ES2325485T3 - Metodos para identificar compuestos para regular la masa o la funcion muscular utilizando receptores del factor liberador de corticotropina. - Google Patents

Abstract

Un método para identificar compuestos candidatos para regular la masa o la función del músculo esquelético, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto in vitro un compuesto experimental con un receptor 2 del factor liberador de corticotropina (CRF 2R) o una célula que expresa un CRF 2R funcional; (b) determinar si el compuesto experimental se une o activa el CRF2R; y (c) seleccionar aquellos compuestos que se unen a CRF2R y determinar además si el compuesto experimental regula la masa o la función del músculo esquelético en un modelo de cultivo celular de atrofia del músculo esquelético y/o en un animal no humano.

Description

Métodos para identificar compuestos para regular la masa o la función muscular utilizando receptores del factor liberador de corticotropina.

Campo técnico

La presente invención se refiere a métodos para identificar compuestos candidatos para regular la masa o la función del músculo esquelético. La invención también se refiere a ciertos compuestos para ser utilizados para fabricar un medicamento para el tratamiento de la atrofia del músculo esquelético utilizando CRF_{2}R como objetivo para la intervención.

Antecedentes CRFR y ligandos

Hasta ahora se han identificado dos receptores del factor liberador de corticotropina (CRF_{1}R y CRF_{2}R) que pertenecen a la clase de receptores acoplados a proteínas G (GPCR). La activación agonista de los CRF_{1}R o CRF_{2}R produce la activación G_{alfas} de la adenilatociclasa. La adenilatociclasa cataliza la formación de AMPc que, a su vez, tiene múltiples efectos incluida la activación de la proteína quinasa A, la liberación de calcio intracelular y la activación de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK). En otros estudios, la mejora de la síntesis del inositol trifosfato intracelular, tras la activación agonista de receptores del CRF, sugiere que los CRFR también se acoplan a G_{\alpha q}.

Se han clonado CRF_{1}R y CRF_{2}R de humanos, ratas, ratones, pollos, vacas, bagres, ranas y ovejas. Cada CRF_{1}R y CRF_{2}R tiene un único patrón de distribución. En los seres humanos se han clonado tres isoformas, alfa, beta y gamma, del receptor CRF_{2}R. Se han identificado homólogos de CRF_{2}R alfa y beta en ratas.

Se conocen varios ligandos/agonistas de los CRFR. El factor liberador de corticotropina (o hormona, CRF o CRH) se une y activa CRF_{1}R y CRF_{2}R. El CRF es un modulador principal de las respuestas corporales frente al estrés. Este péptido de 41 aminoácidos preside una serie de procesos neuronales, endocrinos e inmunológicos como regulador principal del eje hormonal hipotálamo-hipofisario-suprarrenal (eje HPA). Además, existe una importante homología de secuencia entre el CRF y el péptido sauvagina presente en los anfibios así como el péptido urotensina presente en los peces teleósteos, actuando ambos como agonistas de CRF_{1}R y CRF_{2}R. Estos tres péptidos tienen propiedades biológicas similares como agentes hipotensores y secretagogos de ACTH. Además, se ha identificado un congénere de mamífero de la urotensina, la urocortina.

Farmacológicamente, los receptores del CRF se pueden distinguir de los no CRFR a través del uso de agonistas y antagonistas selectivos del receptor. Estos agonistas y antagonistas selectivos, junto con los ratones a los que se les ha eliminado el CRFR (knockout, KO o transgénicos), han sido útiles para determinar el receptor CRF que media las respuestas biológicas específicas.

El papel del CRF_{1}R se encuentra bastante bien estudiado. Los ratones con eliminación del gen CRF_{1}R (knockout de CRF_{1}R) presentan una respuesta al estrés disminuida y un reducido comportamiento ansiogénico. El CRF_{1}R es un mediador principal del eje HPA. En particular, el factor liberador de corticotropina, que es liberado por el hipotálamo y transportado a la pituitaria anterior a través del sistema portal hipotalámico-hipofisiario, interactúa con el CRF_{1}R presente en las células situadas en la pituitaria anterior. La activación agonista del CRF_{1}R da lugar a la liberación de ACTH de las células de la pituitaria anterior a la circulación sistémica. La ACTH liberada se une al receptor de la ACTH presente en las células situadas en la corteza suprarrenal produciendo la liberación de hormonas suprarrenales, incluidos los corticosteroides. Los corticoesteroides median muchos efectos incluyendo, aunque no de forma limitativa, la supresión del sistema inmunológico a través de un mecanismo que implica una atrofia tímica y esplénica. Así, la activación del CRF_{1}R produce indirectamente la regulación por disminución del sistema inmunológico a través de la activación del eje HPA.

El papel del CRF_{2}R ha sido mucho menos estudiado. Los ratones en los que se ha eliminado el gen de CRF_{2}R (knockout de CRF_{2}R) muestran una menor ingesta de alimento después de la estimulación con urocortina y una falta de vasodilatación aunque una respuesta al estrés normal. Los experimentos con CRF_{2}R demuestran que el CRF_{2}R es responsable de los efectos hipotensores/vasodilatadores de los agonistas del CRFR y de la menor ingesta de alimentos observada tras el tratamiento de ratones con agonistas del CRFR.

Métodos para detectar compuestos que se unen a CRF_{2}R se describen, p. ej., en WO 95/34651. En US-A-5.869.450 se describen análogos de CRF útiles como agentes antiinflamatorios con selectividad por el receptor pero no se sugiere su uso para tratar la atrofia muscular.

Atrofia e hipertrofia del músculo esquelético

El músculo esquelético es un tejido plástico que se adapta fácilmente a los cambios en caso de demanda fisiológica de trabajo o necesidad metabólica. La hipertrofia se refiere a un incremento de la masa del músculo esquelético mientras que la atrofia del músculo esquelético se refiere a una disminución de la masa de músculo esquelético. La atrofia del músculo esquelético aguda se puede deber a diversas causas incluyendo, aunque no de forma limitativa: falta de uso debido a cirugía, reposo en cama o rotura de huesos; desnervación/daño nervioso debido a lesión de la médula espinal, enfermedad autoinmune o enfermedad infecciosa; uso de glucocorticoides para condiciones no relacionadas; septicemia debida a infecciones u otras causas; limitación de nutrientes debido a enfermedad o inanición; y viaje espacial. La atrofia del músculo esquelético se produce por procesos biológicos normales aunque, en ciertas situaciones médicas, este proceso biológico normal da lugar a un nivel debilitante de la atrofia muscular. Por ejemplo, la atrofia del músculo esquelético aguda presenta una limitación significativa para la rehabilitación de pacientes inmovilizados incluyendo, aunque no de forma limitativa, las inmovilizaciones relacionadas con un procedimiento ortopédico. En tales casos, el período de rehabilitación necesario para corregir la atrofia del músculo esquelético es a menudo mayor que el período de tiempo necesario para reparar la lesión original. Dicha atrofia por falta de uso aguda es un problema especial en las personas mayores que pueden sufrir ya de déficits básicos relacionados con la edad en la función y la masa muscular, porque dicha atrofia puede conducir a incapacidad permanente y mortalidad
prematura.

La atrofia del músculo esquelético también puede dar lugar a condiciones crónicas como caquexia cancerosa, inflamación crónica, caquexia por SIDA, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), insuficiencia cardiaca congestiva, trastornos genéticos, p. ej. distrofias musculares, enfermedades neurodegenerativas y sarcopenia (pérdida muscular asociada con la edad). En estas condiciones crónicas, la atrofia del músculo esquelético puede conducir a una pérdida prematura de movilidad, añadiéndose por tanto a la morbilidad relacionada con enfermedades.

Se sabe poco con respecto a los procesos moleculares que controlan la atrofia o la hipertrofia del músculo esquelético Aunque el disparador inicial de la atrofia del músculo esquelético es diferente para los diversos eventos iniciadores de atrofia, se producen varios cambios bioquímicos comunes en la fibra de músculo esquelético afectada, incluido un descenso de la síntesis de proteínas y un aumento de la degradación de proteínas, y cambios en las isoenzimas de proteínas enzimáticas contráctiles y metabólicas característicos de un intercambio muscular lento (metabolismo muy oxidante/isoformas de proteínas contráctiles lentas) a rápido (metabolismo muy glicolítico/isoformas de proteínas contráctiles rápidas). Los cambios adicionales que se producen en el músculo esquelético incluyen la pérdida de vasculatura y la regeneración de la matriz extracelular. Tanto el músculo de contracción lenta como el de contracción rápida muestran atrofia en las condiciones apropiadas, dependiendo la pérdida muscular relativa de los estímulos o condiciones de atrofia específicos. En gran medida, todos estos cambios se regulan de forma coordinada y se activan o desactivan en función de las necesidades fisiológicas y metabólicas.

Los procesos por los que se produce una atrofia o hipertrofia se mantienen en las especies de mamíferos. Muchos estudios han demostrado que durante la atrofia se producen los mismos procesos moleculares, celulares y fisiológicos tanto en los roedores como en los seres humanos. Por tanto, los modelos de atrofia del músculo esquelético en roedores se han utilizado con éxito para comprender y predecir respuestas de la atrofia en los seres humanos. Por ejemplo, la atrofia inducida por diversos medios tanto en roedores como en los seres humanos produce cambios similares en la anatomía muscular, la sección transversal, el funcionamiento, el tipo de fibra de intercambio, la expresión de las proteínas contráctiles y la histología. Además, se ha demostrado que diversos agentes regulan la atrofia del músculo esquelético en roedores y seres humanos. Estos agentes incluyen esteroides anabólicos, hormona del crecimiento, factor de crecimiento I tipo insulina y agonistas beta adrenérgicos. En su conjunto, estos datos demuestran que la atrofia del músculo esquelético se produce por mecanismos comunes en los roedores y en los seres
humanos.

Aunque se ha observado que algunos agentes regulan la atrofia del músculo esquelético y estos han sido aprobados para ser usados en los seres humanos con esta indicación, estos agentes tienen efectos adversos no deseables tales como hipertrofia del músculo cardíaco, neoplasia, hirsutismo, androgenización femenina, aumento de la morbilidad y mortalidad, daño hepático, hipoglicemia, dolor musculoesquelético, aumento del turgor de los tejidos, taquicardia y edema. Actualmente, no existen tratamientos muy eficaces y selectivos para la atrofia del músculo esquelético aguda o crónica. Por consiguiente, existe la necesidad de identificar otros agentes terapéuticos para regular la atrofia del músculo esquelético.

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Distrofias musculares

Las distrofias musculares abarcan un grupo de trastornos musculares hereditarios y progresivos que se distinguen clínicamente por la distribución selectiva de la debilidad del músculo esquelético. Las dos formas más comunes de distrofia muscular son las distrofias de Duchenne y la de Becker, que resultan de la herencia de una mutación del gen de la distrofina, que está situado en el locus Xp21. Otras distrofias incluyen, aunque no de forma limitativa, distrofia muscular de la cintura pélvica originada por la mutación de múltiples loci genéticos, incluidos los loci de la calpaína p94, adhalina, \gamma-sarcoglucano y \beta-sarcoglucano; distrofia muscular fascioescapulohumeral (Landouzy-Dejerine), distrofia miotónica y distrofia muscular de Emery-Dreifuss. Los síntomas de la distrofia muscular de Duchenne, que se observa casi exclusivamente en hombres, incluyen marcha de pato, marcha en puntillas, lordosis, caídas frecuentes y dificultad para estar de pie y subir escaleras. Los síntomas comienzan a la edad de 3 a 7 años y la mayoría de los pacientes se ven confinados a una silla de ruedas al cabo de 10-12 años, falleciendo muchos de ellos aproximadamente a los 20 años debido a complicaciones respiratorias. El tratamiento actual de la distrofia muscular de Duchenne incluye la administración de prednisona (un corticosteroide) que, aunque no cura, ralentiza la disminución de la fuerza muscular y retrasa la incapacidad. Se cree que los corticosteroides, tales como la prednisona, actúan bloqueando la activación e infiltración celular inmune aceleradas por los daños en las fibras musculares producidos por la enfermedad. Desgraciadamente, el tratamiento con corticosteroides también produce atrofia del músculo esquelético contrarrestando algunas de las ventajas potenciales del bloqueo de la respuesta inmune de estos pacientes. Por consiguiente, existe la necesidad de identificar agentes terapéuticos que ralenticen el daño de la fibra muscular y retarden la aparición de la incapacidad en pacientes con distrofias musculares y causen un menor grado de atrofia del músculo esquelético que los tratamiento actuales.

Un problema asociado con la identificación de compuestos para usar en el tratamiento de la atrofia del músculo esquelético o de distrofias musculares ha sido la falta de métodos de selección buenos para identificar estos compuestos. Los solicitantes han descubierto ahora que los CRF_{2}R están implicados en la regulación de la masa o la función del músculo esquelético y que agonistas de los CRF_{2}R pueden bloquear la atrofia del músculo esquelético y/o inducir hipertrofia del músculo esquelético. La presente invención resuelve el problema de identificar compuestos para el tratamiento de la atrofia muscular proporcionando métodos de selección con CRF_{2}R que pueden utilizarse para identificar compuestos candidatos útiles para el tratamiento de la atrofia muscular. La presente invención también resuelve el problema de encontrar compuestos para el tratamiento de distrofias musculares proporcionando un método de detección para identificar compuestos candidatos que activen el CRF_{1}R y el CRF_{2}R.

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Sumario de la invención

La presente invención se refiere al uso de CRFR para identificar compuestos candidatos posiblemente útiles para tratar la atrofia del músculo esquelético y/o para inducir la hipertrofia del músculo esquelético. En particular, la invención proporciona métodos in vitro para identificar compuestos candidatos para regular la masa o la función del músculo esquelético que comprenden poner en contacto un compuesto experimental con una célula que expresa CRF_{2}R, o poner en contacto un compuesto experimental con CRF_{2}R aislado, y determinar si el compuesto experimental se une o activa el CRF_{2}R. Otra realización de la invención se refiere a un método para identificar compuestos candidatos terapéuticos de un grupo de uno o más compuestos candidatos conocidos por unir o activar el CRF_{2}R que comprende administrar el compuesto candidato a un animal no humano y determinar si el compuesto candidato regula la masa del músculo esquelético o la función muscular en el animal tratado.

Otra realización de la invención se refiere a un método para identificar compuestos candidatos para regular la masa o la función del músculo esquelético que comprende, en cualquier orden: (i) poner en contacto un compuesto experimental con una célula que expresa un CRF_{2}R funcional y determinar el nivel de activación del CRF_{2}R producido por el compuesto experimental; (ii) poner en contacto un compuesto experimental con una célula que expresa un CRF_{1}R funcional y determinar el nivel de activación del CRF_{1}R producido por el compuesto experimental; (iii) comparar el nivel de activación del CRF_{2}R y el nivel de activación del CRF_{1}R; e (iv) identificar aquellos compuestos experimentales que muestran similar actividad hacia CRF_{2}R y CRF_{1}R o muestran selectividad por CRF_{2}R como compuestos candidatos para regular la masa o la función del músculo esquelético.

La presente invención también se refiere al uso de compuestos, como se describe en las reivindicaciones 6 y 7, para fabricar un medicamento para tratar la atrofia del músculo esquelético.

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Descripción de la lista de secuencias

En la Tabla I se muestra cada una de las secuencias de nucleótidos y proteínas del CRFR o las secuencias de proteínas de análogos de CRF incluidas en la lista de secuencias, junto con sus correspondiente(s) número(s) de registro Genbank o Derwent y las especies animales de las que se han clonado. También se muestran los números de registro de las secuencias de nucleótidos relacionadas que codifican secuencias de aminoácidos idénticas, o casi idénticas, como la secuencia mostrada en la lista de secuencias. Estas secuencias relacionadas difieren principalmente en la cantidad de secuencias 5' o 3' no traducidas mostradas.

TABLA I

1

2

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra el efecto anti-atrofia del agonista de CRF_{1}R/CRF_{2}R, sauvagina (administrada por vía subcutánea, 2 veces al día), en el músculo gemelo medio en el modelo de atrofia por desnervación del nervio ciático de ratón.

La Fig. 2 muestra el efecto anti-atrofia de la sauvagina (administrada continuamente con minibomba osmótica) en el músculo tibial anterior en el modelo de atrofia por desnervación del nervio ciático de ratón.

Las Figs. 3A y 3B muestran el efecto anti-atrofia de la sauvagina (administrada continuamente con minibomba osmótica) en la atrofia inducida por glucocorticoides del músculo tibial anterior (Fig 3A) y el músculo gemelo medio (Fig 3B).

La Fig 4A muestra el efecto anti-atrofia de la sauvagina (administrada por vía subcutánea, 2 veces al día) en la atrofia inducida por escayolado del músculo tibial anterior y el efecto inductor de hipertrofia en el músculo tibial anterior no escayolado (normal). La Fig 4B muestra el efecto anti-atrofia de la sauvagina en la atrofia inducida por escayolado del músculo gemelo medio y el efecto inductor de hipertrofia de la sauvagina sobre el músculo gemelo medio no escayolado (normal).

La Fig. 5 muestra los efectos anti-atrofia e inductores de hipertrofia de la sauvagina y la urocortina (administradas continuamente con minibomba osmótica) en el músculo tibial anterior en el modelo de atrofia inducida por desnervación del nervio ciático de ratón.

Las Figs. 6A y 6B muestran los efectos anti-atrofia de la urocortina (administrada por vía subcutánea, 2 veces al día) en la atrofia del músculo tibial anterior (Fig 6A) y del músculo gemelo medio (Fig 6B) inducida por falta de uso.

