KR101285263B1 - Ｅｄａｒ 리간드 유래 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 TNF-α 계열인 EDAR(EDA receptor) 리간드 유래 신규한 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 EDA 유래 펩타이드인 EDA3와 EDAR 리간드 유래 펩타이드인 EDphD1는 천연의 EDA와 유사한 기능을 수행하며, 안정성이 천연 EDA 와 비교하여 매우 우수하고, 피부 투과도도 매우 우수하다. 따라서 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은, 모발 성장 및 탈모 개선 효과를 가지며, EDA 단백질의 활성이 요구되는 질환 또는 상태를 치료, 예방 및 개선하는데 효능을 발휘한다. 또한, 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유용하게 적용될 수 있다.

Description

ＥＤＡＲ 리간드 유래 펩타이드 및 이의 용도{EDAR Ligand Derived Peptides and Uses Thereof}

본 발명은 EDAR(EDA receptor) 리간드 유래 신규한 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

모낭은 포유동물 피부의 독특한 기관으로서, 원시 표피의 하부가 성장하여 보다 깊은 피부 층으로 신장된 기관이다. 모낭의 기부에는 소낭 또는 진피 유두 세포로서 알려진 세포의 플러그가 존재하며(Stenn and Paus, Physiol . Rev ., 81:449(2002)) 유두는 모낭의 정상적인 순환(Oliver, Embryol . Exp . Morph . 15:331(1966)) 및 모간의 성장에 필수적이다. 모간은 케라틴 필라멘트와 필라멘트 응집 단백질로 충전된 단단하게 밀착된 상피 세포로 제조된 트레드 형상의 구조이다.

인간의 모발은 주기적으로 생장기, 퇴행기, 휴지기를 반복하며 모발이 빠지고 다시 생성되는 과정을 거치게 된다. 모발의 주기 조절은 호르몬 조절이나 많은 성장인자 등의 조절을 통하여 이루어진다. 한편, 심한 스트레스나 영양 결핍 등에 의해서도 조기 퇴행기를 거친 휴지기 도입에 의한 심한 탈모증상이 유발되기도 한다(Arck, American Journal of Pathology, 162(3): 803(2003). 남성형 대머리에 있어서, 두피의 전면 및 상부의 모낭은 안드로겐에 대해 감수성이다. 그래서 남성형 대머리의 경우 모낭의 파괴보다는 모낭의 소형화에 해당 되는데 그 원인으로는 남성 호르몬인 안드로겐의 과한 분비로 인해 5-알파 환원효소가 활성화 되어 테스토스테론(testosterone)이 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone, DHT)으로 변형 되며, 이렇게 생성된 디하이드로테스토스테론은 모발이 자라는 기간을 단축시키고, 모낭을 소형화 시켜 굵고, 튼튼한 성모의 수를 감소시킴으로서 탈모를 유발시킨다. 또한, 탈모여성의 20% 는, 종종 두피 상부의 모발이 얇아지는 것을 특징으로 하는 이들의 일생에서 몇몇 종류의 탈모를 겪는 것으로 추정된다. 나이가 들어감에 따라 탈모가 확산된다. 예를 들면, 흉터 탈모증, 화상 또는 압박 상해와 관련된 흉터형성 상태와 같은 상이한 질환 상태가 현저한 탈모를 일으킬 수 있다. 원인과 무관하게 탈모는 현대사회의 여성 진출이 많아지고, 남성도 외모에 신경을 쓰게 됨으로서 최종적으로 자존심과 자긍심의 상실과 함께 현저한 정신적, 사회적 및 성적 영향력을 행사하는 결과를 초래할 수 있다. 이런 탈모현상을 치료하기 위해 지금까지는 의약품으로 여러 가지 물질 등을 사용되어 왔으나 가격이 너무 비싸고, 여러 가지 부작용들이 유발 되고 있다. 또한 이런 의약품들은 지속적인 사용을 필요로 하며 사용을 중단하였을 때에는 다시 탈모가 유발되는 단점이 있다. 또한 효능에 대한 개개인의 차이가 심하며, 부작용도 개개인 마다 차이가 나는 단점이 있다.

