleate.
  • composition may further contain preservatives, stabilizers, hydration or emulsification accelerators, adjuvants such as salts and / or buffers for osmotic pressure control, and other therapeutically useful substances, which are conventional methods of mixing, granulating or It can be formulated according to the coating method.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be variously changed according to various factors including the age, weight, general health, sex, administration time, administration route, discharge rate, drug combination, and severity of a specific disease.
  • the pharmaceutical composition containing the peptide of the present invention as an active ingredient is formulated in a unit dose form, it is preferable to contain the peptide of the present invention as an active ingredient in a unit dose of about 0.01 to 1,500 mg, and for adult treatment
  • the required dosage is usually, but not limited to, about 1 to 500 mg per day depending on the frequency and intensity of administration.
  • a single dose usually would be sufficient for a total dose of about 5 to 300 mg per day, but for some patients a higher daily dose may be desirable.
  • composition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormonal therapy, chemotherapy, and biological response modifiers.
  • the present invention prevents skin aging comprising the step of treating or administering to a subject at least one of adiponectin-derived peptides selected from the group consisting of a pharmaceutically or cosmetically effective amount of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 21. Or it provides a method for improving skin wrinkles.
  • the pharmaceutically or cosmetically effective amount is 0.0001 to 100 mg / kg, preferably 0.001 to 10 mg / kg, but is not limited thereto.
  • the treatment or dosage may be adjusted according to the weight, age, sex, health status, diet, administration period, administration method, elimination rate, disease severity, etc. of a specific patient. Treatment or administration may be administered once a day, or may be carried out in several times.
  • the object is a vertebrate animal, preferably a mammal, more preferably a human or a laboratory animal such as a rat, rabbit, guinea peak, hamster, dog, cat, and most preferably human, but is not limited thereto. .
  • the treatment or administration method may be applied, oral or parenteral administration, and when administered parenterally, intraperitoneal injection, rectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intrauterine epidural injection, cerebrovascular injection or chest It can be administered by my injection.
  • HATU N-[(dimethylamino-)-1H-1,2,3-triazolo [4,5-b] pyridin-1-yl-methylene] -N-methylmethaneamini from the next step Fmoc amino acid Um hexafluorophosphate N-oxide) and 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt) or HBTU (N-[(1H-benzotriazol-1-yl) (dimethylamino) methylene] -N-
  • the chain of peptides was extended by performing coupling using methylmethanealuminum hexafluorophosphate N-oxide) and DIEA (N, N-diisopropylethylamine) together with hydroxybenzotriazole (HOBt).
  • the crude peptide obtained by the above method was confirmed by using RP-HPLC (2996 Detector, 515 Pump, Waters) as a gradient solvent composition of acetonitrile and water containing 0.1% TFA, and confirming purity. As a result, less than 95% of the peptide was separated and purified by Prep-LC to obtain more than 97% of the peptide. As a result of elemental analysis with an elemental analyzer (EA1112, CE Instrument, Italy) to confirm the exact component of the peptide, it was confirmed that the content of each element of the peptide is identical to the content of each element obtained by calculating from the amino acid sequence. Did.
  • Adiponectin is also broken down into smaller units containing a globular domain, and subunits having a globular domain have a higher activity than adiponectin having a full length, and these receptors for adiponectin include adiponectin receptor 1 (AdipoR1).
  • AdipoR1 adiponectin receptor 1
  • adiponectin receptor 2 Crystal structures of the human adiponectin receptors. Nature. 2015 Apr 16; 520 (7547): 312-6. Doi: 10.1038 / nature14301).
  • the skin permeability of the adiponectin-derived peptide of the present invention prepared in Example 1 was most similar to that of human skin, and was verified using pig skin, which is generally used for the permeability test.
  • FITC fluorescently attached peptide stock positive control 8-mer length peptide 2, 4-mer peptide 4
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the adiponectin-derived peptide of the present invention was remarkably excellent in permeability to the skin as compared to a peptide having a length of 8 amino acids used as a control (FIG. 1).
  • Adiponectin and its receptors have reduced expression on photo-aged skin and UV-irradiated skin.
  • the expression of adiponectin is reduced, the expression of MMP-1 and procollagen, the skin aging regulators, is changed to change the extracellular matrix and photo-aging. It is known to exacerbate (UV-induced inhibition of adipokine production in subcutaneous fat aggravates dermal matrix degradation in human skin.2016.Scientific Reports.10; 6: 25616. Doi: 10.1038 / srep25616).
  • the mouse-derived cell line used 3T3-L1 progenitor fat cells
  • the human-derived cell line used a liposuction primary culture cell line.
  • differentiation-inducing reagents 0.5 mM isobutylmethylxanthine, 1 ⁇ M dexamethasone, 10 ⁇ g / mL insulin (human primary cell line 10 ⁇ g / mL rosiglitazone added).
  • the adiponectin peptides of the present invention were treated and cells and cultures were harvested after 24 hours to measure adiponectin expression and AMPK activity using the corresponding assay kit.
  • the adiponectin-derived peptides of the present invention increased the expression of adiponectin in adipocyte-derived adipocytes, in particular P5, P6, P10 of 5 amino acids length and P4-1, P4-4, P4- of 4 amino acids length. 7, P4-8, P4-9 to P4-10 and P4-13 are not only the normal control group (the group containing only the solvent in which the peptide was dissolved), but also significant adiponectin compared to the conventionally known 18-length adiponectin-derived peptide P1. There was an effect of increasing expression (FIG. 2).
  • adiponectin-derived peptides of the present invention also increased AMPK activity associated with adiponectin receptor activity in mouse and human-derived adipocytes, particularly P5, P6, P10 of 5 amino acids long and P4-1, P4 of 4 amino acids long. -7, P4-8, P4-9 to P4-10, P4-13, etc. are not only a normal control in mouse or human-derived adipocytes, but also a remarkable AMPK compared to P1, a known 18-length adiponectin-derived peptide. It was confirmed that there is an effect of increasing activity. It has been observed that some peptides such as P5 have better activity than fibrate-based drugs known as PPAR ⁇ / PPAR ⁇ activators (FIGS. 3 and 4).
  • Tumor necrosis factor (TNF) ⁇ which is known to affect substrate protein expression during endogenous aging and photoaging, is treated with primary cultured human-derived fibroblasts at a concentration of 5 ng / ml and treated with the adiponectin-derived peptide of the present invention. After 24 hours, cells and cultures were harvested to confirm the effect on procollagen expression.
