DE69935227T2

DE69935227T2 - Für den corticotropin-releasing-factor-typ-2-rezeptor (crfr2) spezifische antagonisten

Info

Publication number: DE69935227T2
Application number: DE69935227T
Authority: DE
Inventors: Joachim University o 96831 Honolulu SPIESS; Andreas RÜHMANN
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1998-07-24
Filing date: 1999-07-23
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2019-07-24
Also published as: WO2000005253A2; EP1100819B1; DE69935227D1; AU765512B2; ATE354587T1; US6846803B1; EP1100819A2; CA2338561A1; WO2000005253A3; AU5413199A; WO2000005253A9

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Antagonisten des Liganden des Typ 2-Rezeptors des Corticotropin-freisetzenden Faktors (CRFR2), dem die 8 bis 10 N-terminalen Aminosäuren von nativem Sauvagine fehlen, und der die Aminosäuresequenz
umfasst, worin Xaa₁ eine neutrale Aminosäure und Xaa₂ eine elektrisch geladene Aminosäure ist. Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Antagonisten des Liganden Typ 2-Rezeptors des Corticotropin-freisetzenden Faktors (CRFR2), dem die 11 N-terminalen Aminosäuren von nativem Sauvagine fehlen, wobei die N-terminale Aminosäure dieses Antagonisten eine geladene Aminosäure ist. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Polynucleotid, das den Antagonisten der vorliegenden Erfindung codiert, einen Vektor, der das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung umfasst, und einen Wirtsorganismus, der das Polynucleotid oder den Vektor der vorliegenden Erfindung einschließt. Ebenfalls beschrieben werden ein Verfahren zur Produktion des Antagonisten der vorliegenden Erfindung, Antikörper, die gegen den Antagonisten der vorliegenden Erfindung gerichtet sind, sowie antiidiotypische Antikörper, die gegen den Antikörper der vorliegenden Erfindung gerichtet sind. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Arzneimittel und diagnostische Zusammensetzungen, die den Antagonisten, das Polynucleotid und/oder den Vektor der vorliegenden Verbindung umfassen. Darüber hinaus betrifft die Erfindung einen Kit, der eine oder mehrere der vorstehend genannten Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfasst, und die Verwendung einer oder mehrerer dieser Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung und/oder Behandlung einer Erkrankung, die mit dem Typ 2-Rezeptor des Corticotropin-freisetzenden Faktors (CRFR2) verbunden ist.
Der Corticotropin-freisetzende Faktor (CRF), von dem angenommen wird, dass er die endokrinen, autonomen, immunologischen und Verhaltens-Antworten auf Stress synchronisiert, wurde auf der Basis seiner Fähigkeit, die Sekretion von adrenocorticotropem Hormon (ACTH) aus dem Hypophysenvorderlappen zu stimulieren (Vale, W., J. Spiess, C. Rivier und J. Rivier, Science 213:1394–1397, 1981), als ein Polypeptid mit 41 Resten beschrieben (Spiess, J., J. Rivier, C. Rivier und W. Vale, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6517–6521, 1981).
Gonzales et al., Cell Tissue Res. 283:117–123 (1996) offenbaren die Anwesenheit von Sauvagine-ähnlichen Epitopen in der inneren Drüse vom Ochsenfrosch Rana catesbeiana.
Gaudino et al., Peptides, Bd. 6; Erg. 3 (1985) offenbaren aktive Peptide aus Amphibienhaut und ihre mögliche Funktion als Neurotransmitter oder Neuromodulator.
CRF zeigt seine Aktivität durch an G-Protein gekoppelte Rezeptoren. Der CRF-Typ1-Rezeptor (CRFR1), der hauptsächlich in Hypophyse und Gehirn gefunden wird, wurde von Mensch, Maus, Ratte, Huhn und Frosch cloniert (Vita, N., P. Laurent, S. Lefort, P. Chalon, J. -M. Lelias, M. Kaghad, G. Le Fur, D. Caput und P. Ferrara, FEBS Lett. 335:1–5, 1993; Chen, R., K.A. Lewis, M. H. Perrin und W. Vale, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 90:8967–8971, 1993; Perrin, M.H., C.J. Donaldson, R. Chen, K.A. Lewis und W. Vale, Endocrinology 133;3058–3061, 1993; Chang, C. -P., R.V. Pearse II, S. O'Connell und M.G. Rosenfeld, Neuron 11:1187–1195, 1993; Yu, J., L.Y. Xie und A.B. Abou-Samra, Endocrinology 137:192–197, 1996; Dautzenberg, F.M., K. Dietrich, M.R. Palchaudhuri und J. Spiess, J. Neurochem. 69:1640–1649, 1997). cDNAs, die zwei Spleißvarianten des CRF-Typ2-Rezeptors, CRFR2a und CRFR2β, codieren, wurden aus Gehirn, Herz und Skelettmuskel cloniert (Lovenberg, T.W., C.W. Liaw, D. Grigoriadis, W. Clevenger, D.T. Chalmers, E.B. De Souza und T. Oltersdorf, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:836–840, 1995; Perrin, M., C. Donaldson, R. Chen, A. Blount, T. Berggren, L. Bilezikjian, P. Sawchenko und W. Vale, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2969–2973, 1995; Kishimoto, T., R.V. Pearse II, C.R. Lin und M.G. Rosenfeld, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 92:1108–1112, 1995; Stenzel, P., R. Kesterson, W. Yeung, R.D. Cone, M.B. Rittenberg und M.P. Stenzel-Poore, Mol. Endocrinol. 9:637–645, 1995). Bei Nagetieren ist CRFR2a ausschließlich im Zentralnervensystem (ZNS) gefunden worden, während CRFR2β überwiegend in der Peripherie verteilt ist. Beim Menschen sind beide Untertypen des Rezeptors im ZNS gefunden worden. (Valdenaire, O., T. Giller, V. Breu, J. Gottowik und G. Kilpatrick, Biochem. Biophys. Acta 1352:129–132, 1997). Neuerdings ist angenommen worden, dass Urocortin (Ucn), ein natürliches CRF-Analog, der endogene Ligand für CRFR2 ist (Vaughan, J., C. Donaldson, J. Bittencourt, M.H. Perrin, K. Lewis, S. Sutton, R. Chan, A.V. Turnbull, D. Lovejoy, C. Rivier, J. Rivier, P.E. Sawchenko und W. Vale, Nature (London) 378:287–292, 1995).
Es wird angenommen, dass CRF eine größere Rolle bei einer Reihe von neuropsychiatrischen Krankheiten, einschließlich affektiver Psychosen, Angstneurosen, Anorexia nervosa und Alzheimerscher Krankheit spielt (Behan, D.P., S.C. Heinrichs, J.C. Troncoso, X.J. Liu, C.H. Kawas, N. Ling und E.B. De Souza, Nature (London) 378:284–287, 1995). Es besteht großes Interesse an Design und Synthese von CRF-Antagonisten, die selektiv mit einem der verschiedenen CRF-Formen in Wechselwirkung treten. Nach der Entdeckung von wirksamen Peptid-Antagonisten, die auf der N-terminal verkürzten Aminosäuresequenz von Mensch/Ratte-CRF (h/rCRF) beruhen, (Rivier, J., C. Rivier, R. Galyean, A. Miranda, C. Miller, A.G. Craig, G. Yamamoto, M. Brown und W. Vale., J. Med. Chem. 36:2851–2859, 1993; Hernandez, J.F., W. Kornreich, C. Rivier, A. Miranda, G. Yamamoto, J. Andrews, Y. Tache, W. Vale und J. Rivier, J. Med. Chem. 36:2860–2867, 1993; Miranda, A., S.C. Koerber, J. Gulyas, S.L. Lahrichi, A.G. Craig, A. Corrigan, A. Hagler, C. Rivier und J. Rivier, J. Med. Chem. 37:1450–1459, 1994; Gulyas, J., C. Rivier, M. Perrin, S.C.
Koerber, S. Sutton, A. Corrigan, S.L. Lahrichi, A.G. Craig, W. Vale und J. Rivier, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10575-01579, 1995; Miranda, A., S.L. Lahrichi, J. Gulyas, S.C. Koerber, A.G. Craig, A. Corrigan, C. Rivier, W. Vale und J. Rivier, J. Med. Chem. 40:3651–3658, 1997), sind mehrere für CRFR1 selektive, nichtpeptidische Antagonisten entwickelt worden (Chen, C., R. Dagnino, Jr., E.B. De Souza, D.E. Grigoriadis, C.Q. Huang, Kjung-II Kim, Z. Liu, T. Moran, T.R. Webb, J.P. Whitten, Y.F. Xie und J.R. McCarthy, J. Med. Chem. 39:4358–4360, 1996; Schulz, D.W., R.S. Mansbach, J. Sprouse, J.P. Braselton, J. Collins, M. Corman, A. Dunaiskis, S. Faraci, A.W. Schmidt, T. Seeger, P. Seymour, F.D. Tingley III, E.N. Winston, Y.L. Chen und J. Heym, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10477–10482, 1996; Christos, T.E. und A. Arvanitis, Expert Opinion On Therapeutic Patents 8:143–152, 1998), die durch CRF vermittelte Anfälle (Barem, T.Z., D.T. Chalmers, C. Chen, Y. Koutsoukos und E.B. De Souza, Brain Reserach 770: 89–95, 1997) oder durch Interleukin-1β induziertes Fieber abschwächen und angstlösende Aktivität in vivo zeigen (Lundkvist, J., Z. Chai, R. Teheranian, H. Hasanvan, T. Bartfai, F. Jenck, U. Widmer und J.-L. Moreau, Eur. J. Pharmacol. 309:195–200, 1996). Die Tatsache jedoch, dass der CRF-Aantagonist α-helikaler CRF_(9-41) unterschiedliche inhibitorische Fähigkeiten in drei unterschiedlichen in vivo-Biountersuchungssystemen aufweist (Fisher, L., C. Rivier, J. Rivier und M. Brown, Endocrinclogy 129:1312–1316, 1991), legt nahe, dass bestimmte physiologische Funktionen von endogenem CRF oder Ucn durch CRFR1, CRFR2 oder beide Rezeptortypen vermittelt werden.
