ES2245048T3 - Factor de crecimiento derivado de cadherina y su uso. - Google Patents
Factor de crecimiento derivado de cadherina y su uso.Info
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Abstract
Péptido designado como Cadherin Derived Growth Factor (CDGF), caracterizado porque se trata de un péptido que se escinde como pro-secuencia durante el procesamiento de la pro-cadherina en cadherina o de un fragmento del mismo, y porque el péptido o el fragmento tiene un efecto de proliferación celular sobre osteoblastos primarios de calvarias de rata, y/o de protección celular y/o de diferenciación celular sobre cultivos de células nerviosas primarias de ganglios de la radícula dorsal de embriones de gallina, y porque presenta una de las secuencias Cadherina-1 humana (28-154): Cadherina-2 humana (24-159): Cadherina-3 humana (27-107): Cadherina-4 humana (21-169): Cadherina-5 humana (26-47): Cadherina-6 humana (19-53): Cadherina-6 humana (19-51): Cadherina-8 humana: Precursor de Cadherina-B humana (Cadherina-11) (23-53): Precursor de cadherina encefálica-cadherina-C humana (Cadherina-12) (24-54): Precursor de cadherina encefálica-cadherina-C humana (Cadherina-12) (24-52): Cadherina-D humana (Cadherina 13) (23-138): Cadherina-F humana (Cadherina 14) (22-60):
Description
Factor de crecimiento derivado de cadherina y su
uso.
Son objeto de la presente invención péptidos
(albúmina) con propiedades de proliferación celular, diferenciación
celular y/o protección celular, que se denominan "Cadherin
Derived Growth Factor" (CDGF - factor de crecimiento derivado de
cadherina), así como su uso.
El objeto de la invención consiste en poner a
disposición péptidos que presentan propiedades de proliferación
celular, protección celular y/o diferenciación celular.
El objeto se cumple mediante los péptidos
denominados Factor de Crecimiento Derivado de Cadherina (CDGF), cuya
secuencia corresponde a una secuencia parcial de una
pre-pro-cadherina, donde la
pre-pro-cadherina presenta los
dominios secuencia de señal, pro-secuencia,
repeticiones de cadherina, región transmembrana y dominio
intracelular, caracterizados porque la secuencia del péptido abarca
la prosecuencia, falta al menos uno de los otros dominios de la
pre-pro-cadherina y porque el
péptido presenta propiedades de proliferación celular, protección
celular y/o de diferenciación celular.
El documento Cell Adhesion and Communication 2
(1994), 15 a 26, divulga la clonación de 5 cadherinas humanas y
describe dominios extracelulares.
La acción de proliferación celular puede ser
determinada, por ejemplo, en osteoblastos primarios de calvarias de
rata, la acción de protección celular y/o diferenciación celular en
cultivos de células nerviosas primarias de ganglios de la radícula
dorsal de embriones de gallina.
En una forma de realización preferida, el CDGF es
un fragmento de la pro-cadherina, es decir, de la
pre-pro-cadherina acortada en la
secuencia de señal.
Con especial preferencia se trata de un término N
de la pro-cadherina, es decir, la parte que es
escindida durante el procesamiento de la
pro-cadherina para obtener la cadherina, o bien, de
un fragmento acortado en un término N o C.
Con preferencia, el CDGF no presenta ninguna
repetición de cadherina.
Las formas de realización preferidas según la
invención son péptidos con la secuencia
Cadherina-1 humana
(28-154):
- CHPGFDAESYTFTVPRRHLERGRVLGRVNFCTGRQRTAYFSLDTRFKVGTDGVITVKRPLRFHNPQIHFLVYAWDSTYRK FSTKVTLNGHHHRPPPHQASVSGIQAELLTFPNSSPGLRRQKR
Cadherina-2 humana
(24-159):
- EASGEIALCKTGFPEDVYSAVLSKDVHEGQPLLNVFSNCNGKRKVQYESSEPADFKVDEDGMVYAVRSFPLSSEHAKFLIYAQDKETQEKWQKLSLKPTLTEESVKESAEVEEIVFPRQFSKHSGHLQRQKR
Cadherina-3 humana
(27-107):
- CRAVFREAEVTLEAGGAEQEPGQALGKVFMGQEPALFSTDNDDFTVRNGETVQERRSLKERNPLKIFPSKRILRRHKR
Cadherina-4 humana
(21-169):
- HNEDLTTRETCKAGFSEDDYTALISQNILEGEKLLQVKSSCVGTKGTQYETNSMDFKGADGTVFATRELQVPSEQVAFTV TAWDSQTAEKWDAVLVAQTSSPHSGHKPQKGKKVVALDPSPPPKDTLLPWPQHQNANGLRRRKR
Cadherina-5 humana
(26-47):
- AGANPAQRDTHSLLPTHRRQKR
Cadherina-6 humana
(19-53):
- TLSTPLSKRTSGFPAKKRALELSGNSKNELNRSKR
Cadherina-6 humana
(19-51):
- TLSTPLSKRTSGFPAKKRALELSGNSKNELNRS
Cadherina-8 humana:
- MLLDLWTPLIILWITLPPCIYMAPMNQSQVLMSGSPLELNSLGEEQRILNRSKR
Precursor de cadherina-B humana
(Cadherina-11) (23-53):
- FAPERRGHLRPSFHGHHEKGKEGQVLQRSKR
Precursor de cadherina-B humana
(Cadherina-11) (26-51):
- ERRGHLRPSFHGHHEKGKEGQVLQRS (OB-CDGF)
Precursor de cadherina
encefálica-cadherina-C humana
(Cadherina-12) (24-54):
- QPQPQQTLATEPRENVIHLPGQRSHFQRVKR
Precursor de cadherina
encefálica-cadherina-C humana
(Cadherina-12) (24-52):
- QPQPQQTLATEPRENVIHLPGQRSHFQRV
Cadherina-D humana (Cadherina 13)
(23-138):
- EDLDCTPGFQQKVFHINQPAEFIEDQSILNLTFSDCKGNDKLRYEVSSPYFKVNSDGGLVALRNITAVGKTLFVHARTPHAEFDMAELVIVGGKDISLQDIFKFARTSPVPRQKRPSVLLLSLFSLACL
Cadherina-F humana (Cadherina 14)
(22-60):
- VPGWRRPTTLYPWRRAPALSRVRRAWVIPPISVSENHKR.
