ES2794579T3

ES2794579T3 - Péptido que tiene actividades antiinflamatoria, osteogénica y de fomento de crecimiento del pelo, y uso del mismo

Info

Publication number: ES2794579T3
Application number: ES14892017T
Authority: ES
Inventors: Yong Ji Chung; Eun Mi Kim; Eung Ji Lee; Kyoung Mi Cho; A Reum Han
Original assignee: Caregen Co Ltd
Current assignee: Caregen Co Ltd
Priority date: 2014-05-13
Filing date: 2014-11-21
Publication date: 2020-11-18
Anticipated expiration: 2034-11-21
Also published as: JP2017515816A; JP6352446B2; CN106488928A; EP3144317B1; EP3360888B1; CN109970842B; JP2018154642A; JP2018158929A; EP3144317A4; CN106488928B; JP6640915B2; CN110092815A; EP3360887B1; US20170049847A1; EP3360887A1; KR20150130617A; CN109970842A; EP3144317A1; ES2819897T3; US10238710B2

Abstract

Un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 para uso en fomentar la actividad antiinflamatoria.

Description

DESCRIPCIÓN

Péptido que tiene actividades antiinflamatoria, osteogénica y de fomento de crecimiento del pelo, y uso del mismo

Campo técnico

La presente solicitud de patente reivindica prioridad sobre y el beneficio de la solicitud de patente coreana No. 10 2014-0057191 presentada en la Oficina Coreana de Propiedad Industrial el 13 de mayo de 2014.

La presente invención se refiere a un péptido que tiene actividades antiinflamatoria, osteogénica y de fomento de crecimiento del pelo, y a un uso del mismo.

Antecedentes técnicos

El factor de necrosis tumoral a (TNF-a) está producido por macrófagos activados en una respuesta inmunitaria del huésped para infección bacteriana y enfermedades tumorales, y varias otras células. Esta citoquina se ha conocido como un medio importante en la respuesta inflamatoria, y es una citoquina inflamatoria que desempeña un papel clave en enfermedades inflamatorias, tal como artritis reumatoide (AR), artritis psoriásica, enfermedad de Crohn, psoriasis, y espondilitis anquilosante (EA). Por ejemplo, TNF-a mantiene la inflamación sinovial y destruye continuamente huesos y cartílagos en artritis reumática. Por tanto, se requiere la inhibición de la actividad biológica específica de TNF-a, y así se han desarrollado varias preparaciones biológicas para inhibir TNF-a para el fin de prevenir la respuesta celular mediada por TNF-a y ajustar las actividades de citoquinas proinflamatorias y los procedimientos regulados por TNF-a.

Mientras tanto, el hueso es una de las partes importantes del cuerpo humano que soporta estructuralmente músculos u órganos y almacena calcio y otros minerales esenciales, en otras palabras, materiales, tales como fósforo y magnesio en el cuerpo. Por tanto, los huesos adultos después de la terminación del crecimiento mantienen el equilibrio del mismo hasta la muerte sin parar mientras los procedimientos de generación y absorción de eliminar huesos viejos y sustituirlos por huesos nuevos se repiten de forma muy dinámica y continua.

Se ha sabido que dos tipos de células están muy implicadas en la remodelación del hueso. Uno de los dos tipos de células corresponde a los osteoblastos, que generan huesos, y el otro corresponde a los osteoclastos, que destruyen huesos. Los osteoblastos generan un ligando del receptor activador del factor nuclear kB (RANKL) y un receptor señuelo del mismo, es decir, osteoprotegerina (OPG). Cuando RANKL se une a RANK, que es un receptor en una superficie de células progenitoras de osteoclastos, las células progenitoras de osteoclastos maduran a osteoclastos, lo que produce resorción del hueso. Sin embargo, la unión de OPG a RANKL bloquea la unión entre RANKL y RANK, suprimiendo de esta manera la formación de osteoclastos, lo que previene así la resorción ósea innecesaria (Theill LE. et al., Annu Rev Immunol., 20:795-823(2002); Wagner EF. et al., Curr Opin Genet Dev., 11:527-532(2001)). La resorción o destrucción de huesos viejos se hace mediante los osteoclastos generados en células sanguíneas (células madre hematopoyéticas), y los osteoclastos hacen agujeros en los huesos para liberar una pequeña cantidad de calcio en la sangre, y el calcio se usa para mantener las funciones corporales (William J. et al., Nature., 423:337342(2003)). Mientras tanto, los osteoblastos generados de las células óseas rellenan los agujeros con colágeno y cubren los agujeros con hidroxiapatita de calcio y fósforo, haciendo de esta manera huesos nuevos rígidos para reconstruir esqueletos (Stains JP. et al., Birth Defects Res C Embryo Today., 75(1):72-80(2005)). Lleva aproximadamente 100 días quebrantar huesos viejos y reconstruir huesos nuevos (Schwarz EM. et al., Curr Opin Orthop., 11:329-335(2000)). Mientras el 100% del contenido en calcio en el hueso se cambia en 1 año en un lactante, aproximadamente el 10-30% del esqueleto se reconstruye por la remodelación de hueso en un adulto cada año. Solo si la velocidad de destruir hueso y la velocidad de formación de hueso son iguales, la densidad ósea se puede mantener como antes. El desequilibrio en huesos importantes puede producir muchas enfermedades, y en particular, las enfermedades asociadas con daño óseo debido a osteoporosis y metástasis ósea de células cancerosas son representativas.

La osteoporosis es un trastorno en el que la masa ósea disminuye por varias causas y el riesgo de fractura ósea aumenta continuamente debido a la degeneración de la microestructura en el tejido óseo. La osteoporosis es una afección en la que los contenidos de minerales (por ejemplo, calcio) y sustratos de hueso se han reducido, y la osteoporosis se produce cuando la acción destructora de hueso se hace superior a la acción formadora de hueso debido al desequilibrio de remodelación ósea (Iqbal MM., South Med J., 93(1):2-18(2000)). Mientras que la estructura interna de huesos normales tiene una estructura compacta, tal como una malla, el hueso de osteoporosis muestra un espacio ampliado entre estructuras y una microarquitectura más delgada que se vuelve susceptible a fracturas esqueléticas por incluso un impacto ligero. Las enfermedades de osteoporosis se clasifican en osteoporosis posmenopáusica, en la que la pérdida de hueso (2-3% al año) aparece rápidamente tras el inicio de la menopausia y el riesgo de compresión medular y fractura ósea de muñeca está aumentado; osteoporosis senil, en la que se desarrolla lentamente (0,5-1% al año) en hombres y mujeres ancianos con edad superior a 70 años e induce la pérdida ósea gradual de los huesos de la cadena y columna vertebral; y osteoporosis secundaria, que se desarrolla por enfermedades (enfermedades endocrinas, enfermedades gastrointestinales, y tumores malignos), fármacos (hormonas corticosuprarrenales, quimioterapia anticáncer, hormonas tiroideas, anticonvulsivos, antiplaquetarios, metotrexato, ciclosporina y GnRH), alcohol, tabaquismo o accidente, independientemente de la edad (Rosen CJ., N Engl J Med., 353(6):595-603(2005); Davidson M. Clinicain Reviews., 12(4):75-82(2002)).