Daher bestand das technische Problem, das der vorliegenden Erfindung zugrunde lag, darin, für CRFR2 spezifische Antagonisten zu entwickeln, um Unterscheidung zwischen Rezeptortyp-spezifischen Funktionen, z.B. in Gehirn und peripheren Organen, zu ermöglichen.
Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Ausführungsformen geliefert, die in den Ansprüchen beschrieben werden.
Demzufolge betrifft die vorliegende Erfindung einen Antagonisten des Typ2-Rezeptors des Corticotropin-freisetzenden Faktors (CRFR2), dem die 8 bis 10 N-terminalen Aminosäuren von nativem Sauvagine fehlen und der die Aminosäuresequenz
umfasst, worin Xaa₁ eine neutrale Aminosäure und Xaa₂ eine geladene Aminosäure ist.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung umfasst der Ausdruck „Ligand" jedes Molekül, das zur spezifischen Bindung an den Typ2-Rezeptor des Corticotropin-freisetzenden Faktors (CRFR2) in der Lage ist, einschließlich z.B. des (der) natürlich vorkommenden, endogenen Liganden von CRFR2 oder jeder beliebigen Verbindung(en), die auf rekombinantem oder chemischem Weg synthetisiert oder biochemisch modifiziert worden ist (sind) und zur Bindung und Aktivierung von CRFR2 in der Lage ist (sind).
Der in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdruck „für CRFR2 spezifisch, „für CRFR2 selektiv", „CRFR2-Spezifität" oder „CRFR2-Selektivität" bezeichnet einen Wert, der höher als 30, bevorzugt höher als 45 und mehr bevorzugt höher als 70 ist und nach der in der Legende zu Tabelle 1 dargestellten Gleichung errechnet wird. Daher bedeutet in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung z.B. ein „für CRFR2 spezifischer" Antagonist nicht, dass er ausschließlich CRFR2 bindet, sondern dass er CRFR2 mit einer mindestens 30-fach, bevorzugt 45-fach und mehr bevorzugt 70-fach höheren Selektivität als Astressin bindet, welches eine ähnliche Affinität für CRFR1 und CRFR2, besonders CRFR2β, aufweist.
Studien, die im Einklang mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt worden sind, ergaben überraschend, dass die Deletion der 8 bis 10 N-terminalen Aminosäuren von nativem Sauvagine, das ein wirksamer, nicht selektiver Aktivator von CRFR ist, diese Verbindung zu einem hoch spezifischen Antagonisten für CRFR2 macht.
In einer bevorzugten Ausführungsform fehlen dem Antagonisten der vorliegenden Erfindung die 10 N-terminalen Aminosäuren von nativem Sauvagine.
In einer anderen, mehr bevorzugten Ausführungsform des Antagonisten der vorliegenden Erfindung ist Xaa₁ eine hydrophobe Aminosäure und Xaa₂ ist Glu oder His.
In einer sogar noch mehr bevorzugten Ausführungsform des Antagonisten der vorliegenden Erfindung ist Xaa₁ Leu.
In einer darüber hinaus mehr bevorzugten Ausführungsform ist Xaa₁ eine polare Aminosäure und Xaa₂ ist Glu oder His.
In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform des Antagonisten der vorliegenden Erfindung ist Xaa₁ Tyr.
Es wird in Betracht gezogen, dass Antagonisten der vorliegenden Erfindung, die Tyr als die N-terminale Aminosäure enthalten, vorteilhaft für eine radioaktive Markierung mit z.B. ¹²⁵I verwendet werden können. Solche Verbindungen können dann in in vivo- oder in vitro-Experimenten für den Nachweis von CRFR2-Bindungsstellen verwendet werden. Obgleich Antagonisten, die über His mit ¹²⁵I markiert wurden, ebenfalls von der Erfindung eingeschlossen werden, werden Antagonisten, die über Tyr markiert sind, bevorzugt, da die Markierungsreaktion aus technischen Gesichtspunkten leichter durchzuführen ist und die markierte Verbindung stabiler und aus diesem Grund leichter zu handhaben ist.
In einer sogar noch mehr bevorzugten Ausführungsform des Antagonisten der vorliegenden Erfindung liegt Xaa₁ in der D-Konfiguration vor.
In einer darüber hinaus noch mehr bevorzugten Ausführungsform des Antagonisten der vorliegenden Erfindung ist Xaa₁ D-Leu oder D-Tyr.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform des Antagonisten der vorliegenden Erfindung ist Xaa₂ Glu.
In einer anderen noch mehr bevorzugten Ausführungsform des Antagonisten der vorliegenden Erfindung ist Xaa₁ D-Phe.
In einer anderen am meisten bevorzugten Ausführungsform des Antagonisten der vorliegenden Erfindung ist Xaa₂ His.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Antagonisten des Liganden des Typ2-Rezeptors des Corticotropinfreisetzenden Faktors (CRFR2), dem die 11 N-terminalen Aminosäuren von nativem Sauvagine fehlen, wobei die N-terminale Aminosäure dieses Antagonisten eine geladene Aminosäure ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist diese geladene Aminosäure positiv geladen.
In einer mehr bevorzugten Ausführungsform ist diese geladene Aminosäure His.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst der Antagonist der vorliegenden Erfindung eine Phenyldiazirin-Gruppe, die an die N-terminale Aminosäure dieses Antagonisten gekoppelt ist.
Es wird in Betracht gezogen, dass Antagonisten der vorliegenden Erfindung, die eine Phenyldiazirin-Gruppe umfassen, z.B. in Photoaffinitäts-Markierungsexperimenten verwendet werden. Demzufolge können diese Verbindungen vorteilhaft verwendet werden, um antagonistische Bindungsstellen von CRFR2β-Rezeptorsystemen zu charakterisieren.
In einer mehr bevorzugten Ausführungsform ist diese Phenyldiazirin-Gruppe eine 4-(1-Azi-2,2,2-trifluorethyl)benzoyl (ATB)-Gruppe.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Polynucleotid, das den Antagonisten der vorliegenden Erfindung codiert.
Das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung kann z.B. DNA, cDNA, RNA oder synthetisch hergestellte DNA oder RNA oder ein rekombinant hergestelltes, chimäres Nucleinsäuremolekül sein, das ein beliebiges dieser Polynucleotide entweder allein oder in Kombination umfasst.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor, der das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung umfasst.
Der Vektor der vorliegenden Erfindung kann z.B. ein Plasmid, Cosmid, Virus, Bakteriophage oder ein anderer Vektor sein, der gewöhnlich in gentechnischen Verfahren verwendet wird, und er kann weitere Gene umfassen, wie etwa Markierungsgene, die die Selektion dieses Vektors in einer geeigneten Wirtszelle und unter geeigneten Bedingungen erlauben.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Vektors der vorliegenden Erfindung ist das Polynucleotid mit einer Expressionskontrollsequenz funktionell verbunden.
Diese Expressionskontrollsequenz gestattet die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen. Die Expression des Polynucleotides umfasst die Transkription des Polynucleotides in eine translatierbare mRNA. Regulationselemente, die die Expression in eukaryontischen Zellen, bevorzugt Zellen von Säugern, sicherstellen, sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Gewöhnlich umfassen sie regulatorische Sequenzen, die den Beginn der Transkription sicherstellen, und optional poly-A-Signale, die die Beendigung der Transkription und die Stabilisierung des Transkriptes sicherstellen. Zusätzliche regulatorische Elemente können sowohl transkriptionale als auch translationale Enhancer und/oder natürlich verbundene oder heterologe Promotorregionen umfassen.