  • Experimental example 4 Adiponectin Effect of derived peptides on MMP-1 expression in human-derived fibroblasts
  • TNF ⁇ which is known to affect substrate protein expression during endogenous aging and photoaging, is treated with primary cultured human-derived fibroblasts at a concentration of 5 ng / ml and treated with adiponectin-derived peptides of the present invention, followed by cell and culture solution after 24 hours.
  • MMP matrix degradation protein
  • the present invention Adiponectin Effect of the derived peptide on the expression of inflammatory cytokines in human-derived fibroblasts
  • TNF ⁇ which is known to affect substrate protein expression during endogenous aging and photoaging, is treated with primary cultured human-derived fibroblasts at a concentration of 5 ng / ml and treated with adiponectin-derived peptides of the present invention, followed by cell and culture solution after 24 hours.
  • IL interleukin
  • Example 6 The present invention Adiponectin Peptides from the human body For photoaging Impact
  • adiponectin-derived peptide of the present invention can effectively suppress photoaging for healthy volunteers.
  • the hips of the volunteers were divided into 4 sections, and then a flat part of the hips was picked and a punched black cloth was covered.
  • adiponectin-derived peptides or scrambled peptides in an amount of 20 ⁇ l / cm 2 were applied, followed by occlusive dressing.
  • the scrambled peptide was used as a control as a peptide composed of the same amino acid sequence having the same number of sequences as the peptide derived from adiponectin of the present invention.
  • a mixture of adiponectin-derived peptide of the present invention was used in a vehicle at a concentration of 10 mM, and the vehicle was a mixture of ethanol and polyethylene glycol in a volume ratio of 3: 7 (Retinoic Acid Inhibits Induction of c-Jun). Protein by Ultraviolet Radiation.Gary J. Fisher, John J. Voorhees, et al. J. Clin.Invest.Volume 101 (6): 1432-1440. (1998)). After irradiating with ultraviolet rays, an adiponectin-derived peptide or a scrambled peptide in an amount of 20 ⁇ l / cm 2 was applied and then a sealed dressing was performed. After 24 hours, samples of 6 mm each containing the fat layer were collected in the above 4 zones, and the photoaging factors were measured and compared by real-time PCR, Western blot, and immunohistochemistry.
  • Example 7 Adiponectin Within protein Adiponectin Confirm the structure of peptides and the possibility of action through polymer formation in vivo
  • the three-dimensional structure of the adiponectin protein present in humans was analyzed to analyze the structural position of the adiponectin peptide prepared in the present invention and the possibility of adiponectin receptor action in vivo.
  • adiponectin peptide As a result, in the case of adiponectin peptide, it was found that a total of three times in the spherical domain known as the action site of the adiponectin protein were repeatedly present in the form of a trimer. Since it is distributed on the outer side, there is a high possibility that it can actually act on the adiponectin receptor. Particularly, in the case of the P5 peptide, it was confirmed that the peptide sequence repeated three times in the adiponectin protein formed a polymer when the three-dimensional protein structure was examined, and as a lipophilic amino acid inside the polymer and a hydrophilic amino acid outside the polymer. It can be confirmed that the possibility of acting on the adiponectin receptor by forming a polymer again when the hydrophilic substance is actually permeated into the human body (FIG. 11).
  • adiponectin peptide prepared in the present invention since it is a short amino acid sequence composed of 5-mer, there is a possibility that it overlaps with the amino acid sequence contained in other proteins actually present in the human body. In this case, it is difficult to see the sequence specifically present in adiponectin, and thus there is a problem that the likelihood of specifically acting on the adiponectin receptor decreases. Accordingly, a sequence overlapping with the adiponectin peptide sequence was searched among all protein sequences present in the human body using the UniProt database provided by NCBI.
  • the P5 peptide of the present invention was confirmed to exist only in the C1q complement protein superfamily to which the adiponectin protein belongs, and was confirmed to be a peptide sequence highly specific to the adiponectin protein.
  • the flexible lotion containing the adiponectin-derived peptide of the present invention as an active ingredient was prepared as shown in Table 2 below.
  • Raw material Content (parts by weight) Adiponectin-derived peptide of Example 1 10.00 1,3-butylene glycol 1.00 Disodium LED 0.05 Allantoin 0.10 Dipotassium glyceride 0.05 Citric Acid 0.01 Sodium citrate 0.02 Glyceres-26 1.00 Arbutin 2.00 Hydrogenated castor oil 1.00 ethanol 30.00 Preservative a very small amount coloring agent a very small amount Flavor a very small amount Purified water Balance
  • the nutrition cream containing the adiponectin-derived peptide of the present invention as an active ingredient was prepared as shown in Table 3 below.
  • Raw material Content (parts by weight) Adiponectin-derived peptide of Example 1 10.0 1,3-butylene glycol 7.0 glycerin 1.0 D-panthenol 0.1 Plant extracts 3.2 Magnesium aluminum silicate 0.3 PEG-40 stearate 1.2 Stearic Acid 2.0 Polysorbate 60 1.5 Lipophilic glyceryl stearate 2.0 Sorbitan sesquioleate 1.5 Cetearyl alcohol 3.0 Mineral oil 4.0 Squalane 3.8 Carlylic / Capric Triglyceride 2.8 vegetable oil 1.8 Dimethicone 0.4 Dipotassium glyceride a very small amount Allantoin a very small amount Sodium hyaluronate a very small amount Tocopheryl Acetate Quantity Triethanolamine Quantity Preservative Quantity Flavor Quantity Purified water Balance
  • Lotion containing the peptide derived from adiponectin of the present invention as an active ingredient was prepared as shown in Table 4 below.
  • Raw material Content (parts by weight) Adiponectin-derived peptide of Example 1 3.5 Cetostearyl alcohol 1.6 Stearic acid 1.4 Lipophilic monostearate glycerin 1.8 PAGE-100 Stearate 2.6 Sesquiolein acid sorbitan 0.6 Squalene 4.8 Macadamia oil 2 Jojoba oil 2 Tocopherol acetate 0.4 Methyl polysiloxane 0.2 Echile Paraben 0.1 Tocopherol acetate 0.4 Methyl polysiloxane 0.2 Echile Paraben 0.1 Propyl paraben 0.1 1,3-butylene glycol 4 Methyl paraben 0.1 Shotgun 0.1 glycerin 4 d-pandenol 0.15 Allantoin 0.1 Carbomer (2% aq. Sol) 4 Triethanolamine 0.15 ethanol 3 pt 41891 0.1 p-H20 48.3
  • Adiponectin-derived peptide of the present invention ... 2 g
  • a powder was prepared by mixing the above components and filling the gas-tight fabric.
