DE60222124T2 - Screening-verfahren - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Screenen von Arzneimitteln (Appetitanregungsmittel, Appetitzügler usw.) unter Verwendung eines Rezeptors und eines Polypeptids, das spezifisch an den Rezeptor binden kann, Verbindungen, die durch das Screening-Verfahren erhältlich sind, und dergleichen.
  • STAND DER TECHNIK
  • Wichtige biologische Funktionen, einschließlich Aufrechterhaltung der Homöostasie in vivo, Reproduktion, Entwicklung von Individuen, Metabolismus, Wachstum, Kontrolle des Nerven-, Zirkulations-, Immun-, Verdauungs- und Stoffwechselsystems, sensorische Anpassung usw., werden durch Zellen reguliert, die endogene Faktoren empfangen, wie verschiedene Hormone und Neurotransmitter, oder Sinnesstimulation, wie Licht oder Geruch, über spezifische Rezeptoren, die auf Zellmembranen vorliegen, die für diese Faktoren oder Stimulation reserviert sind und mit ihnen interagieren. Viele von diesen Rezeptoren für Hormone oder Neurotransmitter werden durch diese funktionelle Regulierung an Guanin-Nucleotid-bindende Proteine gekoppelt (hierin nachstehend manchmal nur als G-Proteine bezeichnet) und sind durch Entwickeln einer Vielzahl von Funktionen durch Vermittlung der intrazellulären Signaltransduktion über die Aktivierung der G-Proteine gekennzeichnet. Außerdem verfügen diese Rezeptorproteine über sieben gemeinsame Transmembrandomänen. Basierend auf dem Vorhergehenden werden diese Rezeptoren daher gemeinsam als G-Protein-gekoppelte Rezeptoren oder sieben Transmembranrezeptoren bezeichnet. An sich ist es bekannt, daß verschiedene Hormone oder Neurotransmitter und ihre Rezeptorproteine vorliegen und miteinander interagieren, um wichtige Rollen bei der Regulierung der biologischen Funktionen zu spielen. Jedoch ist es oftmals unklar, ob irgendwelche anderen unbekannten Substanzen (Hormone, Neurotransmitter usw.) und Rezeptoren für diese Substanzen vorliegen.
  • In jüngsten Jahren beschleunigten gesammelte Sequenzinformationen von menschlicher genomischer DNA oder aus verschiedenen menschlichen Geweben abgeleiteter cDNA bei zu fälligem Sequenzieren und schnellem Fortschritt in der Genanalysetechnologie die Untersuchung des Humangenoms. Basierend auf dem Vorhergehenden wurde aufgeklärt, daß es viele Gene gibt, von denen angenommen wird, daß sie Proteine mit unbekannten Funktionen kodieren. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren haben nicht nur sieben Transmembrandomänen, sondern viele gemeinsame Sequenzen liegen in ihren Nukleinsäuren oder Aminosäuren vor. Daher können sie klar als G-Protein-gekoppelte Rezeptoren in diesen Proteinen identifiziert werden. Andererseits werden diese G-Protein-gekoppelten Rezeptorgene durch Polymerase-Kettenreaktion (hierin nachstehend als PCR abgekürzt) unter Verwendung einer solchen Ähnlichkeit in der Struktur erhalten. Bei diesen bis jetzt so erhaltenen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren können Liganden für einige Rezeptoren, die Subtypen mit hoher Homologie in der Struktur für bekannte Rezeptoren sind, ohne weiteres vorhersehbar sein, aber in den meisten Fällen sind ihre endogenen Liganden unvorhersehbar, so daß Liganden, die diesen Rezeptoren entsprechen, kaum gefunden werden. Aus diesem Grund werden diese Rezeptoren Orphan-Rezeptoren genannt. Es ist wahrscheinlich, daß nicht identifizierte endogene Liganden für diese Orphan-Rezeptoren an dem schlecht analysierten biologischen Phänomen beteiligt sein würden, da die Liganden unbekannt waren. Wenn diese Liganden mit wichtigen physiologischen Wirkungen oder pathologischen Zuständen in Verbindung gebracht werden, wird erwartet, daß die Entwicklung dieser Rezeptoragonisten und -antagonisten zum Durchbruch von neuen Arzneimitteln führen wird (Stadel, J. et al., TiPS, 18, 430-437, 1997; Marchese, A. et al., TiPS, 20, 370-375, 1999; Civelli, O. et al., Brain Res., 848, 63-65, 1999; Howard, A. D. et al., TiPS, 22, 132-140, 2001).
  • Kürzlich versuchten einige Gruppen, Liganden für diese Orphan-Rezeptoren zu identifizieren, und berichteten über die Isolation/strukturelle Bestimmung von Liganden, die neue physiologisch wirksame Peptide sind. Reinsheid et al. und Meunier et al. führten unabhängig voneinander cDNA, die Orphan-G-Protein-gekoppelten Rezeptor LC132 oder ORL1 codiert, in Tierzellen ein, um einen Rezeptor zu exprimieren, isolierten ein neues Peptid aus Schweinehirn- oder Rattenhirnextrakt, der in bezug auf seine Antwort Orphanin FQ oder Nociceptin genannt wird, und bestimmten seine Sequenz (Reinsheid, R. K. et al., Science, 270, 792-794, 1995; Meunier, J.-C. et al., Nature, 377, 532-535, 1995). Es wurde berichtet, daß dieses Peptid mit einem Schmerzgefühl verbunden ist. Weitere Untersuchungen an dem Rezeptor in der Knockout-Maus offenbarten, daß das Peptid am Gedächtnis beteiligt ist (Manabe, T. et al., Nature, 394, 577-581, 1998).
  • Anschließend wurden neue Peptide, einschließlich PrRP (Prolactin-releasing Peptid), Orexin, Apelin, Ghrelin und GALP (Galanin-artiges Peptid) usw. als Liganden für Orphan-G-Protein-gekoppelte Rezeptoren isoliert (Hinuma, S. et al., Nature, 393, 272-276, 1998; Sakurai, T. et al., Cell, 92, 573-585, 1998; Tatemoto, K. et al., Biohem. Biophys. Res. Commun., 251, 471-476, 1998; Kojima, M. et al., Nature, 402, 656-660, 1999; Ohtaki, T. et al., J. Biol. Chem., 274, 37041-37045, 1999). Andererseits wurden einige Rezeptoren für physiologisch aktive Peptide, die bisher unbekannt sind, aufgeklärt. Es wurde aufgedeckt, daß ein Rezeptor für Motilin, der mit der Kontraktion der Darmtrakte verbunden ist, GPR38 war (Feighner, S. D. et al., Science, 284, 2184-2188, 1999). Außerdem wurde SLC-1 als ein Rezeptor für MCH identifiziert (Chambers, J. et al., Nature, 400, 261-265, 1999; Saito, Y. et al., Nature, 400, 265-269, 1999; Shimomura, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 261, 622-626, 1999; Lembo, P. M. C. et al., Nature Cell Biol., 1, 267-271, 1999; Bachner, D. et al., FERS Lett., 457, 522-524, 1999). Ebenso wurde berichtet, daß GPR14 (SENR) ein Rezeptor für Urotensin II ist (Ames, R. S. et al., Nature, 401, 282-286, 1999; Mori, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 265, 123-129, 1999; Nothacker, H. P. et al., Nature Cell Biol., 1, 383-385, 1999; Liu, Q. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 266, 174-178, 1999). Außerdem wurden Rezeptoren für Neuromedin U und Neuropeptid FF, die Neuropeptide sind, kürzlich aufgedeckt. Zusätzlich zu diesen Peptiden wurden physiologisch wirksame Lipide mit geringem Molekulargewicht oder Nukleinsäurederivate, wie Cysteinylleukotriene, Sphingosin-1-phosphat, Lysophosphatididsäure, Sphingosylphosphorylcholin, UDP-Glukose usw., als Liganden für Orphan-Rezeptoren identifiziert (Howard, A. D.; et al, TiPS, 22, 132-140, 2001). Es wurde gezeigt, daß MCH an Fettleibigkeit beteiligt ist, da ihre Knockout-Mäuse ein verringertes Körpergewicht und einen mageren Phänotyp zeigten (Shimada, M. et al., Nature, 396, 670-674, 1998), und da ihr Rezeptor aufgedeckt wurde, wurde es möglich, einen Rezeptorantagonisten zu untersuchen, der wahrscheinlich ein Antifettsuchtmittel sein sollte. Es wurde außerdem berichtet, daß Urotensin II eine starke Wirkung auf das Herz-Kreislauf-System zeigt, da es Herzischämie durch intravenöse Injektion an einen Affen induziert (Ames, R. S. et al., Nature, 401, 282-286, 1999).
  • Wie oben beschrieben, sind Orphan-Rezeptoren und Liganden dafür oftmals an einer neuen physiologischen Aktivität beteiligt, und es wird erwartet, daß ihre Aufklärung zur Entwicklung von neuen Arzneimitteln führen wird. Jedoch ist es bekannt, daß die Untersuchung der Liganden für Orphan-Rezeptoren von vielen Schwierigkeiten begleitet ist. Beispielsweise ist es im allgemeinen unbekannt, welches sekundäre Signaltransduktionssystem stattfinden wird, nachdem Orphan-Rezeptoren auf Zellen exprimiert werden, die auf Liganden reagieren, und ein anderes Reaktionssystem sollte untersucht werden. Außerdem sind Gewebe, wo Liganden vorliegen, nicht ohne weiteres vorhersehbar, so daß verschiedene Gewebeextrakte hergestellt werden sollten. Da die Menge des Liganden, die erforderlich ist, seinen Rezeptor zu stimulieren, sogar in einer extrem niedrigen Konzentration ausreichend ist, wem der Ligand ein Peptid ist, ist außerdem die Menge eines solchen in vivo vorhandenen Liganden in vielen Fällen eine Spurenmenge. Außerdem wird ein Peptid durch Peptidase digeriert, so daß es seine Aktivität verliert, oder unterliegt unspezifischer Adsorption, so daß seine Rückgewinnung während der Reinigung gering wird. Daher ist es normalerweise extrem schwierig, einen solchen Liganden aus dem lebenden Körper zu extrahieren und eine Menge des Liganden, die für die Bestimmung seiner Struktur notwendig ist, zu isolieren. Die Gegenwart von vielen Orphan-Rezeptoren blieb verborgen, aber nur ein sehr kleiner Teil von Liganden für diese Rezeptoren wurde bisher aufgrund der vorhergehenden Probleme entdeckt.
  • Einer der berichteten Orphan-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren ist GPR7 (SEQ ID Nr. 129, O'Dowd, B. F. et al., Genomics, 28, 84-91, 1995). GPR7 weist eine geringe Homologie zum Somatostatinrezeptor (SSTR3) und zu Opioidrezeptoren (δ, κ und μ) auf, aber es war noch unbekannt, was sein Ligand war. Außerdem wurde herausgefunden, daß GPR7 eine Homologie von etwa 64 % zu GPR8 (SEQ ID Nr. 4, O'Dowd, B. F. et al., Genomics, 28, 84-91, 1995) auf der Aminosäureebene aufweist.
  • Es war daher wünschenswert, einen endogenen Liganden für GPR7 zu finden und den Liganden direkt zu verwenden oder ein Arzneimittel-Screening-System unter Verwendung des Liganden zu verwenden (bevorzugt in Kombination mit GPR7), um Pharmazeutika mit einem bisher unbekannten, völlig neuen Mechanismus zu entwickeln.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Die betreffenden Erfinder führten intensive Studien durch, um die vorstehenden Probleme zu lösen, und entdeckten infolgedessen, daß ein endogener Ligand, der in dem Extrakt aus Schweinehypothalamus gefunden wurde, auch ein endogener Ligand für GPR7 ist, wobei seine Fähigkeit der spezifischen Bindung an GPR8, das eine Homologie zu GPR7 aufweist, als Indikator verwendet wurde. Die Erfinder fanden ferner heraus, daß der Ligand eine Appetit-stimulierende Wirkung hat, wobei ein GPR7-Agonist und GPR7-Antagonist als ein Appetitanregungsmittel bzw. ein Präventivmittel/Therapeutikum für Fettleibigkeit (Appetitzügler) verwendet werden können. Basierend auf diesen Ergebnissen führten die Erfinder intensive Untersuchungen durch und erreichten die vorliegende Erfindung.
  • Das heißt, die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die folgenden Merkmale:
    • [1] Ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder ihres Salzes, die bzw. das die Bindungseigenschaft zwischen (1) einem Protein oder seinem Salz, enthaltend dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 129, und (2) einem Polypeptid, das an das Protein spezifisch binden kann, oder seinem Amid oder Ester oder einem Salz davon, enthaltend dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 16, verändert, umfassend die Verwendung (1) des Proteins oder seines Salzes und (2) des Polypeptids oder seines Amids oder Esters oder eines Salzes davon.
    • [2] Das Verfahren zum Screenen gemäß [1], wobei das Polypeptid ein Polypeptid ist, das die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 16 oder SEQ ID Nr. 17, enthält.
    • [3] Das Verfahren zum Screenen nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid ein Polypeptid ist, bestehend aus der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 16, SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 56, SEQ ID Nr. 95, SEQ ID Nr. 98, SEQ ID Nr. 99, SEQ ID Nr. 103, SEQ ID Nr. 105, SEQ ID Nr. 106, SEQ ID Nr. 112 oder SEQ ID Nr. 113.
    • [4] Ein Kit zum Screenen einer Verbindung oder ihres Salzes, die bzw. das die Bindungseigenschaft zwischen (1) einem Protein oder seinem Salz, enthaltend dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 129, und (2) einem Polypeptid, das an das Protein spezifisch binden kann, oder seinem Amid oder Ester oder einem Salz davon, enthaltend dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 16, verändert, umfassend (1) das Protein oder sein Salz und (2) das Polypeptid oder sein Amid oder Ester oder ein Salz davon.
    • [5] Das Verfahren zum Screenen nach Anspruch 1, wobei die Verbindung oder ihr Salz, die gescreent werden sollen, für die Vorbeugung oder Behandlung von Fettleibigkeit bestimmt sind.
    • [6] Ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder ihres Salzes, die bzw. das die Aktivität eines Proteins oder seines Salzes, enthaltend dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 129, inhibiert, umfassend die Verwendung (1) des Proteins oder seines Salzes und (2) eines Polypeptids, das an das Protein spezifisch binden kann, oder seines Amids oder Esters oder eines Salzes davon, enthaltend dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 16.
    • [7] Das Verfahren zum Screenen nach Anspruch 6, wobei die Verbindung oder ihr Salz, die gescreent werden sollen, für die Vorbeugung oder Behandlung von Fettleibigkeit bestimmt sind.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt die gesamte Basensequenz der Mensch-GPR8-Rezeptorprotein-cDNA und die gesamte Aminosäuresequenz des daraus translatierten Mensch-GPR8-Rezeptorproteins.
  • 2 zeigt die UV-Absorption des GPR8-Liganden bei der Reinigung im Endstadium durch HPLC unter Verwendung der Wakosil-II-3C18HG-Säule und der GTPγS-Aktivität von jedem Peak. Die Aktivität wurde in dem mit einem Pfeil gekennzeichneten Peak gewonnen.
  • 3 zeigt die GTPγS-Bindung-beschleunigende Aktivität eines menschlichen homologen GPR8-Ligandenpeptids, bestehend aus 23 Resten, mit verschiedenen Konzentrationen an der CHO/GPR8-Zellmembranfraktion.
  • 4 zeigt die GTPγS-Bindung-beschleunigende Aktivität eines menschlichen homologen GPR8-Ligandenpeptids, bestehend aus 30 Resten, mit verschiedenen Konzentrationen an der CHO/GPR8-Zellmembranfraktion.
  • 5 zeigt die cAMP-Produktion-unterdrückende Aktivität des GPR8-Ligandenpeptids, bestehend aus 23 Resten, in verschiedenen Konzentrationen an menschlichen homologen CHO/GPR8-Zellen.
  • 6 zeigt die Aktivität des GPR8-Ligandenpeptids bei der Nahrungsaufnahme, wobei jeder Wert ein Mittelwert ± Standardabweichung (n = 10) ist.
  • 7 zeigt die cAMP-Produktion-unterdrückende Aktivität des GPR8-Ligandenpeptids, bestehend aus 30 Resten, in verschiedenen Konzentrationen an menschlichen homologen CHO/GPR8-Zellen.
  • 8 zeigt die gesamte Basensequenz der menschlichen homologen Präkursorprotein-cDNA des GPR8-Ligandenpeptids und die gesamte Aminosäuresequenz des menschlichen homologen Präkursorrezeptorproteins des daraus translatierten GPR8-Ligandenpeptids, wobei ein mutmaßliches menschliches homologes GPR8-Ligandenpeptid, das aus 23 Resten besteht, in einem Kasten eingeschlossen ist.
  • 9 zeigt die gesamte Basensequenz der Schweine-homologen Präkursorprotein-cDNA des GPR8-Ligandenpeptids und die gesamte Aminosäurensequenz eines Schweine-homologen Präkursorrezeptorproteins des daraus translatierten GPR8-Ligandenpeptids, wobei ein mutmaßliches Schweine-homologes GPR8-Ligandenpeptid, das aus 23 Resten besteht, in einem Kasten eingeschlossen ist.
  • 10 zeigt die gesamte Basensequenz der Ratten-homologen Präkursorprotein-cDNA des GPR8-Ligandenpeptids und die gesamte Aminosäuresequenz des Ratten-homologen Präkursorrezeptorproteins des daraus translatierten GPR8-Ligandenpeptids, wobei ein mutmaßliches Ratten-homologes GPR8-Ligandenpeptid, das aus 23 Resten besteht, in einem Kasten eingeschlossen ist.
  • 11 zeigt die gesamte Basensequenz der Maus-homologen Präkursorprotein-cDNA des GPR8-Ligandenpeptids und die gesamte Aminosäuresequenz des Maus-homologen Präkursorrezeptorproteins des daraus translatierten GPR8-Ligandenpeptids, wobei ein mutmaßliches Maus-homologes GPR8-Ligandenpeptid, das aus 23 Resten besteht, in einem Kasten eingeschlossen ist.
  • 12 ist eine graphische Darstellung, die die Bindungsinhibitoraktivität des Mensch-GPR8-Liganden mit 23 Resten auf [125I]-markierte Mensch-GPR8-Ligand mit 23 Resten unter Verwendung einer Zellmembranfraktion, die aus Mensch-GPR8-exprimierenden CHO-Zellen hergestellt wird, zeigt.
  • 13 zeigt die gesamte Basensequenz der Mensch-GPR7-cDNA und die gesamte Aminosäuresequenz des daraus translatierten menschlichen GPR7.
  • 14 zeigt die cAMP-Produktion-unterdrückende Aktivität der GPR8-Ligandenpeptide, bestehend aus 23 Resten und 30 Resten, in verschiedenen Konzentrationen auf menschliche homologen CHO/GPR7-Zellen.
  • 15 ist eine graphische Darstellung, die die Bindungsinhibitoraktivität von hGPR8L (1-23) und hGPR8L (1-30) in verschiedenen Konzentrationen auf die Zellmembranfraktion, hergestellt aus Mensch-GPR7-exprimierenden CHO-Zellen von [125I]-markiertem Mensch-GPR8-Ligand mit 23 Resten, unter Verwendung einer Zellmembranfraktion, hergestellt aus Mensch-GPR8-exprimierenden CHO-Zellen, zeigt.
  • 16 ist eine graphische Darstellung, die die GTPγS-Binding-beschleunigende Aktivität von hGPR8L (1-23) an der CHO/GPR7-Zellmembranfraktion zeigt, wobei die Symbole und -∎- Daten angeben, die durch Verabreichen von hGPR8L (1-23) bzw. hGPR8L (1-30) erhalten wurden.
  • BESTE WEISE ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
  • Das Polypeptid, das an das Protein oder sein Salz, enthaltend dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 129, spezifisch binden kann, wird manchmal als das Polypeptid der vorliegenden Erfindung bezeichnet.
  • Beispiele des Polypeptids der vorliegenden Erfindung umfassen ein Polypeptid usw. mit einer Dissoziationskonstante von 1 nM oder weniger, bevorzugt nicht mehr als 200 pM, stärker bevorzugt nicht mehr als 100 pM, noch stärker bevorzugt nicht mehr als 80 pM, und am stärksten bevorzugt nicht mehr als 50 pM, beim Binden an ein Polypeptid, das an ein Protein oder sein Salz binden kann, enthaltend dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 129.
  • Das Polypeptid mit derselben oder im wesentlichen derselben Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, gezeigt durch SEQ ID Nr. 16, das ein Beispiel des Polypeptids der vorliegenden Erfindung ist, kann jedes Polypeptid sein, abgeleitet von jeglichen Zellen von menschlichen und nicht-menschlichen Warmblütern (z. B. Meerschweinchen, Ratte, Maus, Huhn, Kaninchen, Schwein, Schaf, Rind, Affe usw.) (beispielsweise Netzhautzelle, Leberzelle, Splenozyt, Nervenzelle, Gliazelle, β-Zelle der Bauchspeicheldrüse, Knochenmarkszelle, Mesangiumzelle, Langerhans-Zelle, Epidermiszelle, Epithelzelle, Endothelzelle, Fibroblast, Fibrozyt, Myozyt, Fettzelle, Immunzelle (beispielsweise Makrophage, T-Zelle, B-Zelle, natürliche Killerzelle, Mastzelle, Neutrophile, Basophile, Eosinophile, Monozyt), Megakaryozyt, Synoviazelle, Knorpelzelle, Knochenzelle, Osteoblast, Osteokiast, Brustdrüsenzelle, Hepatozyt, Interstitialzelle usw., oder die entsprechenden Präkursorzellen, Stammzellen, Krebszellen usw.), oder jegliche Gewebe, in denen diese Zellen vorliegen, wie Gehirn oder jegliche Gehirnregionen (beispielsweise Netzhaut, Riechkolben, Mandelkern, Basalganglien, Hippocampus, Thalamus, Hypothalamus, Hirnrinde, Medulla oblongata, Kleinhirn), Rückenmark, Hypophyse, Magen, Bauchspeicheldrüse, Niere, Leber, Geschlechtsdrüse, Schilddrüse, Gallenblase, Knochenmark, Nebenniere, Haut, Muskel, Lunge, Magen-Darm-Trakt (beispielsweise Dickdarm und Dünndarm), Blutgefäß, Herz, Thymusdrüse, Milz, Glandula submandibularis, peripheres Blut, Prostata, Hoden, Eierstock, Plazenta, Uterus, Knochen, Gelenk, Skelettmuskel usw.; oder können jegliches Polypeptid sein, abgeleitet von Hämozytzellen oder deren kultivierten Zellen (z. B. MEL, M1, CTLL-2, HT-2, WEHI-3, HL-60, JOSK-1, K562, ML-1, MOLT-3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF-CEM, TALL-1, Jurkat, CCRT-HSB-2, KE-37, SKW-3, HUT-78, HUT-102, H9, U937, THP-1, HEL, JK-1, CMK, KO-812, MEG-01 usw.); und das Polypeptid kann ebenso ein synthetisches Polypeptid sein.
  • Im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 16, umfaßt eine Aminosäuresequenz mit mindestens etwa 90 % Homologie, be vorzugt mindestens etwa 95 % Homologie und stärker bevorzugt mindestens 98 % Homologie, zu der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 16.
  • Speziell umfaßt die im wesentlichen selbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 16, zusätzlich zu den oben beschriebenen Aminosäuresequenzen:
    • (i) die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 16, von der 1 bis 5 (bevorzugt 1 bis 3, stärker bevorzugt 1 oder 2 und am stärksten bevorzugt 1) Aminosäuren deletiert sind;
    • (ii) die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 16, zu der 1 bis 5 (bevorzugt 1 bis 3, stärker bevorzugt 1 oder 2 und am stärksten bevorzugt 1) Aminosäuren hinzugefügt sind;
    • (iii) die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 16, in die 1 bis 5 (bevorzugt 1 bis 3, stärker bevorzugt 1 oder 2 und am stärksten bevorzugt 1) Aminosäuren insertiert sind;
    • (iv) die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 16, in der 1 bis 5 (bevorzugt 1 bis 3, stärker bevorzugt 1 oder 2 und am stärksten bevorzugt 1) Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt sind; und
    • (v) eine Kombination der oben beschriebenen Aminosäuresequenzen (i) bis (iv), usw.
  • Beispiele des Polypeptids, das im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, gezeigt durch SEQ ID Nr. 16, aufweist, umfassen ein Polypeptid, das im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, gezeigt durch SEQ ID Nr. 16, enthält und eine Aktivität aufweist, die im wesentlichen äquivalent zu der der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 16, ist, und dergleichen.
  • Die im wesentlichen äquivalente Aktivität bezieht sich z. B. auf Aktivitäten, welche das Polypeptid der vorliegenden Erfindung besitzt, beispielsweise die später beschriebenen vorbeugenden/therapeutischen Aktivitäten, die Bindungsaktivität für Rezeptoren, die zellstimulierende Aktivität auf die Rezeptor-exprimierenden Zellen (z. B. die Aktivität, die die Arachidonsäurefreisetzung, Acetylcholinfreisetzung, intrazelluläre Ca2 +-Freisetzung, intrazelluläre cAMP-Produktion, intrazelluläre cGMP-Produktion, Inositolphosphatproduktion, Veränderung in dem Zellmembranpotential, Phosphorylierung von intrazellulären Proteinen, Aktivierung von c-fos, pH-Reduktion, GTPγS-Bindungsaktivität usw. fördert), und dergleichen.
  • Der Ausdruck „im wesentlichen äquivalente Aktivität" wird in der Bedeutung verwendet, daß diese Aktivitäten in Wirklichkeit äquivalent sind (beispielsweise biochemisch oder pharmakologisch).
  • Spezielle Beispiele von im wesentlichen derselben Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 16, sind Aminosäuresequenzen, dargestellt durch SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 20, SEQ ID Nr. 21, SEQ ID Nr. 22, SEQ ID Nr. 23, SEQ ID Nr. 24, SEQ ID Nr. 25, SEQ ID Nr. 56, SEQ ID Nr. 57, SEQ ID Nr. 73, SEQ ID Nr. 74, SEQ ID Nr. 91, SEQ ID Nr. 92, SEQ ID Nr. 95, SEQ ID Nr. 96, SEQ ID Nr. 97, SEQ ID Nr. 98, SEQ ID Nr. 99, SEQ ID Nr. 100, SEQ ID Nr. 101, SEQ ID Nr. 102, SEQ ID Nr. 103, SEQ ID Nr. 104, SEQ ID Nr. 105, SEQ ID Nr. 106, SEQ ID Nr. 107, SEQ ID Nr. 108, SEQ ID Nr. 109, SEQ ID Nr. 110, SEQ ID Nr. 111, SEQ ID Nr. 112, SEQ ID Nr. 113 oder SEQ ID Nr. 135, und dergleichen.
  • Spezielle Beispiele des Polypeptids der vorliegenden Erfindung sind Polypeptide, die an GPR7 spezifisch binden können, einschließlich eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 16, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 6, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 17, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 20, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 21, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 22, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 23, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 24, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 25, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 56, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 57, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 73, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 74, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 91, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 92, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 95, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 96, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 97, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 98, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 99, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 100, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 101, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 102, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 103, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 104, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 105, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 106, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 107, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 108, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 109, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 110, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 111, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 112, eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 113 und eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 135 und dergleichen.
  • Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung wird in der Bedeutung verwendet, daß das Polypeptid nicht nur Polypeptide mit der Aktivität zum Binden an ein Protein oder sein Salz, enthaltend dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 129, der zellstimulierenden Aktivität auf Zellen, wo das Protein exprimiert wird (z. B. die Aktivität, die die Arachidonsäurefreisetzung, Acetylcholinfreisetzung, intrazelluläre Ca2 +-Freisetzung, intrazelluläre cAMP-Produktion, Unterdrückung der intrazellulären cAMP-Produktion, intrazelluläre cGMP-Produktion, Inositolphosphatproduktion, Veränderung in dem Zellmembranpotential, Phosphorylierung von intrazellulären Proteinen, Aktivierung von c-fos, pH-Reduktion, GTPγS-Bindungsaktivität usw. fördert), und dergleichen umfaßt, sondern ebenso Präkursorpolypeptide der Polypeptide mit der obigen Bindungsaktivität oder zellstimulierenden Aktivität umfaßt.
  • Spezielle Beispiele der Präkursorpolypeptide der Polypeptide mit einer solchen Bindungsaktivität oder zellstimulierenden Aktivität sind Polypeptide, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 15, usw. enthalten.
  • Spezieller bezieht sich die im wesentlichen selbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 15, auf Aminosäuresequenzen mit mindestens etwa 80 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 90 % Homologie und stärker bevorzugt mindestens etwa 95 % Homologie, zu der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 15, usw.
  • Insbesondere umfassen die im wesentlichen selben Aminosäuresequenzen wie die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 15, zusätzlich zu den oben beschriebenen Aminosäuresequenzen:
    • (i) die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 15, von der 1 bis 15 (bevorzugt 1 bis 10, stärker bevorzugt 1 oder 5 und am stärksten bevorzugt 1 bis 3) Aminosäuren deletiert sind;
    • (ii) die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 15, zu der 1 bis 100 (bevorzugt 1 bis 50, stärker bevorzugt 1 oder 5 und am stärksten bevorzugt 1 bis 3) Aminosäuren hinzugefügt sind;
    • (iii) die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 15, in die 1 bis 15 (bevorzugt 1 bis 10, starker bevorzugt 1 oder 5 und am stärksten bevorzugt 1 bis 3) Aminosäuren insertiert sind;
    • (iv) die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 15, in der 1 bis 15 (bevorzugt 1 bis 10, stärker bevorzugt 1 oder 5 und am stärksten bevorzugt 1 bis 3) Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt sind; und
    • (v) eine Kombination der oben beschriebenen Aminosäuresequenzen (i) bis (iv), usw.
  • Spezielle Beispiele von im wesentlichen derselben Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 15, umfassen Aminosäuresequenzen, dargestellt durch SEQ ID Nr. 42, SEQ ID Nr. 55, SEQ ID Nr. 72 und SEQ ID Nr. 90.
  • Spezielle Beispiele des oben beschriebenen Präkursorpolypeptids sind ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 15, ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 42, ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 55, ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 72 oder ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 90 und dergleichen.
  • Das Protein der vorliegenden Erfindung mit derselben oder im wesentlichen derselben Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 129 (hierin nachstehend manchmal als der Rezeptor der vorliegenden Erfindung bezeichnet) kann jegliches Protein sein, abgeleitet von jeglichen Zellen von menschlichen und nicht-menschlichen Warmblütern (z. B. Meerschweinchen, Ratte, Maus, Huhn, Kaninchen, Schwein, Schaf, Rind, Affe usw.) (beispielsweise Netzhautzelle, Leberzelle, Splenozyt, Nervenzelle, Gliazelle, β-Zelle der Bauchspeicheldrüse, Knochenmarkszelle, Mesangiumzelle, Langerhans-Zelle, Epidermiszelle, Epithelzelle, Endothelzelle, Fibroblast, Fibrozyt, Myozyt, Fettzelle, Immunzelle (beispielsweise Makrophage, T-Zelle, B-Zelle, natürliche Killerzelle, Mastzelle, Neutrophile, Basophile, Eosinophile, Monozyt), Megakaryozyt, Synoviazelle, Knorpelzelle, Knochenzelle, Osteoblast, Osteoklast, Brustdrüsenzelle, Hepatozyt, Interstitialzelle usw., oder die entsprechenden Präkursorzellen, Stammzellen, Krebszellen usw.), oder jegliche Gewebe, in denen diese Zellen vorliegen, wie Gehirn oder jegliche Gehirnregionen (beispielsweise Netzhaut, Riechkolben, Mandelkern, Basalganglien, Hippocampus, Thalamus, Hypothalamus, Hirnrinde, Medulla oblongata, Kleinhirn), Rückenmark, Hypophyse, Magen, Bauchspeicheldrüse, Niere, Leber, Geschlechtsdrüse, Schilddrüse, Gallenblase, Knochenmark, Nebenniere, Haut, Muskel, Lunge, Magen-Darm-Trakt (beispielsweise Dickdarm und Dünndarm), Blutgefäß, Herz, Thymusdrüse, Milz, Glandula submandibularis, peripheres Blut, Prostata, Hoden, Eierstock, Plazenta, Uterus, Knochen, Gelenk, Skelettmuskel usw.; Proteine, abgeleitet von Hämozytzellen oder deren kultivierten Zellen (z. B. MEL, M1, CTLL-2, HT-2, WEHI-3, HL-60, JOSK-1, K562, ML-1, MOLT-3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF-CEM, TALL-1, Jurkat, CCRT-HSB-2, KE-37, SKW-3, HUT-78, HUT-102, H9, U937, THP-1, HEL, JK-1, CMK, KO-812, MEG-01 usw.); das Protein kann ebenso ein synthetisches Protein sein.
  • Die Aminosäuresequenz, die im wesentlichen dieselbe wie die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 129, ist, umfaßt Aminosäuresequenzen mit mindestens etwa 70 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 80 % Homologie und stärker bevorzugt mindestens etwa 90 % Homologie, zu der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 129, usw.
  • Insbesondere umfassen die Aminosäuresequenzen, die im wesentlichen dieselben wie die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 129, sind, zusätzlich zu den oben beschriebenen Aminosäuresequenzen:
    • (i) die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 129, von der 1 bis 15 (bevorzugt 1 bis 10, stärker bevorzugt 1 oder 5 und am stärksten bevorzugt 1 bis 3) Aminosäuren deletiert sind;
    • (ii) die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 129, zu der 1 bis 15 (bevorzugt 1 bis 10, stärker bevorzugt 1 oder 5 und am stärksten bevorzugt 1 bis 3) Aminosäuren hinzugefügt sind;
    • (iii) die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 129, in die 1 bis 15 (bevorzugt 1 bis 10, stärker bevorzugt 1 oder 5 und am stärksten bevorzugt 1 bis 3) Aminosäuren insertiert sind;
    • (iv) die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 129, in der 1 bis 15 (bevorzugt 1 bis 10, stärker bevorzugt 1 oder 5 und am stärksten bevorzugt 1 bis 3) Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt sind; und
    • (v) eine Kombination der oben beschriebenen Aminosäuresequenzen (i) bis (iv), usw.
  • Jedes Teilpeptid kann als das Teilpeptid des Rezeptors der vorliegenden Erfindung verwendet werden (hierin nachstehend manchmal als das Teilpeptid der vorliegenden Erfindung bezeichnet), so lange wie es ein Teilpeptid ist, das für das später beschriebene Verfahren zum Screenen von Arzneimitteln usw. verfügbar ist. Bevorzugt können Teilpeptide eingesetzt werden, die an das Polypeptid der vorliegenden Erfindung binden können, wobei die Teilpeptide eine Aminosäuresequenz enthalten, die der extrazellulären Region entspricht, und dergleichen.
  • Die Polypeptide, Rezeptoren oder Teilpeptide der vorliegenden Erfindung werden gemäß dem konventionellen Weg zum Beschreiben von Peptiden dargestellt, das heißt, der N-Terminus (Aminoterminus) links und der C-Terminus (Carboxylterminus) rechts.
  • In den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung liegt der C-Terminus normalerweise in Form einer Carboxylgruppe (-COOH) oder eines Carboxylats (-COO-) vor, aber der C-Terminus kann in Form eines Amids (-CONH2) oder eines Esters (-COOR) vorliegen.
  • Beispiele der Estergruppe, gezeigt durch R, umfassen eine C1-6-Alkylgruppe, wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl usw.; eine C3-8-Cycloalkylgruppe, wie Cyclopentyl, Cyclohexyl usw.; eine C6-12-Arylgruppe, wie Phenyl, α-Naphthyl usw.; ein Aralkyl mit 7 bis 14 Kohlenstoffatomen, wie eine Phenyl-C1-2-alkylgruppe, z. B. Benzyl, Phenethyl usw.; eine α-Naphthyl-C1-2-alkylgruppe, wie α-Naphthylmethyl usw.; und dergleichen. Außerdem kann Pivaloyloxymethyl oder dergleichen, das weitgehend als ein Ester zur oralen Verabreichung verwendet wird, ebenso verwendet werden.
  • Wenn die Polypeptide, Rezeptoren oder Teilpeptide der vorliegenden Erfindung eine Carboxylgruppe (oder ein Carboxylat) an einer anderen Stelle als dem C-Terminus enthalten, kann sie amidiert oder verestert sein, und ein solches Amid oder ein solcher Ester ist ebenso innerhalb des Polypeptids der vorliegenden Erfindung enthalten. In diesem Fall kann die Estergruppe die oben beschriebenen C-terminalen Ester usw. sein.
  • Die Polypeptide, Rezeptoren oder Teilpeptide der vorliegenden Erfindung umfassen ferner die, in denen die Aminogruppe an den N-terminalen Aminosäureresten (z. B. Methioninrest) mit einer Schutzgruppe (z. B. eine C1-6-Acylgruppe, z. B. eine C1-6-Alkanoylgruppe, wie Formylgruppe, Acetylgruppe usw.) geschützt ist; die, in denen die N-terminale Region in vivo gespalten ist und die so gebildete Glutamylgruppe pyroglutaminiert ist; die, in denen ein Substituent (z. B. -OH, -SH, Aminogruppe, Imidazolgruppe, Indolgruppe, Guanidinogruppe usw.) an der Seitenkette einer Aminosäure in dem Molekül mit einer geeigneten Schutzgruppe (z. B. eine C1-6-Acylgruppe, wie eine C1-6-Acylgruppe, z. B. eine C1-6-Alkanoylgruppe, wie Formylgruppe, Acetylgruppe usw.) geschützt ist, oder konjugierte Proteine, wie sogenannte Glycoproteine mit Zuckerketten, und dergleichen.
  • Als Salze der Polypeptide, Rezeptoren oder Teilpeptide der vorliegenden Erfindung gibt es Salze mit physiologisch akzeptablen Säuren (z. B. anorganischen Säuren, organischen Säuren) oder Basen (z. B. Alkalimetallbasen) usw., wobei die Form physiologisch akzeptabler Säureadditionssalze besonders bevorzugt ist. Beispiele von solchen Salzen sind Salze mit anorganischen Säuren (z. B. Salzsäure, Phosphorsäure, Bromwasserstoffsäure und Schwefelsäure), Salze mit organischen Säuren (z. B. Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Äpfelsäure, Oxasäure, Benzoesäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure) und dergleichen.
  • Die Polypeptide, Rezeptoren oder Teilpeptide der vorliegenden Erfindung können durch ein öffentlich bekanntes Verfahren hergestellt werden, das verwendet wird, um Polypeptide aus den Zellen oder Geweben der oben beschriebenen menschlichen oder nicht-menschlichen Warmblüter zu reinigen, oder können ebenso durch Kultivieren einer Transformante, die eine DNA enthält, welche das Polypeptid codiert, hergestellt werden, wie später beschrieben wird. Außerdem können die Polypeptide, Rezeptoren oder Teilpeptide ebenso durch eine Modifikation der Proteinsynthese hergestellt werden, die hierin nachstehend beschrieben wird.
  • Wenn die Polypeptide, Rezeptoren oder Teilpeptide aus den Geweben oder Zellen des menschlichen oder nicht-menschlichen Warmblüters hergestellt werden, werden die Gewebe oder Zellen des menschlichen oder nicht-menschlichen Warmblüters homogenisiert und mit einer Säure oder dergleichen extrahiert, und das Extrakt wird durch eine Kombination von Chromatographietechniken, wie Umkehrphasenchromatographie, Ionenaustauschchromatographie oder dergleichen, gereinigt und isoliert.
  • Um die Polypeptide, Rezeptoren oder Teilpeptide der vorliegenden Erfindung oder Salze davon, oder Amide davon zu synthetisieren, können kommerziell erhältliche Harze, die zur Polypeptidsynthese verwendet werden, normalerweise verwendet werden. Beispiele solcher Harze umfassen Chlormethylharz, Hydroxymethylharz, Benzhydrylaminharz, Aminomethylharz, 4-Benzyloxybenzylalkoholharz, 4-Methylbenzhydrylaminharz, PAM-Harz, 4-Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethylharz, Polyacrylamidharz, 4-(2',4' -Dimethoxyphenylhydroxymethyl)phenoxyharz, 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminoethyl)phenoxyharz usw. Unter Verwendung dieser Harze werden Aminosäuren, bei denen α-Aminogruppen und funktionelle Gruppen an den Seitenketten entsprechend geschützt sind, an dem Harz in der Reihenfolge der Sequenzen des Zielpolypeptids gemäß der verschiedenen Kondensationsverfahren, die im Stand der Technik öffentlich bekannt sind, kondensiert. Am Ende der Reaktion wird das Polypeptid von dem Harz entfernt, und gleichzeitig werden die Schutzgruppen entfernt. Dann wird die Reaktion zur Bildung intramolekularer Disulfidbindungen in einer stark verdünnten Lösung durchgeführt, um die Zielpolypeptide, -rezeptoren oder -teilpeptide oder Amide davon zu erhalten.
  • Für die Kondensation der oben beschriebenen geschützten Aminosäuren kann eine Vielzahl von Aktivierungsreagenzien für die Polypeptidsynthese verwendet werden, aber Carbodiimide werden besonders bevorzugt eingesetzt. Beispiele von solchen Carbodiimiden umfassen DCC, N,N'-Diisopropylcarbodiimid, N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid usw.
  • Zur Aktivierung durch diese Reagenzien werden die geschützten Aminosäuren in Kombination mit einem Racemisierungsinhibitor (z. B. HOBt, HOOBt) direkt zu dem Harz zugegeben, oder die geschützten Aminosäuren werden zuvor in Form von symmetrischen Säureanhydriden, HOBt-Estern oder HOOBt-Estern aktiviert, gefolgt von der Zugabe der so aktivierten geschützten Aminosäuren zu dem Harz.
  • Lösungsmittel, die zur Verwendung für die Aktivierung der geschützten Aminosäuren oder Kondensierung mit dem Harz geeignet sind, können aus Lösungsmitteln ausgewählt werden, die dafür bekannt sind, daß sie für Polypeptidkondensationsreaktionen von Nutzen sind. Beispiele solcher Lösungsmittel sind Säureamide, wie N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid, N-Methylpyrrolidon usw.; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid, Chloroform usw.; Alkohole, wie Trifluorethanol usw; Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid usw.; Ether, wie Pyridin, Dioxan, Tetrahydrofuran usw.; Nitrile, wie Acetonitril, Propionitril usw.; Ester, wie Methylacetat, Ethylacetat usw.; und entsprechende Gemische aus diesen Lösungsmitteln. Die Reaktionstemperatur wird entsprechend aus dem Bereich ausgewählt, der bekanntermaßen für Reaktionen unter Bildung von Polypeptidbindungen anwendbar ist, und wird normalerweise in dem Bereich von ungefähr -20 °C bis 50 °C ausgewählt. Die aktivierten Aminosäurederivate werden im allgemeinen im 1,5- bis 4fachen Überschuß verwendet. Die Kondensation wird unter Verwendung der Ninhydrinreaktion untersucht; wenn die Kondensation unzureichend ist, kann die Kondensation durch Wiederholen der Kondensationsreaktion ohne die Entfernung der Schutzgruppen vervollständigt werden. Wenn die Kondensation sogar nach der Wiederholung der Reaktion noch unzureichend ist, werden nicht umgesetzte Aminosäuren mit Essigsäureanhydrid oder Acetylimidazol acetyliert, um jeglichen möglichen nachteiligen Einfluß auf die nachfolgende Reaktion auszuschließen.
  • Beispiele der Schutzgruppen, die verwendet werden, um die Ausgangsaminogruppen zu schützen, umfassen Z, Boc, t-Pentyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, Adamantyloxycarbonyl, Trifluoracetyl, Phthaloyl, Formyl, 2-Nitrophenylsulfenyl, Diphenylphosphinothioyl, Fmoc usw.
  • Eine Carboxylgruppe kam durch z. B. Alkylveresterung (in Form von linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylestern der Alkylkomponente, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, t-Butyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, Cyclooctyl, 2-Adamantyl usw.), Aralkylveresterung (z. B. Veresterung in Form von Benzylester, 4-Nitrobenzylester, 4-Methoxybenzylester, 4-Chlorbenzylester, Benzhydrylester usw.), Phenacylveresterung, Benzyloxycarbonylhydrazidierung, t-Butoxycarbonylhydrazidierung, Tritylhydrazidierung oder dergleichen geschützt werden.