El cáncer de mama, cáncer de próstata o el mieloma múltiple habitualmente están acompañados con metástasis ósea (Kozlow W. et al., J Mammary Gland Biol Neoplasia., 10(2):169-180(2005)), y se sabe que la esperanza de vida de los pacientes que tienen tales cánceres es dependiente de la metástasis ósea. La razón por la que la mortalidad de pacientes que tienen cáncer de mama o próstata aumenta es que las células cancerosas selectivamente metastatizan a los huesos. La metástasis ósea observada en cáncer de mama es casi una metástasis osteolítica que lleva a la destrucción del hueso, y se ha sabido que la metástasis osteolítica está causada por la estimulación de osteoclastos más que la influencia directa de las células de cáncer de mama sobre los huesos (Boyde A. et al., Scan Electron Microsc., 4:1537-1554(1986)). Mientras, la metástasis ósea encontrada en cáncer de próstata es una metástasis osteoblástica. También es sabido que la metástasis osteoblástica está estrechamente asociada con osteólisis. Las células cancerosas que entran en los huesos proliferan en microambientes que rodean los huesos para estimular la actividad de osteoclastos u osteoblastos, determinando de esta manera si la posterior metástasis ósea es osteolítica u osteoblástica (Choong PF. et al., Clin Orthop Relat Res., 415S:S19-S31(2003)). La metástasis ósea de células cancerosas se produce en aproximadamente el 80% de las pacientes de cáncer de mama, y las células de cáncer de mama metastatizadas activan los osteoclastos (Bendre M., et al., Clin Orthop Relat Res., 415(Supl):S39-S45(2003); Palmqvist P. et al., J Immunol., 169(6):3353-3362(2002)). Los osteoclastos activados destruyen el equilibrio de los microentornos que rodean el hueso para producir osteólisis, produciendo fracturas patológicas frecuentes, y produciendo también enfermedades relacionadas con los huesos, tal como anemia leucoeritroblástica, deformidad ósea, hipercalcemia, dolor y síndromes de nervocompresión (Roodman GD., N Engl J Med., 350:1655-1664(2004)).

Según los materiales de pago de gastos médicos de seguros de salud analizado por el Instituto de Políticas de Seguros de Salud de la Corporación Coreana de Seguros de Salud Nacionales de 2001 a 2008, el número de pacientes de “enfermedades con pérdida de pelo” se estima en 103.000 personas en 2001, en 142.000 personas en 2005 y en 165.000 personas en 2008. Ha aumentado en el 60% en los últimos siete años. El número de pacientes en sus 20 a 40 se estima en 114.000 personas y representa el 69,5% de todos los pacientes. Además, el número de pacientes en sus 10 se estima en más de 22.000 personas. El número de pacientes masculinos se estima en 84.000 y en 80.000 pacientes femeninas, que es ligeramente más que el de masculinos. El número de pacientes de enfermedad de “pérdida de pelo” en 2008 con tratamiento de Seguro de Salud Coreano son alopecia areata (130.000 personas), alopecia cicatricial (20.000 personas), alopecia androgénica (9.000 personas) y otras pérdidas de pelo no cicatriciales (8.000 personas) en orden.

Fuera, según los datos en junio de 2003 de Estudios Internacionales de Cabello y Belleza, hay 250 millones de pacientes con pérdida de pelo, y la tasa de prevalencia de pacientes con pérdida de pelo entre las edades de veintecuarenta y cincuenta años de edad es el 30-65%. En China el número de pacientes con pérdida de pelo es de 300 millones de personas en 2008. El 30% de los hombres en sus 30 y el 50% de los hombres en sus 50 muestra signos de pérdida de pelo, y el número de pacientes con pérdida de pelo aumenta en el 10-15% cada año. En Japón, la tasa de prevalencia de pérdida de pelo es el 26,5% y el número de pacientes con pérdida de pelo se estima en 12,93 millones de personas.

Actualmente, las preparaciones para tratar la pérdida de pelo se clasifican en gran parte en medicinas farmacéuticas, productos de parafarmacia y cosméticos. El fármaco con receta accesible dado por los médicos es “Propecia”, que fue desarrollado y comercializado por Merck (EE UU), y su principio activo finasterida se ha aprobado como un fármaco para tratar la pérdida de pelo por la FDA de EE UU en diciembre de 1997. La finasterida inhibe la 5-a-reductasa que convierte la testosterona en dihidrotestosterona (DHT), mediante lo cual produce crecimiento de pelo grueso y largo. Aunque tiene un efecto para aliviar la pérdida de pelo a corto plazo, se han descrito efectos secundarios tales como impotencia, disfunción sexual, y aumento de las mamas masculinas. Se ha reconocido minoxidil en seguridad y eficacia como un fármaco disponible para comprar sin receta médica, y se ha aprobado en primer lugar como un fármaco untable para tratar pérdida de pelo por la FDA de EE UU en diciembre de 1997. Mejora la circulación sanguínea y abre canales de potasio para fomentar el crecimiento del pelo, pero tiene respuestas locales, tal como prurito, sarpullido, y pulso frecuente.

Los productos de parafarmacia para la prevención de la pérdida de pelo y crecimiento del pelo aprobados por la Agencia de Alimentos & Fármacos de Corea incluyen “Mobalryeok confidence” (CJ lion), “Hair Tonic” (Moracle), y “Moaenmoah” (LG Household & Health Care). Se han vendido como cosméticos, champús o productos usados en el cuero cabelludo y pelo para mantener o fomentar la salud de la piel y el pelo. El ciclo del pelo humano está en gran parte dividido en fases de crecimiento (anágena), cesación (catágena), y descanso (telógena). En la fase anágena, la actividad de las papilas pilosas es activa, lo que lleva a división celular activa, y por tanto el pelo crece rápidamente. La duración de los pelos en la fase anágena varía de 3 a 6 años, dependiendo del tipo de pelo. Los pelos en la fase anágena representan el 80-90% del pelo total. Cuando la pérdida de pelo está en progreso, una fase anágena más corta y catágena más larga llevan a la reducción de la proporción del pelo en la fase anágena en el pelo entero. En la fase catágena después de la fase anágena, la generación de pelos se vuelve más lenta, y, por tanto, la división celular y el crecimiento se paran finalmente. La fase catágena sigue durante 1-1,5 meses y ocupa el 1% de los pelos totales. En la fase telógena, que la última fase de crecimiento, los folículos pilosos, y papilas pilosas están completamente separados entre sí, y los folículos pilosos gradualmente se contraen, y las raíces del pelo son empujadas hacia arriba, y, por último, el pelo se cae. Esta fase dura aproximadamente 3-4 meses, y representa el 4-14% de los pelos totales. Cuando la actividad de las papilas pilosas es otra vez activa después de que finalice la fase telógena, se generan papilas pilosas para pelo nuevo, y el pelo en la fase telógena es empujado hacia arriba, y eliminado por completo del cuero cabelludo.

A lo largo de la especificación entera, se hace referencia a muchos artículos y documentos de patente y sus citas están representadas. La divulgación de los artículos y documentos de patente citados se incorporan enteramente mediante referencia en la presente especificación, y el nivel del campo técnico en el que está la presente invención, y los detalles de la presente invención se explican más claramente.

Descripción detallada de la invención

Problema técnico

Los presentes inventores se han esforzado para desarrollar excelentes péptidos que tienen una actividad biológicamente eficaz, y como resultado, los presentes inventores han establecido que un péptido compuesto de una secuencia de aminoácidos que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 muestra actividades antiinflamatoria y osteogénica, y un péptido compuesto de una secuencia de aminoácidos que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 tiene actividad que fomenta el crecimiento del pelo, y entonces han completado la presente invención.

Según esto, un aspecto de la presente invención es proporcionar un péptido que tiene una actividad antiinflamatoria. Otro aspecto de la presente invención es proporcionar un péptido que tiene una actividad que fomenta la diferenciación osteogénica.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar un péptido que tiene una actividad que fomenta el crecimiento del pelo.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar una composición antiinflamatoria.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar una composición para fomentar la diferenciación osteogénica. Otro aspecto de la presente invención es proporcionar una composición para prevenir la pérdida de pelo y fomentar el crecimiento de pelo.