Con preferencia, la proteína según la invención
es una proteína que puede obtenerse del hombre o una de sus
variantes que existe naturalmente.
Un objeto de la invención también es una nueva
proteína que abarca partes de la secuencia de aminoácidos de CDGF.
La invención se refiere con preferencia a un CDGF que contiene las
secuencias de aminoácidos precedentemente representadas, pero
también puede contener variantes de esas secuencias. Por
"variantes" en el sentido de la presente invención se
entienden secuencias que, por sustitución, supresión y/o inserción
de distintos aminoácidos o breves secciones de aminoácidos, se
distinguen de las secuencias de aminoácidos del CDGF
precedentemente representadas.
Entre "variantes" se cuentan tanto
variaciones alélicas de los CDGF naturales, como también proteínas
generadas por tecnología de ADN recombinante (especialmente por
mutagénesis in vitro con ayuda de oligonucleótidos
sintetizados químicamente), que corresponden a los CDGF respecto de
su actividad biológica y/o inmunológica.
Reemplazos conservativos son, por ejemplo, Y
por/contra V, K por/contra S, A por/contra S, D por/contra E, G
por/contra S, R por/contra Q, R por/contra A, Q por/contra K.
También se reivindican según la invención ácidos
nucleicos que codifican los péptidos o los derivados o que son
complementarios de estos ácidos nucleicos. En el caso de los ácidos
nucleicos se puede tratar, por ejemplo, de ADN, ARN, APN o análogos
resistentes a nucleasa. Los ácidos nucleicos según la invención son
adecuados para la expresión de los CDGF in vivo en lo que se
refiere a una terapia génica, así como nucleótidos antisentido para
reducir la expresión. También son objeto de la invención vectores
que contienen los ácidos nucleicos. Los vectores son especialmente
adecuados para la expresión del péptido en organismos modificados
por técnicas genéticas.
Además, la invención se refiere a anticuerpos que
están dirigidos contra el CDGF o sus derivados, así como
antagonistas / inhibidores que están dirigidos contra CDGF, un
derivado o uno de los ácidos nucleicos según la invención. Estas
sustancias también son apropiadas como medicamentos para el
tratamiento de estados que están relacionados con una
sobreexpresión de CDGF, así como para su uso para el
diagnóstico.
Los CDGF, derivados, compuestos, ácidos
nucleicos, anticuerpos y/o antagonistas / inhibidores según la
invención se pueden usar como medicamentos junto con coadyuvantes
usuales. Se prefiere en especial que los medicamentos estén
disponibles en forma de preparaciones galénicas adecuadas para
administración por vía oral, bucal, intravenosa, intramuscular,
intracutánea, intratecal, intranasal, local-tópica,
así como en aerosol para la aplicación transpulmonar.
La cantidad de medicamento que debe ser
administrada es preferentemente de 1 \mug a 1 g por unidad de
administración por día.
Los medicamentos según la invención son
apropiados para el tratamiento y la prevención de patologías
degenerativas, así como metabólicas del hueso, tales como
osteoporosis, osteomalacia y osteopenia, del páncreas tal como
diabetes mellitus, del músculo tales como distrofias musculares, de
los vasos, del sistema nervioso central y periférico, tales como
neuropatías periféricas y centrales, del pulmón tal como asma
bronquial, del estómago tal como úlcera, así como para la terapia y
la prevención de procesos inflamatorios, reacciones inflamatorias
alteradas, enfermedades tumorales, así como para la curación de
heridas y huesos.
El agente de diagnóstico según la invención
contiene anticuerpos poli- o monoclonales contra el péptido según la
invención, eventualmente de forma marcada, como con marca
fluorescente o radioactiva, para ser usado en un ELISA o RIA en sí
conocidos. El agente de diagnóstico según la invención contiene ADN,
ARN y/o APN eventualmente de forma modificada y/o marcada para
emplear en sistemas de ensayo conocidos por el especialista tales
como PCR o Fingerprinting.
Los agentes de diagnóstico son apropiados para el
control de niveles de CDGF en tejidos, en secreciones y/o en
líquidos corporales tales como plasma, orina y líquido
cerebroespinal, así como también como marcadores en trastornos
funcionales del hueso, de los músculos, de los vasos, del sistema
nervioso, de los órganos linfáticos, del tracto gastrointestinal,
del sistema inmunológico y de diabetes, así como procesos
inflamatorios y neoplásicos, así como también como marcador en caso
de cáncer (marcador de tumores).
