KR101632948B1 - 항염증, 골 형성 및 발모 촉진 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

항염증, 골 형성 및 발모 촉진 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 항염증 및 골 분화 촉진 활성을 갖는 펩타이드를 제공한다. 본 발명은 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 발모 촉진 활성을 갖는 펩타이드를 제공한다. 본 발명의 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 염증성 사이토카인의 발현을 억제하고 염증 세포의 증식을 억제함으로써 결과적으로 항염증 활성을 나타내며, 골 형성에 관여하는 PI3K, Smad1, Smad5 및 Smad8의 인산화를 증가시키고, ALP, OPG 및 BSP의 발현을 증가시킴으로써 결과적으로 골 분화를 촉진시킨다. 본 발명의 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 모낭세포 및 제대정맥 내피세포의 증식을 촉진시키며, ERK의 인산화를 증가시키고 모발성장에 관여하는 단백질인 PI3K, β-카테닌, IGF-1, KGF, Wnt3a의 발현을 증가시키며, 탈모 유전자인 DKK-1의 발현을 감소시킴으로써 결과적으로 탈모 예방 및 발모 촉진 효능을 나타낸다.

Description

항염증, 골 형성 및 발모 촉진 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도{Peptides Having Activities for Anti-inflammation, Bone Formation and Stimulation Hair Growth and Uses Thereof}
본 발명은 항염증, 골 형성 및 발모 촉진 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 및 이의 용도에 관한 것이다.
TNF-α(tumor necrosis factor-α)는 세균 감염 및 종양 질환에 대한 숙주 면역 반응 중에 활성화된 대식세포 및 여러 다양한 세포에 의해 생성된다. 이 사이토카인은 염증 반응의 중요한 매개체로도 알려져 있는데, 류마티스성관절염(RA), 건선성 관절염, 크론병, 건선, 강직성척수염(AS)과 같은 염증성 질환에 중요한 역할을 담당하고 있는 염증성 사이토카인이다. 예를 들면, 류마티스성관절염에서 TNF-α는 활액 염증을 지속시키고 뼈와 연골을 지속적으로 파괴시킨다. 따라서, TNF-α의 특이적 생물 활성을 억제하는 것이 요구되므로, TNF-α가 매개되는 세포 반응을 막고 염증 전 사이토카인의 활성과 TNF-α에 의해 조절되는 과정을 조정하고자 하는 목적으로 TNF-α를 억제하는 다양한 생물학적 제제가 개발되고 있다.
한편, 뼈는 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질 즉 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다. 따라서 성장이 끝난 성인의 뼈는 멈추지 않고 죽는 날 까지 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 생성과 흡수 과정을 매우 역동적, 지속적으로 반복 재생 하면서 균형을 유지하게 된다.
골재형성에는 크게 두 종류의 세포가 관여하는 것으로 알려져 있다. 두 세포 중 하나는 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast)이고, 다른 하나는 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)이다. 조골세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand)와 이것의 유도 수용체(decoy receptor)인 OPG(osteoprotegerin)를 생성한다. RANKL이 파골 전구세포(osteoclast progenitor cells) 표면에 있는 수용체인 RANK에 결합하면 파골 전구 세포가 파골세포로 성숙화(maturation)되어 골흡수(bone resorption)가 일어난다. 그러나 OPG가 RANKL과 결합하면 RANKL과 RANK간 결합이 차단되어 파골세포의 형성이 억제되고 필요 이상의 골 흡수가 일어나지 않게 된다(Theill LE. et al., Annu Rev Immunol., 20:795-823(2002); Wagner EF. et al., Curr Opin Genet Dev., 11:527-532(2001)). 오래된 뼈의 흡수 또는 파괴는 혈액세포(조혈모세포)에서 생기는 파골세포에 의해 이루어지며 이는 뼈에 구멍을 내어 적은 양의 칼슘을 혈류로 방출시켜 신체기능을 유지하는데 사용된다(William J. et al., Nature., 423:337342(2003)). 한편 뼈세포에서 생성된 조골세포는 교원질로 구멍을 채우고 칼슘과 인의 침적물(hydroxyapatite)을 덮어서 단단한 새로운 뼈를 만들어 골격을 재건한다(Stains JP. et al., Birth Defects Res C Embryo Today., 75(1):72-80(2005)). 뼈가 파괴되기 시작하여 다시 새로운 뼈로 재형성되기까지는 약 100일 정도 걸린다(Schwarz EM. et al., Curr Opin Orthop., 11:329-335(2000)). 유아에서는 1년 내에 뼈의 칼슘이 100% 바뀌지만 성인에서는 매년 골격의 약 10-30%가 이런 과정을 통하여 재형성되며, 파골속도와 조골속도가 동일해야만 전과 같은 골밀도를 유지할 수 있다. 이와 같이 중요한 뼈에 균형이 깨질 경우 많은 질병이 야기될 수 있는데 특히 골다공증과 암세포의 골전이(bone metastasis)로 인한 뼈의 손상과 관련 된 질환이 대표적이다.
골다공증(osteoporosis)은 여러 가지 원인에 의하여 뼈의 질량이 감소하고 뼈 조직의 미세구조의 퇴화로 골절 위험이 지속적으로 증가하는 질환으로 뼈를 구성하는 미네랄(특히 칼슘)과 기질이 감소한 상태이며, 골재형성의 균형이 깨져서 파골작용이 조골작용보다 증가된 상태에서 발생한다(Iqbal MM., South Med J., 93(1):2-18(2000)). 정상적인 뼈 내부는 그물망처럼 치밀한 구조를 이루고 있으나, 골다공증의 경우에는 구조 사이의 간격이 넓어지고 미세구조가 얇아져 약해짐으로써 조그만 충격에도 뼈가 쉽게 골절될 수 있는 상태로 진행된다(Stepan JJ. et al., Endocr Regul., 37(4):225-238(2003). 골다공증은 폐경기의 시작과 동시에 급속한 골손실(연간 2~3%)이 나타나며 척추의 압박 및 손목뼈가 쉽게 골절될 위험이 증가하는 폐경기 이후의 골다공증(Postmenopausal osteoporosis), 70세 이상의 남녀 노인에게 서서히 발생하며(연간 0.5~1%) 골반골(hip bone)과 척추뼈의 점진적인 골 손실을 가져오는 노년기의 골다공증(Senile osteoporosis), 그리고 연령에 상관없이 질병(내분비질환, 위장관질환, 악성종양)이나 약물(부신피질호르몬, 항암화학요법, 갑상선호르몬, 항경련제, 항응고제, 메토트렉사트(methotrexate), 사이클로스포린(cyclosporine), GnRH 등), 알코올, 흡연, 사고로 인해 발생하는 2차 골다공증(Secondary osteoporosis)으로 분류된다(Rosen CJ., N Engl J Med., 353(6):595-603(2005); Davidson M., Clinicain Reviews., 12(4):75-82(2002)).
