JP5893139B2

JP5893139B2 - Ｅｄａｒリガンド由来のペプチド及びこれの用途

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Publication number: JP5893139B2
Application number: JP2014523833A
Authority: JP
Inventors: ジチョン・ヨン; ミキム・ウン
Original assignee: Caregen Co Ltd
Current assignee: Caregen Co Ltd
Priority date: 2011-08-04
Filing date: 2012-05-09
Publication date: 2016-03-23
Anticipated expiration: 2032-05-09
Also published as: CN103764675A; CN103764675B; KR20130015531A; US9550078B2; EP2740740A1; EP2740740A4; ES2610814T3; EP2740740B1; WO2013018977A1; JP2014525917A; US20140255338A1; KR101285263B1

Description

本発明は、ＥＤＡＲ（ＥＤＡｒｅｃｅｐｔｏｒ）リガンド由来の新規なペプチド及びこれの用途に関するものである。

毛包は哺乳動物の皮膚の独特の器官であって、始原表皮の下部が成長してより深い皮膚層に伸びた器官である。毛包の基部には毛乳頭又は毛乳頭細胞として知られている細胞のプラグが存在し（非特許文献１）、乳頭は毛包の正常な循環（非特許文献２）及び毛幹の成長に必須である。毛幹は、ケラチンフィラメントとフィラメント凝集タンパク質で充填された固く密着した上皮細胞で製造されたスレッド形状の構造である。

ヒトの毛は周期的に成長期、退行期、休止期を繰り返して、毛が抜けて再度生成される過程を経る。毛週期の調節はホルモンの調節や多くの成長因子などの調節を通じてなされる。一方、酷いストレスや栄養欠乏などによっても早期退行期を経た休止期導入による酷い脱毛症が誘発されることもある（非特許文献３）。男性型ハゲにおいて、頭皮の前面及び上部の毛包はアンドロゲンに対して感受性である。したがって、男性型ハゲの場合、毛包の破壊よりは毛包の小型化に該当するが、その原因としては、男性ホルモンであるアンドロゲンの過度な分泌によって５α還元酵素が活性化されてテストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）がジヒドロテストステロン（ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ，ＤＨＴ）に変形され、このように生成されたジヒドロテストステロンは毛髪が伸びる期間を短縮させ、毛包を小型化させて、太くて強い成毛の数を減少させることで脱毛を誘発する。また、脱毛女性の２０％は、たびたび頭皮上部の髪が細くなることを特徴とする、彼女らの一生でいくつかの種類の脱毛を経験するものと推定される。年をとるにつれて脱毛が拡散する。例えば、瘢痕性脱毛症、やけど又は圧迫傷害に係る傷跡形成が顕著な脱毛を起こすことがある。原因に関わらず、脱毛は、現代社会の女性進出が多くなり、男性も外見に気を使うようになることで、最終的に自尊心と自負心の喪失と共に、顕著な精神的、社会的及び性的影響力を行使する結果をもたらし得る。このような脱毛現象を治療するために、今までは医薬品として様々な物質などが使用されて来ているが、あまりにも高価であり、様々な副作用が誘発されている。また、このような医薬品は持続的な使用を必要とし、使用を中断したときには再度脱毛が誘発される短所がある。また、効能に対する個人の差が大きく、副作用も個人別に差があるという短所がある。