Mögliche regulatorische Elemente, die die Expression in prokaryontischen Wirtszellen gestatten, umfassen z.B. den PL-, lac-, trp- oder tac-Promotor in E. coli, und Beispiele für regulatorische Elemente, die die Expression in eukaryontischen Wirtszellen gestatten, sind der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe oder der CMV-, SV40-, RSV-Promotor (Rous-Sarkom-Virus), CMV-Enhancer, SV40-Enhancer oder ein Globin-Intron in Säugerzellen und anderen Tierzellen. Neben Elementen, die für den Beginn der Transkription verantwortlich sind, können solche regulatorischen Elemente Signale zur Beendigung der Transkription umfassen, wie etwa die SV40-poly-A-Stelle oder die tk-poly-A-Stelle, stromabwärts vom Polynucleotid gelegen. Darüber hinaus können in Abhängigkeit von dem verwendeten Expressionssystem Leader-Sequenzen, die in der Lage sind, das Polypeptid zu einem zellulären Kompartiment zu lenken oder es in das Kulturmedium zu sekretieren und die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, an die Codierungssequenz des Polynucleotids der Erfindung angefügt werden. Die Leader-Sequenz(en) wird (werden) in einer geeigneten Phase mit Sequenzen für Translation, Initiation und Termination versehen, und bevorzugt ist eine Leader-Sequenz in der Lage, die Sekretion des translatierten Proteins oder eines Teils davon in den periplasmatischen Raum oder das extrazelluläre Kulturmedium zu lenken. Optional kann die heterologe Sequenz ein Fusionsprotein codieren, welches ein C- oder N-terminales Peptid zur Identifizierung einschließt, das gewünschte Kennzeichen, z.B. Stabilisierung oder vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinanten Produktes, verleiht. In diesem Zusammenhang sind geeignete Expressionsvektoren auf dem Fachgebiet bekannt, etwa Okayama-Berg-cDNA-Expressionsvektor pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (In-vitrogene) oder pSPORT1 (GIBCO BRL).
Bevorzugt werden die Sequenzen zur Kontrolle der Expression eukaryontische Promotorsysteme in Vektoren sein, die in der Lage sind, eukaryontische Wirtszellen zu transformieren oder zu transfizieren, doch Kontrollsequenzen für prokaryontische Wirtsorganismen können ebenfalls verwendet werden. Sobald der Vektor in den geeigneten Wirtsorganismus inkorporiert ist, wird der Wirtsorganismus unter Bedingungen gehalten, die für Expression der Nucleotidsequenzen auf hohem Niveau geeignet sind.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung einen Wirtsorganismus, der das Polynucleotid oder den Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst.
Dieser Wirtsorganismus kann eine prokaryontische oder eine eukaryontische Zelle sein. Das Polynucleotid oder der Vektor der vorliegenden Erfindung, das/der in der Wirtszelle vorliegt, kann entweder in das Genom der Wirtszelle integriert werden oder kann extrachromosomal aufrechterhalten werden.
Die Wirtszelle kann jede beliebige prokaryontische oder eukaryontische Zelle sein, wie etwa eine Bakterien-, Insekten-, Pilz-, Pflanzen-, Tier- oder menschliche Zelle. Bevorzugte Pilzzellen sind zum Beispiel jene der Gattung Saccharomyces, besonders jene der Art S. cerevisiae. Der Ausdruck "prokarynontisch" soll alle Bakterien einschließen, die mit einem Polynucleotid oder Vektor der vorliegenden Erfindung zur Expression des Antagonisten der vorliegenden Erfindung transformiert oder transfiziert werden können. Prokaryontische Wirtsorganismen können sowohl Gram-negative als auch Gram-positive Bakterien, zum Beispiel E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens und Bacillus subtilis einschließen. Der Ausdruck „eukaryontisch" soll Zellen von Hefe, höheren Pflanzen, Insekten und bevorzugt vom Menschen einschließen. In Abhängigkeit von dem Wirtsorganismus, der in einem rekombinanten Produktionsverfahren verwendet wird, kann der durch das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung codierte Antagonist post-translational modifiziert werden oder nicht. Ein Polynucleotid der Erfindung kann unter Verwendung einer beliebigen der Techniken, die Fachleuten auf diesem Gebiet allgemein bekannt sind, verwendet werden, um den Wirtsorganismus zu transformieren oder zu transfizieren. Darüber hinaus sind Verfahren zur Herstellung von fusionierten, funktionell verbundenen Genen und deren Expression z.B. in Säugerzellen und Bakterien auf dem Fachgebiet gut bekannt (z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Die hierin beschriebenen genetischen Konstrukte und Verfahren können zur Expression des Antagonisten der vorliegenden Erfindung in eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtsorganismen verwendet werden. Im Allgemeinen werden Expressionsvektoren, die Promotorsequenzen beinhalten, welche die wirksame Transkription des inserierten Polynucleotides erleichtern, in Verbindung mit dem Wirtsorganismus verwendet. Der Expressionsvektor enthält typischerweise einen Replikationsursprung, einen Promotor und einen Terminator sowie spezifische Gene, die phänotypische Selektion der transformierten Zellen ermöglichen. Darüber hinaus können nicht menschliche transgene Tiere, bevorzugt Säuger, die Wirtszellen der Erfindung umfassen, für die Produktion des Antagonisten der vorliegenden Erfindung in großem Maßstab verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Produktion des Antagonisten der vorliegenden Erfindung, wobei dieses Verfahren das Züchten des Wirtsorganismus der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, die die Synthese des genanten Antagonisten bewirken, sowie die Gewinnung des Antagonisten aus der Kultur umfasst.
In Abhängigkeit von dem/der verwendeten spezifischen Konstrukt und Bedingung kann der Antagonist aus den Wirtszellen, aus dem Kulturmedium oder aus beiden gewonnen werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus einen Antagonisten, der durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung gewonnen werden kann.
Alternativ kann der Antagonist der vorliegenden Erfindung nach Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, z.B. Festphasen-Synthese mit Fmoc- oder t-boc-Chemie, chemisch synthetisiert werden (vgl. auch z.B. Rühmann, A., A.K.E. Köpke, F.M. Dautzenberg und J. Spiess, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10609–10613, 1996).
Die Beschreibung offenbart auch einen Antikörper, der gegen den Antagonisten der vorliegenden Erfindung gerichtet ist.
Die Beschreibung offenbart auch einen anti-idiotypischen Antikörper, der gegen den Antikörper der vorliegenden Erfindung gerichtet ist.
Die Antikörper können monoclonale Antikörper, polyclonale Antikörper, Einzelketten-Antikörper, humanisierte Antikörper oder Fragmente davon sein, die den Antagonisten der vorliegenden Erfindung oder den Antikörper, der gegen den Antagonisten der vorliegenden Erfindung gerichtet ist, spezifisch binden. Bispezifische Antikörper, synthetische Antikörper, Antikörperfragmente wie etwa Fab-, Fv- oder scFv-Fragmente etc. oder chemisch modifizierte Derivate eines beliebigen von diesen werden ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umschlossen. Monoclonale Antikörper können zum Beispiel mit den Techniken hergestellt werden, die ursprünglich von Köhler und Milstein, Nature 256:495 (1975) und Galfré, Meth. Enzymol. 73:3 (1981) beschrieben worden sind und welche die Fusion von Myelomzellen der Maus mit Milzzellen, die von immunisierten Säugern stammen, mit Änderungen, die auf dem Fachgebiet entwickelt worden sind, umfassen. Darüber hinaus können Antikörper oder Fragmente davon gewonnen werden, indem Verfahren verwendet werden, die z.B. von Harlow und Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988 beschrieben werden. Die Herstellung von chimären Antikörpern wird zum Beispiel in WO 89/09622 beschrieben. Verfahren zur Herstellung von humanisierten Antikörpern werden z.B. in EP-A1 0 239 400 und WO 90/07861 beschrieben. Eine weitere Quelle für Antikörper, die verwendet werden können, sind die sogenannten xenogenen Antikörper. Das allgemeine Prinzip für die Herstellung von xenogenen Antikörpern wie etwa menschlichen Antikörpern in Mäusen wird z.B. in WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 und WO 96/33735 beschrieben. Wie vorstehend besprochen, können die Antikörper in einer Vielfalt von Formen neben den vollständigen Antikörpern, einschließlich zum Beispiel Fv, Fab und F(ab)2, sowie in einzelnen Ketten vorkommen; vgl. z.B. WO 88/09344.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Arzneimittel, das den Antagonisten, das Polynucleotid und/oder den Vektor der vorliegenden Erfindung und optional einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff und/oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel umfasst.