유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer) 또는 다발성 골수종(multiple myeloma) 환자들에서 거의 항상 골 전이가 일어나고(Kozlow W. et al., J Mammary Gland Biol Neoplasia., 10(2):169-180(2005)), 이들 암환자들이 얼마나 오랫동안 살 수 있는지는 골 전이 여부에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 유방암 환자나 전립선암 환자의 사망률이 높아지는 이유는 암세포가 선택적으로 뼈로 전이되기 때문이다. 유방암에서 관찰되는 골 전이는 대부분 뼈를 파괴하는 골 용해성 골 전이(osteolytic metastasis)로서 유방암 세포가 뼈에 직접적인 영향을 미치는 것이 아니라 파골세포를 자극함으로써 일어나는 것으로 알려져 있다(Boyde A. et al., Scan Electron Microsc., 4:1537-1554(1986)). 반면, 전립선암에서 관찰되는 골전이는 골조성 골전이(osteoblastic metastasis)이다. 골조성 골 전이 또한 골 용해와 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 뼈로 전이해 온 암세포들은 뼈 주위의 미세환경에서 증식하여 파골세포나 조골세포의 활성을 자극함으로써 골용해성 골전이로 진행될지 골조성 골전이로 진행될지를 결정한다(Choong PF. et al., Clin Orthop Relat Res., 415S:S19-S31(2003)). 유방암 환자의 약 80%가 암세포의 골 전이가 발생되며, 전이된 유방암 세포는 파골세포를 활성화 시킨다(Bendre M., et al., Clin Orthop Relat Res., 415(Suppl):S39-S45(2003); Palmqvist P. et al., J Immunol., 169(6):3353-3362(2002)). 활성화 된 파골세포는 뼈 주위의 미세 환경의 균형을 파괴시켜 골용해(osteolysis)를 야기시키고 이러한 현상으로 인해 병적 골절이 자주 발생할 뿐만 아니라, 백혈구 감소증(leukoerythroblastic anaemia), 뼈의 기형, 고칼슘혈증(hypercalcemia), 통증(pain), 신경압박 증후군(nervecompression syndromes)등의 뼈와 관련된 질환이 발생된다(Roodman GD., N Engl J Med., 350:1655-1664(2004)).
국민건강보험공단 건강보험정책연구원이 2001년부터 2008년까지 건강보험 진료비 지급자료를 분석한 내용에 따르면‘탈모질환’의 실진료 환자수가 2001년 10만3천명에서 2005년 14만2천명, 그리고 2008년 16만5천명으로 나타나, 최근 7년 동안 60% 증가하였다. 연령별로는 20~40대 실진료 환자수가 11만4천명으로 환자의 69.5%를 차지하였으며, 10대 이하 환자도 2만2천명 이상인 것으로 나타났다. 성별 실진료 환자수는 2008년 기준으로 남성이 8만 4천명이고 여성은 8만명으로 나타나 남성이 여성보다 약간 더 많은 실정이며,‘탈모’ 질환의 상병별 국내 건강보험 실진료 환자수는 2008년 기준으로 원형탈모증(13만명), 흉터성탈모증(2만명), 안드로젠성탈모증(9천명), 기타 비흉터성모발손실(8천명) 순으로 나타났다.
해외의 탈모환자 유병율을 살펴보면, 2003년 6월 국제 모발 및 성형미용 연구토론회 자료에 따르면 전세계적으로 2.5억명이 탈모환자이며, 24-50세에서 탈모 발병율이 30-65% 정도로 나타났다. 2008년 기준으로 중국의 탈모인구는 약 3억 명에 이르며, 30대 남성인구의 30%, 그리고 50대 남성인구의 50%정도가 탈모 증세를 나타내고 있으며 매년 탈모 환자수는 10-15%정도 증가하고 있다. 일본인의 경우 탈모 발병율이 26.5%이며, 추정 탈모환자 인구수는 1,293만명 정도로 예상되었다.
현재 탈모치료를 위한 제제는 크게 의약품과 의약외품, 그리고 화장품으로 분류된다. 의사의 처방이 있어야 구입이 가능한 전문의약품에는 미국 Merck사에서 개발 판매하고 있는‘프로페시아’가 있으며, 이의 주성분인 피나스테라이드(Finasteride)는 1997년 12월 미국 FDA로부터 탈모치료제 승인을 받았다. 피나스테라이드는 테스토스테론을 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone, DHT)로 전환하는 5-α-리덕테이즈 효소를 억제하는 약제로서 연모를 굵고 긴 모발로 성장하게 하는 역할을 한다. 이는 단기적으로 탈모개선에 효과가 있으나 발기부전, 성기능 감퇴, 남성의 유방비대 등과 같은 부작용이 보고되고 있다. 안전성과 유효성이 인정되어 의사의 처방 없이도 구입이 가능한 약품으로 미녹시딜(Minoxidil)이 있으며, 1997년 12월 미국 FDA로부터 최초의 바르는 탈모 치료제로 승인되었다. 이 약품은 혈액순환을 개선시키고 칼륨 채널을 개방시킴으로써 모발성장을 촉진시키는 효과가 있으나 가려움, 발진 등 국소반응이 올 수 있으며, 빈맥 등이 나타날 수 있다.
