JP6866518B2

JP6866518B2 - 発毛及び／又は育毛促進活性を示すペプチド及びその用途

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Publication number: JP6866518B2
Application number: JP2020036395A
Authority: JP
Inventors: ヨンジ・チョン; ウンミ・キム; ウン−ジ・リ; ミンウン・キム
Original assignee: Caregen Co Ltd
Current assignee: Caregen Co Ltd
Priority date: 2016-02-18
Filing date: 2020-03-04
Publication date: 2021-04-28
Anticipated expiration: 2037-02-09
Also published as: JP6672482B2; CN116333044A; US10568828B2; KR20170097830A; EP3418291A1; CN108699109B; KR101791526B1; EP3418291B1; CN116333039A; CN108699109A; JP2020105196A; JP6868723B2; WO2017142254A1; JP2020105197A; EP3418291A4; US20190046427A1; ES2870470T3; JP2019507187A

Description

本発明は、発毛及び／又は育毛促進活性を示すペプチド、前記ペプチドを有効成分として含む発毛促進用組成物及び前記ペプチドの発毛促進用途に関するものである。

毛嚢は哺乳動物の皮膚の独特の器官であって、原始表皮の下部が成長してより深い皮膚層に伸張された器官である。毛嚢の基部には小嚢または真皮乳頭細胞として知られている細胞のプラグが存在し（非特許文献１）乳頭は毛嚢の正常な循環（非特許文献２〜３）及び毛幹の成長に必須である。毛幹はケラチンフィラメントとフィラメント凝集タンパク質で充填された硬く密着した上皮細胞で製造されたトレッド形状の構造である。

人間の毛髪は周期的に生長期、退行期、休止期を繰り返して毛髪が抜けてまた生成される過程を経るようになる。毛髪周期の決定はホルモン調節や多くの成長因子などの調節を通じてなされる。一方、毛髪は激しいストレスや栄養欠乏などにより早く退行期を経て休止期に入って激しい脱毛が誘発されることがある（非特許文献４）。

男性型ハゲ頭において頭皮の前面及び上部の毛嚢はアンドロゲンに対して感受性を示す。それで、男性型ハゲ頭の場合、毛嚢の破壊よりは毛嚢の小型化に該当するが、男性ホルモンであるアンドロゲンの過剰な分泌が原因である。アンドロゲン過剰分泌によって５−アルファ還元酵素が活性化されてテストステロンがジヒドロテストステロン（ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ、ＤＨＴ）に変形され、このように生成されたジヒドロテストステロンは毛髪が伸びる期間を短縮させ、毛嚢を小型化させて、太くて丈夫な成毛の数を減少させることによって、脱毛を誘発させる。

一般に、年を取るにつれて脱毛が拡散される。例えば、傷跡脱毛症、火傷、または圧迫傷害と関連した傷跡形成状態のような相異する疾患状態が顕著な脱毛を起こすことがある。このような脱毛現象を治療するために、今までは医薬品にさまざまな物質などが使われてきたが、値段があまり高く、さまざまな副作用が誘発される。

また、このような医薬品は持続的な使用を必要とし、使用を中断した時にはまた脱毛が誘発され、効能に対する個々人の差が激しく、副作用も個々人毎に差があるという短所がある。

その他、化粧品に用いられている原料は値段が低廉であるという長所があるが、植物抽出物由来成分から構成されているので、実際その効能は大きくないという短所がある。したがって、効果的で、かつ費用的な面でもより経済的な新しい有効成分に対する要求が当業界に台頭している。

今まで知られている２つの利用可能な薬物（ミノキシジル及びフィナステリド）は追加脱毛を遅延させることはできるが、新しい毛嚢の再生を誘導することはできなかった。また、頭髪化粧品のうち、植物抽出物などを用いた脱毛防止製品が多く発売された。

