WO2005082395A1

WO2005082395A1 - 新規な育毛剤、抗脱毛症剤

Info

Publication number: WO2005082395A1
Application number: PCT/JP2005/004033
Authority: WO
Inventors: Masaaki Yoshikawa; Takahiro Tsuruki; Ayaka Ito
Original assignee: Kyoto University
Priority date: 2004-03-02
Filing date: 2005-03-02
Publication date: 2005-09-09
Also published as: JPWO2005082395A1

Abstract

　Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐで示されるペプチドは、毛周期の休止期から成長期への移行を促進することにより、育毛促進効果を有することが見出された。よって本発明により、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐで示されるペプチドを有効成分とする育毛剤、及び上記ペプチドを用いて育毛を促進する方法が提供された。また上記ペプチドは抗癌剤の副作用である脱毛症に対して有効であることが見出された。よって本発明により、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐで示されるペプチドを有効成分とする抗脱毛症剤、及び上記ペプチドを用いて脱毛を抑制する方法が提供された。本発明のペプチドの育毛促進効果と抗脱毛症効果は経口投与で有効であるために、その利用価値は大きいと考えられる。

Description

新規な育毛剤、抗脱毛症剤技術分野

本発明は、 Ar g-P r o— L e u— Ly s— P r o— Tr pで示されるぺプチドを有効成分とする育毛剤に関す明る。更に本発明は上記べプチドを用いて育毛を促進する方法に関する。更に本発明は r o—L e u— Ly s_ 田、 Ar g— P P r o-Tr pで示されるペプチドを有効成分書とする抗脱毛症剤に関する。更に本発明は上記ペプチドを用いて脱毛を抑制する方法に関する。

背景技術

脱毛は生命に関わる問題ではないが、その精神的な影響は非常に大きく、脱毛や抜け毛で悩む人は我が国で約 2300万人とも言われている。その中で育毛剤を使用している人は約 1Z4程であり、多くの人が現在市販されている育毛剤の効果に充分な満足を感じていないのが現状である。毛成長機構や脱毛メカニズムの基礎研究成果に基づいた新たな育毛促進物質の探索とそのメ力-ズムの解明は現在重要な研究課題の一つであり、脱毛問題で悩む人々の生活の質（QOL) の改善に貢献することが期待される。

本発明者らは、卵白アルプミン由来の動脈弛緩べプチドである O V o k i n i n (2-7) (RADHPF) のアミノ酸残基を部分的に置換して得られた R P LKPWが高血圧自然発症ラット（SHR) に対する経口投与により有意な血圧効果作用を示し、その作用がアンジォテンシン 2型受容体（AT2—R) を介していることを見出している。そして RPLKPWのペプチド自体について、血圧降下作用を有する新規なぺプチドとして特許出願を行っている（特開 2002— 080496号公報)。

一方動脈弛緩 ·血圧降下剤として得られたミノキシジルが育毛促進作用を示すことが知られており、その作用にはスルホニル尿素受容体（SUR) が関与すると考えられている。ミノキシジルと RPLKPWは作用する受容体は異なっているものの、血管弛緩作用、血圧降下作用を有するという点で共通している。しかし R P L K P Wの育毛促進作用についてはこれまで検討がなされたことはなかつた。

また育毛を目的とする食品としては、アマチヤヅルと力キノハと昆布の抽出物を含む食品が知られて、る。また抗癌剤の副作用としての脱毛症状を抑制、改善または予防する事が可能なウーロン茶抽出物を有効成分とする経口脱毛剤が知られている（特開平 9— 309840号公報)。また経口の育毛医薬品として、 T y p e I I 5 αリダクターゼ阻害剤であるフイナステライド（f i n a s t e r i d e) が知られている（J. of American Academy of Dermatology (1998) 39, _PP578- 589)。し力しながら、当薬剤は男性ホルモンの代謝に作用する薬物であること力、ら、副作用が懸念されており、使用上の注意や制限が多い。

発明の開示

そこで、 RPLKPWの育毛促進作用と抗脱毛作用を検討し、その知見を新規な育毛剤ゃ抗脱毛症剤の開発に資することが本発明の課題である。脱毛や抜け毛に悩む人の数が多いことを考えると、新たな育毛剤を提供することの意義は大きいと考えられる。

