DE69925116T2

DE69925116T2 - Neue, physiologisch aktive peptide und ihre verwendung.

Info

Publication number: DE69925116T2
Application number: DE69925116T
Authority: DE
Inventors: Tetsuya Tsukuba-shi OHTAKI; Hideki Tsukuba-shi MATSUI; Yoshihiro Tsukuba-shi ISHIBASHI; Kazuhiro Tsukuba-shi OGI; Chieko Sakai-shi KITADA
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-03-25
Filing date: 1999-03-24
Publication date: 2005-11-17
Anticipated expiration: 2019-03-25
Also published as: DE69925116D1; EP1065214A1; WO1999048920A1; ATE294816T1; US20060155109A1; EP1065214B1; US7374910B2; EP1065214A4; AU2957099A; US7064181B1; CA2323503A1; CA2323503C

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Galaninrezeptor aktivierenden Faktor (Ligandenpeptid und dgl.).
Hintergrund und Stand der Technik
Ein Galanin ist ein physiologisch aktives Peptid, das aus 29 Aminosäureresten besteht, das zum ersten Mal in einem Extrakt aus dem Dünndarm von Schweinen gefunden wurde [FEBS Lett., 164, Seiten 124–128 (1983)] und wurde außer bei Schweinen auch bei verschiedenen anderen Arten festgestellt, wie Säugern, Geflügel, Reptilien und Fischen. Die, deren Aminosäuresequenzen angegeben wurden, sind Humangalanin (FEBS Lett., 283, Seiten 189–194 (1991)), Rindergalanin (FEBS Lett., 234, Seiten 400–406 (1988)), Rattengalanin (J. Biol. Chem., 262, Seiten 16755–16758 (1987)), Schafgalanin (Peptides, 12, Seiten 855–859 (1991)) und dgl. und die 15 Aminosäurereste am N-Ende sind bei allen Arten konserviert.
Bekannte Schweinegalanine sind ein Vorläuferprotein, das aus 123 Aminosäureresten besteht (Preprogalanin (1-123); Proc. Natl. Acad. Sci. USa, 83, Seiten 6287–6291 (1986)), ein Vorläufer, der um 9 Reste am N-Ende länger ist als Galanin, nämlich Präprogalanin-(24-61)-amid und ein Präprogalanin-(37-61)-amid, bei dem 4 Reste des N-Endes eines Galanins deletiert sind (Peptides, 13, Seiten 1055–1060 (1992)).
Bekannte physiologische Aktivitäten der Galanine sind eine die Acetylcholinfreisetzung hemmende Wirkung im Hippocampus (Brain Research, 709, Seiten 81–87 (1996)), eine das Futterzentrum stimulierende Wirkung im Hypothalamus (Obesity Research, 3, Seiten 5735–5895 (1995)), eine die Hypophysenhormonfreisetzung stimulierende Wirkung in der Hirnanhangdrüse (Neuroscience Letter, 75, Seiten 49–54 (1987); Endocrinology, 134, Seiten 529–536 (1994); Peptides, 7, Seiten 51–53 (1986)), ein die Insulinsekretion hemmende Wirkung in der Pankreas (Acta Physiol. Stand., 139, Seiten 591–596 (1990)) und dgl., von denen angenommen wird, dass sie jeweils über einen Galaninrezeptor ausgeübt werden.
Die Galaninrezeptoren werden in drei Unterarten klassifiziert (GALR1, GALR2, GALR3) und die Gene werden für GALR1 in Menschen, Ratten und Mäusen kloniert (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, Seiten 3845–3849 (1993); J. Mol. Neurosci., 6, Seiten 33–41 (1995); FEBS Lett., 411, Seiten 225–230 (1997)), für GALR2 in Ratten (FEBS Lett., 405, Seiten 285–290 (1997); Mol. Pharmacol., 52, Seiten 337–343 (1997); J. Biol. Chem., 272, Seiten 24612–24616 (1997) und für GALR3 in Ratten (J. Biol. Chem., 272, Seiten 31949–31952 (1997). Jeder dieser drei Galaninrezeptoren hat 7 hydrophobe Bereiche (Transmembrandomänen), die charakteristisch sind für einen G-Protein-gekuppelten Rezeptor und es wird angenommen, dass sie ein intrazelluläres Transmissionsystem über eine Aktivierung eines G-Proteins stimulieren.
Es wurde gezeigt, dass ein Galanin an einen Galaninrezeptor jeder dieser drei Unterarten bindet. Die Bindungsaffinität eines Galanins ist die höchste für GALR1 und die nächsthöchste für GALR2 und dann für GALR3 und die Affinität für GALR3 ist etwa zehnfach niedriger als für GALR1 (J. Biol. Chem., 272, 31949–31952, 1997). Es wurde auch berichtet, dass ein Galanin eine cAMP-Produktionshemmung bei einer GALR1 exprimierenden Zelle induziert (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 90, 3845–3849, 1993), eine cAMP-Produktionshemmung bei einer GALR2 exprimierenden Zelle induziert (Mol. Pharmacol., 52, Seiten 337–343 (1997)) und einen erhöhten Inositphosphatmetabolismus und einen erhöhten intrazellulären Calciumionenpegel induziert (J. Biol. Chem., 272, 24612–24616, 1997).
Der einzige intrinsische Agonist für einen Galaninrezeptor, der bisher identifiziert wurde, ist ein Galanin. Es gibt keinen Bericht darüber, dass eine aktivierende Reaktion eines agonistabhängigen G-Proteins (G-Proteingekuppeltes Rezeptorprotein) bei einem Galaninrezeptor, z.B. eine die Bindung von ³⁵S-markiertem Guanosin-5'-O-3-thiotriphosphat ([³⁵S]GTPgS) erhöhende Reaktion (Methods in Enzymology, 237, Seiten 3–13 (1994)) oder eine die GTP-Hydrolysierung fördernde Reaktion (Methods in Enzymology, 237, 13–26, 1994) verwendet wurde, um einen Liganden eines Galaninrezeptors zu suchen.
Es ist erwünscht, einen neuen intrinsischen Agonisten aufzufinden, der sich von einem Galanin in der Selektivität für (Spezifität) eine Unterart der Galaninrezeptoren unterscheidet.
Offenbarung der Erfindung
Es wurde eine Galaninrezeptor-GALR2 exprimierende Zelle und eine Galaninrezeptor-GALR1 exprimierende Zelle konstruiert, die verwendet wurden, um einen geeigneten Test zu etablieren, um die agonistische Aktivität jeder Unterart der Galaninrezeptoren zu bestimmen, d.h. ein [³⁵S]GTPγS-Bindungstest. Wenn dieser Test verwendet wurde, um auf einen GALR2-Agonisten zu screenen, war er erfolgreich, um einen neuen Aktivierungsfaktor zu erhalten, dessen Aktivierungswirkung auf jede Unterart der Galaninrezeptoren von der von Galanin verschieden war. Es wurde weiterhin gefunden, dass es möglich ist, basierend auf den oben beschriebenen Erkenntnissen, eine Verbindung zu screenen, die ihre Bindungsaktivität zwischen diesem neuen Aktivierungsfaktor und einem Galaninrezeptor verändert.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung:

(1) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 35 dargestellt ist und eine Fähigkeit hat, an ein Rezeptorprotein zu binden, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist oder eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von 90 bis 99,9% mit einer Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist, oder ein Vorläufer davon, ein Amid oder ein Ester oder ein Salz davon;
(2) ein Peptid, wie in Abschnitt (1) beschrieben, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 35 dargestellt, und mit der Fähigkeit, ein Rezeptorprotein zu aktivieren, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist oder einer Aminosäuresequenz mit einer Homologie von 90 bis 99,9% mit einer Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist, oder ein Vorläufer davon, ein Amid oder Ester, oder ein Salz davon;
(3) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 36 dargestellt, mit einer Fähigkeit, an ein Rezeptorprotein zu binden, das eine Aminosäuresequenz aufweist, wie in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 dargestellt, oder einer Aminosäuresequenz mit einer Homologie von 90 bis 99,9% mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 dargestellt, oder ein Vorläufer davon, ein Amid oder Ester oder ein Salz davon;
(4) ein Peptid, wie in Abschnitt (1) oder in Abschnitt (3) beschrieben, wobei das Peptid ein Peptid ist mit einer Aminosäuresequenz, die identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 11, 12, 15, 16 oder 43 dargestellt, oder ein Vorläufer davon, ein Amid oder Ester oder ein Salz davon;
(5) ein Peptid, wie in Abschnitt (1) oder in Abschnitt (3) beschrieben, wobei das Peptid ein Peptid ist, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 11, 12, 15, 16 oder 43 dargestellt und mit einem Molekulargewicht von 5.000 bis 10.000, oder ein Vorläufer davon, ein Amid oder Ester oder ein Salz davon;
(6) ein Peptid, wie in Abschnitt (1) oder Abschnitt (3) beschrieben, wobei das Peptid ein Peptid ist, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 17, 31, 33 oder 34 dargestellt, oder ein Vorläufer davon, ein Amid oder Ester oder ein Salz davon;
(7) ein Vorläufer eines Peptids, das in Abschnitt (1) oder Abschnitt (3) beschrieben wurde, wobei der Vorläufer ein Peptid ist, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 29 dargestellt, oder ein Amid oder Ester oder ein Salz davon;
(8) ein Vorläufer eines Peptids, wie in Abschnitt (1) oder Abschnitt (3) beschrieben, der eine Aminosäuresequenz aufweist, wie in SEQ ID Nr. 30, 37 oder 38 dargestellt, oder ein Amid oder Ester oder ein Salz davon;
(9) DNA, die eine DNA aufweist, die eine Basensequenz aufweist, die ein Peptid codiert, wie in Abschnitt (1) oder in Abschnitt (3) beschrieben;
(10) DNA, wie in Abschnitt (9) beschrieben, die ein Peptid codiert mit einer Aminosäuresequenz, die identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 31, 33 oder 34 dargestellt;
(11) DNA, wie in Abschnitt (10) beschrieben, mit einer Basensequenz, wie in SEQ ID Nr. 32, 39 oder 40 dargestellt;
(12) DNA, die eine DNA aufweist, die eine Basensequenz aufweist, die einen Vorläufer für ein Peptid, wie in Abschnitt (1) oder in Abschnitt (3) beschrieben, codiert, mit einer Aminosäuresequenz, die identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 29, 30, 37 oder 38 beschrieben;
(13) DNA, wie in Abschnitt (12) beschrieben, die eine DNA aufweist, die eine Basensequenz aufweist, wie in SEQ ID Nr. 27, 28, 41 oder 42 dargestellt;
(14) rekombinanter Vektor, der eine DNA aufweist, wie in Abschnitt (9) beschrieben;
(15) nicht menschlicher Transformant, der mit dem rekombinanten Vektor transformiert ist, der in Abschnitt (14) beschrieben wurde;
(16) Verfahren zur Herstellung eines Peptids, wie in Abschnitt (1) oder in Abschnitt (3) beschrieben, oder eines Vorläufers davon, eines Amids oder Esters oder eines Salzes davon, das beinhaltet, dass der Transformant, der in Abschnitt (15) beschrieben wurde, gezüchtet wird und ein Peptid erzeugt wird, wie in Abschnitt (1) oder Abschnitt (3) beschrieben;
(17) Antikörper für ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33, SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44 gezeigt;
(18) diagnostisches Mittel, das einen Antikörper enthält, wie in Abschnitt (17) beschrieben;
(19) pharmazeutisches Mittel enthaltend ein Peptid, wie in Abschnitt (1) oder in Abschnitt (3) beschrieben, oder einen Vorläufer davon, ein Amid oder einen Ester, oder ein Salz davon;
(20) pharmazeutisches Mittel, wie in Abschnitt (19) beschrieben, das ein die Gedächtnisfunktion verbesserndes Mittel, Appetit regulierendes Mittel, ein die Uterusfunktion regulierendes Mittel, ein die Nierenfunktion regulierendes Mittel, ein die Prostatafunktion regulierendes Mittel, ein die Hodenfunktion regulierendes Mittel oder ein die Skelettmuskelfunktion regulierendes Mittel ist;
(21) Verfahren zum Screenen eines Agonisten oder Antagonisten für ein Rezeptorprotein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3 dargestellt, das beinhaltet, dass ein Peptid verwendet wird, wie in Abschnitt (1) oder in Abschnitt (3) beschrieben, oder ein Vorläufer davon, ein Amid oder Ester oder ein Salz davon;
(22) ein Peptid bestehend aus einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 16, SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 35, SEQ ID Nr. 36, SEQ ID Nr. 43, SEQ ID Nr. 44, gezeigt oder ein Vorläufer davon, ein Amid oder Ester oder ein Salz davon;
(23) Peptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, wie in SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 36 gezeigt und mit einer Fähigkeit, an ein Rezeptorprotein zu binden, das eine Aminosäuresequenz aufweist, wie in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 gezeigt, oder ein Vorläufer davon, ein Amid oder Ester oder ein Salz davon;
(24) ein Peptid, das (i) eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34 gezeigt, (ii) eine Aminosäuresequenz, die als Ergebnis der Deletion von 1 bis 7 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34 gezeigt ist, gebildet wurde, (iii) eine Aminosäuresequenz, die als Ergebnis der Addition von 1 bis 20 Aminosäuren an die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34 gezeigt ist, gebildet wurde, oder (iv) eine Aminosäuresequenz, die als Ergebnis der Substitution von 1 bis 7 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34 gezeigt ist, gebildet wurde, mit (i) einer Fähigkeit, an ein Rezeptorprotein zu binden, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 dargestellt, oder eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von 90 bis 99,9% mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 dargestellt, oder (ii) einer Fähigkeit, das Rezeptorprotein oder einen Vorläufer davon, ein Amid oder einen Ester oder ein Salz davon zu aktivieren, aufweist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die nachgewiesenen Ergebnisse der Galaninrezeptor aktivierenden Wirkung in einem [³⁵S]GTPγS-Bindungstest.
2 zeigt die Ergebnisse des [³⁵S]GTPγS-Bindungstests unter Verwendung einer GALR2 exprimierenden Zellmembranfraktion in den in Beispiel 2 erhaltenen Probefraktionen (2-3).
3 zeigt die Ergebnisse der Analyse einer in Beispiel 2 erhaltenen Probefraktion (2-3) unter Verwendung eines Schweinegalaninradioimmunoassaykits (Peninsula).
4 zeigt das Molekulargewicht einer Komponente mit einer GALR2 aktivierenden Wirkung ([³⁵S]GTPγS-bindungsfördernde Wirkung), die in Beispiel 2 erhalten wurde (2-4), das mit einer Gelfiltrations-HPLC bestimmt wurde.
5 zeigt das Molekulargewicht eines bekannten Peptids in Beispiel 2 (2-4), bestimmt mit Gelfiltrations-HPLC.
6 zeigt den Vergleich der Aminosäuresequenzen zwischen einem erfinderischen Peptid und einem Galaninvorläufer.
7 zeigt die Ergebnisse des Antikörpertiters einer Maus, die mit einem Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys(-NH₂)-KLH-Komplex immunisiert wurde, bestimmt unter Verwendung von HPR-markiertem Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys-NH₂.
8 zeigt ein beispielhaftes Screening für ein Hybridoma nach einer Zellfusion, wenn eine Maus verwendet wird, die mit einem Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys(-NH₂)-KLH-Komplex immunisiert wurde.
9 zeigt die Reaktivitäten eines monoklonalen Antikörpers GR2-1N, der hergestellt wurde unter Verwendung eines Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys(-NH₂)-KLH-Komplexes mit Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys-NH₂, (einer Amidform von SEQ ID Nr. 44), einem Schweineligandenpeptid (1-60) (SEQ ID Nr. 31) und einem Rattengalanin (SEQ ID Nr. 61) als Immunogen, bestimmt mit kompetitivem EIA unter Verwendung von mit HPR markiertem Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys-NH₂.
10 ist ein Schema, das ein Verfahren darstellt zur Herstellung eines Strukturgens des in Beispiel 20 beschriebenen Schweineligandenpeptids.
11 zeigt eine Konstruktion eines Vektors zur Expression des in Beispiel 21 beschriebenen Fusionsproteins.
12 zeigt eine Konstruktion eines Schweineligandenpeptid exprimierenden Stamms, wie in Beispiel 21 beschrieben.
13 zeigt die Ergebnisse der in Beispiel 23 beschriebenen SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
14 zeigt die Ergebnisse der in Beispiel 24 durchgeführten Fütterungstests.
Beste Ausführungsform zur Durchführung der Erfindung
Ein Ausdruck "im Wesentlichen identisch", wie er hier verwendet wird, bedeutet, dass die Aktivität eines Proteins, z.B. Rezeptoragonistaktivität, d.h. eine Fähigkeit, einen Rezeptor zu aktivieren, die ein Ligand besitzt, eine Ligandenrezeptorbindungsaktivität, im Wesentlichen gleich ist. Eine Substitution, Deletion, Addition oder Insertion einer Aminosäure verursacht manchmal keine wesentliche Veränderung in den physiologischen und chemischen Eigenschaften eines Peptids und in diesem Fall kann ein Protein, das einer Substitution, Deletion, Addition oder Insertion unterzogen wurde, angesehen werden als im Wesentlichen identisch mit einem Protein, das keine Substitution, Deletion, Addition oder Insertion erfahren hat. Ein im Wesentlichen identischer Substituent für eine Aminosäure in einer Aminosäuresequenz kann z.B. aus anderen Aminosäuren der Klasse, zu der die Aminosäure gehört, ausgewählt werden. Eine nicht polare (hydrophobe) Aminosäure kann z.B. Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin sein. Eine polare (neutrale) Aminosäure kann z.B. Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin sein. Eine positiv geladene (basische) Aminosäure kann z.B. Arginin, Lysin und Histidin sein. Eine negativ geladene (saure Aminosäure) kann z.B. Asparaginsäure und Glutaminsäure sein.
Ein Peptid der vorliegenden Erfindung ist ein Peptid mit einer Fähigkeit, an einen Galaninrezeptor zu binden. Bevorzugt hat es eine Galaninrezeptor aktivierende Wirkung und ist ein anderes Ligandenpeptid als bekannte Galanine. Ein Galaninrezeptor ist unten definiert.
Ein erfindungsgemäßes Peptid kann z.B. ein Peptid sein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 35 gezeigt (z.B. SEQ ID Nr. 13) und mit einer Fähigkeit, an ein Rezeptorprotein zu binden, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 dargestellt oder einer Aminosäuresequenz mit einer Homologie von 90 bis 99,9% mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 dargestellt (bevorzugt einer Fähigkeit, ein Rezeptorprotein zu aktivieren), was typischerweise einschließt:

(I) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 35 dargestellt (z.B. SEQ ID Nr. 13), und auch eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 11, 12, 15, 16 oder 43 gezeigt und mit einer Fähigkeit, an ein Rezeptorprotein zu binden, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 dargestellt, oder einer Aminosäuresequenz mit einer Homologie von 90 bis 99,9% mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 gezeigt, bevorzugt mit einer Fähigkeit, ein Rezeptorprotein zu aktivieren;
(II) ein Peptid, wie in Abschnitt (I) beschrieben, mit einem Molekulargewicht von 5.000 bis 10.000;
(III) ein Peptid, wie in Abschnitt (I) beschrieben, mit einem Molekulargewicht von 5.000 bis 8.000;
(IV) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 17 dargestellt und mit einer Fähigkeit, an ein Rezeptorprotein zu binden, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 gezeigt (bevorzugt mit einer Fähigkeit, ein Rezeptorprotein zu aktivieren) und mit einem Molekulargewicht von 5.000 bis 10.000 und
(V) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34 gezeigt und mit einer Fähigkeit, an ein Rezeptorprotein zu binden, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 dargestellt (bevorzugt mit einer Fähigkeit, ein Rezeptorprotein zu aktivieren).

Weiterhin schließt ein erfindungsgemäßes Peptid ein:

(VI) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 36 dargestellt;
(VII) ein Peptid, wie in Abschnitt (VI) beschrieben, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 16 oder SEQ ID Nr. 43 gezeigt;
(VIII) ein Peptid, wie in Abschnitt (VII) beschrieben, mit einem Molekulargewicht von 5.000 bis 10.000;
(IX) ein Peptid, wie in Abschnitt (VII) beschrieben, mit einem Molekulargewicht von 5.000 bis 8.000;
(X) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34 gezeigt;
(XI) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 17 gezeigt;
(XII) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 35 gezeigt (z.B. SEQ ID Nr. 13), und die auch eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 16 oder SEQ ID Nr. 43 gezeigt;
(XIII) ein Peptid, wie in den Abschnitten (X) bis (XII) beschrieben, mit einem Molekulargewicht von 5.000 bis 10.000.

Ein Peptid der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung desselben und eine Verwendung davon werden im Detail unten beschrieben.
Woher das erfindungsgemäße Peptid stammt, ist nicht spezifisch beschränkt, es kann aus einem Gewebe (z.B. Hirnanhangdrüse, Pankreas, Gehirn, Nieren, Leber, Geschlechtsdrüsen, Schilddrüse, Gallenblase, Knochenmark, Nebennierenrinde, Haut, Muskeln, Lungen, Verdauungstrakt, Blutgefäße, Herz, Hoden und dgl.) oder einer Zelle eines Menschen oder Warmblüters (z.B. Meerschweinchen, Ratte, Maus ebenso wie Schwein, Schaf, Rind und Affe) oder einer Zelle stammen (bevorzugt solchen, die aus Mausgehirn, Rattengehirn, Schweinegehirn, Rindergehirn, Schweinehypothalamus, Rinderhypothalamus, Schweinelunge, Rinderlunge, Rindermagen, menschlichem Hypothalamus, Schweinehoden, Rinderhoden, Rattenhoden, menschlichen Hoden oder menschlicher Lunge) oder kann ein synthetisches Peptid sein.
Z.B. kann ein erfindungsgemäßes Peptid sein:

[1] zusätzlich zu einem Peptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34 gezeigt (bevorzugt SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34) ein Peptid mit einer Aktivität, deren Qualität im Wesentlichen analog ist zu einem Peptid, das eine Aminosäure aufweist mit einer Homologie von etwa 50 bis 99,9% (bevorzugt 70 bis 99,9%, bevorzugter 80 bis 99,9%, weiter bevorzugt 90 bis 99,9%, am meisten bevorzugt 95 bis 99,9%) mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34 gezeigt (bevorzugt SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34) (außer der Sequenz für ein Galanin, wie in SEQ ID Nr. 7, 8, 9 oder 10 dargestellt oder einem Vorläufer davon).

Der Ausdruck "eine Aktivität, deren Qualität im Wesentlichen analog ist" bedeutet eine analoge Qualität im Hinblick auf eine Galaninrezeptoren GALR1, GALR2 oder GALR3 bindende Aktivität, eine Galaninrezeptoren GALR1, GALR2 oder GALR3 aktivierende Aktivität und eine Fähigkeit, eine begleitende Signaltransmissionskaskade zu aktivieren, z.B. Arachidonfreisetzung, intrazelluläre Ca²⁺-Freisetzung, Hemmung der intrazellulären cAMP-Produktion, Inositphosphorsäureerzeugung (Hemmung), Zellmembranpotenzialvariation, intrazelluläre Proteinphosphorylierung, intrazelluläre pH-Veränderung und dgl. Die quantitativen Faktoren dieser Aktivität, wie die Potenz oder das Molekulargewicht können unterschiedlich sein.
Typische Beispiele für ein Peptid der Erfindung sind unten aufgeführt (außer für ein Galanin mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 7, 8, 9 oder 10 gezeigt oder einen Vorläufer davon.

(I) Ein Peptid, das aus Mäusegehirn, Rattengehirn, Schweinegehirn, Rindergehirn, Schweinehypothalamus, Rinderhypothalamus, Schweinelunge, Rinderlunge, Rindermagen, menschlichem Hypothalamus, Schweinehoden, Rinderhoden, Rattenhoden, menschlichen Hoden oder menschlicher Lunge stammt, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die von einer Aminosäuresequenz dargestellt wird, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34 gezeigt (bevorzugt SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34) oder eine Teilsequenz davon.
(II) Ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die als Ergebnis der Substitution, Deletion, Addition oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in einem Peptid gebildet wurde, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34 gezeigt (bevorzugt SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34) oder eine Teilsequenz davon kann beispielhaft angeführt werden als ein Peptid, das eine im Wesentlichen identische Aminosäuresequenz aufweist. Z.B. ein Peptid, das (1) eine Aminosäuresequenz aufweist, die als Ergebnis der Deletion von 1 bis 7, bevorzugt 1 bis 5, bevorzugter 1 bis 3 Aminosäuren in einer Aminosäuresequenz gebildet wurde, die in SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34 gezeigt ist (bevorzugt SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34) oder eine Teilsequenz davon, (2) eine Aminosäuresequenz, die als Ergebnis der Addition (oder Insertion) von 1 bis 20, bevorzugt 1 bis 15, bevorzugter 1 bis 10 Aminosäuren zu einer Aminosäuresequenz gebildet wurde, die in SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34 gezeigt ist (bevorzugt SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34) oder eine Teilsequenz davon, (3) eine Aminosäuresequenz, die als Ergebnis der Substitution von 1 bis 7, bevorzugt 1 bis 5, bevorzugter 1 bis 3 Aminosäuren in einer Aminosäuresequenz gebildet wurde, die in SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34 gezeigt ist (bevorzugt SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34) oder eine Teilsequenz davon durch andere Aminosäuren.

"Eine Aminosäure, deren Qualität im Wesentlichen analog ist" bedeutet eine Aminosäure mit einer Homologie im Bereich von 70 bis 99,9%, bevorzugt 80 bis 99,9%, bevorzugter 90 bis 99,9%, am meisten bevorzugt 95 bis 99,9%.
Das Molekulargewicht eines erfindungsgemäßen Peptids, wenn es mit Gelfiltrationschromatographie oder einer äquivalenten Methode bestimmt wird, liegt in einem Bereich von etwa 5.000 bis etwa 10.000 Dalton, bevorzugt etwa 5.000 bis etwa 8.000 Dalton, bevorzugter etwa 5.500 bis etwa 8.000 Dalton, am meisten bevorzugt etwa 6.000 bis etwa 7.000 Dalton.
Ein Peptid, wie es hier betrachtet wird, hat ein N-Ende (Aminoende) auf der linken Seite und ein C-Ende (Carboxylende) auf der rechten Seite gemäß der üblichen Peptidbezeichnung.
Während ein Peptid der Erfindung ein C-Ende hat, das gewöhnlich eine Carboxylgruppe (-COOH) oder ein Carboxylat (-COO^–) ist, kann es auch ein C-Ende haben, das ein Amid (-CONH₂) oder ein Ester (-COOR) ist. R in einem Ester kann z.B. eine C₁-C₆-Alkylgruppe sein, wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl und n-Butyl, eine C₃-C₈-Cycloalkylgruppe, wie Cyclopentyl und Cyclohexyl, eine C₆-C₁₂-Arylgruppe, wie Phenyl und α-Naphthyl, eine Phenyl-C₁-C₂-alkylgruppe, wie Benzyl, Phenethyl und Benzhydryl, oder eine C₇-C₁₄-Aralkylgruppe, wie α-Naphthyl-C₁-C₂-alkyl, wie α-Naphthylmethyl ebenso wie eine Pivaloyloxymethylgruppe, die häufig angewendet wird für Esterformen zur oralen Verabreichung.
Wenn ein erfindungsgemäßes Peptid eine Carboxylgruppe oder ein Carboxylat irgendwo anders als am C-Ende aufweist, wird es auch als ein Peptid der Erfindung angesehen, wenn eine solche Gruppe zu einem Amid oder Ester derivatisiert ist. In einem solchen Fall kann der Ester ein Ester sein, wie oben beispielhaft als Ester am C-Ende angegeben.
Während ein Salz eines Peptids der Erfindung ein Salz mit einer physiologisch annehmbaren Base (z.B. einem Alkalimetall) oder Säure (organischen oder anorganischen Säure) sein kann, ist ein physiologisch annehmbares Säureadditionssalz besonders bevorzugt. Ein solches Salz kann z.B. ein Salz mit einer anorganischen Säure (z.B. Salzsäure, Phosphorsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure) sein oder ein Salz mit einer organischen Säure (z.B. Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Citronensäure, Äpfelsäure, Oxalsäure, Benzoesäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure).
Ein erfindungsgemäßes Peptid kann mit einer Methode erzeugt werden, um ein Peptid in gereinigter Form aus einem Gewebe oder einer Zelle eines Menschen oder warmblütigen Tiers zu isolieren oder kann gemäß der unten beschriebenen Peptidsynthese erzeugt werden.
Ein Peptid der Erfindung kann auch hergestellt werden, indem ein Transformant inkubiert wird, der eine DNA aufweist, die dieses Peptid codiert. Solche DNA, die dieses Peptid codiert, kann gemäß einer bekannten Klonierungsmethode hergestellt werden (z.B. einer Methode, wie in Molecular Cloning, 2. Auflage, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989, beschrieben).
Eine solche Klonierungsmethode kann z.B. sein: (1) eine Methode, bei der ein Transformant, der eine DNA aufweist, die ein vorgesehenes Peptid codiert, aus einer cDNA-Bibliothek erhalten wird durch eine Hybridisierung unter Verwendung einer DNA-Sonde oder eines DNA-Primers, der entwickelt wurde basierend auf der Aminosäuresequenz dieses Peptids oder (2) eine Methode, bei der ein Transformant, der eine DNA aufweist, die ein vorgesehenes Peptid codiert, erhalten wird, durch eine PCR unter Verwendung eines DNA-Primers, der entwickelt wurde basierend auf der Aminosäuresequenz dieses Peptids.
Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Peptids aus einem Gewebe oder einer Zelle eines Menschen oder eines Warmblüters wird ein solches Gewebe oder eine solche Zelle eines Menschen oder eines warmblütigen Tiers homogenisiert und mit einer Säure oder einem Alkohol extrahiert und der erhaltene Extrakt wird durch eine Kombination von Aussalzen, Dialyse, Gelfiltration und chromatographischen Methoden, wie Reverse-Phase-Ionenaustausch- und Affinitätschromatographie gereinigt.
Wie oben beschrieben, kann ein erfindungsgemäßes Peptid erzeugt werden (1) mit einer an sich bekannten Peptidsynthesemethode oder (2), indem ein Peptid, das das erfindungsgemäße Peptid enthält, mit einer geeigneten Peptidase gespalten wird.
Eine Peptidsynthesemethode kann z.B. eine Festphasensynthese oder Flüssigphasensynthese sein. So werden ein Teilpeptid oder eine Aminosäure, die ein Peptid der Erfindung bilden kann und der restliche Bereich kondensiert und eine Schutzgruppe, falls vorhanden, dann entfernt, wodurch das vorgesehene Peptid entsteht. Bekannte Kondensations- und Schutzgruppenabspaltungsmethoden sind solche, die in [1] und [2] unten beschrieben werden.

[1] M. Bodanszky und M.A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966).
[2] Schroeder und Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965).

