JP2019508489A - 発毛促進活性及び／又はメラニン生成促進活性を示すペプチド及びその用途 - Google Patents

Abstract

本発明は、発毛促進活性及び／又はメラニン生成促進活性を示すペプチド、前記ペプチドを有効成分として含む脱毛防止及び／又は改善用組成物、前記ペプチドを有効成分として含む発毛及び／又は育毛促進用組成物、前記ペプチドの脱毛防止及び／又は改善用途、前記ペプチドの発毛及び／又は育毛促進用途、前記ペプチドを有効成分として含むメラニン低色素症の予防及び／又は治療用薬剤学的組成物、前記ペプチドを有効成分として含むメラニン低色素症の予防及び／又は改善用化粧品組成物、及び前記ペプチドのメラニン低色素症の予防、改善、及び／又は治療用途に関するものである。前記ペプチドは毛嚢細胞成長を促進し、発毛関連成長因子及び発毛関連因子の発現を増加させることによって、発毛に優れる効果を示す。また、前記ペプチドは、チロシナーゼの活性及び発現を増加させ、メラニン形成に関与する因子の発現を増加させることによって、メラニン生成において優れる効果を示す。前述した本発明のペプチドの優れる活性及び安定性により前記ペプチドは医薬、医薬外品、及び化粧品に非常に有利に適用できる。【選択図】図１ａ

Description

本発明は、発毛促進活性及び／又はメラニン生成促進活性を示すペプチド、前記ペプチドを有効成分として含む脱毛防止及び／又は改善用組成物、前記ペプチドを有効成分として含む発毛及び／又は育毛促進用組成物、前記ペプチドの脱毛防止及び／又は改善用途、前記ペプチドの発毛及び／又は育毛促進用途、前記ペプチドを有効成分として含むメラニン低色素症の予防及び／又は治療用薬剤学的組成物、前記ペプチドを有効成分として含むメラニン低色素症の予防及び／又は改善用化粧品組成物、及び前記ペプチドのメラニン低色素症の予防、改善、及び／又は治療用途に関するものである。

毛嚢は哺乳動物の皮膚の独特の器官であって、原始表皮の下部が成長してより深い皮膚層に伸張された器官である。毛嚢の基部には小嚢または真皮乳頭細胞として知られている細胞のプラグが存在し（非特許文献１）、乳頭は毛嚢の正常な循環（非特許文献２〜３）及び毛幹の成長に必須である。毛幹はケラチンフィラメントとフィラメント凝集タンパク質で充填された硬く密着した上皮細胞で製造されたトレッド形状の構造である。

人間の毛髪は周期的に生長期、退行期、休止期を繰り返して毛髪が抜けてまた生成される過程を経るようになる。毛髪周期の決定はホルモン調節や多くの成長因子などの調節を通じてなされる。一方、毛髪は激しいストレスや栄養欠乏などにより早く退行期を経て休止期に入って激しい脱毛が誘発されることがある（非特許文献４）。

男性型ハゲ頭において頭皮の前面及び上部の毛嚢はアンドロゲンに対して感受性を示す。それで、男性型ハゲ頭の場合、毛嚢の破壊よりは毛嚢の小型化に該当するが、男性ホルモンであるアンドロゲンの過剰な分泌が原因である。アンドロゲン過剰分泌によって５−アルファ還元酵素が活性化されてテストステロンがジヒドロテストステロン（ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ、ＤＨＴ）に変形され、このように生成されたジヒドロテストステロンは毛髪が伸びる期間を短縮させ、毛嚢を小型化させて、太くて丈夫な成毛の数を減少させることによって、脱毛を誘発させる。

一般に、年を取るにつれて脱毛が拡散される。例えば、傷跡脱毛症、火傷、または圧迫傷害と関連した傷跡形成状態のような相異する疾患状態が顕著な脱毛を起こすことがある。このような脱毛現象を治療するために、今までは医薬品にさまざまな物質などが使われてきたが、値段があまり高く、さまざまな副作用が誘発される。

また、このような医薬品は持続的な使用を必要とし、使用を中断した時にはまた脱毛が誘発され、効能に対する個々人の差が激しく、副作用も個々人毎に差があるという短所がある。

その他、化粧品に用いられている原料は値段が低廉であるという長所があるが、植物抽出物由来成分から構成されているので、実際その効能は大きくないという短所がある。したがって、効果的で、かつ費用的な面でもより経済的な新しい有効成分に対する要求が当業界に台頭している。

今まで知られている２つの利用可能な薬物（ミノキシジル及びフィナステリド）は追加脱毛を遅延させることはできるが、新しい毛嚢の再生を誘導することはできなかった。また、頭髪化粧品のうち、植物抽出物などを用いた脱毛防止製品が多く発売された。

例えば、クララ、唐辛子、當藥、桑白皮、桑葉、人参、甘草、芍薬、地黄、茴香、山茱萸、ニンニクなどの抽出物を含有した製品、キサンチン及び成長ホルモンを含有する組成物を添加してジヒドロテストステロンの過剰に伴う細胞代謝の抑制を改善すると共に、成長ホルモンが毛髪成長を促進することによって、脱毛防止及び毛髪を再生して毛髪成長促進効果を示す製品、発毛及び毛髪の成長を促進するためにミネラル及びビタミン類、緑茶、ローズマリー、ヨモギ、甘草抽出液を含有した製品を開発して、頭皮と毛髪に栄養を供給し、脱毛の予防及び毛髪成長促進に効果がある発毛促進用製品、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、及び葉酸などの物質と植物抽出物を混合して人体内の５−アルファ還元酵素を抑制して男性ホルモンの代謝過程でジヒドロテストステロンガ形成されないようにし、髪の毛の新陳代謝作用を助ける男性型脱毛製品が開発されたが、新生毛髪の生成まで影響を及ぼす製品は見つけることができなかった。

皮膚細胞は紫外線や環境汚染、その他の外部要因の刺激に対して防御機転として表皮基底層に存在するメラニン細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）のメラニン小体（ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅ）でメラニンを生成する。メラニンは動物の皮膚、瞳、髪の毛の色を決定する重要な要因である。低色素症は皮膚癌の危険因子とも知られている。