그 외 화장품으로 이용되고 있는 원료들은 가격이 저렴하다는 장점이 있지만, 식물 추출물 유래 성분들로 구성 되어 있기 때문에 실제 그 효능은 크지 않다는 단점이 있다.

따라서 보다 효과적이면서도 비용적인 측면에서 보다 경제적인 새로운 유효성분에 대한 요구가 당업계에 대두하고 있다.

지금까지 알려진 2가지 이용 가능한 약물(미녹시딜 및 피나스테라이드)은 추가의 탈모를 지연시킬 수는 있지만, 실제로 새로운 모낭의 재생을 유도하는 효과는 나타내지 못했다. 또한 많은 두발 화장품 중에서 식물 추출물 등을 이용한 탈모방지 제품이 많이 출시되었는데, 특히, 고삼, 고추, 당약, 상백피, 상엽, 인삼, 감초, 작약, 지황, 회향, 산수유, 마늘등의 추출물을 함유한 제품, 크산틴 및 성장호르몬을 함유하는 조성물을 첨가하여 디하이드로테스토스테론의 과잉에 따른 세포대사 억제를 개선함과 동시에 성장 호르몬의 성장 촉진 효과를 이용함으로써 탈모방지 및 모발재생을 통한 모발성장 촉진 효과를 나타내는 제품, 미네랄 및 비타민류, 녹차, 로즈마리, 쑥, 감초 추출액을 함유하여 두피와 모발에 대한 영양 공급을 통해 탈모 예방 및 모발 성장 촉진 효과를 나타내는 제품, 그리고 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 니코틴산, 판토텐산, 비오틴 및 엽산 등의 물질과 식물추출물을 혼합하여 체내의 5-알파 환원효소를 억제하고 남성호르몬의 대사과정에서 디하이드로테스토스테론이 형성되지 않도록 하며 모발의 신진대사작용을 도와 남성형 탈모의 개선을 도와주는 제품들이 개발되었으나, 신생모발의 생성까지 영향을 미치는 제품은 찾기 힘들었다. 한편 일본의 도쿄 자혜회 의과대학 건강의학센터 연구그룹 임상팀에 의해 당뇨 등에 효능을 보이는 것으로 밝혀진 콜로소린산(corosolic acid)을 이용한 제품이 개발 되어 체내의 5-알파 환원효소를 억제하고 모발 성장에 탁월한 효능을 보이는 제품이 개발되기도 하였다.

모발의 성장 및 퇴화의 과정에는 매우 많은 요인들이 서로 연계되어있는데, 본 연구자들은 모근의 생성에 있어서 중요한 섬유아세포 증식을 촉진하고, 모낭 형성 및 모발로의 분화를 유도하는데 중요한 인자의 발현을 촉진하는 효과를 활용한 연구를 수행하였다.

TNF 계열 리간드인 EDA는 모발, 치아, 땀샘 등의 외배엽으로부터 분화된 다양한 기관의 발달에 관여하는 것으로 알려져 있으며 결핍 시, 성염색체 연관 소한 외배엽 형성 장애 (X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia)가 발생하는 것으로 알려져 있다. 다양한 EDA 이소폼(isoform)들 중 EDA1이 외배엽 발달에 가장 중요하고 특이적 수용체인 EDAR에 결합하여 그 기능을 나타내게 된다. EDAR에 대한 EDA1의 결합 이 후 EDARADD(EDAR-associated death domain), NEMO(NF-κB Essential Modulator)의 활성화가 이루어지고 NF-κB의 저해 단백질인 IκB의 인산화를 통한 분해 과정이 나타남으로써 NF-κB의 핵 내 이동이 나타난다. 핵 속으로 들어간 NF-κB는 연결조직 성장인자/CCN 계열 단백질 2 (CTGF/CCN2) 및 Shh(Sonic hedgehog homolog)와 같은 모낭 형성 촉진 효과를 갖는 단백질의 유전자 발현을 촉진한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 EDA1과 동일한 기능 또는 유사한 기능 유지하면서도 자연의 EDA1 단백질보다 활성, 피부 투과도 및 안정성이 우수한 물질을 개발하고자 노력한 결과, 자연의 EDA1 단백질의 아미노산 서열에 기초하여 상술한 특성을 나타내는 두 가지 EDA1 관련 펩타이드를 합성함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열목록 제1서열 및 제2서열에 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 발모 촉진 및 모발 생성 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin conditions) 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 EDA1(ectodysplasin A1) 관련 신호전달 부전-연관 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 서열목록 제1서열 및 제2서열에 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 제공한다.