Nach einer Reaktion können übliche Reinigungsmethoden, wie Extraktion mit einem Lösungsmitel, Destillation, Säulenchromatographie, Flüssigchromatographie und Umkristallisation in Kombination angewendet werden, um ein erfindungsgemäßes reines Peptid zu isolieren. Ein mit der oben beschriebenen Methode in freier Form erhaltenes Peptid kann in ein geeignetes Salz mit einer bekannten Methode umgewandelt werden und das als Salz erhaltene Peptid kann in eine freie Form umgewandelt werden mit einer bekannten Methode.
Für eine Amidform eines erfindungsgemäßen Peptids kann ein im Handel erhältliches Harz für eine Peptidsynthese angewendet werden, die für eine Amidbildung geeignet ist. Ein solches Harz kann z.B. ein Chlormethylharz, ein Hydroxymethylharz, ein Benzhydrylaminharz, ein Aminomethylharz, ein 4-Benzyloxybenzylalkoholharz, ein 4-Methylbenzhydrylaminharz, ein PAM-Harz, ein 4-Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethylharz, ein Polyacrylamidharz, ein 4-(2',4'-Dimethoxyphenylhydroxymethyl)phenoxyharz, ein 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminoethyl)phenoxyharz und dgl. sein. Unter Verwendung irgendwelcher dieser Harze wird eine Aminosäure, deren α-Aminogruppe und Seitenkettenfunktionalität in geeigneter Weise geschützt sind, in der Reihenfolge kondensiert, die die Sequenz eines vorgesehenen Peptids ergibt, an dem Harz mit einer an sich bekannten Kondensationsmethode. Am Ende der Reaktion wird das Peptid von dem Harz gleichzeitig mit der Abspaltung der Schutzgruppen abgeschnitten und dann eine intramolekulare Disulfidbindung, falls notwendig, gebildet, wodurch das vorgesehene Peptid entsteht.
Obwohl die Kondensation einer geschützten Aminosäure, wie oben beschrieben, durchgeführt werden kann unter Verwendung verschiedener aktivierenden Mittel, die bei einer Peptidsynthese angewendet werden, ist ein Carbodiimid bevorzugt. Ein Carbodiimid kann z.B. DCC, N,N'-Diisopropylcarbodiimid, N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid und dgl. sein. Für die Aktivierung mit irgendeiner dieser Verbindungen kann eine geschützte Aminosäure zusammen mit einem Racemisierungsinhibitor (z.B. HOBt, HOOBt etc.) direkt einem Harz zugefügt werden oder eine Aminosäure, die vorher in Form eines symmetrischen Anhydrids, HOBt-Esters oder HOOBt-Esters geschützt ist, kann zuerst aktiviert und dann dem Harz zugefügt werden. Ein für die Aktivierung einer geschützten Aminosäure oder für die Kondensation mit einem Harz verwendetes Lösungsmittel kann in geeigneter Weise aus den Lösungsmitteln ausgewählt werden, von denen bekannt ist, dass sie für eine Peptidkondensationsreaktion anwendbar sind. Z.B. kann ein Säureamid, wie N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid und N-Methylpyrlidon, ein halogenierter Kohlenwasserstoff, wie Methylenchlorid und Chloroform, ein Alkohol, wie Trifluorethanol, ein Sulfoxid, wie Dimethylsulfoxid, ein tertiäres Amin, wie Pyridin, ein Ether, wie Dioxan und Tetrahydrofuran, ein Nitril, wie Acetonitril und Propionitril, ein Ester, wie Methylacetat und Ethylacetat, und eine Mischung davon angewendet werden. Die Reaktionstemperatur liegt in einem Bereich, von dem bekannt ist, dass er für die Bildung einer Peptidbindung anwendbar ist und ist gewöhnlich etwa –20 bis etwa 50°C. Ein aktiviertes Aminosäurederivat wird gewöhnlich in einer Menge von etwa 1,5- bis etwa 4-fachem Überschuss verwendet. Wenn ein Ninhydrintest eine unzureichende Kondensation anzeigt, kann die Kondensation wiederholt werden ohne Schutzgruppen abzuspalten, um eine vollständige Kondensation sicherzustellen. Wenn keine vollständige Kondensation auch nach wiederholten Kondensationsstufen erreicht wurde, wird Essigsäureanhydrid oder Acetylimidazol verwendet, um eine nicht umgesetzte Aminosäure zu acetylieren, um irgendwelche Störungen bei nachfolgenden Reaktionen zu vermeiden.
Eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe in einer Ausgangsaminosäure kann z.B. Z, Boc, t-Pentyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, Adamantyloxycarbonyl, Trifluoracetyl, Phthaloyl, Formyl, 2-Nitrophenylsulfenyl, Diphenylphosphinothioyl, Fmoc und dgl. sein. Eine Schutzgruppe für eine Carboxylgruppe kann z.B. irgendeine der oben als R aufgeführten sein, wie eine C₁-C₆-Alkylgruppe, eine C₃-C₈-Cycloalkylgruppe und eine C₇-C₁₄-Aralkylgruppe ebenso wie 2-Adamantyl, 4-Nitrobenzyl, 4-Methoxybenzyl, 4-Chlorbenzyl, eine Phenacylgruppe und Benzyloxycarbonylhydrazid, t-Butoxycarbonylhydrazid, Tritylhydrazid und dgl.
Die Hydroxylgruppe von Serin und Threonin kann durch Veresterung oder Veretherung geschützt werden. Eine Gruppe, die für eine solche Veresterung geeignet ist, kann z.B. eine Niedrig-(C₁-C₆)-alkanoylgruppe, wie eine Acetylgruppe, eine Aroylgruppe, wie eine Benzoylgruppe, und eine Gruppe, die von einem Carbonat abgeleitet ist, wie eine Benzyloxycarbonylgruppe und eine Ethoxycarbonylgruppe sein. Eine Gruppe, die für die Veretherung geeignet ist, kann z.B. eine Benzylgruppe, eine Tetrahydropyranylgruppe und eine t-Butylgruppe sein.
Eine Schutzgruppe für eine phenolische Hydroxylgruppe von Tyrosin kann z.B. Bzl, Cl₂-Bzl, 2-Nitrobenzyl, Br-Z, t-Butyl und dgl. sein.
Eine Schutzgruppe für das Imidazol von Histidin kann z.B. Tos, 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl, DNP, Benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc und dgl. sein.
Ein Ausgangsmaterial, dessen Carboxylgruppe aktiviert ist, kann z.B. ein entsprechendes Säureanhydrid, ein Azid, ein aktivierter Ester [ein Ester mit einem Alkohol (z.B. Pentachlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, 2,4-Dinitrophenol, Cyanomethylalkohol, p-Nitrophenol, HONB, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid, HOBt)] und dgl. sein. Ein Ausgangsmaterial, dessen Aminogruppe aktiviert ist, kann z.B. ein entsprechendes Phosphorylamid sein.
Eine Methode zur Entfernung (Abspaltung) einer Schutzgruppe kann z.B. eine katalytische Hydrierung unter Wasserstoffströmung in Gegenwart eines Katalysators, wie Pd-Ruß oder Pd/C, eine Säurebehandlung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff Methansulfonsäure, Trifluormethansulfonsäure, Trifluoressigsäure oder einer Mischung davon, eine basische Behandlung mit Diisopropylethylamin, Triethylamin, Piperidin, Piperazin und dgl., ebenso wie eine Reduktion mit Natrium in wässrigem Ammoniak sein. Die Abspaltung durch saure Behandlung, wie oben beschrieben, wird gewöhnlich bei einer Temperatur von –20 bis 40°C, effektiv unter Zugabe eines Kationenfängers, wie Anisol, Phenol, Thioanisol, m-Kresol, p-Kresol, Dimethylsulfid, 1,4-Butandithiol, 1,2-Ethandithiol und dgl. sein. Eine als Schutzgruppe für Imidazol bei Histidin verwendete 2,4-Dinitrophenylgruppe kann durch Behandlung mit Thiophenol abgespalten werden und eine als Schutzgruppe für das Indol von Tryptophan verwendete Formylgruppe kann durch eine Behandlung mit einem Alkali, wie verdünntem Natriumhydroxid und verdünntem Ammoniak abgespalten werden zusätzlich zu einer Abspaltungsmethode durch Säurebehandlung in Gegenwart von 1,2-Ethandithiol und 1,4-Butandithiol, wie oben beschrieben.
Die Methode und die Gruppe zum Schutz einer funktionellen Gruppe, die nicht an der Reaktion eines Ausgangsmaterials beteiligt sein soll, die Abspaltung der Schutzgruppe und die Aktivierung einer Gruppe, die an der Reaktion beteiligt sein soll, können in geeigneter Weise aus bekannten Gruppen und bekannten Mitteln ausgewählt werden.
Eine weitere Methode, um eine Amidform eines Peptids der Erfindung zu erhalten, beinhaltet, dass eine α-Carboxylgruppe der Aminosäure am Carboxylende amidiert wird, die Peptidkette in Richtung der Aminogruppe verlängert wird, bis die gewünschte Länge erhalten ist, ein Peptid ohne Schutzgruppe an der α-Aminogruppe am N-Ende der Peptidkette und ein Peptid (eine Aminosäure) ohne Schutzgruppe der Carboxylgruppe am C-Ende gebildet wird und dann diese zwei Peptide in einer Lösungsmittelmischung, wie oben beschrieben, kondensiert werden. Die Bedingungen für die Kondensation sind wie oben beschrieben. Nach Reinigung des durch Kondensation erhaltenen geschützten Peptids werden alle Schutzgruppen mit den oben beschriebenen Methoden abgespalten, um das vorgesehene rohe Peptid zu erhalten. Dieses rohe Peptid wird verschiedenen Reinigungsmitteln unterzogen und eine gewünschte Fraktion wird lyophilisiert, um eine Amidform des vorgesehenen Peptids zu erhalten.
Für eine Esterform eines erfindungsgemäßen Peptids wird eine α-Carboxylgruppe der Aminosäure am Carboxylende mit einem geeigneten Alkohol unter Bildung eines Aminosäureesters kondensiert und dann einem Verfahren für eine Amidform des Peptids unterzogen, um eine Esterform des vorgesehenen Peptids zu erhalten.
Ein erfindungsgemäßes Peptid kann irgendeines sein, solange es eine Aktivität hat, wie ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz (z.B. GALR1-Agonistaktivität, GALR2-Agonistaktivität oder GALR3-Agonistaktivität etc.), die in SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34 (bevorzugt SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34) gezeigt ist oder eine Teilsequenz davon. Ein solches Peptid kann z.B. ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz sein, die als Ergebnis der Deletion, Addition (Insertion) oder Substitution von 1 bis 5 Aminosäuren in einer Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34 (bevorzugt SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34) gezeigt ist, oder einer Teilsequenz davon gebildet wurde.
Ein Vorläufer eines erfindungsgemäßen Peptids kann irgendein Peptid sein, das die Teilsequenz eines Ligandenpeptids der Erfindung codiert (mit Ausnahme eines Galanins mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 7, 8, 9 oder 10 dargestellt, oder eines Vorläufers davon).
Typischerweise kann ein Vorläufer eines erfindungsgemäßen Peptids z.B. ein Peptid (oder Polypeptid) mit einer Aminosäuresequenz sein, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 29 dargestellt.
In diesem Zusammenhang kann "eine im Wesentlichen identische Aminosäuresequenz" z.B. eine Aminosäuresequenz sein mit einer Homologie von 70 bis 99,9%, bevorzugter 80 bis 99,9%, noch weiter bevorzugt 90 bis 99,9%, am meisten bevorzugt 95 bis 99,9% mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 29 dargestellt.
Weiterhin kann "eine im Wesentlichen identische Aminosäuresequenz" z.B. (i) eine Aminosäuresequenz sein, die als Ergebnis der Substitution von 1 bis 7, bevorzugt 1 bis 5, bevorzugter 1 bis 3 Aminosäuren in einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 29 dargestellt, durch andere Aminosäuren gebildet wird, (ii) eine Aminosäuresequenz, die als Ergebnis der Deletion von 1 bis 7, bevorzugt 1 bis 5, bevorzugter 1 bis 3 Aminosäuren in einer Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 29 dargestellt ist, gebildet wird, (iii) eine Aminosäuresequenz, die als Ergebnis der Addition (oder Insertion) von 1 bis 7, bevorzugt 1 bis 5, bevorzugter 1 bis 3 Aminosäuren zu einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 29 dargestellt, gebildet wird, sein. Die Position der "Substitution, Deletion, Addition (oder Insertion)" ist nicht besonders beschränkt, solange sie außerhalb des Bereichs liegt, der als Teilsequenz ein Ligandenpeptid der Erfindung codiert.
Typischerweise kann ein Peptid (oder Polypeptid), das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäure, wie in SEQ ID Nr. 29 dargestellt, z.B. sein:

(1) ein Peptid (oder Polypeptid), das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäure, wie in SEQ ID Nr. 30 dargestellt;
(2) ein Peptid (oder Polypeptid), das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäure, wie in SEQ ID Nr. 37 dargestellt oder
(3) ein Peptid (oder Polypeptid), das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäure, wie in SEQ ID Nr. 38 dargestellt.

Ein Peptid der vorliegenden Erfindung kann als Antigen zur Herstellung eines Antiligandenpeptid-Antikörpers verwendet werden. Ein Peptid als ein derartiges Antigen kann ein Peptid der Erfindung, wie oben beschrieben sein, ebenso wie ein Teilpeptid eines Peptids der Erfindung, wie oben beschrieben, z.B. ein N-terminales Peptid, ein C-terminales Peptid und ein in der Mitte angeordnetes Peptid.
Ein Teilpeptid kann ein Peptid sein, das eine einzige Domäne eines erfinderischen Peptids enthält oder ein Peptid, das zwei oder mehr Domänen gleichzeitig enthält.
Da ein oben beschriebenes Teilpeptid annehmbar sein kann, wenn es als Antigen zur Herstellung eines Antiligandenpeptid-Antikörpers verwendet werden kann, kann es auch (i) ein Teilpeptid sein, das als Ergebnis der Addition (oder Insertion) von einer oder mehreren (bevorzugt 1 bis 3, bevorzugter 1 oder 2) anderen Aminosäureresten an ein Teilpeptid, wie ein N-terminales Peptid, ein C-terminales Peptid und ein in der Mitte positioniertes Peptid eines oben beschriebenen erfindungsgemäßen Peptids gebildet wird, (ii) ein Teilpeptid, das als Ergebnis der Deletion von einem oder mehreren (bevorzugt 1 bis 3, bevorzugter 1 oder 2) Aminosäureresten aus einem Teilpeptid, wie einem N-terminalen Peptid, einem C-terminalen Peptid und einem in der Mitte positionierten Peptid eines oben beschriebenen erfindungsgemäßen Peptids gebildet wird, (iii) ein Teilpeptid, das als Ergebnis der Substitution von einem oder mehreren (bevorzugt 1 bis 3, bevorzugter 1 oder 2) ein Teilpeptid bildenden Aminosäureresten, wie einem N-terminalen Peptid, einem C-terminalen Peptid und einem in der Mitte positionierten Peptid eines oben beschriebenen erfindungsgemäßen Peptids durch andere Aminosäuren gebildet wird, sein.
Ein solches Teilpeptid ist typischerweise ein Peptid, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die dargestellt wird durch [1] Ala Pro Ala His Arg Gly Arg Gly Gly Cys-NH₂ (Amidform von SEQ ID Nr. 44), das in dem im unten beschriebenen Beispiel 9 angewendet wird, ebenso wie:

[2] ein Peptid, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, wie in SEQ ID Nr. 11 dargestellt;
[3] ein Peptid, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, wie in SEQ ID Nr. 12 dargestellt;
[4] ein Peptid, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, wie in SEQ ID Nr. 13 dargestellt;
[5] ein Peptid, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, wie in SEQ ID Nr. 15 dargestellt;
[6] ein Peptid, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, wie in SEQ ID Nr. 16 dargestellt;
[7] ein Peptid, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, wie in SEQ ID Nr. 17 dargestellt;
[8] ein Peptid, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, wie in SEQ ID Nr. 35 dargestellt;
[9] ein Peptid, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, wie in SEQ ID Nr. 36 dargestellt und
[10] ein Peptid, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, wie in SEQ ID Nr. 43 dargestellt.