例えば、クララ、唐辛子、當藥、桑白皮、桑葉、人参、甘草、芍薬、地黄、茴香、山茱萸、ニンニクなどの抽出物を含有した製品、キサンチン及び成長ホルモンを含有する組成物を添加してジヒドロテストステロンの過剰に伴う細胞代謝の抑制を改善すると共に、成長ホルモンが毛髪成長を促進することによって、脱毛防止及び毛髪を再生して毛髪成長促進効果を示す製品、発毛及び毛髪の成長を促進するためにミネラル及びビタミン類、緑茶、ローズマリー、ヨモギ、甘草抽出液を含有した製品を開発して、頭皮と毛髪に栄養を供給し、脱毛の予防及び毛髪成長促進に効果がある発毛促進用製品、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、及び葉酸などの物質と植物抽出物を混合して人体内の５−アルファ還元酵素を抑制して男性ホルモンの代謝過程でジヒドロテストステロンが形成されないようにし、髪の毛の新陳代謝作用を助ける男性型脱毛製品が開発されたが、新生毛髪の生成まで影響を及ぼす製品は見つけることができなかった。

本明細書の全体に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体として本明細書に参照として挿入されて、本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。

ＳｔｅｎｎａｎｄＰａｕｓ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，８１：４４９（２００２）Ｏｌｉｖｅｒ，Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．１５：３３１１（１９６６）Ｏｌｉｖｅｒ，Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．１６：２３１（１９６６）ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，１６２（３）（２００３），（Ａｒｃｋ，ＰｅｔｒａＣｌａｒａ；Ｈａｎｄｊｉｓｋｉ，Ｂｏｒｉ）

本発明者らは、優れる発毛及び／又は育毛効能を有するペプチドを開発するために努力した結果、本発明者らのペプチドライブラリーから優れる発毛効能を示す３種のペプチドを選別しており、これらの発毛及び／又は育毛効能に対して実験的に究めることによって、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の目的は配列番号１乃至３からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる発毛及び／又は育毛促進活性を示すペプチドを提供することにある。

本発明の他の目的は、配列番号１乃至３からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される１種以上のペプチドを有効成分として含む脱毛防止及び／又は改善用組成物を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、配列番号１乃至３からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される１種以上のペプチドを有効成分として含む発毛及び／又は育毛促進用組成物を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、配列番号１乃至３からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるペプチドの脱毛防止及び／又は改善用途を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、配列番号１乃至３からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるペプチドの発毛及び／又は育毛促進用途を提供することにある。

本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求範囲、及び図面により、一層明確になる。

本発明者らは、優れる発毛及び／又は育毛促進効能を有するペプチドを開発するために努力した結果、本発明者らのペプチドライブラリーから優れる発毛及び／又は育毛促進効能を示す３種のペプチドを選別しており、これらの発毛及び／又は育毛促進効能に対して実験的に究めた。

本発明の一態様は、配列番号１乃至３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む発毛及び／又は育毛促進活性を示すペプチドに関するものである。

前記ペプチドは、配列番号１乃至３からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を含むものでありうるが、例えば、配列番号１乃至３からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるものでありうる。

本発明は発毛及び／又は育毛促進活性を有するペプチド、前記ペプチドを有効成分として含む脱毛防止及び／又は改善用組成物、前記ペプチドを有効成分として含む発毛及び／又は育毛促進用組成物、前記ペプチドの脱毛防止及び／又は改善用途、及び前記ペプチドの発毛及び／又は育毛促進用途に関するものであって、前記ペプチドは毛嚢細胞成長を促進し、発毛関連成長因子及び発毛関連因子の発現を増加させることによって、発毛及び／又は育毛に対して優れる効果を示し、優れる活性及び安定性により化粧品に非常に有利に適用できる。