Beispiele für geeignete pharmazeutische Trägerstoffe sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und umschließen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen wie etwa Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Arten an Benetzungsmitteln, sterile Lösungen etc. Zusammensetzungen, die solche Trägerstoffe umfassen, können mit gut bekannten, herkömmlichen Verfahren formuliert werden. Diese Arzneimittel können dem Patienten in einer geeigneten Dosis verabreicht werden. Die Verabreichung der geeigneten Zusammensetzungen kann über verschiedene Wege erfolgen, z.B. durch intravenöse, intraperitoneale, subkutane, intramuskuläre, örtliche oder intradermale Verabreichung. Die Dosierungsstrategie wird von dem behandelnden Arzt und klinischen Faktoren bestimmt werden. Wie auf dem medizinischen Fachgebiet gut bekannt ist, hängt die Dosierung für einen beliebigen Patienten von vielen Faktoren ab, einschließlich der Größe des Patienten, der Körperoberfläche, des Alters, der bestimmten Verbindung, die verabreicht werden soll, des Geschlechtes, des Zeitpunktes und des Verabreichungsweges, des allgemeinen Gesundheitszustandes und anderer Arzneistoffe, die gleichzeitig verabreicht werden. Die Zusammensetzungen der Erfindung können lokal oder systemisch verabreicht werden. Präparate zur parenteralen Verabreichung schließen sterile wässrige oder nicht wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen ein. Beispiele für nicht wässrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, Pflanzenöle wie etwa Olivenöl und injizierbare organische Ester wie etwa Ethyloleat. Wässrige Trägerstoffe umschließen Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Kochsalzlösungen, und gepufferte Medien. Parenterale Trägerstoffe umschließen Natriumchloridlösung, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, laktierte Ringerlösung oder fette Öle. Intravenöse Trägerstoffe umschließen Ergänzungsmittel für Flüssigkeiten und Nährstoffe, Elektrolyt-Ergänzungsmittel (wie etwa jene, die auf Ringer-Dextrose beruhen) und dergleichen. Konservierungsmittel und andere Zusätze wie etwa zum Beispiel antimikrobielle Zusätze, Antioxidantien, Chelatbildner und inerte Gase und dergleichen können ebenfalls vorhanden sein. Darüber hinaus kann das Arzneimittel der vorliegenden Erfindung in Abhängigkeit vom jeweiligen Verwendungszweck des Arzneimittels weitere Agenzien umfassen.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung eine diagnostische Zusammensetzung, welche den Antagonisten, das Polynucleotid und/oder den Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus einen Kit, welcher den Antagonisten, das Polynucleotid und/oder den Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die Bestandteile der diagnostischen Zusammensetzung und/oder des Kits der vorliegenden Erfindung können in Behältern wie etwa Ampullen, optional in Pufferlösungen und/oder anderen Lösungen, verpackt sein. Wenn es zweckmäßig ist, können eine oder mehrere dieser Bestandteile in einem oder dem selben Behälter verpackt sein. Zusätzlich oder alternativ können einer oder mehrere dieser Bestandteile an einen Feststoff wie etwa einen Nitrocellulosefilter oder eine Nylonmembran oder an die Vertiefung einer Mikrotiterplatte adsorbiert sein.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Antagonisten, des Polynucleotides und/oder des Vektors der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Vermeidung und/oder Behandlung einer Krankheit, die mit dem Typ2-Rezeptor des Corticotropin-freisetzenden Faktors (CRFR2) verbunden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Antagonisten oder der Verwendung der vorliegenden Erfindung ist CRFR2 CRFR2α oder CRFR2β.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform dient die Verwendung der vorliegenden Erfindung der Vermeidung und/oder Behandlung von affektiven Psychosen, Magen-Darm-Erkrankungen, kardiopathischen Erkrankungen, psychiatrischen Erkrankungen, besonders Essstörungen, Angstneurosen oder Anorexia nervosa und/oder Alzheimerscher Krankheit.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung des Antagonisten, des Polynucleotides und/oder des Vektors der vorliegenden Erfindung zur Erforschung von für den CRF-Rezeptortyp spezifischen Funktionen.
Abkürzungen, die in der Beschreibung, den Legenden der Abbildungen und den Beispielen verwendet werden, sind wie folgt: IUPAC-Regeln werden für die Nomenklatur von Peptiden, einschließlich der Ein-Buchstaben-Codes für Aminosäuren, verwendet. AAA: Aminosäure-Analyse; ACTH: Adrenocorticotropes Hormon; ANOVA: Ein-Wege-Analyse der Varianz; Astressin: {cyclo(30–33)[DPhe¹², Nle^21,38, Glu³⁰, Lys³³]h/rCRF_(12-41)}; BSA: Rinderserumalbumin; cAMP: 3',5'-zyklisches Adenosinmonophosphat; CRF: Corticotropin-freisetzender Faktor (h = vom Menschen, o = vom Schaf, r = von der Ratte; CRFR: CRF-Rezeptor; DIEA: N,N-diisopropylethylamin: DMF: Dimethylformamid; Fmoc: 9-Fluorenylmethoxycarbonyl: HBTU: O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyliuroniumhexafluorphosphat; HEK: menschliche embryonale Niere; HOAc: Essigsäure; HOBt: 1-Hydroxybenzotriazol; ¹²⁵I: ¹²⁵I-jodiert; MeCN: Acetonitril; MS: Massenspektrometrie; NMP: N-Methylpyrrolidon-2; OAll: O-Allyl; OAlloc: O-Allyloxycarbonyl; Pd⁰[PPh₃]₄: Tetrakis-(triphenylphosphin)-palladium; RP-HPLC: Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie; SAR: Struktur-Aktivität-Beziehung; Svg: Sauvagine; TFA: Trifluor-Essigsäure; Ucn; Urocortin.
Die Abbildungen zeigen:
1: Vergleich der Aminosäuresequenz des Corticotropin-releasing-Faktors von Mensch/Ratte (h/rCRF) mit dem Corticotropin-freisetzendem Faktor vom Schaf (oCRF), Urocortin der Ratte (rUcn), Sauvagine (Svg) und Astressin. Identische Aminosäuren sind unterlegt.
2 Chemische Quervernetzung von [¹²⁵I-Tyr⁰]oCRF oder [¹²⁵I-Tyr⁰]Svg an Membran-Homogenate von menschlichen embryonellen 293-Nierenzellen (HEK), die stabil mit cDNA transfiziert worden sind, die den Ratten-CRF-Rezeptor vom Typ 1 (rCRFR1) (Linien 1 und 2) beziehungsweise den Maus-CRF-Rezeptor vom Typ 2β (mCRF2β) (Linen 3 und 4) codiert. 50 μg des gesamten Membranproteins wurden mit etwa 100.000 cpm [¹²⁵I-Tyr⁰]oCFR (Linien 1 und 2) und [¹²⁵I-Tyr⁰]Svg (Linien 3 und 4) markiert und in Anwesenheit (Linien 2 und 4) oder Abwesenheit (Linien 1 und 3) von 2000 Einheiten PNGase inkubiert (37 °C, 30 min).
3: Verdrängung von [¹²⁵I-Tyr⁰]oCFR (A) oder [¹²⁵I-Tyr⁰]Svg (B), gebunden an Membran-Homogenate von HEK-293-Zellen, die stabil mit cDNA transfiziert worden sind, die den Ratten-CRF-Rezeptor vom Typ 1 (rCRFR1) (A) beziehungsweise den Maus-CRF-Rezeptor vom Typ 2β (mCRF2β) (B) codiert, durch oCRF (Verbindung 1, o), Svg (Verbindung 2, ☐), Astressin (Verbindung 3, Δ), [DPhe¹², Nle^21,38]h/rCRF_(12-41)(Verbindung 5,
[DPhe¹²]oCRF_(12-41) (Verbindung 6, •), [DPhe¹¹]rUcn_(11-40) (Verbindung 7, ♦) und [DPhe¹¹, His¹²]Svg_(11-40) (Verbindung 11,
Die Fehlerbalken stellen den SAM („SEM", Standardabweichung des Mittelwerts) dar und werden nicht ausgeführt, wenn sie kleiner als die Symbole sind.
4: Potenz von 1 μM CRF-Antagonist (Verbindungen 3–14), die cAMP-Produktion in transfizierten HEK-293-Zellen zu stimulieren (% IA, intrinsische Aktivität) (A, B). Wirksamkeit von CRF-Antagonisten (c = 1 μM für rCRFR1 und c = 10 nM für mCRFR2β), die cAMP-Produktion in transfizierten HEK-293-Zellen zu hemmen, die durch 1 nM oCRF (Verbindung 1 für rCRFR1) und 1 nM Svg (Verbindung 2 für mCRFR2β) stimuliert worden waren (relative in vitro-Potenz) (C, D). Die Daten stellen den Mittelwert aus 3–11 Experimenten dar. Die Fehlerbalken zeigen die SA.
Die Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Beispiel 1: Synthese und Analyse von Peptiden
Unterschiedliche, verkürzte und in der Konformation festgelegte Analoga des Corticotropin-freisetzenden Faktors (CRF) wurden auf der Basis der Aminosäuresequenz von Mensch/Ratte-CRF (h/rCRF), Schaf-CRF (oCRF), Urocortin der Ratte (rUcn) oder Sauvagine (Svg) (0,1 mMol-Bereich) mit Fmoc- Chemie auf TentaGel S RAM-Harz (Rapp, Tübingen, Deutschland) mit einem Peptid-Synthesegerät, Modell ABI 433A (Applied Biosystems) synthetisiert. Der Vergleich der Aminosäuresequenzen von oCRF, rUcn und Svg mit der Sequenz von h/rCRF ergibt eine Aminosäure-Identität von 45–83 %. Die genannten CRF-Liganden teilen hohe Aminosäure-Identität am N-Terminus (47 %), der sich über Aminosäure 2–20 (h/rCRF und oCRF) und 1–19 (rUcn und Svg) erstreckt, aber nur eine geringe am C-Terminus (14 %) der Peptide, der sich über Aminosäure 21–41 beziehungsweise 20–40 erstreckt (1). Man nahm an, dass die Wechselwirkungen zwischen Ligand und Rezeptor der verkürzten Formen der CRF-Peptide, die sich über die Aminosäuren 11–40 (rUcn und Svg) beziehungsweise 12–41 (h/rCRF und oCRF) erstreckten, anders abliefen als bei den CRF-Peptiden von CRFR1 oder CRFR2 in voller Länge (Dautzenberg, F.M., K. Dietrich, M.R. Palchaudhuri und Spiess, J. Neurochem. 69:1640–1649, 1997: Vaughan, J., C. Donaldson, J. Bittencourt, M.H. Perrin, K. Lewis, S. Sutton, R. Chan, A.V. Turnbull, D. Lovejoy, C. Rivier, J. Rivier, P.E. Sawchenko und W. Vale, Nature (London) 378:287–292, 1995; Donaldson, C.J., S.W. Sutton, M.H. Perrin, A.Z. Corrigan, K.A. Lewis, J.E. Rivier, J.M. Vaughan und W. W. Vale, Endocrinology 137:2167–2170, 1996; Gottowik, J., V. Goetschy, S. Henriot, E. Kitas, B. Fluhman, R. G. Clerc, J.L. Moreau, F.J. Monsma und G.J. Kilpatrick, Neuropharmacol. 36:1439–1446, 1997).