식약청에서 탈모 방지와 육모 기능을 허가 받은 의약외품 제품에는 대표적으로 CJ 라이온의‘모발력 컴피턴트’, 모라클의 ‘헤어토닉’, LG생활건강의 ‘모앤모아’등이 있으며, 화장품류로는 샴푸류 또는 피부, 모발의 건강을 유지 또는 증진하기 위해 두피나 모발에 사용되는 제품이 판매되고 있다. 사람의 탈모주기는 크게 성장기(anagen), 퇴행기(catagen) 및 휴지기 (telogen)로 구분된다. 성장기는 모유도의 활동이 활발하면서 세포분열이 왕성하게 일어나 모발이 빠른 속도로 자라는 시기이다. 성장기의 수명은 털의 종류마다 다르지만 머리카락의 경우, 3-6년 정도이다. 성장기 모발은 전체모발의 80-90%를 차지하며, 탈모가 진행되고 있는 사람은 성장기가 짧아지고 휴지기가 긴 모발주기를 가지게 되어 전체모발에서 성장기모발의 비중이 감소하게 된다. 퇴행기는 모발의 성장기가 끝나고 모발 생성이 점차 느려져 결국 세포분열 및 성장이 멈추는 시기로 퇴행기의 수명은 1-1.5개월 정도이며 전체 모발의 1% 정도가 이 단계에 속한다. 휴지기는 성장의 마지막 단계로서 모낭과 모유두가 완전히 분리되어 모낭은 위축되고 모근은 더욱 위쪽으로 올라가 머리카락이 빠지는 단계이다. 휴지기는 3-4개월간 지속되고 전체모발의 4-14%가 이 단계에 해당된다. 휴지기가 끝나고 다시 모유두의 활동이 활발해지면, 새로운 모발의 모유두가 만들어지면서 휴지기에 있던 모발은 밀려나서 완전히 두피 밖으로 빠져나오게 된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 우수한 펩타이드들을 개발하고자 노력한 결과, 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 항염증 및 골 형성 활성을 나타내며, 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 발모 촉진 활성을 갖는다는 것을 갖는다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 항염증 활성을 갖는 펩타이드를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 골 분화 촉진 활성을 갖는 펩타이드를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 발모 촉진 활성을 갖는 펩타이드를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항염증용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 골 분화 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성을 갖는 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 골 분화 촉진 활성을 갖는 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 발모 촉진 활성을 갖는 펩타이드를 제공한다.
본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 우수한 펩타이드들을 개발하고자 노력한 결과, 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 항염증 및 골 형성 활성을 나타내며, 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 발모 촉진 활성을 갖는다는 것을 갖는다는 것을 규명하였다.
본 발명의 펩타이드는 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 펩타이드는 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되어 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 염증성 사이토카인의 발현을 억제하고 염증 세포의 증식을 억제함으로써 결과적으로 항염증 활성을 나타낸다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 골 형성에 관여하는 PI3K, Smad1, Smad5 및 Smad8의 인산화를 증가시키며, ALP, OPG 및 BSP의 발현을 증가시킴으로써 결과적으로 골 분화를 촉진시킨다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 모낭세포 및 제대정맥 내피세포의 증식을 촉진시키며, ERK의 인산화를 증가시키고 모발성장에 관여하는 단백질인 PI3K, β-카테닌, IGF-1, KGF, Wnt3a의 발현을 증가시키며, 탈모 유전자인 DKK-1의 발현을 감소시킴으로써 결과적으로 탈모 예방 및 발모 촉진 효능을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성 기술(US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 펩타이드의 N- 또는 C-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합될 수 있다.
상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 언급되는 용어 “안정성”은 “인 비보”안정성 뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 염증성 사이토카인의 발현을 억제하며 염증 세포의 증식을 억제하여 염증 반응을 억제함으로 염증성 질환의 예방 또는 치료에 매우 유효하다.
본 발명의 항염증용 조성물이 적용될 수 있는 염증성 질환은 염증성 피부질환(예: 천식, 습진, 건선, 알러지, 류마티스 관절염, 건선 관절염(psoriatic arthritis), 아토피성 피부염, 건선, 여드름, 아토피성 비염(건초열), 알레르기성 피부염(습진), 만성 부비동염 또는 지루성 피부염(seborrheic dermatitis)), 골질환, 위염, 통풍, 통풍 관절염, 궤양, 만성 기관지염, 급성 폐손상, 폐염증, 기도 과민반응, 염증성 장질환(예: 크론병, 궤양성 대장염), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 폐혈증, 폐혈성 쇼크, 맥관염 및 활액낭염 같은 급성 또는 만성 염증 질환; 루프스, 류마티스 다발성 근육통, 공피증, 베게너육아종증, 측두 동맥염, 저온형글로불린혈증(cryoglobulinemia) 및 다발성 경화증 같은 자가면역 질환; 이식 거부; 고형암(예: 폐, CNS, 장, 신장 및 췌장)을 포함하는 암; 알쯔하이머병; 동맥경화증; 바이러스 감염(예: HIV or 인플루엔자); 만성 바이러스 감염(예, 엡스타인-바 바이러스, 거대세포 바이러스, 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus); 또는 모세혈관 확장성 운동실조증을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 항염증성 조성물은 약제학적 조성물 또는 화장품 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조될 경우, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 펩타이드의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 어떤 투여량은 1일 당 0.0001-200 ㎍이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물이 화장품 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 펩타이드와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골 분화 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물은 골모세포주의 분화를 촉진시킨다. 따라서, 본 발명의 조성물은 골 분화를 효과적으로 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 골 분화에 관여하는 PI3K, Smad1, Smad5 및 Smad8의 인산화를 증가시키고, 골 분화 표지인자인 OPG, ALP 및 BSP 유전자 발현을 증가시킨다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 골 질환을 개선 또는 치료에 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 개선 또는 치료될 수 있는 골 질환은 골다공증, 소년기 골다공증, 골형성 부전증, 골연화증, 골 괴사증, 구루병, 골수염, 치조골 소실, 뼈의 파젯병(Paget’s disease), 고칼슘혈증, 원발성 부갑상선기능항진증, 전이성(metastatic) 골 질환, 골수종, 류마티스 관절염에서의 골 소실, 전이성 골 질환, 암에 의한 골 소실, 섬유성 골이형성증, 무형성 골 질환, 대사성 골 질환 및 나이에 따른 골 질량의 소실을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 골 분화 촉진용 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제3서열 의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물은 모낭세포 및 제대정맥 내피세포의 증식을 촉진시키며, ERK의 인산화를 증가시키고 모발성장에 관여하는 단백질인 PI3K, β-카테닌, IGF-1, KGF, Wnt3a의 발현을 증가시키며, 탈모 유전자인 DKK-1의 발현을 감소시킴으로써 결과적으로 탈모 예방 및 발모 촉진 효능을 나타낸다.