Los CDGF según la invención y sus derivados se
pueden obtener por aislamiento a partir de hemofiltrado mediante la
extracción por intercambio de cationes con posterior elución de las
sustancias adsorbidas, una nueva cromatografía por intercambio de
cationes del extracto que contiene los péptidos, así como una
cromatografía en fase inversa en varias etapas. Los péptidos según
la invención se pueden obtener de modo totalmente sintético
mediante una síntesis en fase sólida en el sentido de la síntesis
de Merrifield o una síntesis en fase líquida según métodos conocidos
por el especialista con aminoácidos protegidos y posterior
purificación. Los péptidos según la invención también se pueden
preparar mediante vectores biotecnológicos usuales a través de
procedimientos de expresión heteróloga en sí conocidos por el
especialista.
Por ejemplo, un péptido designado como
OB-CDGF, se purificó mediante métodos
cromatográficos a partir de hemofiltrado humano y se identificó con
ayuda de un bioensayo.
El péptido presenta una masa molecular de 3062,8
Da. Hasta ahora, a través del análisis de un ADNc se presentó una
pre-pro-secuencia de
OB-cadherina. En esta secuencia derivada del ADNc se
encuentra la secuencia peptídica según la invención directamente
detrás de la secuencia de señal putativa (véase Figura 1).
La caracterización bioquímica del péptido según
la invención se efectuó mediante espectrometría de masa y
secuenciación del péptido completo. Del análisis de la secuencia
del péptido biológicamente activo resultó la siguiente secuencia de
aminoácido para OB-CDGF:
- ERRGHLRPSFHGHHEKGKEGQVLQRS
En el espectro de masa ESI (Elektrospray
Ionisation) del OB-CDGF se determinó la masa
molecular (MW) con:
OB-CDGF, MW 3062,8 Da
El péptido según la invención se puede obtener
mediante un procedimiento de purificación a partir de hemofiltrado
humano. Este procedimiento de acuerdo con el documento DE 36 33
707, que divulga la obtención de albúminas a partir de
hemofiltrado, se efectuó de una forma modificada.
Durante la ultrafiltración de la sangre de
enfermos renales se producen grandes cantidades de hemofiltrado. El
hemofiltrado humano se diluye eventualmente con agua y se
acidifica. El valor del pH varía preferentemente de 1,5 a 3,5, en
especial de 2,5 a 3,0. Posteriormente, el hemofiltrado es guiado a
través de un intercambiador de cationes, por ejemplo un material de
soporte modificado con grupos de ácido sulfónico (Fraktogel SP -
650 (M), Merck, Darmstadt). Los péptidos unidos con el
intercambiador de cationes se eluyen con una disolución salina con
una concentración relativamente elevada. La intensidad iónica de la
disolución de elución corresponde, en este caso, aproximadamente a
una disolución de acetato de amonio 0,5 a 1 molar.
El eluato recolectado se somete a otra
cromatografía por intercambio de cationes. Esta cromatografía es
preferentemente una elución en etapas con tampones con valores
crecientes del pH.
Las fracciones que contienen el péptido según la
invención se continúan purificando mediante cromatografía
preparativa de fase inversa y posterior cromatografía
semipreparativa de fase inversa, por ejemplo en materiales de
soporte modificados en C4. El grado de pureza se verifica
preferentemente mediante cromatografía analítica de fase inversa en
materiales de soporte modificados en C18.
La sustancia obtenida por purificación
cromatográfica se condujo hacia la clarificación estructural. La
determinación de la masa molecular del péptido nativo se efectuó
mediante un espectrómetro de masa por electronebulización. El
análisis de secuencia se llevó a cabo a través de una degradación de
Edman de los péptidos, así como de derivados químicamente
modificados con un secuenciador ABI 473 A.
La síntesis total se efectuó en las usuales fases
sólidas en el sentido de la síntesis de Merrifield. La estrategia
de síntesis y la estructura del péptido y de sus derivados con los
aminoácidos correspondientemente protegidos son conocidos por el
especialista.
El OB-CDGF según la invención,
así como su ADNc, su gen y análogos, fragmentos y derivados del
péptido, del ADNc y del gen, así como anticuerpos, que neutralizan
la acción del OB-CDGF, pueden ser utilizados como
medicamentos.
Figura 1 muestra la estructura del dominio de las
cadherinas.
Figura 2 muestra los cromatogramas del
aislamiento del OB-CDGF a partir de hemofiltrado. La
identificación se realiza mediante un ensayo de proliferación en
osteoblastos primarios. Los detalles de la purificación se pueden
deducir del Ejemplo 1.
Figura 3 muestra el espectro de masa por
electronebulización del OB-CDGF aislado. A partir de
los iones protonados dos y tres veces se calcula un peso molecular
de 3.062 Dalton.
Figura 4 muestra la curva
dosis-efecto del OB-CDGF sintetizado
químicamente sobre la proliferatina de células óseas primarias. En
Figura 4a se muestra el efecto durante un tiempo de incubación de
72 horas, en Figura 4b, durante un tiempo de incubación de 48
horas. Se midió la absorción de bromodesoxiuridina (BrdU). La
inserción de BrdU se midió por medio de ELISA.
Figura 5 muestra la unión específica de
OB-CDGF marcado con yodo a osteoblastos primarios
(monocapa) y a la matriz extracelular (ecm) de osteoblastos
primarios. Se representa el desplazamiento del
OB-CDGF marcado por OB-CDGF no
marcado con una creciente concentración de la cantidad de
OB-CDGF no marcado.
Figura 6 muestra la estimulación de osteoblastos
primarios mediante la adición de OB-CDGF. La
concentración intracelular de calcio aumenta mediante la adición de
OB-CDGF. Se midió el contenido de calcio en
presencia de Fura 2 en células individuales en el microscopio
fluorescente.
