ES2797736T3 - Péptido que tiene fomento de diferenciación osteogénica y fomento de activación de fibroblastos de ligamento periodontal, y uso del mismo - Google Patents
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Abstract
Péptido compuesto por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad ósea seleccionada del grupo que consiste en osteoporosis, osteoporosis infantil, osteogénesis imperfecta, osteomalacia, osteonecrosis, raquitismo, osteomielitis, pérdida ósea alveolar, enfermedad ósea de Paget, hipercalcemia, hiperparatiroidismo primario, enfermedades óseas metastásicas, médula ósea, pérdida ósea en artritis reumatoide, enfermedad ósea metastásica, pérdida ósea relacionada con cáncer, displasia fibrosa, enfermedad ósea adinámica, enfermedad ósea metabólica y pérdida de masa ósea relacionada con la edad.
Description
DESCRIPCIÓN
Péptido que tiene fomento de diferenciación osteogénica y fomento de activación de fibroblastos de ligamento periodontal, y uso del mismo
Campo técnico
La presente invención se refiere a un péptido que tiene una capacidad de fomento de diferenciación osteogénica y una capacidad de fomento de actividad de fibroblastos de ligamento periodontal y a un uso del mismo.
Técnica anterior
Los huesos son un tejido común calcificado en los cuerpos y que sirve para soportar los cuerpos mediante un procedimiento de reformación. Las causas de enfermedades óseas pueden dividirse principalmente en tres: en primer lugar, un tamaño anómalo en el proceso de crecimiento; en segundo lugar, un desequilibrio entre la formación ósea por osteoblastos y la absorción ósea por osteoclastos en el proceso de remodelación ósea; y en tercer lugar, anomalía en la calcificación o mineralización ósea.
La superfamilia de factor de crecimiento transformante beta (TGF-P) está compuesta por 40 o más miembros, tales como nodal, activina y proteínas morfogenéticas óseas (BMP). En cuanto a la señalización de TGF-p, tipos particulares I y II de receptores serina/treonina cinasa forman complejos, que penetran en las membranas plasmáticas a través de una forma de complejo heteromérico para transmitir en primer lugar señales. Se sabe que TGF-p/BMP están implicados en diversas funciones en el organismo y la formación ósea del proceso de desarrollo de los mamíferos. La perturbación de la señalización de TGF-p/BMP afecta a múltiples enfermedades relacionadas con los huesos, tales como metástasis tumoral, focomelia y artritis.
Los huesos del cuerpo son un órgano muy dinámico de tal manera que los huesos se degradan gradualmente cada día y el relleno con huesos nuevos se produce en la cantidad de huesos degradados y, por tanto, se mantiene la homeostasis. Cuando se aumenta o disminuye la actividad de un tipo de células entre osteoclastos para degradar huesos y osteoblastos para regenerar huesos, pueden provocarse diversas enfermedades debido a la destrucción de la homeostasis. El aumento de la actividad de osteoclastos que absorben huesos provoca enfermedades, tales como osteoporosis, en las que se fomenta la degradación de huesos y los huesos son finos y se rompen fácilmente, y el aumento de la en actividad de los osteoblastos provoca deformidades óseas o calcificación ósea debido a un aumento de la densidad ósea. Por tanto, el equilibrio entre osteoclastos y osteoblastos es importante.
En cuanto a fármacos conocidos hasta ahora, Korea Bone Bank, que es una empresa farmacéutica de productos biosimilares, recibió recientemente la aprobación para ensayos clínicos de “Rafugen” como proteína morfogenética ósea de la administración de fármacos y alimentos de Corea y entró en los ensayos clínicos para el mismo. Adicionalmente, Daewoong lanzó “Novosis” como máquina médica de biofusión de concepto novedoso en la que se injerta proteína morfogenética ósea, “BMP2”, en huesos artificiales. Novosis se usará de diversas maneras en el tratamiento relacionado con injerto de hueso incluyendo implantación, en la que los huesos se adhieren mejor y se reduce el tiempo de intervención y el tiempo de hemorragia en comparación con autotrasplante, y por tanto se espera una recuperación rápida. Adicionalmente, Dong-Wha Pharm lanzó “DW1350”, como fármaco que tiene excelentes funciones de inhibición de osteoclastos y fomento de osteoblastos, pero tal fármaco se ha sometido continuamente a ensayos clínicos hasta ahora y no se ha lanzado en Corea.
El documento WO 2009/154330 A1 da a conocer un péptido sintético osteogénico que contiene péptido de formación ósea 2 (BFP2) para estimular la diferenciación de osteoblastos para tratar defectos de los huesos.
El documento WO 2007/049904 A1 da a conocer una composición para mejorar un estado de la piel y para tratar una enfermedad periodontal.
El documento WO 2009/139525 A1 da a conocer un péptido sintético que contiene péptido de formación ósea 1 (BFP-1) para estimular la diferenciación de osteoblastos en el tratamiento de osteoporosis, defectos de los huesos y/u osteoartritis.
El documento KR 2011 0107552 A se refiere a un péptido para tratar enfermedades óseas.
El documento KR 20120129127 A se refiere a una composición para prevenir o tratar la osteoporosis y enfermedad de defecto de los huesos.