Zur Synthese der zyklisierten CRF-Analoga wurden Astressin und cyczlo(29–32)[DPhe¹¹, Glu²⁹, Lys³²]rUcn_(11-40), die Aminosäure-Derivate Fmoc-L-Glu(OAll)-OH und Fmoc-L-Lys(Alloc)-OH verwendet (PerSeptive Biosystems GmbH, Hamburg, Deutschland). Die Seitenketten-geschützten Peptide ließ man mit Pd⁰[PPh₃]₄ in HOAc/N-Methylanilin/Dichlormethan (Vol./Vol.; 2:1:40) über drei Stunden reagieren, dann wurden sie mit HOBt/HBTU in DMF und DIEA in NMP über acht Stunden zyklisiert. Nach Entfernung der N-terminalen Fmoc-Gruppe mit Piperidin in NMP wurden die Peptide unter Standardbedingungen vom Harz abgespalten. Die Rohpeptide wurden durch präparative Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) gereinigt, die auf einer Waters-Prep-Nova-Pak HR C18-Silicagel-Säule (5 × 30 cm, 6 μm Partikelgröße, 6 nm Porengröße) mit einem Gemisch aus wässriger 0,1 %-Trifluoressigsäure und MeCN durchgeführt wurde (vgl. Tabelle 5). Die Massenspektren der gereinigten Peptide wurden mit einem Plasma-Desorptions-Massenspektrometer (Biolon 20, Uppsala) aufgenommen. Eine Aminosäure-Analyse (AAA) wurde nach der Hydrolyse der Peptide (6 N HCl, 3 h, 150 °C) mit einem Beckman High Performance Analyzer System 6300 (Beckmann, San Remon) durchgeführt.
Beispiel 2: Bindung von CRF-Agonisten und -Antagonisten an rCRFR1
CRF-Agonisten und Antagonisten wurden in einer in vitro-Untersuchung auf ihre Fähigkeit untersucht, [¹²⁵I-Tyr⁰]oCFR oder [¹²⁵I-Tyr⁰]Svg von Membranen von HEK-rCRFR1-Zellen (Rühmann, A., A.K.E. Köpke, F.M. Dautzenberg und J. Spiess, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10609–10613, 1996) oder von HEK-mCRFR2β-Zellen (Kishimoto, T., R.V. Pearse II, C.R. Lin und M.G. Rosenfeld, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1108–1112, 1995) zu verdrängen. Die Bindungsuntersuchungen wurden in MultiScreen-Platten mit 96 Vertiefungen (Millipore, Eschborn, Deutschland) mit GF/B-Filtern (Porengröße 1,0 μm) durchgeführt. 50 Mikroliter Membransuspension (25 μg Protein von HEK-rCRFR1-Zellen; 50 μg Protein von HEK-CRFR2β-Zellen) wurden auf eine Platte gegeben, die CRF-Peptide (c = 0-1 μM) und jeweils 50.000 ZpM („cpm"; Zerfälle pro Minute) an [¹²⁵I-Tyr⁰]oCFR (spezifische Aktivität 81,4 TBq/mMol, 68,25 pM, DuPont NEN, Boston) für die Analyse von rCRFR1 oder [¹²⁵I-Tyr⁰]Svg (spezifische Aktivität 81.4 TBq/mMol, 68,25 pM, DuPont NEN, Boston) für die Analyse von mCRFR2β in 100 μl Inkubationspufferlösung (50 mM Tris/Cl, 5 mM MgCl₂, 2 mM EGTA, 100.000 Kallikrein-Inhibitor-Einheiten pro Liter Trasylol (Bayer, Leverkusen), 1 mM Dithiothreit, 1 mg/ml BSA, pH-Wert 7,4) enthielt. Nach der Inkubation (60 min, 23°C) wurde die Membransuspension durch die Platte abgesaugt, gefolgt von zwei Waschgängen mit Untersuchungspufferlösung (0,2 ml, 23°C). Die Radioaktivität der gestanzten Filter wurde mit einem automatischen Gammazähler, 1470 WIZARD, (Berthold, Hannover) gemessen. Spezifische Bindung von [¹²⁵I-Tyr⁰]oCRF oder [¹²⁵I-Tyr⁰]Svg an Membranen von transfizierten Zellen wurde durch Subtraktion von unspezifischer Bindung, die in Anwesenheit von 1 μM nicht markiertem Ligand gefunden wurde von der Gesamtbindung, berechnet.
Datenanalyse wurde mit dem nichtlinearen Kurvenanpassungsprogramm LIGAND durchgeführt. Statistische Analyse wurde mit ANOVA durchgeführt, und signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch nachträglichen Vergleich mit dem Dunn-Test bestimmt.
Beispiel 3: Chemische Quervernetzung mit [¹²⁵I-Tyr⁰]oCFR oder [¹²⁵I-Tyr⁰]Svg
Die chemische Quervernetzung wurde in 1,5 ml-Polypropylen-Röhrchen (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) wie für die Bindungsuntersuchung durchgeführt, mit der Änderung, dass kein BSA verwendet wurde.
Die Proben (50 μg und 100 μg Protein aus Membranfraktionen von HEK-rCRFR1-Zellen beziehungsweise HEK-mCRFR2β-Zellen) ließ man nach der Inkubation mit dem Liganden (V = 300 μl, 100.000 ZpM, 1 h, 23°C) mit 10 μl Disuccinimidylsuberat (1,5 mM in Dimethylsulfoxid, 23°C, 20 min) reagieren. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 1,0 ml eisgekühlter Pufferlösung (10 mM Tris/Cl, 1 mM EDTA, pH-Wert 7,0, 4°C) beendet. In einigen Experimenten wurde der durch chemische Quervernetzung gebundene Rezeptor mit PNGase (New England Biolabs, Schwalbach) deglycosyliert. Die Proben wurden dann erhitzt (100°C, 5 min.) und der SDS-PAGE unterworfen. Autoradiographie wurde auf einer BAS-IP NP 2040P-Abbildungsplatte durchgeführt. Die Radioaktivität wurde mit einem Fujix-BAS 2000-Scanner überwacht (Raytest, Straubenhardt). Die Gel-Dokumentation wurde mit dem Programm TINA (Raytest) durchgeführt.
Beispiel 4: Bestimmung der cAMP-Stimulierung
HEK-rCRFR1-Zellen oder HEK-mCRFR2β-Zellen wurden mit verschiedenen CRF-Agonisten in Anwesenheit oder Abwesenheit von 1 μM oder 10 nM Antagonist oder mit CRF-Antagonist (c = 1 μM) allein inkubiert. Nach Entfernung des Kulturmediums wurden die Zellen mit wässriger 6 %iger Trichloressigsäure (5 min, 100°C) lysiert (Rühmann, A., A.K.E. Köpke, F.M.
Dautzenberg und J. Spiess, Natl. Acad. Sci. USA 93:10609–10613, 1996). Die Zelllysate wurden bis zur Untersuchung mit einem RIA-Kit (Amersham, Little Chalfont) bei –70 °C gelagert. Die Datenanalyse wurde mit dem sigmoidalen Dosis-Antwort-Kurvenanpassungsprogramm ALLFIT durchgeführt. Statistische Signifikanz wurde quer durch die Gruppen mit ANOVA bestimmt, und signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch nachträglichen Vergleich unter Verwendung des Dunn-Testes bestimmt.