  • Die Hydroxylgruppe von Serin kann beispielsweise durch ihre Veresterung oder Veretherung geschützt werden. Beispiele von Gruppen, die entsprechend für die Veresterung verwendet werden, umfassen eine niedere (C1-6)-Alkanoylgruppe, wie eine Acetylgruppe, eine Aroylgruppe, wie eine Benzoylgruppe, und eine Gruppe, abgeleitet von Kohlensäure, wie eine Benzyloxycarbonylgruppe und Ethoxycarbonylgruppe. Beispiele einer Gruppe, die entsprechend für die Veretherung verwendet wird, umfassen eine Benzylgruppe, Tetrahydropyranylgruppe, t-Butylgruppe usw.
  • Beispiele von Gruppen zum Schutz der Phenolhydroxylgruppe von Tyrosin umfassen Bzl, Cl2-Bzl, 2-Nitrobenzyl, Br-Z, t-Butyl usw.
  • Beispiele von Gruppen, die verwendet werden, um die Imidazolkomponente von Histidin zu schützen, umfassen Tos, 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl, DNP, Benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc usw.
  • Beispiele der aktivierten Carboxylgruppen in den Ausgangsaminosäuren umfassen die entsprechenden Säureanhydride, Azide, aktivierten Ester [Ester mit Alkoholen (z. B. Pentachlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, 2,4-Dinitrophenol, Cyanomethylalkohol, p-Nitrophenol, HONG, N-Hydroxysuccimid, N-Hydroxyphthalimid, HOBt)] usw. Als aktivierte Aminosäuren, in denen die Aminogruppen in dem Ausgangsmaterial aktiviert sind, werden die entsprechenden Phosphoramide eingesetzt.
  • Um die Schutzgruppen zu beseitigen (abzuspalten), werden katalytische Reduktion unter Wasserstoffgasstrom in Gegenwart eines Katalysators, wie Pd-Ruß oder Pd-Kohlenstoff; eine Säurebehandlung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff, Methansulfonsäure, Trifluormethansulfonsäure oder Trifluoressigsäure oder einer Gemischlösung aus diesen Säuren; eine Behandlung mit einer Base, wie Diisopropylethylamin, Triethylamin, Piperidin oder Piperazin; und die Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak verwendet. Die Beseitigung der Schutz gruppe durch die oben beschriebene Säurebehandlung wird im allgemeinen bei einer Temperatur von ungefähr -20 °C bis 40 °C durchgeführt. Bei der Säurebehandlung ist es effizient, einen Kationenfänger, wie Anisol, Phenol, Thioanisol, m-Cresol, p-Cresol, Dimethylsulfid, 1,4-Butandithiol oder 1,2-Ethandithiol, zuzugeben. Außerdem wird die 2,4-Dinitrophenylgruppe, die als Schutzgruppe für das Imidazol von Histidin bekannt ist, durch eine Behandlung mit Thiophenol entfernt. Die Formylgruppe, die als Schutzgruppe für das Indol von Tryptophan verwendet wird, wird durch die zuvor genannte Säurebehandlung in Gegenwart von 1,2-Ethandithiol, 1,4-Butandithiol usw., sowie durch eine Behandlung mit einem Alkali, wie einer verdünnten Natriumhydroxidlösung, verdünntem Ammoniak usw., beseitigt.
  • Der Schutz von funktionellen Gruppen, die nicht an der Reaktion der Ausgangsmaterialien beteiligt sein sollten, Schutzgruppen, die Beseitigung der Schutzgruppen und die Aktivierung von funktionellen Gruppen, die an der Reaktion beteiligt sind, können entsprechend aus öffentlich bekannten Gruppen und öffentlich bekannten Mitteln ausgewählt werden.
  • Bei einem anderen Verfahren für den Erhalt der Amide der Polypeptide, Rezeptoren oder Teilpeptide der vorliegenden Erfindung wird beispielsweise die α-Carboxylgruppe der carboxyterminalen Aminosäure zunächst durch Amidierung geschützt; die Peptidkette (Polypeptidkette) wird dann von der Aminogruppenseite auf eine gewünschte Länge erweitert. Danach werden ein Polypeptid, bei dem nur die Schutzgruppe der N-terminalen α-Aminogruppe der Peptidkette von dem Polypeptid entfernt wurde, und ein Polypeptid, bei dem nur die Schutzgruppe der C-terminalen Carboxylgruppe entfernt wurde, hergestellt. Die zwei Polypeptide werden in einem Gemisch aus den oben beschriebenen Lösungsmitteln kondensiert. Die Einzelheiten der Kondensationsreaktion sind dieselben, wie oben beschrieben. Nachdem das geschützte Polypeptid, das durch die Kondensation erhalten wird, gereinigt ist, werden alle Schutzgruppen durch das oben beschriebene Verfahren entfernt, um das gewünschte rohe Polypeptid zu erhalten. Dieses rohe Polypeptid wird durch verschiedene bekannte Reinigungsarten gereinigt. Die Lyophilisierung der Hauptfraktion ergibt das Amid der gewünschten Polypeptide, Rezeptoren oder Teilpeptide davon.
  • Um die veresterten Polypeptide, Rezeptoren oder Teilpeptide davon herzustellen, wird beispielsweise die α-Carboxylgruppe der carboxyterminalen Aminosäure mit einem gewünschten Alkohol kondensiert, um den Aminosäureester herzustellen, worauf eine Verfahrensweise ähnlich der Herstellung des obigen amidierten Proteins folgt, um die gewünschten veresterten Polypeptide, Rezeptoren oder Teilpeptide davon zu erhalten.
  • Die Polypeptide, Rezeptoren oder Teilpeptide der vorliegenden Erfindung können durch öffentlich bekannte Verfahren zur Peptidsynthese hergestellt werden; oder die Teilpeptide der Rezeptoren können durch Spaltung der Rezeptoren mit einer geeigneten Peptidase hergestellt werden. Für die Peptidsynthese kann beispielsweise entweder Festphasensynthese oder Flüssigphasensynthese verwendet werden. Das heißt, die Teilpeptide oder Aminosäuren, die die Polypeptide, Rezeptoren oder Teilpeptide der vorliegenden Erfindung bilden können, werden mit dem übrigen Teil kondensiert. Wenn das Produkt Schutzgruppen enthält, werden diese Schutzgruppen entfernt, wodurch das gewünschte Peptid erhalten wurde. Öffentlich bekannte Verfahren zur Kondensation und Beseitigung der Schutzgruppen werden nachstehend in i) bis v) beschrieben.
    • i) M. Bodanszky & M. A. Ondetti: Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
    • ii) Schroeder & Luebke: The Peptide, Academic Press, New York (1965)
    • iii) Nobuo Izumiya, et al.: Peptide Gosei-no-Kiso to Jikken (Gasics and experiments of Peptide synthesis), veröffentlich von Maruzen Co. (1975)
    • iv) Haruaki Yajima & Shunpei Sakakibara: Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experiment) 1, Tanpakushitsu no Kagaku (Chemistry of Proteins) IV, 205 (1977)
    • v) Haruaki Yajima Hrsg.: Zoku Iyakuhin no Kaihatsu (A sequel to Development of Pharmaceuticals), Bd. 14, Peptide Synthesis, veröffentlicht von Hirnkawa Shoten
  • Nach der Beendigung der Reaktion kann das Produkt durch eine Kombination von konventionellen. Reinigungsverfahren, wie Lösungsmittelextraktion, Destillation, Säulenchromatographie, Flüssigchromatographie und Umkristallisierung usw. gereinigt und isoliert werden, wodurch die Polypeptide, Rezeptoren oder Teilpeptide der vorliegenden Erfindung erhalten werden. Wenn die Polypeptide, Rezeptoren oder Teilpeptide der vorliegenden Erfindung, die durch die obigen Verfahren erhalten wurden, in einer freien Form vorliegen, können sie in entsprechende Salze durch öffentlich bekannte Verfahren oder Modifikationen davon umgewandelt werden; wenn sie in einer Salzform erhalten werden, können sie in ihre freie Form oder in die Form von anderen Salzen durch öffentlich bekannte Verfahren oder Modifikationen davon umgewandelt werden.
  • Für die DNA, die die Polypeptide, Rezeptoren oder Teilpeptide der vorliegenden Erfindung codiert, kann jede DNA verwendet werden, so lange wie sie die oben beschriebene Basensequenz, die die Polypeptide, Rezeptoren oder Teilpeptide der vorliegenden Erfindung codiert, enthält. Die DNA kann irgendeine der genomischen DNA, genomischen DNA-Bibliothek, cDNA, abgeleitet von den oben beschriebenen Zellen/Geweben, cDNA-Bibliothek, abgeleitet von den oben beschriebenen Zellen/Geweben, und synthetischen DNA sein.
  • Der Vektor, der für die Bibliothek verwendet werden soll, kann eine Bakteriophage, Plasmid, Cosmid, Phagemid und dergleichen sein. Außerdem kann die DNA durch Umkehrtranskriptase-Polymerase-Kettenreaktion (hierin nachstehend als RT-PCR abgekürzt) mit einer Gesamt-RNA- oder -mRNA-Fraktion, hergestellt aus den oben beschriebenen Zellen oder Geweben, amplifiziert werden.
  • Die DNA, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, kann jede DNA sein, so lange wie sie beispielsweise ist: (i) eine DNA, enthaltend die Basensequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 18, SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 26, SEQ ID Nr. 27, SEQ ID Nr. 28, SEQ ID Nr. 29, SEQ ID Nr. 30, SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 58, SEQ ID Nr. 59, SEQ ID Nr. 75, SEQ ID Nr. 76, SEQ ID Nr. 93, SEQ ID Nr. 94, SEQ ID Nr. 114, SEQ ID Nr. 115, SEQ ID Nr. 116, SEQ ID Nr. 117, SEQ ID Nr. 118, SEQ ID Nr. 119, SEQ ID Nr. 120, SEQ ID Nr. 121, SEQ ID Nr. 122, SEQ ID Nr. 123, SEQ ID Nr. 124 oder SEQ ID Nr. 125, (ii) eine DNA mit einer Basensequenz, die unter hochstringenten Bedingungen mit der Basensequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 18, SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 26, SEQ ID Nr. 27, SEQ ID Nr. 28, SEQ ID Nr. 29, SEQ ID Nr. 30, SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 58, SEQ ID Nr. 59, SEQ ID Nr. 75, SEQ ID Nr. 76, SEQ ID Nr. 93, SEQ ID Nr. 94, SEQ ID Nr. 114, SEQ ID Nr. 115, SEQ ID Nr. 116, SEQ ID Nr. 117, SEQ ID Nr. 118, SEQ ID Nr. 119, SEQ ID Nr. 120, SEQ ID Nr. 121, SEQ ID Nr. 122, SEQ ID Nr. 123, SEQ ID Nr. 124 oder SEQ ID Nr. 125, hybridisierbar ist und ein Polypeptid codiert, welches die Aktivität aufweist, die im wesentlichen äquivalent zu der des Polypeptids der vorliegenden Erfindung ist, (iii) eine DNA, enthaltend eine Basensequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 41, SEQ ID Nr. 54, SEQ ID Nr. 71 oder SEQ ID Nr. 89, oder (iv) eine DNA, enthaltend eine Basensequenz, die mit der Basense quenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 41, SEQ ID Nr. 54, SEQ ID Nr. 71 oder SEQ ID Nr. 89, unter hochstringenten Bedingungen hybridisierbar ist, usw.
  • Spezielle Beispiele der DNA, die unter hochstringenten Bedingungen mit der Basensequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 18, SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 26, SEQ ID Nr. 27, SEQ ID Nr. 28, SEQ ID Nr. 29, SEQ ID Nr. 30, SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 58, SEQ ID Nr. 59, SEQ ID Nr. 75, SEQ ID Nr. 76, SEQ ID Nr. 93, SEQ ID Nr. 94, SEQ ID Nr. 114, SEQ ID Nr. 115, SEQ ID Nr. 116, SEQ ID Nr. 117, SEQ ID Nr. 118, SEQ ID Nr. 119, SEQ ID Nr. 120, SEQ ID Nr. 121, SEQ ID Nr. 122, SEQ ID Nr. 123, SEQ ID Nr. 124 oder SEQ ID Nr. 125, oder mit der Basensequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 41, SEQ ID Nr. 54, SEQ ID Nr. 71 oder SEQ ID Nr. 89, hybridisierbar ist, sind DNAs, enthaltend Basensequenzen mit mindestens etwa 70 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 80 % Homologie, stärker bevorzugt mindestens etwa 90 % Homologie und stärker bevorzugt mindestens etwa 95 % Homologie, zu der Basensequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 18, SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 26, SEQ ID Nr. 27, SEQ ID Nr. 28, SEQ ID Nr. 29, SEQ ID Nr. 30, SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 58, SEQ ID Nr. 59, SEQ ID Nr. 75, SEQ ID Nr. 76, SEQ ID Nr. 93, SEQ ID Nr. 94, SEQ ID Nr. 114, SEQ ID Nr. 115, SEQ ID Nr. 116, SEQ ID Nr. 117, SEQ ID Nr. 118, SEQ ID Nr. 119, SEQ ID Nr. 120, SEQ ID Nr. 121, SEQ ID Nr. 122, SEQ ID Nr. 123, SEQ ID Nr. 124 oder SEQ ID Nr. 125 oder durch SEQ ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 41, SEQ ID Nr. 54, SEQ ID Nr. 71 oder SEQ ID Nr. 89; und dergleichen.
  • Die Hybridisierung kann durch öffentlich bekannte Verfahren oder durch Modifikationen davon durchgeführt werden, beispielsweise gemäß dem Verfahren, das in Molecular Cloning, 2. Aufl. (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) beschrieben ist, usw. Eine kommerziell erhältliche Bibliothek kann ebenso gemäß den Anweisungen des durch den Hersteller beigefügten Protokolls verwendet werden. Die Hybridisierung kann bevorzugt unter hochstringenten Bedingungen durchgeführt werden.
  • Die hierin verwendeten hochstringenten Bedingungen sind beispielsweise die in einer Natriumkonzentration bei ungefähr 19 bis 40 mM, bevorzugt ungefähr 19 bis 20 mM bei einer Temperatur von ungefähr 50 bis 70 °C, bevorzugt ungefähr 60 bis 65 °C. Insbesondere sind die Hybridisierungsbedingungen in einer Natriumkonzentration bei etwa 19 mM bei einer Temperatur von etwa 65 °C am stärksten bevorzugt.
  • Spezieller
    • (i) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 18 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 16, verwendet;
    • (ii) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 19 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 17, verwendet;
    • (iii) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 26 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 20, verwendet;
    • (iv) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 27 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 21, verwendet;
    • (v) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 28 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 22, verwendet;
    • (vi) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 29 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 23, verwendet;
    • (vii) wird eine DNA, enthaltend die durch. SEQ ID Nr. 30 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 24, verwendet;
    • (viii) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 31 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 25, verwendet;
    • (ix) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 58 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 56, verwendet;
    • (x) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 59 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 57, verwendet;
    • (xi) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 75 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 73, verwendet;
    • (xii) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 76 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 74, verwendet;
    • (xiii) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 93 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 91, verwendet;
    • (xiv) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 94 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 92, verwendet;
    • (xv) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 18 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 95, verwendet;
    • (xvi) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 114 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 96, verwendet;
    • (xvii) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 115 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 97, verwendet;
    • (xviii) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 116 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 98, verwendet;
    • (xix) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 117 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 99, verwendet;
    • (xx) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 118 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 100, verwendet;
    • (xxi) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 119 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 101, verwendet;
    • (xxii) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 120 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 102, verwendet;
    • (xxiii) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 58 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 103, verwendet;
    • (xxiv) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 75 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 104, verwendet;
    • (xxv) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 18 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 105, verwendet;
    • (xxvi) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 18 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 106, verwendet;
    • (xxvii) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 121 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 107, verwendet;
    • (xxviii) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 122 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 108, verwendet;
    • (xxix) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 123 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 109, verwendet;
    • (xxx) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 124 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 110, verwendet;
    • (xxxi) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 125 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 6, verwendet;
    • (xxxii) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 121 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 111, verwendet;
    • (xxxiii) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 18 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 112, verwendet;
    • (xxxiv) wird eine DNA, enthaltend die durch SEQ ID Nr. 121 dargestellte Basensequenz oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 113, verwendet und dergleichen.
  • Die DNA, die den Rezeptor der vorliegenden Erfindung codiert, umfaßt beispielsweise eine DNA mit der Basensequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 128, oder eine DNA mit einer Basensequenz, die mit der Basensequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 128, unter hochstringenten Bedingungen hybridisierbar ist, und ein Polypeptid mit einer Aktivität codiert, die im wesentlichen äquivalent zu der des Rezeptors der vorliegenden Erfindung ist, und dergleichen. Jede dieser DNAs kann eingesetzt werden.
  • Beispiele der DNA, die mit der Basensequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 128, hybridisierbar ist, umfassen eine DNA, enthaltend eine Basensequenz mit mindestens etwa 70 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 80 % Homologie, stärker bevorzugt mindestens etwa 90 % Homologie und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95 % Homologie, zu der Basensequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 128, und dergleichen.
  • Die Hybridisierung kann durch öffentlich bekannte Verfahren oder durch Modifikationen davon durchgeführt werden, beispielsweise gemäß dem Verfahren, das in Molecular Cloning, 2. Aufl. (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) beschrieben ist, usw. Eine kommerziell erhältliche Bibliothek kann ebenso gemäß den Anweisungen des durch den Hersteller beigefügten Protokolls verwendet werden. Die Hybridisierung kann bevorzugt unter hochstringenten Bedingungen durchgeführt werden.
  • Die hierin verwendeten hochstringenten Bedingungen sind beispielsweise die in einer Natriumkonzentration bei ungefähr 19 bis 40 mM, bevorzugt ungefähr 19 bis 20 mM bei einer Temperatur von ungefähr 50 bis 70 °C, bevorzugt ungefähr 60 bis 65 °C. Insbesondere sind Hybridisierungsbedingungen in einer Natriumkonzentration bei etwa 19 mM bei einer Temperatur von etwa 65 °C am stärksten bevorzugt.
  • Spezieller wird eine DNA, enthaltend die Basensequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 128, oder dergleichen, als die DNA, die das Polypeptid codiert, enthaltend die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 129, verwendet.
  • Für die DNA, die das Teilpeptid des Rezeptors der vorliegenden Erfindung codiert, kann jede DNA verwendet werden, insofern sie eine Basensequenz, die das oben beschriebene Teilpeptid des Rezeptors der vorliegenden Erfindung codiert, enthält. Die DNA kann irgendeine der genomischen DNA, genomischen DNA-Bibliothek, cDNA, abgeleitet von den oben beschriebenen Zellen/Geweben, cDNA-Bibliothek, abgeleitet von den oben beschriebenen Zellen/Geweben, und synthetischen DNA sein.
  • Die DNA, die das Teilpeptid des Rezeptors der vorliegenden Erfindung codiert, umfaßt beispielsweise eine DNA, die eine Teilbasensequenz der DNA, enthaltend die Basensequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 128, aufweist, oder eine DNA, die eine Basensequenz aufweist, die mit der Basensequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 128, unter hochstringenten Bedingungen hybridisierbar ist, und eine Teilbasensequenz der DNA aufweist, die ein Polypeptid mit einer Aktivität codiert, die im wesentlichen äquivalent zu der des Rezeptors der vorliegenden Erfindung ist, und dergleichen.
  • Die DNA, die mit der Basensequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 128, hybridisierbar ist, weist dieselbe Bedeutung, wie oben beschrieben, auf.
  • Die oben beschriebenen Verfahren zur Hybridisierung und die oben beschriebenen hochstringenten Bedingungen werden ebenfalls verwendet.
  • Die DNA, die das Polypeptid, den Rezeptor oder das Teilpeptid der vorliegenden Erfindung codiert, kann durch öffentlich bekannte Verfahren markiert sein. Spezielle Beispiele umfassen die, die mit einem Isotop markiert sind, die, die mit Fluoreszenz markiert sind (Markierung mit z. B. Fluoreszein usw.), die, die biotinyliert sind, die, die mit Enzym markiert sind, usw.
  • Zum Klonen der DNA, die das Polypeptid, den Rezeptor oder das Teilpeptid der vorliegenden Erfindung vollständig codiert (hierin nachstehend werden die Polypeptide oder derglei chen manchmal nur als das Polypeptid der vorliegenden Erfindung in der folgenden Beschreibung zum Klonen und zur Expression der DNA, die diese Polypeptide oder dergleichen codiert, bezeichnet), kann die DNA entweder durch öffentlich bekannte PCR unter Verwendung synthetischer DNA-Primer, enthaltend einen Teil der Basensequenz des Polypeptids der vorliegenden Erfindung, amplifiziert werden, oder die DNA, eingeführt in einen entsprechenden Vektor, kann durch Hybridisierung mit einem markierten DNA-Fragment oder einer markierten synthetischen DNA, die einen Teil oder die gesamte Region des Polypeptids der vorliegenden Erfindung codieren, ausgewählt werden. Die Hybridisierung kann beispielsweise gemäß dem Verfahren durchgeführt werden, das in Molecular Cloning, 2. Aufl. (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) beschrieben ist, usw. Die Hybridisierung kann ebenso unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen Bibliothek gemäß dem Protokoll, das in den beigefügten Anweisungen beschrieben ist, durchgeführt werden.
  • Die Umwandlung der Basensequenz der DNA kann durch öffentlich bekannte Verfahren, wie das ODA-LA-PCR-Verfahren, das Gapped-Duplex-Verfahren oder das Kunkel-Verfahren, oder Modifikationen davon unter Verwendung eines öffentlich bekannten Kits, erhältlich als MutanTM-super Express Km (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd., Marke), MutanTM-K (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd., Marke), usw. durchgeführt werden.
  • Die geklonte DNA, die das Polypeptid codiert, kann als solche in Abhängigkeit vom Zweck oder, wenn gewünscht, nach der Digestion mit einem Restriktionsenzym oder nach der Zugabe eines Linkers dazu verwendet werden. Die DNA kann ATG als ein Translationsinitiationscodon an dem 5'-Ende davon und TAA, TGA oder TAG als ein Translationsterminationscodon an dem 3'-Ende davon enthalten. Diese Translationsinitiations- und -terminationscodone können ebenso unter Verwendung eines geeigneten synthetischen DNA-Adapters zugefügt werden.
  • Der Expressionsvektor des Polypeptids der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden, beispielsweise durch (a) Exzidieren des gewünschten DNA-Fragments aus der DNA, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, (b) und dann Ligieren des DNA-Fragments mit einem entsprechenden Expressionsvektor stromabwärts eines Promotors in dem Vektor.
  • Beispiele des Vektors umfassen Plasmide, abgeleitet von E. coli (z. B. pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Plasmide, abgeleitet von Bacillus subtilis (z. B. pUB110, pTP5, pC194), Plasmide, abgeleitet von Hefe (z. B. pSH19, pSH15), Bakteriophagen, wie λ-Phage usw., Tierviren, wie Retrovirus, Vacciniavirus, Baculovirus usw., sowie pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo, usw.
  • Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Promoter kann irgendein Promotor sein, wenn er gut mit einem Wirt, der für die Genexpression verwendet werden soll, übereinstimmt. In dem Fall der Verwendung von Tierzellen als Wirt umfassen Beispiele des Promoters SRα-Promotor, SV40-Promotor, HIV·LTR-Promotor, CMV-Promotor, HSV-TK-Promotor, usw.
  • Unter diesen wird der CMV-Promotor (CMV = Cytomegalovirus) oder der SRα-Promotor bevorzugt verwendet. Wenn der Wirt Bakterien der Gattung Escherichia ist, umfassen bevorzugte Beispiele des Promotors trp-Promotor, lac-Promotor, recA-Promotor, λPL-Promotor, lpp-Promotor, T7-Promotor usw. In dem Fall der Verwendung von Bakterien der Gattung Bacillus als Wirt sind bevorzugte Beispiel des Promotors SPO1-Promotor, SPO2-Promotor und penP-Promotor. Wenn Hefe als Wirt verwendet wird, sind bevorzugte Beispiele des Promotors PHO5-Promotor, PGK-Promotor, GAP-Promotor und ADH-Promotor. Wenn Insektenzellen als Wirt verwendet werden, umfassen bevorzugte Beispiele des Promotors Polyhedrin-Promotor, P10-Promotor usw.
  • Zusätzlich zu den vorhergehenden Beispielen kann der Expressionsvektor ferner gegebenenfalls einen Enhancer, ein Splicing-Signal, ein Poly-A-Additionssignal, einen Selektionsmarker, SV40-Replikationsstartpunkt (hierin nachstehend manchmal als SV40ori abgekürzt) usw. enthalten. Beispiele des Selektionsmarkers umfassen das Dihydrofolatreduktase-(hierin nachstehend manchmal als dhfr abgekürzt)-Gen [Methotrexat-Resistenz (MTX-Resistenz)], das Ampicillin-Resistenzgen (hierin manchmal als Ampr abgekürzt), das Neomycin-Resistenzgen (hierin nachstehend manchmal als Neo abgekürzt, G418-Resistenz) usw. Insbesondere kann, wenn das dhfr-Gen als Selektionsmarker unter Verwendung von dhfr-Gendefizienten Zellen des chinesischen Hamsters verwendet wird, die Selektion ebenso auf Thymidin-freien Medien durchgeführt werden.
  • Wenn notwendig, wird eine Signalsequenz, die mit einem Wirt zusammenpaßt, zu dem N-Terminus des Polypeptids der vorliegenden Erfindung zugefügt. Beispiele der Signalsequenz, die verwendet werden kann, sind Pho-A-Signalsequenz, OmpA-Signalsequenz usw. bei der Verwendung von Bakterien der Gattung Escherichia als Wirt; α-Amylase-Signalsequenz, Subtilisin-Signalsequenz, usw. bei der Verwendung von Bakterien der Gattung Bacillus als Wirt; MFα-Signalsequenz, SUC2-Signalsequenz usw. bei der Verwendung von Hefe als Wirt; bzw. Insulin-Signalsequenz, α-Interferon-Signalsequenz, Antikörpermolekül-Signalsequenz usw. bei der Verwendung von Tierzellen als Wirt.
  • Unter Verwendung des Vektors, der die DNA umfaßt, die das so konstruierte Polypeptid codiert, können Transformanten hergestellt werden.
  • Beispiele des Wirts, der eingesetzt werden kann, sind Bakterien, die zu der Gattung Escherichia gehören, Bakterien, die zu der Gattung Bacillus gehören, Hefe, Insektenzellen, Insekten und Tierzellen usw.
  • Spezielle Beispiele der Bakterien, die zu der Gattung Escherichia gehören, umfassen Escherichia coli K12 DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)), C600 (Genetics, 39, 440 (1954)], usw.
  • Beispiele der Bakterien, die zu der Gattung Bacillus gehören, umfassen Bacillus subtilis M1114 [Gene, 24, 255 (1983)), 207-21 (Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)], usw.
  • Beispiele von Hefe umfassen Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris KM71, usw.
  • Beispiele von Insektenzellen umfassen für den Virus AcNPV Spodoptera-frugiperda-Zellen (Sf-Zellen), MG1-Zellen, abgeleitet vom Mitteldarm von Trichoplusia ni, High FiveTM-Zellen, abgeleitet vom Ei von Trichoplusia ni, Zellen, abgeleitet von Mamestra brassicae, Zellen, abgeleitet von Estigmena acrea, usw.; und für den Virus BmNPV werden Bombyxmori-N-Zellen (BmN-Zellen), usw. verwendet. Beispiele der Sf-Zellen, die verwendet werden können, sind Sf9-Zellen (ATCC CRL 171 1), Sf21-Zellen (beide Zellen werden in Vaughn, J. L. et al., In Vivo, 13, 213-217 (1977), beschrieben) usw.
  • Als das Insekt kann beispielsweise eine Larve von Bombyx mori usw. verwendet werden [Maeda, et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • Beispiele von Tierzellen umfassen Affenzellen COS-7, Vero, Zellen vom Chinesischen Hamster CHO (hierin nachstehend einfach als CHO-Zelle bezeichnet), dhfr-Gen-defiziente Zellen vom Chinesischen Hamster CHO (hierin nachstehend einfach als CHO(dhfr-)-Zelle bezeichnet), Maus-L-Zellen, Maus-AtT-20, Maus-Myelomzellen, Ratten-GH3, Menschen-FL-Zellen, usw.
  • Bakterien, die zu der Gattung Escherichia gehören, können beispielsweise durch das Verfahren transformiert werden, das in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982), usw. beschrieben ist.
  • Bakterien, die zu der Gattung Bacillus gehören, können beispielsweise durch das Verfahren transformiert werden, das in Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979), usw. beschrieben ist.
  • Hefe kann beispielsweise durch das Verfahren transformiert werden, das in Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 1929 (1978), usw. beschrieben ist.
  • Insektenzellen oder Insekten können beispielsweise gemäß dem Verfahren transformiert werden, das in Bio/Technology, 6, 47-55 (1988), usw. beschrieben ist.
  • Tierzellen können beispielsweise gemäß dem Verfahren transformiert werden, das in Saibo Kogaku (Cell Engineering), Extraausgabe 8, Shin Saibo Kogaku Jikken Protocol (New Cell Engineering Experimental Protocol), 263-267 (1995), veröffentlicht von Shujunsha, oder Virology, 52, 456 (1973) beschrieben ist.
  • Daher kann die Transformante, transformiert mit dem Expressionsvektor, der die DNA umfaßt, die das Polypeptid codiert, erhalten werden.
  • Wenn der Wirt Bakterien sind, die zu der Gattung Escherichia oder der Gattung Bacillus gehören, kann die Transformante geeigneterweise in einem flüssigen Medium kultiviert werden, welches Materialien enthält, die für das Wachstum der Transformante erforderlich sind, wie Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Materialien usw. Beispiele der Kohlenstoffquellen umfassen Glukose, Dextrin, lösliche Stärke, Saccharose usw. Beispiele der Stickstoffquellen umfassen anorganische oder organische Materialien, wie Ammoniumsalze, Nitratsalze, Maisquellwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakt, Sojabohnenkuchen, Kartoffelextrakt usw. Beispiele der anorganischen Materialien sind Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat, Magnesiumchlorid usw. Außerdem können Hefe, Vitamine, Wachstumsbeschleunigungsfaktoren usw. ebenso zu dem Medium zugegeben werden. Bevorzugt wird der pH des Mediums auf etwa 5 bis etwa 8 eingestellt.
  • Ein bevorzugtes Beispiel des Mediums zur Kultivierung der Bakterien, die zu der Gattung Escherichia gehören, ist M9-Medium, ergänzt mit Glukose und Casaminosäuren [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972]. Wenn notwendig und gewünscht, kann eine Chemikalie wie 3β-Indolylacrylsäure zu dem Medium zugegeben werden, wodurch der Promotor effizient aktiviert wird.
  • Wenn die Bakterien, die zu der Gattung Escherichia gehören, als Wirt verwendet werden, wird die Transformante normalerweise bei ungefähr 15 °C bis 43 °C für ungefähr 3 bis 24 Stunden kultiviert. Wenn notwendig, kann die Kultur belüftet oder gerührt werden.
  • Wenn die Bakterien, die zu der Gattung Bacillus gehören, als Wirt verwendet werden, wird die Transformante im allgemeinen bei ungefähr 30 °C bis 40 °C für ungefähr 6 bis 24 Stunden kultiviert. Wenn notwendig, kann die Kultur belüftet oder gerührt werden.
  • Wenn Hefe als Wirt verwendet wird, wird die Transformante beispielsweise in Burkholder-Minimalmedium [Bostian, K. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 4505 (1980)] oder in SD-Medium, ergänzt mit 0,5 % Casaminosäuren [Bitter, G. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 5330 (1984)], kultiviert. Bevorzugt wird der pH des Mediums auf etwa 5 bis etwa 8 eingestellt. Im allgemeinen wird die Transformante bei ungefähr 20 °C bis 35 °C für ungefähr 24 bis 72 Stunden kultiviert. Wenn notwendig, kann die Kultur belüftet oder gerührt werden.
  • Wenn Insektenzellen oder Insekten als Wirt verwendet werden, wird die Transformante beispielsweise in Grace-Insektenmedium kultiviert (Grace, T. C. C., Nature, 195, 788 (1962)), zu dem ein geeignetes Additiv, wie immobilisiertes 10%iges Rinderserum, zugegeben wird. Bevorzugt wird der pH des Mediums auf etwa 6,2 bis etwa 6,4 eingestellt. Normalerweise wird die Transformante bei etwa 27 °C für etwa 3 Tage bis etwa 5 Tage kultiviert, und wenn notwendig, kann die Kultur belüftet oder gerührt werden.
  • Wenn Tierzellen als Wirt eingesetzt werden, wird die Transformante in beispielsweise MEM-Medium, umfassend etwa 5 % bis etwa 20 % fetales Rinderserum, [Science, 122, 501 (1952)], DMEM-Medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI-1640-Medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], 199-Medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)], usw. kultiviert. Bevorzugt wird der pH des Mediums auf etwa 6 bis etwa 8 eingestellt. Die Transformante wird normalerweise bei etwa 30 °C bis etwa 40 °C für etwa 15 Stunden bis etwa 60 Stunden kultiviert, und wenn notwendig, kann die Kultur belüftet oder gerührt werden.
  • Wie oben beschrieben, kann das Polypeptid der vorliegenden Erfindung im Inneren, in der Zellmembran oder an der Außenseite der Transformante usw. hergestellt werden.
  • Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann von der oben beschriebenen Kultur beispielsweise durch die folgenden Verfahren abgetrennt und gereinigt werden.
  • Wenn das Polypeptid der vorliegenden Erfindung aus der Kultur oder Zellen extrahiert wird, werden nach der Kultivierung die Transformante oder Zelle durch ein öffentlich bekanntes Verfahren gesammelt und in einem geeigneten Puffer suspendiert. Die Transformante oder Zelle wird dann durch öffentlich bekannte Verfahren, wie Ultraschallbehandlung, eine Behandlung mit Lysozym und/oder Gefrier-Tau-Kreislauf, gefolgt von Zentrifugation, Filtration usw. gespalten. So kann das rohe Extrakt des Polypeptids erhalten werden. Der Puffer, der für die Verfahrensweisen verwendet wird, kann einen Proteinmodifikator, wie Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid, oder ein oberflächenaktives Mittel, wie Triton X-100TM, usw. enthalten. Wenn das Polypeptid in der Kulturlösung sekretiert wird, kann nach der Beendigung der Kultivierung der Überstand von der Transformante oder Zelle abgetrennt werden, um den Überstand durch ein öffentlich bekanntes Verfahren zu sammeln.
  • Der Überstand oder das Polypeptid, das in dem so erhaltenen Extrakt enthalten ist, kann durch geeignetes Kombinieren der öffentlich bekannten Verfahren zur Trennung und Reinigung gereinigt werden. Diese öffentlich bekannten Verfahren zur Trennung und Reinigung umfassen ein Verfahren, das den Unterschied in der Löslichkeit nutzt, wie Aussalzen, Lösungsmittelausfällung usw.; ein Verfahren, das hauptsächlich den Unterschied im Molekulargewicht nutzt, wie Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese usw.; ein Verfahren, das den Unterschied in der elektrischen Ladung nutzt, wie Ionenaustauschchromatographie usw.; ein Verfahren, das den Unterschied in der spezifischen Affinität nutzt, wie Affinitätschromatographie usw.; ein Verfahren, das den Unterschied in der Hydrophobie nutzt, wie Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie usw.; ein Verfahren, das den Unterschied im isoelektrischen Punkt nutzt, wie isoelektrische Fokussierungselektrophorese; und dergleichen.
  • Wenn das so erhaltene Polypeptid in freier Form vorliegt, kann es in das Salz durch öffentlich bekannte Verfahren oder Modifikationen davon umgewandelt werden. Wenn andererseits das Polypeptid in Form eines Salzes erhalten wird, kann es in die freie Form oder in die Form eines anderen Salzes durch öffentlich bekannte Verfahren oder Modifikationen davon umgewandelt werden.
  • Das Polypeptid, das durch die Rekombinante hergestellt wird, kann vor oder nach der Reinigung mit einem geeigneten Protein-modifizierenden Enzym behandelt werden, so daß das Protein oder Teilpeptid geeignet modifiziert werden kann, um ein Polypeptid teilweise zu entfernen. Beispiele des Protein-modifizierenden Enzyms umfassen Trypsin, Chymotrypsin, Arginylendopeptidase, Proteinkinase, Glykosidase oder dergleichen.
  • Hierin nachstehend wird das Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung ausführlich beschrieben.
  • (i) Unter Verwendung des Rezeptorbindungsassaysystems über das Expressionssystem unter Verwendung des Rezeptors der vorliegenden Erfindung, seiner Teilpeptide oder Salze davon (hierin nachstehend manchmal insgesamt als der Rezeptor der vorliegenden Erfindung bezeichnet) oder unter Verwendung des rekombinanten Rezeptors der vorliegenden Erfindung, und (ii) unter Verwendung des Rezeptorbindungsassaysystems über das Expressionssystem unter Verwendung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung oder unter Verwendung des rekombinanten Polypeptids der vorliegenden Erfindung können Verbindungen (z. B. Peptide, Proteine, Nicht-Peptidverbindungen, synthetische Verbindungen, Fermentationsprodukte usw.) oder Salze davon, die die Bindungseigenschaften zwischen dem Rezeptor der vorliegenden Erfindung und dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung verändern, effizient gescreent werden.
  • Diese Verbindungen oder Salze davon umfassen 1) Verbindungen (Agonisten), die die zellstimulierende Aktivität aufweisen (z. B. die Aktivität, die die Arachidonsäurefreisetzung, Acetylcholinfreisetzung, intrazelluläre Ca2 +-Freisetzung, intrazelluläre cAMP-Produktion, Unterdrückung der intrazellulären cAMP-Produktion, intrazelluläre cGMP-Produktion, Inositolphosphatproduktion, Veränderung in dem Zellmembranpotential, Phosphorylierung von intrazellulären Proteinen, Aktivierung von c-fos, pH-Reduktion, GTPγS-Bindungsaktivität usw. fördert), vermittelt durch den Rezeptor der vorliegenden Erfindung; 2) Verbindungen (Antagonisten), die die oben beschriebene zellstimulierende Aktivität nicht aufweisen; 3) Verbindungen, die die Bindung des Rezeptors der vorliegenden Erfindung an den Liganden der vorliegenden Erfindung fördern; 4) Verbindungen, die die Bindung des Rezeptors der vorliegenden Erfindung an den Liganden der vorliegenden Erfindung inhibieren; und dergleichen.
  • Speziell wird der Vergleich zwischen (i) dem Fall, bei dem das Polypeptid der vorliegenden Erfindung mit dem Rezeptor der vorliegenden Erfindung in Kontakt gebracht wird, und (ii) dem Fall, bei dem das Polypeptid der vorliegenden Erfindung und eine Testverbindung mit dem Rezeptor der vorliegenden Erfindung in Kontakt gebracht werden, durchgeführt. Der Vergleich wird durch Analysieren von beispielsweise der Bindungsmenge des Polypeptids der vorliegenden Erfindung an den Rezeptor der vorliegenden Erfindung, der zellstimulierenden Aktivität oder dergleichen bewirkt.
  • Das Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt beispielsweise:
    • (1) ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder ihres Salzes, die die Bindungseigenschaft zwischen dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung und dem Rezeptor der vorliegenden Erfindung verändern, umfassend das Analysieren der Bindungsmenge einer markierten Form des Polypeptids der vorliegenden Erfindung an den Rezeptor der vorliegenden Erfindung (i) in dem Fall, bei dem eine markierte Form des Polypeptids der vorliegenden Erfindung mit dem obigen Rezeptor der vorliegenden Erfindung in Kontakt gebracht wird, und (ii) in dem Fall, bei dem eine markierte Form des Polypeptids der vorliegenden Erfindung und eine Testverbindung mit dem Rezeptor der vorliegenden Erfindung in Kontakt gebracht werden, und Vergleichen von (i) und (ii);
    • (2) ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder ihres Salzes, die die Bindungseigenschaft zwischen dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung und dem Rezeptor der vorliegenden Erfindung verändern, umfassend das Analysieren der Bindungsmenge einer markierten Form des Polypeptids der vorliegenden Erfindung an eine Zelle, die den Rezeptor der vorliegenden Erfindung enthält, oder ihre Zellmembran (i) in dem Fall, bei dem eine markierte Form des Polypeptids der vorliegenden Erfindung mit der Zelle, die den Rezeptor der vorliegenden Erfindung enthält, oder ihrer Zellmembran in Kontakt gebracht wird, und (ii) in dem Fall, bei dem eine markierte Form des Polypeptids der vorliegenden Erfindung und eine Testverbindung mit der Zelle, die den Rezeptor der vorliegenden Erfindung enthält, oder ihrer Zellmembran in Kontakt gebracht werden, und Vergleichen von (i) und (ii);
    • (3) ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder ihres Salzes, die die Bindungseigenschaft zwischen dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung und dem Rezeptor der vorliegenden Erfindung verändern, umfassend das Analysieren der Bindungsmenge einer markierten Form des Polypeptids der vorliegenden Erfindung an den Rezeptor der vorliegenden Erfindung (i) in dem Fall, bei dem eine markierte Form des Polypeptids der vorliegenden Erfindung mit dem Rezeptor der vorliegenden Erfindung, exprimiert auf einer Zellmembran durch Kultivieren einer Transformante, die eine DNA enthält, welche den Rezeptor der vorliegenden Erfindung codiert, in Kontakt gebracht wird, und (ii) in dem Fall, bei dem eine markierte Form des Polypeptids der vorliegenden Erfindung und eine Testverbindung mit dem Rezeptor der vorliegenden Erfindung, exprimiert auf einer Zellmembran durch Kultivieren einer Trans formante, die eine DNA enthält, welche den Rezeptor der vorliegenden Erfindung codiert, in Kontakt gebracht werden, und Vergleichen von (i) und (ii);
    • (4) ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder ihres Salzes, die die Bindungseigenschaft zwischen dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung und dem Rezeptor der vorliegenden Erfindung verändern, umfassend das Analysieren der zellstimulierenden Aktivität (z. B. der Aktivität, die die Arachidonsäurefreisetzung, Acetylcholinfreisetzung, intrazelluläre Ca2 +-Freisetzung, intrazelluläre cAMP-Produktion, Unterdrückung der intrazellulären cAMP-Produktion, intrazelluläre cGMP-Produktion, Inositolphosphatproduktion, Veränderung in dem Zellmembranpotential, Phosphorylierung von intrazellulären Proteinen, Aktivierung von c-fos, pH-Reduktion, GTPγS-Bindungsaktivität usw. fördert oder unterdrückt), vermittelt durch den Rezeptor der vorliegenden Erfindung, wenn das Polypeptid der vorliegenden Erfindung mit einer Zelle, die den Rezeptor der vorliegenden Erfindung enthält, in Kontakt gebracht wird, und wenn das Polypeptid der vorliegenden Erfindung und eine Testverbindung mit einer Zelle, die den Rezeptor der vorliegenden Erfindung enthält, in Kontakt gebracht werden, und Vergleichen der Aktivität; und
    • (5) ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder ihres Salzes, die die Bindungseigenschaft zwischen dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung und dem Rezeptor der vorliegenden Erfindung verändern, umfassend das Analysieren der zellstimulierenden Aktivität (z. B. der Aktivität, die die Arachidonsäurefreisetzung, Acetylcholinfreisetzung, intrazelluläre Ca2 +-Freisetzung, intrazelluläre cAMP-Produktion, Unterdrückung der intrazellulären cAMP-Produktion, intrazelluläre cGMP-Produktion, Inositolphosphatproduktion, Veränderung in dem Zellmembranpotential, Phosphorylierung von intrazellulären Proteinen, Aktivierung von c-fos, pH-Reduktion, GTPγS-Bindungsaktivität usw. fördert oder unterdrückt), vermittelt durch den Rezeptor der vorliegenden Erfindung, wenn das Polypeptid der vorliegenden Erfindung mit dem Rezeptor der vorliegenden Erfindung, exprimiert auf einer Zellmembran durch Kultivieren einer Transformante, die eine DNA enthält, welche den Rezeptor der vorliegenden Erfindung codiert, in Kontakt gebracht wird, und wenn das Polypeptid der vorliegenden Erfindung und eine Testverbindung mit dem Rezeptor der vorliegenden Erfindung, exprimiert auf einer Zellmembran durch Kultivieren einer Transformante, die eine DNA enthält, welche den Rezeptor der vorliegenden Erfindung codiert, in Kontakt gebracht werden, und Vergleichen der Aktivität; und dergleichen.