El documento KR 2011 0107552 A da a conocer un péptido para su uso en la mejora de la caída del cabello y para el tratamiento de enfermedad ósea.
El documento KR 20100035240 A se refiere a nuevos péptidos relacionados con factor del crecimiento para su uso en la prevención o el tratamiento de estados asociados con BMP-4 tales como osteoporosis.
El documento EP 2383283 A2 se refiere a un péptido para su uso en la prevención y el tratamiento de enfermedades óseas.
Sin embargo, el uso de los péptidos dados a conocer en esta solicitud en el tratamiento y la prevención de enfermedades óseas o el tratamiento de enfermedades periodontales fomentando la diferenciación y actividad osteogénica no se da a conocer o ni siquiera se sugiere en la técnica anterior.
A lo largo de la totalidad de la memoria descriptiva se hace referencia a muchos artículos y documentos de patente y se representan sus citas. Se explican más claramente el nivel del campo técnico dentro del cual se encuentra la presente invención y los detalles de la presente invención.
Descripción detallada de la invención
Problema técnico
Los presentes inventores se esforzaron por desarrollar excelentes péptidos que tuvieran actividad biológica eficaz y, como resultado, los presentes inventores establecieron que un péptido compuesto por una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 tiene excelentes actividades biológicas, tales como fomentar el crecimiento y la diferenciación de osteoblastos y fomentar la actividad de fibroblastos de ligamento periodontal, y por tanto completaron la presente invención.
Por consiguiente, un aspecto de la presente invención es proporcionar un péptido que tenga una capacidad de fomento de diferenciación osteogénica y una capacidad de fomento de actividad de fibroblastos de ligamento periodontal. Otro aspecto de la presente invención es proporcionar una composición para prevenir o tratar enfermedades óseas. Todavía otro aspecto de la presente invención es proporcionar una composición para prevenir o tratar enfermedades periodontales.
Otros fines y ventajas de la presente invención resultarán más evidentes con la siguiente descripción detallada de la invención, reivindicaciones y dibujos.
Solución técnica
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un péptido que tiene una capacidad de fomento de diferenciación osteogénica, compuesto por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un péptido que tiene una actividad de fomento de fibroblastos de ligamento periodontal, compuesto por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.
Los presentes inventores se esforzaron por desarrollar excelentes péptidos que tuvieran una actividad biológica eficaz y, como resultado, los presentes inventores establecieron que un péptido compuesto por una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 tiene excelentes actividades biológicas, tales como fomentar el crecimiento y la diferenciación de osteoblastos y fomentar la actividad de fibroblastos de ligamento periodontal. Los péptidos de la presente invención incluyen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. Específicamente, los péptidos de la presente invención están esencialmente compuestos por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
Según una realización de la presente invención, el péptido de la presente invención fomenta la proliferación de osteoblastos, induce la fosforilación de Smad1, Smad5 y Smad8 para activar la señalización de BMP, y aumenta la expresión de fosfatasa alcalina (ALP), colágeno tipo I alfa 1 (COL1A1) y sialoproteína ósea (BSP), que se conocen como marcadores de formación ósea, fomentando en última instancia la diferenciación osteogénica.
Según otra realización de la presente invención, el péptido de la presente invención fomenta el crecimiento de fibroblastos de ligamento periodontal mediante la fosforilación de PI3K y Akt, aumenta la fosforilación de PI3K y Akt, y aumenta la expresión de marcadores activos, tales como colágeno tipo I alfa 1 (COL1A1) y sialofosfoproteína dentinaria (DSPP) para fomentar la actividad de fibroblastos de ligamento periodontal, mostrando en última instancia una actividad de regeneración periodontal.
Tal como se usa en el presente documento, el término “péptido” se refiere a una molécula lineal en la que residuos de aminoácido se unen entre sí mediante un enlace peptídico. El péptido de la presente invención puede prepararse mediante métodos de síntesis química conocidos en la técnica, especialmente, técnicas de síntesis en fase sólida
(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, etal., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111 (1984)) o técnicas de síntesis en fase líquida (patente estadounidense n.° 5.516.891).
Según una realización de la presente invención, un grupo protector, que se selecciona del grupo que consiste en un grupo acetilo, un grupo fluorenilmetoxicarbonilo, un grupo formilo, un grupo palmitoilo, un grupo miristilo, un grupo estearilo y polietilenglicol (PEG), puede unirse al extremo N o C-terminal del péptido.
La modificación de aminoácido anterior mejora significativamente la estabilidad de los péptidos de la presente invención. Tal como se usa en el presente documento, el término “estabilidad” se refiere a la estabilidad en almacenamiento (por ejemplo, estabilidad en almacenamiento a temperatura ambiente) así como a la estabilidad “in vivo". El grupo protector anterior protege a los péptidos de la presente invención frente al ataque de enzimas de escisión de proteínas in vivo.
Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición para prevenir o tratar enfermedades óseas, conteniendo la composición, como principio activo, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.
Dado que la composición de la presente invención contiene, como principio activo, el péptido anterior compuesto por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 de la presente invención, las descripciones de contenido solapante entre los mismos se omitirán para evitar una complejidad excesiva de la presente memoria descriptiva.