そこで本発明者らは、 RP LKPWの育毛促進作用を検討する目的で該ぺプチドを飼料に混合してマウスに経口摂取させたところ、有意な育毛促進効果が得られることを見出した。該ペプチドの育毛促進効果は、毛周期の、休止期から成長期への移行が促進されることによるものと考えられる。よって本発明は、 Ar g 一 P r o— Le u— L y s_P r o— T r ρで示されるペプチドを有効成分とする育毛剤、及び上記ぺプチドを用いて育毛を促進する方法を提供するものである。また本発明者らは抗癌剤であるエトポシドと R P L K P Wを併用してラットに経口投与したところ、ェトポシドの副作用である脱毛症に対して該ぺプチドが有効であることを見出した。よって本発明は、 Ar g— P r o_L e u— Ly s— P r o-Tr pで示されるぺプチドを有効成分とする抗脱毛症剤、及び上記ぺプチドを用いて脱毛を抑制する方法を提供するものである。

本発明により、 Ar g— P r o -L e u-Ly s— P r o-Tr pで示されるぺプチドを有効成分とする育毛剤、及び上記べプチドを用いて育毛を促進する方法が提供された。更に本発明により、 Ar g— P r o— Le u— Ly s—P r o -Tr pで示されるペプチドを有効成分とする抗脱毛症剤、及び上記ペプチドを用いて脱毛を抑制する方法が提供された。本発明のぺプチドの育毛促進作用と抗脱毛作用は経口投与で有効であるために簡便に摂取することができ、多くの人々の注意を喚起する可能性が高いと考えられる。上記ペプチドは育毛剤として有効であるために、本発明の知見を利用して、例えば、育毛医薬品、育毛食品、育毛化粧品を開発することが可能である。また抗癌剤の副作用として脱毛はしばしば見られ、それは抗癌剤の投与を受けている患者の生命に関わる問題ではないが、精神的な苦痛を考えると本発明の抗脱毛症剤の意義は大きい。

図面の簡単な説明

図 1は、コントロール群と RP LKPW投与群において、マウス背部の育毛促進効果を評価した写真である。

図 2は、コントロール群と RPLKPWを投与群において、毛の生えている部分の割合の比較を行ったグラフである。

図 3は、コントロール群と RPLKPWを投与群において、全毛包中における An a g e nV I期にある毛包の割合を示すグラフである。

図 4は、ヒト頭髪毛乳頭細胞における VEGFmRN A発現量に対して、 RP L K PWが及ぼす効果の経時変化を示すグラフである。

図 5は、エトポシドによる脱毛が、 RPLKPWにより抑制される効果を示すグラフである。

発明を実施するための最良の形態本努明は、 Ar g—P r o— Le u— Ly s—P r o— Tr pで示されるぺプチドを有効成分として含有する育毛剤である。更に本発明は、 A r g— P r o— L e u-Ly s-P r o-Tr pで示されるペプチドを有効成分として含有する抗脱毛症剤である。上記のペプチドは育毛促進作用を有するために、当該べプチドを有効成分として含有することを特徴とする育毛剤を調製することが可能である。また上記のぺプチドを用いて育毛を促進する方法もまた本発明の範囲内である。更に上記のペプチドを使用して、特に抗癌剤の副作用としての脱毛を抑制することが可能である。上記でいう A r gはアルギニン、 P r oはプロリン、 L e uはロイシン、 Ly sはリジン、 T r pはトリプトファンを示す。かかるァミノ酸はいずれも L—体である。

本明のペプチドは、ペプチド合成法で取得することができる。即ち、ぺプチド合成に通常用いられる方法である液相法または固相法で、ぺプチド結合の任意の位置で二分される 2種のフラグメントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有する原料と、他方のフラグメントに相当する反応性アミノ基を有する原料と ■¾：、 2— (lH-Benzotriazole-1-yl) -1, 1， 3, 3-tetramethyluronium hexaf luorophosp hate (HBTU) 等の活性エステルを用いた方法や、カルポジイミドを用いた方法等を用いて縮合させることができる。生成する縮合物が保護基を有する場合、その保護基を除去することによっても製造し得る。