Ein Teilpeptid, wie es hier bezeichnet wird, kann auch ein Amid (-CONH₂) oder einen Ester (-COOR) an seinem C-Ende haben. Eine Estergruppe, die hier angewendet wird, kann z.B. eine sein, die im Zusammenhang mit einem oben beschriebenen Peptid beispielhaft ausgeführt wurde. Wenn ein solches Teilpeptid eine Carboxylgruppe oder ein Carboxylat irgendwo anders als am C-Ende aufweist, wird es auch als Teilpeptid der Erfindung angesehen, wenn eine solche Gruppe zu einer Amidogruppe oder einem Ester derivatisiert ist. In einem solchen Fall kann der Ester ein Ester sein ähnlich dem, der oben beispielhaft aufgeführt wurde als Ester am C-Ende.
Ein Teilpeptid eines erfinderischen Peptids selbst kann eine Aktivität haben, wie sie das erfinderische Peptid besitzt (z.B. eine Galaninrezeptor aktivierende Wirkung).
Ein Teilpeptid eines erfinderischen Peptids selbst kann auch ein Fusionspeptid mit einem Protein sein, dessen Funktion oder Eigenschaften wohl bekannt sind.
Ein solches Fusionsprotein kann typischerweise ein Fusionspeptid von einem Peptid, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die durch Ala Pro Ala His Arg Gly Arg Gly Gly Cys-NH₂ (Amidform von SEQ ID Nr. 44), das in Beispiel 11, wie unten beschrieben, angewendet wird, besteht, und einem Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH) sein.
Ein Salz eines Teilproteins eines erfindungsgemäßen Peptids kann so sein, wie ein Salz eines oben beschriebenen Peptids.
Ein Amid, Ester oder Salz eines Teilpeptids eines erfindungsgemäßen Peptids kann gemäß einer oben beschriebenen Synthese hergestellt werden oder durch Spalten eines Peptids der Erfindung mit einer geeigneten Peptidase.
Eine DNA, die ein erfindungsgemäßes Peptid codiert, kann irgendeine DNA sein, die eine DNA aufweist, die eine Basensequenz aufweist, die (I) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 35 dargestellt (z.B. SEQ ID Nr. 13) und mit der Fähigkeit, an ein Rezeptorprotein zu binden, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 gezeigt (bevorzugt mit einer Fähigkeit, ein Rezeptorprotein zu aktivieren) oder (II) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 36 dargestellt, codiert.
Eine DNA, die eine DNA aufweist, die eine Basensequenz aufweist, die ein erfindungsgemäßes Peptid, wie oben aufgeführt, codiert, kann auch angewendet werden.
Weiterhin kann auch eine Genom-DNA, eine Genom-DNA-Bibliothek, eine cDNA, die aus einem oben beschriebenen Gewebe oder einer oben beschriebenen Zelle stammt, eine aus einem oben beschriebenen Gewebe oder einer oben beschriebenen Zelle stammende cDNA-Bibliothek und eine synthetische DNA angewendet werden. Ein in einer Bibliothek verwendeter Vektor kann ein Bakteriophage, ein Plasmid, ein Cosmid oder ein Phagemid und dgl. sein. Eine direkte Amplifikation aus einer RNA-Fraktion, die aus dem oben beschriebenen Gewe be oder der oben beschriebenen Zelle hergestellt wurde, kann auch mit einer Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (im Folgenden als RT-PCR bezeichnet) durchgeführt werden.
Typischerweise können die folgenden angewendet werden: (1) eine DNA, die eine DNA aufweist, die eine Basensequenz aufweist, die ein Peptid codiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34 gezeigt, (2) eine DNA, die aus einem Säuger stammt, die mit einer Sequenz, die in (1) spezifisch angegeben ist, unter stringenten Bedingungen hybridisiert werden kann und (3) eine DNA, die nicht mit einer Sequenz, wie in (1) oder (2) spezifisch angegeben hybridisiert werden kann aufgrund einer Degeneriertheit des genetischen Codes, aber ein Polypeptid codiert mit identischer Aminosäuresequenz. Eine Hybridisierung kann mit einer an sich bekannten Methode oder einer analogen Methode durchgeführt werden. Die oben beschriebenen stringenten Bedingungen können z.B. etabliert werden bei 42°C mit 50% Formamid, 4 × SSPE (1 × SSPE = 150 mM NaCl, 10 mM NaH₂PO₄·H₂O, 1 mM EDTA, pH 7,4), 5 × Denhart-Lösung und 0,1% SDS.
Eine DNA, die eine DNA aufweist, die eine Basensequenz aufweist, die ein Peptid codiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 31 dargestellt, kann typischerweise eine DNA sein, die eine DNA aufweist, die eine Basensequenz aufweist, die in SEQ ID Nr. 32 gezeigt wird, eine DNA, die eine DNA aufweist, die eine Basensequenz aufweist, die ein Peptid codiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 33 dargestellt, kann typischerweise eine DNA sein, die eine DNA aufweist, die eine Basensequenz aufweist, die in SEQ ID Nr. 39 gezeigt ist und eine DNA, die eine DNA aufweist, die eine Basensequenz aufweist, die ein Peptid codiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist zu einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 34 gezeigt, kann typischerweise eine DNA sein, die eine DNA aufweist, die eine Basensequenz aufweist, die in SEQ ID Nr. 40 gezeigt ist. Von den DNAs, die erfinderische Peptide oder Teilpeptide davon codieren, wird ein DNA-Fragment mit 6 bis 51 (bevorzugt 9 bis 30, bevorzugter 12 bis 30) Teilbasensequenzen bevorzugt als Sonde für den DNA-Nachweis angewendet.
Eine DNA, die einen Vorläufer eines erfindungsgemäßen Peptids codiert, kann z.B. eine DNA sein, die eine DNA aufweist, die eine Basensequenz aufweist, die ein Peptid (Polypeptid) codiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 29 gezeigt (z.B. eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 30, SEQ ID Nr. 37 oder SEQ ID Nr. 38 gezeigt).
Eine DNA, die eine DNA aufweist, die eine Basensequenz aufweist, die ein Peptid (Polypeptid) codiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 29 dargestellt, kann typischerweise eine DNA sein, die eine DNA aufweist, die eine Basensequenz aufweist, wie in SEQ ID Nr. 27 dargestellt, eine DNA, die eine DNA aufweist, die eine Basensequenz aufweist, die ein Peptid codiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 30 dargestellt, kann typischerweise eine DNA sein, die eine DNA aufweist, die eine Basensequenz aufweist, wie in SEQ ID Nr. 28 dargestellt, eine DNA, die eine DNA aufweist, die eine Basensequenz aufweist, die ein Peptid codiert, das eine Aminosäuresequenz auf weist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 37 dargestellt, kann typischerweise eine DNA sein, die eine DNA aufweist, die eine Basensequenz aufweist, wie in SEQ ID Nr. 41 dargestellt, und eine DNA, die eine DNA aufweist, die eine Basensequenz aufweist, die ein Peptid codiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch mit einer Aminosäuresequenz ist, wie in SEQ ID Nr. 38 dargestellt, kann typischerweise eine DNA sein, die eine DNA aufweist, die eine Basensequenz aufweist, wie in SEQ ID Nr. 42 gezeigt.
Eine DNA, die ein Peptid der Erfindung oder ein Äquivalent davon codiert, kann auch mit der folgenden Gentechnologie erzeugt werden. Eine solche gentechnische Technologie kann z.B. eine Methode sein, wie in Molecular Cloning beschrieben (2. Auflage, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Wenn eine im Handel erhältliche Bibliothek oder ein Kit angewendet wird, kann die beigefügte Anleitung befolgt werden.
Eine DNA, die ein Peptid der Erfindung oder ein Äquivalent davon codiert, kann gescreent werden durch Hybridisierung einer markierten Sonde, die erhalten wurde, indem ein DNA-Fragment synthetisiert wurde basierend auf der Aminosäuresequenz des Peptids oder eines Teils davon mit einer Genom-DNA- oder cDNA-Bibliothek.
Bei einem Verfahren zum Klonieren einer DNA, die vollständig ein erfindungsgemäßes Peptid oder ein Äquivalent davon codiert, wird ein synthetischer DNA-Primer mit einer Teilbasensequenz eines Peptids der Erfindung verwendet, um eine PCR in an sich bekannter Weise durchzuführen, um die vorgesehene DNA aus einer Genom-DNA- oder cDNA-Bibliothek zu amplifizieren, oder eine Hybridisierung mit einer DNA, die in einen geeigneten Vektor integriert ist, der mit einem DNA-Fragment oder einer synthetischen DNA mit dem gesamten erfindungsgemäßen Peptid oder einem Teil davon markiert ist, wird durchgeführt, wodurch ein Screening erreicht wird.
Eine DNA, die ein kloniertes Peptid der Erfindung codiert, kann so, wie sie ist, verwendet werden, oder, falls notwendig, nachdem sie mit einem Restriktionsenzym verdaut wurde, oder aber gebunden an einen Linker. Eine solche DNA hat ein ATG als Translationsstartcodon auf der Seite des 5'-Endes und kann ein TAA, TGA oder TAG als Translationsterminationscodon auf der Seite des 3'-Endes haben. Solche Translationsstart- und Terminationscodons können unter Verwendung geeigneter synthetischer DNA-Adapter zugefügt werden.
Ein Expressionsvektor für ein erfindungsgemäßes Peptid kann z.B. erzeugt werden, indem (a) ein vorgesehenes DNA-Fragment aus einer DNA geschnitten wird, die das erfindungsgemäße Peptid codiert und anschließend (b) das so erhaltene DNA-Fragment stromabwärts des Promotors in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert wird.
Ein Vektor kann ein aus E. coli stammendes Plasmid (z.B. pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), ein aus Bacillus subtilis stammendes Plasmid (z.B. pUB110, pTP5, pC194), ein aus Hefe stammendes Plasmid (z.B. pSH19, pSH15), ein Bakteriophage, wie ein λ-Phage, ebenso wie ein Tiervirus, wie ein Retrovirus, Vacciniavirus, Vaculovirus und dgl. sein.
Ein erfindungsgemäß angewendeter Promotor kann irgendein Promotor sein, der dem für die Expression eines Gens angewendeten Wirts entspricht und dafür geeignet ist.
Wenn die Wirtszelle, die transformiert werden soll, eine Tierzelle ist, kann als Promotor angewendet werden: ein von SV40 stammender Promotor, ein Retroviruspromotor, ein Metallothioneinpromotor, ein Hitze schockpromotor, ein Cyctomegaloviruspromotor, ein SRα-Promotor und dgl. Bevorzugt sind ein trp-Promotor, ein T7-Promotor, ein lac-Promotor, ein recA-Promotor, ein λPL-Promotor, ein lpp-Promotor und dgl., wenn die Wirtszelle ein Escherichia-Mikroorganismus ist, ein SPO1-Promotor, ein SPO2-Promotor, ein penP-Promotor und dgl., wenn die Wirtszelle ein Bacillus-Mikroorganismus ist und ein PHO5-Promotor, ein PGK-Promotor, ein GAP-Promotor, ein ADH1-Promotor, ein GAL-Promotor und dgl., wenn die Wirtszelle eine Hefe ist. Wenn die Wirtszelle eine Insektenzelle ist, können ein Polyhedrinpromotor, ein p10-Promotor und dgl. angewendet werden.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen kann ein Expressionsvektor auch gegebenenfalls einen Enhancer, ein Spleiß-Signal, ein Poly-A-Additionssignal, einen Selektionsmarker, einen SV40-Replikationsursprung (im Folgenden als SV40ori bezeichnet) und dgl. enthalten. Ein Selektionsmarker kann z.B. Dihydrofolatreduktase(im Folgenden als dhfr)-Gen [Methotrexat-(MTX)-resistent], ein Ampicillinresistenzgen (im Folgenden als Amp' bezeichnet), ein Neomycinresistenzgen (im Folgenden als Neo, G418-resistent bezeichnet) und dgl. sein. Eine Selektion ist auch möglich in einem thymidinfreien Medium, insbesondere wenn ein DHFR-Gen als Selektionsmarker in CHO-(dhfr^–)-Zellen verwendet wird.
Falls notwendig, wird eine Signalsequenz, die für einen Wirt geeignet ist, am N-Ende eines Peptids oder eines Teils davon zugefügt. Verwendet werden können eine phoA·Signalsequenz, eine OmpA·Signalsequenz und dgl., wenn die Wirtszelle ein Escherichia-Mikroorganismus ist, eine Invertase·Signalsequenz und dgl., wenn die Wirtszelle eine Hefe ist, eine Insulin·Signalsequenz, eine α-Amylase·Signalsequenz, eine Subtilisin·Signalsequenz und dgl., wenn die Wirtszelle ein Bacillus-Mikroorganismus ist, eine Paarungsfaktor α (MFα)·Signalsequenz, eine α-Interferon·Signalsequenz, eine Antikörpermolekül·Signalsequenz und dgl., wenn die Wirtszelle eine Tierzelle ist.
Unter Verwendung eines Vektors, der eine DNA enthält, die ein so konstruiertes Peptid codiert, kann ein Transformant erzeugt werden.
Eine Wirtszelle kann z.B. ein Escherichia- und Bacillus-Mikroorganismus, eine Hefe, ein Insekt oder eine Insektenzelle, eine Tierzelle und dgl. sein.
Ein Escherichia-Mikroorganismus kann z.B. Escherichia coli K12·DH1 (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 60, 160 (1968)), JM 103 (Nucleic Acids Research, Bd. 9, 309 (1981)), JA221 (Journal of Molecular Biology, Bd. 120, 517 (1978)), HB 101 (Journal of Molecular Biology, Bd. 41, 459 (1969)), C600 (Genetics, Bd. 39, 440 (1954)) und dgl. sein.
Ein Bacillus-Mikroorganismus kann z.B. Bacillus subtilis MI114 (Gene, Bd. 24, 255 (1983)), 207-21 (Journal of Biochemistry, Bd. 95, 87 (1984)) und dgl. sein.
Eine Hefe kann z.B. Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R^–, NA87-11A, DKD-SD, 20B-12 und dgl. sein.
Ein Insekt kann z.B. eine Larve des Seidenwurms sein (Maeda et al., Nature, Bd. 315, 592 (1985)).
Eine Insektenzelle kann z.B., wenn das Virus AcNPV ist, eine vom Heerwurm stammende Zelllinie sein, z.B. eine Spodoptera-frugiperda-Zelle (Sf-Zelle), eine aus dem mittleren Darm von Trichoplusia ni stammende MG1-Zelle, eine aus dem Ei von Trichoplusia ni stammende High-Five^TM-Zelle, eine aus Mamestra brassicae abgeleitete Zelle oder eine aus Estigmena acrea stammende Zelle sein. Wenn als Virus BmNPV verwendet wird, kann als vom Seidenwurm abgeleitete Zelllinie Bombyx mori N (BmN-Zelle) angewendet werden. Eine Sf-Zelle kann z.B. eine Sf9-Zelle (ATCC CRL1711), eine Sf21-Zelle (alle in J.L. Vaughn et al., in Vitro, Bd. 13, 213–217 (1977)) sein.
Eine Tierzelle kann z.B. eine Simian COS-7-Zelle, eine Verozelle, eine CHO-Zelle vom Chinesischen Hamster, eine DHFR-Gen-defiziente CHO-Zelle vom Chinesischen Hamster (CHO/dhfr^–-Zelle), eine Maus-L-Zelle, eine Maus-3T3-Zelle, eine Mausmyelomzelle, eine Human-HEK-293-Zelle, eine Human-FL-Zelle, eine 293-Zelle, eine C127-Zelle, eine BALB3T3-Zelle, eine Sp-2/0-Zelle und dgl. sein.
Um einen Escherichia-Mikroorganismus zu transformieren, kann z.B. ein in Proc. Natl. Acad. Sci, USA, Bd. 69, 2110 (1972) oder in Gene, Bd. 17, 107 (1982) beschriebenes Verfahren angewendet werden.
Um einen Bacillus-Mikroorganismus zu transformieren, kann z.B. ein in Molecular & General Genetics, Bd. 168, 111 (1979) beschriebenes Verfahren verwendet werden.
Um eine Hefe zu transformieren, kann z.B. eine in Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 75, 1929 (1978) beschriebenes Verfahren angewendet werden.
Um ein Insekt oder eine Insektenzelle zu transformieren, kann z.B. eine in Bio/Technology, Bd. 6, Seiten 47–55 (1988) beschriebene Methode angewendet werden.
Um eine Tierzelle zu transformieren, kann z.B. eine in Virology, Bd. 52, S. 456 (1973) beschriebene Methode verwendet werden.
Ein Verfahren, um einen Expressionsvektor in eine Zelle zu transduzieren, kann z.B. eine Lipofektionsmethode (P.L. Felgner et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Bd. 84, S. 7413 (1987)), eine Calciumphosphatmethode (F.L. Graham und A.J. van der Eb, Virology, Bd. 52, Seiten 456–467 (1973)), eine Elektroporationsmethode (E. Nuemann et al., EMBO J., Bd. 1, Seiten 841–845 (1982)) und dgl. sein.
Wie oben beschrieben, kann ein Transformant, der mit einem Expressionsvektor, der eine DNA aufweist, die ein erfindungsgemäßes Peptid codiert, transformiert wurde, erhalten werden.
Bei einem Verfahren, um ein erfindungsgemäßes Peptid stabil unter Verwendung einer Tierzelle zu exprimieren, wird eine Zelle, in der ein Expressionsvektor, der in eine oben beschriebene Tierzelle transduziert wurde, in das Chromosom integriert ist, mithilfe der Klonselektion ausgewählt. Typischerweise wird ein Transformant ausgewählt unter Verwendung eines oben beschriebenen Selektionsmarkers als Index. Wenn die Klonselektion in der erhaltenen Tierzelle wiederholt wird unter Verwendung eines solchen Selektionsmarkers, kann eine zuverlässige Tierzelle, die das erfindungsgemäße Peptid in hohem Grad exprimieren kann, erhalten werden. Wenn ein dhfr-Gen als Selektionsmarker verwendet wird, wird der MTX-Gehalt nach und nach über den Inkubationszeitraum erhöht, um einen resistenten Stamm auszuwählen, indem eine DNA, die ein erfinderisches Peptid codiert, zusammen mit einem dhfr-Gen amplifiziert wird, wodurch eine Tierzelllinie erhalten wird, die eine weitere höhere Expression ermöglicht.
Ein oben beschriebener Transformant wird unter solchen Bedingungen inkubiert, die zulassen, dass eine DNA, die ein erfindungsgemäßes Peptid codiert, exprimiert wird und dann das erfinderische Peptid produziert und angesammelt wird, wobei das erfinderische Peptid erzeugt wird.
Für die Inkubation des Transformanten ist, wenn die Wirtszelle ein Escherichia- oder Bacillus-Mikroorganismus ist, ein geeignetes Kulturmedium ein flüssiges Medium, das die Komponenten enthalten kann, die für das Wachstum des Transformanten erforderlich sind, wie z.B. eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, eine anorganische Substanz und dgl. Eine Kohlenstoffquelle kann z.B. Glucose, Dextrin, lösliche Stärke, Saccharose und dgl. sein und eine Stickstoffquelle kann z.B. anorganisches oder organisches Material sein, wie ein Ammoniumsalz, ein Nitrat, Maiseinweichwasser, Pepton, Casein, ein Fleischextrakt, Sojaflocken, ein Kartoffelextrakt und dgl., und Mineralien können z.B. Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat, Magnesiumchlorid und dgl. sein. Zugegeben werden können auch Hefe, Vitamine, wachstumsfördernde Faktoren und dgl. Der pH-Wert eines Mediums ist bevorzugt etwa 5 bis B.
Als Kulturmedium zur Inkubation eines Escherichia-Mikroorganismus ist ein M9-Medium, das Glucose und Casaminosäure enthält [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431–433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972] bevorzugt. Das Medium kann ein Mittel zur Erhöhung der Promotoreffizienz enthalten, wie 3β-Indolylacrylsäure.
Wenn die Wirtszelle ein Escherichia-Mikroorganismus ist, wird die Inkubation gewöhnlich etwa 3 bis 24 Stunden lang bei etwa 15 bis 43°C durchgeführt, gegebenenfalls unter Belüftung und Rühren.
Wenn die Wirtszelle ein Bacillus-Mikroorganismus ist, wird die Inkubation gewöhnlich etwa 6 bis 24 Stunden bei etwa 30 bis 40°C durchgeführt, gegebenenfalls unter Belüftung und Rühren.
Für die Inkubation des Transformanten wird, wenn die Wirtszelle eine Hefe ist, ein geeignetes Kulturmedium z.B. ein Burkholder-Minimalmedium (K.L. Bostian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 77, 4505 (1980)) oder ein mit 0,5% Casaminosäure ergänztes SD-Medium (G.A. Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81, 5330 (1984)) und dgl. sein. Der pH-Wert des Mediums wird bevorzugt auf etwa 5 bis 8 eingestellt. Die Inkubation wird gewöhnlich etwa 24 bis 72 Stunden lang bei etwa 20 bis 35°C durchgeführt, gegebenenfalls unter Belüftung und Rühren.
Wenn die Wirtszelle eine Insektenzelle ist, ist für die Inkubation des Transformanten ein geeignetes Kulturmedium z.B. Grace's Insektenmedium (T.C.C. Grace, Nature, 195, 788 (1962)), das geeigneterweise z.B. mit inaktiviertem 10% Rinderserum ergänzt ist. Der pH-Wert des Mediums wird bevorzugt auf etwa 6,2 bis 6,4 eingestellt. Die Inkubation wird gewöhnlich etwa 3 bis 5 Tage bei etwa 27°C durchgeführt, gegebenenfalls unter Belüftung und Rühren.
Wenn die Wirtszelle eine Tierzelle ist, ist für die Inkubation des Transformanten ein geeignetes Kulturmedium z.B. mit etwa 5 bis 20% fötalem Kälberserum angereichertes MEM-Medium (Science, Bd. 122, 501 (1952)), ein DMEM-Medium (Virology, Bd. 8, 396 (1959)), ein RPMI-1640-Medium (The Journal of the American Medical Association, Bd. 199, 519 (1967)), ein 199-Medium (Proceeding of the Society for the Biological Medicine, Bd. 73, 1 (1950)) und dgl. Der pH-Wert ist bevorzugt etwa 6 bis B. Die Inkubation wird gewöhnlich etwa 15 bis 60 Stunden bei etwa 30 bis 40°C durchgeführt, gegebenenfalls unter Belüften und Rühren.
Insbesondere wenn eine CHO-(dhfr^–)-Zelle und ein dhfr-Gen als Selektionsmarker angewendet werden, ist ein mit dialysiertem fötalem Kälberserum ergänztes DMEM-Medium, das praktisch kein Thymidin enthält, bevorzugt.
Um ein gereinigtes Peptid der Erfindung aus der oben beschriebenen Kultur zu isolieren, kann das folgende Verfahren z.B. angewendet werden.
Um ein Peptid der Erfindung aus kultivierten Bakterienzellen oder einer Zelle zu extrahieren, werden die Zellen mit einer bekannten Methode nach Inkubation gesammelt und in einer geeigneten Pufferlösung suspendiert und dann mit Lysozym und/oder einem Einfrier-Auftau-Zyklus zerstört und dann einer Zentrifugation oder Filtration unterzogen, wobei ein roher Extrakt des Peptids erhalten wird. Die Pufferlösung kann einen Proteinmodifikator, wie Harnstoff und Guanidinhydrochlorid oder ein Tensid, wie Triton X-100 (Markenzeichen, im Folgenden als TM bezeichnet) enthalten.
Wenn ein Peptid in ein Kulturmedium ausgeschieden wird, wird der Überstand nach Inkubation von der Zelle mit an sich bekannten Methoden abgetrennt und der Überstand gesammelt.
Ein so erhaltener Kulturüberstand oder ein in einem Extrakt enthaltenes Peptid kann mit einer geeigneten Kombination von Trenn- und Isolierungsmethoden, die an sich bekannt sind, gereinigt werden. Solche bekannten Trenn- und Isolierungsmethoden schließen eine Methode ein, bei der die Löslichkeit verwertet wird, wie Aussalzen oder Lösungsmittelsedimentation, eine Methode, bei der der Unterschied im Molekulargewicht verwertet wird, wie Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, ein Verfahren, bei dem der Unterschied in der elektrischen Ladung verwertet wird, wie Ionenaustauschchromatographie, eine Methode, bei der die spezifische Affinität verwertet wird, wie Affinitätschromatographie, eine Methode, bei der der Unterschied in der Hydrophobizität verwendet wird, wie Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographie, eine Methode, bei der der Unterschied im isoelektrischen Punkt verwertet wird, wie isoelektrische Fokussierung und Chromatofokussierung und dgl.
Wenn ein so erhaltenes erfindungsgemäßes Peptid in freier Form ist, kann es in ein Salz umgewandelt werden mit an sich bekannten Methoden oder äquivalenten Methoden und wenn es als Salz erhalten wird, kann es in die freie Form oder ein anderes Salz umgewandelt werden nur an sich bekannten Methoden oder äquivalenten Methoden.
Indem ein von einem Transformanten erzeugtes erfinderisches Peptid mit einem geeigneten Protein modifizierenden Enzym vor oder nach der Reinigung in Kontakt gebracht wird, kann eine fakultative Modifikation ausgeführt werden oder ein Peptid kann teilweise entfernt werden. Ein solches Protein modifizierendes Enzym kann z.B. Trypsin, Chymotrypsin, Arginylendopeptidase, Proteinkinase, Glycosidase und dgl. sein.
Ein so erhaltenes erfinderisches Peptid kann mit einem Enzymimmunoassay unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers identifiziert werden.
Eine DNA, die das erfindungsgemäße Peptid codiert oder ein erfindungsgemäßes Peptid können angewendet werden in (1) einer Synthese eines Liganden eines Galaninrezeptorproteins vollständiger Länge oder eines Teils davon, (2) der Charakterisierung der physiologischen Aktivität, die ein erfindungsgemäßes Peptid besitzt, (3) der Erzeugung einer synthetischen Oligonucleotidsonde oder eines PCR-Primers, (4) der Gewinnung einer DNA, die einen Liganden oder einen Vorläufer eines G-Proteinkonjugat-Rezeptorproteins codiert, (5) der Entwicklung eines Rezeptorbindungstestsystems unter Verwendung eines Expressionssystems eines rekombinanten Rezeptorproteins und eines Screenings für Kandidaten für eine pharmazeutische Verbindung, (6) die Gewinnung eines Antikörpers und eines Antiserums, (7) die Entwicklung eines diagnostischen Mittels unter Verwendung von DNA, RNA, Antikörper oder Antiserum, (8) der Entwicklung eines pharmazeutischen Mittels, wie eines die Gedächtnisfunktion verbessernden Mittels (intelligenztropisches Mittel), eines den Appetit regulieren den Mittels, eines Diabetes behandelnden Mittels, eines die Hypophysenfunktion verbessernden Mittels, eines die Gebärmutterfunktion regulierenden Mittels, eines die Nierenfunktion regulierenden Mittels, eines die Prostatafunktion regulierenden Mittels, eines die Hodenfunktion regulierenden Mittels oder eines die Skelettmuskelfunktion regulierenden Mittels (bevorzugt ein die Gedächtnisfunktion verbesserndes Mittel (intelligenztropes Mittel), eines Appetitzüglers bzw. den Appetit regulierenden Mittels, eines die Gebärmutterfunktion regulierenden Mittels, eines die Nierenfunktion regulierenden Mittels, eines die Prostatafunktion regulierenden Mittels, eines die Hodenfunktion regulierenden Mittels oder eines die Skelettmuskelfunktion regulierenden Mittels), (9) eine Gentherapie und dgl.
Insbesondere unter Verwendung eines Rezeptorbindungstestsystems unter Verwendung eines Expressionssystems eines oben beschriebenen rekombinanten G-Proteinkonjugat-Rezeptorproteins kann ein G-Proteinkonjugat-Rezeptoragonist oder Antagonist, der für einen Warmblüter, wie einen Menschen, spezifisch ist, gescreent werden und ein solcher Agonist oder Antagonist kann als prophylaktisches oder therapeutisches Mittel für verschiedene Krankheiten verwendet werden.
Da das erfindungsgemäße Peptid oder eine DNA, die es codiert, als Ligand von einem Galaninrezeptor(GALR)-Protein erkannt werden kann, das in Hippocampus, Hypothalamus, Uterus, Niere, Prostata, Skelettmuskel, Pankreas, Hoden, Milz, Herz und Hypophyse exprimiert wird, ist es weiterhin im Zusammenhang mit (8), wie oben beschrieben, nützlich als sicheres und weniger toxisches pharmazeutisches Mittel, das z.B. angewendet werden kann als die Gedächtnisfunktion verbessernden Mittels (intelligenztropisches Mittel), ein den Appetit regulierendes Mittel, ein Diabetes behandelndes Mittel, ein die Hypophysenfunktion verbesserndes Mittel, ein die Gebärmutterfunktion regulierendes Mittel, ein die Nierenfunktion regulierendes Mittel, ein die Prostatafunktion regulierendes Mittel oder ein die Skelettmuskelfunktion regulierendes Mittel (bevorzugt ein die Gedächtnisfunktion verbesserndes Mittel (intelligenztropes Mittel), ein Appetitzügler, ein die Gebärmutterfunktion regulierendes Mittel, ein die Nierenfunktion regulierendes Mittel, ein die Prostatafunktion regulierendes Mittel oder ein die Skelettmuskelfunktion regulierendes Mittel) und dgl.
Wenn ein erfindungsgemäßes Peptid oder eine DNA, die es codiert, als oben beschriebenes pharmazeutisches Mittel angewendet wird, wird ein übliches Verfahren befolgt. Z.B. wird eine Tablette, eine Kapsel, ein Elixier oder eine Mikrokapsel, gegebenenfalls beschichtet mit einer Zuckerbeschichtung oder einer enterischen Beschichtung für die orale Verabreichung bereitgestellt oder eine aseptische Lösung oder Suspension in Wasser oder anderen pharmazeutisch annehmbaren Flüssigkeiten zur Injektion wird für die parenterale Verabreichung bereitgestellt. Eine Verbindung oder ihr Salz wird z.B. mit einem physiologisch annehmbaren Träger, Aromastoff Hilfsstoff, Vehikel, Konservierungsmittel, Stabilisator, Bindemittel und dgl. vermischt und zu einer pharmazeutisch annehmbaren Einheitsdosierungsform formuliert. Die Menge an aktivem Inhaltsstoff in einer solchen Formulierung sollte so eingestellt werden, dass die Dosis in einem angegebenen Bereich erhalten werden kann.
Wenn eine erfindungsgemäße DNA angewendet wird, wird eine solche DNA üblicherweise so, wie sie ist, angewendet, oder nachdem sie in einen geeigneten Vektor insertiert wurde, wie einen Retrovirusvektor, einen Adenovirusvektor, einen Adenovirus-assoziierten Virusvektor und dgl.
Ein zu einer Tablette oder einer Kapsel zuzugebendes Additiv kann z.B. ein Bindemittel, wie Gelatine, Maisstärke, Traganth, Gummi arabicum und dgl., ein Arzneimittelträger, wie kristalline Cellulose, ein Streckmit tel, wie Maisstärke, Gelatine, Alginsäure und dgl., ein Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, ein Süßstoff, wie Saccharose, Lactose oder Saccharin, ein Aromastoff wie Pfefferminz, ACAMONO-Öl oder Kirscharoma sein. Wenn eine Einheitsdosierungsform eine Kapsel ist, kann auch ein flüssiger Träger, wie ein Öl zusätzlich zu den oben aufgeführten Materialien enthalten sein. Eine aseptische Zusammensetzung zur Injektion kann üblicherweise formuliert werden, indem ein aktiver Inhaltsstoff und ein natürlich vorkommendes pflanzliches Öl, wie Sesamöl oder Palmöl, in einem Träger, wie Wasser zur Injektion gelöst oder suspendiert werden.
Ein auf Wasser basierendes Vehikel zur Injektion kann z.B. physiologische Kochsalzlösung, eine isotonische Lösung, die Glucose oder andere Mittel (z.B. D-Sorbit, D-Mannit, Natriumchlorid und dgl.) enthält, sein, das gegebenenfalls einen geeigneten Lösungsvermittler, wie Alkohol (z.B. Ethanol), Polyalkohol (z.B. Propylenglycol, Polyethylenglycol), ein nichtionisches Tensid (z.B. Polysorbat 80^TM, HCO-50) enthält. Ein auf Öl basierender Träger kann z.B. Sesamöl oder Sojaöl sein, der gegebenenfalls einen Lösungsvermittler, wie Benzylbenzoat, Benzylalkohol und dgl. enthält.
Ein Puffer (z.B. Phosphatpuffer, Natriumacetatpuffer), ein analgetisches Mittel (z.B. Benzalkoniumchlorid, Procainhydrochlorid und dgl.), ein Stabilisator (z.B. Humanserumalbumin, Polyethylenglycol und dgl.), ein Konservierungsmittel (z.B. Benzylalkohol, Phenol und dgl.), ein Antioxidans können auch eingearbeitet werden. Eine Formulierung zur Injektion, die so hergestellt wurde, wird gewöhnlich in eine geeignete Ampulle gefüllt.
Da eine so erhaltene Formulierung sicher und weniger toxisch ist, kann sie an einen Menschen oder einen Säuger (z.B. Maus, Ratte, Meerschweinchen, Kaninchen ebenso wie Schaf, Schwein, Rind, Katze, Hund, Affen und dgl.) verabreicht werden.
Ein erfindungsgemäßes Peptid oder eine DNA, die es codiert, kann allgemein an einen Erwachsenen (der 60 kg wiegt) oral verabreicht werden, als Peptid in einer Dosis im Bereich von etwa 0,1 bis 100 mg, bevorzugt etwa 1,0 bis 50 mg, bevorzugter etwa 1,0 bis 20 mg, obwohl die Dosis abhängig von den Bedingungen variieren kann. Wenn ein solches Peptid parenteral gegeben wird (z.B. über eine intravenöse Injektion) ist die einzelne tägliche Dosis als Lösung zur Injektion für einen Erwachsenen (der 60 kg wiegt) etwa 0,01 bis 30 mg, bevorzugt etwa 0,1 bis 20 mg, bevorzugter etwa 0,1 bis 10 mg, obwohl die Dosis abhängig von dem Patienten, dem sie verabreicht wird, dem zu behandelnden Organ, den Bedingungen und der Verabreichungsart variieren kann.
Auch in anderen Arten kann eine entsprechende Dosis erhalten werden, indem die Dosis pro 60 kg Körpergewicht, wie oben beschrieben, in eine Dosis bezogen auf das Körpergewicht des jeweiligen Tiers umgewandelt wird.
Erfindungsgemäß ist ein Galaninrezeptor ein G-Protein-gekuppeltes Rezeptorprotein, das aus verschiedenen Geweben (z.B. Hypophyse, Pankreas, Gehirn, Niere, Leber, Gonaden, Schilddrüse, Gallenblase, Knochenmark, Nebenniere, Haut, Muskel, Lunge, Verdauungstrakt, Blutgefäß, Herz und dgl.) und Zellen eines Menschen oder Warmblüters (z.B. eines warmblütigen Säugers (z.B. Kaninchen, Schaf und Ziegen, Ratte, Maus, Meerschweinchen ebenso wie Rind, Pferd und Schwein), Geflügel (z.B. Huhn, Taube, Ente, Gans, Wachtel) und dgl.) stammt, und GALR1, 2 und 3 kann jedes Protein sein, solange es eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 1, 2 bzw. 3 gezeigt ist. Somit kann ein solches Rezeptorprotein ein Protein sein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3 dargestellt ist ebenso wie ein Protein mit einer Homologie von etwa 90 bis 99,9% mit einer Aminosäure sequenz, wie in SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3 dargestellt und mit einer Aktivität, deren Qualität im Wesentlichen analog ist einem Protein mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3 dargestellt.
Die von einem solchen Protein gezeigte Aktivität kann z.B. eine Ligandenbindungsaktivität, eine Signaltransmissionsaktivität und dgl. sein. Die Qualität, die im Wesentlichen analog ist, bedeutet, dass die Aktivität qualitativ analog ist. Die quantitativen Faktoren dieser Aktivität, z.B. die Potenz einer Ligandenbindungsaktivität und einer Signaltransmissionsaktivität oder das Molekulargewicht eines Rezeptorproteins können unterschiedlich sein.
Ein solches Rezeptorprotein schließt weiterhin eines ein, dessen Met am N-Ende geschützt ist (z.B. mit einer C₁-C₆-Alkanoylgruppe, wie einer Formyl- und Acetylgruppe), eines, dessen Glutaminrest am N-Ende zu einer Pyroglutaminsäure derivatisiert ist, eines, dessen Seitenkette einer Aminosäure im Molekül geschützt ist (z.B. mit einer C₁-C₆-Alkanoylgruppe, wie einer Formyl- und Acetylgruppe) oder ein Komplexprotein, wie ein Glycoprotein mit einer daran gebundenen Saccharidkette.
Ein Salz eines solchen Rezeptorproteins kann z.B. ein Salz eines oben beschriebenen Peptids sein.
Ein solches Rezeptorprotein, ein Salz oder Teilpeptid davon kann mit einem Proteinreinigungsverfahren, das an sich bekannt ist, aus Gewebe oder Zellen eines Menschen oder Warmblüters erzeugt werden oder kann mit einem Verfahren erzeugt werden ähnlich dem zur Inkubation eines Transformanten, der eine DNA aufweist, die ein Peptid, wie oben beschrieben, codiert. Eine oben beschriebene Peptidsynthese kann auch angewendet werden.
Ein Teilpeptid eines solchen Rezeptorproteins kann z.B. ein G-Protein-gekuppeltes Rezeptorproteinmolekül sein, das aus der Zellmembran ragt. Dies ist ein Peptid, das einen Anteil enthält, der als extrazellulärer Bereich (hydrophiler Teil) bei einer Hydrophobizitätsdiagrammanalyse eines G-Protein-gekuppelten Rezeptorproteins beurteilt wird. Ein Peptid, das teilweise einen hydrophoben Anteil enthält, kann in gleicher Weise angewendet werden. Während ein Peptid, das eine einzige Domäne enthält, angewendet werden kann, kann auch ein anderes Peptid, das zwei oder mehr Domänen gleichzeitig enthält, angewendet werden.
Ein Salz eines Teilpeptids eines solchen Rezeptorproteins kann z.B. ein Salz sein, wie für ein oben beschriebenes Peptid.
Eine DNA, die ein solches Galaninrezeptorprotein codiert, kann irgendein Protein sein, das eine Basensequenz aufweist, die ein Galaninrezeptorprotein codiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3. Eine Genom-DNA, eine Genom-DNA-Bibliothek, eine cDNA, die aus Gewebe oder Zellen stammt, eine cDNA-Bibliothek, die aus Gewebe oder Zellen stammt und eine synthetische DNA können weiterhin auch angewendet werden. Ein Vektor, der in einer Bibliothek verwendet wird, kann ein Bakteriophage, ein Plasmid, ein Cosmid oder ein Phagemid und dgl. sein. Eine direkte Amplifikation aus einer RNA-Fraktion, die aus Gewebe oder Zellen hergestellt wurde, kann auch mit einer an sich bekannten RT-PCR-Methode durchgeführt werden.
Eine DNA, die einen Galaninrezeptor codiert, der eine Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1, 2 und 3 aufweist, kann typischerweise eine DNA sein mit einer Basensequenz, wie in SEQ ID Nr. 4, 5 bzw. 6 gezeigt.
GALR2 (Galaninrezeptor Typ 2) ist in großen Mengen in Hippocampus, Hypothalamus, Uterus, Niere, Prostata und Skelettmuskel vorhanden und somit kann ein erfindungsgemäßes Peptid, das ein Agonist mit GALR2 aktivierender Fähigkeit ist (oder ein Antagonist gegen GALR2 oder ein neutralisierender Antikörper gegen ein erfindungsgemäßes Peptid) als die Gedächtnisfunktion verbesserndes Mittel, den Appetit anregendes Mittel, die Uterus-, Nieren-, Prostata- oder Skelettmuskelfunktion verbesserndes Mittel angewendet werden.
GALR1 (Galaninrezeptor Typ 1) ist in großen Mengen in Hypothalamus, Hippocampus und Pankreas vorhanden und somit kann ein erfindungsgemäßes Peptid, das ein Agonist mit einer GALR1 aktivierenden Fähigkeit ist (oder ein Antagonist gegen GALR1 oder ein neutralisierender Antikörper gegen ein erfindungsgemäßes Peptid) als Antifettsuchtmittel, intelligenzförderndes Mittel und insulinausscheidendes Mittel angewendet werden.
GALR3 (Galaninrezeptor Typ 3) ist in großen Mengen in Hoden, Milz, Herz, Hypothalamus und Hypophyse vorhanden und somit kann ein erfindungsgemäßes Peptid, das ein Agonist mit GALR3 aktivierender Fähigkeit ist (oder ein Antagonist gegen GALR3 oder ein neutralisierender Antikörper gegen ein erfindungsgemäßes Peptid) als Mittel zur Verbesserung der Funktion von Hoden, Milz oder Herz angewendet werden.
Die vorliegende Erfindung liefert (1) ein Verfahren zum Screenen einer Galaninrezeptor aktivierenden Substanz (Agonist) oder eines Salzes, das beinhaltet, dass der Anteil der Bindung z.B. von ³⁵S-markiertem Guanosin-5'-O-3-thiotriphosphat an eine Zellmembranfraktion bestimmt und verglichen wird, wenn eine Testsubstanz (1) in Kontakt mit und (2) nicht in Kontakt mit einer solchen Zellmembranfraktion ist, die einen Galaninrezeptor exprimiert, der erhalten wurde, indem ein Transformant (Zelle), der eine DNA aufweist, die einen solchen Galaninrezeptor codiert, inkubiert wird und (2) ein Verfahren zum Screenen einer Galaninrezeptoraktivierung hemmenden Substanz (Antagonist) oder eines Salzes davon, das beinhaltet, dass der Anteil der Bindung z.B. von ³⁵S-markiertem Guanosin-5'-O-3-thiotriphosphat an eine Zellmembranfunktion bestimmt und verglichen wird, wenn ein Galanin oder ein erfindungsgemäßes Peptid in Kontakt mit einer solchen Zellmembranfraktion ist, die einen Galaninrezeptor exprimiert, der erhalten wurde, indem ein Transformant (Zelle) inkubiert wird, der eine DNA aufweist, die einen solchen Galaninrezeptor codiert, (1) in Abwesenheit und (2) in Gegenwart einer Testsubstanz.
Ein Verfahren zum Screenen gemäß der vorliegenden Erfindung ist im Detail unten angegeben.
Während das oben beschriebene Galaninrezeptorprotein irgendein Protein sein kann, das ein Galaninrezeptorprotein von entweder GALR1, GALR2 oder GALR3 oder einem Teil davon aufweist und eine solche Rezeptorfunktion hat, ist es bevorzugt eine Zellmembranfraktion, die aus einer Zellkultur hergestellt wurde (mit einer unten beschriebenen Methode), in der ein solcher Galaninrezeptor in großen Mengen exprimiert wird unter Verwendung eines Transformanten (Zelle).
Eine Zelle, die ein Galaninrezeptorprotein aufweist, bedeutet eine Wirtszelle, die das Galaninrezeptorprotein exprimiert und eine solche Wirtszelle kann z.B. eine Hefe, eine Insektenzelle oder eine Tierzelle, wie oben beschrieben, sein, wobei eine Tierzelle bevorzugt ist.
Eine Membranfraktion bedeutet eine Fraktion, die eine große Menge an Zellmembran enthält, die mit einer an sich bekannten Methode nach Zerstörung der Zelle erhalten wurde. Eine Methode, um die Zelle zu zerstören, kann eine Methode sein, bei der die Zelle unter Verwendung eines Potter-Elvehjem-Homogenisators gepresst wird, eine Methode, bei der eine Zelle pelletisiert wird unter Verwendung eines verwirbelnden Mischers oder eines Polytrons (Kinematica), eine Ultraschallpelletisierung oder eine Pelletisierung durch Versprühen über eine feine Düse, indem mit einer French Press unter Druck gesetzt wird. Die Fraktionierung einer Zellmembran wird durch zentrifugale Fraktionierung durchgeführt, z.B. eine fraktionale Zentrifugation oder Gradientenzentrifugation.
Ein Zellpellet wird z.B. bei geringer Geschwindigkeit (500 U/min bis 3.000 U/min) über einen kurzen Zeitraum (gewöhnlich etwa 1 Minute bis 10 Minuten) zentrifugiert und der Überstand wird mit höherer Geschwindigkeit (1.500 U/min bis 30.000 U/min) gewöhnlich 30 Minuten bis 2 Stunden lang zentrifugiert, um eine Ausfällung als Membranfraktion zu erhalten. Diese Membranfraktion besteht hauptsächlich aus Membranprotein und dem Zellmembranbestandteil Phospholipid und enthält exprimierten Galaninrezeptor zusammen mit einem G-Protein, das natürlicherweise von der Zelle exprimiert wird.
Die Menge an Galaninrezeptor in der Zelle, die einen solchen Galaninrezeptor aufweist, oder in einer Membranfraktion ist bevorzugt 1 bis 100 pmol, bevorzugter 5 bis 20 pmol pro 1 mg Membranfraktionsprotein. Eine höhere Expression eines solchen Galaninrezeptors führt zu einer höheren Rezeptor aktivierenden Aktivität pro Membranfraktion (Ligandenbindungsaktivität, spezifische Aktivität), wodurch ein empfindlicheres Screeningsystem aufgebaut werden kann und ein Test einer großen Menge einer Probe unter Verwendung nur einer identischen Charge ermöglicht wird.
Bei einer Methode zum Screenen auf eine Verbindung, die einen Galaninrezeptor aktiviert (Agonist) wird eine Membranfraktion einer Zelle, die einen Galaninrezeptor aufweist, zuerst in einer Pufferlösung suspendiert, die für ein Screening geeignet ist, wodurch ein Rezeptorreferenzstandard erzeugt wird. Eine solche Pufferlösung kann z.B. Phosphatpuffer oder Tris-HCl-Puffer sein, der etwa 1 bis 5 mM Magnesiumion bei einem pH-Wert von etwa 4 bis etwa 10 (bevorzugt etwa 6 bis etwa 8) enthält, gegebenenfalls ergänzt durch Guanosindiphosphat mit etwa 0,1 nM bis 100 μM, bevorzugt etwa 0,1 bis 1 μM. Um den Abbau eines Rezeptors oder einer Testsubstanz durch eine Protease zu unterdrücken, kann ein Proteaseinhibitor, wie PMSF, Leupeptin, E-64 (PEPTIDE KENKYUSHO) und Pepstatin zugegeben werden. Zu etwa 0,01 bis 10 ml Rezeptorlösung wird eine bestimmte Menge (5.000 cpm bis 50.000 cpm) ³⁵S-markiertes Guanosin-5'-O-3-thiotriphosphat und eine Testsubstanz zugegeben. Ein testsubstanzfreies Reaktionssystem (Kontrolle), das nur ³⁵S-markiertes Guanosin-5'-O-3-thiotriphosphat enthält, wird auch bereitgestellt. Die Reaktion wird bei etwa 0 bis 50°C, bevorzugt etwa 4 bis 37°C etwa 20 Minuten bis 24 Stunden lang, bevorzugt etwa 30 Minuten bis 3 Stunden lang durchgeführt. Nach der Reaktion wird die Mischung durch ein Glasfaserfilter oder etwas Äquivalentes filtriert, das mit einem geeigneten Volumen der gleichen Pufferlösung gewaschen wurde, und dann die Radioaktivität des ³⁵S-markierten Guanosin-5'-O-3-thiotriphosphats, die auf dem Glasfaserfilter zurückbleibt, mit einem Flüssigszintillationszähler gezählt. Eine Verbindung, die einen erheblichen Anstieg von der Radioaktivität ohne eine Testsubstanz zu der Radioaktivität in Gegenwart der Testsubstanz liefert, kann als Kandidat für eine Verbindung ausgewählt werden, die einen Galaninrezeptor aktivieren kann.
Um eine Verbindung zu screenen, die die Aktivierung eines Galaninrezeptors hemmt (Antagonist) wird eine Zellmembranfraktion bereitgestellt ähnlich wie bei dem Screening für den oben beschriebenen Agonisten und dann mit einer bestimmten Menge (5.000 cpm bis 50.000 cpm) von ³⁵S-markiertem Guanosin-5'-O-3-thiotriphosphat, einem Galanin oder einem erfinderischen Peptid mit 10^–4 bis 10^–6 M und einer Testsubstanz vereinigt. Ein testsubstanzfreies Reaktionssystem (Kontrolle), das nur ³⁵S-markiertes Guanosin-5'-O-3-thiotriphosphat und das Galanin oder das erfinderische Peptid enthält, wird auch bereitgestellt. Die Reaktion wird wie oben beschrieben durchgeführt und eine Verbindung, die eine erhebliche Abnahme der Radioaktivität ohne eine Testsubstanz im Vergleich zur Radioaktivität in Gegenwart der Testsubstanz ergibt, kann als Kandidat für eine Verbindung ausgewählt werden, die die Aktivierung eines Galaninrezeptors hemmen kann.
Eine solche Testsubstanz kann z.B. ein Peptid, ein Protein, eine Nichtpeptidverbindung, eine synthetische Verbindung, ein Fermentationsprodukt, ein Zellextrakt, ein pflanzlicher Extrakt oder ein Tiergewebeextrakt und dgl. sein, was eine neue Substanz oder eine an sich bekannte Substanz sein kann.
Da ein Galaninrezeptoragonist eine ähnliche Aktivität hat, wie die physiologische Aktivität, die ein erfinderisches Peptid gegenüber dem Galaninrezeptor besitzt, ist sie nützlich als sicheres und weniger toxisches pharmazeutisches Mittel wie das erfinderische Peptid.
Da ein Galaninrezeptorantagonist im Gegensatz dazu die physiologische Aktivität hemmen kann, die ein erfinderisches Peptid gegenüber dem Galaninrezeptorprotein besitzt, ist es nützlich als sicheres und weniger toxisches pharmazeutisches Mittel, das eine solche Rezeptoraktivität unterdrückt.
Ein Salz einer durch eine oben beschriebene Screeningmethode erhaltenen Substanz kann z.B. ein pharmazeutisch annehmbares Salz sein. Ein Salz mit einer anorganischen Base, ein Salz mit einer organischen Base, ein Salz mit einer anorganischen Säure, ein Salz mit einer organischen Säure und ein Salz mit einer basischen oder sauren Aminosäure werden z.B. in Betracht gezogen.
Bevorzugte Beispiele für ein Salz mit einer anorganischen Base sind Alkalisalze, wie Natriumsalz und Kaliumsalz, Erdalkalisalze, wie Calciumsalz und Magnesiumsalz ebenso wie ein Aluminiumsalz und ein Ammoniumsalz.
Bevorzugte Beispiele für ein Salz mit einer organischen Base sind Salze mit Trimethylamin, Triethylamin, Pyridin, Picolin, 2,6-Lutidin, Ethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Cyclohexylamin, Dicyclohexylamin, N,N'-Dibenzylethylendiamin und dgl.
Bevorzugte Beispiele für ein Salz mit einer anorganischen Säure sind Salze mit Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und dgl.
Bevorzugte Beispiele für ein Salz mit einer organischen Säure sind Salze mit Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Fumarsäure, Oxasäure, Weinsäure, Maleinsäure, Citronensäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Benzoesäure und dgl.
Bevorzugte Beispiele für ein Salz mit einer basischen Aminosäure sind Salze mit Arginin, Lysin, Ornithin und dgl. und solche mit einer sauren Aminosäure sind Salze mit Asparaginsäure, Glutaminsäure und dgl.
Wenn eine mit einer erfindungsgemäßen Screeningmethode erhaltene Substanz oder ein Salz davon als pharmazeutisches Mittel verwendet wird, kann sie auf gleiche Weise als pharmazeutisches Mittel verwendet werden, wie für ein oben beschriebenes erfinderisches Peptid beschrieben.
Ein Antikörper oder ein Antiserum für ein erfindungsgemäßes Peptid (z.B. polyklonaler Antikörper, monoklonaler Antikörper) kann erzeugt werden unter Verwendung des erfindungsgemäßen Peptids als Antigen gemäß einer an sich bekannten Herstellungsmethode für Antikörper oder Antiseren.
Ein polyklonaler Antikörper kann z.B. gemäß dem unten beschriebenen Verfahren erzeugt werden.
[Herstellung von polyklonalen Antikörpern]
Ein polyklonaler Antikörper für ein erfindungsgemäßes Peptid kann in an sich bekannter Weise oder mit einer äquivalenten Methode erzeugt werden. Z.B. wird ein Komplex eines Immunantigens (Antigen, z.B. Peptid) mit einem Trägerprotein gebildet und verwendet, um einen Warmblüter (z.B. warmblütiges Säugetier (z.B. Kaninchen, Schaf und Ziege, Ratte, Maus, Meerschweinchen ebenso wie Rind, Pferd und Schwein), Geflügel (z.B. Huhn, Taube, Ente, Gans, Wachtel) und dgl.) auf gleiche Weise zu immunisieren, wie bei der Herstellung von monoklonalen Antikörpern, wie unten beschrieben, und eine Substanz, die einen Antikörper für ein erfinderisches Peptid enthält, wird aus einem immunisierten Tier isoliert und dann gereinigt und isoliert, wodurch der Antikörper erhalten wird.
Im Hinblick auf einen Komplex eines Immunantigens und eines Trägerproteins, die zur Immunisierung eines Säugetiers verwendet werden, sind die Art des Trägerproteins und das Mischverhältnis von Träger und Hapten (erfinderisches Peptid oder Teilpeptid davon) nicht besonders beschränkt und alle Substanzen können in irgendeinem Verhältnis vernetzt werden, solange der Antikörper effizient auf Basis des durch Vernetzen mit dem Träger immunisierenden Haptens erzeugt werden kann, aber gewöhnlich wird ein Trägerprotein, wie Rinderserumalbumin, Rinderseroglobulin, Keyhole-Limpet-Hämocyanin und dgl. in einer Menge von etwa 0,1 bis 20, bevorzugt etwa 1 bis 5 Teilen pro Gewichtsteil Hapten gekuppelt.
Während verschiedene Kondensationsmittel bei der Kupplung eines Haptens mit einem Träger angewandt werden können, sind solche, die gewöhnlich angewendet werden, Glutaraldehyd, Carbodiimid, mit Maleimid aktivierter Ester, ein aktiviertes Esterreagenz, das eine Thiolgruppe oder Dithiopyridylgruppe aufweist.
Ein Kondensationsprodukt wird an ein warmblütiges Tier, wie oben beschrieben, so, wie es ist oder mit einem Verdünnungsmittel oder einem Träger an der Stelle verabreicht, die Antikörper erzeugen kann. Um die Antikörper erzeugende Fähigkeit zu verstärken, kann auch komplettes Freund's Adjuvans oder inkomplettes Freund's Adjuvans verabreicht werden. Die Verabreichung wird gewöhnlich einmal pro etwa 2 bis 6 Wochen und insgesamt etwa drei- bis zehnmal durchgeführt.
Ein polyklonaler Antikörper kann aus Blut oder Ascites, bevorzugt Blut, eines Säugetiers, das wie oben beschrieben immunisiert wurde, isoliert werden.
Der Antikörpertiter für ein erfindungsgemäßes Peptid in einem Antiserum kann auf gleiche Weise gemessen werden wie bei der Messung eines Antikörpertiters eines Hybridomakulturüberstands, wie unten beschrieben. Ein Antikörper kann, wenn er mit einer Methode zur Isolierung und Reinigung eines Immunglobulins gereinigt wurde, ähnlich der Methode zur Isolierung und Reinigung eines monoklonalen Antikörpers, wie unten beschrieben, isoliert werden.
Ein monoklonaler Antikörper kann mit einem unten beschriebenen Verfahren erzeugt werden.
[Herstellung eines monoklonalen Antikörpers]
(a) Herstellung einer monoklonale Antikörper erzeugenden Zelle
Ein erfindungsgemäßes Peptid wird einem warmblütigen Tier (z.B. warmblütigen Säugetier (z.B. Kaninchen, Schaf und Ziege, Ratte, Maus, Meerschweinchen ebenso wie Rind, Pferd und Schwein), Geflügel (z.B. Huhn, Taube, Ente, Gans, Wachtel) und dgl.) so wie sie ist, oder mit einem Verdünnungsmittel oder einem Trä ger an der Stelle, die einen Antikörper nach Verabreichung erzeugen kann, verabreicht. Um die Antikörper erzeugende Fähigkeit zu verstärken, kann auch komplettes Freund's Adjuvans oder inkomplettes Freund's Adjuvans verabreicht werden. Die Verabreichung wird gewöhnlich einmal pro etwa 2 bis 6 Wochen und insgesamt etwa zwei- bis zehnmal durchgeführt.
Bei der Erzeugung einer monoklonale Antikörper erzeugenden Zelle werden warmblütige Tiere, z.B. Mäuse, die mit einem Antigen immunisiert wurden, gescreent auf einzelne Tiere, die einen Antikörpertiter zeigen, die 2 bis 5 Tage nach der letzten Immunisierung getötet werden, um Milz oder Lymphknoten zu erhalten, eine Antikörper erzeugende Zelle, die darin enthalten ist, wird mit einer Myelomzelle fusioniert, wodurch ein monoklonale Antikörper erzeugendes Hybridom erhalten wird. Der Antikörpertiter eines Antiserums kann z.B. bestimmt werden, indem ein Peptid oder ein Teil davon, das wie oben beschrieben markiert ist, mit einem Antiserum umgesetzt wird und anschließend die Aktivität der an den Antikörper gebundenen Markierung gemessen wird. Die Fusion kann mit einer bekannten Methode erreicht werden, wie der Methode von KELLER und MILLSTEIN (Nature, 256, 495 (1975)). Ein Fusionspromotor kann z.B. Polyethylenglycol (PEG) oder Sendai-Virus sein, wobei PEG bevorzugt ist.
Eine Myelomazelle kann z.B. NS-1, P3U1, SP2/0, AP-1 und dgl. sein, wobei P3U1 bevorzugt angewendet wird. Das bevorzugte Verhältnis der Zellzahlen von Antikörper erzeugenden Zellen (Milzzelle) zu Myelomzellen, das angewendet wird, kann 1:1 bis 20:1 sein und ein PEG (bevorzugt PEG1000 bis PEG6000) wird in einer Konzentration von etwa 10 bis 80% zugegeben und die Inkubation wird bei 20 bis 40°C, bevorzugt 30 bis 37°C etwa 1 bis 10 Minuten lang durchgeführt, wodurch eine effiziente Zellfusion erreicht wird.
Obwohl verschiedene Methoden zum Screenen auf Hybridoma, die einen Antikörper für ein erfindungsgemäßes Peptid erzeugen, angewendet werden können, sind Methoden, die beispielhaft angeführt werden können, eine Methode, bei der ein Hybridomakulturüberstand einer Festphase (z.B. einer Mikroplatte) zugegeben wird, auf der erfinderisches Peptidantigen direkt oder mit einem Träger adsorbiert wurde und dann ein Antiimmunglobulin-Antikörper (Antimausimmunglobulin-Antikörper, wenn eine Mauszelle fusioniert wird) oder Protein A, das mit einer radioaktiven Substanz oder einem Enzym markiert ist, zugegeben wird, wodurch ein monoklonaler Antikörper für das erfinderische Peptid nachgewiesen wird, das an die Festphase gebunden ist, und eine Methode, bei der ein Hybridomakulturüberstand zu einer Festphase zugegeben wird, auf der ein Antiimmunglobulin-Antikörper oder Protein A adsorbiert ist und ein erfindungsgemäßes Peptid, das mit einer radioaktiven Substanz oder einem Enzym markiert ist, zugegeben wird, wodurch ein monoklonaler Antikörper für das erfinderische Peptid nachgewiesen wird, der an die Festphase gebunden ist.
Ein monoklonaler Antikörper für ein erfindungsgemäßes Peptid kann mit einer an sich bekannten Methode oder einer äquivalenten Methode gescreent werden. Ein mit HAT (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin) ergänztes Kulturmedium wird gewöhnlich für eine Tierzelle angewendet. Ein Medium zum Screenen und Brüten kann irgendein Medium sein, solange das Hybridoma gezüchtet werden kann. Z.B. kann 1 bis 20%, bevorzugt 10 bis 20% mit fötalem Rinderserum ergänztes RPMI-1640-Medium, ein mit 1 bis 10% fötalem Rinderserum ergänztes GIT-Medium (WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) oder serumfreies Medium für eine Hybridomakultur (SFM101, NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.) angewendet werden. Die Inkubationstemperatur kann gewöhnlich 20 bis 40°C, bevorzugt etwa 37°C sein. Die Inkubationszeit ist gewöhnlich 5 Tage bis 3 Wochen, bevorzugt 1 Woche bis 2 Wochen. Die Inkubation wird gewöhnlich in Gegenwart von 5% CO₂-Gas durchgeführt. Der Antikörpertiter eines Hybridomakulturüberstands kann auf gleiche Weise bestimmt werden wie bei der Bestimmung des Antikörperliters für ein erfinderisches Peptid in einem Antiserum, wie oben beschrieben.
(b) Reinigung von monoklonalen Antikörpern
Ein monoklonaler Antikörper für ein erfinderisches Peptid kann in gereinigter Form isoliert werden gemäß einer Methode zum Isolieren und Reinigen eines Immunglobulins ähnlich der üblichen Isolierung und Reinigung von polyklonalen Antikörpern (z.B. Aussalzen, Alkoholsedimentation, isoelektrische Ausfällung, Elektrophorese, Ionenaustausch-(z.B. DEAE)-Adsorption/Desorption, Ultrazentrifugation, Gelfiltration, eine spezifische Reinigung, bei der ein Antikörper ausschließlich unter Verwendung von antigengebundener Festphase oder einem aktiven Adsorbens, wie Protein A oder G gesammelt wird und dann die Bindung gespalten wird, um den Antikörper zu liefern).
Da jeder Antikörper für ein erfindungsgemäßes Peptid, der gemäß den Methoden (a) und (b), wie oben beschrieben, hergestellt wurde, das jeweilige erfindungsgemäße Peptid spezifisch erkennen kann, kann er verwendet werden, um das Peptid der Erfindung in einer Probenlösung quantitativ zu bestimmen, insbesondere mithilfe eines Sandwich-Immunoassays. Somit liefert die vorliegende Erfindung z.B.:

(i) eine Methode, um ein Peptid der Erfindung in einer Probenlösung quantitativ zu bestimmen, in der ein Antikörper, der mit dem erfinderischen Peptid reaktiv ist, mit der Probenlösung und einem markierten Peptid der Erfindung kompetitiv umgesetzt wird und dann die Rate an markiertem erfinderischem Peptid, die an den Antikörper gebunden ist, bestimmt wird und
(ii) eine Methode, um ein Peptid der Erfindung in einer Probenlösung quantitativ zu bestimmen, bei der die Probenlösung mit einem Antikörper, der an einem Träger immobilisiert ist und einem markierten Antikörper gleichzeitig oder kontinuierlich umgesetzt wird, wobei der eine Antikörper ein Antikörper ist, der das N-Ende des erfindungsgemäßen Peptids erkennt und der andere Antikörper ein Antikörper ist, der mit einer anderen Stelle als dem N-Ende des Peptids der Erfindung reaktiv ist (z.B. dem C-Ende).

Ein monoklonaler Antikörper, der ein erfindungsgemäßes Peptid erkennt, wird nicht nur in einem Assay für das erfindungsgemäße Peptid verwendet, sondern auch bei einem Nachweis auf Basis einer Gewebefärbung. Für solche Zwecke kann ein Antikörpermolekül selbst angewendet werden, oder eine F(ab')₂-, Fab'- oder Fab-Fraktion des Antikörpermoleküls kann angewendet werden. Ein Test unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Antikörpers ist nicht speziell ausgeführt und kann irgendein Test sein, solange er die Menge an Antikörper, Antigen oder Antikörper-Antigen-Komplex bestimmt, die der Menge an Antigen (z.B. dem Gehalt an Ligandenpeptid) in einer Probenlösung entspricht und dann der Anteil auf Basis der Kalibrierungskurve, die unter Verwendung von Standardlösungen mit bekannten Mengen an Antigen erhalten wurde, berechnet wird. Während die bevorzugt angewendeten Methoden z.B. eine Nephrometrie, ein kompetitiver Assay, ein immunometrischer Assay und ein Sandwich-Assay sein können, ist ein besonders bevorzugter Test ein Sandwich-Assay, wie unten beschrieben, wegen der Empfindlichkeit und Spezifität.
Eine bei dem Test unter Verwendung einer markierten Substanz angewendete Markierung kann z.B. ein Radioisotop, ein Enzym, eine fluoreszierende Substanz und eine lumineszierende Substanz sein. Ein Radioisotop kann z.B. [¹²⁵I], [¹³¹I], [³H], [¹⁴C] und dgl. sein; ein Enzym kann bevorzugt ein stabiles Enzym mit einer hohen spezifischen Aktivität sein, wie β-Galactosidase, β-Glucosidase, alkalische Phosphatase, Peroxidase, Malatdehydrogenase und dgl.; eine fluoreszierende Substanz kann z.B. Fluorescamin und Fluorescenisothiocyanat und dgl. sein und eine lumineszierende Substanz kann z.B. Luminol, ein Luminolderivat, Luciferin, Lucigenin und dgl. sein. Ein Biotin-Abidin-System kann angewendet werden, um einen Antikörper oder ein Antigen an eine Markierung zu binden.
Eine Unlöslichmachung eines Antigens oder eines Antikörpers kann durchgeführt werden unter Verwendung einer physikalischen Adsorption oder unter Verwendung einer chemischen Bindung, die gewöhnlich zur Immobilisierung eines Proteins oder eines Enzyms angewendet wird. Ein Träger kann z.B. ein unlösliches Saccharid, wie Agarose, Dextran und Cellulose, ein synthetisches Harz, wie Polystyrol, Polyacrylamid und Silicon ebenso wie ein Glas sein.
Bei einem Sandwich-Assay wird ein unlöslich gemachter oder immobilisierter Antikörper gegen ein erfinderisches Peptid mit einer Probenlösung umgesetzt (primäre Reaktion) und dann mit einem markierten Antikörper für das erfinderische Peptid (sekundäre Reaktion) und anschließend wird die Aktivität der Markierung an einem unlöslich gemachten Träger bestimmt, um das erfinderische Peptid in der Probenlösung quantitativ zu bestimmen. Die primäre Reaktion und die sekundäre Reaktion können in umgekehrter Reihenfolge, gleichzeitig oder in bestimmten Zeitintervallen durchgeführt werden.
Eine Markierung und eine Unlöslichmachung können gemäß den oben beschriebenen Methoden durchgeführt werden. Bei einem Immunoassay wie einem Sandwich-Assay ist ein als Antikörper für eine Festphase angewendeter Antikörper oder ein zur Markierung angewendeter Antikörper nicht notwendigerweise von einer Art und zwei oder mehr Antikörper können in Mischung verwendet werden, um eine höhere Empfindlichkeit des Tests zu erreichen.
Bei einem Test für das erfinderische Peptid unter Anwendung eines Sandwich-Assays der Erfindung kann ein Antikörper gegen das erfinderische Peptid, der in der primären und sekundären Reaktion angewendet wird, bevorzugt Bindungsstellen für das erfinderische Peptid haben, die voneinander verschieden sind. So können die in der primären und sekundären Reaktion angewendeten Antikörper so ausgewählt werden, dass dann, wenn der Antikörper, der in der zweiten Reaktion angewendet wird, das C-Ende des erfinderischen Peptids erkennt, der Antikörper, der in der primären Reaktion angewendet wird, bevorzugt ein Antikörper ist, der eine andere Stelle als das C-Ende erkennt, z.B. das N-Ende.
Ein Antikörper für bzw. gegen das erfindungsgemäße Peptid kann in einem anderen Testsystem, als einem Sandwich-Assay, verwendet werden, z.B. einem kompetitiven Assay, einem immunometrischen Assay und in der Nephrometrie. Bei einem kompetitiven Assay werden ein Antigen in einer Probenlösung und ein markiertes Antigen kompetitiv oder konkurrierend mit einem Antikörper umgesetzt und dann werden nicht umgesetztes markiertes Antigen (F) und Antikörper bindendes Antigen (B) getrennt (B/F-Trennung) und die Markierung entweder in B oder F quantitativ ausgewertet, wodurch das Antigen in der Probenlösung quantitativ ausgewertet wird. Bei dieser Reaktion wird ein löslicher Antikörper als Antikörper angewendet und die B/F-Trennung wird mit einer Flüssigphasenmethode unter Verwendung eines zweiten Antikörpers für Polyethylenglycol und den oben beschriebenen Antikörper durchgeführt und mit einer Festphasenmethode unter Verwendung eines unlöslich gemachten Antikörpers als erstem Antikörper oder unter Verwendung eines löslichen Antikörpers als erstem Antikörper und eines unlöslich gemachten Antikörpers als zweitem Antikörper.
In einem immunometrischen Assay werden ein Antigen in einer Probenlösung und ein unlöslich gemachtes Antigen kompetitiv mit einer bestimmten Menge eines markierten Antikörpers umgesetzt und dann feste Phase und flüssige Phase getrennt oder in einem alternativen Verfahren ein Antigen in einer Probenlösung und ein Überschuss eines markierten Antikörpers umgesetzt und dann unlöslich gemachtes Antigen zugegeben, damit nicht umgesetzter markierter Antikörper an die Festphase binden kann und anschließend werden feste Phase und flüssige Phase getrennt. Danach wird die Markierung in beiden Phasen quantitativ ausgewertet, wodurch das Antigen in der Probenlösung quantitativ bestimmt wird.
Bei der Nephrometrie wird die Menge eines unlöslichen Sediments, das als Ergebnis einer Antigen-Antikörper-Reaktion in einem Gel oder einer Lösung gebildet wird, bestimmt. Sogar wenn eine Probenlösung nur eine Spurenmenge eines Antigens enthält und das entstehende Sediment gering ist, kann Laser-Nephrometrie unter Verwendung einer Laserlicht-Streuvorrichtung bevorzugt angewendet werden.
Wenn eine der oben beschriebenen immunologischen Techniken für einen erfinderischen Assay angewendet wird, sind keine speziellen Bedingungen und Arbeitsschritte spezifisch angegeben. Übliche Bedingungen und Arbeitsschritte für jede Technik, wie sie von einem Fachmann auf diesem Gebiet in technischer Hinsicht in Betracht gezogen werden, können annehmbar sein, um ein Testsystem für ein erfinderisches Peptid oder einen Teil davon zu entwickeln. Solche üblichen Techniken werden in verschiedenen Literaturstellen beschrieben [z.B. H. Irie, Herausgeber, "Radioimmunoassay", KODANSHA, veröffentlicht 1974, H. Irie, Herausgeber, "Radioimmunoassay 2", KODANSHA, veröffentlicht 1979, E. Ishikawa et al., Herausgeber, "Enzyme immunoassay", IGA-KUSHOIN, veröffentlicht 1978, E. Ishikawa et al., Herausgeber, "Enzyme immunoassay" (2. Auflage), IGA-KUSHOIN, veröffentlicht 1982, E. Ishikawa et al., Herausgeber, "Enzyme immunoassay" (3. Auflage), IGA-KUSHOIN, veröffentlicht 1987, "Methods in ENZYMOLOGY", Bd. 70, Immunochemical Techniques (Teil A), Bd. 73, Immunochemical Techniques (Teil B), Bd. 74, Immunochemical Techniques (Teil C), Bd. 84, Immunochemical Techniques (Teil D: Selected immunoassays), Bd. 92, Immunochemical Techniques (Teil E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods), Bd. 121, Immunochemical Techniques (Teil I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies), Academic Press etc.].
Wie oben beschrieben, kann unter Verwendung eines Antikörpers für ein Peptid der vorliegenden Erfindung das Peptid der Erfindung empfindlich quantitativ bestimmt werden.
Zusätzlich kann durch Bestimmung der Konzentration eines erfindungsgemäßen Peptids unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Antikörpers die Verwendung als diagnostisches Mittel erfolgen.
(1) Wenn eine Veränderung der Konzentration eines erfindungsgemäßen Proteins oder eines Äquivalents davon festgestellt wird, kann eine Diagnose oder ein Hinweis auf ein zukünftiges Risiko für Fettsucht, Demenz, Diabetes oder einen Hypophysentumor erfolgen.
Ein erfindungsgemäßer Antikörper kann auch zum Nachweis eines in einer Probe vorhandenen erfinderischen Proteins verwendet werden, z.B. einer Körperflüssigkeit oder einem Gewebe. Er kann auch verwendet werden, um eine Antikörpersäule zur Reinigung eines erfinderischen Proteins zu erzeugen, um erfinderisches Protein in jeder Fraktion während der Reinigung nachzuweisen oder um das Verhalten eines erfinderischen Proteins in einer Testzelle zu analysieren.
In der Beschreibung und den beigefügten Figuren wird eine Base oder eine Aminosäure, wenn sie abgekürzt wird, auf Basis der Nomenklatur der IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature bezeichnet oder wie es im Stand der Technik üblich ist, wie unten beispielhaft ausgeführt. Ein optisches Isomer einer Aminosäure, falls vorhanden, ist in L-Form, wenn nicht anders angegeben.

DNA:: Desoxyribonucleinsäure
cDNA:: Komplementäre Desoxyribonucleinsäure
A:: Adenin
T:: Thymin
G:: Guanin
C:: Cytosin
Y:: Thymin oder Cytosin
N:: Thymin, Cytosin, Adenin oder Guanin
R:: Adenin oder Guanin
M:: Cytosin oder Adenin
W:: Thymin oder Adenin
S:: Cytosin oder Guanin
I:: Inosin
H:: Adenin, Thymin oder Cytosin
D:: Guanin, Adenin oder Thymin
B:: Guanin, Thymin oder Cytosin
RNA:: Ribonucleinsäure
mRNA:: Messenger-Ribonucleinsäure
dATP:: Desoxyadenosintriphosphat
dTTP:: Desoxythymidintriphosphat
dGTP:: Desoxyguanosintriphosphat
dCTP:: Desoxycytidintriphosphat
ATP:: Adenosintriphosphat
EDTA:: Ethylendiamintetraessigsäure
SDS:: Natriumdodecylsulfat
EIA:: Enzymimmunoassay
Gly oder G:: Glycin
Ala oder A:: Alanin
Val oder V:: Valin
Leu oder L:: Leucin
Ile oder I:: Isoleucin
Ser oder S:: Serin
Thr oder T:: Threonin
Cys oder C:: Cystein
Met oder M:: Methionin
Glu oder E:: Glutaminsäure
Asp oder D:: Asparaginsäure
Lys oder K:: Lysin
Arg oder R:: Arginin
His oder H:: Histidin
Phe oder F:: Phenylalanin
Tyr oder Y:: Tyrosin
Trp oder W:: Tryptophan
Pro oder P:: Prolin
Asn oder N:: Aspargin
Gln oder Q:: Glutamin
pGlu:: Pyroglutaminsäure
Me:: Methylgruppe
Et:: Ethylgruppe
Bu:: Butylgruppe
Ph:: Phenylgruppe
TC:: Thiazolidin-4(R)-carboxyamidgruppe

Substituenten, Schutzgruppen und Reagenzien, die in der Beschreibung angewendet werden, sind wie folgt bezeichnet:

Tos:: p-Toluolsulfonyl
HONB:: N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboxyimid
Bzl:: Benzyl
Cl₂-Bzl:: Dichlorbenzyl
Z:: Benzyloxycarbonyl
Br-Z:: 2-Brombenzyloxycarbonyl
Cl-Z:: 2-Chlorbenzyloxycarbonyl
Boc:: t-Butyloxycarbonyl
HOBt:: 1-Hydroxybenzotriazol
DCC:: N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
TFA:: Trifluoressigsäure
Fmoc:: N-9-Fluorenylmethoxycarbonyl
DNP:: Dinitrophenyl
Bum:: t-Butoxymethyl
Trt:: Trityl
PAM:: Phenylacetoamidomethyl
BHA:: Benzohydrylamin
Bom:: Benzyloxymethyl
OcHex:: Cyclohexylester
MeBzl:: 4-Methylbenzyl
CHO:: Formyl
NMP:: N-Methylpyrrolidon