Tal como se valida en los siguientes ejemplos, el péptido compuesto por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 fomenta la proliferación y diferenciación de osteoblastos, y por tanto es muy eficaz en el tratamiento o la prevención de enfermedades óseas.
La composición para prevenir o tratar enfermedades óseas de la presente invención puede usarse para todas las enfermedades que se producen a partir de una reducción de la densidad ósea debido a una función osteoblástica no uniforme o a partir de una acción osteoclástica excesiva debido a inflamación de las articulaciones, y puede usarse, por ejemplo, para osteoporosis, osteoporosis infantil, osteogénesis imperfecta, osteomalacia, osteonecrosis, raquitismo, osteomielitis, pérdida ósea alveolar, enfermedad ósea de Paget, hipercalcemia, hiperparatiroidismo primario, enfermedades óseas metastásicas, médula ósea, pérdida ósea en artritis reumatoide, enfermedad ósea metastásica, pérdida ósea relacionada con cáncer, displasia fibrosa, enfermedad ósea adinámica, enfermedad ósea metabólica y pérdida de masa ósea relacionada con la edad.
Según una realización de la presente invención, la composición de la presente invención puede prepararse para dar una composición farmacéutica que contiene: (a) una cantidad farmacéuticamente eficaz del péptido anterior de la presente invención; y (b) un portador farmacéuticamente aceptable.
Tal como se usa en el presente documento, el término “cantidad farmacéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad suficiente para alcanzar eficacia o actividad del péptido anterior.
El portador farmacéuticamente aceptable se usa habitualmente en el momento de la formulación, y ejemplos del mismo pueden incluir, pero no se limitan a, lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, goma arábiga, fosfato de calcio, alginato, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, jarabe, metilcelulosa, hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, talco, estearato de magnesio y aceite mineral. La composición farmacéutica de la presente invención puede contener adicionalmente, además de los componentes anteriores, un lubricante, un agente humectante, un agente edulcorante, un agente aromatizante, un emulsionante, un agente de suspensión, un conservante y similares. Se describen en detalle agentes y portadores farmacéuticamente aceptables adecuados en Remington's Pharmaceutical Sciences (19a ed., 1995).
La composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por vía oral o parenteral, y ejemplos de la administración parenteral pueden incluir inyecciones intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, local y transdérmica.
Una dosis adecuada de la composición farmacéutica de la presente invención puede variar dependiendo de diversos factores, tales como el método para la formulación, el modo de administración, la edad, peso corporal, sexo y morbididad del paciente, la dieta, el momento de administración, la tasa de excreción y la sensibilidad a la respuesta. Mientras tanto, la dosis de la composición farmacéutica de la presente invención es de 0,0001-20,0 |ig al día.
La composición farmacéutica de la presente invención puede formularse para dar una forma de dosificación unitaria o un recipiente de múltiples dosis usando un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable según el método fácilmente llevado a cabo por un experto habitual en la técnica a la que se refiere la presente invención. En este caso, la forma de dosificación puede ser una disolución en un medio aceitoso o acuoso, una suspensión, una emulsión, un extracto, un polvo, gránulos, un comprimido, una cápsula o un gel (por ejemplo, un hidrogel), y puede incluir además un dispersante o estabilizante.
Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición para prevenir o tratar enfermedades periodontales, conteniendo la composición, como principio activo, el péptido anterior que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.
Dado que la composición de la presente invención contiene el péptido anterior de la presente invención como principio activo, las descripciones de contenido solapante entre los mismos se omitirán para evitar una complejidad excesiva de la presente memoria descriptiva.
El objetivo final del tratamiento de enfermedad periodontal es regenerar tejidos destruidos en huesos periodontales, ligamento periodontal, cemento y similares. Los fibroblastos de ligamento periodontal humanos pueden diferenciarse y proliferar para dar fibroblastos de ligamento periodontal, osteoblastos, cementoblastos y, por tanto, desempeñan un papel fundamental en la regeneración de los tejidos periodontales, de modo que los fibroblastos de ligamento periodontal humanos son células representativas que van a usarse en la aplicación de ingeniería de tejido periodontal para la regeneración de tejido periodontal. Para la regeneración de tejido periodontal, es importante fomentar la proliferación de células de ligamento periodontal que tienen diversas capacidades de diferenciación, induciendo así la regeneración tisular.
Tal como se valida en los siguientes ejemplos, el péptido de la presente invención fomenta la proliferación y actividad de fibroblastos de ligamento periodontal, mostrando así efectos de potenciación de componentes de la matriz extracelular implicados en el mantenimiento y la regeneración de tejidos periodontales. Por tanto, la composición de la presente invención es muy eficaz en la prevención o el tratamiento de diversas enfermedades periodontales.
Las enfermedades periodontales son un tipo de numerosas enfermedades infecciosas bucales, y son causas principales de la caída de dientes que se produce en seres humanos de treinta años de edad o más. Tal como se usa en el presente documento, el término “enfermedad periodontal” incluye numerosas enfermedades que influyen sustancialmente en el periodonto (tejido periodontal). El tejido periodontal está compuesto por estructuras de cobertura y estructuras de soporte, e incluye hueso alveolar, ligamento periodontal, cemento y tejido gingival. Muchas otras enfermedades influyen en estructuras de soporte de dientes, mientras que la inflamación de resina inducida por hilo explica la mayoría de las enfermedades periodontales, y puede clasificarse en gingivitis o periodontitis.