  • Das Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung wird nachstehend ausführlicher beschrieben.
  • Für den Rezeptor der vorliegenden Erfindung werden Membranfraktionen von menschlichen oder nicht-menschlichen Warmblüterorganen bevorzugt eingesetzt. Da es jedoch sehr schwierig ist, speziell vom Menschen stammende Organe zu erhalten, ist der Rezeptor der vorliegenden Erfindung oder dergleichen, der durch die Verwendung einer Rekombinante reichlich exprimiert wird, zur Verwendung beim Screening geeignet.
  • Bei der Herstellung des Rezeptors der vorliegenden Erfindung können die oben beschriebenen Verfahren zur Herstellung des Rezeptors der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
  • Wenn die Zelle, die den Rezeptor der vorliegenden Erfindung enthält, oder ihre Zellmembranfraktion in dem Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, werden die später beschriebenen Herstellungsverfahren verwendet.
  • Wenn die Zelle, die den Rezeptor der vorliegenden Erfindung enthält, in dem Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann die Zelle mit Glutaraldehyd, Formalin usw. fixiert werden. Die Fixierung kann durch ein öffentlich bekanntes Verfahren durchgeführt werden.
  • Die Zelle, die den Rezeptor der vorliegenden Erfindung enthält, bezieht sich auf eine Wirtszelle, in der der Rezeptor der vorliegenden Erfindung exprimiert wird. Beispiele einer solchen Wirtszelle umfassen, wie oben beschrieben, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Hefe, Insektenzellen, Tierzellen, usw. Die Wirtszellen, in denen der Rezeptor der vorliegenden Erfindung exprimiert wird, können in einer ähnlichen Weise wie bei dem oben beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Transformanten, transformiert durch Expressionsvektoren, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung enthalten, hergestellt werden.
  • Die Membranfraktion bezieht sich auf eine Fraktion, die reichlich Zellmembranen enthält, hergestellt durch öffentlich bekannte Verfahren nach der Zerstörung der Zellen. Beispiele der Zerstörung der Zellen umfassen Zellquetschen unter Verwendung eines Potter-Elvehjem- Homogenisators, Zerstörung unter Verwendung eines Waring-Mischers oder Polytrons (hergestellt von Kinematica Inc.), Zerstörung durch Ultraschallbehandlung, Zerstörung durch Zellsprühen über eine dünne Düse unter zunehmenden Druck unter Verwendung einer French-Presse usw., und dergleichen. Zellmembranen werden hauptsächlich durch die Fraktionierung unter Verwendung einer Zentrifugalkraft, wie der für die Fraktionierungszentrifugation, Dichtegradientenzentrifugation usw. fraktioniert. Beispielsweise wird die Zellzerstörungsflüssigkeit bei einer geringen Geschwindigkeit (500 U/min bis 3.000 U/min) für einen kurzen Zeitraum (normalerweise etwa 1 Minute bis etwa 10 Minuten) zentrifugiert, der resultierende Überstand wird dann bei einer höheren Geschwindigkeit (15.000 U/min bis 30.000 U/min) normalerweise für 30 Minuten bis 2 Stunden zentrifugiert. Der so erhaltene Niederschlag wird als die Membranfraktion verwendet. Die Membranfraktion ist reich an exprimiertem Rezeptor und Membrankomponenten, wie Zellen-abgeleitete Phospholipide, Membranproteine oder dergleichen.
  • Die Menge des Rezeptors der vorliegenden Erfindung in den Zellen, die den Rezeptor der vorliegenden Erfindung enthalten, oder in der Membranfraktion beträgt bevorzugt 103 bis 108 Moleküle pro Zelle, stärker bevorzugt 105 bis 107 Moleküle pro Zelle. Wenn sich der Expressionsgrad erhöht, erhöht sich die Ligandenbindungsaktivität pro Einheit an Membranfraktion (spezifische Aktivität), so daß nicht nur das stark empfindliche Screening-System konstruiert werden kann, sondern ebenso große Mengen an Proben mit derselben Charge analysiert werden können.
  • Um die oben beschriebenen Screening-Verfahren (1) bis (3) durchzuführen, sind eine geeignete Fraktion des Rezeptors der vorliegenden Erfindung und eine markierte Form des Polypeptids der vorliegenden Erfindung usw. erforderlich. Die Fraktion des Rezeptors der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt eine Fraktion einer natürlich vorkommenden Form des Rezeptors der vorliegenden Erfindung oder eine Fraktion eines rekombinanten Typs des Rezeptors der vorliegenden Erfindung mit einer äquivalenten Aktivität dazu. Hier bedeutet der Ausdruck äquivalente Aktivität eine äquivalente Ligandenbindungsaktivität usw. Als der markierte Ligand kann ein markierter Ligand, eine dem markierten Liganden analoge Verbindung usw. verwendet werden. Beispielsweise können Liganden verwendet werden, die mit [3H], [125I], [14C], [35S] usw. markiert sind.
  • Speziell wird die Verbindung, die die Bindungseigenschaft zwischen dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung und dem Rezeptor der vorliegenden Erfindung verändert, durch die folgenden Verfahrensweisen gescreent. Zunächst wird ein Rezeptorpräparat durch Suspendieren der Zellen, die den Rezeptor der vorliegenden Erfindung enthalten, oder ihrer Membranfraktion in einem Puffer, der zur Verwendung in dem Screening-Verfahren geeignet ist, hergestellt. Jeder Puffer kann verwendet werden, so lange wie er sich nicht auf die Liganden-Rezeptor-Bindung auswirkt, einschließlich eines Phosphatpuffers oder eines Tris-HCl-Puffers mit einem pH von 4 bis 10 (bevorzugt pH von 6 bis 8) usw. Für den Zweck der Verringerung der nicht-spezifischen Bindung kann ein oberflächenaktives Mittel, wie CHAPS, Tween-80TM (Kao-Atlas Inc.), Digitonin, Deoxycholat usw., gegebenenfalls zu dem Puffer zugegeben werden. Ferner kann für den Zweck der Unterdrückung des Abbaus des Rezeptors der vorliegenden Erfindung oder des Polypeptids der vorliegenden Erfindung mit einer Protease ein Proteaseinhibitor, wie PMSF, Leupeptin, E-64 (hergestellt von Peptide Institute, Inc.), Pepstatin usw. ebenso zugegeben werden. Eine vorgegebene Menge (5.000 cpm bis 500.000 cpm) des markierten Polypeptids der vorliegenden Erfindung wird zu 0,01 ml bis 10 ml der Rezeptorlösung zugegeben, in der 10-10 M bis 10-7 M einer Testverbindung ebenso vorliegen. Um die Menge der nicht-spezifischen Bindung (NSB) zu bestimmen, wird ebenso ein Reaktionsröhrchen, beschickt mit einer nicht markierten Form des Polypeptids der vorliegenden Erfindung in einem großen Überschuß, bereitgestellt. Die Reaktion wird bei ungefähr 0 °C bis 50 °C, bevorzugt 4 °C bis 37 °C für 20 Minuten bis 24 Stunden, bevorzugt 30 Minuten bis 3 Stunden durchgeführt. Nach der Beendigung der Reaktion wird das Reaktionsgemisch durch Glasfaserfilterpapier usw. filtriert und mit einem geeigneten Volumen desselben Puffers gewaschen. Die restliche Radioaktivität auf dem Glasfaserfilterpapier wird dann mittels eines Flüssigszintillationszählers oder γ-Zählers gemessen. Wenn nicht-spezifische Bindung (NSB) von der Zählung (B0) subtrahiert wird, wo jede antagonisierende Substanz abwesend ist, und die resultierende Zählung (B0 minus NSB) 100 % beträgt, kann die Testverbindung, die die spezifische Bindungsmenge (B minus NSB) von z. B. 50 % oder weniger zeigt, als eine mögliche Verbindung ausgewählt werden.
  • Um das oben beschriebene Screening-Verfahren (4) oder (5) durchzuführen, kann die zellstimulierende Aktivität (z. B. die Aktivität, die die Arachidonsäurefreisetzung, Acetylcholinfreisetzung, intrazelluläre Ca2 +-Freisetzung, intrazelluläre cAMP-Produktion, Unterdrückung der intrazellulären cAMP-Produktion, intrazelluläre cGMP-Produktion, Inositolphosphatproduk tion, Veränderung in dem Zellmembranpotential, Phosphorylierung von intrazellulären Proteinen, Aktivierung von c-fos, pH-Reduktion, GTPγS-Bindungsaktivität usw. fördert oder unterdrückt), vermittelt durch den Rezeptor der vorliegenden Erfindung, durch ein öffentlich bekanntes Verfahren oder unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Assaykits bestimmt werden. Speziell werden die Zellen, die den Rezeptor der vorliegenden Erfindung enthalten, zunächst auf einer Mehrlochplatte usw. kultiviert. Vor dem Screening wird das Medium mit frischem Medium oder mit einem geeigneten nicht-zytotoxischen Puffer ersetzt, gefolgt von der Inkubation für einen vorgegebenen Zeitraum in Gegenwart einer Testverbindung usw. Anschließend werden die Zellen extrahiert, oder der Überstand wird rückgewonnen, und das resultierende Produkt wird durch entsprechende Verfahren quantifiziert. Wo es schwierig ist, die Produktion des Indikators der zellstimulierenden Aktivität (z. B. Arachidonsäure usw.) aufgrund eines abbauenden Enzyms, das in den Zellen enthalten ist, zu detektieren, kann ein Inhibitor gegen ein solches abbauendes Enzym vor dem Assay zugegeben werden. Zum Detektieren der Aktivität, wie der cAMP-Produktionsunterdrückung, wird die Grundproduktion in den Zellen zuvor durch Forskolin oder dergleichen erhöht und die unterdrückende Wirkung auf die zunehmende Grundproduktion kann detektiert werden.
  • Für das Screening durch den Assay der zellstimulierenden Aktivität sind entsprechende Zellen, in denen der Rezeptor der vorliegenden Erfindung exprimiert wird, erforderlich. Bevorzugte Zellen, in denen der Rezeptor der vorliegenden Erfindung exprimiert wird, sind die zuvor genannte Zellinie, in der der Rezeptor der vorliegenden Erfindung exprimiert wird, usw.
  • Beispiele der Testverbindung umfassen Peptide, Proteine, Nicht-Peptidverbindungen, synthetische Verbindungen, Fermentationsprodukte, Zellextrakte, Pflanzenextrakte, Tiergewebeextrakte usw.
  • Ein Kit zum Screenen der Verbindung oder ihres Salzes, die die Bindungseigenschaft zwischen dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung und dem Rezeptor der vorliegenden Erfindung verändern, umfaßt den Rezeptor der vorliegenden Erfindung, oder Zellen, die den Rezeptor der vorliegenden Erfindung enthalten, oder eine Membranfraktion der Zellen und das Polypeptid der vorliegenden Erfindung.
  • Beispiele des Screening-Kits der vorliegenden Erfindung werden nachstehend angegeben.
  • 1. Reagens für das Screening
  • (a) Assaypuffer und Waschpuffer
  • Hanks-Mineralsalzmedium (hergestellt von Gibco Co.), ergänzt mit 0,05 % Rinderserumalbumin (Sigma Co.).
  • Die Lösung wird durch Filtration durch einen 0,45-μm-Filter sterilisiert und bei 4 °C gelagert. Alternativ kann die Lösung bei Gebrauch hergestellt werden.
  • (b) Herstellung des Rezeptors der vorliegenden Erfindung
  • CHO-Zellen, in den der Rezeptor der vorliegenden Erfindung exprimiert wird, werden in einer 12-Loch-Platte bei 5 × 105 Zellen/Loch subkultiviert und dann bei 37 °C unter 5 % CO2 und 95 % Luft für 2 Tage kultiviert.
  • (c) Markierter Ligand
  • Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, das mit kommerziell erhältlichem [3H], [125I], [14C], [35S] usw. markiert wurde, wird in einem geeigneten Lösungsmittel oder Puffer gelöst. Die Lösung wird bei 4 °C oder -20 °C gelagert und auf 1 μM mit einem Assaypuffer bei Gebrauch verdünnt.
  • (d) Standardligandenlösung
  • Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung wird in PBS, ergänzt mit 0,1 % Rinderserumalbumin (hergestellt von Sigma, Inc.), in einer Konzentration von 1 mM gelöst, und die Lösung wird bei -20 °C gelagert.
  • 2. Assayverfahren
    • (a) Zellen werden in einer 12-Loch-Gewebekulturplatte kultiviert, um den Rezeptor der vorliegenden Erfindung zu exprimieren. Nach dem zweimaligen Waschen der Zellen mit 1 ml des Assaypuffers werden 490 μl des Assaypuffers zu jedem Loch zugegeben.
    • (b) Nachdem 5 μl einer 10-3 bis 10-10 M Testverbindungslösung zugegeben werden, werden 5 μl einer markierten Form des Peptids der vorliegenden Erfindung zu dem System zugege ben, gefolgt von der Umsetzung bei Raumtemperatur für eine Stunde. Um die Menge der nicht-spezifischen Bindung zu bestimmen, werden 10-3 M Polypeptid der vorliegenden Erfindung in einer Menge von 5 μl anstelle der Testverbindung zugegeben.
    • (c) Das Reaktionsgemisch wird entfernt und dreimal mit jeweils 1 ml des Waschpuffers gewaschen. Das markierte Polypeptid der vorliegenden Erfindung, das an die Zellen gebunden ist, wird in 0,2N NaOH-1 % SDS gelöst und mit 4 ml eines Flüssigszintillators A gemischt (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
    • (d) Radioaktivität wird unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers (hergestellt von Beckmann) gemessen und PMB (Prozentsatz an maximaler Bindung) gemäß der folgenden Gleichung 1 berechnet: PMB = [(B - NSB)/(B0 - NSB)] × 100,worin:
      PMB:
      Prozentsatz an maximaler Bindung
      B:
      Wert, wenn eine Probe zugegeben wird
      NSB:
      nicht-spezifische Bindung
      B0:
      maximale Bindung
  • Die Verbindung oder ihr Salz, die durch das Screening-Verfahren oder den Screening-Kit der vorliegenden Erfindung erhältlich ist, ist die Verbindung, die die Bindungseigenschaft zwischen dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung und dem Rezeptor der vorliegenden Erfindung verändert, oder die Verbindung, die die Aktivität des Rezeptors der vorliegenden Erfindung fördert oder inhibiert. Speziell sind diese Verbindungen 1) Verbindungen oder Salze davon, die die zellstimulierende Aktivität zeigen, vermittelt durch den Rezeptor der vorliegenden Erfindung (die Rezeptoragonisten der vorliegenden Erfindung), 2) Verbindungen, die keine zellstimulierende Aktivität zeigen (die Rezeptorantagonisten der vorliegenden Erfindung), 3) Verbindungen, die die Bindung des Rezeptors der vorliegenden Erfindung an den Liganden der vorliegenden Erfindung fördern, 4) Verbindungen, die die Bindung des Rezeptors der vorliegenden Erfindung an den Liganden der vorliegenden Erfindung inhibieren; usw. Beispiele von solchen Verbindungen umfassen Verbindungen, ausgewählt aus Peptiden, Proteinen, Nicht-Peptid-Verbindungen, synthetischen Verbindungen, Fermentationsproduk ten, Zellextrakten, Pflanzenextrakten, Tiergewebeextrakten, Plasma usw. Diese Verbindungen können entweder neue oder öffentlich bekannte Verbindungen sein.
  • Als Salze von diesen Verbindungen können die verwendet werden, die den Salzen des oben beschriebenen Polypeptids der vorliegenden Erfindung ähnlich sind.
  • Um zu bewerten, ob die Verbindung der oben beschriebene Rezeptoragonist oder -antagonist der vorliegenden Erfindung ist, wird dies durch (i) oder (ii) nachstehend bestimmt.
    • (i) Gemäß den Screening-Verfahren (1) bis (3) wird der Bindungsassay durchgeführt, um die Verbindung zu erhalten, die die Bindungseigenschaft zwischen dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung und dem Rezeptor der vorliegenden Erfindung verändert (speziell die Verbindung, die die Bindung inhibiert). Es wird dann bestimmt, ob die Verbindung die obige zellstimulierende Aktivität aufweist, vermittelt durch den Rezeptor der vorliegenden Erfindung. Die Verbindung oder ihr Salz mit der zellstimulierenden Aktivität ist der Rezeptoragonist der vorliegenden Erfindung, während die Verbindung oder ihr Salz ohne eine solche Aktivität der Rezeptorantagonist der vorliegenden Erfindung ist.
    • (ii) (a) Eine Testverbindung wird mit einer Zelle, die den Rezeptor der vorliegenden Erfindung enthält, in Kontakt gebracht, wobei die zuvor genannte zellstimulierende Aktivität, vermittelt durch den Rezeptor der vorliegenden Erfindung, analysiert wird. Die Verbindung oder ihr Salz mit der zellstimulierenden Aktivität ist der Rezeptoragonist der vorliegenden Erfindung.
    • (b) Die zellstimulierende Aktivität, vermittelt durch den Rezeptor der vorliegenden Erfindung, wird in dem Fall, wo das Polypeptid der vorliegenden Erfindung mit Zellen, die den Rezeptor der vorliegenden Erfindung enthalten, in Kontakt gebracht wird, und in dem Fall, wo das Polypeptid der vorliegenden Erfindung und eine Testverbindung mit Zellen, die den Rezeptor der vorliegenden Erfindung enthalten, in Kontakt gebracht werden, analysiert und dazwischen verglichen. Die Verbindung oder ihr Salz, die die zellstimulierende Aktivität, die durch die Verbindung induziert wird, die den Rezeptor der vorliegenden Erfindung aktiviert, verringern kann, ist der Rezeptorantagonist der vorliegenden Erfindung.
  • Die Rezeptoragonisten der vorliegenden Erfindung zeigen eine ähnliche physiologische Aktivität [(z. B. eine Appetit-anregende Aktivität)], die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung an dem Rezeptor der vorliegenden Erfindung besitzt, und sind daher sichere und gering toxische Arzneimittel (z. B. Präventivmittel/Therapeutika für Magersucht, Appetitanregungsmittel usw.).
  • Die Rezeptorantagonisten der vorliegenden Erfindung können die physiologische Aktivität [(z. B. eine Appetit-anregende Aktivität)], die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung an dem Rezeptor der vorliegenden Erfindung aufweist, unterdrücken, und sind daher als sichere und gering toxische Arzneimittel zur Behandlung/Vorbeugung von beispielsweise Fettleibigkeit [z. B. maligner Mastozytose, exogener Fettleibigkeit, hyperinsulinärer Fettleibigkeit, hyperplasmischer Fettleibigkeit, hypophysärer Fettleibigkeit, hypoplasmischer Fettleibigkeit, hypothyroidaler Fettleibigkeit, hypothalamischer Fettleibigkeit, symptomatischer Fettleibigkeit, infantiler Fettleibigkeit, Oberkörperfettleibigkeit, alimentärer Fettleibigkeit, hypogonadaler Fettleibigkeit, systemischer Mastozytose, einfacher Fettleibigkeit, zentraler Fettleibigkeit usw.], Hyperphagie usw. nützlich.
  • Die Verbindungen, die die Bindung des Rezeptors der vorliegenden Erfindung an den Liganden der vorliegenden Erfindung fördern, sind als sichere und gering toxische Arzneimittel (z. B. Präventivmittel/Therapeutika für Magersucht, Appetitanregungsmittel usw.) nützlich.
  • Die Verbindungen, die die Bindung des Rezeptors der vorliegenden Erfindung an den Liganden der vorliegenden Erfindung inhibieren, sind als sichere und gering toxische Arzneimittel zur Behandlung/Vorbeugung von beispielsweise Fettleibigkeit [z. B. maligner Mastozytose, exogener Fettleibigkeit, hyperinsulinärer Fettleibigkeit, hyperplasmischer Fettleibigkeit, hypophysärer Fettleibigkeit, hypoplasmischer Fettleibigkeit, hypothyroidaler Fettleibigkeit, hypothalamischer Fettleibigkeit, symptomatischer Fettleibigkeit, infantiler Fettleibigkeit, Oberkörperfettleibigkeit, alimentärer Fettleibigkeit, hypogonadaler Fettleibigkeit, systemischer Mastozytose, einfacher Fettleibigkeit, zentraler Fettleibigkeit usw.], Hyperphagie usw. nützlich.
  • Wenn die Verbindung oder ihre Salze, die durch das Screening-Verfahren oder den Screening-Kit der vorliegenden Erfindung erhalten werden, als die oben beschriebenen Arzneimit tel (Prophylaktika/Therapeutika) verwendet werden, können die Verbindung oder ihre Salze zu pharmazeutischen Präparaten in einer konventionellen Weise verarbeitet werden.
  • Beispielsweise können die Verbindung oder ihre Salze oral verwendet werden, beispielsweise in Form von Tabletten, gegebenenfalls überzogen mit Zucker, Kapseln, Elixieren, Mikrokapseln usw., oder parenteral in Form von injizierbaren Präparaten, wie einer sterilen Lösung, einer Suspension usw., in Wasser oder mit einer anderen pharmazeutisch akzeptablen Flüssigkeit (z. B. intravenös, subkutan, pernasal usw.). Diese Präparate können durch Mischen des Polypeptids der vorliegenden Erfindung mit einem physiologisch akzeptablen bekannten Träger, einem Geschmacksstoff, einem Hilfsmittel, einem Vehikel, einem Antiseptikum, einem Stabilisator, einem Bindemittel usw. in einer Einheitsdosierungsform hergestellt werden, die in einer allgemein akzeptierten Weise erforderlich ist, die auf die Herstellung von pharmazeutischen Präparaten angewendet wird. Der Wirkstoff in dem Präparat wird in einer solchen Dosis eingestellt, daß eine entsprechende Dosis innerhalb des angegebenen spezifizierten Bereiches erhalten wird.
  • Additive, die mit Tabletten, Kapseln usw. mischbar sind, umfassen ein Bindmittel, wie Gelatine, Maisstärke, Traganth und Gummiarabikum, ein Hilfsmittel, wie kristalline Cellulose, ein Quellungsmittel, wie Maisstärke, Gelatine, Alginsäure usw., ein Schmiermittel, wie Magnesiumstearat, ein Süßungsstoff, wie Saccharose, Lactose und Saccharin, und einen Geschmacksstoff, wie Pfefferminze, Akamonoöl oder Kirsche, und dergleichen. Wenn die Einheitsdosierungen in der Form von Kapseln vorliegen, können flüssige Träger wie Öle und Fette außerdem zusammen mit den oben beschriebenen Additiven verwendet werden. Eine sterile Zusammensetzung zur Injektion kann gemäß einer konventionellen Weise formuliert werden, die verwendet wird, um pharmazeutische Zusammensetzungen herzustellen, beispielsweise durch Lösen oder Suspendieren der Wirkstoffe in einem Vehikel, wie Wasser zur Injektion mit einem natürlich vorkommenden Pflanzenöl, wie Sesamöl und Kokosnußöl usw.
  • Beispiele eines wässerigen Mediums zur Injektion umfassen physiologische Kochsalzlösung und eine isotonische Lösung, die Glukose und andere Hilfsmittel (z. B. D-Sorbitol, D-Mannitol, Natriumchlorid usw.) usw. enthält, und können in Kombination mit einem geeigneten Auflösungshilfsmittel, wie einem Alkohol (z. B. Ethanol oder dergleichen), einem Polyalkohol (z. B. Propylenglykol, Polyethylenglykol usw.), einem nicht-ionischen oberflä chenaktiven Mittel (z. B. Polysorbate 80TM, HCO-50 usw.) und dergleichen verwendet werden. Beispiele des öligen Mediums umfassen Sesamöl, Sojabohnenöl usw., das ebenso in Kombination mit einem Auflösungshilfsmittel wie Benzylbenzoat, Benzylalkohol usw. verwendet werden kann. Das oben beschriebene Prophylaktikum/Therapeutikum kann außerdem mit einem Puffer (z. B. Phosphatpuffer, Natriumacetatpuffer usw.), einem Beruhigungsmittel (z. B. Benzalkoniumchlorid, Prokainhydrochlorid usw.), einem Stabilisator (z. B. menschliches Serumalbumin, Polyethylenglykol usw.), einem Konservierungsmittel (z. B. Benzylalkohol, Phenol usw.), einem Antioxidationsmittel usw. formuliert werden. Die so hergestellte Flüssigkeit zur Injektion wird normalerweise in eine geeignete Ampulle gefüllt.
  • Da das so erhaltene pharmazeutische Präparat sicher und gering toxisch ist, kann das Präparat an den menschlichen oder nicht-menschlichen Warmblüter verabreicht werden (z. B. Maus, Ratte, Kaninchen, Schaf, Schwein, Rind, Pferd, Huhn, Katze, Hund, Affe, Schimpanse usw.).
  • Die Dosis der Verbindung oder ihrer Salze kann in Abhängigkeit von ihrer Wirkung, der Zielkrankheit, dem Patienten, an den sie verabreicht werden soll, der Verabreichungsweise usw. variieren.
  • Die Verbindung (Agonist) wird oral an den Patienten mit beispielsweise Magersucht (bei 60 kg Körpergewicht) in einer Dosis von etwa 0,1 bis 100 mg, bevorzugt etwa 1,0 bis 50 mg, und stärker bevorzugt etwa 1,0 bis 20 mg pro Tag verabreicht. Bei der parenteralen Verabreichung, wenn die Verbindung an den Patienten mit beispielsweise Magersucht (bei 60 kg Körpergewicht) in Form einer Injektion verabreicht wird, ist es vorteilhaft, die Verbindung intravenös bei einer täglichen Dosis von etwa 0,01 bis 30 mg, bevorzugt etwa 0,1 bis 20 mg and stärker bevorzugt etwa 0,1 bis 10 mg zu verabreichen. Bevorzugt wird die Verbindung an das Nervenzentrum verabreicht oder in einer Dosierungsform mit hoher Transportierbarkeit für das Nervenzentrum verabreicht. Für andere Tierspezies kann die entsprechende Dosis, auf 60 kg Körpergewicht umgerechnet, verabreicht werden.
  • Außerdem wird die Verbindung (Antagonist) oral an den Patienten mit beispielsweise Fettleibigkeit (bei 60 kg Körpergewicht) in einer Dosis von etwa 0,1 bis 100 mg, bevorzugt etwa 1,0 bis 50 mg und stärker bevorzugt etwa 1,0 bis 20 mg pro Tag verabreicht. Bei der parenteralen Verabreichung ist es, wenn die Verbindung an den Patienten mit beispielsweise Fettlei bigkeit (bei 60 kg Körpergewicht) in Form von Injektion verabreicht wird, vorteilhaft, die Verbindung intravenös bei einer täglichen Dosis von etwa 0,01 bis 30 mg, bevorzugt etwa 0,1 bis 20 mg, und stärker bevorzugt etwa 0,1 bis 10 mg zu verabreichen. Bevorzugt wird die Verbindung an das Nervenzentrum verabreicht oder in einer Dosierungsform mit hoher Transportierbarkeit für das Nervenzentrum verabreicht. Für andere Tierspezies kann die entsprechende Dosis, auf 60 kg Körpergewicht umgerechnet, verabreicht werden.
  • Außerdem stellt die vorliegende Erfindung die Nützlichkeiten des (a) Rezeptors der vorliegenden Erfindung, (b) der DNA der vorliegenden Erfindung, (c) des Antikörpers der vorlegenden Erfindung und (d) der Antisense-DNA bereit. Hierin nachstehend werden der Rezeptor der vorliegenden Erfindung und die DNA, die den Rezeptor oder sein Teilpeptid codiert, manchmal nur als die DNA der vorliegenden Erfindung bezeichnet.
  • (1) Präventivmittel/Therapeutikum für Krankheiten, mit denen der Rezeptor der vorliegenden Erfindung verbunden ist
  • Die Reaktion des Rezeptors der vorliegenden Erfindung auf das Polypeptid der vorliegenden Erfindung führt zur Stimulation des Eßverhaltens.
  • Deshalb ist es, wenn der Rezeptor der vorliegenden Erfindung oder die DNA der vorliegenden Erfindung irgendeine(n) Abnormalität oder Mangel umfaßt, oder wenn der Rezeptor der vorliegenden Erfindung oder die DNA, die den Rezeptor codiert, irgendeine(n) Abnormalität oder Mangel umfaßt, sehr wahrscheinlich, daß z. B. Magersucht, Appetitlosigkeit usw. hervorgerufen werden. Daher können der Rezeptor der vorliegenden Erfindung und das Polynukleotid (z. B. DNA), das den Rezeptor codiert, als Präventivmittel/Therapeutika für z. B. Magersucht, Appetitanregungsmittel usw. verwendet werden.
  • Wenn ein Patient/eine Patientin ein verringertes Niveau oder einen Mangel an dem Rezeptor der vorliegenden Erfindung in seinem oder ihrem Körper aufweist, können der Rezeptor der vorliegenden Erfindung und die DNA der vorliegenden Erfindung die Rolle des Rezeptors der vorliegenden Erfindung für den Patienten ausreichend oder geeignet bereitstellen (a) durch Verabreichen der DNA der vorliegenden Erfindung an den Patienten, um den Rezeptor der vorliegenden Erfindung im Körper zu exprimieren, (b) durch Einführen der DNA der vorliegenden Erfindung in eine Zelle, Exprimieren des Rezeptors der vorliegenden Erfindung und dann Transplantieren der Zelle in den Patienten, oder (c) durch Verabreichen des Rezeptors der vorliegenden Erfindung an den Patienten, oder dergleichen.
  • Wenn die DNA der vorliegenden Erfindung als die oben beschriebenen Präventivmittel/Therapeutika verwendet wird, wird die DNA direkt an den menschlichen oder nicht-menschlichen Warmblüter verabreicht; alternativ wird die DNA in einen geeigneten Vektor eingefügt, wie Retrovirusvektor, Adenovirusvektor, Adenovirus-assoziierter Virusvektor usw. und dann an den menschlichen oder nicht-menschlichen Warmblüter in einer konventionellen Weise verabreicht. Die DNA der vorliegenden Erfindung kann ebenso als bloße DNA oder mit Adjuvanzien zur Unterstützung ihrer Aufnahme durch eine Genkanone oder durch einen Katheter wie einen Katheter mit einem Hydrogel verabreicht werden.
  • Wo der Rezeptor der vorliegenden Erfindung als die zuvor genannten Präventivmittel/Therapeutika verwendet wird, wird der Rezeptor vorteilhafterweise bei einem Reinheitsniveau von mindestens 90 %, bevorzugt mindestens 95 %, stärker bevorzugt mindestens 98 % und am stärksten bevorzugt mindestens 99 % verwendet.
  • Der Rezeptor der vorliegenden Erfindung kann oral verwendet werden, beispielsweise in Form von Tabletten, die nach Bedarf zuckerüberzogen sein können, Kapseln, Elixieren, Mikrokapseln usw., oder parenteral in Form von injizierbaren Präparaten, wie einer sterilen Lösung und einer Suspension in Wasser oder mit eine anderen pharmazeutisch akzeptablen Flüssigkeit (z. B. intravenös, subkutan, pernasal usw., bevorzugt subkutan). Die Präparate können durch Mischen des Rezeptors der vorliegenden Erfindung mit einem physiologisch akzeptablen bekannten Träger, einem Geschmacksstoff, einem Hilfsmittel, einem Vehikel, einem Antiseptikum, einem Stabilisator, einem Bindemittel usw. in einer Einheitsdosierungsform hergestellt werden, die in einer allgemein akzeptierten Weise erforderlich ist, die auf die Herstellung von pharmazeutischen Präparaten angewendet wird. Der Wirkstoff in dem Präparat wird in einer solchen Dosis eingestellt, daß eine entsprechende Dosis innerhalb des angegebenen spezifizierten Bereiches erhalten wird.
  • Additive, die mit Tabletten, Kapseln usw. mischbar sind, umfassen ein Bindmittel, wie Gelatine, Maisstärke, Traganth und Gummiarabikum, ein Hilfsmittel, wie kristalline Cellulose, ein Quellungsmittel, wie Maisstärke, Gelatine, Alginsäure usw., ein Schmiermittel, wie Magne siumstearat, ein Süßungsstoff, wie Saccharose, Lactose und Saccharin, und einen Geschmacksstoff, wie Pfefferminze, Akamonoöl oder Kirsche usw. Wenn die Einheitsdosierungen in der Form von Kapseln vorliegen, können flüssige Träger wie Öle und Fette außerdem zusammen mit den oben beschriebenen Additiven verwendet werden. Eine sterile Zusammensetzung zur Injektion kann gemäß einer konventionellen Weise formuliert werden, die verwendet wird, um pharmazeutische Zusammensetzungen herzustellen, beispielsweise durch Lösen oder Suspendieren der Wirkstoffe in einem Vehikel, wie Wasser zur Injektion mit einem natürlich vorkommenden Pflanzenöl, wie Sesamöl und Kokosnußöl usw., um die pharmazeutische Zusammensetzung herzustellen.
  • Beispiele eines wässerigen Mediums zur Injektion umfassen physiologische Kochsalzlösung und eine isotonische Lösung, die Glukose und andere Hilfsmittel enthält (z. B. D-Sorbitol, D-Mannitol, Natriumchlorid usw.), und können in Kombination mit einem geeigneten Auflösungshilfsmittel, wie einem Alkohol (z. B. Ethanol oder dergleichen), einem Polyalkohol (z. B. Propylenglykol, Polyethylenglykol usw.), einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel (z. B. Polysorbate 80TM, HCO-50 usw.) oder dergleichen verwendet werden. Beispiele des öligen Mediums umfassen Sesamöl, Sojabohnenöl und dergleichen, das ebenso in Kombination mit einem Auflösungshilfsmittel wie Benzylbenzoat, Benzylalkohol usw. verwendet werden kann. Die oben beschriebenen Präventivmittel/Therapeutika können außerdem mit einem Puffer (z. B. Phosphatpuffer, Natriumacetatpuffer usw.), einem Beruhigungmittel (z. B. Benzalkoniumchlorid, Prokainhydrochlorid usw.), einem Stabilisator (z. B. menschliches Serumalbumin, Polyethylenglykol usw.), einem Konservierungsmittel (z. B. Benzylalkohol, Phenol usw.), einem Antioxidationsmittel usw. formuliert werden. Die so hergestellte Flüssigkeit zur Injektion wird normalerweise in eine geeignete Ampulle gefüllt.
  • Der Vektor, in den die DNA der vorliegenden Erfindung eingeführt wird, kann ebenso zu pharmazeutischen Präparaten in einer Weise verarbeitet werden, die den obigen Verfahrensweisen ähnlich ist. Diese Präparate werden im allgemeinen parenteral verwendet.
  • Da das so erhaltene pharmazeutische Präparat sicher und gering toxisch ist, kann das Präparat an den menschlichen oder nicht-menschlichen Warmblüter verabreicht werden (z. B. Ratte, Maus, Meerschweinchen, Kaninchen, Huhn, Schaf, Schwein, Rind, Pferd, Katze, Hund, Affe usw.).
  • Die Dosis des Rezeptors der vorliegenden Erfindung kann in Abhängigkeit der Zielkrankheit, dem Patienten, an den sie verabreicht werden soll, der Verabreichungsweise usw. variieren; wo beispielsweise der Rezeptor der vorliegenden Erfindung als ein Appetitanregungsmittel subkutan verabreicht wird, beträgt die Dosis normalerweise etwa 0,1 mg bis etwa 100 mg, bevorzugt etwa 1,0 bis etwa 50 mg und stärker bevorzugt etwa 1,0 bis etwa 20 mg pro Tag für einen Erwachsenen (bei 60 kg Körpergewicht). Bevorzugt wird die Verbindung an das Nervenzentrum verabreicht oder in einer Dosierungsform verabreicht, die zu dem Nervenzentrum hoch transportabel ist. Für andere Tierspezies kann die entsprechende Dosis, auf 60 kg Körpergewicht umgerechnet, verabreicht werden.
  • (2) Gendiagnostikum
  • Unter Verwendung der DNA der vorliegenden Erfindung, z. B. als eine Sonde, kann die Abnormalität (Genabnormalität) der DNA oder mRNA, die den Rezeptor der vorliegenden Erfindung codiert, in dem menschlichen oder nicht-menschlichen Warmblüter (z. B. Ratte, Maus, Meerschweinchen, Kaninchen, Huhn, Schaf, Schwein, Rind, Pferd, Katze, Hund, Affe usw.) detektiert werden. Daher ist die DNA der vorliegenden Erfindung als ein Gendiagnostikum für die Schäden an der DNA oder mRNA, Mutation, eine verringerte Expression oder eine erhöhte Expression oder Überexpression der DNA oder mRNA nützlich.
  • Die oben beschriebene Gendioagnose unter Verwendung der DNA der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise durch den öffentlich bekannten Northern-Hybridisierungsassay oder den PCR-SSCP-Assay durchgeführt werden (Genomics, 5, 874-879 (1989); Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 86, 2766-2770 (1989)), usw.
  • Wenn eine verringerte Expression z. B. durch die Northern-Hybridisierung detektiert wird, kann diagnostiziert werden, daß man wahrscheinlich beispielsweise unter Magersucht leidet, oder es sehr wahrscheinlich ist, daß man in der Zukunft unter Magersucht leidet.
  • Wenn die Überexpression durch die Northern-Hybridisierung detektiert wird, kann diagnostiziert werden, daß man wahrscheinlich beispielsweise unter Fettleibigkeit leidet; oder es ist sehr wahrscheinlich, daß man in der Zukunft unter Fettleibigkeit leidet.
  • (3) Appetitzügler und Diagnostikum, umfassend den Antikörper
  • Die Antikörper für den Rezeptor der vorliegenden Erfindung (hierin nachstehend manchmal einfach als der/die Antikörper der vorliegenden Erfindung bezeichnet) können jeder von den polyklonalen Antikörpern und monoklonalen Antikörpern sein, so lange wie sie Antikörper für den Rezeptor der vorliegenden Erfindung, ihre Teilpeptide oder Salze davon erkennen können.
  • Die Antikörper für den Rezeptor der vorliegenden Erfindung können durch öffentlich bekannte Verfahren zur Herstellung von Antikörpern oder Antiseren unter Verwendung des Rezeptors der vorliegenden Erfindung als ein Antigen hergestellt werden.
  • [Herstellung des monoklonalen Antikörpers]
  • (a) Herstellung von Zellen, die monoklonale Antikörper produzieren
  • Der Rezeptor der vorliegenden Erfindung wird Warmblütern entweder allein oder zusammen mit Trägern oder Verdünnungsmitteln an der Stelle, wo die Herstellung des Antikörpers durch die Verabreichung möglich ist, verabreicht. Um die Antikörperproduktivität bei der Verabreichung zu verstärken, können komplette Freund-Adjuvanzien oder inkomplette Freund-Adjuvanzien verabreicht werden. Die Verabreichung wird normalerweise einmal alle zwei bis sechs Wochen und zwei- bis zehnmal insgesamt durchgeführt. Beispiele von nützlichen Warmblütern sind Affen, Kaninchen, Hunde, Meerschweinchen, Mäuse, Ratten, Schafe, Ziegen und Hühner, wobei die Verwendung von Mäusen und Ratten bevorzugt ist.
  • Bei der Herstellung von Zellen, die monoklonale Antikörper produzieren, wird ein Warmblüter, z. B. Mäuse, immunisiert mit einem Antigen, wobei der Antikörpertiter notiert wird, ausgewählt, dann die Milz oder der Lymphknoten nach zwei bis fünf Tagen ab der letzten Immunisierung gesammelt und die darin enthaltenden Zellen, die monoklonale Antikörper produzieren, mit Myelomzellen aus einem homozoischen oder heterozoischen Tier fusioniert, um Hybridome, die monoklonale Antikörper produzieren, zu erhalten. Die Messung des Antikörpertiters in Antiseren kann beispielsweise durch Umsetzen eines markierten Rezeptors, der später beschrieben wird, mit dem Antiserum durchgeführt werden, gefolgt von Analysieren der Bindungsaktivität des Markierungsmittels, das an den Antikörper gebunden ist. Die Fusion kann beispielsweise durch das bekannte Verfahren von Koehler und Milstein durchgeführt werden [Nature, 256, 495 (1975)]. Beispiele des Fusionspromotors sind Polyethylenglykol (PEG), Sendai-Virus usw., von denen PEG bevorzugt eingesetzt wird.
  • Beispiele der Myelomzellen sind die, die von Warmblütern gesammelt werden, wie NS-1, P3U1, SP2/0, AP-1 usw. Insbesondere wird P3U1 bevorzugt eingesetzt. Ein bevorzugtes Verhältnis der Zahl der verwendeten Zellen, die Antikörper produzieren (Milzzellen), zu der Zahl von Myelomzellen liegt innerhalb eines Bereiches von ungefähr 1:1 bis 20:1. Wenn PEG (bevorzugt PEG 1000 bis PEG 6000) in einer Konzentration von ungefähr 10 bis 80 % zugegeben wird, gefolgt von Inkubation bei 20 bis 40 °C, bevorzugt bei 30 bis 37 °C für 1 bis 10 Minuten, kann eine effiziente Zellfusion durchgeführt werden.
  • Verschiedene Verfahren können zum Screenen eines Hybridoms, das monoklonale Antikörper produziert, verwendet werden. Beispiele von solchen Verfahren umfassen ein Verfahren, umfassend das Zugeben des Überstandes eines Hybridoms zu einer festen Phase (z. B. Mikroplatte), an der der Rezeptor als ein Antigen direkt oder zusammen mit einem Träger adsorbiert ist, Zugeben eines Anti-Immunoglobulin-Antikörpers (wenn Mauszellen für die Zellfusion verwendet werden, wird Anti-Maus-Immunoglobulin-Antikörper verwendet), markiert mit einer radioaktiven Substanz oder einem Enzym oder Protein A, und Detektieren des monoklonalen Antikörpers, der an die feste Phase gebunden ist, und ein Verfahren, umfassend das Zugeben des Überstandes eines Hybridoms zu einer festen Phase, an der der Anti-Immunoglobulin-Antikörper oder Protein A adsorbiert ist, Zugeben des Rezeptors, markiert mit einer radioaktiven Substanz oder einem Enzym, und Detektieren des monoklonalen Antikörpers, der an die feste Phase gebunden ist.
  • Der monoklonale Antikörper kann gemäß den öffentlich bekannten Verfahren oder ihren Modifikationen ausgewählt werden. Im allgemeinen kann die Selektion in einem Medium für Tierzellen, ergänzt mit HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin), bewirkt werden. Jedes Selektions- und Wachstumsmedium kann eingesetzt werden, insofern das Hybridom darin wachsen kann. Beispielsweise können RPMI-1640-Medium, enthaltend 1 bis 20 %, bevorzugt 10 bis 20 % fetales Rinderserum, GIT-Medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), enthaltend 1 bis 10 % fetales Rinderserum, ein serumfreies Medium zur Kultivierung eines Hybridoms (SFM-101, Nissui Seiyaku Co., Ltd.) und dergleichen für das Selektions- und Wachstumsmedium verwendet werden. Die Kultivierung wird im allgemeinen bei 20 bis 40 °C, bevorzugt bei 37 °C, für etwa 5 Tage bis etwa 3 Wochen, bevorzugt 1 bis 2 Wochen, normalerweise in 5 % CO2 durchgeführt. Der Antikörpertiter des Kulturüberstands eines Hybridoms kann wie in dem oben beschriebenen Assay für den Antikörpertiter in Antiseren bestimmt werden.