Otros fines y ventajas de la presente divulgación serán más obvios con la siguiente descripción detallada de la invención, reivindicaciones, y dibujos.

Solución técnica

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un péptido que tiene una actividad antiinflamatoria, compuesto de una secuencia de aminoácidos que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un péptido que tiene una actividad que fomenta la diferenciación osteogénica, compuesto de una secuencia de aminoácidos que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un péptido que tiene una actividad que fomenta el crecimiento del pelo, compuesto de una secuencia de aminoácidos que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Los presentes inventores se han esforzado para desarrollar excelentes péptidos que tienen una actividad biológicamente eficaz, y como resultado, los presentes inventores han establecido que un péptido compuesto de una secuencia de aminoácidos que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 muestra actividades antiinflamatoria y osteogénica, y un péptido compuesto de una secuencia de aminoácidos que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 tiene actividad que fomenta el crecimiento del pelo.

El péptido de la presente invención incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Específicamente, el péptido de la presente invención está esencialmente compuesto de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Según una forma de realización, el péptido compuesto de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 de la presente invención inhibe la expresión de una citoquina inflamatoria y suprime la proliferación de células inflamatorias, exhibiendo como resultado una actividad antiinflamatoria.

Según otra forma de realización de la presente invención, el péptido compuesto de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 de la presente invención aumenta la fosforilación de PI3K, Smad1, Smad5, y Smad8, que están implicadas en osteogénesis, y aumenta la expresión de ALP, OPG, y BSP, fomentando como resultado la diferenciación osteogénica.

Según otra forma de realización de la presente invención, el péptido compuesto de una secuencia de SEQ ID NO: 1 de la presente invención fomenta la proliferación de células de folículos pilosos y células endoteliales de vena umbilical, aumenta la fosforilación de ERK, aumenta la expresión de PI3K, p-catenina, lGF-1, KGF, y Wnt3a, que son proteínas implicadas en el crecimiento del pelo, y reduce la expresión del gen de pérdida de pelo DKK-1, mostrando como resultado actividades de prevenir la pérdida de pelo y fomentar el crecimiento del pelo.

Como se usa en el presente documento, el término “péptido” se refiere a una molécula lineal en la que residuos de aminoácidos se unen entre sí a través de un enlace peptídico. Los péptidos de la presente invención se pueden preparar por un método de síntesis química conocido en la técnica, en especial, técnicas sintéticas en fase sólida (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) o técnicas sintéticas en fase líquida (Patente en EE UU No. 5.516.891).

Según una forma de realización de la presente invención, se puede unir un grupo protector, que se selecciona del grupo que consiste en un grupo acetilo, un grupo fluorenil metoxi carbonilo, un grupo formilo, un grupo palmitoilo, un grupo miristilo, un grupo estearilo, y polietilenglicol (PEG), al extremo C o N del péptido.

La modificación de aminoácidos anterior mejora significativamente la estabilidad del péptido de la presente invención. Como se usa en el presente documento, el término “estabilidad” se refiere a una estabilidad de almacenamiento (por ejemplo, estabilidad de almacenamiento a temperatura ambiente), así como estabilidad “in vivo". El grupo protector anterior protege los péptidos de la presente invención del ataque de enzimas de corte de proteínas in vivo.

Según otro aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona una composición antiinflamatoria que contiene, como un principio activo, el péptido anterior compuesto de una secuencia de aminoácidos que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Puesto que la composición de la presente invención contiene, como principio activo, el péptido anterior compuesto de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 los contenidos solapantes entre la composición y el péptido se omitirán para evitar excesiva complicación de la presente especificación.

Como se valida en los siguientes ejemplos, el péptido compuesto de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 de la presente invención es muy eficaz en la prevención o tratamiento de enfermedades antiinflamatorias al inhibir la expresión de una citoquina inflamatoria, suprimir la proliferación de células inflamatorias, y suprimir la respuesta inflamatoria.

Las enfermedades inflamatorias a las que la composición antiinflamatoria de la presente invención se puede aplicar incluyen, pero no están limitadas a: enfermedades inflamatorias agudas o crónicas, tales como enfermedades inflamatorias de la piel (por ejemplo, asma, eczema, psoriasis, alergias, artritis reumatoide, artritis psoriásica, dermatitis atópica, acné, rinitis atópica (fiebre del heno), dermatitis alérgica (eczema), sinusitis crónica, o dermatitis seborreica), enfermedades óseas, gastritis, gota, artritis gotosa, úlceras, bronquitis crónica, lesión pulmonar aguda, inflamación pulmonar, hipersensibilidad de las vías respiratorias, enfermedad intestinal inflamatoria (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa), espondilitis anquilosante, septicemia, choque séptico, vasculitis, y bursitis; enfermedades autoinmunitarias, tales como lupus, polimialgia reumática, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, arteritis temporal, crioglobulinemia, y esclerosis múltiple; rechazo a trasplantes; cánceres incluyendo tumores sólidos (por ejemplo, pulmón, SNC, intestino, riñón y páncreas); enfermedad de Alzheimer; ateroesclerosis; infecciones víricas (por ejemplo, VIH o gripe); infecciones víricas crónicas (por ejemplo, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus, virus del herpes simple); o ataxia telangiectasia.

Según una forma de realización de la presente invención, la composición antiinflamatoria de la presente invención se puede preparar como una composición farmacéutica o una composición cosmética.

La composición de la presente invención se puede usar como una composición farmacéutica que contiene: (a) una cantidad farmacéuticamente eficaz del péptido anterior de la presente invención; y (b) una sal farmacéuticamente aceptable.

Como se usa en el presente documento, el término “cantidad farmacéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad suficiente para lograr eficacia o actividad del péptido anterior.

El soporte farmacéuticamente aceptable contenido en la composición farmacéutica de la presente invención se usa convencionalmente para la formulación, y ejemplos del mismo pueden incluir, pero no están limitados a, lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, goma arábiga, fosfato de calcio, alginato, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, jarabe, metilcelulosa, hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, talco, estearato de magnesio, y aceite de vaselina. La composición farmacéutica de la presente invención puede contener además un lubricante, un agente humectante, un agente edulcorante, un agente saborizante, un emulsionante, un agente de suspensión, un conservante y similares, además de los ingredientes anteriores. Se describen en detalle los soportes farmacéuticamente aceptables adecuados y preparaciones en Remington's Pharmaceutical Sciences (19a ed., 1995).

La composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar por vía oral o parenteral, y los ejemplos de la administración parenteral pueden incluir inyecciones intravenosas, subcutáneas, intramusculares, intraperitoneales, locales y transdérmicas.

La dosis apropiada de la composición farmacéutica de la presente invención varía dependiendo de factores tales como el método de formulación, manera de administración, edad del paciente, peso corporal, sexo, morbilidad, y alimento, tiempo de administración, ruta de administración, velocidad de excreción y sensibilidad de respuesta. Un experto en la materia puede fácilmente determinar y prescribir la dosis que es eficaz para el tratamiento o prevención deseados. Según una forma de realización preferible de la presente invención, la dosis diaria de la composición farmacéutica de la presente invención es 0,0001-200 |jg.

Además, la composición farmacéutica de la presente invención se formula en una forma farmacéutica unitaria o en un envase multidosis, usando un soporte y/o excipiente farmacéuticamente aceptable según el método que realiza fácilmente una persona que tiene experiencia en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aquí, la forma farmacéutica puede ser una solución en un medio oleaginoso o acuoso, una suspensión, una emulsión, un extracto, un polvo, gránulos, un comprimido, una cápsula, o un gel (por ejemplo, un hidrogel), y puede incluir además un dispersante o un estabilizante.