En el presente documento, las enfermedades periodontales se seleccionan de periodontitis, gingivitis, pericoronitis, abscesos parodontales, periodontosis, otras enfermedades periodontales o una combinación de las mismas.
Tal como se usa en el presente documento, el término “gingivitis” se refiere a una inflamación en los tejidos gingivales, y una primera causa de enfermedades periodontales. Tal como se usa en el presente documento, el término “periodontitis” se refiere a inflamaciones que se producen a partir de hueso alveolar, ligamento periodontal y cemento así como una unidad gingival. Generalmente, la periodontitis se caracteriza por una pérdida de unión gingival crónica y pérdida ósea radial.
La presente invención puede proporcionarse en forma de una composición oral para la prevención y el tratamiento eficaces de enfermedades periodontales, y la forma de dosificación de la composición oral no está particularmente limitada, y puede tener una forma de dosificación habitual. Específicamente, la composición oral puede tener una forma de dosificación de un dentífrico, un colutorio o un producto refrescante para el aliento. La composición oral proporcionada en la presente invención puede contener diversos agentes de base y aditivos necesarios para la formulación dependiendo de la forma de dosificación de la misma, y las clases y cantidades de estos agentes de base y aditivos puede seleccionarlas fácilmente un experto en la técnica. Por ejemplo, cuando la forma de dosificación de la composición oral es un dentífrico, pueden añadirse un producto abrasivo, un agente humectante, un agente espumante, un aglutinante, un edulcorante, un agente de ajuste del pH, un conservante, principios medicinales, una fragancia, un blanqueador, un pigmento, un disolvente o similares.
La composición para prevenir o tratar enfermedades periodontales de la presente invención puede prepararse para dar una composición farmacéutica.
Efectos ventajosos
A continuación se resumen características y ventajas de la presente invención:
(i) El péptido compuesto por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 de la presente invención muestra los efectos de fomentar la proliferación y diferenciación de osteoblastos y fomentar la proliferación y actividad de fibroblastos de ligamento periodontal.
(ii) El péptido de la presente invención aumenta la señalización de BMP, tal como fosforilación de smad1/5/8, aumentando así el crecimiento de osteoblastos y la expresión de marcadores de diferenciación, tales como COL1A1, BSP y ALP, mostrando en última instancia actividad osteogénica.
(iii) El péptido de la presente invención fomenta el crecimiento de fibroblastos de ligamento periodontal mediante la fosforilación de PI3K y Akt y aumenta la expresión de marcadores de activación, tales como COL1A1 y DSPP, mostrando de ese modo en última instancia actividad de regeneración de tejido periodontal.
(iv) La presente invención proporciona una composición para prevenir o tratar enfermedades óseas que contiene el péptido anterior y una composición para prevenir o tratar enfermedades periodontales que contiene el péptido anterior.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1a es un gráfico que muestra un efecto de fomento del crecimiento de osteoblastos tratados con el péptido de SEQ ID NO: 1 preparado mediante un ejemplo de síntesis de la presente invención.
La figura 1b es un gráfico que muestra un efecto de fomento del crecimiento en osteoblastos tratados con el péptido de SEQ ID NO: 2 preparado mediante un ejemplo de síntesis de la presente invención.
La figura 2b ilustra resultados que verifican el nivel de expresión de fosfatasa alcalina (ALP) en el tratamiento con el péptido de SEQ ID NO: 1 preparado mediante el ejemplo de síntesis de la presente invención.
La figura 2b ilustra resultados que verifican el nivel de expresión de fosfatasa alcalina (ALP) en el tratamiento con el péptido de SEQ ID NO: 2 preparado mediante el ejemplo de síntesis de la presente invención.
La figura 3a ilustra resultados que verifican niveles de expresión de ARNm de marcadores de diferenciación osteogénica en el tratamiento con el péptido de SEQ ID NO: 1 preparado mediante el ejemplo de síntesis de la presente invención.
La figura 3b ilustra resultados que verifican niveles de expresión de ARNm de marcadores de diferenciación osteogénica en el tratamiento con el péptido de SEQ ID NO: 2 preparado mediante el ejemplo de síntesis de la presente invención.
La figura 4a ilustra resultados que verifican el nivel de fosforilación de Smad1/5/8 como señal relacionada con la diferenciación osteogénica en el tratamiento con el péptido de SEQ ID NO: 1 preparado mediante el ejemplo de síntesis de la presente invención.
La figura 4b ilustra resultados que verifican el nivel de fosforilación de Smad1/5/8 como señal relacionada con la diferenciación osteogénica en el tratamiento con el péptido de SEQ ID NO: 2 preparado mediante el ejemplo de síntesis de la presente invención.
La figura 5 ilustra resultados de tinción de H&E que verifican aspectos de osteocitos que penetran en esponjas de colágeno en el tratamiento con el péptido de SEQ ID NO: 1 preparado mediante el ejemplo de síntesis de la presente invención.