その他化粧品として用いられている原料は、安価であるという長所があるが、植物抽出物由来の成分から構成されているため、実際にその効能は大きくないという短所がある。

したがって、より効果的で且つコスト面でより経済的な新しい有効成分への要求が、当業界に浮かび上がっている。

今まで知られている２つの利用可能な薬物（ミノキシジル及びフィナステリド）は追加の脱毛を遅延させることはできるが、実際に新しい毛包の再生を誘導する効果はなかった。また、多くの頭髪化粧品のうち植物抽出物などを用いた脱毛防止製品がたくさん発売されているが、特に、クララ、唐辛子、当薬、桑白皮、桑の葉、人参、カンゾウ、シャクヤク、地黄、ウイキョウ、サンシュユ、ニンニクなどの抽出物を含有する製品、キサンチン及び成長ホルモンを含有する組成物を添加してジヒドロテストステロンの過剰による細胞代謝の抑制を改善すると共に、成長ホルモンの成長促進の効果を用いることで、脱毛防止及び毛髪再生を通じた毛髪成長促進の効果を示す製品、ミネラル及びビタミン類、緑茶、ローズマリー、ヨモギ、カンゾウ抽出液を含有して頭皮と毛髪に対する栄養供給を通じて脱毛予防及び毛髪成長促進の効果を示す製品、そしてビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン及び葉酸などの物質と植物抽出物を混合して体内の５α還元酵素を抑制し、男性ホルモンの代謝過程でジヒドロテストステロンが形成されないようにし、毛髪の新陳代謝作用を助けて男性型脱毛の改善を助ける製品が開発されたが、新生毛の生成まで影響を及ぼす製品はなかった。一方、日本の東京慈恵会医科大学健康医学センターの研究グループ臨床チームによって糖尿などに効能を示すことが明らかになったコロソリン酸（ｃｏｒｏｓｏｌｉｃａｃｉｄ）を用いた製品が開発され、体内の５α還元酵素を抑制して毛髪成長に優れた効能を示す製品が開発された。

毛髪の成長及び退化の過程には非常に多くの要因が互いに関連しているが、本研究者らは毛根の生成において重要な繊維芽細胞の増殖を促進し、毛包の形成及び毛髪への分化を誘導するのに重要な因子の発現を促進する効果を活用した研究を行った。

ＴＮＦ系列リガンドであるＥＤＡは、毛髪、歯牙、汗腺などの外胚葉から分化された多様な器官の発達に関与するものと知られており、欠乏すると、Ｘ染色体関連低汗性外胚葉形成不全症（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄｈｙｐｏｈｉｄｒｏｔｉｃｅｃｔｏｄｅｒｍａｌｄｙｓｐｌａｓｉａ）が発生するものと知られている。多様なＥＤＡアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）のうちＥＤＡ１が外胚葉の発達に最も重要で特異的な受容体であるＥＤＡＲに結合してその機能を示すことになる。ＥＤＡＲに対するＥＤＡ１の結合後、ＥＤＡＲＡＤＤ（ＥＤＡＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｄｅａｔｈｄｏｍａｉｎ）、ＮＥＭＯ（ＮＦ−κＢＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｏｄｕｌａｔｏｒ）の活性化がなされ、ＮＦ−κＢの阻害タンパク質であるＩκＢのリン酸化を通じた分解過程が現われ、ＮＦ−κＢの核内移動が生じる。核中に入ったＮＦ−κＢは、結合組織成長因子／ＣＣＮ系列タンパク質２（ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２）及びＳｈｈ（Ｓｏｎｉｃｈｅｄｇｅｈｏｇｈｏｍｏｌｏｇ）のような毛包形成促進効果を有するタンパク質の遺伝子発現を促進する。

本明細書の全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照されてその引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体が本明細書に参照により組み込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。

ＳｔｅｎｎａｎｄＰａｕｓ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，８１：４４９（２００２）Ｏｌｉｖｅｒ，Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．１５：３３１（１９６６）Ａｒｃｋ，ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，１６２（３）：８０３（２００３）

本発明者らは、ＥＤＡ１と同一の機能又は類似する機能を維持しながらも、天然のＥＤＡ１タンパク質より活性、皮膚透過度及び安定性に優れた物質を開発すべく努力した結果、天然のＥＤＡ１タンパク質のアミノ酸配列に基づいて上述した特性を示す二つのＥＤＡ１関連ペプチドを合成し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の目的は、配列表の配列番号１及び配列番号２に記載のアミノ酸配列から構成された群より選択される１種のアミノ酸配列からなるペプチドを提供することにある。

本発明の別の目的は、上記ペプチドを有効成分として含む発毛促進及び毛髪生成改善用の組成物を提供することにある。

本発明の別の目的は、上記ペプチドを有効成分として含む皮膚状態（ｓｋｉｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）改善用の組成物を提供することにある。