La composición de la presente invención se puede usar como una composición cosmética que contiene: (a) una cantidad cosméticamente eficaz del péptido anterior; y (b) un soporte cosméticamente aceptable.

Como se usa en el presente documento, el término “cantidad cosméticamente eficaz” se refiere a una cantidad que es suficiente para lograr la eficacia de la composición de la presente invención descrita anteriormente.

La composición cosmética de la presente invención se puede formular en cualquier forma posológica que se prepara convencionalmente, y los ejemplos de la misma pueden incluir una solución, una suspensión, una emulsión, una pasta, un gel, una crema, una loción, un polvo, un jabón, un limpiador que contiene tensioactivo, un aceite, una base de maquillaje en polvo, una base de maquillaje en emulsión, una base de maquillaje en cera, y un espray, pero no está limitada a las mismas. Más específicamente, la composición cosmética de la presente invención se puede preparar en una forma posológica de una loción emoliente, emulsión nutricional, crema nutricional, crema de masaje, esencia, crema para ojos, crema limpiadora, espuma limpiadora, agua limpiadora, mascarilla facial, espray o polvo.

En casos donde la forma posológica de la presente invención es una pasta, una crema o un gel, el componente soporte de la misma puede incluir fibras animales, fibras vegetales, cera, parafina, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicol, silicona, bentonita, sílice, talco, u óxido de cinc.

En casos donde la forma posológica de la presente invención es un polvo o un espray, el componente soporte de la misma puede incluir lactosa, talco, sílice, hidróxido de aluminio, silicato de calcio, o un polvo de poliamida. En casos donde la forma posológica de la presente invención es especialmente un espray, la forma posológica puede incluir además un propelente, tal como clorofluorohidrocarburo, propano/butano, o éter dimetílico.

En casos donde la forma posológica de la presente invención es una solución o una emulsión, el componente soporte de la misma puede incluir un solvente, un solubilizante, o un emulsionante, por ejemplo, agua, etanol, isopropanol, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, aceite 1,3-butilglicol, ésteres grasos de glicerol, polietilenglicol, o ésteres de ácidos grasos de sorbitano.

En casos donde la forma posológica de la presente invención es una suspensión, el componente soporte de la misma puede incluir diluyentes líquidos, tal como agua, etanol, y propilenglicol; agentes de suspensión, tal como, alcohol isoestearílico etoxilado, éster sorbitol de polioxietileno, y éster sorbitano de polioxietileno; celulosa microcristalina; hidróxido de aluminio metálico; bentonita; agar; o tragacanto.

En casos donde la forma posológica de la presente invención es un limpiador que contiene tensioactivo, el componente soporte de la misma puede incluir sulfato de alcohol alifático, éter sulfato de alcohol alifático, monoéster de sulfosuccinato, isotinato, derivados de imidazolio, taurato de metilo, sarcosinato, éter sulfato de amida de ácido graso, alquilamido betaína, alcohol alifático, glicérido de ácido graso, dietanolamida de ácido graso, aceite vegetal, derivados de lanolina, o éster de ácido graso de glicerol etoxilados.

Los componentes contenidos en la composición cosmética de la presente invención incluyen composiciones que se usan comúnmente en la composición cosmética, además de los péptidos, como ingredientes activos, y el componente soporte de la misma, y, por ejemplo, pueden incluir auxiliares comunes, tal como un antioxidante, un estabilizante, un solubilizante, vitaminas, un pigmento, y un sabor.

Según otro aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona una composición para fomentar la diferenciación osteogénica, que contiene, como un principio activo, el péptido anterior compuesto de una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Puesto que la composición de la presente invención contiene, como un principio activo, el péptido anterior compuesto de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 los contenidos solapantes entre la composición y el péptido se omitirán para evitar excesiva complicación de la presente especificación.

Como se valida en los siguientes ejemplos, el péptido compuesto de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 de la presente invención fomenta la diferenciación de líneas de osteoblastos. Por tanto, la composición de la presente invención puede fomentar eficazmente la diferenciación osteogénica.

Según una forma de realización de la presente invención, la composición de la presente invención aumenta la fosforilación de PI3K, Smad1, Smad5, y Smad8, que están implicadas en diferenciación osteogénica, y aumenta la expresión de los genes OPG, ALP, y b Sp , que son marcadores de diferenciación osteogénica.

Según otra forma de realización de la presente invención, la composición de la presente invención se puede usar en el alivio o tratamiento de enfermedades óseas.

Según una forma de realización de la presente invención, las enfermedades óseas, que se pueden aliviar o tratar por la composición de la presente invención, incluyen osteoporosis, osteoporosis infantil, osteogénesis imperfecta, osteomalacia, necrosis ósea, raquitismo, osteomielitis, pérdida ósea alveolar, enfermedad de Paget de los huesos, hipercalcemia, hiperparatiroidismo primario, enfermedades óseas metastásicas, mieloma, pérdida ósea en artritis reumatoide, pérdida ósea resultante de cánceres, displasia fibrosa, enfermedad ósea aplásica, enfermedades óseas metabólicas, o pérdida de masa ósea con la edad, pero no están limitadas a las mismas.

La composición para fomentar la diferenciación osteogénica de la presente invención se puede preparar como una composición farmacéutica.

Según otro aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona una composición para prevenir la pérdida de pelo o fomentar el crecimiento del pelo, la composición contiene, como un ingrediente activo, el péptido anterior compuesto de una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Como se valida en los siguientes ejemplos, el péptido compuesto de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 de la presente invención fomenta la proliferación de células del folículo piloso o células endoteliales de vena umbilical, aumenta la fosforilación de ERK, aumenta la expresión de PI3K, p-catenina, IGF-1, KGF y Wnt3a, que con proteínas implicadas en el crecimiento del pelo, y reduce la expresión del gen de pérdida de pelo DKK-1, mostrando como resultado actividades de prevenir la pérdida de pelo y fomentar el crecimiento del pelo.

La composición para prevenir la pérdida de pelo o fomentar el crecimiento del pelo de la presente invención se puede preparar como una composición farmacéutica o una composición cosmética.

Según otro aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona un método para aliviar o tratar leucodermia, el método comprende administrar a un sujeto la composición que contiene, como un principio activo, el péptido compuesto de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Según otro aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona un método para aliviar o tratar obesidad, el método comprende administrar a un sujeto la composición que contiene, como un principio activo, el péptido compuesto de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Puesto que el método para aliviar o tratar leucodermia y el método para prevenir o tratar obesidad de la presente invención emplean la composición anterior, los contenidos solapantes entre ellos se omitirán para evitar excesiva complicación de la presente especificación.

Efecto ventajoso

Las características y ventajas de la presente invención se resumen como sigue:

(i) La presente invención proporciona un péptido que tiene una actividad antiinflamatoria y una actividad de fomento de la diferenciación osteogénica, compuesto de una secuencia de aminoácidos que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

(ii) La presente invención proporciona un péptido que tiene una actividad de fomento del crecimiento del pelo, compuesto de una secuencia de aminoácidos que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. (iii) El péptido compuesto de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 de la presente invención inhibe la expresión de una citoquina inflamatoria y suprime la proliferación de células inflamatorias, mostrando como resultado de esta manera una actividad antiinflamatoria, y aumenta la fosforilación de PI3K, Smad1, Smad5, y Smad8, que están implicadas en osteogénesis, y aumenta la expresión de ALP, OPG, y BSP, fomentando como resultado de esta manera la diferenciación osteogénica.