東洋人らはメラニンが過多に生成されることに敏感で、メラニン生成を抑制する美白関連の研究が多く遂行された。しかしながら、最近にはメラニン生成が抑制されて表れる白斑症（Ｖｉｔｉｌｉｇｏ）に対する要求も増加しているので、これに対する研究も進められている。

白斑症は、メラニン細胞の死滅や怪死によるさまざまな大きさ及び形態の白色斑が皮膚に表れる後天性脱色素疾患である。全世界的に人口の約１％で表れる比較的ありふれた疾患で、人種や地域に従う差はない。発生年齢は１０〜３０歳に最も多く、９５％の場合は４０歳以前に発病し、患者の３０％で家族力がある。

白斑症が生じる原因に対してまだ正確に判明されたところがないが、自家免疫説、神経体液説、メラニン細胞自家破壊説など、さまざまな説が提示されている。自家免疫説はメラニン細胞系抗原に対する自家抗体の発現によりメラニン細胞の破壊または機能異常がもたらされるか、または細胞毒性リンパ球や活性化されたリンパ球が分泌したリンフォカインにメラニン細胞が破壊されるという説である。神経体液説は、カテコールアミン生合成の異常とモノアミン酸化酵素の増加などによってストレスと関連した過酸化水素が作られて、これによってメラニン細胞が破壊されるという説であって、白斑症が神経節に沿って発生するか、または神経損傷やストレス後に発病することもある。メラニン細胞自家破壊説は、メラニン形成過程で生じる中間代謝物質や最終代謝物質であるフェノール複合体がメラニン細胞内に蓄積されて細胞を破壊するという説である。その他、固有細胞欠損（ｉｎｈｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｆｅｃｔ）、遺伝要因、細胞死滅、カルシウム代謝異常などの多様な因子が提示されている。

メラニンは、メラニン生成細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ）から合成され、紫外線照射や毒性物質と化学物質を吸収することによって、皮膚を保護することに重要な役割をする。したがって、メラニン合成が正常に起こらない人々では全ての皮膚が白色になるよりは部分的に白色に変わって斑が生じる外形的な問題点もあり、外部刺激に敏感になることがさらに問題である。

メラニン合成に重要な酵素であるチロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、ＴＲＰ−１（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）、ＴＲＰ−２（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−２）は酸化的反応に触媒として作用する（非特許文献５）。

チロシナーゼはチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）をＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）で、ＤＯＰＡをＤＯＰＡキノン（ｑｕｉｎｏｎｅ）に酸化させる作用をし、ＴＲＰ−１はジヒドロキシインドルカルボキシル酸オキシダーゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｉｎｄｏｌｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ）として５，６−ジヒドロキシインドル−２−カルボキシル酸（５，６−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｉｎｄｏｌｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ；ＤＨＩＣＡ）をインドル−５，６−キノン−２−カルボキシル酸（ｉｎｄｏｌ−５，６−ｑｕｉｎｏｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）に変化させることに関与する。

ＴＲＰ−１はチロシナーゼを安定化させ、活性を調節する役割をし、ＴＲＰ−２はＤＯＰＡクロムタウトメラーゼにてＤＯＰＡクロムをＤＨＩＣＡに変化させてメラニン細胞をなすユーメラノン（ｅｕｍｅｌａｎｏｎ）とフェオメラノン（ｐｈｅｏｍｅｌａｎｏｎ）を形成し、これらの割合によって皮膚、髪の毛、瞳の色などが決定される。

メラニン合成は、紫外線照射とＭＳＨ（α−ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）によって活性化される。α−ＭＳＨはペプチドホルモンで、紫外線により生成され、脳下垂体及び皮膚を含んだいろいろな細胞から作られるものとして知られている。

α−ＭＳＨは側分泌（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）によりメラニン生成細胞のＭＣＲ（ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に作用して転写因子であるＭＩＴＦ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）の活性を調節してメラニン合成に重要な役割をするチロシナーゼ、ＴＲＰ−１（ＤＨＩＣＡ ｏｘｉｄａｓｅ）、ＴＲＰ−２（ＤＯＰＡｃｈｒｏｍｅ ｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ）などの活性を調節する（非特許文献６）。

メラニン形成細胞がＵＶまたはα−ＭＳＨによって刺激されれば、各々ｐ３８やＰＫＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ）によりチロシナーゼが活性化されると報告された。ところで、この２つ経路のうち、特にα−ＭＳＨ−＞ｃＡＭＰ−＞ＰＫＡ過程がメラニン合成に重要な役割をするが、ｃＡＭＰの増加はＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）リン酸化を促進させ、これが転写因子であるＭＩＴＦの発現を増加させ、これはチロシナーゼの活性を向上させ、チロシナーゼｍＲＮＡ発現を増加させるという報告がある（非特許文献７〜８）。

一方、我が国をはじめとする東洋人らは誰でも真っ白い皮膚色を有することを願うため、メラニン生成を抑制する美白成分に対する研究を多く遂行してきた。しかしながら、メラニンは皮膚のメラニン生成細胞から合成され、紫外線照射や毒性物質と化学物質を吸収することによって、皮膚を保護することに重要な役割をする。メラニンの正常な合成が表れない場合は、皮膚が外部刺激に敏感で、外形的にも非正常的に見えるので、メラニン合成が正常化できるように治療することが必要であり、これに対する研究も遂行されたものがある。しかしながら、まだメラニン合成を促進させることに対する技術開発が十分に遂行されていない。

本明細書の全体に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体として本明細書に参照として挿入されて本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。