  • Adiponectin-derived peptide of the present invention ... 100 mg
  • tablets were prepared by tableting according to a conventional tablet manufacturing method.
  • Adiponectin-derived peptide of the present invention ... 100 mg
  • the capsule was prepared by filling in gelatin capsules according to the conventional method for producing a capsule.
  • Adiponectin-derived peptide of the present invention ... 1 g
  • Adiponectin-derived peptide of the present invention ... 150 mg
  • Adiponectin-derived peptide of the present invention 10 ⁇ g / ml
  • the solution was filled in a 5 ml Type I ampoule made of transparent glass, sealed under an upper grid of air by dissolving the glass, and autoclaved at 120 ° C. for 15 minutes or more to sterilize to prepare an injection solution.

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Abstract

본 발명은 아디포넥틴으로부터 유래되는 펩티드 단편 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아디포넥틴 유래 펩티드 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 또는 피부주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드는 인간 피부세포 및 생체 내에서 MMP 및 전염증성 사이토카인의 발현을 억제하고, 프로콜라겐의 발현을 증가시키므로, 피부노화에 따른 피부주름 및 탄력을 개선하고 항노화 효능이 있는 조성물의 효능물질로서 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

아디포넥틴 유래 펩티드 및 이를 포함하는 피부노화 방지 또는 피부주름 개선용 조성물
본 발명은 아디포넥틴(adiponectin)으로부터 유래되는 펩티드 단편(peptide fragment 또는 small peptide) 및 이를 포함하는 피부노화 방지 또는 피부주름 개선용 조성물에 관한 것이다.
피부노화는 흔히 피부주름, 처짐 및 늘어짐의 증가와 관련된 외적 및 내적인 과정에 의한 것으로서, 외적 노화는 반복되는 자외선(ultraviolet rays, UV) 노출에 의해 주로 발생하기 때문에 이를 일반적으로 '광노화'라고 한다. 자연적으로 노화된 피부는 매끄럽고 창백하며 잔주름이 있으나, 광노화된 피부는 굵은 피부주름이 생기고 색소침착 및 모세혈관 확장증을 야기하게 된다.
피부의 주요 구조적 구성요소인 콜라겐의 손상은 피부노화의 주된 요인으로 여겨지고 있으며 자연적인 노화 및 광노화 피부 모두에서 확인되고 있다. 콜라겐의 손상은 부분적으로 기질 메탈로프로티나아제(matrix metalloproteinase, MMP)의 유도와 관련된다. MMP는 매트릭스-분해 효소와 구조적으로 연관된 패밀리로서, 염증, 종양 침습 및 피부노화와 같은 다양한 분해 과정에 중요한 역할을 수행한다. MMP의 수준은 자외선 광, 산화적 스트레스 및 사이토카인 등과 같은 다양한 자극에 의해 증가하고, 자외선 조사는 활성 단백질(activator protein-1; AP-1)의 DNA 결합을 촉진시키고, 콜라게나아제(MMP-1), 스트로멜리신(MMP-3), 및 젤라티나아제(MMP-9)와 같은 MMP를 유도한다. 콜라겐이 MMP-1에 의해 일단 분해되면 MMP-3 및 MMP-9에 의해 추가로 분해된다(대한민국 공개특허공보 제10-2014-0138162호).
피하지방은 다른 조직들의 대사를 조절하는 호르몬들과 아디포카인(adipokine)을 분비하여 에너지 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 담당한다. 최근 광노화와 염증, 면역 억제, 암 등의 다양한 질환을 유발하는 환경 인자인 자외선에 의해 인간 피하지방 조직의 지방 함량이 감소하고, 지방 유래 산물인 아디포넥틴이 노화된 피부에서 감소되어 있으며, MMP-1의 증가와 콜라겐의 감소가 유도됨이 알려져 있다.
피부의 결합조직이 재생되거나 파괴되지 않고 온전히 그 탄성과 강도를 유지하기 위해서는, 피부에 존재하는 콜라겐 Ⅰ, Ⅲ(Type Ⅰ, Ⅲ collagen), 엘라스틴(elastin), 피브로넥틴(fibronectin)과 같은 세포외 기질(ECM, Extracellular matrix) 단백질의 생성 및 유지가 중요하다. 자연 노화 또는 자외선에 대한 만성적인 노출은 ECM 단백질의 손실과 피부조직의 탄성과 강도를 감소시키며, 이러한 현상들은 피부주름 형성과 같은 특징적인 피부노화와 강하게 연관되어 있다. 기질 메탈로프로티나아제는 진피 ECM을 분해하는데 있어서 중요한 효소로 작용한다. 자외선 조사 등과 같은 스트레스 조건하에서 각질형성세포(keratinocyte) 및 진피 섬유아세포에서의 MMP의 과발현은 ECM 단백질을 분해하는데 기여함으로써 피부에 피부주름을 형성하게 한다.
한편, 아디포넥틴은 지방세포에서 특이적으로 분비되는 단백질 호르몬인 아디포카인의 일종으로서, 인슐린의 기능을 증진시키고 인슐린 저항성을 유도함으로써 고혈당, 고인슐린증, 비만, 동맥경화와 같은 심혈관 질환 등을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 또한, 아디포넥틴은 암세포의 전이와 염증반응을 억제하는 기능이 있다. 아디포넥틴은 각질세포의 증식뿐만 아니라 피부에서 필라그린(filaggrin), 히알루론산(hyaluronic acid)과 세포외 기질의 발현을 촉진함으로써 상처치료, 섬유화 억제, 피부주름개선, 보습 등의 기능을 수행한다(대한민국 공개특허공보 제10-2015-0032401호). 아디포넥틴은 244개의 아미노산으로 구성되어 있으며 신호서열(signal sequence), N-말단(N-terminal)에 위치한 콜라겐-유사 도메인과 C-말단에 위치한 C1q-유사 구형 도메인(globular domain)으로 이루어져 있다. 육합체(hexamer)와 400 kDa의 고분자 복합체(HMW complex)가 주요한 소중합체(oligomer)로서, 상기 고분자 복합체는 저분자 복합체(LMW complex) 보다 더 활성이 높은 것으로 알려져 있다.