La Fig. 7 muestra el efecto anti-atrofia de la sauvagina (administrada por vía subcutánea, 2 veces al día), en el modelo de atrofia inducida por desnervación del nervio ciático de rata adrenalectomizada, atrofia de los músculos tibial anterior (Fig. 7A), extensor digital largo (EDL) (Fig. 7B), sóleo (Fig. 7C) y gastrocnemio medio (Fig. 7D) inducida por desnervación. Además, la hipertrofia inducida por sauvagina del músculo EDL no denervado (Fig. 7B).

La Fig. 8 muestra que en el modelo de atrofia por desnervación del nervio ciático de ratón, la sauvagina (administrada continuamente con minibomba osmótica) presentó un efecto anti-atrofia en el músculo tibial anterior en ratones salvajes pero no en ratones KO en los que se había eliminado el CRF_{2}R.

Las Figs. 9A y B muestran que en un modelo de atrofia por falta de uso de pata escayolada de ratón, la sauvagina presentó un efecto anti-atrofia en el EDL y en el sóleo medido en la masa (Fig 9A) o la función muscular (Fig 9B).

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Descripción detallada de la invención I. Expresiones y definiciones

La siguiente es una lista de definiciones de las expresiones utilizadas en la presente memoria.

Por "agonista" se entiende cualquier compuesto incluyendo, aunque no de forma limitativa, anticuerpos, que activa un receptor. Por ejemplo, los agonistas del CRFR incluyen, aunque no de forma limitativa, CRF y análogos de CRF.

La expresión "variante alélica" significa una forma de variante de un determinado gen o producto génico. El experto en la técnica reconocerá que un gran número de genes están presentes en dos o más formas alélicas en una población y algunos genes tienen numerosos alelos.

El término "Anticuerpo", en sus diversas formas gramaticales, significa moléculas de inmunoglobulina y partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión de antígenos que une específicamente un antígeno. El término "anticuerpo purificado" significa un anticuerpo que ha sido parcial o totalmente separado de las proteínas y moléculas orgánicas naturales con las que está asociado de forma natural. Preferiblemente, la preparación tiene al menos 60% de anticuerpo, más preferiblemente al menos 75% de anticuerpos, más preferiblemente al menos 90% de anticuerpos, y con máxima preferencia al menos 99%, en peso seco, de anticuerpos.

El término "afinidad de unión" significa la tendencia de un ligando a interactuar con un receptor y está inversamente relacionada con la constante de disociación de una interacción específica de ligando del CRF-CRFR. La constante de disociación se puede medir directamente mediante técnicas estándar de unión por saturación, competencia o cinética o indirectamente mediante técnicas farmacológicas que implican ensayos funcionales y puntos finales.

El término "anticuerpo quimérico" significa un anticuerpo que contiene elementos estructurales de dos o más moléculas de anticuerpos diferentes, es decir, de especies animales diferentes. Los anticuerpos quiméricos incluyen, aunque no de forma limitativa, los anticuerpos conocidos como "anticuerpos humanizados" que incluyen, aunque no de forma limitativa, anticuerpos quiméricos generados mediante la técnica conocida como injerto de regiones determinantes de la complementariedad.

El término "CRF" significa factor liberador de corticotropina que es igual que hormona liberadora de corticotropina (CRH). Los péptidos CRF ilustrativos incluyen CRF r/h y CRF ovinos (véase la patente US-4.415.558), y similares.

El término "análogo de CRF" significa sustancias que actúan como ligandos de los CRFR. Se pueden obtener análogos de CRF adecuados de diversas especies de vertebrados incluidos, aunque no de forma limitativa, sustancias tales como la sauvagina (véase, p. ej., la patente US-4.605.642), la urotensina (véanse, p. ej., las patentes US-4.908.352; y US-4.533.654), la urocortina II de ratón (SEC. ID N.º: 43), el péptido humano relacionado con la urocortina (SEC. ID N.º:44) (Reyes, T.M. y col., Proc. Nat'l Acad Sci 98:2843-2848 (2001)), la urocortina (ver, p. ej., WO 97/00063) y los análogos de CRF descritos en las patentes US-4.415.558; US-4.489.163; US-4.594.329; US-4.605.642; US-5.109.111; US-5.235.036; US-5.278.146; US-5.439.885; US-5.493.006; US-5663292; US-5.824.771; US-5.844.074; y US-5.869.450. Los análogos de CRF preferidos son sauvagina, urocortina, péptidos relacionados con la urocortina, urocortina-II y urotensina.

El término "agonista de CRFR" significa un compuesto o molécula que tiene la capacidad de activar al CRF_{1}R o al CRF_{2}R, o a ambos. La activación del CRFR puede medirse como se describe a continuación.

"CRFR" significa los CRF_{1}R o CRF_{2}R.

"CRF_{1}R" significa cualquier isoforma del CRF_{1}R de cualquier especie animal. El CRF_{1}R ha sido designado anteriormente como CRF-RA, PC-CRF, CRF, (Perrin, M.H. y col. Endocrinology 133:3058-3061 [1993], Chen, R. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8967-8971 [1993], Chang, C-P. y col., Neuron 11:1187-1195 [1993], Kishimoto, T. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1108-1112 [1995] y Vita, N. y col., FEBS Lett. 335: 1-5 [1993]) o el receptor de la CRH.

La definición del CRF_{1}R incluye, aunque no de forma limitativa, aquellos receptores para los que la secuencia de ADNc o genómica que codifica el receptor ha sido depositada en una base de datos de secuencias. Estas secuencias incluyen los números de registro: X72304, E11431, L23332, I92584, T37068, T28968, Q81952, L23333, NM 004382, AF180301, T28970, L25438, L24096, I92586, Q81954, AH006791, NM_007762, X72305, AF054582, Y14036, AF229359, AF229361, AB055434 y L41563. Las secuencias de nucleótidos y proteínas de estos receptores son comercializadas por GenBank o Derwent y por comodidad de uso se presentan secuencias representativas en la lista de secuencias de la presente memoria.

"CRF_{2}R" significa cualquier isoforma del CRF_{2}R de cualquier especie animal. El CRF_{2}R ha sido también denominado HM-CRF, CRF-RB, (Kishimoto, T. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1108-1112 [1995] y Perrin, M. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2969-2973 [1995]).

La definición del receptor CRF_{2}R incluye, aunque no de forma limitativa, aquellos receptores para los que la secuencia del ADN que codifica el receptor ha sido depositada en una base de datos de secuencias. Estas secuencias incluyen los números de registro: U34587, E12752, NM_001883, T12247, T66508, AF011406, AF019381, U16253, T12244, T28972, U17858, NM 009953, Y14037 y AF229360. Las secuencias de nucleótidos y proteínas de estos receptores son comercializadas por GenBank o Derwent y para mayor comodidad de uso se presentan secuencias representativas en la lista de secuencias de la presente memoria.

El término "CRFR" también incluye proteínas truncadas y/o mutadas en donde se han eliminado o modificado regiones de la molécula receptora que no son necesarias para la unión o señalización del ligando. Por ejemplo, el experto en la técnica reconocerá que un CRFR con uno o más cambios conservadores en la secuencia principal de aminoácidos sería útil en la presente invención. Es conocido en la técnica que la sustitución de ciertos aminoácidos por otros aminoácidos con estructuras o propiedades similares (sustituciones conservadoras) puede producir un cambio silencioso, es decir, un cambio que no altera significativamente la funcionalidad. Los sustitutos conservadores son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, es conocido que los GPCR pueden tolerar la sustitución de residuos de aminoácidos en las hélices alfa transmembrana, que están orientadas a lípido, por otros aminoácidos hidrófobos manteniendo su funcionalidad. Los CRF_{1}R que difieren de una secuencia natural por truncaciones y/o mutaciones tales como sustituciones conservadoras de aminoácido también están incluidos en la definición de CRF_{1}R. Los CRF_{2}R que difieren de una secuencia natural en truncaciones y/o mutaciones tales como sustituciones conservadoras de aminoácido también están incluidos en la definición de CRFR_{2}.

El experto en la técnica también reconocerá que los CRFR de un tipo diferente a los antes mencionados, especialmente de tipo mamífero, serían útiles en la presente invención. El experto en la técnica también reconocerá que mediante el uso de sondas de las secuencias del tipo CRFR conocido podrían obtenerse ADNc o secuencias genómicas homólogas a la secuencia conocida a partir de la misma especie o de otra especie mediante métodos de clonación conocidos. Estos CRF_{1}R también están incluidos en la definición de CRF_{1}R y estos CRF_{2}R también están incluidos en la definición de CRF_{2}R.

Además, el experto en la técnica reconocerá que variantes alélicas funcionales o variantes de empalme funcionales de CRFR pueden estar presentes en una determinada especie y que estas variantes serían útiles en la presente invención. Las variantes de empalme de CRFR se describen, por ejemplo, en US-5.888.811; US-5.786.203; y US-5.728545. Estas variantes de CRF_{1}R también están incluidas en la definición de CRF_{1}R y estas variantes de CRF_{2}R también están incluidas en la definición de CRF_{2}R.

Las fusiones de un polipéptido CRF_{1}R o CRF_{2}R, o un fragmento de polipéptido CRF_{1}R o CRF_{2}R a un polipéptido no CRFR reciben el nombre de proteínas de fusión CRFR. Utilizando métodos conocidos, el experto en la técnica sería capaz de preparar proteínas de fusión de un CRF_{1}R o un CRF_{2}R que, aún siendo diferentes de los CRF_{1}R y CRF_{2}R naturales, seguirían siendo útiles en la presente invención. Por ejemplo el polipéptido no CRFR puede ser una secuencia de polipéptidos de señal (o líder) que dirige de forma co-traslacional o post-traslacional la transferencia de la proteína desde su sitio de síntesis a otro sitio (p. ej., el líder del factor á de la levadura). 0 también puede añadirse el polipéptido no CRFR para facilitar la purificación o la identificación del CRFR (p. ej., poli-His, o péptido señal). Las proteínas de fusión CRF_{1}R también están incluidas dentro de la definición de CRF_{1}R y las proteínas de fusión CRF_{2}R también están incluidas dentro de la definición de CRF_{2}R.

La expresión "ruta de transducción de señales del CRF_{2}R" significa cualquier ruta de señalización (p. ej., AMPc, MAP quinasa) o combinación de rutas de señalización que son moduladas por la unión de ligandos endógenos o exógenos a CRF_{2}R.

La expresión "CRFR funcionales" se refiere a CRFR que se unen a CRF o un análogo de CRF in vivo o in vitro y resultan activados como consecuencia de la unión de ligandos.

La expresión "gen de fusión" significa dos o más secuencias codificantes de ADN asociadas operativamente para codificar una proteína híbrida. Una "proteína de fusión" es el producto proteico de un gen de fusión.

El término "inhibir" se refiere al bloqueo parcial o completo de un proceso o actividad determinado. Por ejemplo, un compuesto inhibe la atrofia del músculo esquelético si evita completa o parcialmente la atrofia muscular.

En la presente memoria, se dice que dos secuencias de ADN están "operativamente asociadas" si el tipo de unión entre las dos secuencias de ADN (1) no tiene como consecuencia la introducción de una mutación por cambio de marco, (2) no afecta a la capacidad de una región promotora para dirigir la transcripción de las secuencias codificantes o (3) no afecta a la capacidad del correspondiente transcrito de ARN de ser traducido a una proteína. Por ejemplo, una secuencia codificante y las secuencias reguladoras están operativamente asociadas cuando están covalentemente unidas de modo que tiene lugar la transcripción de la secuencia codificante bajo la influencia o control de las secuencias reguladoras. Por consiguiente, una región promotora está operativamente asociada con una secuencia codificante cuando la región promotora es capaz de realizar la transcripción de esta secuencia de ADN de manera que el transcrito resultante sea capaz de ser traducido en la proteína o el polipéptido deseado.

La expresión "porcentaje de identidad" significa el porcentaje de nucleótidos o aminoácidos que tienen dos secuencias en común, calculado de la forma siguiente: Para calcular el porcentaje de identidad de una secuencia específica (la secuencia problema), se compara la parte relevante de la secuencia problema con una secuencia de referencia utilizando el programa informático de comparación de máximo ajuste Wisconsin Package, versión 10.1, comercializado por Genetics Computer Group, Inc. Este programa utiliza el algoritmo de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics, versión 2: 482-489 (1981). El porcentaje de identidad se calcula con los siguientes parámetros por defecto para el programa de máximo ajuste: la matriz de puntuación es blosum62.cmp, la penalización de introducción de hueco es 8 y la penalización de extensión de hueco es 2. Cuando se compara una secuencia con la secuencia de referencia, la parte relevante de la secuencia problema es aquella que se deriva de una secuencia de CRFR. Por ejemplo, si la consulta es un CRFR/proteína de fusión con etiqueta de purificación, sólo se alinea la parte de polipéptido de CRFR de la secuencia para calcular la puntuación de porcentaje de identidad.

El término "polipéptido" significa cualquier cadena de aminoácidos, independientemente de la longitud o modificación postraduccional (p. ej., fosforilación o glicosilación).

El término "promotor" significa una secuencia de ADN que controla el inicio de la transcripción y la velocidad de transcripción de un gen o región codificadora.

La expresión "tratamiento profiláctico" significa el tratamiento preventivo de un sujeto que actualmente no presenta signos de atrofia del músculo esquelético para bloquear total o parcialmente la ocurrencia de la atrofia del músculo esquelético. El experto en la técnica reconocerá que ciertas personas tienen riesgo de atrofia del músculo esquelético, como se describe en la sección Antecedentes de la invención de la presente memoria. Además, el experto en la técnica reconocerá que si los cambios bioquímicos que producen una atrofia del músculo esquelético son adecuadamente regulados, la ocurrencia de la atrofia puede ser evitada o reducida en las personas con riesgo de sufrirla. Por ejemplo, los pacientes con distrofia muscular que inician un tratamiento con corticoesteroides tienen riesgo de desarrollar atrofia del músculo esquelético, lo que indica que el tratamiento profiláctico en estos pacientes sería
apropiado.

El término "regular", en todas sus formas gramaticales, significa aumentar, reducir o mantener, es decir regular la masa o la función del músculo esquelético significa aumentar, reducir o mantener el nivel de masa o función del músculo esquelético.

La expresión "regulación de la masa o de la función del músculo esquelético" incluye regular la masa del músculo esquelético, la función del músculo esquelético o ambos.

La expresión "elemento regulatorio" significa una secuencia de ADN capaz de controlar el nivel de transcripción de una secuencia de ADN operativamente asociada. Incluidos dentro de esta definición de elemento regulatorio se encuentran los promotores y los potenciadores. P. ej., un elemento regulatorio del gen de CRFR es una secuencia de ADN capaz de controlar el nivel de transcripción del gen de CRFR.

La expresión "gen indicador" significa una secuencia codificante cuyo producto puede ser detectado, preferiblemente cuantitativamente, en donde el gen indicador está operativamente asociado con un elemento promotor o potenciador heterólogo que responde a una señal que debe ser medida. El elemento promotor o potenciador en este contexto se menciona en la presente memoria como "elemento sensible".

La expresión "agonista selectivo" significa que el agonista tiene una actividad significativamente mayor hacia cier-
to(s) receptor(es) que hacia otros receptores pero no que es completamente inactivo con respecto a otros receptores.

La expresión "hipertrofia del músculo esquelético" significa un aumento de la masa del músculo esquelético o de la función del músculo esquelético o de ambas.

La expresión "atrofia del músculo esquelético" significa lo mismo que "desgaste muscular" y significa una reducción de la masa del músculo esquelético o de la función del músculo esquelético o de ambos.

La expresión "variante de empalme" significa un ARNm o proteína producida por el uso alternativo de exón. El experto en la técnica reconocerá que, dependiendo del tipo celular, o incluso dentro de un único tipo celular, un ARNm puede ser expresado en una forma diferente como una variante de empalme y, por consiguiente la proteína traducida será diferente en función del ARNm expresado.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" de una sustancia es una cantidad capaz de producir un resultado médicamente deseable en un paciente tratado, p. ej., reducir la atrofia del músculo esquelético, aumentar la masa del músculo esquelético o aumentar la función del músculo esquelético con una relación beneficio: riesgo aceptable y en un ser humano o un mamífero no humano.

La expresión "tratamiento terapéutico" significa el tratamiento de un sujeto en el cual resulta deseable aumentar la masa muscular o la función muscular. Por ejemplo, el tratamiento de un sujeto que actualmente presenta signos de atrofia del músculo esquelético para invertir parcial o totalmente la atrofia del músculo esquelético existente o para impedir total o parcialmente la ocurrencia de una atrofia adicional del músculo esquelético sería un tratamiento terapéutico para este sujeto. La expresión "tratamiento terapéutico" también incluye, por ejemplo, el tratamiento de un sujeto que no presenta signos de atrofia del músculo esquelético para inducir una hipertrofia del músculo esquelético, p. ej., el tratamiento de ganado para aumentar su masa muscular.

El término "tratamiento" significa un tratamiento profiláctico o terapéutico.

Salvo que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados tienen el mismo significado que el habitualmente entendido por un experto en la técnica de la química de proteínas, farmacología o biología molecular. No está previsto que los métodos, materiales y ejemplos descritos en la presente memoria sean limitativos. Otros métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria se pueden usar en la práctica o para ensayos de la presente invención.