Ｓｔｅｎｎ ａｎｄ Ｐａｕｓ， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ．， ８１： ４４９ （２００２） Ｏｌｉｖｅｒ， Ｅｍｂｒｙｏｌ． Ｅｘｐ． Ｍｏｒｐｈ． １５： ３３１１ （１９６６） Ｏｌｉｖｅｒ， Ｅｍｂｒｙｏｌ． Ｅｘｐ． Ｍｏｒｐｈ． １６： ２３１ （１９６６） Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， １６２（３）（２００３）， （Ａｒｃｋ， Ｐｅｔｒａ Ｃｌａｒａ； Ｈａｎｄｊｉｓｋｉ， Ｂｏｒｉ） Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． １４ （６）： ４３７４４ ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖｏｌ． ２７３， Ｎｏ． ３１， Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｊｕｌｙ ３１， ｐｐ． １９５６０９５６５， １９９８ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３０ （１４）： ３０９６１０６ Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ ２１ （６）： ６６５７６

本発明者らは、生物学的に有効な活性を有するペプチドを開発するために努力した結果、配列表の配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドが優れる発毛効能及びメラニン生成促進活性を示すことを確認し、これらが脱毛防止または改善及びメラニン低色素症の予防及び治療に有用に使用できることを究めることによって、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の目的は配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなる発毛促進活性を示すペプチドを提供することにある。

本発明の他の目的は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む脱毛防止及び／又は改善用組成物を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む発毛及び／又は育毛促進用組成物を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるメラニン生成促進活性を示すペプチドを提供することにある。

本発明の更に他の目的は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含むメラニン低色素症の予防及び／又は治療用薬剤学的組成物を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含むメラニン低色素症の予防及び／又は改善用化粧品組成物を提供することにある。

本発明の他の目的及び利点は、以下の発明の詳細な説明、請求範囲、及び図面により一層明確になる。

本発明者らは、生物学的に有効な活性を有するペプチドを開発するために努力した結果、配列表の配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドが優れる発毛効能及びメラニン生成促進活性を示すことを確認し、これらが脱毛防止または改善及びメラニン低色素症の予防及び治療に有用に使用できることを究めた。

本発明のペプチドは本発明者らが保有しているペプチドライブラリーのうち、細胞増殖実験を通じて発毛効能に優れるペプチドをスクリーニングしたものであって、総２種が本発明のペプチドに提供される。

本発明は発毛促進活性及び／又はメラニン生成促進活性を示すペプチド、前記ペプチドを有効成分として含む脱毛防止及び／又は改善用組成物、前記ペプチドを有効成分として含む発毛及び／又は育毛促進用組成物、前記ペプチドの脱毛防止及び／又は改善用途、前記ペプチドの発毛及び／又は育毛促進用途、前記ペプチドを有効成分として含むメラニン低色素症の予防及び／又は治療用薬剤学的組成物、前記ペプチドを有効成分として含むメラニン低色素症の予防及び／又は改善用化粧品組成物、及び前記ペプチドのメラニン低色素症の予防、改善、及び／又は治療用途に関するものである。前記ペプチドは毛嚢細胞成長を促進し、発毛関連成長因子及び発毛関連因子の発現を増加させることによって、発毛に優れる効果を示す。また、前記ペプチドはチロシナーゼの活性及び発現を増加させ、メラニン形成に関与する因子の発現を増加させることによって、メラニン生成において優れる効果を示す。前述した本発明のペプチドの優れる活性及び安定性により前記ペプチドは医薬、医薬外品、及び化粧品に非常に有利に適用できる。

本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドのヒト毛乳頭細胞（Ｈｕｍａｎ ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ ｃｅｌｌｓ、ＨＨＦＤＰＣ）成長促進効果を示すグラフである。 本発明の一実施形態に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドのヒト毛乳頭細胞（Ｈｕｍａｎ ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ ｃｅｌｌｓ、ＨＨＦＤＰＣ）成長促進効果を示すグラフである。 本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによりβ−カテニンの発現が増加することを確認した結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによりβ−カテニンの発現が増加することを確認した結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによるＶＥＧＦの発現増加を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによるＫＧＦの発現増加を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによるＥＲＫリン酸化増加を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによるＰＩ３Ｋ発現増加及びＥＲＫリン酸化増加を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによるＭＳＸ２発現増加を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによるＴＧＦ−β１発現抑制を確認した結果を示す写真である。 本発明の一実施形態に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによるＴＧＦ−β１発現抑制を確認した結果を示す写真である。 本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによるＢｃｌ−２の発現増加及びＢａｘの発現減少を確認した結果を示す写真である。 本発明の一実施形態に係る配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドによるＢｃｌ−２の発現増加及びＢａｘの発現減少を確認した結果を示す写真である。 本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによるＨａ３−ＩＩ及びケラチン−１４の発現増加を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによるケラチン−１４の発現増加を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによるヒト毛乳頭細胞でＤＨＴ処理により増加した毛髪成長遅延関連因子であるＤＫＫ−１のｍＲＮＡ発現減少を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによるヒト毛乳頭細胞でＤＨＴ処理により増加した毛髪成長遅延関連因子であるＤＫＫ−１のｍＲＮＡ発現減少を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによるＤＫＫ−１の発現減少を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによるＤＫＫ−１の発現減少を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによるメラニン生成増加効果を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによるメラニン生成増加効果を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによりチロシナーゼの活性が増加することを確認した結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによりチロシナーゼの活性が増加することを確認した結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによりＭＩＴＦ、チロシナーゼのｍＲＮＡ発現が増加することを確認した結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによりＭＩＴＦ、チロシナーゼ、ＴＲＰ１のｍＲＮＡ発現が増加することを確認した結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによりＭＩＴＦ及びチロシナーゼのタンパク質発現が増加することを確認した結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによりＭＩＴＦ及びチロシナーゼのタンパク質発現が増加することを確認した結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによるＣＲＥＢのリン酸化増加を確認した結果を示す図である。

本発明の一態様は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含む発毛促進活性を示すペプチドに関するものである。

前記ペプチドは配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含むものであって、例えば、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドのものでありうる。

本発明のペプチドは、アミノ酸配列の一部の部位を選定し、その活性を増加させるためにＮ−末端またはＣ−末端に変形を誘導することができる。

例えば、前記Ｃ−末端変形はペプチドのＣ−末端がヒドロキシ基（−ＯＨ）、アミノ基（−ＮＨ_２）、アザイド（−ＮＨＮＨ_２）などに変形されるものでありうるが、これに限定されるものではない。