(iv) El péptido compuesto de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 de la presente invención fomenta la proliferación de células del folículo piloso o células endoteliales de vena umbilical, aumenta la fosforilación de ERK, aumenta la expresión de PI3K, p-catenina, IGF-1, KGF y Wnt3a, que son proteínas implicadas en el crecimiento del pelo, y reduce la expresión del gen de pérdida del pelo d KK-1, mostrando como resultado de esta manera efectos de prevención de pérdida del pelo y fomento de crecimiento del pelo.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1a a 1c muestran los resultados obtenidos al medir la afinidad de unión al receptor de TNF de los péptidos de la presente invención.

Las figuras 2a a 2f muestran los resultados obtenidos al medir los cambios en la proliferación de macrófagos por los péptidos de la presente invención.

Las figuras 3a a 3c muestran los resultados obtenidos al medir los efectos de los péptidos de la presente invención en la translocación nuclear de NF-kB activado por tratamiento con TNF-a.

Las figuras 4a a 4c muestran los resultados obtenidos al medir los efectos de los péptidos de la presente invención en la expresión de IL-1p aumentada por tratamiento con TNF-a.

Las figuras 5a a 5c muestran los resultados obtenidos al medir los efectos de los péptidos de la presente invención en la expresión de IL-8 aumentada por tratamiento con TNF-a.

La figura 6 muestra los resultados obtenidos al medir los grados de unión al receptor de HGF de los péptidos de la presente invención.

La figura 7 muestra los resultados obtenidos al medir los efectos de los péptidos de la presente invención en la fosforilación de PI3K aumentada por estimulación de la señal del receptor de HGF.

La figura 8 muestra los resultados obtenidos al medir el grado de unión al receptor de BMP del péptido de la presente invención.

La figura 9 muestra los resultados obtenidos al medir los efectos del péptido de la presente invención en la fosforilación de Smad1/5/8 aumentada por estimulación de la señal del receptor de BMP.

Las figuras 10a a 10c muestran los resultados obtenidos al medir los cambios en la expresión de ALP de los péptidos de la presente invención.

Las figuras 11a a 11c muestran los resultados obtenidos al medir la mineralización por el fomento de la diferenciación osteogénica de los péptidos de la presente invención.

Las figuras 12a a 12c muestran los resultados obtenidos al medir los cambios en la expresión de marcadores de diferenciación osteogénica (OPG, ALP y BSP) por los péptidos de la presente invención.

Las figuras 13a y 13b muestran los resultados obtenidos al medir el cambio en la proliferación de células de papila dérmica de folículo piloso humano por los péptidos de la presente invención.

Las figuras 14a y 14b muestran los resultados obtenidos al medir el cambio en la proliferación de células de matriz germinal de folículo piloso humano por los péptidos de la presente invención.

Las figuras 15a y 15b muestran los resultados obtenidos al medir el cambio en la proliferación de células endoteliales de vena umbilical humana por los péptidos de la presente invención.

La figura 16 muestra los resultados obtenidos al medir los cambios en la fosforilación de ERK, expresión de PI3K, y expresión de p-catenina por los péptidos de la presente invención.

La figura 17 muestra los resultados obtenidos al medir los cambios en la expresión de IGF-1, KGF, y Wnt3a por los péptidos de la presente invención.

La figura 18 muestra los resultados obtenidos al medir los efectos de los péptidos de la presente invención en la expresión de DKK-1 aumentada por tratamiento con DHT.

La figura 19 muestra los resultados obtenidos al medir los cambios en la expresión de Ha3-II y queratina 14 por los péptidos de la presente invención.

La figura 20 muestra los resultados obtenidos al medir el cambio en el crecimiento de bigotes de ratón por los péptidos de la presente invención.

Modo de llevar a cabo la invención

De aquí en adelante, la presente invención se describirá en detalle con referencia a los ejemplos. Estos ejemplos son solo para ilustrar la presente invención más específicamente, y será aparente para los expertos en la materia que el ámbito de la presente invención no está limitado por estos ejemplos.

Ejemplos

Los péptidos 2 y 3 se citan en el ejemplo para fines de referencia, pero no son parte de la invención reivindicada.

Ejemplo sintético 1: Síntesis de péptido

A 700 mg de resina de cloruro de clorotritilo (resina CTL, Nova Biochem No. Cat 01-64-0021) introducida en un reactor se añadieron 10 ml de cloruro de metileno (MC), seguido por agitación durante 3 minutos. Después de eliminar la solución, se añadieron 10 ml de dimetilformamida (DMF), seguido por agitación durante 3 minutos y después el solvente se eliminó otra vez. Se pusieron 10 ml de una solución de diclorometano (DCM) en el reactor, y se añadieron 200 mmoles de Fmoc-Cys-OH (Bachem, Suiza) y 400 mmoles de diisopropiletilamina (DIEA), después de lo cual la mezcla se disolvió bien con agitación, y después la reacción se realizó con agitación durante 1 hora. Después de la reacción, el material resultante se lavó, y se disolvieron metanol y DIEA (2:1) en DCM, seguido por una reacción durante 10 minutos, y después el material resultante se lavó con una cantidad excesiva de DCM/DMF (1:1). Después de eliminar la solución, se añadieron 10 ml de DMF, seguido por agitación durante 3 minutos, y después el solvente se eliminó otra vez. Se pusieron 10 ml de una solución de desprotección (piperidina al 20%/DMF) en el reactor, seguido por agitación a temperatura ambiente durante 10 minutos, y después la solución se eliminó. Se añadió la cantidad igual de una solución de desprotección, y después la reacción se mantuvo otra vez durante 10 minutos, seguido por ^{la eliminación de la solución. El material resultante se lavó dos veces con DMF, una vez con MC, y una vez con} dMf, durante 3 minutos cada vez, preparando mediante ello Cys-resina CTL. Se pusieron 10 ml de una solución de DMF en un nuevo reactor, y se añadieron 200 mmoles de Fmoc-Pro (Bachem, Suiza), 200 mmoles de HoBt 200 mmol, y 200 mmoles de Bop, y la mezcla se disolvió bien mediante agitación. Se pusieron 400 mmoles de N,N-^{diisopropiletilamina} (DieA) ^{divisionalmente dos veces en el reactor, y después se llevó a cabo agitación durante al}menos 5 minutos hasta que todos los sólidos se disolvieron. La solución mezclada de aminoácidos disueltos se puso en el reactor que contenía la resina desprotegida, seguido por una reacción con agitación a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de eliminar el líquido de la reacción, la agitación se realizó usando una solución e DMF tres veces durante 5 minutos cada una, seguido por eliminación. Se tomó una pequeña cantidad de la resina reaccionada para comprobar el grado de reacción por la prueba de Kaiser (prueba de ninhidrina). Usando la solución de desprotección, la reacción de desprotección se realizó dos veces de la misma manera que se ha descrito anteriormente, para dar Pro-Cys-resina CTL. Después de suficiente lavado con DMF y MC, se realizó otra vez la prueba de Kaiser, y después se realizó la prueba de unión del siguiente aminoácido de la misma manera que se ha descrito anteriormente. Basado en la secuencia de aminoácidos seleccionada, la reacción en cadena se realizó en el orden de Fmoc-Arg(pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Ile, Fmoc-Ala, Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Arg(pbf), Fmoc-Cys(Trt) y Fmoc-Ala. El grupo protector Fmoc se eliminó haciendo reaccionar dos veces con la solución de desprotección durante 10 minutos cada una y después realizando lavado bien. Se añadieron anhídrido acético, DIEA, e hidroxibenzotriazol (HoBt) para realizar una acetilación durante 1 hora, y después la peptidil resina preparada se lavó tres veces secuencialmente con DMF, MC y metanol, se secó bajo el flujo de gas nitrógeno, y se secó por completo por secado al vacío bajo pentóxido de fósforo (P²O⁵). Se añadieron 30 ml de una solución saliente [ácido trifluoroacético (TFA) al 95%, agua destilada al 2,5%, y tioanisol al 2,5%], y la reacción se mantuvo durante 2 horas mientras que la mezcla se agitaba intermitentemente a temperatura ambiente. La resina se filtró, se lavó con una pequeña cantidad de una solución, y después se mezcló con solución madre. La destilación se realizó a presión reducida para reducir el volumen total en la mitad, y después se añadieron 50 ml de éter frío para inducir precipitación. Después de ello, los precipitados se recogieron por centrifugación, seguido por lavado dos veces con éter frío. Después de que se eliminara la solución madre, seguido por suficiente secado en una atmósfera de nitrógeno, sintetizándose de esta manera 0,79 g de péptido 1 sin purificar, NH²-Ala-Cys-Arg-Ser-Ala-Ile-Gly-Arg-Pro-Cys-COOH (rendimiento: 87,8%), 0,77 g de péptido 2 sin purificar, NH²-Ala-Cys-Phe-Thr-Arg-Thr-Ser-His-Ala-Cys-COOH (rendimiento: 85,5%), 0,76 g de péptido 3 sin purificar, NH²-Ala-Cys-Asp-Gly-Arg-Thr-Gln-Ala-Leu-Cys-COOH (rendimiento: 84,4%). El peso molecular de los péptidos 1,2 y 3 se determinó como 1033,3 Da (valor teórico: 1033,2 Da), 1096,0 Da (valor teórico: 1096,2 Da) y 1036,9 Da (valor teórico: 1037,1 Da) usando un sistema de análisis de peso molecular, respectivamente.