本発明の別の目的は、上記ペプチドを有効成分として含むＥＤＡ１（ｅｃｔｏｄｙｓｐｌａｓｉｎＡ１）関連シグナル伝達不全に関連する疾患の改善又は治療用の組成物を提供することにある。

本発明の別の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によってより明確になる。

本発明の一様態によれば、配列表の配列番号１及び配列番号２に記載のアミノ酸配列から構成された群より選択される１種のアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。

本発明者らは、ＥＤＡ１（ｅｃｔｏｄｙｓｐｌａｓｉｎＡ１）と同一の機能又は類似する機能を維持しながらも、天然のＥＤＡ１タンパク質より活性、皮膚透過度及び安定性に優れた物質を開発すべく努力した結果、天然のＥＤＡ１タンパク質のアミノ酸配列に基づいて上述した特性を示すペプチドを合成し、ＥＤＡ１タンパク質受容体に結合するリガンドの配列に基づいて上述した特性を示すペプチドを合成した。

本発明の特徴及び利点を要約すれば、次のとおりである：
（ｉ）本発明のＥＤＡ由来のペプチドであるＥＤＡ３と、ＥＤＡＲリガンド由来のペプチドであるＥＤｐｈＤ１は、天然のＥＤＡと類似する機能を果たす。
（ｉｉ）本発明のペプチドは、天然のＥＤＡに比べて非常に安定性に優れており、皮膚透過度にも非常に優れている。
（ｉｉｉ）本発明のペプチドを含む組成物は、毛髪の成長及び生成に活性を有し、ＥＤＡタンパク質の活性が要求される疾患又は状態を治療、予防又は改善するのに非常に優れた効能を発揮する。
（ｉｖ）本発明のペプチドの優れた活性及び安定性は、医薬、医薬部外品及び化粧品に非常に有用に適用されることができる。

本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号１と配列番号２のペプチドの高性能液体クロマトグラフィーの分析結果を示すグラフである。本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号１のペプチドを処理した繊維芽細胞の細胞成長促進の効果を示すグラフである。本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号２のペプチドを処理した繊維芽細胞の細胞成長促進の効果を示すグラフである。本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号１のペプチドを処理したとき、ＩκＢタンパク質の細胞内量がリン酸化に続くユビキチン化によって減少することを示すウェスタンブロッティング結果である。本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号２のペプチドを処理したとき、ＩκＢタンパク質の細胞内量がリン酸化に続くユビキチン化によって減少されることを示すウェスタンブロッティング結果である。本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号１のペプチドを処理したとき、細胞質内のＮＦ−κＢの活性化による核内移動を示すウェスタンブロッティング結果である。本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号２のペプチドを処理したとき、細胞質内のＮＦ−κＢの活性化による核内移動を示すウェスタンブロッティング結果である。本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号１のペプチドを処理したとき、ＮＦ−κＢの活性化による下位タンパク質ＣＯＸ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１ｂの発現が増加することを示すＲＴ−ＰＣＲ結果である。本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号２のペプチドを処理したとき、ＮＦ−κＢの活性化による下位タンパク質ＣＯＸ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１ｂの発現が増加することを示すＲＴ−ＰＣＲ結果である。本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号１のペプチドを処理したとき、毛包形成に関与するタンパク質であるＳｈｈの発現増加を示すウェスタンブロッティング結果である。本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号２のペプチドを処理したとき、毛包形成に関与するタンパク質であるＳｈｈの発現増加を示すウェスタンブロッティング結果である。本発明の合成例によって製造されたペプチドを処理したとき、マウス頬髭毛包細胞の細胞成長促進の効果を示すグラフである。

本発明のペプチドは、ＥＤＡ１由来の配列表の配列番号１及び配列番号２に記載のアミノ酸配列から構成された群より選択される。本明細書において用語「ペプチド」とは、ペプチド結合によってアミノ酸残基が互いに結合されて形成された線状の分子を意味する。

本発明のペプチドは、当業界に公知された化学的合成法、特に固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）によって製造されることができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔａｌ．，ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ．ｅｄ．，ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍ．Ｃｏ．：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１（１９８４））。