본 발명의 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 약제학적 조성물 또는 화장품 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 항염증 및 골 분화 촉진 활성을 갖는 펩타이드를 제공한다.
(ii) 본 발명은 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 발모 촉진 활성을 갖는 펩타이드를 제공한다.
(iii) 본 발명의 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 염증성 사이토카인의 발현을 억제하고 염증 세포의 증식을 억제함으로써 결과적으로 항염증 활성을 나타내며, 골 형성에 관여하는 PI3K, Smad1, Smad5 및 Smad8의 인산화를 증가시키고, ALP, OPG 및 BSP의 발현을 증가시킴으로써 결과적으로 골 분화를 촉진시킨다.
(iv) 본 발명의 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 모낭세포 및 제대정맥 내피세포의 증식을 촉진시키며, ERK의 인산화를 증가시키고 모발성장에 관여하는 단백질인 PI3K, β-카테닌, IGF-1, KGF, Wnt3a의 발현을 증가시키며, 탈모 유전자인 DKK-1의 발현을 감소시킴으로써 결과적으로 탈모 예방 및 발모 촉진 효능을 나타낸다.
도 1a-1c는 본 발명의 펩타이드에 대한 TNF 수용체 결합도를 측정한 결과이다.
도 2a-2f는 본 발명의 펩타이드에 의한 대식세포의 증식 변화를 측정한 결과이다.
도 3a-3c는 TNF-α 처리에 의해 활성화된 NF-κB의 핵 내 이동에 작용하는 본 발명의 펩타이드의 효과를 측정한 결과이다.
도 4a-4c는 TNF-α 처리에 의해 증가된 IL-1β 발현에 작용하는 본 발명의 펩타이드의 효과를 측정한 결과이다.
도 5a-5c는 TNF-α 처리에 의해 증가된 IL-8 발현에 작용하는 본 발명의 펩타이드의 효과를 측정한 결과이다.
도 6은 본 발명의 펩타이드에 대한 HGF 수용체 결합도를 측정한 결과이다.
도 7은 HGF 수용체 신호 자극에 의해 증가하는 PI3K 인산화에 작용하는 본 발명의 펩타이드의 효과를 측정한 결과이다.
도 8은 본 발명의 펩타이드에 대한 BMP 수용체 결합도를 측정한 결과이다.
도 9는 BMP 수용체 신호 자극에 의해 증가하는 Smad1/5/8 인산화에 작용하는 본 발명의 펩타이드의 효과를 측정한 결과이다.
도 10a-10c는 본 발명의 펩타이드에 대한 ALP 발현 변화를 측정한 결과이다.
도 11a-11c는 본 발명의 펩타이드의 골 분화 촉진에 따른 광물화(minelaization)를 측정한 결과이다.
도 12a-12c는 본 발명의 펩타이드에 의한 골 분화 표지인자(OPG, ALP 및 BSP)의 발현 변화를 측정한 결과이다.
도 13a-13b는 본 발명의 펩타이드에 의한 모발 진피 유두세포의 증식 변화를 측정한 결과이다.
도 14a-14b는 본 발명의 펩타이드에 의한 모발 모모세포의 증식 변화를 측정한 결과이다.
도 15a-15b는 본 발명의 펩타이드에 의한 제정맥 내피세포의 증식 변화를 측정한 결과이다.
도 16은 본 발명의 펩타이드에 의한 ERK 인산화, PI3K 발현 및 β-카테닌의 발현 변화를 측정한 결과이다.
도 17은 본 발명의 펩타이드에 의한 IGF-1, KGF 및 Wnt3a의 발현 변화를 측정한 결과이다.
도 18은 DHT 처리에 의해 증가된 DKK-1 발현에 작용하는 본 발명의 펩타이드의 효과를 측정한 결과이다.
도 19는 본 발명의 펩타이드에 의한 Ha3-II 및 케라틴-14의 발현 변화를 측정한 결과이다.
도 20은 본 발명의 펩타이드에 의한 쥐 수염의 성장 변화를 측정한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
합성예 1: 펩타이드 합성
클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ml를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF) 10 ml를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ml의 디클로로메탄용액을 넣고 Fmoc-Cys-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM(dichloromethane)에 녹여 10분간 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF)를 10 ml 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine)/DMF) 10 ml를 반응용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, DMF로 1회 세척하여 Cys-CTL 레진(Resin)을 제조하였다. 새로운 반응기에 10 ml의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Pro(Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrin Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Pro-Cys-CTL 레진을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Arg(pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Ile, Fmoc-Ala, Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Arg(pbf), Fmoc-Cys(Trt) 및 Fmoc-Ala 순으로 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 무수초산과 DIEA, HoBt를 넣어 한시간 동안 아세틸화를 수행한 뒤 제조된 펩티딜 레진을 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P2O5 하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액[트리플로로화 초산(Trifluroacetic acid) 81.5%, 증류수 5%, 티오아니졸(Thioanisole) 5%, 페놀(Phenol) 5%, EDT 2.5% 및 TIS 1%] 30 ml을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 NH2-Ala-Cys-Arg-Ser-Ala-Ile-Gly-Arg-Pro-Cys-COOH 펩타이드 1을 0.79 g 합성(수율: 87.7%)하였고, NH2-Ala-Cys-Phe-Thr-Arg-Thr-Ser-His-Ala-Cys-COOH 펩타이드 2를 0.77 g 합성하였으며(수율: 85.5%), NH2-Ala-Cys-Asp-Gly-Arg-Thr-Gln-Ala-Leu-Cys-COOH 펩타이드 3을 0.76 g 합성하였다(수율: 84.4%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 펩타이드 1의 분자량 1033.3(이론값 : 1033.2), 펩타이드 2의 분자량 1096.0(이론값 : 1096.2), 펩타이드 3의 분자량 1036.9 (이론값 : 1037.1)를 얻을 수 있었다.
