DE69636437T2

DE69636437T2 - Ligand polypeptide für hypophyse g-protein gekoppeltes rezeptor-protein, deren herstellung und anwendung

Info

Publication number: DE69636437T2
Application number: DE69636437T
Authority: DE
Inventors: Shuji Hinuma; Yugo Habata; Yuji Kawamata; Masaki Hosoya; Ryo Fujii; Shoji Fukusumi; Chieko Kitada
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1995-12-28
Filing date: 1996-12-26
Publication date: 2007-03-15
Anticipated expiration: 2016-12-27
Also published as: AU1208497A; DE69636437D1; CN1207126A; WO1997024436A3; ATE335818T1; US6228984B1; CA2239299A1; US20050170461A1; EP0870020A2; US6794491B1; EP0870020B1; CN1149286C; WO1997024436A2

Description

[Technisches Gebiet]
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Liganden-Polypeptid für das G-Proteingekoppelte Rezeptorprotein und eine DNA, die eine das Liganden-Polypeptid codierende DNA umfasst.
[Stand der Technik]
Viele Hormone und Neurotransmitter übertragen biologische Funktionen über spezifische Rezeptoren, die auf der Zellmembran vorhanden sind. Viele dieser Rezeptoren greifen durch eine Aktivierung des gekoppelten Guanin-Nucleotidbindenden Proteins (hiernach manchmal kurz als G-Protein bezeichnet) selbst in die intrazelluläre Transduktion von Signalen ein und haben eine gemeinsame Struktur, die 7 Transmembrandomänen einschließt. Daher werden diese Rezeptoren zusammen als G-Protein-gekoppelter Rezeptor oder 7-Transmembran-Rezeptoren bezeichnet.
Einer der Wege zur Modulierung biologischer Funktionen, die von solchen Hormonen oder Neurotransmittern über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren übertragen werden, ist das Hypothalamus-Hypophysen-System. So wird die Sekretion des Hypophysenhormons aus der Hypophyse von Hypothalamushormonen (Hypophysenhormon-Releasing-Faktor) gesteuert, und die Funktionen der Zielzellen oder -organe werden mittels der Hypophysenhormone geregelt, die in den Kreislauf abgegeben werden. Dieser Weg führt funktionelle Modulationen wie die Homöostase und die Regulierung der Fortpflanzung, der Entwicklung, des Metabolismus und des Wachstums von Individuen durch, die für den lebenden Körper wichtig sind. Die Sekretion von Hypophysenhormonen wird von einem positiven Rückkopplungs- oder einem negativen Rückkopplungsmechanismus, der das Hypothalamushormon und das von der endokrinen Zieldrüse sekretierte periphere Hormon einschließt, gesteuert. Die verschiedenen, in der Hypophyse vorhandenen Rezeptorproteine spielen bei der Regulierung des Hypothalamus-Hypophysen-Systems eine zentrale Rolle.
Mittlerweile ist bekannt, dass diese Hormone und Faktoren sowie ihre Rezeptoren nicht im Hypothalamus-Hypophysen-System lokalisiert, sondern im Gehirn weit verteilt sind. Daher wird vermutet, dass diese als Hypothalamushormon bezeichnete Substanz im zentralen Nervensystem als Neurotransmitter oder Neuromodulator fungiert. Darüber hinaus wird die Substanz auch in periphere Gewebe verteilt, und es wird angenommen, dass sie in den betreffenden Geweben wichtige Rollen spielt.
Die Pankreas spielt im Kohlenhydratstoffwechsel eine kritische Rolle, indem sie Glucagon und Insulin sowie Verdauungssaft sezerniert. Während Insulin von den Pankreas-β-Zellen sezerniert wird, wird seine Sekretion hauptsächlich von Glucose stimuliert. Es ist jedoch bekannt, dass β-Zellen eine Vielzahl von Rezeptoren haben, und die Sekretion von Insulin wird von einer Reihe von Faktoren zusätzlich zu Glucose sowie von Peptidhormonen, z.B. Galanin, Somatostatin, gastric inhibiting Polypeptid, Glucagon, Amyrinen etc., Zuckern, z.B. Mannose etc., Aminosäuren und Neurotransmittern u.a. gesteuert.
Das Mittel, das bisher zur Identifizierung von Liganden für die G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteine zur Verfügung stand, besteht in einer Abschätzung aus der Homologie der Primärstruktur von G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteinen.
Kürzlich ist über eine Untersuchung von neuen opioiden Peptiden berichtet worden, bei der eine cDNA, die für ein Rezeptorprotein, dessen Ligand unbekannt ist, d.h. ein Orphan-G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein, codiert, in Tierzellen eingeführt wurde (R. K. Reinsheid et al., Science, 270, 792–794, 1995, J.-C. Menular et al., Nature 377, 532–535, 1995). Mit Hinsicht auf Ähnlichkeiten mit bekannten G-Protein-gekoppelte Rezeptorproteinen und Gewebeverteilungen konnte in diesen Fällen jedoch leicht vorausgesehen werden, dass der Ligand zur Familie der Opioidpeptide gehören würde. Die Geschichte der Forschung und Entwicklung auf dem Gebiet der Substanzen, die durch den Opioidrezeptor auf den lebenden Körper einwirken, reicht viele Jahre zurück, und verschiedene Antagonisten und Agonisten sind entwickelt worden. Daher wurde von den künstlich hergestellten Verbindungen ein Agonist des Rezeptors ausgewählt, und unter seiner Verwendung als Sonde wurde die Expression des Rezeptors in den mit der Rezeptor-cDNA transfizierten Zellen verifiziert. Dann wurde eine Suche nach einem Aktivator der intrazellulären Signalübertragung, der dem Agonisten ähnlich war, unternommen, der so gefundene Aktivator wurde gereinigt, und die Struktur des Liganden wurde bestimmt. Wenn die Homologie eines Orphanrezeptors zu bekannten G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteinen aber niedrig ist, ist es sehr schwierig, seinen Liganden vorherzusagen.
Liganden für Orphan-G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, die in der Hypophyse, dem zentralen Nervensystem und in Pankreas-β-Zellen exprimiert werden, werden als nützlich zur Entwicklung von Medikamenten betrachtet, wobei ihre Strukturen und Funktionen aber noch nicht aufgeklärt worden sind.
In diesem Zusammenhang offenbaren Marchese et al., Genomics, Band 29(2), 335–344 (1995) und Welch et al., Biochem. Biophys. Res. Com., Band 209(2) 606–613 (1995) sowie WO 96/05302 (nur relevant gemäß Art. 54(3) EPÜ) G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, die zu denjenigen des Rezeptors von SEQ ID Nr. 21 der vorliegenden Erfindung hochgradig homolog sind.
[Offenbarung der Erfindung]
Unter Verwendung einer Zelle, bei der eine cDNA, die für ein Orphan-G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein codierend ist, durch ein geeignetes Mittel exprimiert worden ist und bei der die Messung einer spezifischen Zellstimula tionswirkung, veranschaulicht durch eine Signaltransduktionswirkung als Indikator, verwendet wird, ist es den Erfindern der vorliegenden Erfindung gelungen, ein Polypeptid zu screenen, das das Rezeptorprotein als Ligand erkennt.
Weiterhin fanden die Erfinder, dass eine Verbindung gescreent werden kann, die dazu fähig ist, die Verbindungswirkung dieses Liganden, bei dem es sich um einen Faktor zur Aktivierung des Rezeptorproteins handelt, zu ändern.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung

(1) ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus SEQ ID Nr. 73, einer Aminosäuresequenz, bei der 1–15 Aminosäurereste aus SEQ ID Nr. 73 deletiert sind, einer Aminosäuresequenz, bei der 1–80 Aminosäurereste zu SEQ ID Nr. 73 addiert sind und einer Aminosäuresequenz, bei der 1–15 Aminosäurereste von SEQ ID Nr. 73 durch eine oder mehrere andere Aminosäurereste substituiert sind, ausgewählt ist, wobei das Polypeptid an ein Rezeptorprotein binden kann, das die durch SEQ ID Nr. 21 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst, oder dessen Amid oder Ester oder ein Salz davon.
(2) Das in (1) oben beschriebene Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus einer Aminosäuresequenz, bei der 1–10 Aminosäurereste aus SEQ ID Nr. 73 deletiert sind, einer Aminosäuresequenz, bei der 1–50 Aminosäurereste zu SEQ ID Nr. 73 addiert sind und einer Aminosäuresequenz, bei der 1–10 Aminosäurereste von SEQ ID Nr. 73 durch eine oder mehrere andere Aminosäurereste substituiert sind, ausgewählt ist.
(3) Das in (2) oben beschriebene Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus einer Aminosäuresequenz, bei der 1–5 Aminosäurereste aus SEQ ID Nr. 73 deletiert sind, einer Aminosäuresequenz, bei der 1–10 Aminosäurereste zu SEQ ID Nr. 73 addiert sind und einer Aminosäurese quenz, bei der 1–5 Aminosäurereste von SEQ ID Nr. 73 durch eine oder mehrere andere Aminosäurereste substituiert sind, ausgewählt ist.
(4) Das in (1) oben beschriebene Polypeptid, das die Aminosäuresequenz umfasst, die durch SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 10, SEQ ID Nr. 47, SEQ ID Nr. 48, SEQ ID Nr. 49, SEQ ID Nr. 50, SEQ ID Nr. 51, SEQ ID Nr. 52, SEQ ID Nr. 61, SEQ ID Nr. 62, SEQ ID Nr. 63, SEQ ID Nr. 64, SEQ ID Nr. 65 oder SEQ ID Nr. 66 dargestellt wird.
(5) Das in (1) oben beschriebene Polypeptid, das die Aminosäuresequenz umfasst, die durch SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 44, SEQ ID Nr. 45 oder SEQ ID Nr. 59 dargestellt wird.
(6) Eine DNA, die eine DNA mit einer Nucleotidsequenz umfasst, die für das Polypeptid codiert, das im obigen (1) bis (3) beschrieben ist.
(7) Die in (6) oben beschriebene DNA, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die durch SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 16, SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 18, SEQ ID Nr. 46, SEQ ID Nr. 53, SEQ ID Nr. 54, SEQ ID Nr. 55, SEQ ID Nr. 56, SEQ ID Nr. 57, SEQ ID Nr. 58, SEQ ID Nr. 60, SEQ ID Nr. 67, SEQ ID Nr. 68, SEQ ID Nr. 69, SEQ ID Nr. 70, SEQ ID Nr. 71 oder SEQ ID Nr. 72 dargestellt wird.
(8) Ein rekombinanter Vektor, der die in (6) oben beschriebene DNA umfasst.
(9) Eine Wirtszelle, die die in (6) oben beschriebene DNA oder den die in (8) oben beschriebenen rekombinanten Vektor trägt.
(10) Ein Verfahren zur Herstellung des in (1) oben beschriebenen Polypeptids, umfassend das Kultivieren der in (9) oben beschriebenen Transformanten.
(11) Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Polypeptid, sein Amid oder seinen Ester gemäß der Beschreibung in (1) bis (5) oben oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon umfasst.
(11) Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Teilpeptidpeptid, sein Amid oder seinen Ester gemäß der Beschreibung in (4) oben oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon umfasst.
(12) Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die in (1) oben beschriebene DNA enthält.
(13) Die in (11) oder (12) oben beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung, bei der es sich um einen Modulator der Hypophysenfunktion handelt.
(14) Die in (11) oder (12) oben beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung, bei der es sich um einen Modulator der Funktion des zentralen Nervensystems handelt.
(15) Die in (11) oder (12) oben beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung, bei der es sich um einen Modulator der Pankreasfunktion handelt.
(16) Einen Antikörper gegen das in (1) bis (5) oben beschriebene Polypeptid.
(17) Ein Screening-Verfahren für eine Verbindung, die die Bindungswirkung des in (1) oben beschriebenen Polypeptids gegenüber einem Rezeptorprotein ändern kann, wobei das Rezeptorprotein ein Polypeptid, das die durch SEQ ID Nr. 73 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst, binden kann und eine aus SEQ ID Nr. 21 ausgewählte Aminosäuresequenz, eine Aminosäuresequenz, bei der 1–30 Aminosäurereste aus SEQ ID Nr. 21 deletiert sind, einer Aminosäuresequenz, bei der 1–30 Aminosäurereste zu SEQ ID Nr. 21 addiert sind oder einer Aminosäuresequenz, bei der 1–30 Aminosäurereste von SEQ ID Nr. 21 durch eine oder mehrere andere Aminosäurereste substituiert sind, oder ein Salz davon umfasst, wobei das Verfahren die Durchführung eines Vergleichs umfasst zwischen: (i) wenigstens einem Fall, bei dem das in (1) oben beschriebene Polypeptid mit dem Rezeptorprotein oder einem Salz davon in Kontakt gebracht wird; und (ii) wenigstens einem Fall, bei dem das in (1) oben beschriebene Polypeptid zusammen mit einer zu testenden Probe mit dem Rezeptorprotein in Kontakt gebracht wird.
(18) Das im obigen (17) beschriebene Verfahren, wobei das Rezeptorprotein eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus einer Aminosäuresequenz, bei der 1–10 Aminosäurereste aus SEQ ID Nr. 21 deletiert sind, einer Aminosäuresequenz, bei der 1–10 Aminosäurereste zu SEQ ID Nr. 21 addiert sind und einer Aminosäuresequenz, bei der 1–10 Aminosäurereste von SEQ ID Nr. 21 durch eine oder mehrere andere Aminosäurereste substituiert sind, ausgewählt ist.
(19) Ein Kit zum Suchen (Screening) nach einer Verbindung, die die Bindungswirkung des im obigen (1) beschriebenen Polypeptids gegenüber einem Rezeptorprotein ändern kann, wobei das Rezeptorprotein ein Polypeptid, das die durch SEQ ID Nr. 73 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst, binden kann und eine aus SEQ ID Nr. 21 ausgewählte Aminosäuresequenz, eine Aminosäuresequenz, bei der 1–30 Aminosäurereste aus SEQ ID Nr. 21 deletiert sind, einer Aminosäuresequenz, bei der 1–30 Aminosäurereste zu SEQ ID Nr. 21 addiert sind und einer Aminosäuresequenz, bei der 1–30 Aminosäurereste von SEQ ID Nr. 21 durch eine oder mehrere andere Aminosäurereste substituiert sind, oder ein Salz davon umfasst, wobei der Kit Folgendes (i) ein Rezeptorprotein, wie es oben definiert ist, und (ii) ein im obigen (1) beschriebenes Polypeptid umfasst.
(20) Der im obigen (19) beschriebene Kit, wobei das Rezeptorprotein eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus einer Aminosäuresequenz, bei der 1–10 Aminosäurereste aus SEQ ID Nr. 21 deletiert sind, einer Aminosäuresequenz, bei der 1–10 Aminosäurereste zu SEQ ID Nr. 21 addiert sind und einer Aminosäuresequenz, bei der 1–10 Aminosäurereste von SEQ ID Nr. 21 durch eine oder mehrere andere Aminosäurereste substituiert sind, ausgewählt ist.

Die vorliegende Erfindung macht darüber hinaus verfügbar:

(21) das im obigen (1) beschriebene Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, bei der das Peptid von SEQ ID Nr. 74 an den N-Terminus des die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 73 umfassenden Polypeptids addiert ist;
(22) das im obigen (1) beschriebene Polypeptid, das vom Rind, von der Ratte oder vom Menschen stammt, und
(23) die im obigen (11) oder (12) beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Therapeutikum und/oder Prophylaktikum für Demenz, Depression (Melancholie), das hyperkinetische (mikroenzephalopathisches) Syndrom, die Bewusstseinsstörung, das Angstsyndrom, Schizophrenie, Horror, eine Krankheit aufgrund einer Störung der Sekretion von Wachstumshormonen, Hyperphagie, Polyphagie, Hyperchlolesterinämie, Hyperglyceridämie, Hyperlipieämie, Hyperprolaktinämie, Diabetes, Krebs, Pankreatitis, eine Nierenerkrankung, das Turnersche Syndrom, eine Neurose, Rheumatoidarthritis, eine Rückgratverletzung, eine transitorische Gehirnischämie, eine amytrophe Lateralsklerose, eine akute Myokardinfarzierung, eine spinozerebelläre Degeneration, einen Knochenbruch, ein Trauma, Neurodermatitis, Osteoporose, Asthma, Epilepsie, Unfruchtbarkeit und/oder Infertilität ist.

Der hier verwendete Begriff "wesentliche(s) Äquivalent(e)" bedeutet, dass die Wirkung des Proteins, z.B. die Beschaffenheit der Bindungswirkung des Liganden und des Rezeptors und die physikalischen Merkmale im Wesentlichen dieselben sind. Substitutionen, Deletionen oder Insertionen von Aminosäuren führen oft nicht zu drastischen Änderungen der physikalischen und chemischen Merkmale eines Polypeptids, wobei in einem solchen Fall Polypeptide, die die Substitution, Deletion oder Insertion enthalten, als im Wesentlichen äquivalent zu Polypeptiden ohne die Substitution, Deletion oder Insertion betrachtet würden. Ein wesentliches Äquivalent, das eine Aminosäure innerhalb der Sequenz ersetzt, kann aus anderen Elementen der Klasse, zu der die Aminosäure gehört, ausgewählt sein. Die nichtpolaren (hydrophoben) Aminosäuren umfassen Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die polaren, neutralen Aminosäuren umfassen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren umfassen Asparaginsäure und Glutaminsäure.
[Kurzbeschreibung der Zeichnungen]
1 zeigt die Nucleotidsequenz des aus der humanen Hypophyse stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein-cDNA-Fragments, das vom cDNA-Klon p19P2 beherbergt ist, der mittels PCR unter Verwendung einer von der humanen Hypophyse stammenden cDNA isoliert wurde, und die von der Nucleotidsequenz codierte Aminosäure. Bei dem zum Sequenzieren verwendeten Primer handelte es sich um -21M13. Die unterstrichene Region entspricht dem synthetischen Primer.
2 zeigt die Nucleotidsequenz des aus der humanen Hypophyse stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein-cDNA-Fragments, das vom cDNA-Klon p19P2 beherbergt ist, der mittels PCR unter Verwendung einer von der humanen Hypophyse stammenden cDNA isoliert wurde, und die von der Nucleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz. Bei dem zum Sequenzieren verwendeten Primer handelte es sich um M13RV-N (Takara). Die unterstrichene Region entspricht dem synthetischen Primer.
3 zeigt ein Diagramm der partiellen Hydrophobie des Proteins, das von dem in p19P2 beherbergten, aus der humanen Hypophyse stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein-cDNA-Fragment codiert wird, das gemäß der in 1 dargestellten Aminosäuresequenz entworfen ist.
4 zeigt ein Diagramm der partiellen Hydrophobie des Proteins, das von dem in p19P2 beherbergten, aus der humanen Hypophyse stammenden, G- Protein-gekoppelten Rezeptorprotein-cDNA-Fragment codiert wird, das gemäß der in 2 dargestellten Aminosäuresequenz entworfen ist.
5 ist ein Diagramm, in dem die Aminosäure-Teilsequenz des Proteins, das von dem in den 1 und 2 dargestellten, in p19P2 beherbergten, aus der humanen Hypophyse stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein-cDNA-Fragment codiert wird, mit dem bekannten G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein S12863 verglichen wird. Die schattierte Region stellt die Region mit Übereinstimmungen dar. Die Aminosäuresequenz 1 bis 9 von p19P2 entspricht der Aminosäuresequenz 1 bis 99 von 1, und die Aminosäuresequenz 156 bis 230 entspricht der Aminosäuresequenz 1 bis 68 von 2.
6 zeigt die Nucleotidsequenz des von MIN6 stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein-cDNA-Fragments auf der Grundlage der Nucleotidsequenzen der von den cDNA-Klonen pG3-2 und pG1-10 beherbergten, von MIN6 stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein-cDNA-Fragmente, die mittels PCR unter Verwendung der von MIN6 stammenden cDNA isoliert ist, und die von der Nucleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz dar. Die unterstrichene Region entspricht dem synthetischen Primer.
7 ist ein Diagramm, in dem die Aminosäure-Teilsequenz, die von pG3-2/pG1-10 des in 6 veranschaulichten, von MIN6 stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins codiert wird, mit der Aminosäure-Teilsequenz des in den 1 und 2 dargestellten, von p19P2 codierten Proteins verglichen wird. Die schattierte Region entspricht der Region mit Übereinstimmungen. Die Aminosäuresequenz 1 bis 99 des von p19P2 codierten Proteins entspricht der Aminosäuresequenz 1 bis 99 von 1, und die Aminosäuresequenz 156 bis 223 entspricht der Aminosäuresequenz 1 bis 68 von 2. Die Aminosäuresequenz 1 bis 223 des von pG3-2/pG1-10 codierten Proteins entspricht der Aminosäuresequenz 1 bis 223 von 6.
8 ist ein Diagramm der partiellen Hydrophobie des von MIN6 stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins, das gemäß der in 6 dargestellten Aminosäure-Teilsequenz entworfen ist.
9 zeigt die gesamte Nucleotidsequenz der vom cDNA-Klon phGR3 beherbergten, von der humanen Hypophyse stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein-cDNA, die aus einer aus der humanen Hypophyse stammenden cDNA-Bank mittels des Plaque-Hybridisierungsverfahrens unter Verwendung des als Sonde in p19P2 insertierten DNA-Fragments isoliert wurde, und die von der Nucleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz.
10 zeigt das Ergebnis eines Northern-Blotting einer humanen Hypophysen-mRNA, die mit dem isotopenmarkierten humanen Hypophysen-cDNA-Klon phGR3 hybridisiert ist.
11 zeigt einen Plot der Hydrophobie des Proteins, das von der von phGR3 beherbergten, von der humanen Hypophyse stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein-cDNA codiert wird und gemäß der in 9 dargestellten Aminosäuresequenz entworfen ist.
12 zeigt die Nucleotidsequenz des vom cDNA-Klon p5S38 beherbergten, von MIN6 stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein-cDNA-Fragments, das mittels PCR unter Verwendung der von MIN6 stammenden cDNA isoliert wurde, und die von der Nucleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz. Die unterstrichene Region entspricht dem synthetischen Primer.
13 zeigt ein Diagramm, in dem Aminosäure-Teilsequenz des in 12 dargestellten, von p5S38 codierten, von MIN6 stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins mit der Aminosäure-Teilsequenz des in den 1 und 2 dargestellten, G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins, das von dem von p19P2 beherbergten cDNA-Fragment codiert wird, und der Aminosäure-Teilsequenz des G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins, das von den Nucleotidsequenzen der in 6 dargestellten, in pG3-2 und in pG1-10 enthaltenen cDNA-Fragmente codiert wird, verglichen wird. Der schattierte Bereich stellt den Sequenzbereich mit Übereinstimmungen dar. Die Aminosäuresequenz 1 bis 144 des von p5S38 codierten Proteins entspricht der Aminosäuresequenz 1 bis 144 von 12, und die Aminosäuresequenz 1 bis 99 des von p19P2 codierten Proteins entspricht der Aminosäuresequenz 1 bis 99 von 1, und die Aminosäuresequenz 156 bis 223 entspricht der Aminosäuresequenz 1 bis 68 der Aminosäuresequenz von 2. Die Aminosäuresequenz 1 bis 223 des von pG3-2/pG1-10 codierten Proteins entspricht der Aminosäuresequenz 1 bis 223 von 6.
14 zeigt ein Diagramm der partiellen Hydrophobie des Proteins, das von der von p5S38 beherbergten, von MIN6 stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein-cDNA codiert wird, die gemäß der in 12 dargestellten Aminosäure-Teilsequenz entworfen ist.
15 zeigt die Ergebnisse der folgenden Analyse. Danach wurde eine RT-PCR durchgeführt, um die Expression von mRNA in CHO-Zellen zu bestätigen, die mit pAKKO-19P2 transfiziert waren. Die Spuren 1–7 veranschaulichen die Ergebnisse, die erhalten wurden, indem zum Vergleich PCR unter Verwendung serieller Verdünnungen von pAKKO-19P2 durchgeführt wurden, d.h. die Vorratslösung mit 10 μl/ml (Spur 1), Verdünnung 1/2 (Spur 2), Verdünnung 1/4 (Spur 3), Verdünnung 1/64 (Spur 4), Verdünnung 1/256 (Spur 5), Verdünnung 1/1024 (Spur 6) und eine Verdünnung 1/4096 (Spur 7) des Plasmids als Matrize, und das Analysieren der Reaktionsmischungen durch eine Elektrophorese an 1,2%igem Agarosegel. Die Spuren 8 bis 11 sind die Ergebnisse, die erhalten werden, indem PCR unter Verwendung einer Verdünnung von 1/10 (Spur 8), einer Verdünnung von 1/100 (Spur 9) und einer Verdünnung von 1/1000 (Spur 10) der aus der Zelllinie CHO-19P2 hergestellten cDNA als Matrizen und das Einwirkenlassen einer Elektrophorese auf die entsprechenden Reaktionsmischungen durchgeführt werden. Spur 11 wurde erhalten, indem eine PCR unter Verwendung einer Matrize durchgeführt wurde, die erhalten wurde, indem eine cDNA-Synthese ohne reverse Transkriptase durchgeführt und das PCR-Reaktionsprodukt einer Elektropho rese unterzogen wurde. Die Spuren 12 und 13 wurden erhalten, indem eine PCR unter Verwendung von cDNA durchgeführt wurde, die aus Blind-CNO-Zellen mit und ohne Zugabe von reverser Transkriptase bzw. als Matrizen hergestellt wurden und indem die jeweiligen Reaktionsprodukte einer Elektrophorese unterzogen wurden. M stellt den DNA-Größenmarker dar. Die Spuren an beiden Enden wurden erhalten, indem 1 μl des λ/StyI-Aufschlusses (Nippon Gene) einer Elektrophorese unterzogen wurden, und die zweite Spur von rechts wurde mit 1 μl eines Ø/χ174/HincII-Aufschlusses (Nippon Gene) erhalten. Der Pfeil zeigt die Position der mittels PCR amplifizierten Bande von etwa 400 bp an.
16 zeigt die Wirkung der aus dem gesamten Gehirn der Ratte extrahierten, rohen Ligandenpeptidfraktion hinsichtlich der Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen. Die Wirkung hinsichtlich der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten wurde als Prozentwert der Menge der [³H]-Arachidonsäure-Metaboliten ausgedrückt, die in Gegenwart der rohen Liganden-Polypeptidfraktion freigesetzt wurden, wobei die Menge der [³H]-Arachidonsäure-Metaboliten, die in Gegenwart von 0,05% BAS-HABB freigesetzt wurden, als 100% genommen wurde. Die Wirkung zur Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus der CHO-19P2-Zelllinie wurde in einer 30%igen CH₃CN-Fraktion bestimmt.
17 zeigt die Wirkung der rohen, aus dem Rinder-Hypothalamus extrahierten Liganden-Polypeptidfraktion zur Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen. Die die Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten fördernde Wirkung wurde als Prozentwert der Menge der [³H]-Arachidonsäure-Metaboliten, die in Gegenwart der rohen Liganden-Polypeptidfraktion freigesetzt wurden, ausgedrückt, wobei die Menge der [³H]-Arachidonsäure-Metaboliten, die in Gegenwart von 0,05% BAS-HABB freigesetzt wurden, als 100% genommen wurde. Die Wirkung zur Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus der CHO- 19P2-Zelllinie wurde in einer 30%igen CH₃CN-Fraktion wie bei der rohen Liganden-Polypeptidfraktion aus dem ganzen Gehirn der Ratte bestimmt.
18 zeigt die Wirkung der Fraktion, die mit der Umkehrphasen-Säule C18 218TP5415 gereinigt wurde, um die Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen spezifisch zu fördern. Die aktive Fraktion aus RESOURCE S wurde an C18 218TP5415 fraktioniert. Somit wurde die Chromatographie mit einer Fließrate von 1 ml/min bei einem Konzentrationsgradienten von 20%–30% CH₃CN/0,1% TFA/H₂O durchgeführt, das Eluat wurde in 1-ml-Fraktionen aufgenommen, und jede Fraktion wurde lyophilisiert. Dann wurde die Wirkung einer jeden Fraktion zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus der CHO-Zelllinie 19P2 bestimmt. Als Ergebnis wurde die Wirkung in 3 Fraktionen (mit den Bezeichnungen – in der Reihenfolge der Elution – P-1, P-2 und P-3) fraktioniert.
19 zeigt die Wirkung der mit Diphenyl-219TP5415 der Umkehrphasen-Säule gereinigten Fraktion zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen. Die aktive Fraktion P-3 aus C18 218TP5415 wurde an Diphenyl-219TP5415 fraktioniert. Die Chromatographie wurde mit einer Fließrate von 1 ml/min mit einem Konzentrationsgradienten von 22%–25% CH₃CN/0,1% TFA/H₂O durchgeführt, das Eluat wurde in 1-ml-Fraktionen aufgenommen, und jede Fraktion wurde lyophilisiert. Dann wurde die Wirkung einer jeden Fraktion zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-Zellen 19P2 bestimmt. Als Ergebnis konvergierte die Wirkung in einem einzigen Peak.
20 zeigt die Wirkung der Fraktion, die mit der Umkehrphasen-Säule μRPC C2/C18 SC 2.1/10 gereinigt wurde, zur spezifischen Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen. Der Peak mit der aktiven Fraktion aus Diphenyl-219TP5415 wurde an μRPC C2/C18 SC 2.1/10 fraktioniert. Die Chromatographie wurde mit einer Fließrate von 100 μl/min mit einem Konzentrationsgradienten von 22%–23,5% CH₃CN/0,1% TFA/H₂O durchgeführt, das Eluat wurde in 100-μl-Fraktionen isoliert, und jede Fraktion wurde lyophilisiert. Dann wurde die Wirkung zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen in jeder Fraktion bestimmt. Als Ergebnis wurde die Wirkung als zwei Peaks einer offensichtlich einzelnen Substanz (Peptid) gefunden.
21 zeigt die Wirkung der Fraktion P-2, die mit der Umkehrphasen-Säule μRPC C2/C18 SC 2.1/10 gereinigt wurde, zur spezifischen Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen. Die Chromatographie wurde mit einer Fließrate von 100 μl/min mit einem Konzentrationsgradienten von 21,5%–23,0% CH₃CN/0,1% TFA/dH₂O durchgeführt, das Eluat wurde in 100-μl-Fraktionen isoliert, und jede Fraktion wurde lyophilisiert. Dann wurde die Wirkung zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen in jeder Fraktion bestimmt. Als Ergebnis wurde die Wirkung als ein Peak einer offensichtlich einzelnen Substanz (Peptid) gefunden.
22 zeigt die Nucleotidsequenz eines Rinder-Hypothalamus-Liganden-Polypeptid-cDNA-Fragments, das von der Nucleotidsequenz des vom Rinder-Hypothalamus stammenden Liganden-Polypeptid-cDNA-Fragment stammt, das die Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen, die von einem cDNA-Klon beherbergt werden, der mittels PCR unter Verwendung einer vom Rinder-Hypothalamus stammenden cDNA isoliert wurde, spezifisch fördert, und die von der Nucleotidsequenz codierte Nucleotidsequenz. Die mit dem Pfeil gekennzeichnete Region entspricht dem synthetischen Primer.
23 zeigt die Nucleotidsequenz des vom Rinder-Hypothalamus stammenden Liganden-Polypeptid-cDNA-Fragments, das gemäß der Nucleotidsequenz des vom Rinder-Hypothalamus stammenden Liganden-Polypeptid-cDNA-Fragments, das die Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen, die von einem cDNA-Klon beherbergt werden, der mittels PCR unter Verwendung einer vom Rinder-Hypothalamus stammenden cDNA isoliert wurde, erzeugt wurde, und die von der Nucleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz. Die mit dem Pfeil gekennzeichnete Region entspricht dem synthetischen Primer.
24 zeigt die Aminosäuresequenzen (a) und (b) der vom Rinder-Hypothalamus stammenden Liganden-Polypeptide, die die Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen spezifisch fördern, und die cDNA-Sequenz, die für die volle Codierungsregion des von SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 44 definierten Liganden-Polypeptide codiert.
25 zeigt die konzentrationsabhängige Wirkung des synthetischen Liganden-Polypeptids (19P2-L31) zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen. Das synthetische Peptid wurde in entgastem dH₂O mit einer Endkonzentration von 10^–3 M gelöst und mit 0,05%igem BSA-HBSS bis zu Konzentrationen von 10^–12 M – 10^–6 M verdünnt. Die Wirkung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten wurden als die gemessene Radioaktivität von [³H]-Arachidonsäure-Metaboliten ausgedrückt, die im Überstand freigesetzt wurden, wenn die Verdünnung zu den Zellen gegeben wurde. Als Ergebnis wurde die konzentrationsabhängige Wirkung von 19P2-31 zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen gefunden.
26 zeigt die konzentrationsabhängige Wirkung des synthetischen Liganden-Polypeptids (19P2-L31(O)) zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen. Das synthetische Ligandenpeptid wurde in entgastem dH₂O mit einer Endkonzentration von 10^–3 M gelöst und mit 0,05%igem BSA-HBSS zu Konzentrationen von 10^–12 M – 10^–6 M verdünnt. Die Wirkung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten wurde als gemessene Radioaktivität von [³H]-Arachidonsäure-Metaboliten ausgedrückt, die im Überstand freigesetzt wurden, wenn die Verdünnung zu den Zellen gegeben wurde. Als Ergebnis wurde die dosisabhängige Wirkung von 19P2-L31(O) zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen gefunden.
27 zeigt die Wirkung des synthetischen Liganden Polypeptid 19P2-L20 zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen, Das synthetische Peptid wurde in entgastem dH₂O mit einer Endkonzentration von 10^–3 M gelöst und mit 0,05%igem BSA-HBSS zu Konzentrationen von 10^–12 M – 10^–6 M verdünnt. Die Wirkung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten wurde als gemessene Radioaktivität von [³H]-Arachidonsäure-Metaboliten ausgedrückt, die im Überstand freigesetzt wurden, wenn die Verdünnung zu den Zellen gegeben wurde. Als Ergebnis wurde die dosisabhängige Wirkung von 19P2-L20 zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen gefunden.
28 zeigt das Elektrophoregramm an 1,2%igem Agarosegel der DNA-Fragmente der Phagen, die aus einer Rinder-Genombank geklont sind, die mit den Restriktionsenzymen BamHI (B) und SalI (S) aufgeschlossen sind. Als DNA-Größenmarker (M) wurden StyI-Aufschlüsse der DNA des λ-Phagen verwendet. In Spur B wurden zwei vom Vektor stammende Banden in Positionen zwischen der ersten (19 329 bp) und der zweiten (7743 bp) Markerbande sowie 3 Banden, die vom insertierten Fragment zwischen der dritten (6223 bp) und der 5. (3472 bp) Bande stammen, nachgewiesen. In Spur 5 wurden zwei vom Vektor stammende Banden auf vergleichbare Weise nachgewiesen, wobei die obere Bande aufgrund der Überlappung des Bandes des insertierten Fragments dicker als die Bande in Spur B ist.
29 zeigt die Nucleotidsequenz im Bereich der codierenden Region aus genomischer Rinder-DNA decodiert. Die 1. bis zur 3. Base (ATG) entsprechen dem Translations-Startcodon, und die 767. bis zur 769. Base (TAA) entsprechen dem Translations-Endcodon.
30 zeigt einen Vergleich zwischen der Nucleotidsequenz (Genom) im Bereich der codierenden Region, die von genomischer Rinder-DNA und der mittels PCR geklonten Nucleotidsequenz (cDNA) von Rinder-cDNA abgezogen wurde. Die Sequenzregion mit Übereinstimmungen ist durch eine Schattierung markiert. Hinsichtlich der 101. bis zur 572. Region gibt es keine entsprechende Region in der Nucleotidsequenz der cDNA, was darauf hin deutet, dass es sich um ein Intron handelt.
31 zeigt die Translation der Aminosäuresequenz, die nach der Eliminierung des Introns von der Nucleotidsequenz im Bereich der aus genomischer Rinder-DNA decodierten codierenden Region codiert wird.
32 zeigt die Aminosäuresequenz in voller Länge und die für die volle Codierungsregion codierende cDNA-Sequenz des Ratten-Liganden-Polypeptids.
33 zeigt die Aminosäuresequenz des Rinder-Liganden-Polypeptids und die Nucleotidsequenzen von DNA, die für Rinder-Polypeptid und Ratten-Polypeptid codieren. Der Pfeil bezeichnet die dem synthetischen Primer entsprechende Region.
34 zeigt die Aminosäuresequenz in voller Länge und die cDNA-Sequenz, die für die vollständig codierende Region des humanen Liganden-Polypeptids codierend ist.
35 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen in der Translationsregion von Rinder-Liganden-Polypeptid, Ratten-Liganden-Polypeptid und humanem Liganden-Polypeptid.
36 zeigt die Ergebnisse von Rezeptor-Bindungsexperimenten an lebenden Zellen, wobei radioiodiertes Liganden-Polypeptid in den Experimenten verwendet wird.
37 zeigt die Ergebnisse von Messungen der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-9 und CHO-UHR1 durch ein Liganden-Polypeptid.
38 zeigt die Ergebnisse einer Quantifizierung von UHR-1 mRNA durch RT-PCR in diskreten Regionen des Gehirns und von Geweben von Ratten.
39 zeigt die Ergebnisse einer Quantifizierung von Liganden-Polypeptid-mRNA mittels RT-PCR in diskreten Regionen des Gehirns und von Geweben von Ratten.
40 zeigt Auswirkungen von Liganden-Polypeptid auf die glucoseinduzierte Erhöhung der Plasmainsulin-Konzentration, gemessen mittels eines Radioimmunoassays.
41 zeigt die Ergebnisse von Messungen der motorischen Wirkung durch Verabreichung von 10 nmol eines Liganden-Polypeptids an eine Maus.

(a) bezieht sich auf die spontane motorische Wirkung, und (b) bezieht sich auf das Aufrichten.

42 zeigt die Ergebnisse von Messungen der motorischen Wirkung durch Verabreichung von 1 nmol eines Liganden-Polypeptids an eine Maus.

43 zeigt die Ergebnisse von Messungen der motorischen Wirkung durch Verabreichung von 0,1 nmol eines Liganden-Polypeptids an eine Maus.

44 zeigt die Ergebnisse von Messungen der motorischen Wirkung durch Verabreichung von 0,01 nmol eines Liganden-Polypeptids an eine Maus.