図１ａは、本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドのヒト毛乳頭細胞（Ｈｕｍａｎｈａｉｒｆｏｌｌｉｃｌｅｄｅｒｍａｌｐａｐｉｌｌａｃｅｌｌｓ、ＨＨＦＤＰＣ）成長促進効果を示すグラフである。図１ｂは、本発明の一実施形態に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドのヒト毛乳頭細胞（Ｈｕｍａｎｈａｉｒｆｏｌｌｉｃｌｅｄｅｒｍａｌｐａｐｉｌｌａｃｅｌｌｓ、ＨＨＦＤＰＣ）成長促進効果を示すグラフである。図１ｃは、本発明の一実施形態に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドのヒト毛乳頭細胞（Ｈｕｍａｎｈａｉｒｆｏｌｌｉｃｌｅｄｅｒｍａｌｐａｐｉｌｌａｃｅｌｌｓ、ＨＨＦＤＰＣ）成長促進効果を示すグラフである。図２ａは、本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによりβ−カテニンの発現が増加することを確認した結果を示す図である。図２ｂは、本発明の一実施形態に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによりβ−カテニンの発現が増加することを確認した結果を示す図である。図２ｃは、本発明の一実施形態に係る配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドによりβ−カテニンの発現が増加することを確認した結果を示す図である。図３ａは、本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによるＫＧＦ、ｂＦＧＦの発現増加を確認した結果を示す写真である。図３ｂは、本発明の一実施形態に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによるＶＥＧＦの発現増加を確認した結果を示す図である。図３ｃは、本発明の一実施形態に係る配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドによるＶＥＧＦ、ｂＦＧＦの発現増加を確認した結果を示す図である。図４ａは、本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによるＰＩ３Ｋ発現増加及びＥＲＫリン酸化増加を確認した結果を示す写真である。図４ｂは、本発明の一実施形態に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによるＰＩ３Ｋ発現増加及びＥＲＫリン酸化増加を確認した結果を示す写真である。図４ｃは、本発明の一実施形態に係る配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドによるＰＩ３Ｋ発現増加及びＥＲＫリン酸化増加を確認した結果を示す写真である。図５ａは、本発明の一実施形態に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによるＭＳＸ２発現増加を確認した結果を示す写真である。図５ｂは、本発明の一実施形態に係る配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドによるＭＳＸ２発現増加を確認した結果を示す写真である。図６ａは、本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによるＴＧＦ−β１発現抑制を確認した結果を示す写真である。図６ｂは、本発明の一実施形態に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによるＴＧＦ−β１発現抑制を確認した結果を示す写真である。図７ａは、本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによるＢｃｌ−２の発現増加及びＢａｘの発現減少を確認した結果を示す写真である。図７ｂは、本発明の一実施形態に係る配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドによるＢｃｌ−２の発現増加及びＢａｘの発現減少を確認した結果を示す写真である。図８は、本発明の一実施形態に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによるケラチン−１４の発現増加を確認した結果を示す写真である。

本明細書で、用語“ペプチド”は、ペプチド結合によりアミノ酸残基が互いに結合されて形成された線形の分子を意味する。本発明のペプチドは当業界に公知された化学的合成方法、特に固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔａｌ．，ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ．ｅｄ．，ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍ．Ｃｏ．：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１（１９８４））、または液相合成技術（ＵＳ登録特許第５，５１６，８９１号）により製造できる。

本発明のペプチドは本発明者らが保有しているペプチドライブラリーのうち、細胞増殖実験を通じて発毛効能に優れるペプチドをスクリーニングしたものであって、総３種が本発明のペプチドに提供される。

本発明のペプチドは、アミノ酸配列の一部の部位を選定し、その活性を増加させるためにペプチドのＮ−末端及び／又はＣ−末端変形を誘導することができる。

例えば、前記Ｃ−末端変形はペプチドのＣ−末端がヒドロキシ基（−ＯＨ）、アミノ基（−ＮＨ_２）、アザイド（−ＮＨＮＨ_２）などに変形されるものでありうるが、これに限定されるものではない。

また、前記Ｎ−末端変形はペプチドのＮ−末端がアセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で構成された群から選択された１種以上の保護基が結合されるものでありうるが、これに限定されるものではない。前記保護基は、生体内のタンパク質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護する作用をする。

前記ペプチドのＮ−末端及び／又はＣ−末端変形はペプチドの安定性を格段に改善する作用をし、このような変形を通じて本発明のペプチドは生体内投与時の半減期を増加させて高い半減期を有することができる。

本明細書で、用語“安定性”は、イン・ビボ安定性だけでなく、貯蔵安定性（例えば、常温貯蔵安定性）も意味する。

本発明で、“発毛促進”は毛髪が生成されることを意味し、毛髪生成速度及び生成量を増加させる広い意味として使われる。また、毛根機能が強化されるか、または毛髪の脱落及び生成周期が短くなって毛嚢で伸びる毛髪の数が増加することを意味する。