この反応工程において反応に関与すべきでない官能基は、保護基により保護される。ァミノ基の保護基としては、例えばべンジルォキシカルボニル（B z)、 t—プチルォキシカルボニル（B o c)， p—ビフエニルイソプロピロォキシ力ルボニル、 9一フルォレニルメチルォキシカルボニル（Fmo c) 等が挙げられる。カルボキシル基の保護剤としては例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙げられるが、固相法の場合は、 C末端のカルボキシル基はクロ口トリチル樹脂、クロルメチル榭脂、ォキシメチル榭脂、 P—アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。縮合反応は、カルポジイミド等の縮合剤の存在下にあるいは N—保護アミノ酸活性エステルまたはべプチド活性エステルを用いて実施する。

縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合はさらにペプチドの C 末端と樹脂との結合を切断する。更に、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製される。例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィー等が挙げられる。合成したぺプチドの合成はェドマン分解法で C—末端からアミノ酸配列を読み取るプロティンシークェンサ一、 GC—MS等で分析される。

次に医薬品として用いる場合について説明する。本発明の育毛ペプチド、抗脱毛症ぺプチドは経口投与で有効であるという利点を有するが、それに限定されるものではなく、投与経路としては、経口投与、非経口投与、直腸内投与のいずれを採用することもできる。本発明の育毛剤、抗脱毛症剤は、経口的あるいは非経口的に投与することが可能である。本ペプチドの投与量は化合物の種類、投与方法、投与される者の状態や年齢等により異なるが、 1日あたり通常は 0. 01m g k g〜l 00mgZk g、好まし fま 0. lmgz k g〜：！ OmgZk gである。本発明のペプチドは通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のぺプチドと反応しなレヽ物質が用、られる。

具体的には、その様な物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシゥム、合成ケィ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチノレセノレロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピノレセノレロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビエルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケィ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸ィ匕チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセ口ゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルォロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレンダルコ一ル、水等が挙げられる。

剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解または懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはプドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。

これらの製剤は、本発明のぺプチドを 0 . 0 1 %〜 1 0 0重量％、好ましくは 1〜9 0重量％の割合で含有することができる。これらの製剤はまた、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。

経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分例えば乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケィ酸などと混合して散剤とする力、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビュルピロリドンなどの結合剤、カルポキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース力ルシゥムなどの崩壊剤などを加えて湿式又は乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤及び顆粒剤をそのまま或いはステアリン酸マグネシゥム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒又は錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸一メタクリノレ酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいはェチルセルロース、カルナゥバロウ、硬ィ匕油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するカゝ、有効成分をそのまま或いはグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オジープ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。

経口投与用の液状製剤を製造するには、有効成分と白糖、ソルビトール、グリセリンなどの甘味剤とを水に溶解して透明なシロップ剤、更に精油、エタノールなどを加えてエリキシル剤とするか、アラビアゴム、トラガント、ポリソルベート 8 0、カルボキシメチルセルロースナトリゥムなどを加えて乳剤又は懸濁剤としてもよい。これらの液状製剤には所望により矯味剤、着色剤、保存剤などを加えてもよい。

注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸ィ匕ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどの p H調整剤、塩ィ匕ナトリウム、ぶどう糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填する力、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート 8 0、ポリオキシエチレン硬ィ匕ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。

直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジ及ぴモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し型に流し込んで冷却するか、有効成分をボリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被覆すればよい。

皮膚用外用剤を製造するには、有効成分を白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコールなどに加えて必要ならば加湿して練合し軟膏剤とする力、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体などの粘着剤と練合した後ポリアルキルなどの不織布に展延してテープ剤とする。

更に本発明の育毛ぺプチドを種々の飲食物や所謂サブリメントの形で投与することもできる。本発明の育毛ぺプチドを一般に飲食されている物や調味料などの中に配合することが可能であり、そのような飲食物は通常の方法で製造させるものであって特に限定されるものではない。