Figura 7 es un Western blot que comprueba la
actividad intracelular de la MAP-quinasa. Esta
actividad rige como parámetro para la respuesta celular mediada por
receptor y calcio a OB-CDGF en osteoblastos
primarios. La banda superior (46 kD) muestra la concentración de la
MAP-quinasa tras la estimulación con suero fetal de
ternero FCS (izquierda) u OB-CDGF (derecha) en
función del tiempo de incubación. La banda inferior muestra un
control interno para la separación celular / Western blot.
La invención se explica mediante los siguientes
ejemplos.
Se ajustan 800 a 1.000 l de hemofiltrado con HCl
a un valor pH de 2,7 y se diluyen con agua a una conductividad de
5,5 mS/cm y se aplican con una velocidad de flujo de 3 l/min en un
fuerte intercambiador de cationes.
| Columna: | Vantage VA 250 (Amicon, Witten) |
| Material de columna: | Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm x 20 cm |
| Flujo: | 3 l/min |
| Detección: | 280 nm, pH, conductividad |
| Tampón A: | hemofiltrado pH 2,7, conductividad 5,5 mS/cm |
| Tampón B: | acetato de amonio 0,5 M |
| Equipo: | sistema de cromatografía Autopilot, (PerSeptive Biosystems, Wiesbaden) |
Después de aplicar el total de 1.000 l de líquido
durante la noche, se enjuaga con varios volúmenes de columna de HCl
5 mM. La elución de los péptidos unidos se efectúa como elución en
lotes con acetato de amonio 0,5 M. En este caso se logra una
completa elución de los péptidos a través del creciente valor del pH
(6,8 - 7,2) y creciente conductividad (56 mS/cm) en aproximadamente
5 l de eluato.
Los eluatos de acetato de amonio de la extracción
por lotes se combinan en cantidades de 5.000 a 10.000 l de
hemofiltrado-péptido. Tras ajustar a un valor pH de
2,7, el extracto de péptido se aplica sobre el intercambiador
catiónico preparativo bajo la adición de agua-VE
con una conductividad de 5,5 mS/cm.
| Columna: | Vantage 250 VA |
| Material de columna: | Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm x 20 cm |
| Flujo: | de hasta 3 l/min durante la aplicación |
| 0,5 a 1 l durante la elución | |
| Detección: | 280 nm, pH, conductividad |
| Muestra: | hemofiltrado pH 2,7, conductividad 5,5 mS/cm |
| Equipo: | sistema de cromatografía Autopilot, (PerSeptive Biosystems, Wiesbaden) |
Después de la aplicación del extracto en bruto
durante 240 min., se enjuaga la columna con HCl 0,01 M, hasta que la
conductividad sea menor que 1 mS/cm. En este caso, la elución se
realiza en varias etapas con los tampones indicados a
continuación
| Tampón (mS/cm) | Valor pH | Sustancias tampón | Conductividad |
| Tampón de lavado: | 2,0 | HCl 0,01 M | 1 |
| Tampón de elución 1: | 3,6 | ácido cítrico-1-hidrato 0,1 M | 2,9 |
| Tampón de elución 2: | 4,5 | ácido acético 0,1 M + acetato de sodio 0,1 M | 4,0 |
| Tampón de elución 3: | 5,0 | ácido málico 0,1 M | 6,2 |
| Tampón de elución 4: | 5,6 | ácido succínico 0,1 M | 6,1 |
| Tampón de elución 5: | 6,6 | NaH_{2}PO_{4} 0,1 M | 4,9 |
| Tampón de elución 6: | 7,4 | NaH_{2}PO_{4} 0,1 M | 6,7 |
| Tampón de elución 7: | 9,0 | carbonato de amonio 0,1 M | 6,7 |
Los eluatos 1-7 se designan como
pool de pH I-VII. Se recolectan por separado. La
elución se lleva a cabo hasta lograr una línea base, donde para los
distintos pools de pH I a VII se alcanzan volúmenes de elución de
10 a 25 l. El cromatograma se muestra en Figura 2a.
Los distintos pools de pH para el fraccionamiento
y la simultánea desalinización son separados mediante una
cromatografía en fase inversa.
| Columna: | FineLine 100 (Pharmacia, Freiburg) |
| Material de columna: | Source RPC, 15 Fm 10 x 12,5 cm (FineLine 100) |
| Flujo: | 150 ml/min (FineLine 100) |
| Detección: | 280 nm, conductividad, pH |
| Tampón A: | HCl 10 mM |
| Tampón B: | 80% de acetonitrilo en HCl 10 mM |
| Gradiente: | 0-60% de tampón B en 5 volúmenes de columna |
Después de la aplicación del pool de pH, se
enjuaga la columna con el tampón A. Durante la elución se recolectan
fracciones de 200 ml cada una. El cromatograma se muestra en Figura
2 b. En el bioensayo se verifican alícuotas de las fracciones. Las
fracciones son liofilizadas y almacenadas a -20EC.
La fracción 13 activa en el bioensayo del pool de
pH VI fue separada a través de una columna semipreparativa de fase
inversa. Las fracciones 5-7 contenían la sustancia
según la invención.
| Columna: | columna de acero de 4,7 cm x 30 cm |
| Material de relleno: | Vydac RP-C18 15-20 Fm, 300 \ring{A} |
| Tampón A: | 0,1% de TFA |
| Tampón B: | 0,1% de TFA, 80% de acetonitrilo |
| Gradiente: | 5 - 50% de B en 45 min, 50 - 100% de B en 10 min |
| Flujo: | 42 ml/min |
| Detección: | 214 nm y 280 nm |
| Equipo de cromatografía: | BioCad |
| Fracciones: | cada 1,5 min después de inicio del gradiente. |
Se muestra el cromatograma en Figura 2c.