Die SEQ ID Nummern in dem Sequenzprotokoll in der Beschreibung zeigen die folgenden Sequenzen.
[SEQ ID Nr. 1]
Diese zeigt die gesamte Aminosäuresequenz von Ratten-GALR1 (Galaninrezeptor Typ 1).
[SEQ ID Nr. 2]
Diese zeigt die gesamte Aminosäuresequenz von Ratten-GALR2 (Galaninrezeptor Typ 2).
[SEQ ID Nr. 3]
Diese zeigt die gesamte Aminosäuresequenz von Ratten-GALR3 (Galaninrezeptor Typ 3).
[SEQ ID Nr. 4]
Diese zeigt die Basensequenz einer cDNA von Ratten-GALR1 (Galaninrezeptor Typ 1).
[SEQ ID Nr. 5]
Diese zeigt die Basensequenz einer cDNA von Ratten-GALR2 (Galaninrezeptor Typ 2).
[SEQ ID Nr. 6]
Diese zeigt die Basensequenz einer cDNA von Ratten-GALR3 (Galaninrezeptor Typ 3).
[SEQ ID Nr. 7]
Diese zeigt die gesamte Aminosäuresequenz von Schweinegalanin (29 Reste).
[SEQ ID Nr. 8]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz von Schweinegalaninvorläufer Präprogalanin (1 bis 123).
[SEQ ID Nr. 9]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz von Schweinegalaninvorläufer Präprogalanin (24 bis 61).
[SEQ ID Nr. 10]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz von Schweinegalaninvorläufer Präprogalanin (37 bis 61).
[SEQ ID Nr. 11]
Diese zeigt die Teilaminosäuresequenz (34 Reste vom N-Ende) eines Schweinepeptids der Erfindung.
[SEQ ID Nr. 12]
Diese zeigt die Teilaminosäuresequenz (32 Reste vom N-Ende) eines Schweinepeptids der Erfindung.
[SEQ ID Nr. 13]
Diese zeigt die Teilaminosäuresequenz (9 Reste vom N-Ende) eines Chymotrypsinverdaufragments (CHY-1) eines Schweinepeptids der Erfindung.
[SEQ ID Nr. 14]
Diese zeigt die Teilaminosäuresequenz (6 Reste) eines Chymotrypsinverdaufragments (CHY-4) eines Schweinepeptids der Erfindung.
[SEQ ID Nr. 15]
Diese zeigt die Teilaminosäuresequenz (27 Reste) eines Chymotrypsinverdaufragments (CHY-3) eines Schweinepeptids der Erfindung.
[SEQ ID Nr. 16]
Diese zeigt die Teilaminosäuresequenz (11 Reste) eines Chymotrypsinverdaufragments (CHY-2) eines Schweinepeptids der Erfindung.
[SEQ ID Nr. 17]
Diese zeigt die Teilaminosäuresequenz (44 Reste) eines Schweinepeptids der Erfindung.
[SEQ ID Nr. 18]
Diese zeigt eine synthetische DNA (Primer 1), die für das Screenen einer Basensequenz für cDNA, die Ratten-GALR2 codiert, angewendet wird.
[SEQ ID Nr. 19]
Diese zeigt eine synthetische DNA (Primer 2), die für das Screening einer Basensequenz einer cDNA, die Ratten-GALR2 codiert, angewendet wird.
[SEQ ID Nr. 20]
Diese zeigt eine synthetische DNA (Primer pGAL4-7F), die bei einer degenerierten PCR angewendet wird.
[SEQ ID Nr. 21]
Diese zeigt eine synthetische DNA (Primer pGAL9-3F), die bei einer degenerierten PCR angewendet wird.
[SEQ ID Nr. 22]
Diese zeigt eine synthetische DNA (Primer pGAL34-1R), die bei einer degenerierten PCR angewendet wird.
[SEQ ID Nr. 23]
Diese zeigt die Basensequenz eines geschachtelten PCR-Produkts in pCR100-6.
[SEQ ID Nr. 24]
Diese zeigt die Basensequenz eines ineinander gesetzten oder geschachtelten PCR-Produkts in pCR100-7.
[SEQ ID Nr. 25]
Diese zeigt eine synthetische DNA (Primer pGAL9-3F), die zur Herstellung einer Hybridisierungssonde angewendet wird.
[SEQ ID Nr. 26]
Diese zeigt eine synthetische DNA (Primer pGAL34-8R), die zur Herstellung einer Hybridisierungssonde angewendet wird.
[SEQ ID Nr. 27]
Diese zeigt die Basensequenz einer cDNA in pGR2PL6, die in Beispiel 5 erhalten wurde.
[SEQ ID Nr. 28]
Diese zeigt die Basensequenz einer cDNA in pGR2PL3, die in Beispiel 5 erhalten wurde.
[SEQ ID Nr. 29]
Diese zeigt die Sequenz eines Vorläufers eines erfinderischen Peptids, die von der Basensequenz einer cDNA in pGR2PL6 abgeleitet wurde.
[SEQ ID Nr. 30]
Diese zeigt die Sequenz eines Vorläufers eines erfindungsgemäßen Peptids, die auf der Basensequenz einer cDNA in pGR2PL3 beruht.
[SEQ ID Nr. 31]
Diese zeigt die Sequenz eines reifen Proteins (Schwein) eines erfindungsgemäßen Peptids auf Basis der Basensequenz von cDNAs in pGR2PL6 und pGR2PL3.
[SEQ ID Nr. 32]
Diese zeigt eine cDNA-Sequenz (Schwein), die ein reifes Protein eines erfindungsgemäßen Peptids codiert.
[SEQ ID Nr. 33]
Diese zeigt eine Sequenz eines reifen Proteins (Ratte) eines erfinderischen Peptids.
[SEQ ID Nr. 34]
Diese zeigt eine Sequenz eines reifen Proteins (Mensch) eines erfinderischen Peptids.
[SEQ ID Nr. 35]
Diese zeigt die Teilaminosäuresequenz (9 Reste vom N-Ende) eines reifen Proteins (Ratten und Menschen gemeinsam) eines erfinderischen Peptids.
[SEQ ID Nr. 36]
Diese zeigt die Teilaminosäuresequenz (21 Reste vom N-Ende) eines reifen Proteins (Ratten und Menschen gemeinsam) eines erfinderischen Peptids.
[SEQ ID Nr. 37]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz eines Vorläuferproteins eines reifen Proteins (Ratte) eines erfinderischen Peptids.
[SEQ ID Nr. 38]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz eines Vorläuferproteins eines reifen Proteins (Mensch) eines erfinderischen Peptids.
[SEQ ID Nr. 39]
Diese zeigt die cDNA-Sequenz, die ein reifes Protein (Ratte) eines erfinderischen Peptids codiert.
[SEQ ID Nr. 40]
Diese zeigt die cDNA-Sequenz, die ein reifes Protein (Mensch) eines erfinderischen Peptids codiert.
[SEQ ID Nr. 41]
Diese zeigt die cDNA-Sequenz, die ein Vorläuferprotein eines reifen Proteins (Ratte) eines erfinderischen Peptids codiert.
[SEQ ID Nr. 42]
Diese zeigt die cDNA-Sequenz, die ein Vorläuferprotein eines reifen Proteins (Mensch) eines erfinderischen Peptids codiert.
[SEQ ID Nr. 43]
Dies zeigt die Teilaminosäuresequenz (30 Reste vom N-Ende) eines reifen Proteins (Schwein) eines erfinderischen Peptids.
[SEQ ID Nr. 44]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz eines Peptids als Immunogen, das in Beispiel 9 angewendet wird.
[SEQ ID Nr. 45]
Diese zeigt die DNA-Sequenz eines EcoRI/BgIII-Verdaufragments von Plasmid pGR2PL6, das in Beispiel 18 angewendet wird.
[SEQ ID Nr. 46)
Diese zeigt die DNA-Sequenz des Primers pGAL1-1F, der in Beispiel 18 angewendet wird.
[SEQ ID Nr. 47]
Diese zeigt die DNA-Sequenz des Primers pGAL88-1R, der in Beispiel 18 angewendet wird.
[SEQ ID Nr. 48]
Diese zeigt die DNA-Sequenz des Primers F/R120, der in Beispiel 19 angewendet wird.
[SEQ ID Nr. 49]
Diese zeigt die DNA-Sequenz des Primers R/R120, der in Beispiel 19 angewendet wird.
[SEQ ID Nr. 50]
Diese zeigt die DNA-Sequenz, die als Ergebnis einer PCR in Beispiel 19 erhalten wurde.
[SEQ ID Nr. 51]
Diese zeigt die DNA-Sequenz des Primers 1F/H120, der in Beispiel 19 angewendet wird.
[SEQ ID Nr. 52]
Diese zeigt die DNA-Sequenz des Primers 1R/H120, der in Beispiel 19 angewendet wird.
[SEQ ID Nr. 53]
Diese zeigt die DNA-Sequenz des Primers 1F/H470, der in Beispiel 19 angewendet wird.
[SEQ ID Nr. 54]
Diese zeigt die DNA-Sequenz des Primers 1R/H470, der in Beispiel 19 angewendet wird.
[SEQ ID Nr. 55]
Diese zeigt die DNA-Sequenz des Primers 1, der in Beispiel 20 angewendet wird.
[SEQ ID Nr. 56]
Diese zeigt die cDNA-Sequenz des Primers 2, der in Beispiel 20 angewendet wird.
[SEQ ID Nr. 57]
Diese zeigt die DNA-Sequenz des Primers 3, der in Beispiel 20 angewendet wird.
[SEQ ID Nr. 58]
Diese zeigt die DNA-Sequenz des Primers 4, der in Beispiel 20 angewendet wird.
[SEQ ID Nr. 59]
Diese zeigt die synthetische DNA-Sequenz, die in Beispiel 21 angewendet wird.
[SEQ ID Nr. 60]
Diese zeigt die synthetische DNA-Sequenz, die in Beispiel 21 angewendet wird.
[SEQ ID Nr. 61]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz von Rattengalanin (Rattengalanin ist in SEQ ID Nr. 61 dargestellt, dessen C-Ende amidiert ist).
Ein Transformant Escherichia coli TOP10/p GR2PL6, der in Beispiel 5, wie unten beschrieben, erhalten wurde, wurde beim Institute for Fermentation, Osaka (IFO) am 21. August 1998 unter der Hinterlegungsnummer IFO 16201 und beim National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of the Ministry of International Trade and Industry (NIBH, 1-1-3, Higashi, Tsukuba-City, Ibaragi Pref. Japan) am 4. September 1998 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6486 hinterlegt.
Ein Transformant Escherichia coli TOP10/p GR2HL14, der in Beispiel 19, wie unten beschrieben, erhalten wurde, wurde beim Institute for Fermentation, Osaka (IFO) am 5. Februar 1999 unter der Hinterlegungsnummer IFO 16256 und beim National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of the Ministry of International Trade and Industry (NIBH, 1-1-3, Higashi, Tsukuba-City, Ibaragi Pref. Japan) am 22. Februar 1999 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6657 hinterlegt.
Ein Transformant Escherichia coli TOP10/p GR2RL4, der in Beispiel 18, wie unten beschrieben, erhalten wurde, wurde beim Institute for Fermentation, Osaka (IFO) am 5. Februar 1999 unter der Hinterlegungsnummer IFO 16257 und beim National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of the Ministry of International Trade and Industry (NIBH, 1-1-3, Higashi, Tsukuba-City, Ibaragi Pref. Japan) am 22. Februar 1999 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6658 hinterlegt.
Ein Transformant Escherichia coli MM294(DE3)/pTFCGAL, der in Beispiel 21, wie unten beschrieben, erhalten wurde, wurde beim Institute for Fermentation, Osaka (IFO) am 26. Februar 1999 unter der Hinterlegungsnummer IFO 16260 und beim National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of the Ministry of International Trade and Industry (NIBH, 1-1-3, Higashi, Tsukuba-City, Ibaragi Pref. Japan) am 10. März 1999 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6678 hinterlegt.
Ein Transformant Escherichia coli MM294(DE3)/pTB960-11, der in Beispiel 21, wie unten beschrieben, erhalten wurde, wurde beim Institute for Fermentation, Osaka (IFO) am 25. Juni 1997 unter der Hinterlegungsnummer IFO 16100 und beim National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of the Ministry of International Trade and Industry (NIBH, 1-1-3, Higashi, Tsukuba-City, Ibaragi Pref. Japan) am 15. Juni 1998 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6388 hinterlegt.
Ein Transformant Escherichia coli MM294(DE3)/pTCIId23-MPIF1, der in Beispiel 21, wie unten beschrieben, angewendet wurde, wurde beim Institute for Fermentation, Osaka (IFO) am 27. Oktober 1998 unter der Hinterlegungsnummer IFO 16212 und beim National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of the Ministry of International Trade and Industry (NIBH, 1-1-3, Higashi, Tsukuba-City, Ibaragi Pref. Japan) am 23. November 1998 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6582 hinterlegt.
GR2-1N, der in Beispiel 13, wie unten beschrieben, angewendet wurde, wurde beim Institute for Fermentation, Osaka (IFO) am 11. März 1999 unter der Hinterlegungsnummer IFO 50515 und beim National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of the Ministry of Internati onal Trade and Industry (NIBH, 1-1-3, Higashi, Tsukuba-City, Ibaragi Pref. Japan) am 17. März 1999 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6682 hinterlegt.
Die vorliegende Erfindung wird genauer in den folgenden Beispielen beschrieben, die die Erfindung nicht beschränken sollen.
Beispiel 1
Nachweis der Galaninrezeptor (GALR1 GALR2) aktivierenden Wirkung
(1-1) Konstruktion einer Rattengalaninrezeptor (GALR1 GALR2) exprimierenden Zelle
Um ein Ratten-GALR2-Gen zu erhalten, wurden 2 μl Rattenhypothalamus-cDNA (CLONTECH), jeweils 1 μl 10 μM Primer 1 (5'-GTCGACATGAATGGCTCCGGCTGCCGGCAGCCAG-3', SEQ ID Nr.18) und Primer 2 (5'– ACTAGTTTAACAAGCCGGATCCAGGGTTCTAC-3', SEQ ID Nr. 19), 5 μl einer 10-fach konzentrierten Pufferlösung (der Klen Taq Polymerase beigefügt, CLONTECH), 1 μl 10 mM Desoxynucleotidmischung (Invitrogen), 1 μl Klen Taq DNA-Polymerase (CLONTECH) und 39 μl destilliertes Wasser zur Injektion (OTSUKA PHARMACEUTICAL) vermischt, um eine PCR-Lösung herzustellen. Eine PCR wurde durchgeführt unter Verwendung eines Gene Amp PCR-Systems 9700 (PERKIN ELMER) und beinhaltete [1] einen Zyklus 5 Minuten bei 95°C, [2] 3 Zyklen 30 Sekunden bei 95°C gefolgt von 15 Sekunden bei 76°C gefolgt von 2 Minuten bei 72°C, [3] 3 Zyklen 30 Sekunden bei 95°C gefolgt von 15 Sekunden bei 72°C gefolgt von 2 Minuten bei 72°C, [4] 3 Zyklen mit 30 Sekunden bei 95°C gefolgt von 15 Sekunden bei 68°C gefolgt von 2 Minuten bei 72°C, [5] 3 Zyklen mit 30 Sekunden bei 95°C gefolgt von 15 Sekunden bei 64°C gefolgt von 2 Minuten bei 72°C, [6] 3 Zyklen mit 30 Sekunden bei 95°C gefolgt von 15 Sekunden bei 60°C gefolgt von 2 Minuten bei 72°C und [7] 20 Zyklen mit 30 Sekunden bei 95°C gefolgt von 15 Sekunden bei 56°C gefolgt von 2 Minuten bei 72°C. 10 μl der Lösung nach dieser PCR wurden einer Elektrophorese auf einem 1% niedrig schmelzenden Agarosegel (Sea Plaque GTG:FTN) unterzogen und die PCR-Produkte wurden durch Anfärbung mir Ethidiumbromid identifiziert. Eine DNA-Bande bei etwa 1,2 kbp, die als PCR-Produkt erhalten wurde, wurde aus dem Agarosegel mit bekannter Methode gewonnen. Es wurde somit ein Agarosegelstück in ein 0,5-ml-Probenröhrchen überführt und durch Erwärmen auf 70°C geschmolzen und dann bei 40°C equilibriert und dann mit 0,5 μl β-Agarase (NIPPON GENE) vereinigt, um 60 Minuten lang eine Reaktion zu bewirken, wobei die Agarose abgebaut wurde. Das gewünschte DNA-Fragment wurde aus der Reaktionsmischung mit einer bekannten Ethanolausfällungsmethode gewonnen und mit einem PCR-SCRIPT-(STRATAGENE)-Plasmidvektor ligiert. Die Reaktionsmischung wurde Competent High (JM109:TOYOBO) zugegeben, um eine Transformation zu bewirken und dann über Nacht in einem mit 100 μg/ml Ampicillin angereicherten LD-Agarmedium (WAKO PURE CHEMICAL) inkubiert. Die auf dem Medium gebildeten Kolonien wurden auf Gegenwart der Insertion des vorgesehenen DNA-Fragments mithilfe einer Kolonie-PCR-Methode untersucht. Eine Kolonie mit einem insertierten DNA-Fragment wurde über Nacht in mit 100 μg/ml Ampicillin ergänztem LD-Medium (WAKO PURE CHEMICAL) inkubiert und dann wurde aus der Kultur ein Plasmid mit einem insertierten DNA-Fragment gewonnen unter Verwendung eines Plasmid Mini Kit (QIAGEN). Eine Reaktion zur Basensequenzierung wurde durchgeführt unter Verwendung von Dye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction (ABI) und es wurde festgestellt auf Basis der Basense quenzierung unter Verwendung eines fluoreszierenden Sequenzautomaten, dass das insertierte DNA-Fragment in dem Plasmid eine DNA war, die GALR2 codierte mit 1119 bp.
Die in Beispiel 4 in JP-A-7-304797 beschriebene Methode wurde angewendet, um einen Expressionsvektor pAKKO-1.11 für eine Tierzelle herzustellen. Mit einer bekannten Methode wurde ein GALR2 codierendes DNA-Fragment aus diesem Plasmid gewonnen, in einen Vektor pAKKO-1.11 ligiert, in E. Coli DH5α transduziert, wobei ein Transformant erhalten wurde. Dieser Transformant wurde inkubiert, um ein Plasmid, das eine DNA enthielt, die GALR2 codierte, zu erzeugen.
Dieses Plasmid wurde in eine CHO-Zelle transduziert gemäß dem unten beschriebenen Verfahren unter Verwendung eines CellPhect Transfection Kit (Pharmacia), um die vorgesehene GALR2 exprimierende Zelle zu erhalten. Es wurden somit 9,6 mg Plasmid-DNA, gelöst in 240 μl destilliertem Wasser, mit 240 μl Puffer A (dem CellPhect Transfection Kit beigefügt) vereinigt, gerührt, 10 Minuten stehen gelassen, mit 480 μl Puffer B (dem CellPhect Transfection Kit beigefügt) vereinigt, heftig gerührt, um ein Liposom zu bilden, das DNA enthielt. 4 × 10⁵ Zellen von CHO/dhfr^– (erhalten von ATCC) wurden in eine Petrischale geimpft, in mit 10% fötalem Kälberserum (BIO WHITTAKER) ergänztem Ham's F-12-Medium (NISSUI SEIYAKU) bei 37°C unter 5% CO₂ 2 Tage lang inkubiert und dann wurden 480 μl dieser Liposomen tropfenweise zu der Zelle auf der Petrischale zugegeben. Die Zelle wurde bei 37°C unter 5% CO₂ 6 Stunden lang inkubiert und dann zweimal mir serumfreiem Ham's F-12-Medium gewaschen und dann 3 ml 15% Glycerin auf die Zelle auf der Petrischale zugegeben, die somit 2 Minuten behandelt wurde. Nach weiterem zweimaligem Waschen mit serumfreiem Ham's F12-Medium wurde die Zelle in mit 10% fötalem Kälberserum angereichertem Ham's F12-Medium bei 37°C unter 5% CO₂ 15 Stunden lang inkubiert. Die Zellen wurden durch Trypsinbehandlung verteilt und aus der Petrischale gewonnen und 1,25 × 10⁴ Zellen wurden auf eine 6-Napf-Platte geimpft, die einer Inkubation in mit dialysiertem 10% fötalem Kälberserum (JRH BIOSCIENCES) ergänztem Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (NISSUI SEIYAKU) bei 37°C unter 5% CO₂ unterzogen wurde. Da eine mit Plasmid transduzierte transformierte CHO-Zelle in diesem Medium gewachsen war, aber eine nicht transduzierte Zelle nach und nach ausgelöscht wurde, wurde das Kulturmedium am ersten und zweiten Tag der Inkubation ersetzt, um tote Zellen zu entfernen. 8 Tage nach Beginn der Inkubation wurden 20 Kolonien gewachsener transformierter CHO-Zellen (20 Arten von CHO-Zellklonen) selektiert. Jede ausgewählte Zelle (20 Arten der CHO-Zellklone) wurde gewonnen und in eine Zellfraktion formuliert mit der in dem unten beschriebenen Beispiel (1-2) verwendeten Methode. Der Anteil der Bindung von Schweine·¹²⁵I-Galanin (New England Nuclear) an die Membranfraktion wurde mit einer bekannten Methode bestimmt (z.B. der Methode, die in einem Beispiel von EP-0711830A beschrieben ist) und ein Stamm, der GALR2 in hohem Anteil exprimierte, wurde ausgewählt und den nachfolgenden Versuchen unterzogen.
Eine GALR1 codierende cDNA wurde auf gleiche Weise erhalten, wie sie angewendet wurde, um die GALR2 codierende cDNA zu erhalten, wie oben beschrieben. Unter Verwendung der Primer 3 und 4 zusammen mit einer Gehirn-cDNA-Bibliothek (CLONTECH) wurde eine PCR durchgeführt, um Ratten-GALR1-cDNA mit 1486 by zu erhalten, die in pUC119 (TAKARA SHUZO) insertiert wurde, was dann als Plasmid pRGR2 bezeichnet wurde.
Dieses Plasmid wurde doppelt mit EcoRI und PstI verdaut, um ein cDNA-Fragment zu erhalten, das in einen Expressionsplasmidvektor für eine Tierzelle integriert wurde, nämlich pcDNAI (Invitrogen), an der Stelle, die mit EcoRI und NsiI doppelt verdaut worden war, was dann als Plasmid pRGRPC bezeichnet wurde. Dieses Plasmid pRGRPC wurde mit Hind III und Xba I doppelt verdaut, um ein cDNA-Fragment zu erhalten, das in einen Expressionsplasmidvektor für eine Tierzelle integriert wurde, nämlich pRC/CMV (Invitrogen), der mit Hind III und Xba I doppelt verdaut worden war, wobei ein Ratten-GALR1 cDNA exprimierendes Plasmid pRGR 1 erhalten wurde.
Die bekannte Calciumphosphatmethode unter Verwendung von CellPhect Transfection Kit (Pharmacia) wurde angewendet, um das Ratten-GALR1 cDNA exprimierende Plasmid pRGR 1 in eine CHO-KI-Zelle (erhalten von ATCC) zu transduzieren, die in Ham's F12-Medium (NISSUI SEIYAKU) inkubiert worden war und schließlich wurden 24 Klone, die gegen G-418 bei 500 μg/ml resistent waren, isoliert unter Verwendung eines Zylinders aus rostfreiem Stahl. Ein Teil der Zellen der 24 Klone, die so isoliert worden waren, wurden in eine 6-Napf-Platte geimpft und inkubiert, bis sie zusammenfließend waren und dann auf die Bindung an 100 pM Schweine·¹²⁵I-Galanin (New England Nuclear) (z.B. mit der in einem Beispiel von EP-0711830A) beschriebenen Methode) untersucht, um das Ausmaß der Expression eines Rattengalaninrezeptors bei 24 Klonen zu untersuchen. Als Ergebnis zeigte Zelle Nr. 3 die höchste Schweine·¹²⁵I-Galanin bindende Aktivität, was auf den höchsten GALR1-Expressionsgrad hindeutet. Somit wurde eine Grenzverdünnungsmethode angewendet, um zwei Näpfe einer 96-Napf-Mikroplatte mit einer einzelnen Zelle zu beimpfen, deren Vermehrung bewirkt wurde. Aus vereinzelten Zellen wurden 12 Klonzellen isoliert und ein Teil davon wurde wiederum dem gleichen Bindungstest unterzogen. Als Ergebnis wurden die Klonzellen Nr. 3 bis 10 ausgewählt, um als GALR1-exprimierende Zellen verwendet zu werden, da davon ausgegangen wurde, dass sie die höchste ¹²⁵I-Schweinegalanin bindende Aktivität hatte und den höchsten GALR1-Expressionsgrad aufwies.
(1-2) Herstellung von Galaninrezeptor (GALR1 GALR2) exprimierender Zellmembranfraktion
Eine GALR2 exprimierende Zelle, die in Abschnitt (1-1), wie oben beschrieben, erhalten worden war, wurde in einem Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium, das 10% fötales Kälberserum, Glutamin, Penicillin und Streptomycin enthielt, inkubiert, bis sie gerade noch nicht zusammenfließend war (80 bis 90% zusammenfließend). Nach der Inkubation wurde die Zelle mit Phosphatpuffer, der 2,7 mM Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EDTA) [2,7 mM EDTA/Phosphatpuffer Kochsalzlösung (138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na₂HPO₄, 1 mM KH₂PO₄) enthielt, vereinigt und darin suspendiert, um aus dem Inkubator freigesetzt zu werden und dann durch Zentrifugation gewonnen. Die Zelle wurde in einem Puffer aus 10 mM Natriumhydrogencarbonat und 5 mM EDTA (pH 7,3), der eine Proteaseinhibitormischung enthielt (Endkonzentration 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 20 μg/ml Leupeptin, 4 μg/ml E-64, 10 μg/ml Pepstatin) unter Verwendung eines POLYTRON HOMOGENIZERs homogenisiert. Das Homogenisat wurde mit 2.500 U/min 10 Minuten lang unter Verwendung einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge (CR26H, Rotor Modell RR24A: HITACHI) zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten, der dann mit 30.000 U/min 1 Stunde lang ultrazentrifugiert wurde (SCP70H, Rotor Modell RR42: HITACHI), um ein Pellet zu erhalten. Dieses Pellet wurde wiederum in einem Puffer aus 10 mM Natriumhydrogencarbonat und 5 mM EDTA (pH 7,3), der eine Proteaseinhibitormischung (0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 20 μg/ml Leupeptin, 4 μg/ml E-64, 10 μg/ml Pepstatin) enthielt, suspendiert und als Membranfraktion zum Nachweis einer Galaninrezeptor aktivierenden Wirkung verwendet (bei –70°C aufbewahrt).
(1-3) Nachweis einer Galaninrezeptor aktivierenden Wirkung durch [³⁵S]GTPγS-Bindungstest
Die in Abschnitt (1-2), wie oben beschrieben, hergestellte Membranfraktion wurde mit 40 μg/ml (für GALR1-Membranfraktion) oder 32 μg/ml (für GALR2-Membranfraktion) in einem 50 mM Tris-Puffer (pH 7,4), der 1 μM Guanosin-5'-diphosphat (GDP), 0,1% Rinderserumalbumin (BSA), 5 mM MgCl₂ und 150 mM NaCl enthielt, suspendiert und mit jeweils 0,2 ml in kleine Polypropylenröhrchen (Falcon 2053) gefüllt. Die so abgefüllte Membranfraktion wurde mit 2 μl 50 nM [³⁵S]GTPγS (New England Nuclear) und 2 μl Schweinegalanin als Agonist (mit 100 μM, 10 μM, 1 μM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM oder 10 pM) vereinigt und dann wurde die Mischung 60 Minuten lang bei 25°C umgesetzt. Diese Reaktionsmischung wurde mit 1,5 ml eines 50 mM Tris-Puffer (pH 7,4), der 0,05% 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propansulfonsäure (CHAPS), 0,1% BSA, 5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA enthielt, vereinigt und durch ein GF/F-Glasfaserfilter (Whatman) filtriert. Dieser Filter wurde mit 1,5 ml des gleichen Puffers gewaschen, getrocknet und dann auf seine Radioaktivität untersucht unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers.
Dies liefert einen galaninkonzentrationsabhängigen Anstieg des [³⁵S]GTPγS-Bindungsgrads (1), was zeigt, dass diese Methode die Galaninrezeptoragonistaktivität nachweisen kann.
Der EC50-Pegel von Rattengalanin (Konzentration, die die Hälfte des maximalen Bindungspegels liefert) war etwa 3 nM für GALR1 und etwa 10 nM für GALR2.
Beispiel 2
Screening auf GALR2-(Galaninrezeptor Typ 2) aktivierende Verbindungen
(2-1) Herstellung von Schweinehypothalamusextrakt
Innerhalb von 3 Stunden nach Erwerb von Schweinehypothalami von TOKYO SHIBAURA ZOKI wurde das folgende Verfahren vervollständigt, um einen Extrakt zu erhalten.
Zuerst wurden 35 Schweinehypothalami (etwa 500 g) mit einem Messer in kleine Stücke geschnitten, die dann in ein 3000-ml-Becherglas, das 1250 ml siedendes destilliertes Wasser enthielt, gegeben wurden und 10 Minuten lang gesiedet wurden. Das Hypothalamuspräparat wurde nach dem Sieden auf einem Wasserbad gekühlt und anschließend auf einem Eisbad, während es immer noch in dem Becherglas enthalten war, wobei auf etwa 4°C gekühlt wurde. Dieses Hypothalamuspräparat wurde mit dem destillierten Wasser, das für das Sieden angewendet worden war, vereinigt und dann 10 Minuten lang unter Verwendung eines POLYTRON HOMOGENISATORS homogenisiert. Das so erhaltene Homogenisat wurde tropfenweise mit 90 ml Essigsäure auf eine Endkonzentration von 1 M versetzt und dann 1 Stunde lang gerührt. Das Homogenisat wurde mit 10.000 U/min 30 Minuten lang unter Verwendung einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge (CR26H, Rotor Modell RR10A, HITACHI) zentrifugiert, um einen Überstand (1) zu erhalten. Andererseits wurde das nach der Zentrifugation erhaltene Pellet wiederum mit 2.000 ml 1 M Essigsäure vereinigt und dann 10 Minuten lang unter Verwendung eines POLYTRON HOMOGENISATORS homogenisiert. Dieses Homogenisat wurde über Nacht (etwa 16 Stunden lang) unter Verwendung einer Rührflosse über Nacht gerührt und dann 10 Minuten lang unter Verwendung eines POLYTRON HOMOGENISATORS homogenisiert, um einen Überstand (2) zu erhalten. Die Überstände (1) und (2) wurden vermischt und mit 2 Volumina Aceton vereinigt, 1 Stunde lang bei 4°C gerührt, dann mit 10.000 U/min 15 Minuten lang zentrifugiert unter Verwendung einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge (CR26H, Rotor Modell RR10A, HITACHI), um einen Überstand zu erhalten. Der so erhaltene Überstand wurde einer Rotationsverdampfung unterzogen, um Aceton zu entfernen und schließlich auf ein Volumen von 4.000 ml eingeengt. Dieses Konzentrat wurde mit 35.000 U/min 1 Stunde lang unter Verwendung einer Ultrazentrifuge (SCP70H, Rotor Hitachi Modell RPZ35T, HITACHI) zentrifugiert, um einen klaren Überstand zu erhalten. Jeweils 1.000 ml des so erhaltenen Überstands wurden mit 500 ml Diethylether vereinigt und heftig in einem Trenntrichter gemischt und dann in zwei Phasen auftrennen gelassen, wobei eine wässrige Phase erhalten wurde. Diese wässrige Phase wurde an einem Rotationsverdampfer auf ein Volumen von 1.000 ml eingeengt, was den Endextrakt lieferte.
(2-2) Reinigung von Schweinehypothalamusextrakt durch Octadodecyl-Reverse-Chromatographie
Ein octadodecyliertes Silicagel ODS-AM 120-S50 (YMC) wurde mit Methanol aufgequollen und dann in eine Glassäule mit einem Durchmesser von 5 cm auf ein Volumen von 130 ml gepackt, das dann mit 1 M Essigsäure equilibriert wurde. Auf diese Säule wurde der in Stufe (2-1) hergestellte Extrakt (entsprechend 500 g Hypothalami) mit einer Durchflussrate von 400 ml/h geladen. Anschließend wurde die Säule mit etwa 500 ml 1 M Essigsäure und anschließend etwa 500 ml 20% Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure mit einer Durchflussrate von 400 ml/h eluiert, wobei das Gel gewaschen wurde. Schließlich wurde diese Säule mit etwa 500 ml 50% Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure bei einer Durchflussrate von 400 ml/h eluiert, wobei die vorgesehene rohe Peptidkomponente eluierte. Der so erhaltene Extrakt wurde an einem Rotationsverdampfer eingeengt und dann in einem Gefriertrockner (12EL, VirTis) lyophilisiert.
(2-3) Reinigung von Schweinehypothalamusextrakt mit TSKgel ODS80TM Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographie
Eine TSKgel ODS80TM Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographiesäule (TOSOH, 22,5 mm × 30 cm) wurde mit Lösungsmittel A (0,1% Trifluoressigsäure/destilliertes Wasser) in einer Durchflussrate von 8 ml/min zur Equilibrierung eluiert. Ein in Stufe (2-2) wie oben beschrieben erhaltenes lyophilisiertes Material wurde in 40 ml 1 M Essigsäure gelöst und vier 10-ml-Aliquots wurden der Chromatographie unterzogen. Es wurden somit 10 ml einer Lösung des lyophilisierten Materials in Essigsäure auf die Säule geladen, die dann mit 8 ml/min 60 Minuten lang mit einem linearen Gradienten von 80 Vol.-% Lösungsmittel A (0,1% Trifluoressigsäure/destilliertes Wasser)/20 Vol.-% Lösungsmittel B (0,1% Trifluoressigsäure/100% Acetonitril) bis 40 Vol.-% Lösungsmittel A (0,1% Trifluoressigsäure/destilliertes Wasser)/60 Vol.-% Lösungsmittel B (0,1% Trifluoressigsäure/100% Acetonitril) eluiert wurde.
Das Effluens wurde in 8-ml-Aliquots gesammelt, die jeweils mit einer Fraktionsnummer bezeichnet wurden, die in 1-ml-Aliquots dispensiert wurden und zur Trockene eingeengt wurden unter Verwendung einer Vakuumkonzentrierungsvorrichtung (Savant). Das so erhaltene getrocknete Material wurde in 0,03 ml Dimethylsulfoxid gelöst und als Testprobe zur Bestimmung von GALR1 und GALR2 aktivierenden Wirkungen verwendet.
(2-4) Isolierung und Reinigung von GALR2 (Galaninrezeptor Typ 2) aktivierenden Verbindungen mit [³⁵S]GTPγS-Bindungstest
Eine Testprobe, die in der oben beschriebenen Stufe (2-3) erhalten wurde, wurde auf ihre Galaninrezeptor aktivierende Wirkung mit dem [³⁵S]GTPγS-Bindungstest untersucht unter Verwendung der in der oben beschriebenen Stufe (1-3) erhaltenen GALR1- oder GALR2-Membranfraktion.
Die Fraktionen Nr. 36 bis 39 und Nr. 42 bis 43 zeigten eine [³⁵S]GTPγS-bindungsfördernde Wirkung im [³⁵S]GTPγS-Bindungstest unter Verwendung einer GALR1 exprimierenden Zellmembranfraktion, während die Fraktionen 36 bis 39, Nr. 42 bis 43 und Nr. 46 bis 49 eine [³⁵S]GTPγS-bindungsfördernde Wirkung in dem [³⁵S]GTPγS-Bindungstest unter Verwendung einer GALR2 exprimierenden Zellmembranfraktion zeigten [ 2].
Wenn eine Testprobe 100-fach mit Dimethylsulfoxid verdünnt wurde und 3 ml der verdünnten Probe mit einem Schweinegalaninradioimmunoassaykit (Peninsula) analysiert wurden, zeigten die Ergebnisse eine Galaninimmunaktivität in den Fraktionen Nr. 36 bis 38 [3].
Basierend auf den oben beschriebenen Ergebnissen wurde die Komponente mit GALR1 und GALR2 aktivierenden Wirkungen in den Fraktionen Nr. 36 bis 39 als Schweinegalanin beurteilt. Andererseits wurde die Komponente mit der GALR2 aktivierenden Wirkung in den Fraktionen Nr. 46 bis 49 als eine von Schweinegalanin verschiedene Verbindung betrachtet.
(2-5) Bestimmung des Molekulargewichts der GALR2 (Galaninrezeptor Typ 2) aktivierenden Verbindung
Mithilfe einer bekannten Gelfiltrations-Hochleistungsflüssigchromatographie wurde das Molekulargewicht der GALR2 aktivierenden Komponente (Fraktionen Nr. 46 bis 49), die in der oben beschriebenen Stufe (2-4) erhalten worden war, bestimmt.
0,02 ml einer Probenmischung der Fraktionen 46 bis 49 wurden mit 0,08 ml 0,1% Trifluoressigsäure/destilliertem Wasser verdünnt und ein 0,05-ml-Aliquot wurde auf eine G2000SWXL-(TOSOH)-Säule geladen, die mit 0,1% Trifluoressigsäure/10% Acetonitril mit 0,5 ml/min eluiert wurde und das Effluens wurde in Aliquots von 0,25 ml gesammelt (in Intervallen von 0,5 Minuten). Die so erhaltenen Fraktionen wurden zur Trockene eingeengt (SpeedVac Plus SC210A; Savant) und direkt in einer Suspension der Membranfraktion gelöst, die dann mit 2 μl 50 nM [³⁵S]GTPγS (New England Nuclear) ergänzt wurde und auf den [³⁵S]GTPγS-Bindungsgrad danach mit der in Stufe (1-3) beschriebenen Methode untersucht wurde.
Als Ergebnis wurde die Komponente mit einer GALR2 aktivierenden Wirkung ([³⁵S]GTPγS-bindungsfördernden Wirkung) in Fraktion Nr. 35 eluiert (Retentionszeit: 17 bis 17,5 Minuten) [4]. Ein Vergleich und eine Untersuchung unter Verwendung bekannter Peptide, die unter den gleichen Bedingungen analysiert wurden (Aderenomedulin, Magensäure hemmendes Peptid, PACAP38, Neuropeptid Y, β-Endorphin, Galanin, SRIF28 (Somatostatin 28), Rinderserumalbumin, Trypsininhibitor Lysozym) [5] zeigte, dass das Molekulargewicht der Komponente mit der GALR2 aktivierenden Wirkung in den Fraktionen Nr. 46 bis 49 etwa 5.000 bis etwa 7.000 war.
Andererseits ist das Molekulargewicht des bekannten Schweinegalanins (PEPTID KENKYUSHO) 3157,4 (Retentionszeit: 18,858 Minuten). Es wurde somit vorgeschlagen, dass die Komponente mit der GALR2 aktivierenden Wirkung in den Fraktionen Nr. 46 bis 49 eine andere Substanz als bekanntes Galanin war.
Beispiel 3
Reinigung der Verbindung mit GALR2 (Galaninrezeptor Typ 21 aktivierender Wirkung
(3-1) Herstellung von Schweinehypothalamusextrakt
Um eine große Menge Hypothalamusextrakt herzustellen, wurde die oben in Stufe (2-1) beschriebene Methode wie unten beschrieben, vereinfacht.
50 gefrorene Schweinehypothalami (TOKYO SHIBAURA ZOKI) (etwa 1 kg) wurden mit einem Messer in dünne Scheiben geschnitten, die dann in ein 5.000-ml-Becherglas, das 2.500 ml siedendes destilliertes Wasser enthielt, gegeben und 10 Minuten lang gesiedet. Das Hypothalamuspräparat wurde nach dem Sieden auf einem Wasserbad gekühlt und anschließend auf einem Eisbad, während es immer noch in dem Becherglas enthalten war, wobei auf etwa 4°C gekühlt wurde und dann wurde mit destilliertem Wasser, das für das Sieden angewendet worden war, vereinigt und dann 10 Minuten unter Verwendung eines POLYTRON HOMOGENISATORS homogenisiert. Das so erhaltene Homogenisat wurde tropfenweise mit 150 ml Essigsäure und 8 ml 6 n Salzsäure auf eine Endkonzentration von 1 M bzw. 20 mM versetzt und dann über Nacht (etwa 16 Stunden lang) unter Verwendung einer Rührflosse gerührt. Das Homogenisat wurde mit 8.000 U/min 30 Minuten lang unter Verwendung einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge (CR26H, Rotor Modell RR10A, HITACHI) zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten, der durch Gaze filtriert wurde, um jegliche Lipidbruchstücke zu entfernen. Dieses Verfahren wurde viermal wiederholt, um einen Extrakt aus etwa 4 kg Hypothalami herzustellen.
(3-2) Einengung und Rohfraktionierung von Schweinehypothalamusextrakt
(3-2-1) Reinigung mit Octadodecyl-Reverse-Phase-Chromatographie
Octadodecyliertes Silicagel (YMC, ODS-AM 120-S50) wurde in Methanol gequollen und dann in eine Glassäule mit 5 cm Durchmesser auf ein Volumen von 400 ml gepackt, die dann mit 1 M Essigsäure equilibriert wurde.
Auf diese Säule wurde die Hälfte des Extrakts (entsprechend 2 kg Hypothalami), der in Stufe (3-1) hergestellt worden war, mit einer Durchflussrate von 400 ml/h geladen. Anschließend wurde diese Säule mit etwa 1.000 ml 1 M Essigsäure und anschließend etwa 1.200 ml 20% Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure mit einer Durchflussrate von 400 ml/h eluiert, wodurch das Gel gewaschen wurde. Schließlich wurde diese Säule mit etwa 2.000 ml 60% Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure mit einer Durchflussrate von 400 ml/h eluiert, wodurch die vorgesehene rohe Peptidfraktion eluiert wurde. Der so erhaltene Extrakt wurde an einem Verdampfer eingeengt und dann mit einem Gefriertrockner (12EL, VirTis) lyophilisiert. Dieses Verfahren wurde zweimal wiederholt, um ein lyophilisiertes Pulver des Hypothalamusextrakts, der etwa 4 kg entsprach (200 Organe), herzustellen.
(3-2-2) Reinigung mit SP-Sephadex-Ionenaustauschchromatographie
SP-Sephadex C25 (Pharmacia Biotech), das mit 10 mM Salzsäure gequollen worden war, wurde in eine Glassäule mit 5 cm Durchmesser gepackt auf ein Volumen von 120 ml, das dann mit 100 mM Salzsäure gewaschen und dann mit 1 M Essigsäure equilibriert wurde. Das lyophilisierte Pulver des in Stufe (3-2-1) erhaltenen Hypothalamusextrakts wurde in etwa 800 ml 1 M Essigsäure gelöst und auf eine equilibrierte SP-Sephadex-C25-Säule mit einer Durchflussrate von 400 ml/h geladen und nach und nach mit etwa 600 ml 1 M Essigsäure, etwa 600 ml 1 M Pyridin und dann etwa 600 ml 1 M Pyridin·Essigsäure (pH 5,0) mit einer Durchflussrate von 400 ml/h eluiert und das Effluens wurde in Aliquots von 40 ml gesammelt, die in 0,2-ml-Aliquots dispensiert wurden und zur Trockene eingeengt wurden unter Verwendung einer Vakuumkonzentrationsvorrichtung (Savant). Das so erhaltene getrocknete Material wurde in 0,04 ml Dimethylsulfoxid gelöst und auf eine GALR2 aktivierende Wirkung mit der oben in Stufe (1-3) beschriebenen Methode untersucht.
Als Ergebnis wurde festgestellt, dass eine vorgesehene Komponente mit einer GALR2 aktivierenden Wirkung mit 1 M Pyridin·Essigsäure (pH 5,0) eluiert worden war. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Komponente (Verbindung) mit der GALR2 aktivierenden Wirkung eine stark basische Substanz war.
(3-2-3) Reinigung mit Sephadex-G50-Gelfiltrationschromatographie
Eine Fraktion, die mit 1 M Pyridin·Essigsäure (pH 5,0) eluierte, die in Stufe (3-2-2) wie oben beschrieben, erhalten worden war, wurde an einem Verdampfer auf 100 ml eingeengt, die bei einer Durchflussrate von 400 ml/h auf eine Sephadex G50-(Pharmacia Biotech)-Säule (6 cm Durchmesser, 3.000 ml Volumen), die mit 1 M Essigsäure equilibriert worden war, geladen wurden und dann mit 1 M Essigsäure mit einer Durchflussrate von 400 ml/h eluiert wurden und dann wurde das Effluens in Aliquots von 33 ml gesammelt, die jeweils mit einer Fraktionsnummer bezeichnet wurden, die in 0,25-ml-Aliquots dispensiert wurden und zur Trockene eingeengt wurden unter Verwendung einer Vakuumkonzentrationsvorrichtung (Savant). Das so erhaltene getrocknete Material wurde in 0,03 ml Dimethylsulfoxid gelöst und auf die GALR2 aktivierende Wirkung mit der oben in Stufe (1-3) beschriebenen Methode untersucht.
Als Ergebnis wurde festgestellt, dass eine vorgesehene Komponente mit der GALR2 aktivierenden Wirkung hauptsächlich in den Fraktionen Nr. 66 bis 80 eluiert. Eine schwache Aktivität wurde auch in den Fraktionen Nr. 55 bis 65 und Nr. 45 bis 54 festgestellt. Jede der Fraktionen Nr. 66 bis 80, Nr. 55 bis 65 und Nr. 45 bis 54 wurde gemischt und lyophilisiert.
(3-3) Reinigung der Verbindung mit GALR2 aktivierender Wirkung unter Verwendung von HPLC
(3-3-1) Reinigung mit TSKgel ODS80TM Reverse-Phase-Hochleistungsflüssgchromatographie
Eine TSKgel ODS80TM Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographiesäule (TOSOH, 22,5 mm × 30 cm) wurde mit Lösungsmittel A (0,1% Trifluoressigsäure/destilliertes Wasser) mit einer Durchflussrate von 4 ml/min bei 40°C zur Equilibrierung eluiert.
Ein lyophilisiertes Material einer Sephadex-G50-Fraktion, die wie oben in Stufe (3-2-3) beschrieben, erhalten worden war, wurde in 1 M Essigsäure gelöst und auf die Säule geladen und dann mit einer Durchflussrate von 4 ml/min 120 Minuten lang mit einem linearen Gradienten von 67 Vol.-% Lösungsmittel A (0,1% Trifluores sigsäure/destilliertes Wasser)/33% Vol.-% Lösungsmittel B (0,1% Trifluoressigsäure/60% Acetonitril) bis 100 Vol.-% Lösungsmittel B (0,1% Trifluoressigsäure/60% Acetonitril) eluiert, um das Effluens zu gewinnen.
Das Effluens wurde in Aliquots von 8 ml gesammelt, die jeweils mit einer Fraktionsnummer bezeichnet wurden. Das lyophilisierte Material der Fraktionen Nr. 66 bis 80 wurde der Chromatographie in zwei Teilen unterzogen und jede der Fraktionen 55 bis 65 und 45 bis 54 wurde einmal chromatographiert.
4 μl der Fraktion wurden direkt verwendet, um die GALR2 aktivierende Wirkung zu untersuchen mit der Methode, wie oben in Stufe (1-3) beschrieben. Als Ergebnis zeigte jede Chromatographie drei aktive Peaks. Die Retentionszeit der Komponente mit der aktivierenden Wirkung, die für Fraktion Nr. 35 bis 38 festgestellt wurde, war fast in Übereinstimmung mit der von Galanin, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die in den Fraktionen 47 bis 50 festgestellte aktivierende Komponente war fast in Übereinstimmung mit der Retentionszeit der Komponente mit der GALR2 aktivierenden Wirkung, die in Beispiel 2 beschrieben wurde (die GALR1 nicht aktivierte und nicht mit dem oben beschriebenen Schweinegalanin-Radioimmunoassaykit nachgewiesen wurde). Somit wurde festgestellt, dass die Fraktionen 47 bis 50 zur Reinigung der Komponente mit GALR2 aktivierender Wirkung verwendet wurden und diese wurden daher vereinigt und lyophilisiert.
(3-3-2) Reinigung mit TSKgel CM-2SW-Ionenaustauschhochleistungsflüssigchromatographie
Eine TSKgel CM-2SW-Ionenaustauschhochleistungsflüssigchromatographiesäule (TOSOH, 0,46 cm × 25 cm) wurde bei 20°C mit einer Durchflussrate von 1 ml/min mit Lösungsmittel A (10 mM Ammoniumformiat/40% Acetonitril) zur Equilibrierung eluiert.
Lyophilisiertes Material von einer Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographiefraktion, die in der oben beschriebenen Stufe (3-3-1) erhalten worden war, wurde in Lösungsmittel A gelöst und auf die Säule geladen und dann mit 1 ml/min 60 Minuten lang mir einem linearen Gradienten von 100 Vol.-% Lösungsmittel A (10 mM Ammoniumformiat/40% Acetonitril) bis 100 Vol.-% Lösungsmittel B (500 mM Ammoniumformiat/40% Acetonitril) eluiert, um das Effluens zu gewinnen.
Das Effluens wurde in Aliquots von 0,5 ml gesammelt, die jeweils mit einer Fraktionsnummer bezeichnet wurden. 1 μl der Fraktion wurde direkt verwendet, um die GALR2 aktivierende Wirkung mit der oben in Stufe (1-3) beschriebenen Methode zu bestimmen. Als Ergebnis wurde ein Hauptaktivitätspeak in den Fraktionen Nr. 89 bis 92 nachgewiesen. Diese Fraktionen wurden vereinigt und einer nachfolgenden Reinigung unterzogen.
(3-3-3) Reinigung mit Diphenyl-Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographie
Eine Diphenyl-Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographiesäule (Vydak219TP54, 0,46 cm × 25 cm) wurde bei 40°C mit einer Durchflussrate von 1 ml/min mit Lösungsmittel A (0,1% Trifluoressigsäure/destilliertes Wasser) zur Equilibrierung eluiert.
Die oben in Stufe (3-3-2) erhaltene Ionenaustauschhochleistungsflüssigchromatographiefraktion wurde direkt auf die Säule geladen und dann mit 1 ml/min innerhalb von 1 Minute mit 100 Vol.-% Lösungsmittel A (0,1% Trifluoressigsäure/destilliertes Wasser), das schnell zu 50 Vol.-% Lösungsmittel B (0,1% Trifluoressigsäure/60% Acetonitril) verändert wurde, und dann mit einer Durchflussrate von 1 ml/min 60 Minuten lang mit einem linearen Gradienten bis 100 Vol.-% Lösungsmittel B eluiert, um das Effluens zu gewinnen.
Das Effluens wurde in Aliquots von 1 ml gesammelt, die jeweils mit einer Fraktionsnummer bezeichnet wurden. 1 μl der Fraktion wurde direkt verwendet, um die GALR2 aktivierende Wirkung mit der oben in Stufe (1-3) beschriebenen Methode zu untersuchen. Als Ergebnis wurde ein Hauptaktivitätspeak nachgewiesen in den Fraktionen Nr. 24 bis 26. Diese Fraktionen wurden vereinigt und einer nachfolgenden Reinigung unterzogen.
(3-3-4) Reinigung mit Superphenyl-Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographie
Eine TSKgel-Superphenyl-Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographiesäule (TOSOH, 0,46 cm × 10 cm) wurde bei 40°C mit einer Durchflussrate von 1 ml/min mit Lösungsmittel A (0,1% Trifluoressigsäure/destilliertes Wasser) zur Equilibrierung eluiert.
Eine Diphenyl-Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographiefraktion, die, wie oben beschrieben, in Stufe (3-3-3) erhalten worden war, wurde direkt auf die Säule geladen und dann mit einer Durchflussrate von 1 ml/min innerhalb 1 Minute mit 100 Vol.-% Lösungsmittel A (0,1% Trifluoressigsäure/destilliertes Wasser), das schnell zu 45 Vol.-% Lösungsmittel B (0,1% Trifluoressigsäure/60% Acetonitril) verändert wurde, und dann bei einer Durchflussrate von 1 ml/min 80 Minuten lang mit einem linearen Gradienten bis 55% Lösungsmittel B eluiert, um das Effluens zu gewinnen.
Das Effluens wurde in Aliquots von 1 ml gesammelt, die jeweils mit einer Fraktionsnummer bezeichnet wurden. 1 μl der Fraktion wurde direkt verwendet, um die GALR2 aktivierende Wirkung mit der oben in Stufe (1-3) beschriebenen Methode zu untersuchen. Als Ergebnis wurde ein Hauptaktivitätspeak in den Fraktionen Nr. 44 bis 45 und 50 bis 52 nachgewiesen. Die Fraktionen Nr. 44 bis 45 wurden vereinigt und wieder unter den gleichen Bedingungen chromatographiert, um ausfließende Fraktionen als Aliquots von 0,5 ml zu erhalten. Andererseits wurde jede der Fraktionen 50, 51 und 52 wiederum einzeln unter den gleichen Bedingungen chromatographiert, um ausfließende Fraktionen als Aliquots von 0,5 ml zu erhalten.
2 μl jeder Fraktion wurden direkt verwendet, um die GALR2 aktivierende Wirkung mit der oben in Stufe (1-3) beschriebenen Methode zu untersuchen. Als Ergebnis wurde ein Aktivitätspeak in den Fraktionen Nr. 93 bis 95 nachgewiesen, die bei der zweiten Chromatographie der Fraktionen Nr. 44 bis 45 erhalten worden waren, und in den Fraktionen Nr. 105 bis 107, die bei der zweiten Chromatographie der Fraktion Nr. 50 erhalten worden waren. Die zweite Chromatographie der Fraktion Nr. 51 lieferte einen Hauptaktivitätspeak in den Fraktionen Nr. 105 bis 107 und einen schwach aktiven Peak in den Fraktionen Nr. 108 bis 109. Zusätzlich zeigte die zweite Chromatographie der Fraktion Nr. 52 einen breiten Hauptaktivitätspeak in den Fraktionen Nr. 106 bis 110.
(3-3-5) Reinigung mit Super-ODS-Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographie
(3-3-5-1) Reinigung der Haupt-GALR2 aktivierenden Komponente
(3-3-5-1-1) Chromatographie in Gegenwart von Trifluoressigsäure
Eine TSKgel Super-ODS-Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographiesäule (TOSOH, 0,46 cm × 10 cm) wurde bei 40°C mit einer Durchflussrate von 1 ml/min mit Lösungsmittel A (0,1% Trifluoressigsäure/destilliertes Wasser) zur Equilibrierung eluiert.
Eine Superphenyl-Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographiefraktion, die in der oben beschriebenen Stufe (3-3-4) erhalten worden war, wurde direkt auf die Säule geladen und dann mit einer Durchflussrate von 1 ml/min innerhalb einer Minute mit einem linearen Gradienten von 100 Vol.-% Lösungsmittel A (0,1% Trifluoressigsäure/destilliertes Wasser) bis 50 Vol.-% Lösungsmittel B (0,1% Trifluoressigsäure/60% Acetonitril) eluiert und dann mit einer Durchflussrate von 1 ml/min 84 Minuten lang mit einem linearen Gradienten bis 62,5% Lösungsmittel B, um das Effluens zu gewinnen.
Das Effluens wurde in Aliquots von jeweils 0,5 ml gesammelt, die jeweils mit einer Fraktionsnummer bezeichnet wurden. 2 μl der Fraktion wurden direkt verwendet, um die GALR2 aktivierende Wirkung mit der oben in Stufe (1-3) beschriebenen Methode zu untersuchen. Als Ergebnis wurde ein Hauptaktivitätspeak in den Fraktionen Nr. 96 und 97 nachgewiesen.
Die Fraktionen Nr. 96 bis 97 wurden vereinigt und wiederum unter den gleichen Bedingungen chromatographiert, um die Fraktionen in Aliquots von 0,5 ml zu erhalten. Während ein einzelner Peak in einem UV-Absorptionsspektrum bei 210 nm nachgewiesen wurde, hatte der Peak eine Schulter, die die Gegenwart von Verunreinigungen widerspiegelte. 2 μl jeder Fraktion wurden direkt verwendet, um die GALR2 aktivierende Wirkung mit der oben in Stufe (1-3) beschriebenen Methode zu untersuchen. Als Ergebnis wurde ein aktiver Peak in den Fraktionen Nr. 98 bis 100 nachgewiesen und entsprach dem Peak, der mit dem UV-Absorptionsspektrum bei 210 nm nachgewiesen wurde, dessen Schulter aber diesmal entfernt worden war. Um die Verunreinigungen, die der Schulter des Peaks entsprachen, zu entfernen, wurde eine weitere Reinigung durchgeführt mit der in Stufe (3-3-5-1-2) beschriebenen Methode.
(3-3-5-1-2) Chromatographie in Gegenwart von Heptafluorbuttersäure
Eine TSKgel Super-ODS-Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographiesäule (TOSOH, 0,46 cm × 10 cm) wurde bei 40°C mit einer Durchflussrate von 1 ml/min mit Lösungsmittel A (0,1% Heptafluorbuttersäure/destilliertes Wasser) zur Equilibrierung eluiert.
Die Fraktionen Nr. 98 bis 100, die in Stufe (3-3-5-1-1) erhalten worden waren, wurden direkt auf die Säule geladen und dann mit einer Durchflussrate von 1 ml/min innerhalb von 1 Minute mit 100 Vol.-% Lösungsmittel A (0,1% Heptafluorbuttersäure/destilliertes Wasser), das schnell zu 35 Vol.-% Lösungsmittel B (0,1% Heptafluorbuttersäure/100% Acetonitril) verändert wurde und dann mit einer Durchflussrate von 1 ml/min 60 Minuten lang mit einem linearen Gradienten bis 50% Lösungsmittel B eluiert, um das Effluens zu gewinnen.
Das Effluens wurde in Aliquots von 0,5 ml gesammelt, die jeweils mit einer Fraktionsnummer bezeichnet wurden. 2 μl der Fraktion wurden direkt verwendet, um die GALR2 aktivierende Wirkung mit der oben in Stufe (1-3) beschriebenen Methode zu untersuchen. Als Ergebnis wurde ein aktiver Peak in den Fraktionen Nr. 67 bis 69 nachgewiesen. Dieser aktive Peak stimmte vollständig überein mit dem früheren UV-Absorptionspeak der Doppelpeaks bei 210 nm, was ein einzelnes gereinigtes Peptid anzeigt. Diese Komponente mit der aktivierenden Wirkung wurde als Haupt-GALR2 aktivierende Komponente bezeichnet.
(3-3-5-2) Reinigung der GALR2 aktivierenden Hilfskomgonente (1)
Eine TSKgel Super-ODS-Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographiesäule (TOSOH, 0,46 cm × 10 cm) wurde bei 40°C mit einer Durchflussrate von 1 ml/min mit Lösungsmittel A (0,1% Heptafluorbuttersäure/ destilliertes Wasser) zur Equilibrierung eluiert.
Die Superphenyl-Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographie-Fraktionen Nr. 105 bis 107 (aus Fraktion Nr. 50), Fraktionen Nr. 105 bis 107 (aus Fraktion Nr. 51) und Fraktionen Nr. 106 bis 107 (aus Fraktion Nr. 52), die in Stufe (3-3-4) erhalten worden waren, wurden vermischt und direkt auf die Säule geladen und dann mit einer Durchflussrate von 1 ml/min innerhalb 1 Minute mit 100 Vol.-% Lösungsmittel A (0,1% Trifluoressigsäure/destilliertes Wasser), das schnell zu 52,5 Vol.-% Lösungsmittel B (0,1% Trifluoressigsäure/60% Acetonitril) verändert wurde, eluiert und dann mit einer Durchflussrate von 1 ml/min 84 Minuten lang mit einem linearen Gradienten bis 65% Lösungsmittel B, um das Effluens zu gewinnen. Das Effluens wurde in Aliquots von 0,5 ml gesammelt, die jeweils nur einer Fraktionsnummer bezeichnet wurden.
2 μl der Fraktion wurden direkt verwendet, um die GALR2 aktivierende Wirkung mit der oben in Stufe (1-3) beschriebenen Methode zu untersuchen. Als Ergebnis wurde ein aktiver Peak in den Fraktionen Nr. 75 bis 76 nachgewiesen. Die Fraktionen Nr. 75 und 76 wurden vermischt und wiederum unter den gleichen Bedingungen chromatographiert, um Aliquots von 0,5 ml zu sammeln, die jeweils mit der Fraktionsnummer bezeichnet wurden. Das Effluens wurde als einzelner Peak in dem UV-Absorptionsspektrum bei 210 nm nachgewiesen. 3 μl der Fraktion wurden direkt verwendet, um die GALR2 aktivierende Wirkung mit der oben in Stufe (1-3) beschriebenen Methode nachzuweisen. Als Ergebnis wurde ein aktiver Peak in den Fraktionen Nr. 76 bis 78 festgestellt. Dieser aktive Peak stimmte überein mit dem UV-Absorptionspeak bei 210 nm, was auf ein einzelnes gereinigtes Peptid hindeutet. Diese Komponente mit der aktivierenden Wirkung wurde als GALR2 aktivierende Hilfskomponente (1) bezeichnet.
(3-3-5-3) Reinigung der GALR2 aktivierenden Hilfskomponente (2)
Eine TSKgel Super-ODS-Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographiesäule (TOSOH, 0,46 cm × 10 cm) wurde bei 40°C mit einer Durchflussrate von 1 ml/min mit Lösungsmittel A (0,1% Heptafluorbuttersäure/ destilliertes Wasser) zur Equilibrierung eluiert.
Die Superphenyl-Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographie-Fraktionen Nr. 108 bis 109 (aus Fraktion Nr. 51) und die Fraktionen Nr. 108 bis 110 (aus Fraktion Nr. 52), die in Stufe (3-3-4) erhalten worden waren, wurden vermischt und direkt auf die Säule geladen und dann mit einer Durchflussrate von 1 ml/min innerhalb 1 Minute mit 100 Vol.-% Lösungsmittel A, das schnell zu 52,5 Vol.-% Lösungsmittel B (0,1% Trifluoressigsäure/60% Acetonitril) verändert wurde, und dann mit 1 ml/min 84 Minuten lang mit einem linearen Gradienten bis 65% Lösungsmittel B eluiert, um das Effluens zu gewinnen. Das Effluens wurde in Aliquots von 0,5 ml gesammelt, die jeweils mit einer Fraktionsnummer bezeichnet wurden.
2 μl der Fraktion wurden direkt verwendet, um die GALR2 aktivierende Wirkung mit der oben in Stufe (1-3) beschriebenen Methode zu untersuchen. Als Ergebnis wurde ein aktiver Peak in den Fraktionen Nr. 79 bis 80 nachgewiesen.
Die Fraktionen Nr. 79 und 80 wurden vermischt und wiederum unter den gleichen Bedingungen chromatographiert, um Aliquots mit 0,5 ml zu sammeln, die als einzelner Peak in dem UV-Absorptionsspektrum bei 210 nm nachgewiesen wurden.
3 μl der Fraktion wurden direkt verwendet, um die GALR2 aktivierende Wirkung mit der oben in Stufe (1-3) beschriebenen Methode zu untersuchen. Als Ergebnis wurde ein Hauptaktivitätspeak in den Fraktionen Nr.
79 bis 81 nachgewiesen. Dieser aktive Peak stimmte vollständig überein mit dem UV-Absorptionspeak bei 210 nm, was auf ein einzelnes gereinigtes Peptid hindeutet. Diese Komponente mit der aktivierenden Wirkung wurde als GALR2 aktivierende Hilfskomponente (2) bezeichnet.
Beispiel 4
Aminosäuresequenzierung
(4-1) N-terminale Aminosäuresequenzierung der Hauptkomponente mit GALR2 aktivierender Wirkung
Die GALR2 aktivierende Hauptkomponente der Fraktionen 67 bis 69, die in Stufe (3-3-5-1-2), wie oben beschrieben, erhalten worden waren, wurden in 20 μl 0,1% Trifluoressigsäure/30% Acetonitril gelöst und tropfenweise zu einer Peptidträgerscheibe (Beckman) zugegeben, die dann über Stickstoffgas getrocknet wurde. Die Scheibe wurde auf eine Proteinsequenziervorrichtung (BECKMAN, LF3400DT) montiert und einem automatischen Edman-Abbau mit Standardanalyse (Verfahren 40) unterzogen, um die Aminosäuren zu sequenzieren. Jeder Zyklus identifizierte die PHT-Aminosäure, die in Tabelle 1 gezeigt ist.
Tabelle 1 N-terminale Aminosäuresequenz der GALR2 aktivierenden Hauptkomponente
Aus Tabelle 1 wurde die Aminosäuresequenz vom N-Ende bis zum 34. Rest der GALR2 aktivierenden Hauptkomponente bestimmt, wie unten gezeigt (der 28. Rest X war unbekannt).
APVHRGRGGWTLNSAGYLLGPVLHPPSXAEGGGK (N-terminale Aminosäuresequenz der GALR2-aktivierenden Hauptkomponente: SEQ ID Nr. 11).
Die Sequenz, die aus 13 Resten vom 9. Rest bis zum 21. Rest des N-Endes der erhaltenen Aminosäuresequenz bestand, stimmte überein mit der N-terminalen Aminosäuresequenz des bekannten Schweinegalanins. Die Aminosäuresequenzen in den benachbarten Regionen stimmten jedoch nicht überein mit irgendwelchen Sequenzen von Schweinegalanin und seinen Vorläufern.
Da kein bekanntes Peptid, das mit dieser Aminosäuresequenz übereinstimmte, gefunden wurde, wurde angenommen, dass die hier erhaltene GALR2 aktivierende Hauptkomponente ein neues Peptid ist.
(4-2) N-terminale Aminosäuresequenzierung der Hilfskomponente (1) mit GALR2 aktivierender Wirkung
Die GALR2 aktivierende Hilfskomponente in den Fraktionen 76 bis 78, die in der oben beschriebenen Stufe (3-3-5-2) erhalten wurde, wurde auf gleiche Weise wie in Stufe (4-1) analysiert.
Jeder Zyklus identifizierte die in Tabelle 2 gezeigte Aminosäure. Tabelle 2 N-terminale Aminosäuresequenz der aktivierenden Hilfskomponente (1)