また、前記Ｎ−末端変形は、ペプチドのＮ−末端がアセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で構成された群から選択された１種以上の保護基が結合されるものでありうるが、これに限定されるものではない。前記保護基は、生体内のタンパク質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護する作用をする。

前記ペプチドのＮ−末端及び／又はＣ−末端変形は、ペプチドの安定性を格段に改善する作用をし、このような変形を通じて本発明のペプチドは生体内投与時の半減期を増加させて高い半減期を有することができる。

本発明の一態様によれば、本発明のペプチドは毛嚢細胞成長を促進し、毛髪成長関連因子であるβ−カテニンの発現を増加させ、発毛関連成長因子であるＫＧＦ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）の発現を増加させ、発毛シグナリング分子であるＰＩ３Ｋ（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ）の発現を増加させ、ＥＲＫ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ）のリン酸化を増加させ、毛髪成長関連因子であるＭＳＸ２、Ｈａ３−ＩＩ、及びケラチン−１４の発現を増加させ、毛髪成長遅延と関連したＴＧＦ−β１及びＤＫＫ−１の発現を減少させ、細胞死滅抑制タンパク質であるＢｃｌ−２の発現増加、及び細胞死滅関連タンパク質であるＢａｘの発現減少を誘導する。

このような結果は本発明のペプチドが発毛に対して非常に優れる効能を有するということを意味する。したがって、本発明のペプチドは脱毛防止または改善、発毛促進、及び毛髪成長改善用途に利用できる。

本発明の他の態様は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択された１種以上のペプチドを有効成分として含む脱毛防止または改善用組成物に関するものである。

本発明のペプチドは、毛根が生成できるようにする皮膚組織の髪の毛卵胞（ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ）にある細胞の増殖を誘導して新たな毛嚢が生成できるようにする。さらに、β−カテニン（ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ）のシグナルを活性化させて発毛促進遺伝子を発現させ、発毛に関与する成長因子の発現を増加させる。

本発明のペプチドは毛髪が生成され成長される時期である生長期を促進させる役割をし、さまざまな環境的な要因により退行期へ行く毛髪の周期を生長期に維持するようにすることによって、脱毛抑制効果を示し、正常毛髪では毛髪に栄養分を供給して毛髪健康が維持できるようにする。したがって、本発明の組成物は脱毛防止及び／又は改善に非常に効果的である。

本発明の組成物は前述した本発明のペプチドを有効成分として含むので、この２つの間の共通した内容は本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。

本発明の更に他の態様は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択された１種以上のペプチドを有効成分として含む発毛及び／又は育毛促進用組成物に関するものである。

本発明の組成物は化粧品組成物に製造できるが、これに限定されるものではない。

前記化粧品組成物は、前述した本発明のペプチドの化粧品学的有効量（ｃｏｓｍｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）を含むものでありうる。

また、前記化粧品組成物は化粧品学的に許容される担体を追加的に含むものでありうるが、これに限定されるものではない。

本発明の化粧品組成物は当業界で通常的に製造されるいかなる剤形にも製造されることができ、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤−含有クレンジング、オイル、粉末ファウンデーション、乳濁液ファウンデーション、ワックスファウンデーション、及び／又はスプレーなどに剤形化できるが、これに限定されるものではなく、例えば、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー、及び／又はパウダーの剤形に製造できる。

前記化粧品組成物の剤形がペースト、クリーム、またはゲルの場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、及び／又は酸化亜鉛などが利用できるが、これに限定されるものではない。

前記化粧品組成物の剤形がパウダーまたはスプレーの場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、及び／又はポリアミドパウダーが利用できるが、これに限定されるものではない。

前記化粧品組成物の剤形がスプレーの場合には、追加的にクロロフルオロハイドロカーボン、プロパン／ブタン、及び／又はジメチルエーテルのような推進体を含むことができるが、これに限定されるものではない。

前記化粧品組成物の剤形が溶液または乳濁液の場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤、及び／又は乳濁化剤が用いられることができ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、及び／又はソルビタンの脂肪酸エステルが利用できるが、これに限定されるものではない。

前記化粧品組成物の剤形が懸濁液の場合には、担体成分として、水、エタノール、及び／又はプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、及び／又はポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガー、及び／又はトラガカントなどが利用できるが、これに限定されるものではない。

前記化粧品組成物の剤形が界面−活性剤含有クレンジングの場合には、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホスクシン酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、及び／又はエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが利用できるが、これに限定されるものではない。

本発明の化粧品組成物に含まれる成分は有効成分としてのペプチド類と担体成分の以外に、化粧品組成物に通常的に用いられる成分を含むことができ、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、及び／又は香料のような通常的な補助剤を含むことができるが、これに限定されるものではない。

本発明の更に他の一態様は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドの脱毛防止、及び／又は改善用途に関するものである。

前記ペプチドは前述したペプチドと同一であるので、共通した内容は本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。

本発明の更に他の一態様は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドの発毛及び／又は育毛促進用途に関するものである。

前記ペプチドは前述したペプチドと同一であるので、共通した内容は本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。

本発明の更に他の一態様は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるメラニン生成促進活性を示すペプチドに関するものである。

本発明の一態様によれば、本発明のペプチドはメラニン形成細胞でメラニン生成を増加させ、メラニン合成を調節する酵素であるチロシナーゼの発現を増加させ、メラニン形成に関与する因子であるＭＩＴＦ、ＴＲＰ１の発現を増加させ、ＣＲＥＢのリン酸化を増加させる。

このような結果は、本発明のペプチドがメラニン生成を増加させることによって、メラニン低色素症が緩和されるようにする効果を有するということを意味する。したがって、本発明のペプチドはメラニン低色素症の予防、改善、及び／又は治療用途に利用できる。