本発明において、“毛髪成長”または“育毛”は、生成された毛髪（髪の毛）の太さが増加するか、または長さ伸び速度に影響を及ぼすことを意味する。

本発明の他の一態様によれば、本発明のペプチドは毛嚢細胞の成長を促進し、毛髪成長関連因子であるβ−カテニンの発現を増加させ、発毛関連成長因子であるＫＧＦ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ｂＦＧＦ（Ｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）の発現を増加させ、発毛シグナリング分子であるＰＩ３Ｋ（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ３−ｋｉｎａｓｅ）の発現を増加させ、ＥＲＫ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄｋｉｎａｓｅ）のリン酸化を増加させ、毛髪成長関連因子であるＭＳＸ２及びケラチン−１４の発現を増加させ、毛髪成長遅延と関連したＴＧＦ−β１の発現を抑制させ、細胞死滅抑制タンパク質であるＢｃｌ−２の発現増加及び細胞死滅関連タンパク質であるＢａｘの発現減少を誘導する。

このような結果は、本発明のペプチドが発毛及び／又は育毛に対して非常に優れる効能を有するということを意味する。したがって、本発明のペプチドは脱毛防止及び／又は改善、発毛及び／又は育毛促進用途に利用できる。

本発明の更に他の一態様は、本発明のペプチドを有効成分として含む脱毛防止または改善用組成物に関するものである。

本発明において、“脱毛防止”は毛嚢または頭皮から毛髪が抜ける現象が阻止または弱化されることを意味する。

本発明のペプチドは毛根が生成できるようにする皮膚組織の髪の毛卵胞（ｈａｉｒｆｏｌｌｉｃｌｅ）にある細胞の増殖を誘導して新たな毛嚢が生成できるようにする。さらに、β−カテニン（ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ）のシグナルを活性化させて発毛促進遺伝子を発現させ、発毛に関与する成長因子の発現を増加させる。

本発明のペプチドは毛髪が生成され成長される時期である生長期を促進させる役割をし、さまざまな環境的な要因により退行期に進行する毛髪の周期を生長期に維持することによって脱毛抑制効果を示し、正常毛髪では毛髪に栄養分を供給して毛髪健康が維持できるようにする。したがって、本発明の組成物は脱毛防止及び／又は改善に非常に効果的である。

本発明の組成物は前述した本発明のペプチドを有効成分として含むので、この２つの間の共通した内容は本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。

本発明の更に他の一態様は、配列番号１乃至３からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される１種以上のペプチドを有効成分として含む発毛及び／又は育毛促進用組成物を提供する。

本発明の組成物は、化粧品組成物に製造できるが、これに限定されるものではない。

前記化粧品組成物は、前述した本発明のペプチドの化粧品学的有効量（ｃｏｓｍｅｔｉｃａｌｌｙｅｆｆｅｃｔｉｖｅａｍｏｕｎｔ）を含むものでありうる。

また、前記化粧品組成物は化粧品学的に許容される担体を追加的に含むものでありうるが、これに限定されるものではない。

本明細書で、用語“化粧品学的有効量”は前述した本発明の化粧品組成物の効能を達成することに十分な量を意味する。

本発明の化粧品組成物は、当業界で通常的に製造されるいかなる剤形でも製造されることができ、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤−含有クレンジング、オイル、粉末ファウンデーション、乳濁液ファウンデーション、ワックスファウンデーション、及び／又はスプレーなどに剤形化できるが、これに限定されるものではない。例えば、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー、及び／又はパウダーの剤形に製造できる。

前記化粧品組成物の剤形がペースト、クリーム、またはゲルの場合には、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、または酸化亜鉛などが利用できるが、これに限定されるものではない。

前記化粧品組成物の剤形がパウダーまたはスプレーの場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、またはポリアミドパウダーが用いられることができ、特にスプレーの場合には、追加的にクロロフルオロハイドロカーボン、プロパン／ブタン、またはジメチルエーテルのような推進体を含むことができるが、これに限定されるものではない。

前記化粧品組成物の剤形が溶液または乳濁液の場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤、または乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、またはソルビタンの脂肪酸エステルがある。

前記化粧品組成物の剤形が懸濁液の場合には、担体成分として、水、エタノール、またはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガー、またはトラガカントなどが利用できるが、これに限定されるものではない。

前記化粧品組成物の剤形が界面−活性剤含有クレンジングの場合には、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホスクシン酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが利用できるが、これに限定されるものではない。

本発明の化粧品組成物に含まれる成分は、有効成分としてのペプチド類と担体成分の以外に、化粧品組成物に通常的に用いられる成分を含むことができ、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、及び／又は香料のような通常的な補助剤を含むことができるが、これに限定されるものではない。