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II. El papel de los CRFR para regular la masa del músculo esquelético

El experto en la técnica reconocerá la utilidad de la presente invención con la información según el estado de la técnica y la descripción siguiente. Los resultados descritos en la presente memoria muestran que la administración de un agonista del receptor CRF que activa CRF_{1}R y CRF_{2}R (agonista no selectivo de CRFR) bloquea y/o inhibe la atrofia del músculo esquelético induciendo un efecto de desnervación, falta de uso o tratamiento con dexametasona en modelos de atrofia del músculo esquelético. Además, los datos muestran que los agonistas del CRFR no muestran este efecto anti-atrofia en aquellos ratones a los que les ha sido eliminado el CRF_{2}R. También, en ratas en las que se ha interrumpido el eje HPA mediado por CRF_{1}R extirpando las glándulas suprarrenales (adrenalectomía quirúrgica), el tratamiento de estos animales con los agonistas no selectivos del CRFR muestra un efecto anti-atrofia que indica que el CRF_{2}R media los efectos anti-atrofia. Además, los resultados muestran que la administración de un agonista no selectivo de CRFR presenta un efecto inductor de hipertrofia. En conjunto, estos datos demuestran el papel modulador del CRF_{2}R en el proceso de atrofia del músculo esquelético. El papel específico de los CRFR in vivo se investigó utilizando los agentes farmacológicos sauvagina (Bachem Biosciences, Inc. King de Prussia, PA) y urocortina (Bachem Biosciences, Inc)., que son agonistas selectivos del CRFR, en diferentes modelos de atrofia del músculo esquelético descritos a continuación. Estos agentes han sido bien identificados y se encuentran descritos en la bibliografía científica.

Las figuras 1-7 y 9 muestran los resultados de experimentos que demuestran que la administración de agonistas selectivos de CRFR produce una inhibición estadísticamente significativa de la atrofia del músculo esquelético. La Figura 8 muestra que el efecto anti-atrofia del agonista de CRFR sauvagina está mediado a través de CRF_{2}R. Los agonistas del CRFR administrados 2 veces al día junto con el inhibidor de la fosfodiesteresa teofilina produjo una inhibición de la atrofia del músculo esquelético en modelos animales de atrofia del músculo esquelético. Se añadió teofilina para potenciar la duración y la magnitud de la acción del agonista de CRFR produciendo una mayor eficacia de estos compuestos. La teofilina administrada sola en estos modelos de atrofia no tuvo ningún efecto, demostrando así que el efecto anti-atrofia conseguido por el agonista de CRFR junto con la teofilina se debía al efecto del agonista de CRFR. Además, la dosificación continua del agonista de CRFR en ausencia de teofilina, mediante minibomba osmótica, también produjo una inhibición de la atrofia del músculo esquelético y/o una hipertrofia del músculo esquelético. La significación estadística de los resultados se determinó con ANCOVA (Douglas C. Montgomery, Design and Analysis of Experiments, John Wiley and Sons, Nueva York (2^{nd} ed. 1984)). Abreviaturas utilizadas en las figuras 1-9: g=gramo; EEM=error estándar de la media.

En particular, la Figura 1 (Fig. 1) muestra que la sauvagina inhibe la atrofia inducida por desnervación del músculo gemelo medio en un modelo de atrofia por desnervación del nervio ciático de ratón. Leyenda: A - solución salina fisiológica (control); B - sauvagina (0,01 mg/kg) + teofilina; C - sauvagina (0,03 mg/kg) + teofilina; D - sauvagina (0,1 mg/kg) + teofilina; E - sauvagina (1,0 mg/kg) + teofilina; * - p\leq 0,05 comparado con la solución salina. Tras la desnervación del nervio ciático derecho, a los ratones machos se les inyectó sauvagina por vía subcutánea en la región medioescapular 2 veces al día a las dosis indicadas anteriormente o control (solución salina fisiológica) durante nueve días. La sauvagina se administró junto con 30 mg/kg de teofilina. El día nueve se extirpó y pesó el músculo gemelo medial para determinar el grado de atrofia.

La Figura 2 (Fig. 2). muestra que la sauvagina inhibe la atrofia del músculo tibial anterior inducida por desnervación en un modelo de atrofia por desnervación del nervio ciático de ratón. Leyenda: A - agua (control); B - sauvagina (0,1 mg/kg/d); C - sauvagina (0,3 mg/kg/d); D - sauvagina (1,0 mg/kg/d); * - p\leq 0,05 con respecto al agua. Tras la desnervación del nervio ciático derecho, a los ratones machos se les administró sauvagina o control (solución salina fisiológica) mediante infusión continua utilizando una minibomba osmótica Alzet a 5 \mul/h hasta finalizar el período experimental (sin teofilina adicional). La dosis diaria de sauvagina administrada fue la indicada anteriormente. La implantación de la minibomba se realizó en el momento de la desnervación del nervio ciático. El día nueve se extirpó el músculo tibial anterior y se pesó para determinar el grado de atrofia.

La Figura 3 (Fig. 3) muestra que la sauvagina inhibe la atrofia muscular inducida por glucocorticoides del músculo tibial anterior (Fig 3A) y de los músculos del gemelo medial (Fig 3B) en el modelo de atrofia inducida por glucocorticoides de ratón. Leyenda: A - agua sólo sin dexametasona incluida en el agua potable (control no atrofiado); B - agua + dexametasona (control atrofiado); C - sauvagina (0,1 mg/kg/d) + dexametasona; D - sauvagina (0,3 mg/kg/d) + dexametasona; E - sauvagina (1,0 mg/kg/d) + dexametasona; * - p\leq 0,05 con respecto al agua; # - p\leq 0,05 con respecto al agua + dexametasona. Tras la adición del glucocorticoide dexametasona al agua potable (1,2 mg/kg/d) se les administró a los ratones machos los agentes antes indicados o el control (solución salina fisiológica) mediante infusión continua utilizando una minibomba osmótica Alzet a 5 \mul/h hasta finalizar el período experimental (sin añadir más teofilina). La dosis diaria de sauvagina administrada es según se ha indicado anteriormente. La implantación de la minibomba se realizó al iniciar la exposición de dexametasona. A los nueve días del inicio de la dosificación de sauvagina se extirparon y pesaron los músculos gastrocnemio medio y tibial anterior para determinar el grado de atrofia.

La Figura 4 (Fig. 4) demuestra que la sauvagina inhibe la atrofia inducida por falta de uso de los músculos tibial anterior (Fig 4A) y gastrocnemio medio (Fig 4B). También se observó una hipertrofia estadísticamente significativa de los músculos gastrocnemio medio y tibial anterior de la pata no escayolada con el tratamiento de sauvagina. Leyenda: A - solución salina fisiológica (control); B - teofilina; C - sauvagina (0,03 mg/kg) + teofilina; D - sauvagina (0,1 mg/kg) + teofilina; E - sauvagina (0,3 mg/kg) + teofilina; * - p\leq 0,05 con respecto a la solución salina. Tras el escayolado de la pata trasera derecha, a los ratones machos se les inyectó por vía subcutánea en la región medioescapular 2 veces al día la dosis diaria administrada indicada de sauvagina o de control (solución salina fisiológica) durante diez días. La sauvagina se administró junto con dosis 2 veces al día por vía intraperitoneal del inhibidor de la fosfodiesteresa teofilina (30 mg/kg). En el día diez se extirparon y pesaron los músculos gastrocnemio medio y tibial anterior para determinar el grado de atrofia.

La Figura 5 (Fig. 5) muestra que tanto la sauvagina como la urocortina inhiben la atrofia del músculo tibial anterior inducida por desnervación en un modelo de atrofia por desnervación del nervio ciático de ratón. Además, se observó una hipertrofia de la pata no denervada con el tratamiento de urocortina. Leyenda: A - agua (control); B - sauvagina (1 mg/kg/d); C - urocortina (1,0 mg/kg/d); * - p\leq 0,05 con respecto al agua. Tras la desnervación del nervio ciático derecho, se les administró a los ratones machos los agentes antes indicados o el control (solución salina fisiológica) mediante infusión continua utilizando una minibomba osmótica Alzet a 5 \mul/h hasta el final del período experimental (sin teofilina adicional). La dosis diaria de los agentes administrada es la indicada anteriormente. La implantación de la minibomba se realizó simultáneamente con la desnervación del nervio ciático. El día nueve se extirpó y pesó el músculo tibial anterior para determinar el grado de atrofia.

La Figura 6 (Fig. 6) muestra que la urocortina inhibe la atrofia inducida por falta de uso de los músculos tibial anterior (Fig 6A) y gastrocnemio medio (Fig 6B) en el modelo de atrofia por falto de uso de pata escayolada de ratón. Leyenda: A - solución salina fisiológica (control); B - urocortina (0,3 mg/kg) + teofilina; * - p\leq 0,05 con respecto a la solución salina. Tras el escayolado de la pata trasera derecha se les inyectó a los ratones machos por vía subcutánea en la región medioescapular 2 veces al día urocortina o control (solución salina fisiológica) durante diez días. La urocortina se administró a las dosis que se indican en la descripción de las figuras 6A y 6B. La urocortina se administró junto con dosis del inhibidor de la fosfodiesteresa teofilina (30 mg/kg), 2 veces al día por vía intraperitoneal. El día diez se extirparon y pesaron los músculos gastrocnemio medio y tibial anterior para determinar el grado de atrofia.

La Figura 7 (Fig. 7) muestra que la sauvagina inhibe la atrofia inducida por desnervación de los músculos tibial anterior (Fig. 7A), EDL (Fig. 7B), sóleo (Fig. 7C) y gastrocnemio medio (Fig. 7D). Además, la sauvagina causó una hipertrofia estadísticamente significativa del músculo EDL no denervado (Fig. 7B). Leyenda: A - solución salina fisiológica (control); B - sauvagina (0,003 mg/kg) + teofilina; C - sauvagina (0,01 mg/kg) + teofilina; D - sauvagina (0,03 mg/kg) + teofilina; # - p\leq 0,05 con respecto a los correspondientes controles. Tras la desnervación del nervio ciático derecho, a las ratas machos adrenalectomizadas (se utilizaron ratas adrenalectomizadas para eliminar los efectos inductores de la atrofia del músculo esquelético debidos a la activación del eje HPA a través de agonismos del CRF_{1}R) se les inyectó por vía subcutánea en la región medioescapular 2 veces al día sauvagina o control (solución salina fisiológica) durante nueve días a las dosis indicadas anteriormente. La sauvagina se administró junto con 30 mg/kg de teofilina. El día nueve se extirparon y pesaron los músculos tibial anterior, extensor digital largo (EDL), sóleo, gastrocnemio medio y plantar para determinar el grado de atrofia.

La Figura 8 (Fig. 8) muestra que la sauvagina inhibe la atrofia observada en los ratones salvajes pero no en los ratones a los que se les ha eliminado el CRF_{2}R en el modelo de atrofia por desnervación del nervio ciático de ratón. Leyenda: A-C - ratones salvajes; D-F - ratones KO a los que se les ha eliminado el CRF_{2}R. A y D - agua (control); B y E - sauvagina (0,3 mg/kg/d); C y F - sauvagina (1,0 mg/kg/d); * - p\leq 0,05 con respecto a la solución salina. Tras la desnervación del nervio ciático derecho, a los ratones hembras salvajes y a ratones KO a los que se les ha eliminado el CRF_{2}R se les administró sauvagina o control mediante infusión continua utilizando una minibomba osmótica Alzet a 5 \mul/h durante nueve días a la dosis diaria administrada indicada anteriormente. El día nueve se extirpó y pesó el músculo tibial anterior para determinar el grado de atrofia.

La Figura 9 (Fig. 9) muestra que la sauvagina inhibe la pérdida inducida por falta de uso de la masa muscular de EDL y sóleo (Fig 9A) e inhibe la pérdida de función muscular valorada mediante medición de la fuerza absoluta (Fig 9B) en el modelo de atrofia por falta de uso de pata escayolada de ratón. Leyenda: A - músculo no escayolado, control; B - músculo escayolado, control de solución salina; C - músculo escayolado, sauvagina (0,3 mg/kg) + teofilina (30 mg/kg); * - p\leq 0,05 con respecto a la solución salina. Tras el escayolado de la pata trasera derecha, a los ratones machos se les inyectó por vía subcutánea en la región medioescapular 2 veces al día sauvagina o control (solución salina fisiológica) durante diez días a las dosis indicadas anteriormente. La sauvagina se administró junto con 30 mg/kg de teofilina. El día diez se extirparon los músculos EDL y sóleo y se midió la fuerza absoluta y la masa para determinar el grado de atrofia.

III. Preparación de CRFR, CRF o análogos de CRF o líneas celulares que expresan los CRFR

Los CRF_{1}R, CRF_{2}R, CRF y análogos de CRF pueden prepararse para diferentes usos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, la generación de anticuerpos, el uso como reactivos en los ensayos de detección de la presente invención y el uso como reactivos farmacéuticos para el tratamiento de la atrofia del músculo esquelético. Será evidente para el experto en la técnica que, para ciertas realizaciones de la invención, los polipéptidos purificados serán más útiles mientras que para otras realizaciones serán más útiles las líneas celulares que expresan los polipéptidos. Por ejemplo, en los casos en los que sea importante conservar las características estructurales y funcionales del CRFR, p. ej., en un método de detección para identificar compuestos candidatos que activen los CRFR, es deseable utilizar células que expresen CRFR funcionales.

Dado que los CRF y los análogos de CRF son polipéptidos cortos, el experto en la materia reconocerá que estos polipéptidos se obtendrán de forma más conveniente mediante síntesis directa en lugar de mediante medios recombinantes utilizando técnicas bien conocidas en la técnica. Además, muchas de estas moléculas son comercializadas.

Si la fuente de CRFR es una línea celular que expresa el polipéptido, las células pueden, por ejemplo, expresar de forma endógena CRFR, haber sido estimuladas para aumentar la expresión endógena de CRFR o haber sido tratadas mediante ingeniería genética para expresar un CRFR. Los métodos para determinar si una línea celular expresa un polipéptido de interés son conocidos en la técnica, por ejemplo, la detección del polipéptido con un anticuerpo apropiado, el uso de una sonda de ADN para detectar el ARNm que codifica la proteína (p. ej., técnicas Northern blot o PCR), o la medición de la unión de un agente selectivo al polipéptido de interés (p. ej., un agonista selectivo marcado radiactivamente).

El uso de tecnología del ADN recombinante para preparar CRF_{1}R, CRF_{2}R o líneas celulares que expresan estos polipéptidos está especialmente contemplado. Dichos métodos recombinantes son bien conocidos en la técnica. Para expresar CRF_{1}R o CRF_{2}R recombinantes se prepara un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés bajo el control de uno o más elementos reguladores. Las secuencias genómicas o de ADNc que codifican CRF_{1}R y CRF_{2}R de varias especies se encuentran descritas y pueden obtenerse de la base de datos GenBank (disponible en <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/>) o la base de datos Derwent (disponible en <http://www.derwent.co.uk/geneseq/index.html>) así como la lista de secuencias para esta solicitud. Los números de registro de las secuencias de CRF_{1}R y CRF_{2}R y sus correspondientes números de secuencia se muestran en la Tabla I. Utilizando esta información de secuencias públicamente disponible, una forma de aislar una molécula de ácido nucleico que codifica un CRF_{1}R o CRF_{2}R es detectar una genoteca de ADN o ADNc genómico con una sonda de ADN sintetizada de forma natural o artificial utilizando métodos bien conocidos en la técnica, p. ej., con amplificación mediante PCR de la secuencia desde una genoteca apropiada. Otro método es utilizar cebadores de oligonucleótido específicos para el receptor de interés para amplificar mediante PCR el ADNc directamente del ARNm aislado en un determinado tejido (tal como músculo esquelético). Este ARNm aislado es comercializado en el mercado. El experto en la técnica también reconocerá que utilizando sondas de ácido nucleico que corresponden a partes de las secuencias de receptor CRFR conocidas pueden obtenerse los ADNc homólogos o secuencias genómicas de otras especies utilizando métodos conocidos. Especialmente útiles en los métodos de la presente invención son los receptores CRFR de los tipos que incluyen, aunque no de forma limitativa, hombre, ratón, rata, cerdo, mono, chimpancé, mono tití, perro, vaca, oveja, gato, pollo y pavo. Mediante métodos bien conocidos en la técnica, la molécula de ácido nucleico aislada que codifica el CRFR de interés es después ligada a un vector de expresión adecuado. El vector de expresión así preparado es expresado en una célula hospedadora y las células hospedadoras que expresan el receptor se utilizan directamente en un ensayo de detección o el receptor es aislado de las células hospedadoras que expresan el receptor y este receptor aislado es utilizado después en un ensayo de detección.

Los sistemas hospedador-vector de expresión que se pueden usar para los fines de la invención incluyen, aunque no de forma limitativa: microorganismos tales como bacterias (p. ej., E. coli, B. subtilis) transformados con ADN bacteriófago recombinante, ADN de plásmido, o vectores de expresión de ADN cósmido que contienen secuencias de nucleótidos de CRFR; levadura (p. ej., Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinante que contienen secuencias de nucleótidos de CRFR; sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinante (p. ej., baculovirus) que contienen secuencias de nucleótidos de CRFR; sistemas celulares vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinante (p. ej., virus del mosaico de coliflor, virus del mosaico de tabaco) o transformados con vectores de expresión de plásmido recombinante (p. ej., plásmido Ti) que contienen secuencias de nucleótidos de CRFR; o sistemas celulares de mamífero (p. ej., COS, CHO, HEK293, NIH3T3) que albergan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (p. ej., promotor de la metalotioneína) o virus de mamífero (p. ej., retrovirus LTR) y que también contienen secuencias de nucleótidos de CRFR.

La célula hospedadora se utiliza para obtener el polipéptido de interés. Dado que el CRFR es una molécula unida a membrana, este se purifica a partir de las membranas de célula hospedadora o también el CRFR es utilizado mientras está anclado en la membrana celular, es decir, se utilizan células enteras o fracciones de membrana de célula. La purificación o el enriquecimiento de los CRFR a partir de estos sistemas de expresión se realiza utilizando detergentes y micelas de lípido apropiados por métodos bien conocidos por el experto en la técnica.