本発明のペプチドＥＤＡ３は、ＥＤＡ１タンパク質の複数部位を無作為に部分合成して受容体タンパク質に対する結合可能部位を１次探索した後、この予測された部位のアミノ酸配列を最適化して本発明のペプチドとして選定製造し、これら候補ペプチドのうち最も活性に優れたペプチドをスクリーニングすることで、本発明の配列表の配列番号１のペプチドが提供される。

本発明のまた別のペプチドＥＤｐｈＤ１は、ＥＤＡ１タンパク質の受容体であるＥＤＡＲに特異的な結合を示す配列をファージディスプレイ（ｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙ）技術を通じて探索した後、当該配列を対象ペプチドとして選定製造し、これら候補ペプチドのうち最も活性に優れたペプチドをスクリーニングすることで、本発明の配列表の配列番号２のペプチドが提供される。

配列表の配列番号１及び配列番号２のペプチドは、天然のＥＤＡ１と類似する作用を果たして、受容体と結合して成長因子のような機能を果たすペプチドである。

本発明のペプチドは、それ自体で天然のＥＤＡ１タンパク質より安定性に優れているが、アミノ酸の変形によって安定性がより向上することができる。

本発明の好ましい実現例によれば、上記ペプチドのＮ末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から構成された群より選択される保護基が結合されている。

上述したアミノ酸の変形は、本発明のペプチドの安定性を大きく改善する作用をする。本明細書において用語「安定性」とは、「インビボ」安定性だけでなく、保存安定性（例えば、常温保存安定性）も意味する。上述した保護基は、生体内のタンパク質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護する作用をする。

本発明の別の様態によれば、本発明のペプチドを有効成分として含む発毛促進及び毛髪生成改善用の組成物を提供する。

本発明の別の様態によれば、本発明のペプチドを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に処理するステップを含む発毛促進及び毛髪生成改善方法を提供する。

本発明のまた別の様態によれば、本発明は、発毛促進及び毛髪生成改善用の医薬品（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ）を製造するための本発明のペプチドの用途を提供する。

本発明の組成物は、上述した本発明のＥＤＡ１関連ペプチドを有効成分として含むので、これら間で共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。

下記の実施例で立証されたように、本発明のＥＤＡ１関連ペプチドは、ヒトＥＤＡタンパク質から由来するものであって、繊維芽細胞の成長促進能力を持ち、またＥＤＡ１−ＥＤＡＲの代表的なシグナルを促進することで、ＥＤＡＲＡＤＤ、ＮＥＭＯの活性化後、ＮＦ−κＢの阻害タンパク質であるＩκＢのリン酸化を通じた分解過程とＮＦ−κＢの核内移動が生じた。なお、核中に入ったＮＦ−κＢによる下位分子の発現及びＳｈｈ（Ｓｏｎｉｃｈｅｄｇｅｈｏｇｈｏｍｏｌｏｇ）のような毛包形成促進の効果を有するタンパク質の発現が促進されることを確認した。また、本発明のペプチドは、マウスの毛髪成長に対する促進効果を示した。よって、本発明の組成物は、毛髪の成長及び皮膚状態の改善に非常に効果的である。

本発明の別の様態によれば、本発明のペプチドを有効成分として含む皮膚状態（ｓｋｉｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）改善用の組成物を提供する。

本発明のまた別の様態によれば、本発明のペプチドを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に処理するステップを含む皮膚状態（ｓｋｉｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）改善方法を提供する。

本発明のまた別の様態によれば、本発明は、皮膚状態（ｓｋｉｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）改善用の医薬品を製造するための本発明のペプチドの用途を提供する。

本発明の好ましい実現例によれば、本発明の組成物は、しわの改善、皮膚弾力の改善、皮膚老化の防止、皮膚保湿の改善、傷跡の除去又は皮膚の再生を含む皮膚状態の改善に用いられる。

本発明の別の様態によれば、本発明のペプチドを有効成分として含むＥＤＡ１関連シグナル伝達不全に関連する疾患の改善又は治療用の組成物を提供する。

本発明のまた別の様態によれば、本発明のペプチドを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に処理するステップを含むＥＤＡ１（ｅｃｔｏｄｙｓｐｌａｓｉｎＡ１）関連シグナル伝達不全に関連する疾患の予防又は治療方法を提供する。