종래 다양한 생리적 활성을 갖는 것으로 알려진 아디포넥틴 유래의 펩티드 개발은 그간 국내외 많은 연구자들과 제약회사들의 표적이 되어 왔으나 체내 중합체 형성의 어려움으로 최종 성공 가능성이 상대적으로 낮았다. 따라서, 피부에 도포 가능하고 뛰어난 생리적 활성을 갖는 아디포넥틴 유래의 짧은 펩티드의 개발이 요구되고 있다.
본 발명의 과제는 아디포넥틴 유래 펩티드 및 이를 함유하는 피부노화 방지 또는 피부주름 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 피부노화 방지 또는 피부주름 개선용 아디포넥틴 유래 펩티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아디포넥틴 유래 펩티드 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 또는 피부주름 개선용 화장료 조성물 또는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 피부노화는 광노화 또는 자연노화일 수 있고, 상기 광노화는 UV 노출로 인한 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 아디포넥틴 유래 펩티드는 화장료 조성물 또는 약학적 조성물에 0.001 내지 20 mM의 농도로 함유될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 화장료 조성물은 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 젤, 연고, 패취 또는 분무제의 제형으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 약학적 또는 화장품학적으로 유효한 양의 서열번호 1 내지 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아디포넥틴 유래 펩티드 중 하나 이상을 개체에 처리 또는 투여하는 단계를 포함하는 피부노화 방지 또는 피부주름 개선 방법을 제공한다.
본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 개체는 인간일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 피부노화 방지 및 피부주름 개선 효과가 있는 아디포넥틴 유래의 신규한 펩티드에 관한 것으로서, 상기 펩티드는 인간 피부세포 및 생체 내에서 MMP 및 전염증성 사이토카인의 발현을 억제하고, 프로콜라겐의 발현을 증가시키므로, 피부노화에 따른 피부주름 및 탄력을 개선하고 항노화 효능이 있는 조성물의 효능물질로서 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드의 피부 투과도 테스트 결과를 보여주는 사진이다.
도 2는 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드가 마우스 지방세포에서 아디포넥틴의 발현에 미치는 영향을 보여주는 그래프로서, 'CNT'는 정상 대조군을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드가 마우스 지방세포에서 AMPK의 활성에 미치는 영향을 보여주는 그래프로서, 'CNT'는 정상 대조군을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드가 인간 지방세포에서 AMPK의 활성에 미치는 영향을 보여주는 그래프로서, 'CNT'는 정상 대조군을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드가 인간 유래 섬유아세포에서 프로콜라겐의 발현에 미치는 영향을 보여주는 전기영동 사진으로서, C는 대조군, V는 비히클(vehicle), AQ는 전체 길이의 아디포넥틴, gAQ는 구형 아디포넥틴을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드가 인간 유래 섬유아세포에서 MMP-1의 발현에 미치는 영향을 보여주는 전기영동 사진으로서, C는 대조군, V는 비히클, P1', P2' 등은 본 발명의 4개 아미노산 길이의 아디포넥틴 유래 펩티드를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드가 인간 유래 섬유아세포에서 염증성 사이토카인의 발현에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. V는 대조군, P9, P10 등은 본 발명의 5개 아미노산 길이의 아디포넥틴 유래 펩티드 9번과 10번을 나타내고, c1은 5 ng/㎖, c2는 5 ㎍/㎖의 농도를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드가 인체에서 홍반(Erythema)의 발생에 미치는 영향을 보여주는 사진이다.
도 9a 내지 도 9c는 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드가 인체에서 아디포넥틴의 발현 및 AMPK의 인산화에 미치는 영향을 보여주는 면역조직화학 및 웨스턴 블롯 전기영동 사진이다.
도 10a 내지 도 10c는 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드가 인체에서 TNF-α, 프로콜라겐 타입 I 및 탄성 섬유의 발현에 미치는 영향을 보여주는 면역조직화학 및 웨스턴 블롯 전기영동 사진이다.
도 11은 본 발명의 아디포넥틴 펩티드가 아디포넥틴 단백질 내에 존재하는 구조적인 위치에 대한 결정 구조를 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아디포넥틴 유래 펩티드 및 상기 아디포넥틴 유래 펩티드 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 또는 피부주름 개선용 화장료 조성물 또는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드는 아디포넥틴으로부터 유래되는 4개 아미노산(4-mer) 또는 5개 아미노산(5-mer) 길이의 펩티드 단편으로서, 하기 표 1에 기재되어 있는 아미노산 서열을 갖는다.
아디포넥틴펩티드 아미노산 서열(분자량) 서열번호 아디포넥틴펩티드 아미노산 서열(분자량) 서열번호
P4-1 IPGL(398.5) 1 P1 KFHCNIPGLYYFAYHITV(2186.6) 22
P4-2 PGLY(448.52) 2 P2 IPGLYYFA(943) 23
P4-3 GLYY(514.58) 3 P3 IPGLY(561) 14
P4-4 LYYF(604.71) 4 P4 PGLYY(611) 15
P4-5 YYFA(562.63) 5 P5 GLYYF(662) 16
P4-6 YFAY(562.63) 6 P6 LYYFA(676) 17
P4-7 FAYH(536.59) 7 P7 CNIPG(503) 18
P4-8 AYHI(502.57) 8 P8 KFHCN(647) 19
P4-9 YHIT(532.6) 9 P9 HCNIP(582) 20
P4-10 NIPG(399.44) 10 P10 NIPGL(512) 21
P4-11 CNIP(445.54) 11
P4-12 HCNI(485.56) 12
P4-13 팔미토일-LYYF 13
본 명세서에 있어서, "피부주름"이라 함은 피부상에 형성된 피부주름을 제한없이 나타내는 것으로서, 이는 내재적 및 외부요인에 의해 발생하는 피부주름, 예를 들어 자외선 자극 등에 의한 피부 광노화에 수반되는 피부주름을 포함한다.본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 피부노화 방지는 광노화 또는 자연노화에 의한 피부노화 억제 작용을 의미하나, 상기 피부노화는 특히 UV 노출에 의한 광노화인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 피부주름은 광노화 또는 자연노화에 의한 것일 수 있고, 광노화에 의한 것이 보다 바람직하며, UV 노출에 의한 광노화인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 펩티드는 화장료 조성물 내 0.001 내지 20 mM의 농도로 함유되는 것이 바람직하고, 0.01 내지 10 mM의 농도로 함유되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 펩티드의 농도가 0.001 mM 미만이면 항노화 및 피부주름 개선 효과를 얻기 어렵고, 20 mM을 초과하면 함유량 증가에 따른 뚜렷한 효과의 증가가 나타나지 않아서 생산 경제성이 떨어지는 문제점이 있다.