45 zeigt die Ergebnisse von Messungen der Körpertemperatur, die zu demjenigen Zeitpunkt gemessen wird, an dem das Liganden-Polypeptid in den Seitenventrikel von Mäusen verabreicht wird. Die Verabreichung des Liganden-Polypeptids wird 15 h nach der Verabreichung von Reserpin mit einer Dosis von 3 mg/kg, s.c., durchgeführt.
In 45 zeigen die Markierungen mit einem Stern p < 0,05, und die Markierungen mit zwei Sternen zeigen p < 0,01.
46 veranschaulicht die Zeichnung, in der die Mikroinjektionskanüle in einem Winkel von 20° in die Area postrema eingeführt ist.
47 zeigt ein typisches Beispiel für den direkten und den mittleren Blutdruck, der nach der Injektion von Ligand-Polypeptid in die Area postrema der Ratte gemessen wird. Er wird nach der Injektion von 10 nmol Ligand-Polypeptid mit einer Rate von 1 μl/min und unter der Bedingungen der fehlenden Anästhesie gemessen.
48 zeigt die Ergebnisse von Messungen des Wachstumshormons (GH) im Plasma, wenn 50 nmol Ligand-Polypeptid nach einer Anästhesie mittels Pentobarbital in den dritten Ventrikel der Ratte injiziert werden.
49 zeigt die Änderungen der Sekretion des GH im Plasma durch die Verabreichung von 50 nmol Liganden-Polypeptid in den dritten Ventrikel bei sich frei bewegenden Ratten.
Das Liganden-Polypeptid oder PBS wurde in den dritten Ventrikel verabreicht. 10 min später wurden der Ratte bei Bewusstsein 5 μg/kg GHRH intravenös verabreicht. GH-Konzentrationen wurden unmittelbar vor der intravenösen Verabreichung (Zeitpunkt 0) und 10, 20, 30, 40 und 60 min nach einer intravenösen Verabreichung von GHRH gemessen.
In 49 zeigt die Markierung durch einen Stern p < 0,05, und die Markierungen durch zwei Sterne zeigen p < 0,01.
50 zeigt die Beziehung zwischen dem Ligand-Polypeptid-Serum und der Extinktion.
51 zeigt die Hemmung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metabiliten durch polyklonale Antiliganden-Polypeptid-Antikörper.
52 zeigt die Sequenz der für UHR-1 codierenden cDNA, die auf pAKKO-UHR1-7 konstruiert ist.
[Bester Modus zur Durchführung der Erfindung]
Das Liganden-Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid, das dazu fähig ist, an ein G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein zu binden, und es umfasst eine Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID Nr. 73 veranschaulicht ist, oder deren wesentliches Äquivalent oder ein Teilpeptid davon oder dessen Amid oder Ester oder ein Salz davon. In SEQ ID Nr. 73 ist Xaa an der 10. Position Ala oder Thr; Xaa an der 11. Position ist Gly oder Ser, und Xaa an der 21. Position ist H, Gly oder GlyArg.
Das obige Liganden-Polypeptid, sein Amid oder sein Ester oder ein Salz davon (hiernach manchmal kurz als Liganden-Polypeptid oder Polypeptid bezeichnet), Verfahren zur Herstellung davon und Verwendungen für das Polypeptid werden jetzt ausführlich beschrieben.
Das obige Liganden-Polypeptid der vorliegenden Erfindung umfassen Polypeptide, die von beliebigen Geweben, z.B. der Hypophyse, der Pankreas, dem Gehirn, der Niere, der Leber, der Gonade, der Thyreoidea, der Gallenbla se, Knochenmark, der Nebenniere, der Haut, dem Muskel, der Lunge, dem Verdauungskanal, dem Blutgefäß, dem Herzen etc. oder Zellen von Menschen und anderen warmblütigen Tieren, z.B. dem Meerschweinchen, der Ratte, der Maus, dem Schwein, dem Schaf, dem Rind, dem Affen etc. stammen und eine durch SEQ ID Nr. 73 veranschaulichte Aminosäuresequenz oder deren substantielles Äquivalent umfassen. Zum Beispiel umfasst das Liganden-Polypeptid der vorliegenden Erfindung zusätzlich zu dem die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 73 umfassenden Protein dasjenige Protein, das eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von etwa 50–99,9%, vorzugsweise 70–99,9%, noch mehr bevorzugt 80–99,9% und besonders bevorzugt 90–99,9% zur Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 73 hat und eine qualitativ im Wesentlichen äquivalente Wirkung zu demjenigen Protein aufweist, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 73 umfasst. Der Begriff "im Wesentlichen äquivalent" bedeutet, dass die Beschaffenheit der rezeptorbindenden Wirkung, der Signalübertragungswirkung und dergleichen äquivalent sind. Somit ist es zulässig, dass sogar Unterschiede zwischen Eigenschaften wie der Stärke der Rezeptorbindungswirkung und der Molmasse des Polypeptids vorhanden sind.
Insbesondere umfasst das Liganden-Polypeptid der vorliegenden Erfindung das Polypeptid, das vom ganzen Rattengehirn, dem Rinder-Hypothalamus oder dem ganzen humanen Gehirn stammt und das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 73 umfasst. Darüber hinaus umfasst das Liganden-Polypeptid der vorliegenden Erfindung diejenigen Polypeptide, die im Wesentlichen äquivalente Polypeptide wie diejenigen Polypeptide, bei denen 1 bis 15, vorzugsweise 1 bis 10 und noch mehr bevorzugt 1 bis 5 Aminosäurereste aus der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 73 deletiert sind, Polypeptide, bei denen 1 bis 80, vorzugsweise 1 bis 50, noch mehr bevorzugt 1 bis 10 Aminosäurereste zur Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 73 addiert sind, oder Polypeptide, bei denen 1 bis 15, vorzugsweise 1 bis 10, noch mehr bevorzugt 1 bis 5 Aminosäurereste durch einen oder mehrere andere Aminosäurereste substituiert sind, umfassen.
Die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 73 umfasst die SEQ ID Nr. 8, 9, 10, 50, 51, 52, 64, 65 oder 66. Die zum Polypeptid im Wesentlichen äquivalenten Polypeptide, die die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 73 umfassen, sind Polypeptide, die die Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr. 1, 3, 4, 5, 6, 7, 44, 45, 47, 48, 49, 59, 61, 62 oder 63 umfassen.
Von diesen ist dasjenige Polypeptid bevorzugt, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 73 umfasst, und dasjenige Polypeptid, das die Aminosäuresequenz umfasst, bei dem ein Peptid mit SEQ ID Nr. 74 am N-Terminus des die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 73 umfassenden Polypeptids addiert ist.
Weiterhin umfasst das Polypeptid oder das Teilpeptid der vorliegenden Erfindung diejenigen, bei denen die N-terminale Seite von Gln unter Bildung von Pyroglutamylpeptid in vivo gespalten ist.
Bei den in dieser Beschreibung beschriebenen Peptiden sind gemäß der Konvention zur Peptidbezeichnung die linken Enden der N-Terminus (Amino-Terminus), und das rechte Ende ist der C-Terminus (Carboxyl-Terminus). Obwohl der C-Terminus des Polypeptids von SEQ ID Nr. 73 gewöhnlich Carboxyl(-COOH) oder Carboxylat(-COO^–) ist, kann er die Amid-(-CONH₂-) oder Ester-(-COOR-)Form annehmen. Der Esterrest R umfasst eine C_1-6-Alkylgruppe wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl etc., eine C_3-8-Cycloalkylgruppe wie Cyclopentyl, Cyclohexyl etc., eine C_6-12-Arylgruppe wie Phenyl, α-Naphthyl etc. und eine C_7-14-Arylgruppe wie eine Phenyl-C_1-2-alkylgruppe, z.B. Benzyl, Phenethyl, Benzhydryl etc. oder ein α-Naphthyl-C_1-2-alkyl, z.B. α-Naphthylmethyl etc. Darüber hinaus kann der Ester ein Pivaloyloxymethylester sein, der zur oralen Verabreichung weithin eingesetzt wird. Wenn das Polypeptid von SEQ ID Nr. 73 eine Carboxyl- oder Carboxylatgruppe in einer beliebigen, vom C-Terminus verschiedenen Position hat, ist das entsprechende Amid oder der entsprechende Ester auch in das Konzept des Polypeptids der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Der unmittelbar zuvor erwähnte Ester schließt die für den C-Terminus erwähnten Ester ein.
Das bevorzugte Liganden-Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist ein Peptid, dessen C-Terminus amidiert ist. Besonders bevorzugt ist ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 5, 8, 47, 50, 61 oder 64 umfasst, bei der der C-Terminus amidiert ist.
Das Salz des Polypeptids der vorliegenden Erfindung umfasst Salze mit physiologisch annehmbaren Basen, z.B. Alkalimetallen oder Säuren wie organischen oder anorganischen Säuren, und ist vorzugsweise ein physiologisch annehmbares Säureadditionssalz. Beispiele für solche Salze sind Salze davon mit anorganischen Säuren, z.B. Salzsäure, Phosphorsäure, Bromwasserstoffsäure oder Schwefelsäure etc., und Salze davon mit organischen Säuren, z.B. Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Oxalsäure, Benzoesäure, Methansulfonsäure oder Benzolsulfonsäure etc.
Das Liganden-Polypeptid oder dessen Amid oder Ester oder ein Salz davon der vorliegenden Erfindung können aus den Geweben oder Zellen von warmblütigen Tieren einschließlich des Menschen durch Reinigungstechniken hergestellt werden, oder sie können durch die hiernach beschriebene Peptidsynthese hergestellt werden. Darüber hinaus kann es durch das Kultivieren einer Transformanten, die die für das Polypeptid codierende DNA trägt, hergestellt werden, wie hiernach beschrieben ist.
Bei der Herstellung aus den Geweben oder Zellen des Menschen oder von anderen warmblütigen Tieren kann das Liganden-Polypeptid durch ein Verfahren gereinigt und isoliert werden, das das Homogenisieren des Gewebes oder der Zellen des Menschen oder des anderen warmblütigen Tieres, das Extrahieren des Homogenats beispielsweise mit einer Säure und das Einwirkenlassen einer Kombination aus chromatographischen Verfahren wie der Umkehrphasen-Chromatographie, der Ionenaustausch-Chromatographie, der Affinitätschromatographie etc. auf den Extrakt umfasst.
Wie oben erwähnt ist, kann das Liganden-Polypeptid in der vorliegenden Erfindung durch an sich bekannte Verfahren für die Peptidsynthese hergestellt werden. Die Verfahren zur Peptidsynthese können ein beliebiges von einer Festphasensynthese und einer Flüssigphasensynthese sein. Somit kann das Zielpeptid hergestellt werden, indem ein Teilpeptid oder eine Teil-Aminosäure, das bzw. die dazu fähig ist, das Protein zu bilden mit seinem restlichen Teil kondensiert wird, und wenn das Produkt eine Schutzgruppe hat, wird diese abgespalten, woraufhin ein gewünschtes Peptid hergestellt werden kann. Die bekannten Verfahren zur Kondensation und Entschützung umfassen die in der folgenden Literatur (1)–(5) beschriebenen Verfahren.

(1) M. Bodanszky und M. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York, 1966
(2) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York, 1965
(3) Nobuo Izumiya et al., Fundamentals and Experiments in Peptide Synthesis, Maruzen, 1975
(4) Haruaki Yajima und Shumpei Sakakibara, Biochemical Experiment Series 1, Protein Chemistry IV, 205, 1977
(5) Haruaki Yajima (Hrsg.), Development of Drugs-Continued, 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten

Nach der Reaktion kann das Protein durch eine Kombination von herkömmlichen Reinigungstechniken wie der Lösungsmittelextraktion, der Säulenchromatographie, der Flüssigchromatographie und der Umkristallisation gereinigt und isoliert werden. Wenn das oben isolierte Protein ein freie Verbindung ist, kann es durch ein bekanntes Verfahren in ein geeignetes Salz umgewandelt werden. Wenn das isolierte Produkt umgekehrt ein Salz ist, kann es durch ein bekanntes Verfahren in das freie Peptid umgewandelt werden.
Das Amid des Polypeptids kann erhalten werden, indem ein Harz für die Peptidsynthese verwendet wird, das zur Amidierung geeignet ist. Das Harz umfasst ein Chlormethyl-Harz, Hydroxymethyl-Harz, Benzhydrylamin-Harz, Aminomethyl-Harz, 4-Benzyloxybenzylalkohol-Harz, 4-Methylbenzhydrylamin-Harz, PAM-Harz, 4-Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl-Harz, Polyacrylamid-Harz, 4-(2',4'-Dimethoxyphenylhydroxymethyl)phenoxy-Harz, 4-(2',4'-Dimethoxphenyl-Fmoc-aminoethyl)phenoxy-Harz und so weiter. Bei Verwendung eines solchen Harzes werden Aminosäuren, deren α-Aminogruppen und funktionelle Gruppen der Seitenkette zweckmäßig geschützt sind, durch verschiedene, an sich bekannte Kondensationstechniken am Harz gemäß der Sequenz des Zielpeptids kondensiert. Am Ende der Reaktionsreihen wird das Peptid oder das geschützte Peptid vom Harz entfernt, und die Schutzgruppen werden entfernt, wodurch das Ziel-Polypeptid erhalten wird.
Zur Kondensation der oben erwähnten geschützten Aminosäuren kann eine Vielzahl von Aktivierungsreagenzien für die Peptidsynthese verwendet werden, wobei eine Carbodiimid-Verbindung aber besonders geeignet ist. Das Carbodiimid umfasst DCC, N,N'-Diisopropylcarbodiimid, und N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminoprolyl)carbodiimid. Zur Aktivierung mit einem solchen Reagenz werden ein Racemisierungsinhibitoradditiv, z.B. HOBt, und die geschützte Aminosäure direkt zum Harz oder zur geschützten, als symmetrisches Säureanhydrid, HOBt-Ester oder HOOBt-Ester voraktivierten Aminosäure gegeben. Das Lösungsmittel zur Aktivierung der geschützten Aminosäuren oder zur Kondensation mit dem Harz kann zweckmäßig aus denjenigen Lösungsmitteln ausgewählt werden, von denen bekannt ist, dass sie für Peptid-Kondensationsreaktionen brauchbar sind. Zum Beispiel können N,N-Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon, Chloroform, Trifluorethanol, Dimethylsulfoxid, DMF, Pyridin, Dioxan, Methylenchlorid, Tetrahydrofuran, Acetonitril, Ethylacetat oder geeignete Mischungen davon erwähnt werden. Die Reaktionstemperatur kann aus dem Bereich derjenigen ausgewählt werden, von denen bisher bekannt ist, dass sie für die Bildung von Peptidbindungen brauchbar sind, und wird gewöhnlich aus dem Bereich von etwa –20°C bis 50°C ausgewählt. Das aktivierte Aminosäurederivat wird gewöhnlich in einem Anteil eines 1,5- bis 4fachen Überschusses verwendet. Wenn bei einem Test unter Verwendung der Ninhydrin-Reaktion festgestellt wird, dass die Kondensation unzureichend ist, kann die Kondensationsreaktion wiederholt werden, um eine ausreichende Kondensation zu erzielen, ohne dass die Schutzgruppe entfernt wird. Wenn bei einer wiederholten Kondensation immer noch kein ausreichendender Kondensationsgrad erhalten wird, kann die nicht umgesetzte Aminogruppe mit Essigsäureanhydrid oder Acetylimidazol acetyliert werden.
Die Schutzgruppe der Aminogruppe für die Ausgangsmaterial-Aminosäure umfasst Z, Boc, tertiär-Amyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, Adamantyloxycarbonyl, Trifluoracetyl, Phthalyl, Formyl, 2-Nitrophenylsulfinyl, Diphenylphosphinothioyl oder Fmoc. Die Carboxy-Schutzgruppe, die verwendet werden kann, umfasst, ohne darauf beschränkt zu sein, das C_1-6-Alkyl, C_3-8-Cycloalkyl und C_7-14-Aralkyl, die oben erwähnt sind, sowie 2-Adamantyl, 4-Nitrobenzyl, 4-Methoxybenzyl, 4-Chlorbenzyl, Phenacyl, Benzyloxycarbonylhydrazido, tertiär-Butoxycarbonylhydrazido und Tritylhydrazido.
Die Hydroxygruppe von Serin und Threonin kann durch eine Veresterung oder Veretherung geschützt werden. Die für die Veresterung geeignete Gruppe umfasst von Kohlenstoff stammende Gruppen wie niedere Alkanoylgruppen, z.B. Acetyl etc., Aroylgruppen, z.B. Benzoyl etc., Benzyloxycarbonyl und Ethoxycarbonyl. Die für die Veretherung geeignete Gruppe umfasst Benzyl, Tetrahydropyranyl und tertiär-Butyl.
Die Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe von Tyrosin umfasst Bzl, Cl₂-Bzl, 2-Nitrobenzyl, Br-2 und tertiär-Butyl.
Die Schutzgruppe von Imidazol für Histidin umfasst Tos, 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl, DNP, Benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt und Fmoc.
Die aktivierte Carboxylgruppe der Ausgangs-Aminosäure umfasst das entsprechende Säureanhydrid, Azid und aktive Ester, z.B. Ester mit Alkoholen wie Pentachlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, 2,4-Dinitrophenol, Cyanmethylalkohol, p-Nitrophenol, HONB, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid, HOBt etc. Die aktivierte Aminogruppe der Ausgangs-Aminosäure umfasst das entsprechende Phosphoramid.
Das Verfahren zur Eliminierung der Schutzgruppen schließt eine katalytische Reduktion unter Verwendung von Wasserstoffgas in Gegenwart eines Katalysators wie Palladiumschwarz oder Palladium auf Kohlenstoff, eine Säurebehandlung mit wasserfreiem Wasserstofffluorid, Methansulfonsäure, Trifluormethansulfonsäure, Trifluoressigsäure oder einer Mischung solcher Säuren, eine Basenbehandlung mit Diisopropylethylamin, Triethylamin, Piperidin, Piperazin, eine Reduktion mit Natriummetall in flüssigem Ammoniak ein. Die Eliminierungsreaktion durch die oben erwähnte Säurebehandlung wird gewöhnlich bei einer Temperatur von –20°C bis 40°C durchgeführt und kann vorteilhaft unter Zugabe eines Kationenakzeptors wie Anisol, Phenol, Thioanisol, m-Kresol, p-Kresol, Dimethylsulfid, 1,4-Butandithiol, 1,2-Ethandithiol durchgeführt werden. Die 2,4-Dinitrophenylgruppe, die zum Schutz der Imidazolgruppe von Histidin verwendet wird, kann durch eine Behandlung mit Thiophenol eliminiert werden, während die Formylgruppe, die zum Schutz der Indolgruppe von Tryptophan verwendet wird, durch eine Alkalibehandlung mit einer verdünnten Natriumhydroxidlösung oder verdünntem wässrigen Ammoniak sowie die oben erwähnte Säurebehandlung in Gegenwart von 1,4-Ethandithiol, 1,4-Butandithiol eliminiert werden kann.
Das Verfahren zum Schutz von funktionellen Gruppen, die an der Reaktion des Ausgangsstoffs nicht teilnehmen sollten, die verwendbaren Schutzgruppen, das Verfahren zur Entfernung der Schutzgruppen und das Verfahren zur Aktivierung der funktionellen Gruppen, die an der Reaktion teilnehmen sollen, können alle zweckmäßig aus den bekannten Gruppen und Verfahren ausgewählt werden.
Ein weiteres Verfahren zum Erhalt der Amidform des Polypeptids umfasst zuerst die Amidierung der α-Carboxylgruppe der Aminosäure am C-Terminal, dann die Erweiterung der Peptidkette auf der N-Seite bis zur gewünschten Kettenlänge und dann das selektive Entschützen der α-Aminogruppe des C-Terminal-Peptids und der α-Carboxygruppe der Aminosäure oder des Peptids, das den Rest des Ziel-Polypeptids bilden soll, und das Kondensieren der beiden Fragmente, deren α-Aminogruppe und funktionellen Seitenketten-Gruppen mit geeigneten, oben erwähnten Schutzgruppen geschützt worden waren, in einem Lösungsmittelgemisch wie demjenigen, das oben beschrieben worden ist. Die Parameter dieser Kondensationsreaktion können dieselben sein, die oben beschrieben wurden. Aus dem mittels Kondensation erhaltenen geschützten Peptid können alle Schutzgruppen durch das oben beschriebene Verfahren entfernt werden, wodurch das gewünschte rohe Peptid erhalten wird. Dieses rohe Peptid kann durch bekannte Reinigungsverfahren gereinigt werden, und die Hauptfraktion kann lyophilisiert werden, wodurch das amidierte Ziel-Polypeptid erhalten wird.
Um einen Ester des Polypeptids zu erhalten, wird die α-Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure mit einem gewünschten Alkohol kondensiert, wodurch ein Aminosäureester erhalten wird, und dann folgt das oben beschriebene Verfahren zur Erzeugung des Amids.
Das Teilpeptid des Liganden-Polypeptids der vorliegenden Erfindung, sein Amid oder Ester oder ein Salz davon können jedes beliebige Peptid sein, das dieselben Wirkungen hat, z.B. eine die Hypophysenfunktion modulierende Wirkung, eine die Funktion des zentralen Nervensystems modulierende Wirkung oder eine die Pankreasfunktion modulierende Wirkung wie das Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 73 oder dessen substantielles Äquivalent. Als solche Peptide können Peptide erwähnt werden, bei denen 1 bis 15 Aminosäurereste aus der oben erwähnten Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 73 eliminiert sind. Insbesondere können das Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die der 2. bis 21. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 73 entspricht, das Peptid, das der 3. bis 21. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 73 entspricht, das Peptid, das der 4. bis 21. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 73 entspricht, das Peptid, das der 5. bis 21. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 73 entspricht, das Peptid, das der 6. bis 21. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 73 entspricht, das Peptid, das der 7. bis 21. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 73 entspricht, das Peptid, das der B. bis 21. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 73 entspricht, das Peptid, das der 9. bis 21. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 73 entspricht, das Peptid, das der 10. bis 21. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 73 entspricht, das Peptid, das der 11. bis 21. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 73 entspricht, das Peptid, das der 12. bis 21. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 73 entspricht, das Peptid, das der 13. bis 21. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 73 entspricht, das Peptid, das der 14. bis 21. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 73 entspricht, und das Peptid, das der 15. bis 21. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 73 entspricht, können als bevorzugte Beispiele erwähnt werden. Darüber hinaus ist das Peptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 74 auch bevorzugt.
Das Liganden-Polypeptid oder ein Teilpeptid davon kann als Antigen zur Herstellung eines Anti-Liganden-Polypeptid-Antikörpers verwendet werden. Das Polypeptid als Antigen umfasst N-Terminus-Peptide, C-Terminus-Peptide oder Peptide von mittleren, von den oben erwähnten Liganden-Polypeptiden oder Teilpeptiden davon verschiedenen Teilen. Insbesondere umfasst es das Teilpeptid von SEQ ID Nr. 92, 93 oder 94.
Das Teilpeptid kann ein Peptid sein, das jede der Domänen enthält, oder es kann ein Peptid sein, das eine Mehrzahl der Domänen innerhalb des Moleküls enthält.
Das in dieser Beschreibung erwähnte Teilpeptid kann eines sein, das mit einer Amidbindung (-CONH₂) oder einer Esterbindung (-COOR) am C-Terminus endet. Der Ester umfasst hier dasselbe obige Polypeptid. Wenn das Teilpeptid eine Carboxyl- oder Carboxylatgruppe in einer beliebigen, vom C-Terminus verschiedenen Position hat, fällt derjenige Fall, in dem eine solche Gruppe oder ein solcher Rest amidiert oder verestert wurde, auch in den Rahmen des Teilpeptids der vorliegenden Erfindung. Der Ester kann hier derselbe wie der oben erwähnte Ester am C-Terminus sein.
Das Liganden-Polypeptid oder dessen Teilpeptid der vorliegenden Erfindung kann in Form eines Fusionsproteins vorliegen, das mit einem Protein, dessen Funktionen oder Eigenschaften bereits bekannt sind, fusioniert werden.
Das Salz eines solchen Teilpeptids des Liganden-Polypeptids der vorliegenden Erfindung kann dasselbe wie das oben erwähnte Salz des Polypeptids sein.
Das Teilpeptid des Liganden-Polypeptids der Erfindung, sein Amid oder Ester oder ein Salz davon können durch dieselben Syntheseverfahren wie diejenigen, die für das Polypeptid erwähnt wurden, oder durch eine Spaltung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung mit einer geeigneten Peptidase hergestellt werden.
Die für das Liganden-Polypeptid oder ein Teilpeptid davon der vorliegenden Erfindung codierende DNA kann jede beliebige DNA sein, die die Nucleotidsequenz umfasst, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 73 oder dessen substantielles Äquivalent codiert.
Weiterhin kann die DNA eine beliebige genomische DNA, genomische DNA-Bank, von Gewebe oder Zellen stammende cDNA, von Gewebe oder Zellen stammende cDNA-Bank und synthetische DNA sein. Der Vektor für eine solche Bank kann ein beliebiger Bakteriophage, ein beliebiges Plasmid, Cosmid und Phagemid sein. Darüber hinaus kann sie mittels des RT-PCR-Verfahrens unter Verwendung einer RNA-Fraktion, die aus einem Gewebe oder Zellen hergestellt ist, direkt amplifiziert werden.
Insbesondere kann als DNA, die für ein Polypeptid codiert, das vom ganzen Rattengehirn oder vom Rinder-Hypothalamus stammt und die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 4 umfasst, diejenige DNA veranschaulicht werden, die die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 umfasst. In SEQ ID Nr. 2 stellt R an der 129. Position G oder A dar, und Y an der 179. und 240. Position stellt C oder T dar. Wenn Y an der 179. Position C ist, wird die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 codiert, und wenn Y an der 179. Position T ist, wird die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 44 codiert.
Als DNA, die für ein vom Rind stammendes Polypeptid, das die SEQ ID Nr. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 umfassende Aminosäuresequenz codiert, kann eine DNA veranschaulicht werden, die die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 11, 12, 13, 14, 15, 16 17 oder 18 umfasst. Hier stellen R an der 63. Position von SEQ ID Nr. 11, 13, 14 oder 15 und R an der 29. Position von SEQ ID Nr. 12, 16, 17 oder 18 G oder A dar.
Als DNA, die für ein von der Ratte stammendes Polypeptid mit SEQ ID Nr. 45, 47, 48, 49, 50, 51 oder 52 codiert, kann eine DNA, die die Nucleotidsequenz von SEQ ID Nr. 46, 53, 54, 55, 56, 57 oder 58 umfasst, veranschaulicht werden.
Weiterhin kann als DNA, die für ein vom Menschen stammendes Peptid mit SEQ ID Nr. 59, 61, 62, 63, 64, 65 oder 66 codiert, eine DNA, die die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 60, 67, 68, 69, 70, 71 oder 72 umfasst, veranschaulicht werden.
Von den DNA, die für das vom Rind stammende, die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 44 umfassende Polypeptid codiert, können das von der Ratte stammende Polypeptid, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 45 umfasst, oder das vom Menschen stammende Polypeptid, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 59 umfasst, DNA-Fragmente, die die Nucleotid-Teilsequenzen 6 bis 90, vorzugsweise 6 bis 60 und besonders bevorzugt 12 bis 30 umfassen, vorteilhaft als DNA-Sonden verwendet werden.
Die für das Liganden-Polypeptid oder ein Teilpeptid davon der vorliegenden Erfindung codierende DNA kann mittels der folgenden gentechnischen Verfahren hergestellt werden.
Die DNA, die das Polypeptid oder Teilpeptid der vorliegenden Erfindung vollständig codiert, kann entweder mittels PCR-Amplifikation unter Verwendung von synthetischen DNA-Primern mit einer Teil-Nucleotidsequenz des Polypeptids oder Teilpeptids oder mittels einer Hybridisierung unter Verwendung der DNA, die in einen geeigneten Vektor insertiert und mit einem DNA-Fragment markiert ist, das einen Teil der oder die gesamte Region eines vom Menschen stammenden Polypeptids oder einer synthetischen DNA umfasst, kloniert werden. Die Hybridisierung kann typischerweise mittels des Verfahrens erfolgen, das in Molecular Cloning (2. Auflage, J. Sambrook et al, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) beschrieben ist. Wenn eine kommerzielle Bank verwendet wird, kann die im Begleithandbuch aufgeführte Anleitung befolgt werden.
Die geklonte, für das Polypeptid oder Teilpeptid codierende DNA kann direkt oder nach einem Aufschluss mit einem Restriktionsenzym oder einer Addition eines Linkers in Abhängigkeit vom Zweck verwendet werden. Diese DNA weist ATG als Translations-Initiierungscodon am 5'-Ende auf und kann TAA, TGA oder TAG als Terminationscodon am 3'-Ende haben. Das Translations-Initiierungs- und das Terminationscodon können mittels geeigneter DNA-Adapter addiert werden.
Ein Expressionsvektor für das Polypeptid oder Teilpeptid kann hergestellt werden, indem beispielsweise (a) ein Ziel-DNA-Fragment, das von der DNA für das Polypeptid oder Teilpeptid der vorliegenden Erfindung verschieden ist, ausgeschnitten wird und (b) das Ziel-DNA-Fragment mit der Stromabwärts-Seite eines Promotors in einem geeigneten Expressionsvektor ligasiert wird.
Der Vektor kann Plasmide, die von Escherichia coli, z.B. pBR322, pBR325, pUC12, pUC13 etc., stammen, Plasmide, die von Bacillus subtilis, z.B. pUB110, pTP5, pC194 etc., stammen, Plasmide, die von Hefen, z.B. pSH19, pSH15 etc., stammen, Bakteriophagen wie den λ-Phagen und ein tierisches Virus wie ein Retrovirus, Vakzinvirus und ein Baculovirus einschließen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiger Promotor verwendet werden, sofern er mit der zur Expression eines Gens verwendeten Wirtszelle verträglich ist. Wenn der Wirt für die Transformation E. coli ist, sind die Promotoren vorzugsweise trp-Promotoren, lac-Promotoren, recA-Promotoren, λ_PL-Promotoren, lpp-Promotoren etc. Wenn der Wirt für die Transformation Bacillus ist, sind die Promotoren vorzugsweise SPO1-Promotoren, SPO2-Promotoren, penP-Promotoren etc. Wenn der Wirt eine Hefe ist, sind die Promotoren vorzugsweise PHO5-Promotoren, PGK-Promotoren, GAP-Promotoren, ADH-Promotoren etc. Wenn der Wirt eine Tierzelle ist, umfassen die Promotoren von SV40 stammende Promotoren, Retrovirus-Promotoren, Metallothionein-Promotoren, Hitzeschock-Promotoren, Cytomegalovirus-(CMV-)Promotoren, SRα-Promotoren etc. Zur Expression kann ein Enhancer effektiv verwendet werden.
Nach Bedarf kann weiterhin eine wirtskompatible Signalsequenz an der N-terminalen Seite des Polypeptids oder eines Teilpeptids davon addiert werden. Wenn der Wirt E. coli ist, können die verwendbaren Signalsequenzen alkalische Phosphatase-Signalsequenzen, OmpA-Signalsequenzen etc. einschließen. Wenn der Wirt Bacillus ist, können sie α-Amylase-Signalsequenzen, Subtilisin-Signalsequenzen etc. einschließen. Wenn der Wirt eine Hefe ist, können sie Paarungsfaktor-α-Signalsequenzen, Invertase-Signalsequenzen etc. einschließen. Wenn der Wirt eine tierische Zelle ist, können sie Insulin-Signalsequenzen, α-Interteron-Signalsequenzen, Antikörpermolekül-Signalsequenzen etc. einschließen.
Eine Transformante oder ein Transfektant wird erzeugt, indem der so konstruierte Vektor, der die das Polypeptid oder das Teilpeptid codierende DNA der vorliegenden Erfindung trägt, verwendet wird. Beim Wirt kann es sich beispielsweise um Escherichia-Mikroorganismen, Bacillus-Mikro- organismen, Hefen, Insektenzellen, Tierzellen etc. handeln. Beispiele für die Escherichia- und Bacillus-Mikroorganismen umfassen Escherichia coli K12·DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acid Research, Band 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology, Band 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, Band 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, Band 39, 440 (1954)] etc. Beispiele für den Bacillus-Mikroorganismus sind beispielsweise Bacillus subtilis MI114 [Gene, Band 24, 255 (1983)], 207–21 [Journal of Biochemistry, Band 95, 76 (1984)] etc.
Bei der Hefe kann es sich beispielsweise um Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R^–, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12 etc. handeln. Beim Insekt kann es sich um eine Seidenraupe (Bombyx-mori-Larve) [Maeda et al., Nature, Band 315, 592 (1985)] etc. handeln. Bei der tierischen Wirtszelle kann es sich beispielsweise um die vom Affen stammende Zelllinie COS-7, Vero, Eierstock-Zelllinie des chinesischen Hamsters (CHO-Zelle), die hinsichtlich des DHFR-Gens defiziente Zelllinie des chinesischen Hamsters (dhfr^–CHO-Zelle), die Maus-L-Zelle, die Mausmyelom-Zelle, humanes FL etc. handeln.
In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle erfolgt die Transformation unter Verwendung von Standardtechniken, die für solche Zellen zweckmäßig sind. Die Transformation von Echerichia-Mikroorganismen kann nach Methoden erfolgen, die beispielsweise in Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Band 69, 2110 (1972), Gene, Band 17, 107 (1982) etc. offenbart sind. die Transformation von Bacillus-Mikroorganismen kann nach Methoden erfolgen, die beispielsweise in Molecular & General Genetics, Band 168, 111 (1979) etc. offenbart sind. Die Transformation der Hefe kann nach Verfahren erfolgen, die beispielsweise in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 75, 1929 (1978) etc. offenbart sind. Die Insektenzellen können nach Methoden transformiert werden, die beispielsweise in Bio/Technology, 6, 47–55, 1988, offenbart sind. Die Tierzellen können durch Methoden transformiert werden, die beispielsweise in Virology, Band 52, 456, 1973, etc. offenbart sind. Die Transformanten oder Transfektanten, bei denen der Expressionsvektor, der ein Polypeptid oder ein Teilpeptid davon trägt, DNA codierende beherbergt, werden nach den oben erwähnten Techniken hergestellt.
Eine Kultivierung der Transformanten (oder des Transfektanten), wobei der Wirt Escherichia- oder Bacillus-Mikroorganismen sind, kann in einem flüssigen Kulturmedium zweckmäßig durchgeführt werden. Das Kulturmedium kann Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Mineralien etc., die zum Züchten der Transformanten erforderlich sind, enthalten. Die Kohlenstoffquelle kann Glucose, Dextrin, lösliche Stärke, Saccharose etc. einschließen. Die Stickstoffquelle kann organische oder anorganische Substanzen wie Ammoniumsalze, Nitrasen, Maisquellwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakte, Bohnenkuchen, Kartoffelextrakte etc. einschließen. Beispiele für die Mineralien können Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat, Magnesiumchlorid etc. einschließen. Weiterhin ist es zulässig, Hefen, Vitamine, wachstumsfördernde Faktoren etc. zuzugeben. Es ist erwünscht, dass das Kulturmedium einen pH-Wert von etwa 5 bis etwa 8 hat.
Beim Kulturmedium für Escherichia-Mikroorganismen handelt es sich vorzugsweise um ein M9-Medium, das zum Beispiel Glucose und Gasaminosäure enthält (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972). In Abhängigkeit von der Notwendigkeit kann das Medium mit Wirkstoffen wie 3β-Indolylacrylsäure supplementiert werden, um die Effizienz des Promotors zu verbessern. Im Fall eines Escherichia-Wirtes erfolgt die Kultivierung gewöhnlich bei etwa 15 bis 43°C für etwa 3 bis 24 h. Bei Bedarf können eine Belüftung und ein Rühren angewandt werden. Im Fall des Bacillus-Wirts erfolgt die Kultivierung gewöhnlich bei etwa 30 bis 40°C für etwa 6 bis 24 h. Bei Bedarf können auch eine Belüftung und ein Rühren angewandt werden. Im Fall der Transformanten, bei der der Wirt eine Hefe ist, kann das verwendete Kulturmedium beispielsweise ein Burkholder-Minimum-Medium [Bostian, K. L. et al., Proc Natl. Acal. Sci. USA, Band 77, 4505 (1980)], ein SD-Medium, das 0,5% Gasaminosäure enthält [G. A. Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 81, 5330 (1984)] etc. sein. Es ist bevorzugt, dass der pH-Wert des Kulturme diums auf etwa 5 bis etwa 8 eingestellt wird. Die Kultivierung wird gewöhnlich bei etwa 20 bis 35°C für etwa 24 bis 72 h durchgeführt. Bei Bedarf können eine Belüftung und ein Rühren angewandt werden. Im Fall einer Transformanten, bei der der Wirt ein Insekt ist, kann das verwendete Kulturmedium diejenigen einschließen, die durch eine zweckmäßige Zugabe von Additiven wie einem passivierten (oder immobilisierten) 10%igen Rinderserum und dergleichen zu Grace-Insektenmedium (T. C. C. Grace, Nature, 195, 788 (1962)) einschließen. Es ist bevorzugt, dass der pH-Wert des Kulturmediums auf etwa 6,2 bis 6,4 eingestellt wird. Die Kultivierung wird gewöhnlich bei etwa 27°C für etwa 3 bis 5 Tage durchgeführt. Bei Bedarf können eine Belüftung und ein Rühren angewandt werden. Im Fall der Transformanten, bei der der Wirt eine Tierzelle ist, kann das verwendete Kulturmedium MEM-Medium [Science, Band 122, 501 (1952)], DMEM-Medium [Virology, Band 8, 396 (1959)], RPMI-1640-Medium [Journal of the American Medical Association, Band 199, 519 (1967)], 199-Medium [Proceedings of the Society of the Biological Medicine, Band 73, 1 (1950)], etc., die zum Beispiel etwa 5 bis 20% fötales Kalbserum enthalten, einschließen. Es ist bevorzugt, dass der pH-Wert etwa 6 bis etwa 8 beträgt. Die Kultivierung erfolgt gewöhnlich bei etwa 30 bis 40°C für etwa 15 bis 60 h. Bei Bedarf können ein Medienersatz, eine Belüftung und ein Rühren angewandt werden.
Die Abtrennung und Reinigung des Polypeptids oder Teilpeptids aus den oben erwähnten Kulturen kann gemäß der hier unten beschriebenen Verfahren erfolgen.
Zum Extrahieren eines Polypeptids oder Teilpeptids aus den kultivierten Mikroorganismen oder Zellen werden die Mikroorganismen oder Zellen durch bekannte Verfahren nach der Kultivierung isoliert, in einer geeigneten Pufferlösung suspendiert, mit Ultraschallwellen, Lysozym und/oder Gefrieren und Auftauen etc. zerstört, und dann wird ein rohes Extrakt des Polypeptids oder Teilpeptids durch Zentrifugation oder Filtration erhalten. Andere herkömmliche Extraktions- oder Isolierungsverfahren können angewandt werden. Die Pufferlösung kann ein Protein-Denaturierungsmittel wie Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid oder ein Tensid wie Triton X-100 (registrierte Marke, hiernach oft als "TM" bezeichnet) enthalten.
In demjenigen Fall, in dem das Polypeptid oder Teilpeptid in Kulturmedien sezerniert werden, werden überstehende Flüssigkeiten nach Beendigung der Kultivierung von den Mikroorganismen oder Zellen abgetrennt, und die resultierende überstehende Flüssigkeit wird durch weithin bekannte Verfahren isoliert. Die überstehende Kulturflüssigkeit und der Extrakt, die das Polypeptid oder das Teilpeptid enthalten, können durch geeignete Kombinationen von weithin bekannten Verfahren zur Abtrennung, Isolierung und Reinigung gereinigt werden. Die weithin bekannten Verfahren zur Abtrennung, Isolierung und Reinigung können Verfahren einschließen, bei denen die Löslichkeit ausgenutzt wird, wie ein Aussalzen oder eine Sedimentierung, Lösungsmittelverfahren, bei denen kurzgefasst ein Unterschied der Molmasse oder des Molekulargewichts ausgenutzt wird, wie die Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und die Gelelektrophorese an SDS-Polyacrylamid, Verfahren, bei denen ein Unterschied der elektrischen Ladung ausgenutzt wird, wie die Ionenaustausch-Chromatographie, Verfahren, bei denen eine spezielle Affinität ausgenutzt wird, wie die Affinitätschromatographie, Verfahren, bei denen ein Unterschied der hydrophoben Eigenschaft ausgenutzt wird, wie die Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie, und Verfahren, bei denen ein Unterschied des isoelektrischen Punktes ausgenutzt wird, wie die isoelektrische Elektrophorese oder die Chromatofokussierung etc.
In Fällen, in denen das so erhaltene Polypeptid oder Teilpeptid in der freien Form vorliegt, kann das freie Protein durch bekannte Verfahren oder dazu analoge Verfahren in sein Salz umgewandelt werden. In demjenigen Fall, in dem das so erhaltene Polypeptid oder Teilpeptid umgekehrt in Salzform vorliegt, kann das Proteinsalz durch bekannte Verfahren und dazu analoge Verfahren in die freie Form oder in ein anderes Salz umgewandelt werden.
Das von der Transformanten erzeugte Polypeptid oder Teilpeptid kann willkürlich modifiziert werden, oder ein Polypeptid kann durch die Einwirkung eines geeigneten proteinmodifizierenden Enzyms vor oder nach der Reinigung teilweise daraus entfernt werden, Das proteinmodifizierende Enzym kann Trypsin, Chymotrypsin, Arginylendopeptidase, Proteinkinase, Glycosidase etc. einschließen. Die Aktivität des so gebildeten Polypeptids oder Teilpeptids kann gemessen werden, indem die Kopplung (oder Bindung) mit einem Rezeptor experimentiert wird, oder durch Enzym-Immunoassays (enzymgebundene Immunoassays), bei denen spezielle Antikörper verwendet werden.
Die DNA, die für das Liganden-Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, das Liganden-Polypeptid oder ein Teilpeptid davon können zur (1) Synthese eines Teils oder der gesamten Länge des Liganden für ein G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein, (2) Suche nach den physiologischen Wirkungen des Liganden-Polypeptids oder von dessen Teilpeptid der vorliegenden Erfindung, (3) Herstellung einer synthetischen Oligonucleotid-Sonde oder eines PCR-Primers, (4) Erhalt von DNA, die für Liganden von G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteinen und Vorstufen-Proteinen codierend sind, (5) Entwicklung von Rezeptor-Bindungs-Assaysystemen unter Verwendung der Expression von rekombinanten Rezeptorproteinen und ein Screening von Kandidaten für medizinisch wirksame Verbindungen, (6) Erhalt von Antikörpern und Antiseren, (7) Entwicklung von Diagnostika, bei denen die Antikörper oder Antiseren verwendet werden, (8) Entwicklung von Medikamenten wie Modulatoren der Hypophysenfunktion, Modulatoren der Funktion des zentralen Nervensystems und Modulatoren der Pankreasfunktion und (9) Gentherapien, unter anderen Verwendungen, verwendet werden.
Insbesondere durch die Verwendung des Rezeptor-Bindungsassay-Systems, bei dem die Expression eines rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins ausgenutzt wird, was unten beschrieben ist, können Agonisten oder Antagonisten von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die für warmblütige Tiere einschließlich Menschen spezifisch sind, gescreent werden, und solche Agonisten und Antagonisten können als Prophylaktika und Therapeutika für verschiedene Krankheiten verwendet werden.
Weiterhin ist unter Bezugnahme auf das obige (8) das Liganden-Polypeptid, ein Teilpeptid davon oder die DNA, die eine davon codiert, jeweils gemäß der vorliegenden Erfindung, als sichere pharmazeutische Zusammensetzung mit einem niedrigen toxischen Potenzial brauchbar, weil es von dem in der Hypophyse, dem zentralen Nervensystem und Pankreas-β-Zellen exprimierten G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein als Ligand erkannt wird. Das Liganden-Polypeptid, ein Teilpeptid davon oder die DNA, die eine davon codiert, jeweils gemäß der vorliegenden Erfindung, ist mit der Modulation der Hypophysenfunktion, der Funktion des zentralen Nervensystems und der Pankreasfunktion assoziiert und kann daher als therapeutische und prophylaktisches pharmazeutische Zusammensetzung für Demenzen wie die senile Demenz, die zerebrovaskuläre Demenz (Demenz aufgrund einer zerebrovaskulären Störung), einer mit phylodegenerativen retroplastischen Krankheiten zusammenhängenden Demenz (z.B. Alzheimer-Krankheit, Parkinsonsche Krankheit, Pick-Krankheit, Huntington-Krankheit etc.), Demenz aufgrund von Infektionskrankheiten (z.B. verzögerte Virusinfektionen wie die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit), Demenzen im Zusammenhang mit endokrinen, metabolischen und toxischen Krankheiten (z.B. Hypothyreoidismus, Vitamin-B12-Mangel, Alkoholismus und eine Vergiftung mit verschiedenen Medikamenten, Metallen oder organischen Verbindungen), Demenzen im Zusammenhang mit onkogenen Krankheiten (z.B. Gehirntumor), Demenzen aufgrund von traumatischen Krankheiten (z.B. chronische subdurale Hämatome), Depression (Melancholie), das hyperkinetische Syndrom (Mikroenzephalopathie), Bewusstseinsstörung, Angstsyndrom, Schizophrenie, Horror, einer Krankheit aufgrund einer Störung der Sekretion von Wachstumshormonen (z.B. Gigantismus, akromegalem Gigantismus etc.), Hyperphagie, Polyphagie, Hypercholesterinämie, Hyperglyceridämie, Hyperlipämie, Hyperprolaktinämie, Diabetes (z.B. diabetische Komplikationen, diabetische Nephropathie, diabetische Neuropathie, diabetische Retinopathie etc.), Krebs (z.B. Brustkrebs, lymphatische Leukämie, Zystenkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs etc.), Pankreatitis, eine Nierenerkrankung (z.B. chronisches Nierenversagen, Nephritis etc.), Turner-Syndrom, Neurose, Rheumatoidarthritis, eine Rückgratverletzung, transitorische Gehirnischämie, amyotrophe laterale Sklerose, aktute Myokardinfarzierung, spinozerebelläre Degeneration, einen Knochenbruch, ein Trauma, atopische Dermatitis, Osteoporose, Asthma, Epilepsie, Unfruchtbarkeit oder Oligogalaktie verwendet werden. Weiterhin können sie auch als Mittel zur Verbesserung des postoperativen Nährmittelzustands und/oder als Vasopressor verwendet werden.
Wenn das Polypeptid, ein Teilpeptid davon oder die eine davon codierende DNA der vorliegenden Erfindung als pharmazeutische Zusammensetzung wie oben beschrieben verwendet wird, kann sie durch herkömmliche Verfahren genutzt werden. Zum Beispiel kann sie oral in Form von Tabletten, die bei Bedarf zuckerbeschichtet sein können, Kapseln, Elixiere, Mikrokapseln etc., oder nichtoral in Form von injizierbaren Präparaten wie aseptischen Lösungen und Suspensionen in Wasser oder anderen pharmazeutisch annehmbaren Flüssigkeiten verwendet werden. Diese Präparate können hergestellt werden, indem das Polypeptid, ein Teilpeptid davon oder die eine davon codierende DNA mit physiologisch annehmbaren Trägern, Aromen, Trägermitteln, Hilfsstoffen, Antiseptika, Stabilisatoren, Bindemittel etc. in Formen der Dosiseinheit, die für allgemein anerkannte Arten der Herstellung von Pharmazeutika erforderlich sind, vermischt wird. Wirkstoffgehalte in diesen Präparaten sind so einzustellen, dass eine zweckmäßige Dosis innerhalb des spezifizierten Bereichs erhalten wird.
Additive, die Tabletten, Kapseln etc. zugemischt werden können, schließen Bindemittel wie Gelatine, Maisstärke, Tragacanth und Gummi arabicum, Trägermittel wie kristalline Cellulose, Quellmittel wie Maisstärke, Gelatine und Alginsäure, Gleitmittel wie Magnesiumstearat, Süßstoffe wie Saccharose, Lactose und Saccharin und Aromen wie Pfefferminz, Akamonoöl und Kirsche. Wenn die Form der Dosiseinheit die Kapsel ist, können die oben erwähnten Materialien weiterhin flüssige Träger wie Öle und Fette einschließen. Sterile Zusammensetzungen zur Injektion können mit üblichen Verfahren zur Herstellung von Pharmazeutika wie durch das Auflösen oder Suspendieren von Wirkstoffen, natürlich vorkommenden pflanzlichen Ölen wie Sesamöl und Kokosöl etc. in Hilfsstoffen wie Wasser zur Injektion formuliert werden.
Wässrige Flüssigkeiten zur Injektion schließen physiologische Kochsalzlösung und isotonische Lösungen ein, die Glucose und andere Hilfsmittel, z.B. D-Sorbit, D-Mannit und Natriumchlorid enthalten, und sie können in Kombination mit zweckmäßigen Auflösungs-Hilfsmitteln wie Alkoholen, z.B. Ethanol, Polyalkoholen, z.B. Propylenglycol und Polyethylenglycol, nichtionischen Tensiden, z.B. Polysorbat 80 (Marke) und HCO-50 etc. verwendet werden. Ölartige Flüssigkeiten umfassen Sesamöl und Sojabohnenöl und können in Kombination mit Auflösungs-Hilfsmitteln wie Benzylbenzoat und Benzylalkohol verwendet werden. Weiterhin können die oben erwähnten Materialien auch mit Puffern, z.B. Phosphatpuffer und Natriumacetatpuffer; Linderungsmitteln, z.B. Benzalkoniumchlorid, Procainhydrochlorid; Stabilisatoren, z.B. Human-Serumalbumin, Polyethylenglycol; Konservierungsmitteln, z.B. Benzylalkohol, Phenol; Antioxidanzien etc. formuliert werden. Die so hergestellte injizierbare Flüssigkeit wird normalerweise in eine zweckmäßige Ampulle abgefüllt. Weil das so erhaltene Präparat sicher ist und eine niedrige Toxizität hat, kann es Menschen oder warmblütigen Säugetieren, z.B. der Maus, Ratten, dem Meerschweinchen, Kaninchen, Hühnern, Schafen, Schweinen, Rindern, Katzen, Hunden, Affen, Paviane, Schimpansen beispielsweise, verabreicht werden.
Die Dosis des Polypeptids, eines Teilpeptids davon oder der DNA, die eines davon codiert, beträgt bei oraler Verabreichung in Abhängigkeit von den Symptomen etc. normalerweise 0,1–100 mg, vorzugsweise 1,0–50 mg und noch mehr bevorzugt 1,0–20 mg pro Tag für einen Erwachsenen (mit einem Gewicht von 60 kg). Bei nichtoraler Verabreichung ist es vorteilhaft, das Polypeptid, ein Teilpeptid davon oder der DNA, die eines davon codiert, in Form eines injizierbaren Präparats in einer täglichen Dosis von etwa 0,01–30 mg, vorzugsweise etwa 0,1–20 mg und noch mehr bevorzugt etwa 0,1–10 mg pro Verabreichung mittels einer intravenösen Injektion für einen Erwachsenen (mit einem Gewicht von 60 kg) in Abhängigkeit vom Patienten, dem Zielorgan, den Symptomen, der Verabreichungsmethode etc. zu verabreichen. Bei anderen Tierspezies können entsprechende Dosen konvertiert auf ein Gewicht von 60 kg verabreicht werden.
Das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein für das obige Liganden-Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiges der G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteine sein, die von verschiedenen Geweben, z.B. der Hypophyse, der Pankreas, dem Gehirn, der Niere, der Leber, der Gonade, der Thyreoidea, der Gallenblase, Knochenmark, der Nebenniere, der Haut, dem Muskel, der Lunge, dem Verdauungskanal, dem Blutgefäß, dem Herzen etc. von Menschen und anderen warmblütigen Tieren, z.B. dem Meerschweinchen, der Ratte, der Maus, dem Schwein, dem Schaf, dem Rind, dem Affen etc. stammen und eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 19, 20, 21, 22 oder 23 oder deren substantielles Äquivalent umfassen. Somit umfasst das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein der vorliegenden Erfindung zusätzlich zu Proteinen, die die SEQ ID Nr. 19, 20, 21, 22 oder 23 umfassen, diejenigen Proteine, die Aminosäuresequenzen mit einer Homologie von etwa 90–99,9% zur Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 19, 20, 21, 22 oder 23 umfassen und eine qualitativ im Wesentlichen äquivalente Wirkung zu Proteinen haben, die die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 19, 20, 21, 22 oder 23 umfassen. Die Wirkungen, die diese Proteinen haben, können eine ligandenbindende Wirkung und eine Signaltransduktionswirkung einschließen. Der Begriff "im Wesentlichen äquivalent" bedeutet, dass die Beschaffenheit der ligandenbindenden Wirkung und dergleichen äquivalent sind. Daher ist es zulässig, dass sogar Unterschiede zwischen Eigenschaften wie der Stärke der ligandenbindenden Wirkung und der Molmasse des Rezeptorproteins vorhanden sind.
Insbesondere umfassen die G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteine von der humanen Hypophyse stammende G-Protein-gekoppelte Rezeptorproteine, die die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 19 und/oder SEQ ID Nr. 20 umfassen, von der Maus-Pankreas stammende G-Protein-gekoppelte Rezeptorproteine, die die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 22 umfassen, und von Maus-Pankreas stammende G-Protein-gekoppelte Rezeptorproteine, die die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 23 umfassen. Weil die von der humanen Hypophyse stammende G-Protein-gekoppelte Rezeptorproteine, die die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 19 und/oder SEQ ID Nr. 20 umfassen, schließen sie das von der humanen Hypophyse stammende G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein ein, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 21 umfasst. Die G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteine umfassen weiterhin Proteine, bei denen 1 bis 30 Aminosäurereste, vorzugsweise 1 bis 10 Aminosäurereste, von der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 19, 20, 21, 22 oder 23 deletiert sind, Proteine, bei denen 1 bis 30 Aminosäurereste, vorzugsweise 1 bis 10 Aminosäurereste, zur Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 19, 20, 21, 22 oder 23 addiert sind, diejenigen Proteine, bei denen 1 bis 30 Aminosäurereste, vorzugsweise 1 bis 10 Aminosäurereste in der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 19, 20, 21, 22 oder 23 durch ein oder mehrere andere Aminsäurereste ersetzt sind.
Hier enthält das Protein, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 21 oder ein substantielles Äquivalent davon umfasst, die volle Länge der Aminosäuresequenz für das von der humanen Hypophyse stammende G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein. Das Protein, das eine Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 19 oder/und SEQ ID Nr. 20 oder ein substantielles Äquivalent davon umfasst, kann ein Teilpeptid desjenigen Proteins sein, das eine Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 21 oder ein substantielles Äquivalent davon umfasst. Das Protein, das eine Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 22 oder SEQ ID Nr. 23 oder ein substantielles Äquivalent davon umfasst, ist ein G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein, das von der Mauspankreas stammt, weil aber seine Aminosäuresequenz der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 19 oder/und SEQ ID Nr. 20 ziemlich ähnlich ist (siehe Beispiel 8, insbesondere 13), wird das Protein, das eine Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 22 oder SEQ ID Nr. 23 oder ein substantielles Äquivalent davon umfasst, auch in die Kategorie des Teilpeptids des Proteins, das eine Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 21 oder ein substantielles Äquivalent davon umfasst, eingeordnet.
Somit umfasst das oben erwähnte Protein, das eine Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 21 oder ein substantielles Äquivalent davon oder ein partielles Peptid des Proteins oder ein Salz davon umfasst, das unten beschrieben wird, das Protein, das eine Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 19, 20, 22 oder 23 oder ein substantielles Äquivalent davon oder ein Salz davon umfasst.
Weiterhin umfasst das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein das Protein, bei dem das N-terminale Met mit einer Schutzgruppe, z.B. einem C_1-6-Acyl wie Formyl oder Acetyl, geschützt wurde, das Protein, bei dem die N-terminale Seite von Glu unter Bildung von Pyroglutamin in vivo gespalten wurde, das Protein, bei dem die Seitenkette einer beliebigen relevanten, einen Bestandteil bildenden Aminosäure mit einer geeigneten Schutzgruppe, z.B. einem C_1-6-Acyl wie Formyl oder Acetyl, geschützt wurde, und ein komplexes Protein wie Glycoproteine, das durch eine Bindung von Zuckerketten erhältlich ist.
Das Salz des G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins umfasst dieselben Arten von Salzen, die für das Liganden-Polypeptid erwähnt wurden.
Das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein oder ein Salz oder ein Teilpeptid davon kann aus den Geweben oder Zellen von Menschen oder anderen warmblütigen Tieren durch die als solche bekannte Reinigungstechnik oder – wie oben beschrieben – durch das Kultivieren einer Transformanten, die eine DNA trägt, die für das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein codierend ist, hergestellt werden. Es kann auch gemäß den oben beschriebenen Verfahren zur Peptidsynthese hergestellt werden.
Ein Teilpeptid des G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins kann zum Beispiel ein Fragment einschließen, das einen extrazellulären Teil des G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins enthält, d.h. diejenige Stelle, die außerhalb der Zellmembranen frei liegt. Beispiele für das Teilpeptid sind Fragmente, die eine Region enthalten, bei der es sich um einen extrazellulären Bereich (hydrophile Region) handelt, der in einer graphischen Hydrophobieanalyse des G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins wie denjenigen, die in 3, 4, 8, 11 oder 14 dargestellt sind, analysiert wird. Weiterhin kann auch ein Fragment verwendet werden, das teilweise eine hydrophobe Region enthält. Während Peptide, die jede Domäne getrennt enthalten, auch verwendet werden können, können Peptide, die mehrere Domänen gleichzeitig enthalten, auch verwendet werden.
Das Salz eines Teilpeptids des G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins kann dasselbe Salz sein, das für das Salz des Liganden-Polypeptids erwähnt wurde.
Die für das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein codierende DNA kann eine beliebige DNA sein, die eine Nucleotidsequenz einschließt, die das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein codiert, das eine Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 19, 20, 21, 22 oder 23 oder ein substantielles Äquivalent dazu umfasst. Sie kann auch eine beliebige genomische DNA, genomische DNA-Bank, von Gewebe oder Zellen stammende cDNA, von Gewebe oder Zellen stammende cDNA-Bank und beliebige eine synthetische DNA sein. Der Vektor für eine solche Bank kann einen Bakteriophagen, ein Plasmid, ein Cosmid und ein Phagemid einschließen. Weiterhin kann eine direkte Amplifizierung unter Verwendung einer aus einem Gewebe oder Zellen hergestellten RNA-Fraktion mittels des RT-PCR-Verfahrens durchgeführt werden.
Insbesondere umfasst die DNA, die das von der humanen Hypophyse stammende G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein codiert, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 19 umfasst, eine DNA, die die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 24 umfasst. Die DNA, die das von der humanen Hypophyse stammende G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein codiert, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 20 umfasst, schließt eine DNA ein, die die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 25 umfasst. Die DNA, die das von der humanen Hypophyse stammende G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein codiert, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 21 umfasst, schließt eine DNA ein, die die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 26 umfasst. Die DNA, die das von der Maus-Pankreas stammende G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein codiert, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 22 umfasst, schließt eine DNA ein, die die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 27 umfasst. Die DNA, die das von der Maus-Pankreas stammende G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein codiert, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 23 umfasst, schließt eine DNA ein, die die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 28 umfasst.
Ein Verfahren zum Klonen der DNA, die für das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein vollständig codiert, ein Vektor, Promotor, eine Wirtszelle, ein Transformationsverfahren, ein Verfahren zum Kultivieren der Transformanten oder ein Verfahren zur Trennung und Reinigung des G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins kann dasselbe wie dasjenige einschließen, das für das Liganden-Polypeptid erwähnt wurde.
Insbesondere wird das Plasmid phGR3, das im unten beschriebenen Beispiel 5 erhalten wird, mit dem Restriktionsenzym SalI aufgeschlossen, und der Translationsrahmen für die hGR3 codierende cDNA mit voller Länge wird isoliert. Dieser Rahmen wird einer Ligasierung beispielsweise an den Expressionsvektor pAKKO-111 zur Verwendung mit tierischen Zellen, der nach dem Aufschluss mit SalI zur Verhinderung einer Autocyclisierung mit BAP (bakterielle alkalische Phosphatase) behandelt worden war, unterzogen. Nach Vervollständigung der Ligationsreaktion wird ein Teil der Reaktionsmischung zur Transfektion beispielsweise von Escherichia coli DH5 verwendet. Von den erhaltenen Transformanten wird eine Transformante, bei der die für hGR3 codierende cDNA in Vorwärtsrichtung in Bezug auf einen Promotor wie SRα, der zuvor in den Expressionsvektor eingeführt wurde, eingeführt worden ist, durch eine Kartierung nach einer Spaltung mit Restriktionsenzymen oder mittels einer Nucleotid-Sequenzierung ausgewählt, und die Plasmid-DNA wird im Produktionsmaßstab hergestellt.
Die so konstruierte DNA des Expressionsvektors wird in CHO-dhfr^–-Zellen eingeführt, wobei ein Kit zur Einführung eines Gens in tierische Zellen mittels des Calciumphosphat-Verfahrens, des Liposomenverfahrens oder dergleichen verwendet wird, wodurch eine hohe G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein-(hGR3-) Expressions-CHO-Zelllinie erhalten wird.
Die resultierenden CHO-Zellen werden in einem nucleinsäurefreien Screening-Mediumin einem CO₂-Inkubator bei 37°C unter Verwendung von 5%igem CO₂ 1 bis 4 Tage lang kultiviert, wodurch das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein (hGR3) erhalten wird.
Das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein wird von den obigen CHO-Zellen unter Verwendung einer Affinitätssäule gereinigt, die hergestellt wird, indem ein Antikörper für das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein oder ein Teilpeptid davon an einen Träger oder eine Affinitätssäule, die durch das Konjugieren eines Liganden für das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein hergestellt wird, konjugiert wird.
Die Wirkung des so gebildeten G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins kann gemessen werden, indem die Bindung mit einem Liganden oder durch Enzym-Immunoassays unter Verwendung von spezifischen Antikörpern untersucht wird.
Das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein, das Teilpeptid davon und die das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein codierende DNA können wie folgt verwendet werden:

1) zur Bestimmung eines Liganden für das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein,
2) zum Erhalt eines Antikörpers und eines Antiserums,
3) zur Konstruktion eines Systems zum Exprimieren eines rekombinanten Rezeptorproteins,
4) zur Entwicklung eines rezeptorbindenden Assaysystems unter Verwendung des obigen Entwicklungssystems und durch das Screening von pharmazeutischen Kandidaten für Verbindungen,
5) zur Konstruktion von Medikamenten durch Vergleich mit Liganden und Rezeptoren, die eine ähnliche oder eine analoge Struktur haben,
6) zur Herstellung einer Sonde zur Analyse von Genen und zur Herstellung eines PCR-Primers,
7) zur Genmanipulationstherapie.

Insbesondere ist es möglich, einen G-Protein-gekoppelten Rezeptoragonisten oder einen Antagonisten, der für ein warmblütiges Tier wie den Menschen spezifisch ist, mit einem rezeptorbindenden Assaysystem zu screenen, bei dem ein System zum Exprimieren eines rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins verwendet wird. Der so gescreente oder charakterisierte Agonist oder Antagonist ermöglicht verschiedene Anwendungen einschließlich der Prävention und/oder Therapie einer Vielzahl von Krankheiten.
Unten sind Verwendungen des Liganden-Polypeptids der vorliegenden Erfindung, von G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteinen für das Liganden-Polypeptid, von Liganden-Polypeptide codierenden DNA, von G-Protein-gekoppelte Rezeptorproteine codierenden DNA und von deren Antikörpern beschrieben.
(1) Verfahren zur Bestimmung eines Liganden für das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein
Das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein, das Teilpeptid davon oder ein Salz davon ist als Reagenz zur Untersuchung oder Bestimmung eines Liganden für das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein brauchbar.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Bestimmung eines Liganden für ein G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein, umfassend das In-Kontakt-Bringen des G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins oder eines Teilpeptids davon mit der zu testenden Verbindung und das Messen des Bindungsumfangs, der zellstimulierenden Wirkung etc. der Testverbindung gegenüber dem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein oder einem Teilprotein davon verfügbar gemacht.
Die zu testende Verbindung kann nicht nur bekannte Liganden wie Angiotensine, Bombesine, Canavinoide, Cholecystokinine, Glutamin, Serotonin, Mela tonine, Neuropeptide Y, Opioide, Purin, Vasopressine, Oxytocine, VIP (vasoaktive intestinale und verwandte Peptide), Somatostatine, Dopamin, Motiline, Amyline, Bradykinine, CGRP (Calcitonin Gene-Related Peptides), Leukotriene, Pankreastatine, Prostaglandine, Thromboxane, Adenosin, Adrenalin, α- und β-Chemokine wie IL-8, GROα, GORβ, GROγ, NAP-2, ENA-78, PF4, IP10, GCP-2, MCP-1, HC14, MCP-3, I-309, NIP1α, MIP-1β, RANTES etc.; Endotheline, Enterogastrine, Histamin, Neurotensine, TRH, Pankreas-Polypeptide, Galanin, modifizierte Derivate davon, Analoga davon, Familienmitglieder davon und dergleichen, aber auch Gewebeextrakte, Zellkultur-Überstände etc. des Menschen und von warmblütigen Tieren wie Mäusen, Ratten, Schweinen, Rindern, Schafen und Affen etc. einschließen. Zum Beispiel werden der Gewebeextrakt, der Zellkultur-Überstand etc. zum G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein gegeben, um die zellstimulierende Wirkung etc. zu messen, und unter Bezugnahme auf die Messungen fraktioniert, woraufhin ein einzelner Ligand schließlich bestimmt und erhalten werden kann.
In einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren zur Bestimmung des Liganden ein Verfahren zur Bestimmung davon, ob eine Probe (die eine Verbindung oder ein Salz davon einschließt) dazu fähig ist, eine Zielzelle zu stimulieren, wobei das Verfahren das Verbinden der Verbindung mit dem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein entweder in Gegenwart des G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins, eines Teilpeptids davon oder eines Salzes davon, oder durch ein Rezeptorbindungs-Assaysystem, bei dem das Expressionssystem für das rekombinante Rezeptorprotein konstruiert und verwendet wird, und das Messen der durch den Rezeptor vermittelten zellstimulierenden Wirkung etc. einschließt. Beispiele für die zellstimulierenden Wirkungen, die gemessen werden können, umfassen die Förderung oder Hemmung von biologischen Reaktionen, z.B. eine Freisetzung von Arachidonsäure, Freisetzung von Acetylcholin, Freisetzung von endozellulärem Ca²⁺, Erzeugung von endozellulärem cAMP, Erzeugung von endozellulärem cGMP, Erzeugung von Inositphosphat, eine Änderung des Potenzials der Zellmembran, eine Phosphorylierung von endozellulärem Protein, Aktivierung von c-fos, Absenkung des pH-Wertes etc. und vorzugsweise eine Freisetzung von Arachidonsäure. Beispiele für die Verbindung oder ein Salz davon, die zur Stimulierung der Zelle über eine Verbindung mit dem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein fähig sind, umfassen Peptide, Proteine, nichtpeptidische Verbindungen, synthetische Verbindungen, fermentierte Produkte etc.
In spezielleren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen die Verfahren zum Screening und zur Identifizierung eines Liganden Folgendes:

1) ein Verfahren zum Screening nach einem Liganden für ein G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein, umfassend das In-Kontakt-Bringen einer markierten Testverbindung mit einem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein oder einem Salz davon oder einem Teilpeptid oder einem Salz davon und das Messen der Menge der markierten Testverbindung, die sich mit dem Protein oder dem Salz davon oder mit dem Teilpeptid oder dem Salz davon verbindet;
2) ein Verfahren zum Screening nach einem Liganden für ein G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein, umfassend das In-Kontakt-Bringen einer markierten Testverbindung mit Zellen, die das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein enthalten, oder mit der Membranfraktion der Zelle und das Messen der Menge der markierten Testverbindung, die sich mit den Zellen oder der Membranfraktion verbindet;
3) ein Verfahren zum Screening nach einem Liganden für ein G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein, umfassend das In-Kontakt-Bringen einer markierten Testverbindung mit einem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein, das auf Zellmembranen exprimiert wird, durch das Kultivieren von Transformanten, die die das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein codierende DNA tragen, und das Messen der Menge der markierten Testverbindung, die sich mit dem G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein verbindet;
4) ein Verfahren zum Screening nach einem Liganden für ein G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein, umfassend das In-Kontakt-Bringen einer Testverbindung mit Zellen, die das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein enthalten, und das Messen der zellstimulierenden Wirkung, z.B. der fördernden oder hemmenden Wirkung auf biologische Reaktionen wie die Freisetzung von Arachidonsäure, die Freisetzung von Acetylcholin, die Freisetzung von endozellulärem Ca²⁺, die Erzeugung von endozellulärem cAMP, die Erzeugung von endozellulärem cGMP, die Erzeugung von Inositphosphat, Änderungen des Potenzials der Zellmembran, eine Phosphorylierung von endozellulärem Protein, eine Aktivierung von c-fos, eine Absenkung des pH-Wertes etc. über das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein und
5) ein Verfahren zum Screening nach einem Liganden für das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein, umfassend das In-Kontakt-Bringen einer Testverbindung mit dem auf der Zellmembran exprimierten G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein durch das Kultivieren von Transformanten, die die das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein codierende DNA tragen, und das Messen wenigstens einer zellstimulierenden Wirkung, z.B. einer Wirkung auf die Förderung oder Hemmung von physiologischen Reaktionen wie die Freisetzung von Arachidonsäure, die Freisetzung von Acetylcholin, die Freisetzung von endozellulärem Ca²⁺, die Erzeugung von endozellulärem cAMP, die Erzeugung von endozellulärem cGMP, die Erzeugung von Inositphosphat, Änderungen des Potenzials der Zellmembran, eine Phosphorylierung von endozellulärem Protein, eine Aktivierung von c-fos, eine Absenkung des pH-Wertes etc. über das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein.

Unten sind spezielle Veranschaulichungen des Verfahrens zum Screening und zur Identifizierung von Liganden beschrieben.
Zuerst kann das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein, das zum Verfahren zur Bestimmung des Liganden verwendet wird, jedes beliebige Material einschließen, sofern dieses ein G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein, ein Teilpeptid davon oder ein Salz davon enthält, obwohl es bevorzugt ist, große Mengen der G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteine in tierischen Zellen zu exprimieren.
Bei der Herstellung des G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins kann das oben erwähnte Verfahren verwendet und ausgeführt werden, indem die das Protein codierende DNA in Säugerzellen oder in Insektenzellen exprimiert wird. Hinsichtlich des DNA-Fragments, das für eine spezielle Region wie ein extrazelluläres Epitop, die extrazellulären Domänen etc. codierend ist, kann komplementäre DNA verwendet werden, obwohl das Expressionsverfahren nicht darauf beschränkt ist. Zum Beispiel können auch Genfragmente oder synthetische DNA verwendet werden.
Zur Einführung des das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein codierenden DNA-Fragments in tierische Wirtszellen und seiner effizienten Expression ist bevorzugt, dass das DNA-Fragment auf der Stromabwärts-Seite von Polyeder-Promotoren eingearbeitet wird, die von Kernpolyederviren, die zum Baculovirus gehören, von SV40 stammenden Promotoren, vom Retrovirus stammenden Promotoren, Metallothionein-Promotoren, humanen Hitzeschock-Promotoren, Cytomegalovirus-Promotoren, SRα-Promotoren etc. stammen. Untersuchungen der Anzahl und der Qualität des exprimierten Rezeptors können mittels Verfahren, die als solche den Fachleuten bekannt sind, oder mittels dazu ähnlicher Verfahren auf der Grundlage der vorliegenden Offenbarung erfolgen. Zum Beispiel können sie mittels Verfahren erfolgen, die in Veröffentlichungen wie P. Nambi et al.: The Journal of Biochemical Society, Band 267, S. 19555–19559 (1992) beschrieben sind.
Demgemäß kann das Material, das ein G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein oder ein Teilpeptid davon enthält, hinsichtlich der Bestimmung des Liganden Produkte, die G-Protein-gekoppelte Rezeptorproteine enthalten, die mittels Verfahren, die den Fachleuten als solche bekannt sind, oder mittels dazu ähnlicher Verfahren gereinigt sind, Peptidfragmente des G-Protein- gekoppelten Rezeptorproteins, das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein enthaltende Zellen, Membranfraktionen der das Protein enthaltenden Zelle etc. einschließen.
Wenn die das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein enthaltende Zelle im Verfahren zur Bestimmung des Liganden verwendet wird, kann die Zelle mit Bindemitteln einschließlich Glutaraldehyd, Formalin etc. immobilisiert sein. Die Immobilisierung kann mittels Verfahren, die als solche den Fachleuten bekannt sind, oder mittels dazu ähnlicher Verfahren erfolgen.
Die das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein enthaltenden Zellen sind Wirtszellen, die das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein exprimieren. Beispiele für die Wirtzellen sind Mikroorganismen wie Escherichia coli, Bacillus subtilis, Hefen, Insektenzellen, Tierzellen etc.
Die Zellmembran-Fraktion ist eine an Zellmembran reiche Fraktion, die mittels Verfahren, die als solche den Fachleuten bekannt sind, oder mittels dazu ähnlicher Verfahren nach der Zerstörung von Zellen hergestellt wird. Beispiele für die Zellzerstörung können ein Verfahren zum Zusammenpressen von Zellen mittels eines Potter-Elvehjem-Homogenisators, eine Zerstörung mittels eines Waning-Mischers oder eines von Kinematica hergestellten Polytrons, eine Zerstörung mittels Ultraschallwellen, eine Zerstörung durch das Ausblasen von Zellen aus kleinen Düsen zusammen mit dem Einwirkenlassen eines Drucks unter Verwendung einer French-Presse oder dergleichen etc. einschließen. Bei der Fraktionierung der Zellmembran wird hauptsächlich ein Fraktionierungsverfahren mittels Zentrifugalkraft, wie eine fraktionierende Zentrifugaltrennung und eine Dichtegradienten-Zentrifugaltrennung, verwendet. Zum Beispiel wird zerstörte Zellflüssigkeit bei niedriger Drehzahl (500 U./min bis 3000 U./min) für einen kurzen Zeitraum (gewöhnlich etwa 1 bis 10 min lang) zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit wird weiterhin bei hoher Drehzahl (15 000 U./min bis 30 000 U./min) gewöhnlich 30 min bis 2 h lang zentrifugiert, und das resultierende Präzipitat wird als Membranfraktion verwendet. Die Membranfraktion enthält eine Charge des exprimierten G- Protein-gekoppelten Rezeptorproteins und eine Charge Membrankomponenten wie Phospholipiden und Membranproteinen, die von den Zellen stammen.
Die Menge des G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins in der Membranfraktionszelle, die das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein enthält, beträgt vorzugsweise 10³ bis 10⁸ Moleküle pro Zelle oder noch mehr bevorzugt 10⁵ bis 10⁷ Moleküle pro Zelle. Im Übrigen ist die ligandenbindende Wirkung (spezifische Wirkung) pro Membranfraktion umso höher, je größer die exprimierte Menge ist, wodurch die Konstruktion eines hochempfindlichen Screening-Systems möglich wird, und darüber hinaus ermöglicht es die Messung einer großen Probenmenge innerhalb derselben Charge.
Zur Durchführung der obigen Verfahren 1) bis 3), bei denen Liganden bestimmt werden, die zur Verbindung mit dem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein fähig sind, sind eine geeignete G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein-Fraktion und eine markierte Testverbindung erforderlich. Die G-Protein-gekoppelte Rezeptorfraktion ist vorzugsweise ein natürlich vorkommender G-Protein-gekoppelter Rezeptor (natürlicher Typ), ein rekombinanter G-Protein-gekoppelter Rezeptor mit einer Wirkung, die zu derjenigen des natürlichen Typs äquivalent ist. Hier bedeutet der Begriff "mit einer Wirkung äquivalent zu" die oben diskutierte äquivalente Ligandenbindungswirkung.
Geeignete Beispiele für die markierte Testverbindung umfassen die oben erwähnte, zu testende Verbindung, die mit [³H], [¹²⁵I], [¹⁴C], [³⁵S] etc. markiert sind.
Insbesondere erfolgt die Bestimmung von Liganden, die zur Bindung mit G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteinen fähig sind, wie folgt:
Zuerst werden Zellen oder Zellmembranfraktionen, die das G-Proteingekoppelte Rezeptorprotein enthalten, in einem für den Assay geeigneten Puffer suspendiert, um die Rezeptorprobe zur Durchführung des Verfahrens zur Bestimmung der Ligandenbindung mit dem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein durchzuführen. Der Puffer kann einen beliebigen Puffer wie einen Tris-HCl-Puffer oder Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 4–10, vorzugsweise einem pH-Wert von 6–8, einschließen, solange er die Bindung des Liganden an den Rezeptor nicht hemmt. Darüber hinaus können Tenside wie CHAPS, Tween 80^TM (Kao-Atlas, Japan), Digitonin, Deoxycholat etc. und verschiedene Proteine wie Rinderserumalbumin (BSA), Gelatine, Milchderivate etc. zum Puffer gegeben werden, um eine unspezifische Bindung zu vermindern. Weiterhin kann ein Proteaseinhibitor wie PMSF, Leupeptin, E-64 (hergestellt von Peptide Laboratory), Pepstatin etc. zugegeben werden, um eine Zersetzung des Rezeptors und des Liganden durch Protease zu hemmen. Eine Testverbindung, die mit einer vorbestimmten (oder bestimmten) Menge (5000 cpm bis 500 000 cpm) [³H], [¹²⁵I], [¹⁴C], [³⁵S] etc. markiert ist, liegt in, 0,01 ml bis 10 ml der Rezeptorlösung vor. Um die nichtspezifisch bindende Menge (NSB) zu bestimmen, wird ein Reagenzglas, in das eine große Überschussmenge der unmarkierten Testverbindung gegeben wird, ebenfalls hergestellt. Die Reaktion wird bei 0–50 °C, vorzugsweise bei 4–37 °C 20 min bis 24 h lang, vorzugsweise 30 min bis 3 h lang durchgeführt. Nach der Reaktion wird sie durch einen Glasfaserfilter oder dergleichen filtriert, mit einer zweckmäßigen Menge desselben Puffers gewaschen, und die im Glasfaserfilter verbleibende Radioaktivität wird mittels eines Flüssig-Szintillationszählers oder eines Gammazählers gemessen. Die Testverbindung, bei der die Zählung (B – NSB), die durch das Subtrahieren der nichtspezifischen bindenden Menge (NSB) von der bindenden Gesamtmenge (B) erhalten wird, mehr als 0 cpm beträgt, wird als Ligand für das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein identifiziert.
Bei der Durchführung der oben erwähnten Verfahren 4) bis 5), in denen Liganden bestimmt werden, die zur Verbindung mit dem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein fähig sind, können die zellstimulierende Wirkung, z.B. die Freisetzung von Arachidonsäure, die Freisetzung von Acetylcholin, die Freisetzung von endozellulärem Ca²⁺, die Erzeugung von endozellulärem cAMP, die Erzeugung von Inositphosphat, Änderungen des Potenzials der Zellmembran, die Phosphorylierung von endozellulärem Protein, die Aktivierung von c-fos, eine Absenkung des pH-Wertes, die Aktivierung des G-Proteins, die Zellenausbreitung etc., die vom G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein vermittelt werden, können mit bekannten Verfahren oder unter Verwendung kommerziell erhältlicher Messkits gemessen werden. Insbesondere werden G-Protein-gekoppelte Rezeptorproteine enthaltende Zellen zuerst in einer Mikrotiterplatte oder dergleichen kultiviert.
Bei der Durchführung der Bestimmung des Liganden wird vor dem Experiment mit frischem Medium oder einem geeigneten Puffer, der den Zellen gegenüber keine Toxizität aufweist, substituiert und unter geeigneten Bedingungen und für einen ausreichenden Zeitraum nach der Zugabe einer Testverbindung etc. dazu inkubiert. Dann werden die Zellen extrahiert, oder die überstehende Flüssigkeit wird isoliert, und bei jedem der Verfahren wird das resultierende Produkt bestimmt. Wenn eine Erzeugung der Substanz, z.B. von Arachidonsäure etc., die als Index für die zellstimulierende Wirkung dienen soll, aufgrund des in der Zelle enthaltenden zersetzenden Enzyms schwierig festzustellen ist, kann ein Assay durchgeführt werden, indem ein Inhibitor gegen das zersetzende Enzym zugegeben wird. Hinsichtlich der Wirkung wie einer hemmenden Wirkung gegen eine Erzeugung von cAMP kann diese als hemmende Wirkung gegen die Erzeugung der Zellen, deren wesentliche Erzeugung durch Forskolin oder dergleichen erhöht wird, nachgewiesen werden.
Der Kit, der für das Verfahren zur Bestimmung der Ligandenverbindung mit dem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein verwendet wird, umfasst ein G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein oder ein Teilpeptid davon, Zellen, die das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein enthalten, eine Membranfraktion aus den Zellen, die das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein enthalten, etc.
Beispiele für den Kit zur Bestimmung des Liganden sind wie folgt:
1. Reagenz zur Bestimmung des Liganden
1) Puffer zur Messung und Puffer zum Waschen.
Das Pufferprodukt, wobei 0,05% Rinderserumalbumin (hergestellt von Sigma) zu Hanks gepufferter Salzlösung (hergestellt von Gibco) gegeben wird.
Dieses Produkt kann durch Filtration durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm sterilisiert und bei 4°C aufbewahrt oder bei der Verwendung formuliert werden.
2) Probe des G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins.
CHO-Zellen, in denen G-Protein-gekoppelte Rezeptorproteine exprimiert werden, werden mit einer Rate von 5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung in einer Platte mit 12 Vertiefungen subkultiviert und bei 37°C in einer angefeuchteten Atmosphäre aus 5% CO₂/95% Luft zwei Tage lang kultiviert, wodurch die Probe hergestellt wird.
3) Markierte Testverbindung.
Die Verbindung, die mit kommerziell erhältlichem [³H], [¹²⁵I], [¹⁴C], [³⁵S] etc. markiert oder mittels eines geeigneten Verfahrens markiert ist.
Das im Zustand einer wässrigen Lösung vorliegende Produkt wird bei 4°C oder –20°C aufbewahrt und nach der Verwendung zur Messung mit einem Puffer auf 1 μM verdünnt. Im Fall einer kaum wasserlöslichen Testverbindung kann diese in einem organischen Lösungsmittel wie Dimethylformamid, DMSO, Methanol und dergleichen gelöst werden.
4) Nichtmarkierte Testverbindung.
Dieselbe Verbindung wie die markierte wird in einer Konzentration des 100- bis 1000-fach konzentrierten Zustands hergestellt.
2. Messmethode

1) G-Protein-gekoppelte Rezeptorproteine exprimierende CNO-Zellen, die in einer Gewebekulturplatte mit 12 Vertiefungen kultiviert sind, werden zur Messung zweimal mit 1 ml Puffer gewaschen, und dann werden zur Messung 490 μl Puffer in jede Vertiefung gegeben.
2) 5 μl der markierten Testverbindung werden zugegeben, und die Mischung wird 1 h lang bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Zur Messung der nichtspezifischen Bindungsmenge werden 5 μl der unmarkierten Testverbindung zugegeben.
3) Die Reaktionslösung wird aus jeder der Vertiefungen entfernt, die zur Messung dreimal mit 1 ml Puffer gewaschen wird. Die markierte, sich an die Zellen bindende Testverbindung wird in 0,2 N NaOH – 1% SDS gelöst und mit 4 ml eines Flüssig-Szintillators A, hergestellt von WAKO Pure Chemical, Japan, vermischt.
4) Die Messung der Radioaktivität erfolgt mittels eines Flüssig-Szintillationszählers wie einem, der von Beckmann hergestellt wird.

(2) Prophylaktikum und Therapeutikum für G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein- oder Liganden-Polypeptid-Mangelkrankheiten
Wenn ein Ligand für das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein mittels des oben erwähnten Verfahrens (1) erkannt wird, kann der Ligand oder die das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein codierende DNA in Abhängigkeit von der Wirkung, die dieser Ligand hat, als Prophylaktikum und/oder Therapeutikum zur Behandlung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein- oder Liganden-Polypeptid-Mangelkrankheiten verwendet werden.
Wenn beispielsweise bei einem Patienten die physiologische Wirkung des Liganden, z.B. eine die Hypophysenfunktion modulierende Wirkung, eine Wirkung der Modulierung des zentralen Nervensystems oder eine die Pankreasfunktion modulierende Wirkung aufgrund einer Abnahme des G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins oder des Liganden-Polypeptids in vivo nicht erwartet werden kann, kann die Menge des G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins oder des Liganden-Polypeptids in den Gehirnzellen des Patienten erhöht werden, wodurch die Wirkung des Liganden vollständig erreicht wird, indem:

(a) die das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein codierende DNA dem Patienten verabreicht wird, damit sie exprimiert wird, oder
(b) die das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein oder das Liganden-Polypeptid codierende DNA in Gehirnzellen oder dergleichen dem Patienten verabreicht wird. Demgemäß kann die das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein oder das Liganden-Polypeptid codierende DNA als sicheres und weniger toxisches Verhütungsmittel und Therapeutikum für G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein- oder Liganden-Polypeptid-Mangelkrankheiten verwendet werden.

Wenn die oben erwähnte DNA als das oben erwähnte Mittel verwendet wird, kann die DNA allein oder nach ihrer Insertion in einen geeigneten Vektor wie einen Retrovirus-Vektor, Adenovirus-Vektor, adenovirusassoziierten Virusvektor etc. insertiert werden, gefolgt von dem Einwirkenlassen eines herkömmlichen Mittels, bei dem es sich um dasselbe Mittel wie bei der Verwendung der für das Liganden-Polypeptid oder ein Teilpeptid davon codierenden DNA als pharmazeutische Zusammensetzung handelt, auf den Produktvektor.
(3) Quantitative Bestimmung des G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins am Liganden-Polypeptid
Das Liganden-Polypeptid, das gegenüber einem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein eine bindende Wirkung aufweist, oder ein Teilpeptid davon oder ein Salz davon sind ergeben die Fähigkeit, die Menge eines G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins oder eines Teilpeptids davon oder eines Salzes davon in vivo mit guter Empfindlichkeit guantitativ zu bestimmen.
Diese quantitative Bestimmung kann beispielsweise erfolgen, indem eine Kombination mit einer kompetitiven Analyse erfolgt. Somit wird eine zu bestimmende Probe mit dem Liganden-Polypeptid so in Kontakt gebracht, dass die Konzentration eines G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins oder eines Teilpeptids davon in der Probe bestimmt werden kann. In einer Ausführungsform der quantitativen Bestimmung können die im folgenden 1) und 2) beschriebenen Protokolle oder dazu ähnliche Verfahren verwendet werden:

1) Hiroshi Irie (Hrsg.): "Radioimmunoassay" (Kodansha, Japan, 1974) und
2) Hiroshi Irie (Hrsg.): "Radioimmunoassay, Second Serie" (Kodansha, Japan, 1979).

(4) Screening einer Verbindung, die die Bindungswirkung eines Liganden-Polypeptids, eines Teilpeptids davon oder eines Salzes davon (hiernach manchmal einfach als Ligand oder Liganden-Polypeptid bezeichnet) gegenüber dem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein ändert
G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteine oder ein Teilpeptid davon oder ein Salz davon können verwendet werden. Alternativ werden Expressionssysteme für rekombinante G-Protein-gekoppelte Rezeptorproteine konstruiert, und rezeptorbindende Assaysysteme, bei denen das Expressionssystem eingesetzt wird, werden verwendet. Bei diesen Assaysystemen ist es möglich, Verbindungen, z.B. Peptide, Proteine, nichtpeptidische Verbindungen, synthetische Verbindungen, fermentierte Verbindungen, Zellextrakte, Extrakte von tierischen Zellen etc. oder Salze davon, die die Bindungswirkung eines Liganden-Polypeptids gegenüber dem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein ändern, zu screenen. Eine solche Verbindung umfasst eine Verbindung, die eine vom G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein vermittelte zellstimulierende Wirkung, z.B. eine fördernde Wirkung oder eine hemmende Wirkung auf physiologische Reaktionen einschließlich der Freisetzung von Arachidonsäure, einer Freisetzung von Acetylcholin, der Freisetzung von endozellulärem Ca²⁺, der Erzeugung von endozellulärem cAMP, der Erzeugung von endozellulärem cGMP, der Erzeugung von Inositphosphat, Änderungen des Potenzials der Zellmembran, der Phosphorylierung von endozellulärem Protein, der Aktivierung von c-fos, einer Absenkung des pH-Wertes, der Aktivierung des G-Proteins, der Zellenausbreitung etc. aufweist, einen sogenannten "G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Agonisten", eine Verbindung, die frei von einer solchen zellstimulierenden Wirkung ist, einen sogenannten "G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Antagonisten" etc. Der Begriff "Änderung der Bindungsaktivität eines Liganden-Polypeptids umfasst in demjenigen Fall, in dem die Bindung des Liganden gehemmt wird, und demjenigen Fall, in dem die Bindung des Liganden gefördert wird, beide Konzepte.
Somit macht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screenen nach einer Verbindung verfügbar, die die bindende Wirkung eines Liganden mit einem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein oder eines Salzes davon ändert, dadurch gekennzeichnet, dass die folgenden beiden Fälle verglichen werden:

(i) derjenige Fall, in dem der Ligand mit dem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein oder einem Salz davon oder einem Teilpeptid davon oder einem Salz davon in Kontakt gebracht wird, und
(ii) derjenige Fall, in dem der Ligand mit einer Mischung des G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins oder eines Salzes davon oder eines Teilpeptids davon oder eines Salzes davon und der Testverbindung in Kontakt gebracht wird.