본 발명자들은 EDA1(ectodysplasin A1) 과 동일한 기능 혹은 유사한 기능을 유지하면서도, 천연 EDA1 단백질보다 활성, 피부 투과도 및 안정성이 우수한 물질을 개발하고자 노력한 결과, 천연의 EDA1 단백질의 아미노산 서열에 기초하여 상술한 특성을 나타내는 펩타이드를 합성하였고 EDA1 단백질 수용체에 결합하는 리간드의 서열에 기초하여 상술한 특성을 나타내는 펩타이드를 합성하였다.

본 발명의 펩타이드는 EDA1-유래의 서열목록 제1서열 및 제2서열에 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.

본 발명의 펩타이드는 당 업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer . Chem . Soc . 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).

본 발명의 펩타이드 EDA3는 EDA1 단백질의 여러 부위를 무작위적으로 부분 합성 하여 수용체 단백질에 대한 결합가능 부위를 1차 탐색한 뒤, 이 예측된 부위의 아미노산 서열을 최적화하여 본 발명의 펩타이드로 선정 제조하였으며 이들 후보 펩타이드들 중에서 가장 활성이 우수한 펩타이드를 스크리닝 함으로써, 본 발명의 서열목록 제1서열의 펩타이드가 제공된다.

본 발명의 또 다른 펩타이드 EDphD1은 EDA1 단백질의 수용체인 EDAR에 특이적인 결합을 보이는 서열을 파지디스플레이(phage display) 기술을 통해 탐색한 뒤, 해당 서열을 대상 펩타이드로 선정 제조하였으며, 이들 후보 펩타이드들 중에서 가장 활성이 우수한 펩타이드를 스크리닝 함으로써 본 발명의 서열목록 제2서열의 펩타이드가 제공된다.

서열목록 제1서열 및 제2서열의 펩타이드는 천연 EDA1과 유사한 작용을 수행하여 수용기와 결합하여 성장인자와 같은 기능을 수행하는 펩타이드이다.

본 발명의 펩타이드는 그 자체로서 천연의 EDA1 단백질보다 안정성이 우수하지만 아미노산의 변형에 의해 안정성이 더욱 향상될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합되어 있다.

상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 용어 “안정성”은 "인 비보" 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 발모 촉진 및 모발 생성 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 EDA1 관련 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 EDA1 관련 펩타이드는 인간 EDA 단백질에서 유래된 것으로 섬유아세포 성장 촉진능력을 가지며 또한 EDA1-EDAR의 대표적인 시그널을 촉진함으로써, EDARADD, NEMO의 활성화 이후 NF-κB의 저해 단백질인 IkB의 인산화를 통한 분해 과정과 NF-κB의 핵 내 이동이 나타났다. 더욱이 핵 속으로 들어간 NF-κB에 의한 하위 분자들의 발현 및 Shh(Sonic hedgehog homolog)와 같은 모낭 형성 촉진 효과를 갖는 단백질의 발현이 촉진됨을 확인하였다. 또한 본 발명의 펩타이드는 마우스의 모발 생장에 대한 촉진 효과를 나타내었다. 따라서, 본 발명의 조성물은 모발의 성장 및 피부 상태의 개선에 매우 효과적이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin conditions) 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 상처제거 또는 피부재생 등을 포함하는 피부상태 개선에 이용된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 EDA1 관련 신호전달의 부전-연관 질환의 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 골질환, 골다공증 또는 비만 예방 또는 치료를 포함하는 EDA1관련 신호전달의 부전-연관 질환의 개선 또는 치료에 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 EDA1 단백질의 활성을 나타내는 펩타이드의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 EDA1 관련 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여하는 것이 바람직하며, 예를 들어 피부 국소 투여에 의해 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-1000 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 EDA1 관련 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품 조성물로 이용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 조성물의 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 펩타이드류와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명의 EDA 유래 펩타이드인 EDA3와 EDAR 리간드 유래 펩타이드인 EDphD1는 천연의 EDA와 유사한 기능을 수행한다.

