DE69733933T2

DE69733933T2 - Neue Liganden des Neuropeptid Rezeptors HFGAN72

Info

Publication number: DE69733933T2
Application number: DE69733933T
Authority: DE
Inventors: Derk J. King of Prussia Bergsma; David P. King of Prussia Brooks; Miklos King of Prussia Gellai; Masashi Yanagisawa; Shelagh Wilson
Original assignee: SmithKline Beecham Ltd; University of Texas System; SmithKline Beecham Corp; University of Texas at Austin
Current assignee: SmithKline Beecham Ltd; University of Texas System; SmithKline Beecham Corp; University of Texas at Austin
Priority date: 1996-12-17
Filing date: 1997-12-17
Publication date: 2006-01-26
Anticipated expiration: 2017-12-18
Also published as: US6750026B2; US20020082202A1; CA2218452C; DE849361T1; DE69733933D1; EP0849361A2; JP3946847B2; JPH10229887A; EP0849361B1; US6309854B1; EP0849361A3; CA2218452A1

Description

Bereich der Erfindung
Diese Erfindung betrifft neu identifizierte Polypeptide und Polynucleotide, die die Polypeptide codieren, die Liganden für den Neuropeptid Rezeptor HFGAN72, nachstehend als „HFGAN72-Rezeptor-Liganden" bezeichnet sind.
Hintergrund der Erfindung
Diese Erfindung betrifft neu identifizierte Polynucleotide, Polypeptide, die durch solche Polynucleotide codiert sind, die Verwendung solcher Polynucleotide und Polypeptide sowie die Produktion solcher Polynucleotide und Polypeptide. Genauer, die Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind Liganden für einen menschlichen 7-Transmembran-Rezeptor. Die Erfindung betrifft auch die Hemmung und Aktivierung der Wirkung solcher Polypeptide.
Es ist wohlbekannt, dass viele medizinisch signifikante biologische Prozesse durch Proteine vermittelt sind, die an Signaltransduktionswegen beteiligt sind, die G-Proteine und/oder sekundäre Botenstoffe, z.B. cAMP (Lefkowitz, Nature, 1991, 351:353-354) einbeziehen. Hierin sind diese Proteine als Proteine bezeichnet, die an Wegen mit G-Proteinen für PPG-Proteine beteiligt sind. Einige Beispiele für diese Proteine umfassen die GPC-Rezeptoren wie jene für adrenergische Mittel und Dopamin (Kobilka, B.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1987, 84:46-50; Kobilka, B.K. et al., Science, 1987, 238:650-656; Bunzow, J.R. et al., Nature, 1988, 336 :783-787), G-Proteine selbst, Effektorproteine, z.B. Phospholipase C, Adenylcyclase und Phosphodiesterase, sowie Aktuator-Proteine, z.B. Protein-Kinase A und Protein-Kinase C (Simon, M.I. et al., Science, 1991, 252:802-8)
Zum Beispiel ist bei einer Form der Signaltransduktion die Wirkung der Hormonbindung die Aktivierung des Enzyms Adenylat-Cyclase innerhalb der Zelle. Die Enzymaktivierung durch Hormone hängt von der Gegenwart des Nucleotids GTP ab. GTP beeinflusst ebenfalls die Hormonbindung. Ein G-Protein verbindet den Hormonrezeptor mit Adenylat-Cyclase. Es wurde gezeigt, dass G-Protein GTP für gebundenes GDP eintauscht, wenn es durch einen Hormonrezeptor aktiviert wird. Die GTP-tragende Form bindet dann an aktivierte Adenylat-Cyclase. Die Hydrolyse von GTP zu GDP, katalysiert durch das G-Protein selbst, überführt das G-Protein wieder in seine inaktive Grundform. Somit dient das G-Protein in einer Doppelrolle, als ein Zwischenprodukt, das das Signal vom Rezeptor zum Effektor schaltet und als eine Uhr, die die Dauer des Signals kontrolliert.
Die Membran-Protein-Gen-Überfamilie von an G-Protein gekoppelten Rezeptoren wurde charakterisiert, dass sie sieben vermutliche Transmembran-Domänen hat. Es wird angenommen, dass die Domänen transmembrane α-Helices darstellen, die durch extrazelluläre oder cytoplasmatische Schleifen verbunden sind. Mit G-Protein gekoppelte Rezeptoren umfassen eine Vielzahl von biologisch aktiven Rezeptoren wie hormonelle, virale, Wachstumsfaktor- und Neuro-Rezeptoren.