La figura 6a es un gráfico que muestra un efecto de fomento del crecimiento de fibroblastos de ligamento periodontal tratados con el péptido de SEQ ID NO: 1 preparado mediante un ejemplo de síntesis de la presente invención.
La figura 6b es un gráfico que muestra un efecto de fomento del crecimiento de fibroblastos de ligamento periodontal tratados con el péptido de SEQ ID NO: 2 preparado mediante un ejemplo de síntesis de la presente invención.
La figura 7a ilustra resultados que verifican los aumentos de niveles de fosforilación de PI3K y Akt, que son proteínas relacionadas con el fomento de crecimiento de fibroblastos de ligamento periodontal en el tratamiento con el péptido de SEQ ID NO: 1 preparado mediante un ejemplo de síntesis de la presente invención.
La figura 7b ilustra resultados que verifican los aumentos de niveles de fosforilación de PI3K y Akt, que son proteínas relacionadas con el fomento de crecimiento de fibroblastos de ligamento periodontal en el tratamiento con el péptido de SEQ ID NO: 2 preparado mediante un ejemplo de síntesis de la presente invención.
La figura 8a ilustra resultados que verifican los aumentos de niveles de expresión de ARNm de COL1A1 y DSPP, que son genes relacionados con la activación de fibroblastos de ligamento periodontal, en el tratamiento con el péptido de SEQ ID NO: 1 preparado mediante un ejemplo de síntesis de la presente invención.
La figura 8b ilustra resultados que verifican los aumentos de niveles de expresión de ARNm de COL1A1 y DSPP, que son genes relacionados con la activación de fibroblastos de ligamento periodontal en el tratamiento con el péptido de SEQ ID NO: 2 preparado mediante un ejemplo de síntesis de la presente invención.
Modo de llevar a cabo la invención
Ejemplos
Ejemplo de síntesis 1: síntesis de péptido
Se pusieron 700 mg de resina de cloruro de cloro-tritilo (resina CTL, Nova Biochem, n.° de cat. 01-64-0021) en un recipiente de reacción y se añadieron 10 ml de cloruro de metileno (MC), seguido por agitación durante 3 minutos. Después de retirarse la disolución, se añadieron 10 ml de dimetilformamida (DMF), seguido por agitación durante 3 minutos, y después se retiró de nuevo el disolvente. Se pusieron 10 ml de una disolución de diclorometano (DCM) en el reactor y se añadieron 200 mmol de Fmoc-Ser(tBu)-OH (Bachem, Suiza) y 400 mmol de diisopropiletilamina (DIEA), tras lo cual se disolvió exhaustivamente la mezcla con agitación y después se lavó la reacción con agitación durante 1 hora. Después de la reacción, se lavó el producto de reacción y después se disolvieron metanol y DIEA (2:1) en DCM, seguido por reacción durante 10 minutos, y después se llevó a cabo el producto de reacción usando exceso de DCM/DMF (1:1). Después de retirarse la disolución, se añadieron 10 ml de DMF, seguido por agitación durante 3 minutos, y después se retiró de nuevo el disolvente. Se pusieron 10 ml de una disolución de desprotección (el 20% de piperidina/DMF) en el reactor, seguido por agitación a temperatura ambiente durante 10 minutos y después se retiró la disolución. Se añadió una cantidad igual de una disolución de desprotección y después se mantuvo de nuevo la reacción durante 10 minutos, seguido por retirada de la disolución. Después, se lavó el producto de reacción dos veces con DMF, una vez con MC y una vez con DMF, durante 3 minutos cada vez, preparando de ese modo resina Ser(tBu)-CTL.
Se pusieron 10 ml de una disolución de DMF en un nuevo reactor y se añadieron 200 mmol de Fmoc-Lys(Boc)-OH (Bachem, Suiza), 200 mmol de HoBt y 200 mmol de Bop, y se disolvió exhaustivamente la mezcla con agitación. Se pusieron dos veces de manera dividida 400 mmol de N,N-diisopropiletilamina (DIEA) en el reactor y después se llevó a cabo la agitación durante al menos 5 minutos hasta que se disolvieron todos los sólidos. Se puso la disolución mixta de aminoácidos disueltos en un recipiente de reacción que contenía la resina desprotegida y se llevó a cabo la reacción con agitación a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de retirar el líquido de reacción, se llevó a cabo la agitación usando una disolución de DMF tres veces durante 5 minutos cada vez, seguido por retirada. Se tomó una pequeña cantidad de la resina que había reaccionado para comprobar el grado de reacción mediante la prueba de Kaiser (prueba de ninhidrina). Usando la disolución de desprotección, se llevó a cabo la reacción de desprotección dos veces de la misma manera que la descrita anteriormente, preparando así resina Lys(Boc)-Ser(tBu)-CTL. Después de lavar de manera suficiente con DMF y MC, se llevó a cabo de nuevo la prueba de Kaiser y después se llevó a cabo la siguiente prueba de unión de aminoácidos de la misma manera que la descrita anteriormente.