Se determinaron todas las masas de los péptidos
nativos y sintéticos en el espectrómetro de masa por
electronebulización (ESI-MS). Las masas moleculares
del péptido se determinaron de acuerdo con los números másicos (MW)
que se indicaron previamente. El espectro de masa se indica en
Figura 3.
El péptido purificado, nativo y preparado por
síntesis fue analizado por degradación de Edman en un secuenciador
ABI 473 A usando el programa estándar. Las muestras se aplicaron en
una membrana de polibreno en cantidades entre 100 y 400 pmol. En
concordancia con los resultados de las determinaciones de masas,
resultó la siguiente secuencia de aminoácidos:
- ERRGHLRPSFHGHHEKGKEGQVLQRS
Se efectuó una comparación del banco de datos con
ayuda del paquete del programa HUSAR en los bancos de datos
SwissProt y EMBL-Nukleinsäure. La secuencia
equivale a los aminoácidos derivados del ADNc del precursor de la
cadherina-11 humana (cadherina de osteoblastos,
propéptido, aminoácidos 26-51).
La síntesis del péptido con la secuencia
ERRGHLRPSFHGHHEKGKEGQVLQRS se realizó según el método en fase sólida
de Merrifield, partiendo de aminoácidos protegidos con Fmoc. El
péptido sintético se purificó mediante una cromatografía en fase
inversa. La identidad y la pureza de la sustancia se comprobó con
ayuda de espectrometría de masa, análisis de secuencias y
electroforesis de zonas capilares.
El aislamiento del OB-CDGF se
realizó mediante su actividad biológica en un ensayo de
proliferación de osteoblastos primarios. Para ello, se liofilizaron,
en cada caso, alícuotas de las distintas etapas cromatográficas que
se describieron en el Ejemplo 1 y luego se sometieron al ensayo
biológico. Las fracciones, de las que resultó en cada caso una
señal positiva, se sometieron a una ulterior purificación.
El ensayo mide la proliferación de las células,
después de que se mantuvieron en un medio sin suero con 1 mg/ml de
albúmina de suero ovino, se añadieron luego las muestras y al cabo
otras 48 horas se determinó la inserción de
^{3}H-timidina o bromodesoxiuranosina (Brdu). Como
control positivo se utilizan en este ensayo factores que promueven
el crecimiento óseo, tales como IGF o angiotensina o suero fetal de
ternero (FCS).
Los experimentos se realizaron según
Pfeilschifter et al., Endocrinology 126, 703,
1990.
La obtención de osteoblastos primarios se efectuó
a través de digestión secuencial mediante colagenasa de calvarias
fetales de rata. En este caso se obtuvieron 5 fracciones celulares.
El pool de las fracciones celulares 3-5 se cultivó
in vitro. El cultivo de las células se realizó en una
incubadora con una humedad relativa ambiente de 95%, un contenido
de CO_{2} de 5% y una temperatura de 37EC. Se estudiaron las
sustancias de ensayo en cultivos del primero, segundo o tercer
pasaje celular.
Para el estudio, las células fueron sembradas al
menos 95 horas previas a la adición de las sustancias de ensayo, en
una cantidad celular de 7 x 10^{3} células (en 100 \mul de
medio de cultivo / pocillo en placas de microtitulación (MTP) con
fondo redondo. En este caso se utilizó como medio de cultivo MEM
Dulbecco (más 4,5 g/l de glucosa más
3,7 g/l de NaHCO_{3} sin glutamina), al que se añadió suero fetal de ternero al 5% (FKS) y 5000 U/ml de penicilina / estreptomicina.
3,7 g/l de NaHCO_{3} sin glutamina), al que se añadió suero fetal de ternero al 5% (FKS) y 5000 U/ml de penicilina / estreptomicina.
Inmediatamente antes de añadir las sustancias de
ensayo al cultivo celular, se realizó un intercambio del medio por
150 \mul de medio, el que, en lugar de FKS, contenía 1 mg/ml de
albúmina de suero bovino (RSA). Las sustancias de ensayo se
añadieron en las concentraciones deseadas al medio con contenido de
RSA. Como control positivo se preparó, además, TGF\beta_{1}
(Transforming growth factor \beta_{1}) en concentraciones de
0,1-0,2 ng/ml. Por cada control (positivo) o bien
concentración de sustancia se efectuaron tres determinaciones.
La incubación de los cultivos celulares con
sustancias de ensayo se realizó durante 24 a 72 horas, en las
últimas 3 horas adicionalmente en presencia de la sonda de timidina
(adición de 1 \muCi
metil-^{3}H-timidina / cavidad de
MTP en 20 \mul de disolución de PBS).
Al final del tiempo de incubación se lavaron los
cultivos celulares 3 veces con disolución salina al 0,9% y, a
continuación, se mezcló cada vez con 100 \mul de líquido de
centelleo (OptiPhase Supermix^{J} de la empresa Wallac).
Posteriormente se efectuó la medición de la radiactividad incluida
en el ADN en un contador de líquido de centelleo (1450
MicroBeta^{J} de la empresa Wallac) en cpm.
En la evaluación, los cultivos celulares que
exclusivamente recibieron medio con contenido de RSA, sirvieron como
controles (100%).
El OB-CDGF presenta, en función
de la dosis, una acción promotora del crecimiento sobre osteoblastos
primarios (células óseas). Esta acción biológica fue comprobada
tanto para el péptido nativo, como también para el péptido obtenido
por síntesis.