  • (b) Reinigung des monoklonalen Antikörpers
  • Die Trennung und Reinigung eines monoklonalen Antikörpers kann durch öffentlich bekannte Verfahren durchgeführt werden, wie die Trennung und Reinigung von Immunglobulinen [beispielsweise Aussalzen, Alkoholausfällung, isoelektrische Punktausfällung, Elektrophorese, Adsorption und Desorption mit Ionenaustauschern (z. B. DEAE), Ultrazentrifugation, Gelfiltration oder ein spezifisches Reinigungsverfahren, welches nur das Sammeln eines Antikörpers mit einem aktivierten Adsorptionsmittel, wie eine Antigen-bindende Festphase, Protein A oder Protein G, und Dissoziieren der Bindung, um den Antikörper zu erhalten, umfaßt].
  • [Herstellung eines polyklonalen Antikörpers]
  • Der polyklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung kann durch öffentlich bekannte Verfahren oder Modifikationen davon hergestellt werden. Beispielsweise wird ein Warmblüter mit einem Immungen (Rezeptorantigen) per se immunisiert, oder ein Komplex aus Immunogen und einem Trägerprotein wird gebildet und ein Warmblüter wird mit dem Komplex in einer ähnlichen Weise zu dem oben beschriebenen Verfahren für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern immunisiert. Das Produkt, das den Antikörper für den Rezeptor der vorliegenden Erfindung enthält, wird aus dem immunisierten Tier gesammelt, gefolgt von Trennung und Reinigung des Antikörpers.
  • In dem Komplex aus Immunogen und Trägerprotein, der verwendet wird, um einen Warmblüter zu immunisieren, kann der Typ des Trägerproteins und das Mischverhältnis von Träger zu Hapten jeder Typ und jedes Verhältnis sein, so lange wie der Antikörper effizient für das Hapten, das durch Vernetzen mit dem Träger immunisiert wird, produziert wird. Beispielsweise wird Rinderserumalbumin, Rinderthyroglobulin, Hemocyanin oder dergleichen mit dem Hapten in einem Träger-zu-Hapten-Gewichtsverhältnis von ungefähr 0,1 bis 20, bevorzugt etwa 1 bis etwa 5 verknüpft.
  • Eine Vielzahl von Kondensationsmitteln kann zum Verknüpfen von Träger mit Hapten verwendet werden. Glutaraldehyd-, Carbodiimid-, Maleimid-aktivierter Ester und aktivierte Esterreagenzien, umfassend eine Thiolgruppe oder Dithiopyridylgruppe, werden zum Verknüpfen verwendet.
  • Das Kondensationsprodukt wird den Warmblütern entweder allein oder zusammen mit Trägern oder Verdünnungsmitteln an der Stelle, die den Antikörper durch Verabreichung produzieren kann, verabreicht. Um die Antikörperproduktivität bei der Verabreichung zu verstärken, kann komplettes Freund-Adjuvans oder inkomplettes Freund-Adjuvans verabreicht werden. Die Verabreichung wird normalerweise einmal etwa aller 2 bis 6 Wochen und 3 bis 10 Mal insgesamt durchgeführt.
  • Der polyklonale Antikörper kann aus Blut, Aszites usw., bevorzugt aus dem Blut des Warmblüters, der durch das oben beschriebene Verfahren immunisiert wird, gesammelt werden.
  • Der Titer des polyklonalen Antikörpers in Antiserum kann durch dieselbe Verfahrensweise wie die zur Bestimmung des oben beschriebenen Serumantikörpertiters analysiert werden. Die Trennung und Reinigung des polyklonalen Antikörpers kann durchgeführt werden, indem das Verfahren zur Trennung und Reinigung von Immunoglobulinen, das wie bei der Trennung und Reinigung von hierin zuvor beschriebenen monoklonalen Antikörpern durchgeführt wird, befolgt wird.
  • Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können als Präventivmittel/Therapeutika für beispielsweise Fettleibigkeit [z. B. maligner Mastozytose, exogener Fettleibigkeit, hyperinsulinärer Fettleibigkeit, hyperplasmischer Fettleibigkeit, hypophysärer Fettleibigkeit, hypoplasmischer Fettleibigkeit, hypothyroidaler Fettleibigkeit, hypothalamischer Fettleibigkeit, symptomatischer Fettleibigkeit, infantiler Fettleibigkeit, Oberkörperfettleibigkeit, alimentärer Fettleibigkeit, hypogonadaler Fettleibigkeit, systemischer Mastozytose einfacher, Fettleibigkeit, zentraler Fettleibigkeit usw.], Hyperphagie usw., bevorzugt als Appetitzügler usw. verwendet werden.
  • Die Präventivmittel/Therapeutika für die oben beschriebenen Krankheiten, umfassend den Antikörper der vorliegenden Erfindung, können an menschlichen oder nicht-menschlichen Warmblüters (z. B. Ratte, Kaninchen, Schaf, Schwein, Rind, Katze, Hund, Affe usw.) oral oder parenteral direkt als ein flüssiges Präparat oder als eine pharmazeutische Zusammensetzung in einer geeigneten Präparatform verabreicht werden. Die Dosis variiert in Abhängigkeit des Patienten, an den sie verabreicht werden soll, der Zielkrankheit, der Verabreichungsweise usw.; wenn es z. B. als ein Appetitzügler für einen Erwachsenen verwendet wird, wird der Antikörper der vorliegenden Erfindung vorteilhafterweise durch intravenöse Injektion verabreicht, normalerweise in einer Einzeldosis von ungefähr 0,01 bis 20 mg/kg Körpergewicht, bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht und stärker bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 5 mg/kg Körpergewicht, ungefähr 1 bis 5 Mal, bevorzugt ungefähr 1 bis 3 Mal, pro Tag. Für eine andere parenterale Verabreichung und orale Verabreichung kann die entsprechende Dosis verabreicht werden. Wenn die Zustände sehr ernst sind, kann die Dosis in Abhängigkeit der Zustände erhöht werden.
  • Der Antikörper der vorliegenden Erfindung kann direkt als solcher oder als eine geeignete pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung, die für die oben beschriebene Verabreichung verwendet wird, enthält einen pharmakologisch akzeptablen Träger mit den zuvor genannten Verbindungen oder Salzen davon, ein Verdünnungsmittel oder Hilfsmittel. Eine solche Zusammensetzung wird in dem Präparat, das zur oralen oder parenteralen Verabreichung geeignet ist, bereitgestellt.
  • Das heißt, Beispiele der Zusammensetzung zur oralen Verabreichung umfassen feste oder flüssige Präparate, speziell Tabletten (einschließlich Dragees und Tabletten in Hüllenform), Pillen, Körnchen, Pulverpräparate, Kapseln (einschließlich weichen Kapseln), Sirup, Emulsionen, Suspensionen usw. Eine solche Zusammensetzung wird durch öffentlich bekannte Verfahren hergestellt und enthält ein Vehikel, ein Verdünnungsmittel oder Hilfsmittel, die konventionell in dem Gebiet der pharmazeutischen Präparate verwendet werden. Beispiele des Vehikels oder Hilfsmittels für Tabletten sind Lactose, Stärke, Saccharose, Magnesiumstearat usw.
  • Beispiele der Zusammensetzung zur parenteralen Verabreichung, die verwendet werden können, sind Injektionen, Zäpfchen usw., und die Injektionen umfassen die Form von intravenöser, subkutaner, transkutaner, intramuskulärer und Tröpfcheninjektionen usw. Diese Injektionen werden durch öffentlich bekannte Verfahren hergestellt, z. B. durch Auflösen, Suspendie ren oder Emulgieren des zuvor genannten Antikörpers oder seiner Salze in einem sterilen wässerigen oder öligen flüssigen Medium. Für das wässerige Medium zur Injektion werden beispielsweise physiologische Kochsalzlösung und isotonische Lösungen, enthaltend Glukose und anderes Adjuvanz, usw. verwendet. Geeignete Auflösungshilfsmittel, beispielsweise Alkohol (z. B. Ethanol), Polyalkohol (z. B. Propylenglycol oder Polyethylenglycol), nicht ionisches oberflächenaktives Mittel [z. B. Polysorbat 80, HCO-50 (Polyoxyethylen-(50 mol)Addukt von hydriertem Rizinusöl)], können in Kombination verwendet werden. Für die ölige Lösung werden beispielsweise Sesamöl, Sojabohnenöl und dergleichen verwendet, und Auflösungshilfsmittel, wie Benzylbenzoat, Benzylalkohol usw., können in Kombination verwendet werden. Die so hergestellte Flüssigkeit zur Injektion wird normalerweise in eine geeignete Ampulle gefüllt. Das Zäpfchen, das zur rektalen Verabreichung verwendet wird, wird durch Mischen des zuvor genannten Antikörpers oder seiner Salze mit einer konventionellen Zäpfchengrundlage hergestellt.
  • Die oben beschriebene orale oder parenterale pharmazeutische Zusammensetzung wird vorteilhafterweise in einer Einheitsdosierungsform hergestellt, die für die Dosis des Wirkstoffes geeignet ist. Beispiele einer solchen Einheitsdosierungsform umfassen Tabletten, Pillen, Kapseln, Injektionen (Ampullen), Zäpfchen usw. Es ist bevorzugt, daß der oben beschriebene Antikörper im allgemeinen in einer Dosis von 5 bis 500 mg pro Einheitsdosierungsform, 5 bis 100 mg speziell für Injektionen und 10 bis 250 mg für andere Präparate enthalten ist.
  • Jede oben beschriebene Zusammensetzung kann ferner andere Wirkstoffkomponenten enthalten, sofern die Formulierung mit dem Antikörper keine nachteilige Interaktion hervorruft.
  • (5) Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Antisense-DNA
  • Die Antisense-DNAs mit einer komplementären oder im wesentlichen komplementären Basensequenz zu dem Rezeptor der vorliegenden Erfindung oder zu der DNA, die den Rezeptor oder sein Teilpeptid codiert (hierin nachstehend werden diese DNAs manchmal nur als die Antisense-DNA bezeichnet), kann jegliche Antisense-DNA sein, so lange wie sie eine komplementäre oder im wesentlichen komplementäre Basensequenz zu der DNA der vorliegenden Erfindung besitzt und die Expression der DNA unterdrücken kann.
  • Die Basensequenz, die im wesentlichen komplementär zu der DNA der vorliegenden Erfindung ist, kann beispielsweise eine Basensequenz mit mindestens etwa 70 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 80 % Homologie, stärker bevorzugt mindestens etwa 90 % Homologie und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95 % Homologie, zu der Vollängen-Basensequenz oder Teilbasensequenz der Basensequenz, die zu der DNA der vorliegenden Erfindung komplementär ist, sein (d. h., komplementärer Strang zu der DNA der vorliegenden Erfindung). In der gesamten Basensequenz des komplementären Strangs zu der DNA der vorliegenden Erfindung weist eine Antisense-DNA mindestens etwa 70 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 80 % Homologie, stärker bevorzugt mindestens etwa 90 % Homologie und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95 % Homologie, zu dem komplementären Strang der Basensequenz auf, die die N-terminale Region des Rezeptors der vorliegenden Erfindung codiert (z. B. die Basensequenz usw. um das Initiationscodon herum). Diese Antisense-DNAs können unter Verwendung eines öffentlich bekannten DNA-Syntheseautomats usw. synthetisiert werden.
  • Die Antisense-DNA, die komplementär an die DNA der vorliegenden Erfindung bindet, um die Expression der DNA zu unterdrücken, kann als ein Präventivmittel/Therapeutika von beispielsweise Fettleibigkeit [z. B. maligner Mastozytose, exogener Fettleibigkeit, hyperinsulinärer Fettleibigkeit, hyperplasmischer Fettleibigkeit, hypophysärer Fettleibigkeit, hypoplasmischer Fettleibigkeit, hypothyroidaler Fettleibigkeit, hypothalamischer Fettleibigkeit, symptomatischer Fettleibigkeit, infantiler Fettleibigkeit, Oberkörperfettleibigkeit, alimentärer Fettleibigkeit, hypogonadaler Fettleibigkeit, systemischer Mastozytosem einfacher Fettleibigkeit, zentraler Fettleibigkeit usw.], Hyperphagie, usw., bevorzugt als Appetitzügler, usw. verwendet werden.
  • Wenn die Antisense-DNA verwendet wird, wird die Antisense-DNA beispielsweise direkt verabreicht, oder die Antisense-DNA wird in einen geeigneten Vektor, wie Retrovirusvektor, Adenovirusvektor, Adenovirus-assoziierter Virusvektor usw. eingefügt, und dann in einer konventionellen Weise verabreicht. Die Antisense-DNA kann ebenso als intakte DNA oder mit Adjuvanzien zur Unterstützung seiner Aufnahme durch eine Genkanone oder durch einen Katheter wie einen Katheter mit einem Hydrogel verabreicht werden.
  • Außerdem kann die Antisense-DNA ebenso als eine Oligonukleotidsonde zur Diagnose eingesetzt werden, um die Gegenwart der DNA der vorliegenden Erfindung in Geweben oder Zellen oder den Stand ihrer Expression zu untersuchen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner bereit:
    • (i) eine doppelsträngige RNA, enthaltend einen Teil der RNA, die den Rezeptor der vorliegenden Erfindung codiert;
    • (ii) eine Pharmazeutikum, umfassend die oben beschriebene doppelsträngige RNA;
    • (iii) ein Ribozym, enthaltend einen Teil der RNA, die das Protein der vorliegenden Erfindung codiert;
    • (iv) ein Pharmazeutikum, umfassend das oben beschriebene Ribozym;
    • (v) einen Expressionsvektor, enthaltend ein Gen (DNA), das das oben beschriebene Ribozym codiert; usw.
  • Wie bei dem oben beschriebenen Antisense-Nukleotid kann die doppelsträngige RNA, das Ribozym usw. RNA, die aus der DNA der vorliegenden Erfindung transkribiert wurde, zerstören oder die Funktionen der RNA unterdrücken, und so daß sie die Funktionen des Rezeptors oder der DNA der Erfindung in vivo unterdrücken können und daher als ein Präventivmittel/Therapeutikum von beispielsweise Fettleibigkeit [z. B. maligner Mastozytose, exogener Fettleibigkeit, hyperinsulinärer Fettleibigkeit, hyperplasmischer Fettleibigkeit, hypophysärer Fettleibigkeit, hypoplasmischer Fettleibigkeit, hypothyroidaler Fettleibigkeit, hypothalamischer Fettleibigkeit, symptomatischer Fettleibigkeit, infantiler Fettleibigkeit, Oberkörperfettleibigkeit, alimentärer Fettleibigkeit, hypogonadaler Fettleibigkeit, systemischer Mastozytose, einfacher Fettleibigkeit, zentraler Fettleibigkeit usw.], Hyperphagie usw., bevorzugt als Appetitzügler usw. verwendet werden können.
  • Die doppelsträngige RNA kann durch deren Konstruktion auf Basis der Sequenz des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung durch eine Modifikation von öffentlich bekannten Verfahren (z. B. Nature, 411, 494, 2001) hergestellt werden.
  • Das Ribozym kann durch dessen Konstruktion auf Basis der Sequenz des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung durch eine Modifikation von öffentlich bekannten Verfahren (z. B. TRENDS in Molecular Medicine, 7, 221, 2001) hergestellt werden. Beispielsweise kann das Ribozym, das auf Basis der Sequenz des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung konstruiert wird, durch Ligieren eines öffentlich bekannten Ribozyma an einen Teil der RNA, die den Rezeptor der vorliegenden Erfindung codiert, hergestellt werden. Der Teil der RNA, der den Rezeptor der Erfindung codiert, umfaßt eine Sequenz usw., die an die Consensus-Sequenz NUX angrenzt (wobei N alle Basen darstellt und X andere Basen als G darstellt), die durch ein öffentlich bekanntes Ribozym gespalten werden kann.
  • Wenn die oben beschriebene doppelsträngige RNA oder das oben beschriebene Ribozym als das oben beschriebene Präventivmittel/Therapeutikum verwendet wird, kann die RNA oder das Ribozym zu pharmazeutischen Präparaten wie bei dem Antisense-Polynukleotid verarbeitet werden, die dann zur Verabreichung bereitgestellt werden. Der oben beschriebene Expressionsvektor (v) wird als das oben beschriebene Präventivmittel/Therapeutikum unter Verwendung des Vektors wie in der öffentlich bekannten Gentherapie usw. verwendet.
  • In der Beschreibung und den Zeichnungen werden die Codes von Basen und Aminosäuren usw. durch Abkürzungen gezeigt, und in diesem Fall werden sie gemäß der IUPAC-IUB Commission an Biochemical Nomenclature oder durch übliche Codes in der Technik ange geben, Beispiele von denen werden nachstehend gezeigt. Bei Aminosäuren, die ein optisches Isomer aufweisen können, liegt die L-Form vor, wenn nicht anders angegeben.
    • DNA:
    Desoxyribonukleinsäure
    cDNA:
    komplementäre Desoxyribonukleinsäure
    A:
    Adenin
    T:
    Thymin
    G:
    Guanin
    C:
    Cytosin
    I:
    Inosin
    R:
    Adenin (A) oder Guanin (G)
    Y:
    Thymin (T) oder Cytosin (C)
    M:
    Adenin (A) oder Cytosin (C)
    K:
    Guanin (G) oder Thymin (T)
    S:
    Guanin (G) oder Cytosin (C)
    W:
    Adenin (A) oder Thymin (T)
    B:
    Guanin (G), Guanin (G) oder Thymin (T)
    D:
    Adenin (A), Guanin (G) oder Thymin (T)
    V:
    Adenin (A), Guanin (G) oder Cytosin (C)
    N:
    Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) oder Thymin (T) oder unbekannte oder andere Base
    RNA:
    Ribonukleinsäure
    mRNA:
    Messenger-Ribonukleinsäure
    dATP:
    Desoxyadenosintriphosphat
    dTTP:
    Desoxythymidintriphosphat
    dGTP:
    Desoxyguanosintriphosphat
    dCTP:
    Desoxycytidintriphosphat
    ATP:
    Adenosintriphosphat
    EDTA:
    Ethylendiamintetraessigsäure
    SDS:
    Natriumdodecylsulfat
    BHA:
    Benzhydrylamin
    pMBHA:
    p-Methylbenzyhydrylamin
    Tos:
    p-Toluolsulfonyl
    Bzl:
    Benzyl
    Bom:
    Benzyloxymethyl
    Boc:
    t-Butyloxycarbonyl
    DCM:
    Dichlormethan
    HOBt:
    1-Hydroxybenztriazol
    DCC:
    N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
    TFA:
    Trifluoressigsäure
    DIEA:
    Diisopropylethylamin
    BSA:
    Rinderserumalbumin
    CHAPS:
    3-[(3-Cholamidpropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat
    Gly oder G:
    Glycin
    Ala oder A:
    Alanin
    Val oder V:
    Valin
    Leu oder L:
    Leucin
    Ile oder I:
    Isoleucin
    Ser oder S:
    Serin
    Thr oder T:
    Threonin
    Cys oder C:
    Cystein
    Met oder M:
    Methionin
    Glu oder E:
    Glutaminsäure
    Asp oder D:
    Asparaginsäure
    Lys oder K:
    Lysin
    Arg oder R:
    Arginin
    His oder H:
    Histidin
    Phe oder F:
    Phenylalanin
    Tyr oder Y:
    Tyrosin
    Trp oder W:
    Tryptophan
    Pro oder P:
    Prolin
    Asn oder N:
    Asparagin
    Gin oder Q:
    Glutamin
    pGlu:
    Pyroglutaminsäure
    Tyr(I):
    3-Iodtyrosin
    DMF:
    N,N-Dimethylformamid
    Fmoc:
    N-9-Fluorenylmethoxycarbonyl
    Trt:
    Trityl
    Pbf:
    2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl
    Clt:
    2-Chlortrityl
    But:
    t-Butyl
    Met(O):
    Methioninsulfoxid
  • Die Sequenzidentifikationsnummern in dem Sequenzprotokoll der Beschreibung geben die folgenden Sequenzen an.
  • [SEQ ID Nr. 1]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die zum Screenen der cDNA, die menschliches GPR8 codiert, verwendet wurde.
  • [SEQ ID Nr. 2]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die zum Screenen der cDNA, die menschliches GPR8 codiert, verwendet wurde.
  • [SEQ ID Nr. 3]
  • Diese zeigt die gesamte Basensequenz der Mensch-GPR8-cDNA, zu der die Basensequenz, erkannt durch das Restriktionsenzym ClaI, an dem 5'-Ende hinzugefügt ist, und die Basensequenz, erkannt durch das Restriktionsenzym SpeI, an dem 3'-Ende hinzugefügt ist.
  • [SEQ ID Nr. 4]
  • Diese zeigt die gesamte Aminosäuresequenz von menschlichem GPR8.
  • [SEQ ID Nr. 5]
  • Diese zeigt die Sequenz der Ribosonde, die verwendet wird, um den Expressionsgrad von GPR8-Rezeptorprotein-mRNA in jedem Klon der GPR8-exprimierenden CHO-Zellinie zu bestimmen.
  • [SEQ ID Nr. 6]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz, erhalten als Ergebnis der aminoterminalen Aminosäuresequenzierung von Ligandenpeptid an GPR8, gereinigt aus Schweinehypothalamus.
  • [SEQ ID Nr. 7]
  • Diese zeigt eine EST-Sequenz (Zugangs-Nr. AW007531), von der angenommen wird, daß ihr komplementärer Strang einen Teil des Präkursorproteins eines menschlichen Homologs für das GPR8-Ligandenpeptid codiert.
  • [SEQ ID Nr. 8]
  • Diese zeigt eine EST-Sequenz (Zugangs-Nr. AI500303), von der angenommen wird, daß ihr komplementärer Strang einen Teil des Präkursorproteins eines menschlichen Homologs für das GPR8-Ligandenpeptid codiert.
  • [SEQ ID Nr. 9]
  • Diese zeigt eine EST-Sequenz (Zugangs-Nr. AI990964), von der angenommen wird, daß ihr komplementärer Strang einen Teil des Präkursorproteins eines menschlichen Homologs für das GPR8-Ligandenpeptid codiert.
  • [SEQ ID Nr. 10]
  • Diese zeigt eine EST-Sequenz (Zugangs-Nr. AA744804), von der angenommen wird, daß ihr komplementärer Strang einen Teil des Präkursorproteins eines menschlichen Homologs für das GPR8-Ligandenpeptid codiert.
  • [SEQ ID Nr. 11]
  • Diese zeigt eine EST-Sequenz (Zugangs-Nr. H31598), von der angenommen wird, daß ihr komplementärer Strang einen Teil des Präkursorproteins eines Rattenhomologs für das GPR8-Ligandenpeptid codiert.
  • [SEQ ID Nr. 12]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die zum Screenen von cDNA, die einen Teil des Präkursorproteins eines menschlichen Homologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, verwendet wurde.
  • [SEQ ID Nr. 13]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die zum Screenen von cDNA, die einen Teil des Präkursorproteins eines menschlichen Homologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, verwendet wurde.
  • [SEQ ID Nr. 14]
  • Diese zeigt die DNA-Sequenz, die einen Teil des Präkursorproteins eines menschlichen Homologs des Ligandpeptids für GPR8 codiert, amplifiziert aus menschlicher vom Gehirn abgeleiteter cDNA.
  • [SEQ ID Nr. 15]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz für einen Teil des Präkursorproteins eines menschlichen Homologs des Ligandenpeptids für GPR8.
  • [SEQ ID Nr. 16]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz eines menschlichen Homologs des Ligandenpeptids für GPR8, abgeleitet von SEQ ID Nr. 15.
  • [SEQ ID Nr. 17]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz eines menschlichen Homologs des Ligandenpeptids für GPR8, abgeleitet von SEQ ID Nr. 15.
  • [SEQ ID Nr. 18]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 16, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 19]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 17, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 20]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz von Mensch-GPR-Ligand (1-29), synthetisiert in dem hierin nachstehend beschriebenen REFERENZBEISPIEL 14.
  • [SEQ ID Nr. 21]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz von Mensch-GPR-Ligand (1-28), synthetisiert in dem hierin nachstehend beschriebenen REFERENZBEISPIEL 15.
  • [SEQ ID Nr. 22]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz von Mensch-GPR-Ligand (1-27), synthetisiert in dem hierin nachstehend beschriebenen REFERENZBEISPIEL 16.
  • [SEQ ID Nr. 23]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz von Mensch-GPR-Ligand (1-26), synthetisiert in dem hierin nachstehend beschriebenen REFERENZBEISPIEL 17.
  • [SEQ ID Nr. 24]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz von Mensch-GPR-Ligand (1-25), synthetisiert in dem hierin nachstehend beschriebenen REFERENZBEISPIEL 18.
  • [SEQ ID Nr. 25]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz von Mensch-GPR-Ligand (1-24), synthetisiert in dem hierin nachstehend beschriebenen REFERENZBEISPIEL 19.
  • [SEQ ID Nr. 26]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 20, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 27]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 21, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 28]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 22, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 29]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 23, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 30]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 24, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 31]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 25, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 32]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 4, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 33]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um die 5'-stromaufwärts-Sequenz der cDNA, die das Präkursorprotein eines menschlichen Homologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 34]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um die 5'-stromaufwärts-Sequenz der cDNA, die das Präkursorprotein eines menschlichen Homologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 35]
  • Diese zeigt die DNA-Sequenz an der 5'-stromaufwärts-Stelle der cDNA, die das Präkursorprotein eines menschlichen Homologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert.
  • [SEQ ID Nr. 36]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um die 3'-stromabwärts-Sequenz der cDNA, die das Präkursorprotein eines menschlichen Homologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 37]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um die 3'-stromabwärts-Sequenz der cDNA, die das Präkursorprotein eines menschlichen Homologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 38]
  • Diese zeigt die DNA-Sequenz an der 3'-stromabwärts-Stelle der cDNA, die das Präkursorprotein eines menschlichen Homologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert.
  • [SEQ ID Nr. 39]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um die cDNA, die das Präkursorprotein eines menschlichen Homologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 40]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um die cDNA, die das Präkursorprotein eines menschlichen Homologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 41]
  • Diese zeigt die Sequenz der cDNA, die das Präkursorprotein eines menschlichen Homologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert.
  • [SEQ ID Nr. 42]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz des Präkursorproteins eines menschlichen Homologs des Ligandenpeptids für GPR8.
  • [SEQ ID Nr. 43]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um die 5'-stromaufwärts-Sequenz der cDNA, die das Präkursorprotein eines Schweinehomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 44]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um die 5'-stromaufwärts-Sequenz der cDNA, die das Präkursorprotein eines Schweinehomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 45]
  • Diese zeigt die DNA-Sequenz an der 5'-stromaufwärts-Stelle der cDNA, die das Präkursorprotein eines Schweinehomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert.
  • [SEQ ID Nr. 46]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um die 5'-stromaufwärts-Sequenz der cDNA, die das Präkursorprotein eines Schweinehomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 47]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um die 5'-stromaufwärts-Sequenz der cDNA, die das Präkursorprotein eines Schweinehomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 48]
  • Diese zeigt die DNA-Sequenz an der 5'-stromaufwärts-Stelle der cDNA, die das Präkursorprotein eines Schweinehomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 49]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um die 3'-stromabwärts-Sequenz der cDNA, die das Präkursorprotein eines Schweinehomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 50]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um die 3'-stromabwärts-Sequenz der cDNA, die das Präkursorprotein eines Schweinehomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 51]
  • Diese zeigt die DNA-Sequenz an der 3'-stromabwärts-Stelle der cDNA, die das Präkursorprotein eines Schweinehomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert.
  • [SEQ ID Nr. 52]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um cDNA, die das Präkursorprotein eines Schweinehomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 53]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um cDNA, die das Präkursorprotein eines Schweinehomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 54]
  • Diese zeigt die Sequenz der cDNA, die das Präkursorprotein eines Schweinehomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert.
  • [SEQ ID Nr. 55]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz des Präkursorproteins eines Schweinehomologs des Ligandenpeptids für GPR8.
  • [SEQ ID Nr. 56]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz eines Schweinehomologs des Ligandenpeptids für GPR8, abgeleitet von SEQ ID Nr. 55.
  • [SEQ ID Nr. 57]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz eines Schweinehomologs des Ligandenpeptids für GPR8, abgeleitet von SEQ ID Nr. 55.
  • [SEQ ID Nr. 58]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 56, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 59]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 57, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 60]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um cDNA, die einen Teil des Präkursorproteins eines Rattenhomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 61]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um cDNA, die einen Teil des Präkursorproteins eines Rattenhomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 62]
  • Diese zeigt die Sequenz der cDNA, die einen Teil des Präkursorproteins eines Rattenhomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert.
  • [SEQ ID Nr. 63]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um die 5'-stromaufwärts-Sequenz der cDNA, die das Präkursorprotein eines Rattenhomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 64]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um die 5'-stomaufwärts-Sequenz der cDNA, die das Präkursorprotein eines Rattenhomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 65]
  • Diese zeigt die 5'-stromaufwärts-DNA-Sequenz der cDNA, die das Präkursorprotein eines Rattenhomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert.
  • [SEQ ID Nr. 66]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um die 3'-stromabwärts-Sequenz der cDNA, die das Präkursorprotein eines Rattenhomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 67]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um die 3'-stromabwärts-Sequenz der cDNA, die das Präkursorprotein eines Rattenhomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 68]
  • Diese zeigt die 3'-stromabwärts-Sequenz der cDNA, die das Präkursorprotein eines Rattenhomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert.
  • [SEQ ID Nr. 69]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um cDNA, die das Präkursorprotein eines Rattenhomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 70]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um cDNA, die das Präkursorprotein eines Rattenhomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 71]
  • Diese zeigt die Sequenz der cDNA, die das Präkursorprotein eines Rattenhomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert.
  • [SEQ ID Nr. 72]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz des Präkursorproteins eines Rattenhomologs des Ligandenpeptids für GPR8.
  • [SEQ ID Nr. 73]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz eines Rattenhomologs des Ligandenpeptids für GPR8, abgeleitet von SEQ ID Nr. 72.
  • [SEQ ID Nr. 74]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz eines Rattenhomologs des Ligandenpeptids für GPR8, abgeleitet von SEQ ID Nr. 72.
  • [SEQ ID Nr. 75]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 73, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 76]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 74, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 77]
  • Diese zeigt die Mausgenomfragmentsequenz, von der angenommen wird, daß sie einen Teil des Präkursorproteins eines Maushomologs des GPR8-Ligandenpeptids codiert.
  • [SEQ ID Nr. 78]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um cDNA, die einen Teil des Präkursorproteins eines Maushomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu screenen.
  • [SEQ ID Nr. 79]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um cDNA, die einen Teil des Präkursorproteins eines Maushomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu screenen.
  • [SEQ ID Nr. 80]
  • Diese zeigt die DNA-Sequenz, die einen Teil des Präkursorproteisn eines menschlichen Homologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, amplifiziert aus Maustestis-abgeleiteter cDNA.
  • [SEQ ID Nr. 81]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um die 5'-stromaufwärts-Sequenz der cDNA, die das Präkursorprotein eines Maushomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 82]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um die 5'-stromaufwärts-Sequenz der cDNA, die das Präkursorprotein eines Maushomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 83]
  • Diese zeigt die DNA-Sequenz an der 5'-stromaufwärts-Stelle der cDNA, die das Präkursorprotein eines Maushomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert.
  • [SEQ ID Nr. 84]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um die 3'-stromabwärts-Stelle der cDNA, die das Präkursorprotein eines Maushomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 85]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um die 3'-stromabwärts-Sequenz der cDNA, die das Präkursorprotein eines Maushomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 86]
  • Diese zeigt die DNA-Sequenz an der 3'-stromabwärts-Stelle der cDNA, die das Präkursorprotein eines Maushomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert.
  • [SEQ ID Nr. 87]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um cDNA, die das Präkursorprotein eines Maushomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen
  • [SEQ ID Nr. 88]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wird, um cDNA, die das Präkursorprotein eines Maushomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, zu erlangen.
  • [SEQ ID Nr. 89]
  • Diese zeigt die Sequenz einer cDNA, die das Präkursorprotein eines Maushomologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert.
  • [SEQ ID Nr. 90]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz des Präkursorproteins eines Maushomologs des Ligandenpeptids für GPR8.
  • [SEQ ID Nr. 91]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz eines Maushomologs des Ligandenpeptids für GPR8, abgeleitet von SEQ ID Nr. 90.
  • [SEQ ID Nr. 92]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz eines Maushomologs des Ligandenpeptids für GPR8, abgeleitet von SEQ ID Nr. 90.
  • [SEQ ID Nr. 93]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 91, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 94]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 92, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 95]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz eines Oxidationsproduktes des Mensch-GPR8-Liganden (1-23), synthetisiert in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 44.
  • [SEQ ID Nr. 96]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz von Mensch-GPR8-Ligand (1-22), synthetisiert in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 45.
  • [SEQ ID Nr. 97]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz von Mensch-GPR8-Ligand (1-21), synthetisiert in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 46.
  • [SEQ ID Nr. 98]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz von Mensch-GPR8-Ligand (1-20), synthetisiert in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 47.
  • [SEQ ID Nr. 99]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz von Mensch-GPR8-Ligand (1-19), synthetisiert in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 48.
  • [SEQ ID Nr. 100]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz von Mensch-GPR8-Ligand (1-18), synthetisiert in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 49.
  • [SEQ ID Nr. 101]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz von Mensch-GPR8-Ligand (1-17), synthetisiert in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 50.
  • [SEQ ID Nr. 102]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz von Mensch-GPR8-Ligand (1-16), synthetisiert in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 51.
  • [SEQ ID Nr. 103]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz eines Oxidationsproduktes des Schweine-GPR8-Liganden (1-23), synthetisiert in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 54.
  • [SEQ ID Nr. 104]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz eines Oxidationsproduktes des Ratten- oder Maus-GPR8-Liganden (1-23), synthetisiert in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 55.
  • [SEQ ID Nr. 105]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz von Mensch-GPR8-Ligand (1-23), synthetisiert in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 12.
  • [SEQ ID Nr. 106]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz von [Nα-Acetyl-Trp1]-Mensch-GPR8-Ligand (1-23), synthetisiert in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 56.
  • [SEQ ID Nr. 107]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz von Mensch-GPR8-Ligand (2-23), synthetisiert in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 57.
  • [SEQ ID Nr. 108]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz von Mensch-GPR8-Ligand (4-23), synthetisiert in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 58.
  • [SEQ ID Nr. 109]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz von Mensch-GPR8-Ligand (9-23), synthetisiert in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 59.
  • [SEQ ID Nr. 110]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz von Mensch-GPR8-Ligand (15-23), synthetisiert in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 60.
  • [SEQ ID Nr. 111]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz von [N-Acetyl-Tyr2]-Mensch-GPR8-Ligand (2-23), synthetisiert in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 61.
  • [SEQ ID Nr. 112]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz von [D-Trp1]-Mensch-GPR8-Ligand (1-23), synthetisiert in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 62.
  • [SEQ ID Nr. 113]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz von [N-3-Indolpropanyl-Tyr2]-Mensch-GPR8-Ligand (2-23), synthetisiert in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 63.
  • [SEQ ID Nr. 114]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 96, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 115]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 97, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 116]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 98, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 117]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 99, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 118]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 100, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 119]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 101, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 120]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 102, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 121]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 107, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 122]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 108, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 123]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 109, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 124]
  • Diese zeigt die Basensequenz-, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 110, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 125]
  • Diese zeigt die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 6, codiert.
  • [SEQ ID Nr. 126]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die zum Screening der cDNA, die Mensch-GPR7 codiert, verwendet wurde.
  • [SEQ ID Nr. 127]
  • Diese zeigt eine synthetische DNA, die zum Screening der cDNA, die Mensch-GPR7 codiert, verwendet wurde.
  • [SEQ ID Nr. 128]
  • Diese zeigt die gesamte Basensequenz von Mensch-GPR7-Protein-cDNA, zu der die Basensequenz, erkannt durch Restriktionsenzym ClaI, an dem 5'-Ende hinzugefügt ist, und die Basensequenz, erkannt durch Restriktionsenzym SpeI, an dem 3'-Ende hinzugefügt ist.
  • [SEQ ID Nr. 129]
  • Diese zeigt die gesamte Aminosäuresequenz von menschlichem GPR7.
  • [SEQ ID Nr. 130]
  • Diese zeigt die Basensequenz der DNA, die als Primer zum Amplifizieren von menschlicher Standard-GPR7-DNA verwendet wurde.
  • [SEQ ID Nr. 131]
  • Diese zeigt die Basensequenz der DNA, die als Primer zum Amplifizieren von menschlicher Standard-GPR7-DNA verwendet wurde.
  • [SEQ ID Nr. 132]
  • Diese zeigt die Sequenz von synthetischer DNA, die als Primer zur Bestimmung des Expressionsgrades des GPR7-Gens in Mensch-GPR7-exprimierenden CHO-Zellen verwendet wurde.
  • [SEQ ID Nr. 133]
  • Diese zeigt die Sequenz von synthetischer DNA, die als Primer zur Bestimmung des Expressionsgrades des GPR7-Gens in Mensch-GPR7-exprimierenden CHO-Zellen verwendet wurde.
  • [SEQ ID Nr. 134]
  • Diese zeigt die Sequenz von synthetischer DNA, die als Sonde zur Bestimmung des Expressionsgrades des GPR7-Gens in Mensch-GPR7-exprimierenden CHO-Zellen verwendet wurde.
  • [SEQ ID Nr. 135]
  • Diese zeigt die Aminosäuresequenz von [Phe2]-Mensch-GPR8-Ligand (1-20).
  • Die Transformante Escherichia coli DH5α/pAKKO-GPR8, die in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 3 erhalten wurde, ist seit 27. Februar 2001 in dem Institute for Fermentation (IFO), mit Sitz in 2-17-85, Juso Honcho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Osaka (Postleitzahl 532-8686), unter der Zugangsnummer IFO 16564 bzw. seit 11. April 2001 in dem National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, mit Sitz in Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki (Postleitzahl 305-8566), unter der Zugangsnummer FERM BP-7540 hinterlegt.
  • Die Transformante Escherichia coli TOP10/pCR2.1-TOPO Human GPR8 Ligand Precursor, die in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 28 erhalten wurde, ist seit 27. Februar 2001 in dem Institute for Fermentation (IFO), mit Sitz in 2-17-85, Juso Honcho, Yodoga wa-ku, Osaka-shi, Osaka (Postleitzahl 532-8686), unter der Zugangsnummer IFO 16568 bzw. seit 11. April 2001 in dem National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, mit Sitz in Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki (Postleitzahl 305-8566), unter der Zugangsnummer FERM BP-7544 hinterlegt.
  • Die Transformante Escherichia Escherichia coli TOP10/pCR2.1-TOPO Porcine GPR8 Ligand Precursor, die in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 32 erhalten wurde, ist seit 27. Februar 2001 in dem Institute for Fermentation (IFO), mit Sitz in 2-17-85, Juso Honcho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Osaka (Postleitzahl 532-8686), unter der Zugangsnummer IFO 16565 bzw. seit 11. April 2001 in dem National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, mit Sitz in Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki (Postleitzahl 305-8566), unter der Zugangsnummer FERM BP-7541 hinterlegt.
  • Die Transformante Escherichia coli TOP10/pCR2.1-TOPO Rat GPR8 Ligand Precursor, die in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 36 erhalten wurde, ist seit 27. Februar 2001 in dem Institute for Fermentation (IFO), mit Sitz in 2-17-85, Juso Honcho, Yodogawaku, Osaka-shi, Osaka (Postleitzahl 532-8686), unter der Zugangsnummer IFO 16567 bzw. seit 11. April 2001 in dem National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, mit Sitz in Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki (Postleitzahl 305-8566), unter der Zugangsnummer FERM BP-7543 hinterlegt.
  • Die Transformante Escherichia coli TOP10/pCR2.1-TOPO Mouse GPR8 Ligand Precursor, die in dem später beschriebenen REFERENZBEISPIEL 41 erhalten wurde, ist seit 27. Februar 2001 in dem Institute for Fermentation (IFO), mit Sitz in 2-17-85, Juso Honcho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Osaka (Postleitzahl 532-8686), unter der Zugangsnummer IFO 16566 bzw. seit 11. April 2001 in dem National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, mit Sitz in Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki (Postleitzahl 305-8566), unter der Zugangsnummer FERM BP-7542 hinterlegt.
  • BEISPIELE
  • Die vorliegende Erfindung wird nachstehend in bezug auf die REFERENZBEISPIELE und BEISPIELE ausführlicher beschrieben, aber soll den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht auf diese beschränken.
  • REFERENZBEISPIEL 1
  • Amplifikation von Mensch-GPR8-cDNA durch PCR unter Verwendung von vom menschlichen Gehirn abgeleiteter cDNA
  • Umkehrtranskription wurde unter Verwendung von zufälligen Primern, in denen vom menschlichen Gehirn abgeleitete Poly(A)+RNA (Clontech Laboratories, Inc.) als eine Matrize verwendet wurde, durchgeführt. Der Kit TaKaRa RNA PCR ver. 2.1 wurde für die Umkehrtranskription verwendet. Dann wurde die Amplifikation durch PCR durchgeführt, wobei das resultierende Umkehrtranskriptionsprodukt als eine Matrize verwendet wurde und synthetische Primer, dargestellt durch SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2, verwendet wurden. Die synthetischen Primer wurden so konstruiert, um das Gen in der Region zu amplifizieren, die zu ihrem Rezeptorprotein translatiert werden soll, wobei die Erkennungssequenzen von Restriktionsenzymen zu den 5'- bzw. 3'-Enden hinzugefügt wurden, so daß die Basensequenzen, erkannt durch Restriktionsenzyme ClaI und SpeI, zu dem Gen an den 5'- bzw. 3'-Enden hinzugefügt wurden. Die Reaktionslösung bestand aus 5 μl cDNA-Matrize, 0,4 μM jedes synthetischen DNA-Primers, 0,8 mM dNTPs und 0,5 μl pfu-Polymerase (Stratagene), wobei dazu der Puffer, der dem Enzym beigefügt war, hinzugefügt wurde, wodurch das Gesamtvolumen von 50 μl hergestellt wurde. Für die Amplifikation wurde nach dem Erhitzen auf 94 °C für 60 Sekunden ein Zyklus, eingestellt auf 94 °C für 60 Sekunden, 65 °C für 60 Sekunden und 72 °C für 150 Sekunden, 35 Mal unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wiederholt. Das amplifizierte Produkt wurde durch 0,8-%-Agarosegelelektrophorese bestätigt, gefolgt von Einfärben mit Ethidiumbromid.
  • REFERENZBEISPIEL 2
  • Subklonieren des PCR-Produkts in einen Plasmidvektor und Bestätigung der amplifizierten cDNA-Sequenz durch Dekodieren der Basensequenz der insertierten cDNA-Region
  • Die Reaktionslösung, erhalten durch PCR in REFERENZBEISPIEL 1, wurde 0,8 % niedrigschmelzender Agarosegelelektrophorese zur Trennung unterzogen. Die Bandenteile wurden von dem Gel mit einer Rasierklinge exzidiert und zu kleinen Stücken zerkleinert, die dann mit Phenol/Chloroform extrahiert und in Ethanol ausgefällt wurden, wodurch die DNA gewonnen wurde. Gemäß dem Protokoll, das dem PCR-ScriptTM Amp SK(+) Cloning Kit (Stratagene) beigefügt war, wurden die gewonnenen DNAs in den Plasmidvektor, pCR-ScriptTM Amp SK(+), subkloniert. Die rekombinanten Vektoren wurden in Escherichia coli DH5α-kompetente Zellen eingeführt (Toyobo Co., Ltd.), wodurch Transformanten erzeugt wurden. Dann wurden Klone mit einem cDNA-insertierten Fragment in einem LB-Agarkulturmedium, enthaltend Ampicillin, IPTG und X-gal, selektiert. Nur die Klone, die weiße Farbe zeigten, wurden mit einem sterilisierten Zahnstocher ausgewählt, um die Transformante Escherichia coli DH5α/GPR8 zu erlangen. Die einzelnen Klone wurden über Nacht in einem LB-Kulturmedium, enthaltend Ampicillin, kultiviert, und Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung von QIAwell 8 Plasmid Kit (Qiagen) hergestellt. Ein aliquoter Teil der so hergestellten DNAs wurde mit Restriktionsenzymen ClaI und SpeI digeriert, um die Größe des insertierten Rezeptor-cDNA-Fragments zu bestätigen. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung eines Dye-Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kits (PE Biosystems) durchgeführt, und die DNAs wurden unter Verwendung eines automatischen Fluoreszenzsequenzers decodiert (SEQ ID Nr. 3). 1 zeigt die gesamte Basensequenz der Mensch-GPR8-Rezeptorprotein-cDNA (SEQ ID Nr. 23) und die gesamte aus der Mensch-GPR8-Rezeptorprotein-cDNA translatierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 4).