Beispiel 5: Verdrängung von [¹²⁵I-Tyr⁰]oCFR oder [¹²⁵I-Tyr⁰]Svg von rekombinantem rCRFR1 oder mCRFR2β durch CRF-Analoga
Membran-Homogenate von menschlichen embryonalen Nieren- (HEK) 293-Zellen, die stabil mit cDNA transfiziert worden waren, die den CRF-Typ1-Rezeptor der Ratte (rCRFR1) oder den CRF-Typ2β-Rezeptor der Maus (mCRFR2β) codieren, wurden nach Standardverfahren hergestellt (vgl. z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, NY, 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und Wiley Interscience, NY, 1989). Es stellte sich heraus, dass die spezifische Bindung des [¹²⁵I-Tyr⁰]oCRF an Membranen von HEK-rCRFR1-Zellen 93 % betrug, wenn der Radioligand durch den oCRF verdrängt wurde. In analogen Verdrängungsexperimenten mit Svg wurde bestimmt, dass die spezifische Bindung von [¹²⁵I-Tyr⁰]Svg an Membranen von HEK-mCRFR2β-Zellen 94 % betrug. Eine spezifische Bindung der beiden radioaktiv markierten CRF-Analoga an Membranen von nicht transfizierten HEK-293-Zellen konnte nicht beobachtet werden. Diese Daten konnten bestätigt werden, als auf chemischem Weg eine Quervernetzung von [¹²⁵I-Tyr⁰]oCFR und [¹²⁵I-Tyr⁰]Svg an rCRFR1 beziehungsweise mCRFR2β hergestellt wurde. Das Molekulargewicht der beiden quervernetzten Rezeptoren betrug 66.000. Nach Deglycosylierung mit PNGase wurden Molekulargewichte von 43.000 beziehungsweise 41.000 für quervernetzten mCRFR2β beziehungsweise rCRFR1 gemessen (2); dies stimmt mit den auf der Basis von DNA-Daten vorhergesagten Molekulargewichten überein (Perrin, M.H., C.J. Donaldson, R. Chen, K.A. Lewis und W. Vale, Endocrinology 133;3058–3061, 1993; Kishimoto, T., R.V. Pearse II, C.R. Lin und M.G. Rosenfeld, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1108–1112, 1995). Der Unterschied von 2.000 zwischen den Molekulargewichten von rCRFR1 und mCRFR2β ist wahrscheinlich auf die längere Aminosäuresequenz von mCRFR2β zurückzuführen. Chemische Quervernetzungen mit nicht transfizierten HEK-293-Zellen konnten mit keinem der Radioliganden beobachtet werden.
Wie für die CRF-Peptid-Antagonisten erwartet worden ist (Dautzenberg, F.M., K. Dietrich, M.R. Palchaudhuri und J. Spiess, J. Neurochem. 69:1640–1649, 1997; Donaldson, C.J., S.W. Sutton, M.H. Perrin, A.Z. Corrigan, K.A. Lewis, J.E. Rivier, J.M. Vaughan und W.W. Vale, Endocrinology 137:2167–2170, 1996; Gottowik, J., V. Goetschy, S. Henriot, E. Kitas, B. Fluhman, R.G. Clerc, J.L. Moreau, F.J. Monsma und G.J. Kilpatrick, Neuropharmacol. 36:1439–1446, 1997), zeigten oCRF und Svg Bindung an rCRFR1 mit ähnlich hoher Affinität (oCRF: K_d = 0,6 ± 0,1 nM, Svg: K_d = 0,7 ± 0,1 nM), aber unterschieden sich signifikant in ihrer Bindung an mCRFR2β (oCRF: K_d = 162,4 ± 37,6 nM, Svg: K_d = 4,5 ± 0,6 nM) (Tabelle 1, 3).
Für die Bindung der CRF-Antagonisten (α-helikaler CRF_(9-41) und [DPhe¹², Nle^21,38]h/rCRF_(12-41), die bereits früher beschrieben worden waren (Gulyas, J., C. Rivier, M. Perrin, S.C. Koerber, S. Sutton, A. Corrigan, S.L. Lahrichi, A.G. Craig, W. Vale und J. Rivier, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10575–10579, 1995), an rCRFR1 wurden K_d-Werte von 60,3 ± 10,6 nM beziehungsweise 46,4 ± 9,4 nM erhalten. Es wurde herausgefunden, dass der Antagonist Astressin (Gulyas, J., C. Rivier, M. Perrin, S.C. Koerber, S. Sutton, A. Corrigan, S.L. Lahrichi, A.G. Craig, W. Vale und J. Rivier, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10575–10579, 1995), cyclo(30-33)[DPhe¹², Nle^21,38, Glu³⁰, Lys³³]h/rCRF_(12-41), nicht selektiv mit ähnlicher Affinität an rCRFR1 (K_d = 5,7 ± 1,6 nM) und mCRFR2β (K_d = 4,0 ± 2,3 nM) bindet, wohingegen α-helikaler CRF_(9-41) und [DPhe¹², Nle^21,38]h/rCRF_(12-41) moderate Selektivität für die Bindung an mCRFR2β mit K_d-Werten von 6,4 ± 0,9 nM beziehungsweise 17,7 ± 2,2 nM aufwiesen (Tabelle 1). Basierend auf der Aminosäuresequenz von oCRF zeigte [DPhe¹²]oCRF_(12-41) mit K_d-Werten von 290,2 ± 74,7 nM beziehungsweise 153,8 ± 26,8 nM eine Bindung geringer Affinität an rCRFR1 und mCRFR2β (Tabelle 1, 3).
Die verkürzten Ucn-Analoga [DPhe¹¹]rUcn_(11-40), [DPhe¹¹, Glu¹²] rUcn_(11-40), [DLeu¹¹, Glu¹²]rUcn_(11-40) und cyclo(29–32)[DPhe¹¹, Glu²⁹, Lys³²]rUcn_(11-40) zeigten moderate Bindungsaffinität für rCRFR1 mit K_d-Werten von 33,0 ± 5,9 nM, 68,2 ± 20,5 nM, 91,1 ± 21,2 nM beziehungsweise 47,1 ± 8,9 nM, und wiesen mit K_d-Werten von 5,2 ± 1,5 nM, 9,5 ± 2,0 nM, 27,9 ± 3,4 nM beziehungsweise 22, 4 ± 4,8 nM geringe Präferenz für eine Bindung an mCRFR2β auf (Tabelle 1, 3).
Die von Svg abstammenden Peptide [DLeu¹¹]Svg_(11-40), Svg_(11-40), [DPhe¹¹]Svg_(11-40) und [DPhe¹¹, His¹²]Svg_(11-40) zeigten eine Bindung geringer Affinität an rCRFR1 mit K_d-Werten von 1670,0 ± 500,0 nM, 831,2 ± 668,8 nM, 237,3 ± 27,7 nM beziehungsweise 153,6 ± 33,5 nM, eine Bindung hoher Affinität an mCRFR2β mit K_d-Werten von 20,9 ± 4,1 nM, 15,4 ± 2,5 nM, 3,5 ± 0,2 nM beziehungsweise 1,4 ± 0,4 (Tabelle 1). Daher banden [DPhe¹¹, His¹²]Svg_(11-40), [DLeu¹¹]Svg_(11-40), [DPhe¹¹]Svg_(11-40) und Svg_(11-40) mit einer 77-, 56-, 47- beziehungsweise 38-fach höheren Selektivität an mCRFR2β als Astressin.
ANOVA zeigte statistisch signifikante Unterschiede bei der Bindung hoher Affinität der CRF- Peptide (Verbindungen 1–14), F(13,41) = 13,17 p = 0,0001, an Zellmembranen von HEK-rCRFR1-Zellen (Tabelle 1). Der nachträgliche Vergleich zeigte im Vergleich mit den Verbindungen 1–5 und 7–11 (p = 0,0001) eine signifikant geringere Bindungsaffinität von [DLeu¹¹]Svg_(11-40)(Verbindung 13) und Svg_(11-40)(Verbindung 14) gegenüber Zellmembranen (Tabelle 1). Statistisch signifikante Unterschiede wurden für die Bindung hoher Affinität, F(13,36) = 20,34, p = 0,0001, von oCRF (Verbindung 1) und [DPhe¹²]oCRF_(12-41) (Verbindung 6) an Zellmembranen von HEK-mCRFR2β-Zellen beobachtet. Nachträglicher Vergleich zeigte im Vergleich zu den Verbindungen 2–5 und den Verbindungen 7–14 (p = 0,0001) eine signifikant geringere Bindungsaffinität von oCRF (Verbindung 1) und [DPhe¹²]oCRF_(12-41) (Verbindung 6) an Zellmembranen (Tabelle 1).
Daher war im Vergleich zu Astressin der wirksamste, bisher beschriebene CRF-Antagonist (Gulyas, J., C. Rivier, M. Perrin, S.C. Koerber, S. Sutton, A. Corrigan, S. Lahrichi, A.G. Craig, W. Vale und J. Rivier, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10575–10579, 1995), die intrinsische Aktivität von [DPhe¹¹, His¹²]Svg_(11-40), in Experimenten mit HEK-rCRFR1 oder HEK-mCRFR2β-Zellen nicht signifikant verschieden. Man fand jedoch heraus, dass die inhibitorische Potenz von [DPhe¹¹, His¹²]Svg_(11-40) gegenüber rCRFR1 15 % der Potenz von Astressin betrug. Dieser Unterschied wurde als signifikant bestimmt. Im Gegensatz dazu wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den inhibitorischen Potenzen von Astressin und [DPhe¹¹, His¹²]Svg_(11-40) beobachtet, wenn HEK-mCRF2β-Zellen untersucht wurden (Tabelle 2). Der Unterschied zwischen Astressin und [DPhe¹¹, His¹²]Svg_(11-40) war in Bindungsexperimenten sogar noch ausgeprägter (Tabelle 1), wodurch gezeigt wurde, dass [DPhe¹¹, His¹²]Svg_(11-40) im Gegensatz zu Astressin selektive Bindung an mCRFR2β einging. Auf der Basis von Liganden-Vergleichen wurde daher gezeigt, dass [DPhe¹¹, His¹²]Svg_(11-40) ein selektiver, auf mCRFR2β gerichteter CRF-Antagonist mit geringen intrinsischen, gegen rCRFR1 und mCRFR2β gerichteten Aktivitäten war.