본 발명의 펩티드는 일반적인 화학합성, 예를 들어 고체상 펩티드 합성기술(solid-phase peptide synthesis)에 의해 제조될 수 있고, 상기 펩티드를 코딩하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하여 상기 펩티드를 발현시킨 다음, 통상의 방법으로 정제하여 제조할 수도 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 펩티드 외에 본 발명이 목적으로 하는 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 상기 펩티드의 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 추가로 함유할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화장료 조성물은 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 또는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않고, 본 기술분야에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 다른 한편으로, 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 젤, 연고, 패취 또는 분무제의 제형으로 제조될 수도 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있고, 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있으며, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있고, 예를 들어 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코,올 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으며, 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드는 피부에 대한 투과도가 현저하게 뛰어나고(도 1 참조), 지방세포에서 아디포넥틴의 발현을 증가시키며(도 2 참조), 또한 마우스 및 인간 유래의 지방세포에서 아디포넥틴 수용체의 활성과 연관된 AMPK 활성을 현저하게 증가시킬 수 있다(도 3 및 도 4 참조).
또한, 본 발명의 다른 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드는 TNFα에 의해 감소한 프로콜라겐의 발현을 증가시키고(도 5 참조), TNFα에 의하여 증가한 MMP-1의 발현을 감소시키며(도 6 참조), 또한 TNFα에 의하여 증가한 염증성 사이토카인의 발현은 감소시키면서 항염증성 사이토카인의 발현은 증가시킬 수 있다(도 7 참조).
따라서, 본 발명의 신규한 아디포넥틴 유래 펩티드는 피부노화 현상을 억제할 뿐만 아니라, MMP의 발현 및 활성을 억제시키고 프로콜라겐의 발현을 향상시키는 효과가 있어 피부주름 및 탄력 개선에 기여할 수 있으므로, 상기 펩티드는 피부노화 방지 및 피부주름 개선을 위한 화장료 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 피부노화 방지 또는 피부주름 개선용 약학적 조성물의 투여 경로는 피부, 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함되고, 경구 또는 비경구 투여가 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 '비경구'는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 병소내 주사 또는 주입기술을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명에 따른 아디포넥틴 유래 펩티드에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 상기 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캅셀제, 환 등이 포함된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제형화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 투여시간, 투여 경로, 배출률, 약물 배합 및 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있다.
본 발명의 상기 펩티드를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 단위 용량 형태로 제형화하는 경우, 유효성분으로서 본 발명의 펩티드를 약 0.01 내지 1,500 ㎎의 단위용량으로 함유되는 것이 바람직하고, 성인 치료에 필요한 투여량은 투여의 빈도와 강도에 따라 하루에 약 1 내지 500 ㎎ 범위가 보통이나 이에 한정되지 않는다. 성인에게 근육 내 또는 정맥 내 투여 시 일 회 투여량으로는 하루에 보통 약 5 내지 300 ㎎의 전체 투여량이면 충분할 것이나, 일부 환자의 경우 더 높은 일일 투여량이 바람직할 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 약학적 또는 화장품학적으로 유효한 양의 서열번호 1 내지 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아디포넥틴 유래 펩티드 중 하나 이상을 개체에 처리 또는 투여하는 단계를 포함하는 피부노화 방지 또는 피부주름 개선 방법을 제공한다.
상기 약학적 또는 화장품학적으로 유효한 양이란 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 이에 제한되는 것은 아니다. 처리 또는 투여량은 특정 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여기간, 투여방법, 제거율, 질환의 중증도 등에 따라 조절될 수 있다. 처리 또는 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 실시할 수도 있다.
상기 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 보다 바람직하게는 인간 또는 쥐, 토끼, 기니아피크, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 인간일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 처리 또는 투여 방법은 도포, 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 자궁내 경막 주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 더욱 상세히 설명한다.
그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드의 제조
본 발명의 펩티드를 합성하기 위해 메리필드(Merrifield)의 SPPS(Solid PhasePeptide Synthesis) 방법(J. Am. Chem. Soc., 85(14), 2149-2154)을 이용하였다. 먼저, 본 발명의 펩티드 합성을 위해 2-클로로트리틸 클로라이드(CTC) 수지를 이용하여 합성을 시작하였으며, 첫 단계의 Fmoc(9-fluorenylmethoxy carbonyl) 아미노산은 N,N-디이소프로필에틸아민(N,N-diisopropylethylamine, DIEA)를 사용하여 디클로로메탄 (dichloromethane, DCM) 용매 하에서 커플링하였다. 그 다음 단계의 Fmoc 아미노산부터는 HATU(N-[(디메틸아미노-)-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리딘-1-일-메틸렌]-N-메틸메탄아미니움 헥사플루오로포스페이트 N-옥사이드)와 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt) 혹은 HBTU(N-[(1H-벤조트리아졸-1-일)(디메틸아미노)메틸렌]-N-메틸메탄아미니움 헥사플루오로포스페이트 N-옥사이드)와 히드록시벤조트리아졸(HOBt)에 DIEA(N,N-diisopropylethylamine)를 함께 사용하여 커플링을 해나가는 방법으로 펩티드의 사슬을 연장시켰다. 이때, C-말단에서부터 N-말단 방향으로 합성해 나가며, 아미노 말단에 Fmoc-아미노산을 커플링시킨 후, 20% 피페리딘 용액으로 Fmoc기를 제거(Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide (1 ed.). CRC Press.848)하고 DMF(Dimethylforamide)으로 여러번 씻어준 다음 커플링해 나가는 방법으로 진행하였다. 마지막으로, Fmoc-아미노산을 커플링시킨 후, 20% 피페리딘 용액으로 Fmoc기를 제거하고 카르복실산과 N,N'-디이소프로필 카르보디이미드(DIC), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt)을 함께 사용하여 아실기를 커플링한 다음 DMF로 여러번 세척하여 건조시켰다. 여기에 TFA(Trifuloroacetic acid)-H2O-트리이소프로필실란(95:2.5:2.5,vol./vol.) 용액을 가하고, 2 내지 3시간 동안 반응시켜 보호기(Protecting group)의 제거 및 수지로부터 펩티드를 분리시킨 후, 디에틸에테르(diethylether)로 펩티드를 침천시켜 상기 표 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 각각의 펩티드들을 합성하였다.