  • REFERENZBEISPIEL 3
  • Herstellung von CHO-Zellen, die GPR8 exprimieren
  • Unter Verwendung von Plasmid Midi Kit (Qiagen) wurde Plasmid-DNA aus den Escherichia-coli-Klonen hergestellt, transformiert durch das Plasmid, das das Gen trägt, welches die Vollängen-Aminosäuresequenz von vom menschlichen Gehirn abgeleitetem GPR8 codiert, wobei die Sequenz in REFERENZBEISPIEL 2 bestätigt wurde und die ClaI- und SpeI-Erkennungssequenzen an den 5'- bzw. 3'-Enden hinzugefügt waren. Die Plasmid-DNA wurde mit den Restriktionsenzymen ClaI und SpeI digeriert, wodurch die Insert-DNA exzidiert wurde. Die Insert-DNA wurde Elektrophorese unterzogen, von dem Agarosegel mit einer Rasierklinge exzidiert, in kleine Stücke zerkleinert, dann mit Phenol und mit Phenol/Chloroform extrahiert und in Ethanol ausgefällt, wodurch die DNA gewonnen wurde. Die Insert-DNA wurde zu dem Tierzellexpressionsvektorplasmid pAKKO-111H hinzugefügt (dasselbe Vektorplasmid wie pAKKO1.11H, beschrieben in Hinuma, S., et al., Biochim. Biophys. Acta, 1219, 251-259, 1994), der mit ClaI und SpeI digeriert wurde, gefolgt von der Ligation unter Verwendung von T4-Ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.), um ein Rezeptorproteinexpressionsplasmid pAKKO-GPR8 zu konstruieren. Escherichia coli, transformiert durch dieses Plasmid pAKKO-GPR8, wurde Escherichia coli DH5α/pAKKO-GPR8 genannt.
  • Escherichia coli DH5α (Toyobo Co., Ltd.), transfektiert mit pAKKO-GPR8, wurde kultiviert, und die pAKKO-GPR8-Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von Plasmid Midi Kit (Qiagen) hergestellt. Unter Verwendung des CellPhect Transfection Kits (Amersham Pharmacia Biotech) wurde die Plasmid-DNA in CHO-dhfr--Zellen gemäß dem beigefügten Protokoll transfektiert. DNA, 4,5 μg, wurde mit Calciumphosphat in Suspension co-ausgefällt. Die resultierende Suspension wurde zu einer Petrischale mit einem Durchmesser von 6 cm zugegeben, in der 5 × 105 oder 1 × 106 CHO-dhfr--Zellen vor 24 Stunden gesät wurden. Die Zellen wurden in MEMα-Medium, enthaltend 10 % fetales Kalbsserum, für einen Tag kultiviert. Nach der Passage wurden die Zellen in Nukleinsäure-freiem MEMα-Selektionsmedium, enthaltend 10 % dialysiertes fetales Kalbsserum, kultiviert, 47 Klone der Transformantenkolonie GPR8-exprimierenden CHO-Zellen, die in dem Selektionsmedium wuchsen, wurden selektiert.
  • REFERENZBEISPIEL 4
  • Selektion der CHO/GPR8-Zellinie mit hoher Expression der menschlichen Vollängen-GPR8-Protein-mRNA
  • Der Expressionsgrad der Vollängen-GPR8-Protein-mRNAs von 47 Klonen aus der CHO/GPR8-Zellinie, etabliert in REFERENZBEISPIEL 3, wurde folgendermaßen unter Verwendung der Cytostar-T-Platte (Amersham Pharmacia Biotech) gemäß dem beigefügten Protokoll bestimmt. Jeder Klon der CHO/GPR8-Zellinie wurde auf der Cytostar-T-Platte in 2,5 × 104 Zellen/Loch inokuliert. Nach dem Kultivieren für 24 Stunden wurden die Zellen mit 10 % Formalin fixiert. Zu jedem Loch wurden 0,25 % Triton X-100 zur Erhöhung der Zellpermeabilität zugegeben, 35S-markierte Ribosonde von SEQ ID Nr. 5 wurde zu den Zellen zur Hybridisierung zugegeben. Die freie Ribosonde wurde durch Zugeben von 20 μg/ml RNase A zu jedem Loch digeriert. Nachdem die Platte gründlich gewaschen worden war, wurde die Radioaktivität der hybridisierten Ribosonde mit Topcounter analysiert. Die Zellinie mit einer hohen Radioaktivität stellt einen hohen mRNA-Expressionsgrad bereit. Drei Klone (Nr. 17, Nr. 41 und Nr. 46), die einen hohen mRNA-Expressionsgrad zeigten, wurden für das folgende Experiment verwendet, speziell Klon Nr. 17 als ein Hauptklon.
  • REFERENZBEISPIEL 5
  • Bestimmung des intrazellulären cAMP-Niveaus unter Verwendung von GPR8-exprimierenden CHO-Zellen
  • Die CHL/GPR8-Zellen, hergestellt in REFERENZBEISPIEL 4, und Schein-CHO-Zellen wurden auf einer 24-Loch-Platte in 5 × 104 Zellen/Loch inokuliert, gefolgt von der Kultivierung für 48 Stunden. Die Zellen wurden mit Hanks-Puffer (pH 7,4), enthaltend 0,2 mM 3-Isobutyl-methylxanthin, 0,05 % BSA und 20 mM HEPES (hierin nachstehend wird der Hanks-Puffer (pH 7,4), enthaltend 0,2 mM 3-Isobutyl-methylxanthin, 0,05 % BSA und 20 mM HEPES, als ein Reaktionspuffer bezeichnet), gewaschen. Danach wurden 0,5 ml des Reaktionspuffers zu dem System zugegeben, das in einem Inkubator für 30 Minuten warm gehalten wurde. Nachdem der Reaktionspuffer entfernt wurde, wurden 0,25 ml eines frischen Reaktionspuffers zu den Zellen zugegeben. Dann wurden 0,25 ml des Reaktionspuffers, enthaltend eine Probenflüssigkeit und 2 μM Forskolin, zu den Zellen zugegeben, gefolgt von der Umsetzung bei 37 °C für 24 Minuten. Durch Zugeben von 100 μl von 20 % Perchlorsäure wurde die Reaktion beendet. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf Eis für eine Stunde stehengelassen, wodurch intrazelluläres cAMP extrahiert wurde. Die Menge an cAMP in dem Extrakt wurde unter Verwendung von cAMP EIA Kit (Amersham Pharmacia Biotech) gemessen.
  • REFERENZBEISPIEL 6
  • Assay für GTPγS-Bindungsaktivität unter Verwendung der Membranfraktion der GPR8-exprimierenden CHO-Zellen
  • Die [35S]-Guanosin-5'-(γ-thio)triphosphat-Bindung-beschleunigende Aktivität auf eine Membranfraktion der GPR8-exprimierenden CHO-Zellen wurde durch die folgenden Verfahrensweisen analysiert. Zunächst wird die Herstellung der Membranfraktion beschrieben. Zu 1 × 108 CHO/GPR8-Zellen wurden 10 ml eines Homogenatpuffers zugegeben (10 mM NaHCO3, 5 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 1 μg/ml Pepstatin, 4 μg/ml E64 und 20 μg/ml Leupeptin). Das Gemisch wurde durch die Verwendung von Polytron (12.000 U/min, 1 min) homogeni siert. Das Zellhomogenat wurde der Zentrifugation unterzogen (1.000 g, 15 min), wodurch der Überstand erhalten wurde. Dann wurde der Überstand der Ultrazentrifugation unterzogen (Beckman Typ 30 Rotor, 30.000 U/min, 1 Stunde). Der resultierende Niederschlag wurde als Membranfraktion der GPR8-exprimierenden CHO-Zellen verwendet.
  • Die GTPγS-Bindungsaktivität wurde folgendermaßen analysiert. Die Membranfraktion der GPR8-exprimierenden CHO-Zellen wurde mit einem Membranverdünnungspuffer (50 mM Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,4), 5 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 1 μM GDP) verdünnt, wodurch eine Zellmembranfraktionslösung zum Analysieren mit einem Proteinniveau von 30 mg/ml hergestellt wurde. Zu 200 μl der Zellmembranfraktionslösung zum Analysieren wurden 2 μl von 51,5 nM [35S]-Guanosin-5'-(γ-thio)triphosphat (NEN Co.) und eine Probenflüssigkeit zugegeben. Das resultierende Lösungsgemisch wurde bei 25 °C für eine Stunde gehalten. Das Gemisch wurde durch einen Filter filtriert. Nach dem zweimaligen Waschen mit 1,5 ml eines Waschpuffers (50 mM Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,4), 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0,1 % BSA) wurde die Radioaktivität des Filters mit einem Flüssigszintillationszählers gemessen.
  • REFERENZBEISPIEL 7
  • Detektion der cAMP-Produktion-unterdrückenden und GTPγS-Bindung-beschleunigenden Aktivität, enthalten in Schweinehypothalamusextrakt, spezifisch für die CHO/GPR8-Zellinie
  • Hochleistungsflüssigchromatographie-Fraktionen (HPLC-Fraktionen) des Schweinhypothalamusextrakts wurden durch die folgenden Verfahrensweisen hergestellt. Schweinehypothalamus, 500 g (entspricht 30 Schweinen), der von Tokyo Shibaura Zoki Co. erworben und unter Eiskühlung gehalten wurde, nachdem er den Schweinen am Tag ihrer Tötung entnommen wurde, wurde zerschnitten, direkt in 2,0 Liter siedendes destilliertes Wasser gegeben und für 10 Minuten gekocht. Direkt nach dem Kochen wurde das zerschnittene Produkt eisgekühlt, und 120 ml Essigsäure wurden zu dem Homogenat zugegeben, wodurch die Endkonzentration von 1,0 M erhalten wurde. Unter Verwendung von Polytron (20.000 U/min, 6 min) wurde das Gemisch homogenisiert. Das Homogenat wurde zentrifugiert (8.000 U/min, 30 min) und der Überstand wurde entnommen. Nachdem 2,0 Liter von 1,0 M Essigsäure zu dem Niederschlag zugegeben wurden, wurde das Gemisch erneut unter Verwendung von Polytron homogenisiert. Das Homogenat wurde über Nacht gerührt und dann zentrifugiert (8.000 U/min, 30 min), wodurch der Überstand erhalten wurde. Nachdem das 2fache Volumen von abgekühltem Aceton tropfenweise langsam zu dem Überstand bei 4 °C zugegeben wurde, wurde der Überstand, der durch die erste Zentrifugation erhalten wurde, über Nacht gerührt, der Überstand, der durch die zweite Zentrifugation erhalten wurde, wurde für 4 Stunden gerührt. Der Extrakt mit hinzugefügtem Aceton wurde zentrifugiert (8.000 U/min, 30 min), wodurch der Niederschlag entfernt wurde, und das Aceton wurde im Vakuum von dem Überstand unter Verwendung eines Verdampfers abgedampft. Ein gleiches Volumen von Diethylether wurde zu dem Aceton-freiem Extrakt zugegeben, die Etherschicht, die Lipide enthält, wurde unter Verwendung eines Trenntrichters abgetrennt, wodurch die wässerige Schicht gewonnen wurde. Nachdem die Lipide mit Ether entfernt waren, wurde der Extrakt im Vakuum unter Verwendung eines Verdampfers konzentriert, wodurch der Ether vollständig entfernt wurde. Das Konzentrat wurde durch ein Glasfaserfilterpaier (Advantech, DP70 (90 mm ∅)) filtriert und das Filtrat wurde in eine Glassäule (30 ∅ × 240 mm), gepackt mit C18-Säule (YMC, YMCgel ODS-AM 120-S50), geladen. Nach dem Waschen mit 400 ml von 1,0 M Essigsäure wurde die Säule mit 500 ml 60%igem Acetonitril, enthaltend 0,1 % Trifluoressigsäure, eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum konzentriert, das Lösungsmittel wurde abdestilliert und dann wurde das Konzentrat lyophilisiert. Etwa 0,5 g des lyophilisierten Produktes wurden in 30 ml 10%igem Acetonitril, enthaltend 0,1 % Trifluoressigsäure, gelöst. Ein aliquoter Teil von 10 ml wurde jeweils HPLC auf 10 % bis 60 % Acetonitril, enthaltend 0,1 % Trifluoressigsäure, durch Dichtegradientenelution unter Verwendung der C18-Säule unterzogen (Toso, TSKgel ODS-80TM (21,5 ∅ × 300 mm)). HPLC wurde dreimal durchgeführt. Das Eluat wurde in 60 Fraktionen fraktioniert, und die Eluate wurden in drei Durchgängen gesammelt. Jede Fraktion wurde konzentriert und zur Trockne im Vakuum eingedampft. Der Rest wurde in 0,5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst.
  • Eine DMSO-Lösung der HPLC-Fraktion, die wie oben beschrieben erhalten wurde, wurde zu den CHL/GPR8-Zellen durch die Verfahrensweisen, gezeigt in REFERENZBEISPIEL 5, zugegeben, um das Niveau an cAMP, das in den Zellen produziert wurde, zu bestimmen. Im Ergebnis wurde eine merkliche Aktivität, die das cAMP-Produkt unterdrückt, in Fraktion Nr. 30 festgestellt. Ebenso wurde die GTPγS-Bindung-beschleunigende Aktivität auf eine ähnlichen Probenflüssigkeit unter Verwendung der GPR8-exprimierenden CHO-Zellen untersucht. Ebenso wurde eine markierte Aktivität um die Fraktion Nr. 30 herum bestätigt. Da diese Aktivitäten nicht in anderen Rezeptorexpressionszellen beobachtet wurden, offenbaren die Er gebnisse, daß eine Liganden-aktive Substanz, die für GPR8 spezifisch ist, in dem Schweinehypothalamusextrakt vorlag.
  • REFERENZBEISPIEL 8
  • Inaktivierung der aktiven Substanz, die die intrazelluläre cAMP-Produktion-unterdrückende Aktivität zeigt, die für GPR8-exprimierende CHO-Zellen in Schweinehypothalamusextrakt spezifisch ist
  • Die HPLC-Fraktion Nr. 30, die die intrazelluläre cAMP-Produktion-unterdrückende Aktivität auf die GPR8-exprimierenden CHO-Zellen in REFERENZBEISPIEL 7 zeigt, wurde mit einem proteolytischem Enzym, Pronase (Sigma, Protease Typ XIV (P5147)) behandelt, wodurch untersucht wurde, ob die aktive Substanz proteinartig ist.
  • Die HPLC-Fraktion (Nr. 30), 2 μl, aus dem oben beschriebenen Hypothalamusextrakt wurde zu 200 μl von 0,2 M Ammoniumacetat zugegeben, und 3 μl Pronase wurde weiter dazugegeben. Nach der Inkubation bei 37 °C für 2 Stunden wurde die Kultur in siedendem Wasser für 10 Minuten gekocht, wodurch die Pronase inaktiviert wurde. Zu der Reaktionslösung wurden 2 ml destilliertes Wasser, enthaltend 0,05 mg BSA und 0,05 mg CHAPS zugegeben, gefolgt von der Lyophilisierung. Um zu untersuchen, ob Pronase selbst oder das Erhitzen oder die Lypohilisierung eine Wirkung haben, wurden Pronase allein, die HPLC-Fraktion allein und ein Gemisch von der HPLC-Fraktion mit Pronase allein nach ihrem Erhitzen in einer ähnlichen Weise behandelt und dann lyophilisiert. Jede lyophilisierte Probenflüssigkeit wurde zu den GPR8-exprimierenden CHO-Zellen durch die Verfahrensweisen, gezeigt in REFERENZBEISPIEL 5, zugegeben, und die intrazelluläre cAMP-Produktion-unterdrückende Aktivität wurde analysiert. Da die aktive Substanz, die die intrazelluläre cAMP-Produktion-unterdrückende Aktivität auf die GPR8-exprimierenden CHO-Zellen in dem Schweinehypothalamusextrakt zeigt, vollständig durch die Pronase inaktiviert wurde, wurde offenbart, daß diese Substanz ein Protein oder Peptid war.
  • REFERENZBEISPIEL 9
  • Reinigung der aktiven Substanz, die die GTPγS-Bindung-beschleunigende Aktivität zeigt, die für die Membranfraktion der GPR8-exprimierenden CHO-Zellen aus Schweinehypothalamus spezifisch ist
  • Ein repräsentatives Beispiel zum Reinigen der aktiven Substanz aus dem Schweinehypothalamus, die die Ligandenaktivität zeigt, die für GPR8 spezifisch ist, unter Verwendung der GTPγS-Bindung-beschleunigenden Aktivität auf die Membranfraktion der GPR8-exprimierenden CHO-Zellen als ein Indikator wird nachstehend in spezifischer Weise beschrieben. Schweinehypothalamus, 500 g (entspricht 30 Schweinen), wurde mit 1,0 M Essigsäure durch dieselben Verfahrensweisen, wie in REFERENZBEISPIEL 7 beschrieben, extrahiert. Nach der Ausfällung und Entfernung von Lipiden mit Ether wurde der Extrakt auf einer Säule, gepackt mit C18 (YMC, YMCgel ODS-AM 120-S50), adsorbiert, gefolgt von der Elution mit 60 % Acetonitril, enthaltend 0,1 % Trifluoressigsäure. Nachdem das Eluat konzentriert und lyophilisiert wurde, wurde das Konzentrat der HPLC unter Verwendung der C18-Säule unterzogen (Toso, TSKgel ODS-80TS (21,5 ∅ × 300 mm)), wodurch die aktive Fraktion erhalten wurde. Die Aktivität wurde in Fraktion Nr. 30 gewonnen, die weiter durch die folgenden Verfahrensweisen gereinigt wurde.
  • Die Fraktion wurde in 10 ml von 10 mM Ammoniumformiat, enthaltend 10 % Acetonitril, gelöst. Nachdem die Lösung durch eine Kationenaustauschsäule geführt wurde (Toso, TSKgel SP-5PW (20 mm ∅ × 150 mm)), wurde die Säule mit 10 mM bis 2,0 M Ammoniumformiat, enthaltend 10 % Acetonitril, mittels Dichtegradienten eluiert. Die Aktivität wurde bei etwa 0,8 M Ammoniumformiat gewonnen. Die aktive Fraktion wurde lyophilisiert und in 1,0 ml von 10 % Acetonitril, enthaltend 0,1 % Trifluoressigsäure, gelöst. Nachdem die Lösung durch eine CN-Säule geführt wurde (Nomura Chemical Co., Ltd., Develosil CN-UG-5 (4,6 mm ∅ × 250 mm)), wurde die Elution mit einem Dichtegradienten mit 21 % bis 26 % Acetonitril, enthaltend 0,1 % Trifluoressigsäure, durchgeführt. Die Aktivität trat bei rund 22,1 % Acetonitril auf. Die aktive Fraktion wurde lyophilisiert und in 0,1 ml DMSO gelöst. Die Lösung wurde ferner mit 0,4 ml von 10 % Acetonitril, enthaltend 0,1 % Trifluoressigsäure, zugegeben, die durch eine ODS-Säule geführt wurde (Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd., Wakosil-II 3C18HG (2,0 mm ∅ × 150 mm)), gefolgt von Elution in bezug auf den Dichtegradienten von 22,5 % bis 32,5 % Acetonitril, enthaltend 0,1 % Trifluoressigsäure. Die Aktivität trat als Einzelpeak bei rund 26,5 % Acetonitril auf (2).
  • REFERENZBEISPIEL 10
  • Amino-terminale Aminosäuresequenzierung der aktiven Substanz die die GTPγS-Bindung-beschleunigende Aktivität zeigt, die für die GPR8-exprimierenden CHO-Zellen spezifisch ist, gereinigt aus Schweinehypothalamus, und EST-Sequenz, von der vorausgesagt wird, daß sie einen Teil der Mensch- und Ratten-homologen Peptidpräkursorproteine vom GPR8-Liganden codiert
  • Amino-terminale Aminosäuresequenzierung der aktiven Substanz, die die GTPγS-Bindung-beschleunigende Aktivität zeigt, die für die Membranfraktion der GPR8-exprimierenden CHO-Zellen spezifisch ist, gereinigt in REFERENZBEISPIEL 9, wurde durchgeführt. Da vermutet wurde, daß die aktive Substanz ein Protein oder Peptid sein würde, wie in REFERENZBEISPIEL 8 gezeigt, wurde die Amino-terminale Aminosäuresequenzierung unter Verwendung von Procise 494 Protein Sequencer, erhältlich von Perkin-Elmer, unter Verwendung des Eluats, enthaltend den aktiven Peak, durchgeführt. Infolgedessen wurde die Sequenz, dargestellt durch SEQ ID: 6, in der Region von bis zu 17 Resten vom Aminoterminus erhalten. Diese Sequenz wurde als ein Teil des Ligandenpeptids betrachtet.
  • Die Untersuchung der Gendatenbank, basierend auf dieser Sequenz, ergab einige EST-Sequenzen (EST = Expressed Sequence Tag), und es wurde geschlußfolgert, daß die Sequenz oder ihr komplementärer Strang einen Teil des Präkursorproteins von diesem Peptid codieren würde. Diese Sequenzen haben die folgenden Zugangsnummern, cDNA-Startpunkt, Sequenzgröße und Sequenzidentifikationsnummern: AW007531 (anaplastisches Oligodentrogliom, 438 Basen, SEQ ID Nr. 7), AI500303 (anaplastisches Oligodentrogliorn, 264 Basen, SEQ ID Nr. 8), AI990964 (Kolonschleimhaut von Patienten mit Crohn-Krankheit, 424 Basen, SEQ ID Nr. 9), AA744804 (Keimzentrum B-Zelle, 375 Basen, SEQ ID Nr. 10), H31598 (PC12-Zellen, 260 Basen, SEQ ID Nr. 11). Die ersten 4 Sequenzen stammen vom Menschen, und die letzte Sequenz stammt von der Ratte. Die DNA-Sequenzen von diesen ESTs stimmen sehr gut mit der Region überein, die die Aminosäuresequenz codiert, welche der Sequenz des aktiven Peptids entspricht, das aus Schweinehypothalamus isoliert wurde. Außerdem war die translatierte Aminosäuresequenz beinah identisch mit der Sequenz des Peptids, das aus Schweinehypothalamus isoliert und geklärt wurde, außer daß der 5. Rest Thr Val ist. Basierend auf dem Vorhergehenden wurde geschlußfolgert, daß diese ESTs einen Teil von Menschen- oder Ratten-homologen Präkursorproteinen des Ligandenpeptids für GPR8 codieren würden.
  • REFERENZBEISPIEL 11
  • Amplifikation von menschlicher cDNA, die einen Teil des GPR8-Ligandenpeptidpräkursors codiert und die amplifizierte cDNA-Sequenz decodiert
  • Basierend auf den mutmaßlichen EST-Sequenzen, um einen Teil des Präkursorproteins des GPR8-Ligandenpeptids, beschrieben in REFERENZBEISPIEL 10, zu codieren, wurden Primer konstruiert, und cDNA, die einen Teil des GPR8-Ligandenpeptidpräkursors codiert, wurde aus vom menschlichen Gehirn abgeleiteter cDNA durch PCR amplifiziert.
  • Umkehrtranskription wurde unter Verwendung zufälliger Primer durchgeführt, wobei vom menschlichen Gehirn abgeleitete Poly(A)+RNA (Clontech Laboratories, Inc.) als eine Matrize verwendet wurde. ReverTra Ace (Toyobo Co., Ltd.) wurde für die Umkehrtranskription verwendet. Dann wurde die Amplifikation durch PCR unter Verwendung von synthetischen Primern, dargestellt durch SEQ ID Nr. 12 und SEQ ID Nr. 13, konstruiert auf der Basis der EST-Sequenzen, beschrieben in REFERENZBEISPIEL 10, durchgeführt. Die Reaktionslösung bestand aus 2 μl cDNA-Matrize, jeweils 0,5 μM der synthetischen DNA-Primer, 1,6 mM dNTPs und 0,2 μl LA Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.), zu der Puffer, der dem Enzym beigefügt war, zugegeben wurde, wodurch das Gesamtvolumen von 20 μl hergestellt wurde. Für die Amplifikation wurde nach dem Erhitzen auf 96 °C für 120 Sekunden unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) ein Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 45 Sekunden, viermal wiederholt, wurde ein Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 70 °C für 45 Sekunden, viermal wiederholt, wurde ein Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 68 °C für 45 Sekunden, viermal wiederholt, wurde ein Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden, 64 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 45 Sekunden, fünfmal wiederholt, wurde ein Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden, 60 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 45 Sekunden, zwanzig Mal wiederholt, und schließlich wurde das Gemisch bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Das amplifizierte Produkt wurde durch 3-%-Agarosegelelektrophorese, gefolgt von Färben mit Ethidiumbromid, bestätigt.
  • Die PCR-Lösung wurde 3%iger niedrigschmelzender Agarosegelelektrophorese zur Trennung unterzogen. Nachdem die Bandenteile von dem Gel mit einer Rasierklinge exzidiert wurden, wurde die DNA unter Verwendung von QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) gewonnen. Die gewonnene DNA wurde in den Plasmidvektor pCR2.1-TOPO gemäß dem Protokoll von TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) subkloniert, der dann in Escherichia coli TOP 10 (Invitrogen) zur Transfektion eingeführt wurde. Dann wurden die Klone mit einem cDNA-insertierten Fragment in einem LB-Agarkulturmedium, enthaltend Ampicillin und X-gal, selektiert. Nur die Klone, die weiße Farbe zeigten, wurden mit einem sterilisierten Zahnstocher ausgewählt, um die Transformanten zu erlangen. Die einzelnen Klone wurden über Nacht in einem LB-Kulturmedium, enthaltend Ampicillin, kultiviert, und Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung von QIAwell 8 Plasmid Kit (Qiagen) hergestellt. Die Reaktion zum Bestimmen der Basensequenz wurde unter Verwendung eines DyeDeoxy Terminator Cycle Sequence Kits (PE Biosystems) durchgeführt, und die DNAs wurden unter Verwendung eines automatischen Fluoreszenzsequenzers decodiert, um die DNA-Sequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 14, zu erhalten. Wie vorhergesagt, lag die Peptidsequenz, die dem aktiven Peptid entspricht, das aus Schweinehypothalamus isoliert und in seiner Sequenz geklärt wurde, in einem Teil (SEQ ID Nr. 15) des GPR8-Ligandenpeptidpräkursorproteins vor, das aus der zuvor genannten Sequenz translatiert wurde. In dem C-Terminus lag die Arg-Arg-Sequenz (Seidah, N. G. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 839, 9-24, 1998) an 2 Stellen vor, wobei von der Sequenz ein normales physiologisch aktives Peptid exzidiert wurde. Im Hinblick auf das Vorhergehende wurde geschlußfolgert, daß die Aminosäuresequenz eines menschlichen Homologs des GPR8-Ligandenpeptids entweder SEQ ID Nr. 16 oder 17 oder beide sein würde.
  • REFERENZBEISPIEL 12
  • Produktion von Fmoc-Mensch-GPR8-Ligand (1-23):
    • Fmoc-Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu (SEQ ID Nr. 105)
  • und Mensch-GPR8-Ligand (1-23):
    • Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu (SEQ ID Nr. 16)
  • Unter Verwendung von 0,25 mmol (0,76 mmol/g) Fmoc-Leu-O-Clt-Harz als Ausgangsmaterial, erhalten durch Einführen von Fmoc-Leu in kommerziell erhältliches 2-Chlortritylharz (Clt-Harz, 1,33 mmol/g), und unter Verwendung eines Peptidsynthesizers AMI 433A wurde die Kondensation durch das Fmoc/DCC/HOBt-Verfahren nacheinander in der Reihenfolge von Fmoc-Gly, Fmoc-Met, Fmoc-Leu, Fmoc-Leu, Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Arg (Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Val, Fmoc-Thr (But), Fmoc-His (Trt), Fmoc-Tyr (But), Fmoc-Arg (Pbf), Fmoc-Pro, Fmoc-Ser (But), Fmoc-Ala, Fmoc-Val, Fmoc-His (Trt), Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Tyr (But) und Fmoc-Trp (Boc) durchgeführt, um 830 mg von Fmoc-Trp (Boc)-Tyr (But)-Lys (Boc)-His (Trt)-Val-Ala-Ser (But)-Pro-Arg (Pbf)-Tyr (But)-His (Trt)-Thr (But)-Val-Gly-Arg (Pbf)-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-O-Clt-Harz zu erhalten. Zu 150 mg von diesem Harz wurden 5 ml TFA/Thioanisol/m-Cresol/Triisopropylsilan/Ethandithiol (85/5/5/2,5/2/5) zugegeben. Nachdem das Gemisch bei Raumtemperatur für 2 Stunden geschüttelt wurde, wurde das Harz abfiltriert, und das Lösungsmittel wurde konzentriert. Ether wurde zu dem Konzentrat zugegeben, um rohes Fmoc-Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu als Niederschläge zu erhalten. Das Rohprodukt wurde der linearen Dichtegradientenelution (60 min) unter Verwendung des Elutionsmittels A: 0,1 % TFA-Wasser, und Elutionsmittels B: 0,1 % TFA-enthaltendes Acetonitril, in A/B: 72/28 bis 52/48, auf präparativer HPLC unter Verwendung der YMC D-ODS-5-ST S-5 120A-Säule (20 × 150 mm) unterzogen. Fraktionen, die das Produkt enthalten, wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch 9,7 mg weiße Pulver erhalten wurden.
    Massenspektrum (M+H)+ 2805,7 (ber. 2805,4)
    Elutionszeit auf HPLC 25,1 min
    Bedingungen zur Elution:
    Säule: Wakosil-II 5C18 HG (4,6 × 100 mm)
    Elutionsmittel: lineare Dichtegradientenelution unter Verwendung von Elutionsmittel A: 0,1 % TFA-Wasser, und Elutionsmittel B: Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA, mit Lösungen A/B = 100/0 bis 30/70 (35 min)
    Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.
  • Zu 5 mg des so erhaltenen Fmoc-Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu wurde 1 ml von 20%igem Diethylamin/DMF zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Nachdem das Lösungsmittel durch Destillation entfernt wurde, wurde der Rest der linearen Dichtegradientenelution (60 min) mit Elutionsmittel A: 0,1 % TFA-Wasser, und Elutionsmittel B: 0,1 % TFA-enthaltendes Acetonitril, in A/B: 74/26 bis 64/36, auf präparativer HPLC unter Verwendung der YMC D-ODS-5-ST S-5 120A-Säule (20 × 150 mm) unterzogen. Fraktionen, die das Produkt enthalten, wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch 1,2 mg weiße Pulver erhalten wurden.
    Massenspektrum (M+H)+ 2583,6 (ber. 2583,4)
    Elutionszeit auf HPLC 20,4 min
    Bedingungen zur Elution:
    Säule: Wakosil-II 5C18 HG (4,6 × 100 mm)
    Elutionsmittel: lineare Dichtegradientenelution unter Verwendung von Elutionsmittel A: 0,1 % TFA-Wasser, und Elutionsmittel B: Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA, mit Lösungen A/B = 100/0 bis 30/70 (35 min)
    Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.
  • REFERENZBEISPIEL 13
  • Produktion von Mensch-GPR8-Ligand (1-30): Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr-Leu-Trp (SEQ ID Nr. 17)
  • Unter Verwendung von 0,25 mmol (0,64 mmol/g) Fmoc-Trp(Boc)-O-Clt-Harz als Ausgangsmaterial, erhalten durch Einführen von Fmoc-Trp (Boc) in kommerziell erhältliches 2-Chlortritylharz (Clt-Harz, 1,33 mmol/g), wurden Aminosäuren in ihrer Sequenzreihenfolge wie in REFERENZBEISPIEL 12 kondensiert, und die Fmoc-Gruppe wurde auf dem Harz nach der Einführung des letzten Trp und vor dem Exzidieren aus dem Harz entfernt. Durch die Behandlung mit TFA/Thioanisol/m-Cresol/Triisopropylsilan/Ethandithiol (85/5/5/2,5/2,5) wurden die Exzision aus dem Harz und die Entfernung der Seitenkettenschutzgruppen gleichzeitig bewirkt. Das Rohpeptid wurde wie in REFERENZBEISPIEL 12 gereinigt, wodurch
    Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr-Leu-Trp
    erhalten wurde.
    Massenspektrum (M+H)+ 3543,4 (ber. 3544,2)
    Elutionszeit auf HPLC 21,5 min
    Bedingungen zur Elution:
    Säule: Wakosil-II 5C18 HG (4,6 × 100 mm)
    Elutionsmittel: lineare Dichtegradientenelution unter Verwendung von Elutionsmittel A: 0,1 % TFA-Wasser, und Elutionsmittel B: Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA, mit Lösungen A/B = 100/0 bis 30/70 (35 min)
    Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.
  • REFERENZBEISPIEL 14
  • Produktion von Mensch-GPR8-Ligand (1-29):
    • Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID Nr. 20)
  • Unter Verwendung des Harzes von REFERENZBEISPIEL 12 wurden Aminosäuren in der Reihenfolge ihrer Sequenzen wie in REFERENZBEISPIEL 13 kondensiert, und die Exzision aus dem Harz und die Reinigung wurden durchgeführt, wodurch
    • Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr-Leu
    erhalten wurde
  • REFERENZBEISPIEL 15
  • Produktion von Mensch-GPR8-Ligand (1-28):
    • Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr (SEQ ID Nr. 21)
  • Nachdem Fmoc-Tyr (But) in kommerziell erhältliches 2-Chlortritylharz (Clt-Harz, 1,33 mmol/g) eingeführt wurde, wurden die Kondensation von Aminosäuren in ihrer Sequenzreihenfolge, die Exzision aus dem Harz und die Reinigung wie in REFERENZBEISPIEL 13 durchgeführt, wodurch
    • Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro-Tyr
    erhalten wurde.
  • REFERENZBEISPIEL 16
  • Produktion von Mensch-GPR8-Liganad (1-27):
    • Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro (SEQ ID Nr. 22)
  • Nachdem Fmoc-Pro in kommerziell erhältliches 2-Chlortritylharz (Clt-Harz, 1,33 mmol/g) eingeführt wurde, wurden die Kondensation von Aminosäuren in ihrer Sequenzreihenfolge, die Exzision aus dem Harz und die Reinigung wie in REFERENZBEISPIEL 13 durchgeführt, wodurch
    • Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser-Pro
    erhalten wurde.
  • REFERENZBEISPIEL 17
  • Produktion von Mensch-GPR8-Ligand (1-26): Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg- Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser (SEQ ID Nr. 23)
  • Nachdem Fmoc-Tyr (But) in kommerziell erhältliches 2-Chlortritylharz (Clt-Harz, 1,33 mmol/g) eingeführt wurde, wurden die Kondensation von Aminosäuren in ihrer Sequenzreihenfolge, die Exzision aus dem Harz und die Reinigung wie in REFERENZBEISPIEL 13 durchgeführt, wodurch Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg-Ser erhalten wurde.
  • REFERENZBEISPIEL 18
  • Produktion von Mensch-GPR8-Ligand (1-25):
    • Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg (SEQ ID Nr. 24)
  • Nachdem Fmoc-Arg (Pbf) in kommerziell erhältliches 2-Chlortritylharz (Clt-Harz, 1,33 mmol/g) eingeführt wurde, wurden die Kondensation von Aminosäuren in ihrer Sequenzreihenfolge, die Exzision aus dem Harz und die Reinigung wie in REFERENZBEISPIEL 13 durchgeführt, wodurch
    • Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg-Arg erhalten wurde.
  • REFERENZBEISPIEL 19
  • Produktion von Mensch-GPR8-Ligand (1-24):
    • Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg (SEQ ID Nr. 25)
  • Nachdem Fmoc-Arg (Pbf) in kommerziell erhältliches 2-Chlortritylharz (Clt-Harz, 1,33 mmol/g) eingeführt wurde, wurden die Kondensation von Aminosäuren in ihrer Sequenzreihenfolge, die Exzision aus dem Harz und die Reinigung wie in REFERENZBEISPIEL 13 durchgeführt, wodurch
    • Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu-Arg.
    erhalten wurde.
  • REFERENZBEISPIEL 20
  • GTPγS-Bindung-beschleunigende Aktivität eines menschlichen Homologs des GPR8-Ligandenpeptids, bestehend aus 23 Resten, gemessen unter Verwendung der Membranfraktion der GPR8-exprimierenden CHO-Zellen
  • Das menschliche Homolog des GPR8-Ligandenpeptids, bestehend aus 23 Resten, das in REFERENZBEISPIEL 12 synthetisiert wurde (hierin nachstehend manchmal als hGPR8L (1-23) bezeichnet), wurde zu der Membranfraktion der GPR8-exprimierenden CHO-Zellen in verschiedenen Konzentrationen gemäß den Verfahrensweisen, die in REFERENZBEISPIEL 6 beschrieben sind, zugegeben, um die GTPγS-Bindung-beschleunigende Aktivität zu analysieren. Die Ergebnisse werden in 3 gezeigt. Offensichtlich beschleunigte hGPR8L (1-23) dosisabhängig die GTPγS-Bindung der Membranfraktion der GPR8-exprimierenden CHO-Zellen. Die Ergebnisse offenbarten, daß das Peptid mit einer Struktur von SEQ ID Nr. 16 ein Ligand für GPR8 ist.
  • REFERENZBEISPIEL 21
  • GTPγS-Bindung-beschleunigende Aktivität eines menschlichen Homologs des GPR8-Ligandenpeptids, bestehend aus 30 Resten, gemessen unter Verwendung der Membranfraktion der GPR8-exprimierenden CHO-Zellen
  • Das menschliche Homolog des GPR8-Ligandenpeptids, bestehend aus 30 Resten, das in REFERENZBEISPIEL 13 synthetisiert wurde (hierin nachstehend manchmal als hGPR8L (1-30) bezeichnet) wurde zu der Membranfraktion der GPR8-exprimierenden CHO-Zellen in verschiedenen Konzentrationen gemäß den Verfahrensweisen, die in REFERENZBEISPIEL 6 beschrieben sind, zugegeben, um die GTPγS-Bindung-beschleunigende Aktivität zu analysierten. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. Offensichtlich beschleunigte hGPR8L (1-30) dosisabhängig die GTPγS-Bindung der Membranfraktion der GPR8-exprimierenden CHO-Zellen. Die Ergebnisse offenbarten, daß das Peptid mit einer Struktur von SEQ ID Nr. 17 ein Ligand für GPR8 ist.
  • REFERENZBEISPIEL 22
  • Intrazelluläre cAMP-Produktion-unterdrückende Aktivität eines menschlichen Homologs des GPR8-Ligandenpeptids, bestehend aus 23 Resten, gemessen unter Verwendung der GPR8-exprimierenden CHO-Zellen
  • hGPR8L (1-23), das in REFERENZBEISPIEL 12 synthetisiert wurde, wurde mit den GPR8-exprimierenden CHO-Zellen in verschiedenen Konzentrationen gemäß den Verfahrensweisen, die in REFERENZBEISPIEL 5 beschrieben sind, in Kontakt gebracht, um die intrazelluläre cAMP-Produktion-unterdrückende Aktivität zu analysieren. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. Offensichtlich unterdrückte hGPR8L (1-23) die intrazelluläre cAMP-Produktion dosisabhängig in den GPR8-exprimierenden CHO-Zellen. In der Figur wird die cAMP-Synthese-unterdrückende Aktivität durch den Wert in Prozent ausgedrückt, der erhalten wurde, wenn das intrazelluläre cAMP-Niveau, das mit einem Reaktionspuffer zugefügt wurde, von dem intrazellulären cAMP-Niveau subtrahiert wurde, wenn hGPR8L (1-23) zugefügt wurde, wobei das intrazelluläre cAMP-Niveau, erhalten durch Subtrahieren des intrazellulären cAMP-Niveaus, zugefügt mit einem Reaktionspuffer, von dem intrazellulären cAMP-Niveau, zugefügt mit einem Forskolin-enthaltenden Reaktionspuffer, 100 % beträgt.
  • REFERENZBEISPIEL 23
  • Intrazelluläre cAMP-Produktion-unterdrückende Aktivität eines menschlichen Homologs des GPR8-Ligandenpeptids, bestehend aus 30 Resten, gemessen unter Verwendung der GPR8-exprimierenden CHO-Zellen
  • hGPR8L (1-30), das in REFERENZBEISPIEL 13 synthetisiert wurde, wurde mit den GPR8-exprimierenden CHO-Zellen in verschiedenen Konzentrationen gemäß den Verfahrensweisen, die in REFERENZBEISPIEL 5 beschrieben sind, in Kontakt gebracht, um die intrazelluläre cAMP-Produktion-unterdrückende Aktivität zu analysieren. Die Ergebnisse werden in 7 gezeigt. Offensichtlich unterdrückte hGPR8L (1-30) die intrazelluläre cAMP-Produktion dosisabhängig in den GPR8-exprimierenden CHO-Zellen. In der Figur wurde die cAMP-Synthese-unterdrückende Aktivität durch den Wert in Prozent ausgedrückt, der erhalten wurde, wenn das intrazelluläre cAMP-Niveau, zugefügt mit einem Reaktionspuffer, von dem intrazellulären cAMP-Niveau substrahiert wurde, wenn hGPR8L (1-30) zugefügt wurde, wobei das intrazelluläre cAMP-Niveau, erhalten durch Subtrahieren des intrazellulären cAMP-Niveaus, zugefügt mit einem Reaktionspuffer, von dem intrazellulären cAMP-Niveau, zugefügt mit einem Forskolin-enthaltenden Reaktionspuffer, 100 % beträgt.
  • REFERENZBEISPIEL 24
  • Wirkung des GPR8-Liganden auf das Eßverhalten
  • Männlichen Wistar-Ratten (9 Wochen alt) unter Pentobarbitalanästhesie wurde eine Führungskanüle (AG-8), gerichtet auf das Seitenventrikel (AP: 8,1, L: 1,8, H: 7,1 mm), eingeführt. Die Tiere konnten sich mindestens eine Woche postoperativ erholen, bevor sie in den Experimenten verwendet wurden. Während des Erholungszeitraums wurden die Tiere jeden Tag der Behandlung unterzogen, um Streß zu verringern, der durch intrazerebroventrikuläre Injektion verursacht wird.
  • Fütterungsversuche begannen 15:00 Uhr. Den Ratten wurde eine Mikroinjektionskanüle ohne Anästhesie und ohne Zwang eingeführt, und sie erhielten eine PBS-Lösung aus dem Peptid (Peptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 16), erhalten in REFERENZBEISPIEL 12, oder PBS allein in einer Dosis von 5 μl/min für 2 Minuten. Die Mikroinjektionskanüle wurde 1 Minute nach Beendigung der Injektion entfernt und die Tiere hatten freien Zugang zu vorher abgewogenem Futter (Pellets CE2: Nippon Kurea). Die Zeit zählte ab dem Injektionszeitpunkt, und die Futteraufnahme wurde durch Wiegen der Pellets nach 30, 60 und 120 Minuten gemessen (6).