1) Rohe Daten ohne Korrektur für lag
2) S*: Zusätzlich zu PTH-Ser, wurde dessen Abbauprodukt (PTH-Dehydroalanin-DTT-Addukt) auc nachgewiesen
3) Obwohl der Peak für PTH-His im 24. Zyklus beobachtet wurde, war er unter der Nachweisgrenze
4) Es wurde keine PTH-Aminosäure im 28. Zyklus identifiziert.

Aus Tabelle 2 wurde die Aminosäuresequenz vom N-Ende bis zum 32. Rest der GALR2 aktivierenden Hilfskomponente (1) bestimmt, wie unten gezeigt (der 28. Rest X war unbekannt). APVHRGRGGWTLNSAGYLLGPVLHPPSXAEGG (N-terminale Aminosäuresequenz der GALR2 aktivierenden Hilfskomponente (1): SEQ ID Nr. 12).
Diese Aminosäuresequenz stimmte vollständig überein mit den 32 Resten der N-terminalen Aminosäuresequenz der GALR2 aktivierenden Hauptkomponente, die in Stufe (4-1), wie oben beschrieben, erhalten wurde.
(4-3) N-terminale Aminosäuresequenzierung der Hilfskomponente (2) mit GALR2 aktivierender Wirkung
Die GALR2 aktivierende Hilfskomponente (2) in den Fraktionen Nr. 79 bis 81, die in Stufe (3-3-5-3), wie oben beschrieben, erhalten wurde, wurde in 20 μl 0,1% Trifluoressigsäure/30% Acetonitril gelöst und Ammoniumbicarbonat (Endkonzentration: 1%), TLCK-Chymotrypsin (Endkonzentration: 10 pmol, Sigma) und destilliertes Wasser wurden auf 50 μl zugegeben, und dann 1 Stunde bei 37°C reagieren gelassen.
Eine Spheri-5-RP-18 Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographiesäule (BROWNLY, 2,1 mm × 30 mm) wurde mit Lösungsmittel A (0,1% Trifluoressigsäure) bei 25°C und mit einer Durchflussrate von 300 μl/min zur Equilibrierung eluiert.
Die Säule wurde mit der gesamten Menge der Enzymreaktionsmischung beladen und dann mit 300 μl/min 30 Minuten lang mit 100 Vol.-% Lösungsmittel A (0,1% Trifluoressigsäure), die zu 70 Vol.-% Lösungsmittel B (0,1% Trifluoressigsäure/70% Acetonitril) geändert wurde, eluiert, um die herausfließenden Fraktionen zu sammeln, die den vier herausfließenden Peaks entsprachen, die eine UV-Absorption bei 210 nm zeigten (CHY-1, CHY-2, CHY-3 und CHY-4).
Die vier so erhaltenen Fraktionen (mit Chymotrypsin verdaute Fragmente) wurden unter Stickstoffströmung auf ein Volumen von weniger als 50 μl eingeengt und dann einer N-terminalen Aminosäuresequenzierung unterzogen unter Verwendung einer Proteinsequenziervorrichtung wie in Stufe (4-1). CHY-3 wurde analysiert mit einer Proteinsequenziervorrichtung von BECKMAN Modell LF3400DT, während CHY-1, CHY-2 und CHY-4 mit einer Proteinsequenziervorrichtung von APPLIED BIOSYSTEMS Modell 477A analysiert wurden. Die N-terminale Aminosäuresequenzierung lieferte die folgenden Sequenzen:
CHY-1: APVHRGRGG (SEQ ID Nr.: 13)
CHX-2: XAIDGLPXPQS (X ist unbekannt) (SEQ ID Nr.: 16)
CHY-3: LLGPVLHPPSXAEGGGKTALGILDL (X ist unbekannt) (SEQ ID Nr. 15)
CHY-4: TLNSAG (SEQ ID Nr.: 14)
Basierend auf der N-terminalen Aminosäuresequenz der GALR2 aktivierenden Hauptkomponente, die, wie oben beschrieben, in Stufe (4-1) erhalten wurde, oder der GALR2 aktivierenden Hilfskomponente (1), die, wie oben beschrieben, in Stufe (4-2) erhalten wurde, wurde die N-terminale Aminosäuresequenz der GALR2 aktivierenden Hilfskomponente (2) wie folgt angenommen.
APVHRGRGGWTLNSAGYLLGPVLHPPSXAEGGGKTALGILDL (SEQ ID Nr.: 17)
Beispiel 5
cDNA, die Schweineligandpentid (1-60) codiert
1) Klonierung eines Genfragments des GALR2 aktivierenden Faktors vom Schwein durch degenerierte PCR
Aus dem Gesamtgehirn von Schwein wurde die Gesamt-RNA extrahiert unter Verwendung eines TRIZOL-Reagenzes (Gibco BRL) gemäß der in der beigefügten Anleitung beschriebenen Methode. Anschließend wurde Poly(A)⁺RNA aus dieser Gesamt-RNA präpariert unter Verwendung einer Oligo-dT-Cellulosesäule (mRNA Purification Kit, Pharmacia) gemäß der in der beigefügten Anleitung beschriebenen Methode. Dann wurde ein erster Strang cDNA aus dieser Poly(A)+RNA synthetisiert unter Verwendung eines 3'-RACE Systems für die schnelle Amplifikation von cDNA-Enden (Gibco BRL) gemäß der in der beigefügten Anleitung beschriebenen Methode. Die folgenden degenerativen Primer wurden synthetisiert basierend auf der Teilaminosäuresequenz der GALR2 aktivierenden Komponente vom Schwein.
pGAL4-7F: 5'-CAYMGNGGIMGNGGIGGSTGGAC-3' (SEQ ID Nr.: 20)
pGAL4-3F: 5'-GGHTGGACNCTNAAYAGYGC-3' (SEQ ID Nr.: 21)
pGAL34-1R: 5'-ATICCNAGIGCNGTYTTICCYTT-3' (SEQ ID Nr.: 22)
Der erste oben beschriebene cDNA-Strang wurde als Matrize angewendet, um die erste PCR durchzuführen unter Verwendung von pGAL4-7F und pGAL34-1R als Primer. Bei dieser PCR wurde die Reaktionsmischung hergestellt, indem 0,5 μl Taq-Polymerase (TAKARA), jeweils 10 μl beigefügter 10 × PCR-Puffer (500 mM KCl-100 mM Tris·HCl, pH 8,3), 6 μl 25 mM MgCl₂, 8 μl 2,5 mM dNTP-Mischung, jeweils 10 μl Primer pGAL4-7F und Primer pGAL34-1R (beide 10 μM), 8 μl der Matrizen-cDNA (erster Strang cDNA, wie oben beschrieben) und 47,5 μl destilliertes Wasser vermischt wurden. Diese PCR beinhaltete 1) eine Anfangsdegeneration (94°C·30 Sekunden), 2) 32 Zyklen (94°C·20 Sekunden – 55°C·30 Sekunden – 72°C·30 Sekunden) und dann 3) eine Endverlängerung (72°C·4 Minuten) und lieferte ein Anfangs-PCR-Produkt.
Das so erhaltene Anfangs-PCR-Produkt wurde als Matrize verwendet, um die zweite PCR durchzuführen (ineinander gesetzte oder geschachtelte PCR). Die Reaktionsmischung wurde hergestellt, indem 0,5 μl Taq-Polymerase (TAKARA), 10 μl des beigefügten 10 × PCR-Puffers (500 mM KCl-100 mM Tris·HCl, pH 8,3), 6 μl 25 mM MgCl₂, 8 μl 2,5 mM dNTP-Mischung, jeweils 10 μl Primer pGAL9-3F und Primer pGAL34-1R (beide 10 μM), 5 μl Matrizen-cDNA (Anfangs-PCR-Produkt) und 50,5 μl destilliertes Wasser vermischt wurden. Diese PCR beinhaltete 1) eine Anfangsdegeneration (94°C·30 Sekunden), 2) 32 Zyklen (94°C·20 Sekunden – 55°C·30 Sekunden – 72°C·30 Sekunden) und dann 3) eine Endverlängerung (72°C·10 Minuten) und lieferte ein geschachteltes PCR-Produkt.
Weiterhin wurde dieses geschachtelte PCR-Produkt einer Elektrophorese auf einem 2,0% Agarosegel unterzogen und ein Gelstück, das etwa 100 by mit Cybergrün gefärbte Bande enthielt, wurde mit einem Messer herausgeschnitten. Aus diesem Gelstück wurde ein DNA-Fragment, das ein geschachteltes PCR-Produkt war, unter Verwendung eines Gene Clean DNA Extraktionskits (BIO 101) gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde unter Verwendung eines TOPO TA Cloning Kits (Invitrogen) in einen Plasmidvektor pCRII ligiert, der dem Kit beigefügt war, mit der in der beigefügten Anleitung beschriebenen Methode. Das so erhaltene Plasmid wurde gereinigt unter Verwendung eines QIAwell 8 Ultra plasmid purification kit (QIAGEN). Die Reaktion zur Sequenzierung der Basen des geschachtelten PCR-Produkts in diesem Plasmid wurde durchgeführt unter Verwendung eines Dye Terminator Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems, Perkin Elmer) und die Basensequenz des geschachtelten PCR-Produkts wurde interpretiert unter Verwendung eines fluoreszierenden Sequenzautomaten (DNA-Sequencer Prism 377; Applied Biosystems, Perkin Elmer). Als Ergebnis wurden mehrere Plasmide, die jeweils ein 98-bp-DNA-Fragment aufwiesen, das ein Teilpeptid eines GALR2 aktivierenden Faktors vom Schwein codierte, erhalten. Da die degenerierten Primer in der PCR angewendet wurden, unterschieden sich die DNAs in diesen verschiedenen Plasmiden voneinander in den Basensequenzen der den Primerns entsprechenden Teile. Die Basensequenzen der geschachtelten PCR-Produkte in den repräsentativen zwei Klonen, nämlich pCR100-6 und pCR100-7:
pCR100-6:
GGCTGGACTT TAAATAGTGC TGG2TTACCTC CTGGGTCCCG TACTCCATCC GCCCTCCAGG GCTGAAGGAG GCGGGAAGGG CAAAACAGCC CTGGGCAT (SEQ ID Nr.: 23)
pCR100-7:
GGTTGGACTT TGAACAGTGC TGGTTACCTC CTGGGTCCCG TACTCCATCC GCCCTCCAGG GCTGAAGGAG GCGGGAAGGG CAAAACCGCC CTAGGCAT (SEQ ID Nr.: 24)
2) Klonierung von cDNA, die Schweineligandenpeptid (1-60) codiert
Aus der aus ganzen Schweinehirnen erhaltenen Poly(A)⁺RNA wurde eine Schweinegesamthirn-cDNA-Phagenbibliothek erstellt unter Verwendung eines ZAP-cDNA-Gigapack-III-Goldklonierungskits (STRATAGE-NE). Die Methode war wie in einer beigefügten Anleitung beschrieben. Ein entstehender Phage (2,2 Mio. Plaque bildende Einheiten) wurde mit E. coli XL1-Blue MRF' (STRATAGENE) mit der in der Anleitung beschriebenen Methode infiziert und auf 120 NZY-Mediumagarplatten geimpft, die 8 Stunden bei 37°C inkubiert wurden. Aus einem so erhaltenen E. coli-Plaque wurde ein Phage auf eine Hybond-N+-Nylonmembran (Amersham) überführt. Diese Nylonmembran wurde aufeinander folgend in eine 0,5 n Natriumhydroxidlösung, die 1,5 M Natriumchlorid enthielt, 0,5 M Tris-Puffer (pH 7,0), der 1,5 M Natriumchlorid enthielt, und 2 × SSC-Lösung eingetaucht und dann an der Luft getrocknet.
Die entstehende Nylonmembran wurde 24 Stunden lang bei 60°C in einen Hybridisierungspuffer (5 × SSPE, 5 × Denhardt's Lösung; 0,5% SDS, 0,1 mg/ml Lachssperm-DNA) gelegt und dann 24 Stunden bei 60°C in einen Hybridisierungspuffer ähnlich dem vorhergehenden, außer dass er weiterhin eine Hybridisierungssonde enthielt (5 × 10⁵ cpm/ml) gelegt. Diese Hybridisierungssonde war eine DNA, die mit den folgenden zwei Primern pGAL9-3F und pGAL34-8R unter Verwendung einer 1:1-Mischung der Plasmide pCR100-6 und pCR100-7, wie oben beschrieben, als Matrize amplifiziert wurde.
pGAL9-3F: 5'-GGHTGGACNCTNAAYAGYGC-3' (SEQ ID Nr.: 25)
pGAL34-8R: 5'-ATDCCBAGGGCDGTTTTGCCCTT-3' (SEQ ID Nr.: 26)
Somit beinhaltet diese Amplifikationsreaktion [wobei die Reaktionsmischung hergestellt wurde, indem 0,5 ml ExTaq (TAKARA), 5 μl des beigefügten 10 × ExTaq-Puffers (der 20 mM MgCl₂ enthielt), 4 μl 2,5 mM dNTP-Mischung, 10 μl [α-³²P]dCTP (6000 Ci/mmol), jeweils 0,5 μl des Primers pGAL9-3F und des Primers pGAL34-8R (jeweils 10 μM), 1 μl der Matrizen-cDNA und 29 μl destilliertes Wasser vermischt wurden] eine Anfangsdegeneration 30 Sekunden bei 96°C gefolgt von 32 Zyklen mit 94°C·20 Sekunden – 55°C·30 Sekunden – 72°C·30 Sekunden) gefolgt von einer Endverlängerung bei 72°C über 4 Minuten und lieferte ein amplifiziertes DNA-Fragment.
Die Nylonmembran wurde nach dieser Hybridisierungsreaktion mit 0,2 × SSC-Pufferlösung, die 0,1% SDS enthielt, bei 50°C 30 Minuten lang gewaschen und dann einer Autoradiografie unterzogen unter Verwendung eines Röntgenfilms (Kodak, BioMax MS) in Gegenwart eines Sensibilisierungsschirms (Belichtung 3 Tage bei –70°C). Ein als Ergebnis der Autoradiografie nachgewiesener positiver Plaque wurde isoliert und ein Phage wurde in 5 ml einer SM-Pufferlösung (100 mM NaCl, 8 mM MgSO₄, 0,01% Gelatine, 50 mM Tris·HCl, pH 7,5), die 0,1 ml Chloroform enthielt, extrahiert.
Ein entstehender Phage wurde wieder mit E. coli XL1-Blue MRF' infiziert und dann auf NZY-Mediumagarplatten geimpft, die 8 Stunden bei 37°C inkubiert wurden. Aus einem so erhaltenen E. coli-Plaque wurde ein Phage auf eine Nylonmembran (Amersham, Hybond-N⁺) überführt und eine Hybridisierung, wie oben beschrieben, durchgeführt. Ein einzelner positiver Klon wurde mit Autoradiografie isoliert und eine Reihe der oben beschriebenen Verfahren wurde wiederum wiederholt, um einen vollständig vereinzelten Phagenklon zu erhalten.
Anschließend wurde ein Plasmid aus diesem Phagenklon isoliert und mit der unten beschriebenen Methode gereinigt. Eine Phagenlösung (1 μl) wurde mit einem E. coli XPORT (50 μl), einem Helferphagen (10 μl) und einem E. coli XLOLR (5 μl) vermischt und auf eine NZY-Agarplatte geimpft, die 8 Stunden bei 37°C inkubiert wurde. Eine kleine Kolonie des E. coli XLOLR, die sich in dem E. coli XPORT-Plaque gebildet hatte, wurde mit einem Zahnstocher herausgepickt und in einem LB-Medium, das Ampicillin und Tetracyclin enthielt, über Nacht bei 37°C inkubiert. Aus einer einzelnen Kolonie wurde der E. coli XLOLR herausgepickt und einer Flüssiginkubation in einem LB-Medium unterzogen. Nach Abschluss der Inkubation wurde E. coli XLOLR gesammelt und ein Plasmid wurde gereinigt unter Verwendung eines Plasmidreinigungskits (QIAGENE QIAwell 8 Ultra).
Die Reaktion zur Basensequenzierung der cDNA, die den GALR2 aktivierenden Faktor vom Schwein in diesem Plasmid codierte, wurde durchgeführt unter Verwendung eines Dye Terminator Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems, Perkin Elmer) und die Basensequenz der cDNA, die den GALR2 aktivierenden Faktor vom Schwein codierte, wurde interpretiert unter Verwendung eines Fluoreszenzsequenzautomaten (DNA-Sequenzautomat Prism 377; Applied Biosystems, Perkin Elmer). Als Ergebnis wurde ein Plasmid pGR2PL6 mit einem 974 by DNA-Fragment und ein Plasmid pGR2PL3 mit einem 1007 by DNA-Fragment, die das gesamte Peptid des GALR2 aktivierenden Faktors vom Schwein codierten, erhalten. Obwohl die Kettenlängen und die Amino säuresequenzen der Vorläufer des GALR2 aktivierenden Faktors, die von beiden DNA-Sequenzen codiert wurden, sich stark voneinander unterschieden, waren die Sequenzen des Teils des reifen Aktivierungsfaktors (reifes Peptid), von denen angenommen wurde, dass sie durch Prozessierung erzeugt würden, bei beiden gleich.
Jedes der beiden so erhaltenen Plasmide wurde mit einer bekannten Methode in einen E. coli TOP 10 transduziert, um die Transformanten TOP 10/pGR2PL6 und TOP 10/pGR2PL3 zu erzeugen.
Beispiel 6
Herstellung von Schweineligandenpeptid (1-60):