(ⅱ) 본 발명의 펩타이드는 안정성이 천연 EDA 와 비교하여 매우 우수하고, 피부 투과도도 매우 우수하다.

(ⅲ) 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은 모발의 성장 및 생성에 활성을 갖고, EDA 단백질의 활성이 요구되는 질환 또는 상태를 치료, 예방 또는 개선하는 데 매우 우수한 효능을 발휘한다.

(ⅳ) 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은, 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유용하게 적용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 1 서열과 제 2서열의 펩타이드의 고성능 액상 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2a는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 1 서열의 펩타이드를 처리한 섬유아세포의 세포성장 촉진 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2b는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 2 서열의 펩타이드를 처리한 섬유아세포의 세포성장 촉진 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 1 서열의 펩타이드를 처리하였을 때 IκB 단백질의 세포 내 양이 인산화에 이은 유비퀴틴화에 의해 감소되는 것을 보여주는 웨스턴 블롯팅 결과이다.
도 3b는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 2 서열의 펩타이드를 처리하였을 때 IκB 단백질의 세포 내 양이 인산화에 이은 유비퀴틴화에 의해 감소되는 것을 보여주는 웨스턴 블롯팅 결과이다.
도 4a는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 1 서열의 펩타이드를 처리하였을 때 세포질 내 NF-κB의 활성화에 따른 핵 내 이동을 보여주는 웨스턴 블롯팅 결과이다.
도 4b는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 2 서열의 펩타이드를 처리하였을 때 세포질 내 NF-κB의 활성화에 따른 핵 내 이동을 보여주는 웨스턴 블롯팅 결과이다.
도 5a는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 1서열의 펩타이드를 처리하였을 때 NF-κB의 활성화에 따른 하위 단백질 COX-2, IL-6, IL-1b의 발현 증가가 나타남을 보여주는 RT-PCR 결과이다.
도 5b는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 2서열의 펩타이드를 처리하였을 때 NF-κB의 활성화에 따른 하위 단백질 COX-2, IL-6, IL-1b의 발현 증가가 나타남을 보여주는 RT-PCR 결과이다.
도 6a는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 1서열의 펩타이드를 처리하였을 때 모낭 형성에 관여하는 단백질인 Shh의 발현 증가를 보여주는 웨스턴 블롯팅 결과이다.
도 6b는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 2서열의 펩타이드를 처리하였을 때 모낭 형성에 관여하는 단백질인 Shh의 발현 증가를 보여주는 웨스턴 블롯팅 결과이다.
도 7은 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 펩타이드를 처리하였을 때 마우스 수염 모낭 세포의 세포성장 촉진 효과를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

합성예 1: Asn - Met - Ser - Lys - His - Thr - Thr - Phe - Phe - Gly - Ala (서열목록 제1서열)의 합성

클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ㎖를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF) 10 ㎖를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ㎖의 디클로로메탄(DCM) 용액을 넣고 Fmoc-Ala(pbf)-OH (Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM에 녹여 10분간 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 DMF를 10 ㎖ 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine)/DMF) 10 ㎖를 반응용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, DMF로 1회 세척하여 Ala(pbf)-CTL Resin을 제조하였다. 새로운 반응기에 10 ㎖의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Gly-OH (Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA(N,N-Diisopropylethylamine)를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrin test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Gly-Ala(pbf)-CTL Resin을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Phe, Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-His(trt), Fmoc-Lys, Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Met 및 Fmoc-Asn 순으로 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 무수초산과 DIEA, HoBt(Hydroxybenzotriazole)를 넣어 한시간동안 아세틸화를 수행한 뒤 제조된 펩티딜 레진을 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, 오산화인(Phosphorus pentoxide, P₂O₅) 하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액[TFA(Trifluroacetic acid) 95%, 증류수 2.5%, 티오아니졸(Thioanisole) 2.5%] 30 ㎖을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2 시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ㎖의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 Asn-Met-Ser-Lys-His-Thr-Thr-Phe-Phe-Gly-Ala 펩타이드 1을 0.85 g 합성하였다(수율: 89.9%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 분자량 1240.4(이론값 : 1239.5)를 얻을 수 있었다. 위와 같은 방법으로 서열2 펩타이드 (Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Thr-His-His-Arg-Pro-Trp-Thr)도 합성하였다. (수율 : 92.1%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 분자량 1446.5 (이론값 :1447.5)Da 의 값을 얻을 수 있었다.