  • REFERENZBEISPIEL 25
  • Klonen des 5'-stromaufwärts-Endes der cDNA, die Mensch-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert
  • 5'-RACE-PCR wurde durchgeführt, um die 5'-stromaufwärts-Basensequenz der cDNA zu klären, die das Mensch-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert, wobei menschliche Hypothalamus-cDNA als eine Matrize verwendet wurde, und ein Primer, hergestellt basierend auf der menschlichen cDNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 14), die einen Teil des Präkursorproteins eines menschlichen Homologs des Ligandenpeptids für GPR8 codiert, beschrieben in REFERENZBEISPIEL 11 (hierin nachstehend manchmal als Mensch-GPR8-Liganad bezeichnet), wurde verwendet. Das 5'-RACE-PCR-Klonen wurde durch die folgenden Verfahrensweisen bewirkt: PCR wurde durchgeführt unter Verwendung von menschlicher hypothalamischer Marathon-Ready-cDNA (CLONTECH) als eine Matrize und unter Verwendung von AP1-Primer, der dem Kit beigefügt war, und des synthetischen Primers von SEQ ID Nr. 33, und dann wurde unter Verwendung dieser PCR-Lösung als eine Matrize PCR weiter unter Verwendung des AP2-Primers, der dem Kit beigefügt war, und des synthetischen Primers von SEQ ID Nr. 34 durchgeführt. Die Zusammensetzungen der Reaktionslösungen und Reaktionsbedingungen für PCR waren folgendermaßen. Die Reaktionslösung bestand aus 4 μl menschlicher hypothalamischer cDNA, 0,5 μM AP1-Primer, 0,5 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 33, 0,4 mM dNTPs und 0,2 μl LATaq-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.), wobei GC-(I)-Puffer, der dem Enzym beigefügt war, zugefügt wurde, um das Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl herzustellen. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslösung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 120 Sekunden 30 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 68 °C für 240 Sekunden, unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Dann wurde die PCR-Lösung 50fach mit Tricine-EDTA-Puffer, der dem Kit beigefügt war, verdünnt. Ein aliquoter Teil von 2 μl der Verdünnung, 0,5 μM AP2-Primer, 0,5 μM synthetischer DNA-Primer von SEQ ID Nr. 34, 0,4 mM dNTPs und 0,2 μl LATaq-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden durch Zugabe von GC-(I)-Puffer, der dem Enzym beigefügt war, auf ein Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl gebracht. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslösung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 120 Sekunden 4 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 180 Sekunden, 4 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 70 °C für 180 Sekunden, 17 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 68 °C für 180 Sekunden, unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Nachdem die amplifizierte DNA durch 1,2-%-Agarosegelelektrophorese isoliert wurde, wurde die DNA mit einer Größe von etwa 1200 bp mit einer Rasierklinge exzidiert und unter Verwendung von QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) gewonnen. Die gewonnene DNA wurde in den Vektor PCR2.1-TOPO gemäß dem Protokoll von TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) subkloniert, der dann in eine Escherichia coli TOP10-kompetente Zelle (Invitrogen) zur Transfektion transfektiert wurde. Die resultierenden Klone, die das cDNA-Insertfragment tragen, wurden in einem LB-Medium, enthaltend Ampicillin und X-gal, selektiert. Nur die Klone, die weiße Farbe zeigten, wurden mit einem sterilisierten Zahnstocher ausgewählt, um die Transformanten zu erlangen. Die einzelnen Klone wurden über Nacht in einem LB-Kulturmedium, enthaltend Ampicillin, kultiviert, und Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung von QIAwell 8 Plasmid Kit (Qiagen) hergestellt. Die Reaktion für die Basensequenzierung wurde unter Verwendung von BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaktion Kit (PE Biosystems) durchgeführt, und die DNAs wurden unter Verwendung eines automatischen Fluoreszenzsequenzers decodiert, um die DNA-Sequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 35, zu erlangen.
  • REFERENZBEISPIEL 26
  • Herstellung von menschlicher Gehirn-cDNA
  • Menschliche Gehirn-cDNA wurde aus menschlicher Gehirn-Poly A (+) RNA (CLONTECH) unter Verwendung des MarathonTM cDNA Amplification Kits (CLONTECH) hergestellt. cDNAs, die für RACE-PCR bereitgestellt wurden, wurden gemäß dem Protokoll, der dem Kit beigefügt war, hergestellt, außer für die Synthese der Erststrang-cDNA. Die Erststrang-cDNA wurde aus 1 μg menschlicher Gehirn-Poly A (+) RNA unter Verwendung von Umkehrtranskriptase MMLV (-RNAse H) (RefTraAce, Toyobo Co., Ltd.) anstelle von Umkehrtranskriptase AMV, die dem Kit beigefügt war, synthetisiert.
  • REFERENZBEISPIEL 27
  • Klonen des 3'-stromabwärts-Endes der cDNA, die Mensch-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert
  • 3'-RACE-PCR wurde durchgeführt, um die 3'-stromabwärts-Basensequenz der cDNA zu klären, die den Mensch-GPR8-Liganden codiert, in dem die menschliche Gehirn-cDNA als eine Matrize verwendet wurde, und ein Primer, hergestellt basierend auf der menschlichen cDNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 14), die einen Teil des Präkursorproteins eines menschlichen Homologs des Ligandenpeptids für GPR8, beschrieben in REFERENZBEISPIEL 11, codiert, wurde verwendet. Das 3'-RACE-PCR-Klonen wurde durch die folgenden Verfahrensweisen bewirkt: PCR wurde unter Verwendung von menschlicher Gehirn-cDNA als eine Matrize und unter Verwendung von AP1-Primer, der dem Kit beigefügt war, und dem synthetischen Primer von SEQ ID Nr. 36 durchgeführt, und dann wurde unter Verwendung dieser PCR-Lösung als eine Matrize PCR weiter unter Verwendung von AP2-Primer, der dem Kit beigefügt war, und dem synthetischen Primer von SEQ ID Nr. 37 durchgeführt. Die Zusammensetzungen der Reaktionslösungen und die Reaktionsbedingungen für die PCR waren folgendermaßen. Die Reaktionslösung bestand aus 1 μl menschlicher Gehirn-cDNA, 50fach verdünnt mit Tricine-EDTA-Puffer, der dem Kit beigefügt war, 0,5 μM AP1-Primer, 0,5 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 36, 0,4 mM dNTPs und 0,2 μl LATaq-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.), wobei GC-(I)-Puffer, der dem Enzym beigefügt war, zugefügt wurde, um das Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl herzustellen. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslösung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 120 Sekunden 30 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 68 °C für 240 Sekunden, unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Dann wurde die PCR-Lösung 50fach mit Tricine-EDTA-Puffer, der dem Kit beigefügt war, verdünnt. Ein aliquoter Teil von 1 μl der verdünnten PCR-Lösung, 0,5 μM AP2-Primer, 0,5 μM synthetischer DNA-Primer von SEQ ID Nr. 37, 0,4 mM dNTPs und 0,2 μl LATaq-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.), wurden durch Zugabe von GC-(I)-Puffer, der dem Enzym beigefügt war, auf das Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl gebracht. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslösung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 120 Sekunden 4 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 180 Sekunden, 4 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 70 °C für 180 Sekunden, 17 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 68 °C für 180 Sekunden, unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Nachdem die amplifizierte DNA durch 1,5-%-Agarosegelelektrophorese isoliert wurde, wurde die DNA mit einer Größe von etwa 600 bp mit einer Rasierklinge exzidiert und unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen) gewonnen. Die gewonnene DNA wurde in den Vektor PCR2.1-TOPO gemäß dem Protokoll von TOPO TA Cloning Kot (Invitrogen) subkloniert, der dann in eine Escherichia coli TOP10-kompetente Zelle (Invitrogen) zur Transfektion transfektiert wurde. Die resultierenden Klone, die das cDNA-Insertfragement tragen, wurden in einem LB-Medium, enthaltend Ampicillin und X-gal, selektiert. Nur die Klone, die weiße Farbe zeigten, wurden mit einem sterilisierten Zahnstocher ausgewählt, um die Transformanten zu erlangen. Die einzelnen Klone wurden über Nacht in einem LB-Kulturmedium, enthaltend Ampicillin, kultiviert, und Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung des QIAwell 8 Plasmid Kits (Qiagen) hergestellt. Die Reaktion zur Basensequenzierung wurde unter Verwendung des BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaktion Kits (PE Biosystems) durchgeführt, und die DNAs wurden unter Verwendung eines automatischen Fluoreszenzsequenzers decodiert, um die DNA-Sequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 38, zu erlangen.
  • REFERENZBEISPIEL 28
  • Klonen der cDNA, die Mensch-GPR8-Ligandpräkursorprotein codiert
  • Amplifikation wurde durch PCR durchgeführt, um die Klonierung der cDNA, die das Mensch-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert, zu bewirken, in dem die menschliche Hypothalamus-cDNA als eine Matrize verwendet wurde, und ein Primer, hergestellt basierend auf der 5'-stromaufwärts-Basensequenz der cDNA, die Mensch-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert, und ein Primer, hergestellt basierend auf der 3'-stromabwärts-Basensequenz der cDNA, die Mensch-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert, wurden verwendet. Die Zusammensetzungen der Reaktionslösungen und die Reaktionsbedingungen für die PCR waren folgendermaßen. Die Reaktionslösung bestand aus 1 μl menschlicher Hypothalamus-Marathon-Ready-cDNA (CLONTECH), 0,5 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 39, 0,5 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 40, 0,4 mM dNTPs, 2,5 mM MgCl2, 5 % DMSO und 0,2 μl LATaq-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.), wobei der Puffer, der dem Enzym beigefügt war, zugefügt wurde, um das Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl herzustellen. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslö sung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 60 Sekunden 35 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden, 64 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 120 Sekunden, unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Nachdem die amplifizierte DNA durch 1,5-%-Agarosegelelektrophorese isoliert wurde, wurde die DNA mit einer Größe von etwa 700 bp mit einer Rasierklinge exzidiert und unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen) gewonnen. Die gewonnene DNA wurde in Vektor PCR2.1-TOPO gemäß dem Protokoll von TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) subkloniert, der dann in eine Escherichia coli TOP10-kompetente Zelle (Invitrogen) zur Transfektion transfektiert wurde. Die resultierenden Klone, die das cDNA-Insertfragment tragen, wurden in einem LB-Medium, enthaltend Ampicillin und X-gal, selektiert. Nur die Klone, die weiße Farbe zeigten, wurden mit einem sterilisierten Zahnstocher ausgewählt, um die Transformanten zu erlangen. Die einzelnen Klone wurden über Nacht in einem LB-Kulturmedium, enthaltend Ampicillin, kultiviert, und Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung des QIAwell 8 Plasmid Kits (Qiagen) hergestellt. Die Reaktion zur Basensequenzierung wurde unter Verwendung des BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits (PE Biosystems) durchgeführt, und die DNAs wurden unter Verwendung eines automatischen Fluoreszenzsequenzers decodiert, um die DNA-Sequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 41, zu erlangen.
  • Da diese Sequenz (SEQ ID Nr. 41) Mensch-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert, wurde Escherichia coli, transformiert durch Plasmid, das diese DNA trägt, TOP10/pCR2.1-TOPO Human GPR8-Ligand Precursor genannt.
  • In der DNA-Sequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 41, liegt ein solcher Rahmen, der die Aminosäuresequenz von Mensch-GPR8-Ligandenpeptid codiert, beschrieben in REFERENZBEISPIEL 11, vor, aber die 5'-stromaufwärts-Stelle weist kein ATG auf, von dem angenommen wird, daß es ein Initiationscodon der Proteintranslation ist. Jedoch gibt es einige Beispiele, die bisher berichteten, daß andere Codone als ATG vermutlich als Initiationscodon in einigen Proteinen fungieren (menschlicher basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (H. Prats et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1836-1840, 1989; R. Z. Florkiewicz und A. Sommer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3978-3981, 1989), Maus-Retinsäure-Rezeptor β4 (S. Nagpal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 2718, 1992), menschliche Phosphoribosylpyrophosphatsynthase (M. Taira et al., J. Biol. Chem., 265, 16491-16497, 1990), Drosophila-Cholinacetyltransferase (H. Sugihara et al., J. Biol. Chem., 265, 21714-21719, 1990)).
  • In diesen Berichten wird häufig vorhergesagt, daß Leu-codierendes CTG als ein Initiationscodon anstelle von ATG dient und so ebenso auf Mensch-GPR8-Ligandenpräkursorprotein anwendbar ist. Basierend auf dem Vergleich mit dem Präkursorprotein von dem später beschriebenen Schwein- oder Ratten-GPR8-Liganden-Homolog wurde daher vermutet, daß ein CTG-Codon, das an der Stelle liegt, die beinah ATG entspricht, von dem angenommen wird, daß es als ein Initiationscodon in diesen Präkursorproteinen dient, als ein Initiationscodon gelesen werden würde, und eine Sequenz des Präkursorproteins wurde vorhergesagt. Die Aminosäuresequenz von diesem hypothetischen Mensch-GPR8-Ligandenpräkursorprotein wird durch SEQ ID Nr. 42 gezeigt. Ebenso werden die Aminosäuresequenz und die DNA-Sequenz des hypothetischen Mensch-GPR8-Ligandenpräkursorproteins in 8 gezeigt.
  • REFERENZBEISPIEL 29
  • Herstellung von Schweinerückenmark-cDNA
  • Schweinerückenmark-cDNA wurde aus Schweinerückenmark-Poly A (+) RNA (CLONTECH) unter Verwendung des MarathonTM cDNA Amplification Kits (CLONTECH) hergestellt. Schweinerückenmark-Poly A (+) RNA wurde aus Schweinerückenmark folgendermaßen hergestellt. Schweinerückenmark wurde in ISOGEN (Nippon Gene) mit einem Polytron-Homogenisator vollständig homogenisiert. Aus dem Homogenat wurde die Schweinerückenmark-Gesamt-RNA gemäß dem Gesamt-RNA-Herstellungsverfahren unter Verwendung von ISOGEN-Lösung erreicht. Dann wurde die Chromatographie zweimal unter Verwendung einer Oligo-dT-Cellulosesäule, die dem mRNA Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech) beigefügt war, durchgeführt, um 7 μg Schweinerückenmark-Poly A (+) RNA zu erlangen. Die cDNAs, bereitgestellt für RACE-PCR, wurden gemäß dem Protokoll, das dem Kit beigefügt war, hergestellt, außer für die Synthese der Erststrang-cDNA. Die Erststrang-cDNA wurde aus 1 μg Schweinerückenmark-Poly A (+) RNA unter Verwendung von Umkehrtranskriptase MMLV (-RNAse H) (RefTraAce, Toyobo Co., Ltd.) anstelle von Umkehrtranskriptase AMV, die dem Kit beigefügt war, synthetisiert.
  • REFERENZBEISPIEL 30
  • Klonen des 5'-stromaufwärts-Endes der cDNA, die Schwein-GPR8-Ligandprekursorprotein codiert
  • Die erste 5'-RACE-PCR, gefolgt von der zweiten 5'-RACE-PCR unter Verwendung einer Basensequenz der DNA, amplifiziert durch die erste PCR, offenbarte die 5'-stromaufwärts-Basensequenz der cDNA, die das Präkursorprotein eines Schweinehomologs des GPR8-Ligandenpeptids codiert (hierin nachstehend manchmal als Schweine-GPR8-Ligand bezeichnet).
  • Das erste 5'-RACE-PCR-Klonen wurde durch die folgenden Verfahrensweisen erreicht. PCR wurde durchgeführt, wobei die zuvor genannte Schweinerückenmark-cDNA als eine Matrize verwendet wurde, und AP1-Primer, der dem Kit beigefügt war, und der synthetische Primer von SEQ ID Nr. 43 verwendet wurden, gefolgt von der PCR unter Verwendung dieser PCR-Lösung als eine Matrize und ferner unter Verwendung von AP2-Primer, der dem Kit beigefügt war, und dem synthetischen Primer von SEQ ID Nr. 44. Die Zusammensetzungen der Reaktionslösungen und die Reaktionsbedingungen für die PCR waren folgendermaßen. Die Reaktionslösung bestand aus 4 μl Schweinerückenmark-cDNA, 50fach verdünnt mit Tricine-EDTA-Puffer, der dem Kit beigefügt war, 0,5 μM AP1-Primer, 0,5 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 43, 0,4 mM dNTPs und 0,2 μl LATaq-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.), wobei GC-(I)-Puffer, der dem Enzym beigefügt war, zugefügt wurde, um das Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl herzustellen. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslösung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 120 Sekunden 30 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 68 °C für 180 Sekunden, unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Dann wurden 1 μl der PCR-Lösung, 100fach verdünnt mit Tricine-EDTA-Puffer, der dem Kit beigefügt war, 0,5 μM AP2-Primer, 0,5 μM synthetischer DNA-Primer von SEQ ID Nr. 44, 0,4 mM dNTPs und 0,2 μl Advantage-GC 2-Polymerase (CLONTECH) durch Zugabe des Puffers, der dem Enzym beigefügt war, auf das Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl gebracht. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslösung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 60 Sekunden 3 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 180 Sekunden, 3 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 70 °C für 180 Sekunden, dann 4 Wiederholungen von einem Zy klus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 68 °C für 180 Sekunden, und dann 15 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden, 64 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 180 Sekunden, unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Die amplifizierte DNA wurde durch 1,2-%-Agarosegelelektrophorese isolisert, und die DNA mit einer Größe von etwa 300 bp wurde mit einer Rasierklinge exzidiert und unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen) gewonnen. Die gewonnene DNA wurde in Vektor PCR2.1-TOPO gemäß dem Protokoll von TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) subkloniert, der dann in eine Escherichia coli TOP10-kompetente Zelle (Invitrogen) zur Transfektion transfektiert wurde. Die resultierenden Klone, die das cDNA-Insertfragment tragen, wurden in einem LB-Medium, enthaltend Ampicillin, IPTG und X-gal, selektiert. Nur die Klone, die weiße Farbe zeigten, wurden mit einem sterilisierten Zahnstocher ausgewählt, um die Transformanten zu erlangen. Die einzelnen Klone wurden über Nacht in einem LB-Kulturmedium, enthaltend Ampicillin, kultiviert, und Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung des QIAwell 8 Plasmid Kits (Qiagen) hergestellt. Die Reaktion zur Basensequenzierung wurde unter Verwendung des BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits (PE Biosystems) durchgeführt, und die DNAs wurden unter Verwendung eines automatischen Fluoreszenzsequenzers decodiert, um die DNA-Sequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 45, zu erlangen.
  • Das zweite 5'-RACE-PCR-Klonen wurde durch die folgenden Verfahrensweisen bewirkt. Unter Verwendung der Schweinerückenmark-cDNA als eine Matrize wurde PCR unter Verwendung von AP1-Primer, der dem Kit beigefügt war, und dem synthetischen Primer von SEQ ID Nr. 46 durchgeführt, gefolgt von PCR unter Verwendung von dieser PCR-Lösung als eine Matrize und ferner unter Verwendung von AP2-Primer, der dem Kit beigefügt war, und dem synthetischen Primer von SEQ ID Nr. 47. Die Zusammensetzungen der Reaktionslösungen und die Reaktionsbedingungen für die PCR waren folgendermaßen. Die Reaktionslösung bestand aus 1 μl Schweinerückenmark-cDNA, 50fach verdünnt mit Tricine-EDTA-Puffer, der dem Kit beigefügt war, 0,5 μM AP1-Primer, 0,5 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 46, 0,4 mM dNTPs und 0,2 μl Advantage-GC 2-Polymerase (CLONTECH), wobei GC-(I)-Puffer, der dem Enzym beigefügt war, zugefügt wurde, um das Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl herzustellen. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslösung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 60 Sekunden 5 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 180 Sekunden, 5 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 70 °C für 180 Sekunden, 20 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 68 °C für 180 Sekunden, unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Dann wurden 1 μl der PCR-Lösung, 100fach verdünnt mit Tricine-EDTA-Puffer, der dem Kit beigefügt war, 0,5 μM AP2-Primer, 0,5 μM synthetischer DNA-Primer von SEQ ID Nr. 47, 0,4 mM dNTPs und 0,2 μl Advantage-GC 2-Polymerase (CLONTECH) durch Zugabe des Puffers, der dem Enzym beigefügt war, auf das Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl gebracht. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslösung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 60 Sekunden 31 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 68 °C für 180 Sekunden, unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Die amplifizierte DNA wurde durch 2,0-%-Agarosegelelektrophorese isoliert, und die DNA mit einer Größe von etwa 200 bp wurde mit einer Rasierklinge exzidiert und unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen) gewonnen. Die gewonnene DNA wurde in Vektor PCR2.1-TOPO gemäß dem Protokoll von TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) subkloniert, der dann in eine Escherichia coli TOP10-kompetente Zelle (Invitrogen) zur Transfektion transfektiert wurde. Die resultierenden Klone, die das cDNA-Insertfragment tragen, wurden in einem LB-Medium, enthaltend Ampicillin, IPTG und X-gal, selektiert. Nur die Klone, die weiße Farbe zeigten, wurden mit einem sterilisierten Zahnstocher ausgewählt, um die Transformanten zu erlangen. Die einzelnen Klone wurden über Nacht in einem LB-Kulturmedium, enthaltend Ampicillin, kultiviert, und Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung des QIAwell 8 Plasmid Kits (Qiagen) hergestellt. Die Reaktion zur Basensequenzierung wurde unter Verwendung des BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits (PE Biosystems) durchgeführt, und die DNAs wurden unter Verwendung eines automatischen Fluoreszenzsequenzers decodiert, um die DNA-Sequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 48, zu erlangen.
  • REFERENZBEISPIEL 31
  • Klonen des 3'-stromabwärts-Endes der cDNA, die Schweine-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert
  • Die 3'-stromabwärts-Basensequenz der cDNA, die das Präkursorprotein des Schweine-GPR8-Ligandenpeptids codiert, wurde durch 3'-RACE-PCR-Klonierung unter Verwendung eines Primers, hergestellt basierend auf der 5'-stromaufwärts-Basensequenz der cDNA, die das Schweine-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert, geklärt. Die 3'-RACE-PCR-Klonierung wurde mittels Durchführen der PCR unter Verwendung der Schweinerückenmark-cDNA als eine Matrize und ferner unter Verwendung von AP1-Primer, der dem Kit beigefügt war, und dem synthetischen Primer von SEQ ID Nr. 49 erreicht, gefolgt von PCR unter Verwendung der resultierenden PCR-Lösung als eine Matrize und ferner unter Verwendung von AP2-Primer, der dem Kit beigefügt war, und dem synthetischen Primer von SEQ ID Nr. 50. Die Zusammensetzungen der Reaktionslösungen und die Reaktionsbedingungen für die PCR waren folgendermaßen. Die Reaktionslösung bestand aus 1 μl Schweinerückenmark-cDNA, 50fach verdünnt mit Tricine-EDTA-Puffer, der dem Kit beigefügt war, 0,5 μM AP1-Primer, 0,5 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 49, 0,4 mM dNTPs und 0,2 μl Advantage-GC 2-Polymerase (CLONTECH), wobei das Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl unter Zugabe des Puffers, der dem Enzym beigefügt war, hergestellt wurde. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslösung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 60 Sekunden 5 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 120 Sekunden, 5 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 70 °C für 120 Sekunden, dann 20 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 68 °C für 120 Sekunden, unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Dann wurde die Reaktionslösung, bestehend aus 1 μl der PCR-Lösung, 100fach verdünnt Tricine-EDTA-Puffer, der dem Kit beigefügt war, 0,5 μM AP2-Primer, 0,5 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 50, 0,4 mM dNTPs und 0,2 μl Advantage-GC 2-Polymerase (CLONTECH), auf ein Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl unter Zugabe des Puffers, der dem Enzym beigefügt war, gebracht. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslösung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 120 Sekunden 31 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 68 °C für 120 Sekunden, unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Nach dem die amplifizierte DNA durch 2,0-%-Agarosegelelektrophorese isoliert wurde, wurde die DNA mit einer Größe von etwa 650 bp mit einer Rasierklinge exzidiert und unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen) gewonnen. Die gewonnene DNA wurde in Vektor PCR2.1-TOPO gemäß dem Protokoll von TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) subkloniert, der dann in eine Escherichia coli TOP10-kompetente Zelle (Invitrogen) zur Transfektion transfektiert wurde. Die resultierenden Klone, die das cDNA-Insertfragment tragen, wurden in einem LB-Medium, enthaltend Ampicillin, X-gal und IPTG, selektiert. Nur die Klone, die weiße Farbe zeigten, wurden mit einem sterilisierten Zahnstocher ausgewählt, um die Transformanten zu erlangen. Die einzelnen Klone wurden über Nacht in einem LB-Kulturmedium, enthaltend Ampicillin, kultiviert, und Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung des QIAwell 8 Plasmid Kits (Qiagen) hergestellt. Die Reaktion zur Basensequenzierung wurde unter Verwendung des BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaktion Kits (PE Biosystems) durchgeführt, und die DNAs wurden unter Verwendung eines automatischen Fluoreszenzsequenzers decodiert, um die DNA-Sequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 51, zu erlangen.
  • REFERENZBEISPIEL 32
  • Klonen der cDNA, die Schweine-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert
  • Eine cDNA, die das Schweine-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert, wurde durch PCR-Amplifikation mit einem Primer, hergestellt basierend auf der 5'-stromaufwärts-Basensequenz der cDNA, die das Schweine-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert, kloniert, wobei Schweinerückenmark-cDNA als eine Matrize verwendet wurde. Die Zusammensetzungen der Reaktionslösungen und die Reaktionsbedingungen für die PCR waren folgendermaßen. Die Reaktionslösung bestand aus 1 μl Schweinerückenmark-cDNA, 50fach verdünnt mit Tricine-EDTA-Puffer, der dem Kit beigefügt war, 0,5 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 52, 0,5 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 53, 0,4 mM dNTPs, 0,2 μl Advantage-2-Polymerase (CLONTECH), wobei der Puffer, der dem Enzym beigefügt war, zugefügt wurde, um das Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl herzustellen. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslösung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 60 Sekunden 4 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 75 Sekunden, 4 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 70 °C für 75 Sekunden, dann 4 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 68 °C für 75 Sekunden, dann 5 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden, 64 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 45 Sekunden, dann 20 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden, 60 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 45 Sekunden, unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Die amplifizierte DNA wurde durch 1,2-%-Agarosegelelektrophorese isoliert, und die DNA mit einer Größe von etwa 600 bp wurde mit einer Rasierklinge exzidiert und unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kits (Qia gen) gewonnen. Die gewonnene DNA wurde in Vektor PCR2.1-TOPO gemäß dem Protokoll von TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) subkloniert, der dann in eine Escherichia coli TOP10-kompetente Zelle (Invitrogen) zur Transfektion transfektiert wurde. Die resultierenden Klone, die das cDNA-Insertfragment tragen, wurden in einem LB-Medium, enthaltend Ampicillin und X-gal, selektiert. Nur die Klone, die weiße Farbe zeigten, wurden mit einem sterilisierten Zahnstocher ausgewählt, um die Transformanten zu erlangen. Die einzelnen Klone wurden über Nacht in einem LB-Kulturmedium, enthaltend Ampicillin, kultiviert, und Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung des QIAwell 8 Plasmid Kits (Qiagen) hergestellt. Die Reaktion zur Basensequenzierung wurde unter Verwendung des BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits (PE Biosystems) durchgeführt, und die DNAs wurden unter Verwendung eines automatischen Fluoreszenzsequenzers decodiert, um die DNA-Sequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 54, zu erlangen. Da diese Sequenz (SEQ ID Nr. 54) Schweine-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert, wurde Escherichia coli, transformiert durch ein Plasmid, das diese DNA trägt, TOP10/pCR2.1-TOPO Porcine GPR8-Ligand Precursor genannt.
  • Die Aminosäuresequenz für Schweine-GPR8-Ligandenpräkursor, codiert durch die DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 54, wird durch SEQ ID Nr. 55 gezeigt. In der Aminosäuresequenz von diesem Präkursorprotein lag eine Sequenz mit bis zu 17 Resten von dem N-Terminus vor, was durch Aminosäuresequenzierung des GPR8-Ligandenpeptids, isoliert aus Schweinehypothalamus, unter Verwendung der GTPγS-Bindungsaktivität auf die Membranfraktion der GPR8-exprimierenden Zellen, beschrieben in REFERENZBEISPIEL 10, als ein Indikator geklärt wurde. Außerdem lag die Arg-Arg-Sequenz (Seidah, N. G. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 839, 9-24, 1998) an 2 Stellen in der carboxyterminalen Seite von dieser Sequenz vor, wobei angenommen wird, daß davon ein normales physiologisch aktives Peptid exzidiert wird, wie in dem menschlichen homologen Präkursorprotein des GPR8-Ligandenpeptids. Im Hinblick auf das Vorhergehende wurde geschlußfolgert, daß die Aminosäuresequenz eines Schweinehomologs des GPR8-Ligandenpeptids entweder SEQ ID Nr. 56 oder 57 oder beide sein würde. 9 zeigt die Aminosäuresequenz und DNA-Sequenz des Schweine-GPR8-Ligandenpräkursorproteins.
  • REFERENZBEISPIEL 33
  • Klonen des cDNA-Fragments, das einen Teil des Ratten-GPR8-Ligandenpräkursorproteins codiert
  • Wie in REFERENZBEISPIEL 10 beschrieben, erfolgte die Databankdurchsuchung basierend auf der Sequenz von 17 Aminosäuren von dem N-Terminus (SEQ ID Nr. 6) des Peptids, das aus Schweinehypothalamus gereinigt wurde, unter Verwendung der GTPγS-Bindungsaktivität auf die Membranfraktion der GPR8-exprimierenden Zellen als ein Indikator. Daher wurde die Ratten-EST-Basensequenz (Zugangs-Nr. H31598), die mit der Basensequenz von SEQ ID Nr. 11 übereinstimmt, gefunden. Die DNA-Sequenz wies einen Translationsrahmen auf, indem die Sequenz von 15 Aminosäuren mit der Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 6) für das Peptid, das aus Schweinehypothalamus gereinigt wurde, identisch war. Diese H31598 ist eine EST-Sequenz, abgeleitet von der cDNA-Bibliothek, hergestellt aus Ratten-PC12-Zellen, und bestand aus 260 Basen, einschließlich 7 nicht identifizierten Basen. Da diese H31598 vermutlich einen Teil des Präkursorproteins eines Ratten-homologen Peptids des GPR8-Liganden codiert (hierin nachstehend manchmal als Ratten-GPR8-Ligand bezeichnet), um seine genaue Basensequenz zu bestimmen, wurde PCR-Klonierung auf den jeweiligen Primern durchgeführt, hergestellt basierend auf der 5'-Basensequenz und 3'-Basensequenz von H31598 unter Verwendung von Rattenhirn-Marathon-Ready-cDNA (CLONTECH) als eine Matrize. Die Zusammensetzungen der Reaktionslösungen und die Reaktionsbedingungen für die PCR waren folgendermaßen. Die Reaktionslösung bestand aus 2 μl Rattenhirn-Marathon-cDNA (CLONTECH), 0,5 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 60, 0,5 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 61, 0,4 mM dNTPs und 0,2 μl Advantage-GC 2-Polymerase (CLONTECH), wobei das Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl unter Zugabe des Puffers, der dem Enzym beigefügt war, hergestellt wurde. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslösung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 60 Sekunden 35 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden, 60 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 60 Sekunden, unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Die amplifizierte DNA wurde durch 4,0-%-Agarosegelelektrophorese isoliert, und die DNA mit einer Größe von etwa 250 bp wurde mit einer Rasierklinge exzidiert und unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen) gewonnen. Die gewonnene DNA wurde in Vektor PCR2.1-TOPO gemäß dem Protokoll von TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) subkloniert, der dann in eine Escherichia coli TOP10-kompetente Zelle (Invitrogen) zur Transfektion transfektiert wurde. Die resultierenden Klone die das cDNA-Insertfragment tragen, wurden in einem LB-Medium, enthaltend Ampicillin und X-gal, selektiert. Nur die Klone, die weiße Farbe zeigten, wurden mit einem sterilisierten Zahnstocher ausgewählt, um die Transformanten zu erlangen. Die einzelnen Klone wurden über Nacht in einem LB-Kulturmedium, enthaltend Ampicillin, kultiviert, und Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung des QIAwell 8 Plasmid Kits (Qiagen) hergestellt. Die Reaktion zur Basensequenzierung wurde unter Verwendung des BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaktion Kits (PE Biosystems) durchgeführt, und die DNAs wurden unter Verwendung eines automatischen Fluoreszenzsequenzers decodiert, um die DNA-Sequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 62, zu erlangen. Der Vergleich zwischen der Basensequenz (SEQ ID Nr. 62) der PCR-klonierten DNA und der Basensequenz von H31589 offenbart, daß es einen Ablesefehler von einer Basendeletion in der Basensequenz von H31589 gab.
  • REFERENZBEISPIEL 34
  • Klonen des 5'-stromaufwärts-Endes der cDNA, die Ratten-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert
  • Die 5'-stromaufwärts-Basensequenz der cDNA, die das Ratten-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert, wurde durch 5'-RACE-PCR-Klonierung geklärt. Die 5'-RACE-PCR-Klonierung wurde mittels Durchführen von PCR unter Verwendung von AP1-Primer, der dem Kit beigefügt war, und dem synthetischen Primer von SEQ ID Nr. 63 bewirkt, wobei Rattenhirn-Marathon-Ready-cDNA (CLONTECH) als eine Matrize verwendet wurde, gefolgt von PCR unter Verwendung von AP2-Primer, der dem Kit beigefügt war, und dem synthetischen Primer von SEQ ID Nr. 64, wobei die resultierende PCR-Lösung als eine Matrize verwendet wurde. Die Zusammensetzungen der Reaktionslösungen und die Reaktionsbedingungen für die PCR waren folgendermaßen. Die Reaktionslösung bestand aus 2 μl Rattenhirn-Marathon-cDNA (CLONTECH), 0,5 μM AP1-Primer, 0,5 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 63, 0,4 mM dNTPs und 0,2 μl LATaq-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.), wobei das Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl unter Zugabe von GC-(I)-Puffer, der dem Enzym beigefügt war, hergestellt wurde. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslösung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 60 Sekunden 30 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 68 °C für 120 Sekunden, unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Dann machte die Reakti onslösung, bestehend aus 2 μl der PCR-Lösung, 200fach verdünnt mit Tricine-EDTA-Puffer, der dem Kit beigefügt war, 0,5 μM AP2-Primer, 0,5 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 64, 0,4 mM dNTPs und 0,2 μl Advantage-GC 2-Polymerase (CLONTECH,) das Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl unter Zugabe des Puffers, der dem Enzym beigefügt war, aus. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslösung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 60 Sekunden 31 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 68 °C für 120 Sekunden, unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Die amplifizierte DNA wurde durch 1,2-%-Agarosegelelektrophorese isoliert, und die DNA mit einer Größe von etwa 600 bp wurde mit einer Rasierklinge exzidiert und unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen) gewonnen. Die gewonnene DNA wurde in Vektor PCR2.1-TOPO gemäß dem Protokoll von TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) subkloniert, der dann in ein Escherichia coli TOP10-kompetente Zelle (Invitrogen) zur Transfektion transfektiert wurden. Die resultierenden Klone, die das cDNA-Insertfragment tragen, wurden in einem LB-Medium, enthaltend Ampicillin und X-gal, selektiert. Nur die Klone, die weiße Farbe zeigten, wurden mit einem sterilisierten Zahnstocher ausgewählt, um die Transformanten zu erlangen. Die einzelnen Klone wurden über Nacht in einem LB-Kulturmedium, enthaltend Ampicillin, kultiviert, und Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung des QIAwell 8 Plasmid Kits (Qiagen) hergestellt. Die Reaktion zur Basensequenzierung wurde unter Verwendung des BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits (PE Biosystems) durchgeführt, und die DNAs wurden unter Verwendung eines automatischen Fluoreszenzsequenzers decodiert, um die DNA-Sequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 65, zu erlangen.
  • REFERENZBEISPIEL 35
  • Klonen des 3'-stromabwärts-Endes der cDNA, die Ratten-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert
  • Die 3'-stromabwärts-Basensequenz der cDNA, die Ratten-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert, wurde durch 3'-RACE-PCR-Klonierung unter Verwendung eines Primers, hergestellt basierend auf der 5'-stromaufwärts-terminalen Basensequenz der cDNA, die das Ratten-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert, und eines Primers, hergestellt basierend auf der cDNA-Fragmentsequenz, die einen Teil des Ratten-GPR8-Ligandenpräkursorproteins codiert, geklärt. Die 3'-RACE-PCR-Klonierung wurde mittels Durchführen der PCR unter Verwen dung von AP1-Primer, der dem Kit beigefügt war, und dem synthetischen Primer von SEQ ID Nr. 66 bewirkt, wobei Rattenhirn-Marathon-Ready-cDNA (CLONTECH) als eine Matrize verwendet wurde, gefolgt von PCR unter Verwendung von AP2-Primer, der dem Kit beigefügt war, und dem synthetischen Primer von SEQ ID Nr. 67, wobei die resultierende PCR-Lösung als eine Matrize verwendet wurde. Die Zusammensetzungen der Reaktionslösungen und die Reaktionsbedingungen für die PCR waren folgendermaßen. Die Reaktionslösung, bestehend aus 2 μl Rattenhirn-Marathon-Ready-cDNA (CLONTECH), 0,5 μM AP1-Primer, 0,5 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 66, 0,4 mM dNTPs und 0,4 μl Advantage-GC 2-Polymerase (CLONTECH), machte das Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl unter Zugabe des Puffers, der dem Enzym beigefügt war, aus. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslösung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 60 Sekunden 30 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 68 °C für 180 Sekunden, unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Dann machte die Reaktionslösung, bestehend aus 2 μl der PCR-Lösung, 200fach verdünnt mit Tricine-EDTA-Puffer, der dem Kit beigefügt war, 0,5 μM AP2-Primer, 0,5 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 67, 0,4 mM dNTPs und 0,4 μl Advantage-GC 2-Polymerase (CLONTECH), das Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl unter Zugabe des Puffers, der dem Enzym beigefügt war, aus. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslösung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 60 Sekunden 30 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 68 °C für 180 Sekunden, unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Die amplifizierte DNA wurde durch 1,2-%-Agarosegelelektrophorese isoliert, und die DNA mit einer Größe von etwa 600 bp wurde mit einer Rasierklinge exzidiert und unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen) gewonnen. Die gewonnene DNA wurde in Vektor PCR2.1-TOPO gemäß dem Protokoll von TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) subkloniert, der dann in eine Escherichia coli TOP10-kompetente Zelle (Invitrogen) zur Transfektion transfektiert wurde. Die resultierenden Klone, die das cDNA-Insertfragment tragen, wurden in einem LB-Medium, enthaltend Ampicillin und X-gal, selektiert. Nur die Klone, die weiße Farbe zeigten, wurden mit einem sterilisierten Zahnstocher ausgewählt, um die Transformanten zu erlangen. Die einzelnen Klone wurden über Nacht in einem LB-Kulturmedium, enthaltend Ampicillin, kultiviert, und Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung des QIAwell 8 Plasmid Kits (Qiagen) hergestellt. Die Reaktion zur Basensequenzierung wurde unter Verwendung des BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits (PE Biosystems) durchgeführt, und die DNAs wurden unter Verwendung eines automatischen Fluoreszenzsequenzers decodiert, um die DNA-Sequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 68, zu erlangen.
  • REFERENZBEISPIEL 36
  • Klonen der cDNA, die Ratten-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert
  • Eine cDNA, die das Ratten-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert, wurde durch PCR-Amplifikation mit einem Primer, hergestellt basierend auf der 5'-stromaufwärts-Basensequenz der cDNA, die das Ratten-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert, und einem Primer, hergestellt basierend auf der 3'-stromabwärts-Basensequenz der cDNA, die das Ratten-GPR8-Ligandenpräkursorprotein kodiert, geklont, wobei Rattenhirn-cDNA als eine Matrize verwendet wurde. Die Zusammensetzungen der Reaktionslösungen und die Reaktionsbedingungen für die PCR waren folgendermaßen. Die Reaktionslösung bestand aus 1 μl Rattenhirn-Marathon-Ready-cDNA, 0,5 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 69, 0,5 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 70, 0,4 mM dNTPs und 0,4 μl Advantage-2-Polymerase (CLONTECH), wobei der Puffer, der dem Enzym beigefügt war, zugefügt wurde, um das Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl herzustellen. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslösung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 60 Sekunden 35 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden, 60 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 60 Sekunden, unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Die amplifizierte DNA wurde durch 1,2-%-Agarosegelelektrophorese isoliert, und die DNA mit einer Größe von etwa 750 bp wurde mit einer Rasierklinge exzidiert und unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen) gewonnen. Die gewonnene DNA wurde in Vektor PCR2.1-TOPO gemäß dem Protokoll von TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) subkloniert, der dann in ein Escherichia coli TOP10-kompetente Zelle (Invitrogen) zur Transfektion transfektiert wurde. Die resultierenden Klone, die das cDNA-Insertfragment tragen, wurden in einem LB-Medium, enthaltend Ampicillin und X-gal, selektiert. Nur die Klone, die weiße Farbe zeigten, wurden mit einem sterilisierten Zahnstocher ausgewählt, um die Transformanten zu erlangen. Die einzelnen Klone wurden über Nacht in einem LB-Kulturmedium, enthaltend Ampicillin, kultiviert, und Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung des QIAwell 8 Plasmid Kits (Qiagen) hergestellt. Die Reaktion zur Basensequenzierung wurde unter Verwendung des BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits (PE Biosystems) durchgeführt, und die DNAs wurden unter Verwendung eines automatischen Fluoreszenzsequenzers decodiert, um die DNA-Sequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 71, zu erlangen. Da diese Sequenz (SEQ ID Nr. 71) das Ratten-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert, wurde Escherichia coli, transformiert durch ein Plasmid, das diese DNA trägt, TOP10/pCR2.1-TOPO Rat GPR8-Ligand Precursor genannt.
  • Die Aminosäuresequenz für Ratten-GPR8-Ligandpräkursor, codiert durch die DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 71, ist durch SEQ ID Nr. 72 gezeigt. In der Aminosäuresequenz von diesem Präkursorprotein lag eine ähnliche Sequenz vor, die sich nur in der 5. und der 17. Aminosäure von der Sequenz mit bis zu 17 Resten von dem N-Terminus unterschied, die durch Aminosäuresequenzierung des GPR8-Ligandenpeptids, isoliert aus Schweinehypothalamus, unter Verwendung der GTPγS-Bindungsaktivität auf die Membranfraktion der GPR8-exprimierenden Zellen, beschrieben in REFERENZBEISPIEL 10, als ein Indikator geklärt wurde. Außerdem lag die Arg-Arg-Sequenz (Seidah, N. G. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 839, 9-24, 1998) an 2 Stellen der carboxyterminalen Seite dieser Sequenz vor, von der angenommen wurde, daß die Sequenz ein normales physiologisch aktives Peptid exzidieren würde, wie in dem Mensch- oder Schwein-homologen Präkursorprotein des GPR8-Ligandenpeptids. Im Hinblick auf das Vorhergehende wurde geschlußfolgert, daß die Aminosäuresequenz eines Rattenhomologs des GPR8-Ligandenpeptids entweder SEQ ID Nr. 73 oder 74 oder beide sein würde. 10 zeigt die Aminosäuresequenz und DNA-Sequenz des Ratten-GPR8-Ligandenpräkursorproteins.