本発明のまた別の様態によれば、本発明は、ＥＤＡ１（ｅｃｔｏｄｙｓｐｌａｓｉｎＡ１）関連シグナル伝達不全に関連する疾患の予防又は治療用の医薬品を製造するための本発明のペプチドの用途を提供する。

本発明の好ましい実現例によれば、本発明の組成物は、骨疾患、骨粗鬆症又は肥満の予防又は治療を含むＥＤＡ１関連シグナル伝逹不全に関連する疾患の改善又は治療に用いることができる。

本発明の組成物は、（ａ）上述した本発明のＥＤＡ１タンパク質の活性を示すペプチドの薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物として用いることができる。

本明細書において用語「薬剤学的有効量」とは、上述したＥＤＡ１関連ペプチドの効能又は活性を達成するのに十分な量を意味する。

本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキトロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油などを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、上記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。

本発明の薬剤学的組成物は、非経口で投与することが好ましく、例えば、皮膚局所投与によって投与することができる。

本発明の薬剤学的組成物の好適な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性といった要因によって多様であり、普通に熟練した医者は所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の好ましい実現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇである。

本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することで単位用量形態に製造されるか、又は多用量容器内に内入させて製造されることができる。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又はゲル（例えば、ハイドロゲル）の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含んでもよい。

また、本発明の組成物は、（ａ）上述した本発明のＥＤＡ１関連ペプチドの化粧品学的有効量（ｃｏｓｍｅｔｉｃａｌｌｙｅｆｆｅｃｔｉｖｅａｍｏｕｎｔ）；及び（ｂ）化粧品学的に許容される担体を含む化粧品組成物として用いることができる。

本明細書において用語「化粧品学的有効量」とは、上述した本発明の組成物の効能を達成するのに十分な量を意味する。

本発明の化粧品組成物は、当業界で通常製造されるいずれの剤形にも製造することができ、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉状ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレーなどに剤形化することができるが、これに限定されるものではない。より詳細には、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー又はパウダーの剤形に製造することができる。

本発明の剤形がペースト、クリーム又はゲルの場合には、担体成分として、動物油、植物油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、滑石又は酸化亜鉛などが用いることができる。

本発明の剤形がパウダー又はスプレーの場合には、担体成分として、ラクトース、滑石、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート又はポリアミドパウダーを用いることができ、特にスプレーの場合には、さらにクロロフルオロハイドロカーボン、プロパン／ブタン又はジメチルエーテルのような推進剤を含むことができる。

本発明の剤形が溶液又は乳濁液の場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤又は乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセリン脂肪族エステル、ポリエチレングリコール又はソルビタン脂肪酸エステルがある。

本発明の剤形が懸濁液の場合には、担体成分として、水、エタノール又はプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天又はトラガントなどを用いることができる。

本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングの場合には、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオン酸、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物油、ラノリン誘導体又はエトキシル化グリセリン脂肪酸エステルなどを用いることができる。

本発明の化粧品組成物に含まれる成分は、有効成分としてのペプチド類と担体成分以外に、化粧品組成物に通常用いられる成分を含み、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常の補助剤を含むことができる。

以下、実施例を通じて、本発明をより詳しく説明する。これら実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないということは、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者にとって自明であろう。