本発明の更に他の一態様は、配列番号１乃至３からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるペプチドの脱毛防止及び／又は改善用途に関するものである。

前記ペプチドは前述したペプチドと同一であるので、共通した内容は本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。

本発明の更に他の一態様は、配列番号１乃至３からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるペプチドの発毛及び／又は育毛促進用途に関するものである。

以下、実施形態を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施形態はただ本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨に従って本発明の範囲がこれら実施形態により制限されないことは当業界で通常の知識を有する者において自明である。

実施形態
合成例１：ペプチドの合成
クロロトリチルクロライドレジン（Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅｒｅｓｉｎ；ＣＴＬｒｅｓｉｎ，ＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍＣａｔＮｏ．０１−６４−００２１）７００ｍｇを反応容器に入れてメチレンクロライド（ＭＣ）１０ｍｌを加えて３分間撹拌した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍｌを入れて３分間撹拌した後、また溶媒を除去した。反応器に１０ｍｌのジクロロメタン溶液を入れてＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）４００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かして、１時間の間撹拌しながら反応させた。反応後、洗浄し、メタノールとＤＩＥＡ（２：１）をＤＣＭ（ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）に溶かして１０分間反応させ、過量のＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）で洗浄した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を１０ｍｌ入れて３分間撹拌した後、また溶媒を除去した。脱保護溶液（２０％のピペリジン（Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）／ＤＭＦ）１０ｍｌを反応容器に入れて１０分間常温で撹拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れて、また１０分間反応を維持した後、溶液を除去し、各々３分ずつＤＭＦで２回、ＭＣで１回、ＤＭＦで１回洗浄してＩｌｅ−ＣＴＬＲｅｓｉｎを製造した。新たな反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れてＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ、ＨｏＢｔ２００ｍｍｏｌｅ、及びＢｏｐ２００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かした。反応器に４００ｍｍｏｌｅＤＩＥＡを分画に２回に亘って入れた後、全ての固体が溶けるまで最小限５分間撹拌した。溶かしたアミノ酸混合溶液を脱保護されたレジンがある反応容器に入れて１時間の間常温で撹拌しながら反応させた。反応液を除去し、ＤＭＦ溶液で３回５分ずつ撹拌した後、除去した。反応レジンを少量取ってカイザーテスト（ＮｉｈｙｄｒｉｎＴｅｓｔ）を用いて反応程度を点検した。脱保護溶液で上記のように同一に２回脱保護反応させてＬｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｉｌｅ−ＣＴＬＲｅｓｉｎを製造した。ＤＭＦとＭＣで十分に洗浄し、もう一度カイザーテストを遂行した後、前記と同様に以下のアミノ酸付着実験を遂行した。選ばれたアミノ酸配列に基づいてＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨの順に連鎖反応させた。Ｆｍｏｃ−保護基を脱保護溶液で１０分ずつ２回反応させた後、よく洗浄して除去した。無水酢酸とＤＩＥＡ、ＨｏＢｔを入れて一時間の間アセチル化を遂行した後、製造されたペプチジルレジンをＤＭＦ、ＭＣ、及びメタノールで各々３回洗浄し、窒素空気をゆっくり流して乾燥した後、Ｐ_２Ｏ_５下で真空に減圧して完全に乾燥した後、脱漏溶液［トリフルロ化酢酸（Ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）９５％、蒸留水２．５％、チオアニソール（Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）２．５％］３０ｍｌを入れた後、常温で時々揺らしながら２時間反応を維持した。フィルタリングを行ってレジンを濾して、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合せた。減圧を用いて全体ボリュームが半分位残るように蒸留し、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈殿を誘導した後、遠心分離して沈殿を集めて、もう２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去し、窒素下で十分に乾燥して精製前の配列番号１のアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅからなるペプチド１を０．７ｇ合成した（収率：９０．０％）。分子量測定機を用いて測定時、分子量５７１．７（理論値：５７１．７２）を得ることができた。

他のペプチドである配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド２及び配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド３も前記のような方法により合成を進行した。

毛髪成長促進効能を示すペプチド確保のために自社のペプチドライブラリースクリーニングを細胞増殖実験を通じて進行しており、３種ペプチドを選別した。この後、この３種ペプチドの毛髪成長促進効能を以下の多様な遺伝子及びタンパク質発現変化などを通じて観察しており、これらの優れる効能を確認した。