Basándose en la secuencia de aminoácidos seleccionada, se llevó a cabo la reacción en cadena en el orden de Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Leu, Fmoc-Asn(Trt), Fmoc-Leu, Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Arg(Pbf). Se retiró el grupo protector Fmoc mediante reacción dos veces con la disolución de desprotección durante 10 min cada vez, seguido por retirada mediante lavado exhaustivo. Se añadieron anhídrido acético, DIEA e hidroxibenzotriazol (HoBt) para llevar a cabo la acetilación durante 1 hora y después se lavó la resina de peptidilo preparada tres veces de manera secuencial con DMF, MC y metanol, se secó bajo el flujo de gas nitrógeno y se secó completamente mediante secado a vacío bajo pentóxido de fósforo (P2O5). Se añadieron 30 ml de una disolución saliente [el 95% de ácido trifluoroacético (TFA), el 2,5% de agua destilada y el 2,5% de tioanisol] y se mantuvo la reacción durante 2 horas mientras se agitaba de manera intermitente la mezcla a temperatura ambiente. Se filtró la resina, se lavó con una pequeña cantidad de una disolución y después se mezcló con disolución madre. Se llevó a cabo la destilación a presión reducida para reducir el volumen total a la mitad y después se añadieron 50 ml de éter frío para inducir precipitación. Después de eso, se recogieron los precipitados mediante centrifugación, seguido por lavado dos veces con éter frío. Se retiró la disolución madre, seguido por secado suficiente bajo atmósfera de nitrógeno, sintetizando de ese modo 0,85 g de péptido 1 sin purificar, Arg-Ser-Leu-Asn-Leu-Arg-Asp-Ser-Gln-Lys-Ser (rendimiento: 89,9%). Se determinó que el peso molecular era de 1303 (valor teórico: 1303,440) usando un sistema de análisis de peso molecular. También se sintetizó péptido 2, Phe-Asp-Met-Gly-Ala-Tyr-Lys-Ser-Ser-Lys (SEQ ID NO: 2), mediante el mismo método (rendimiento: 92,1%). Se determinó que el peso molecular era de 1133 (valor teórico: 1133,275) usando un sistema de análisis de peso molecular.
[Tabla 1]
Ejemplo 1: verificación del efecto de crecimiento de osteocitos usando péptidos sintéticos
Con el fin de analizar la acción de tipo BMP2 de los péptidos de secuencia sintetizados en el ejemplo de síntesis 1, se llevaron a cabo ensayos de MTT usando células C2C12, que son una línea celular de mioblastos, para investigar el efecto de fomento de la proliferación.
Se cultivaron las células C2C12 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco) complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS, Sigma) usando un matraz de 500 ml para cultivo tisular. Se desprendieron cuidadosamente las líneas celulares cultivadas del fondo del recipiente de cultivo usando una disolución de tripsina al 1%, seguido por centrifugación, obteniendo de ese modo únicamente precipitados celulares. Volvieron a suspenderse los precipitados celulares en medio de cultivo DMEM complementado sin FBS y después se añadieron a una placa de 96 pocillos para cultivo tisular a 1 X 103 células por cada pocillo, seguido por cultivo en condiciones de 37°C y CO2 al 5% durante 24 horas. Después de 24 horas, se cambió el medio con el mismo líquido de cultivo excluyendo completamente suero y después se disolvieron la muestra de blanco y cada uno del péptido sintético de manera estéril en agua destilada y se cultivó la mezcla a una concentración de 10 |ig/ml durante 72 horas en las mismas condiciones. Se añadió la muestra de MTT al pocillo de cultivo completado y, después de 4 horas, se disolvió el formazán formado en DMSO y después se midió la absorbancia a 560 nm para determinar la proliferación celular.
La figura 1 ilustra resultados de crecimiento de osteoblastos después del tratamiento con los péptidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. Tal como se muestra en las figuras 1a y 1b, los péptidos de la presente invención fomentaron significativamente el crecimiento de osteoblastos.
Los péptidos de la presente invención se encontraron mediante unión con el receptor de BMP tipo Ib, y se verificó que el presente péptido desempeñaba el mismo papel que BMP, que es una proteína que es importante en la formación de huesos. El péptido que se une a receptor de BMP tipo Ib de la presente invención realiza una función similar a BMP natural.
Ejemplo 2: verificación del efecto de fomento de diferenciación osteogénica de péptidos sintéticos
Con el fin de analizar la acción de tipo BMP2 de los péptidos de secuencia sintetizados en el ejemplo de síntesis 1, se investigó el efecto de fomento de diferenciación de osteoblastos mediante tinción con fosfatasa alcalina (ALP) de células MC3T3-E1, que son una línea celular de preosteoblastos. Se colocaron las células MC3T3-E1 en una placa de 24 pocillos hasta 3 X 104 células y después se cultivaron durante 24 horas en condiciones de 37°C y CO2 al 5%. Después de 24 horas, se trató el medio alfa-MEM que contenía FBS al 10% y ácido ascórbico 50 ug/ml bglicerofosfato 100 mM con los péptidos sintéticos a concentraciones de 10 ug/ml y 50 ug/ml, y después se llevó a cabo el cultivo durante 13 días mientras se intercambió el medio cada tres días. Se lavó el pocillo de placa de cultivo completado dos veces con PBS y después se inmovilizaron las células con un tampón de inmovilización, en el que se mezclaron acetona, formaldehído al 37% y disolución de ácido cítrico, durante 30 segundos. Se llevó a cabo la siguiente tinción usando el kit de tinción de fosfatasa alcalina de leucocitos (SIGMA).