実施例
合成例１：Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ（配列表の配列番号１）の合成
クロロトリチルクロリド樹脂（Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅｒｅｓｉｎ；ＣＴＬｒｅｓｉｎ，ＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍＣａｔＮｏ．０１−６４−００２１）７００ｍｇを反応容器に入れて、メチレンクロライド（ＭＣ）１０ｍｌを加えて３分間攪拌した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍｌを入れて３分間攪拌した後、さらに溶媒を除去した。反応器に１０ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液を入れて、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）４００ｍｍｏｌｅを入れた後、攪拌してよく溶かし、１時間攪拌しながら反応させた。反応後、洗浄してメタノールとＤＩＥＡ（２：１）をＤＣＭに溶かして１０分間反応させ、過量のＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）で洗浄した。溶液を除去してＤＭＦを１０ｍｌ入れて３分間攪拌した後、さらに溶媒を除去した。脱保護溶液（２０％のピペリジン（Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）／ＤＭＦ）１０ｍｌを反応容器に入れて、１０分間常温で攪拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れて、さらに１０分間反応を維持した後、溶液を除去してそれぞれ３分ずつＤＭＦで２回、ＭＣで１回、ＤＭＦで１回洗浄して、Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＣＴＬＲｅｓｉｎを製造した。新たな反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れて、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ、ＨｏＢｔ２００ｍｍｏｌｅ及びＢｏｐ２００ｍｍｏｌｅを入れた後、攪拌してよく溶かした。反応器に４００ｍｍｏｌｅＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）を分画で２回にかけて入れた後、全ての固体が溶けるまで最小限５分間攪拌した。溶かしたアミノ酸混合溶液を脱保護された樹脂がある反応容器に入れて、１時間常温で攪拌しながら反応させた。反応液を除去してＤＭＦ溶液で３回５分ずつ攪拌した後、除去した。反応樹脂を少量取ってカイザー試験（ＫａｉｓｅｒＴｅｓｔ）を用いて反応程度を点検した。脱保護溶液で上記と同様に２回脱保護反応させてＧｌｙ−Ａｌａ（ｐｂｆ）−ＣＴＬＲｅｓｉｎを製造した。ＤＭＦとＭＣで十分洗浄し、再度カイザー試験を行った後、上記と同様に下記のアミノ酸付着実験を行った。選定されたアミノ酸配列に基づいて、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ及びＦｍｏｃ−Ａｓｎの順に連鎖反応させた。Ｆｍｏｃ−保護基を脱保護溶液で１０分ずつ２回反応させた後、よく洗浄して除去した。無水酢酸とＤＩＥＡ、ＨｏＢｔ（Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）を入れて１時間アセチル化を行った後、製造されたペプチジル樹脂をＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールでそれぞれ３回洗浄し、窒素空気をゆっくり流して乾燥した後、五酸化燐（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｐｅｎｔｏｘｉｄｅ，Ｐ_２Ｏ_５）下で真空に減圧して完全に乾燥した後、脱漏溶液［ＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）９５％、蒸留水２．５％、チオアニソール（Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）２．５％］３０ｍｌを入れた後、常温でたまに振りながら２時間反応を維持した。フィルタリングして樹脂をろ過し、樹脂を少量の溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を用いて全体ボリュームが半分程度残るように蒸留し、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈殿を誘導した後、遠心分離して沈殿を集めて、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去し、窒素下で十分乾燥して、精製前Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａペプチド−１を０．８５ｇ合成した（収率：８９．９％）。分子量測定器を用いて測定したとき、分子量１２４０．４（理論値：１２３９．５）を得ることができた。上記のような方法で配列番号２のペプチド（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ）も合成した（収率：９２．１％）。分子量測定器を用いて測定したとき、分子量１４４６．５（理論値：１４４７．５）Ｄａの値を得ることができた。

試験例１：合成ペプチドを活用した細胞成長効果の確認
合成例１及び２で合成された配列ペプチドに対する成長因子の類似効能及び抑制効能を分析するために、リジノなどの方法（Ｒｉｚｚｉｎｏ，ｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４８：４２６６（１９８８））を参照して、ＨａＣａＴ角質細胞株とＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞を用いたＳＲＢ（ＳｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅＢ）比色法を用いて測定した。

ＨａＣａＴ角質細胞株（韓国細胞株銀行）及びＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞（韓国細胞株銀行）を、それぞれ２５０ｍｌ用量の組織培養用フラスコを用いて１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ，Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で培養した。培養された細胞株を１％トリプシン溶液で培養容器の底から剥がした後、遠心分離して細胞沈殿物のみを集めた。これをＦＢＳが含有されていないＤＭＥＭ培養液にさらに懸濁した後、組織培養用の９６ウェルプレートに各ウェル当たり３×１０^３細胞になるように入れて、２４時間３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。２４時間後、血清を完全に除外した同一の培養液に培地を交換した後、標準を設定するための空試料と合成ペプチドを１０％蒸留水に滅菌状態で溶かした後、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌの濃度で７２時間上記と同一条件で培養した。培養が完了した後、培養上層液を除去し、エタノールを用いて細胞を固定化して、細胞固定が終わった後、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓａｌｉｎｅ）で３回洗浄した。洗浄溶液を除去してから、比色ＳＲＢ溶液で処理して１％酢酸（ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）で十分洗浄した後、顕微鏡で細胞を観察して生存細胞の状態を観察し、紫外線５９０ｎｍで吸光度を測定して細胞の生存状態を測定した。