En los sistemas bacterianos pueden seleccionarse de forma ventajosa varios vectores de expresión en función del uso previsto para el producto génico que se va a expresar. Por ejemplo, cuando se produce una gran cantidad de esta proteína para la generación de anticuerpos anti-CRFR, son deseables vectores que dirijan la expresión de elevados niveles de productos proteicos. El experto en la técnica es capaz de generar dichas construcciones de vectores y purificar las proteínas mediante diversas metodologías, incluyendo las tecnologías de purificación selectiva como las columnas selectivas de proteína de fusión las columnas de anticuerpos así como las tecnologías de purificación no selectiva.

En un sistema de expresión de proteínas en insectos se usa un baculovirus, como el virus de la polihedrosis nuclear de A. californica (AcNPV), como vector para expresar genes extraños en células de S. frugiperda. En este caso, las secuencias de nucleótidos de CRFR son clonadas en regiones no esenciales del virus y colocadas bajo el control de un promotor AcNPV. Los virus recombinantes se utilizan a continuación para infectar células en las cuales el gen insertado es expresado y la proteína es purificada mediante una de las muchas técnicas conocidas por el experto en la técnica.

En células hospedadoras de mamífero se pueden utilizar varios sistemas de expresión basados en virus. La utilización de estos sistemas de expresión frecuentemente requiere la creación de señales de inicio específicas en los vectores para la traducción eficaz de las secuencias de nucleótidos insertadas. Esto es especialmente importante si se utiliza una parte del gen de CRFR que no contiene la señal de inicio endógena. La colocación de esta señal de inicio, dentro del marco de la región codificadora de la secuencia de nucleótidos insertada, así como la adición de elementos potenciadores de la transcripción y la traducción y la purificación de la proteína recombinante se consiguen mediante una de las muchas metodologías conocidas por el experto en la técnica. Igualmente importante en las células hospedadoras de mamífero es la selección de un tipo celular adecuado que sea capaz de realizar las modificaciones postraducción de la proteína recombinante. Estas modificaciones, por ejemplo, escisión, fosforilación, glicosilación, etc., requieren la selección de la célula hospedadora apropiada que contiene las enzimas modificadoras. Dichas células hospedadoras incluyen, aunque no de forma limitativa, CHO, HEK293, NIH3T3, COS, etc. y son conocidas por los expertos en la técnica.

Para una elevada expresión a largo plazo de proteínas recombinantes se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de modo estable CRFR pueden ser obtenidas por ingeniería. El experto en la técnica, de acuerdo con métodos conocidos tales como electroporación, transfección con fosfato cálcico o transfección mediada por liposomas, puede generar una línea celular que exprese de modo estable los CRFR. Esto se lleva a cabo habitualmente mediante la transfección de células usando vectores de expresión que contienen elementos de control de la expresión adecuados (p. ej. secuencias promotoras, secuencias potenciadoras, secuencias de terminación de la transcripción, sitios de poliadenilación, sitios de inicio de la traducción, etc.), un marcador seleccionable y el gen de interés. El marcador seleccionable puede estar contenido dentro del mismo vector, como el gen de interés, o en un vector separado que es cotransfectado con el vector que contiene la secuencia de CRFR. El marcador seleccionable en el vector de expresión puede conferir resistencia a la selección y permitir a las células integrar de forma estable el vector en sus cromosomas y crecer para formar focos que, a su vez, se pueden clonar y expandir en líneas celulares. De forma alternativa, el vector de expresión puede permitir seleccionar la célula que expresa el marcador seleccionable utilizando un atributo físico del marcador, por ejemplo, la expresión de la proteína fluorescente verde (GFP) permite seleccionar células que expresan el marcador utilizando el análisis de separación de células activadas por fluorescencia (FACS).

El experto en la técnica puede seleccionar un tipo celular apropiado para la transfección para permitir así la selección de células en las cuales el gen de interés ha sido integrado con éxito. Por ejemplo, cuando el marcador seleccionable es la timidina quinasa del virus herpes sencillo, la hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa o la adenina fosforibosiltransferasa, el tipo celular adecuado serían células tk, hgprt o aprt, respectivamente. O también se pueden usar células normales en las que el marcador seleccionable es dhfr, gpt, neo o hygro, los cuales confieren resistencia a metotrexato, ácido micofenólico, G-418 o higromicina, respectivamente. Estas líneas celulares recombinantes son útiles para identificar compuestos candidatos que afectan a la actividad de CRFR.

IV. Preparación de anticuerpos anti-CRFR

Los anticuerpos que reconocen de forma selectiva uno o más epítopos de un CRFR también están abarcados por la invención. Dichos anticuerpos incluyen, p. ej. anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos, anticuerpos de cadena simple, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')_{2}, moléculas producidas usando una genoteca de expresión de Fab, anticuerpos humanos (policlonales o monoclonales) producidos en ratones transgénicos y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores. Para usos terapéuticos se prefieren los anticuerpos quiméricos o humanos, siendo los anticuerpos humanos los más preferidos.

Los anticuerpos pueden ser utilizados junto con los esquemas de detección de compuestos descritos en la presente memoria para la evaluación de compuestos experimentales, p. ej., para la inmovilización de polipéptidos CRFR o también estos anticuerpos pueden ser utilizados con técnicas de terapia génica para evaluar, por ejemplo, la expresión del CRFR en células o directamente en tejidos del paciente en los que se han introducido estos genes. Además, los anticuerpos de la presente invención son útiles para fabricar medicamentos para tratar la atrofia del músculo esquelético. Los anticuerpos selectivos para el CRFR pueden ser detectados mediante los métodos de la presente invención para identificar un subconjunto de anticuerpos que son agonistas del CRFR. Además, los anticuerpos anti-idiotipo generados frente a anticuerpos específicos de CRF o de un análogo de CRF pueden ser útiles como agonistas del CRFR y, como los anticuerpos anti-CRFR, pueden ser identificados por su capacidad para activar el CRFR por los métodos de la presente invención.

Para producir anticuerpos se pueden inmunizar diferentes animales hospedadores mediante inyección con CRFR, CRF o un análogo de CRF, anticuerpo anti-CRF, anticuerpo anti-análogo de CRF, o fragmentos inmunogénicos de los mismos por métodos bien conocidos en la técnica. Para preparar un anticuerpo anti-idiotipo, el inmunógeno es un anticuerpo anti-CRF o un anticuerpo anti-análogo de CRF. La producción de anticuerpos anti-idiotipo se describe, por ejemplo, en US-4.699.880. Los animales hospedadores adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, conejos, ratones, cabras, ovejas y caballos. Las técnicas de inmunización son bien conocidas en la técnica. Los anticuerpos policlonales se pueden purificar a partir del suero de los animales inmunizados o también se pueden generar los anticuerpos monoclonales mediante métodos que son bien conocidos en la técnica. Estas técnicas incluyen, aunque no de forma limitativa, las técnicas bien conocidas del hibridoma de Kohler y Milstein, las técnicas del hibridoma de linfocitos B humanos y la tecnología del hibridoma del EBV. Los anticuerpos monoclonales pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulinas, como IgG, IgE, IgM, IgA e IgD que contienen cadenas ligeras kappa o lambda.

Debido a la inmunogenicidad de los anticuerpos no humanos en los seres humanos, se prefieren los anticuerpos quiméricos a los anticuerpos no humanos cuando estos se utilizan para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Las técnicas para producir y utilizar anticuerpos quiméricos son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en US -5.807.715; US-4.816.397; US-4.816.567; US-5.530.101; US-5.585.089; US-5.693.761; US-5.693.762; US-6.180.370; y US-5.824.307.

Los anticuerpos totalmente humanos son especialmente deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos porque son menos inmunogénicos que los anticuerpos no humanos o que los anticuerpos quiméricos. Estos anticuerpos pueden ser obtenidos utilizando ratones transgénicos que son prácticamente incapaces de expresar genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina endógena pero que sí pueden expresar genes humanos de cadena pesada y ligera. Los ratones transgénicos son inmunizados en la forma normal con un antígeno seleccionado, p. ej., la totalidad o una parte de CRF_{2}R. Los anticuerpos monoclonales dirigidos frente al antígeno se obtienen mediante tecnología de hibridoma convencional a partir de estos ratones transgénicos inmunizados. Esta tecnología se describe en detalle en US-5.874.299; US-5.877.397; US-5.569.825; US-5.661.016; US-5.770.429; y US-6.075.181. Como alternativa a la obtención de inmunoglobulinas humanas directamente del cultivo de las células de hibridoma, las células de hibridoma pueden utilizarse como fuente de loci de cadena pesada y cadena ligera reorganizados para su posterior expresión o manipulación genética. El aislamiento de genes de estas células productoras de anticuerpos es sencillo dado que existen disponibles elevados niveles de los ARNm apropiados. Los loci reorganizados recuperados pueden ser manipulados según se desee. Por ejemplo, la región constante puede ser eliminada o sustituida por la de un isotipo diferente o las regiones variables pueden ser unidas para codificar regiones Fv de cadena única. Estas técnicas se describen en WO 96/33735 y WO 96/34096.

V. Selección de compuestos experimentales

Los compuestos que pueden ser analizados con los ensayos de la invención incluyen, aunque no de forma limitativa, genotecas de compuestos conocidos, incluyendo productos naturales tales como extractos vegetales o animales, sustancias químicas sintéticas, materiales biológicamente activos incluyendo proteínas, péptidos tales como péptidos solubles, incluyendo de forma no excluyente elementos de genotecas de péptidos aleatorios y genotecas moleculares derivadas de química combinatoria compuestas por aminoácidos de configuración D- o L-, fosfopéptidos (incluyendo, aunque no de forma limitativa, elementos de genotecas de fosfopéptidos dirigidos aleatorios o parcialmente degenerados), anticuerpos (incluyendo, aunque no de forma limitativa, anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, humanos, anti-idiotípicos o de cadena única y fragmentos de genoteca de expresión Fab, F(ab')_{2} y Fab y fragmentos de los mismos que se unen a epítopo) y moléculas orgánicas e inorgánicas.

Además de las fuentes más tradicionales de compuestos experimentales, las tecnologías de modelado y de búsqueda por ordenador permiten una selección racional de compuestos experimentales utilizando información estructural del sitio de unión de ligandos de CRFR o de agonistas de CRFR ya identificados. Esta selección racional de compuestos experimentales puede reducir el número de compuestos experimentales que deban ser analizados para identificar un compuesto candidato terapéutico. Los CRFR son GPCR y, por consiguiente, el conocimiento de la secuencia CRFR de proteínas permite generar un modelo de su sitio de unión que puede ser utilizado para analizar sus posibles ligandos. Este proceso puede realizarse de varias maneras bien conocidas en la técnica. Brevemente, el método más robusto implica generar un alineamiento de la secuencia de CRFR a una plantilla (derivada de las estructuras cristalinas de bacterio-rodopsina o rodopsina u otro modelo GPCR), conversión de las estructuras de aminoácido, refinado del modelo mediante mecánica molecular y examen visual. Si no puede obtenerse un alineamiento fuerte de la secuencia entonces puede generarse también un modelo creando modelos de las hélices hidrófobas. Estas son después ensambladas girando y traduciendo cada hélice con respecto a las demás partiendo del diseño general de las estructuras de rodopsina conocidas. También pueden utilizarse los datos de mutación que señalan hacia contactos residuo-residuo para posicionar las hélices entre sí de manera que se consigan estos contactos. Durante este proceso, también puede utilizarse el acoplamiento de los ligandos conocidos a la cavidad del sitio de unión dentro de las hélices para ayudar a posicionar las hélices desarrollando interacciones que estabilicen la unión del ligando. El modelo puede ser completado mediante refinado utilizando mecánica molecular y formación de los bucles intracelulares y extracelulares con técnicas de modelado de homología convencionales. Información general relativa a la construcción y al modelado de GPCR puede encontrarse en Schoneberg T. y col., Molecular and Cellular Endocrinology, 151:181-193 (1999), Flower, D., Biochimica et Biophysica Acta, 1422:207-234 (1999), y Sexton, P.M., Current Opinion in Drug Discovery and Development, 2(5):440-448 (1999).

Una vez completado el modelo, este puede utilizarse junto con uno de los diferentes programas informáticos existentes para limitar el número de compuestos que deban ser analizados por los métodos de selección de la presente invención. El más general de todos ellos es el programa DOCK (UCSF Molecular Design Institute, 533 Parnassus Ave, U-64, Box 0446, San Francisco, California 94143-0446). Varias de sus variantes pueden analizar bases de datos de compuestos comerciales y/o patentados para comprobar el ajuste de sus factores estéricos y la complementariedad electrostática básica con el sitio de unión. Con frecuencia se ha descubierto que las moléculas que consiguen una buena puntuación en DOCK tienen mayor probabilidad de ser ligandos. Otro programa que puede utilizarse es FLEXX (Tripos Inc., 1699 South Hanley Rd., St. Louis, Missouri, 63144-2913 (www.tripos.com)). Este programa, por ser significativamente más lento, habitualmente se limita a búsquedas en bases de datos de compuestos de menor tamaño. El esquema de puntuación de FLEXX es más detallado y habitualmente proporciona una mejor estimación de la capacidad de unión que DOCK. FLEXX se utiliza de forma óptima para confirmar las sugerencias de DOCK o para examinar genotecas de compuestos generados de forma combinatoria a partir de ligandos o plantillas conocidos.

VI. Ensayos de detección para identificar compuestos candidatos para regular la masa o la función del músculo esquelético

El hallazgo de que el CRF_{2}R juega un papel a la hora de regular la atrofia del músculo esquelético permite a diferentes métodos analizar uno o más compuestos experimentales para identificar compuestos candidatos que puedan ser posteriormente utilizados para el tratamiento profiláctico o terapéutico de la atrofia del músculo esquelético.

Dado que CRF_{2}R y CRF_{1}R son proteínas homólogas, se espera que un determinado porcentaje de los agonistas de CRF_{2}R también funcionen como agonistas de CRF_{1}R. Como se ha descrito anteriormente, la activación del CRF_{1}R induce la activación del eje HPA y la producción concomitante de corticoesteroides. En la mayoría de los casos en los que se desea un aumento de la masa o de la función muscular no resulta deseable activar el eje HPA. Por tanto, además de analizar en los compuestos experimentales su capacidad para activar CRF_{2}R, la invención también proporciona el uso de CRF_{2}R y CRF_{1}R para detectar agonistas selectivos de CRF_{2}R. Cuando se selecciona un compuesto candidato útil para tratar la atrofia muscular aguda o crónica, no relacionada con la distrofia muscular, es preferible que los compuestos candidatos sean selectivos para CRF_{2}R. Preferiblemente el compuesto candidato presenta una selectividad 10 veces mayor por CRF_{2}R que por CRF_{1}R (es decir, 10 veces más activo frente a CRF_{2}R que frente a CRF_{1}R), más preferiblemente una selectividad 100 veces mayor y con máxima preferencia una selectividad 1000 veces mayor o superior. Dado que los estudios publicados han demostrado el beneficio del tratamiento con corticosteroides en el tratamiento de las distrofias musculares, sería beneficioso que un agonista del CRF_{2}R conservase cierto nivel de agonismo del CRF_{1}R cuando se usa para tratar distrofias musculares. Por consiguiente, para tratar distrofias musculares se prefiere un compuesto de menor selectividad que active el CRF_{2}R y el CRF_{1}R dentro de un intervalo de concentración similar. Preferiblemente el compuesto candidato es 100 veces más selectivo por CRF_{2}R que un CRF_{1}R, más preferiblemente 10 veces más selectivo y con máxima preferencia no selectivo por CRF_{2}R que un CRF_{1}R (es decir, la actividad del compuesto candidato por CRF_{2}R y por CRF_{1}R es prácticamente similar). Asimismo, en este caso, puede ser más preferible que el compuesto sea un agonista total del CRF_{2}R pero que al mismo tiempo sea un agonista parcial del CRF_{1}R. Este compuesto candidato tendría, por tanto, un límite integrado al máximo grado de aumento y potencial de cortisol para la atrofia muscular, mientras que el efecto anti-atrofia mediado a través del CRF_{2}R podría ser mejorado aumentando la dosis. El experto en la técnica sería capaz de determinar fácilmente si un compuesto candidato es un agonista total o parcial del CRF_{1}R o del CRF_{2}R utilizando métodos conocidos en la técnica.

Para analizar compuestos finalmente utilizados para regular la masa o la función del músculo esquelético a través de CRF_{2}R en los seres humanos se prefiere que el ensayo inicial in vitro se realice utilizando un CRF_{2}R con una secuencia de aminoácidos que sea idéntica en más del 80% a SEC. nº:10 y más preferiblemente idéntica en más del 90% a SEC. nº:10. Más preferiblemente los compuestos experimentales se analizarán frente a un CRF_{2}R de humano, ratón o rata, siendo el más preferido el humano. Para analizar compuestos que finalmente sean utilizados para regular la masa o la función del músculo esquelético a través de CRF_{2}R en una especie no humana es preferible utilizar el CRF_{2}R de la especie para la que se contempla el tratamiento.

Para los ensayos para determinar el nivel de actividad que tiene una prueba o un compuesto candidato hacia CRF_{1}R y determinar la selectividad que un compuesto candidato presenta por CRF_{2}R frente a CRF_{1}R, se prefiere que el análisis inicial se realice con un CRF_{1}R que tenga una secuencia de aminoácidos que sea idéntica en más del 80% a SEC. nº:2 y más preferiblemente idéntica en más del 90% a SEC. nº:2. Más preferiblemente los compuestos experimentales serán analizados frente a un CRF_{1}R de humano, ratón o rata, siendo el más preferido el humano. Para analizar compuestos que finalmente serán utilizados para regular la masa o la función del músculo esquelético en una especie no humana, es preferible utilizar el CRF_{1}R de la especie para la cual se contempla el tratamiento.