펩타이드 아미노산 서열 분석값(질량분석기)
분석치 이론치
서열 1 ACRSAIGRPC 1033.3 1033.2
서열 2 ACFTRTSHAC 1096.0 1096.2
서열 3 ACDGRTQALC 1036.9 1037.1
실시예 1: 항염증 활성 평가
1-1. 수용체 결합 어세이(TNFR)
ELISA 용 플레이트에 펩타이드 50 μg/25 μl와 코팅 버퍼(20 mM 소듐 포스페이트 pH 9.6) 25 μl를 첨가하여 섞고 4℃ 하룻밤 동안 배양하였다. PBST(300 μl)로 3회 세척한 다음 블로킹 버퍼(3% BSA) 200 μl로 블로킹을 2시간 동안 실온에서 실시하였다. PBST(300 μl)로 3회 세척한 다음 TGFR 타입 II(R&D Systems)를 웰 당 0.5 μg/1 ml 첨가한 후 2시간 동안 실온에서 배양하였다. PBST(300 μl)씩 3회 세척한 다음 항-인간 IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology)를 1:1,000으로 희석하여 웰 당 100 μl씩 첨가하고 2시간 동안 실온에서 배양하였다. PBST(300 μl)로 3회 세척한 다음 TMB 용액(Sigma Aldrich)을 100 μl씩 첨가한 후 발색을 진행하였다. 정지 용액(3 N H2SO4) 50 μl를 첨가하여 반응을 멈춘 다음 O.D 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실험결과, TNFR에 대한 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 및 서열목록 제3서열의 펩타이드의 높은 결합 친화도(binding affinity)를 확인하였다(양성 대조군: TNF-α)(도 1a-1c).
1-2. 분화 어세이(Proliferation assay)
마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포를 1x104 세포/웰의 밀도로 48웰 플레이트에 시딩하였다. 24시간 안정화 후 6시간 동안 무혈청 배지에서 배양하고 TNF-α 100 ng/ml과 펩타이드 50 μg/ml을 동시에 처리한 다음 72시간 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양 상층액을 제거하고 에탄올을 이용하여 세포를 고정화 한 다음 세포고정이 끝난 후, PBS(phosphate buffer saline)로 3회 세척하였다. 세척용액을 제거한 뒤 비색 SRB 용액으로 처리하고 1% acetic acid 로 충분히 세척을 한 뒤 현미경으로 세포를 관찰하여 생존 세포의 상태를 관찰하였으며, 20mM tris로 탈 염색된 용액에 대해 자외선 560 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존 상태를 측정하였다.
실험결과, TNF-α 처리에 의해 증가된 RAW264.7 세포 증식이 서열목록 제1서열의 펩타이드 처리에 의해 감소됨을 확인할 수 있었다(도 2a-2f).
1-3. 인간 모모세포을 이용한 웨스턴 블롯팅
인간 모모세포(keratinocyte)인 HaCaT 세포를 5x105 세포/웰로 6웰 플레이트에 시딩한 후 하룻밤 동안 배양한 다음, 펩타이드를 농도별로 처리하고 1시간 동안 배양하였다. 세포를 용해한 다음, 항-pERK 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국)와 항-p-c-Jun 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 이용하여 RANKL-RANK 시그널인 p-Erk, p-c-Jun에 대한 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
실험결과, TNF-α 처리에 의해 활성화된 NF-κB의 핵 내 이동은 서열목록 제1서열의 펩타이드 처리에 의해 감소되었다(도 3a-3c).
1-4. IL-1β 및 IL-8에 대한 ELISA
인간 단핵구(monocyte) THP-1 세포를 2x106 세포/웰의 밀도로 24웰 플레이트에 시딩하였다. 하룻밤 동안 배양한 후 샘플을 10 μg/ml 농도로 30분간 전처리 하고 50 ng/ml TNF-α를 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 세포 배양 배지를 획득하고 4℃, 13,000 rpm 으로 10분간 원심분리 후 상등액을 분리하였다. IL-1b 및 IL-8 ELISA 키트(R&D system)를 이용하여 ELISA를 수행하였다.
실험결과, TNF-α 처리에 의해 증가된 IL-1b 및 IL-8의 발현이 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 및 서열목록 제3서열의 펩타이드 처리에 의해 저해됨을 ELISA를 통해 확인하였다(도 4a-4c 및 도 5a-5c).
실시예 2: 골 형성능 평가
2-1. 수용체 결합 어세이(HGFR)
ELISA 용 플레이트에 펩타이드 50 μg/25 μl과 코팅 버퍼(20 mM 소듐 포스페이트 pH 9.6) 25 μl를 첨가하여 섞고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. PBST(300 μl)로 3회 세척한 다음 블로킹 버퍼(3% BSA) 200 μl로 블로킹을 2시간 동안 실온에서 수행하였다. PBST(300 μl)로 3회 세척한 다음 HGFR(R&D Systems)를 웰 당 0.5 μg/1 ml를 첨가한 후 2시간 동안 실온에서 배양하였다. PBST(300 μl)로 3회 세척한 다음 항-인간 IgG-HRP를 1:1,000으로 희석하여 웰 당 100 μl씩 첨가한 다음 2시간 동안 실온에서 배양하였다. PBST(300 μl)로 3회 세척한 다음 TMB 용액을 100 μl씩 첨가한 후 발색을 진행하였다. 정지 용액(3 N H2SO4) 50 μl를 첨가하여 반응을 멈춘 다음 O.D 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실험결과, HGFR에 대한 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열을 갖는 펩타이드의 높은 결합 친화도를 확인하였다(도 6).
2-2. 골모세포를 이용한 웨스턴 블롯팅(PI3K 인산화)
2x105 세포/웰의 세포 밀도로 6웰 플레이트에 MC3T3-E1(마우스 골모세포주) 세포를 시딩하고 하룻밤 동안 배양한 세포를 무혈청 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 펩타이드를 50 μg/ml 농도로 15분 처리하였다(양성 대조군: HGF 50 ng/ml). 세포 용해 버퍼를 처리하여 용해물을 확보 후 단백질 정량하고 항-pPI3K 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 이용하여 Phospho-PI3K(P-PI3K)에 대한 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
HGFR에 대한 높은 결합 친화도를 나타낸 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 펩타이드 처리 시, HGFR 신호 자극에 의한 PI3K 인산화 증가를 확인할 수 있었다(도 7).