번호	아미노산 서열	분석값(질량분석기)
		분석치	이론치
서열 1	NMSKHTTFFGA	1240.4	1239.5
서열 2	LLADTTHHRPWT	1447.6	1446.5

시험예 1: 합성 펩타이드를 활용한 세포 성장효과의 확인

합성예 1 및 2에서 합성된 서열 펩타이드에 대한 성장인자의 유사 효능 및 억제 효능을 분석하기 위해 리지노 등의 방법(Rizzino, et al. Cancer Res . 48:4266(1988))을 참조하여 HaCaT 각질세포주와 NIH3T3 섬유아세포를 이용한 SRB(Sulforhodamine B) 비색법을 이용하여 측정하였다.

HaCaT 각질세포주(한국세포주은행) 및 NIH3T3 섬유아세포(한국세포주은행)를 각각 250 ㎖ 용량의 조직 배양용 플라스크를 이용하여 10% 우태아혈청(FBS; fetal bovine serum, Sigma)을 포함하는 DMEM(Dulbecco’s modied Eagle's medium, Gibco, U.S.A.)에서 배양하였다. 배양된 세포주들을 1% 트립신 용액으로 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심 분리하여 세포 침전물만을 모았다. 이를 FBS가 함유되지 않은 DMEM 배양액에 다시 현탁한 후, 96-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 3 X 10³ 세포가 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 24시간 뒤 혈청을 완전히 제외한 동일한 배양액으로 배지를 교환한 뒤 표준을 잡기위한 공 시료와 합성 펩타이드를 10% 증류수에 멸균상태로 녹인 뒤 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖의 농도로 72시간을 위와 동일 조건으로 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양 상층액을 제거하고 에탄올을 이용하여 세포를 고정화 한 다음 세포고정이 끝난 후, PBS(phosphate buffer saline)로 3회 세척하였다. 세척용액을 제거한 뒤 비색 SRB 용액으로 처리하고 1% acetic acid 로 충분히 세척을 한 뒤 현미경으로 세포를 관찰하여 생존 세포의 상태를 관찰하였으며, 자외선 590 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존 상태를 측정하였다.

도 2는 펩타이드 처리 후의 각질세포(도 2a) 및 섬유아세포(도 2b)의 성장에 대한 결과이다. 도 2a 및 2b에서 나타낸 바와 같이 본 발명의 펩타이드는 섬유아세포의 성장을 크게 증진 시켰다.

시험예 2: 합성 펩타이드의 EDA1 - EDAR 시그널 촉진 효과 확인

HaCaT 세포에 합성예 1에서 합성한 펩타이드들을 처리하고 20분경과 후, EDA 단백질의 대표적인 시그널인 IκB 인산화를 통한 NF-κB 핵 내 이동을 확인하였다. 각각의 효과는 IκB 및 NF-κB의 항체(산타크루즈, 미국)를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 통해 관찰되었다. 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 경우 IκB의 인산화 및 유비퀴틴화에 의한 처리 농도별 분해 효과가 확인되었으며(도 3a 및 3b) 억제제인 IκB의 분해에 의한 NF-κB 활성화 및 핵 내 이동이 확인되었다(도 4a 및 4b). 또한, 펩타이드에 의한 NF-κB의 핵 내 이동에 대한 영향을 확인하기 위해 NF-κB에 의해 발현이 유도되는 것으로 알려진 IL-1b, IL-6, COX-2의 발현 정도를 각각의 특이적인 프라이머를 사용한 RT-PCR를 통해 관찰하였다. 펩타이드에 의해 유도된 NF-κB의 핵 내 이동에 의해 위의 세 가지 단백질들의 발현이 증가된 것을 관찰할 수 있었다(도 5a 및 5b).