Los métodos de la presente invención pueden utilizarse para aplicaciones de elevado rendimiento aunque el uso simplemente de un compuesto experimental en el método ya es abarcado por el término "análisis". Los compuestos experimentales que se unen a CRF_{2}R, activan CRF_{2}R, prolongan o aumentan la activación inducida por el agonista del CRF_{2}R o de una ruta de transducción de señales de CRF_{2}R, o aumentan la expresión de genes de CRF_{2}R o CRF, determinados según un método de la presente invención, reciben el nombre en la presente memoria de "compuestos candidatos." Estos compuestos candidatos pueden utilizarse para regular la masa o la función del músculo esquelético. Sin embargo, de forma más típica, este primer nivel de análisis in vitro proporciona un medio para seleccionar un intervalo más estrecho de compuestos, es decir, los compuestos candidatos, que merecen una investigación adicional a otros niveles de análisis. El experto en la materia reconocerá que una utilidad de la presente invención es identificar, dentro de un grupo de uno o más compuestos experimentales, un subconjunto de compuestos que merezcan una investigación más detallada. El experto en la técnica también reconocerá que los ensayos de la presente invención son útiles para categorizar la probable utilidad de un determinado compuesto candidato con respecto a otros compuestos candidatos. Por ejemplo, un compuesto candidato que activa CRF_{2}R a 1000 nM (pero no a 10 nM) tiene menos interés que otro que active CRF_{2}R a 10 nM. Con esta información el experto en la materia puede seleccionar un subconjunto de compuestos candidatos identificados en el primer nivel de análisis para una investigación más detallada. A título ilustrativo solamente, los compuestos que activan CRF_{2}R a concentraciones de menos de 200 nM pueden ser analizados adicionalmente en un modelo animal de atrofia del músculo esquelético, mientras que los que están por encima del umbral no serán analizados en más detalle. El experto en la materia también reconocerá que, dependiendo de cómo se selecciona el grupo de compuestos experimentales y de cómo se seleccionan los positivos, sólo una cierta parte de los compuestos experimentales serán identificados como compuestos candidatos y que esta parte puede ser muy pequeña.

Los sistemas de ensayo descritos a continuación pueden ser formulados en kits que comprenden CRF_{2}R o células que expresan el CRF_{2}R que pueden ser envasadas en diferentes recipientes, p. ej., viales, tubos, placas de pocillos de microtitulación, frascos y similares. Otro reactivos pueden ser introducidos en recipientes separados e incluidos en el kit, p. ej., muestras de control positivo, muestras de control negativo, tampones y medios de cultivo celular.

En una realización, la invención proporciona un método para analizar uno o más compuestos experimentales e identificar compuestos candidatos que se unen con CRF_{2}R. Los métodos para determinar la unión de un compuesto a un receptor son bien conocidos en la técnica. De forma típica, la determinación incluye las etapas de incubar una fuente del CRF_{2}R con un compuesto marcado, que se sabe que se une al receptor en presencia o ausencia de un compuesto experimental, y determinar la cantidad de compuesto marcado unido. La fuente de CRF_{2}R puede ser células que expresan CRF_{2}R o alguna forma de CRF_{2}R aislado, como se describe en la presente memoria. El compuesto marcado puede ser CRF o cualquier análogo de CRF marcado de manera que pueda ser medido, preferiblemente cuantitativamente (p. ej., marcado con 125I, marcado con europio, marcado con fluoresceína, marcado con GFP o marcado con ^{35}S-metionina). Estos métodos de marcado son bien conocidos en la técnica. Los compuestos experimentales que se unen con el CRFR reducen la cantidad de ligando marcado unido al receptor, reduciendo así el nivel de señal con respecto al de las muestras de control (ausencia de compuesto experimental). Se han descrito variaciones de esta técnica en las que la unión al receptor en presencia y ausencia de agentes desacopladores de proteína G permite diferenciar entre agonistas y antagonistas (p. ej., unión en ausencia y en presencia de un análogo de nucleótido de guanina, es decir, GpppNHp). Ver Keen, M., Radioligand Binding Methods for Membrane Preparations and Intact cells en Receptor Signal Transduction Protocols, R.A.J. Challis, (ed), Humana Press Inc., Totoway N.J.
(1997).

Dado que resulta deseable diferenciar entre compuestos que se unen de forma específica a CRF_{2}R y no a CRF_{1}R, los ensayos descritos anteriormente deberían realizarse utilizando una célula, o una membrana de una célula, que exprese solamente CRF_{2}R o también pueden realizarse los ensayos con una fuente recombinante de CRF_{2}R. Las células que expresan ambas formas de CRFR se pueden modificar utilizando la recombinación homóloga para inactivar o de otra manera inhabilitar el gen del CRF_{1}R. De forma alternativa, si la fuente de CRFR contiene más de un tipo de CRFR, la señal de fondo producida por el receptor que no es de interés deberá restarse de la señal obtenida en el ensayo. La respuesta de fondo se puede determinar mediante diversos métodos, incluyendo la eliminación de la señal del CRFR que no es de interés mediante el uso de moléculas antisentido, anticuerpos o antagonistas selectivos. Los antagonistas de CRFR conocidos incluyen antalarmina (selectiva para CRF_{1}R), antisauvagina-30 (selectiva para CRF_{2}R) y astresina (no selectiva para CRF_{1}R / CRF_{2}R).

En otra realización, la invención proporciona métodos para analizar compuestos experimentales e identificar compuestos candidatos que activen CRF_{2}R y/o CRF_{1}R. De forma típica, los ensayos están basados en células; sin embargo, se conocen ensayos sin células capaces de diferenciar entre unión de agonistas y unión de antagonistas, como se ha descrito anteriormente. Los ensayos basados en células incluyen las etapas de poner en contacto células que expresan CRF_{1}R o CRF_{2}R con un compuesto experimental o un control y medir la activación del CRFR en función de la expresión o la actividad de componentes de las rutas de transducción de señales del CRFR.

Como se ha descrito anteriormente en la sección Antecedentes de la invención, los CRFR parecen acoplarse a través de diferentes rutas incluyendo G_{\alpha s}, G_{\alpha q} o G_{\alpha i}, en función del tipo celular. Se cree que la activación agonista del CRFR permite al receptor enviar una señal a través de cualquiera de estas vías siempre y cuando los componentes necesarios de la vía estén presentes en el tipo de célula en cuestión. Por consiguiente, para analizar la activación de CRFR, en un ensayo puede utilizarse cualquiera de las rutas de transducción de señales como lectura, incluso si el tipo celular relevante para el tratamiento, in vivo, acopla el CRFR a la atrofia del músculo esquelético a través de una ruta diferente. El experto en la técnica reconocerá que un ensayo de detección sería eficaz para identificar los agonistas del CRFR útiles independientemente de la ruta de medición de la activación del receptor. Los ensayos para medir la activación de estas vías de señalización son conocidos en la técnica.

Por ejemplo, después de entrar en contacto con el compuesto experimental, los lisados de las células pueden ser preparados y analizados para la inducción de AMPc. El AMPc es inducido como respuesta a la activación G_{\alpha s}. Dado que el G_{\alpha s} es activado por receptores que no son CRFR y dado que un compuesto experimental puede estar ejerciendo su efecto a través de CRFR o de otro mecanismo, se necesitan dos comparaciones de control para determinar si un compuesto experimental aumenta los niveles de AMPc a través de la activación de un CRFR. Un control compara el nivel de AMPc de las células que han entrado en contacto con un compuesto experimental y el nivel de AMPc de las células que han entrado en contacto con un compuesto de control (es decir, el vehículo en el que se ha disuelto el compuesto experimental). Si el compuesto experimental aumenta el nivel de AMPc con respecto al compuesto de control, esto indica que el compuesto experimental está aumentando el AMPc por algún mecanismo. El otro control compara el nivel de AMPc de una línea celular que expresa el CRFR con el de una línea celular que es prácticamente la misma pero que no expresa el CRFR, habiendo sido ambas líneas celulares tratadas con el compuesto experimental. Si el compuesto experimental eleva el nivel de AMPc en la línea celular que expresa el CRFR con respecto a la línea celular que no expresa el CRFR, esto es una indicación de que el compuesto experimental eleva el AMPc a través de la activación del CRFR.

En una realización específica de la invención, la inducción de AMPc se mide utilizando construcciones de ADN que contienen el elemento sensible al AMPc unido a uno de los diferentes genes indicadores que pueden introducirse en las células que expresan el CRFR. Dichos genes indicadores incluyen, aunque no de forma limitativa, cloranfenicol acetiltransferasa (gato), luciferasa, glucurónido sintetasa, hormona del crecimiento, proteínas fluorescentes (p. ej. proteína fluorescente verde) o fosfatasa alcalina. Tras la exposición de las células al compuesto experimental, puede cuantificarse el nivel de expresión del gen indicador para determinar la capacidad del compuesto experimental de aumentar el nivel de AMPc y así determinar la capacidad de un compuesto experimental para activar el CRFR.

Las células útiles en este ensayo son las mismas que las del ensayo de unión a CRFR descrito anteriormente salvo que las células utilizadas en los ensayos de activación expresan preferiblemente un receptor funcional que da una respuesta estadísticamente significativa al CRF o a uno o más análogos de CRF. Además de utilizar células que expresan los CRFR de longitud total, las células se pueden diseñar de modo que expresen CRFR que contengan el dominio de unión al ligando del receptor acoplado a elementos indicadores, o físicamente modificado para que los contengan, o que interactúen con proteínas de señalización. Por ejemplo, un CRFR salvaje o un fragmento de CRFR puede ser fusionado a una proteína G dando lugar a una activación de la proteína G fusionada tras la unión agonista a la parte CRFR de la proteína de fusión (Siefert, R. y col., Trends Pharmacol. Sci. 20: 383-389 (1999)). Las células deberían también poseer preferiblemente una serie de características, dependiendo de la lectura, para maximizar la respuesta inductiva por el CRF o el análogo de CRF, por ejemplo, para detectar una inducción fuerte de un gen indicador CRE sería ventajoso: (a) un nivel bajo natural de AMPc; (b) proteínas G capaces de interaccionar con los CRFR; (c) un elevado nivel de adenilil ciclasa; (d) un elevado nivel de proteína quinasa A; (e) un bajo nivel de fosfodiesterasas y (f) un alto nivel de proteína de unión al elemento de respuesta a AMPc. Para aumentar la respuesta al CRF o a un análogo de CRF se podrían diseñar células hospedadoras que expresasen una cantidad mayor de factores favorables o una cantidad menor de factores desfavorables. Además, se podrían eliminar vías alternativas para la inducción del indicador de CRE para reducir los niveles basales.

En algunos casos, las respuestas del receptor acoplado a proteínas G disminuye o se desensibiliza después de una exposición prolongada a un agonista. Otra realización de la invención proporciona métodos para identificar compuestos que prolongan o aumentan la activación inducida por el agonista del CRF_{2}R, o la ruta de transducción de señales del CRF_{2}R, como respuesta a un agonista del CRF_{2}R. Estos compuestos pueden utilizarse, por ejemplo, junto con un agonista del CRF_{2}R para tratar la atrofia del músculo esquelético. De forma típica el método utiliza un ensayo basado en células que comprende en cualquier orden o al mismo tiempo (i) poner en contacto las células con un compuesto experimental; (ii) tratar células que expresan el CRF_{2}R funcional con un agonista del CRF_{2}R a una concentración de agonista y durante un período de exposición agonista-receptor suficientes para permitir la desensibilización del receptor; y (iii) determinar el nivel de activación del CRF_{2}R. El experto en la técnica reconocerá que existen diferentes mecanismos que contribuyen a la desensibilización del receptor incluyendo, aunque no de forma limitativa, fosforilación del receptor, internalización o degradación del receptor y modulación a la baja de la ruta de transducción de señales del CRFR. El experto en la técnica puede determinar el momento apropiado (es decir, antes, durante o después del tratamiento con agonistas) para poner en contacto las células con los compuestos experimentales en función del mecanismo de desensibilización pretendido. Por ejemplo, el hecho de poner en contacto las células con compuestos experimentales después del tratamiento con agonistas permite detectar compuestos experimentales que bloquean la desensibilización del receptor producida como consecuencia de la fosforilación de este.

En otra realización, la invención proporciona un método para analizar uno o más compuestos experimentales e identificar compuestos candidatos que regulan la transcripción del gen CRF_{2}R o la expresión del CRF_{2}R. Los compuestos candidatos que regulan la actividad transcripcional de genes de CRFR pueden ser identificados utilizando un gen indicador operativamente asociado con una región reguladora del CRF_{2}R (construcción de gen indicador). Estos métodos son conocidos en la técnica. En uno de estos métodos, la construcción del gen indicador se pone en contacto con un compuesto experimental en presencia de una fuente de factores celulares y se determina el nivel de expresión del gen indicador. Un compuesto experimental que produce un aumento del nivel de expresión, con respecto a una muestra de control, indica un compuesto candidato que aumenta la transcripción del gen CRF_{2}R. Para proporcionar los factores celulares necesarios para la transcripción in vitro o in vivo se preparan células o extractos celulares apropiados de cualquier tipo celular que normalmente exprese el CRF_{2}R.

Los compuestos candidatos que regulan la expresión del CRF_{2}R también pueden ser identificados con un método en donde una célula es puesta en contacto con un compuesto experimental para determinar la expresión del CRFR. El nivel de expresión del CRF_{2}R en presencia del compuesto experimental se compara con el nivel de expresión en ausencia del compuesto experimental. Los compuestos experimentales que aumentan la expresión del CRF_{2}R son identificados como compuestos candidatos para aumentar la masa muscular o la función muscular. Este método detecta compuestos candidatos que aumentan la transcripción o la traducción del CRF_{2}R o que aumentan la estabilidad del ARNm o la proteína de CRF_{2}R.

En otra realización, esta invención proporciona métodos para analizar uno o más compuestos experimentales e identificar compuestos candidatos que regulan la expresión del CRF o de un análogo de CRF. Estos ensayos se realizan prácticamente como se ha descrito anteriormente para identificar compuestos candidatos que regulan la expresión del CRFR realizando las siguientes modificaciones. Para identificar un compuesto candidato que regule la transcripción del gen de CRF o un gen del análogo del CRF, el gen indicador debe estar operativamente asociado con la región reguladora del gen de CRF o del gen del análogo del CRF de interés y la fuente de factores celulares debería ser de un tipo celular que expresara el gen de interés.

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VII. Ensayos de compuestos candidatos utilizando modelos de atrofia del músculo esquelético

Los compuestos candidatos seleccionados de uno o más compuestos experimentales mediante ensayo in vitro, como se ha descrito anteriormente, pueden ser analizados también para comprobar su capacidad para regular la masa o la función del músculo esquelético en sistemas modelo de atrofia e/o hipertrofia del músculo esquelético. Estos modelos de atrofia o hipertrofia del músculo esquelético incluyen modelos de cultivo celular in vitro y modelos animales in vivo de atrofia del músculo esquelético. Estos niveles adicionales de análisis son útiles para limitar aún más el intervalo de compuestos candidatos que merecen una investigación adicional, p. ej., en ensayos clínicos.

Modelos de cultivo celular de atrofia muscular

Los modelos in vitro de atrofia del músculo esquelético son conocidos en la técnica. Estos modelos se describen, por ejemplo, en Vandenburgh, H.H., In vitro 24:609-619 (1988), Vandenburgh, H.H. y col., J de Biomechanics, 24 Suppl 1:91-99 (1991), Vandenburgh, H.H y col., In Vitro Cell. Dev. Biol., 24(3):166-174 (1988), Chromiak, J.A. y col., In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim., 34(9):694-703 (1998), Shansky, J. y col., In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim., 33(9):659-661 (1997), Perrone, C.E. y col., J. Biol. Chem. 270(5):2099-2106 (1995), Chromiac, J.A. y Vandenburgh, H.H., J. Cell. Physiol. 159(3):407-414 (1994), y Vandenburgh, H.H. y Karlisch, P., In Vitro Cell. Dev. Biol. 25(7):607-616 (1989). Estos modelos son útiles, aunque no necesarios, después del análisis in vitro descrito anteriormente para estrechar aún más el intervalo de compuestos candidatos que merecen ser estudiados en un modelo animal. Los modelos de cultivo celular son tratados con compuestos candidatos para medir la respuesta del modelo al tratamiento y evaluar los cambios en los marcadores musculares tales como: síntesis o degradación de la proteína muscular, cambios en la masa o la función contráctil del músculo esquelético. Aquellos compuestos que inducen cambios significativos en los marcadores musculares son de forma típica analizados adicionalmente en un modelo animal de atrofia del músculo esquelético.

Modelos animales de atrofia del músculo esquelético

Los compuestos candidatos son administrados a animales no humanos y se controla la respuesta de estos animales, por ejemplo, evaluando los cambios en los marcadores de atrofia o hipertrofia tales como: masa del músculo esquelético, función del músculo esquelético, sección transversal de músculo o miofibra, contenido de proteínas contráctiles, contenido de proteínas no contráctiles o un marcador bioquímico o genético relacionado con los cambios de masa o función del músculo esquelético. Los compuestos candidatos que inducen hipertrofia del músculo esquelético o impiden cualquier aspecto de la atrofia del músculo esquelético deberían ser considerados como candidatos terapéuticos prospectivos para el tratamiento de la atrofia del músculo esquelético humano y reciben el nombre en la presente memoria de compuestos candidatos terapéuticos. En estos análisis, además de valorar la capacidad de un compuesto candidato para regular la atrofia del músculo esquelético, también pueden detectarse efectos adversos no deseables como la toxicidad. La ausencia de un elevado nivel no aceptable de efectos adversos puede utilizarse como otro criterio para la selección de compuestos candidatos terapéuticos.