図２は、ペプチド処理後の角質細胞（図２ａ）及び繊維芽細胞（図２ｂ）の成長に対する結果である。図２ａ及び２ｂに示されたように、本発明のペプチドは繊維芽細胞の成長を大きく増進させた。

試験例２：合成ペプチドのＥＤＡ１−ＥＤＡＲシグナル促進効果の確認
ＨａＣａＴ細胞に合成例１で合成したペプチドを処理して２０分経過後、ＥＤＡタンパク質の代表的なシグナルであるＩκＢのリン酸化を通じたＮＦ−κＢの核内移動を確認した。それぞれの効果は、ＩκＢ及びＮＦ−κＢの抗体（サンタクルーズ、米国）を用いてウェスタンブロッティングを通じて観察された。本発明のペプチドを処理した場合、ＩκＢのリン酸化及びユビキチン化による処理濃度別の分解効果が確認され（図３ａ及び３ｂ）、抑制剤であるＩκＢの分解によるＮＦ−κＢの活性化及び核内移動が確認された（図４ａ及び４ｂ）。また、ペプチドによるＮＦ−κＢの核内移動に対する影響を確認するために、ＮＦ−κＢによって発現が誘導されるものと知られているＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６、ＣＯＸ−２の発現程度を、それぞれの特異的なプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲを通じて観察した。ペプチドによって誘導されたＮＦ−κＢの核内移動によって上記三つのタンパク質の発現が増加したことが観察された（図５ａ及び５ｂ）。

図３ａ及び３ｂは、本発明のペプチドを処理したとき、ＩκＢのリン酸化及びユビキチン化による分解効果が現れることを示し、図４ａ及び４ｂは、本発明のペプチドを処理したとき、ＮＦ−κＢの核内移動が促進されることを示す。また、図５ａ及び５ｂは、本発明のペプチドを処理したとき、ＮＦ−κＢの核内移動の促進による下位発現分子ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６、ＣＯＸ−２の発現増加を示す。

試験例１及び２の実験結果を総合すれば、本発明のペプチドは、ＥＤＡ１−ＥＤＡＲシグナルの活性化による非常に優れた毛髪成長促進の機能を発揮することが分かる。

試験例３：合成ペプチドによる毛包形成促進タンパク質Ｓｈｈの発現増加の確認
合成例１で合成したペプチドのＥＤＡ１ターゲットタンパク質であって、毛包形成促進効果を有するものと知られているタンパク質であるＳｈｈの発現量増加に対する影響を確認するために、角質細胞を６０ｍｍ組織培養用プレートに３×１０^５細胞になるように入れて、２４時間３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。２４時間後、１％血清を含む同一の培養液に培地を交換した後、標準を設定するための空試料と合成ペプチドを蒸留水に滅菌状態で溶かした後、１０μｇ／ｍｌの濃度で処理して、２４時間上記と同一の条件で培養した。その後、Ｓｈｈ特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティングを進行した。

図６ａから分かるように、ペプチドの処理濃度によって毛包形成促進タンパク質であるＳｈｈの発現量が増加することが確認された。また、図６ｂは、本発明のペプチドを角質細胞に濃度別処理してＳｈｈの発現量を観察したとき、処理濃度によってＳｈｈの発現量が増加することを示す。この結果は、ペプチドによってＥＤＡ１−ＥＤＡＲシグナルが伝達されて毛髪成長促進だけでなく、新しい毛包形成の誘導による発毛効果も現れるということを示す。