Beim Screening-Verfahren besteht ein charakteristisches Merkmal der vorliegenden Erfindung darin, dass die Menge des Liganden, der mit dem G- Protein-gekoppelten Rezeptorprotein oder einem Teilpeptid davon verbunden wird, die zellstimulierende Wirkung des Liganden etc. sowohl in dem Fall gemessen werden, in dem (i) das Liganden-Polypeptid mit den G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteinen oder Teilpeptiden davon in Kontakt gebracht wird, als auch in dem Fall, in dem (ii) das Liganden-Polypeptid und die Testverbindung mit dem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein oder einem Teilpeptid davon und der Testverbindung in Kontakt gebracht werden, und dann ein Vergleich dazwischen durchgeführt wird.
In einer spezielleren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Folgendes verfügbar gemacht:

1) ein Verfahren, bei dem nach einer Verbindung oder einem Salz davon, die bzw. das die bindende Wirkung eines Liganden-Polypeptids gegenüber einem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein ändern, gesucht (gescreent) wird, dadurch gekennzeichnet, dass, wenn ein markiertes Liganden-Polypeptid mit einem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein oder einem oder einem Teilpeptid davon in Kontakt gebracht wird und wenn ein markiertes Liganden-Polypeptid und eine Testverbindung mit einem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein oder einem Teilpeptid davon in Kontakt gebracht werden, die Mengen des mit dem Protein oder einem Teilpeptid davon oder einem Salz davon verbundenen markierten Liganden-Polypeptids gemessen und verglichen werden;
2) ein Verfahren zum Screenen (Suchen) nach einer Verbindung oder einem Salz davon, die bzw. das die bindende Wirkung eines Liganden-Polypeptids gegenüber einem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein ändert, dadurch gekennzeichnet, dass, wenn ein markiertes Liganden-Polypeptid mit Zellen, die G-Protein-gekoppelte Rezeptorproteine enthalten, oder einer Membranfraktion der Zellen in Kontakt gebracht wird und wenn ein markiertes Liganden-Polypeptid und eine Testverbindung mit Zellen in Kontakt gebracht werden, die G-Protein-gekoppelte Rezeptorproteine oder eine Membranfraktion der Zellen enthalten, die Mengen des markierten Liganden-Polypeptids, das sich an das Protein oder ein Teilpeptid davon oder einem Salz davon bindet, gemessen und verglichen werden;
3) ein Verfahren zum Screenen (Suchen) nach einer Verbindung oder einem Salz davon, die bzw. das die bindende Wirkung eines Liganden-Polypeptids gegenüber einem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein ändert, dadurch gekennzeichnet, dass, wenn ein markiertes Liganden-Polypeptid mit G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteinen, die auf der Zellmembran exprimiert werden, in Kontakt gebracht wird, indem eine Transformante kultiviert wird, die eine ein G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein exprimierende DNA trägt, und wenn ein markiertes Liganden-Polypeptid und eine Testverbindung mit G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteinen, die auf der Zellmembran exprimiert werden, in Kontakt gebracht werden, indem eine Transformante, die eine die das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein codierende DIVA trägt, kultiviert wird, die Mengen des markierten Liganden-Polypeptids, das mit dem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein verbunden ist, gemessen und verglichen werden;
4) ein Verfahren zum Screenen (Suchen) nach einer Verbindung oder einem Salz davon, die bzw. das die Bindung eines Liganden-Polypeptids gegenüber einem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein ändert, dadurch gekennzeichnet, dass, wenn eine ein G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein aktivierende Verbindung, z.B. ein Liganden-Polypeptid der vorliegenden Erfindung etc., mit Zellen in Kontakt gebracht wird, die G-Protein-gekoppelte Rezeptorproteine enthalten, und wenn die ein G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein aktivierende Verbindung und eine Testverbindung mit Zellen in Kontakt gebracht werden, die G-Proteingekoppelte Rezeptorproteine enthalten, die resultierende, das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein übertragende Zelle Wirkungen stimuliert, z.B. Wirkungen zur Förderung oder Wirkungen zur Hemmung von physiologischen Reaktionen einschließlich der Freisetzung von Ara chidonsäure, der Freisetzung von Acetylcholin, der Freisetzung von endozellulärem Ca²⁺, der Erzeugung von endozellulärem cAMP, der Erzeugung von Inositphosphat, Änderungen des Potenzials der Zellmembran, der Phosphorylierung von endozellulären Proteinen, der Aktivierung von c-fos, einer Absenkung des pH-Wertes, der Aktivierung des G-Proteins, der Zellenausbreitung etc. gemessen und verglichen werden, und
5) ein Verfahren zum Screenen (Suchen) nach einer Verbindung oder einem Salz davon, die bzw. das die bindende Wirkung eines Liganden-Polypeptids gegenüber einem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein ändert, dadurch gekennzeichnet, dass, wenn eine ein G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein aktivierende Verbindung, z.B. ein Liganden-Polypeptid der vorliegenden Erfindung etc. mit G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteinen in Kontakt gebracht wird, die auf Zellmembranen exprimiert werden, indem Transformanten kultiviert werden, die eine ein G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein codierende DNA tragen, und wenn eine ein G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein aktivierende Verbindung und eine Testverbindung mit dem auf der Zellmembran exprimierten G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein in Kontakt gebracht wird, indem die Transformante, die die ein G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein codierende DNA trägt, kultiviert wird, die resultierende, das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein übertragende Zelle Wirkungen stimuliert, z.B. Wirkungen zur Förderung oder Wirkungen zur Hemmung von physiologischen Reaktionen einschließlich der Freisetzung von Arachidonsäure, der Freisetzung von Acetylcholin, der Freisetzung von endozellulärem Ca²⁺, der Erzeugung von endozellulärem cAMP, der Erzeugung von endozellulärem cGMP, der Erzeugung von Inositphosphat, Änderungen des Potenzials der Zellmembran, der Phosphorylierung von endozellulären Proteinen, der Aktivierung von c-fos, einer Absenkung des pH-Wertes, der Aktivierung des G-Proteins, der Zellenausbreitung etc. gemessen und verglichen werden.

Der G-Protein-gekoppelte Rezeptoragonist oder -antagonist muss zuerst gescreent werden, wodurch unter Verwendung von G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein enthaltenden Zellen, Geweben oder Zellmembran-Fraktionen, die von der Ratte oder dergleichen stammen, ein Kandidat für eine Verbindung erhalten wird (primäres Screening), dann, wobei sichergestellt wird, ob der Kandidat für die Verbindung wirklich die Bindung zwischen humanen G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteinen und Liganden hemmt (sekundäres Screening). Andere Rezeptorproteine existieren unvermeidbar, und wenn die Zellen, die Gewebe oder die Zellmembran-Fraktionen verwendet wurden, erschweren sie als solche das Screening von Agonisten oder Antagonisten für die gewünschten Rezeptorproteine. Durch die Verwendung des vom Menschen stammenden, G-Protein gekoppelten Rezeptorproteins besteht jedoch keine Notwendigkeit dafür, das primäre Screening durchzuführen, wodurch es ermöglicht wird, eine Verbindung, die die bindende Wirkung zwischen einem Liganden und einem G-Protein-gekoppelten Rezeptor ändert, wirksam zu screenen. Darüber hinaus ist es möglich, auszuwerten, ob die gescreente Verbindung ein G-Protein-gekoppelter Rezeptoragonist oder ein G-Protein-gekoppelter Rezeptorantagonist ist.
Spezielle Erläuterungen des Screening-Verfahrens werden unten gegeben.
Zuerst kann mit Hinsicht auf das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein, das für das Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, jedes beliebige Produkt verwendet werden, sofern es G-Protein-gekoppelte Rezeptorproteine oder Teilpeptide davon enthält, obwohl die Verwendung einer Membranfraktion von Organen von Säugern bevorzugt ist. Menschliche Organe können aber extrem knapp sein, und demgemäß sind G-Protein-gekoppelte Rezeptorproteine, die unter Verwendung einer Rekombinationstechnik in einer großen Menge exprimiert werden, für das Screening geeignet.
Bei der Herstellung des G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins kann das oben erwähnte Verfahren angewandt werden.
Wenn Zellen oder Zellmembranfraktionen, die das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein enthalten, beim Screening-Verfahren verwendet werden, kann das oben erwähnte Verfahren angewandt werden.
Bei der Durchführung der oben erwähnten Verfahren 1) bis 3) zum Screening der Verbindung, die zur Änderung der bindenden Wirkung des Liganden mit dem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein fähig ist, sind eine geeignete G-Protein-gekoppelte Rezeptorfraktion und ein markiertes Liganden-Polypeptid erforderlich. Hinsichtlich der G-Protein-gekoppelten Rezeptorfraktion ist es bevorzugt, natürlich vorkommende G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (natürliche G-Protein-gekoppelte Rezeptoren vom Typ G) oder rekombinante, Typ-G-Protein-gekoppelte Rezeptorfraktionen mit einer Aktivität, die zu derjenigen des gekoppelten natürlichen Proteins vom Typ G äquivalent ist, zu verwenden. Hier bedeutet der Begriff "mit einer Wirkung äquivalent zu" dieselbe ligandenbindende Wirkung oder die im Wesentlichen äquivalente ligandenbindende Wirkung.
Hinsichtlich des markierten Liganden ist es möglich, markierte Liganden, zu markierten Liganden analoge Verbindungen etc. zu verwenden. Zum Beispiel können Liganden, die mit [³H], [¹²⁵I], [¹⁴C], [³⁵S] etc. markiert sind, und andere markierte Substanzen verwendet werden.
Insbesondere werden G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein enthaltende Zellen oder Zellmembranfraktionen zuerst in einem für das Bestimmungsverfahren geeigneten Puffer suspendiert, um die Rezeptorprobe zur Durchführung des Screenings nach einer Verbindung, die die bindende Wirkung des Liganden mit dem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein ändert, herzustellen. Hinsichtlich des Puffers kann jeder beliebige Puffer wie Tris-HCl-Puffer oder Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 4–10, vorzugsweise einem pH-Wert von 6–8, der die Verbindung des Liganden mit dem Rezeptor nicht hemmt, verwendet werden.
Darüber hinaus können ein Tensid wie CHAPS, Tween 80^TM (Kao-Atlas, Japan), Digitonin, Deoxycholat etc. und/oder verschiedene Proteine wie Rinderserumalbumin (BSA), Gelatine etc. zum Puffer gegeben werden, um die nichtspezifische Bindung einzuschränken. Weiterhin kann ein Proteaseinhibitor wie PMSF, Leupeptin, E-64, hergestellt von Peptide Laboratory, Japan, Pepstatin etc. zugegeben werden, um die Zersetzung des Rezeptors und des Liganden durch Protease zu hemmen. Ein markierter Ligand in einer bestimmten Menge (5000 cpm bis 500 000 cpm) wird zu 0,01 ml bis 10 ml der Rezeptorlösung gegeben, und gleichzeitig liegen 10^–4 M bis 10^–10 M einer Testverbindung vor. Um die nichtspezifisch bindende Menge (NSB) zu bestimmen, wird auch ein Reaktionsrohr hergestellt, in das eine große Überschussmenge von unmarkierten Testverbindungen gegeben wird.
Die Reaktion wird bei 0–50 °C, vorzugsweise bei 4–37°C 20 min bis 24 h lang, vorzugsweise 30 min bis 3 h lang durchgeführt. Nach der Reaktion wird sie durch einen Glasfaserfilter, ein Filterpapier oder dergleichen filtriert, mit einer geeigneten Menge desselben Puffers gewaschen, und die im Glasfaserfilter etc. zurückgehaltene Radioaktivität wird mittels eines Flüssig-Szintillationszählers oder eines Gamma-Zählers gemessen. Unter der Annahme, dass die Zählung (B₀ – NSB), die durch das Subtrahieren der nichtspezifisch bindenden Menge (NSB) von der auf 100% gesetzten bindenden Gesamtmenge (B₀), wobei eine antagonisierende Substanz nicht vorhanden ist, erhalten wird, kann eine Testverbindung, bei der die spezifisch bindende Menge (B - NSB), die durch das Subtrahieren der nichtspezifisch bindenden Menge (NSB) von der bindenden Gesamtmenge (B) erhalten wird, weniger als 50% beträgt, als Kandidat für einen Liganden für das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein der vorliegenden Erfindung ausgewählt werden.
Bei der Durchführung der oben erwähnten Verfahren 4) bis 5) zum Screening nach einer Verbindung, die die bindende Wirkung des Liganden mit dem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein, die vom G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein vermittelte zellstimulierende Wirkung ändert, können z.B. Wirkungen zur Förderung oder Wirkungen zur Hemmung von physiologischen Reaktionen wie der Freisetzung von Arachidonsäure, der Freisetzung von Acetylcholin, der Erhöhung von intrazellulärem Ca²⁺, der Erzeugung von intrazellulärem cAMP, der Erzeugung von Inositphosphat, Änderungen des Potenzials der Zellmembran, der Phosphorylierung von intrazellulären Proteinen, der Aktivierung von c-fos, einer Absenkung des pH-Wertes, der Aktivierung des G-Proteins und der Zellenausbreitung etc. mittels bekannter Verfahren oder unter Verwendung kommerziell erhältlicher Messkits gemessen werden. Insbesondere werden das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein enthaltende Zellen zuerst in einer Mikrotiterplatte oder dergleichen kultiviert.
Bei der Durchführung des Screening erfolgt zuvor eine Substitution durch einen geeigneten Puffer, der keine Toxizität gegenüber frischem Medium oder Zellen aufweist, eine Inkubation unter geeigneten Bedingungen und für einen spezifizierten Zeitraum nach der Zugabe einer Testverbindung etc. dazu. Die resultierenden Zellen werden extrahiert, oder die überstehende Flüssigkeit wird isoliert, und das resultierende Produkt wird vorzugsweise quantitativ durch jedes der Verfahren bestimmt. Wenn es aufgrund des Vorhandenseins von in der Zelle enthaltenden zersetzenden Enzymen schwierig ist, die Erzeugung der indikativen Substanz, z.B. Arachidonsäure etc., bei der es sich um ein Anzeichen für die zellstimulierende Wirkung handelt, zu identifizieren, kann ein Assay durchgeführt werden, indem ein Inhibitor gegen das zersetzende Enzym zugegeben wird. Hinsichtlich der Wirkungen wie einer hemmenden Wirkung gegen die Erzeugung von cAMP kann diese als hemmende Wirkung gegen die Erzeugung von cAMP in denjenigen Zellen, deren wesentliche Erzeugung durch Forskolin oder dergleichen erhöht worden ist, nachgewiesen werden.
Zur Durchführung eines Screenings durch Messung der zellstimulierenden Wirkung sind Zellen, in denen ein geeignetes G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein exprimiert wird, erforderlich. Bevorzugte G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein exprimierende Zellen sind Zelllinien oder Stämme, die natürlich vorkommendes G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein (natürliches Typ-G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein) enthalten, z.B. die Maus-Pankreas-β-Zelllinie, MIN6 etc., die oben erwähnten rekombinantes Typ-G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein exprimierenden Zelllinien oder Stämme etc.
Beispiele für die Testverbindung umfassen ein Peptid, Proteine, nichtpeptidische Verbindungen, synthetisierte Verbindungen, fermentierte Produkte, Zellextrakte, Pflanzenextrakte, Extrakte von tierischen Geweben, Serum, Blut, Körperflüssigkeit etc. Diese Verbindungen können neu oder bekannt sein.
Ein Kit zum Screening der Verbindung, die die bindende Wirkung des Liganden mit dem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein oder einem Salz davon ändert, umfasst ein G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein oder ein Teilpeptid davon oder ein G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein enthaltende Zellen oder eine Zellmembran-Fraktion davon.
Beispiele für den Screening-Kit umfassen die folgenden:
1. Reagenz zur Bestimmung eines Liganden.
1) Puffer zur Messung und Puffer zum Waschen.
Das Produkt, wobei 0,05% Rinderserumalbumin (hergestellt von Sigma) zu Hanks gepufferter Salzlösung (hergestellt von Gibco) gegeben wird.
Es kann durch Filtration durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm sterilisiert und bei 4°C aufbewahrt oder bei der Verwendung hergestellt werden.
2) Probe des G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins
CHO-Zellen, in denen G-Protein-gekoppelte Rezeptorproteine exprimiert werden, werden mit einer Rate von 5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung in einer Platte mit 12 Vertiefungen subkultiviert und bei 37°C in einer Atmosphäre aus 5% CO₂ und 95% Luft zwei Tage lang kultiviert, wodurch die Probe hergestellt wird.
3) Markierter Ligand.
Der Ligand, der mit kommerziell erhältlichem [³H], [¹²⁵I], [¹⁴C], [³⁵S] etc. markiert ist.
Das Produkt wird im Zustand einer wässrigen Lösung bei 4°C oder –20°C aufbewahrt und bei der Verwendung mit einem Puffer für die Messung auf 1 μM verdünnt.
4) Liganden-Standardlösung.
Ligand wird in PBS gelöst, das 0,1% Rinderserumalbumin (hergestellt von Sigma) enthält, wodurch 1 mM angefertigt wird, und bei –20°C aufbewahrt.
2. Messverfahren

1) CHO-Zellen werden in einer Gewebekulturplatte mit 12 Vertiefungen kultiviert, wodurch G-Protein-gekoppelte Rezeptorproteine exprimiert werden. Die G-Protein-gekoppelte Rezeptorproteine exprimierenden CHO-Zellen werden zur Messung zweimal mit 1 ml Puffer gewaschen. Dann werden zur Messung 490 μl Puffer in jede Vertiefung gegeben.
2) 5 μl einer Lösung der Testverbindung mit 10^–3 bis 10^–10 M werden zugegeben, dann werden 5 μl eines markierten Liganden zugegeben und 1 h lang bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Um die nichtspezifisch bindende Menge zu bestimmen, werden statt der Testverbindung 5 μl des Liganden mit 10^–3 M zugegeben.
3) Die Reaktionslösung wird aus der Vertiefung entnommen, die zur Messung dreimal mit 1 ml Puffer gewaschen wird. Der sich mit den Zellen verbindende markierte Ligand wird in 0,2 N NaOH – 1% SDS aufge löst und mit 4 ml eines flüssigen Szintillators A (wie demjenigen, der von Wako Pure Chemical, Japan, hergestellt wird).
4) Radioaktivität wird mittels eines Flüssig-Szintillationszählers (z.B. einem von Beckmann hergestellten) gemessen, und die PMB (prozentuale maximale Bindung) wird mittels der folgenden Gleichung berechnet: PMB = [(B – NSB)/B0 – NSB)] × 100

PMB:

prozentuale maximale Bindung

B:

Wert, wenn eine Probe zugegeben ist

NSB:

Nichtspezifische Bindung

B₀:

Maximale Bindung

Die Verbindung oder ein Salz davon, die bzw. das durch das Screening-Verfahren oder mittels des Screening-Kits erhalten wird, ist eine Verbindung, die die bindende Wirkung eines Liganden-Polypeptids gegenüber einem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein ändert, wobei die Verbindung die Bindung hemmt oder fördert, und insbesondere ist sie eine Verbindung mit einer zellstimulierenden Wirkung, die über einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor oder ein Salz davon übertragen wird, ein sogenannter "G-Protein-gekoppelter Rezeptoragonist", oder eine Verbindung, die keine stimulierende Wirkung hat, ein sogenannter "G-Protein-gekoppelter Rezeptorantagonist". Beispiele für die Verbindung sind Peptide, Proteine, nichtpeptidische Verbindungen, synthetisierte Verbindungen, fermentierte Produkte etc., und die Verbindung kann neu oder bekannt sein.
Der G-Protein-gekoppelte Rezeptoragonist hat dieselbe physiologische Wirkung wie der Ligand für das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein und ist daher in Abhängigkeit von der Ligandenaktivität als sichere und weniger toxische pharmazeutische Zusammensetzung brauchbar.
Andererseits ist der G-Protein-gekoppelte Rezeptorantagonist dazu fähig, die physiologische Wirkung des Liganden gegenüber dem G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein zu hemmen, und daher ist er als sichere und weniger toxische pharmazeutische Zusammensetzung zur Hemmung der Ligandenwirkung brauchbar.
Das Liganden-Polypeptid der vorliegenden Erfindung betrifft die Wirkung zur Modulierung der Hypophysenfunktion, der Wirkung zur Modulierung der Funktion des zentralen Nervensystems oder die Wirkung zur Modulierung der Pankreasfunktion. Daher kann der oben erwähnte Agonist oder Antagonist als Therapeutikum und/oder Prophylaktikum für Demenzen wie die senile Demenz, die zerebrovaskuläre Demenz (Demenz aufgrund einer zerebrovaskulären Störung), einer mit phylodegenerativen retroplastischen Krankheiten zusammenhängenden Demenz (z.B. Alzheimer-Krankheit, Parkinsonsche Krankheit, Pick-Krankheit, Huntington-Krankheit etc.), Demenz aufgrund von Infektionskrankheiten (z.B. verzögerte Virusinfektionen wie die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit), Demenzen im Zusammenhang mit endokrinen, metabolischen und toxischen Krankheiten (z.B. Hypothyreoidismus, Vitamin-B12-Mangel, Alkoholismus und eine Vergiftung mit verschiedenen Medikamenten, Metallen oder organischen Verbindungen), Demenzen im Zusammenhang mit onkogenen Krankheiten (z.B. Gehirntumor), Demenzen aufgrund von traumatischen Krankheiten (z.B. chronische subdurale Hämatome), Depression (Melancholie), das hyperkinetische (mikroenzephalopathische) Syndrom, Bewusstseinsstörung, Angstsyndrom, Schizophrenie, Horror, einer Krankheit aufgrund einer Störung der Sekretion von Wachstumshormonen (z.B. Gigantismus, akromegalem Gigantismus etc.), Hyperphagie, Polyphagie, Hypercholesterinämie, Hyperglyceridämie, Hyperlipämie, Hyperprolaktinämie, Hyperglykämie, Pituitarismus, hypophysärem Zwergwuchs, Diabetes (z.B. diabetische Komplikationen, diabetische Nephropathie, diabetische Neuropathie, diabetische Retinopathie etc.), Krebs (z.B. Brustkrebs, lymphatische Leukämie, Zystenkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs etc.), Pankreatitis, eine Nierenerkrankung (z.B. chronisches Nierenversagen, Nephritis etc.), Turner-Syndrom, Neurose, Rheumatoidarthritis, eine Rückgratverletzung, transitori sche Gehirnischämie, amyotrophe Myokardinfarzierung, akute Myokardinfarzierung, spinozerebelläre Degeneration, einen Knochenbruch, ein Trauma, atopische Dermatitis, Osteoporose, Asthma, Epilepsie, Unfruchtbarkeit oder Oligogalaktie verwendet werden. Weiterhin können der Agonist oder Antagonist auch als Hypnotikum sedativum, als Mittel zur Verbesserung des postoperativen Nährmittelzustands, als Vasopressor oder -depressor verwendet werden.
Wenn die Verbindung oder ein Salz davon, die bzw. das durch das Screening-Verfahren oder durch den Screening-Kit erhalten wird, als pharmazeutische Zusammensetzung verwendet wird, kann ein herkömmliches Mittel, bei dem es sich um dasselbe Mittel wie bei der Verwendung des oben erwähnten Liganden-Polypeptids als pharmazeutische Zusammensetzung handelt, darauf angewandt werden.
(5) Herstellung eines Antikörpers oder Antiserums gegen das Liganden-Polypeptid oder das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein.
Antikörper, z.B. ein polyklonaler Antikörper, ein monoklonaler Antikörper, und Antiseren gegen das Liganden-Polypeptid oder das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein können durch Verfahren zur Herstellung von Antikörpern oder Antiseren, die den Fachleuten bekannt sind, oder dazu ähnlichen Verfahren hergestellt werden, wobei das Liganden-Polypeptid oder das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein als Antigen verwendet werden. Beispielsweise können polyklonale Antikörper durch das unten aufgeführte Verfahren hergestellt werden.
[Herstellung eines polyklonalen Antikörpers]
Das oben erwähnte Polypeptid oder Protein als Antigen wird an ein Trägerprotein gekoppelt. Das Trägerprotein kann beispielsweise Rinder-Thyroglobulin, Rinderserumalbumin, Rinder-γ-globulin, Hämocyanin oder Freunds vollständiges Adjuvans (Difco) sein.
Die Kopplungsreaktion zwischen dem Antigenprotein und dem Trägerprotein kann durch das bekannte Verfahren erfolgen. Das Reagenz zur Verwendung in der Kopplungsreaktion umfasst, ohne darauf beschränkt zu sein, Glutaraldehyd und ein wasserlösliches Carbodiimid. Das zweckmäßige Verhältnis des Antigenproteins zum Trägerprotein beträgt etwa 1:1 bis etwa 1:10, und hinsichtlich des Reaktions-pH-Wertes werden in vielen Fällen zufriedenstellende Ergebnisse erhalten, wenn die Reaktion etwa um den Neutralpunkt herum, insbesondere im pH-Bereich von etwa 6–8 durchgeführt wird. Die Reaktionsdauer beträgt in vielen Fällen vorzugsweise etwa 1 bis 12 h und noch mehr bevorzugt etwa 2 bis 6 h. Das so erhaltene Konjugat wird bei etwa 0 bis 18°C auf die routinemäßige Weise gegen Wasser dialysiert und gefroren aufbewahrt oder gegebenenfalls lyophilisiert aufbewahrt.
Zur Herstellung eines polyklonalen Antikörpers wird ein warmblütiges Tier mit dem immunogenen Produkt auf die oben beschriebene Weise inokuliert. Das warmblütige Tier, das zu diesem Zweck verwendet werden kann, umfasst warmblütige Säuger, z.B. das Kaninchen, das Schaf, die Ziege, die Ratte, die Maus, das Meerschweinchen, das Rind, das Pferd, das Schwein etc. und Vogelspezies, z.B. das Huhn, die Taube, die Ente, die Gans, die Wachtel etc. Hinsichtlich der Methodologie zum Inokulieren eines warmblütigen Tieres mit dem Immunogen kann die Inokulumgröße des Immunogens gerade ausreichend zur Erzeugung von Antikörpern sein. Beispielsweise kann der gewünschte Antikörper in vielen Fällen hergestellt werden, indem 1 mg des Immunogens in 1 ml Kochsalzlösung mit Freunds vollständigem Adjuvans emulgiert und die Emulsion fünfmal in vierwöchigen Intervallen subkutan am hinteren Fußballen der Hinterextremität von Kaninchen subkutan injiziert wird. Zum Ernten des im warmblütigen Tier, zum Beispiel in einem Kaninchen, erzeugten Antikörpers wird das Blut gewöhnlich während des 7. Tags bis zum 12. Tag nach der letzten Inokulationsdosis aus der Ohrvene entnommen und zentrifugiert, um ein Antiserum zu isolieren. Zur Reinigung wird das Antiserum gewöhnlich einer Affinitätschromatographie unterzogen, wobei ein Träger verwendet wird, an den jedes Antigenpeptid konjugiert wurde, und die adsorbierte Fraktion wird isoliert, wodurch ein polyklonaler Antikörper erhalten wird.
Der monoklonale Antikörper kann mit dem folgenden Verfahren hergestellt werden.
[Herstellung eines monoklonalen Antikörpers]
(a) Herstellung von monoklonale Antikörper erzeugenden Zellen.
Das Liganden-Polypeptid oder G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein wird warmblütigen Tieren entweder allein oder zusammen mit Trägern oder Verdünnungsmitteln an derjenigen Stelle verabreicht, an der die Erzeugung eines Antikörpers durch die Verabreichung möglich ist. Um die Produktivität des Antikörpers bei der Verabreichung zu potenzieren, können Freunds vollständiges Adjuvans oder Freunds unvollständiges Adjuvans verabreicht werden. Die Verabreichung erfolgt gewöhnlich alle zwei bis sechs Wochen und zwei- bis zehnmal insgesamt. Beispiele für verwendbare warmblütige Tiere sind Affen, Kaninchen, Hunde, Meerschweinchen, Mäuse, Ratten, Schafe, Ziegen und Hühner, und die Verwendung von Mäusen und Ratten ist bevorzugt.
Bei der Herstellung der Zellen, die monoklonale Antikörper erzeugen, ist ein Tier, bei dem der Antikörper-Titer festgestellt wird, aus warmblütigen Tieren (z.B. Mäusen) ausgewählt, die mit Antigenen immunisiert sind, dann werden zwei bis fünf Tage nach der endgültigen Immunisierung die Milz oder Lymphknoten isoliert, und darin enthaltene Antikörper erzeugende Zellen werden mit Myelomzellen fusioniert, wodurch monoklonale Antikörper erzeugende Hybridome erhalten werden. Eine Messung des Antikörper-Titers in Antiseren kann beispielsweise erfolgen, indem ein markiertes Liganden-Polypeptid oder ein markiertes G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein (das unten erwähnt wird) mit dem Antiserum umgesetzt wird, gefolgt von einer Messung der bindenden Wirkung des Markierungsmittels mit dem Antikörper.
Der Fusionierungsvorgang kann beispielsweise mittels eines Verfahren von Koehler und Milstein erfolgen (Nature, 256, 495, 1975). Beispiele für den Fusionsbeschleuniger sind Polyethylenglycol (PEG), das Sendai-Virus etc., und die Verwendung von PEG ist bevorzugt.
Beispiele für die Myelomzellen sind NS-1, P3U1, 5P2/0, AP-1 etc., und die Verwendung von P3U1 ist bevorzugt. Das bevorzugte Fusionierungsverhältnis der Anzahl der verwendeten Antikörper erzeugenden Zellen (Milzzellen) zur Anzahl der verwendeten Myelomzellen liegt in einem Bereich von etwa 1:1 bis 20:1. Wenn PEG (vorzugsweise PEG 1000 bis PEG 6000) in einer Konzentration von etwa 10–80% zugegeben wird, gefolgt von einem ein- bis 10-minütigen Inkubieren bei 20–40°C (vorzugsweise bis 30–37°C), kann eine effiziente Zellfusion erfolgen.
Zum Screenen eines Hybridoms, das einen Antiliganden-Polypeptid-Antikörper oder einen Anti-G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Antikörper erzeugt, können verschiedene Verfahren angewandt werden. Zum Beispiel wird überstehende Flüssigkeit einer Hybridomkultur zu einer festen Phase (z.B. einer Mikroplatte) gegeben, an der das Liganden-Polypeptid-Antigen oder das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein-Antigen entweder direkt oder mit einem Träger adsorbiert wird, dann wird ein Anti-Immunoglobulin-Antikörper (Anti-Maus-Immunoglobulin-Antikörper wird verwendet, wenn die für die Zellfusion verwendeten Zellen von der Maus stammen), der mit einer radioaktiven Substanz markiert ist, ein Enzym oder dergleichen, oder Protein A dazugegeben, und dann werden Anti-Liganden-Polypeptid-monoklonale Antikörper oder Anti-G-Protein-gekoppelte Rezeptor-monoklonale Antikörper, die an der festen Phase gebunden sind, nachgewiesen, oder überstehende Flüssigkeit der Hybridomkultur wird zur Festphase gegeben, an der Anti-Immunoglobulin oder Protein A adsorbiert wird, dann wird das Liganden-Polypeptid oder der G-Protein-gekoppelte Rezeptor, das bzw. der mit einer radioaktiven Substanz oder einem Enzym markiert ist, zugegeben, und an die feste Phase gebundenes Antiliganden-Polypeptid oder Anti-G-Protein-gekoppelte Rezeptormonoklinale Antikörper werden nachgewiesen.
Eine Auswahl und ein Klonen der Anti-Liganden-Polypeptid-monoklonalen Antikörper oder der Anti-G-Protein-gekoppelten Rezeptor-monoklonalen Antikörper erzeugenden Hybridome kann durch Verfahren, die den Fachleuten als solche bekannt sind, oder durch dazu ähnliche Verfahren erfolgen. Üblicherweise wird es in einem Medium für tierische Zellen durchgeführt, das HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) enthält. Hinsichtlich eines Mediums zur Selektion, zum Klonen und zum Züchten kann jedes Medium verwendet werden, sofern Hybridome darin wachsen können. Beispiele für das Medium sind ein RPMI-1640-Medium (Dainippon Pharmaceuticals Co., Ltd. Japan), das 1–20% (vorzugsweise 10–20%) fötales Kalbserum (FCS) enthält, ein GIT-Medium (Wako Pure Chemical, Japan), das 1–20% fötales Kalbserum enthält, und ein serumfreies Medium zur Kultivierung von Hybridomen (SFM-101; Nissui Seiyaku, Japan). Die Kultivierungstemperatur beträgt vorzugsweise 20–40°C und vorzugsweise etwa 37°C. Die Kultivierungsdauer beträgt gewöhnlich von fünf Tagen bis zu drei Wochen und vorzugsweise ein bis zwei Wochen. Die Kultivierung wird gewöhnlich in 5% Kohlenstoffdioxidgas durchgeführt. Der Antikörper-Titer der überstehenden Flüssigkeit der Hybridomkultur kann auf dieselbe Weise wie bei der oben erwähnten Messung des Antikörper-Titers des Anti-Liganden-Polypeptids oder des Anti-G-Protein-gekoppelten Rezeptors im Antiserum gemessen werden.
(b) Reinigung des monoklonalen Antikörpers.
Wie bei der Trennung/Reinigung herkömmlicher polyklonaler Antikörper kann die Trennung/Reinigung des Anti-Liganden-Polypeptid-monoklonalen Antikörpers oder des Anti-G-Protein-gekoppelten Rezeptor-monoklonalen Antikörpers nach Verfahren zur Trennung/Reinigung von Immunoglobulin, wie durch ein Aussalzen, eine Ausfällung mit einem Alkohol, eine isoelektrische Ausfällung, eine Elektrophorese, eine Adsorption/Desorption unter Verwendung von Ionenaustauschern wie DEAE, eine Ultrazentrifugation, eine Gelfiltration, nach speziellen Reinigungsverfahren, bei denen nur ein Antikörper durch eine Behandlung mit einem aktiven Adsorptionsmittel wie einer antigenbindenden Festphase, Protein A oder Protein G gesammelt wird und die Bindung dissoziiert, woraufhin der Antikörper erhalten wird, erfolgen.
Der Liganden-Polypeptid-Antikörper oder der G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Antikörper, die durch das obige Verfahren (a) oder (b) hergestellt werden, sind dazu fähig, ein Liganden-Polypeptid oder G-Protein-gekoppelte Rezeptoren spezifisch zu erkennen, und folglich können sie für eine quantitative Bestimmung des Liganden-Polypeptids oder des G-Protein-gekoppelten Rezeptors in Test-Flüssigkeitsproben und insbesondere für eine quantitative Bestimmung durch Sandwich-Immunoassays verwendet werden.
Somit macht die vorliegende Erfindung beispielsweise die folgenden Verfahren verfügbar:

(i) eine quantitative Bestimmung eines Liganden-Polypeptids oder eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors in einer Test-Flüssigkeitsprobe, die folgendes umfasst: (a) eine kompetitive Umsetzung der Test-Flüssigkeitsprobe mit einem markierten Liganden-Polypeptid oder einem markierten G-Protein-gekoppelten Rezeptor mit einem Antikörper, der mit dem Liganden-Polypeptid oder dem G-Protein-gekoppelten Rezeptor reagiert, und (b) eine Messung des Verhältnisses des markierten Liganden-Polypeptids oder des markierten G-Protein-gekoppelten Rezeptors, das bzw. der sich mit dem Antikörper verbindet, und
(ii) eine quantitative Bestimmung eines Liganden-Polypeptids oder eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors in einer Test-Flüssigkeitsprobe, die folgendes umfasst: (a) eine Umsetzung der Test-Flüssigkeitsprobe mit einem auf einem unlöslichen Träger immobilisierten Antikörper und einem markierten Antikörper gleichzeitig oder nacheinander und (b) eine Messung der Aktivität des Markierungsmittels auf dem unlöslichen Träger, wobei ein Antikörper dazu fähig ist, die N-terminale Region des Liganden-Polypeptids oder des G-Protein-gekoppelten Rezeptors zu erkennen, während ein anderer Antikörper dazu fähig ist, die C-terminale Region des Liganden-Polypeptids oder des G-Protein-gekoppelten Rezeptors zu erkennen.

Wenn der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung, der ein Liganden-Polypeptid oder einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor erkennt (der hiernach auch als "Anti-Liganden-Polypeptid" oder "Anti-G-Protein-gekoppelter Rezeptor-Antikörper" bezeichnet werden kann), verwendet wird, können Liganden-Polypeptid- oder G-Protein-gekoppelte Rezeptoren gemessen werden und können darüber hinaus auch mittels einer Gewebeanfärbung etc. nachgewiesen werden. Dazu können Antikörper-Moleküle als solche oder auch F(ab')₂-, Fab'- oder Fab-Fraktionen des Antikörpermoleküls verwendet werden. Hinsichtlich des für den Antikörper der vorliegenden Erfindung verwendeten Messverfahrens gibt es keine besondere Einschränkung, und jedes beliebige Messverfahren kann verwendet werden, sofern es ein Verfahren betrifft, bei dem die Menge des Antikörper-, Antigen- oder Antikörper-Antigen-Komplexes in Abhängigkeit von oder entsprechend der Menge des Antigens, z.B. der Menge des Liganden-Polypeptids oder des G-Protein-gekoppelten Rezeptors etc. in der zu messenden Flüssigkeitsprobe mittels eines chemischen oder physikalischen Mittels nachgewiesen und dann unter Verwendung einer Standardkurve, die mittels einer eine bekannte Menge des Antigens enthaltenden Standardlösung angefertigt wird, berechnet wird. Zum Beispiel werden zweckmäßigerweise die Nephrometrie, ein kompetitives Verfahren, ein immunometrisches Verfahren und ein Sandwich- Verfahren verwendet, und hinsichtlich der Empfindlichkeit und Spezifität ist das Sandwich-Verfahren, das hier unten beschrieben wird, besonders bevorzugt.
Beispiele für das Markierungsmittel, das beim Messverfahren unter Verwendung der Markierungssubstanz verwendet wird, sind Radioisotope, Enzyme, fluoreszierende Substanzen, lumineszierende Substanzen, Kolloide, magnetische Substanzen etc. Beispiele für das Radioisotop sind [¹²⁵I], [¹³¹I], [³H] und [¹⁴C]; bevorzugte Beispiele für das Enzym sind diejenigen, die stabil sind und eine große spezifische Wirkung aufweisen, wie β-Galactosidase, β-Glucosidase, alkalische Phosphatase, Peroxidase und Malatdehydrogenase; Beispiele für die fluoreszierende Substanz sind Fluorescamin, Fluoresceinisothiocyanat etc., und Beispiele für die lumineszierende Substanz sind Luminol, Luminolderivate, Luciferin, Lucigenin etc. Weiterhin kann auch ein Biotin-Avidin-System zum Verbinden eines Antikörpers oder Antigens mit einem Markierungsmittel verwendet werden.
Bei einer Unlöslichmachung (Immobilisierung) von Antigenen oder Antikörpern kann eine physikalische Adsorption verwendet werden, oder eine chemische Bindung, die üblicherweise für eine Unlöslichmachung oder Immobilisierung von Proteinen oder Enzymen verwendet wird, kann ebenfalls verwendet werden. Beispiele für den Träger sind unlösliche Polysaccharide wie Agarose, Dextran und Cellulose, synthetische Harze wie Polystyrol, Polyacrylamid und Silicon, Glas etc.
Bei einem Sandwich- (oder Zwei-Stellen-)Verfahren wird die Testflüssigkeit mit einem unlöslich gemachten Antiliganden-Polypeptid oder Anti-G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Antikörper zur Reaktion gebracht (erste Reaktion), dann wird sie mit einem markierten Anti-Liganden-Polypeptid oder einem markierten Anti-G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Antikörper zur Reaktion gebracht (zweite Reaktion), und die Wirkung des Markierungsmittels auf den unlöslichen Träger wird gemessen, woraufhin die Menge des Liganden-Polypeptids oder des G-Protein-gekoppelten Rezeptors in der Testflüssigkeit bestimmt werden kann. Die erste Reaktion und die zweite Reaktion können umgekehrt oder gleichzeitig durchgeführt werden, oder sie können mit einem Intervall durchgeführt werden. Der Typ des Markierungsmittels und das Verfahren zur Unlöslichmachung (Immobilisierung) können dieselben sein, die hier bereits erwähnt wurden. Beim Immunoassay mittels eines Sandwich-Verfahrens ist es nicht immer erforderlich, das der für den markierten Antikörper verwendete Antikörper und der Antikörper für die Festphase ein Typ oder eine Spezies sind, sondern zum Ziel zur Verbesserung der Messempfindlichkeit etc. kann auch eine Mischung aus zwei oder mehr Antikörpern verwendet werden.
Beim Verfahren zur Messung des Liganden-Polypeptid- oder der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren mittels des Sandwich-Verfahrens der vorliegenden Erfindung sind die bevorzugten Anti-Liganden-Polypeptid-Antikörper oder Anti-G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Antikörper, die für die erste und die zweite Reaktion verwendet werden, Antikörper, deren Stellen, die sich mit dem Liganden-Polypeptid- oder dem G-Protein-gekoppelten Rezeptor verbinden, voneinander verschieden sind. Somit sind die bei der ersten und der zweiten Reaktion verwendeten Antikörper diejenigen, bei denen, wenn der bei der zweiten Reaktion verwendete Antikörper die C-terminale Region des Liganden-Polypeptid- oder des G-Protein-gekoppelten Rezeptors erkennt, der Antikörper, der die andere, von den C-terminalen Regionen verschiedene Stellen, z.B. zur Erkennung der N-terminalen Region, vorzugsweise bei der ersten Reaktion verwendet wird.
Der Anti-Liganden-Polypeptid-Antikörper oder der Anti-G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Antikörper der vorliegenden Erfindung kann bei einem vom Sandwich-Verfahren verschiedenen Messsystem, wie einem kompetitiven Verfahren, einem immunometrischen Verfahren und einer Nephrometrie, verwendet werden. Bei einem kompetitiven Verfahren werden ein Antigen in der Testlösung und ein markiertes Antigen mit einem Antikörper kompetitiv umgesetzt, dann werden ein nicht umgesetztes, markiertes Antigen (F) und ein markiertes Antigen, das sich mit einem Antikörper (B) verbindet, getrennt (d.h. eine B/F-Trennung), und die markierte Menge von B und F wird gemessen, woraufhin die Menge des Antigens in der Testlösung bestimmt wird. Hinsichtlich eines Verfahrens für eine solche Reaktion gibt es ein Flüssigphasen-Verfahren, bei dem ein löslicher Antikörper als Antikörper verwendet wird, und die B/F-Trennung erfolgt mittels Polyethylenglycol, einen zweiten Antikörper für den oben erwähnten Antikörper, etc.; und ein Festphasen-Verfahren, bei dem ein immobilisierter Antikörper als erster Antikörper verwendet wird oder ein löslicher Antikörper als erster Antikörper verwendet wird, während ein immobilisierter Antikörper als zweiter Antikörper verwendet wird.
Bei einem immunometrischen Verfahren werden ein Antigen in der Testlösung und ein immobilisiertes Antigen einer kompetitiven Reaktion mit einer bestimmten Menge eines markierten Antikörpers unterzogen, gefolgt von einer Trennung in feste und flüssige Phasen, oder das Antigen in der Testlösung und eine Überschussmenge des markierten Antikörpers werden zur Reaktion gebracht, dann wird ein immobilisiertes Antigen zugegeben, um einen nicht umgesetzten, markierten Antikörper an der Festphase zu binden, und dann wird in eine feste und eine flüssige Phase getrennt. Danach wird die markierte Menge einer jeden der Phasen gemessen, um die Antigenmenge in der Testlösung zu bestimmen.
Bei der Nephrometrie wird die Menge des unlöslichen Sediments, das als Folge der Antigen-Antikörper-Reaktion in einem Gel oder in einer Lösung erzeugt wird, gemessen. Sogar wenn die Antigenmenge in der Testlösung klein ist und nur eine kleine Menge des Sediments erhalten wird, kann eine Laser-Nephrometrie, bei der eine Laserstreuung verwendet wird, zweckmäßig eingesetzt werden.
Bei der Anwendung einer jeden dieser immunologischen Messverfahren (Immunoassays) auf das Messverfahren der vorliegenden Erfindung ist es nicht notwendig, spezielle Bedingungen, Betriebsarten etc. dafür einzurichten. Ein Messsystem (Assaysystem) für einen Liganden-Polypeptid- oder einen G- Protein-gekoppelten Rezeptor kann entworfen werden, wobei die technischen Erwägungen der Fachleute für die herkömmlichen Bedingungen und Funktionen bei jedem der Verfahren in Betracht gezogen werden. Bezüglich der Einzelheiten zu diesen herkömmlichen technischen Vorrichtungen kann auf eine Vielzahl von Zusammenfassungen, Referenzbüchern etc. Bezug genommen werden. Dabei handelt es sich beispielsweise um Hiroshi Irie (Hrsg.): "Radioimmunoassay" (Kodansha, Japan, 1974); Hiroshi Irie (Hrsg.): "Radioimmunoassay; Second Series" (Kodansha, Japan, 1979); Eiji Ishikawa et al. (Hrsg.): "Enzyme Immunoassay" (Igaku Shoin, Japan, 1978); Eiji Ishikawa et al. (Hrsg): "Enzyme Immunoassay" (Second Edition) (Igaku Shoin, Japan, 1982); Eiji Ishikawa et al. (Hrsg.): "Enzyme Immunoassay" (Third Edition) (Igaku Shoin, Japan, 1987); "Methods in Enzymology" Band 70 (Immunochemical Techniques (Part A)); ibid. Band 7 3 (Immunochemical Techniques (Part B)); ibid. Band 74 (Immunochemical Techniques (Part C)); ibid. Band 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)); ibid. Band 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)); ibid. Band 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (Academic Press); etc.
Die Menge des Liganden-Polypeptids oder der G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteine kann jetzt mit hoher Präzision durch die Verwendung des Anti-Liganden-Polypeptid- oder des Anti-G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Antikörpers der vorliegenden Erfindung bestimmt werden.
In der Beschreibung und in den Zeichnungen der vorliegenden Anmeldung sind die Abkürzungen, die für Basen (Nucleotide), Aminosäuren und so weiter verwendet werden, diejenigen, die von der IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature empfohlen sind, oder diejenigen, die im Fachgebiet üblicherweise verwendet werden. Beispiele dafür sind unten aufgeführt. Aminosäuren, bei denen eine optische Isomerisierung möglich ist, liegen, sofern nichts anderes angegeben ist, in der L-Form vor.