[Tabla 1]

n i m l l r l i in iz

Ejemplo 1: Evaluación de la actividad antiinflamatoria

1-1. Ensayo de unión a receptor (TNFR)

En una placa de ELISA, se añadieron y mezclaron 50 pg/25 pl de péptido y 25 pl de un tampón de recubrimiento (fosfato de sodio 20 mM, pH 9,6), y después se incubó a 4°C durante la noche. Después de lavar tres veces con PBST (300 pl), se llevó a cabo el bloqueo con 200 pl de un tampón de bloqueo (BSA al 3%) a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar tres veces con PBST (300 pl), se añadió TGFR de tipo II (R&D Systems) a 0,5 pg/1 ml por pocillo, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 2 horas, Después de lavar tres veces con PBST (300 pl), anti-IgG humana-HRP (Santa Cruz Biotechnology) se diluyó a 1:1.000, que después se añadió a 100 pl por pocillo. Seguido por incubación a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar tres veces con PBST (300 pl), se añadieron 100 pl de una solución de TMB (Sigma Aldrich), seguido por desarrollo de color. Se añadieron 50 pl de una solución de parada (H2SO43 N) para parar la reacción, y después se leyó la absorbancia a D.O. 450 nm.

Los resultados de la prueba verificaron la alta afinidad de unión de los péptidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 a TNFR (control positivo: TNF-a) (Fig. 1a-1c).

1-2. Ensayo de proliferación

Se sembraron células raw 264.7, la línea celular de macrófagos de ratón, en una placa de 48 pocillos a una densidad de 1x104 células/pocillo. Después de estabilización durante 24 horas, las células se incubaron en un medio sin suero durante 6 horas, y después se trataron simultáneamente con TNF-a 100 ng/ml y péptido 50 pg/ml, seguido por incubación durante 72 horas. Después de completar la incubación, el sobrenadante se eliminó y las células se inmovilizaron usando etanol, y después de que terminara la inmovilización celular, las células se lavaron tres veces con solución salina tamponada en fosfato (PBS). Después de eliminar la solución de lavado, las células se trataron con solución de SRB colorimétrica, y se lavaron suficientemente con ácido acético al 1%. A continuación, las células se observaron usando un microscopio para observar las condiciones de las células vivas. La absorbancia de la solución decolorada con tris 20 mM se leyó a luz UV de 560 nm, midiendo de esta manera las condiciones de supervivencia de las células.

Los resultados de la prueba verificaron que la proliferación de células RAW264.7 aumentada con el tratamiento con TNF-a se redujo por el tratamiento con el péptido de SEQ ID NO: 1 (Fig. 2a-2f).

1-3. Inmunotransferencia usando células de matriz germinal de folículo piloso humano

Se sembraron las células de matriz germinal de folículo piloso humano (queratinocitos), células HaCaT en una placa de 6 pocillos a 5x105 células/pocillo, seguido por incubación durante la noche, y después las células se trataron con el péptido a diferentes concentraciones, seguido por incubación durante 1 hora. Después de la lisis celular, se realizó inmunotransferencia con respecto a señales RANKL-RANK, p-ERK y p-c-Jun usando un anticuerpo anti-pERK (Santa Cruz Biotechnology, EE UU) y anticuerpo anti-p-c-Jun (Santa Cruz Biotechnology, EE UU).

Los resultados de la prueba verificaron que la translocación nuclear de NF-kB activada por tratamiento con TNF-a se redujo por el tratamiento con el péptido de SEQ ID NO: 1 (Fig. 3a-3c).

1-4. ELISA de IL-1P e IL-8

Se sembraron los monocitos humanos, células THP-1, en una placa de 24 pocillos a una densidad de 2x106 células/pocillo. Después de incubación durante la noche, las células se pretrataron con las muestras a 10 pg/ml durante 30 minutos, y se trataron con TNF-a 50 ng/ml, seguido por incubación durante 24 horas. El medio de incubación de células se obtuvo, seguido por centrifugación a 13.000 rpm durante 10 minutos a 4°C, y después el sobrenadante se separó. Se llevó a cabo ELISA usando el kit de ELISA de IL-1b e IL-8 (R&D Systems).

Los resultados de la prueba verificaron que la expresión de IL-1b e IL-8 aumentada por tratamiento con TNF-a se inhibió por el tratamiento con los péptidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 mediante ELISA (Fig. 4a-4c y 5a-5c).

Ejemplo 2: Evaluación de la capacidad osteogénica

2-1. Ensayo de unión a receptor (HGFR)

En una placa de ELISA, se añadieron y mezclaron 50 jg/25 j l de péptido y 25 j l de un tampón de recubrimiento (fosfato de sodio 20 mM, pH 9,6), y después se incubó a 4°C durante la noche. Después de lavar tres veces con PBST (300 jl), se llevó a cabo el bloqueo con 200 j l de un tampón de bloqueo (BSA al 3%) a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar tres veces con PBST (300 jl), se añadió HGFR (R&D Systems) a 0,5 jg/1 ml por pocillo, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar tres veces con PBST (300 jl), anti-IgG humana-HRP se diluyó a 1:1.000, que después se añadió a 100 j l por pocillo, seguido por incubación a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar tres veces con PBST (300 jl), se añadieron 100 j l de una solución de TMB, seguido por desarrollo de color. Se añadieron 50 j l de una solución de parada (H²SO⁴3 N) para parar la reacción, y después se leyó la absorbancia a D.O. 450 nm.

Los resultados de la prueba verificaron la alta afinidad de unión de los péptidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3 a HGFR (Fig. 6).

2-2. Inmunotransferencia usando osteoblastos (fosforilación de PI3K)

Se sembraron células MC3T3-E1 (línea de osteoblastos de ratón) en una placa de 6 pocillos a una densidad celular de 2x10⁵células/pocillo, y después las células incubadas durante la noche se incubaron en un medio sin suero durante 24 horas. Las células se trataron con los péptidos a 50 jg/m l durante 15 minutos (control positivo: HGF 50 ng/ml). Las células se trataron con el tampón de lisis celular para obtener un lisado, seguido por cuantificación de proteína, y se después se realizó la inmunotransferencia con respecto a fosfo-PI3K (P-PI3K) usando anticuerpo anti-pPI3K (Santa Cruz Biotechnology, EE UU).