Se trataron las células durante 2 minutos con una disolución alcalina de FBB y una disolución de nitrito de sodio mezcladas a 1:1 y después se trataron con un tampón compuesto por agua destilada y disolución alcalina de naftol AS-BI, seguido por revelado de color en una incubadora a 37°C durante 1 hora.
Como resultados de pruebas, cuando se trataron preosteoblastos MC3T3-E1 con los péptidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 a diferentes concentraciones, se verificó el aumento de la expresión de ALP según el fomento de diferenciación (figuras 2a y 2b).
Ejemplo 3: verificación del aumento de la expresión de genes relacionados con diferenciación osteogénica mediante péptidos sintéticos
Con el fin de investigar los niveles de expresión de ARNm de genes relacionados con diferenciación osteogénica, sialoproteína ósea (BSP) y colágeno tipo I alfa 1 (COL1A1) mediante los péptidos de secuencia sintetizados en el ejemplo de síntesis 1, se colocaron células MC3T3-E1 en una placa de 6 pocillos hasta 2 X 105 células y después se cultivaron durante 24 horas en condiciones de 37°C y CO2 al 5%. Después de 24 horas, se trató el medio que contenía FBS al 10% con los péptidos respectivos a 10 ug/ml y 50 ug/ml, y se usó BMP2 en un control positivo a 100 ng/ml. Después de 2 días, se llevó a cabo el lavado con PBS y después se aisló ARN usando azul Easy (Intron). Se sintetizó ADNc usando 1 ug de ARN y premezcla de RT (Intron), y se llevó a cabo PCR usando premezcla de PCR (Bioneer) y después se cargó el producto resultante sobre gel de agarosa para investigar el grado de expresión de ARNm de cada gen.
Como resultados de pruebas, cuando se trataron preosteoblastos MC3T3-E1 con los péptidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 a diferentes concentraciones, se verificaron los aumentos de los niveles de expresión de ARNm de los genes de diferenciación osteogénica (figuras 3a y 3b).
Ejemplo 4: verificación del efecto de fomento de señal de diferenciación osteogénica mediante péptidos sintéticos
Con el fin de investigar si pSmad1/5/8, que es una señal implicada en el fomento de diferenciación osteogénica, se activaba mediante los presentes péptidos, se colocaron células MC3T3-E1 en una placa de 6 pocillos a 2 X 105 células y después se cultivaron durante 24 horas en las condiciones de 37°C y CO2 al 5%. Después de 24 horas, se intercambió el medio por medio sin suero, seguido por cultivo durante 24 horas. Después, se trató el producto
resultante con los péptidos respectivos a 10 ug/ml y se usó BMP2 como control positivo a 50 ng/ml. Después de 15 minutos y 30 minutos, se llevó a cabo el lavado con PBS y después se añadió un tampón de lisis para obtener proteínas mediante lisis, seguido por inmunotransferencia de tipo Western.
Como resultados de pruebas, cuando se trataron preosteoblastos MC3T3-E1 con los péptidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 a diferentes concentraciones, se verificó el fomento de la fosforilación de Smad1/5/8 lo que muestra la activación de señal de diferenciación osteogénica (figuras 4a y 4b).
Ejemplo 5: verificación del efecto de proliferación y permeación de osteocitos mediante péptidos sintéticos
Se humedeció una esponja de colágeno con un tamaño de 0,5 mm x 0,5 mm con 100 ug del péptido de SEQ ID NO: 1, se trasplantó en el lomo del ratón Balb/c y después se dejó durante 2 semanas. Después de eso, se extrajo la esponja de colágeno y después se introdujo en un bloque de parafina y después se midió el grado de permeación y diferenciación de osteocitos en la esponja de colágeno mediante tinción de H&E (figura 5).
Mediante los resultados, volvió a verificarse in vivo el efecto de fomento de formación ósea, tal como proliferación y diferenciación de osteocitos, del péptido de SEQ ID NO: 1, que se había mostrado in vitro.
Ejemplo 6 : verificación del efecto de fomento del crecimiento de fibroblastos de ligamento periodontal mediante péptidos sintéticos
Con el fin de investigar los efectos de los péptidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 sobre el periodonto, se analizaron los efectos de fomento de fibroblastos de ligamento periodontal humanos. Se colocaron los fibroblastos de ligamento periodontal en una placa de 48 pocillos hasta 1 X 103 células y después se cultivaron durante 24 horas en condiciones de 37°C y CO2 al 5%. Después de 24 horas, se llevó a cabo el intercambio por medio que no contenía suero, seguido por cultivo durante 6 horas. Después de eso, se trató el producto resultante con los péptidos a concentraciones de 0,05-10 ug/ml y se usaron BMP-2 e IGF-1 como controles positivos a una concentración de 0,2 ug/ml, seguido por cultivo durante 72 horas. Después de completarse el cultivo, se retiró el sobrenadante de cultivo y se inmovilizaron las células usando etanol. Después de terminarse la inmovilización celular, se lavaron las células tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después de retirarse la disolución de lavado, se trataron las células con disolución de SRB colorimétrica y se lavaron suficientemente con ácido acético al 1%. Después, se observaron las células usando un microscopio para observar las condiciones de células vivas. Se leyó la absorbancia para la disolución decolorada con Tris 20 mM a luz UV de 560 nm, midiendo de ese modo las condiciones de supervivencia de las células.