El péptido correspondiente a la región del CDGF
de la Cadherina-12 (BR-Cadherina;
N-Cadherina-2) con la secuencia de
aminoácidos QPQPQQTLATEPRENVIHLPGQRSHFQRV, que fue sintetizado según
la síntesis en fase sólida -como se describió en el Ejemplo 1 para
el OB-CDGF-, se estudió respecto de su acción
estimuladora de supervivencia sobre cultivos primarios de neuronas
de ganglios de la radícula dorsal de embriones de gallina.
El modelo de ensayo se estructuró del siguiente
modo:
La preparación y el cultivo se realizaron como se
describió por Borasio G. D., John J., Wittinghofer A., Barde Y.-A.,
Sendtner M. Heumann R. (1989) Neuron 2, 1087-1096.
Para determinar los efectos estimuladores de la supervivencia de
principios activos, se utiliza la determinación del contenido
celular de LDH después de un tiempo de incubación de 48 horas. Para
ello, se retira el medio de cultivo golpeando la placa. Sólo las
células vitales se mantienen adheridas al fondo de la placa y
pueden entonces ser determinadas. Para determinar el contenido de
LDH se utiliza el kit de verificación de la citotoxicidad de LDH de
Boehringer Mannheim (BM).
Los cultivos se colocan como duplicados en placas
de microtitulación de 96 pocillos. En cada placa se lleva una curva
de graduación de NGF y se expresa la actividad biológica de las
sustancias en pg/ml de equivalentes de NGF. Como sustancia de
referencia de bajo peso molecular, se conlleva el derivado de
estaurosporina K252a en una concentración de 300 nmol/l.
El péptido mostró en función de la concentración
una acción estimuladora de la supervivencia sobre estas neuronas
primarias. Estas células son células nerviosas típicas, de modo que
el BR-CDGF constituye un factor de
neuroprotección.
El péptido correspondiente a la región de CDGF de
la Cadherina-6 con la secuencia de aminoácidos
TLSTPLSKRTSGFPAKKRALELSGNSKNELNRS, que fue sintetizado según la
síntesis en fase sólida -como se describió en el Ejemplo 1 para el
OB-CDGF-, se estudió respecto de su acción
estimuladora de supervivencia sobre cultivos primarios de neuronas
de ganglios de la radícula dorsal de embriones de gallina. El
modelo de ensayo se estructuró como se describió en el Ejemplo
2.
El péptido mostró en función de la concentración
una acción estimuladora de supervivencia sobre estas neuronas
primarias.
La unión de péptidos osteoproliferativos con
monocapas de osteoblastos neonatales de ratas se realizó utilizando
péptidos marcados con ^{125}I. La yodación se realizó con
cloramina T. La actividad específica de los péptidos fue de 100.000
cpm/ng. Los estudios de unión se realizaron en capas confluentes,
así como en la matriz extracelular de un primer pasaje de
osteoblastos neonatales de ratas. Las células se incubaron en un
medio con contenido de suero durante 24 horas, y luego se lavaron
cuatro veces con PBS y se incubaron durante 2 horas a 4ºC en 250
\mul del tampón de ensayo (HEPES 20 mM, 0,1 mg/ml de BSA, pH 7,0)
con 80.000 cpm del péptido marcado con yodo en presencia de
diferentes concentraciones del péptido no marcado. Luego se retiró
el tampón de incubación, las células se lavaron cuatro veces con
PBS frío y se solubilizaron con NaOH 1 M. La actividad relacionada
con las células fue determinada con ayuda de un contador gamma. Los
correspondientes resultados del ensayo están representados en
Figura 5. Al aumentar la concentración de OB-CDGF no
marcado, disminuye la cantidad de OB-CDGF marcado
específicamente unido.
La cadena de señales intracelulares para
calcio^{2+} se mide en células individuales de osteoblastos. La
actividad intracelular de Ca^{2+} de osteoblastos primarios se
mide con el colorante Fura-2 (Calbiochem, Bad Soden,
Alemania) sensible al Ca^{2+}. Los osteoblastos primarios se
cultivan sobre portaobjetos de vidrio (diámetro de 30 mm) durante
uno a tres días, los que están fijados a una cámara de perfusión de
un microscopio invertido (Axiomat IDC-UV, Zeiss,
Göttingen, Alemania). Las células se incubaron durante 10 minutos a
37ºC en una disolución tampón de Krebs-Henseleit
modificada (KHB, composición NaCl 145 mM, K_{2}HPO_{4} 1,6 mM,
KH_{2}PO_{4}0,4 mM, gluconato de calcio 1,3 mM, MgCl_{2} 1,0
mM, D-glucosa 5,0 mM, pH 7,4) con 5 \muM de
Fura-2/éster acetoximetílico disuelto en 0,1 g/l de
Pluronic F-127 (Sigma, Deisenhofen, Alemania) en
RPMI 1640 (PAA, Cölbe, Alemania).
A la incubación siguió un período de equilibrio
de 10 a 15 min, en el cual las células se enjuagan con una
disolución de KHB a 37º con una velocidad de perfusión de 5 ml/min.