Es ist berichtet worden, dass CRFR1 von Säugern im Gegensatz zu CRFR2 nicht selektiv für CRF und CRF-ähnliche Peptide einschließlich der strukturell verwandten, aus 40 Aminosäuren bestehenden Peptide Svg und Ucn ist (Vita, N., P. Laurent, S. Lefort, P. Chalon, J.-M. Lelias, M. Kaghad, G. Le Fur, D. Caput und P. Ferrara, FERS Lett. 335:1–5, 1993; Dautzenberg, F.M., K. Dietrich, M.R. Palchaudhuri und J. Spiess, J. Neurochem. 69:1640–1649, 1997; Vaughan, J., C. Donaldson, J. Bittencourt, M.H. Perrin, K. Lewis, S. Sutton, R. Chan, A.V. Turnbull, D. Lovejoy, C. Rivier, J. Rivier, P.E. Sawchenko und W. Vale, Nature (London) 378:287–292, 1995; Fisher, L., C. Rivier, J. Rivier und M. Brown, Endocrinology 129:1312–1316, 1991; Donaldson, C.J., S.W. Sutton, M.H. Perrin, A.Z. Corrigan, K.A. Lewis, J.E. Rivier, J.M. Vaughan und W.W. Vale, Endocrinology 137:2167–2170, 1996). Experimentelle Daten, die bisher zur Verfügung stehen, zeigen keine signifikanten pharmakologischen Unterschiede zwischen säugerstämmigem CRFR2α und CRFR2β (Fisher, L., C, Rivier, J. Rivier und M. Brown, Endocrinology 129:1312–1316, 1991; Donaldson, C.J., S.W. Sutton, M.H. Perrin, A.Z. Corrigan, K.A. Lewis, J.E. Rivier, J.M. Vaughan und W.W. Vale, Endocrinology 37:2167–2170, 1996). Auf dieser Basis wird erwartet, dass [DPhe¹¹, His¹²]Svg_(11-40) CRFR2α; in ähnlicher Weise hemmt wie CRFR2β. Tatsächlich zeigten Ergebnisse, die aus in vivo-Experimenten mit BALB/c-Mäusen gewonnen worden waren, dass [DPhe¹¹, His¹²]Svg_(11-40) CRF-vermittelte Verhaltenseffekte im lateralen Septum hemmte (J. Radulovic, A. Rühmann, T. Liepold und J. Spiess, J. Neurosci. 19:5016–5025, 1999; D.T. Chalmers, T.W. Lovenberg und E.B. DeSouza, J. Neurosci. 15:6340–6350 (1995), einem Gebiet im Gehirn, das ausschließlich CRF2α-mRNA exprimiert.
Beispiel 6: cAMP-Stimulierung
Die Peptid-Agonisten oCRF und Svg zeigten eine hohe Potenz, cAMP-Akkumulation in HEK-rCRFR1-Zellen zu erhöhen, mit EC₅₀-Werten von 0,41 ± 0,08 nM beziehungsweise 0,19 ± 0,05 nM, unterschieden sich aber signifikant in ihren Potenzen, cAMP-Produktion in HEK-mCRFR2β-Zellen zu stimulieren, mit EC₅₀-Werten von 11,79 ± 1,96 nM beziehungsweise 0,23 ± 0,05 nM.
Die vorstehend genannten CRF-Antagonisten (Verbindungen 3–14, Tabelle 2, 4) wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, oCRF- und Svg-stimulierte cAMP-Produktion in transfizierten HEK-293-Zellen, die rCRFR1 (HEK-rCRFR1-Zellen) beziehungsweise mCRFR2β (HEK-mCRFR2β-Zellen) exprimieren, zu verstärken oder zu hemmen. Intrinsische Aktivitäten wurden bei Peptid-Konzentrationen gemessen, die maximale Bildung von cAMP in HEK-rCRFR1- oder HEK-mCRFR2β-Zellen erzeugten. Die intrinsischen Aktivitäten von CRF-Antagonisten, die auf ihre Wirkung bei einer Konzentration von 1 μM auf HEK-rCRFR1-Zellen untersucht wurden, lagen im Bereich von 4–23 % der intrinsischen Aktivität von oCRF (Verbindung 1), untersucht bei einer Konzentration von 1 nM. Die intrinsischen Aktivitäten der Antagonisten, die unter äquivalenten Bedingungen mit HEK-mCRFR2β-Zellen untersucht worden waren, betrugen 0,4–0,9 % der intrinsischen Aktivität von Svg (Verbindung 2) (Tabelle 2, 4).
ANOVA zeigte statistisch signifikante Unterschiede bei der intrinsischen Aktivität, F(12,50) = 11,68, p = 0, 0001, der Verbindungen 3–14 bei der Stimulierung der cAMP-Produktion in HEK-rCRFR1-Zellen an. Ein nachträglicher Vergleich ergab eine signifikant höhere intrinsische Aktivität für die Verbindungen 8, 9 und 13 im Vergleich zu den Verbindungen 5, 6, 7, 11 und 12 (p = 0,001). Die Verbindungen 4 und 14 erhöhten ebenfalls die cAMP- Produktion in HEK-rCRFR1-Zellen, wenn sie mit dem basalen cAMP-Spiegel in den selben Zellen verglichen wurden (p = 0,001) (Tabelle 2). ANOVA zeigte keine statistisch signifikanten Unterschiede bei der intrinsischen Aktivität der Verbindungen 3–14, die cAMP-Produktion in HEK-mCRFR2β-Zellen zu stimulieren. Verbindung 11 wies die geringste intrinsische Aktivität aller untersuchten CRF-Antagonisten in Experimenten mit dem jeweiligen rekombinanten System, HEK-rCRFR1-Zellen und HEK-mCRFR2β-Zellen, auf (Tabelle 2).
Die Rangordnung für die Potenzen der mit CRF verbundenen Peptid-Antagonisten, oCRF-induzierte cAMP-Akkumulierung in HEK-rCRFR1-Zellen zu unterdrücken, war wie folgt: Astressin (Verbindung 3) und [DPhe¹¹]rUcn_(11-40) (Verbindung 7) > [DPhe¹², Nle^21,38]h/rCRF_(12-41) (Verbindung 5) und [DPhe¹¹, Glu¹²]rUcn_(11-40) (Verbindung 8) > [DLeu¹¹, Glu¹²]rUcn_(11-40) (Verbindung 9) und α-helikaler CRF_(9-41) (Verbindung 4) > [DPhe¹¹, His¹²]Svg_(11-40) (Verbindung 11), [DPhe¹¹]Svg_(11-40) (Verbindung 12), Svg_(11-40) (Verbindung 14) und cyclo(29–32) [DPhe¹¹, Glu²⁹, Lys³²]rUcn_(11-40) (Verbindung 10) > [DPhe¹²]oCRF_(12-41) (Verbindung 6) und [DLeu¹¹]Svg_(11-40) (Verbindung 13). Im Gegensatz dazu wurde das folgende pharmakologische Profil für die Inhibition von Svgstimulierter cAMP-Produktion in HEK-mCRFR2β-Zellen durch CRF-Antagonisten erhalten: [DPhe¹¹, His¹²]Svg_(11-40) (Verbindung 11) > Astressin (Verbindung 3), [DPhe¹¹]rUcn_(11-40) (Verbindung 7), [DPhe¹¹, Glu¹²]rUcn_(11-40) (Verbindung 8) und α-helikaler CRF_(9-41) (Verbindung 4) > [DPhe¹¹]Svg_(11-40) (Verbindung 12), [DLeu¹¹]Svg_(11-40) (Verbindung 13) und Svg_(11-40) (Verbindung 14) > [DLeu¹¹, Glu¹²]rUcn_(11-40) (Verbindung 9) > [DPhe¹², Nle^21,38]h/rCRF_(12-41) (Verbindung 5), cyclo(29–32) (DPhe¹¹, Glu²⁹, Lys³²]rUcn_(11-40)(Verbindung 10) und [DPhe¹²]oCRF_(12-41) (Verbindung 6).
ANOVA ergab statistisch signifikante Unterschiede für die Potenz, F(12,39) _ 7,93, p = 0,0001, der Verbindungen 3–14, oCRF-stimulierte cAMP-Produktion in HEK-rCRFR1-Zellen zu hemmen. Ein nachträglicher Vergleich zeigte im Vergleich zu Verbindung 6 (p = 0,0001) und den Verbindungen 10–14 (p = 0,0001) eine signifikant höhere Potenz der Verbindungen 3 und 7. Eine signifikant höhere Potenz wurde im Vergleich zu den Verbindungen 6 (p = 0,001) und 13 (p = 0,0001) auch für die Verbindung 5 beobachtet.
ANOVA ergab statistisch signifikante Unterschiede für die Potenz, F(12,65) _ 6,34, p = 0,0001, der Verbindungen 3–14, Svg-stimulierte cAMP-Produktion in HEK-mCRFR2β-Zellen zu hemmen. Nachträglicher Vergleich zeigte im Vergleich zu den Verbindungen 2 und 4 (p = 0,001) oder den Verbindungen 5, 6, 9, 10 und 13 (p = 0,0001) eine signifikant höhere Potenz der Verbindung 11.
Beispiel 7: Synthese von 4-(1-Azi-2,2,2-trifluorethyl)benzoesäure
4-(1-Azi-2,2,2-trifluorethyl)benzoesäure wurde, wie in PCT/EP96/05011 beschrieben, synthetisiert.