Se pudo verificar que el tratamiento con los péptidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, que muestran alta afinidad de unión a HGFR, aumentaron la fosforilación de PI3K por estimulación de la señal de HGFR (Fig. 7).

2-3. Ensayo de unión a receptor (BMPR)

En una placa de ELISA, se añadieron y mezclaron 50 jg/25 j l de péptido y 25 j l de un tampón de recubrimiento (fosfato de sodio 20 mM, pH 9,6), y después se incubó a 4°C durante la noche. Después de lavar tres veces con PBST (300 jl), se llevó a cabo el bloqueo con 200 j l de un tampón de bloqueo (BSA al 3%) a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar tres veces con PBST (300 jl), se añadió BMPR-IB (R&D Systems) a 0,5 jg/1 ml por pocillo, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar tres veces con PBST (300 jl), anti-IgG humana-HRP se diluyó a 1:1.000, que después se añadió a 100 j l por pocillo, seguido por incubación a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar tres veces con PBST (300 jl), se añadieron 100 j l de una solución de TMB, seguido por desarrollo de color. Se añadieron 50 j l de una solución de parada (H²SO⁴3 N) para parar la reacción, y después se leyó la absorbancia a D.O. 450 nm.

Los resultados de la prueba verificaron la alta afinidad de unión del péptido de SEQ ID NO: 2 a BMPR (Fig. 8).

2-4. Inmunotransferencia usando osteoblastos (fosforilación de Smad1/5/8)

Se sembraron células MC3T3-E1 (línea de osteoblastos de ratón) en una placa de 6 pocillos a una densidad celular de 2x10⁵células/pocillo. Las células incubadas durante la noche se incubaron en un medio sin suero durante 24 horas, y después se trataron con el péptido a 50 jg/m l durante 15 minutos y 30 minutos (control positivo: BMP4 50 ng/ml). Las células se trataron con el tampón de lisis celular para obtener un lisado, seguido por cuantificación de proteína, y se después se realizó la inmunotransferencia con respecto a fosfo-smad1/5/8 (P-smad1/5/8) usando anticuerpo antip-smad1/5/8 (Santa Cruz Biotechnology, EE UU).

Se pudo verificar que el tratamiento con el péptido de SEQ ID NO: 2, que muestran alta afinidad de unión a BMPR, aumentó la fosforilación de Smad1/5/8 por estimulación de la señal de BMPR (Fig. 9).

2-5. Tinción de ALP

Se sembraron células MC3T3-E1, la línea de osteoblastos de ratón, en una placa de 24 pocillos a 4x10⁴células/pocillo, y después se incubaron durante la noche. Después del intercambio con un medio que contenía ácido ascórbico 50 jg/m l b-glicerofosfato 10 mM, las células se trataron con cada péptido a concentraciones de 10 jg/m l y 50 jg/ml, y se incubaron durante 14 días para inducir diferenciación. Aquí, el intercambio de medio cada tres días y el tratamiento con el péptido se repitieron (control positivo: BMP230 ng/ml). El pocillo de la placa con incubación completada se lavó dos veces con PBS, y después las células se inmovilizaron con un tampón de inmovilización, en el que se mezclaron acetona, formaldehído al 37% y solución de ácido cítrico, durante 30 segundos. Se llevó a cabo la siguiente tinción usando el kit de tinción de fosfatasa alcalina de leucocitos (SIGMA).

Las células se trataron con una mezcla, en la que una solución alcalina FBB se mezcló con una solución de nitrito de sodio a 1:1, durante 2 minutos, y después se trataron con un tampón compuesto de agua destilada y solución alcalina AS-BI de naftol, seguido por desarrollo de color en un incubador a 37°C durante 1 hora.

Los resultados de la prueba verificaron que el tratamiento de preosteoblastos MC3T3-E1 con el péptido de SEQ ID NO: 1 a diferentes concentraciones aumentó la expresión de ALP mediante el fomento de la diferenciación (Fig. 10a-10c).

2-6. Tinción con rojo alizarina

Se sembraron células MC3T3-E1 (línea de osteoblastos de ratón) en una placa de 24 pocillos a una densidad celular de 4x104 células/pocillo. El medio de las células incubadas durante la noche se intercambió con medio a-MEM que contenía ácido ascórbico 50 pg/ml y p-glicerofosfato 10 mM, y después las células se trataron con los péptidos a diferentes concentraciones (10 pg/ml y 50 pg/ml), seguido por incubación en un incubador a 37°C durante 14 días. Aquí, el intercambio de medio cada tres días y el tratamiento con el péptido se repitieron (control positivo: rhBMP2 (Cell signalling) 30 ng/ml). Después de completar la incubación, el pocillo de la placa se lavó dos veces con PBS, y las células se inmovilizaron por el tratamiento con EtOH al 70% durante 1 hora. A continuación, se tiñeron con alizarina rojo S (pH 4,2, Sigma Aldrich) 40 mM durante 10 minutos. Las células se trataron con cloruro de cetilpiridinio al 10% (disuelto en fosfato de sodio 10 mM (pH 7,0)) durante 15 minutos, y después la absorbancia se leyó a 560 nm usando un espectrofotómetro (SpectraMax, Molecular Devices).

Se verificó mediante la tinción con rojo alizarina que el tratamiento de preosteoblastos MC3T3-E1 con el péptido de SEQ ID NO: 1 a diferentes concentraciones aumentó la mineralización mediante el fomento de la diferenciación (Fig. 11a-11c).

2- 7. RT-PCR

Se sembraron células MC3T3-E1 (línea de osteoblastos de ratón) en una placa de 6 pocillos a una densidad celular de 1x105 células/pocillo. Las células incubadas durante la noche se trataron con los péptidos a diferentes concentraciones (10 pg/ml y 50 pg/ml), seguido por incubación en un incubador a 37°C durante tres días (control positivo: BMP2 (Cell signalling) 100 ng/ml). Después de recoger las células con incubación completada, las células se trataron con solución de extracción de ARN (Easy Blue, Intron) para preparar ARN, y después se sintetizó ADNc usando premezcla de RT (Intron). Se llevó a cabo PCR usando cebadores de marcadores respectivos (OPG, ALP, BSP) y premezcla de PCR (Intron).

Las secuencias de cebadores específicas de diana usadas en la PCR para marcadores de diferenciación osteogénica fueron como sigue: secuencia de cebador directo de OPG, 5'-CTGCCTGGGAAGAAGATCAG-3' y cebador inverso de OPG, 5'-TTGTGAAGCTGTGCAGGAAC-3' (temperatura de hibridación, 60°C); secuencia de cebador directo de ALP, 5'-CCAGCAGGTTTCTCTCTTGG-3' y cebador inverso ALP, 5'-CTGGGAGRCRCATCCTGAGC-3' (temperatura de hibridación, 60°C); secuencia de cebador directo de BSP, 5'-AAAGTGAAGGAAAGCGACGA-3' y cebador inverso de BSP, 5'-GTTCCTTCTGCACCTGCTTC-3' (temperatura de hibridación, 60°C).

Se cargaron 5 pl de producto de PCR en un gel de agarosa al 1%, seguido por electroforesis, y después las bandas se investigaron usando Gel-Doc.

La línea de osteoblastos de ratón células MC3T3-E1 se trataron con el péptido de SEQ ID NO: 1, y después se incubaron durante tres días. Como resultado, se pudo observar que la expresión para marcadores de diferenciación osteogénica, osteoprotegerina (OPG), fosfatasa alcalina (AP), y sialoproteína ósea (BSP) aumentó en todo el grupo de control positivo, el grupo tratado con BMP2 100 ng/ml, y el grupo tratado con el péptido de SEQ ID NO: 1 (Fig. 12a-12c).