En la técnica se conocen diversos modelos animales de atrofia del músculo esquelético, como los descritos en las siguientes referencias: Herbison, G.J. y col. Arch. Phys. Med. Rehabil. 60:401-404 (1979), Appell, H-J. Sports Medicine 10:42-58 (1990), Hasselgren, P-0. y Fischer, J.E. World J. Surg. 22:203-208 (1998), Agbenyega, E.T. y Wareham, A.C. Comp. Biochem. Physiol. 102A:141-145 (1992), Thomason, D.B. y Booth, F.W. J. App. Physiol. 68:1-12 (1990), Fitts, R.H. y col. J. Appl. Physiol. 60:1946-1953 (1986), Bramanti, P. y col. Int. J. Anat. Embryol. 103:45-64 (1998), Cartee, G.D. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 50:137-141 (1995), Cork, L.C. y col. Prog. Clin. Biol. Res. 229:241-269 (1987), Booth, F.W. y Gollnick, P.D. Med. Sci. Sports Exerc. 15:415-420 (1983), Bloomfield, S.A. Med. Sci. Sports Exerc. 29:197-206 (1997). Los animales preferidos para estos modelos son ratones y ratas. Estos modelos incluyen, por ejemplo, modelos de atrofia inducida por la falta de uso, como inmovilización de extremidades por escayolado o por otros medios, suspensión de la extremidad posterior, inmovilización completa del animal y situaciones de gravedad reducida. Los modelos de atrofia inducida por daño nervioso incluyen, por ejemplo, compresión nerviosa, extirpación de secciones de nervios que inervan músculos específicos, administración de toxina a los nervios e infección de nervios con agente infecciosos víricos, bacterianos o eucarióticos. Los modelos de atrofia inducida por glucocorticoides incluyen la administración de dosis inductoras de atrofia de glucocorticoides exógenos a animales y la estimulación de la producción endógena de corticosteroides, por ejemplo, mediante la administración de hormonas que activan el eje hipotálamo-hipofisario-suprarrenal (HPA). Los modelos de atrofia inducida por septicemia incluyen, por ejemplo, la inoculación con microorganismos inductores de septicemia, como bacterias, el tratamiento del animal con compuestos inmunoactivadores, como extracto de la pared celular bacteriana o endotoxina y punción de la pared intestinal. Los modelos de atrofia inducida por caquexia incluyen, por ejemplo, la inoculación de un animal con células tumorigénicas con potencial de inducción de caquexia, infección de un animal con agentes infecciosos (como los virus que causan SIDA) que producen caquexia y el tratamiento de un animal con hormonas o citoquinas tales como CNTF, TNF, IL-6, IL-1, etc. que inducen caquexia. Los modelos de atrofia inducida por insuficiencia cardiaca incluyen la manipulación de un animal de modo que la insuficiencia cardiaca se produzca con atrofia del músculo esquelético concomitante. Los modelos de atrofia inducida por enfermedad neurodegenerativa incluyen modelos de animales autoinmunes como los resultantes de la inmunización de un animal con componentes neuronales. Los modelos de atrofia inducidos por distrofia muscular incluyen modelos de distrofia muscular naturales o artificiales inducidos genéticamente tales como la mutación del gen de la distrofina que se produce en el ratón Mdx.

Los modelos animales de hipertrofia del músculo esquelético incluyen, por ejemplo, modelos de mayor uso del músculo de una extremidad. debido a la inactivación de la extremidad opuesta, ajuste del peso después de un acontecimiento inductor de atrofia por falta de uso, reutilización de un músculo atrofiado por un daño nervioso transitorio, mayor uso de músculos selectivos debido a inactivación de un músculo sinérgico (p. ej., hipertrofia compensatoria), mayor utilización muscular debido a una mayor carga colocada en el músculo e hipertrofia resultante de la retirada del glucocorticoide tras una atrofia inducida por glucocorticoides. Los modelos de la atrofia animal incluyen el modelo de atrofia por desnervación del nervio ciático, el modelo de atrofia inducida por glucocorticoides y el modelo de atrofia por falta de uso de una pata escayolada, que se describen a continuación más detalladamente.

El modelo de atrofia por desnervación del nervio ciático implica anestesiar al animal y posteriormente extirpar quirúrgicamente un segmento corto del nervio ciático derecho o izquierdo (p. ej. en ratones el nervio ciático se aísla aproximadamente en el punto medio del fémur) y extraer un segmento de 3 a 5 mm. Esto produce la desnervación de la extremidad posterior izquierda dando lugar a la atrofia de estos músculos. De forma típica, la inervación del bíceps femoral se deja intacta para permitir un movimiento satisfactorio de la rodilla para que la ambulación sea prácticamente normal. De forma típica, en los animales no tratados, a los 10 días de la desnervación la masa muscular de los músculos denervados se reduce del 30 al 50%. Tras la desnervación, los compuestos experimentales son administrados, p. ej., mediante inyección o infusión continua, p. ej., tras la implantación de una minibomba osmótica (p. ej., Alzet, Palo Alto, CA), para determinar su efecto sobre la atrofia del músculo esquelético inducida por desnervación. En diversos momentos después de la desnervación los animales son eutanizados y los músculos de las patas inferiores son diseccionados rápidamente, tanto de las patas denervadas como de las no denervadas, y los músculos, limpios de tendones y de tejido conjuntivo, son pesados. Se analiza el grado de atrofia de los músculos afectados, por ejemplo, midiendo la masa muscular, la sección transversal del músculo, la sección transversal de la miofibra o el contenido de proteína contráctil.

El modelo de atrofia inducida por glucocorticoides implica la administración de un glucocorticoide al animal de ensayo, p. ej. 1,2 mg/kg/día de dexametasona en el agua de bebida. De forma típica, en los animales no tratados a los 10 días de la administración de dexametasona la masa de músculo esquelético se reduce del 30 al 50%. De forma concomitante con o después de la administración de glucocorticoides, se administran compuestos experimentales, p. ej., mediante inyección o infusión continua, para determinar su efecto sobre la atrofia inducida por glucocorticoides del músculo esquelético. En diversos momentos tras la administración de glucocorticoides se analiza el grado de atrofia de los músculos afectados tal como se ha descrito anteriormente para el modelo de desnervación.

El modelo de atrofia por falta de uso debido al escayolado de la pata implica el escayolado de una pata trasera de un animal desde la rodilla hasta el pie. De forma típica, a los 10 días del escayolado la masa muscular se reduce del 20 al 40%. Después del escayolado se administran compuestos experimentales mediante inyección o infusión continua a través de implantación de una minibomba osmótica (p. ej., Alzet, Palo Alto, CA) para determinar su efecto sobre la atrofia del músculo esquelético inducida por escayolado de la pata. En diversos momentos tras el escayolado de la pata se analiza el grado de atrofia en los músculos afectados tal como se ha descrito anteriormente para el modelo de desnervación.

El experto en la técnica reconocerá que al analizar compuestos para el uso humano y debido a las diferencias entre el CRF_{2}R humano y el CRF_{2}R de otras especies animales, pueden obtenerse algunos resultados falso positivos o negativos durante la realización del análisis con CRF_{2}R no humano. Por consiguiente, es preferible realizar el análisis inicial in vitro con CRF_{2}R humano. En ciertas circunstancias, algunos compuestos candidatos identificados pueden ser activos sólo para el receptor humano y no para el receptor no humano. En estas circunstancias, aún puede ser deseable determinar si estos compuestos candidatos pueden regular la masa o la función del músculo esquelético en un segundo nivel de análisis. Dado que estos candidatos no activan el CRF_{2}R no humano, no se recomienda un análisis in vivo convencional con un animal no humano. En estas circunstancias el segundo nivel de análisis para estos candidatos puede realizarse en animales transgénicos que expresan CRFR humano.

Para generar animales con CRFR transgénico pueden utilizarse animales de cualquier tipo, especialmente mamíferos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, ratones, ratas, conejos, cobayas, cerdos, cabras, perros y primates no humanos. Se prefieren los ratones y las ratas, siendo los ratones los más preferidos. En la técnica se conocen diferentes métodos que pueden utilizarse para introducir los transgenes de CRFR humano en animales y obtener las líneas originales de animales transgénicos. Estas técnicas incluyen, aunque no de forma limitativa, microinyección pronuclear, transferencia génica mediada por retrovirus a líneas germinales, localización específica de genes en células madre embriónicas, electroporación de embriones y transferencia génica mediada por esperma.

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VIII. Métodos de terapia génica para tratar la atrofia del músculo esquelético

La actividad general del CRF_{2}R puede aumentarse mediante sobreexpresión de un gen para CRF_{2}R (para aumentar la expresión del CRF_{2}R) o un CRF_{2}R constitutivamente activo en el tejido apropiado. El nivel de CRF puede aumentarse, in vivo, mediante una sobreexpresión análoga de un gen del CRF. La sobreexpresión de estos genes aumentará la actividad celular total del CRF_{2}R, regulando así la atrofia del músculo esquelético. El gen o los genes de interés son insertados en un vector adecuado para su expresión en el sujeto. Estos vectores incluyen, aunque no de forma limitativa, adenovirus, virus asociados a adenovirus, vectores de retrovirus y herpesvirus además de otras partículas que han introducido ADN en las células (p. ej., liposoma, partículas de oro, etc.) o mediante inyección directa del vector de expresión de ADN que contiene el gen de interés en el tejido humano (p. ej., músculo).

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IX. Formulaciones farmacéuticas y métodos de utilización

Los compuestos candidatos o compuestos candidatos terapéuticos identificados por los métodos de selección descritos en la presente memoria pueden ser administrados a personas para tratar la atrofia del músculo esquelético o para inducir la hipertrofia del músculo esquelético. A este fin, la presente invención abarca la fabricación de medicamentos para modular la atrofia del músculo esquelético, incluyendo, aunque no de forma limitativa, la atrofia del músculo esquelético inducida por falta de uso debido a cirugía, reposo en cama, rotura de hueso; desnervación/daño nervioso debido a lesión de la médula espinal; enfermedad autoinmune; enfermedad infecciosa; uso de glucocorticoides para afecciones no relacionadas; sepsis debida a infección u otras causas; limitación de nutrientes debida a enfermedad o inanición; caquexia cancerosa; inflamación crónica; caquexia asociada al SIDA; EPOC; insuficiencia cardiaca congestiva; sarcopenia y trastornos genéticos, p. ej., distrofias musculares o enfermedades neurodegenerativas. Los agonistas de CRF_{2}R pueden utilizarse para inhibir la atrofia del músculo esquelético. No es necesario que los compuestos eficaces presenten una especificidad absoluta por el CRFR. Se contempla la administración simultánea de antagonistas específicos de otros receptores afectados y un agonista eficaz pero no específico. De forma alternativa, esta ausencia de especificidad puede ser tratada mediante modulación solo de la dosis o de la posología.

Los compuestos candidatos o los compuestos candidatos terapéuticos identificados por los métodos de selección de la presente invención pueden ser administrados junto con compuestos que prolonguen o aumenten la activación de un CRF_{2}R o de una ruta de transducción de señales del CRF_{2}R. Estos compuestos pueden ser compuestos conocidos, por ejemplo, teofilina, o también pueden ser compuestos identificados mediante los métodos de selección de esta invención para prolongar o aumentar la activación de un receptor CRF_{2}R o de una ruta de transducción de señales del CRF_{2}R.

Determinación de la dosis

La seguridad y la eficacia terapéutica de los compuestos que agonizan el CRFR pueden ser determinadas por procedimientos convencionales utilizando tecnologías in vitro o in vivo. Se prefieren los compuestos que presentan elevados índices terapéuticos, aunque los compuestos con índices terapéuticos inferiores son útiles si el nivel de efectos adversos es aceptable. Los datos obtenidos mediante las técnicas toxicológicas y farmacológicas in vitro e in vivo pueden utilizarse para formular el intervalo de dosis que puede resultar útil en los seres humanos. La dosis preferida está en el intervalo en el cual la concentración circulante del compuesto es máxima desde el punto de vista terapéutico con una seguridad aceptable. La concentración circulante del compuesto puede variar en función de la forma de dosificación, el tiempo postdosificación, la ruta de administración, etc. Las dosis fuera de este intervalo también son útiles siempre que los efectos adversos sean aceptables. Pueden utilizarse aspectos como la edad, el peso del paciente, y similares, para determinar estos aspectos en la forma convencional. Los métodos farmacogenéticos pueden ser útiles para optimizar la selección del compuesto, las dosis y la posología en las poblaciones clínicas.

Formulación y uso

Las composiciones farmacéuticas para usar en la modulación de la atrofia del músculo esquelético de acuerdo con la presente invención pueden ser formuladas mediante metodologías convencionales con vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones de la presente invención se proporcionan preferiblemente en una forma farmacéutica unitaria. En la presente memoria, una "forma farmacéutica unitaria" es una composición de esta invención que contiene una cantidad de un agonista del CRF_{2}R que es adecuada para su administración a un animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano, en una dosis única, según las buenas prácticas médicas. Las composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas para una administración, por ejemplo, intranasal, transdérmica, de inhalación, parenteral, cutánea, oral o rectal. Para la administración oral, la composición farmacéutica puede adoptar la forma de pastillas o cápsulas que contienen el compuesto farmacológicamente activo y aditivos incluyendo, aunque no de forma limitativa, aglutinantes, cargas, lubricantes, disgregantes o agentes humectantes. Las pastillas pueden ser recubiertas. Las preparaciones líquidas para la administración oral incluyen, aunque no de forma limitativa, jarabes, suspensiones o productos secos que son reconstituidos con un vehículo líquido antes de su uso y que contienen el compuesto farmacológicamente activo y aditivos incluyendo, aunque no de forma limitativa, agentes de suspensión, emulsionantes, vehículos no acuosos, conservantes, sales tamponadoras, saborizantes, colorantes, edulcorantes, etc. Las composiciones farmacéuticas para la administración oral pueden ser formuladas para una liberación controlada del compuesto farmacológicamente activo en la boca, el estómago o el tracto intestinal.

Para la administración por inhalación, los compuestos para usar según la presente invención pueden ser administrados, aunque no de forma limitativa, en las siguientes formas: líquido, polvo, gel o en forma de un aerosol utilizando propelentes presurizados o no presurizados en dosis medidas previamente o no medidas previamente. El compuesto farmacológicamente activo puede ser formulado con cargas, vehículos, conservantes, tampones, etc., apropiados. Para la administración parenteral, el compuesto farmacológicamente activo puede ser formulado con vehículos fisiológicamente aceptables, conservantes, etc. y preparado como suspensiones, soluciones, emulsiones, polvos listos para la reconstitución, etc. para su inyección en bolo o infusión. Las dosis de estos compuestos pueden ser administradas mediante diferentes tecnologías, incluyendo agujas hipodérmicas, dispositivos a alta presión, etc. Para la administración rectal, el compuesto farmacológicamente activo puede ser formulado con vehículos fisiológicamente aceptables, conservantes, etc. para su administración como supositorios, enemas, etc. Para la administración cutánea, el compuesto farmacológicamente activo puede ser formulado con vehículos fisiológicamente aceptables incluyendo lociones, emolientes, etc., o incorporado en un dispositivo tipo parche. Para una administración a largo plazo, el compuesto farmacológicamente activo y los aditivos apropiados tales como, aunque no de forma limitativa, polímeros, materiales hidrófobos, resinas, etc. puede ser formulado como una preparación de acción prolongada para inyección o implantación en múltiples sitios, incluyendo de forma no excluyente ubicaciones intramusculares y subcutáneas. Además, el compuesto farmacológicamente activo puede ser administrado por un dispositivo dispensador.

Monitorización de efectos durante los ensayos clínicos

La monitorización del efecto de compuestos (p. ej., fármacos) sobre la expresión o la actividad del CRF_{2}R puede realizarse no sólo en los análisis básicos de fármacos sino también en los ensayos clínicos. Por ejemplo, la eficacia de un compuesto, determinada en un ensayo de detección, para aumentar la actividad del receptor CRF_{2}R o la expresión del receptor CRF_{2}R puede ser valorada en ensayos clínicos de pacientes con, o con riesgo de, atrofia del músculo esquelético. Puede determinarse el efecto del compuesto sobre el paciente en diferentes momentos después de la administración del compuesto experimental o del placebo, por ejemplo, observando el cambio en las mediciones de masa del músculo esquelético, función del músculo esquelético, marcadores bioquímicos de fallo muscular o calidad de vida. Los métodos para medir la masa del músculo esquelético en seres humanos son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo: medición de la circunferencia de una extremidad; medición del espesor muscular mediante, por ejemplo, tomografía computerizada, IRM o resonancia supersónica; o biopsia muscular para examinar parámetros morfológicos y bioquímicos (p. ej., área de la sección transversal de la fibra, diámetro de la fibra o actividades enzimáticas). Además, dado que la masa del músculo esquelético está relacionada con la función del músculo esquelético, puede utilizarse la función muscular como un marcador sustitutorio de la masa y los cambios de masa muscular pueden ser valorados utilizando mediciones funcionales, p. ej., la resistencia, la fuerza de un grupo de músculos sinergistas o las características de contracción halladas en los registros electromiográficos. Además, la pérdida de proteína muscular como consecuencia de la atrofia muscular puede medirse cuantificando los niveles de aminoácidos o de derivados de aminoácidos, p. ej., 3-metil histidina, en la orina o la sangre de un sujeto. Para una revisión de estos métodos ver Appell, Sports Med. 10:42-58 (1990). Las mediciones de la calidad de vida incluyen, aunque no de forma limitativa, la facilidad para levantarse de una silla, el número de pasos dados antes de la aparición del cansancio o la capacidad para subir escaleras.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Construcción de vectores para la expresión del receptor CRF_{2}R humano

Se extrae la secuencia de ADN del CRF_{2}R humano (CRF_{2}Rh), N.º de registro E12752, y se sintetizan dos oligonucleótidos, incluido uno que contiene el extremo 5' del gen que comienza en el codón de inicio (oligonucleótido 5') y otro que contiene el extremo 3' del gen que contiene el codón de terminación (oligonucleótido 3'). Estos oligonucleótidos están diseñados para contener sitios de endonucleasa de restricción que no están presentes en el gen CRF_{2}Rh con un único sitio en el oligonucleótido 5' y un único sitio de endonucleasa de restricción diferente en el oligonucleótido 3'. Además, el oligonucleótido 3' contiene una secuencia señal de poliadenilación añadida. El ADNc bicatenario de músculo esquelético humano puede adquirirse a QUICK-Clone cDNA collection (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.). Utilizando los oligonucleótidos 5' y 3' anteriores, el ADNc de CRF_{2}Rh es amplificado mediante PCR del ADNc del músculo esquelético humano utilizando el kit AdvanTaq PCR (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.). El producto de la PCR del gen CRF_{2}Rh es purificado de artefactos de la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa y el fragmento de ADN del gen de CRF_{2}Rh es purificado en el gel de agarosa utilizando un producto de purificación tal como NucleoTrap (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.).