2-3. 수용체 결합 어세이(BMPR)
ELISA 용 플레이트에 펩타이드 50 μg/25 μl와 코팅 버퍼(20 mM 소듐 포스페이트 pH 9.6) 25 μl를 첨가하여 섞고 4℃ 하룻밤 동안 배양하였다. PBST(300 μl)로 3회 세척한 다음 블로킹 버퍼(3% BSA) 200 μl로 블로킹을 2시간 동안 실온에서 진행하였다. PBST(300 μl)로 3회 세척한 다음 BMPR-IB(R&D Systems)를 웰 당 0.5 μg/1 ml 첨가한 후 2시간 동안 실온에서 배양하였다. PBST(300 μl)씩 3회 세척한 다음 항-인간 IgG-HRP를 1:1,000으로 희석하여 웰 당 100 μl씩 첨가한 다음 2시간 동안 실온에서 배양하였다. PBST(300 μl)로 3회 세척한 다음 TMB 용액을 100 μl씩 첨가한 후 발색을 진행하였다. 정지 용액(3 N H2SO4) 50 μl를 첨가하여 반응을 멈춘 다음 O.D 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
실험결과, BMPR에 대한 서열목록 제2서열의 펩타이드의 높은 결합 친화도를 확인하였다(양성 대조군: BMP4)(도 8).
2-4. 골모세포를 이용한 웨스턴 블롯팅(Smad1/5/8 인산화)
2x105 세포/웰의 세포 밀도로 6웰 플레이트에 MC3T3-E1(마우스 골모세포주) 세포를 시딩하였다. 하룻밤 동안 배양한 세포를 무혈청 배지에서 24시간 동안 배양한 다음 펩타이드를 50 μg/ml 농도로 15분, 30분간 처리하였다(양성 대조군: BMP4 50 ng/ml). 세포 용해 버퍼를 처리하여 용해물을 확보 후 단백질 정량하고 항-p-smad1/5/8 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 이용하여 Phospho-smad1/5/8 (P-smad1/5/8)에 대한 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
BMPR에 대한 높은 결합 친화도를 나타낸 서열목록 제2서열의 펩타이드 처리 시, BMPR 신호 자극에 의한 Smad1/5/8 인산화 증가를 확인할 수 있었다(도 9).
2-5. ALP 염색
마우스 골모세포주 MC3T3-E1 세포를 4x104 세포/웰로 24웰 플레이트에 시딩한 후 하룻밤 동안 배양하였다. 50 μg/ml 아스코르브산 + 10 mM b-글리세로포스페이트를 포함한 배지로 교체 후 각 펩타이드를 10 μg/ml, 50 μg/ml 농도로 처리하고 14일 동안 배양하여 분화를 유도시켰다. 이 때 3일에 한번 씩 배지 교환 및 펩타이드 처리를 반복하였다(양성 대조군: BMP2 30 ng/ml). 배양 완료된 플레이트 웰을 PBS로 2회 세척 후 아세톤, 37% 포름알데히드, 시트르산 용액이 섞인 고정 버퍼로 30초간 세포 고정하였다. 백혈구 알칼라인 포스파타아제 염색 키트(SIGMA) 이용하여 아래의 염색을 진행하였다.
FBB-알칼라인 용액, 아질산 나트륨 용액을 1:1로 섞어 2분간 처리한 후 증류수와 나프톨 AS-BI 알칼라인 용액으로 이루어진 버퍼를 처리하여 37℃ 배양기에서 1시간 동안 발색시켰다.
실험결과, 전구-골아세포 MC3T3-E1에 서열목록 제1서열의 펩타이드를 농도별로 처리하였을 때 분화 촉진에 따른 ALP 발현 증가를 확인하였다(도 10a-10c).
2-6. 알리자린 레드 염색
4X104 세포/웰의 세포 밀도로 24웰 플레이트에 MC3T3-E1(마우스 골모세포주)를 시딩하였다. 하룻밤 동안 배양한 세포의 배지를 50 μg/ml 아스코르브산, 10 mM β-글리세로포스페이트를 포함한 α-MEM 배지로 교체 후 펩타이드를 농도 별(10, 50 μg/ml)로 처리하고 14일 동안 37℃ 배양기에서 배양하였다. 이 때, 3일에 한번 씩 배지 교환 및 펩타이드 처리를 반복하였다(양성 대조군: 30 ng/ml rhBMP2(Cell signaling)). 배양 완료 후 플레이트 웰을 PBS로 2회 세척 하고 70% EtOH 1시간 처리하여 고정하였다. 그 다음 40 mM 알리자린 레드 S(pH 4.2)(Sigma Aldrich)를 처리하여 10분간 염색하였다. 10% 세틸 피리디늄 클로라이드(10 mM 소듐 포스페이트에 녹임(pH 7.0))를 15분간 처리한 후 분광광도계(SpectraMax, Molecular Devices)를 이용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.
전구-골아세포 MC3T3-E1에 서열목록 제1서열의 펩타이드를 농도별로 처리하였을 때 분화 촉진에 따른 광물화(mineralization) 증가를 알리자린 레드 염색으로 확인하였다(도 11a-11c).
2-7. RT-PCR
1X105 세포/웰의 세포 밀도로 6웰 플레이트에 MC3T3-E1(마우스 골모세포주)를 시딩하였다. 하룻밤 동안 배양한 후 펩타이드를 농도 별(10, 50 μg/ml)로 처리하고 3일 동안 37℃ 배양기에서 배양하였다(양성 대조군: 100 ng/ml BMP2(Cell signaling)). 배양 완료된 세포를 회수한 후 RNA 추출 용액(Easy Blue, Intron)을 처리하여 RNA를 준비한 후 RT 프리믹스(Intron)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 각 표지 인자(OPG, ALP, BSP)에 대한 프라이머와 PCR 프리믹스(Intron)를 사용하여 PCR 진행하였다.