また本発明の育毛ぺプチドをへァクリーム、ヘアリキッドあるいはゲルなどの種々の形態で化粧品中に配合して育毛化粧品とすることも可能である。なおクリーム状、ェマルジヨン状あるいはゲル状の育毛化粧品とする際に、一般的に使用される種々の添加剤を配合することができる。かかる添加剤は特に限定されるものではないが、水、エタノール、プロパノールおょぴイソプロパノール等の低級脂肪族アルコール、あるいはグリセリンおよび 1、 2—プロピレングリコールのようなグリコールなどの溶媒を配合することが可能である。更にその他に、アルキルトリメチノレアンモニゥム塩、アルキルべタイン、ォキシェチル化脂肪族アルコール、胎肪酸アル力ノールアミド、ォキシェチル化脂肪酸エステルなどのカチオン性、両性あるレ、は非ィオン性界面活性剤からなる湿潤剤ないしは乳化剤、香油、エチレングリコールジステアレートなどの乳白剤、 2、 4、 4 トリクロルー 2 —ヒド口キシジフエニルエーテルあるいはメチルイソチアゾリゾンのような殺菌剤ないしは防カビ剤、緩衝剤、保湿剤や酸ィ匕防止剤を適宜使用することができる。なお以下の実施例において本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲を限定するものではない。 '

実施例

毛包は一定の周期で常に生えかわる器官であり、毛周期は成長期（An a g e n)、退行期（C a t a g e n)、休止期（Te 1 o g e n) から構成される。 C 3 HZHeマウスにおいては 7週齢から 50日間、毛周期は T e 1 o g e n期に同調していることが知られている。

本発明においては、毛周期が T e 1 o g e n期にある 7週齢の雄性 C 3HZH eマウスの背部をパリカンとシェーバーにより脱毛し、 3日間の回復期間をおいた後、 8週齢より lmg/k gに相当する RPLKPWを粉末飼料に混合し、自由に摂取させた。

RPLKP W混合飼料を 14日間投与した後に、育毛促進作用につレ、て評価を行った。図 1にマウス背部の写真を示す。図 1において上段はコントロール群のマウスの写真であり、下段は R p L K P Wを投与した群のマゥスの写真である。また図 2は図 1の写真を画像解析して定量化した結果である。図 2のグラフにおいて縦軸はマウスの背部全体のうち、毛の生えている部分の割合を示す。図 1と図 2より判る様に、 RPLKPW投与群においてはコントロール群と比較して育毛が促進していることが認められた。

上記で述べた様に毛包には一定の周期があるが、 An a g e n期は更に I期から V I期までの 6つの期間に分類することができ、毛包が成長するに伴い、 An a g e n I期から I V期へと移行する。

マウス背部から採取した皮膚をへマトキシン ·ェォジンで染色し、見られる皮膚組織を観察した。コントロール群でも RPLKPW投与群でも、 An a g e n へ移行している毛包が確認された。コントロール群から採取した皮膚では An a g e n i i I期の毛包が確認され、古い毛包が残っており、新しい毛包がパルジ付近までしか延びていない。一方 RPLKPW投与群においては An a g e nV I期に移行している毛包の増加が確認され、新しい毛包が表皮を貫通していた。この結果からコントロール群と比較して、 RP LKPW投与群では毛の生育の進行が促進していると考えられる。

全毛包の中で、 An a g e n V I期にある毛包の割合を定量ィ匕した結果を図 3 に示す。図 3の結果は、 RP LKPWが T e 1 o g e n期から An a g e n期への移行を促進することを意味している。よって RPLKP Wの育毛効果はこのような毛周期の移行によって起こるものであることが判った。

間質系細胞として毛包基底部に存在している毛乳頭細胞は、毛包上皮細胞幹細胞に対して様々なサイトカインゃ細胞増殖因子を放出し、毛包の自己再生を行つている。育毛剤として知られるミノキシジルもまた、毛乳頭細胞から血管内皮細胞成長因子（VEGF) の産生を促進することが知られている。そこで、ヒト頭髪毛乳頭細胞に対する VEGFの影響を検討した。本検討により、 RPLKPW の育毛促進効果のメカニズムを更に解明することができる。

ヒト頭髪毛乳頭細胞を 5 X 10⁴個ずつ、 6 Ommのディッシュに播き、 23 時間培養した。その後培地を交換して 1時間後にサンプルを添加した。サンプルを添加してから 3時間、 6時間、 12時間、 24時間培養を行い、その後細胞から全 RN Aを抽出し、 AB I P r i sm7000を用いた定量的 RT— P CRにより VEGFmRNA発現量の解析を行った。

その結果を図 4に示す。なお図 4において縦軸は、コントロールの VEGFm RNAの発現量を 1とした時の RPLKPW投与群における VEGFmRNA発現量を、横軸は刺激時間を示す。ヒト頭髪毛乳頭細胞を 0. の RPLKP