La clonación del producto de la PCR de CRF_{2}Rh en el vector pIRESneo (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.) se realiza cortando primero el producto de la PCR de CRF_{2}Rh y el vector pIRESneo con las endonucleasas de restricción apropiadas de manera que los sitios 5' y 3' de las endonucleasas de restricción queden listos para la ligadura. El ADN del vector pIRESneo es ligado al ADN del producto de la PCR de CRF_{2}Rh utilizando ADN ligasa, del kit AdvantAge^{TM}PCR Cloning (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.), según las recomendaciones del fabricante. La construcción vector ligado + inserto (pIRESneo/CRF_{2}Rh) es después utilizada para transformar células competentes de E. coli TOP10F' (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.). Las células transformadas se colocan en agar que contiene LB/X-gal/IPTG más ampicilina. Se seleccionan las colonias blancas (clones positivos) y se cultivan individualmente en medio LB. El ADN de plásmido se aísla utilizando NucleoBond DNA Purification System (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.). Se secuencia el inserto de al menos un clon para garantizar que la secuencia de CRF_{2}Rh es correcta. Las células HEK293 que contienen un plásmido Mercury CRE-LUC (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.) integrado de forma estable son transfeccionadas con pIRESneo/ ADN de CRF_{2}Rh purificado que tiene el inserto de secuencia correcto utilizando el kit de transfección de mamífero CalPhos^{TM} (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU. Se seleccionan las células transfeccionadas de modo estable con pIRESneo/ADN de CRF_{2}Rh y se cultivan las células en G418. Las células transfeccionadas de modo estable (células HEK293/CRE-LUC/pIRESneo/ CRF_{2}Rh) son propagadas en DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) que contienen 10% de suero fetal bovino (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.), solución de penicilina/estreptomicina (Life Technologies, Rockville, MD), L-glutamina (Life Technologies, Rockville, MD) y aminoácidos no esenciales (Life Technologies, Rockville, MD) a 37ºC en una atmósfera compuesta por 5% de dióxido de carbono/95% de aire. Los clones se caracterizan por su unión a CRF y la activación de CRE-LUC tras la exposición a CRF, como se describe en el Ejemplo 2 y el Ejemplo 3. Las células que expresan el receptor CRF_{2}Rh a un nivel apropiado y que se acoplan de forma apropiada al sistema indicador CRE-LUC se utilizan después para un análisis posterior.

Ejemplo 2

Ensayos de unión al receptor

El análisis de unión al receptor de compuestos se realiza en células completas colocando las células HEK293/CRE-LUC/pIRESneo/CRF_{2}Rh del Ejemplo 1 en una placa de 96 pocillos recubierta con polilisina. Las células se siembran en medio DMEM que contiene 10% de suero fetal bovino, solución de penicilina/estreptomicina, L-glutamina y aminoácidos no esenciales a 37ºC en una atmósfera compuesta por 5% de dióxido de carbono/95% de aire y se incuban durante la noche. Se retira el medio de cultivo y se añade la cantidad apropiada de CRF marcada covalentemente con europio (Eu-CRF) en MEM (Life Technologies, Rockville, MD) + 10% de Seablock (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.). Las células se incuban con el Eu-CRF durante 90 minutos a temperatura ambiente y después se lavan 4 veces con solución salina tamponada con fosfato sin magnesio ni calcio (Life Technologies, Rockville, MD). Tras el lavado final se agrega solución potenciadora (Wallac Inc., Gaithersburg, MD) y la placa se lee en un lector de placas Wallac (Wallac Inc., Gaithersburg, MD) utilizando el programa BioWorks Europium. Para el análisis de unión por saturación se añaden a las células dosis logarítmicas de Eu-CRF en el intervalo de 10(-12) a 10(-3) M y se analiza la unión en ausencia y en presencia de una concentración de saturación de CRF no marcado para evaluar la unión no específica. Para la unión competitiva se agrega una concentración de Eu-CRF que es la mitad de la máxima, en términos de unión, además de diferentes concentraciones del compuesto de interés.

Ejemplo 3

Ensayo de activación del receptor

El análisis de activación del receptor se realiza sembrando las células HEK293/CRE-LUC/pIRESneo/CRF_{2}Rh del Ejemplo 1 en una placa Packard View Plate-96 (Packard Inc., CA). Las células se siembran en medio DMEM que contiene 10% de suero fetal bovino, solución de penicilina/estreptomicina, L-glutamina y aminoácidos no esenciales a 37ºC en una atmósfera compuesta por 5% de dióxido de carbono/95% de aire y se incuban durante la noche. El medio es después eliminado y sustituido por DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) que contiene 0,01% de albúmina bovina (fracción V) (SIGMA, St. Louis, MO) que contiene el compuesto de interés. Las células son después incubadas durante cuatro horas a 37ºC en una atmósfera compuesta por 5% de dióxido de carbono/95% de aire, después de lo cual se elimina el medio y se lavan las células dos veces con Hanks Balanced Salt Solution (Life Technologies, Rockville, MD). Después se añade reactivo de lisis (Promega Inc., Madison, WI) a las células lavadas, las cuales son después incubadas durante 20 minutos a 37ºC en una atmósfera compuesta por 5% de dióxido de carbono/95% de aire. Las células se colocan a continuación a -80ºC durante 20 minutos y después se realiza una incubación durante 20 minutos a 37ºC en una atmósfera compuesta por 5% de dióxido de carbono/95% de aire. Tras esta incubación se añade tampón con luciferasa y sustrato de luciferasa (Promega Inc., Madison, WI) a los lisados celulares y se cuantifica la actividad de la luciferasa con un luminómetro. La actividad relativa de un compuesto se evalúa comparando el aumento tras la exposición con un compuesto al nivel de luciferasa en las células HEK que contienen la construcción CRE-LUC sin el CRF_{2}Rh tras la exposición al compuesto. La especificidad de la respuesta también se calcula evaluando la respuesta de la luciferasa de las células de CRF_{2}Rh/CRE-LUC HEK al compuesto en presencia y en ausencia de un exceso 10 veces superior de antagonista de CRF_{2}Rh.

Ejemplo 4

Ensayos para identificar compuestos candidatos que prolonguen o aumenten la activación del CRF_{2}R y/o de una ruta de transducción de señales del receptor CRF_{2}R

La identificación de compuestos que prolongan o aumentan la activación inducida por el agonista del CRF_{2}R o de una ruta de transducción de señales del CRF_{2}R implica realizar una variación en el ensayo de activación del receptor descrito en el Ejemplo 3. En particular, este ensayo se realiza sembrando las células de HEK293/ CRE-LUC/pIRESneo/receptor CRF_{2}Rh en una placa Packard View Plate-96 (Packard Inc., CA). Las células se siembran en medio DMEM que contiene 10% de suero fetal bovino, solución de penicilina/estreptomicina, L-glutamina, aminoácidos no esenciales y cantidades de saturación de CRF a 37ºC en una atmósfera compuesta por 5% de dióxido de carbono/95% de aire y después se incuban durante 48 horas. El medio es después eliminado y sustituido por DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) que contiene 0,01% de albúmina bovina (fracción V) (SIGMA, St. Louis, MO) y CRF, además del compuesto de interés. Las células son después incubadas durante cuatro horas a 37ºC en una atmósfera compuesta por 5% de dióxido de carbono/95% de aire, después de lo cual se elimina el medio y las células se lavan dos veces con Hanks Balanced Salt Solution (Life Technologies, Rockville, MD). Después se añade el reactivo de lisis (Promega Inc., Madison, WI) a las células lavadas y estas se incuban durante 20 minutos a 37ºC en una atmósfera compuesta por 5% de dióxido de carbono/95% de aire. Las células se colocan a -80ºC durante 20 minutos y a continuación se incuban durante 20 minutos a 37ºC en una atmósfera compuesta por 5% de dióxido de carbono/95% de aire. Después de esta incubación se añade a los lisados celulares tampón con luciferasa y sustrato de luciferasa (Promega Inc., Madison, WI) y se cuantifica la actividad de la luciferasa con un luminómetro. Los compuestos experimentales que estimulan la fluorescencia de forma significativa por encima del nivel del de las células de control no tratadas, una vez realizadas las correcciones necesarias para las variaciones de densidad celular, son considerados compuestos candidatos para regular la masa o la función del músculo esquelético. Los compuestos de mayor interés son aquellos que inducen un nivel de fluorescencia relativamente superior.

Ejemplo 5

Ensayos para identificar compuestos candidatos específicos para CRF_{2}R

Los compuestos que activan el CRF_{2}R son identificados como en el Ejemplo 3. Para seleccionar los compuestos que muestran más selectividad por CRF_{2}R que por CRF_{1}R también se analizan estos compuestos frente a CRF_{1}R. Las células HEK293/CRE-LUC/pIRESneo/CRFh_{1}R son generadas básicamente como se describe en el Ejemplo 1 salvo que se utiliza la secuencia de ADN humano de CRF_{1}R (CRFh_{1}R), N.º de registro X72304, para la amplificación inicial mediante PCR. Para determinar la actividad de los compuestos frente a CRF_{1}R se realiza un ensayo de activación prácticamente como se ha descrito en el Ejemplo 3 salvo que para sembrar las placas se utilizan células HEK293/CRE-LUC/pIRESneo/CRFh_{1}R. Se compara la cantidad de fluorescencia estimulada por el compuesto en las células que expresan CRF_{2}R con la cantidad de fluorescencia estimulada por el compuesto en las células que expresan CRF_{1}R. Aquellos compuestos que muestran una respuesta 10 veces mejor (en base molar) en las células que expresan CRF_{2}R que en las células que expresan CRF_{1}R son después analizadas más detalladamente para estudiar la especificidad de respuesta y eliminar las diferencias debidas a la variación clonal. Las células HEK293/CRE-LUC/pIRESneo/CRF_{2}Rh son analizadas con el compuesto en presencia o en ausencia de un exceso 10 veces superior del antagonista de CRF_{2}R antisauvagina-30. Aquellos compuestos que muestran una selectividad 10 veces superior por el CRF_{2}R y cuya actividad es inhibida por la antisauvagina-30 son seleccionados como compuestos candidatos.

Ejemplo 6

Ensayos para identificar compuestos candidatos que aumentan la expresión del CRF_{2}Rh

La secuencia que contiene la región promotora del gen CRF_{2}Rh que comienza lo suficientemente lejos corriente arriba con respecto al sitio de iniciación transcripcional para contener todos los elementos reguladores necesarios para la expresión fisiológica del gen CRF_{2}Rh en el tejido apropiado se extrae de la base de datos de genomas humanos. Se sintetizan dos oligonucleótidos, uno que contiene el extremo 5' de la región promotora (oligonucleótido 5') y otro que contiene el extremo 3' de la región promotora, incluido el sitio de iniciación transcripcional (oligonucleótido 3'). Estos oligonucleótidos también contienen sitios de endonucleasa de restricción que no están presentes en la región reguladora del gen CRF_{2}Rh con un único sitio en el oligonucleótido 5' y un único sitio de endonucleasa de restricción diferente en el oligonucleótido 3'. Los oligonucleótidos 5' y 3' se utilizan para amplificar mediante PCR la región reguladora del gen CRF_{2}Rh de ADN humano (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.) utilizando el kit Advantage®Genomic PCR (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.). El producto de la PCR de la región reguladora del gen CRF_{2}Rh es purificado de artefactos de la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa y el fragmento de ADN de la región reguladora del gen CRF_{2}Rh es purificado en gel agarosa con un producto purificador tal como NucleoTrap (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.). La clonación del producto de la PCR de la región reguladora del gen CRF_{2}Rh en el vector pECFP-1 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.) se realiza cortando en primer lugar el producto de la PCR de la región reguladora del gen CRF_{2}Rh y el vector pECFP-1 con las endonucleasas de restricción apropiadas de manera que los sitios 5' y 3' de las endonucleasas de restricción queden listos para la ligadura. La ligadura del ADN del vector pECFP-1 al producto de la PCR de la región reguladora del gen CRF_{2}Rh ADN se realiza utilizando ADN ligasa del AdvantAge^{TM}PCR Cloning Kit (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.) según las recomendaciones del fabricante. La construcción vector ligado + inserto son después utilizados para transformar células competentes de E. coli TOP10F' (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.). Las células se colocan en agar que contiene LB más canamicina y se seleccionan las colonias resistentes a la canamicina para su análisis posterior. Los clones resistentes a la canamicina se cultivan en medio de canamicina que contiene LB, se aísla ADN de plásmido utilizando NucleoBond DNA Purification System (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.) y se analiza la construcción que contiene la región reguladora del gen de hVPAC_{2} mediante secuenciación del ADN para garantizar la corrección e integridad de la construcción. La construcción de ADN de plásmido purificada que contiene la región reguladora del gen CRF_{2}Rh es después transfeccionada en las células HEK293 mediante transfección mediada por fosfato cálcico con el kit de transfección en células de mamífero CalPhos^{TM} (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.). Los clones celulares transfeccionados se seleccionan utilizando G418, aislado y propagado en DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) que contiene 10% de suero fetal bovino (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.), solución de penicilina/estreptomicina (Life Technologies, Rockville, MD), L-glutamina (Life Technologies, Rockville, MD), aminoácidos no esenciales (Life Technologies, Rockville, MD) y G418 (Life Technologies, Rockville, MD) a 37ºC en una atmósfera compuesta por 5% de dióxido de carbono/95% de aire. Los clones resistentes a G418 se caracterizan mediante transferencia de Southern para garantizar que contienen la secuencia promotora del gen CRF_{2}Rh; además se analiza la activación de la región reguladora del gen CRF_{2}Rh utilizando un agente estimulante apropiado. Las células que expresan la región reguladora del gen CRF_{2}Rh-ECFP a un nivel apropiado son después utilizadas en ensayos diseñados para evaluar compuestos que pueden modular la actividad de la región reguladora del gen CRF_{2}Rh de la forma siguiente: El análisis de activación de la región reguladora se realiza sembrando las células HEK293 que contienen la región reguladora del gen CRF_{2}Rh-ECFP a una densidad apropiada en placas de microtitulación negras de 96 pocillos con fondo transparente y dejando crecer durante la noche. Al día siguiente se elimina el medio y el compuesto experimental se añade a un medio de crecimiento fresco. Las células son incubadas durante 16 horas a 37ºC en una atmósfera compuesta por 5% de dióxido de carbono/95% de aire y después se mide la fluorescencia (excitación a 433 (453) nm detectando la emisión a 475(501) nm con un fluorómetro (biolumin^{TM} 960, Molecular Dynamics/Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Los compuestos experimentales que estimulan la fluorescencia de forma significativa por encima del nivel de la fluorescencia de las células de control no tratadas, tras corregir las variaciones de densidad celular, son considerados como compuestos candidatos para regular la masa o la función del músculo esquelético. Los compuestos de mayor interés son aquellos que inducen un nivel de fluorescencia relativamente superior.