골 분화 표지인자 PCR에 이용된 타겟-특이적 프라이머 서열은 다음과 같다: OPG 정방향 프라이머 서열, 5’-CTGCCTGGGAAGAAGATCAG-3’ 및 OPG 역방향 프라이머, 5’-TTGTGAAGCTGTGCAGGAAC-3’(어닐링 온도, 60℃); ALP 정방향 프라이머 서열, 5’-CCAGCAGGTTTCTCTCTTGG-3’ 및 ALP 역방향 프라이머, 5’ -CTGGGAGRCRCATCCTGAGC-3’(어닐링 온도, 60℃); BSP 정방향 프라이머 서열, 5’-AAAGTGAAGGAAAGCGACGA-3’ 및 BSP 역방향 프라이머, 5’ -GTTCCTTCTGCACCTGCTTC-3’(어닐링 온도, 60℃).
1% 아가로오스 겔에 PCR 산물을 5 μl씩 로딩하여 전기영동한 후 Gel-Doc에서 밴드를 확인하였다.
마우스 골모세포주 MC3T3-E1에 서열목록 제1서열의 펩타이드를 처리하고 3일간 배양 한 결과, 골 분화 표지 인자인 OPG(osteoprotegerin), ALP(alkaline phosphatase), BSP(bone sialoprotein)의 발현이 양성 대조군 BMP2 100 ng/ml 처리군과 서열목록 제1서열의 펩타이드 처리군에서 모두 증가되는 것을 관찰할 수 있었다(도 12a-12c).
실시예 3: 발모 능력 평가
3-1. 세포 증식률 관찰(proliferation assay)
모발 주요 세포인 진피유두세포(Human Hair Follicle Dermal Papilla Cell), 모모세포(Human Hair Follicle Germinal Matrix Cell), 제정맥 내피세포(Human umbilical vein endothelial cell)에 대한 세포증식 효과를 관찰하기 위하여 각 세포를 96웰 플레이트에 3x103 세포/웰의 밀도로 시딩한 후 24시간 동안 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 혈청을 완전히 제외한 동일한 배양액으로 배지를 교환한 뒤 펩타이드를 농도별(1 μg/ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml) 처리하고 위와 동일 조건으로 72시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 제거하고 에탄올을 이용하여 세포를 고정한 다음 PBS(phosphate buffer saline)로 3회 세척하였다. 세척용액을 제거한 뒤 비색 SRB 용액을 처리하여 염색을 진행하였다. 1% 아세트산으로 충분히 세척한 뒤 현미경으로 세포를 관찰하여 생존 세포의 상태를 관찰하였으며, 자외선 590 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존 상태를 측정하였다.
모발진피유두세포(Human HFDPC), 모발 모모세포(Human HFGMC) 및 제정맥내피세포(HUVEC)에 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 펩타이드를 농도별로 처리 하고 72시간 배양하였을 때, 농도 의존적으로 세포 증식이 증가되었다(도 13a-13b, 도 14a-14b 및 도 15a-15b).
3-2. 세포 신호 전달 물질의 변화 관찰
모발 진피유두세포에서 세포 증식에 관여하는 주요 신호 전달 물질인 ERK 인산화 및 PI3K에 대한 발현 변화를 관찰하고자, 각 세포에 본 발명의 펩타이드를 30분, 60분간 처리한 후 이에 대한 특이적인 항체로 웨스턴 블롯팅을 수행하여 pERK, PI3K 변화를 관찰하였다. 항-pERK 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국) 및 항-pPI3K 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 이용하여 실험을 진행하였다.
1X105 세포/웰의 밀도로 6웰 플레이트에 인간 모발 진피유두세포를 시딩하고 하룻밤 동안 배양하여 세포를 안정화 후 농도별(1 μg/ml, 10 μg/ml), 시간별(30분, 60분)로 펩타이드를 처리하였다. 세포 용해 버퍼를 처리하여 용해물을 확보한 후 단백질을 정량하고 Phospho-ERK(pERK), PI3K. β-카테닌에 대한 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
모발진피유두세포에 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제3서열의 펩타이드를 30분, 60분 처리하고 세포증식관련 신호전달 물질의 변화를 관찰한 결과, 세포증식에 관여하는 ERK 인산화, PI3K 레벨과 모발형성에 관여하는 β-카테닌의 발현이 증가되었다(도 16).
3-3. 모발성장에 관여하는 단백질의 변화 관찰
모발 진피유두세포에서 모근성장에 관여하는 단백질인 IGF1, KGF, Wnt3a 에 대한 발현의 변화를 관찰하고자, 각 세포에 본 발명의 펩타이드를 24시간 처리한 후 이에 대한 특이적인 항체로 웨스턴 블롯팅을 수행하여 모발 성장 관련 단백질의 변화를 관찰하였다.
1X105 세포/웰의 밀도로 6웰 플레이트에 인간 모발 진피유두세포를 시딩한다. 하룻밤 동안 배양하여 세포를 안정화 후 펩타이드를 농도별(0.1-50 μg/ml)로 24시간 동안 처리하였다. 세포 용해 버퍼를 처리하여 용해물을 확보한 후 단백질을 정량하고 IGF-1, KGF, Wnt3a에 대한 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
항-IGF-1 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국), 항-KGF 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국) 및 항-Wnt3a 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 이용하여 실험을 진행하였다.
모발진피유두세포에 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제3서열의 펩타이드를 24시간동안 농도별로 처리한 결과, 모발성장에 관여하는 단백질인 IGF-1, KGF, Wnt3a의 발현이 증가되었다(도 17).
3-4. 탈모유발호르몬에 의한 관련 단백질의 변화 관찰
탈모를 유도하는 호르몬인 DHT(Dihydrotestosterone)에 대한 펩타이드 효능을 관찰하기 위하여 모발 진피유두세포에 DHT 5 μg/ml 및 본 발명의 펩타이드를 농도별로 처리한 후 탈모관련 단백질인 DKK-1의 발현 변화를 관찰하였다. 48시간 동안 DHT 와 펩타이드를 처리한 후 DKK-1에 대한 특이적인 항체로 웨스턴 블롯팅을 수행하여 DKK-1의 발현을 측정하였다.