상기의 방법으로 얻은 조(crude) 펩티드는 0.1% TFA가 포함된 아세토니트릴(acetonitrile)과 물의 구배 용매 조성으로 RP-HPLC(2996 Detector, 515 Pump, Waters)를 이용하여 순도를 확인하였으며, 순도 확인 결과 95% 이하의 펩티드는 Prep-LC로 분리 정제하여 97% 이상의 펩티드를 얻었다. 상기 펩티드의 정확한 성분 확인을 위하여 원소 분석기(EA1112, CE Instrument, Italy)로 원소 분석을 한 결과, 펩티드의 원소별 함유량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 원소별 함유량과 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가짐을 확인하였다.
실험예 1. 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드의 피부 투과도 측정
아디포넥틴은 구형 도메인(globular domain)을 포함하는 더 작은 단위로 분해되기도 하고, 전체 길이를 갖는 아디포넥틴 보다 구형 도메인을 갖는 소단위가 활성이 더 높으며, 이러한 이러한 아디포넥틴에 대한 수용체는 아디포넥틴 수용체1(AdipoR1)과 아디포넥틴 수용체2(AdipoR2)로 알려져 있다(Crystal structures of the human adiponectin receptors. Nature. 2015 Apr 16;520(7547):312-6. doi: 10.1038/nature14301). 이에, 실시예 1에서 제조된 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드의 피부 투과도를 사람피부와 가장 유사하여 일반적으로 투과도 테스트에 사용되는 돼지피부를 이용하여 검증하였다. 돼지 피부의 크기를 가로, 세로 2 ㎝로 자른 후 FITC 형광 부착된 해당 펩티드 스톡(양성대조군 8-mer 길이의 2번 펩티드, 4-mer 4번 펩티드)과 DMSO를 농도별로 준비한 후 돼지 피부 위에 충분한 양을 도포하였다. 빛을 차단하여 37℃ 인큐베이터에서 2시간 동안 두었다. LN2를 이용해 급속냉동후에 동결절단(Cryosection)을 시행하였다. DAPI(핵염색)로 5분간 처리후 세척하였고, 공초점 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드는 대조군으로 사용된 8개 아미노산 길이의 펩티드와 비교하여 피부에 대한 투과도가 현저하게 뛰어남을 확인하였다(도 1).
실험예 2. 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드가 아디포넥틴의 발현에 미치는 영향
아디포넥틴 및 그의 수용체는 광노화된 피부와 자외선 조사한 피부에서 그 발현이 감소되고, 이와 같이 아디포넥틴의 발현이 감소되면 피부노화 조절인자인 MMP-1과 프로콜라겐의 발현을 조절하여 세포외 기질을 변화시키고 광노화를 악화시킬 수 있음이 알려져 있다(UV-induced inhibition of adipokine production in subcutaneous fat aggravates dermal matrix degradation in human skin.2016.Scientific Reports.10;6:25616. doi: 10.1038/srep25616). 또한, 아디포넥틴 수용체가 활성화되면 하위 AMPK 인산화와 PPARα/PPARγ 활성도가 증가하는 것으로 알려져 있다(Crystal structures of the human adiponectin receptors. Nature. 2015 Apr 16;520(7547):312-6. doi: 10.1038/nature14301). 이에, 체내 아디포넥틴 발현 증가는 피부노화 방어에 주요한 역할을 할 수 있으므로 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드가 주요 아디포넥틴 생성 장소인 마우스 및 인간 유래의 지방세포에서 아디포넥틴의 발현과 수용체 활성에 미치는 영향을 확인하였다. 마우스 유래 세포주는 3T3-L1 전구지방세포를 이용하였으며, 인간 유래 세포주는 지방흡입 일차 배양 세포주를 사용하였다. 각 세포주를 배양한 후, 세포가 꽉 차면 각 해당 분화 유도 시약(0.5 mM 이소부틸메틸크산틴, 1 μM 덱사메타손, 10 ㎍/㎖ 인슐린(인간 일차세포주 10 ㎍/㎖ 로지글리타존 추가)으로 분화를 유도하였고, 5일째 본 발명의 아디포넥틴 펩티드들을 처리하고 24시간 후에 세포 및 배양액을 수확하여 아디포넥틴 발현량과 AMPK 활성도를 해당 분석 키트를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드는 마우스 유래의 지방세포에서 아디포넥틴의 발현을 증가시켰고, 특히 5개 아미노산 길이의 P5, P6, P10 및 4개 아미노산 길이의 P4-1, P4-4, P4-7, P4-8, P4-9 내지 P4-10 및 P4-13은 정상대조군(펩티드를 녹인 용매만 포함된 군)은 물론이고 종래 알려진 18개 길이의 아디포넥틴 유래 펩티드인 P1과 비교해서도 현저한 아디포넥틴 발현 증가 효과가 있었다(도 2). 또한, 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드는 마우스 및 인간 유래의 지방세포에서 아디포넥틴 수용체의 활성과 연관된 AMPK 활성도 증가시켰고, 특히 5개 아미노산 길이의 P5, P6, P10 및 4개 아미노산 길이의 P4-1, P4-7, P4-8, P4-9 내지 P4-10 및 P4-13 등은 마우스 또는 인간 유래의 지방세포에서 정상대조군은 물론이고 종래 알려진 18개 길이의 아디포넥틴 유래 펩티드인 P1과 비교해서도 현저한 AMPK 활성 증가 효과가 있음을 확인하였다. P5 등의 일부 펩티드는 PPARα/PPARγ의 활성인자(activator)로 알려진 파이브레이트(fibrate) 계열의 약물들보다 활성이 좋은 것으로 관찰되었다(도 3 및 도 4).