Los osteoblastos primarios cargados con Fura-2 se
miden a 340, 360, 380 nm con una rueda filtrante de alta velocidad
(velocidad de rotación 10 hercios), un tubo contador de fotones
individuales (Hamamatsu, Herrsching, Alemania) y una lámpara de
xenón de cuarzo (XBO 75 W/OFR, Zeiss, Alemania) como fuente de luz
/ impulsos. La emisión de Fura-2 se mide a través
de un filtro de onda larga a 510 nm con una lente Ultrafluar 125 x
de inmersión en glicerol. Todas las mediciones se realizan en las
distintas células. El campo de medición se elige mediante un
orificio ajustable de aproximadamente 8 \mum de diámetro. Se
evalúa la relación de la emisión de fotones después de excitar a
340 y 380 nm. Los datos en bruto se corrigen respecto de la
autofluorescencia y del ruido. El valor de fondo así obtenido se
descuenta de las señales de medición en cada experimento. Los datos
en bruto se calculan y se median 10 puntos de datos adyacentes, a
los efectos de lograr una resolución de tiempo de 1 Hz. La
fluorescencia a 360 nm se utiliza para verificar la actividad del
calcio. Todas las muestras se disuelven en un tampón de fosfato
previo al experimento y se miden al menos durante 1 a 2 minutos. La
calibración del Ca^{2+} se mide al final de cada experimento
mediante la incubación de las células con el ionóforo Ca^{2+},
Ionomicina (10 \mumol, Sigma, Deisenhofen, Alemania) en presencia
de 1,3 mmol de Ca^{2+}, o bien la ausencia nominal
(etilenglicol-bis(\beta-aminoetiléter
5 mM), ácido N,N,N',N'-tetraacético, en presencia
de EGTA). Sólo se utilizan calibraciones, tanto con valores máximos
como también mínimos, para la determinación del valor de Ca^{2+}.
En los experimentos, en los cuales no fue exitosa la doble
calibración, se utiliza el valor medio de todas las calibraciones.
Los correspondientes resultados se muestran en Figura 6.
Como ya se mostró en el Ejemplo 5, mediante la
incubación con CDGF se puede inducir una liberación intracelular de
calcio en osteoblastos primarios. A los efectos de caracterizar con
mayor detalle esta respuesta fisiológica, se estudió el siguiente
recorrido de señal intracelular ("corriente abajo" del calcio).
Una posible cascada de transducción de señales es la activación de
la MAP-quinasa, una enzima que desempeña un papel
esencial en la transmisión de señales del citoplasma al núcleo
celular. Al transmitirse la señal, se produce una fosforilación de
la enzima que puede ser detectada con un anticuerpo específico. La
detección de esta proteína se puede efectuar, por lo tanto, en el
Western blot y, debido al estímulo, constituye una medida para la
fosforilación, como también para la expresión. Se incubaron
osteoblastos primarios durante diferentes períodos con cadherina o
bien con controles (FCS). Mediante la adición del anticuerpo se
comprobó en el Western blot la expresión de la enzima
(MAP-quinasa) en la célula. Los resultados se
muestran en Figura 7. Se puede apreciar claramente que, sin un
estímulo como FCS u OB-CDGF, no se produce
expresión alguna, mientras que después de la estimulación aparece
una clara banda del tamaño esperado de la
MAP-quinasa (banda superior). Cuanto más se haya
estimulado con OB-CDGF, tanto más clara se tornaba
la banda visible. Esto muestra unívocamente que el
OB-CDGF lleva a una expresión de la
MAP-quinasa intracelular. De aquí se puede deducir
que el CDGF actúa como mediador del receptor a través del calcio y
que el consiguiente procesamiento de señal pasa a través de la
MAP-quinasa.
(1) DATOS GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Wolf-Georg Forssmann
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Feodor-Lynen-Strasse 31
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LOCALIDAD: Hannover
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 30625
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DENOMINACIÓN DE LA INVENCIÓN: Factor de crecimiento derivado de cadherina y su uso
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- CANTIDAD DE SECUENCIAS: 14
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- VERSIÓN PARA COMPUTADORA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: Floppy disk
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- COMPUTADORA: compatible con PC IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 123 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 132 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 144 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gly Ala Asn Pro Ala Gln Arg Asp Thr His
Ser Leu Leu Pro Thr}
\sac{His Arg Arg Gln Lys Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Leu Ser Thr Pro Leu Ser Lys Arg Thr Ser
Gly Phe Pro Ala Lys}
\sac{Lys Arg Ala Leu Glu Leu Ser Gly Asn Ser Lys
Asn Glu Leu Asn Arg}
\sac{Ser Lys Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Leu Ser Thr Pro Leu Ser Lys Arg Thr Ser
Gly Phe Pro Ala Lys}
\sac{Lys Arg Ala Leu Glu Leu Ser Gly Asn Ser Lys
Asn Glu Leu Asn Arg}
\sac{Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 54 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Leu Leu Asp Leu Trp Thr Pro Leu Ile Ile
Leu Trp Ile Thr Leu}