도 3a 및 3b는 본 발명의 펩타이드를 처리하였을때 IκB의 인산화 및 유비퀴틴화에 의한 분해 효과가 나타남을 보여주며, 도 4a 및 4b는 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때 NF-κB의 핵 내 이동이 촉진되는 것을 보여준다. 또한, 도 5a 및 5b는 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때 NF-κB의 핵 내 이동 촉진에 의한 하위 발현 분자 IL-1b, IL-6, COX-2의 발현 증가를 보여준다.

시험예 1 및 2의 실험 결과를 종합하면, 본 발명의 펩타이드는 EDA1-EDAR 시그널 활성화에 의한 매우 우수한 모발 성장 촉진 기능을 발휘하는 것을 알 수 있다.

시험예 3: 합성 펩타이드에 의한 모낭 형성 촉진 단백질 Shh 의 발현 증가 확인

합성예 1에서 합성한 펩타이드의 EDA1 타겟 단백질이자 모낭 형성 촉진 효과를 갖는 것으로 알려진 단백질인 Shh의 발현량 증가에 대한 영향을 확인하기 위해 각질세포를 60-mm 조직 배양용 평판에 3 X 10⁵ 세포가 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 24시간 뒤 1% 혈청을 포함한 동일한 배양액으로 배지를 교환한 뒤 표준을 잡기위한 공 시료와 합성 펩타이드를 증류수에 멸균상태로 녹인 뒤 10 ㎍/㎖ 농도로 처리하고, 24시간 동안 위와 동일 조건으로 배양하였다. 이 후 Shh 특이적인 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅을 진행하였다.

도 6a에서 확인 할 수 있듯이 펩타이드의 처리 농도에 따라 모낭 형성 촉진 단백질인 Shh의 발현양이 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 또한, 도 6b는 본 발명의 펩타이드를 각질세포에 농도별 처리하여 Shh의 발현양을 관찰 하였을 때 처리 농도에 따라 Shh의 발현양이 증가하는 것을 보여 준다. 이 결과는 펩타이드에 의해 EDA1-EDAR 시그널이 전달되어 모발 성장 촉진뿐만 아니라 새로운 모낭 형성 유도에 의한 발모 효과도 나타난다는 것을 보여준다.

시험예 5 : 제조된 펩타이드를 처리한 마우스 모발 성장 효과

합성예 1을 통해 제조된 펩타이드를 C57BL/6 마우스에서 채취된 수염 모낭 세포에 처리하여 증식 효과를 관찰하였다. 마우스의 수염 모낭에서 채취된 세포를 96-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 3 X 10³ 세포가 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 24시간 뒤 혈청을 완전히 제외한 동일한 배양액으로 배지를 교환한 뒤 표준을 잡기위한 공 시료와 합성 펩타이드를 증류수에 멸균상태로 녹인 뒤 10 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖의 농도로 72시간을 위와 동일 조건으로 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양 상층액을 제거하고 에탄올을 이용하여 세포를 고정화 한 다음 세포고정이 끝난 후, PBS(phosphate buffer saline)로 3회 세척하였다. 세척용액을 제거한 뒤 비색 SRB 용액으로 처리하고 1% acetic acid 로 충분히 세척을 한 뒤 현미경으로 세포를 관찰하여 생존 세포의 상태를 관찰하였으며, 자외선 590 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존 상태를 측정하였다(도 7).

도 7은 펩타이드 처리 후의 마우스 모낭 세포의 성장에 대한 결과가 나타나 있다. 합성 펩타이드를 50 ㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, 상대적으로 컨트롤에 비교하여 상당한 성장율을 나타내었다.

실시예 1: 나노화 펩타이드의 제조

상기 합성예에서 얻은 펩타이드 2종을 50 mg을 각 각 정확히 칭량한 뒤 증류수 500 ㎖로 충분히 교반하여 용해하였다. 배합체 용액을 레시틴 5 g, 소듐 올리에이트(sodium oleate) 0.3 ㎖, 에탄올 50 ㎖ 그리고 약간의 유상과 함께 혼합한 후, 총량이 1 L가 되도록 증류수로 양을 맞추고 마이크로플루다이저로 고압을 이용하여 유화시켜 사이즈 100 nm 정도의 나노좀을 제조하였다. 제조된 나노좀은 최종 농도가 약 50 ppm으로 단독 혹은 복합적으로 화장품 제조용으로 사용되었다.