1X105 세포/웰의 밀도로 6웰 플레이트에 인간 모발 진피유두세포를 시딩한다. 하룻밤 동안 배양하여 세포를 안정화 후 5 μg/ml DHT(Sigma Aldrich)와 함께 펩타이드를 농도별(1 μg/ml, 10 μg/ml)로 48시간 동안 처리하였다. 세포 용해 버퍼를 처리하여 용해물을 확보한 후 단백질을 정량하고 항-DKK-1 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 이용하여 DKK-1에 대한 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
모발진피유두세포에 탈모 유도 호르몬인 DHT 처리 시 탈모단백질인 DKK-1의 발현이 증가되었으며 DHT에 의해 증가된 DKK-1의 발현을 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제3서열의 펩타이드가 감소시키는 것을 확인하였다(도 18).
3-5. 케라틴 발현 변화 관찰
서열목록 제1서열 또는 서열목록 제3서열의 펩타이드가 각질세포의 분화 촉진 유도를 통해 모발 성장 촉진 효과를 나타내는지를 관찰하고자 세포 분화 표지 물질인 케라틴의 발현 변화를 측정하였다.
1X105 세포/웰의 밀도로 6웰 플레이트에 인간 각질세포주 HaCaT 세포를 시딩하고 하룻밤 동안 배양한 후 펩타이드를 농도별(0.1 μg/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml)로 처리하고 24시간 동안 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양 완료된 세포 회수 후 RNA 추출 용액(Easy Blue, Intron)을 처리하여 RNA를 준비한 후 RT 프리믹스(Intron)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 각 표지 인자(Ha3-II, 케라틴 14)에 대한 프라이머와 PCR 프리믹스(Intron)를 사용하여 RT-PCR을 수행하여 이들의 발현 변화를 측정하였다.
각질 세포 분화 표지인자 PCR에 이용된 타겟-특이적 프라이머 서열은 다음과 같다: Ha3-II 정방향 프라이머 서열, 5’-CAGAAGTATAGCAGTAAGACAG-3’ 및 Ha3-II 역방향 프라이머, 5’-CAAGAGGAAAGTTTATTAGGC-3’(어닐링 온도, 60℃); Keratin14 정방향 프라이머 서열, 5’-GGACGCCCACCTTTCATCTTC-3’ 및 Keratin14 역방향 프라이머, 5’-ATCTGGCGGTTGGTGGAGG-3’(어닐링 온도, 60℃).
1% 아가로오스 겔에 PCR 산물을 5 μl씩 로딩한 후 전기영동하고 Gel-Doc에서 밴드를 확인하였다.
각질 세포에 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제3서열의 펩타이드를 농도별로 처리 후 분화 표지 인자인 Ha3-II와 케라틴-14에 대한 mRNA 발현 정도를 확인한 결과, 두 펩타이드 모두 각질 세포 분화 촉진 효능을 나타내는 것을 확인하였다(도 19).
3-6. 쥐 수염 성장 속도 관찰
쥐 수염 부위의 모근을 분리한 다음 펩타이드를 50 μg/ml 농도로 처리하여 8일 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 5일과 8일째 모발의 길이를 관찰하여 펩타이드의 효능을 확인하였다.
펩타이드 처리에 의한 모발의 성장 변화를 관찰한 결과, 5일, 8일 처리 군에서 대조군에 비해 빠른 모발의 성장을 관찰되었다(도 20).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> CAREGEN Co,.LTD. <120> Peptides Having Activities for Anti-inflammation, Bone Formation and Stimulation Hair Growth and Uses Thereof <130> PN130724 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 1 <400> 1 Ala Cys Arg Ser Ala Ile Gly Arg Pro Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 2 <400> 2 Ala Cys Phe Thr Arg Thr Ser His Ala Cys 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 3 <400> 3 Ala Cys Asp Gly Arg Thr Gln Ala Leu Cys 1 5 10 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPG Forward Primer <400> 4 ctgcctggga agaagatcag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPG Reverse Primer <400> 5 ttgtgaagct gtgcaggaac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP Forward Primer <400> 6 ccagcaggtt tctctcttgg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP Reverse Primer <400> 7 ctgggagrcr catcctgagc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSP Forward Primer <400> 8 aaagtgaagg aaagcgacga 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSP Reverse Primer <400> 9 gttccttctg cacctgcttc 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ha3-II Forward Primer <400> 10 cagaagtata gcagtaagac ag 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ha3-II Reverse Primer <400> 11 caagaggaaa gtttattagg c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Keratin14 Forward Primer <400> 12 ggacgcccac ctttcatctt c 21 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Keratin14 Reverse Primer <400> 13 atctggcggt tggtggagg 19

Claims (16)

  1. 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진 항염증 활성을 갖는 펩타이드.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 염증 세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  4. 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진 골 분화 촉진 활성을 갖는 펩타이드.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 펩타이드는 PI3K, Smad1, Smad5 및 Smad8의 인산화를 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 펩타이드는 ALP(Alkaline phosphatase), OPG(osteoprotegerin) 및 BSP(bone sialoprotein)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  7. 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진 발모 촉진 활성을 갖는 펩타이드.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 펩타이드는 모낭세포 또는 제대정맥 내피세포의 증식을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 펩타이드는 ERK의 인산화를 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 펩타이드는 PI3K, β-카테닌, IGF-1, KGF 및 Wnt3a의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  11. 제 7 항에 있어서, 상기 펩타이드는 DKK-1의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  12. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물.
  13. 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골 질환의 개선 또는 치료용 약제학적 조성물로서 상기 골 질환은 골다공증, 소년기 골다공증, 골형성 부전증, 골연화증, 골 괴사증, 구루병, 골수염, 치조골 소실, 뼈의 파젯병(Paget’s disease), 고칼슘혈증, 원발성 부갑상선기능항진증, 전이성(metastatic) 골 질환, 골수종, 류마티스 관절염에서의 골 소실, 전이성 골 질환, 암에 의한 골 소실, 섬유성 골이형성증, 무형성 골 질환, 대사성 골 질환 또는 나이에 따른 골 질량의 소실인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물.
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