前記メラニン低色素症は、白斑症、白色症、脱色素母斑、白色粃糠疹、白癜、炎症後脱色症、斑状硬皮症、部分白皮症、特発性滴状低色素症、及び／又は点状白皮症のものでありうるが、これに限定されるものではない。

本発明の更に他の態様は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択された１種以上のペプチドを有効成分として含むメラニン低色素症の予防及び／又は治療用薬剤学的組成物に関するものである。

本発明の組成物が薬剤学的組成物に製造される場合、前述した本発明のペプチドの薬剤学的有効量（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）を含むものでありうる。

また、前記薬剤学的組成物は薬剤学的に許容される担体を追加的に含むものでありうるが、これに限定されるものではない。

本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は製剤時に通常的に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、珪酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアル酸マグネシウム、及び／又はミネラルオイルなどを含むことができるが、これに限定されるものではない。

本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加で含むことができるが、これに限定されるものではない。

本発明の薬剤学的組成物は非経口で投与するものでありうるが、例えば、皮膚局所投与により投与することができる。

本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因により多様で、普通に熟練した医師は所望の治療または予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の好ましい具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は０．００１−１０００ｍｇ／ｋｇである。

本発明の薬剤学的組成物は、当該発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量形態に製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造できる。

この際、剤形はオイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、または油化液形態であるか、またはエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、またはゲル（例えば、ハイドロゲル）形態であって、分散剤または安定化剤をさらに含むことができるが、これに限定されるものではない。

本発明の更に他の態様は、配列番号１または配列番号２からなるペプチドからなる群から選択された１種以上のペプチドを有効成分として含むメラニン低色素症の予防及び／又は改善用化粧品組成物を提供する。

本発明の組成物が化粧品組成物に製造される場合、前述した本発明のペプチドの化粧品学的有効量（ｃｏｓｍｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）を含むものでありうる。

また、前記化粧品組成物は化粧品学的に許容される担体を追加的に含むものでありうるが、これに限定されるものではない。

本明細書で、用語“ペプチド”は、ペプチド結合によりアミノ酸残基が互いに結合されて形成された線形の分子を意味する。本発明のペプチドは当業界に公知された化学的合成方法、特に固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ； Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５：２１４９−５４（１９６３）； Ｓｔｅｗａｒｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｎｄ． ｅｄ．， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ． Ｃｏ．： Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， １１１（１９８４））、または液相合成技術（ＵＳ登録特許第５，５１６，８９１号）により製造できる。

本明細書で、用語“安定性”は、イン・ビボ安定性だけでなく、貯蔵安定性（例えば、常温貯蔵安定性）も意味する。

本発明で、“発毛促進”は毛髪が生成されることを意味し、毛髪生成速度及び生成量を増加させる広い意味として使われる。また、毛根機能が強化されるか、または毛髪の脱落及び生成周期が短くなって毛嚢で伸びる毛髪の数が増加することを意味する。

本発明において、“毛髪成長”または“育毛”は、生成された毛髪（髪の毛）の太さが増加するか、長さ伸び速度に影響を及ぼすことを意味する。

本発明において、“脱毛防止”は、毛嚢または頭皮から毛髪が抜ける現象が阻止または弱化されることを意味する。

本明細書で、用語“化粧品学的有効量”は、前述した本発明の組成物の効能を達成するのに十分な量を意味する。

本明細書で、用語“薬剤学的有効量”は前述したペプチドの効能または活性を達成することに十分な量を意味する。

以下、実施形態を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施形態はただ本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨に従って本発明の範囲がこれら実施形態により制限されないということは当業界で通常の知識を有する者において自明である。

実施形態
合成例１：ペプチドの合成
クロロトリチルクロライドレジン（Ｃｈｌｏｒｏ ｔｒｉｔｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｒｅｓｉｎ； ＣＴＬ ｒｅｓｉｎ， Ｎｏｖａ ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔ Ｎｏ． ０１−６４−００２１）７００ｍｇを反応容器に入れてメチレンクロライド（ＭＣ）１０ｍｌを加えて３分間撹拌した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍｌを入れて３分間撹拌した後、また溶媒を除去した。反応器に１０ｍｌのジクロロメタン溶液を入れてＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）４００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かして、１時間の間撹拌しながら反応させた。反応後、洗浄し、メタノールとＤＩＥＡ（２：１）をＤＣＭ（ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）に溶かして１０分間反応させ、過量のＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）で洗浄した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を１０ｍｌ入れて３分間撹拌した後、また溶媒を除去した。脱保護溶液（２０％のピペリジン（Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）／ＤＭＦ）１０ｍｌを反応容器に入れて１０分間常温で撹拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れて、また１０分間反応を維持した後、溶液を除去し、各々３分ずつＤＭＦで２回、ＭＣで１回、ＤＭＦで１回洗浄してＬｅｕ−ＣＴＬ Ｒｅｓｉｎを製造した。新たな反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れて、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ、ＨｏＢｔ ２００ｍｍｏｌｅ、及びＢｏｐ ２００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かした。反応器に４００ｍｍｏｌｅ ＤＩＥＡを分画に２回に亘って入れた後、全ての固体が溶けるまで最小限５分間撹拌した。溶かしたアミノ酸混合溶液を脱保護されたレジンがある反応容器に入れて１時間の間常温で撹拌しながら反応させた。反応液を除去し、ＤＭＦ溶液で３回５分ずつ撹拌した後、除去した。反応レジンを少量取ってカイザーテスト（Ｎｉｈｙｄｒｉｎ Ｔｅｓｔ）を用いて反応程度を点検した。脱保護溶液で前記と同様に２回脱保護反応させてＴｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−ＣＴＬ Ｒｅｓｉｎを製造した。ＤＭＦとＭＣで十分に洗浄し、もう一度カイザーテストを遂行した後、前記と同様に以下のアミノ酸付着実験を遂行した。選ばれたアミノ酸配列に基づいてＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨの順に連鎖反応させた。Ｆｍｏｃ−保護基を脱保護溶液で１０分ずつ２回反応させた後、よく洗浄して除去した。無水酢酸とＤＩＥＡ、ＨｏＢｔを入れて１時間の間アセチル化を遂行した後、製造されたペプチジルレジンをＤＭＦ、ＭＣ、及びメタノールで各々３回を洗浄し、窒素空気をゆっくり流して乾燥した後、Ｐ_２Ｏ_５下で真空に減圧して完全に乾燥した後、脱漏溶液［トリフルロ化酢酸（Ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）９５％、蒸留水２．５％、チオアニソール（Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）２．５％］３０ｍｌを入れた後、常温で時々揺らしながら２時間反応を維持した。フィルタリングを行ってレジンを濾して、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合せた。減圧を用いて全体ボリュームが半分位残るように蒸留し、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈殿を誘導した後、遠心分離して沈殿を集めて、もう２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去し、窒素下で十分に乾燥して精製前Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕペプチド１を０．７３ｇ合成した（収率：９３．１％）。分子量測定機を用いて測定時、分子量１１６２．３（理論値：１１６２．３）を得ることができた。他の配列番号２のペプチドも前記のような方法により合成を進行した。