실험예 3. 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드가 인간 유래 섬유아세포에서의 프로콜라겐 발현에 미치는 영향
일차 배양한 인간 유래 섬유아세포에 내인성 노화 및 광노화 과정에서 기질단백질 발현에 영향을 주는 것으로 알려진 종양 괴사 인자(TNF)α를 5 ng/㎖의 농도로 처리하고 동시에 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드를 처리하여 24시간 후에 세포와 배양액을 수확하여 프로콜라겐의 발현에 미치는 영향을 확인하였다.
그 결과, TNFα에 의해 감소한 프로콜라겐의 발현이 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드의 처리에 의해 증가되었음을 확인하였다(도 5).
실험예 4. 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드가 인간 유래 섬유아세포에서의 MMP-1 발현에 미치는 영향
일차 배양한 인간 유래 섬유아세포에 내인성 노화 및 광노화 과정에서 기질단백질 발현에 영향을 주는 것으로 알려진 TNFα를 5 ng/㎖의 농도로 처리하고 동시에 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드를 처리하여 24시간 후에 세포와 배양액을 수확하여 기질분해단백질인 MMP(Matrix Metalloproteinase)-1의 발현에 미치는 영향을 확인하였다.
그 결과, TNFα에 의하여 증가한 MMP-1의 발현이 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드의 처리에 의해 감소되었음을 확인하였다(도 6).
실험예 5. 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드가 인간 유래 섬유아세포에서의 염증성 사이토카인의 발현에 미치는 영향
일차 배양한 인간 유래 섬유아세포에 내인성 노화 및 광노화 과정에서 기질단백질 발현에 영향을 주는 것으로 알려진 TNFα를 5 ng/㎖의 농도로 처리하고 동시에 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드를 처리하여 24시간 후에 세포와 배양액을 수확하여 염증성 사이토카인인 인터루킨(IL)-6 및 TNFα와 항염증성 사이토카인인 IL-10의 발현에 미치는 영향을 확인하였다.
그 결과, 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드를 처리하면 TNFα에 의하여 증가한 염증성 사이토카인인 IL-6 및 TNFα의 발현은 감소시키고 항염증성 사이토카인인 IL-10의 발현은 증가시킴을 확인하였다(도 7).
실시예 6. 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드가 인체에서 광노화에 미치는 영향
건강한 자원자를 대상으로 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드가 광노화를 효과적으로 억제할 수 있는지 여부를 확인하였다. 이를 위하여, 자원자의 엉덩이를 4 구역으로 나눈 후, 엉덩이의 편평한 부분을 골라 구멍을 뚫은 검은 천을 덮었다. 자외선을 쪼이기 24시간 전과 30분 전에 20 ㎕/㎠ 양의 아디포넥틴 유래 펩티드 또는 스크램블 펩티드(scrambled peptide)를 도포한 후, 밀봉 드레싱(occlusive dressing)을 실시하였다. 상기 스크램블 펩티드는 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드와 동일한 수의 서열을 갖고 동일한 아미노산으로 구성된 펩티드로서 대조군으로 사용되었다. 시험약은 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드를 10 mM의 농도로 비히클에 혼합한 것을 사용하였고, 상기 비히클은 에탄올과 폴리에틸렌 글리콜을 3:7의 부피비로 섞은 것을 사용하였다(Retinoic Acid Inhibits Induction of c-Jun Protein by Ultraviolet Radiation. Gary J. Fisher, John J. Voorhees, et al. J. Clin. Invest. Volume 101(6): 1432-1440. (1998)). 자외선을 쪼여준 후, 20 ㎕/㎠ 양의 아디포넥틴 유래 펩티드 또는 스크램블 펩티드를 바른 후 밀봉 드레싱을 실시하였다. 24시간 후 상기 4 구역에서 각각 지방층을 포함하는 6 ㎜의 검체를 체취하였고, 체취한 검체에서 실시간(Real time) PCR, 웨스턴 블롯 및 면역조직화학법에 의해 광노화 관여인자를 측정하여 비교하였다.
그 결과, 대조군을 처리한 자원자에서는 홍반(Erythema)이 발생한 것과 대조적으로, 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드를 처리한 자원자에서는 홍반이 거의 발생하지 않았다(도 8). 또한, 본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드를 처리한 자원자에서는 아디포넥틴의 발현 및 하위 신호전달 단백질인 AMPK의 인산화가 증가하였고(도 9a 내지 도 9c), 피부노화, 탄력 및 염증에 관여하는 TNF-α의 발현 감소(도 10a), 프로콜라겐 타입 I의 발현 증가(도 10b) 및 탄성 섬유의 발현 증가(도 10c)가 확인되었다.
실시예 7. 아디포넥틴 단백질 내 아디포넥틴 펩티드의 구조 및 생체 내 중합체 형성을 통한 작용 가능성 확인
인간에 존재하는 아디포넥틴 단백질의 3차원적 구조를 분석하여 본 발명에서 제조한 아디포넥틴 펩티드의 구조적인 위치와 생체 내 아디포넥틴 수용체 작용 가능성을 분석하였다.
그 결과, 아디포넥틴 펩디드의 경우 아디포넥틴 단백질의 작용 부위로 알려져 있는 구형 도메인에 총 3번이 반복하여 트라이머(trimer) 형태로 존재하고 있음을 알 수 있었고, 특히나 작용부위 구형 도메인의 구형 구조의 최외곽 쪽에 분포하고 있어서 실제로 아디포넥틴 수용체에 작용할 수 있는 가능성이 높았다. 특히, P5 펩티드의 경우에는 아디포넥틴 단백질에서 3번 반복하는 펩티드 서열이 3차원 단백질 구조를 살펴보았을 때 중합체를 형성하고 있음을 확인할 수 있었고, 중합체의 내부에 친유성 아미노산, 중합체의 외부에 친수성 아미노산으로 구성되어 실제로 친수성 물질이 많은 인체 내에 투과되었을 경우에 다시 중합체를 형성하는 양상이 되어 아디포넥틴 수용체에 작용할 가능성을 확인할 수 있었다(도 11).