Ejemplo 3: Evaluación de la capacidad de crecimiento del pelo

3- 1. Observación de proliferación celular (ensayo de proliferación celular)

Con el fin de observar el efecto de proliferación celular en células de papila dérmica de folículo piloso humano, células de matriz germinal de folículo piloso humano, y células endoteliales de vena umbilical humana, que son las principales células pilosas, cada tipo de células se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 3x103 células/pocillo, seguido por incubación en condiciones de 37°C y CO2 al 5% durante 24 horas. Después de que el medio se intercambiara con el mismo medio de cultivo excluyendo suero por completo, las células se trataron con los péptidos a diferentes concentraciones (1 pg/ml, 10 pg/ml y 50 pg/ml), seguido por incubación en las mismas condiciones durante 72 horas. Después de eliminar el sobrenadante de incubación, las células se inmovilizaron usando etanol, y se lavaron tres veces con solución salina tamponada en fosfato (PBS). La solución de lavado se eliminó, y las células se tiñeron mediante el tratamiento con solución de SRB colorimétrica. Después de las células se lavaron suficientemente con ácido acético al 1%, las células se observaron usando un microscopio para observar el estado de las células vivas. La absorbancia se leyó a luz UV de 560 nm, midiendo de esta manera las condiciones de supervivencia de las células.

Cuando las células de papila dérmica de folículo piloso humano (HFDPC), células de matriz germinal de folículo piloso humano (HFGMC), y células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) se trataron con los péptidos de s Eq ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3 a diferentes concentraciones y después se incubaron durante 72 horas, la proliferación celular aumentó de una manera dependiente de la concentración (Fig. 13a-13b, Fig. 14a-14b y Fig. 15a-15b).

3-2. Observación de cambio en el material de señalización celular

Con el fin de observar cambios en la fosforilación de ERK y la expresión de PI3K, que son los principales materiales de señalización implicados en la proliferación celular en las células de papila dérmica de folículo piloso humano, las células se trataron con los péptidos de la presente invención durante 30 minutos y 60 minutos, y después se sometieron a inmunotransferencia usando anticuerpos específicos, observando de esta manera los cambios en pERK y PI3K. La prueba se llevó a cabo usando un anticuerpo anti-pERK (Santa Cruz Biotechnology, EE UU) y un anticuerpo antipPI3K (Santa Cruz Biotechnology, EE UU).

Las células de papila dérmica de folículo piloso humano se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de 1x105 células/pocillo, y después se estabilizaron por incubación durante la noche, y después las células se trataron con péptidos a diferentes concentraciones (1 pg/ml y 10 pg/ml) por tiempos (30 minutos y 60 minutos). Las células se trataron con el tampón de lisis celular para obtener un lisado, seguido por cuantificación de proteína, y después se realizó inmunotransferencia con respecto a fosfo-ERK (pERK), PI3K y p-catenina.

Las células de papila dérmica de folículo piloso humano se trataron con el péptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 durante 30 minutos y 60 minutos, y después se observaron los cambios en los materiales de señalización relacionados con proliferación celular. Como resultado, la fosforilación de ERK y el nivel de PI3K, que están implicados en proliferación celular, y la expresión de p-catenina, que está implicada en la formación de pelo, aumentaron (Fig. 16).

3-3. Observación de cambios en proteínas implicadas en el crecimiento del pelo

Con el fin de observar los cambios en la expresión de IGF-1, KGF y Wnt3a, que son proteínas implicadas en el desarrollo de raíces de pelo en las células de papila dérmica de folículo piloso humano, las células se trataron con los péptidos de la presente invención durante 24 horas, y después se sometieron a inmunotransferencia usando anticuerpos específicos, observando de esta manera los cambios en proteínas relacionadas con el crecimiento del pelo.

Las células de papila dérmica de folículo piloso humano se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de 1x105 células/pocillo. Las células se estabilizaron por incubación durante la noche, y después se trataron con los péptidos a diferentes concentraciones (0,1-50 pg/ml) durante 24 horas. Las células se trataron con el tampón de lisis celular para obtener un lisado, seguido por cuantificación de proteína, y después se realizó inmunotransferencia con respecto a IGF-1, KGF y Wnt3a.

La prueba se llevó a cabo usando un anticuerpo anti-IGF-1 (Santa Cruz Biotechnology, EE UU), anticuerpo anti-KGF (Santa Cruz Biotechnology, EE UU), y anticuerpo anti-Wnt3a (Santa Cruz Biotechnology, EE UU).

Las células de papila dérmica de folículo piloso humano se trataron con el péptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 a diferentes concentraciones durante 24 horas. Como resultado la expresión de IGF-1, KGF y Wnt3a, que son proteínas implicadas en el crecimiento del pelo, aumentó (Fig. 17).

3-4. Observación de cambios en proteínas relacionadas por hormona que produce la pérdida de pelo

Con el fin de observar los efectos de los péptidos en dihidrotestosterona (DHT), que es la hormona que causa la pérdida de pelo, las células de la papila dérmica del folículo piloso se trataron con DHT 5 pg/ml y los péptidos de la presente invención a diferentes concentraciones, y después se observó el cambio de expresión de DKK-1, que es una proteína relacionada con la pérdida de pelo. Las células se trataron con DHT y los péptidos durante 48 horas, y después se sometieron a inmunotransferencia con respecto a DKK-1 usando anticuerpos específicos, observando de esta manera la expresión de DKK-1.

Las células de papila dérmica de folículo piloso humano se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de 1x105 células/pocillo. Las células se estabilizaron por incubación durante la noche, y después las células se trataron con DHT (Sigma Aldrich) 5 pg/ml junto con los péptidos a diferentes concentraciones (1 pg/ml y 10 pg/ml) durante 48 horas. Las células se trataron con el tampón de lisis celular para obtener un lisado, seguido por cuantificación de proteína, y después se realizó inmunotransferencia con respecto a DKK-1 usando un anticuerpo anti-DKK-1 (Santa Cruz Biotechnology, EE UU).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 para uso en fomentar la actividad antiinflamatoria.

2. El péptido para uso según la reivindicación 1, en donde el péptido inhibe la expresión de una citoquina inflamatoria.

3. El péptido para uso según la reivindicación 1, en donde el péptido suprime la proliferación de células inflamatorias.

4. Un péptido de secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 para uso terapéutico en fomentar la actividad de diferenciación osteogénica.

5. El péptido para uso según la reivindicación 4, en donde el péptido aumenta la fosforilación de PI3K, Smad1, Smad5 y Smad8.

6. El péptido para uso según la reivindicación 4, en donde el péptido aumenta la expresión de fosfatasa alcalina (ALP), osteoprotegerina (OPG) y sialoproteína ósea (BSP).

7. Uso de un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 para fomentar la actividad de crecimiento del pelo.

8. Uso del péptido según la reivindicación 7, en donde el péptido fomenta la proliferación de células del folículo piloso o células endoteliales de vena umbilical.

9. Uso del péptido según la reivindicación 7, en donde el péptido aumenta la fosforilación de ERK.

10. Uso del péptido según la reivindicación 7, en donde el péptido aumenta la expresión de PI3K, p-catenina, IGF-1, KGF y Wnt3a.

11. Uso del péptido según la reivindicación 7, en donde el péptido reduce la expresión de DKK-1.

12. El péptido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 para uso en prevenir o tratar enfermedades óseas.

13. El péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 para uso en prevenir la pérdida de pelo o fomentar el crecimiento del pelo.