実施形態１：ＤＰＣ増殖アッセイ
ヒト毛乳頭細胞（Ｈｕｍａｎ ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ ｃｅｌｌｓ）を２×１０^３細胞／ウェルの密度で９６−ウェルプレートにシーディングした後、一晩中培養した。無血清培地に変えた後、ペプチドを処理して３日間培養し、４ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ溶液を１００ｕｌずつウェルに処理して４時間反応させた。生成されたホルマザンをＤＭＳＯ処理を通じて溶かして出した後、マイクロプレートリーダを使用して５６０ｎｍでの吸光度を測定して、その結果を図１ａ及び図１ｂに示した。

図１ａ及び図１ｂから確認できるように、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド処理によりヒト毛乳頭細胞の成長が濃度依存的に促進されることを確認した。

実施形態２：β−カテニン活性試験
ヒト毛乳頭細胞を４×１０^５細胞／ウェルの密度で６−ウェルプレートにシーディングした後、一晩中培養した。無血清培地に変えた後、ペプチドを処理して１５、３０分培養し、細胞を回収して核と細胞質タンパク質を各々分離した。β−カテニン抗体（ｓａｎｔａｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いてウェスタンブロッティングを遂行してβ−カテニン発現様相を比較して、その結果を図２ａ及び図２ｂに示した。

図２ａ及び図２ｂから確認できるように、ヒト毛乳頭細胞で毛髪成長関連因子であるβ−カテニンの発現が配列表の配列番号１または配列番号２のペプチド処理により増加した。β−カテニン発現増加及び活性は毛髪成長関連分子の発現を増加させる。

実施形態３：ＫＧＦ、ＶＥＧＦ ＲＴ−ＰＣＲ
ヒト毛乳頭細胞を４×１０^５細胞／ウェルの密度で６−ウェルプレートにシーディングした後、一晩中培養した。無血清培地に変えた後、ペプチドを処理して２４時間の間培養し、細胞を回収してＲＮＡを分離した。ＲＮＡ定量後、ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲプリミックス（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）及びＫＧＦ、ＶＥＧＦ各々のプライマーを用いてＰＣＲ進行後、５％アガロースゲルに電気泳動して各サンプル処理条件で前記成長因子のｍＲＮＡ発現程度を比較して、その結果を図３ａ及び図３ｂに示した。

図３ａから確認できるように、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド処理によりヒト毛乳頭細胞の成長に影響を与えるＶＥＧＦの発現が増加することを確認した。

また、図３ｂから確認できるように、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド処理によりヒト毛乳頭細胞の成長に影響を与える因子であるＫＧＦの発現が増加することを確認した。

実施形態４：ＰＩ３Ｋ ＆ ｐ−ＥＲＫ ＷＢ
ヒト毛乳頭細胞を４×１０^５細胞／ウェルの密度で６−ウェルプレートにシーディングした後、一晩中培養した。無血清培地に変えた後、ペプチドを処理して１５、３０分培養し、細胞を回収して細胞溶解物を準備した。ＰＩ３Ｋ抗体（ｓａｎｔａｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）及びｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いてウェスタンブロッティングを遂行してタンパク質発現様相を比較して、その結果を図４ａ及び図４ｂに示した。

図４ａから確認できるように、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド処理によりヒト毛乳頭細胞の成長に影響を与えるＥＲＫリン酸化レベルが増加した。

また、図４ｂから確認できるように、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド処理によりヒト毛乳頭細胞で毛髪成長シグナリング分子であるＰＩ３Ｋの発現増加及びＥＲＫリン酸化レベル増加が観察された。

実施形態５：ＭＳＸ２ ＲＴ−ＰＣＲ
ヒト毛乳頭細胞を４×１０^５細胞／ウェルの密度で６−ウェルプレートにシーディングした後、一晩中培養した。無血清培地に変えた後、ペプチドを処理して２４時間の間培養し、細胞を回収してＲＮＡを分離した。ＲＮＡ定量後、ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲプリミックス（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）及びＭＳＸ２プライマーを用いてＰＣＲ進行後、５％アガロースゲルに電気泳動して各サンプル処理条件で前記成長因子のｍＲＮＡ発現程度を比較して、その結果を図５に示した。

図５から確認できるように、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド処理によりヒト毛乳頭細胞で毛幹（ｈａｉｒ ｓｈａｆｔ）伸張（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）に影響を与える因子であるＭＳＸ２の発現が増加した。

実施形態６：ＴＧＦ−β１ ＲＴ−ＰＣＲ
ヒト毛乳頭細胞を４×１０^５細胞／ウェルの密度で６−ウェルプレートにシーディングした後、一晩中培養した。無血清培地に変えた後、ペプチドを処理して２４時間の間培養し、細胞を回収してＲＮＡを分離した。ＲＮＡ定量後、ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲプリミックス（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）及びＴＧＦ−β１プライマーを用いてＰＣＲ進行後、５％アガロースゲルに電気泳動して各サンプル処理条件で前記成長因子のｍＲＮＡ発現程度を比較して、その結果を図６ａ及び図６ｂに示した。