실시예 8. 아디포넥틴 펩티드의 서열의 타 단백질과의 중복 여부 검색
본 발명에서 제조한 아디포넥틴 펩티드의 경우 5-mer로 구성된 짧은 아미노산 서열이기 때문에 실제적으로 인체 내에 존재하는 다른 단백질에 포함된 아미노산 서열과 중복될 가능성이 있다. 이러한 경우에 아디포넥틴에만 특이적으로 존재하는 서열로 보기 힘들고, 따라서 아디포넥틴 수용체에 특이적으로 작용할 가능성이 떨어지는 문제가 있다. 이에 미국 NCBI에서 제공하는 UniProt 데이터베이스를 이용하여 인체 내에 존재하는 모든 단백질 서열 중에 아디포넥틴 펩티드 서열과 중복되는 서열을 검색하였다.
그 결과, 특히 본 발명의 P5 펩티드의 경우 아디포넥틴 단백질이 속해 있는 C1q 보체 단백질 슈퍼패밀리에만 존재하는 것으로 확인되어, 아디포넥틴 단백질에 매우 특이적인 펩티드 서열로 확인되었다.
제조예 1. 화장료의 제조
<1-1> 유연 화장수의 제조
본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드를 유효성분으로 함유하는 유연 화장수는 하기 표 2와 같이 제조하였다.
원료 함량(중량부)
실시예 1의 아디포넥틴 유래 펩티드 10.00
1,3-부틸렌글리콜 1.00
디소듐이디티에이 0.05
알란토인 0.10
디포타슘글리시리제이트 0.05
시트릭애씨드 0.01
소듐시트레이트 0.02
글리세레스-26 1.00
알부틴 2.00
하이드로제네이티드캐스터오일 1.00
에탄올 30.00
보존제 미량
착색제 미량
착향제 미량
정제수 잔량
<1-2> 영양 크림의 제조
본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드를 유효성분으로 함유한 영양크림은 하기 표 3의 조성과 같이 제조하였다.
원료 함량(중량부)
실시예 1의 아디포넥틴 유래 펩티드 10.0
1,3-부틸렌 글리콜 7.0
글리세린 1.0
D-판테놀 0.1
식물 추출물 3.2
마그네슘알루미늄실리케이트 0.3
PEG-40 스테아레이트 1.2
스테아릭애씨드 2.0
폴리소르베이트 60 1.5
친유형글리세릴스테아레이트 2.0
소르비탄세스퀴올리에이트 1.5
세테아릴알코올 3.0
미네랄오일 4.0
스쿠알란 3.8
카르릴릭/카프릭트리글리세라이드 2.8
식물성 오일 1.8
디메치콘 0.4
디포타슘글리시리제이트 미량
알란토인 미량
소듐 히아루로네이트 미량
토코페릴아세테이트 적량
트리에탄올아민 적량
보존제 적량
착향제 적량
정제수 잔량
<1-3> 로션의 제조
본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드를 유효성분으로 함유한 로션은 하기 표 4의 조성과 같이 제조하였다.
원료 함량(중량부)
실시예 1의 아디포넥틴 유래 펩티드 3.5
세토스테아릴알코올 1.6
스테아린산 1.4
친유형모노스테아린산글리세린 1.8
피이지-100 스테아레이트 2.6
세스퀴올레인산소르비탈 0.6
스쿠알렌 4.8
마카다이아오일 2
호호바오일 2
초산토코페롤 0.4
메칠폴리실록산 0.2
에칠파라벤 0.1
초산토코페롤 0.4
메칠폴리실록산 0.2
에칠파라벤 0.1
프로필파라벤 0.1
1,3-부칠렌글리콜 4
메칠파라벤 0.1
산탄검 0.1
글리세린 4
d-판데놀 0.15
알란토인 0.1
카르보머(2% aq. Sol) 4
트리에탄올아민 0.15
에탄올 3
pt 41891 0.1
p-H20 48.3
제조예 2. 약학적 제제의 제조
<2-1> 산제의 제조
본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드··········2 g
유당························1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<2-2> 정제의 제조
본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드·········100 ㎎
옥수수 전분 ···················100 ㎎
유 당 ······················100 ㎎
스테아린산 마그네슘 ················2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<2-3> 캡슐제의 제조
본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드·········100 ㎎
옥수수 전분 ···················100 ㎎
유당·······················100 ㎎
스테아린산 마그네슘 ················2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<2-4> 환의 제조
본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드··········1 g
유당·······················1.5 g
글리세린······················1 g
자일리톨·····················0.5 g
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
<2-5> 과립의 제조
본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드·········150 ㎎
대두추출물 ····················50 ㎎
포도당······················200 ㎎
전분·······················600 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
<2-6> 주사액제의 제조
본 발명의 아디포넥틴 유래 펩티드 ·······10 ㎍/㎖
묽은 염산 BP ·················pH 3.5로 될 때까지
주사용 염화나트륨 BP ·············최대 1 ㎖
적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 본 발명의 TRPV1 억제 펩티드를 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절한 후, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시켰으며, 120℃에서 15분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

Claims (12)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 피부노화 방지 또는 피부주름 개선용 아디포넥틴 유래 펩티드.
  2. 서열번호 1 내지 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아디포넥틴 유래 펩티드 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 또는 피부주름 개선용 화장료 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 피부노화는 광노화 또는 자연노화인 화장료 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 광노화는 UV 노출로 인한 것인 화장료 조성물.
  5. 청구항 2에 있어서,
    상기 아디포넥틴 유래 펩티드를 0.001 내지 20 mM의 농도로 함유하는 화장료 조성물.
  6. 청구항 2에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 젤, 연고, 패취 또는 분무제의 제형으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 갖는 화장료 조성물.
  7. 서열번호 1 내지 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아디포넥틴 유래 펩티드 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 또는 피부주름 개선용 약학적 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 피부노화는 광노화 또는 자연노화인 약학적 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 광노화는 UV 노출로 인한 것인 약학적 조성물.
  10. 청구항 7에 있어서,
    상기 아디포넥틴 유래 펩티드를 0.001 내지 20 mM의 농도로 함유하는 약학적 조성물.
  11. 화장품학적으로 유효한 양의 서열번호 1 내지 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아디포넥틴 유래 펩티드 중 하나 이상을 개체에 처리 또는 투여하는 단계를 포함하는 피부노화 방지 또는 피부주름 개선 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 개체는 인간인 피부노화 방지 또는 피부주름 개선 방법.
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