\sac{Pro Pro Cys Ile Tyr Met Ala Pro Met Asn Gln
Ser Gln Val Leu Met}
\sac{Ser Gly Ser Pro Leu Glu Leu Asn Ser Leu Gly
Glu Glu Gln Arg Ile}
\sac{Leu Asn Arg Ser Lys Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ala Pro Glu Arg Arg Gly His Leu Arg Pro
Ser Phe His Gly His}
\sac{His Glu Lys Gly Lys Glu Gly Gln Val Leu Gln
Arg Ser Lys Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Arg Arg Gly His Leu Arg Pro Ser Phe His
Gly His His Glu Lys}
\sac{Gly Lys Glu Gly Gln Val Leu Gln Arg
Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Pro Gln Pro Gln Gln Thr Leu Ala Thr Glu
Pro Arg Glu Asn Val}
\sac{Ile His Leu Pro Gly Gln Arg Ser His Phe Gln
Arg Val Lys Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (Xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Pro Gln Pro Gln Gln Thr Leu Ala Thr Glu
Pro Arg Glu Asn Val}
\sac{Ile His Leu Pro Gly Gln Arg Ser His Phe Gln
Arg Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 129 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Pro Gly Trp Arg Arg Pro Thr Thr Leu Tyr
Pro Trp Arg Arg Ala}
\sac{Pro Ala Leu Ser Arg Val Arg Arg Ala Trp Val
Ile Pro Pro Ile Ser}
\sac{Val Ser Glu Asn His Lys Arg}
Claims (9)
1. Péptido designado como Cadherin Derived Growth
Factor (CDGF), caracterizado porque se trata de un péptido
que se escinde como pro- secuencia durante el procesamiento de la
pro-cadherina en cadherina o de un fragmento del
mismo, y porque el péptido o el fragmento tiene un efecto de
proliferación celular sobre osteoblastos primarios de calvarias de
rata, y/o de protección celular y/o de diferenciación celular sobre
cultivos de células nerviosas primarias de ganglios de la radícula
dorsal de embriones de gallina, y porque presenta una de las
secuencias
Cadherina-1 humana
(28-154):
- CHPGFDAESYTFTVPRRHLERGRVLGRVNFCTGRQRTAYFSLDTRFKVGTDGVITVKRPLRFHNPQIHFLVYAWDSTYRKFSTKVTLNGHHHRPPPHQASVSGIQAELLTFPNSSPGLRRQKR
Cadherina-2 humana
(24-159):
- EASGEIALCKTGFPEDVYSAVLSKDVHEGQPLLNVFSNCNGKRKVQYESSEPADFKVDEDGMVYAVRSFPLSSEHAKFLIYAQDKETQEKWQKLSLKPTLTEESVKESAEVEEIVFPRQFSKHSGHLQRQKR
Cadherina-3 humana
(27-107):
- CRAVFREAEVTLEAGGAEQEPGQALGKVFMGQEPALFSTDNDDFTVRNGETVQERRSLKERNPLKIFPSKRILRRHKR
Cadherina-4 humana
(21-169):
- HNEDLTTRETCKAGFSEDDYTALISQNILEGEKLLQVKSSCVGTKGTQYETNSMDFKGADGTVFATRELQVPSEQVAFTVTAWDSQTAEKWDAVLVAQTSSPHSGHKPQKGKKVVALDPSPPPKDTLLPWPQHQNANGLRRRKR
Cadherina-5 humana
(26-47):
- AGANPAQRDTHSLLPTHRRQKR
Cadherina-6 humana
(19-53):
- TLSTPLSKRTSGFPAKKRALELSGNSKNELNRSKR
Cadherina-6 humana
(19-51):
- TLSTPLSKRTSGFPAKKRALELSGNSKNELNRS
Cadherina-8 humana:
- MLLDLWTPLIILWITLPPCIYMAPMNQSQVLMSGSPLELNSLGEEQRILNRSKR
Precursor de Cadherina-B humana
(Cadherina-11) (23-53):
- FAPERRGHLRPSFHGHHEKGKEGQVLQRSKR
- ERRGHLRPSFHGHHEKGKEGQVLQRS (OB-CDGF)
Precursor de cadherina
encefálica-cadherina-C humana
(Cadherina-12) (24-54):
- QPQPQQTLATEPRENVIHLPGQRSHFQRVKR
Precursor de cadherina
encefálica-cadherina-C humana
(Cadherina-12) (24-52):
- QPQPQQTLATEPRENVIHLPGQRSHFQRV
Cadherina-D humana (Cadherina 13)
(23-138):
- EDLDCTPGFQQKVFHINQPAEFIEDQSILNLTFSDCKGNDKLRYEVSSPYFKVNSDGGLVALRNITAVGKTLFVHARTPHAEFDMAEELVIVGGKDISLQDIFKFARTSPVPRQKRPSVLLLSLFSLACL
o
Cadherina-F humana (Cadherina 14)
(22-60):
- VPGWRRPTTLYPWRRAPALSRVRRAWVIPPISVSENHKR.
2. Ácidos nucleicos que codifican el CDGF de
acuerdo con la reivindicación 1.
3. Ácido nucleico caracterizado porque es
complementario del ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación
2.
4. Vectores que contienen ácidos nucleicos de
acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 2 ó 3.
5. Anticuerpos caracterizados porque están
dirigidos contra CDGF de acuerdo con la reivindicación 1.
6. Medicamentos que contienen CDGF de acuerdo con
la reivindicación 1, ácidos nucleicos de acuerdo con al menos una de
las reivindicaciones 2 ó 3 y/o anticuerpos de acuerdo con la
reivindicación 5 junto con coadyuvantes usuales.
7. Medios de diagnóstico que contienen CDGF de
acuerdo con la reivindicación 1, ácidos nucleicos de acuerdo con al
menos una de las reivindicaciones 2 ó 3 y/o anticuerpos de acuerdo
con la reivindicación 5 junto con coadyuvantes usuales.
8. Medicamentos de acuerdo con la reivindicación
6 en forma de preparaciones galénicas adecuadas para la
administración por vía oral, intravenosa, intramuscular,
intracutánea, intratecal, así como en aerosol para la aplicación
transpulmonar.
9. Procedimientos para la preparación de CDGF de
acuerdo con la reivindicación 1,
- a partir de hemofiltrado por extracción de
intercambio de cationes con posterior elución de las sustancias
adsorbidas, una nueva cromatografía por intercambio de cationes del
extracto que contiene los péptidos, así como una cromatografía en
fase inversa de varias etapas, o
- por síntesis en fase sólida en el sentido de la
síntesis de Merrifield, así como síntesis en fase líquida según
métodos en sí conocidos por el especialista con aminoácidos
protegidos y purificación, o
- por procedimientos de expresión heteróloga en
sí conocidos por el especialista mediante vectores biotecnológicos
convencionales de acuerdo con la reivindicación 5.
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