  • REFERENZBEISPIEL 37
  • Klonen des cDNA-Fragments, das einen Teil des Maus-GPR8-Ligandenpräkursorproteins codiert
  • Eine Databankdurchsuchung wurde durchgeführt, basierend auf der Basensequenz, die das Schweine-GPR8-Ligandenpeptid mit 23 Aminosäureresten, dargestellt durch SEQ ID Nr. 58, codiert. Infolge der Mausgenomdatenbank von Celera Genomics wurde die Mausgenomfragmentsequenz von SEQ ID Nr. 77, enthaltend eine Basensequenz ähnlich der Basensequenz von SEQ ID Nr. 58, entdeckt. Es wurde vorhergesagt, daß diese Sequenz eine Genomfragmentsequenz sein würde, die einen Teil des Präkursorproteins eines Maushomologs des GPR8-Ligandenpeptids codiert (hierin nachstehend manchmal als Maus-GPR8-Ligand bezeichnet). Die Zusammensetzungen der Reaktionslösungen und die Reaktionsbedingungen für die PCR waren folgendermaßen. Ein Mikroliter Maustestis-cDNA (CLONTECH), 0,5 μM synthetischer DNA-Primer von SEQ ID Nr. 78, 0,5 μM synthetischer DNA-Primer von SEQ ID Nr. 79, 0,4 mM dNTPs und 0,2 μl LATaq-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) machten das Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl unter Zugabe von GC-(I)-Puffer, der dem Enzym beigefügt war, aus. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslösung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 120 Sekunden 10 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 68 °C für 120 Sekunden, 25 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden, 64 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 120 Sekunden, unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Die amplifizierte DNA wurde durch 1,5-%-Agarosegelelektrophorese isoliert, und die DNA mit einer Größe von etwa 350 bp wurde mit einer Rasierklinge exzidiert und unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen) gewonnen. Die gewonnene DNA wurde in Vektor PCR2.1-TOPO gemäß dem Protokoll von TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) subkloniert, der dann in eine Escherichia coli TOP10-kompetente Zelle (Invitrogen) zur Transfektion transfektiert wurde. Die resultierenden Klone, die das cDNA-Insertfragment tragen, wurden in einem LB-Medium, enthaltend Ampicillin und X-gal, selektiert. Nur die Klone, die weiße Farbe zeigten, wurden mit einem sterilisierten Zahnstocher ausgewählt, um die Transformanten zu erlangen. Die einzelnen Klone wurden über Nacht in einem LB-Kulturmedium, enthaltend Ampicillin, kultiviert, und Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung des QIAwell 8 Plasmid Kits (Qiagen) hergestellt. Die Reaktion zur Basensequenzierung wurde unter Verwendung des BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits (PE Biosystems) durchgeführt, und die DNAs wurden unter Verwendung eines automatischen Fluoreszenzsequenzers decodiert (SEQ ID Nr. 80). Die Basensequenz der cDNA, die hierin durch PCR-Klonierung erreicht wird, stimmte vollständig mit der Mausgenomfragment-Basensequenz überein, die zwischen den 2 Basensequenzen, verwendet für die Primer von SEQ ID Nr. 78 und SEQ ID Nr. 79, insertiert wurde.
  • REFERENZBEISPIEL 38
  • Herstellung von Maushirn-cDNA
  • Maushirn-cDNA wurde aus Maushirn-Poly A (+) RNA (CLONTECH) unter Verwendung des SMARTTM RACE cDNA Amplification Kits (CLONTECH) gemäß dem Protokoll, das dem Kit beigefügt war, hergestellt. Eine Lösung aus der synthetisierten Erststrang-cDNA wurde 10fach mit Tricine-EDTA-Puffer, der dem Kit beigefügt war, verdünnt. Die Lösung wurde für RACE-PCR verwendet.
  • REFERENZBEISPIEL 39
  • Klonen des 5'-stromaufwärts-Endes der cDNA, die Maus-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert
  • Die 5'-stromaufwärts-Basensequenz der cDNA, die das Maus-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert, wurde durch 5'-RACE-PCR-Klonierung geklärt. Die 5'-RACE-PCR-Klonierung wurde durch PCR unter Verwendung von Universal Primer Mix, der dem SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit beigefügt war, und dem synthetischen Primer von SEQ ID Nr. 81 geklärt, wobei Maushirn-cDNA als eine Matrize verwendet wurde, gefolgt von PCR unter Verwendung von Nested Universal Primer, der dem Kit beigefügt war, und dem synthetischen Primer von SEQ ID Nr. 82, wobei die resultierende PCR-Lösung als eine Matrize verwendet wurde. Die Zusammensetzungen der Reaktionslösungen und die Reaktionsbedingungen für die PCR waren folgendermaßen. Die Reaktionslösung, bestehend aus 1 μl Maushirn-cDNA, 2 μl Universal Primer Mix, 0,2 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 81, 0,8 mM dNTPs und 0,4 μl Advantage-GC 2-Polymerase (CLONTECH), machte das Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl unter Zugabe des Puffers, der dem Enzym beigefügt war, aus. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslösung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 120 Sekunden 30 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 68 °C für 120 Sekunden, unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Dann machte die Reaktionslösung, bestehend aus 0,5 μl der PCR-Lösung, 50fach verdünnt mit Tricine-EDTA-Puffer, der dem Kit beigefügt war, 0,5 μM Nested Universal Primer, 0,5 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 82, 0,8 mM dNTPs und 0,4 μl Advantage-GC 2-Polymerase (CLONTECH), das Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl unter Zugabe des Puffers, der dem Enzym beigefügt war, aus. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslösung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 120 Sekunden 30 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden, 60 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 120 Sekunden unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Die amplifizierte DNA wurde durch 1,5-%-Agarosegelelektrophorese isoliert, und die DNA mit einer Größe von etwa 300 bp wurde mit einer Rasierklinge exzidiert und unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen) gewonnen. Die gewonnene DNA wurde in Vektor PCR2.1-TOPO gemäß dem Protokoll von TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) subkloniert, der dann in eine Escherichia coli TOP10-kompetente Zelle (Invitrogen) zur Transfektion transfektiert wurde. Die resultierenden Klone, die das cDNA-Insertfragment tragen, wurden in einem LB-Medium, enthaltend Ampicillin und X-gal, selektiert. Nur die Klone, die weiße Farbe zeigten, wurden mit einem sterilisierten Zahnstocher ausgewählt, um die Transformanten zu erlangen. Die einzelnen Klone wurden über Nacht in einem LB-Kulturmedium, enthaltend Ampicillin, kultiviert, und Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung des QIAwell 8 Plasmid Kits (Qiagen) hergestellt. Die Reaktion zur Basensequenzierung wurde unter Verwendung des BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits (PE Biosystems) durchgeführt, und die DNAs wurden unter Verwendung eines automatischen Fluoreszenzsequenzers decodiert, um die DNA-Sequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 83, zu erlangen.
  • REFERENZBEISPIEL 40
  • Konen des 3'-stromabwärts-Endes der cDNA, die Maus-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert
  • Die 3'-stromabwärts-Basensequenz der cDNA, die das Maus-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert, wurde durch 3'-RACE-PCR-Klonierung geklärt. Die 3'-RACE-PCR-Klonierung wurde durch PCR unter Verwendung von Universal Primer Mix, der dem SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit beigefügt war, und dem synthetischen Primer von SEQ ID Nr. 84 bewirkt, wobei die Maushirn-cDNA als eine Matrize verwende wurde, gefolgt von PCR unter Verwendung von Nested Universal Primer, der dem Kit beigefügt war, und dem synthetischen Primer von SEQ ID Nr. 85, wobei die resultierende PCR-Lösung als eine Matrize verwendet wurde. Die Zusammensetzungen der Reaktionslösungen und die Reaktionsbedingungen für die PCR waren folgendermaßen. Die Reaktionslösung, bestehend aus 1 μl Maushirn-cDNA, 2 μl Universal Primer Mix, 0,5 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 84, 0,8 mM dNTPs und 0,4 μl Advantage-GC 2-Polymerase (CLONTECH), machte das Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl unter Zugabe des Puffers, der dem Enzym beigefügt war, aus. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslösung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 120 Sekunden 30 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden und 68 °C für 120 Sekunden, unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Dann machte die Reaktionslösung, bestehend aus 0,5 μl der PCR-Lösung, 50fach verdünnt mit Tricine-EDTA-Puffer, der dem Kit beigefügt war, 0,5 μM Nested Universal Primer, 0,5 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 85, 0,8 mM dNTPs und 0,4 μl Advantage-GC 2-Polymerase (CLONTECH), das Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl unter Zugabe des Puffers, der dem Enzym beigefügt war, aus. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslösung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 120 Sekunden 30 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden, 64 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 120 Sekunden, unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Die amplifizierte DNA wurde durch 1,5-%-Agarosegelelektrophorese isoliert, und die DNA mit einer Größe von etwa 700 bp wurde mit einer Rasierklinge exzidiert und unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen) gewonnen. Die gewonnene DNA wurde in Vektor PCR2.1-TOPO gemäß dem Protokoll von TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) subkloniert, der dann in eine Escherichia coli TOP10-kompetente Zelle (Invitrogen) zur Transfektion transfektiert wurde. Die resultierenden Klone, die das cDNA-Insertfragment tragen, wurden in einem LB-Medium, enthaltend Ampicillin und X-gal, selektiert. Nur die Klone, die weiße Farbe zeigten, wurden mit einem sterilisierten Zahnstocher ausgewählt, um die Transformanten zu erlangen. Die einzelnen Klone wurden über Nacht in einem LB-Kulturmedium, enthaltend Ampicillin, kultiviert, und Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung des QIAwell 8 Plasmid Kits (Qiagen) hergestellt. Die Reaktion zur Basensequenzierung wurde unter Verwendung des BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits (PE Biosystems) durchgeführt, und die DNAs wurden unter Verwendung eines automatischen Fluoreszenzsequenzers decodiert, um die DNA-Sequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 86, zu erlangen.
  • REFERENZBEISPIEL 41
  • Klonen der cDNA, die Maus-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert
  • Eine cDNA, die das Maus-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert, wurde durch PCR-Amplifikation mit einem Primer, hergestellt basierend auf der 5'-stromaufwärts-Basensequenz der cDNA, die das Maus-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert, und einem Primer, hergestellt basierend auf der 3'-stromabwärts-Basensequenz der cDNA, die das Maus-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert, geklont, wobei Maushirn-cDNA als eine Matrize verwendet wurde. Die Zusammensetzungen der Reaktionslösungen und die Reaktionsbedingungen für die PCR waren folgendermaßen. Die Reaktionslösung bestand aus 0,5 μl Maus hirn-cDNA, 0,5 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 87, 0,5 μM synthetischem DNA-Primer von SEQ ID Nr. 88, 1,6 mM dNTPs und 0,2 μl LATaq-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.), wobei der Puffer, der dem Enzym beigefügt war, zugefügt wurde, um das Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl herzustellen. Unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems) wurde die Reaktionslösung nach dem Erhitzen auf 96 °C für 120 Sekunden 40 Wiederholungen von einem Zyklus, eingestellt auf 96 °C für 30 Sekunden, 64 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 120 Sekunden, unterzogen und schließlich bei 72 °C für 10 Minuten gehalten. Die amplifizierte DNA wurde durch 1,5-%-Agarosegelelektrophorese isoliert, und die DNA mit einer Größe von etwa 700 bp wurde mit einer Rasierklinge exzidiert und unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen) gewonnen. Die gewonnene DNA wurde in Vektor PCR2.1-TOPO gemäß dem Protokoll von TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) subkloniert, der dann in eine Escherichia coli TOP10-kompetente Zelle (Invitrogen) zur Transfektion transfektiert wurde. Die resultierenden Klone, die das cDNA-Insertfragment tragen, wurden in einem LB-Medium, enthaltend Ampicillin und X-gal, selektiert. Nur die Klone, die weiße Farbe zeigten, wurden mit einem sterilisierten Zahnstocher ausgewählt, um die Transformanten zu erlangen. Die einzelnen Klone wurden über Nacht in einem LB-Kulturmedium, enthaltend Ampicillin, kultiviert, und Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung des QIAwell 8 Plasmid Kits (Qiagen) hergestellt. Die Reaktion zur Basensequenzierung wurde unter Verwendung des BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaktion Kits (PE Biosystems) durchgeführt, und die DNAs wurden unter Verwendung eines automatischen Fluoreszenzsequenzers decodiert, um die DNA-Sequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 89, zu erlangen. Da diese Sequenz (SEQ ID Nr. 89) das Maus-GPR8-Ligandenpräkursorprotein codiert, wurde Escherichia coli, transformiert durch ein Plasmid, das diese DNA trägt, TOP10/pCR2.1-TOPO Mouse GPR8-Ligand Precursor genannt.
  • In der Aminosäuresequenz der DNA-Sequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 89, liegt ein solcher Rahmen, der eine ähnliche Aminosäuresequenz codiert, die sich nur in der 5. und 17. Aminosäure von der Sequenz von bis zu 17 Resten von dem N-Terminus unterscheidet, was durch Aminosäuresequenzierung des GPR8-Ligandenpeptids, isoliert aus Schweinehypothalamus, unter Verwendung der GTPγS-Bindungsaktivität auf die Membranfraktion der GPR8-exprimierenden Zellen, beschrieben in REFERENZBEISPIEL 10, als ein Indikator geklärt wurde. Wie in dem Mensch-GPR8-Ligandpräkursor, existiert jedoch kein ATG, von dem angenommen wird, daß es als ein Initiationscodon der Proteintranslation fungiert, an der 5'-stromaufwärts-Seite. Jedoch, wie in dem Mensch-GPR8-Ligandenpräkursorprotein vorhergesagt, basierend auf dem Vergleich mit dem Präkursorprotein von Schweine- oder Ratten-GPR8-Ligandenhomolog, wurde vermutet, daß ein CTG-Codon, das an der Stelle vorliegt, die dem fast ATG entspricht, von dem angenommen wird, daß es als ein Initiationcodon in diesen Präkursorproteinen fungiert, als ein Initiationscodon gelesen würde, und eine Sequenz des Maus-GPR8-Ligandenpräkursorproteins wurde vorhergesagt. Die Aminosäuresequenz von diesem hypothetischen Maus-GPR8-Ligandenpräkursorprotein wird durch SEQ ID Nr. 90 gezeigt. Wie in dem Fall von Mensch-, Schwein- oder Ratten-homologen Präkursorprotein des GPR8-Ligandenpeptids, lag die Arg-Arg-Sequenz (Seidah, N. G. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 839, 9-24, 1998) an 2 Stellen in der carboxyterminalen Seite der Sequenz, von der angenommen wird, das sie eine Aminosäuresequenz des Maus-GPR8-Liganden ist, vor, wobei von der Sequenz vermutlich ein normales physiologisch aktives Peptid exzidiert wurde. Im Hinblick auf das Vorhergehende wurde geschlußfolgert, daß die Aminosäuresequenz eines Maushomologs des GPR8-Ligandenpeptids entweder SEQ ID Nr. 91 oder 92 oder beide sein würde. Die Aminosäuresequenz für Maus-GPR8-Ligand mit 23 Resten, dargestellt durch SEQ ID Nr. 91, stimmte mit der Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 73) für Ratten-GPR8-Ligand mit 23 Resten überein. 11 zeigt die Aminosäuresequenz und DNA-Sequenz des hypothetischen Maus-GPR8-Ligandenpräkursorproteins.
  • REFERENZBEISPIEL 42
  • Herstellung von [125I-Tyr2]-hGPR8L (1-23) und [125I-Tyr10]-hGPR8L (1-23)
  • Eine Lösung aus 1 nmol hGPR8L (1-23) in 5 μl DMSO wurde mit 5 μl 0,1 M Nickelchlorid gemischt. Nachdem die Lösung mit 10 μl von 0,001 % wässeriger Wasserstoffperoxidlösung in 0,1 M HEPES (pH 7), 10 μl einer 10 μl/ml Laktoperoxidaselösung (Sigma, Inc.) in 0,1 M HEPES (pH 7) und 10 μl von [125I] NaI 37 MBq (NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, LTD.) gemischt wurde, wurde das Gemisch bei Raumtemperatur für 60 Minuten umgesetzt und durch HPLC unter den folgenden Bedingungen fraktioniert.
  • Eine verwendete Säule war ODS-80TM (4,6 mm × 15 cm) (TOSO Co., Ltd.), und unter Verwendung von 10 % Acetonitril/0,1 % TFA und 60 % Acetonitril/0,1 % TFA als Elutionsmittel A bzw. B wurde die Gradientenelution in 0-0 % (2 min), 0-30 % (3 min) und 30-38 % (5 min), 38-43 % (55 min) Elutionsmittel B/Elutionsmittel A + B durchgeführt. Die Fließge schwindigkeit betrug 1 ml/min, die Säulentemperatur betrug 25 °C, und die Detektion wurde bei einer Extinktion von 220 nm durchgeführt.
  • Da 2-Tyrosin-Reste in hGPR8L (1-23) vorliegen, werden [125I-Tyr2]-hGPR8L (1-23) und [125I-Tyr10]-hGPR8L (1-23) durch Iodierung hergestellt. Unter den HPLC-Bedingungen wurden hGPR8L (1-23), [125I-Tyr2]-hGPR8L (1-23) und [125I-Tyr10]-hGPR8L (1-23) bei etwa 24 min, 30 min bzw. 32 min eluiert.
  • REFERENZBEISPIEL 43
  • Rezeptorbindungstest unter Verwendung von [125I-Tyr10]-hGPR8L (1-23)
  • Der Rezeptorbindungstest wurde unter Verwendung von [125I]-markiertem hGPR8L (1-23), hergestellt wie in REFERENZBEISPIEL 42 beschrieben, und der Zellmembranfraktion, hergestellt aus GPR8-exprimierenden CHO-Zellen, hergestellt in derselben Weise wie die Verfahren, die in REFERENZBEISPIEL 6 beschrieben sind, durchgeführt.
  • Die Zellmembranfraktion, hergestellt aus Mensch-GPR8-exprimierenden CHO-Zellen, wurde mit einem Assaypuffer (25 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), 0,05 % CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat), 0,1 % BSA (Rinderserumalbumin), 0,25 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid), 1 μg/ml Pepstatin, 20 μg/ml Leupeptin, pH 7,4) in verschiedenen Konzentrationen verdünnt. Anschließend wurde ein aliquoter Teil von 200 μl der Verdünnung in einem Polypropylenteströhrchen (Falcon 2053) dispensiert. Um die gesamte Bindung (TB) zu analysieren, wurden 2 μl DMSO und 2 μl 7 nM [125I-Tyr2]-hGPR8L (1-23) oder [125I-Tyr10]-hGPR8L (1-23) zu der Membranfraktionslösung zugegeben. Um ebenso die nicht-spezifische Bindung (NSB) zu analysieren, wurden 2 μl einer 100 μM hGPR8L (1-23) Lösung in DMSO und 2 μl von 7 nM [125I-Tyr2]-hGPR8L (1-23) oder [125I-Tyr10]-hGPR8L (1-23) zu der Membranfraktionslösung zugegeben. Nach der Umsetzung bei 25 °C für 60 Minuten wurde die Reaktionslösung durch einen Polyethylenimin-behandelten Whatman-Glasfilter (GF-F) saugfiltriert. Nach der Filtration wurde die restliche Radioaktivität, die auf dem Filterpapier verblieb, mit einem γ-Zähler gemessen, und die spezifische Bindung (SB) wurde durch Subtrahieren der nicht-spezifischen Bindung von der gesamten Bindung bestimmt. Da die spezifische Bindung, erhalten unter Verwendung von [125I-Tyr10]-hGPR8L (1-23), zweimal höher als der Fall unter Verwendung von [125I-Tyr2]-hGPR8L (1-23) war, wurde [125I-Tyr10]-hGPR8L (1-23) in dem tatsächlichen Test verwendet. Wenn die Konzentration der Membranfraktion verändert wurde, wurde die spezifische Bindung von [125I-Tyr10]-hGPR8L (1-23) in Abhängigkeit der Konzentration der Membranfraktion aufgezeichnet. Ebenso wurde durch Einstellen der Konzentration der Membranfraktion bei 5 μg/ml die 50%ige Inhibitionskonzentration (IC50-Wert) von hGPR8L (1-23) aus der Inhibierungsrate (%) berechnet. Der IC50-Wert betrug 0,25 nM. 12 zeigt die Bindungsinhibierung von hGPR8L (1-23) in verschiedenen Konzentrationen.
  • REFERENZBEISPIEL 44
  • Produktion von oxidiertem Mensch-GPR8-Ligand (1-23):
    • Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met(O)-Gly-Leu (SEQ ID Nr. 95)
  • In 0,5 ml von 50%iger wässeriger Essigsäurelösung wurden 0,45 mg der Verbindung von. REFERENZBEISPIEL 12 gelöst. Dann wurden 0,05 ml von 0,3 % wässeriger Wasserstoffperoxidlösung zu der Lösung zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 8 Stunden stehengelassen. Nach dem Konzentrieren im Vakuum wurde das Konzentrat auf SepPark gereinigt, wodurch 0,443 mg weiße Pulver erhalten wurden.
    Massenspektrum (M+H)+: 2599,2 (ber. 2599,4)
    Elutionszeit auf HPLC: 19,1 min
    Bedingungen zur Elution:
    Säule: Wakosil-II 5C18 HG (4,6 × 100 mm)
    Elutionsmittel: lineare Dichtegradientenelution unter Verwendung von Elutionsmittel A: 0,1 % TFA-Wasser, und Elutionsmittel B: Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA, mit A/B = 100/0 bis 30/70 (35 min)
    Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.
  • REFERENZBEISPIEL 45
  • Produktion von Mensch-GPR8-Ligand (1-22):
    • Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly (SEQ ID Nr. 96)
  • Fmoc-Gly wurde in kommerziell erhältliches 2-Chlortritylharz (Clt-Harz, 1,33 mmol/g) eingeführt. Dann wurden die Kondensation von Aminosäuren in der Sequenzreihenfolge, die Exzision aus dem Harz und die Reinigung wie in REFERENZBEISPIEL 13 durchgeführt, wodurch das Produkt erhalten wurde.
  • REFERENZBEISPIEL 46
  • Produktion von Mensch-GPR8-Liganad (1-21):
    • Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met (SEQ ID Nr. 97)
  • Fmoc-Met wurde in kommerziell erhältliches 2-Chlortritylharz (Clt-Harz, 1,33 mmol/g) eingeführt. Dann wurden die Kondensation von Aminosäuren in der Sequenzreihenfolge, die Exzision aus dem Harz und die Reinigung wie in REFERENZBEISPIEL 13 durchgeführt, wodurch das Produkt erhalten wurde.
  • REFERENZBEISPIEL 47
  • Produktion von Mensch-GPR8-Ligand (1-20):
    • Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu (SEQ ID Nr. 98)
  • Fmoc-Leu wurde in kommerziell erhältliches 2-Chlortritylharz (Clt-Harz, 1,33 mmol/g) eingeführt. Dann wurden die Kondensation von Aminosäuren in der Sequenzreihenfolge, die Exzision aus dem Harz und die Reinigung wie in REFERENZBEISPIEL 13 durchgeführt, wodurch das Produkt erhalten wurde.
    Massenspektrum (M+H)+: 2282,8 (ber. 2282,6)
    Elutionszeit auf HPLC: 17,2 min
    Bedingungen zur Elution:
    Säule: Wakosil-II 5C18 HG (4,6 × 100 mm)
    Elutionsmittel: lineare Dichtegradientenelution unter Verwendung von Elutionsmittel A: 0,1 % TFA-Wasser, und Elutionsmittel B: Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA, mit A/B = 100/0 bis 30/70 (35 min)
    Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.
  • REFERENZBEISPIEL 48
  • Produktion von Mensch-GPR8-Ligand (1-19):
    • Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu (SEQ ID Nr. 99)
  • Fmoc-Leu wurde in kommerziell erhältliches 2-Chlortritylharz (Clt-Harz, 1,33 mmol/g) eingeführt. Dann wurden die Kondensation von Aminosäuren in der Sequenzreihenfolge, die Exzision aus dem Harz und die Reinigung wie in REFERENZBEISPIEL 13 durchgeführt, wodurch das Produkt erhalten wurde.
    Massenspektrum (M+H)+: 2169,6 (ber. 2169,5)
    Elutionszeit auf HPLC: 16,4 min
    Bedingungen zur Elution:
    Säule: Wakosil-II 5C18 HG (4,6 × 100 mm)
    Elutionsmittel: lineare Dichtegradientenelution unter Verwendung von Elutionsmittel A: 0,1 % TFA-Wasser, und Elutionsmittel B: Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA, mit A/B = 100/0 bis 0/70 (35 min)
    Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.
  • REFERENZBEISPIEL 49
  • Produktion von Mensch-GPR8-Ligand (1-18):
    • Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly (SEQ ID Nr. 100)
  • Fmoc-Gly wurde in kommerziell erhältliches 2-Chlortritylharz (Clt-Harz, 1,33 mmol/g) eingeführt. Dann wurden die Kondensation von Aminosäuren in der Sequenzreihenfolge, die Exzision aus dem Harz und die Reinigung wie in REFERENZBEISPIEL 13 durchgeführt, wodurch das Produkt erhalten wurde.
    Massenspektrum (M+H)+: 205 6, 8 (ber. 2056,3)
    Elutionszeit auf HPLC: 14,2 min
    Bedingungen zur Elution:
    Säule: Wakosil-II 5C18 HG (4,6 × 100 mm)
    Elutionsmittel: lineare Dichtegradientenelution unter Verwendung von Elutionsmittel A: 0,1 % TFA-Wasser, und Elutionsmittel B: Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA, mit A/B = 100/0 bis 30/70 (35 min)
    Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.
  • REFERENZBEISPIEL 50
  • Produktion von Mensch-GPR8-Ligand (1-17):
    • Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala (SEQ ID Nr. 101)
  • Fmoc-Leu wurde in kommerziell erhältliches 2-Chlortritylharz (Clt-Harz, 1,33 mmol/g) eingeführt. Dann wurden die Kondensation von Aminosäuren in der Sequenzreihenfolge, die Exzision aus dem Harz und die Reinigung wie in REFERENZBEISPIEL 13 durchgeführt, wodurch das Produkt erhalten wurde.
  • REFERENZBEISPIEL 51
  • Produktion von Mensch-GPR8-Ligand (1-16):
    • Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala (SEQ ID Nr. 102)
  • Fmoc-Leu wurde in kommerziell erhältliches 2-Chlortritylharz (Clt-Harz, 1,33 mmol/g) eingeführt. Dann wurden die Kondensation von Aminosäuren in der Sequenzreihenfolge, die Exzision aus dem Harz und die Reinigung wie in REFERENZBEISPIEL 13 durchgeführt, wodurch das Produkt erhalten wurde.
  • REFERENZBEISPIEL 52
  • Produktion von Schwein-GPR8-Ligand (1-23):
    • Trp-Tyr-Lys-His-Thr-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu (SEQ ID Nr. 56)
  • Fmoc-Leu wurde in kommerziell erhältliches 2-Chlortritylharz (Clt-Harz, 1,33 mmol/g) eingeführt. Dann wurden die Kondensation von Aminosäuren in der Sequenzreihenfolge, die Exzision aus dem Harz und die Reinigung wie in REFERENZBEISPIEL 13 durchgeführt, wodurch das Produkt erhalten wurde.
    Massenspektrum (M+H)+: 2585,2 (ber. 2585,4)
    Elutionszeit auf HPLC: 20,2 min
    Bedingungen zur Elution:
    Säule: Wakosil-II 5C18 HG (4,6 × 100 mm)
    Elutionsmittel: lineare Dichtegradientenelution unter Verwendung von Elutionsmittel A: 0,1 % TFA-Wasser, und Elutionsmittel B: Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA, mit A/B = 100/0 bis 30/70 (35 min)
    Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.
  • REFERENZBEISPIEL 53
  • Produktion von Ratten/Maus-GPR8-Ligand (1-23)
    • Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ser-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu (SEQ ID Nr. 73 und SEQ ID Nr. 91)
  • Die Kondensation von Aminosäuren in der Sequenzreihenfolge, die Exzision aus dem Harz und die Reinigung wurden wie in REFERENZBEISPIEL 52 durchgeführt, wodurch das Produkt erhalten wurde.
  • REFERENZBEISPIEL 54
  • Produktion von oxidiertem Schwein-GPR8-Ligand (1-23):
    • Trp-Tyr-Lys-His-Thr-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met(O)-Gly-Leu (SEQ ID Nr. 103)
  • Die Verbindung von REFERENZBEISPIEL 52 wurde wie in REFERENZBEISPIEL 44 oxidiert, wodurch das Produkt erhalten wurde.
    Massenspektrum (M+H)+: 2601,3 (ber. 2601,4)
    Elutionszeit auf HPLC: 18,9 min
    Bedingungen zur Elution:
    Säule: Wakosil-II 5C18 HG (4,6 × 100 mm)
    Elutionsmittel: lineare Dichtegradientenelution unter Verwendung von Elutionsmittel A: 0,1 % TFA-Wasser, und Elutionsmittel B: Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA, mit A/B = 100/0 bis 30/70 (35 min)
    Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.
  • REFERENZBEISPIEL 55
  • Produktion von oxidiertem Ratten/Maus-GPR8-Ligand (1-23):
    • Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ser-Gly-Leu-Leu-Met(O)-Gly-Leu (SEQ ID Nr. 104)
  • Die Verbindung von REFERENZBEISPIEL 53 wurde wie in REFERENZBEISPIEL 44 oxidiert, wodurch das Produkt erhalten wurde.
  • REFERENZBEISPIEL 56
  • Produktion of [Nα-Acetyl-Trp1]-Mensch-GPR8-Ligand (1-23):
    • Ac-Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu (SEQ ID Nr. 106)
  • Aus dem Harz, hergestellt in REFERENZBEISPIEL 12, wurde die Fmoc-Gruppe entfernt. Nach dem Acetylieren mit Essigsäureanhydrid wurde das acetylierte Produkt mit TFA/Thioanisol/m-Cresol/Triisopropylsilan/Ethandithiol (85/5/5/2,5/2,5) behandelt, wodurch die Exzision aus dem Harz und die Entfernung der Seitenkettenschutzgruppen gleichzeitig bewirkt wurden. Das rohe Peptid wurde in derselben Weise wie REFERENZBEISPIEL 12 gereinigt, wodurch das Produkt erhalten wurde.
    Massenspektrum (M+H)+: 2626. 12625,8 (ber. 2627. 12626,1)
    Elutionszeit auf HPLC: 21,4 min
    Bedingungen zur Elution:
    Säule: Wakosil-II 5C18 HG (4,6 × 100 mm)
    Elutionsmittel: lineare Dichtegradientenelution unter Verwendung von Elutionsmittel A: 0,1 % TFA-Wasser, und Elutionsmittel B: Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA, mit A/B = 100/0 bis 30/70 (35 min)
    Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.
  • REFERENZBEISPIEL 57
  • Produktion von Mensch-GPR8-Ligand (2-23):
    • Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu (SEQ ID Nr. 107)
  • Wie in REFERENZBEISPIEL 12 wurde eine gewünschte Aminosäuresequenz in das Harz eingeführt. Nach dem Einführen des letzten Tyr und vor dem Exzidieren aus dem Harz wurde die Fmoc-Gruppe auf dem Harz entfernt. Dann wurde das Fmoc-entfernte Produkt mit TFA/Thioanisol/m-Cresol/Triisopropylsilan/Ethandithiol (85/5/5/2,5/2,5) behandelt, wodurch die Exzision aus dem Harz und die Entfernung der Seitenkettenschutzgruppen gleichzeitig bewirkt wurden. Das rohe Peptid wurde in derselben Weise wie in REFERENZBEISPIEL 12 gereinigt, wodurch das Produkt erhalten wurde.
    Massenspektrum (M+H)+: 2397,1 (ber. 2397,3)
    Elutionszeit auf HPLC: 19,9 min
    Bedingungen zur Elution:
    Säule: Wakosil-II 5C18 HG (4,6 × 100 mm)
    Elutionsmittel: lineare Dichtegradientenelution unter Verwendung von Elutionsmittel A: 0,1 % TFA-Wasser, und Elutionsmittel B: Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA, mit A/B = 100/0 bis 30/70 (35 min)
    Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.
  • REFERENZBEISPIEL 58
  • Produktion von Mensch-GPR8-Ligand (4-23):
    • His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu (SEQ ID Nr. 108)
  • Wie in REFERENZBEISPIEL 12 wurde eine gewünschte Aminosäuresequenz in das Harz eingeführt. Nach dem Einführen des letzten His und vor dem Exzidieren aus dem Harz wurde die Fmoc-Gruppe auf dem Harz entfernt. Dann wurde das Fmoc-entfernte Produkt mit TFA/Thioanisol/m-Cresol/Triisopropylsilan/Ethandithiol (85/5/5/2,5/2,5) behandelt, wodurch die Exzision aus dem Harz und die Entfernung der Seitenkettenschutzgruppen gleichzeitig bewirkt wurden. Das rohe Peptid wurde in derselben Weise wie in REFERENZBEISPIEL 12 gereinigt, wodurch das Produkt erhalten wurde.
    Massenspektrum (M+H)+: 2106,0 (ber. 2106,1)
    Elutionszeit auf HPLC: 20,0 min
    Bedingungen zur Elution:
    Säule: Wakosil-II 5C18 HG (4,6 × 100 mm) Elutionsmittel: lineare Dichtegradientenelution unter Verwendung von Elutionsmittel A: 0,1 % TFA-Wasser, und Elutionsmittel B: Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA, mit A/B = 100/0 bis 30/70 (35 min)
    Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.
  • REFERENZBEISPIEL 59
  • Produktion von Mensch-GPR8-Ligand (9-23):
    • Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu (SEQ ID Nr. 109)
  • Wie in REFERENZBEISPIEL 12 wurde eine gewünschte Aminosäuresequenz in das Harz eingeführt. Nach dem Einführen des letzten Arg und vor dem Exzidieren aus dem Harz wurde die Fmoc-Gruppe auf dem Harz entfernt. Dann wurde das Fmoc-entfernte Produkt mit TFA/Thioanisol/m-Cresol/Triisopropylsilan/Ethandithiol (85/5/5/2,5/2,5) behandelt, wodurch die Exzision aus dem Harz und die Entfernung der Seitenkettenschutzgruppen gleichzeitig bewirkt wurden. Das rohe Peptid wurde in derselben Weise wie in REFERENZBEISPIEL 12 gereinigt, wodurch das Produkt erhalten wurde.
    Massenspektrum (M+H)+: 1615,0 (ber. 1614,9)
    Elutionszeit auf HPLC: 20,2 min
    Bedingungen zur Elution:
    Säule: Wakosil-II 5C18 HG (4,6 × 100 mm)
    Elutionsmittel: lineare Dichtegradientenelution unter Verwendung von Elutionsmittel A: 0,1 % TFA-Wasser, und Elutionsmittel B: Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA, mit A/B = 100/0 bis 30/70 (35 min)
    Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.
  • REFERENZBEISPIEL 60
  • Produktion von Mensch-GPR8-Ligand (15-23): Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu (SEQ ID Nr. 110)
  • Wie in REFERENZBEISPIEL 12 wurde eine gewünschte Aminosäuresequenz in das Harz eingeführt. Nach der Einführung des letzten Arg und vor dem Exzidieren aus dem Harz wurde die Fmoc-Gruppe auf dem Harz entfernt. Dann wurde das Fmoc-entfernte Produkt mit TFA/Thioanisol/m-Cresol/Triisopropylsilan/Ethandithiol (85/5/5/2,5/2,5) behandelt, wodurch die Exzision aus dem Harz und die Entfernung der Seitenkettenschutzgruppen gleichzeitig bewirkt wurden. Das rohe Peptid wurde in derselben Weise wie in REFERENZBEISPIEL 12 gereinigt, wodurch das Produkt erhalten wurde.
    Massenspektrum (M+H)+: 901,4 (ber. 901,5)
    Elutionszeit auf HPLC: 20,2 min
    Bedingungen zur Elution:
    Säule: Wakosil-II 5C 18 HG (4,6 × 100 mm)
    Elutionsmittel: lineare Dichtegradientenelution unter Verwendung von Elutionsmittel A: 0,1 % TFA-Wasser, und Elutionsmittel B: Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA, mit A/B = 100/0 bis 30/70 (35 min)
    Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.
  • REFERENZBEISPIEL 61
  • Produktion von [N-Acetyl-Tyr2]-Mensch-GPR8-Ligand (2-23):
    • Ac-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu (SEQ ID Nr. 111)
  • Nach der Acetylierung des Harzes, hergestellt in REFERENZBEISPIEL 57, mit Essigsäureanhydrid wurde das acetylierte Produkt wie in REFERENZBEISPIEL 57 behandelt und gereinigt, wodurch das Produkt erhalten wurde.
    Massenspektrum (M+H)+: 2439,3 (ber. 2439,3)
    Elutionszeit auf HPLC: 20,2 min
    Bedingungen zur Elution:
    Säule: Wakosil-II 5C18 HG (4,6 × 100 mm)
    Elutionsmittel: lineare Dichtegradientenelution unter Verwendung von Elutionsmittel A: 0,1 % TFA-Wasser, und Elutionsmittel B: Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA, mit A/B = 100/0 bis 30/70 (35 min)
    Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.
  • REFERENZBEISPIEL 62
  • Produktion von [D-Trp1]-Mensch-GPR8-Ligand (1-23):
    • D-Trp-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu (SEQ ID Nr. 112)
  • Das Produkt wurde in derselben Weise wie in REFERENZBEISPIEL 12 unter Verwendung von Fmoc-D-Trp (Boc) anstelle von Fmoc-Trp (Boc) erhalten.
    Massenspektrum (M+H)+: 2583,4 (ber. 2583,4)
    Elutionszeit auf HPLC: 20,6 min
    Bedingungen zur Elution:
    Säule: Wakosil-II 5C18 HG (4,6 × 100 mm)
    Elutionsmittel: lineare Dichtegradientenelution unter Verwendung von Elutionsmittel A: 0,1 % TFA-Wasser, und Elutionsmittel B: Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA, mit A/B = 100/0 bis 30/70 (35 min)
    Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.
  • REFERENZBEISPIEL 63
  • Produktion von [N-3-Indolpropanyl-Tyr2]-Mensch-GPR8-Ligand (2-23):
    • 3-Indolpropanoyl-Tyr-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala- Ala-Gly-Leu-Leu-Met-Gly-Leu (SEQ ID Nr. 113)
  • Unter Verwendung von 3-Indolpropionsäure anstelle von Fmoc-Trp (Boc) in REFERENZBEISPIEL 12 wurde ein gewünschtes Harz hergestellt. Das Harz wurde mit TFA/Thioanisol/m-Cresol/Triisopropylsilan/Ethandithiol (85/5/5/2,5/2,5) behandelt, wodurch die Exzision aus dem Harz und die Entfernung der Seitenkettenschutzgruppen gleichzeitig bewirkt wurden. Das rohe Peptid wurde in derselben Weise wie in REFERENZBEISPIEL 12 gereinigt, wodurch das Produkt erhalten wurde.
    Massenspektrum (M+H)+: 2568,4 (ber. 2568,4)
    Elutionszeit auf HPLC: 21,7 min
    Bedingungen zur Elution:
    Säule: Wakosil-II 5C18 HG (4,6 × 100 mm)
    Elutionsmittel: lineare Dichtegradientenelution unter Verwendung von Elutionsmittel A: 0,1 % TFA-Wasser, und Elutionsmittel B: Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA, mit A/B = 100/0 bis 30/70 (35 min)
    Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.
  • REFERENZBEISPIEL 64
  • GTPγS-Bindung-beschleunigende Aktivität von Mensch- und Schwein-homologen Derivaten des GPR8-Ligandenpeptids, gemessen unter Verwendung der Membranfraktion der GPR8-exprimierenden Zellen
  • Die Mensch- und Schwein-homologen Derivate des GPR8-Ligandenpeptids, dessen Synthese in der Beschreibung beschrieben ist, wurde zu der Membranfraktion der GPR8-exprimierenden Zellen in verschiedenen Konzentrationen durch die Verfahrensweisen, die in REFERENZBEISPIEL 6 beschrieben sind, zugegeben, um die GTPγS-Bindung-beschleunigende Aktivität zu bestimmen. Die Sequenzidentifikationsnummern der getesteten Derivate und die GTPγS-Bindung-beschleunigende Aktivität sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Aktivität wurde als die 50%ige wirksame Konzentration (EC50) ausgedrückt. Die GTPγS-Bindung-beschleunigenden Aktivitäten von hGPR8L (1-23) und hGPR8L (1-30), beschrieben in den REFERENZBEISPIELEN 20 und 21, sind ebenso in der Tabelle gezeigt.
  • REFERENZBEISPIEL 65
  • Rezeptorbindungsaktivität von Mensch- und Schwein-homologen Derivaten des GPR8-Ligandenpeptids, gemessen unter Verwendung der Membranfraktion der GPR8-exprimierenden Zellen und [125I-Tyr10]-hGPR8L (1-23) Die Rezeptorbindungsaktivität der Mensch- oder Schwein-homologen Derivate des GPR8-Ligandenpeptids, dessen Synthese in der Beschreibung beschrieben ist, wurde, wie in REFERENZBEISPIEL 43 beschrieben, unter Verwendung der Membranfraktion der GPR8-exprimierenden Zellen und [125I-Tyr10]-hGPR8L (1-23) bestimmt. Die Sequenzidentifikationsnummern der getesteten Derivate und die Rezeptorbindungsaktivität sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Rezeptorbindungsaktvität wurde als die 50%ige Bindungsinhibitionskonzentration (IC50) ausgedrückt. Die Rezeptorbindungsaktivität von hGPR8L (1-23), beschrieben in REFERENZBEISPIEL 43, ist ebenso in der Tabelle gezeigt. Tabelle 1 GTPγS-Bindung-beschleunigende Aktivität und Rezeptorbindungsaktivität von Mensch- und Schweine-homologen Derivaten des GPR8-Ligandenpeptids
    Derivat SEQ ID Nr. GTPγS-Bindung-beschleunigende Aktivität (EC50 nM) Rezeptorbindung (IC50 nM)
    hGPR8L (1-23) 16 1,6 0,25
    hGPR8L (1-30) 17 0,57 0,025
    [Met(O)]-hGPR8L (1-23) 95 1,4 0,31
    Fmoc-hGPR8L (1-23) 105 240 0,20
    Ac-hGPR8L (1-23) 106 14 2,4
    [D-Trp1]-hGPR8L (1-23) 112 7,1 0,82
    hGPR8L (2-23) 107 3900 160
    Ac-hGPR8L (2-23) 111 7200 420
    IndPr-hGPR8L (2-23) 113 5,0 0,28
    hGPR8L (4-23) 108 6700 1400
    hGPR8L (9-23) 109 4200 1300
    hGPR8L (1-20) 98 0,86 0,20
    hGPR8L (1-19) 99 1000 100
    hGPR8L (1-18) 100 > 10000 2700
    pGPR8L (1-23) 56 1,5 0,38
    [Met(O)]-pGPR8L (1-23) 103 0,73 0,29
  • REFERENZBEISPIEL 66
  • Amplifikation von Mensch-GPR7-DNA durch PCR unter Verwendung von menschlicher chromosomaler DNA
  • Unter Verwendung menschlicher chromosomaler DNA als eine Matrize wurde die Amplifikation von DNA durch PCR unter Verwendung von 2 synthetischen Primern (SEQ ID Nr. 126 und SEQ ID Nr. 127) durchgeführt. Die synthetischen Primer wurden so konstruiert, um das Gen in der Region, die zu ihrem Rezeptorprotein translatiert werden soll, zu amplifizieren, wobei die Erkennungssequenzen der Restriktionsenzyme an den 5'- und 3'-Enden zugefügt wurden, so daß die Basensequenzen, erkannt durch die Restriktionsenzyme ClaI und SpeI, an das Gen an den 5'- bzw. 3'-Enden zugefügt wurden. Die Reaktionslösung bestand aus 0,5 μl menschlicher chromosomaler DNA (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.), jeweils 1 μM synthetischen DNA-Primern, 0,8 mM dNTPs, 1 mM MgCl2 und 1 μl KOD-Polymerase (Toyobo Co., Ltd.), zu der der Puffer, der dem Enzym beigefügt war, zugegeben wurde, wodurch das Gesamtvolumen von 50 μl hergestellt wurde. Nach dem Erhitzen auf 94 °C für 60 Sekunden wurde die Amplifikation in 35 Zyklen von 98 °C für 15 Sekunden, 65 °C für 2 Sekunden und 74 °C für 30 Sekunden unter Verwendung von Thermal Cycler (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.) durchgeführt. Das amplifizierte Produkt wurde durch 0,8-%-Agarosegelelektrophorese, gefolgt von Einfärbung mit Ethidiumbromid, bestätigt.
  • REFERENZBEISPIEL 67
  • Subklonieren des PCR-Produktes in einen Plasmidvektor und Bestätigung der amplifizierten DNA-Sequenz durch Dekodieren der Basensequenz der insertierten DNA-Region
  • Die Reaktionslösung, erhalten durch PCR in REFERENZBEISPIEL 66, wurde 0,8 % niedrigschmelzender Agarosegelelektrophorese zur Trennung unterzogen. Die Bandenteile wurden von dem Gel mit einer Rasierklinge exzidiert und zu kleinen Stücken zerkleinert, die dann mit Phenol/Chloroform extrahiert und in Ethanol ausgefällt wurden, um die DNA zu gewinnen.