Como resultados de pruebas, cuando se trataron los fibroblastos de ligamento periodontal con los péptidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 a diferentes concentraciones, se verificó el aumento del crecimiento celular de una manera dependiente de la dosis (figuras 6a y 6b).
Ejemplo 7: verificación del mecanismo de fomento del crecimiento de fibroblastos de ligamento periodontal mediante péptidos sintéticos
Con el fin de investigar los efectos de fomento del crecimiento de fibroblastos de ligamento periodontal humanos mediante los péptidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, se analizaron los grados de fosforilación de moléculas de señalización relacionadas usando inmunotransferencia de tipo Western. Se colocaron los fibroblastos de ligamento periodontal en una placa de 6 pocillos hasta 5 X 105 células y después se cultivaron durante 24 horas en condiciones de 37°C y CO2 al 5%. Después de eso, se trató el producto resultante con los péptidos a una concentración de 10 ug/ml y se usó bFGF como control positivo a una concentración de 0,2 ug/ml. Después, se recogieron las células mediante tiempos de cultivo de 5-15 minutos y se aislaron las proteínas totales y después se llevó a cabo la inmunotransferencia de tipo Western con respecto a p-PI3K y p-Akt.
Como resultados de pruebas, cuando se trataron los fibroblastos de ligamento periodontal con los péptidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, se verificaron los aumentos de los niveles de fosforilación de PI3K y Akt (figuras 7a y 7b).
Ejemplo 8 : verificación del efecto de fomento de la actividad de fibroblastos de ligamento periodontal mediante péptidos sintéticos
Con el fin de investigar los efectos de fomento de la actividad de fibroblastos de ligamento periodontal mediante los péptidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, se analizó la expresión de ARNm de genes relacionados usando RT-PCR. Se colocaron los fibroblastos de ligamento periodontal en una placa de 24 pocillos hasta 1,5 X 104 células y después se cultivaron durante 24 horas en condiciones de 37°C y CO2 al 5%. Después de 24 horas, se llevó a cabo el intercambio por el medio que no contenía suero, seguido por cultivo durante 24 horas. Después de eso, se trató el producto resultante con los péptidos a concentraciones de 1 y 10 ug/ml y se usaron BMP- 2 y IGF-1 como controles positivos a una concentración de 0,2 ug/ml, seguido por cultivo durante 72 horas. Después de completarse el cultivo, se llevó a cabo el lavado con PBS y después se aisló ARN usando azul Easy (Intron). Se sintetizó ADNc usando 1 ug de ARN y premezcla de RT (Intron) y se llevó a cabo PCR usando premezcla de PCR (Bioneer) y después se cargó el producto resultante sobre gel de agarosa para investigar el nivel de ARNm de cada marcador.
Como resultados de pruebas, cuando se trataron los fibroblastos de ligamento periodontal con los péptidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 a diferentes concentraciones, se verificaron los aumentos de los niveles de expresión de ARNm de colágeno tipo I alfa-1 (COL1A1) y sialofosfoproteína dentinaria (DSPP), que son genes relacionados con la actividad celular (figuras 8a y 8b).
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<220>
<223> Péptido 2
<400> 2
Phe Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys
1 5 10
Claims (8)
1. Péptido compuesto por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad ósea seleccionada del grupo que consiste en osteoporosis, osteoporosis infantil, osteogénesis imperfecta, osteomalacia, osteonecrosis, raquitismo, osteomielitis, pérdida ósea alveolar, enfermedad ósea de Paget, hipercalcemia, hiperparatiroidismo primario, enfermedades óseas metastásicas, médula ósea, pérdida ósea en artritis reumatoide, enfermedad ósea metastásica, pérdida ósea relacionada con cáncer, displasia fibrosa, enfermedad ósea adinámica, enfermedad ósea metabólica y pérdida de masa ósea relacionada con la edad.
2. Péptido para su uso según la reivindicación 1, en el que el péptido fomenta la proliferación de osteoblastos.
3. Péptido para su uso según la reivindicación 1, en el que el péptido aumenta la fosforilación de Smad1, Smad5 y Smad8.
4. Péptido para su uso según la reivindicación 1, en el que el péptido aumenta la expresión de fosfatasa alcalina (ALP), colágeno tipo I alfa 1 (COL1A1) y sialoproteína ósea (BSP).
5. Péptido compuesto por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 para su uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades periodontales.
6. Péptido para su uso según la reivindicación 5, en el que el péptido fomenta la proliferación de fibroblastos de ligamento periodontal.
7. Péptido para su uso según la reivindicación 5, en el que el péptido aumenta la fosforilación de PI3K y Akt.
8. Péptido para su uso según la reivindicación 5, en el que el péptido aumenta la expresión de colágeno tipo I alfa 1 (COL1A1) y sialofosfoproteína dentinaria (DSp P).
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