Ejemplo 7

Ensayos para identificar compuestos que aumentan la expresión del CRF humano

Los métodos para identificar compuestos que aumentan la expresión del CRF humano (CRFh) son prácticamente idénticos a aquellos utilizados para identificar compuestos que aumentan la expresión del receptor VPAC_{2}h salvo que la región reguladora utilizada es aquella para el gen de CRFh. La secuencia que contiene la región reguladora del gen de CRFh, que comienza lo suficientemente lejos corriente arriba con respecto al sitio de iniciación transcripcional para contener todos los elementos reguladores necesarios para la expresión fisiológica del gen de CRFh en el tejido apropiado se extrae de la base de datos de genomas humanos. Se sintetizan dos oligonucleótidos, uno que contiene el extremo 5' de la región reguladora (oligonucleótido 5') y el otro que contiene el extremo 3' de la región reguladora, incluido el sitio de iniciación transcripcional (oligonucleótido 3'). Estos oligonucleótidos también contienen sitios de endonucleasa de restricción que no están presentes en la región reguladora del gen de CRFh con un único sitio en el oligonucleótido 5' y un único sitio de endonucleasa de restricción diferente en el oligonucleótido 3'. Los oligonucleótidos 5' y 3' se utilizan para amplificar mediante PCR la región reguladora del gen de CRFh de ADN humano (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.) utilizando el kit Advantage®Genomic PCR (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.). El producto de la PCR de la región reguladora del gen de CRFh es purificado de artefactos de la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa y el fragmento de ADN de la región reguladora del gen de CRFh es purificado del gel agarosa con el producto purificador NucleoTrap (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.). La clonación del producto de la PCR de la región reguladora del gen de CRFh en el vector pECFP-1 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.) se realiza cortando en primer lugar el producto de la PCR de la región reguladora del gen de CRFh y el vector pECFP-1 con las endonucleasas de restricción apropiadas de manera que los sitios 5' y 3' de las endonucleasas de restricción queden listos para la ligadura. La ligadura del ADN del vector pECFP-1 al ADN del producto de la PCR de la región reguladora del gen de CRFh se realiza utilizando ADN ligasa del Advantage^{TM}PCR Cloning Kit (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.) según las recomendaciones del fabricante. La construcción vector ligado + inserto se usa después para transformar células competentes de E. coli TOP10F' (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.). Las células son colocadas en agar que contiene LB más canamicina y después se seleccionan las colonias resistentes a la canamicina para su análisis posterior. Los clones resistentes a la canamicina se cultivan en medio de canamicina que contiene LB y se aísla ADN de plásmido con NucleoBond DNA Purification System (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.) y la construcción que contiene la región reguladora del gen de CRFh se analiza mediante secuenciación del ADN para garantizar la corrección e integridad de la construcción. La construcción purificada de ADN de plásmido que contiene la región reguladora del gen de CRFh es después transfeccionada en las células HEK293 mediante transfección mediada por fosfato cálcico con el kit de transfección en células de mamífero CalPhos^{TM} (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.). Los clones celulares transfeccionados se seleccionan utilizando G418, aislado y propagado en DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) que contiene 10% de suero fetal bovino (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.), solución de penicilina/estreptomicina (Life Technologies, Rockville, MD), L-glutamina (Life Technologies, Rockville, MD), aminoácidos no esenciales (Life Technologies, Rockville, MD) y G418 (Life Technologies, Rockville, MD) a 37ºC en una atmósfera compuesta por 5% de dióxido de carbono/95% de aire. Los clones resistentes a G418 se identifican mediante transferencia de Southern para garantizar que contienen la secuencia de la región reguladora del gen de CRFh; además la activación de la región reguladora del gen de CRFh se analiza con un agente estimulante apropiado. Las células que expresan la región reguladora del gen de CRFh-ECFP a un nivel apropiado son después utilizadas en ensayos diseñados para evaluar compuestos que pueden modular la actividad de la región reguladora del gen de CRFh de la forma siguiente: El análisis de la activación de la región reguladora se realiza como en el Ejemplo 5 salvo que se utilizan clones que contienen la construcción de la región reguladora del gen de CRFh.

Ejemplo 8

Método para preparar anticuerpos humanos que activan el CRF_{2}Rh

Los anticuerpos monoclonales totalmente humanos que activan el CRF_{2}Rh se obtienen generando en primer lugar proteína CRF_{2}Rh recombinante de la forma siguiente: Se sigue el procedimiento del Ejemplo 1 para obtener el producto de la PCR de CRF_{2}Rh. Este producto de la PCR de CRF_{2}Rh es después clonado en el vector pHAT20 (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.) cortando en primer lugar el producto de la PCR del gen CRF_{2}Rh y el vector pHAT20 con las endonucleasas de restricción apropiadas de manera que los sitios 5' y 3' de las endonucleasas de restricción queden listos para la ligadura. La ligadura del ADN del vector pHAT20 al ADN del producto de la PCR del gen de CRF_{2}Rh se realiza utilizando ADN ligasa del AdvantAgeTMPCR Cloning Kit (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.) según las recomendaciones del fabricante. La construcción vector ligado + inserto es después utilizada para transformar células competentes de E. coli TOP10F' (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.). Las células transformadas son colocadas en agar que contiene LB más ampicilina y después se seleccionan las colonias resistentes a la ampicilina para un análisis posterior. Los clones positivos se cultivan en medio LB que contiene ampicilina y se aísla ADN de plásmido utilizando NucleoBond DNA Purification System (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.) y la construcción que contiene el gen CRF_{2}Rh se analiza mediante secuenciación del ADN para garantizar la corrección e integridad de la construcción. El ADN del vector CRF_{2}Rh-pHAT20 es después utilizado para una clonación adicional mediante una PCR utilizando un oligonucleótido 5' que contiene el comienzo de la secuencia HAT y un único sitio de endonucleasa de restricción no presente en la construcción CRF_{2}Rh -pHAT20 y el oligonucleótido 3' CRF_{2}Rh utilizado anteriormente. Los cebadores de oligonucleótido se utilizan para amplificar mediante PCR el gen de fusión HAT-CRF_{2}Rh de la construcción CRF_{2}Rh-pHAT20 y después se purifica el producto de la PCR como se ha descrito anteriormente. A continuación el producto de la PCR del gen de fusión HAT-CRF_{2}Rh se utiliza para la clonación en el vector pBacPAK8 utilizando el sistema de expresión BacPAK de baculovirus de Clonetech (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.). El ligado del gen de fusión HAT-CRF_{2}Rh en el vector pBacPAK8 es prácticamente igual a lo descrito anteriormente. La construcción CRF_{2}Rh/HAT-pBacPAK8 es después transfeccionada en células competentes de E. coli TOP10'F, se seleccionan las células resistentes a la ampicilina, se aísla el ADN de plásmido y se comprueba la integridad de la construcción como se ha descrito anteriormente. Esta construcción es después cotransfectada con ADN BacPAK6 linearizado en células hospedadoras Sf21 de insecto utilizando el kit de transfección en células de mamífero CalPhos^{TM} (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.). Las células de insecto son después incubadas durante 2-3 días y a continuación se cosecha el virus de las placas transparentes individuales. Después se amplifica el virus en células Sf21, se titula el virus cosechado y el virus titulado se utiliza para infección a gran escala de células Sf21 utilizando BacPAK Insect Cell Media - todo ello según las recomendaciones del fabricante (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.). La proteína de fusión HAT-CRF_{2}R recombinante es después purificada con el TALON® CellThru Purification Kit de Clonetech (Clonetech Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.) en las condiciones recomendadas por el fabricante. Brevemente, las células Sf21 infectadas son cosechadas 48 horas después de la infección y sonicadas en tampón de extracción/carga. El lisado celular se pasa después a través de una columna TALON® CellThru. La columna se lava dos veces con tampón de extracción/carga y la proteína HAT-CRF_{2}Rh unida se eluye con tampón de elución. Se analiza la integridad de la proteína eluída mediante SDS-PAGE y se cuantifica la concentración de proteína con el sistema Bio-Rad SDS-PAGE y los sistemas de cuantificación de proteínas según las recomendaciones del fabricante (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Ca). La proteína de fusión HAT-CRF_{2}Rh purificada se utiliza posteriormente para inmunizar animales XenoMouse (Abgenix Inc., Fremont, CA) y fabricar anticuerpos monoclonales humanos de la forma siguiente: Se utilizan 10 \mug de proteína de fusión HAT-CRF_{2}Rh recombinante purificada junto con 25 \mug de monofosforil lípido A adyuvante (Sigma, St. Louis, MO) para vacunar 10 animales XenoMouse repetidamente durante un período de ocho semanas. El suero, obtenido de animales vacunados, se utiliza en un ELISA de captura de antígeno con proteína de fusión HAT-CRF_{2}Rh purificada para detectar anticuerpos frente a la proteína HAT-CRF_{2}Rh recubriendo placas de ELISA de poliestireno (Corning Glass Works, Corning, NY) con proteína de fusión HAT-CRF_{2}Rh, bloqueada con PBS-1% de BSA y lavada e incubada a 37ºC durante 1 hora con una dilución 1:50 de las muestras de suero. Después de lavar 5 veces con PBS, las placas son incubadas a 37ºC durante 1 hora con anticuerpos de cabra conjugados con fosfatasa alcalina anti-inmunoglobulina G humana. Las placas se lavan después 5 veces con PBS y se detectan anticuerpos con sustrato de p-nitrofenil fosfato (Sigma, St. Louis, MO) en tampón. Se midieron las densidades ópticas a 405 nm con un lector de placas y se cuantificó la señal. Los ratones con una elevada producción de anticuerpos demostrada se utilizan para la formación de hibridomas. Los hibridomas se generan por fusión de células esplénicas de los animales XenoMouse con línea celular de mieloma no secretor NSA-bcl2 con una relación 4:1 de células de bazo y células NSA-bcl2 en presencia de 30% de polietilenglicol PEG1450. Las células fusionadas son clonadas individualmente limitando la dilución en 96 placas de pocillo y cultivadas en medio RPMI-1640 que contiene 10% de suero fetal bovino, aminoácidos no esenciales, piruvato sódico, L-glutamina, 100 \mu/ml de penicilina-estreptomicina e hipoxantina-aminopterin-timidina (todos ellos de Life Technologies, Rockville, MD). Los sobrenadantes de los hibridomas seleccionados de hipoxantina-aminopterin-timidina se analizaron para determinar la producción de anticuerpos humanos con ELISA, como se ha descrito anteriormente. Los hibridomas que producen anticuerpos humanos frente a la proteína de fusión HAT-CRF_{2}Rh se seleccionan para la producción de anticuerpos a gran escala. Los anticuerpos monoclonales se purifican mediante cromatografía de afinidad con proteína G-Sepharose. Brevemente, el sobrenadante de los clones que son hibridomas cultivados se carga en una columna con proteína G-Sepharose (SIGMA, St. Louis, MO) en tampón de carga, se lava 3 veces y el IgG se eluye con tampón de elución. Estos anticuerpos se utilizan posteriormente para analizar y evaluar el potencial de activación (agonismo) de CRF_{2}Rh. Esto se realiza con la metodología descrita en el Ejemplo 3. Los anticuerpos monoclonales humanos que muestran actividad agonista frente al CRF_{2}Rh se denominan compuestos candidatos.

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Ejemplo 9

Determinación de la fuerza absoluta de un músculo

Los músculos extensor digital largo (EDL) y sóleo son extirpados, tendón a tendón, de la pata escayolada de ratón. Se hace una sutura con hilo de seda en cada tendón de los músculos aislados y los músculos se colocan en una cámara de plexiglas llena con solución de Ringer (cloruro sódico 137 mM, bicarbonato sódico 24 mM, glucosa 11 mM, cloruro potásico 5 mM, sulfato magnésico 1 mM, fosfato sódico 1 mM, tubocurarina 0,025 mM, todos ellos a pH 7,4 y oxigenados con 95% de oxígeno/5% de dióxido de carbono) con un burbujeo constante de 95% de oxígeno/5% de dióxido de carbono mantenido a 25ºC. Los músculos se alinean horizontalmente entre un brazo de palanca de servomotor (modelo 305B-LR Cambridge Technology Inc., Watertown MA, EE.UU.) y el gancho de acero inoxidable de un transductor de fuerza (modelo BG-50; Kulite Semiconductor Products Inc., Leonia, NJ, EE.UU.) y el campo se estimula mediante impulsos transmitidos entre dos electrodos de platino colocados longitudinalmente en cada cara del músculo. Los impulsos de onda cuadrada (0,2 ms de duración) generados por un PC con una tarjeta Labview (modelo PCI-MIO 16E-4), Labview Inc., Austin, TX, EE.UU.) son amplificados (amplificador de potencia Acurus modelo A25, Dobbs Ferry, NY, EE.UU.) para aumentar la contracción titánica. El voltaje de estimulación y la longitud muscular (Lo) se ajustan para obtener una fuerza de contracción isométrica máxima. La producción de fuerza titánica máxima (Po) se determina a partir de la meseta de la relación frecuencia-fuerza.

Ejemplo 10

Tratamiento terapéutico de la atrofia del músculo esquelético utilizando un anticuerpo humano que es un agonista del receptor CRF_{2}Rh

Un hombre que pesa 50 kg y que tiene una atrofia muscular significativa de brazos y piernas debido a un reposo en cama prolongado, es tratado para invertir la atrofia del músculo esquelético. Una vez a la semana durante un período de 3 meses se le administran al paciente 15 ml de una solución acuosa a pH 6 que comprende un anticuerpo activador del receptor CRF_{2}R mediante inyección intravenosa. La solución comprende:

3

Al final del período de tratamiento el sujeto presenta aumentos medibles de la masa muscular y de la fuerza y movilidad de brazos y piernas.

Ejemplo 11

Tratamiento profiláctico de la atrofia del músculo esquelético utilizando un anticuerpo humano que es un agonista del receptor CRF_{2}Rh

Una mujer que pesa 55 kg está programada para una intervención quirúrgica de sustitución de la articulación de la cadera para dentro de un mes. Antes y después de la intervención la paciente es tratada para mejorar la masa del músculo esquelético y reducir el nivel de atrofia del músculo esquelético por falta de uso muscular durante la recuperación postquirúrgica. En particular, se le administra a la paciente mediante inyección intravenosa una vez a la semana 1 mes antes de la intervención y 2 meses después de la intervención 18 ml de una solución acuosa de pH 6,0 que comprende un anticuerpo activador del receptor CRF_{2}R. La solución comprende lo siguiente:

4

Al final del período de tratamiento la paciente presenta una conservación medible de masa muscular, fuerza y movilidad de brazos y piernas con respecto a su estado esperado sin tratamiento con anticuerpos.

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Ejemplo 12

Tratamiento profiláctico de la atrofia del músculo esquelético con un anticuerpo humano que es un agonista del receptor CRF_{2}R

Una mujer que pesa 45 kg es escayolada para tratar una fractura sencilla del húmero a consecuencia de una caída. La mujer es tratada para evitar la atrofia del músculo esquelético del brazo y del hombro afectados debido a la falta de uso y al uso limitado durante la recuperación de la fractura. En particular, se le administra a la paciente una vez a la semana a partir del día del escayolado 13 ml de una solución de pH 6,0 que comprende el anti-CRFh2R mediante inyección intravenosa. La solución comprende:

5

Al final del período de tratamiento, la paciente presenta una conservación medible de masa muscular, fuerza y movilidad del brazo y del hombro afectados y una menor terapia física con respecto al estado esperado de la paciente y un período de seguimiento sin tratamiento con anticuerpos.

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Ejemplo 13

Tratamiento profiláctico de la atrofia del músculo esquelético con urocortina-II

Una mujer que pesa 60 kg es ingresada en el hospital en estado comatoso. La mujer es tratada por este método para evitar la atrofia del músculo esquelético de todo el cuerpo debido a la falta de uso durante el estado comatoso. En particular, una vez al día mientras estaba en coma se le administraron a la mujer, a través de infusión intravenosa lenta, aproximadamente 500 ml de una solución acuosa preparada mediante adición de 5 ml de la siguiente solución madre a 500 ml de solución salina estéril:

6

Como consecuencia del tratamiento, la paciente presenta una conservación medible de la masa y la función del músculo esquelético y menor necesidad de terapia física durante el coma y después de recuperar la consciencia con respecto al estado de la paciente sin terapia farmacológica.

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Ejemplo 14

Tratamiento terapéutico de un paciente con distrofia muscular de Duchenne con CRF

Un hombre que pesa 40 kg con un diagnóstico de distrofia muscular de Duchenne es tratado con un compuesto que presenta agonismo del CRF-R y del CRF-R en un intervalo de dosis similar. El sujeto es tratado con una formulación del compuesto de acción prolongada y liberación sostenida para mejorar o conservar la fuerza y la función muscular durante la progresión de la enfermedad. En particular, una vez al mes se le administra al paciente, mediante inyección intramuscular, 3 ml de una solución acuosa de pH 6,0 que comprende lo siguiente:

7

Como consecuencia del tratamiento, el sujeto experimenta una mejora o una atenuación de la reducción de fuerza muscular o función muscular en las evaluaciones a lo largo del tiempo con respecto a las presentadas durante la progresión natural de la enfermedad.

Claims (8)

1. Un método para identificar compuestos candidatos para regular la masa o la función del músculo esquelético, que comprende las etapas de:

(a)

poner en contacto in vitro un compuesto experimental con un receptor 2 del factor liberador de corticotropina (CRF_{2}R) o una célula que expresa un CRF_{2}R funcional;

(b)

determinar si el compuesto experimental se une o activa el CRF_{2}R; y

(c)

seleccionar aquellos compuestos que se unen a CRF_{2}R y determinar además si el compuesto experimental regula la masa o la función del músculo esquelético en un modelo de cultivo celular de atrofia del músculo esquelético y/o en un animal no humano.

2. Un método según la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

(a)

poner en contacto el compuesto experimental con una célula que expresa un CRF_{2}R funcional y determinar el nivel de activación del CRF_{2}R producido por el compuesto experimental;

(b)

poner en contacto el mismo compuesto experimental con una célula que expresa un receptor 1 del factor liberador de corticotropina (CRF_{1}R) funcional y determinar el nivel de activación del CRF_{1}R producido por el compuesto experimental; seguido de

(c)

seleccionar aquellos compuestos experimentales que muestran más selectividad por CRF_{2}R que por CRF_{1}R para determinar si el compuesto regula la masa o la función del músculo esquelético en el modelo de cultivo celular o en el animal no humano.

3. Un método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que incluye determinar si el compuesto experimental regula la masa o la función del músculo esquelético en un animal no humano.

4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende poner en contacto el compuesto experimental con una célula eucariótica que expresa un CRF_{2}R funcional, teniendo la célula un nivel celular de AMPc, en donde la determinación de si el compuesto experimental activa el CRF_{2}R implica medir el nivel celular de AMPc.

5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el CRF_{2}R tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en más del 80%, preferiblemente idéntica en más del 90%, y con máxima preferencia es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEC. ID N.º: 10.

6. El uso de un compuesto seleccionado de un vector de expresión que codifica un CRF_{2}R funcional, un vector de expresión que codifica un CRF_{2}R constitutivamente activo, un vector de expresión que codifica un factor liberador de corticotropina (CRF) para fabricar un medicamento para tratar la atrofia del músculo esquelético.

7. El uso de un compuesto seleccionado de un anticuerpo quimérico o humano específico para un CRF_{2}R o un CRF para fabricar un medicamento para tratar la atrofia del músculo esquelético.

8. El uso de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en donde la atrofia del músculo esquelético resulta de una distrofia muscular o de su tratamiento y el compuesto es también un agonista CRF_{1}R.