Ala-Pro-Val-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Val-Leu-His-Pro-Pro-Ser-Arg-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Lys-Thr-Ala-Leu-Gly-Ile-Leu-Asp-Leu-Trp-Lys-Ala-Ile-Asp-Gly-Leu-pro-Tyr-Pro-Gln-Ser-Gln-Leu-Ala-Ser (SEQ ID Nr.: 31)

Ein im Handel erhältliches Boc-Ser(Bzl)1-OCH₂-PAM-Harz (0,73 mmol/g Harz) in der Menge, die 0,5 mmol entsprach, wurde in einen Reaktor eines Peptidsyntheseautomaten ABI 430A gegeben und Boc-Ala, Boc-Leu, Boc-Gln, Boc-Ser(Bzl), Boc-Pro, Boc-Tyr (Br-Z), Boc-Gly, Boc-Asp(OcHex), Boc-Ile, Boc-Lys(Cl-Z), Boc-Trp(CHO), Boc-Thr(Bzl), Boc-Glu(OcHex), Boc-Arg(Tos), Boc-His(Bom), Boc-Val und Boc-Asn wurden in der gewünschten Reihenfolge der Aminosäuren mit einer auf Boc-Strategie basierenden (NMP-HOBt) Peptidsynthesemethode eingeführt, wobei das vorgesehene geschützte Peptidharz erhalten wurde. 0,105 g dieses Harzes wurden zusammen mit 1,1 g p-Kresol und 1,2 ml 1,4-Butandithiol in 10 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff 60 Minuten lang bei 0°C gerührt und dann wurde der Fluorwasserstoff bei vermindertem Druck abdestilliert, um einen Rückstand zu erhalten, der mit Diethylether vereinigt wurde, um den Niederschlag durch Filtration zu sammeln. Dieser Niederschlag wurde mit 50% wässriger Essigsäure extrahiert und unlösliche Bestandteile wurden entfernt und der Extrakt wurde sorgfältig eingeengt und dann auf eine Sephadex^® G-25-Säule (2,0 × 80 cm), die mir 50% wässriger Essigsäure gepackt worden war, geladen und mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert, um eine Hauptfaktion zu sammeln, die dann einer Reverse-Phase-Chromatographiesäule (2,6 × 60 cm) unterzogen wurde, die mit LiChroprep^® RP-18 gepackt war, die dann mit 200 ml 0,1% wässrigem TFA gewaschen wurde und dann mit einem linearen Gradienten unter Verwendung von 300 ml 0,1% wässriger TFA und 300 ml 50% wässrigem Acetonitril, das 0,1% TFA enthielt, eluiert wurde und eine Hauptfraktion wurde gesammelt, eingeengt, lyophilisiert, um 39 mg eines weißen Pulvers zu erhalten. Dieses Material wurde weiter auf eine Ionenaustauschchromatographiesäule geladen, die mit CM-Cellulofine^® gepackt war und mit einem linearen Gradienten von 50 mM bis 200 mM Ammoniumacetat eluiert, um eine Hauptfraktion zu sammeln, die repetitiv lyophilisiert wurde, um 10 mg eines weißen Pulvers zu erhalten.
(M+H)⁺ in MS: gefunden 6204,7 (berechnet 6205,2)
HPLC Retentionszeit: 21,8 nun
Säulenbedingungen:
Säule: Wakosil 5C18T, 4,6 × 100 mm
Elutionsmittel: Verwendung von Lösungsmittel A: 0,1% wässriges TFA und Lösungsmittel B: 0,1% TFA enthaltendes Acetonitril mit einem linearen Gradienten von A/B: 95/5 bis 45/55 (über 25 Minuten)
Durchflussrate: 1,0 ml/min
Beispiel 7
Herstellung von Rattenligandenpeptid (1-60):

Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Val-Leu-His-Leu-Ser-Ser-Lys-Ala-Asn-Gln-Gly-Arg-Lys-Thr-Asp-Ser-Ala-Leu-Glu-Ile-Leu-Asp-Leu-Trp-Lys-Ala-Ile-Asg-Gly-Leu-Pro-Tyr-Ser-Arg-Ser-Pro-Arg-Met-Thr (SEQ ID Nr. 33) und Humanligandenpolypeptid (l-60): Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Val-Leu-His-Leu-Pro-Gln-Met-Gly-Asp-Gln-Asp-Gly-Lys-Arg-Glu-Thr-Ala-Leu-Glu-Ile-Leu-Asp-Leu-Trp-Lys-Ala-Ile-Asp-Gly-Leu-Pro-Tyr-Ser-His-Pro-Pro-Gln-Pro-Ser (SEQ ID Nr.: 34)

Ein im Handel erhältliches Boc-Thr(Bzl)1-OCH₂-PAM-Harz kann angewendet werden, um die Synthese und die Reinigung ähnlich wie in Beispiel 1 durchzuführen, um die Peptide zu erhalten.
Beispiel 8
Herstellung von Antigenpeptid Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys-NH₂
(Amidform von SEQ ID Nr. 44), das zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern angewendet wird
Ein im Handel erhältliches p-Methyl-MBH-Harz (0,77 mmol/g Harz) wurde auf gleiche Weise angewendet, wie in Beispiel 1, um Boc-Cys(MeBzl), Boc-Gly, Boc-Arg(Tos), Boc-His(Bom), Boc-Ala und Boc-Pro in der gewünschten Reihenfolge der Aminosäuren zu kondensieren und dann mit Fluorwasserstoff behandelt, auf einer Sephadex^® G-25-Säule (2,0 × 80 cm), die mit 50% wässriger Essigsäure gepackt war, gereinigt, lyophilisiert, um 50 mg weißes Pulver zu erhalten.
(M+H)⁺ in MS: gefunden 980,5 (berechnet 980,5)
HPLC Retentionszeit: 5,2 min
Säulenbedingungen:
Säule: Wakosil 5C18T, 4,6 × 100 mm
Elutionsmittel: Verwendung von Lösungsmittel A: 0,1% wässriges TFA und Lösungsmittel B: 0,1% TFA enthaltendes Acetonitril mit einem linearen Gradienten von 0 bis 50% Lösungsmittel B (über 25 Minuten)
Durchflussrate: 1,0 ml/min
Beispiel 9
Herstellung von Immunogen das Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly enthält (SEQ ID Nr. 35)
Das Peptid, das durch Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys-NH₂ dargestellt wird (Amidform von SEQ ID Nr. 44), das wie oben beschrieben in Beispiel 8 erhalten wurde, wurde mit Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH) komplexiert, um ein Immunogen zu erhalten. Es wurden somit 20 mg KLH in 1,4 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH 6,5) gelöst und dann mit 100 μl einer DMF-Lösung, die 2,2 mg (8 μmol) N-(γ-Maleimidobutyloxy)succinimid (GMBS) enthielt, vermischt und bei Raumtemperatur 40 Minuten lang umgesetzt. Nach der Reaktion wurde die Mischung auf einer Sephadex G-25-Säule fraktioniert und mit 15 mg von mit Maleimidgruppen substituiertem KLH und 1,6 mg des Peptids Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys-NH₂ (Amidform von SEQ ID Nr. 44) vermischt und bei 4°C 2 Tage lang umgesetzt. Nach der Reaktion wurde die Mischung gegen physiologische Kochsalzlösung 2 Tage lang bei 4°C dialysiert.
Beispiel 10
Immunisierung
6 bis 8 Wochen alte weibliche BALB/C-Mäuse wurden subcutan mit etwa 30 μg/Tier des in Beispiel 9 beschriebenen Immunogens, d.h. Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys(-NH₂)-KLH zusammen mit Freund's komplettem Adjuvans immunisiert. Danach wurde ein Tier zweimal mit der gleichen Menge des Immunogens zusammen mit inkomplettem Freund's Adjuvans alle 3 Wochen geboosted.
Beispiel 11
Herstellung von enzymmarkiertem Antigen
Herstellung von mit Meerrettichperoxidase (HRP)-markiertem Peptid Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys-NH₂ (Amidform von SEQ ID Nr. 44)
Das in Beispiel 8 erhaltene Peptid Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys-NH₂ (Amidform von SEQ ID Nr. 44) wurde mit HRP (für Enzymimmunoassay, Boehringer Mannheim) vernetzt, um eine markierte Form eines Enzymimmunoassays (EIA) zu erhalten. Es wurden daher 6 mg (150 nmol) HRP in 0,95 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH 6,5) gelöst und mit 50 μl einer DMF-Lösung, die 0,42 mg (1,5 μmol) GMBS enthielt, vermischt und dann wurde die Mischung bei Raumtemperatur 30 Minuten lang umgesetzt und auf einer Sephadex G-25-Säule fraktioniert. 4,2 mg (105 nmol) mit Maleimidgruppen substituiertes HRP, die so erhalten wurden, und 0,31 mg (315 nmol) des Peptids Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys-NH₂ (Amidform von SEQ ID Nr. 44), das in Beispiel 9 erhalten worden war, wurden vermischt und bei 4°C 1 Tag lang umgesetzt. Nach der Reaktion wurde die Mischung auf einer Ultrogel AcA44-(LKB-Pharmacia)-Säule fraktionier, um mit HRP markiertes Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys-NH₂ zu erhalten.
Beispiel 12
Bestimmung des Antikörpertiters in Antiserum der Maus, die mit Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys(-NH₂)-KLH-Komplex immunisiert worden war
Der Antikörpertiter im Serum einer Maus, die mit Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys(-NH₂)-KLH-Komplex, der in Beispiel 9 erhalten worden war, immunisiert worden war, wurde mit der unten beschriebenen Methode bestimmt. Zur Herstellung einer Mikroplatte, an die Antimausimmunglobulinantikörper gebunden war, wurden jeweils 100 μl 0,1 M Carbonatpuffer (pH 9,6), der 100 μg/ml Antimausimmunglobulinantikörper (IgG-Fraktion, KAPPEL) enthielt, in eine 96-Napf-Mikroplatte gegeben, die bei 4°C 24 Stunden lang stehen gelassen wurde. Die Platte wurde mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) gewaschen und dann wurden jeweils 300 μl PBS, das 25% BLOCKACE (SNOW BRAND MILK PRODUCTS) enthielt, zugegeben, um überschüssige Bindungsstellen in einem Napf zu maskieren und dann wurde die Behandlung mindestens 24 Stunden lang bei 4°C fortgesetzt.
Jeder Napf der Mikroplatte mit gebundenem Antimausimmunglobulinantikörper, der wie oben erhalten wurde, erhielt 50 μl Puffer C [0,02 M Phosphatpuffer, der 1% BSA, 0,4 M NaCl und 2 mM EDTA enthält, pH 7,0] und 100 μl von mit Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys(-NH₂)-KLH komplexiertem Antiserum, das mit Puffer C verdünnt ist, und wurde 16 Stunden lang bei 4°C reagieren gelassen. Anschließend wurde die Platte mit PBS gewaschen und erhielt 100 μl mit HRP markiertes Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys-NH₂ (500-fach verdünnt mit Puffer C), das in Beispiel 11, wie oben beschrieben, hergestellt worden war, und wurde dann bei Raumtemperatur 1 Tag lang reagieren gelassen. Dann wurde die Platte mit PBS gewaschen und die Enzymaktivität auf der Festphase bestimmt, indem 100 μl eines TMB-Mikronapfperoxidasesubstratsystems (KIRKEGAARD & PERRY LAB, Inc., erhältlich von FUNAKOSHI) zugegeben wurden und anschließend bei Raumtemperatur 10 Minuten lang umgesetzt wurden. 100 μl 1 M Phosphorsäure wurden zugegeben, um die Reaktion abzusättigen und die Extinktion bei 450 nm wurde mit einem Plattenlesegerät bestimmt (BICHROMA-TIC, DAINIPPON PHARMACEUTICAL). Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt. Alle 8 immunisierten Mäuse zeigten einen Anstieg des Antikörpertiters gegen Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys(-NH₂)-KLH-Komplex.
Beispiel 13
Herstellung, von monoklonalen Antikörpern gegen Rattenligandenpeptid (1-60) (SEQ ID Nr. 33)
Eine Maus mit einem relativ hohen Antikörpertiter wurde intravenös mit 200 bis 300 μg des Immunogens, gelöst in 0,25 bis 0,3 ml physiologischer Kochsalzlösung beimpft, um die endgültige Immunisierung zu bewirken. 3 bis 4 Tage nach der Immunisierung wurde der Maus die Milz entnommen, mit einem Sieb aus rostfreiem Stahl komprimiert, filtriert und in Eagle's Minimalessenzialmedium (MEM) suspendiert, um eine Milzzellsuspension zu erhalten. Als zu fusionierende Zelle wurde eine von BALB/C-Mäusen abgeleitete Myelomzelle P3-X63.Ag8.U1 (P3U1) angewendet [Cunent Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1 (1978)]. Die Zellfusion wurde gemäß einer ursprünglichen Methode durchgeführt [Nature 256, 495 (1975)]. Es wurde somit jede der Milzzellen und P3U1 dreimal mit serumfreiem MEM gewaschen und die Milzzelle und P3U1 wurden in einem Zellzahlverhältnis von 10:1 vermischt und dann bei 800 U/min 15 Minuten lang zentrifugiert, um die Zelle auszu fällen. Nach Entfernung eines ausreichenden Überstandes wurde der Niederschlag vorsichtig pulverisiert und dann mit 0,3 ml 45% Polyethylenglycol (PEG) 6000 (KOCHLITE) vereinigt und in einem Wasserbad bei 37°C 7 Minuten lang stehen gelassen, wodurch die Zellfusion bewirkt wurde. Nach der Fusion wurde MEM in einer Rate von 2 ml/min zugegeben, bis 15 ml MEM insgesamt zugegeben worden waren und dann wurde die Mischung mit 600 U/min 15 Minuten lang zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen. Der so erhaltene Zellniederschlag wurde in mit 10% fötalem Kälberserum angereichertem GIT-Medium (WAKO PURE CHEMICAL) (GIT-10% FCS) in einer Dichte von 2 × 10⁵ P3U1-Zellen pro 1 ml suspendiert und 1 ml/Napf wurde in 192 Näpfe von 24-Napf-Mehrfachschalen (RINBRO) gegeben. Nach der Beimpfung wurden die Zellen bei 37°C in einem 5% CO₂-Gasinkubator inkubiert. Nach 24 Stunden wurde 1 ml/Napf GIT-10% FCS-Medium, das HAT enthielt (Hypoxanthin 1 × 10^–4 M, Aminopterin 4 × 10^–7 M, Thymidin 1,6 × 10^–3 M) (HAT-Medium) zugegeben, um die HAT-selektive Inkubation zu starten. Die HAT-selektive Inkubation wurde fortgesetzt, indem 1 ml des alten Mediums verworfen wurden und anschließend 1 ml HAT-Medium 3, 6 und 9 Tage nach Beginn der Inkubation zugegeben wurden. Die Proliferation eines Hybridomas wurden am 9. bis 14. Tag nach der Zellfusion festgestellt und der Überstand wurde gesammelt, wenn das Kulturmedium sich gelb färbte (etwa 1 × 10⁶ Zellen/ml) und der Antikörpertiter wurde gemäß der in Beispiel 5 beschriebenen Methode untersucht.
Als repräsentativer Fall für das Screening auf Hybridomas, die aus einer mit Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys(-NH₂)-KLH-Komplex immunisierten Maus stammen, wurden die unter Verwendung der Maus Nr. 8 erhaltenen Ergebnisse (siehe 7) in 8 gezeigt.
Anschließend wurden solche Hybridomas, die hohe Antikörpertiter aufwiesen, mit der Methode der begrenzten Verdünnung kloniert. Bei der Klonierung wurden als Feeder-Zellen Thymozyten einer BALB/C-Maus zugegeben auf 5 × 10⁵ Zellen/Napf. Nach der Klonierung wurde ein Hybridoma intraperitoneal mit einer Dosis von 1 bis 3 × 10⁶ Zellen pro Tier einer Maus (BALB/C), die vorher intraperitoneal mit 0,5 ml Mineralöl behandelt worden war, gegeben und antikörperhaltiges Ascites wurde 6 bis 20 Tage lang gesammelt.
Von dem erhaltenen Ascites wurden monoklonale Antikörper auf einer Protein-A-Säule gereinigt. Es wurden 6 bis 20 ml des Ascites mit einem gleichen Volumen eines Bindungspuffers (3,5 M NaCl, 0,05% mit NaN₃ ergänztes 1,5 M Glycin, pH 9,0) verdünnt und dann auf eine rekombinante Protein-A-Agarose-(Repligen)-Säule geladen, die vorher mit dem Bindungspuffer equilibriert worden war, und der spezifische Antikörper wurde mit einem Elutionspuffer (0,05% mit NaN₃ ergänzter 0,1 M Citratuffer, pH 3,0) eluiert. Das Effluens wurde gegen PBS 2 Tage lang bei 4°C dialysiert, durch Filtration durch ein 0,22 um Filter (Millipore) sterilisiert und bei 4°C oder –80°C aufbewahrt. Zur Bestimmung der Klasse und Unterklasse der monoklonalen Antikörper wurde ein Enzym Linked Immunosorbent Assay (ELISA) unter Verwendung einer Festphase, an die gereinigter monoklonaler Antikörper gebunden war, durchgeführt. Es wurde dazu 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,6, der 2 μg/ml Antikörper enthielt, in eine 96-NapF-Mikroplatte in Aliquots von 100 μl abgegeben, die 24 Stunden lang bei 4°C stehen gelassen wurden. Gemäß der in Beispiel 12 beschriebenen Methode wurden überschüssige Bindungsstellen in einem Napf mit BLOCKACE maskiert und dann die Klasse und Unterklasse von immobilisiertem Antikörper mit einem ELISA untersucht unter Anwendung eines isotypisierenden Kits (Mouse-TyperTM Sub-Isotyping Kit, BIORAD).
Beispiel 14
Kompetitiver Enzymimmunoassay (kompetitiver EIA)
Die Reaktionsspezifität der monoklonalen Antikörper, die unter Verwendung des Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys(-NH₂)-KLH-Komplexes als Immunogen hergestellt worden waren, wurde mit der unten beschriebenen Methode untersucht. Der Antikörpertiter jeder Lösung von monoklonalen Antikörpern wurde mit der in Beispiel 12 beschriebenen Methode bestimmt und die Antikörperkonzentration, bei der der Bindungsgrad der markierten Substanz etwa 50% des gesättigten Bindungsgrads war (etwa 30 bis 50 ng/ml) wurde bestimmt als Antikörperkonzentration, die in dem kompetitiven EIA angewendet wurde. Anschließend wurde in die in Beispiel 12 beschriebene Mikroplatte, an die Antimausimnunglobulin-Antikörper gebunden waren, 50 μl der Antikörperlösung, die auf eine vorbestimmte Konzentration mit Puffer C verdünnt worden war, 50 μl Puffer C, der 0,05% CHAPS-Lösung von Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys-NH₂ (Amidform von SEQ ID Nr. 44), das Schweineligandenpeptid (1-60) (SEQ ID Nr. 31) und Rattengalanin (SEQ ID Nr. 61) und 50 μl HRP-markiertes Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys-NH₂ (250-fach verdünnt mit Puffer C) gegeben, und dann 16 Stunden lang bei 4°C umgesetzt. Nach der Reaktion und der Wäsche mit PBS wurde die Enzymaktivität auf der festen Phase mit der in Beispiel 12 beschriebenen Methode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Reaktivität von monoklonalen Antikörpern mit dem Peptid Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Cys-NH₂, (Amidform von SEQ ID Nr. 44)

+:: (B/B₀) < 0,50
±:: 0,50 ≤ (B/B₀) < 0,80
-:: 0,80 ≤ (B/B₀) worin
B:: Gehalt von mit HRP markiertem SEQ ID Nr. 44 gebunden an den Antikörper in Gegenwart des Antigens
B₀:: Gehalt an mit HRP markiertem SEQ ID Nr. 44 gebunden an den Antikörper ohne Antigen.