図６ａ及び図６ｂから確認できるように、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド処理によりヒト毛乳頭細胞で毛髪成長抑制因子のうちの１つであるＴＧＦ−β１の発現が抑制されることを確認した。

実施形態７：Ｂｃｌ−２／Ｂａｘ ＷＢ
ヒト毛乳頭細胞を４×１０^５細胞／ウェルの密度で６−ウェルプレートにシーディングした後、一晩中培養した。無血清培地に変えた後、ペプチドを処理して２４時間培養し、細胞を回収して細胞溶解物を準備した。Ｂｃｌ−２及びＢａｘ抗体（ｓａｎｔａｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いてウェスタンブロットを遂行してタンパク質発現様相を比較して、その結果を図７ａ及び図７ｂに示した。

図７ａ及び図７ｂから確認できるように、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド処理によりヒト毛乳頭細胞で抗−細胞死滅タンパク質であるＢｃｌ−２の発現が増加し、細胞死滅関連タンパク質であるＢａｘの発現が減少した。

実施形態８：Ｈａ３−ＩＩ及びケラチン−１４ ＲＴ−ＰＣＲ
ヒト毛乳頭細胞を５×１０^５細胞／ウェルの密度で６−ウェルプレートにシーディングした後、一晩中培養した。無血清培地に変えた後、ペプチドを処理して２４時間の間培養し、細胞を回収してＲＮＡを分離した。ＲＮＡ定量後、ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲプリミックス（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）及びＨａ３−ＩＩ、ケラチン−１４プライマーを用いてＰＣＲ進行後、５％アガロースゲルに電気泳動して各サンプル処理条件で前記成長因子のｍＲＮＡ発現程度を比較して、その結果を図８ａ及び図８ｂに示した。

図８ａから確認できるように、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド処理によりヒト毛乳頭細胞で毛髪成長関連因子であるＨａ３−ＩＩ及びケラチン−１４のｍＲＮＡ発現が増加することを確認した。

また、図８ｂから確認できるように、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド処理によりヒト毛乳頭細胞でケラチン−１４のｍＲＮＡ発現が増加することを確認した。

実施形態９：ＤＫＫ−１ＲＴ−ＰＣＲ
ヒト毛乳頭細胞を５×１０^５細胞／ウェルの密度で６−ウェルプレートにシーディングした後、一晩中培養した。無血清培地に変えた後、ペプチドを処理して２４時間の間培養し、細胞を回収してＲＮＡを分離した。ＲＮＡ定量後、ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲプリミックス（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）及びＤＫＫ−１プライマーを用いてＰＣＲ進行後、５％アガロースゲルに電気泳動して各サンプル処理条件で前記成長因子のｍＲＮＡ発現程度を比較して、その結果を図９ａ及び図９ｂに示した。

図９ａ及び図９ｂから確認できるように、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドの処理によりヒト毛乳頭細胞でＤＨＴ処理により増加した毛髪成長遅延関連因子であるＤＫＫ−１のｍＲＮＡ発現が減少した。

実施形態１０：ＤＫＫ−１ ＷＢ
ヒト毛乳頭細胞を４×１０^５細胞／ウェルの密度で６−ウェルプレートにシーディングした後、一晩中培養した。無血清培地に変えた後、ペプチドを処理して２４時間の間培養し、細胞を回収して細胞溶解物を準備した。ＤＫＫ−１抗体（ｓａｎｔａｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いてウェスタンブロットを遂行してタンパク質発現様相を比較して、その結果を図１０ａ及び図１０ｂに示した。

図１０ａ及び図１０ｂから確認できるように、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドの処理によりヒト毛乳頭細胞でＤＨＴ処理により増加した毛髪成長遅延関連因子であるＤＫＫ−１のタンパク質発現が減少した。

実施形態１１：メラニン測定アッセイ
６−ウェル培養用平板にメラニン形成細胞（Ｂ１６Ｆ１０ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）を３７℃培養器で２４時間培養した後、各板の培地を除去し、新たな培地に取替後、本ペプチドを濃度別に処理した。７２時間の間培養した後、培養液を除去し、細胞を剥がした後、１．５ｍｌチューブに移して１３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離して上層液を除去し、細胞ペレットを回収してメラニンを観察した。細胞ペレットを２Ｍ ＮａＯＨ １５０ｕｌずつ入れて６０℃で３０分間細胞内メラニンを溶解させた。９６−ウェル平板の各ウェルに溶解させて得た上層液を１００ｕｌずつ入れて４９０ｎｍで吸光度を測定して、その結果を図１１ａ及び図１１ｂに示した。

図１１ａ及び図１１ｂから確認できるように、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド処理によりメラニン細胞でメラニン生成が増加した。

実施形態１２：チロシナーゼ活性試験
黒色腫細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）の細胞を６−ウェル培養用平板に２４時間培養し、濃度別ペプチドを処理して７２時間培養した。氷の上に６−ウェル培養用平板を上げて、冷たいＰＢＳで洗浄した後、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００が含まれた０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ６．８、溶解バッファ）を３００ｕＬ入れて、細胞を１．５ｍＬチューブに集めて−２７０℃に急速冷凍させた後、解凍させる反応を５回繰り返して細胞膜を破壊した。１３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上層液を他の１．５ｍＬチューブに集めて、この試料のタンパク質を定量した。試料のタンパク質濃度が同じ濃度になるように希薄して９６−ウェル培養用平板に３個のウェルずつ株分けし、１０ｍＭ Ｌ−ｄｏｐａ ２０ｕＬを添加して３７℃で１時間培養後、４７５ｎｍで吸光度を測定して、その結果を図１２ａ及び図１２ｂに示した。

図１２ａ及び図１２ｂから確認できるように、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド処理によりメラニン細胞内チロシナーゼ活性が増加した。