試験例５：製造されたペプチドを処理したマウスの毛髪成長の効果
合成例１を通じて製造されたペプチドをＣ５７ＢＬ／６マウスから採取された頬髭毛包細胞に処理して、増殖効果を観察した。マウス頬髭毛包から採取された細胞を組織培養用の９６ウェルプレートに各ウェル当たり３×１０^３細胞になるように入れて、２４時間３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。２４時間後、血清を完全に除去した同一の培養液に培地を交換した後、標準を設定するための空試料と合成ペプチドを蒸留水に滅菌状態で溶かした後、１０μｇ／ｍｌび５０μｇ／ｍｌの濃度で７２時間上記と同一条件で培養した。培養が完了した後、培養上層液を除去し、エタノールを用いて細胞を固定化して、細胞固定が終わった後、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓａｌｉｎｅ）で３回洗浄した。洗浄溶液を除去してから、比色ＳＲＢ溶液で処理して１％酢酸で十分洗浄した後、顕微鏡で細胞を観察して生存細胞の状態を観察し、紫外線５９０ｎｍで吸光度を測定して細胞の生存状態を測定した（図７）。

図７は、ペプチド処理後のマウス毛包細胞の成長に対する結果が示されている。合成ペプチドを５０μｇ／ｍｌの濃度で処理したとき、相対的に対照群に比べて相当な成長率を示した。

実施例１：ナノ化ペプチドの製造
上記合成例にて得たペプチド２種を、５０ｍｇをそれぞれ正確に秤量した後、蒸留水５００ｍｌで十分に攪拌して溶解した。配合体溶液をレシチン５ｇ、オレイン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｏｌｅａｔｅ）０．３ｍｌ、エタノール５０ｍｌを混合した後、総量が１Ｌになるように蒸留水で定容し、マイクロフルイダイザで高圧を用いて乳化させて、サイズ１００ｎｍ程度のナノソームを製造した。製造されたナノソームは、最終濃度が約５０ｐｐｍで単独あるいは複合的に化粧品製造用に使用された。

剤形例１：柔軟化粧水
上記実施例で製造されたペプチドナノソームを含み、下記組成からなる柔軟化粧水を、通常の化粧水の製造方法によって製造した。

剤形例２：栄養クリーム
上記実施例で製造されたペプチドナノソームを含み、下記組成からなる栄養クリームを、通常の栄養クリームの製造方法によって製造した。

剤形例３：栄養化粧水
上記実施例で製造されたペプチドナノソームを含み、下記組成からなる栄養化粧水を、通常の化粧水の製造方法によって製造した。

剤形例４：エッセンス
上記実施例で製造されたペプチドナノソームを含み、下記組成からなるエッセンスを、通常のエッセンスの製造方法によって製造した。

剤形例５：ヘアセラム
上記実施例で製造されたペプチドナノソームを含み、下記組成からなるヘアセラムを、通常のヘアセラムの製造方法によって製造した。

剤形例６：ヘア化粧水
上記実施例で製造されたペプチドナノソームを含み、下記組成からなるヘア化粧水を、通常のヘア化粧水の製造方法によって製造した。

以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好ましい実現例に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれの等価物によって定義されると言える。

Claims

配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
前記ペプチドのＮ末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から構成された群より選択される保護基が結合されていることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
前記ペプチドは、ヒトＥＤＡ（ｅｃｔｏｄｙｓｐｌａｓｉｎＡ）タンパク質から由来することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
前記ペプチドは、繊維芽細胞の成長促進能を有することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
前記ペプチドは、ＥＤＡ１−ＥＤＡＲ（ＥＤＡｒｅｃｅｐｔｏｒ）シグナルを促進させることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
前記ペプチドは、毛包形成誘導タンパク質であるＳｈｈ（Ｓｏｎｉｃｈｅｄｇｅｈｏｇｈｏｍｏｌｏｇ）の発現を促進させることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
前記ペプチドは、毛包細胞の成長を促進させることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
配列表の配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む発毛促進又は毛髪生成改善用の組成物。
配列表の配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む皮膚状態（ｓｋｉｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）改善用の組成物であって、
前記皮膚状態の改善は、しわの改善、皮膚弾力の改善、皮膚老化の防止、皮膚保湿の改善、傷跡の除去又は皮膚の再生である組成物。