Als repräsentativer Fall sind die Ergebnisse des kompetitiven EIAs des monoklonalen Antikörpers GR2-1N (IgG_2b, κ), der die höchste Reaktivität mit dem Schweineligandenpeptid (1-60) (SEQ ID Nr. 31) zeigte, in 9 gezeigt. Eindeutig zeigt sich in der Figur, dass GR2-1N, während es mit Cys-Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly (SEQ ID Nr. 44) und mit dem Schweineligandenpeptid (1-60) (SEQ ID Nr. 31) fast die gleiche Reaktivität hat, nicht mit dem Rattengalanin (SEQ ID Nr. 61) reagiert. Basierend auf der Kalibrierungskurve für GR2-1N gegen Schweineligandenpeptid (1-60) (SEQ ID Nr. 31) war der Anteil an Schweineligandenpeptid (1-60) (SEQ ID Nr. 31), der (B/B₀) = 0,5 ergab, 6 nM, 4,95 ng/Napf, wobei die Nachweisempfindlichkeit etwa 0,1 nM [(B/B₀) = 0,8] war. Der kompetitive EIA unter Anwendung von GR2-1N ermöglicht somit eine spezifische Bestimmung des Ala-Pro-Ala-His-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-tragenden Rattenligandenpeptids (SEQ ID Nr. 33), das Schweineligandenpeptid (1-60) (SEQ ID Nr. 31) oder Humanligandenpeptid (SEQ ID Nr. 44) in einem Anteil von nur etwa 0,1 nM aufweist, ohne irgendeine Kreuzreaktion mit SEQ ID Nr. X (Rattengalamin) zu zeigen.
Beispiel 15
Herstellung von Schweineligandenpeptid(1-34)(SEQ ID Nr. 11)
5 nmol Schweineligandenpeptid (1-60) wurden in 250 μl 1% Ammoniumbicarbonat, das 16% Acetonitril enthielt, zusammen mit 50 pmol Lysylendopeptidase (WAKO PURE CHEMICAL) 3,5 Stunden lang auf 37°C gehalten.
Eine Spheri-5 RP-18-Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographiesäule (BROWNLY, 2,1 mm × 30 mm) wurde zuerst mit Lösungsmittel A (0,1% Trifluoressigsäure) mit einer Durchflussrate von 300 μl/min zur Equlibrierung bei 25°C eluiert. Die Säule wurde mit der Enzymreaktionsmischung beladen und dann mit 300 μl/min 30 Minuten lang eluiert, wobei die Konzentration von Lösungsmittel B (0,1% Trifluoressigsäure/70% Acetonitril) auf 70% anstieg. Das Effluens wurde auf Basis der Extinktion bei 210 nm überwacht und die Peaks wurden manuell fraktioniert.
Die Peakfraktion, die bei 20,2 Minuten eluierte, zeigte MS-Daten von M+H⁺ 3466,5, was das fragmentierte Ligandenpeptid (1-34) des Schweineligandenpeptids (1-60) auch auf Basis der Aminosäureanalyse validierte.
Beispiel 16
Herstellung von Schweineligandenpeptid(1-30)(SEQ ID Nr. 43)
5 nmol des Schweineligandenpeptids (1-60) wurden in 250 μl 1% Ammoniumbicarbonat, das 8% Acetonitril enthielt, zusammen mit 50 pmol Endoproteinase Glu-C (Boehringer Mannheim) 6 Stunden lang auf 37°C und anschließend 13 Stunden lang auf 25°C gehalten.
Die Enzymreaktionsmischung wurde unter den gleichen Bedingungen, wie beim Schweineligandenpeptid (1-34) getrennt.
Die Peakfraktion, die bei 19,8 Minuten eluierte, zeigte MS-Daten von M+H⁺ 3167,2, was das fragmentierte Ligandenpeptid (1-30) des Schweineligandenpeptids (1-60) auch auf Basis der Aminosäureanalyse validierte.
Beispiel 17
Galaninrezeptorbindungstest unter Verwendung von [¹²⁵I]-Rattengalanin
Die wie in Stufe (1-2) oben beschrieben hergestellte Membranfraktion wurde mit 13 μg/ml (für GALR1-Membranfraktion) oder 15 μg/ml (für GALR2-Membranfraktion) in einem 50 mM Tris-Puffer (pH 7,3), der 0,1% Rinderserumalbumin (BSA), 5 mM MgCl₂, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 20 μg/ml Leupeptin, 10 μg/ml Pepstatin, 8 μg/ml E-64 enthielt, suspendiert und jeweils 0,1 ml wurden in kleine Polypropylenröhrchen (Falcon 2053) gegeben. Die so dispensierte Membranfraktion wurde mit 4 μl 5 nM [¹²⁵I]-Rattengalanin (New England Nuclear) und 1 μl eines erfinderischen Peptidsyntheseprodukts (Schweineligandenpeptid (1-60) (SEQ ID Nr. 31), dem Produkt eines begrenzten Abbaus eines erfinderischen Peptidsyntheseprodukts (Schweineligandenpeptid (1-30) (SEQ ID Nr. 43), Schweineligandenpeptid (1-34) (SEQ ID Nr. 11) oder Rattengalanin (PEPTID KENKYUSHO) (SEQ ID Nr. 61) in verschiedenen Konzentrationen (100 μM bis 100 pM Lösung in Dimethylsulfoxid) vereinigt und die Mischung wurde 60 Minuten lang bei 25°C umgesetzt. Diese Reaktionsmischung wurde mit 1,5 ml eines 50 nm Tris-Puffers (pH 7,4), der 0,05% 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propansulfonsäure (CHAPS), 0,1% BSA, 5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA enthielt, vereinigt und durch ein GF/F-Glasfaserfilter (Whatman) filtriert. Dieses Filter wurde mit 1,5 ml des gleichen Puffers gewaschen und dann auf Radioaktivität unter Verwendung eines Gammazählers untersucht.
Der in Gegenwart von 1 μl 100 μM Rattengalanin beobachtete Bindungsanteil wurde als nicht spezifische Bindung (NSB) angesehen, während der in Gegenwart von 1 μl Dimethylsulfoxid beobachtete Bindungsanteil als maximale Bindung (B₀) angesehen wurde, wodurch der Peptidgehalt IC₅₀ berechnet wurde, bei dem die maximale spezifische Bindung (B₀-NSB) um 50% gehemmt war (Tabelle 4).
Tabelle 4
Beispiel 18
Klonierung einer cDNA die Rattenligandenpeptid (1-60) codiert
Mit einer Methode, wie in Beispiel 5, wurde die Gesamt-RNA aus Rattenhypothalamus präpariert unter Verwendung von TRIZOL-Reagenz (Gibco BRL). Aus dieser Gesamt-RNA wurde Poly(A)⁺RNA gereinigt unter Verwendung einer Oligo-dT-Cellulosesäule (mRNA Purification Kit, Pharmacia). Aus dieser Poly(A)+RNA wurde eine Rattenhypothalamus-cDNA-Phagenbibliothek erstellt unter Verwendung eines ZAP-cDNA-Gigapack-III-Goldklonierungskits (Stratagene). Ein entstehender Phage (2,2 Mio. Plaque bildende Einheiten) wurde mit E. coli XL1-Blue MRF' (Stratagene) infiziert und auf 130 NZY-Mediumagarplatten geimpft, die 8 Stunden bei 37°C inkubiert wurden. Aus einem so erhaltenen E. coli-Plaque wurde ein Phage auf Hybond-N⁺- Nylonmembran (Amersham) überführt. Diese Nylonmembran wurde aufeinander folgend in 0,5 n Natriumhydroxidlösung, die 1,5 M Natriumchlorid enthielt, 0,5 M Tris-Puffer (pH 7,0), der 1,5 M Natriumchlorid enthielt, und 2 × SSC-Lösung eingetaucht und dann an der Luft getrocknet.
Die entstehende Nylonmembran wurde 24 Stunden bei 60°C in Hybridisierungspuffer (5 × SSPE, 5 × Denhardt's Lösung, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml Lachssperm-DNA) gelegt und dann 18 Stunden bei 60°C in den gleichen Hybridierungspuffer wie vorher, außer, dass er weiterhin eine Hybridisierungssonde enthielt (2,8 × 10⁶ cpm/ml) gelegt. Diese Hybridisierungssonde war das DNA-Fragment (356 Basenpaare), das mit den Primern pGALI-1F und pGAL88-1R, die unten gezeigt sind, zusammen mit dem EcoRI/BgIII-Verdaufragment von Plasmid pGR2PL6 (SEQ ID Nr. 45) als Matrize amplifiziert worden war. Für die Amplifikationsreaktion wurde die Reaktionsmischung angewendet, die durch Vermischen von 0,5 μl ExTaq (TAKARA), 10 μl beigefügtem 10 × PCR-Puffer (500 mM KCl – 25 mM MgCl₂ – 100 mM Tris-HCl, pH 8,3), 8 μl 2,5 mM dNTP-Mischung, 25 μl [α-³²P]dCTP (6000 Ci/mmol), jeweils 1 μl Primer pGAL9-3F und Primer pGAL34-8R (jeweils 10 μM), 1 μl Matrizen-cDNA und 54 μl destilliertem Wasser hergestellt wurde und die reaktion beinhaltete eine anfängliche Degeneration 30 Sekunden lang bei 94°C gefolgt von 32 Zyklen 94°C·20 Sekunden – 60°C·30 Sekunden – 72°C·30 Sekunden gefolgt von einer letzten Verlängerung 4 Minuten bei 72°C.
pGAL1-1F: 5'-ATGGCTCTGACTGTCCCTCTGATCGTTCT-3' (SEQ ID Nr.: 46)
pGAL88-lR: 5'-TGAAACCTCGTAGTTCCTGGTCGGATTCG-3' (SEQ ID Nr.: 47)
Die Nylonmembran wurde nach dieser Hybridisierungsreaktion mit einer 2 × SSC-Pufferlösung, die 0,1% SDS enthielt, bei 50°C gewaschen und dann einer Autoradiografie unter Verwendung eines Röntgenfilms (Kodak, BioMax MS) in Gegenwart eines Sensibilisierungsschirms (Belichtung 3 Tage bei –70°C) unterzogen. Ein als Ergebnis der Autoradiografie identifizierter positiver Plaque wurde isoliert und ein Phage wurde in 5 ml SM-Pufferlösung (100 mM NaCl, 8 mM MgSO₄, 0,01% Gelatine, 50 mM Tris·HCl, pH 7,5), die 0,1 ml Chloroform enthielt, extrahiert.
Ein entstehender Phage wurde wiederum mit E. coli XL1-Blue MRF' infiziert und dann auf NZY-Mediumagarplatten geimpft, die 8 Stunden bei 37°C inkubiert wurden. Aus einem so erhaltenen E. coli-Plaque wurde ein Phage auf eine Nylonmembran (Amersham, Hybond N⁺) überführt und eine Hybridisierung wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Ein einzelner positiver Klon wurde mit Autoradiografie ausgewählt und unter Verwendung einer Kapillarsäule aufgepickt. Eine Reihe gleicher Verfahren, wie oben beschrieben, wurde wiederholt, wiederum um einen vollständigen einzelnen Phagenklon zu erhalten.
Anschließend wurde ein Plasmid aus dem klonierten Phagen mit der unten beschriebenen Methode isoliert.
Eine Phagenlösung (1 μl) wurde mit E. coli XPORT (50 μl), einem Helferphagen (10 μl) und E. coli XLOLR (5 ml) vermischt und auf eine NZY-Agarplatte geimpft, die 8 Stunden bei 37°C inkubiert wurde. Eine kleine Kolonie des E. coli XLOLR, die sich in dem E. coli XPORT-Plaque gebildet hatte, wurde mit einem Zahn stocher herausgepickt und in LB-Medium, das Ampicillin und Tetracyclin enthielt, über Nacht bei 37°C inkubiert. Aus einer einzelnen Kolonie wurde E. coli XLOLR herausgepickt und einer Flüssiginkubation in LB-Medium unterzogen. Nach Abschluss der Inkubation wurde E. coli XLOLR gesammelt und ein Plasmid unter Verwendung eines Plasmidreinigungskits (QIAGENE QIAgen 8Well Ultra) gereinigt.
Ein entstehendes Plasmid wurde einer Sequenzierungsreaktion unterzogen unter Anwendung eines Dye terminator Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems, Perkin Elmer) und das Sequenzierungsreaktionsprodukt wurde interpretiert unter Verwendung einer DNA-Sequenziervorrichtung Prism 377 (Applied Biosystems, Perkin Elmer). Als Ergebnis wurde ein Plasmid pGR2RL4 mit einem 974 by DNA-Fragment (SEQ ID Nr. 39), das das gesamte Peptid des Rattenliganden (1-60) codierte, erhalten. E. coli TOP10, der mit diesem Plasmid transformiert war, wurde als TOP 10/pGR2RL4 bezeichnet.
Beispiel 19
Klonierung von Humanligandenpeptid (1-60)
Eine cDNA-Bibliothek von menschlichem Gehirn wurde hergestellt aus Humanhirnpoly(A)⁺RNA (CLONTECH) unter Verwendung eines ZAP-cDNA-Synthesekits (STRATAGENE). Die sich ergebende cDNA wurde als Matrize angewendet, um eine PCR durchzuführen unter Verwendung der folgenden Primer F/R120 und R/R120.
F/R120: 5'-AGGCTGGACCCTCAATAGTGCTGGTTAC-3' (SEQ ID Nr.: 48)
R/R120: 5'-CCATCTATGGCCTTCCACAGGTCTAGGA-3' (SEQ ID Nr.: 49)
Die PCR-Reaktionsmischung wurde hergestellt, indem 0,5 μl Taq (TAKARA), 5 μl beigefügter 10 × PCR-Puffer (500 mM KCl-25 mM MgCl₂-100 mM Tris-HCl, pH 8,3), 4 μl 2,5 mM dNTP-Mischung, 3 μl 25 mM MgCl₂, jeweils 0,25 μl Primer F/R120 und R/R120 (jeweils 100 μM), 1 μl Matrizen-cDNA und 36 μl destilliertes Wasser vermischt wurden und einer anfänglichen Degeneration 30 Sekunden bei 94°C und anschließend 35 Zyklen 94°C·30 Sekunden – 60°C·30 Sekunden – 72°C·30 Sekunden gefolgt von einer letzten Verlängerung 10 Minuten bei 72°C unterzogen wurden. Ein entstehendes DNA-Fragment wurde kloniert unter Verwendung eines TOPO TA Klonierungskits (Invitrogen) mit der in der beigefügten Anleitung beschriebenen Methode. Die klonierte DNA-Sequenz wurde mit der in Beispiel 5 beschriebenen Methode interpretiert und die in SEQ ID Nr. 50 dargestellte Sequenz wurde erhalten.
AGGCTGGACC CTCAATAGTG CTGGTTACCT TCTGGGTCCC GTCCTCCACC TTCCCCAAAT 60
GGGTGACCAA GACGGAAAGA GGGAGACAGC CCTTGAGATC CTAGACCTGT GGAAGGCCAT 120
AGATGG 126
(SEQ ID Nr. 50)
Aus der sich ergebenden Sequenz wurden Primer 1F/H120 (SEQ ID Nr. 51) und 1R/H120 (SEQ ID Nr. 52) hergestellt und den unten beschriebenen 5'-RACE und 3'-RACE-Versuchen unterzogen.
1F/H120: 5'-CAAATGGGTGACCAAGACGGAAAGAGGG-3' (SEQ ID Nr.: 51)
R/H120 : 5'-GGTCTAGGATCTCAAGGGCTGTCTCCCT-3' (SEQ ID Nr.: 52)
Die Reaktionsmischung für die 5'-RACE und 3'-RACE-Versuche wurde hergestellt, indem 0,5 μl Taq (TAKARA), 5 μl des beigefügten 10 × PCR-Puffers (500 mM KCl-25 mM MgCl₂-100 mM Tris-HCl, pH 8,3), 4 μl 2,5 mM dNTP-Mischung, 3 μl 25 mM MgCl₂, 1 μl 10 μM Primer F/R120 (für 3'-RACE) oder 10 μM Primer R/R120 (für 5'-RACE), 1 μl 10 μM Primer AP1 (dem Marathon-Ready cDNA-Kit von CLONTECH beigefügt), 5 μl Matrizen-cDNA (CLONTECH, Marathon-Ready cDNA-Kit, Humanhypothalamus) und 31 μl destilliertes Wasser vermischt wurden. Die Reaktion beinhaltete eine anfängliche Degeneration 60 Sekunden lang bei 94°C, gefolgt von 5 Zyklen mit 94°C 30 Sekunden lang – 72°C·120 Sekunden, gefolgt von 5 Zyklen bei 94°C·30 Sekunden – 70°C·120 Sekunden, gefolgt von 25 Zyklen mit 94°C·30 Sekunden – 68°C·120 Sekunden, gefolgt von einer letzten Verlängerung 10 Minuten bei 68°C.
Anschließend wurde eine geschachtelte PCR durchgeführt unter Verwendung der Reaktionslösung der oben beschriebenen PCR als Matrize.
Die Reaktionsmischung wurde hergestellt, indem 0,5 μl Taq (TAKARA), 5 μl des beigefügten 10 × PCR-Puffers (500 mM KCl-25 mM MgCl₂-100 mM Tris-HCl, pH 8,3), 4 μl 2,5 mM dNTP-Mischung, 3 μl 25 mM MgCl₂, 1 μl 10 μM Primer IF/H120 (für 3'-RACE) oder 10 μM Primer 1R/H120 (für 5'-RACE), 1 μl 10 μM Primer AP2 (dem Marathon-Ready cDNA-Kit von CLONTECH beigefügt), 5 μl Matrizen-DNA (50-fach verdünnte PCR-Reaktionslösung) und 31 μl destilliertes Wasser vermischt wurden. Die Reaktion beinhaltete eine anfängliche Degeneration 60 Sekunden bei 94°C, gefolgt von 5 Zyklen mit 94°C·30 Sekunden – 72°C·120 Sekunden, gefolgt von 5 Zyklen mit 94°C·30 Sekunden – 70°C·120 Sekunden, gefolgt von 25 Zyklen mit 94°C·30 Sekunden – 68°C·120 Sekunden, gefolgt von einer letzten Verlängerung 10 Minuten bei 68°C.
Ein entstehendes DNA-Fragment wurde unter Verwendung eines TOPO-TA-Klonierungskits (Invitrogen) gemäß der in der beigefügten Anleitung beschriebenen Methode kloniert. Die klonierte DNA-Sequenz wurde interpretiert mir der in Beispiel 5 beschriebenen Methode (im Abschnitt Schweine-cDNA-Klonierung), um die Sequenzdaten am 5'- und 3'-Ende zu erhalten. Basierend auf den Sequenzdaten wurden die folgenden Primer 1F/H470 und 1R/H450 hergestellt.
1F/H470: 5'-GAGGAGCCAGAGAGAGCTGCGGAGAG-3' (SEQ ID Nr.: 53)
1R/H470: 5'-GAGCTGGAGAAGAAGGATAGGAACAGGG-3' (SEQ ID Nr.: 54)
Diese Humanhirn-cDNA-Bibliothek wurde als Matrize angewendet, um eine PCR durchzuführen unter Verwendung der Primer F/H450 und R/H450. Die PCR-Reaktionsmischung wurde hergestellt, indem 0,5 μl Pfuturbo-DNA-Polymerase (Stratagene), 5 μl des beigefügten 10 × PCR-Puffers (500 mM KCl-25 mM MgCl₂-100 mM Tris-HCl, pH 8,3), 4 μl 2,5 mM dNTP-Mischung, jeweils 2,5 ml 10 μM Primer F/H470 und R/H470, 0,5 μl cDNA vom gesamten menschlichen Hirn als Matrize und 35 μl destilliertes Wasser vermischt wurden. Die Reaktion beinhaltete eine anfängliche Degeneration 30 Sekunden bei 94°C, gefolgt von 35 Zyklen mit 94°C·30 Sekunden – 70°C·5 Minuten, gefolgt von einer letzten Verlängerung 10 Minuten bei 72°C. Ein entstehendes DNA-Fragment wurde kloniert unter Verwendung eines pPCR-Script Amp 5K(⁺)-Vektors (Stratagene) gemäß der in der beigefügten Anleitung beschriebenen Methode. Die klonierte DNA-Sequenz wurde mit der in Beispiel 5 beschriebenen Methode (im Abschnitt Schweine-cDNA-Klonierung) interpretiert, um pGR2HL14 mit einem 473-bp-DNA-Fragment (SEQ ID Nr. 40), das das gesamte menschliche Ligandenpeptid (1-60) codierte, zu erhalten.
Ein E. coli TOP10, der mit diesem Plasmid transformiert war, wurde als TOP10/pGR2HL14 bezeichnet.
Beispiel 20
Herstellung des Strukturgens von Schweineligandenpeptid (1-60) (siehe 10)
Ein Strukturgen eines erfinderischen (1-60) Peptids wurde mit einer PCR aus Plasmid pGR2PL6, das in Beispiel 5 erhalten worden war, unter Verwendung von Primer 1: 5'-AGCATATGGCTCCGGTCCACAGG-3' (SEQ ID Nr. 55, KIKKOTECH) mit einer Nde-I-Schnittstelle und einem Methionin stromaufwärts benachbart dem Strukturgen und Primer 2: 5'-CTGGATCCTCAGGAGGCCAACTGAGAC-3' (SEQ ID Nr. 56, GLINER Japan) mit einem Stoppcodon und einer stromabwärts benachbarten BamH-I-Schnittstelle, amplifiziert. Dieses Gen wurde in einen pCRII-TOPO-Vektor ligiert unter Verwendung eines TOPO-TA-Klonierungskits (Invitrogen), um pCRII/GAL herzustellen. Dieses Plasmid wurde in eine TOP10 One Shot-kompetente Zelle transformiert, die auf mit X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactose) beschichtetes LB-Agarmedium (1% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid, 2% Agar), das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, geimpft wurde und einen Tag lang bei 37°C inkubiert wurde und dann wurde ein Transformant ausgewählt auf Basis der Tetracyclinresistenz und der β-Galactosidaseaktivität. Dieser Transformant wurde über Nacht auf LB-Medium (1% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid), das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, inkubiert und dann wurde ein Plasmid gewonnen unter Verwendung eines QIAprep8 Miniprep-Kits (QIAGENE). Auch unter Verwendung von Primer 3: 5'-CAGCCCTCGGCATCCTGGACC-3' (SEQ ID Nr. 57, GLINER Japan) und Primer 4: 5'-GGTCCAGGATGCCGAGGGCTG-3' (SEQ ID Nr. 58, GLINER Japan) wurde eine ortsspezifische Variation (Quick Change, STRATAGENE) induziert, um pCRII/GALdesBam herzustellen, bei dem eine Ava-I-Erkennungsstelle benachbart dem BamH I in dem Strukturgen eines erfinderischen Schweineligandenpeptids (1-60) deletiert worden war. Die Basensequenz der Strukturgenregion eines erfinderischen Schweineligandenpeptids (1-60) in dem Plasmid wurde verifiziert unter Verwendung einer DNA-Sequenziervorrichtung von Applied Biosystems Modell 377. 2 μg pCRII/GALdesBam, dessen Basensequenz sichergestellt worden war, wurde mit Nde I gespalten und die Enden unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase geglättet (DNA Blunting Kit, TAKARA). Nach einer Spaltung mit EcoR V gefolgt von einer Elektrophorese auf einem 3% Agarosegel wurde ein etwa 200 by DNA-Fragment extrahiert unter Verwendung von QIAquick Gelextraktionskit (QIAGENE) und in 25 μl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA) gelöst.
Beispiel 21
Herstellung eines Schweineligandenpeptid (1-60) exprimierenden Plasmids
a) Herstellung eines Fusionsprotein exprimierenden Vektors (siehe 11)
1 μg Plasmid pTB960-11, das in einem Transformanten Escherichia coli MM294(DE3)/pTB960-11 vorhanden war, der beim National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of the Ministry of International Trade and Industry (NIBH) am 15. Juni 1998 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6388 und beim Institute for Fermentation, Osaka (IFO) am 25. Juni 1997 mit der Hinterlegungsnummer IFO 16100 hinterlegt worden war, wurde mit Xba I und Ava I gespalten und dann einer 1% Agarosegelelektrophorese unterzogen und ein DNA-Fragment mit etwa 4,4 kbp wurde extrahiert unter Verwendung von QIAquick Gelextraktionskit (QIAGENE) und in 50 μl TE-Puffer gelöst. Jeweils 1 μl des deletierten Teils eines hFGF-Mutein-CS23-Strukturgens und der synthetischen DNAs (5'-CTAGACATATGCCAGCATTGC-3' (SEQ ID Nr. 59) und 5'-TCGGGCAATGCTGGCATATGT-3'- (SEQ ID Nr. 60), beide von GLINER Japan), die entwickelt worden waren, um eine Insertion stromaufwärts benachbart einer Nde-I-Schnittstelle und eines Startcodons zu bewirken, wurden in 100 μl einer Phosphorylierungslösung [50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreitol, 0,1 mM Spermidin, 0,1 mM EDTA, 1 mM ATP, 10 Einheiten T4-Polynucleotidkinase (NIPPON GENE)] bei 37°C 1 Stunde lang umgesetzt, um eine Phosphorylierung am 5'-Ende zu bewirken. Nach Abschluss der Reaktion wurde eine Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung durchgeführt. Der Niederschlag wurde in 50 μl TE-Puffer gelöst, der dann 10 Minuten auf 80°C gehalten wurde und dann abkühlen gelassen wurde, wodurch eine Reassoziierung bewirkt wurde. Das Xba-I-Ava-I-DNA-Fragment und die Reassoziierungslösung wurden ligiert unter Verwendung des Takara DNA Ligation Kit Ver 2 (TAKARA). Es wurden somit 1 μl Xba-I-Ava-I-DNA-Fragment und 1 μl Reassoziierungslösung mit 3 μl destilliertem Wasser und 5 μl Ligation Solution I vereinigt und 30 Minuten bei 16°C umgesetzt. 10 μl dieser Ligationslösung wurden verwendet, um E. coli JM109-kompetente Zellen (TOYOBO) zu transformieren, die dann auf LB-Agarmedium, das 10 μg/ml Tetracyclin enthielt, geimpft wurden und dann wurde eine gebildete tetracyclinresistente Kolonie ausgewählt. Dieser Transformant wurde auf LB-Medium über Nacht inkubiert und dann ein Plasmid hergestellt unter Verwendung eines QIAprep8 Miniprep-Kits (QIAGENE). Dieses Plasmid wurde mit Nde I gespalten und einer 1% Agarosegelelektrophorese unterzogen, um die Bildung einer neuen Nde-I-Schnittstelle sicherzustellen, wodurch Plasmid pTBNde erhalten wurde.
Anschließend wurde 1 μg Plasmid pTBNde mit PstI gespalten, die Enden mit T4-DNA-Polymerase geglättet (DNA Blunting Kit, TAKARA) und dann einer Phenol-Chloroform-Extraktion und einer Ethanolfällung unterzogen. Der so erhaltene Niederschlag wurde in 10 μl TE-Pufferlösung gelöst, mit Nde I gespalten, einer 3% Agarosegelelektrophorese unterzogen, um ein DNA-Fragment mit etwa 470 by zu erhalten, das unter Verwendung von QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGENE) extrahiert wurde und in 25 μl TE-Puffer gelöst wurde.
1 μl eines Plasmids pTCII, das in einem Transformanten Escherichia coli MM294(DE3)/pTCIId23-MPIF1 enthalten war, der beim National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of the Ministry of International Trade and Industry (NIBH) am 24. November 1998 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-6582 und beim Institute for Fermentation, Osaka (IFO) am 27. Oktober 1998 mit der Hinterlegungsnummer IFO 16212 hinterlegt worden war, wurde mit Bsm I und Pvu II gespalten und einer 1% Agarosegelelektrophorese unterzogen, um ein DNA-Fragment mit etwa 3,7 kbp zu erhalten, das unter Verwendung von QIAquick Gel Extraction Kit extrahiert wurde und in 25 μl TE-Puffer gelöst wurde. Bei diesem DNA-Fragment wurden mit T4-DNA-Polymerase die Enden geglättet unter Verwendung eines DNA Blunting Kits und dann ligiert. Nach der Ligierung gefolgt von einer Phenol-Chloroform-Extraktion gefolgt von einer Ethanolausfällung wurde die Mischung in 10 μl TE-Puffer gelöst. Diese Lösung wurde mit BamH I gespalten und die Enden mit T4-DNA-Polymerase geglättet und dann mit Nde I geschnitten, einer 1% Agarosegelelektrophorese unterzogen, um ein DNA-Fragment mit etwa 3,7 kbp zu erhalten, das unter Verwendung von QIAquick Gel Extraction Kit extrahiert wurde und in 50 μl TE-Puffer gelöst wurde. 4 μl eines Nde-I-Blunt-DNA-Fragments mit 470 by und 1 μl eines Nde-I-Blunt-DNA-Fragments mit 3,7 kbp, wie oben beschrieben, wurden mit 5 μl Ligationslösung I vereinigt und bei 16°C 30 Minuten lang umgesetzt. 10 μl dieser Ligationslösung wurden verwendet, um E. coli JM109-kompetente Zellen (TOYOBO) zu transformieren, die auf LB-Agarmedium, das 10 μg/ml Tetracyclin enthielt, geimpft wurden und dann wurde eine tetracyclinresistente Kolonie, die sich gebildet hatte, ausgewählt. Dieser Transformant wurde über Nacht auf LB-Medium inkubiert und dann wurde ein Plasmid hergestellt unter Verwendung eines QIAprep8 Miniprep-Kits und als Vektor pTFC bezeichnet, um ein Fusionsprotein zu exprimieren.
b) Konstruktion eines Schweineligandenpeptids (1-60) exprimierenden Stamms (siehe 12)
1 μg des Vektors pTFC zur Expression eines Fusionsproteins wurde mit BamH I geschnitten und die Enden mit T4-DNA-Polymerase geglättet (DNA Blunting Kit, TAKARA) und dann einer 1% Agarosegelelektrophorese unterzogen, um ein DNA-Fragment mit etwa 4,2 kbp zu erhalten, das unter Verwendung von QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGENE) extrahiert wurde und in 50 μl TE-Puffer gelöst wurde. Dieses Fragment und ein in Beispiel 20 hergestelltes erfinderisches Peptidstrukturgen wurden unter Verwendung von Takara DNA Ligation Kit Ver 2 (TAKARA) ligiert. Es wurden somit 1 μl einer Lösung von mit BamH I geschnittenem geglätteten pTFC und 4 μl einer Lösung mit erfinderischem Peptidstrukturgen vermischt und dann mit 5 μl Ligierungslösung I vereinigt und 30 Minuten lang bei 16°C umgesetzt. 10 μg/ml dieser Ligierungslösung wurden verwendet, um E. coli JM109-kompetente Zellen (TOYOBO) zu transformieren, die auf LB-Agarmedium, das 10 μg/ml Tetracyclin enthielt, geimpft wurden und dann 1 Tag lang bei 37°C inkubiert wurden und dann wurde eine tetracyclinresistente Kolonie, die sich gebildet hatte, ausgewählt.
Dieser Transformant wurde auf LB-Medium über Nacht inkubiert und dann ein Plasmid gesammelt unter Verwendung eines QIAprep8 Miniprep Kits (QIAGENE) und als das erfinderische Peptid exprimierendes Plasmid pTFCGAL bezeichnet. Die Basensequenz des Strukturgenteils eines Fusionsproteins dieses Plasmids wurde verifiziert unter Verwendung einer Applied Biosystems Modell 377 DNA-Sequenziervorrichtung. Dieses Expressionsplasmid pTFCGAL wurde in E. coli MM294(DE3) transformiert und auf LB-Agarmedium, das 10 μg/ml Tetracyclin enthielt, geimpft, 1 Tag lang bei 37°C inkubiert und dann wurde ein tetracyclinresistenter Transformantenstamm selektiert, wodurch ein das erfinderische Peptid exprimierender Stamm MM294(DE3)/pTFCGAL erhalten wurde. Dieser transformierte E. coli-Stamm MM294(DE3)/pTFCGAL wurde beim National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of the Ministry of International Trade and Industry (NIBH) am 10. März 1999 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-6678 hinterlegt. Er wurde auch beim Institute for Fermentation, Osaka (IFO) am 26. Februar 1999 mit der Hinterlegungsnummer IFO 16260 hinterlegt.
Beispiel 22
Inkubation eines Schweineligandenpeptid (1-60) exprimierenden Stamms
Der erfinderisches Peptid exprimierende Stamm MM294(DE3)/pTFCGAL, der in Beispiel 21 erhalten wurde, wurde unter Schütteln in 1 1 LB-Medium, das 5 mg/l Tetracyclin enthielt, 16 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Kulturflüssigkeit wurde in einen 50-l-Fermenter, der mit 20 l Hauptfermentationsmedium (1,68% Natriummonohydrogenphosphat, 0,3% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1% Ammoniumchlorid, 0,05% Natriumchlorid, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,0005% Thiaminchlorid, 1,5% Glucose, 1,0% Casaminosäure, 1,0% Hefeextrakt) beschickt war, überführt und dann bei 37°C unter Rühren mit 200 U/min und bei einer Belüftung von 20 l/min inkubiert. Als die Trübheit der Kulturflüssigkeit etwa 1200 CRET-Einheiten war, wurde Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) auf eine Endkonzentration von 23,8 mg/l zugegeben. 30 und 150 Minuten nach der Zugabe von IPTG wurden 0,75% Glucose zugegeben und die Inkubation bis 10 Stunden nach dem Start der Inkubation fortgesetzt. Die Kulturflüssigkeit wurde mit 5.000 U/min 30 Minuten lang zentrifugiert, um etwa 830 g Bakterienzellen zu erhalten.
Beispiel 23
Reinigung von Schweineligandenpeptid (1-60)
200 g der in Beispiel 22 erhaltenen Bakterienzellen wurden in 600 ml 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), der 150 mM Natriumchlorid, 0,1 mM Amidinophenylmethansulfonylfluoridhydrochlorid (APMSF) und 0,1 mM EDTA enthielt, suspendiert, mit Ultraschall (BRANSON SONIFIER MODEL 450) behandelt, zentrifugiert (10 Minuten lang 10.000 U/min), um den Überstand abzutrennen, wodurch Einschlusskörper erhalten wurden. Diese Einschlusskörper wurden in 60 ml destilliertem Wasser suspendiert, mit 140 ml Ameisensäure vereinigt, um die Auflösung zu bewirken, und dann wurde die Spaltung an der Peptidbindung an der C-terminalen Seite des Methionins, das das Fusionsprotein CS23 mit dem erfinderischen Schweineligandenpeptid (1-60) ligierte, durchgeführt durch Zugabe von 2 g Bromcyan gefolgt von einer 24-stündigen Behandlung bei Raumtemperatur. Nach Abschluss der Reaktion wurde die Lösung gegen destilliertes Wasser über Nacht dialysiert und zentrifugiert (10 Minuten lang 10.000 U/min). Der Überstand wurde über Nacht gegen 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), dessen pH-Wert mit Salzsäure auf 6,0 eingestellt war, dialysiert, zentrifugiert (10 Minuten lang 10.000 U/min), um etwa 400 ml Überstand zu erhalten. Dieser Überstand wurde mit 10 ml/min auf CM-TOYOPEARL 650 M (3,0 cm ID × 10 cm L, TOSOH) aufgegeben, die mir 50 mM Natriumacetatpuffer (pH 6,0) equilibriert worden war, und nach sorgfältigem Waschen mit der Equilibrierungslösung mit einem stufenweisen Gradienten von 0 bis 100% Lösungsmittel B (50 mM Natriumacetatpuffer + 1 M Natriumchlorid, pH 6,0) eluiert, wodurch eine Fraktion erhalten wurde, die erfinderisches Schweineligandenpeptid (1-60) enthielt. Ein Drittel des Volumens dieser Fraktion wurde mit 5 ml/min auf C4P-50 (2,15 cm ID × 30 cm L, SHOWADENKO), die mit 0,1% Trifluoressigsäure equilibriert worden war, aufgetragen und mit einem stufenweisen Gradienten von 33 bis 43% Lösungsmittel B (80% Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure) eluiert. Die verbleibenden zwei Drittel des Volumens wurden dem gleichen Verfahren unterzogen, um eine Fraktion zu sammeln, die das erfinderische Schweineligandenpeptid (1-60) enthielt, die dann lyophilisiert wurde, was 67 mg eines gereinigten erfinderischen Schweineligandenpeptids (1-60) lieferte.
a) Analyse mit SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Das gereinigte erfinderische Schweineligandenpeptid (1-60) wurde in 0,0625 Tris-HCl (pH 6,8), das 2% SDS, 10% Glycerin, 5% 2-Mercaptoethanol und 0,001% Bromphenolblau enthielt [Laemmli, UK: Nature, 227, 680 (1979)], gelöst, 3 Minuten lang zum Sieden erhitzt und dann einer Elektrophorese auf MULTIGEL 15/25 (DAIICHI KAGAKU YAKUHIN) unterzogen. Das Gel wurde nach der Elektrophorese mit RAPID CBB KANTO (KANTO KAGAKU) gefärbt, was eine einzelne Bande zeigte (siehe 13)
b) Analyse der Aminosäurezusammensetzung
Das gereinigte erfinderische Schweineligandenpeptid (1-60) wurde einer Gasphasenhydrolysierung mit 6 n Salzsäure, die 1% Phenol enthielt, bei 110°C 24 und 48 Stunden lang unterzogen und dann die Aminosäurezusammensetzung untersucht unter Verwendung einer Aminosäureanalysevorrichtung (HITACHI Modell L-8500A Amino Acid Analyzer). Als Ergebnis wurde eine Übereinstimmung mit der aufgrund der cDNA-Basensequenz angenommenen Aminosäuresequenz beobachtet, wie Tabelle 5 zeigt.
Tabelle 5 Analyse der Aminosäurezusammensetzung
c) Sequenzierungsanalyse der N-terminalen Aminosäuren
Die N-terminale Aminosäuresequenz wurde bestimmt unter Verwendung einer Gasphasenproteinsequenziervorrichtung (APPLIED BIOSYSTEMS, Modell 477A). Als Ergebnis wurde die Übereinstimmung mit der aufgrund der cDNA-Basensequenz angenommenen Aminosäurezusammensetzung festgestellt, wie sich aus Tabelle 6 ergibt.
Tabelle 6 N-terminale Aminosäuresequenzierung
d) Analyse der C-terminalen Aminosäure
Das gereinigte erfinderische Schweineligandenpeptid (1-60) wurde einer Gasphasenhydrolysierung mit wasserfreiem Hydrazin 3,5 Stunden bei 100°C unterzogen und dann das C-Ende untersucht unter Verwendung einer Aminosäureanalysevorrichtung (HITACHI Modell L-8500A Amino Acid Analyzer). Als Ergebnis wurde eine Übereinstimmung mit der auf der cDNA-Basensequenz basierenden Aminosäure festgestellt, wie sich aus Tabelle 7 ergibt.
Tabelle 7 C-terminale Aminosäure
Beispiel 24
Aufnahmetest
Das dritte Ventrikel (AP: –7,1, L: 0,0, H: 2,0 mm) einer männlichen Wistar-Ratte (8W) wurde unter Anästhesie mit Pentobarbital mit einer Führungskanüle versehen. Nach diesem chirurgischen Eingriff wurde das Tier 1 Woche sich erholen gelassen vor einem Aufnahmetest. Das Tier wurde bei einem Licht/Dunkelzyklus von 12 Stunden (Licht: 8:00 bis 20:00) gehalten und der Aufnahmetest wurde um 16:00 gestartet. Der Ratte wurde ohne Anästhesie ohne Einschränkung eine Mikroinjektionskanüle eingesetzt, durch die sie mit Schweinepeptid (1-60) (SEQ ID Nr. 31) gelöst in PBS oder nur mit PBS mit 2,5 μl/min 4 Minuten lang behandelt wurde. 1 Minute nach Abschluss der Behandlung wurde die Mikroinjektionskanüle entfernt und das Tier erhielt freien Zugang zu Futter. Das innerhalb von 90 Minuten nach Abschluss der Behandlung aufgenommene Futter wurde bestimmt und als Futterverbrauch gezeigt (14).
Industrielle Anwendbarkeit
Ein Peptid der Erfindung oder ein Vorläufer davon, ein Amid oder Ester oder ein Salz davon hat die Fähigkeit, einen Galaninrezeptor zu aktivieren. Es kann somit für die Entwicklung eines pharmazeutischen Mittels mit geringen Nebenwirkungen verwendet werden, z.B. als ein die Funktion im Hypothalamus, der Hirnanhangdrüse, dem Uterus, den Nieren, der Prostata oder den Skelettmuskeln regulierendes Mittel, wo der Galaninrezeptor in großer Menge vorhanden ist.
Die Verwendung eines erfinderischen Peptids oder eines Vorläufers davon, eines Amids oder Esters oder eines Salzes davon ermöglicht ein Screenen auf eine Verbindung, die die Bindungsaktivität an den Galaninrezeptor verändert.
Sequenzprotokoll

Claims

Peptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 35 dargestellt ist, und mit der Fähigkeit, an ein Rezeptorprotein zu binden, das eine Aminosäuresequenz, die identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 dargestellt, oder eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von 90 bis 99,9% mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 dargestellt, aufweist, oder ein Vorläufer davon, ein Amid oder Ester oder ein Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 35 dargestellt, und mit der Fähigkeit, ein Rezeptorprotein zu aktivieren, das eine Aminosäuresequenz, die identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 dargestellt, oder eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von 90 bis 99,9% mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 dargestellt, aufweist, oder ein Vorläufer davon, ein Amid oder Ester oder ein Salz davon.
Peptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 36 dargestellt, und mit der Fähigkeit, an ein Rezeptorprotein zu binden, das eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 dargestellt, oder eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von 90 bis 99,9% mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 dargestellt, aufweist, oder ein Vorläufer davon, ein Amid oder Ester oder ein Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, wobei das Peptid ein Peptid ist, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch mit einer Aminosäuresequenz ist, die in SEQ ID Nr. 11, 12, 15, 16 oder 43 dargestellt ist, oder ein Vorläufer davon, ein Amid oder Ester, oder ein Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, wobei das Peptid ein Peptid ist, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 11, 12, 15, 16 oder 43 dargestellt ist und mit einem Molekulargewicht von 5.000 bis 10.000, oder ein Vorläufer davon, ein Amid oder Ester oder ein Salz davon.
Peptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, wobei das Peptid ein Peptid ist, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 17, 31, 33 oder 34 dargestellt ist, oder ein Vorläufer davon, ein Amid oder Ester oder ein Salz davon.
Vorläufer eines Peptids nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, wobei der Vorläufer ein Peptid ist, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 29 dargestellt, oder ein Amid oder Ester oder ein Salz davon.
Vorläufer eines Peptids nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, der eine Aminosäuresequenz aufweist, wie in SEQ ID Nr. 30, 37 oder 38 dargestellt, oder ein Amid oder Ester, oder ein Salz davon.
DNA, die eine DNA enthält, die eine Basensequenz enthält, die ein Peptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 3 codiert.
DNA nach Anspruch 9, die ein Peptid codiert mit einer Aminosäuresequenz, die identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 31, 33 oder 34 dargestellt.
DNA nach Anspruch 10 mit einer Basensequenz, wie in SEQ ID Nr. 32, 39 oder 40 dargestellt.
DNA enthaltend eine DNA, die eine Basensequenz aufweist, die einen Vorläufer eines Peptids nach Anspruch 1 oder Anspruch 3 codiert mit einer Aminosäuresequenz, die identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 29, 30, 37 oder 38 dargestellt.
DNA nach Anspruch 12, die eine DNA aufweist, die eine Basensequenz aufweist, die durch SEQ ID Nr. 27, 28, 41 oder 42 dargestellt wird.
Rekombinanter Vektor enthaltend eine DNA nach Anspruch 9.
Nicht menschlicher Transformant, der mit dem rekombinanten Vektor nach Anspruch 14 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach Anspruch 1 oder Anspruch 3 oder eines Vorläufers davon, des Amids oder Esters, oder eines Salzes davon, das beinhaltet, dass der Transformant nach Anspruch 15 kultiviert wird und ein Peptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 3 erzeugt wird.
Antikörper für ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33, SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44 dargestellt ist.
Diagnostisches Mittel enthaltend einen Antikörper nach Anspruch 17.
Pharmazeutisches Mittel enthaltend ein Peptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 3 oder einen Vorläufer davon, ein Amid oder einen Ester, oder ein Salz davon.
Pharmazeutisches Mittel nach Anspruch 19, das ein die Gedächtnisfunktion verbesserndes Mittel, ein den Appetit regelndes Mittel, ein die Gebärmutterfunktion regulierendes Mittel, ein die Nierenfunktion regulierendes Mittel, ein die Prostatafunktion regulierendes Mittel, ein die Hodenfunktion regulierendes Mittel oder ein die Skelettmuskelfunktion regulierendes Mittel ist.
Verfahren zum Screenen eines Agonisten oder Antagonisten für ein Rezeptorprotein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch oder im Wesentlichen identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3 dargestellt ist, das beinhaltet, dass ein Peptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 3 oder ein Vorläufer davon, ein Amid oder Ester, oder ein Salz davon verwendet wird.
Peptid enthaltend eine Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. l 1, SEQ ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 16, SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 35, SEQ ID Nr. 36, SEQ ID Nr. 43, SEQ ID Nr. 44 dargestellt ist, oder ein Vorläufer davon, ein Amid oder Ester oder ein Salz davon.
Peptid, das eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 36 dargestellt, aufweist und mit der Fähigkeit, ein Rezeptorprotein zu binden, das eine Aminosäuresequenz aufweist, wie in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 dargestellt, oder ein Vorläufer davon, ein Amid oder Ester oder ein Salz davon.
Peptid, das (i) eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34 dargestellt, (ii) eine Aminosäuresequenz, die als Ergebnis der Deletion von 1 bis 7 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34 dargestellt, gebildet wird, (iii) eine Aminosäuresequenz, die als Ergebnis der Addition von 1 bis 20 Aminosäuren an die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34 dargestellt, gebildet wird, oder (iv) eine Aminosäuresequenz, die als Ergebnis der Substitution von 1 bis 7 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 33 oder SEQ ID Nr. 34 dargestellt, gebildet wird, aufweist mit (i) der Fähigkeit, an ein Rezeptorprotein zu binden, das eine Aminosäuresequenz, die identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 dargestellt, oder eine Aminosäuresequenz aufweist mit einer Homologie von 90 bis 99,9% mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 dargestellt, oder (ii) der Fähigkeit, das Rezeptorprotein zu aktivieren, oder ein Vorläufer davon, ein Amid oder Ester oder ein Salz davon.