実施形態１３：メラニン生成関連遺伝子ＲＴ−ＰＣＲ
メラニン形成細胞（Ｂ１６Ｆ１０細胞株）を６−ウェル培養用平板に２４時間培養後、ペプチドを濃度別に処理した。７２時間の間培養された細胞のＲＮＡ抽出後、ｃＤＮＡを製作した。メラニン形成に関与する因子であるＭＩＴＦ及びチロシナーゼに対する各々の特異的なプライマーを用いてＰＣＲして各遺伝子の発現変化を観察して、その結果を図１３ａ及び図１３ｂに示した。

図１３ａから確認できるように、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドをメラニン細胞に処理時、メラニン形成過程に関与する転写因子であるＭＩＴＦ及び酵素であるチロシナーゼのｍＲＮＡ発現が増加した。

また、図１３ｂから確認できるように、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドをメラニン細胞に処理時、メラニン形成過程に関与する転写因子であるＭＩＴＦ及び酵素であるチロシナーゼ、ＴＲＰ１のｍＲＮＡ発現が増加した。

実施形態１４：メラニン生成関連タンパク質ウェスタンブロッティング
メラニン形成細胞（Ｂ１６Ｆ１０細胞株）を６−ウェル培養用平板に２４時間培養後、本ペプチドを濃度別に処理した。７２時間の間培養した後、細胞を溶解してメラニン形成に関与する因子であるＭＩＴＦ及びチロシナーゼの発現を特異的な抗体（２種類全てＳａｎｔａｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いてウェスタンブロットにより確認して、その結果を図１４に示した。

図１４ａ及び図１４ｂから確認できるように、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドをメラニン細胞に処理時、メラニン形成過程に関与する転写因子であるＭＩＴＦ及び酵素であるチロシナーゼのタンパク質発現が増加した。

実施形態１５：メラニン生成関連タンパク質活性試験
メラニン形成細胞（Ｂ１６Ｆ１０細胞株）を６−ウェル培養用平板に２４時間培養後、本ペプチドを濃度別に処理した。７２時間の間細胞を培養した後、細胞を溶解してメラニン形成に関与する信号伝達物質であるＣＲＥＢのリン酸化程度を特異的な抗体（ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いてウェスタンブロットにより確認した。

図１５から確認できるように、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドをメラニン細胞に処理時、メラニン形成過程に関与する因子であるＣＲＥＢのリン酸化レベルが増加した。

以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者に当たって、このような具体的な技術は単に好ましい具現例であり、これに本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は添付した請求項とその等価物により定義されるということができる。

本発明は、発毛促進活性及び／又はメラニン生成促進活性を示すペプチド、前記ペプチドを有効成分として含む脱毛防止及び／又は改善用組成物、前記ペプチドを有効成分として含む発毛及び／又は育毛促進用組成物、前記ペプチドの脱毛防止及び／又は改善用途、前記ペプチドの発毛及び／又は育毛促進用途、前記ペプチドを有効成分として含むメラニン低色素症の予防及び／又は治療用薬剤学的組成物、前記ペプチドを有効成分として含むメラニン低色素症の予防及び／又は改善用化粧品組成物、及び前記ペプチドのメラニン低色素症の予防、改善、及び／又は治療用途に関するものである。

Claims (19)

1. 配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなる発毛促進活性を示す、ペプチド。
2. 前記ペプチドは、毛嚢細胞成長を促進することを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
3. 前記ペプチドは、β−カテニン発現を増加させることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
4. 前記ペプチドは、ＫＧＦ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）及びＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選択される発毛関連成長因子の発現を増加させることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
5. 前記ペプチドは、ＰＩ３Ｋ（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ）の発現及びＥＲＫ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｋｉｎａｓｅ）のリン酸化を増加させることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
6. 前記ペプチドは、ＭＳＸ２（Ｍｓｈ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２）、Ｈａ３−ＩＩ（Ｋｅｒａｔｉｎ、ｔｙｐｅ Ｉ ｃｕｔｉｃｕｌａｒ Ｈａ３−ＩＩ）、及びケラチン−１４からなる群から選択される発毛関連因子の発現を増加させることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
7. 前記ペプチドは、ＴＧＦ−β１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ １）及びＤＫＫ−１（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ ＷＮＴ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １）からなる群から選択される毛髪成長遅延因子の発現を減少させることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
8. 前記ペプチドは、Ｂｃｌ−２（Ｂ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ２）の発現を増加させ、Ｂａｘ（ＢＣＬ２−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｘ ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現を減少させることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
9. 配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択された１種以上のペプチドを有効成分として含む、脱毛防止または改善用組成物。
10. 配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択された１種以上のペプチドを有効成分として含む、発毛または育毛促進用組成物。
11. 配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるメラニン生成促進活性を示す、ペプチド。
12. 前記ペプチドは、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）の活性を増加させることを特徴とする、請求項１１に記載のペプチド。
13. 前記ペプチドは、ＭＩＴＦ（Ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）及びＴＲＰ１（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）からなる群から選択されるメラニン合成関連因子の発現を増加させることを特徴とする、請求項１１に記載のペプチド。
14. 前記ペプチドは、チロシナーゼの発現を増加させることを特徴とする、請求項１１に記載のペプチド。
15. 前記ペプチドは、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）のリン酸化を増加させることを特徴とする、請求項１１に記載のペプチド。
16. 配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択された１種以上のペプチドを有効成分として含む、メラニン低色素症の予防または治療用薬剤学的組成物。
17. 前記低色素症は、白斑症、白色症、脱色素母斑、白色粃糠疹、白癜、炎症後脱色症、斑状硬皮症、部分白皮症、特発性滴状低色素症、または点状白皮症であることを特徴とする、請求項１６に記載のメラニン低色素症の予防または治療用薬剤学的組成物。
18. 配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択された１種以上のペプチドを有効成分として含む、メラニン低色素症の改善用化粧品組成物。
19. 前記低色素症は、白斑症、白色症、脱色素母斑、白色粃糠疹、白癜、炎症後脱色症、斑状硬皮症、部分白皮症、特発性滴状低色素症、または点状白皮症であることを特徴とする、請求項１８に記載のメラニン低色素症の改善用化粧品組成物。