DNA:: Deoxyribonucleinsäure
cDNA:: Komplementäre Deoxyribonucleinsäure
A:: Adenin
T:: Thymin
G:: Guanin
C:: Cytosin
RNA:: Ribonucleinsäure
mRNA:: Messenger-Ribonucleinsäure
dATP:: Deoxyadenosintriphosphat
dTTP:: Deoxythymidintriphosphat
dGTP:: Deoxyguanosintriphosphat
dCTP:: Deoxycytidintriphosphat
ATP:: Adenosintriphosphat
EDTA:: Ethylendiamintetraessigsäure
SDS:: Natriumdodecylsulfat
EIA:: Enzym-Immunoassay
G, Gly:: Glycin (oder Glycyl)
A, Ala:: Alanin (oder Alanyl)
V, Val:: Valin (oder Valyl)
L, Leu:: Leucin (oder Leucyl)
I, Ile:: Isoleucin (oder Isoleucyl)
S, Ser:: Serin (oder Seryl)
T, Thr:: Threonin (oder Threonyl)
C, Cys:: Cystein (oder Cysteinyl)
M, Met:: Methionin (oder Methionyl)
E, Glu:: Glutaminsäure(oder Glutamyl)
D, Asp:: Aspartamsäure (oder Aspartyl)
K, Lys:: Lysin (oder Lysyl)
R, Arg:: Arginine (oder Arginyl)
H, His:: Histidine (oder Histidyl)
F, Phe:: Phenylalanin (oder Phenylalanyl)
Y, Tyr:: Tyrosin (oder Tyrosyl)
W, Trp:: Tryptophan (oder Tryptophanyl)
P, Pro:: Prolin (oder Prolyl;
N, Asn:: Asparagin (oder Asparaginyl)
Q, Gin:: Glutamin (oder Glutaminyl)
pGlu:: Pyroglutamsäure (oder Pyroglutamyl)
Me:: Methyl
Et:: Ethyl
Bu:: Butyl
Ph:: Phenyl
TC:: Thiazolidinyl-4(R)-carboxamid

In dieser Beschreibung werden Substitutionen, Schutzgruppen und Reagenzien, die üblicherweise verwendet werden, mit den folgenden Abkürzungen bezeichnet:

BHA:: Benzhydrylamin
pMBHA:: p-Methylbenzhydrylamin
Tos:: p-Toluolsulfonyl
CHO:: Formyl
HONB:: N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboxyimid
OcHex:: Cyclohexylester
Bzl:: Benzyl
Bom:: Benzyloxymethyl
Br-Z:: 2-Brombenzyloxycarbonyl
Boc:: t-Butoxycarbonyl
DCM:: Dichlormethan
HOBt:: 1-Hydroxybenztriazol
DCC:: N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
TFA:: Trifluoracetat
DIEA:: Diisopropylethylamin
Fmoc:: N-9-Fluorenylmethoxycarbonyl
DNP:: Dinitrophenyl
Bum:: t-Butoxymethyl
Trt:: Trityl

Jede der im Sequenzprotokoll der Beschreibung aufgeführten SEQ ID Nr. bezieht sich auf die folgende Sequenz:

[SEQ ID Nr. 1] ist eine komplette Aminosäuresequenz des von der Rinder-Hypophyse stammenden Liganden-Polypeptids, das von der in pBOV3 eingeschlossenen cDNA codiert wird.
[SEQ ID Nr. 2] ist eine komplette Nucleotidsequenz der von der Rinder-Hypophyse stammenden Liganden-Polypeptid-cDNA.
[SEQ ID Nr. 3] ist eine Aminosäuresequenz des von der Rinder-Hypophyse stammenden Liganden-Polypeptids, das durch eine Reinigung und eine Analyse der N-terminalen Sequenz für die Fraktion P-3 erhalten wurde. Die Aminosäuresequenz entspricht der 23. bis 51. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1.
[SEQ ID Nr. 4] ist eine Aminosäuresequenz des von der Rinder-Hypophyse stammenden Liganden-Polypeptids, das durch eine Reinigung und eine Analyse der N-terminalen Sequenz für die Fraktion P-2 erhalten wurde. Die Aminosäuresequenz entspricht der 34. bis 52. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1.
[SEQ ID Nr. 5] ist eine Aminosäuresequenz des von der Rinder-Hypophyse stammenden Liganden-Polypeptids. Die Aminosäuresequenz entspricht der 23. bis 53. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1.
[SEQ ID Nr. 6] ist eine Aminosäuresequenz des von der Rinder-Hypophyse stammenden Liganden-Polypeptids. Die Aminosäuresequenz entspricht der 23. bis 54. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1.
[SEQ ID Nr. 7] ist eine Aminosäuresequenz des von der Rinder-Hypophyse stammenden Liganden-Polypeptids. Die Aminosäuresequenz entspricht der 23. bis 55. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1.
[SEQ ID Nr. 8] ist eine Aminosäuresequenz des von der Rinder-Hypophyse stammenden Liganden-Polypeptids. Die Aminosäuresequenz entspricht der 34. bis 53. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1.
[SEQ ID Nr. 9] ist eine Aminosäuresequenz des von der Rinder-Hypophyse stammenden Liganden-Polypeptids. Die Aminosäuresequenz entspricht der 34. bis 54. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1.
[SEQ ID Nr. 10] ist eine Aminosäuresequenz des von der Rinder-Hypophyse stammenden Liganden-Polypeptids. Die Aminosäuresequenz entspricht der 34. bis 55. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1.
[SEQ ID Nr. 11] ist eine Nucleotidsequenz der DNA, die für das von der Rinder-Hypophyse stammenden Liganden-Polypeptid (SEQ ID Nr. 3) codiert.
[SEQ ID Nr. 12] ist eine Nucleotidsequenz der DNA, die für das von der Rinder-Hypophyse stammenden Liganden-Polypeptid (SEQ ID Nr. 4) codiert.
[SEQ ID Nr. 13] ist eine Nucleotidsequenz der DNA, die für das von der Rinder-Hypophyse stammenden Liganden-Polypeptid (SEQ ID Nr. 5) codiert.
[SEQ ID Nr. 14] ist eine Nucleotidsequenz der DNA, die für das von der Rinder-Hypophyse stammenden Liganden-Polypeptid (SEQ ID Nr. 6) codiert.
[SEQ ID Nr. 15] ist eine Nucleotidsequenz der DNA, die für das von der Rinder-Hypophyse stammenden Liganden-Polypeptid (SEQ ID Nr. 7) codiert.
[SEQ ID Nr. 16] ist eine Nucleotidsequenz der DNA, die für das von der Rinder-Hypophyse stammenden Liganden-Polypeptid (SEQ ID Nr. 8) codiert.
[SEQ ID Nr. 17] ist eine Nucleotidsequenz der DNA, die für das von der Rinder-Hypophyse stammenden Liganden-Polypeptid (SEQ ID Nr. 9) codiert.
[SEQ ID Nr. 18] ist eine Nucleotidsequenz der DNA, die für das von der Rinder-Hypophyse stammenden Liganden-Polypeptid (SEQ ID Nr. 10) codiert.
[SEQ ID Nr. 19] ist eine partielle Aminosäuresequenz des von der humanen Hypophyse stammenden G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins, das von dem in p19P2 eingeschlossenen, von der humanen Hypophyse stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein-cDNA-Fragment codiert wird.
[SEQ ID Nr. 20] ist eine partielle Aminosäuresequenz des von der humanen Hypophyse stammenden G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins, das von dem in p19P2 eingeschlossenen, von der humanen Hypophyse stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein-cDNA-Fragment codiert wird.
[SEQ ID Nr. 21] ist die vollständige Aminosäuresequenz des von der humanen Hypophyse stammenden G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins, das von dem in phGR3 eingeschlossenen, von der humanen Hypophyse stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein-cDNA-Fragment codiert wird.
[SEQ ID Nr. 22] ist eine partielle Aminosäuresequenz des Mauspankreas-β-Zelllinien-, von MIN6 stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins, das von dem Mauspankreas-β-Zelllinien-, von MIN6-stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein-cDNA-Fragment mit der Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 27) codiert wird, das auf den Nucleotidsequenzen der Mauspankreas-β-Zelllinien-, von MIN6 stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein- cDNA-Fragmenten stammt, die jeweils in pG3-2 und pG1-10 eingeschlossen sind.
[SEQ ID Nr. 23] ist eine partielle Aminosäuresequenz des Mauspankreas-β-Zelllinien-, von MIN6 stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteins, das von p5S38 codiert wird.
[SEQ ID Nr. 24] ist eine Nucleotidsequenz des von der humanen Hypophyse stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein-cDNA-Fragments, das in p19P2 eingeschlossen ist.
[SEQ ID Nr. 25] ist eine Nucleotidsequenz des von der humanen Hypophyse stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein-cDNA-Fragments, das in p19P2 eingeschlossen ist.
[SEQ ID Nr. 25] ist die vollständige Nucleotidsequenz der von der humanen Hypophyse stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein-cDNA, die in phGR3 eingeschlossen ist.
[SEQ ID Nr. 26] ist eine Nucleotidsequenz der Mauspankreas-β-Zelllinien-, von MIN6 stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein-cDNA, die auf den Nucleotidsequenzen der Mauspankreas-β-Zelllinien-, von MIN6 stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein-cDNA-Fragmente basiert, die jeweils in pG3-2 und pG1-10 eingeschlossen sind.
[SEQ ID Nr. 28] ist eine Nucleotidsequenz der Mauspankreas-β-Zelllinien-, von MIN6 stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorprotein-cDNA, die in p5S38 eingeschlossen ist.
[SEQ ID Nr. 29] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein codierend ist.
[SEQ ID Nr. 30] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein codierend ist.
[SEQ ID Nr. 31] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein codierend ist.
[SEQ ID Nr. 32] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein codierend ist.
[SEQ ID Nr. 33] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein codierend ist.
[SEQ ID Nr. 34] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein codierend ist.
[SEQ ID Nr. 35] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das von der Rinderhypophyse stammende Liganden-Polypeptid codierend ist, wobei der Primer durch P5-1 veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 36] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das von der Rinderhypophyse stammende Liganden-Polypeptid codierend ist, wobei der Primer durch P3-1 veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 37] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das von der Rinderhypophyse stammende Liganden-Polypeptid codierend ist, wobei der Primer durch P3-2 veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 38] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das von der Rinderhypophyse stammende Liganden-Polypeptid codierend ist, wobei der Primer durch PE veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 39] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das von der Rinderhypophyse stammende Liganden-Polypeptid codierend ist, wobei der Primer durch PDN veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 40] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das von der Rinderhypophyse stammende Liganden-Polypeptid codierend ist, wobei der Primer durch FB veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 41] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das von der Rinderhypophyse stammende Liganden-Polypeptid codierend ist, wobei der Primer durch FC veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 42] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das von der Rinderhypophyse stammende Liganden-Polypeptid codierend ist, wobei der Primer durch BOVF veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 43] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das von der Rinderhypophyse stammende Liganden-Polypeptid codierend ist, wobei der Primer durch BOVR veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 44] ist eine komplette Aminosäuresequenz des vom Rindergenom stammenden Liganden-Polypeptids.
[SEQ ID Nr. 45] ist eine komplette Aminosäuresequenz des Liganden-Polypeptids vom Rattentyp, die von der in pRAV3 eingeschlossenen cDNA codiert wird.
[SEQ ID Nr. 46] ist eine komplette Nucleotidsequenz der Liganden-Polypeptid-cDNA vom Rattentyp.
[SEQ ID Nr. 47] ist eine Aminosäuresequenz des Liganden-Polypeptids vom Rattentyp. Die Aminosäuresequenz entspricht der 22. bis 52. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 45.
[SEQ ID Nr. 48] ist eine Aminosäuresequenz des Liganden-Polypeptids vom Rattentyp. Die Aminosäuresequenz entspricht der 22, bis 53. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 45.
[SEQ ID Nr. 49] ist eine Aminosäuresequenz des Liganden-Polypeptids vom Rattentyp. Die Aminosäuresequenz entspricht der 22. bis 54. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 45.
[SEQ ID Nr. 50] ist eine Aminosäuresequenz des Liganden-Polypeptids vom Rattentyp. Die Aminosäuresequenz entspricht der 33. bis 52. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 45.
[SEQ ID Nr. 51] ist eine Aminosäuresequenz des Liganden-Polypeptids vom Rattentyp. Die Aminosäuresequenz entspricht der 33. bis 53. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 45.
[SEQ ID Nr. 52] ist eine Aminosäuresequenz des Liganden-Polypeptids vom Rattentyp. Die Aminosäuresequenz entspricht der 33. bis 54. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 45.
[SEQ ID Nr. 53] ist eine Nucleotidsequenz, die für das Liganden-Polypeptid vom Rattentyp mit SEQ ID Nr. 47 codiert.
[SEQ ID Nr. 54] ist eine Nucleotidsequenz, die für das Liganden-Polypeptid vom Rattentyp mit SEQ ID Nr. 48 codiert.
[SEQ ID Nr. 55] ist eine Nucleotidsequenz, die für das Liganden-Polypeptid vom Rattentyp mit SEQ ID Nr. 49 codiert.
[SEQ ID Nr. 56] ist eine Nucleotidsequenz, die für das Liganden-Polypeptid vom Rattentyp mit SEQ ID Nr. 50 codiert.
[SEQ ID Nr. 57] ist eine Nucleotidsequenz, die für das Liganden-Polypeptid vom Rattentyp mit SEQ ID Nr. 51 codiert.
[SEQ ID Nr. 58] ist eine Nucleotidsequenz, die für das Liganden-Polypeptid vom Rattentyp mit SEQ ID Nr. 52 codiert.
[SEQ ID Nr. 59] ist die komplette Aminosäuresequenz des Liganden-Polypeptids vom humanen Typ, das von der in pH0B7 eingeschlossenen cDNA codiert wird.
[SEQ ID Nr. 60] ist die komplette Aminosäuresequenz der Polypeptid-cDNA vom humanen Typ.
[SEQ ID Nr. 61] ist eine Aminosäuresequenz des Liganden-Polypeptids vom humanen Typ. Die Aminosäuresequenz entspricht der 23. bis 53. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 59.
[SEQ ID Nr. 62] ist eine Aminosäuresequenz des Liganden-Polypeptids vom humanen Typ. Die Aminosäuresequenz entspricht der 23. bis 54. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 59.
[SEQ ID Nr. 63] ist eine Aminosäuresequenz des Liganden-Polypeptids vom humanen Typ. Die Aminosäuresequenz entspricht der 23. bis 55. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 59.
[SEQ ID Nr. 64] ist eine Aminosäuresequenz des Liganden-Polypeptids vom humanen Typ. Die Aminosäuresequenz entspricht der 34. bis 53. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 59.
[SEQ ID Nr. 65] ist eine Aminosäuresequenz des Liganden-Polypeptids vom humanen Typ. Die Aminosäuresequenz entspricht der 34. bis 54. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 59.
[SEQ ID Nr. 66] ist eine Aminosäuresequenz des Liganden-Polypeptids vom humanen Typ. Die Aminosäuresequenz entspricht der 34. bis 55. Position der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 59.
[SEQ ID Nr. 67] ist eine Nucleotidsequenz, die für das Liganden-Polypeptid vom humanen Typ mit SEQ ID Nr. 61 codiert.
[SEQ ID Nr. 68] ist eine Nucleotidsequenz, die für das Liganden-Polypeptid vom humanen Typ mit SEQ ID Nr. 62 codiert.
[SEQ ID Nr. 69] ist eine Nucleotidsequenz, die für das Liganden-Polypeptid vom humanen Typ mit SEQ ID Nr. 63 codiert.
[SEQ ID Nr. 70] ist eine Nucleotidsequenz, die für das Liganden-Polypeptid vom humanen Typ mit SEQ ID Nr. 64 codiert.
[SEQ ID Nr. 71] ist eine Nucleotidsequenz, die für das Liganden-Polypeptid vom humanen Typ mit SEQ ID Nr. 65 codiert.
[SEQ ID Nr. 72] ist eine Nucleotidsequenz, die für das Liganden-Polypeptid vom humanen Typ mit SEQ ID Nr. 66 codiert.
[SEQ ID Nr. 73] ist eine partielle Aminosäuresequenz des Liganden-Polypeptids, wobei Xaa in der 10. Position Ala oder Thr ist, Xaa der 11. Position Gly oder Ser ist und Xaa in der 21. Position H, Gly oder GlyArg ist.
[SEQ ID Nr. 74] ist eine partielle Aminosäuresequenz des Liganden-Polypeptids, wobei Xaa in der 3. Position Ala oder Thr ist, Xaa der 5. Position Gly oder Arg ist und Xaa in der 10. Position Ile oder Thr ist.
[SEQ ID Nr. 75] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das Liganden-Polypeptid vom Rattentyp codierend ist, wobei der Primer durch RA veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 76] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das Liganden-Polypeptid vom Rattentyp codierend ist, wobei der Primer durch RC veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 77] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das Liganden-Polypeptid vom Rattentyp codierend ist, wobei der Primer durch rF veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 78] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das Liganden-Polypeptid vom Rattentyp codierend ist, wobei der Primer durch rR veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 79] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das Liganden-Polypeptid vom humanen Typ codierend ist, wobei der Primer durch R1 veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 80] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das Liganden-Polypeptid vom humanen Typ codierend ist, wobei der Primer durch R3 veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 81] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das Liganden-Polypeptid vom humanen Typ codierend ist, wobei der Primer durch R4 veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 82] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das Liganden-Polypeptid vom humanen Typ codierend ist, wobei der Primer durch HA veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 83] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das Liganden-Polypeptid vom humanen Typ codierend ist, wobei der Primer durch HB veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 84] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das Liganden-Polypeptid vom humanen Typ codierend ist, wobei der Primer durch HE veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 85] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das Liganden-Polypeptid vom humanen Typ codierend ist, wobei der Primer durch HF veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 86] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das Liganden-Polypeptid vom humanen Typ codierend ist, wobei der Primer durch 5H veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 87] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das Liganden-Polypeptid vom humanen Typ codierend ist, wobei der Primer durch 3HN veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 88] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein vom Rattentyp (UHR-1) codierend ist, wobei der Primer durch rRECF veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 89] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein vom Rattentyp (UHR-1) codierend ist, wobei der Primer durch rRECR veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 90] ist eine synthetische DNA, die zur Amplifizierung von G3PDH, UHR-1 und einem Liganden verwendet wird, wobei der Primer durch r19F veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 91] ist eine synthetische DNA, die zur Amplifizierung von G3PDH, UHR-1 und einem Liganden verwendet wird, wobei der Primer durch r19R veranschaulicht ist.
[SEQ ID Nr. 92] ist ein N-terminales Peptid des Liganden-Polypeptids, das für ein Antigen verwendet wird (Peptid-I).
[SEQ ID Nr. 93] ist ein C-terminales Peptid des Liganden-Polypeptids, das für ein Antigen verwendet wird (Peptid-II).
[SEQ ID Nr. 94] ist ein Peptid des zentralen Teils im Liganden-Polypeptid, das für ein Antigen verwendet wird (Peptid-III).
[SEQ ID Nr. 95] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein vom Rattentyp (UHR-1) codierend ist.
[SEQ ID Nr. 96] ist ein synthetischer DNA-Primer zum Screenen einer cDNA, die für das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein vom Rattentyp (UHR-1) codierend ist.

Die als INVαF/p19P2 bezeichnete Transformante von Escherichia coli, die in dem hier unten erwähnten Beispiel 2 erhalten wird, ist gemäß den Bedingungen des Budapester Abkommens am 9. August 1994 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology (NIBH), Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, hinterlegt worden, und ihr ist die Hinterlegungsnummer FERM BP-4776 zugeordnet worden. Seit dem 22. August 1994 ist sie auch beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO) hinterlegt, und ihr ist die Hinterlegungsnummer IFO 15739 zugeordnet worden.
Die als INVαF'/pG3-2 bezeichnete Transformante von Escherichia coli, die in dem hier unten erwähnten Beispiel 4 erhalten wird, ist gemäß den Bedingungen des Budapester Abkommens am 9. August 1994 beim NIBH hinterlegt worden, und ihr ist die Hinterlegungsnummer FERM BP-4775 zugeordnet worden. Seit dem 22. August 1994 ist sie auch beim IFO hinterlegt, und ihr ist die Hinterlegungsnummer IFO 15740 zugeordnet worden.
Die als JM109/phGR3 bezeichnete Transformante von Escherichia coli, die in dem hier unten erwähnten Beispiel 5 erhalten wird, ist gemäß den Bedingungen des Budapester Abkommens am 27 September 1994 beim NIBH hinterlegt worden, und ihr ist die Hinterlegungsnummer FERM BP-4807 zugeordnet worden. Seit dem 22. September 1994 ist sie auch beim IFO hinterlegt, und ihr ist die Hinterlegungsnummer IFO 15748 zugeordnet worden.
Die als JM109/p5S38 bezeichnete Transformante von Escherichia coli, die in dem hier unten erwähnten Beispiel 8 erhalten wird, ist gemäß den Bedingungen des Budapester Abkommens am 27 Oktober 1994 beim NIBH hinterlegt worden, und ihr ist die Hinterlegungsnummer FERM BP-4856 zugeordnet worden. Seit dem 25. Oktober 1994 ist sie auch beim IFO hinterlegt, und ihr ist die Hinterlegungsnummer IFO 15754 zugeordnet worden.
Die als JM109/pBOV3 bezeichnete Transformante von Escherichia coli, die in dem hier unten erwähnten Beispiel 20 erhalten wird, ist gemäß den Bedingungen des Budapester Abkommens am 13. Februar 1996 beim NIBH hinterlegt worden, und ihr ist die Hinterlegungsnummer FERM BP-5391 zugeordnet worden. Seit dem 25. Januar 1996 ist sie auch beim IFO hinterlegt, und ihr ist die Hinterlegungsnummer IFO 15910 zugeordnet worden.
Die als JM109/pRAV3 bezeichnete Transformante von Escherichia coli, die in dem hier unten erwähnten Beispiel 29 erhalten wird, ist gemäß den Bedingungen des Budapester Abkommens am 12. September 1996 beim NIBH hinterlegt worden, und ihr ist die Hinterlegungsnummer FERM BP-5665 zugeordnet worden. Seit dem 3. September 1996 ist sie auch beim IFO hinterlegt, und ihr ist die Hinterlegungsnummer IFO 16012 zugeordnet worden.
Die als JM109/pHOV7 bezeichnete Transformante von Escherichia coli, die in dem hier unten erwähnten Beispiel 32 erhalten wird, ist gemäß den Bedingungen des Budapester Abkommens am 12. September 1996 beim NIBH hinterlegt worden, und ihr ist die Hinterlegungsnummer FERM BP-5666 zugeordnet worden. Seit dem 5. September 1996 ist sie auch beim IFO hinterlegt, und ihr ist die Hinterlegungsnummer IFO 16013 zugeordnet worden.
[Industrielle Anwendung]
Die bioaktive Substanz der vorliegenden Erfindung, nämlich das Liganden-Polypeptid oder ein Amid oder Ester davon oder ein Salz davon, ein Teilpeptid davon oder die für das Liganden-Polypeptid codierende DNA, hat eine funktionsmodulierende Wirkung auf verschiedene Gewebe oder innere Organe, z.B. das Herz, die Lunge, die Leber, die Milz, den Thymus, die Niere, die Adrenaldrüsen, den Skelettmuskel, den Testikel etc. zusätzlich zur Hypophyse, dem zentralen Nervensystem oder der Pankreas und sind als Medikamente brauchbar. Weiterhin ist die Substanz zum Screening von Agonisten oder Antagonisten von G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteinen brauchbar. Die Verbindungen, die durch ein solches Screening erhalten werden können, haben auch eine funktionsmodulierende Wirkung auf die oben beschriebenen Gewebe oder inneren Organe und sind als Medikamente brauchbar.
[Beispiele]
Unten sind Arbeitsbeispiele der vorliegenden Erfindung beschrieben, die nur zu veranschaulichenden Zwecken aufgeführt sind und den Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht einschränken.
[Bezugsbeispiel 1]
Herstellung eines synthetischen DNA-Primers zur Amplifizierung der DNA-Codierung für ein G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein
Es wurde ein Vergleich von Deoxyribonucleotid-Sequenzen, die für die bekannten Aminosäuresequenzen codieren, die der ersten membranüberspannenen Domäne jeweils des vom Menschen stammenden TRH-Rezeptorproteins (HTRHR), des vom Menschen stammenden RANTES-Rezeptorproteins (L10918, HUMRANTES), dem vom humanen Burkitt-Syndrom stammenden, unbekannten Liganden-Rezeptorprotein (X68149, HSBLR1A), dem vom Menschen stammenden Somatostatin-Rezeptorprotein (L14856, HUMSOMAT), dem von der Ratte stammenden μ-Opioid-Rezeptorprotein (U02083, RNU02083), dem von der Ratte stammenden Neuromedin-B-Rezeptorprotein (M73482, HUMNMBR), dem vom Menschen stammenden muscarinischen Acetylcholin-Rezeptorprotein (X15266, HSHM4), dem von der Ratte stammenden Adrenalin-α,B-Rezeptorprotein (L08609, RATAADRE01), dem vom Menschen stammenden Somatostatin-3-Rezeptorprotein (M96738, HUMSSTR3X), dem vom Menschen stammenden C₅a-Rezeptorprotein (HUMC5AAR), dem vom Menschen stammenden, unbekannten Liganden-Rezeptorprotein (HUMRDC1A), dem vom Menschen stammenden, unbekannten Liganden-Rezeptorprotein (M84605, HU-MOPRODRE) und dem von der Ratte stammenden Adrenalin-α₂B-Rezeptorprotein (M91466, RATA2BAR) entsprechen oder fast entsprechen, gemacht. Als Ergebnis wurden hochgradig homologe Regionen oder Teile gefunden.
Weiterhin wurde ein Vergleich von Deoxynucleotid-Sequenzen, die für die bekannten Aminsäuresequenzen codierend sind, die der die 6. Membran überspannenden Domäne jeweils des von der Maus stammenden, unbekannten Liganden-Rezeptorprotein (M80481, MUSGIR), dem vom Menschen stammenden Bombesin-Rezeptorprotein (L08893, HUMBOMB3S), dem vom Menschen stammenden Adenosin-A2-Rezeptorprotein (S46950, 546950), dem von der Maus stammenden, unbekannten Liganden-Rezeptorprotein (D21061, MUSGPCR), dem von der Maus stammenden TRH-Rezeptorprotein (S43387, 543387), dem von der Ratte stammenden Neuromedin-K-Rezeptorprotein (J05189, RATNEURA), dem von der Ratte stammenden Adenosin-A1-Rezeptorprotein (M69045, RATA1ARA), dem vom Menschen stammenden Neurokinin-A-Rezeptorprotein (M57414, HUMNEKAR), dem von der Ratte stammenden Neurokinin-A-Rezeptorprotein (M94152, DATADENREC), dem vom Menschen stammenden Somatostatin-1-Rezeptorprotein (M81829, HUMSRI1A), dem vom Menschen stammenden Neurokinin-3-Rezeptorprotein (586390, S86371S54), dem von der Ratte stammenden, unbekannten Liganden-Rezeptorprotein (X61496, RNCGPCR), dem vom Menschen stammenden Somatostatin-4-Rezeptorprotein (L07061, HUMSSTR4Z) und dem von der Ratte stammenden GnRH-Rezeptorprotein (M31670, RATGNRHA) entsprechen oder fast entsprechen, gemacht. Als Ergebnis wurden hochgradig homologe Regionen oder Teile gefunden.
Die oben erwähnten Abkürzungen in Klammern sind Kennzahlen (Bezugszahlen), die aufgeführt werden, wenn die GenBank/EMBL-Datenbank unter Verwendung der DNASIS-Gen/Protein-Sequenzierungs-Datenbank (CD019, Hitachi Software Engineering, Japan) abgefragt wird, und sie werden gewöhnlich als "Hinterlegungsnummern" oder "Eingangsnummern" bezeichnet. HTRHR ist jedoch die Sequenz, die in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 304797/1993 (EPA 638645) offenbart ist.
Insbesondere war geplant, gemischte Basen auf der Grundlage der Basenregionen, die sich in Übereinstimmung mit cDNA befanden, die für eine große Anzahl von Rezeptorproteinen codieren, einzuarbeiten, um die Basen-Übereinstimmung von Sequenzen mit so vielen Rezeptor-cDNA wie möglich sogar in anderen Regionen zu erhöhen. Auf der Grundlage dieser Sequenzen wurde die degenerierte synthetische DIVA mit einer durch SEQ ID Nr. 29 oder SEQ ID Nr. 30 veranschaulichte Nucleotidsequenz, die zur homologen Nucleotidsequenz komplementär ist, hergestellt.
[Synthetische DNA]

5'-CGTGG(G oder C)C(A oder C)T(G oder C)(G oder C)TGGGCAAC(A, G, C oder T)(C oder T)CCTG-3' (SEQ ID Nr. 29)
5'-GT(A, G, C oder T)G(A oder T)(A oder G)(A oder G)GGCA(A, G, C oder T)CCAGCAGA(G oder T)GGCAAA-3' (SEQ ID Nr. 30)

Die Klammern deuten darauf hin, dass die Einarbeitung einer Mehrzahl von Basen bei der Primerherstellung zu mehreren Oligonucleotiden führt. In anderen Worten wurden zum Zeitpunkt der Synthese bei den oben erwähnten DNA die Nucleotidreste in Klammern in Gegenwart einer Mischung von mehreren Basen eingearbeitet.
[Beispiel 1]
Amplifizierung von Rezeptor-cDNA mittels PCR unter Verwendung einer von der humanen Hypophyse stammenden cDNA
Unter Verwendung einer von der humanen Hypophyse stammenden cDNA (QuickClone, CLONTECH Laboratories, Inc.) als Matrize wurde eine PCR-Amplifizierung unter Verwendung der in Bezugsbeispiel 1 hergestellten DNA-Primer durchgeführt. Die Zusammensetzung der Reaktionslösung bestand aus den synthetischen DNA-Primern (SEQ: 5'-Primersequenz und 3'-Primersequenz) jeweils in einer Menge von 1 μM, 1 ng der Matrizen-cDNA, 0,25 mM dNTPs, 1 μl Taq-DNA-Polymerase und ein am Enzymkit gebundener Puffer, und die Gesamtmenge der Reaktionslösung wurde auf 100 μl gebracht. Der Amplifizierungszyklus, der 1 min lang 95°C, 1 min lang 55°C und 1 min lang 72°C einschloss, wurde 30 Mal unter Verwendung eines Thermal Cycler (Perkin-Elmer Co.) wiederholt. Vor der Zugabe von Taq-DNA-Polymerase wurde die verbleibende Reaktionslösung gemischt und 5 min bei 95°C und 5 min lang bei 65°C erwärmt. Die amplifizierten Produkte wurden mittels Elektrophorese an 1,2% Agarosegel und einem Anfärben mit Ethidiumbromid bestätigt.
[Beispiel 2]
Subklonierung des PCR-Produkts in einen Plasmidvektor und Auswahl eines neuen Kandidaten für einen Rezeptorklon über das Decodieren der Nucleotidsequenz der insertierten cDNA-Region
Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung von 0,8% eines bei tiefer Temperatur schmelzenden Agarosegels getrennt, die Bandenteile wurden mit einer Rasierklinge aus dem Gel ausgeschnitten und in der Wärme geschmol zen, mit Phenol extrahiert und in Ethanol ausgefällt, um DNA zu isolieren. Die isolierten DNA wurden nach dem Protokoll, das einen TA-Cloning Kit (Invitrogen Co.) beilag, in den Plasmid-Vektor pCR^TM II (wobei TM eine eingetragene Marke darstellt) subkloniert. Die rekombinanten Vektoren wurden in E. coli INVαF'-kompetente Zellen (Invitrogen Co.) eingeführt, wodurch Transformanten erzeugt wurden. Dann wurden transformante Klone mit einem cDNA-insertierten Fragment in einem LB-Agar-Kulturmedium, das Ampicillin und X-gal enthielt, ausgewählt. Nur transformante Klone mit weißer Farbe wurden mit einem sterilisierten Zahnstocher entfernt, wodurch die Transformante Escherichia coli INVαF'/p19P2 erhalten wurde.
Die einzelnen Klone wurden über Nacht in einem Ampicillin enthaltenden LB-Kulturmedium kultiviert und mit einer automatischen Plasmid-Extraktionsmaschine (Kurabo Co., Japan) behandelt, wodurch Plasmid-DNA hergestellt wurden. Ein Aliquot der so hergestellten DNA wurde mit EcoRI geschnitten, um die Größe des insertierten cDNA-Fragments zu bestätigen. Ein Aliquot der verbliebenen DNA wurde mit RNase weiterbearbeitet, mit Phenol/Chloroform extrahiert und in Ethanol ausgefällt, um kondensiert zu werden. Eine Sequenzierung erfolgte unter Verwendung eines DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (ABI Co.), die DNA wurden mittels eines automatischen Fluoreszenz-Sequencers decodiert, und die Daten der erhaltenen Nucleotidsequenzen wurden mittels DNASIS (Hitachi System Engineering Col, Japan) gelesen. Die unterstrichenen Bereiche stellen Regionen dar, die den synthetischen Primern entsprechen.
Eine Homologiebestimmung wurde auf der Grundlage der bestimmten Nucleotidsequenzen [SEQ ID Nr. 24 und 25 (hier ist die bestimmte Nucleotidsequenz diejenige Nucleotidsequenz, bei der der unterstrichene Bereich aus der Sequenz von 1 bzw. 2 gelöscht wurde)].
Als Ergebnis wurde festgestellt, dass ein neues G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein vom cDNA-Insert im Plasmid, p19P2, aus der Transformanten Escherichia coli INVαF'/p19P2 codiert wurde. Um dies mittels DNASIS (Hitachi System Engineering Co., Japan) weiter zu bestätigen, wurden die Nucleotidsequenzen in Aminosäuresequenzen [SEQ ID Nr. 19 und 20] umgewandelt, und eine Homologiebestimmung wurde mit Hinsicht auf eine graphische Darstellung der Hydrophobie [3 und 4] und auf dem Niveau der Aminosäuresequenz durchgeführt, um eine Homologie in Bezug auf Neuropeptid-Y-Rezeptorproteine [5] zu finden.
[Beispiel 3]
Herstellung einer Poly(A)-⁺RNA-Fraktion aus Mauspankreas-β-Zellstämmen MIN6 und Synthese von cDNA
Eine Gesamt-RNA wurde aus dem Mauspankreas-β-Zellstamm MIN6 (Jun-ichi Miyazaki et al, Endocrinology, Band 127, Nr. 1, S. 126–132) nach dem Guanidinthiocyanat-Verfahren (B. B. Kaplan et al., Biochem. J., 183, 181–184 (1979) hergestellt, und dann wurden Poly(A)-⁺RNA-Fraktionen mit einem mRNA-Reinigungskit (Pharmacial Co.) hergestellt. Als Nächstes wurden 5 μg der Poly(A)-⁺RNA-Fraktion zu einem statistischen DNA-Hexamer (BRL Co.) als Primer gegeben, und die resultierende Mischung wurde einer Umsetzung mit Maus-Moloney-Leukämievirus (MMLV)-reverse-Transkriptase (BRL Co.) in dem dem MMLV-reverse-Transkriptase-Kit beiliegenden Puffer unterzogen, wodurch komplementäre DNA synthetisiert wurden. Das Reaktionsprodukt wurde mit Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert, in Ethanol ausgefällt und dann in 30 μl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl bei einem pH-Wert von 8,0, 1 mM EDTA bei einem pH-Wert von 8,0) gelöst.
[Beispiel 4]
Amplifizierung von Rezeptor-cDNA mittels PCR unter Verwendung einer von MIN6 stammenden cDNA und Sequenzierung
Unter Verwendung von 5 μl cDNA aus dem obigen Beispiel 3, die aus dem Mauspankreas-β-Zellstamm MIN6 hergestellt war, als Matrize wurde eine PCR- Amplifikation unter Verwendung der in Bezugsbeispiel 1 synthetisierten DNA-Primer unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt. Das resultierende PCR-Produkt wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 in den Plasmidvektor pCRTM II subkloniert, wodurch ein Plasmid, pG3-2, erhalten wurde. Das Plasmid pG3-2 wurde in E. coli INVαF' transfiziert, wodurch transformierte Escherichia coli, INVαF'/pG3-2, erhalten wurde.
Unter Verwendung von 5 μl der cDNA aus dem obigen Beispiel 3, die aus dem Mauspankreas-β-Zellstamm MIN6 hergestellt war, als Matrize wurde eine PCR-Amplifikation mit PCR-Primern, die in F. Libert et al., "Science, 244: 569–572, 1989" offenbart sind, d.h. einem degenerierten synthetischen Primer, der durch die folgende Sequenz:

5'-CTGTG(C oder T)G(C oder T)(G oder C)AT(C oder T)GCIIT(G oder T) GA(C oder T)(A oder C)G(G oder C)TAC-3' (SEQ ID Nr. 31)

5'-A(G oder T)G(A oder T)AG(A oder T)AGGGCAGCCAGCAGAI(G oder C) (A oder G)(C oder T)GAA-3' (SEQ ID Nr. 32)