Beispiel 8: Analyse von CRFR2-selektiven Antagonisten, die für radioaktive Markierung und Experimente zur Fotoaffinitätsmarkierung geeignet sind
Die für den Typ2β-Rezeptor des Corticotropin-freisetzenden Faktors (CRF) (CRFR2β) selektiven Antagonisten, die auf der verkürzten Aminosäuresequenz von Sauvagine (Svg) basieren, wurden synthetisiert und charakterisiert. Die N-terminale Aminosäure Leu¹¹ in Svg_(11-40) wurde entweder durch Tyrosin oder ein Phenyldiazirin, die 4-(1-Azi-2,2,2-trifluorethyl)benzoyl (ATB)-Gruppe, zur radioaktiven Markierung beziehungsweise für Experimente zur Fotoaffinitätsmarkierung ersetzt. Um die Bindungsaffinität der Liganden an Membran-Homogenate von Zellen aus menschlicher embryonaler Niere (HEK), die dauerhaft mit cDNA transfiziert worden waren, welche CRFR1 der Ratte (rCRFR1) oder CRFR2β der Maus (mCRFR2β) codiert, weiter zu steigern, wurde Glu¹² durch Histidin ersetzt.
Die Bindungsaffinität der Verbindungen für rCRFR1 und mCRFR2β und die Potenz der Liganden, in transfizierten Zellen cAMP-Akkumulation zu erzeugen (agonistische Aktivität) oder durch oCRF-(rCRFR) oder Svg-(mCRFR2β) stimulierte cAMP-Produktion zu hemmen (antagonistische Aktivität), wurden mit der Bindungsaffinität und Potenz von anti-Sauvergine 30, {[DPhe¹¹, His¹²]Svg_(11-40)} (Verbindung 11), Astressin {cyclo(30-33)[DPhe¹², Nle^21,38, Glu³⁰, Lys³³]h/rCRF_(12-41) (Verbindung 3) und den fotoaktivierbaren Astressin-Analoga ATB-cyclo(30-33) [Nle^21,38, Glu³⁰, Ala³², Lys³³]h/rCRF_(13-41) (Verbindung 15) und ATB-cyclo(30-33) [Nle^21,38, Glu³⁰, Tyr³², Lys³³]h/rCRF_(13-41) (Verbindung 16) verglichen.
Substitution von DPhe¹¹ durch die Phenyldiazirin-Einheit in ATB-[His¹²]Svg_(12-40) (Verbindung 17) veränderte Bindungsaffinität, Liganden-Selektivität und Potenz dieses Liganden für CRFR1 und mCRFR2β im Vergleich zu anti-Sauvagine-30 (Verbindung 11) nicht signifikant (Tabellen 3 und 4). Ähnliche Ergebnisse konnten für ATB-cyclo(30-33)[Nle^21,38, Glu³⁰, Ala³², LyS³³]h/rCRF_(13-41) (Verbindung 15) im Vergleich mit Astressin (Verbindung 3) beobachtet werden (Tabellen 3 und 4).
Substitution von DPhe¹¹ durch Tyrosin in [Tyr¹¹, His¹²]Svg_(11-40) (Verbindung 18) oder [Tyr¹¹]Svg_(11-40)(Verbindung 19) verringerte die Bindungsaffinität dieser Verbindungen für rCRFR1 oder mCRFR2β um das 1,4- bis 5,9-fache im Vergleich zu Antisauvagine-30 (Verbindung 11) beziehungsweise [DPhe¹¹]Svg_(11-40) (Verbindung 12), ohne die bevorzugte Bindung an mCRFR2β zu verändern. Weitere N-terminale Verkürzung der Aminosäuresequenz Svg_(11-40) um eine Aminosäure und Substitution von Glu¹² durch Tyrosin hebt die Bindung hoher Affinität von [Tyr¹²]Svg_(12-40) (Verbindung 20) an mCRFR2β vollständig auf (Tabelle 3).
Literatur

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Claims

Antagonist des Liganden des Typ 2-Rezeptors des Corticotropinfreisetzenden Faktors (CRFR2), dem die 8 bis 10 N-terminalen Aminosäuren des nativen Sauvagine fehlen und der die Aminosäuresequenz Xaa₁-Xaa₂-Leu-Leu-Arg-Lys-Met-Ile-Glu-Ile-Glu-Lys-Gln-Glu-Lys-Glu-Lys-Gln-Gln-Ala-Ala-Asn-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Asp-Thr-Ile-NH₂ umfasst, wobei Xaa₁ eine neutrale Aminosäure ist und Xaa₂ eine geladene Aminosäure ist.
Antagonist nach Anspruch 1, dem die 10 N-terminalen Aminosäuren von nativem Sauvagine fehlen.
Antagonist nach Anspruch 2, wobei Xaa₁ eine hydrophobe Aminosäure ist und Xaa₂ Glu oder His ist.
Antagonist nach Anspruch 3, wobei Xaa₁ Leu ist.
Antagonist nach Anspruch 1 oder 2, wobei Xaa₁ eine polare Aminosäure und Xaa₂ Glu oder His ist.
Antagonist nach Anspruch 5, wobei Xaa₁ Tyr ist.
Antagonist nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Xaa₁ in der D-Konfiguration vorliegt.
Antagonist nach Anspruch 7, wobei Xaa₁ D-Leu ist.
Antagonist nach Anspruch 7, wobei Xaa₁ D-Tyr ist.
Antagonist nach einem der Ansprüche 4, 6, 8 oder 9, wobei Xaa₂ Glu ist.
Antagonist nach Anspruch 7, wobei Xaa₁ D-Phe ist.
Antagonist nach einem der Ansprüche 6, 9 oder 11, wobei Xaa₂ His ist.
Antagonist des Liganden des Typ 2-Rezeptors des Corticotropinfreisetzenden Faktors (CRFR2), der natives Sauvagine ist und dem die 11 N-terminalen Aminosäuren von nativen Sauvagine fehlen, wobei die N-terminale Aminosäure des Antagonisten eine geladene Aminosäure ist.
Antagonist nach Anspruch 13, wobei die geladene Aminosäure positiv geladen ist.
Antagonist nach Anspruch 14, wobei die geladene Aminosäure His ist.
Antagonist nach einem der Ansprüche 1 bis 15, der eine Phenyldiaziringruppe umfasst, die an die N-terminale Aminosäure des Antagonisten gekoppelt ist.
Antagonist nach Anspruch 16, wobei die Phenyldiaziringruppe eine 4-(1-Azi-2,2,2-trifluoroethyl)benzoyl(ATB)-Gruppe ist.
Polynucleotid, das den Antagonisten nach einem der Ansprüche 1 bis 6, 10, 12 oder 13 bis 15 codiert.
Vektor, umfassend das Polynucleotid nach Anspruch 18.
Vektor nach Anspruch 19, wobei das Polynucleotid funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden ist.
Wirtszelle, umfassend das Polynucleotid nach Anspruch 18 oder den Vektor nach Anspruch 19 oder 20 oder ein nicht-menschliches transgenes Tier, das die Wirtszellen umfasst.
Verfahren zur Herstellung des Antagonisten nach einem der Ansprüche 1 bis 6, 10, 12 oder 13 bis 15, wobei das Verfahren das Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 21 unter Bedingungen umfasst, welche die Synthese des Antagonisten bewirken, und Gewinnen des Antagonisten aus der Kultur.
Arzneimittel, umfassend den Antagonisten nach einem der Ansprüche 1 bis 17, das Polynucleotid nach Anspruch 18, und/oder den Vektor nach Anspruch 19 oder 20, und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel.
Diagnostische Zusammensetzung, umfassend den Antagonisten nach einem der Ansprüche 1 bis 17, das Polynucleotid nach Anspruch 18, und/oder den Vektor nach Anspruch 19 oder 20.
Kit, umfassend (a) einen Antagonisten nach einem der Ansprüche 1 bis 17; (b) das Polynucleotid nach Anspruch 18; und/oder (c) den Vektor nach Anspruch 19 oder 20.
Verwendung des Antagonisten nach einem der Ansprüche 1 bis 17, des Polynucleotids nach Anspruch 18 und/oder des Vektors nach Anspruch 19 oder 20 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung und/oder Behandlung einer Krankheit, die mit dem Typ 2-Rezeptor des Corticotropin-freisetzenden Faktors (CRFR2) assoziiert ist.
Antagonist nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei der CRFR2 CRFR2α oder CRFR2β ist.
Verwendung nach Anspruch 26, wobei der CRFR2 CRFR2α oder CRFR2β ist.
Verwendung nach Anspruch 26 oder 28 zur Prävention und/oder Behandlung von affektiven Psychosen, Magen-/Darmerkrankungen, Herzerkrankungen, psychiatrischen Erkrankungen, vorzugsweise Essstörungen, Angstneurosen oder Anorexa nervosa, und/oder Alzheimerscher Krankheit.
In vitro-Verwendung des Antagonisten nach einem der Ansprüche 1 bis 17, des Polynucleotids nach Anspruch 18 und/oder des Vektors nach Anspruch 19 oder 20 zur Erforschung von CRF-Rezeptor-Typ-spezifischen Funktionen.