제형예 1: 유연화장수

상기 실시예에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 유연화장수를 일반적인 화장수 제조방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	2.5
1,3-부틸렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
PEG 1500	1.0
소듐히알루로네이트	1.0
폴리솔베이트 20	0.5
에탄올	8.0
방부제, 색소	적량
벤조페논-9	0.05
향	미량
정제수	잔량
합계	100

제형예 2: 영양크림

상기 실시예에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양크림을 일반적인 영양크림 제조방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	2.5
메도우폼오일	3.0
세테아릴알콜	1.5
스테아린산	1.5
글리세릴스테아레이트	1.5
유동 파라핀	10.0
밀납	2.0
폴리솔베이트60	0.6
솔비탄 세스퀴올레이트	2.5
스쿠알란	3.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
글리세린	5.0
트리에탄올아민	0.5
토코페릴아세테이트	0.5
방부제, 색소	적량
향	적량
정제수	잔량
합계	100

제형예 3: 영양화장수

상기 실시예에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양화장수를 일반적인 화장수 제조방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	2.5
1,3-부틸렌글리콜	4.0
글리세린	4.0
세테아릴알콜	0.8
글리세릴스테아레이트	1.0
트리에탄올아민	0.13
토코페릴아세테이트	0.3
유동파라핀	5.0
스쿠알란	3.0
마카다미아너트오일	2.0
폴리솔베이트60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	0.5
카르복시비닐폴리머	1.0
방부제,색소	적량
향	적량
정제수	잔량
합계	100

제형예 4: 에센스

상기 실시예에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 에센스를 일반적인 에센스 제조방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	2.5
글리세린	10.0
1,3-부틸렌글리콜	5.0
PEG 1500	2.0
알란토인	0.1
DL-판테놀	0.3
EDTA-2Na	0.02
히드록시에틸 셀룰로오스	0.1
소듐히알루로네이트	8.0
카르복시비닐폴리머	0.2
트리에탄올아민	0.18
옥틸도데세스-16	0.4
에탄올	6.0
향, 방부제, 색소	적량
정제수	잔량
합계	100

제형예 5: 헤어세럼

상기 실시예에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 헤어세럼를 일반적인 헤어세럼 제조방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	1
글리세린	10.0
1,3-부틸렌글리콜	5.0
PEG 1500	2.0
알란토인	0.1
DL-판테놀	0.3
EDTA-2Na	0.02
히드록시에틸 셀룰로오스	0.1
소듐히알루로네이트	8.0
카르복시비닐폴리머	0.2
트리에탄올아민	0.18
옥틸도데세스-16	0.4
에탄올	6.0
향, 방부제, 색소	적량
정제수	잔량
합계	100

제형예 6: 헤어토너

상기 실시예에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 헤어세럼를 일반적인 헤어세럼 제조방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	1
글리세린	2.0
1,3-부틸렌글리콜	2.0
PEG 1500	2.0
알란토인	0.1
DL-판테놀	0.3
EDTA-2Na	0.02
소듐히알루로네이트	8.0
카르복시비닐폴리머	0.2
트리에탄올아민	0.18
에탄올	10.0
향, 방부제, 색소	적량
정제수	잔량
합계	100

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (12)

1. 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드의 N-말단이 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 인간 EDA(ectodysplasin A) 단백질에서 유래된 것을 특징으로 하는 펩타이드.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 섬유아세포의 성장 촉진능을 갖는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 EDA1-EDAR(EDA receptor) 시그널을 촉진 시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 모낭 형성 유도 단백질인 Shh(Sonic hedgehog homolog)의 발현을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 모낭 세포의 성장을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
   
8. 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열에 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 발모 촉진 및 모발 생성 개선용 조성물.
   
9. 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열에 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin conditions) 개선용 화장품 조성물.
   
10. 제 9 항에 있어서, 상기 피부 상태의 개선은 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 상처제거 또는 피부재생인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
11. 삭제
12. 삭제

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