^TM

Die Reaktion zur Bestimmung der Nucleotidsequenz (Sequenzierung) wurde mit einem DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (ABI Co.) durchgeführt, die DNA wurde mittels eines automatischen Fluoreszenz-Sequencers (ABI Co.) decodiert, und die Daten der erhaltenen Nucleotidsequenz wurden mittels DNASIS (Hitachi System Engineering Col, Japan) analysiert.
6 zeigt eine vom Mauspankreas-β-Zellstamm MIN6 stammende, G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein codierende DNA (SEQ ID Nr. 27) und eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 22), die von der isolierten DNA auf der Grundlage der Nukleotidsequenzen der Plasmide pG3-2 und pG1-10, die in der Transformanten Escherichia coli INVαF'/pG3-2 enthalten sind, codiert werden. Die unterstrichenen Bereiche stellen Regionen dar, die den synthetischen Primern entsprechen.
Eine Homologiebestimmung wurde auf der Grundlage der bestimmten Nucleotidsequenz [6] durchgeführt. Als Ergebnis wurde ermittelt, dass ein neues G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein vom erhaltenen cDNA-Fragment codiert wurde. Um dies weiter zu bestätigen, wurde die Nucleotidsequenz mittels DNASIS (Hitachi System Engineering Col, Japan) in eine Aminosäuresequenz [6] umgewandelt, eine graphische Darstellung der Hydrophobie wurde erstellt, um das Vorhandensein von sechs hydrophoben Regionen zu bestätigen [8]. Beim Vergleich der Aminosäuresequenz mit derjenigen von p19P2, die in Beispiel 2 erhalten wurde, wurde weiterhin ein hoher Homologiegrad gefunden, wie in [7] dargestellt ist. Als Ergebnis besteht die starke Vermutung, dass von pG3-2 und pG1-10 codierte G-Protein-gekoppelte Rezeptorproteine denselben Liganden wie das von p19P2 codierte Protein-gekoppelte Rezeptorprotein erkennen, obwohl die tierischen Spezies, von denen die von pG3-2 und pG1-10 stammen, von demjenigen verschieden sind, aus dem das von p19P2 codierte Rezeptorprotein stammt.
[Beispiel 5]
Klonierung von cDNA, die komplette Codierungsbereiche für ein Rezeptorprotein umfasst, aus einer von der humanen Hypophyse stammenden cDNA-Bank
Die von der Clontech Co. entworfene DNA-Bank, bei der der Phagenvektor λ gt11 (CLONTECH Laboratories, Inc.; CLH L1139b) verwendet wird, wurde als von der humanen Hypophyse stammende cDNA-Bank verwendet. Die humane Hypophysen-cDNA-Bank (2 × 10⁶ pfu (plaqueformende Einheit)) wurde mit E. coli Y1090^–, das mit Magnesiumsulfat behandelt worden war, vermischt und 15 min lang bei 37°C inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 0,5% Agarose (Pharmacia Co.) LB. Das E. coli wurde auf einer LB-Platte mit 1,5% Agarose (Wako-Junyaku Co.) (die 50 μg/ml Ampicillin enthielt) ausplattiert. Ein Nitrocellulosefilter wurde auf die Platte gelegt, auf der sich Plaques bildeten, und der Plaque wurde auf den Filter übertragen. Der Filter wurde mit einem Alkali denaturiert und dann 3 h lang auf 80°C erwärmt, um die DNA zu fixieren.
Der Filter wurde über Nacht bei 42°C zusammen mit der unten erwähnten Sonde in einem Puffer inkubiert, der 50% Formamid, 5 × SSPE (20 × SSPE (pH-Wert 7,4) ist 3 M NaCl, 0,2 M NaH₂PO₄·H₂O, 25 mM EDTA), 5 × Denhardt-Lösung (Nippon Gene, Japan), 0,1% SDS und 100 μg/ml Lachssperma-DNA zur Hybridisierung enthielt.
Die verwendete Sonde wurde erhalten, indem das DNA-Fragment, das in das in Arbeitsbeispiel 2 erhaltene Plasmid p19P2 insertiert war, mit EcoRI zerschnitten wurde, gefolgt von der Isolierung und Markierung durch die Einarbeitung von [³²P]dCTP (Dupont Co.) mit einem statistisch primenden DNA-Markierungskit (Amasham Co.).
Es wurde mit 2 × SSC (20 × SSC ist 3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat), 0,1% SDS 1 h lang bei 55°C gewaschen und dann einer Autoradiographie bei –80°C unterzogen, um hybridisierte Plaques nachzuweisen.
Bei diesem Screening wurden Hybridisierungssignale in drei unabhängigen Plaques erkannt. Jede DNA wurde aus den drei Klonen hergestellt. Die mit EcoRI aufgeschlossenen DNA wurden einer Elektrophorese an Agarose unterzogen und mittels Southern Blotting unter Verwendung derselben Sonde wie derjenigen, die beim Screening verwendet wurde, analysiert. Hybridisierungsbanden wurden bei etwa 0,7 kb, 0,8 kb bzw. 2,0 kb identifiziert. Von diesen wurde das DNA-Fragment ausgewählt, das der Bande bei etwa 2,0 kb (λ hGR3) entsprach. Das von λ hGR3 stammende EcoRI-Fragment mit einer hybridisierbaren Größe wurde an die EcoRI-Stelle des Plasmids pUC18 subkloniert, und E. coli JM109 wurde mit dem Plasmid transformiert, wodurch die Transformante E. coli JM109/phGR3 erhalten wurde. Eine Restriktionsenzym-Karte des Plasmids phGR3 wurde unter Bezugnahme auf eine Restriktionsenzym-Karte, die aus der in Beispiel 2 veranschaulichten Nucleotidsequenz abgeleitet wurde, hergestellt. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass sie eine Rezeptorprotein-codierende DNA mit voller Länge trug, was aus der in Beispiel 2 veranschaulichten Rezeptorprotein-codierenden DNA vorhergesagt wurde.
[Beispiel 6]
Sequenzierung einer von der humanen Hypophyse stammenden Rezeptorprotein-cDNA
Von den EcoRI-Fragmenten, die in das im obigen Beispiel 5 erhaltene Plasmid phGR3 insertiert waren, wurde die Nucleotidsequenz von EcoRI bis NheI mit etwa 1330 bp, die als Rezeptorprotein-codierende Region betrachtet wird, sequenziert. Konkret gesagt wurden durch die Verwendung von Restriktionsenzymstellen, die in den EcoRI-Fragmenten vorhanden sind, unnötige Teile entfernt oder notwendige Fragmente subkloniert, um Matrizenplasmide zur Analysierung der Nucleotidsequenz herzustellen.
Die Reaktion zur Bestimmung der Nucleotidsequenz (Sequenzierung) wurde mit einem DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (ABI Co.) durchgeführt, die DNA wurde mittels eines automatischen Fluoreszenz-Sequencers (ABI Co.) decodiert, und die Daten der erhaltenen Nucleotidsequenz wurden mittels DNASIS (Hitachi System Engineering Col, Japan) analysiert.
9 zeigt eine Nucleotidsequenz unmittelbar nach der EcoRI-Stelle bis zur NheI-Stelle, die von phGR3 codiert wird. Die Nucleotidsequenz der von der humanen Hypophyse stammenden, Rezeptorprotein codierenden DNA entspricht der Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 26) vom 118. bis zum 1227. Nucleotid [9]. Eine Aminosäuresequenz des Rezeptorproteins, die von der Nucleotidsequenz codiert wird, ist in SEQ ID Nr. 21 veranschaulicht.
[Beispiel 7]
Northern-Hybridisierung mit von humaner Hypophyse stammenden, proteincodierenden phGR3
Ein Northern Blotting wurde durchgeführt, um die Expression von in Beispiel 5 erhaltenen, phGR3-codierten, von der humanen Hypophyse stammenden Rezeptorproteinen in der Hypophyse auf mRNA-Niveau nachzuweisen. Humane-Hypophysen-mRNA (2,5 μg, Clontech Co.) wurde als Matrizen-mRNA verwendet, und dieselbe Sonde, die in Arbeitsbeispiel 5 verwendet wurde, wurde als Sonde verwendet. Eine Nylonmembran (Pall Biodyne, USA) wurde als Filter für das Northern Blotting und die Migration der mRNA verwendet, und ihre Adsorption (ihr Aufsaugen) mit dem Blotting-Filter erfolgte nach dem Verfahren, das in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, offenbart ist.
Die Hybridisierung erfolgte, indem der oben erwähnte Filter und die Sonde über Nacht bei 42°C in einem Puffer inkubiert wurde, der 50% Formamid, 5 × SSPE, 5 × Denhardt-Lösung, 0,1% SDS und 100 μg/ml Lachssperma-DNA enthielt. Der Filter wurde mit 0k1 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C gewaschen und diente nach einem Trocknen an Luft drei Tage lang zur Belichtung eines Röntgenfilms (XAR5, Kodak). Die Ergebnisse entsprachen der Darstellung in 10, woraus entnommen wird, dass das von phGR3 codierte Rezeptorgen in der humanen Hypophyse exprimiert wird.
[Beispiel 8]
Amplifizierung von Rezeptor-cDNA mittels PCR unter Verwendung einer von MIN6 stammenden cDNA und Sequenzierung
Unter Verwendung von 5 μl cDNA, die aus dem Mauspankreas-β-Zellstamm MIN6 in Arbeitsbeispiel 3 hergestellt wurde, als Matrize wurde eine PCR-Amplifizierung unter Verwendung der in Beispiel 4 synthetisierten DNA-Primer, die in F. Libert et al., "Science 244: 569–572, 1989" offenbart sind, d.h. eines synthetischen Primers, der durch die folgende Sequenz:

^TM

Die Reaktion zur Bestimmung der Nucleotidsequenz (Sequenzierung) wurde mit einem DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (ABI Co.) durchgeführt, die DNA wurde mittels eines automatischen Fluoreszenz-Sequencers (ABI Co.) decodiert, und die Daten der erhaltenen Nucleotidsequenz wurden mittels DNASIS (Hitachi System Engineering Col, Japan) gelesen.
12 zeigt eine vom Mauspankreas-β-Zellstamm MIN6 stammende, G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein codierende DNA (SEQ ID Nr. 28) und eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 23), die von der isolierten DNA auf der Grundlage der Nucleotidsequenz des Plasmids p5S538 codiert wird. Die unterstrichenen Bereiche stellen Regionen dar, die den synthetischen Primern entsprechen.
Eine Homologiebestimmung erfolgte auf der Grundlage der bestimmten Nucleotidsequenz [12]. Als Ergebnis wurde ermittelt, dass ein neues, G-Protein-gekoppeltes Rezeptorprotein vom erhaltenen cDNA-Fragment codiert wurde. Um dies weiter zu bestätigen, wurde die Nucleotidsequenz unter Verwendung von DNASIS (Hitachi System Engineering Co., Japan) in eine Aminosäuresequenz [12] umgewandelt, und eine graphische Darstellung der Hydrophobie wurde durchgeführt, um das Vorhandensein von vier hydrophoben Regionen [14] zu bestätigen. Beim Vergleich der Aminosäuresequenz mit denjenigen, die von dem in Beispiel 2 erhaltenen p19P2 und dem in Beispiel 4 erhaltenen pG3-2 codiert werden, wurde weiterhin ein hoher Homologiegrad gefunden, wie in 13 veranschaulicht ist. Als Ergebnis besteht die starke Vermutung, dass das Mauspankreas-β-Zellstamm-, von MIN6 stammende, G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein, das von p5S38 codiert wird, denselben Liganden wie das von der humanen Hypophyse stammende, G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein, das von p19P2 codiert wird, erkennt, obwohl die tierische Spezies, von der das von p5S38 codierte Rezeptorprotein stammt, von demjenigen verschieden ist, von dem das von p19P2 codierte Rezeptorprotein stammt. Es besteht auch die starke Vermutung, dass das Mauspankreas-β-Zellstamm-, von MIN6 stammende, G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein, das von p5S38 codiert wird, denselben Liganden wie die Mauspankreas-β-Zellstamm-, von MIN6 stammenden, G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteine, die von pG3-2 und pG1-10 codiert werden, erkennen, und dass sie einander analoge Rezeptorproteine (ein sogenannter "Subtyp") sind.
[Beispiel 9]
Herstellung von CHO-Zellen, die phGR3 exprimieren
Das Plasmid phGR3 (Beispiel 5), das eine cDNA enthält, die die volle Länge der Aminosäuresequenz des humanen Hypophysen-Rezeptorproteins codiert, wurde mit dem Restriktionsenzym NcoI aufgeschlossen und einer Elektrophorese an Agarosegel unterzogen, und ein Fragment mit etwa 1 kb wurde isoliert. Beide Enden des isolierten Fragments wurden mit einem Kit zur Bildung eines DNA-Moleküls mit Blunt-Enden (Takara Shuzo Co., Japan) mit einem Blunt-Ende versehen und mit dem zugegebenen SalI-Linker mit SalI behandelt und in die SalI-Stelle von pUC119 insertiert, wodurch das Plasmid 510 erhalten wurde. Dann wurde 510 mit SalI und SacII behandelt, wodurch ein Fragment von etwa 700 bp (das die N-terminate codierende Region enthielt) hergestellt wurde. Dann wurde ein Fragment von etwa 700 bp (das die C-terminate codierende Region einschließlich Initiierungs- und Terminierungscodons enthielt) mit SacII und NheI aus phGR3 ausgeschnitten. Diese beiden Fragmente wurden zum Tierzellen-Expressionsvektorplasmid pAKKO111H (dasjenige Vektorplasmid, das mit dem in Biochim. Biophys. Acta, S. Hinuma et al., 1219, 251–259, 1994 beschriebenen pAKKO1.11 H identisch ist) gegeben, und eine Ligationsreaktion wurde durchgeführt, wodurch ein Rezeptorprotein-Expressionsplasmid pAKKO-19P2 mit voller Länge konstruiert wurde.
Mit pAKKO-19P2 transfiziertes E. coli wurde kultiviert, und das pAKKO-19P2-Plasmid wurde mittels QIAGEN Maxi einer Massenproduktion unterzogen. Ein 20-μg-Teil der Plasmid-DNA wurde in 1 ml sterilem PBS aufgelöst, und in einer Genübertragungsampulle (Wako Pure Chemical Ind.) wurde die Lösung zur Ribosomenbildung einer gründlichen Wirbelbehandlung unterzogen. 125 μl dieses Ribosoms wurden zu CHOdhfr^–-Zellen gegeben, die 24 h zuvor mit 1 × 10⁶ pro Scheibe mit einem Durchmesser von 10 cm subkultiviert worden und unmittelbar vor der Zugabe in frisches Medium eingebracht worden waren, und eine über Nacht erfolgende Kultur wurde durchgeführt. Nach einer weiteren eintägigen Kultur in frischem Medium wurde das Medium gegen ein Screening-Medium ausgetauscht, und die Inkubation wurde einen Tag lang weiter ausgeführt. Für ein effizientes Screening von Transformanten wurde eine Subkultur bei einer niedrigen Zelldichte durchgeführt, und nur die Zellen, die im Screening-Medium wuchsen, wurden ausgewählt, um eine CHO-Zelllinie zur Expression eines Rezeptor-Proteins mit voller Länge, CHO-19P2, zu begründen.
[Beispiel 10]
Bestätigung der Expressionsmenge des Rezeptorproteins mit voller Länge in der CHO-19P2-Zelllinie auf Transkriptionsniveau
Unter Verwendung des FastTrack-Kits (Invitrogen) wurden CHO-Zellen, die gemäß der Anleitung zum Kit mit pAKKO-19P2 transfiziert waren, und Schein-CHO-Zellen hergestellt, um poly(A)⁺RNA herzustellen. Unter Verwendung von 0,02 μg dieser poly(A)⁺RNA wurde eine cDNA mittels eines RNA-PCR-Kits (Takara Shuzo Co., Japan) synthetisiert. Bei der verwendeten Primerart handelte es sich um ein statistisches 9mer, und das Gesamtvolumen der Reaktionsmischung betrug 40 μl. Als negative Kontrolle der cDNA-Synthese wurde auch eine von Reverse-Transkriptase freie Reaktionsmischung bereitgestellt. Zunächst wurde die Reaktionsmischung 10 min lang bei 30°C inkubiert, um in gewissem Ausmaß eine Amplifizierungsreaktion durchzuführen. Dann wurde sie 30 min lang bei 42°C inkubiert, um die Reverse-Transkriptionsreaktion fortschreiten zu lassen. Das Enzym wurde durch ein 5-minütiges Erwärmen bei 99°C inaktiviert, und das Reaktionssystem wurde 5 min lang bei 5°C gekühlt.
Nach Abschluss der Reverse-Transkriptionsreaktion wurde ein Teil der Reaktionsmischung isoliert, und nach der Verdünnung mit destilliertem Wasser wurde eine Extraktion mit Phenol/Chloroform und weiter mit Diethylether durchgeführt. Der Extrakt wurde einer Ausfällung aus Ethanol unterzogen, und das Präzipitat wurde zur Verwendung als cDNA-Probe in einer vorbestimmten Menge an destilliertem Wasser aufgelöst. Diese cDNA-Lösung und die Plasmid-DNA (pAKKO-19P2) wurden seriell verdünnt, und unter Verwendung von Primern, die für das Rezeptorprotein mit voller Länge spezifisch waren, wurde eine PCR durchgeführt. Die Sequenzen der Primer, die gemäß der Basensequenz der codierenden Region des Rezeptor-Proteins mit voller Länge hergestellt wurden, waren CTGACTTATTTTCTGGGCTGCCGC (SEQ ID Nr. 33) für das 5'-Ende und AACACCGACACATAGACGGTGACC (SEQ ID Nr. 34) für das 3'-Ende.
Die PCR-Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 100 μl unter Verwendung von jeweils 1 μM der Primer, 0,5 μl Taq-DNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Japan), des Reaktionspuffers und von dNTP, die zusammen mit dem Enzym vorlagen, und 10 μl Matrizen-DNA (cDNA oder Plasmidlösung) durchgeführt. Zuerst wurde die Reaktionsmischung einer 2-minütigen Wärmebehandlung bei 94°C unterzogen, um die Matrizen-DNA ausreichend zu denaturieren, und 25 Zyklen bei 95°C × 30 s, 65°C × 30 s und 72°C × 60 s unterzogen. Nach Abschluss der Reaktion wurden 10 μl der Reaktionsmischung einer Elektrophorese an Agarosegel unterzogen, und der Nachweis und der quantitative Vergleich der Amplifizierungsprodukte wurde durchgeführt. Als Ergebnis wurde ein PCR-Produkt mit der Größe (400 bp), das aus der cDNA-Codierung für das Rezeptorprotein mit voller Länge vorhersagbar war, nachgewiesen [15]. Auf der Spur der PCR-Reaktionsmischung, bei der das Produkt des von Reverse-Transkriptase freien Transkriptionssystems als Matrize verwendet wurde, wurde keine spezifische Bande nachgewiesen, wodurch die Möglichkeit ausgeschlossen wurde, dass es sich um ein PCR-Produkt handelte, das von der genomischen DNA der CHO-Zellen stammte. Darüber hinaus erschien auch in der Spur der Scheinzellen keine spezifische Bande. Daher war klar, dass das Produkt nicht von der mRNA stammte, die ursprünglich in CHO-Zellen exprimiert wird [15].
[Beispiel 11]
Nachweis der Aktivität zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen in einem Ratten-Vollgehirnextrakt
Eine rohe Peptidfraktion wurde aus Ratten-Vollgehirn durch das folgende Verfahren hergestellt. Das unmittelbar nach der Tötung enukleierte Ratten-Vollgehirn wurde in flüssigem Stickstoff gefroren und bei –80°C aufbewahrt. 20 g des gefrorenen Ratten-Vollgehirns (das Äquivalent von 10 Ratten) wurde fein zerteilt und in 80 ml destilliertem Wasser 10 min lang gekocht. Nach dem Abschrecken des gekochten Gewebes auf Eis wurden 4,7 ml Essigsäure mit einer Endkonzentration von 1,0 M zugegeben, und die Mischung wurde mittels eines Polytrons (20 000 U./min, 6 min) homogenisiert. Das Homogenisat wurde über Nacht gerührt und dann zentrifugiert (10 000 U./min, 20 min), um den Überstand abzutrennen. Das Sediment wurde in 40 ml 1,0 M Essigsäure homogenisiert und nochmals zentrifugiert, um den Überstand zu isolieren. Die Überstände wurden vereinigt, in 3 Volumina Aceton verdünnt, 30 min lang auf Eis stehen gelassen und zentrifugiert (10 000 U./min, 20 min), um den Überstand zu isolieren. Der isolierte Überstand wurde eingedampft, um das Aceton zu entfernen. Zum resultierenden acetonfreien Konzentrat wurden 2 Volumina 0,05%ige Trifluoressigsäure (TFA)/H₂O gegeben, und die Mischung wurde auf eine Umkehrphasen-C18-Säule (Prep C18, 125 Å, Millipore) aufgetragen. Nach dem Auftragen des Überstands wurde die Säule mit 0,05% TFA/H₂O gewaschen, und eine Gradientenelution wurde mit 10%, 20%, 30%, 40%, 50% und 60% CH₃CN/0,05% TFA/H₂O durchgeführt. Die Fraktionen wurden jeweils in 10 Aliquote aufgeteilt und lyophilisiert. Die getrocknete Probe des Ratten-Vollgehirns, die vom Äquivalent eines Tieres stammte, wurde in 20 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und in 1 ml von Hanks' gepufferter Kochsalzlösung (HBSS), die mit 0,05% Rinderserumalbumin (BSA) versetzt war, suspendiert, wodurch eine Rohpeptidfraktion erhalten wurde.
Eine Platte mit 24 Vertiefungen wurde mit den das Rezeptorprotein in voller Länge exprimierenden CHO-Zellen und Schein-CHO-Zellen mit 0,5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung beimpft und 24 h lang kultiviert. Dann wurde [³H]-Arachidonsäure bis zu einer Endkonzentration von 0,25 μCi/Vertiefung zugegeben. 16 h nach der Zugabe der [³H]-Arachidonsäure wurden die Zellen mit 0,05% BSA-HBSS gespült, und die oben erwähnte rohe Peptidfraktion wurde mit 400 μl/Vertiefung zugegeben. Die Mischung wurde 30 min lang bei 37°C inkubiert, und ein 300-μl-Teil der Reaktionsmischung (400 μl) wurde zu 4 ml eines Szintillators gegeben, und die Menge des in die Reaktionsmischung freigesetzten [³H]-Arachidonsäure-Metaboliten wurde mit einem Szintillationszähler bestimmt. Als Ergebnis wurde in der 30%igen CH₃CN-Fraktion des Eluats eine Wirkung der Freisetzung des [³H]-Arachidonsäure-Metaboliten nachgewiesen, die für das von den CHO-Zellen (CHO-19P2) exprimierte Rezeptorprotein mit voller Länge spezifisch war [16].
[Beispiel 12]
Nachweis der Aktivität zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen in einem Rinder-Hypothalamus-Extrakt
Eine rohe Peptidfraktion wurde aus 360 g (dem Äquivalent von 1 Tier) Rindergehirngewebe, das den Hypothalamus einschloss, auf dieselbe Weise wie in Beispiel 11 hergestellt. Eine getrocknete Peptidprobe pro 0,05 Tiere wurde in 40 μl DMSO gelöst und in 2 ml 0,05%igen BSA-HBSS suspendiert, und der Nachweis der Wirkung zur Freisetzung von Arachidonsäure wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 11 versucht. Als Ergebnis wurde eine Aktivität zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus der CHO-19P2-Zelllinie in derjenigen Fraktion nachgewiesen, die mit 30%igem CH₃CN aus einer C18-Säule eluiert worden war, auf die die rohe Rinder-Hypothalamus-Fraktion aufgetragen worden war [17].
[Beispiel 13]
Herstellung der Wirkung (Peptid) zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen durch eine Reinigung aus Rinder-Hypothalamus
Jetzt wird ein typisches Verfahren zur Ernte der Wirkung zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zelllinie durch eine Reinigung aus dem Rinder-Hypothalamus beschrieben. 4,0 kg einer gefrorenen Rindergehirn-Gewebeprobe, die den Hypothalamus einschloss (das Äquivalent von 80 Tieren), wurde gemahlen und in 8,0 1 destilliertem Wasser 20 min lang gekocht. Nach einem Abschrecken auf Eis wurden 540 ml Essigsäure mit einer Endkonzentration von 1,0 M zugegeben, und die Mischung wurde mittels eines Polytron (10 000 U./min, 12 min) homogenisiert. Das Homogenisat wurde über Nacht gerührt und dann zentrifugiert (9500 U./min, 20 min), wodurch ein Überstand isoliert wurde. Das Sediment wurde in 4,0 1 von 1,0 M Essigsäure suspendiert und mit dem Polytron homogenisiert und nochmals zentrifugiert, wodurch ein weiterer Überstand isoliert wurde. Die Überstände wurden vereinigt, und TFA wurde mit einer Endkonzentration von 0,05% zugegeben. Die Mischung wurde auf Umkehrphasen-C18 (Prep C18 125 Å, 160 ml; Millipore), mit dem eine Glassäule gepackt war, aufgetragen. Nach der Zugabe wurde die Säule mit 320 ml 0,05% TFA/H₂O gewaschen, und eine 3-Gradienten-Elution wurde mit 10%, 30% und 50% CH₃CN/0,05% TFA/H₂O durchgeführt. Zur 30-%-CH₃CN/0,05-%-TFA/H₂O-Fraktion wurden 2 Volumina 20 mM CH₃COONH₄/H₂O gegeben, und die Mischung wurde auf die Kationenaustauschsäule HiPrep CM-Sepharose FF (Pharmacia) aufgetragen. Nachdem die Säule mit 20 mM CH₃COONH₄/10% CH₃ CN/H₂O gewaschen worden war, wurde eine 4-Gradienten-Elution mit 100 mM, 200 mM, 500 mM und 1000 mM CH₃COONH₄/10% CH₃ CN/H₂O durchgeführt. In der 200-mM-CH₃COONH₄-Fraktion wurde eine Wirkung zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CNO-19P2 nachgewiesen. Daher wurde diese Fraktion mit 3 Volumina Aceton verdünnt, zur Deproteinisierung zentrifugiert und in einem Verdampfer konzentriert. Zur konzentrierten Fraktion wurde TFA gegeben (Endkonzentration 0,1%), und die Mischung wurde mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 4 eingestellt und auf 3 ml der Umkehrphasen-Säule RESOURCE RPC (Pharmacia) aufgetragen. Eine Elution wurde mit einem Konzentrationsgradienten von 15%–30% CH₃CN durchgeführt. Als Ergebnis wurde die Wirkung zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus der CHO-19P2-Zelllinie in der Fraktion mit 19%–21% CH₃CN nachgewiesen. Die aktive, aus RESOURCE RPC eluierte Fraktion wurde lyophilisiert, in DMSO gelöst, in 50 mM MES, pH-Wert 5,0/10% CH₃CN suspendiert und zu 1 ml der Kationenaustauschsäule RESOURCE 5 gegeben. Die Elution wurde mit einem Konzentrationsgradienten von 0 M–0,7 M NaCl durchgeführt. Als Ergebnis wurde die Wirkung zur spezifischen Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen in der Fraktion mit 0,32 M–0,46 M NaCl nachgewiesen. Das aktive Eluat aus RESOURCE S wurde lyophilisiert, in DMSO gelöst, in 0,1% TFA/H₂O suspendiert und zur Umkehrphasen-Säule C18 218TP5415 (Vydac) gegeben, und die Elution wurde mit einem Konzentrationsgradienten von 20%–30% CH₃CN durchgeführt. Als Ergebnis wurde die Wirkung zur spezifischen Förderung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen in den drei Fraktionen mit 22,5%, 23% und 23,5% CH₃CN nachgewiesen (diese aktiven Fraktionen werden als P-1, P-2 und P-3 bezeichnet) [18]. Von den drei aktiven Fraktionen wurde die Fraktion aus 23,5% CH₃CN (P-3) lyophilisiert, in DMSO gelöst, in 0,1% TFA/H₂O suspendiert und zur Umkehrphasen-Säule Diphenyl 219TP5415 (Vydac) gegeben, und die Elution wurde mit einem Gradienten von 22%–25% CH₃CN durchgeführt. Als Ergebnis konvergierte die Aktivität zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen durch die Isolierung in einem Elutionspeak, der mit 23% CH₃CN erhalten wurde [19]. Die Fraktion mit der höchsten Aktivität aus der Umkehrphasen-Säule Diphenyl 219TP5415 wurde lyophilisiert, in DMSO gelöst, in 0,1% TFA/H₂O suspendiert und auf die Umkehrphasen-Säule μRPC C2/C18 SC 2.1/10 (Pharmacia) aufgegeben, und eine Elution wurde mit einem Gradienten von 22%–23,5% CH₃CN durchgeführt. Als Ergebnis wurde die Wirkung zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidon säure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen in den beiden Peaks nachgewiesen, die mit 23,0% und 23,2% CH₃CN eluiert werden [20].
[Beispiel 14]
Bestimmung der Aminosäuresequenz des aus dem Rinder-Hypothalamus durch Reinigung erhaltenen Peptids mit der Wirkung zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen
Die in Beispiel 13 gereinigte Aminosäuresequenz des Peptids (P-3) mit einer Wirkung zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen wurde bestimmt. Die Fraktion mit der höchsten Wirkung aus der Umkehrphasen-μRPC C2/C18 SC 2.1/10 wurde lyophilisiert und in 20 μl von 70%igem CH₃CN aufgelöst und mit der Peptid-Sequenziervorrichtung (ABI.491) auf die Aminosäuresequenz analysiert. Als Ergebnis wurde die durch SEQ ID Nr. 3 definierte Sequenz erhalten. Die 7. und die 19. Aminosäure wurden jedoch nicht nur durch die Analyse der Aminosäuresequenz bestimmt.
[Beispiel 15]
Herstellung des aus dem Rinder-Hypothalamus durch Reinigung erhaltenen Wirkstoffs (Peptid), das die Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen spezifisch fördert
Von den drei aktiven Fraktionen, die in Beispiel 13 mit Vydac C18 218TP5415 erhalten wurden, wurde die mit 23,0% CH₃CN eluiert aktive Fraktion (P-2) weiter gereinigt. Diese aktive Fraktion wurde lyophilisiert, in DMSO gelöst, in 0,1% TFA/dH₂O suspendiert und auf die Umkehrphasen-Säule Diphenyl-219TP5415 (Vydac) aufgegeben, und eine Elution wurde mit einem Gradienten von 21,0%–24,0% CH₃CN durchgeführt. Als Ergebnis wurde eine Wirkung zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure- Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen in einem Peak, der mit 21,9% CH₃CN eluiert wurde, nachgewiesen. Diese Fraktion wurde Iyophilisiert, in DMSO gelöst, in 0,1% TFA/dH₂O suspendiert und auf die Umkehrphasen-Säule μRPC C2/C18-SC-2.1/10 (Pharmacia) aufgegeben, und eine Elution erfolgte mit einem CH₃CN-Gradienten von 21,5%–23,0%. Als Ergebnis konvergierte die Wirkung zur spezifischen Förderung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen in einem Peak, der mit 22,0% CH₃CN eluiert wurde [21].
[Beispiel 16]
Bestimmung der Aminosäuresequenz des aus dem Rinder-Hypothalamus gereinigten Peptids (P-2), das die Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen spezifisch fördert
Die Aminosäuresequenz des in Beispiel 15 gereinigten Peptids (P-2) mit einer Wirkung zur spezifischen Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen wurde bestimmt. Die Fraktion mit der höchsten Wirkung aus der Umkehrphasen-Säule μRPC C2/C18-SC-2.1/10 wurde lyophilisiert, in 20 μl 70%igem CH₃CN aufgelöst und mit der Peptid-Sequenziervorrichtung (ABI, 492) auf die Aminosäuresequenz analysiert (SEQ ID Nr. 4).
[Beispiel 171
Herstellung einer Poly(A)⁺RNA-Fraktion aus dem Rinder-Hypothalamus und Synthese einer cDNA
Unter Verwendung von Isogen (Nippon Gene) wurde eine Gesamt-RNA aus Rinder-Hypothalamus, das das Äquivalent von einem Tier darstellte, hergestellt. Dann wurde mittels Fast Track (Invitrogen) eine Poly(A)⁺RNA-Fraktion hergestellt. Aus 1 μg dieser Poly(A)⁺RNA-Fraktion wurde cDNA mit dem 3'-RACE-System (GIBCO BRL) und dem Marathon cDNA- Amplifizierungskit (Contech) gemäß der Handbücher synthetisiert und in 20 bzw. 10 μl aufgelöst.
[Beispiel 18]
Erhalt einer cDNA, die für die in Beispiel 14 etablierte Aminosäuresequenz codierend ist
Zum Erhalt einer cDNA, die für ein Polypeptid codierend ist, das die in Beispiel 14 etablierte Aminosäuresequenz umfasst, wurde zuerst der Erhalt einer für SEQ ID Nr. 1 codierenden Basensequenz versucht. Somit wurden die Primer P5-1 (SEQ ID Nr. 35), P3-1 (SEQ ID Nr. 36) und P3-2 (SEQ ID Nr. 37) synthetisiert. (In der Sequenztabelle stellt I Inosin dar). Unter Verwendung von 0,5 μl der in Beispiel 17 mittels 3'-RACE hergestellten cDNA als Matrize und EXTaq (Takara Shuzo Co., Japan) als DNA-Polymerase wurden 2,5 μl eines begleitenden Puffers, 200 μM begleitendes dNTP und die Primer P5-1 und P3-1 jeweils mit einer Endkonzentration von 200 nM zugegeben, es wurde mit Wasser auf 25 μl aufgefüllt, und nach 1 min bei 94°C wurde ein Zyklus von 98°C × 10 s, 50°C × 30 s, 68°C × 10 s 30 Mal wiederholt. Diese Reaktionsmischung wurde mit Tricin-EDTA-Puffer um das 50-fache verdünnt, und unter Verwendung von 2,5 μl der Verdünnung als Matrize und der Primerkombination aus P5-1 und P3-2 wurde die Reaktion ansonsten auf dieselbe Weise durchgeführt, wie sie oben beschrieben ist. Als thermischer Cycler wurden Gene Amp 9600 (Perkin Elmer) verwendet. Das Amplifizierungsprodukt wurde einer Elektrophorese an 4%iger Agarose und einem Anfärben mit Ethidiumbromid unterzogen, und eine Bande mit etwa 70 bp wurde ausgeschnitten und einer thermischen Fusion, einer Phenolextraktion und einer Ethanolausfällung unterzogen. Die isolierte DNA wurde gemäß dem Handbuch zum TA Cloning Kit (Invitrogen) in den Plasmidvektor PCR^TM II subkloniert. Der Vektor wurde dann in E. coli JM109 eingeführt, und die resultierende Transformante wurde in einem Ampicillin enthaltenden LB-Medium kultiviert. Das mit einem automatischen Plasmidextraktor (Kurabo) erhaltene Plasmid wurde gemäß dem Handbuch des Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (ABI) umgesetzt und mit einer fluoreszierenden automatischen DNA-Sequenziervorrichtung (ABI) decodiert. Als Ergebnis wurde die in 22 dargestellte Sequenz erhalten, und es wurde bestätigt, dass es sich um einen Teil der für SEQ ID Nr. 1 codierenden Basensequenz handelte.
[Beispiel 19]
Erhalt einer bioaktiven Polypeptid-cDNA mittels RACE unter Verwendung der in Beispiel 18 erhaltenen Sequenz
Zuerst wurden zur Amplifizierung (5'-RACE) der Sequenz am 5'-Ende die beiden Primer PE (SEQ ID Nr. 38) und PDN (SEQ ID Nr. 39) synthetisiert, indem die in 22 dargestellte Sequenz verwendet wurde. Die mittels des cDNA-Amplifizierungskits Marathon in Beispiel 17 hergestellte cDNA wurde mit Tricin-EDTA-Puffer um das 100-fache verdünnt. Dann wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 eine Reaktionsmischung hergestellt, indem 2,5 μl der Verdünnung und eine Kombination des dem Kit beiliegenden Adapterprimers AP1 und des Primers PE verwendet wurde, und nach 1 min bei 94°C wurde ein Zyklus von 98°C ×10 s und 68°C × 5 min 30 Mal wiederholt. Dieses Reaktionssystem wurde weiterhin 50 Mal mit Tricin-EDTA-Puffer verdünnt, und unter Verwendung von 2,5 μl der Verdünnung als Matrize und der geänderten Primer-Kombination aus AP1 und PDN wurde die Reaktion 1 min lang bei 94°C durchgeführt, gefolgt von 4 Zyklen von 94°C × 1 min, 98°C × 10 s, 72°C × 5 min, 4 Zyklen bei 98°C × 10 s, 70°C × 5 min und 26 Zyklen bei 98°C × 10 s, 68°C × 5 min. Das Amplifizierungsprodukt wurde einer Elektrophorese an 1,2%igem Agarosegel unterzogen und mit Ethidiumbromid gefärbt, und eine Bande von etwa 150 bp wurde ausgeschnitten und durch ein Zentrifugen-Filterröhrchen (Millipore) durch Zentrifugieren filtriert, mit Phenol extrahiert und aus Ethanol ausgefällt. Die isolierte DNA wurde gemäß dem Handbuch des TA Cloning Kit (Invitrogen) in den Plasmidvektor PCR^TM II subkloniert. Der Vektor wurde dann in E. coli JM109 eingeführt, und die resultierende Transformante wurde kultiviert, und die Sequenz des insertierten cDNA-Fragments wurde wie in Beispiel 18 analysiert. Als Ergebnis wurde die in 23 dargestellte Sequenz erhalten. Auf der Grundlage dieser Sequenz wurden die Primer FB (SEQ ID Nr. 40) und FG (SEQ ID Nr. 41) synthetisiert, und die 3'-Sequenz wurde geklont (3'-RACE). Unter Verwendung derselben Matrize wie für 5'-RACE in derselben Menge und der Kombination aus dem begleitenden Adapterprimer AP1 mit dem Primer FC wurde eine PCR 1 min lang bei 94°C durchgeführt, gefolgt von 5 Zyklen bei 98°C × 10 s, 72°C × 5 min, 5 Zyklen bei 98°C × 10 s, 70°C × 5 min und 25 Zyklen bei 98°C × 10 s, 68°C × 5 min. Dann wurde unter Verwendung von 2,5 μl einer 50-fachen Verdünnung dieser Reaktionsmischung in Tricin-EDTA-Puffer als Matrize und der Kombination des begleitenden Primers AP2 mit dem Primer FB die Reaktion bei 94°C 1 min lang weiter durchgeführt, gefolgt von 4 Zyklen bei 98°C × 10 s, 72°C × 5 min, 4 Zyklen bei 98°C × 10 s, 70°C × 5 min und 27 Zyklen bei 98°C × 10 s, 68°C × 5 min. Das Amplifizierungsprodukt wurde einer Elektrophorese an 1,2%igem Agarosegel unterzogen und mit Ethidiumbromid gefärbt, und eine Bande mit etwa 400 bp wurde ausgeschnitten, und die DNA wurde wie bei 5'-RACE isoliert. Dieses DNA-Fragment wurde in den Plasmidvektor pCR^TM II subkloniert und in E. coli JM109 eingeführt, und die Sequenz des insertierten cDNA-Fragments in der resultierenden Transformante wurde analysiert. Aus den Ergebnissen von 5'-RACE und 3'-RACE wurde die DNA-Sequenz [24], die für die komplette codierende Region des durch SEQ ID Nr. 1 definierten bioaktiven Polypeptids etabliert. Somit ist in 24(a) und (b) die Base¹³⁴ G, die Base¹⁸⁴ ist T oder C, und die Base²⁴⁵ war T oder C.
Die in 24 dargestellte cDNA war diejenige cDNA, die ein aus 98 Aminosäuren bestehendes Polypeptid codierte. Die Tatsache, dass die Aminosäuren in den Positionen 1–22 einen Cluster von hydrophoben Aminosäuren umfassen, lässt zusammen mit der Tatsache, dass die N-terminate Region des aktiven Peptids mit Ser in Position 23 beginnt, wie in Beispiel 14 gezeigt wird, vermuten, dass die Aminosäuren 1–22 eine Sekretionssignalsequenz darstellen. Andererseits wurde gefunden, dass die Sequenz Gly Arg Arg Arg in den Positionen 54–57 des Polypeptids ein typisches Aminosäuremotiv ist, das im Fall einer Spaltung eines bioaktiven Peptids vorliegt. Wie im Fall dieses Spaltungsmotivs ist bekannt, dass aufgrund des Vorhandenseins von Gly der C-Terminus des Produktpeptids oft amidiert ist.
Die N-terminalen Sequenzdaten für P-3 von Beispiel 14 und die N-terminalen Sequenzdaten für P-2 von Beispiel 16 lassen zusammen mit dieser GlyArg-ArgArg-Sequenz vermuten, dass wenigstens einige der bioaktiven Peptide, die aus dem mit dieser cDNA codierten Polypeptid ausgeschnitten sind, von SEQ ID Nr. 3, SEQ ID.4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 10 definiert sind.
[Beispiel 20]
Erhalt eines DNA-Fragments, das die vollständige codierende Region einer vom Rind stammenden, bioaktiven Polypeptid-cDNA umfasst, mittels PCR
Unter Verwendung der mit dem Marathon cDNA-Amplifizierungskit in Beispiel 17 hergestellten cDNA als Matrize wurde ein DNA-Fragment, das die gesamte codierende Region von bioaktiver Polypeptid-cDNA einschloss, konstruiert. Zuerst wurden auf der Grundlage der in Beispiel 19 gefundenen cDNA-Sequenz zwei Primer mit den von SEQ ID Nr. 42 bzw. SEQ ID Nr. 43 definierten Basensequenzen synthetisiert.
BOVF

5'-GTGTCGACGAATGAAGGCGGTGGGGGCCTGGC-3' (SEQ ID Nr. 42)

BOVR (24 mer)

5'-AGGCTCCCGCTGTTATTCCTGGAC-3' (SEQ ID Nr. 43)

BOVF enthält den Initiierungscodon der bioaktiven Polypeptid-cDNA und ist eine Sensesequenz, die –2 bis +22 (wobei A des Initiierungscodons ATG als +1 gezählt wird) entspricht, wobei die Stelle des Restriktionsenzyms SalI hinzugefügt ist. Andererseits ist BOVR eine Antisense-Sequenz, die +285 bis +309 entspricht, das den Terminationscodon der bioaktiven Polypeptid-cDNA einschließt.
Die PCR wurde wie folgt durchgeführt. Die cDNA, die unter Verwendung des cDNA-Amplifizierungskits Marathon in Beispiel 17 hergestellt worden war, wurde in einem Tricin-EDTA-Puffer um das 100-fache verdünnt, und unter Verwendung von 2,5 μl der Verdünnung wurde eine Reaktionsmischung wie in Beispiel 2 hergestellt und 94°C × 1 min, 3 Zyklen bei 98°C × 10 s, 72°C × 5 min, 3 Zyklen bei 98°C × 10 s, 70°C × 5 min, und 27 Zyklen bei 98°C × 10 s, 68°C × 5 min unterzogen. Das Amplifizierungsprodukt wurde einer Elektrophorese an 2%iger Agarose und einem Anfärben mit Ethidiuimbromid unterzogen, und eine Bande mit etwa 320 bp wurde ausgeschnitten. Die DNA wurde isoliert und im Plasmidvektor pCR^TM II wie in Beispiel 3 subkloniert. Der Vektor wurde in Escherichia coli JM109 eingeführt, wodurch die Transformante E. coli JM109/pBOV3 erhalten wurde. Die Sequenz des in die Transformante insertierten cDNA-Fragments wurde dann analysiert. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass dieses DNA-Fragment ein Fragment war, das die gesamte codierende Region der bioaktiven Polypeptid-cDNA abdeckte.
[Beispiel 21]
Synthese von Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2 (19P2-L31)
1) Synthese von Ser (Bzl)-Arg(Tos)-Ala-His(Bom)-Gln-His(Bom)-Ser(Bzl)-Met-Glu(OcHex)-Ile-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Pro-Asp(OcHex)-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp(CHO)-Tyr(Br-Z)-Ala-Gly-Arg(Tos)-Gly-Ile-Arg(Tos)-Pro-Val-Gly-Arg(Tos)-PhepMBHA-Harz
Der Reaktor einer Peptid-Synthesevorrichtung (Applied Biosystems 430A) wurde mit 0,71 g (0,5 mmol) eines kommerziellen p-Methyl-BHA-Harzes (Applied Biosystems, gegenwärtig Perkin Elmer) befüllt. Nach einem Benetzen mit DCM wurde die anfängliche Aminosäure Boc-Phe mittels des HOBt/DCC-Verfahrens aktiviert und in das p-Methyl-BHA-Harz eingeführt. Das Harz wurde mit 50% TFA/DCM behandelt, um Boc zu entfernen und die Aminosäuregruppe zu befreien, und mit DIEA neutralisiert. An diese Aminogruppe wurde mittels des HOBt/DCC-Verfahrens die nächste Aminosäure Boc-Arg (Tos) kondensiert. Nachdem das Fehlen einer nicht umgesetzten Aminofunktion durch den Ninhydrin-Test bestätigt war, wurde eine aufeinanderfolgende Kondensation von Boc-Gly, Boc-Val, Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Ile, Boc-Gly, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Ala, Boc-Tyr(Br-Z) durchgeführt. Boc-Ala, Boc-Tyr (Br-Z), deren Kondensation mittels des Ninhydrin-Tests als unzureichend erkannt wurde, wurden nochmals kondensiert, um die Reaktion abzuschließen. Das Harz wurde getrocknet, und die Hälfte des Harzes wurde abgezogen. Am Rest wurden nacheinander Boc-34, Trp(CHO), Boc-Ala, Boc-Pro, Boc-Asn, Boc-Ile, Boc-Asp(OcHex), Boc-Pro, Boc-Thr(Bzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Ile, Boc-Glu(OcHex), Boc-Met, Boc-Ser(Bzl), Boc-His(Bom), Boc-Gln, Boc-His(Bom), Boc-Ala, Boc-Arg(Tos), Boc-Ser(Bzl) in Reihe kondensiert und erneut kondensiert, bis mittels des Ninhydrin-Tests eine ausreichende Kondensation bestätigt war. Nach Einführung der vollen Sequenz der Aminosäuren von 19P2-L31 wurde das Harz mit 50% TFA/DCM behandelt, um Boc-Gruppen am Harz zu entfernen, und dann getrocknet, wodurch 1,28 g des Peptidharzes erhalten wurden.
2) Synthese von Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-MH2(13P2-L32)
In einem Teflon-Hydrogenfluoridreaktor wurde das in 1) erhaltene Harz mit 3,8 g p-Cresol, 1 ml 1,4-Butandithiol und 10 ml Hydrogenfluorid 60 min lang bei 0°C umgesetzt. Das Hydrogenfluorid und das 1,4-Butandithiol (1 ml) wurden unter vermindertem Druck abdestilliert, und der Rückstand wurde mit 100 ml Diethylether verdünnt, gerührt, durch eine Glasfilter filtriert, und die Fraktion auf dem Filter wurde getrocknet. Diese Fraktion wurde in 50 ml 50%iger Essigsäure/H₂O suspendiert und gerührt, um das Peptid zu extrahieren. Nach der Abtrennung des Harzes wurde der Extrakt unter vermindertem Druck auf etwa 5 ml konzentriert und an Sephadex G-25 (2 × 90 cm) chromatographiert. Die Entwicklung erfolgte mit 50%iger Essigsäure/H₂O, und die Fraktionen von 114 ml–181 ml wurden vereinigt und lyophilisiert, wodurch 290 mg eines weißen Pulvers isoliert wurde, das 19P2-L31 enthielt. Die Pulver wurden auf eine Umkehrphasen-Säule mit LiChroprep RP-18 (Merck) aufgetragen und wiederholt mittels einer Gradientenelution gereinigt, wobei 0,1%ige TFA/H₂O und 0,1%ige TFA, die 30% Acetonitril/H₂O enthielt, verwendet wurden. Die bei etwa 25% Acetonitril eluierte Fraktion wurde gesammelt und lyophilisiert, wodurch 71 mg weiße Pulver erhalten wurden.