実施形態１：ＤＰＣ増殖アッセイ
ヒト毛乳頭細胞（Ｈｕｍａｎｈａｉｒｆｏｌｌｉｃｌｅｄｅｒｍａｌｐａｐｉｌｌａｃｅｌｌｓ）を２×１０^３細胞／ウェルの密度で９６−ウェルプレートにシーディングした後、一晩中培養した。無血清培地に変えた後、ペプチドを処理して３日間培養し、４ｍｇ／ｍｌＭＴＴ溶液を１００ｕｌずつウェルに処理して４時間反応させた。生成されたホルマザンをＤＭＳＯ処理を通じて溶かして出した後、マイクロプレートリーダを使用して５６０ｎｍでの吸光度を測定して、その結果を図１ａ乃至図１ｃに示した。

図１ａ乃至図１ｃから確認できるように、各々配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド処理によりヒト毛乳頭細胞の成長が濃度依存的に促進されることを確認した。

実施形態２：β−カテニン活性化テスト
ヒト毛乳頭細胞を４×１０^５細胞／ウェルの密度で６−ウェルプレートにシーディングした後、一晩中培養した。無血清培地に変えた後、ペプチドを処理して１５、３０分培養し、細胞を回収して核と細胞質タンパク質を各々分離した。β−カテニン抗体（ｓａｎｔａｃｒｕｚｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いてウェスタンブロッティングを遂行して核でのβ−カテニン発現様相を比較して、その結果を図２ａ乃至図２ｃに示した。

図２ａ乃至図２ｃから確認できるように、ヒト毛乳頭細胞で毛髪成長関連因子であるβ−カテニンの活性増加に伴う核移動（ｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）が配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド処理により促進されることが観察された。

実施形態３：ＫＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦＲＴ−ＰＣＲ
ヒト毛乳頭細胞を４×１０^５細胞／ウェルの密度で６−ウェルプレートにシーディングした後、一晩中培養した。無血清培地に変えた後、ペプチドを処理して２４時間の間培養して細胞を回収してＲＮＡを分離した。ＲＮＡ定量後、ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲプリミックス（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）、及びＫＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ各々のプライマーを用いてＰＣＲ進行後、５％アガロースゲルに電気泳動して各サンプル処理条件で前記成長因子のｍＲＮＡ発現程度を比較して、その結果を図３ａ乃至図３ｃに示した。

図３ａから確認できるように、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド処理によりヒト毛乳頭細胞で毛髪成長と関連した成長因子であるＫＧＦ、ｂＦＧＦのｍＲＮＡ発現が増加することを確認した。

また、図３ｂから確認できるように、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド処理によりヒト毛乳頭細胞で毛髪成長に影響を与える因子であるＶＥＧＦのｍＲＮＡ発現が増加し、図３ｃから確認できるように、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド処理によりＶＥＧＦ、ｂＦＧＦのｍＲＮＡ発現が増加することを確認した。

実施形態４：ＰＩ３Ｋ＆ｐ−ＥＲＫＷＢ
ヒト毛乳頭細胞を４×１０^５細胞／ウェルの密度で６−ウェルプレートにシーディングした後、一晩中培養した。無血清培地に変えた後、ペプチドを処理して１５、３０分培養し、細胞を回収して細胞溶解物を準備した。ＰＩ３Ｋ抗体（ｓａｎｔａｃｒｕｚｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）及びｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いてウェスタンブロッティングを遂行してタンパク質発現様相を比較して、その結果を図４ａ及び図４ｂに示した。

図４ａ及び図４ｂから確認できるように、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド処理によりヒト毛乳頭細胞で発毛シグナリング分子（ｈａｉｒｇｒｏｗｔｈｓｉｇｎａｌｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌｅ）であるＰＩ３Ｋ発現増加及びＥＲＫリン酸化増加が観察された。

実施形態５：ＭＳＸ２ＲＴ−ＰＣＲ
ヒト毛乳頭細胞を４×１０^５細胞／ウェルの密度で６−ウェルプレートにシーディングした後、一晩中培養した。無血清培地に変えた後、ペプチドを処理して２４時間の間培養して細胞を回収してＲＮＡを分離した。ＲＮＡ定量後、ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲプリミックス（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）及びＭＳＸ２プライマーを用いてＰＣＲ進行後、５％アガロースゲルに電気泳動して各サンプル処理条件でｍＲＮＡ発現程度を比較して、その結果を図５ａ及び図５ｂに示した。