  • Gemäß dem Protokoll, das dem PCR-ScriptTM Amp SK(+) Cloning Kit (Stratagene) beigefügt war, wurden die gewonnenen DNAs in den Plasmidvektor, pCR-ScriptTM Amp SK(+), subkloniert. Die rekombinanten Vektoren wurden in Escherichia coli DH5α-kompetente Zellen (Toyobo Co., Ltd.) eingeführt, um Transformanten zu erzeugen. Dann wurden die Klone mit dem DNA-insertierten Fragment in einem LB-Agarkulturmedium, enthaltend Ampicillin, IPTG und X-gal, selektiert. Nur die Klone, die weiße Farbe zeigten, wurden mit einem sterilisierten Zahnstocher ausgewählt, um die Transformante Escherichia coli DH5α/GPR7 zu erlangen. Die einzelnen Klone wurden über Nacht in einem LB-Kulturmedium, enthaltend Ampicillin, kultiviert, und die Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung des QIAwell 8 Plasmid Kits (Qiagen) hergestellt. Ein aliquoter Teil der so hergestellten DNAs wurde mit Restriktionsenzymen ClaI und SpeI digeriert, um die Größe des insertierten Rezeptor-DNA-Fragments zu bestätigen. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung eines DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems, Inc.) durchgeführt, und die DNAs wurden unter Verwendung eines automatischen Fluoreszenzsequenzers decodiert (SEQ ID Nr. 128). Das pCR-Script Amp SK(+)-Plasmid, das die DNA mit der Basensequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 128, behielt, wurde pCR-Script-Human-GPR7 genannt. Die Aminosäuresequenz von menschlichem GPR7, codiert durch die DNA mit der Basensequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 128, wird durch SEQ ID Nr. 129 dargestellt. Ebenso werden die DNA-Sequenz und Aminosäuresequenz von menschlichem GPR7 in 13 gezeigt. Die DNA-Sequenz von menschlichem GPR7, das hierin sequenziert wird, unterschied sich um 2 Basen von der DNA-Sequenz, die von O'Dowd et al. (O'Dowd, B. F. et al., Genomics, 28, 84-91, 1995) mitgeteilt wurde. Diese 2 Basen entsprechen den Basen 893 und 894 in SEQ ID Nr. 128, die C und G gemäß dem Bericht von O'Dowd et al. sind und diesem REFERENZBEISPIEL G bzw. C sind. Daher ist die 296. Aminosäure der SEQ ID Nr. 129 in der translatierten Aminosäuresequenz, die wie mitgeteilt Thr in O'Dowd et al. entspricht, in diesem BEISPIEL Ser.
  • REFERENZBEISPIEL 68
  • Herstellung von CHO-Zellen, die menschliches GPR7 exprimieren
  • Unter Verwendung des Plasmid Midi Kits (Qiagen) wurde Plasmid-DNA aus Escherichia coli-Klonen hergestellt, transformiert durch das Plasmid, welches das Gen trägt, das die Volllängen-Aminosäuresequenz von menschlichem GPR7 codiert, wobei die Sequenz in REFERENZBEISPIEL 67 bestätigt wurde, wobei die ClaI- und SpeI-Erkennungssequenzen an den 5'- bzw. 3'-Enden zufügt sind. Die Plasmid-DNA wurde mit den Restriktionsenzymen ClaI und SpeI digeriert, um die Insert-DNA zu exzidieren. Die Insert-DNA wurde der Elektrophorese unterzogen, aus dem Agarosegel mit einer Rasierklinge exzidiert, in kleine Stücke zerkleinert, dann mit Phenol und mit Phenol/Chloroform extrahiert, und in Ethanol ausgefällt, wodurch die DNA gewonnen wurde. Die Insert-DNA wurde in den Vektorplasmid pAKKO-111H (dasselbe Vektorplasmid wie pAKKO1.11 H, beschrieben in Hinuma, S., et al., Biochim. Biophys. Acta, 1219, 251-259, 1994) zur Tierzellexpression hinzugefügt, der mit ClaI und SpeI digeriert wurde, gefolgt von Ligation unter Verwendung von T4-Ligase (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.) zur Konstruktion von Plasmid pAKKO-Human GPR7 zur Proteinexpression. Escherichia coli, transformiert durch diesen Plasmid pAKKO-Human GPR7, wurde Escherichia coli DH5α/pAKKO-Human GPR7 genannt.
  • Nachdem Escherichia coli DH5α (Toyobo Co., Ltd.), transfektiert mit pAKKO-Human GPR7 kultiviert wurde, wurde pAKKO-Human GPR7-Plasmid-DNA unter Verwendung des Plasmid Midi Kits (Qiagen) hergestellt. Unter Verwendung des CellPhect Transfection Kits (Amersham Pharmacia Biotech) wurde die Plasmid-DNA in CHO-dhfr--Zellen gemäß dem beigefügten Protokoll transfektiert. DNA, 3 μg, wurde mit Calciumphosphat in Suspension co-ausgefällt. Die resultierende Suspension wurde zu einer Petrischale mit einem Durchmesser von 6 cm zugegeben, in der 5 × 105 oder 1 × 106 CHO-dhfr--Zellen vor 24 Stunden gesät wurden. Die Zellen wurden in MEMα-Medium, enthaltend 10 % fetales Kalbsserum, für einen Tag kultiviert. Nach der Passage wurden die Zellen in Nukleinsäure-freiem MEMα-Selektionsmedium, enthaltend 10 % dialysiertes fetales Kalbsserum, kultiviert, um 24 Klone der Transformantenkolonie GPR8-exprimierenden CHO-Zellen, die in dem Selektionsmedium wuchsen, zu selektieren.
  • REFERENZBEISPIEL 69
  • Bestimmung des Expressionsgrads von Mensch-GPR7-Gen in der Mensch-GPR7-exprimierenden CHO-Zellinie unter Verwendung von TaqMan PCR
  • Die 24 Klone der Mensch-GPR7-exprimierenden CHO-Zellinie, hergestellt gemäß REFERENZBEISPIEL 68, wurden einzeln in einem 25-cm2-Kolben inkubiert. Unter Verwendung von ISOGEN (Nippon Gene Co., Ltd.) wurde die Gesamt-RNA-Fraktion aus den gezüchteten Zellen hergestellt. Die Gesamt-RNA-Fraktion wurde mit DNase I unter Verwen dung des MessageClean Kits (Gen Hunter, Inc.) behandelt, um die Gesamt-RNA frei von DNA zu erlangen.
  • Unter Verwendung der Gesamt-RNA als eine Matrize wurde die cDNA durch die Verwendung des TagMan Reverse Transcription Reagents Kits (Applied Biosystems, Inc.) synthetisiert. Die Reaktionslösung bestand aus 4 μg der Gesamt-RNA, behandelt mit DNase I, 1 μl zufälligen Primer, 4,4 μl von 25 mM MgCl2-Lösung, 2 μl von 10 mM dNTP-Mix, 0,4 μl RNase-Inhibitor und 0,5 μl Umkehrtranskriptase, zu der der Puffer, der dem Kit beigefügt war, zugegeben wurde, wodurch das Gesamtvolumen von 20 μl hergestellt wurde. Die Umkehrtranskription wurde unter Bedingungen von 25 °C für 10 Minuten, 48 °C für 30 Minuten und dann 95 °C für 5 Minuten unter Verwendung von Thermal Cycler (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.) durchgeführt.
  • Menschliche Standard-GPR7-DNA wurde durch Reinigen der DNA, amplifiziert durch PCR, unter Verwendung der menschlichen Vollängen-GPR7-DNA als eine Matrize hergestellt. Die Reaktionslösung bestand aus 5 pg pCR-Script Mensch-GPR7, beschrieben in REFERENZBEISPIEL 67, 0,5 μM synthetischem DNA-Primer (SEQ ID Nr. 130), 0,5 μM synthetischem DNA-Primer (SEQ ID Nr. 131), 1,6 mM dNTPs, 2,5 mM MgCl2 und 0,5 μl LATaq-Polymerase (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.), zu der der Puffer, der dem Enzym beigefügt war, zugegeben wurde, wodurch das Gesamtvolumen von 50 μl hergestellt wurde. Nach dem Erhitzen auf 94 °C für 120 Sekunden wurde die Amplifikation in 25 Zyklen von 94 °C für 30 Sekunden, 60 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 60 Sekunden unter Verwendung von Thermal Cycler (PE Biosystems, Inc.) durchgeführt. Das amplifizierte Produkt wurde schließlich bei 72 °C für 10 Minuten warm gehalten. Die PCR-Lösung wurde mittels 0,8-%-Agarosegelelektrophorese abgetrennt. Nachdem die Bandenteile mit einer Rasierklinge exzidiert wurden, wurde die DNA, amplifiziert durch PCR, unter Verwendung des QIAquick PCR Purification Kits (Qiagen) gewonnen. Um die Primer-DNAs und dNTPs, die der PCR-amplifizierten DNA-Lösung beigemischt waren, zu entfernen, wurde die DNA-Lösung durch die Chromospin Column 400 (CLONTECH, Inc.) zur Gelchromatographie geführt, wodurch die amplifizierte Mensch-GPR7-DNA-Elutionsfraktion erhalten wurde. Basierend auf der Menge an DNA, berechnet aus der Absorption von dieser amplifizierten Mensch-GPR7-DNA-Lösung bei 260 nm, und der Basenzusammensetzung der amplifizierten Mensch-GPR7-DNA wurde die Zahl der DNA-Kopien, die in der amplifizierten Mensch-GPR7-DNA-Lösung enthalten sind, berechnet. Die amplifizierte Mensch-GPR7-DNA wurde als menschliche Standard-GPR7-DNA für TaqMan-PCR zur Quantifikation verwendet.
  • Die Zahl an Kopien an Mensch-GPR7-Gen, exprimiert auf der Mensch-GPR7-CHO-Zellinie, wurde durch TaqMan-PCR bestimmt. Die Reaktionslösung für TaqMan-PCR bestand aus 1 μl einer umkehr-transkribierten cDNA-Lösung, mit destilliertem Wasser 100fach verdünnt, oder menschlicher Standard-GPR7-DNA-Lösung mit verschiedenen Kopiezahlen, jeweils 0,2 μM von synthetischen DNA-Primern (SEQ ID Nr. 132 und SEQ ID Nr. 133) und 0,2 μM Mensch-GPR7-TaqMan-Sonde [Sonde mit der Basensequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 134 (Fam-TTCATCCTCA ACCTGGCCAT CGC-Tamra; wobei Fam und Tamra 6-Carboxy-fluorescein bzw. 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin darstellen)], zu der TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Inc.) zugegeben wurde, um das Gesamtvolumen von 25 μl herzustellen. PCR wurde unter Verwendung des ABI PRISM 7700 Sequence Detector Systems (Applied Biosystems, Inc.) durch Warmhalten bei 50 °C für 2 Minuten und bei 95 °C für 10 Minuten und dann 40 Mal Wiederholen des Zyklus, eingestellt auf 95 °C für 15 Sekunden und 60 °C für 60 Sekunden, durchgeführt. Der Expressionsgrad von Mensch-GPR7-Gen wurde mit der ABI PRISM 7700 SDS-Software berechnet. Die Anzahl an Zyklen in dem Moment, wenn die Fluoreszenzintensität des Reporters den eingestellten Grad erreicht, wurde auf der Ordinate übernommen und der Logarithmus der Anzahl von Kopien von verschiedener menschlicher Standard-GPR7-DNA wurde auf der Abszisse übernommen, um eine Standardkurve herzustellen. Die Kopiezahl von Mensch-GPR7-cDNA, die in der Umkehr-transkribierten cDNA enthalten war, wurde aus der Standardkurve berechnet, um den Expressionsgrad von Mensch-GPR7-Gene pro 1 ng der Gesamt-RNA zu bestimmen. Die Klone Nr. 7, 8 und 14, die einen hohen Expressionsgrad von Mensch-GPR7-Gen zeigen, wurden als die Zellinien selektiert, in denen Mensch-GPR7-Gen stark exprimiert wurde.
  • REFERENZBEISPIEL 70
  • Bestimmung des intrazellularen cAMP-Produktions-Niveaus unter Verwendung der Mensch-GPR7-exprimierenden CHO-Zellen
  • Die Mensch-GPR7-exprimierenden CHO-Zellen, die in REFERENZBEISPIEL 68 hergestellt und wie in REFERENZBEISPIEL 69 beschrieben selektiert wurden, wurden auf einer 24-Loch-Platte in 5 × 104 Zellen/Loch gesät, gefolgt von der Inkubation für 48 Stunden. Die Zellen wurden mit einem MEMα-Puffer (pH 7,4), enthaltend 0,2 mM 3-Isobutyl-methylxanthin, 0,05 % BSA (Rinderserumalbumin) und 20 mM HEPES, gewaschen (hierin nachstehend wird der MEMα-Puffer (pH 7,4), enthaltend 0,2 mM 3-Isobutyl-methylxanthin, 0,05 % BSA und 20 mM HEPES, als Reaktionspuffer bezeichnet). Danach wurden 0,5 ml des Reaktionspuffers zu den Zellen gegeben, die dann in einem Inkubator für 30 Minuten warm gehalten wurde. Der Reaktionspuffer wurde entfernt, und nachdem 0,25 ml eines frischen Reaktionspuffers zu den Zellen aufgefüllt wurden, wurden eine Probenlösung in DMSO mit einer entsprechenden Konzentration und 0,25 ml des Reaktionspuffers, enthaltend 2 μM Forskolin, zu den Zellen zugegeben, gefolgt von der Umsetzung bei 37 °C für 30 Minuten. Die Reaktion wurde durch Zugeben von 100 μl von 20 % Perchlorsäure beendet. Dann wurde das Reaktionsgemisch auf Eis für eine Stunde gegeben, um intrazelluläres cAMP zu extrahieren. Das Niveau von cAMP in dem Extrakt wurde durch cAMP EIA Kit (Amersham Pharmacia Biotech) bestimmt.
  • REFERENZBEISPIEL 71
  • (1) [Phe2]-Mensch-GPR8-Ligand (1-20): Herstellung von Trp-Phe-Lys-His-Val-Ala-Ser-Pro-Arg-Tyr-His-Thr-Val-Gly-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu (SEQ ID Nr. 135)
  • Unter Verwendung eines automatischen Peptidsynthesizers (Model ABI 433), erhältlich von Applied Biosystems, Inc., wurde das geschützte Zielpeptidharz gemäß dem Programm synthetisiert, um die Peptidketten nacheinander von dem C-Terminus durch die Fmoc-Technik zu verlängern.
  • Wang-Harz (p-Benzyloxybenzylalkohol-Harz) (0,25 mmol) wurde als ein Ausgangsaminosäureharzträger verwendet. Fmoc-Aminosäurederivate von Fmoc-Leu, Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Arg (Pbf), Fmoc-Val, Fmoc-Thr (But), Fmoc-His (Trt), Fmoc-Tyr (But), Fmoc-Pro, Fmoc-Ser (But), Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Phe und Fmoc-Trp (Boc) wurden nacheinander in der angegebenen Reihenfolge unter Verwendung von HBTU (2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat) kondensiert.
  • Nachdem die Konstruktion der Peptide auf dem Harz beendet war, wurde das geschützte Peptidharz getrocknet. Das resultierende geschützte Peptid wurde mit TFA behandelt, um den Schutz abzuspalten, und das Peptid von dem Harzträger zu trennen. Das erhaltene rohe Peptid wurde mit 0,1 % TFA-Wasser extrahiert, und das Extrakt wurde lyophilisiert, wodurch ein pulverförmiger Feststoff erhalten wurde. Anschließend wurde das rohe Peptid der präparativen Reinigung auf Umkehrphase-Hochleistungschromatographie (Shimadzu Corporation, preparative Vorrichtung: Modell LC8A) unter Verwendung des Acetonitril-0,1 % TFA-Wasser-Systems (15-35 %, 80 Minuten) unterzogen. So wurden 35 mg des gereinigten Zielpeptids erhalten.
  • Das gereinigte Peptid wurde bei 110 °C für 22 Minuten mit 4N Methansulfonsäure, enthaltend 0,2 % 3-(2-Aminoethyl)indol, hydrolysiert, wodurch das Hydrolysat erhalten wurde. Das Produkt wies die folgenden Analysedaten für Aminosäuren des Hydrolysats auf (berechnete Daten in Klammern).
    Thr (1) 0,93, Ser (1) 0,92, Gly (2) 2,03, Ala (3) 3,09, Val (2) 1,90, Leu (2) 2,02, Tyr (1) 1,02, Phe (1) 1,00, His (2) 1,91, Lys (1) 0,98, Trp (1) 0,88, Arg (2) 2,06, Pro (1) 1,02 Die Reinheit betrug gemäß der HPLC 98,8 %. Massenspektrendaten betrugen 2266,6 (ber. 2266,6).
  • (2) Herstellung von [Phe2,125I-Tyr10]-Mensch-GPR8-Liganden (1-20) unter Verwendung des Laktoperoxidaseverfahrens
  • Eine Lösung aus 10 nmol [Phe2]-Mensch-GPR8-Liganden (1-20) (SEQ ID Nr. 135), erhalten durch eine Modifikation des in (1) oben beschriebenen Verfahrens, in 10 μl DMSO wurde mit 10 μl von 0,1 M wässeriger Nickelchloridlösung, 10 μl von 0,001 % wässeriger Wasserstoffperoxidlösung, 10 μg/ml Laktoperoxidase (Sigma, Inc.), gelöst in 0,1 M HEPES (pH 7,6) und 10 μl [125I]NaI 40 MBq (NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, LTD.) gemischt. Nachdem das Gemisch bei Raumtemperatur für 50 Minuten umgesetzt wurde, wurde das Produkt, [Phe2,125I-Tyr10]-Mensch-GPR8-Ligand (1-20), auf HPLC unter den folgenden Bedingungen fraktioniert.
  • Unter Verwendung von ODS-80TM (4,6 mm × 15 cm) (Toso Co., Ltd.) als eine Säule und 10 % Acetonitril/0,1 % TFA als Elutionsmittel A und 60 % Acetonitril/0,1 % TFA als Elutionsmittel B wurde das Produkt der Gradientenelution von 0-0 (2 min), 0-27 (5 min), 27-32 (40 min) %B/A + B (60 min) unterzogen. Die Fließgeschwindigkeit betrug 1 ml/min und die Säulentemperatur betrug 40 °C, und die Detektion wurde bei 215 nm durchgeführt. Unter den HPLC-Bedingungen wurde der [Phe2,125I-Tyr10]-Mensch-GPR8-Ligand (1-20) rund 25 Minuten eluiert.
  • BEISPIEL 1
  • Intrazelluläre cAMP-Produktion-unterdrückende Aktivität von GPR8-Ligandenpeptid-menschlichen Homologa mit 23 Resten oder 30 Resten, analysiert unter Verwendung der Mensch-GPR7-exprimierenden CHO-Zellen
  • Gemäß dem Verfahren, das in REFERENZBEISPIEL 70 beschrieben ist, wurde hGPR8L (1-23) (SEQ ID Nr. 16) oder hGPR8L (1-30) (SEQ ID Nr. 17) zu den Mensch-GPR7-exprimierenden CHO-Zellen in verschiedenen Konzentrationen gegeben, um die intrazelluläre cAMP-Produktion-unterdrückende Aktivität zu bestimmen. Die Ergebnisse werden in 14 gezeigt, wobei die cAMP-Synthese-unterdrückende Aktivität durch den Wert als % des intrazellulären cAMP-Niveaus ausgedrückt wird, das durch Subtrahieren des intrazellulären cAMP-Niveaus, akkumuliert, wenn hGPR8L (1-23) oder hGPR8L (1-30) zugegeben wurde, von dem intrazellulären cAMP-Niveau, akkumuliert, wenn der Reaktionspuffer zugegeben wurde, erhalten wurde, wobei als 100 % das intrazelluläre cAMP-Niveau verwendet wird, das durch Subtrahieren des intrazellulären cAMP-Niveaus, akkumuliert, wenn der Reaktionspuffer zugegeben wurde, von dem intrazellulären cAMP-Niveau, akkumuliert, wenn der Reaktionspuffer, der Forskolin enthält, zugegeben wurde, erhalten wurde.
  • Offensichtlich unterdrückten hGPR8L (1-23) und hGPR8L (1-30) die intrazelluläre cAMP-Produktion dosisabhängig in den Mensch-GPR7-exprimierenden CHO-Zellen. Dies offenbart, daß hGPR8L (1-23) und hGPR8L (1-30) Liganden für das menschliche GPR7 waren. Wenn 50 % Inhibitionskonzentration (IC50) aus dem cAMP-Produktionsniveau bestimmt wurden, betrugen die IC50-Werte von hGPR8L (1-23) und hGPR8L (1-30) 0,025 nM bzw. 0,13 nM.
  • Es konnte nachgewiesen werden, daß eine ähnliche Reaktion in den Mensch-GPR7-exprimierenden CHO-Zellen zu der oben beschriebenen Reaktion auftrat, wenn Schweine-, Ratten- und Maushomologa (SEQ ID Nr. 56, SEQ ID Nr. 73 und SEQ ID Nr. 91) zu hGPR8L (1-23) und Schweine-, Ratten- und Maushomologa (SEQ ID Nr. 57, SEQ ID Nr. 74 und SEQ ID Nr. 92) zu hGPR8L (1-30) verwendet wurden.
  • BEISPIEL 2
  • Rezeptorbindungstest unter Verwendung von [125I-Tyr10]-hGPR8L (1-23)
  • Der Rezeptorbindungstest wurde unter Verwendung von [125I-Tyr10]-hGPR8L (1-23), hergestellt wie in REFERENZBEISPIEL 42 beschrieben, durchgeführt, und die Zellmembranfraktion aus den Mensch-GPR7-exprimierenden CHO-Zellen hergestellt.
  • Zunächst wird die Herstellung der Membranfraktion nachstehend beschrieben.
  • Zu 1 × 108 der Mensch-GPR7-exprimierenden CHO-Zellen wurden 10 ml eines Homogenatpuffers (10 mM NaHCO3, 5 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), 0,5 mM PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid), 1 μg/ml·Pepstatin, 4 μg/ml E64 und 20 μg/ml Leupeptin) zugegeben. Das Gemisch wurde unter Verwendung von Polytron (12.000 U/min, 1 min) homogenisiert. Das Zellhomogenat wurde zentrifugiert (1.000 g, 15 min), wodurch der Überstand erhalten wurde. Dann wurde der Überstand der Ultrazentrifugation (Beckman Typ 30 Rotor, 30.000 U/min, 1 Stunde) unterzogen. Der resultierende Niederschlag wurde als eine Membranfraktion der Mensch-GPR7-exprimierenden CHO-Zellen verwendet.
  • Die so hergestellte Zellmembranfraktion wurde in verschiedenen Konzentrationen mit einem Assaypuffer verdünnt (25 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 0,05 % CHAPS (3-[(3-Choramidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat), 0,1 % BSA, 0,5 mM PMSF, 1 μg/ml Pepstatin, 20 μg/ml Leupeptin und 4 μg/ml E-64, pH 7,4). Dann wurde ein aliquoter Teil von 200 μl der Verdünnung in ein Teströhrchen aus Propylen (Falcon 2053) dispensiert. Um die gesamte Bindung zu analysieren, wurden 2 μl DMSO und 2 μl von 8 nM [125I-Tyr10]-hGPR8L (1-23) zu der Membranfraktionslösung zugegeben. Ebenso wurde die nicht-spezifische Bindung durch Zugeben von 2 μl einer DMSO-Lösung aus 1 mM hGPR8L (1-23) und 2 μl von 8 nM [125I-Tyr10]-hGPR8L (1-23) zu der Membranfraktionslösung analysiert. Nach der Umsetzung bei 25 °C für 75 Minuten wurde die Reaktionslösung durch einen Polyethylenimin-behandelten Whatman-Glasfilter (GF-F) saugfiltriert, und der Filter wurde zweimal mit 1,5 ml eines Waschpuffers (25 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 0,05 % CHAPS, 0,1 % BSA, pH 7,4) gewaschen. Nach der Filtration wurde die restliche Radioaktivität, die auf dem Filterpapier verblieb, mit einem γ-Zähler gemessen, und die spezifische Bindung wurde durch Subtrahieren der nicht-spezifischen Bindung von der Gesamtbindung bestimmt.
  • Wenn die Konzentration der Membranfraktion verändert wurde, wurde gezeigt, daß die spezifische Bindung von [125I-Tyr10]-hGPR8L (1-23) von der Konzentration der Membranfraktion abhängig war. Ebenso wurde die Konzentration der Membranfraktion auf 10 μg/ml eingestellt, und die Bindungsinhibierung von [125I-Tyr10]-hGPR8L (1-23) gegen die Membranfraktion der Mensch-GPR7-exprimierenden Zellen durch hGPR8L (1-23) und hGPR8L (1-30) wurde untersucht. Die 50%ige Inhibitionskonzentration (IC50-Wert) wurde aus der Inhibierungsrate berechnet. Der IC50-Wert von hGPR8L (1-23) betrug 0,099 nM. Ebenso betrug der IC50-Wert von hGPR8L (1-30) 0,025 nM.
  • Die Ergebnisse geben an, daß hGPR8L (1-23) und hGPR8L (1-30) eine hohe Affinität für die Membranfraktion der Mensch-GPR7-exprimierenden Zellen aufwiesen, was bedeutet, daß hGPR8L (1-23) und hGPR8L (1-30) Liganden mit hoher Affinität für den Mensch-GPR7-Rezeptor sind. 15 zeigt die Bindungsinhibierung von hGPR8L (1-23) und hGPR8L (1-30) in verschiedenen Konzentrationen.
  • Es konnte ebenso nachgewiesen werden, daß die Bindungsinhibierung von [125I-Tyr10]-hGPR8L (1-23) gegen die Membranfraktion der Mensch-GPR7-exprimierenden Zellen festgestellt wurde, wie oben beschrieben, wenn Ratten- und Maushomologa (SEQ ID Nr. 73 und SEQ ID Nr. 91) zu hGPR8L (1-23) und Schwein-, Ratten- und Maushomologa (SEQ ID Nr. 57, SEQ ID Nr. 74 und SEQ ID Nr. 92) zu hGPR8L (1-30) verwendet wurden.
  • BEISPIEL 3
  • 1) Assay für die GTPγS-Bindungsaktivität unter Verwendung der Membranfraktion der GPR7-exprimierenden CHO-Zellen
  • Die [35S]-Guanosin-5'-(γ-thio)triphosphat (GTPγS) Bindung-beschleunigende Aktivität auf die Membranfraktion der GPR7-exprimierenden Zellen wurde durch die folgenden Verfahrensweisen analysiert.
  • Die Membranfraktion der GPR7-exprimierenden CHO-Zellen, hergestellt durch das Verfahren, das in BEISPIEL 2 beschrieben ist, wurde mit einem Membranverdünnungspuffer verdünnt (50 mM Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,4), 5 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 1 μM GDP und 0,1 % BSA), wodurch eine Zellmembranfraktionslösung für den Assay mit einem Proteinniveau von 30 μg/ml hergestellt wurde. Zu 200 μl der Zellmembranfraktionslösung für den Assay wurden 2 μl von 50 nM [35S]-Guanosin-5'-(γ-thio)triphosphat (NEN Co.) und 2 μl einer Probenlösung in DMSO, die auf eine entsprechende Konzentration eingestellt wurde, zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde bei 25 °C für eine Stunde warm gehalten. Das Gemisch wurde durch einen Filter filtriert. Nachdem der Filter zweimal mit 1,5 ml eines Waschpuffers gewaschen wurde (50 mM Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,4), 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA und 0,1 % BSA), wurde die Radioaktivität des Filters mit einem Flüssigszintillationszähler gemessen.
  • 2) GTPγS-Bindimg-beschleunigende Aktivität von hGPR8L (1-23) oder hGPR8L (1-30), analysiert unter Verwendung der Membranfraktion der GPR7-exprimierenden CHO-Zellen
  • Gemäß den Verfahrensweisen, die in 1) oben beschrieben sind, wurden hGPR8L (1-23) oder hGPR8L (1-30) zu der Membranfraktion der GPR7-exprimierenden CHO-Zellen in verschiedenen Konzentrationen gegeben, um die GTPγS-Bindung-beschleunigende Aktivität zu analysieren.
  • Die Ergebnisse sind in 16 gezeigt.
  • Offensichtlich unterdrückten hGPR8L (1-23) und hGPR8L (1-30) die intrazelluläre cAMP-Produktion dosisabhängig in den GPR7-exprimierenden CHO-Zellen.
  • Die 50%ige wirksame Konzentration (EC50-Wert) wurde aus der GTPγS-Bindung-beschleunigenden Aktivität berechnet. Der EC50-Wert von hGPR8L (1-23) betrug 0,74 nM. Ebenso betrug der EC50-Wert von hGPR8L (1-30) 0,67 nM (TABELLE 2).
  • Es konnte ebenso nachgewiesen werden, daß die Reaktion der Mensch-GPR7-exprimierenden CHO-Zellen, wie oben beschrieben, auftrat, wem Ratten- und Maushomologa (SEQ ID Nr. 73 und SEQ ID Nr. 91) zu hGPR8L (1-23) und Schwein-, Ratten- und Maushomologa (SEQ ID Nr. 57, SEQ ID Nr. 74 und SEQ ID Nr. 92) zu hGPR8L (1-30) verwendet wurden.
  • BEISPIEL 4
  • GTPγS-Bindung-beschleunigende Aktivität von Mensch- und Schweine-homologen Deriva ten von GPR8-Ligandenpeptiden, analysiert unter Verwendung der Membranfraktion der GPR7-exprimierenden CHO-Zellen.
  • Gemäß der Verfahrensweisen, die in BEISPIEL 3 beschrieben sind, wurden Menschl- und Schweine-homologe Derivate der GPR8-Ligandenpeptide, erhalten in den REFERENZBEISPIELEN, an die Membranfraktion der GPR7-exprimierenden CHO-Zellen in verschiedenen Konzentrationen abgegeben, um die GTPγS-Bindung-beschleunigende Aktivität zu analysieren.
  • Die Sequenzidentifikationsnummern und GTPγS-Bindung-beschleunigende Aktivität der analysierten Derivate werden in Tabelle 2 gezeigt, wobei die Aktivität als die 50%ige wirksame Konzentration (EC50) ausgedrückt wird. Tabelle 2 GTPγS-Binding-beschleunigende Aktivität und Rezeptorbindungsaktivität von Mensch- und Schweine-homologen Derivaten von GPR8-Ligandenpeptiden
    Derivat SEQ ID Nr. GTPγS-Binding-beschleunigende Aktivität (EC50 nM) Rezeptorbindungsaktivität (IC50 nM)
    hGPR8L (1-23) 16 0,74 0,072
    hGPR8L (1-30) 17 0,67 0,025
    [Met(O)]-hGPR8L (1-23) 95 1,6 0,17
    Fmoc-hGPR8L (1-23) 105 6,6 0,14
    Ac-hGPR8L (1-23) 106 1,5 0,077
    [D-Trp1]-hGPR8L (1-23) 112 2,3 0,63
    hGPR8L (2-23) 107 7410 140
    Ac-hGPR8L (2-23) 111 7000 570
    Inder-hGPR8L (2-23) 113 0,85 0,044
    hGPR8L (4-23) 108 > 10000 1200
    hGPR8L (9-23) 109 > 10000 2200
    hGPR8L (1-20) 98 0,88 0,094
    hGPR8L (1-19) 99 84 1,7
    hGPR8L (1-18) 100 6200 2400
    pGPR8L (1-23) 56 0,35 0,066
    [Met(O)]-pGPR8L (1-23) 103 1,2 0,22
  • BEISPIEL 5
  • Rezeptorbindungsaktivität von Mensch- und Schweine-homologen Derivaten von GPR8-Ligandenpeptiden, analysiert unter Verwendung der Membranfraktion der GPR7-exprimierenden CHO-Zellen und [125I-Tyr10]-hGPR8L (1-23)
  • Gemäß den Verfahrensweisen, die in BEISPIEL 2 beschrieben sind, wurden Mensch- und Schweine-homologe Derivate der GPR8-Ligandenpeptide, erhalten in den REFERENZBEISPIELEN, hinsichtlich der Rezeptorbindungsaktivität unter Verwendung der Membranfraktion der GPR7-exprimierenden CHO-Zellen und [125I-Tyr10]-hGPR8L (1-23) analysiert.
  • Die Sequenzidentifikationsnummern und Rezeptorbindungsaktivität der analysierten Derivate werden in Tabelle 2 gezeigt, wobei die Aktivität als die 50%ige Inhibitionskonzentration (IC50) ausgedrückt wurde.
  • BEISPIEL 6
  • Screening einer Verbindung, die die Bindung von [Phe2,125I-Tyr10]-Mensch-GPR8-Ligand (1-20) an Mensch-GPR verändert
  • Ein Rezeptorbindungstest wurde unter Verwendung von [Phe2,125I-Tyr10]-Mensch-GPR8-Ligand (1-20), hergestellt durch die Verfahrensweisen, die in REFERENZBEISPIEL 71 beschrieben sind, und der Membranfraktion der GPR7-exprimierenden CHO-Zellen, hergestellt durch die in BEISPIEL 2 beschriebenen Verfahrensweisen, durchgeführt, wobei die Bindungs-inhibierende Aktivität einer Testverbindung analysiert wurde.
  • Die Zellmembranfraktion, hergestellt aus den GPR7-exprimierenden CHO-Zellen, wurde auf 15 μg/ml mit einem Assaypuffer (25 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 0,05 % CHAPS, 0,1 % BSA, 0,5 mM PMSF, 1 μg/ml Pepstatin, 4 μg/ml E-64 und 20 μg/ml Leupeptin, pH 7,4) verdünnt. Dann wurde ein aliquoter Teil von 200 μl der Verdünnung in einem Teströhrchen aus Propylen (Falcon 2053) dispensiert. Um die gesamte Bindung zu analysieren, wurden 2 μl DMSO und 2 μl Assaypuffer für 7 nM [Phe2,125I-Tyr10]-Mensch-GPR8-Ligand (1-20) zu der Membranfraktionslösung zugegeben. Um ebenso die nicht-spezifische Bindung zu analysieren, wurden 2 μl einer DMSO-Lösung von 100 μM Mensch-GPR8-Ligand (1-23) und 2 μl des Assaypuffers für 7 nM [Phe2,125I-Tyr10]-Mensch-GPR8-Ligand (1-20) zu der Membranfraktionslösung zugegeben. Außerdem wurden 2 μl einer DMSO-Lösung einer Testverbindung, verdünnt in verschiedenen Konzentrationen, und 2 μl des Assaypuffers für 7 nM [Phe2,125I-Tyr10]-Mensch-GPR8-Ligand (1-20) zu der Membranfraktionslösung zugegeben, um die Bindung-inhibierende Aktivität der Testverbindung zu analysieren. Nach der Umsetzung bei 25 °C für 75 Minuten wurde die Reaktionslösung durch einen Polyethylenimin-behandelten Whatman-Glasfilter (GF/F) saugfiltriert. Nach der Filtration wurde die restliche Radioaktivität, die auf dem Filterpapier verblieb, mit einem γ-Zähler gemessen, und die spezifische Bindung wurde durch Subtrahieren der nicht-spezifischen Bindung von der Gesamtbindung bestimmt. Die Bindung-inhibierende Aktivität (Inhibitierungsrate, %) der Testverbindung gegenüber dem GPR7-Rezeptor wird als Prozent ((TB - X)/SB × 100 (%)) ausgedrückt, was das Verhältnis der Radioaktivität, erhalten durch Subtrahieren der Radioaktivität (X), die auf dem Filterpapier verblieb, wenn die Testverbindung und [Phe2,125I-Tyr10]-Mensch-GPR8-Ligand (1-20) zugegeben wurden, von der Gesamtbindung (TB), zu dem Rezeptor ist.
  • BEISPIEL 7
  • Screening einer Verbindung, die die intrazelluläre cAMP-Produktion-unterdrückende Aktivität von Mensch-GPR8-Ligand in den Mensch-GPR7-exprimierenden CHO-Zellen verändert
  • Gemäß den Verfahrensweisen, die in REFERENZBEISPIEL 70 beschrieben sind, kann eine Verbindung, die die intrazelluläre cAMP-Produktion-unterdrückende Aktivität von Mensch-GPR8-Ligand in den Mensch-GPR7-exprimierenden Zellen verändert, durch Geben von 2 μl von 250 nM Mensch-GPR8-Ligand (1-23) (SEQ ID Nr. 16) als ein Reaktionspuffer und 2 μl einer DMSO-Lösung der Testverbindung in verschiedenen Konzentrationen gleichzeitig an die Mensch-GPR7-exprimierenden CHO-Zellen gescreent werden.
  • Die Aktivität der Testverbindung auf die cAMP-Produktion-unterdrückende Aktivität des Mensch-GPR8-Liganden in den Mensch-GPR7-exprimierenden Zellen wird als Prozent des intrazellulären cAMP-Niveaus ausgedrückt, das durch Subtrahieren des intrazellulären cAMP-Niveaus, akkumuliert, wenn der Mensch-GPR8-Ligand und die Testverbindung zugegeben wurden, von dem intrazellulären cAMP-Niveau, akkumuliert, wenn der Reaktionspuffer, der Forskolin enthält, zugegeben wurde, erhalten wird, wobei als 100 % das intrazelluläre cAMP-Niveau verwendet wird, das durch Subtrahieren des intrazellulären cAMP-Niveaus, akkumuliert, wenn der Mensch-GPR8-Ligand allein zugegeben wurde, von dem intrazellulären cAMP-Niveau, akkumuliert, wenn der Reaktionspuffer, der Forskolin enthält, zugegeben wurde, erhalten wurde. Wenn die Testverbindung die Wirkung des Mensch-GPR8-Liganden unterdrückt, beträgt der Prozentsatz 100 % oder weniger, während der Prozentsatz 100 % oder mehr wird, wenn die Testverbindung die Wirkung des Mensch-GPR8-Liganden verstärkt.
  • BEISPIEL 8
  • Screening einer Verbindung, die die GTPγS-Bindung-beschleunigende Aktivität des Mensch-GPR8-Liganden an die Membranfraktion der Mensch-GPR7-exprimierenden CHO-Zellen verändert
  • Gemäß den Verfahrensweisen, die in BEISPIEL 3 beschrieben sind, kann eine Verbindung, die die GTPγS-Bindung-beschleunigende Aktivität von Mensch-GPR8-Ligand an die Membranfraktion der Mensch-GPR7-exprimierenden Zellen verändert, durch Geben von 2 μl einer DMSO-Lösung aus 100 nM Mensch-GPR8-Ligand (1-23) (SEQ ID Nr. 16) als ein Reaktionspuffer und 2 μl einer DMSO-Lösung der Testverbindung in verschiedenen Konzentrationen gleichzeitig an die Membranfraktionslösung für den Zweck des Assays, der aus den Mensch-GPR7-exprimierenden CHO-Zellen hergestellt wurde, gescreent werden.
  • Die Aktivität der Testverbindung auf die GTPγS-Bindung-beschleunigende Aktivität von Mensch-GPR8-Ligand in der Membranfraktion der Mensch-GPR7-exprimierenden Zellen wird als Prozent der Radioaktivität ausgedrückt, erhalten durch Subtrahieren der Radioaktivitat, wenn 2 μl DMSO allein zugegeben wurden, von der Radioaktivität, wenn der Mensch-GPR8-Ligand und die Testverbindung zugegeben wurden, wobei als 100 % die Radioaktivität verwendet wurde, die durch Subtrahieren der Radioaktivität, wenn 2 μl DMSO allein verwendet wurden, von der Radioaktivität, wenn der Mensch-GPR8-Ligand zugegeben wurde, erhalten wurde. Wenn die Testverbindung die Aktivität des Mensch-GPR8-Liganden unter drückt, beträgt der Prozentsatz 100 % oder weniger, während der Prozentsatz 100 % oder mehr beträgt, wenn die Testverbindung die Wirkung von Mensch-GPR8-Ligand verstärkt.
  • INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
  • Die Verbindungen oder Salze davon, die unter Verwendung der Screening-Verfahren oder Screening-Kits der vorliegenden Erfindung erhältlich sind, sind gering toxisch und nützlich als beispielsweise Präventivmittel/Therapeutika für Magersucht, Appetitanregungsmittel, Präventivmittel/Therapeutika für Fettleibigkeit [z. B. maligner Mastozytose, exogener Fettleibigkeit, hyperinsulinärer Fettleibigkeit, hyperplasmischer Fettleibigkeit, hypophysärer Fettleibigkeit, hypoplasmischer Fettleibigkeit, hypothyroidaler Fettleibigkeit, hypothalamischer Fettleibigkeit, symptomatischer Fettleibigkeit, infantiler Fettleibigkeit, Oberkörperfettleibigkeit, alimentärer Fettleibigkeit, hypogonadaler Fettleibigkeit, systemischer Mastozytose, einfacher Fettleibigkeit, zentraler Fettleibigkeit usw.], Präventivmittel/Therapeutika für Hyperphagie usw. Von diesen sind die Rezeptorantagonisten der vorliegenden Erfindung als Appetitzügler nützlich. Außerdem sind die Rezeptoren der vorliegenden Erfindung, die Polynukleotide, die die Rezeptoren kodieren, als beispielsweise Präventivmittel/Therapeutika für Magersucht, Appetitanregungsmittel, usw. nützlich. Die Polynukleotide, die die Rezeptoren der vorliegenden Erfindung kodieren, sind für die Diagnose von Magersucht oder Fettleibigkeit nützlich. Außerdem sind die Antikörper und Antisense-Nukleotide für die Rezeptoren der vorliegenden Erfindung als Appetitzügler und Diagnostika nützlich.
  • [Sequenzprotokoll]
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Claims (7)

  1. Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder ihres Salzes, die bzw. das die Bindungseigenschaft zwischen (1) einem Protein oder seinem Salz, enthaltend dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 129, und (2) einem Polypeptid, das an das Protein spezifisch binden kann, oder seinem Amid oder Ester oder einem Salz davon, enthaltend dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 16, verändert, umfassend die Verwendung (1) des Proteins oder seines Salzes und (2) des Polypeptids oder seines Amids oder Esters oder eines Salzes davon.
  2. Verfahren zum Screenen nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid ein Polypeptid ist, das die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 16 oder SEQ ID Nr. 17, enthält.
  3. Verfahren zum Screenen nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid ein Polypeptid ist, bestehend aus der Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 16, SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 56, SEQ ID Nr. 95, SEQ ID Nr. 98, SEQ ID Nr. 99, SEQ ID Nr. 103, SEQ ID Nr. 105, SEQ ID Nr. 106, SEQ ID Nr. 112 oder SEQ ID Nr. 113.
  4. Kit zum Screenen einer Verbindung oder ihres Salzes, die bzw. das die Bindungseigenschaft zwischen (1) einem Protein oder seinem Salz, enthaltend dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 129, und (2) einem Polypeptid, das an das Protein spezifisch binden kann, oder seinem Amid oder Ester oder einem Salz davon, enthaltend dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 16, verändert, umfassend (1) das Protein oder sein Salz und (2) das Polypeptid oder sein Amid oder Ester oder ein Salz davon.
  5. Verfahren zum Screenen nach Anspruch 1, wobei die Verbindung oder ihr Salz, die gescreent werden sollen, für die Vorbeugung oder Behandlung von Fettleibigkeit bestimmt sind.
  6. Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder ihres Salzes, die bzw. das die Aktivität eines Proteins oder seines Salzes, enthaltend dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 129, inhibiert, umfassend die Verwendung (1) des Proteins oder seines Salzes und (2) eines Polypeptids, das an das Protein spezifisch binden kann, oder seines Amids oder Esters oder eines Salzes davon, enthaltend dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 16.
  7. Verfahren zum Screenen nach Anspruch 6, wobei die Verbindung oder ihr Salz, die gescreent werden sollen, für die Vorbeugung oder Behandlung von Fettleibigkeit bestimmt sind.
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