Massenspektrum (M + H)⁺ 3574,645
HPLC-Elutionszeit 18,2 min
Säulenbedingungen

Säule:	Wakosil 5C18 (4,6 × 100 mm)
Eluent:	A(0,1% TFA/H₂O) B(0,1% TFA-haltiges, 50%iges Acetonitril/H₂O)

Elution mit linearem Gradienten von A nach B (25 min)
Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.

[Beispiel 22]
Synthese von Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met(O)-Glu-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2(19P2-L31(O))
In 20 ml 5%iger Essigsäure/H₂O wurden 6 mg synthetisches 19P2-L31 gelöst, und nur das Met wurde mit 40 μl 30%igem H₂O₂ selektiv oxidiert. Nach Abschluss der Reaktion wurde die Reaktionsmischung zur Reinigung sofort auf eine Umkehrphasen-Säule LiChroprep RP-18 (Merck) gegeben, wodurch 5,8 mg des Zielpeptids erhalten wurden.

Massenspektrum (M + H)⁺ 3590,531
HPLC-Elutionszeit 17,9 min
Säulenbedingungen

[Beispiel 23]
Synthese von Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2(19P2-L20)
An das Harz, das den Kondensationen bis Boc-Tyr(Br-Z) in Beispiel 21-1) unterzogen worden war, wurden weiterhin auf dieselbe Weise Boc-Trp(CHO), Boc-Ala, Boc-Pro, Boc-Asn, Boc-Ile, Boc-Asp(OcHex), Boc-Pro, Boc-Thr(Bzl) in Reihe kondensiert, wodurch 1,14 g Boc-Thr(Bzl)-Pro-Asp(OcHex)-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp(CHO)-Tyr(Br-Z)-Ala-Gly-Arg(Tos)-Gly-Ile-Arg(Tos)-Pro-Val-Gly-Arg(Tos)-Phe-pMBHA-Harz erhalten wurden. Dieses Harz wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 21-2) mit Hydrogenfluorid behandelt und säulenchromatographisch gereinigt, wodurch 60 mg weiße Pulver erhalten wurden.

Massenspektrum (M + H)⁺ 2242,149
HPLC-Elutionszeit 10,4 min
Säulenbedingungen

Säule:	Wakosil 5C18 (4,6 100 mm)
Eluent:	A(0,1% TFA-haltiges, 15%iges Acetonitril/H₂O) B(0,1% TFA-haltiges, 45%iges Acetonitril/H₂O)

Elution mit linearem Gradienten von A nach B (15 min)
Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.

[Beispiel 24]
Bestimmung der Arachidonsäure-Metabolite freisetzenden Wirkung des synthetischen Peptids (19P2-L31)
Die Wirkung des in Beispiel 21 synthetisierten synthetischen Peptids (19P2-L31) zur spezifischen Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 11 untersucht. Das synthetische Peptid wurde mit einer Konzentration von 10^–3 M in entgastem dH₂O gelöst und mit 0,05% BSA-HBSS verdünnt, und die Wirkung zur Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen bei jeder Konzentration wurde untersucht, wobei die Menge an [³H]Arachidonsäure-Metaboliten als Indikator verwendet wurde. Als Ergebnis wurde eine konzentrationsabhängige Wirkung zur Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten im Bereich von 10^–12 M bis 10^–6 M nachgewiesen [25]. Wenn die Wirkung zur Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten des Peptids 19P2-L31(O), d.h. des in Beispiel 22 synthetisierten Methionin-Oxidationsprodukts von 19P2-L31, verglichen wurde, wurde gefunden, dass die Wirkung von 19P2-L31(O) zur Wirkung von 19P2-L31 äquivalent war, wie aus 26 ersehen werden kann.
[Beispiel 25]
Bestimmung der Wirkung zur Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten des synthetischen Peptids (19P2-L20)
Die Wirkung zur Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten des in Beispiel 23 synthetisierten synthetischen Äquivalents (19P2-L20) des natürlichen Peptids P-2 zur spezifischen Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen wurde wie in Beispiel 11 bestimmt. Somit wurde das synthetische Peptid in einer Endkonzentration von 10^–3 M in entgastem dH₂O gelöst, und diese Lösung wurde mit 0,05% BAS-HBSS seriell verdünnt. Die Wirkung zur spezifischen Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-Zellen bei jeder Konzentration wurde untersucht, wobei die Menge der [³H]Arachidonsäure-Metaboliten als Indikator verwendet wurde.
Als Ergebnis wurde eine konzentrationsabhängige Wirkung zur Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten im Bereich von 10^–12 M bis 10^–6 M fast mit demselben Grad wie 19P2-L31 nachgewiesen [27].
[Beispiel 26]
Analyse der Codierungsregion-Basensequenz von genomischer Rinder-DNA pBOV3 wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI aufgeschlossen, und nach einer Fraktionierung mittels Gelelektrophorese an Agarose wurde die dem cDNA-Fragment entsprechende DNA isoliert, um eine Sonde herzustellen. Diese DNA wurde mittels eines Multiprime DNA labeling kit (Amersham) mit ³²P markiert. Eine LB-Agarplatte wurde mit etwa 2,0 × 10⁶ Phagen der Bovine Genomic Library (Clontech BL1015j), die unter Verwendung des Klonierungsvektors EMBL3 5P6/T7 und Escherichia coli K802 als Wirt konstruiert worden waren, beimpft, und sie wurde zur Bildung von Plaques über Nacht kultiviert. Die Plaques wurden auf einen Nitrocellulose-Filter übertragen und nach einer alkalischen Modifizierung und Neutralisierung in der Wärme (80°C, 2 h) behandelt, um die DNA zu inaktivieren. Dieser Filter wurde zur Hybridisierung mit der markierten Sonde in 50% Formamid-Hybri-Puffer (50% Formamid, 5 × Denhardt-Lösung, 4 × SSPE, 0,1 mg/ml in der Wärme denaturierte Lachssperma-DNA, 0,1% SDS) über Nacht bei 42°C inkubiert. Nach dieser Hybridisierung wurde der Filter mit 2 × SSC, 0,1% SDS 1,5 h lang bei Raumtemperatur gewaschen und weiterhin 30 min lang bei 55°C im selben Puffer gewaschen. Der Nachweis dafür, dass der Klon mit der Sonde hybridisierte, erfolgte an Kodak-Röntgenfilm (X-OMAT^TM AR) nach einer viertägigen Belichtung unter Verwendung eines Sensibilisierungsschirms bei –80°C. Nach der Entwicklung des Films wurde dieser mit den Plattenpositionen verglichen, und die hybridisierten Phagen wurden isoliert. Dann wurden das Ausplattieren und die Hybridisierung zum Klonen der Phagen auf dieselbe Weise wiederholt.
Die geklonten Phagen wurden mittels des Plattenlysat-Verfahrens in großem Maßstab hergestellt, und die Phagen-DNA wurde extrahiert. Dann wurden eine Spaltung an den Spaltstellen der Restriktionsenzyme SalI und BamHI an beiden Enden der Klonierungsstelle des Vektors und eine Bestimmung des insertierten, von genomischer Rinder-DNA stammenden Fragments durch eine Gelelektrophorese an 1,2%iger Agarose durchgeführt [28]. Als Ergebnis wurden im Fall des BamHI-Aufschlusses 3 Fragmente zusätzlich zu den von den Phagen stammenden Banden nachgewiesen. Im Fall des Aufschlusses mit SalI wurde eine mit der Phagenbande überlappende Bande nachgewiesen.
Weil angenommen wurde, dass das mit SalI aufgeschlossene Fragment die volle Länge enthielt und um dieses Fragment in einen Plasmidvektor subzuklonieren, wurde es an den mit BAP (von E. coli stammende alkalische Phosphatase) behandelten Plasmidvektor pUC18 (Pharmacia) ligasiert und in E. coli JM109 eingeführt. Aus diesem Mikroorganismus wurde eine vom Genom stammende, mittels eines SalI-Fragment insertierte Plasmid-DNA in einem Produktionsmaßstab hergestellt, und die Basensequenz in der Nachbarschaft ihrer codierenden Region wurde mittels einer Fluoreszenz-Sequenziervorrichtung 370A von Perkin Elmer Applied Biosystems und dem Kit desselben Herstellers analysiert. Als Ergebnis wurde die in 29 veranschaulichte Sequenz erhalten. Ein Vergleich mit dem Codierungsbereich der cDNA offenbart, dass die codierende Region aufgrund ihrer Abstammung von genomischer DNA durch ein Intron von 472 bp zweigeteilt ist [30]. 31 und SEQ ID Nr. 44 stellen die Aminosäuresequenz dar, die aus dieser Rindergenom-Codierungsregion (ausschließlich der Intron-Region) vorhergesagt wird.
[Beispiel 27]
Herstellung einer Poly(A⁺)-RNA-Fraktion aus der Medulla oblongata der Ratte und Synthese der cDNA
Unter Verwendung von Isogen (Nippon Gene) wurde Gesamt-RNA aus der dorsalen Region der Medulla oblongata der Ratte hergestellt, und unter Verwendung von FastTrack (Invitrogen) wurde die Poly(A⁺)-RNA-Fraktion hergestellt. Zu 5 μg dieser Poly(A⁺)-RNA wurde das statistische Primer-DNA-Hexamer (BRL) gegeben, und unter Verwendung von Moloney-Mausleukämiereverse-Transkriptase (BRL) und des begleitenden Puffers wurde komplementäre DNA synthetisiert. Das Reaktionsprodukt wurde aus Ethanol ausgefällt und in 12 μl DW aufgelöst. Darüber hinaus wurde aus 1 μg dieser Poly(A⁺)-RNA unter Verwendung des cDNA-Amplifizierungskits Marathon (Clontech) gemäß dem Handbuch eine cDNA synthetisiert und in 10 μl DW aufgelöst.
[Beispiel 28]
Erhalt einer bioaktiven Ratten-Polypeptid-cDNA mittels RACE
Zum Erhalt der vollständigen codierenden Region der bioaktiven Ratten-Polypeptid-cDNA wurde ein Experiment auf dieselbe Weise wie beim Erhalt der Rinder-cDNA durchgeführt. Zuerst wurde eine PCR unter Verwendung derselben Primer P5-1 (SEQ ID Nr. 35) und P3-1 (SEQ ID Nr. 36), die in Beispiel 18 als Primer verwendet wurden, durchgeführt, und die in Beispiel 27 synthetisierte komplementäre DNA wurde unter Verwendung des statistischen Primer-DNA-Hexamers (BRL) und von Moloney-Mausleukämie-reverse-Transkriptase (BRL) als Matrize synthetisiert. Das Reaktionssystem bestand aus 1,25 μl der Matrizen-cDNA, 200 μM dNTP, 1 μM jeweils der Primer, ExTaq (Takara Shuzo Co., Japan) als DNA-Polymerase und 2,5 μl des begleitenden Puffers und einer ausreichenden Wassermenge, um insgesamt 25 μl anzufertigen. Die Reaktion wurde 1 min lang bei 94°C durchgeführt, gefolgt von 40 Zyklen bei 98°C × 1 min, gefolgt von 40 Zyklen bei 98°C × 10 s, 50°C × 30 s und 72°C × 5 s, und die Reaktionsmischung wurde dann 20 s lang bei 72°C stehen gelassen. Beim verwendeten Thermocycler handelte es sich um GeneAmp2400 (Perkin Elmer). Das Amplifizierungsprodukt wurde einer Elektrophorese an 4%iger Agarose und einem Anfärben an Ethidiumbromid unterzogen, und die Bande mit etwa 80 bp wurde ausgeschnitten. Dann wurde auf die in Beispiel 19 beschriebene Weise die DNA isoliert, in den Plasmidvektor pCR^TM II subkloniert und in E. coli JM109 eingeführt, und das insertierte cDNA-Fragment wurde sequenziert. Als Ergebnis konnte eine Teilsequenz des bioaktiven Ratten-Polypeptids erhalten werden. Auf der Grundlage dieser Sequenz wurden zwei Primer, nämlich RA (SEQ ID Nr. 75) für 3'-RACE und RC (SEQ ID Nr. 76) für 5'-RACE, synthetisiert, und 5'- und 3'-RACE wurden durchgeführt.

RA:5'-CARCAYTCCATGGAGACAAGAACCCC-3' (SEQ ID Nr. 75) (wobei R A oder G bedeutet, Y T oder G bedeutet)
RC:5'-TACCAGGCAGGATTGATACAGGGG-3' (SEQ ID Nr. 76)

Als Matrize wurde die Matrize, die unter Verwendung des cDNA-Amplifizierungskits Marathon (Clontech) in Beispiel 27 synthetisiert worden war, mit dem begleitenden Tricin-EDTA-Puffer um das 40-fache verdünnt, und 2,5 μl der Verdünnung wurden verwendet. Als Primer wurden RA und der Adapterprimer AP1, der im Kit enthalten war, für 3'-RACE verwendet, und RC und AP1 wurden für 5'-RACE verwendet. Die Reaktionsmischung wurde ansonsten auf dieselbe Weise wie oben hergestellt. Die Reaktionsbedingungen waren 94°C × 1 min, 5 Zyklen bei 98°C × 10 s, 72°C × 45 s, 3 Zyklen bei 98°C × 10 s, 70°C × 45 s und 40 Zyklen bei 98°C × 10 s, 68°C × 45 s. Als Ergebnis wurden eine Bande mit etwa 400 bp aus 3'-RACE und Banden mit etwa 400 bp und 250 bp aus 5'-RACE erhalten. Diese Banden wurden auf dieselbe Weise wie oben isoliert, und indem sie in der Reaktion als Matrizen und Primer eingesetzt wurden, wurde eine Sequenzierung mittels des Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (ABI) durchgeführt. Als Ergebnis konnte die Sequenz bis zu Poly A aus der Region erhalten werden, von der angenommen wird, dass es sich um die nichtcodierende 5'-Region handelt.
[Beispiel 29]
Erhalt einer cDNA mit voller Länge eines bioaktiven Ratten-Polypeptids mittels PCR
Auf der Grundlage der in Beispiel 28 erhaltenen Sequenz wurden zwei Primer, nämlich rF für die den Initiierungscodon (SEQ ID Nr. 77) einschließende Region und rR für die 3'-Seite des Terminationscodons (SEQ ID Nr. 78), synthetisiert, um das die cDNA mit voller Länge einschließende Fragment zu amplifizieren.

rF:5'-GGCATCATCCAGGAAGACGGAGCAT-3' (SEQ ID Nr. 77)
rR:5'-AGCAGAGGAGAGGGAGGGTACAGGA-3' (SEQ ID Nr. 78)

Unter Verwendung der cDNA, die mittels des Moloney-Mausleukämie-reverse-Transkriptase in Beispiel 27 als Matrize hergestellt worden war, und ExTaq (Takara Shuzo Co., Japan) wurde eine PCR durchgeführt, indem 40 Zyklen von 95°C × 30 s, 68°C × 60 s durchgeführt wurden. Das Amplifizierungsprodukt wurde einer Elektrophorese an Agarose und einem Anfärben an Ethidiumbromid unterzogen, und eine Bande mit etwa 350 bp wurde ausgeschnitten. Die DNA wurde isoliert, in den Plasmidvektor pCR^TM II subkloniert und wie in Beispiel 19 in E. coli JM109 eingeführt. Das Plasmid wurde aus der Transformanten extrahiert, und die Basensequenz wurde bestimmt. Als Ergebnis wurde E. coli JM 190/pRAV3 mit der cDNA mit voller Länge eines bioaktiven Ratten-Polypeptids erhalten [32].
[Beispiel 30]
Synthese von cDNA aus einer humanen Vollgehirn-Poly(A)⁺RNA-Fraktion
Aus 1 μg einer humanen Vollgehirn-Poly(A)⁺RNA-Fraktion (Clontech) wurde cDNA mit dem cDNA-Amplifizierungskit Marathon (Clontech) gemäß dem Handbuch synthetisiert und in 10 μl gelöst. Darüber hinaus wurde das statistische DNA-Hexamer (BRL) als Primer zu 5 μg derselben Poly(A)⁺RNA-Fraktion gegeben, und unter Verwendung von Moloney-Mausleukämiereverse-Transkriptase (BRL) und des begleitenden Puffers wurde komplementäre DNA synthetisiert. Das Reaktionsprodukt wurde aus Ethanol ausgefällt und in 30 μl TE aufgelöst.
[Beispiel 31]
Erhalt einer bioaktiven humanen cDNA mittels RACE
Aus der in Beispiel 28 erhaltenen Aminosäuresequenz des bioaktiven Ratten-Polypeptids [33] wurden die gut erhaltenen Regionen der Ratten- und Rinder-Polypeptide ausgewählt, und die folgenden drei Primer, R1 (SEQ ID Nr. 79), R3 (SEQ ID Nr. 80) und R4 (SEQ ID Nr. 81) wurden synthetisiert. Dann wurde eine Amplifizierung der von ihnen flankierten Region mittels PCR unter Verwendung von humaner cDNA als Matrize versucht. Unter Bezugnahme auf 33 stellt Rinder.aa die Aminosäuresequenz des Rinder-Polypeptids dar, Rinder.seq stellt die Basensequenz der für das Rinder-Polypeptid codierenden DNA dar, und Ratten.seq stellt die Basensequenz der für das Ratten-Polypeptid codierenden DNA dar.

R1:5'-ACGTGGCTTCTGTGCTTGCTGC-3' (SEQ ID Nr. 79)
R3:5'-GCCTGATCCCGCGGCCCGTGTRCCA-3' (SEQ ID Nr. 80)
R4:5'-TTGCCCTTCTCCTGCCGAAGCGGCCC-3' (SEQ ID Nr. 81)

Die mittels des cDNA-Amplifizierungskits Marathon (Clontech) hergestellte cDNA in Beispiel 30 wurde mit Tricin-EDTA-Puffer um das 30-fache verdünnt, und 0,25 μl der Verdünnung wurden als Matrize verwendet. Die Reaktionsmischung bestand aus 200 μM dNTP, jeweils 0,2 μM der Primer R1 und R4, eine 50:50-Mischung des Taq-Start-Antikörpers (Clontech) und der DNA-Polymerase ExTaq (Takara Shuzo Co., Japan), 2,5 μl des begleitenden Puffers und einer ausreichenden Wassermenge, um insgesamt 25 μl zu erhalten. Die Reaktionsbedingungen waren 94°C × 1 min, gefolgt von 42 Zyklen bei 98°C × 10 s, 68°C × 40 s und 1 min eines Stehens bei 72°C. Dann wurde unter Verwendung von 1 μl einer 100-fachen Verdünnung der obigen Reaktionsmischung in Tricin-EDTA-Puffer als Matrize dieselbe Reaktionsmischung wie oben mit der Ausnahme, dass die Primerkombination zu R1 und R3 geändert wurde, angefertigt, und eine PCR wurde in der Abfolge 94°C × 1 min und 25 Zyklen bei 98°C × 10 s, 68°C × 40 s durchgeführt. Das Amplifizierungsprodukt wurde einer Elektrophorese an 4%iger Agarose und einem Anfärben an Ethidiumbromid unterzogen. Als Ergebnis wurde wie erwartet eine Bande mit etwa 130 bp erhalten. Diese Bande wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 28 isoliert, und unter Verwendung des isolierten Fragments als Matrize wurde eine Sequenzierung mit dem Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (ABI) durchgeführt. Als Ergebnis konnte eine Teilsequenz des bioaktiven humanen Polypeptids erhalten werden. Daher wurden auf der Grundlage dieser Sequenz die Primer HA (SEQ ID Nr. 82) und HB (SEQ ID Nr. 83) für 3'-RACE und die Primer HE (SEQ ID Nr. 84) und HF (SEQ ID Nr. 85) für 5'-RACE synthetisiert, und 5'- und 3'-RACE wurden durchgeführt.

HA:5'-GGCGGGGGCTGCAAGTCGTACCCATCG-3' (SEQ ID Nr. 82)
HB:5'-CGGCACTCCATGGAGATCCGCACCCCT-3' (SEQ ID Nr. 83)
HE:5'-CAGGCAGGATTGATGTCAGGGGTGCGG-3' (SEQ ID Nr. 84)
HF:5'-CATGGAGTGCCGATGGGTACGACTTGC-3' (SEQ ID Nr. 85)

Als Matrize wurden 2,5 μl einer 20-fachen Verdünnung der in Beispiel 30 hergestellten cDNA in Tricin-EDTA-Puffer verwendet. Für die anfängliche PCR wurden Reaktionsmischungen auf dieselbe Weise wie oben mit der Ausnahme hergestellt, dass HA und der Adapterprimer AP1 für 3'-RACE und HE und AP1 für 5'-RACE verwendet wurden. Die Reaktionssequenz war 94°C × 1 min, 5 Zyklen bei 98°C × 10 s, 72°C × 35 s, 5 Zyklen bei 98°C × 10 s, 70°C × 35 s und 40 Zyklen bei 98°C × 10 s, 68°C 35 s. Dann wurde unter Verwendung von 1 μl einer 100-fachen Verdünnung dieser Reaktionsmischung in Tricin-EDTA-Puffer als Matrize eine zweite PCR mit denselben Zyklen wie bei der ersten PCR durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde aber unter Verwendung der Primer HB und AP1 für 3'-RACE oder HF und AP2 für 5'-RACE und Klen Taq (Clontech) als DNA-Polymerase und dem begleitenden Puffer durchgeführt. Als Ergebnis wurde eine Bande mit etwa 250 bp aus 3'-RACE und eine Bande mit etwa 150 bp aus 5'-RACE erhalten. Diese Banden wurden mittels desselben Verfahrens wie oben sequenziert, und unter Verwendung dieser Banden in Kombination mit den zuvor erhaltenen Teilsequenzen wurde die Sequenz aus der Region, von der angenommen wurde, dass es sich um die 5'-nichtcodierende Region für Poly A des bioaktiven humanen Polypeptids handelte, erhalten.
[Beispiel 32]
Erhalt einer cDNA mit voller Länge für ein bioaktives humanes Polypeptid mittels PCR
Auf der Grundlage der in Beispiel 31 erhaltenen Sequenz wurden die beiden Primer 5H (SEQ ID Nr. 86) und 3HN (SEQ ID Nr. 87) zur Amplifizierung eines Fragments, das eine cDNA mit voller Länge einschließt, synthetisiert.

5H:5'-GGCCTCCTCGGAGGAGCCAAGGGATGA-3' (SEQ ID Nr. 86)
3HN:5'-GGGAAAGGAGCCCGAAGGAGAGGAGAG-3' (SEQ ID Nr. 87)