図５ａ及び図５ｂから確認できるように、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド処理によりヒト毛乳頭細胞で毛髪成長関連因子であるＭＳＸ２のｍＲＮＡ発現が促進されることを確認した。

実施形態６：ＴＧＦ−β１ＲＴ−ＰＣＲ
ヒト毛乳頭細胞を４×１０^５細胞／ウェルの密度で６−ウェルプレートにシーディングした後、一晩中培養した。無血清培地に変えた後、ペプチドを処理して２４時間の間培養し、細胞を回収してＲＮＡを分離した。ＲＮＡ定量後、ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲプリミックス（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）及びＴＧＦ−β１プライマーを用いてＰＣＲ進行後、５％アガロースゲルに電気泳動して各サンプル処理条件でｍＲＮＡ発現程度を比較して、その結果を図６ａ及び図６ｂに示した。

図６ａ及び図６ｂから確認できるように、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド処理によりヒト毛乳頭細胞で毛髪成長遅延と関連したＴＧＦ−β１のｍＲＮＡ発現が抑制されることを確認した。

実施形態７：Ｂｃｌ−２／ＢａｘＷＢ
ヒト毛乳頭細胞を４×１０^５細胞／ウェルの密度で６−ウェルプレートにシーディングした後、一晩中培養した。無血清培地に変えた後、ペプチドを処理して２４時間培養し、細胞を回収して細胞溶解物を準備した。Ｂｃｌ−２及びＢａｘ抗体（ｓａｎｔａｃｒｕｚｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いてウェスタンブロットを遂行してタンパク質発現様相を比較して、その結果を図７ａ及び図７ｂに示した。

図７ａ及び図７ｂから確認できるように、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド処理によりヒト毛乳頭細胞で細胞死滅抑制タンパク質であるＢｃｌ−２の発現増加及び細胞死滅関連タンパク質であるＢａｘの発現減少が確認された。

実施形態８：ケラチン−１４ＲＴ−ＰＣＲ
ヒト毛乳頭細胞を５×１０^５細胞／ウェルの密度で６−ウェルプレートにシーディングした後、一晩中培養した。無血清培地に変えた後、ペプチドを処理して２４時間の間培養し、細胞を回収してＲＮＡを分離した。ＲＮＡ定量後、ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲプリミックス（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）及びケラチン−１４プライマーを用いてＰＣＲ進行後、５％アガロースゲルに電気泳動して各サンプル処理条件でｍＲＮＡ発現程度を比較して、その結果を図８に示した。

図８から確認できるように、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド処理によりヒト毛乳頭細胞で毛髪成長関連因子であるケラチン−１４のｍＲＮＡ発現が増加することを確認した。

以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者に当たって、このような具体的な技術は単に好ましい具現例であり、これに本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は添付した請求項とその等価物により定義されるということができる。

Claims

配列番号２のアミノ酸配列からなる発毛促進活性を示す、ペプチド。
前記ペプチドは、毛嚢細胞成長を促進することを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
前記ペプチドは、β−カテニンの発現を増加させることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
前記ペプチドは、ＫＧＦ（ＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ）、ｂＦＧＦ（Ｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、及びＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）からなる群から選択される発毛関連成長因子の発現を増加させることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
前記ペプチドは、ＭＳＸ２（Ｍｓｈｈｏｍｅｏｂｏｘ２）及びケラチン−１４からなる群から選択される発毛関連因子の発現を増加させることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
前記ペプチドは、ＰＩ３Ｋ（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ３−ｋｉｎａｓｅ）の発現及びＥＲＫ（ＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＳｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄＫｉｎａｓｅ）のリン酸化を増加させることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
前記ペプチドは、ＴＧＦ−β１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｅｔａ１）の発現を抑制することを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
前記ペプチドは、Ｂｃｌ−２（Ｂ−ｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｍａ２）の発現を増加させ、Ｂａｘ（ＢＣＬ２−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＸｐｒｏｔｅｉｎ）の発現を減少させることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、脱毛防止または改善用組成物。
配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、発毛または育毛促進用組成物。