Wで刺激することにより、該細胞における V E G F m R N Aの発現は時間依存的に促進し、 24時間の刺激で 2. 3倍に増加した。これはミノキシジル 30 μ M で刺激した時と同じ効果であった。この結果から、 RPLKPWの育毛促進作用に V E G Fが関与していることが示唆された。

SD系ラットを用い、以下の（1) 〜（5) の 5群に分けて抗脱毛活性の評価を行なった。各群のラットには母親を一匹つけ、自由に哺乳させた。母親には日本クレア製の固形食 CE 2を自由に接種させ、飲水も自由にさせた。薬剤の投与は 1日 1回、朝 10時より 1 1時の間に行った。尚、ぺプチドの投与は、生後 6 日目から生後 13日目までの 6日間連続して投与するというプロトコールに従い、経口投与で 1日 1回行つた。エトポシドは 1. 2 m g / k g体重の用量で、生後 1 1日目から 13日目までの 3日間連続して腹腔内に投与した。

(1) エトポシド（日本化薬製ラステツト：抗癌剤）単独投与群

(2) エトポシドと 3mgZk gの RP LKPWを併用投与した群

(3) ェトポシドと 1 OmgZk gの RPLKPWを併用投与した群

(4) エトポシドと 3 Omg/k gの RPLKPWを併用投与した群

(5) ェトポシドと 10 Omg/k gの RPLKPWを併用投与した群

上記 5群の投与検体について、生後 20日目に、肉眼下観察により脱毛度を検討した。ラットの毛が生えている領域の割合（％) により評価を行なった。各群

4匹で平均を検討したところ、毛が生えている領域の割合は（1) エトポシド単独投与群で 35. 5% (標準偏差 10. 9)、 (2) RPLKPW3mg/k g投与群で 75. 4% (標準偏差 4. 3)、 (3) RPLKPW1 Omg/k g投与群で 52. 7% (標準偏差 7. 8)、（4) RPLKPW3 Omg/k g投与群で 6 3. 0% (標準偏差 8. 2)、 (6) RPLKPW10 OmgZk g投与群で 10 0. 0% (標準偏差 0) であった。その結果をグラフにして図 5に示す。なお図 5で *は 1 %の危険率での有意差を、 * * *は 0. 1 %の危険率での有意差をそれぞれ示す。

表 5の結果より、 RPLKPWを3mg/k gで 6日間の経口投与することにより、抗癌剤ェトポシドによる脱毛は有意に抑制された。なお R P L K P Wを 1 Omg/k gで投与した群と RPLKPWを 3 Omg/k gで投与した群では、エトポシド単独投与群と比較して有意差は認められなかつた。一方、 R P L K P Wを 100mg/k g投与した群では、ほぼ完全な脱毛抑制が認められた。よつて RP LKPWは育毛促進作用のみならず、抗脱毛作用を有していることが示された。，

産業上の利用可能性

本発明により、 Ar g -P r o-Le u-Ly s_P r o—Tr pで示されるペプチドを有効成分として含有する育毛剤が提供された。更に本発明により、 A r g— P r o-Le u-Ly s— P r o—Tr pで示されるぺプチドを有効成分として含有する抗脱毛症剤が提供された。本発明の知見を利用して、当該べプチドを有効成分と含有する育毛医薬品、育毛医薬品や育毛化粧品を開発することが可能であると考えられる。

Claims

請求の範囲

1. Ar g— P r o— Le u— Ly s— P r o—T r pで示されるぺプチドを有効成分とする育毛剤。

2. 請求項 1記載の育毛剤を有効成分として含有する育毛医薬品。

3. 請求項 1記載の育毛剤を有効成分として含有する育毛食品。

4. 請求項 1記載の育毛剤を有効成分として含有する育毛化粧品。

5. Ar g—P r o— Le u— Ly s— P r o—T r pで示されるぺプチドを用いて育毛を促進する方法。

6. Ar g-P r o-Le u-Ly s-P r o—T r pで示されるペプチドを有効成分とする抗脱毛症剤。

7. Ar g— P r o— Le u— Ly s— P r o— Tr pで示されるペプチドを用いて脱毛を抑制する方法。