Unter Verwendung von 2,5 μl der cDNA, die unter Verwendung von Moloney-Mausleukämie-reverse-Transkriptase (BRL) in Beispiel 30 als Matrize hergestellt worden war, und der Reaktionsmischung, die unter Verwendung von Klen Taq DNA-Polymerase (Clontech) hergestellt worden war, wurde die PCR-Reaktion in der Abfolge 94°C × 1 min und 40 Zyklen bei 98°C × 10 s, 68°C × 30 s durchgeführt. Das erhaltene Fragment mit etwa 360 bp wurde ansonsten auf dieselbe Weise wie in Beispiel 29 isoliert und subkloniert (wobei pCRTM 2.1 als Vektor verwendet wurde). Das Plasmid wurde isoliert, und seine Basensequenz wurde bestimmt. Als Ergebnis wurde E. coli JM109/pHOV7, die die cDNA in voller Länge eines humanen bioaktiven Polypeptids enthielt, erhalten [34]. Hinsichtlich der Aminosäuresequenz der Translationsregion wurde ein Vergleich zwischen diesem humanen bioaktiven Polypeptid und dem in Beispiel 20 aufgeführten Rinder-Polypeptid oder dem Ratten-Polypeptid aus Beispiel 29 durchgeführt [35].
[Beispiel 33]
Ein G-Protein-gekoppelter Orphan-Rezeptor, UHR-1, ist aus Nuclei suprachiasmatica aus dem Hypothalamus der Ratte geklont worden, und seine Nucleotidsequenzen sind berichtet worden (Biochemical and Biophysical Research Communications, Band 209, Nr. 2, S. 606–613, 1995, Genbank-Hinterlegungsnummer: 577867). Ein von UHR-1 geklontes Protein wies über 359 Aminosäuren eine Identität von 91,6% mit phGR3 auf, was vermuten lässt, dass UHR-1 ein Gegenstück von hGR3 ist. Um dies zu bestätigen, klonten wir eine cDNA für die codierenden Regionen von UHR-1 und etablierten CHO-Zellen, die UHR-1 stabil exprimieren, wie unten beschrieben ist. Poly(A)⁺RNA wurde aus Hypophysenvorderlappenextrakt mittels eines FastTrack^TM-Kits (Invitrogen Co.) hergestellt, und eine cDNA wurde mit 0,2 μg davon mit dem Takara RNA PCR Kit (Takara) synthetisiert. Die cDNA wurde in 10 μl destilliertem Wasser gelöst und als Matrize für die folgende PCR verwendet. Zur Isolierung von UHR-1-cDNA wurden zwei Primer, nämlich 5'-GTTCACAG(GTCGAC)ATGACCTCAC-3' [SEQ ID Nr. 95] (UHF) und 5'-CTCAGA(GCTAGC)AGAGTGTCATCAG-3' [SEQ ID Nr. 96] (UHR), auf der Grundlage der Sequenz des bei Genbank (Hinterlegungsnummer: S77867) hinterlegten UHR-1 synthetisiert. Bei diesen Primern bedeuten GTCGAC bzw. GCTAGC die SalI- bzw. die NheI-Stelle. ExTaq (Takara) wurde mit der gleichen Menge an Taq Start Antibody (Clontech Laboratories, Inc.) vermischt, um eine Amplifizierung von nichtspezifischen Produkten und Primerdimeren zu verhindern. Eine Reaktionsmischung wurde hergestellt, indem 5 μl des Ex Taq beiliegenden Puffers, 4 μl dNTPs, 1 μl der aus Ex Taq und Taq Start Antibody gemischten Lösung und 1 μl mit jeweils 50 μM eines jeden Primers zugegeben wurden. Die cDNA wurde mit destilliertem Wasser auf ein Fünftel verdünnt, und ein Aliquot (5 μl) wurde zur Reaktionsmischung gegeben. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: Denaturierung bei 95°C für 2 min, gefolgt von 27 Zyklen bei 95°C für 30 s, 65 C für 30 s und 72°C für 1 min, und danach diese Zyklen bei 72°C für 7 min.
Die PCR-Produkte wurden mit 1,2%igem Agarosegel getrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt. Agarosegel-Scheiben, die die Bande mit etwa 1,1 kbp enthielten, wurden mit einer Rasierklinge ausgeschnitten und dann mittels einer Ultra-Free-Filtereinheit (Millipore) filtriert. Das Eluent wurde mit Phenol:Chloroform extrahiert und in Ethanol ausgefällt. Die amplifizierte DNA wurde mit einem TA-Klonierungskit (Invitrogen Co.) in pCR^TM II subkloniert und dann in E.-coli-JM109-kompetente Zellen eingeführt. Transformanten wurden in LB- (Luria-Bertani-)Agar-Kulturmedium, das Ampicillin, IPTG (Isopropylthio-β-D-galactosid) und X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid) enthielt, selektiert. Die einzelnen Klone wurden in einem Ampicillin enthaltenden LB-Kulturmedium kultiviert und mit einer automatischen Plasmidextraktionsmaschine (Kurabo) behandelt, wodurch die jeweiligen Plasmid-DNA hergestellt wurden. Die Sequenzierung erfolgte mit einem ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Kit FS (Perkin-Elmer) und einem automatischen ABI-Sequencer. In 52 bezeichnen die Unterstreichungen die Sequenzen, die den Teilen der Primersequenzen entsprechen. Doppelt unterstrichene Basen bedeuten die Basensubstitution im Vergleich zu den berichteten Sequenzdaten, und eine dieser Substitutionen wurde von einer Aminosäure-Substitution von ²⁸⁹Leu(CTC) zu ²⁸⁹Val(GTC) begleitet. Auf diese Weise wurde ein Plasmid, pCRII-UHR-1, das das UHR-1-cDNA-Fragment enthielt, konstruiert.
Das cDNA-Expressionsplasmid UHR-1 wurde wie folgt hergestellt. Zuerst wurde pCRII-UHR-1 mit NheI und SalI aufgeschlossen. Das resultierende Fragment von etwa 1,1 kbp wurde mittels Elektrophorese unter Verwendung eines 1,2%igen Agarosegels abgetrennt und wie oben ausgefällt. Das DNA-Fragment wurde dann mit einem Ligationssystem (Takara) in die NheI-SalI-Stelle von pAKKO-111H ligasiert. Das resultierende Expressionsplasmid pAKKO-UHR-1 wurde in E. coli JM109 eingeführt.
Die CHO-dhfr^–-Zellen wurden in Petrischalen mit einem Durchmesser von 10 cm bis zu einer Zellzahl von 1 × 10⁶ gezogen und 24 h lang bei 37°C in α-MEM kultiviert, das 10% fötales Rinderserum enthielt. Das Expressionsplasmid (20 μg) wurde mit einem Liposomenverfahren in die Zellen eingeführt, wobei ein Gene Transfer (Nippon Gene) verwendet wurde. 24 h nach der Einführung wurde das Medium durch frisches ersetzt. Nach einer weiteren 24-stündigen Inkubation wurde das Kulturmedium zu einem Selektionsmedium, α-MEM ohne Nucleoside, das 10% dialysiertes fötales Rinderserum enthielt, geändert. Eine Kultur wurde durchgeführt, bis im Selektionsmedium gezogene Zellen erhalten waren. Auf diese Weise wurde CHO-UHR-1, das UHR-1 in hohem Maße exprimierte, erhalten.
[Beispiel 34]
Radioiodierung von 19P2-L31 und Rezeptorbindungsexperimente
19P2-L31 wurde mit [¹²⁵I]-Bolton-Hunter-Reagens (NEN.Dupont; NEX-120) wie folgt radioiodiert. 200 μl [¹²⁵I]-Bolton-Hunter-Reagens wurden in einem 500-μl-Eppendorf-Röhrchen mit N₂-Gas getrocknet. Das getrocknete Reagens wurde in 2 μl Acetonitril gelöst und dann mit 4 ml eines 50 mM Phosphatpuffers (pH-Wert 8,0) und 4 μl 19P2-L31 3 × 10^–4 M vermischt. Die Mischung wurde 40 min lang bei Raumtemperatur inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt, indem 5 μl 1,0 M Glycin zugegeben wurden. Die gesamte Reaktionsmischung wurde mit 300 μl 18%igem Acetonitril verdünnt und in die Umkehrphasen-HPLC-Säule TSK-Gel ODS-80TM (4,6 × 100 mm; TOSO) injiziert. Das radioiodierte 19P2-L31 wurde mit einem linearen Gradienten der Acetonitril-Konzentration von 18 bis 32,4% in 0,1%iger Trifluoressigsäure 24 min lang mit einer Durchflussrate von 1 ml/min eluiert. Die Spitzenfraktion des radioiodierten 19P2-L31 wurden aufgefangen und mit dem zweifachen Volumen von 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), die 0,1% BSA und 0,05% CHAPS enthielt, verdünnt und dann bei –20°C aufbewahrt.
Rezeptorbindungsexperimente mit [¹²⁵I]-19P2-L31 wurden wie folgt durchgeführt. Als rezeptorexprimierende CHO-Zellen wurden in diesem Experiment CHO-19P2-9, ein Monoklon von CHO-19P2, CHO-UHR-1, und Schein-CHO verwendet. CHO-19P2-9-Zellen, die aus CHO-19P2-Zellen unter Verwendung einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen durch Ultraverdünnungstechniken ausgewählt sind, sind diejenigen Klone, die auf eine stärkere die Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten fördernde Reaktion durch 19P2-L31 hindeuten. Die Schein-CHO-Zellen dienen zur Kontrolle und wurden nur mit dem Expressionsvektor pAKKO transformiert. Diese in Kolben zum Kultivieren von Geweben kultivierten Zellen wurden mit 5 mM EDTA/PBS geerntet und dann in HBSS resuspendiert, das 0,05% BSA und 0,05% CHAPS mit 0,5 × 10⁷ Zellen/ml enthielt. Die Zellsuspensionen wurden 2,5 h lang bei Raumtemperatur in einem Gesamtvolumen von 100 μl mit 200 pM [¹²⁵I]-19P2-L31 inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde mit 2 ml eines eiskalten Puffers (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, der 5 mM EDTA, 0,05% BSA und 0,05% CHAPS enthielt) verdünnt und sofort durch Glasfilter GF/F (Whattman), die mit dem 0,3% Polyethylenimin enthaltenden Puffer vorbenetzt worden waren, filtriert. Die Glasfilter wurden einer γ-Zählung unterzogen. Beim Vorhandensein von 200 nM unmarkiertem 19P2-L31 wurde eine nichtspezifische Bindung beobachtet.
[36] zeigt Rezeptorbindungsexperimente mit [¹²⁵I]-19P2-L31 an lebenden Zellen.
Eine spezifische Bindung von [¹²⁵I]-19P2-L31 wurde bei CHO-Zellen nachgewiesen, die mit hGR3 bzw. dem Rattenhomologen UHR-1 exprimiert worden waren. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die von hGR3 und UHR-1 codierten Proteine als spezifischer Rezeptor von 19P2-L31 dienen.
[Beispiel 35]
Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-9 und CHO-UHR1 mittels 19P2-L31
Die Wirkung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten wurde wie in Beispiel 11 für CHO-19P2-9 und CHO-UHR1 und Schein-CHO gemessen.
[37] zeigt die Wirkung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten aus CHO-19P2-9 und CHO-UHR1 durch 19P2-L31.
Bei CHO-Zellen, die mit dem Ratten-Homolog UHR1 exprimiert wurden, war die nachgewiesene Wirkung der Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten dieselbe wie bei CHO-19P2-9. Die Experimente wurden doppelt durchgeführt. Diese Ergebnisse zeigen, dass das von UHR-1 codierte Protein genauso gut wie hGR3 als spezifischer Rezeptor funktioniert.
[Beispiel 36]
Quantifizierung des Ratten-19P2-Liganden und von Ratten-UHR-1-mRNA (BBRC, 209, 606–613, 1995) mittels RT-PCR
(1) Herstellung von Poly(A)⁺RNA und cDNA-Synthese aus Rattengeweben.
Poly(A)⁺RNA wurde aus einer Vielzahl von Geweben von Ratten (Wister-Stamm, männlich, 8 Wochen alt) durch eine Homogenisierung mit Isogen (Nippon Gene), gefolgt von einer Oligo-(dT)-Cellulose-Chromatographie (Pharmacia) isoliert. 1 μg Poly(A)⁺RNA wurde mit DNaseI (Amplifizierungsgrad, GibcoBRL) behandelt, um die Kontamination mit genomischer DNA zu eliminieren. DNaseI wurde durch die Zugabe einer 25 mM EDTA-Lösung bei 65°C inaktiviert. Dann wurde RNA (160 ng) in 40 μl einer Reaktionsmischung, die 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,3), 2,5 μM statistische Hexamere (Takara), 0,4 mM eines jeden dNTP und 10 U AMV-reverse-Transkriptase XL (Takara) enthielt, revers transkribiert. Die Proben wurden 10 min lang bei 30°C inkubiert, gefolgt von 42°C für 1 h, dann 99°C für 5 min, um die Reaktion zu stoppen. Die Reaktionsmischung wurde durch Ausfällen in Ethanol gereinigt, und dann wurde die cDNA mit Tricin-EDTA-Puffer (entsprechend 4 ng Poly(A)⁺RNA/μl) auf 40 μl verdünnt.
(2) Konstruktion von Plasmidvektoren mit positiver Regelung
Ratten-Glycerinaldehyd-3-phosphatasedehydrogenase (G3PDH) und Ratten-UHR-1-cDNA wurden aus der Ratten-Hypophysentumor-Zelllinie GH₃ mittels RT-PCR isoliert, die Poly(A)⁺RNA von GH₃ wurde mittels FastTrack (Invitrogen) hergestellt, und cDNA wurde wie in Beispiel 36(1) synthetisiert. Zur Amplifizierung verwendete Oligonucleotid-Primer sind wie folgt: der Ratten-G3PDH-Amplifizierungsprimer-Satz (Clontech), rRECF(5'-CCTGCTGGCCATTCTCCTGTCTTAC-3') (SEQ ID Nr. 88) und rRECR(5'-GGGTCCAGGTCCCGCAGAAGGTTGA-3') (SEQ ID Nr. 89) für UHR-1.
Die aus GH₃-cDNA amplifizierten Fragmente wurden mit einem TA-Klonierungssatz (Invitrogen) subkloniert. Die rekombinanten Vektoren wurden in E. coli JM109 eingeführt. Die transformanten Klone wurden in einem Ampicillin enthaltenden LB-Kulturmedium kultiviert, und die Plasmid-DNA wurden mit einem Qiagen Plasmid Midi Kit (Qiagen) hergestellt. Das Plasmid des Ratten-Liganden-Polypeptids wurde aus E. coli JM109/pRAV3 hergestellt, das hinterlegt war.
(3) Quantifizierende RT-PCR
cDNA und Plasmid-DNA, die in (1) und (2) hergestellt worden waren, wurden mit destilliertem Wasser auf zweckmäßige Konzentrationen verdünnt und als Matrizen für eine quantitative RT-PCR verwendet. G3PDH, UHR-1 und Liganden-Polypeptid-cDNA-Fragmente wurden mittels des humanen G3PDH-Amplimers (Contech), rRECF und rRECR und r19F(5'-GAAGACGGAGCATGGCCCTGAAGAC-3') (SEQ ID Nr. 91) bzw. r19R(5'-GGCAGCTGAGTTGGCCAAGTCCAGT-3') (SEQ ID Nr. 91) amplifiziert.
Jede Reaktionsprobe enthielt 100 μM einer dNTP-Mischung, 200 nM eines jeden Primers, 4 μl Matrizen-DNA, 0,25 μl 50x KlenTaq-DNA-Polymerase-Mischung (Clontech) und 2,5 μl des mit der KenTaq DNA-Polymerase-Mischung gelieferten Puffers mit einem Endvolumen von 25 μl. Die PCR-Bedingungen für G3PDH waren wie folgt: Denaturierung bei 94°C für 1 min, gefolgt von 26 Zyklen bei 98°C für 10 s, bei 65°C für 20 s und bei 72°C für 40 s. Die PCR-Bedingungen für UHR-1 und das Liganden-Polypeptid waren wie folgt: Denaturierung bei 94°C für 1 min, gefolgt von 34 Zyklen bei 98°C für 10 s und bei 68°C für 25 s. Ein Aliquot von 5 μl eines jeden RT-PCR-Produkts wurde durch eine Elektrophorese an 4% Nusieve 3:1-Agarosegel (F.M.C.) getrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt. Die Banden wurden mittels eines Dichteprogramms (Advanced American Biotechnology) quantifiziert.
Die Ergebnisse waren ein Maß für die Expressionsgrade von UHR-1 bzw. Liganden-Polypeptid-mRNA in den Geweben und sind in den 38 bzw. 39 dargestellt. UHR-1 und Liganden-Polypeptid-mRNA wurden in allen getesteten Geweben nachgewiesen. Der höchste Grad der UHR-1-mRNA-Expression wurde in der Hypophyse nachgewiesen, und mäßige Expressionsgrade wurden im Gehirn nachgewiesen, während sie in periphären Geweben mit Ausnahme der Adrenaldrüse schwach exprimiert wurde. Liganden-Polypeptid-mRNA wurde in den Gehirnbereichen hauptsächlich im Hypothalamus und im Rückenmark exprimiert und mit vergleichsweise hohen Graden in der Lunge, im Thymus, der Pankreas, der Niere, den Adrenaldrüsen und im Testis exprimiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass UHR-1 und das Liganden-Polypeptid eine signifikante Rolle bei der Regulierung von Funktionen in verschiedenen Geweben spielen.
[Beispiel 37]
Auswirkung von 19P2-L31 auf eine glucoseinduzierte Erhöhung der Plasmainsulinkonzentration
Männliche Wistar-Ratten (8–10 Wochen) wurden durch eine i.p. Injektion von Pentobarbital (65 mg/kg) anästhesiert. Nur Glucose (86 mg/Ratte) oder Glucose und 19P2-L31 (675 pmol, 2,25 nmol, 6,75 nmol und 67,5 nmol/Ratte) wurden mittels Bolusinjektion in die Drosselvene verabreicht. Die Insulinkonzentration des Plasmas wurde mit einem Radioimmunoassay-Kit (Amersham) bestimmt.
Eine Verabreichung von 19P2-L31 mit Dosen von 675 pmol, 2,25 nmol und 6,75 nmol hemmte partiell einen glucoseinduzierten scharfen Anstieg (die erste Phase) der Plasmainsulin-Konzentration 2 min nach der Injektion und die stetige Erhöhung (die zweite Phase) 6 min nach der Injektion. Bei der Dosis von 67,5 nmol hemmte es die erste und die zweite Phase der Erhöhung der Insulinkonzentration vollständig [40].
[Beispiel 38]
Auswirkungen des Liganden-Polypeptids auf die motorische Aktivität der Maus
Die Auswirkungen der Verabreichung von 19P1-L31 in den Seitenventrikel der Maus auf die motorische Aktivität wurde untersucht. Die reife männliche ICR-Maus (Gewicht bei der Operation: etwa 35 g) wurde mittels einer intraperitonealen Verabreichung von 50 mg/kg Pentobarbital anästhesiert und dann auf einer Stereotaxieapparatur fixiert. Der Schädel einer der Mäuse wurde freigelegt, dann wurde mit einem Zahnarztbohrer ein Loch für die Einführung einer Kanülenführung in den linken Seitenventrikel angefertigt. Die Spitze einer Führungskanüle aus rostfreiem Stahl (24 G, Länge 5 mm) zur Injektion von Medikamenten in den Seitenventrikel wurde an der Position AP: +0,6 mm (vom Bregma), L: linke 1 mm und H: –1 mm (von der Dura mater) eingeführt. Die Führungskanüle wurde mit Klebstoff am Schädel fixiert. Die Mäuse mit implantierter Kanüle wurden wie oben beschrieben gehalten und wenigstens drei Tage nach der Operation für eine Verhaltensanalyse verwendet.
Die motorische Aktivität wie die spontane motorische Aktivität und das Aufrichten wurden gemessen, wobei jede Maus sich in einem transparenten Acrylkäfig (24 × 37 × 30 cm) innerhalb eines schallgedämmten, beleuchteten (Licht an: 6–18 Uhr) Gehäuses befand. Leitungswasser und Laborfutter waren ad libitum verfügbar. Die motorische Aktivität wurde mittels eines Supermex (Muromachi Kikai) gemessen. Medikamente und PBS wurden um 14:30 Uhr ±30 min verabreicht. Bei der Verabreichung wurde eine Mikroinjektionskanüle aus rostfreiem Stahl (30 G, Länge 6 mm) in die Führungskanüle eingeführt. Die Mikroinjektionskanüle wurde mit einem Teflonschlauch an eine Mikrospritzenpumpe angeschlossen, und die Injektion von PBS oder einem in PBS aufgelösten Peptid dauerte 2 min bei einer Geschwindigkeit von 2 μl/min. Die Mikroinjektionskanüle wurde 2 min nach dem Ende der Injektion herausgezogen, dann wurde die motorische Aktivität gemessen.
Die Ergebnisse sind als Mittelwert ±SEM (Standardabweichung des Mittelwerts) ausgedrückt. Zur Bestimmung der Signifikanz von Unterschieden zwischen Werten von Mäusen, die mit einem Peptid behandelt wurden, und den Kontrollen, denen PBS injiziert wurde, wurde der Student-t-Test verwendet. Zum Zweck dieser Analyse wurde angenommen, dass p < 0,05 der Mindestgrad der Signifikanz war.
Wie in [41] veranschaulicht ist, bewirkte die Verabreichung von 10 nmol 19P2-L31 eine signifikante Erhöhung der spontanen motorischen Aktivität 70–105 min nach der Injektion. Das Aufrichtverhalten zeigte ebenfalls eine signifikante Variation. Während die Verabreichung von 1 nmol 19P2-L31 keine statistisch signifikante Änderung der spontanen motorischen Aktivität bewirkte, wies das Aufrichtverhalten nur 105 min nach der Injektion eine signifikante Abnahme auf [42]. Die Verabreichung von 0,1 nmol 19P2-L31 bewirkte 25 min, 40 min und 70 min nach der Injektion eine signifikante Zunahme. In diesem Fall wies das Aufrichtverhalten eine steigende Tendenz auf, die derjenigen der spontanen motorischen Aktivität ähnlich war, obwohl dies statistisch nicht signifikant war [43]. Die Verabreichung von 0,01 nmol 19P2-31 bewirkte eine signifikante Erhöhung 20 min und 40 min nach der Injektion. In diesem Fall wies das Aufrichtverhalten eine steigende Tendenz auf, die derjenigen der spontanen motorischen Aktivität ähnlich war, obwohl dies statistisch nicht signifikant war [44].
[Beispiel 39]
Auswirkungen des Liganden-Polypeptids auf die durch Reserpin induzierte Hypothermie bei Mäusen
Die reife männliche ICR-Maus (Gewicht bei der Operation: etwa 35 g) wurde mittels einer Verabreichung von 50 mg/kg Pentobarbital anästhesiert und dann auf einer Stereotaxieapparatur fixiert. Der Schädel einer der Mäuse wurde freigelegt, dann wurde mit einem Zahnarztbohrer ein Loch für eine Einführung einer Kanülenführung in den linken Seitenventrikel angefertigt. Die Spitze einer Führungskanüle aus rostfreiem Stahl (24 G, Länge 5 mm) zur Injektion von Medikamenten in den Seitenventrikel wurde an der Position AP: +0,6 mm (vom Bregma), L: linke 1 mm und H: –1 mm (von der Dura mater) eingeführt. Die Führungskanüle wurde mit Klebstoff am Schädel fixiert. Die Mäuse mit implantierter Kanüle wurden wie oben beschrieben gehalten und wenigstens drei Tage nach der Operation für Messungen der Körpertemperatur verwendet. Reserpin (Apoplon; Daiichi Pharmaceutical) wurde Mäusen in einer Dosis von 3 mg/kg s.c. verabreicht, und nach 15 h wurde jede Maus zur Messung in einen Käfig gesetzt. Dann wurde eine Mikroinjektionskanüle aus rostfreiem Stahl (30 G, Länge 6 mm) in die Führungskanüle eingeführt. Die Mikroinjektionskanüle wurde mit einem Teflonschlauch an eine Mikrospritzenpumpe angeschlossen, und die Injektion von PBS oder einem in PBS aufgelösten Peptid dauerte 2 min bei einer Geschwindigkeit von 1 μl/min. Die Mikroinjektionskanüle wurde 2 min nach dem Ende der Injektion herausgezogen, dann wurde die Temperatur im Rektum gemessen.
Die Ergebnisse sind als Mittelwert ±SEM ausgedrückt. Zur Bestimmung der Signifikanz von Unterschieden zwischen Werten von Mäusen, die mit einem Peptid behandelt wurden, und den Kontrollen, denen PBS injiziert wurde, wurde der Student-t-Test verwendet. Zum Zweck dieser Analyse wurde angenommen, dass p < 0,05 der Mindestgrad der Signifikanz war.
Wie in [45] veranschaulicht ist, erhöhte sich die durch Reserpin abgesenkte Körpertemperatur nach einer Injektion von 10 nmol 19P2-L31 im Gegensatz zur Kontrolle, der PBS verabreicht wurde, signifikant. Diese Erhöhung der Körpertemperatur erreichte 45 min nach der Verabreichung des Peptids ein Maximum. Andererseits gab es zwischen 1 nmol 19P2-L31 und der Kontrolle, der über den gesamten Zeitraum des Experiments PBS injiziert wurde, keine statistisch signifikante Differenz der Temperaturschwankung.
[Beispiel 40]
Auswirkungen von Liganden-Polypeptid auf den Blutdruck von Ratten
Die Erfinder untersuchten den Einfluss der Injektion von 19P2-L31 in die Area postrema der Medulla oblongata auf den Blutdruck. Männliche Wistar-Ratten (Körpergewicht bei der Operation: ca. 300 g) wurden mit 50 mg/kg Pentobarbital i.p. anästhesiert, und dann wurde jedes Tier auf einer Rattengehirn-Stereotaxieapparatur fixiert. Der Schneidstab wurde von der interauralen Linie um 3,3 mm abgesenkt. Der Schädel wurde freigelegt, und mit einem Zahnarztbohrer wurde im Schädel ein Loch zur Implantation einer Führungskanüle angefertigt. Darüber hinaus wurden Verankerungsschrauben in zwei Positionen um das gebohrte Loch eingelassen. Eine Kanüle aus rostfreiem Stahl, AG-12 (Innendurchmesser 0,4 mm, Außendurchmesser 0,5 mm, EICOM) wurde so eingeführt, dass ihr Führungsende sich im oberen Teil der Area postrema befindet. Zu diesem Zweck wurde die Führungskanüle aus einer Vorwärtsrichtung in einem Winkel von 20° zur Senkrechten eingeführt (46. Dabei ist jedoch zu beachten, dass die Zeichnung eine Mikroinjektionskanüle darstellt, die 1,0 mm länger als die Führungskanüle ist). Unter Bezugnahme auf den Atlas von Paxinos und Watson (1986) betrugen die stereotaxischen Koordinaten AP: –6,0 mm (von der interauralen Linie), L: 0,0 mm und H: +1,5 mm (von der interauralen Linie). Die Führungskanüle wurde mit einem Sekundenkleber, einem Dentalzement und Verankerungsstücken am Schädel befestigt. Eine Leerkanüle, AD-12 (0,35 mm Außendurchmesser, EICOM) wurde in die Führungskanüle eingeführt und mit einer Hutmutter (EICOM) in ihrer Position gesichert. Danach wurden die Ratten in Einzelkäfigen gehalten.
Nach einer etwa einwöchigen Fütterung nach der Implantation der Führungskanüle zur postoperativen Erholung wurde eine Operation zur Messung des Blutdrucks bei Ratten durchgeführt, die sich bei Bewusstsein befanden. Die oben beschriebene Ratte wurde mit 50 mg/kg Pentobarbital i.p. anästhesiert und auf einer Nekropsieunterlage in Rückenlage immobilisiert, und die linke Femoralarterie wurde freigelegt. Ein Polyethylenschlauch SP35 (Innendurchmesser 0,5 mm, Außendurchmesser 0,9 mm, Natsume Seisakusho) wurde zu einer Länge von etwa 60 cm geschnitten und mit 200 E/ml heparinhaltiger Kochsalzlösung befüllt. Dieser Schlauch wurde etwa 2,5 cm tief in die Femoralarterie eingeführt und in dieser Position befestigt. Das freie Ende des Schlauchs wurde unter der dorsalen Haut durchgeführt und im Zervikalbereich (dorsale Seite) freigelegt.
Nach einem für eine Nacht nach der Operation erfolgenden Warten wurde der Polyethylenschlauch an einen Transducer (Spectramed) angeschlossen, und der Blutdruck wurde gemessen. Nachdem die Blutdruckwerte stetig geworden waren, wurden die Hutmutter und die Leerkanüle aus dem Schädel der Ratte entfernt, und statt dessen wurde eine Mikroinjektionskanüle aus rostfreiem Stahl (0,17 mm Innendurchmesser, 0,35 mm Außendurchmesser, EICOM), die an einen Teflonschlauch (Länge 50 cm, Innendurchmesser 0,1 mm, Außendurchmesser 0,4 mm, EICOM) angeschlossen. Die Länge der Mikroinjektionskanüle wurde zuvor so eingestellt, dass ihre Spitze sich 1 mm über die Führungskanüle hinaus erstreckte (46). Ein Ende des Teflonschlauchs wurde an eine Mikrospritzenpumpe angeschlossen, und entweder PBS oder in PBS aufgelöstes 19P2-L31 mit einem Gesamtvolumen von 2 μl wurde mit einer Fließrate von 1,0 μl/min in die Area postrema injiziert.
Nach einer Messung des Blutdrucks wurde die zur Injektion von 19P2-L31 verwendete Mikroinjektionskanüle abgenommen und durch eine Mikroinjektionskanüle zur Injektion einer Färbemittel-(Evans-Blau-)Lösung ersetzt. Das Färbemittel wurde mit derselben Rate von 1,0 μl/min wie bei der Injektion von 19P2-L31 2 min lang infundiert. Nach einer Wartezeit von etwa 3 min wurde die Mikroinjektionskanüle entnommen. Die Ratte wurde enthauptet, und das Gehirn wurde schnell entnommen und eingefroren. Die Gehirne wurden im Kryostaten zu seriellen frontalen Schnitten geschnitten, und die Position der Farbstoffinfusion wurde bestätigt.
Ergebnisse des obigen Experiments zeigten, dass eine Injektion von 10 nmol 19P2-L31 in die Area postrema der Medulla oblongata eine Erhöhung des Blutdrucks bewirkte. Typische Beispiele für den direkten und den mittleren Blutdruck sind in 47 aufgeführt.
[Beispiel 41]
Auswirkungen des Liganden-Polypeptids auf die Konzentration des Hypophysenhormons im Plasma
Die Erfinder untersuchten die Auswirkung von in den dritten Ventrikel verabreichtem 19P2-L31 auf die Konzentrationen der Hypophysenhormone im Plasma. Männliche Wistar-Ratten (Körpergewicht bei der Operation: 290–350 g) wurden mit 50 mg/kg Pentobarbital i.p. anästhesiert und jeweils in einer Stereotaxievorrichtung für Rattengehirne immobilisiert. Der Schneidstab wurde 3,3 mm unterhalb der interauralen Linie eingestellt. Der Schädel wurde freigelegt, und mit einem Zahnarztbohrer wurde im Knochen ein Loch zur Implantation einer Führungskanüle angefertigt. Darüber hinaus wurde eine Verankerungsschraube in einer Position um das gebohrte Loch eingelassen. Eine Kanüle aus rostfreiem Stahl, AG-12 (Innendurchmesser 0,4 mm, Außendurchmesser 0,5 mm, EICOM) wurde so eingeführt, dass ihre Spitze sich im oberen Teil des dritten Ventrikels befindet. Unter Bezugnahme auf den Atlas von Paxinos und Watson (1986) betrugen die stereotaxischen Koordinaten AP: +7,2 mm (von der interauralen Linie), L: 0,0 mm und N: +2,0 mm (von der interauralen Linie). Die Führungskanüle wurde mit einem Sekundenkleber, einem Dentalzement und einem Verankerungsstück am Schädel befestigt. Eine Leerkanüle, AD-12 (0,35 mm Außendurchmesser, EICOM) wurde dann in die Führungskanüle eingeführt und mit einer Hutmutter (EICOM) in ihrer Position gesichert. Danach wurden die Ratten zur Erholung wenigstens 3 Tage lang in Einzelkäfigen gehalten, bevor mit dem Experiment begonnen wurde.
Die operierte Ratte wurde mit 50 mg Pentobarbital i.p. anästhesiert und in Rückenlage fixiert. Nachdem die bilateralen Drosselvenen freigelegt worden waren, wurden 400 μl Blut mit einer 1-ml-Tuberkulinspritze und einer 24-G-Nadel (beide von Termo) abgenommen. Zur Verhinderung einer Verklumpung wurde die Spritze zuvor mit 20 μl Kochsalzlösung, die 200 E/ml Heparin enthielt, befüllt. Die Hutmutter und die Leerkanüle wurden aus dem Schädel der Ratte entfernt, und stattdessen wurde eine Mikroinjektionskanüle aus rostfreiem Stahl (Innendurchmesser 0,17 mm, Außendurchmesser 0,35 mm, EICOM), an die ein Teflonschlauch (Länge 50 cm, Innendurchmesser 0,1 mm, Außendurchmesser 0,4 mm, EICOM) eingeführt. Die Länge der Mikroinjektionskanüle wurde zuvor so eingestellt, dass ihre Spitze um 1 mm aus der Führungskanüle herausstand. Ein Ende des Teflonschlauchs wurde an eine Mikrospritzenpumpe angeschlossen, und entweder PBS oder in PBS gelöstes 19P2-L31 wurde mit einem Gesamtvolumen von 10 μl mit einer Fließrate von 2,5 μl/min in den dritten Ventrikel injiziert. Nach einer Wartezeit von 1 min nach der Infusion wurde die Mikroinjektionskanüle entfernt und die Leerkanüle wieder eingeführt und mit einer Hutmutter in ihrer Position gesichert. Unmittelbar vor Beginn der intraventrikulären Injektion und 10, 20, 30, 40 und 60 min nach Beginn der Verabreichung wurden 400-μl-Teile Blut aus der Drosselvene entnommen. Jede Blutprobe wurde mit einer gekühlten Hochgeschwindigkeits-Zentrifuge (MR-150, Tommy Seiko) zentrifugiert (5000 U./min, 10 min), und der Überstand (Plasma) wurde isoliert. Die Mengen der Hypophysenhormone [Prolactin, Luteinisierungshormon (LH), adrenocorticotrophes Hormon (ACTH), Thyreoidea-stimulierendes Hormon (TSH) und Wachstumshormon (GH)] im Plasma wurden jeweils durch Radioimmunoassays bestimmt.
Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ±S.E.M. ausgedrückt. Um auf einen signifikanten Unterschied zwischen der Gruppe, die mit in PBS gelöstem 19P2-L31 behandelt worden war, und der nur mit PBS behandelten Kontrollgruppe zu testen, wurde ein Student-t-Test verwendet. Gemäß dem zweiseitigen Test wurde angenommen, dass p < 0,05 der minimale Grad der Signifikanz war. Wie in 48 veranschaulicht ist, war die GH-Konzentration im Plasma 20 in nach der Verabreichung von 50 nmol 19P2-L31 in den dritten Ventrikel im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant vermindert. Tendenzen zu einer Abnahme wurden auch 10, 30 und 40 min nach der Verabreichung gefunden, wobei die Änderungen aber nicht statistisch signifikant waren. 60 min nach der Verabreichung gab es keinen Unterschied zur Kontrollgruppe. Hinsichtlich Prolactin, LH, ACTH und TSH im Plasma wies keines davon signifikanten Änderungen auf.
[Beispiel 42]
Auswirkungen eines Liganden-Polypeptids auf die Konzentration des Wachstumshormons (GH) in sich frei bewegenden Ratten
Männliche Wistar-Ratten wurden mit 50 mg/kg Pentobarbital i.p. anästhesiert, und wie in Beispiel 41 wurde eine Führungskanüle aus rostfreiem Stahl, AG-12 (Innendurchmesser 0,4 mm, Außendurchmesser 0,5 mm, EICOM) so implantiert, dass ihre Spitze sich im oberen Teil des dritten Ventrikels befand. Nach der Operation wurden die Ratten in Einzelkäfigen gehalten und zur Erholung 3 Tage lang gehalten, und dann wurde eine Kanüle (Länge 30 cm, Innendurchmesser 0,9 mm, Außendurchmesser 0,9 mm, Natsume Seisakusho), die mit Heparin (200 E/ml) enthaltender Kochsalzlösung befüllt war, unter Pentobarbital-Anästhesie von der rechten Drosselvene aus in das rechte Atrium injiziert. Die Ratten wurden über Nacht gehalten, um von der Anästhesie vollständig aufzuwachen, und dann in transparente Acrylkäfige (30 cm × 30 cm × 35 cm) verbracht. Eine 1-ml-Tuberkulinspritze mit einer 24-G-Nadel (beides von Termo) wurde an die in das Atrium eingeführte Kanüle angeschlossen, und 300 μl Blut wurden abgenommen. Um eine Gerinnung zu verhindern, wurde die Spritze zuvor mit 20 μl einer 200 E/min enthaltenden Kochsalzlösung befüllt. Eine Mikroinjektionsspritze aus rostfreiem Stahl (Innendurchmesser 0,17 mm, Außendurchmesser 0,35 mm, EICOM), die an einen Teflonschlauch (Länge 50 cm, Innendurchmesser 0,1 mm, Außendurchmesser 0,4 mm, EICOM) angeschlossen war, wurde in die in der dritten Ventrikel positionierten Führungskanüle eingeführt. Die Länge der Mikroinjektionskanüle wurde zuvor so eingestellt, dass ihre Spitze sich 1 mm von der Führungskanüle erstreckte. Ein Ende des Teflonschlauchs war an eine Mikrospritzenpumpe angeschlossen, und entweder PBS oder in PBS gelöstes 19P2-L31 wurde mit einem Gesamtvolumen von 10 μl mit einer Fließrate von 2,5 μl/min in den dritten Ventrikel injiziert. 10 min nach Beginn der Verabrei chung in den dritten Ventrikel wurden 5 μg/kg GHRH-Kochsalzlösung über die in das Atrium eingeführte Kanüle verabreicht. Unmittelbar vor Beginn der intraventrikulären Verabreichung und 10, 20, 30, 40 und 60 min nach der Verabreichung von GHRH wurden 300-μl-Teile Blut aus der Drosselvene abgenommen. Jede Blutprobe wurde zentrifugiert (5000 U./min, 10 min), und der Überstand (Plasma) wurde isoliert. Die GH-Konzentrationen im Plasma wurden mittels eines Radioimmunoassays bestimmt.
Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ±S.E.M. ausgedrückt. Um auf einen signifikanten Unterschied zwischen der Gruppe, die mit dem in PBS gelösten 19P2-L31 behandelt worden war, und der nur mit PBS behandelten Kontrollgruppe zu testen, wurde der Student-t-Test verwendet. Gemäß dem zweiseitigen Test wurde angenommen, dass p < 0,05 die Mindestkonzentration der Signifikanz war. Wie in 49 veranschaulicht ist, erhöhte eine Verabreichung von 5 μg/kg GHRH die GH-Konzentration im Plasma. Wenn jedoch 50 nmol 19P2-L31 in den dritten Ventrikel verabreicht wurden, war die GHRH-induzierte Erhöhung des Plasma-GH signifikant gehemmt.
[Beispiel 43]
Herstellung von Kaninchen-Anti-Rind-19P2-L31-Antikörpern
Synthetische Peptide, die die Teilsequenz 19P2-L31 [Peptid I: SRAHQHSMEIRTPDC (SEQ ID Nr. 92), Peptid II: CAWYAGRGIRPVGRFNH₂ (SEQ ID Nr. 93) und CEIRTPDINPAWYAG (SEQ ID Nr. 94)] aufwiesen, wurden nach dem Standardverfahren mit KLH konjugiert. Jedes der in Kochsalzlösung gelösten Peptidkonjugate (600 μg als Peptid) wurde mit Freunds vollständigem Adjuvans vermischt, und die resultierende Emulsion wurde drei Kaninchen (NZW, männlich, 2,5 kg) jeweils subkutan injiziert. Eine Hyperimmunisierung wurde alle drei Wochen insgesamt dreimal mit derselben Dosis des Konjugats wie bei der ersten Injektion mit Freunds vollständigem Adjuvans durchgeführt. Antikörper-Titer wurden wie folgt bestimmt. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden Blutproben jeweils aus der Vene der immunisierten Kaninchen erhalten. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37°C wurden die Blutproben über Nacht bei 4°C gehalten. Dann wurden mittels Zentrifugation Seren hergestellt. Ein Aliquot (100 μl) einer jeden richtig verdünnten Serumprobe) wurde in Polystyrol-Mikroplatten mit 96 Vertiefungen eingeführt, die mit Ziegen-Antikaninchen-IgG- (Fc)-Antikörpern vorbeschichtet worden waren, und dann wurden die Mikroplatten 16 h lang bei 4°C inkubiert. Nach der Entfernung der Seren wurde zu den Vertiefungen jeweils an Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiertes Peptid I, II und III gegeben, und dann wurden die Mikroplatten 4 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Entfernung der Peptide erfolgte eine Färbungreaktion durch die Zugabe eines Substrats. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 100 μl einer Stopplösung gestoppt, und dann wurde die Absorption bei 450 nm in jeder Vertiefung gemessen. Wie in 50 dargestellt ist, wiesen von den Kaninchen nach der Immunisierung erhaltene Serumproben jeweils Bindungswirkungen gegenüber HRP-konjugierten Peptiden auf. In vor der Immunisierung hergestellten Seren wurde jedoch keine Bindungswirkung festgestellt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Kaninchen die Immunisierung durch Antikörper erhielten, die sie jeweils gegen das Peptid I, II und III erzeugten. Zur Herstellung von gereinigten IgG-Antikörper-Fraktionen wurden Seren, die von den immunisierten Kaninchen erhalten worden waren, mit Ammoniumsulfat ausgefällt. Die resultierenden Präzipitate wurden in Boratpuffer aufgelöst und dann mit demselben Puffer dialysiert. Die so erhaltenen IgG-Fraktionen wurden dann auf Affinitätssäulen aufgegeben, die mit dem Peptid I bzw. 19P2-L31 konjugiert waren. Nach einem Waschen der Säulen mit Boratpuffer und danach mit Acetatpuffer (100 mM, pH-Wert 4,5) wurden an die Säule gebundene Antikörper mit Glycinpuffer (200 mM, pH-Wert 2,0 eluiert. Nach einer Neutralisierung mit 1 M Tris wurden die Eluenten jeweils als gereinigte Antikörper verwendet.
[Beispiel 44]
Hemmende Wirkung von Antikörpern auf die von 19P2-L31 induzierte Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten
Die gemäß der Beschreibung in Beispiel 43 hergestellten gereinigten Antikörper wurden auf ihre hemmende Wirkung auf die von 19P2-L31 induzierte Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten getestet. Die Antikörper, die gemäß der Angaben in 51 verdünnt waren, wurden 1 h lang mit 19P2-L31 (5 × 10^–10 M) bei Raumtemperatur vermischt, und dann wurde die Freisetzung von Arachidonsäure-Metaboliten gemäß der Beschreibung in Beispiel 11 untersucht. Wie in 51 veranschaulicht ist, wurde die höchste hemmende Wirkung in Anti-Peptid-II-Antikörpern beobachtet.
[Herstellungsbeispiel 1]
50 mg der in Beispiel 21 erhaltenen Verbindung werden in 50 ml destilliertem Wasser gemäß der japanischen Pharmakopöe aufgelöst, und destilliertes Wasser gemäß der japanischen Pharmakopöe zur Injektion wird dazugegeben, wodurch 100 ml erhalten werden. Die resultierende Lösung wird unter keimfreien Bedingungen filtriert, und das Filtrat von jeweils 1 ml wird in Ampullen zur Injektion abgefüllt, gefriergetrocknet und auch unter keimfreien Bedingungen darin versiegelt.
[Herstellungsbeispiel 2]
100 mg der in Beispiel 21 erhaltenen Verbindung werden in 50 ml destilliertem Wasser zur Injektion gemäß der japanischen Pharmakopöe aufgelöst, und destilliertes Wasser zur Injektion gemäß der japanischen Pharmakopöe wird dazugegeben, wodurch 100 ml erhalten werden. Die resultierende Lösung wird unter keimfreien Bedingungen filtriert, und das Filtrat von jeweils 1 ml wird in Ampullen zur Injektion abgefüllt, gefriergetrocknet und auch unter keimfreien Bedingungen darin versiegelt.
[Auswertung der physiologischen Wirkung des Liganden-Polypeptids der vorliegenden Erfindung]
Die obigen Beispiele 37–41 demonstrieren, dass eine topische Verabreichung des Liganden-Polypeptids eine Verstärkung der spontanen motorischen Aktivität und des Aufrichtverhaltens, eine Erhöhung der Körpertemperatur und des Blutdrucks und eine Abnahme der Konzentration des Wachstumshormons im Plasma induziert. Diese Befunde, die auf physiologischen Wirkungen beruhen, sind der erste Beweis für verschiedene auffallende physiologische Änderungen, die erfolgen, wenn ein Liganden-Polypeptid auf das zentrale Nervensystem einwirkt.
Weil das Liganden-Polypeptid der vorliegenden Erfindung einschließlich eines Salzes davon auf das zentrale Nervensystem von warmblütigen Tieren (z.B. der Ratte, der Maus, des Meerschweinchens, des Huhns, des Kaninchens, des Hundes, des Schweins, des Rinds, des Schafs, des Affen und des Menschen) einwirkt, wodurch eine Vielzahl von pharmakologischen Änderungen induziert wird, ist gezeigt worden, dass der Ligand und das Salz die Eigenschaft zur Änderung des intrakranialen Nervensystems und des endokrinen Systems haben.
Wenn 19P2-L31 in den Seitenventrikel von Mäusen verabreicht wurde, wurde eine Erhöhung des Umfangs der Wirkung bei einer Konzentration von 0,01–10 nmol gefunden. Dies zeigt, dass das Liganden-Polypeptid Änderungen im motorischen System über die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren des zentralen Nervensystems auslöst. Es wurde auch gefunden, dass die Verabreichung des Peptids in den Seitenventrikel zu einer Erhöhung der Körpertemperatur führt und dass eine Verabreichung in die Area postrema der Medulla oblongata von Ratten zur Erhöhung des Blutdrucks führt. Diese Wirkungen ähneln den pharmakologischen Wirkungen bekannter zentraler Stimulanzien (z.B. Amphetamin, Kokain, Methylphenidat etc.). Deshalb ist gezeigt, dass das Liganden-Polypeptid oder ein Salz davon biologische Amine (Dopamin, Noradrenalin, Serotonin) hauptsächlich aus den Reservoirs an den Nervenenden freisetzt (Michio Yuzuru und Takeo Yoshikawa, Medical Science, 42, 535–536, 1991).
Weiterhin wurde, wenn 19P2-L31 in den dritten Ventrikel von Ratten injiziert wurde, die Konzentration des Wachstumshormons im Plasma verringert. Dieser Befund zeigt, dass dieses Peptid auf den Hypothalamus einwirkt und mit der Sekretion von Hypophysenhormonen über das Hypothalamus-Hypophysen-System assoziiert ist. Es ist auch möglich, dass dieses Peptid direkt auf die Hypophyse einwirkt, um die Freisetzung von Wachstumshormon zu unterdrücken. Das Wachstumshormon freisetzende Hormon (GHRH), das die Sekretion des Wachstumshormons aus der Hypophyse reguliert, sowie Somatostatin liegen in der Nachbarschaft des dritten Ventrikels vor (Masahiro Tohyama et al., Kagekuteki Shinkeikino Kaibogaku (Chemical Neuroanatomy), 167–216, 1987). Damit ist gezeigt, dass 19P2-L31 die Freisetzung dieser Substanzen moduliert.
Die obigen Tatsachen zeigen, dass ein Liganden-Polypeptid ein Peptid ist, das auf das zentrale Nervensystem so einwirkt, dass das autonome Nervensystem geregelt wird. Die Tatsache, dass die mRNA dieses Peptids und seines Rezeptors im Hypothalamus und in der Medulla oblongata mit hohen Konzentrationen exprimiert wird, zeigt auch die Einbeziehung des Liganden-Polypeptids in die Modulation des autonomen Nervensystems. Tatsächlich sind die Medulla oblongata und der Hypothalamus das übergeordnete Zentrum der autonomen peripheren Nerven, wo, wie bereits gefunden worden ist, das sympathische Nervensystem und das parasympathische Nervensystem integriert sind, wodurch sie eine wichtige Rolle sowohl bei der neuralen Regulation als auch bei der humoralen Regulation spielen.
Die obigen Befunde deuten auf die Nützlichkeit eines Liganden-Polypeptids oder eines Agonisten eines Liganden-Polypeptids oder eines Salzes davon als Stimulans des zentralen Nervensystems hin, wodurch eine Verstärkung der spontanen motorischen Aktivität bewirkt wird. Somit kann das Peptid als prophylaktisches und/oder therapeutisches Medikament für eine Vielzahl von Krankheiten wie der für Demenzen wie die senile Demenz, die zerebrovaskuläre Demenz (Demenz aufgrund einer zerebrovaskulären Störung), einer mit phylodegenerativen retroplastischen Krankheiten zusammenhängenden Demenz (z.B. Alzheimer-Krankheit, Parkinsonsche Krankheit, Pick-Krankheit, Huntington-Krankheit etc.), Demenz aufgrund von Infektionskrankheiten (z.B. verzögerte Virusinfektionen wie die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit), Demenzen im Zusammenhang mit endokrinen, metabolischen und toxischen Krankheiten (z.B. Hypothyreoidismus, Vitamin-B12-Mangel, Alkoholismus und eine Vergiftung mit verschiedenen Medikamenten, Metallen oder organischen Verbindungen), Demenzen im Zusammenhang mit onkogenen Krankheiten (z.B. Gehirntumor), Demenzen aufgrund von traumatischen Krankheiten (z.B. chronische subdurale Hämatome), Depression (Melancholie), das hyperkinetische Syndrom (Mikroenzephalopathie) oder eine Bewusstseinsstörung verwendet werden. Andererseits ist ein Antagonist des 19P2-Liganden oder eines Salzes davon als beispielsweise als CNS-Depressivum wertvoll und kann als Antipsychotikum, als Medikament gegen die Huntington-Krankheit, als angstbekämpfendes Medikament oder als Hypnotikum sedativum verwendet werden.
Es wurde aufgeklärt, dass eine Injektion des Liganden-Polypeptids in die Area postrema der Medulla oblongata den Blutdruck erhöht. Daher ist ein Liganden-Polypeptid oder ein Agonist eines Liganden-Polypeptids oder ein Salz davon als Vasodepressor wertvoll. Andererseits ist ein Liganden-Polypeptid-Antagonist oder ein Salz davon als Depressor wertvoll.
Es wurde gefunden, dass, wenn ein Liganden-Polypeptid auf den Hypothalamus einwirkt, die Konzentration des Wachstumshormons im Plasma erniedrigt wird. Eine Hypersekretion von Wachstumshormon löst Makrosomie und akromegalischen Gigantismus aus (Katamasu et al., Endocrine Syndrome, 78– 80, 1993; Hiroi et al, Endocrine Syndrome, 149–151, 1993). Daher kann ein Liganden-Polypeptid oder ein Liganden-Polypeptid-Antagonist oder ein Salz davon als prophylaktisches und/oder therapeutisches Medikament für Makrosomie und den akromegalischen Gigantismus verwendet werden. Darüber hinaus fördert das Wachstumshormon die Freisetzung von Glucose aus der Leber und hemmt die Aufnahme von Glucose durch Muskeln und Fettgeweben aus dem Blut, wodurch Hyperglykämie und Diabetes verursacht werden [Eiji Kobayashi, Naibumpi Gensho (Endocrine Phenomena), 1980]. Tatsächlich ist die Sekretion des Wachstumshormons bei Diabetespatienten erhöht (Hiroshi Kiyono, Endocrinology and Metabolic Diseases, 385–402, 1994). Daher kann ein Liganden-Polypeptid oder ein Agonist eines Liganden-Polypeptids oder ein Salz davon beispielsweise als prophylaktisches und/oder therapeutisches Medikament für Diabetes verwendet werden.
Andererseits fördert ein Antagonist des Liganden-Polypeptids die Sekretion des Wachstumshormons. Daher kann ein Liganden-Polypeptid-Antagonist oder ein Salz davon als prophylaktisches und/oder therapeutisches Medikament für Pituitarismus verwendet werden, was zu einer verminderten Konzentration des Wachstumshormons, hypophysärem Zwergwuchs und Hypoglykämie führt. Darüber hinaus sind das Wachstumshormon und der insulinähnliche Wachstumsfaktor, der vom Wachstumshormon sezerniert wird, bei der amytrophen Lateralsklerose, der Osteoporose, einem Nierenversagen und bei einer Verbesserung des postoperativen Nährstoffzustands wirksam (Shizume et al., Endocrine Syndrome, 84–87, 1993, Nikkei Bio-Annal 96, 453–454, 1996; Tobiume et al., Clinical Endocrinology, 44, 1205–1214, 1996). Daher kann ein Liganden-Polypeptid-Antagonist oder ein Salz davon als prophylaktisches und/oder therapeutisches Medikament für solche Krankheiten verwendet werden.
[Sequenzprotokoll]

Claims

Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus SEQ ID Nr. 73, einer Aminosäuresequenz, bei der 1–15 Aminosäurereste aus SEQ ID Nr. 73 deletiert sind, einer Aminosäuresequenz, bei der 1–80 Aminosäurereste zu SEQ ID Nr. 73 addiert sind und einer Aminosäuresequenz, bei der 1–15 Aminosäurereste von SEQ ID Nr. 73 durch eine oder mehrere andere Aminosäurereste substituiert sind, ausgewählt ist, wobei das Polypeptid an ein Rezeptorprotein binden kann, das die durch SEQ ID Nr. 21 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst, oder dessen Amid oder Ester oder ein Salz davon.
Polypeptid gemäß Anspruch 1, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus einer Aminosäuresequenz, bei der 1–10 Aminosäurereste aus SEQ ID Nr. 73 deletiert sind, einer Aminosäuresequenz, bei der 1-50 Aminosäurereste zu SEQ ID Nr. 73 addiert sind und einer Aminosäuresequenz, bei der 1–10 Aminosäurereste von SEQ ID Nr. 73 durch eine oder mehrere andere Aminosäurereste substituiert sind, ausgewählt ist.
Polypeptid gemäß Anspruch 2, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus einer Aminosäuresequenz, bei der 1–5 Aminosäurereste aus SEQ ID Nr. 73 deletiert sind, einer Aminosäuresequenz, bei der 1–10 Aminosäurereste zu SEQ ID Nr. 73 addiert sind und einer Aminosäure sequenz, bei der 1–5 Aminosäurereste von SEQ ID Nr. 73 durch eine oder mehrere andere Aminosäurereste substituiert sind, ausgewählt ist.
Polypeptid gemäß Anspruch 1, das die Aminosäuresequenz umfasst, die durch SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 10, SEQ ID Nr. 47, SEQ ID Nr. 48, SEQ ID Nr. 49, SEQ ID Nr. 50, SEQ ID Nr. 51, SEQ ID Nr. 52, SEQ ID Nr. 61, SEQ ID Nr. 62, SEQ ID Nr. 63, SEQ ID Nr. 64, SEQ ID Nr. 65 oder SEQ ID Nr. 66 dargestellt wird.
Polypeptid gemäß Anspruch 1, das die Aminosäuresequenz umfasst, die durch SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 44, SEQ ID Nr. 45 oder SEQ ID Nr. 59 dargestellt wird.
DNA, die eine DNA mit einer Nucleotidsequenz umfasst, die für das Polypeptid codiert, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert ist.
DNA gemäß Anspruch 6, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die durch SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 16, SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 18, SEQ ID Nr. 46, SEQ ID Nr. 53, SEQ ID Nr. 54, SEQ ID Nr. 55, SEQ ID Nr. 56, SEQ ID Nr. 57, SEQ ID Nr. 58, SEQ ID Nr. 60, SEQ ID Nr. 67, SEQ ID Nr. 68, SEQ ID Nr. 69, SEQ ID Nr. 70, SEQ ID Nr. 71 oder SEQ ID Nr. 72 dargestellt wird.
Rekombinanter Vektor, der die DNA gemäß Anspruch 6 umfasst.
Wirtszelle, die die DNA gemäß Anspruch 6 oder den rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 8 trägt.
Verfahren zur Herstellung des Polypeptids gemäß Anspruch 1, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle gemäß Anspruch 8.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die das Polypeptid, sein Amid oder seinen Ester gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 5 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die die DNA gemäß Anspruch 6 oder 7 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 11 oder 12, bei der es sich um einen Modulator der Hypophysenfunktion handelt.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 11 oder 12, bei der es sich um einen Modulator der Funktion des zentralen Nervensystems handelt.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 11 oder 12, bei der es sich um einen Modulator der Pankreasfunktion handelt.
Antikörper gegen das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5.
Screening-Verfahren für eine Verbindung, die die Oindungsaktivität des Polypeptids gemäß Anspruch 1 gegenüber einem Rezeptorprotein ändern kann, wobei das Rezeptorprotein ein Polypeptid, das die durch SEQ ID Nr. 73 dargestellte Aminosäureseguenz umfasst, binden kann und eine aus SEQ ID Nr. 21 ausgewählte Aminosäuresequenz, eine Aminosäuresequenz, bei der 1–30 Aminosäurereste aus SEQ ID Nr. 21 deletiert sind, einer Aminosäuresequenz, bei der 1–30 Aminosäurereste zu SEQ ID Nr. 21 addiert sind oder einer Aminosäuresequenz, bei der 1–30 Aminosäurereste von SEQ ID Nr. 21 durch eine oder mehrere andere Aminosäurereste substituiert sind, oder ein Salz davon umfasst, wobei das Verfahren die Durchführung eines Vergleichs umfasst zwischen: (i) wenigstens einem Fall, bei dem das Polypeptid gemäß Anspruch 1 mit dem Rezeptorprotein oder einem Salz davon in Kontakt gebracht wird; und (ii) wenigstens einem Fall, bei dem das Polypeptid gemäß Anspruch 1 zusammen mit einer zu testenden Probe mit dem Rezeptorprotein in Kontakt gebracht wird.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei das Rezeptorprotein eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus einer Aminosäuresequenz, bei der 1-10 Aminosäurereste aus SEQ ID Nr. 21 deletiert sind, einer Aminosäuresequenz, bei der 1–10 Aminosäurereste zu SEQ ID Nr. 21 addiert sind und einer Aminosäuresequenz, bei der 1–10 Aminosäurereste von SEQ ID Nr. 21 durch eine oder mehrere andere Aminosäurereste substituiert sind, ausgewählt ist.
Kit zum Suchen (Screening) nach einer Verbindung, die die Bindungsaktivität des Polypeptids gemäß Anspruch 1 gegenüber einem Rezeptorprotein ändern kann, wobei das Rezeptorprotein ein Polypeptid, das die durch SEQ ID Nr. 73 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst, binden kann und eine aus SEQ ID Nr. 21 ausgewählte Aminosäuresequenz, eine Aminosäuresequenz, bei der 1–30 Aminosäurereste aus SEQ ID Nr. 21 deletiert sind, einer Aminosäuresequenz, bei der 1–30 Aminosäurereste zu SEQ ID Nr. 21 addiert sind oder einer Aminosäuresequenz, bei der 1–30 Aminosäurereste von SEQ ID Nr. 21 durch eine oder mehrere andere Aminosäurereste substituiert sind, oder ein Salz davon umfasst, wobei der Kit Folgendes umfasst: (i) ein Rezeptorprotein, wie es oben definiert ist; und (ii) ein Polypeptid, wie es in Anspruch 1 definiert ist.
Kit gemäß Anspruch 19, wobei das Rezeptorprotein eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus einer Aminosäuresequenz, bei der 1-10 Aminosäurereste aus SEQ ID Nr. 21 deletiert sind, einer Aminosäuresequenz, bei der 1-10 Aminosäurereste zu SEQ ID Nr. 21 addiert sind und einer Aminosäuresequenz, bei der 1-10 Aminosäurereste von SEQ ID Nr. 21 durch eine oder mehrere andere Aminosäurereste substituiert sind, ausgewählt ist.