Mit G-Protein gekoppelte Rezeptoren wurden charakterisiert, dass sie diese sieben konservierten hydrophoben Stränge von etwa 20 bis 30 Aminosäuren umfassen, die mindestens acht divergierende hydrophile Schleifen verbinden. Die G-Protein-Familie von gekoppelten Rezeptoren umfasst Dopaminrezeptoren, die an neuroleptische Wirkstoffe binden, die für die Behandlung von psychotischen und neurologischen Störungen verwendet werden. Andere Beispiele für Angehörige dieser Familie umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Calcitonin-, adrenerge Endothelin-, cAMP-, Adenosin-, muscarinische, Acetylcholin-, Serotonin-, Histamin-, Thrombin-, Kinin-, Follikel stimulierendes Hormon-, Opsin-, endotheliales. Differenzierungsgen-1-, Rhodopsin-, Geruchsstoff- und Cytomegalievirus-Rezeptoren.
Die meisten mit G-Protein gekoppelten Rezeptoren haben einzelne konservierte Cysteinreste in jedem der ersten beiden extrazellulären Schleifen, die Dislufidbrücken bilden, von denen angenommen wird, dass sie funktionelle Proteinstruktur stabilisieren. Die sieben transmembranen Regionen werden als TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6 und TM7 bezeichnet. Es wird angenommen, dass TM3 bei der Signaltransduktion eine Rolle spielt.
Phosphorylierung und Lipidierung (Palmitylierung oder Farnesylierung) von Cysteinresten können die Signaltransduktion einiger G-Protein gekoppelter Rezeptoren beeinflussen. Die meisten an G-Protein gekoppelten Rezeptoren enthalten potenzielle Phosphorylierungsstellen innerhalb der dritten cytoplasmatischen Schleife und/oder des Carboxyl-Endes. Bei mehreren an G-Protein gekoppelten Rezeptoren wie dem b-Adenorezeptor vermittelt die Phosphorylierung durch Protein-Kinase A und/oder spezifische Rezeptorkinasen die Rezeptor-Desensibilisierung.
Bei einigen Rezeptoren wird angenommen, dass die Liganden-Bindungsstellen von an G-Protein gekoppelten Rezeptoren hydrophile Höhlungen umfassen, die durch mehrere an G-Protein gekoppelte transmembrane Rezeptordomänen gebildet werden, wobei die Höhlung von hydrophoben Resten der an G-Protein gekoppelten Rezeptoren umgeben ist. Es wird postuliert, dass die hydrophile Seite jeder an G-Protein gekoppelten transmembranen Rezeptorhelix nach innen gewandt ist und eine polare Liganden-Bindungsstelle bildet. Von TM3 wurde in mehreren an G-Protein gekoppelten Rezeptoren angenommen, dass es eine Liganden-Bindungsstelle hat, wie den TM3-Aspartatrest. TM5-Serine, ein TM6-Asparagin und TM6- oder TM7-Phenylalanine oder -Tyrosine sind ebenfalls bei der Liganden-Bindung beteiligt.
An G-Protein gekoppelte Rezeptoren können intrazellulär durch heterotrimere G-Proteine an verschiedene intrazelluläre Enzyme, Ionenkanäle, und Transporter gekoppelt werden. Vgl. Johnson et al., Endoc. Rev., 1989, 10:317-331. Verschiedene G-Protein-a-Untereinheiten stimulieren vorzugsweise bestimmte Effektoren, um verschiedene biologische Funktionen in einer Zelle zu modulieren. Es wurde herausgefunden, dass die Phosphorylierung von cytoplasmatischen Resten von an G-Protein gekoppelten Rezeptoren einen wichtigen Mechanismus für die Regulierung der G-Protein-Kopplung einiger an G-Protein gekoppelter Rezeptoren darstellt. An G-Protein gekoppelte Rezeptoren werden an zahlreichen Orten innerhalb eines Säuger-Wirts gefunden.
Während der letzten 15 Jahre wurden nahezu 350 therapeutische Mittel, die auf 7 transmembrane (7 TM) Rezeptoren oder ihre Liganden abzielen, erfolgreich auf dem Markt eingeführt. Die zeigt an, dass diese Rezeptoren und ihre Liganden eine etablierte, bewiesene Geschichte als therapeutische Ziele haben. Natürlich besteht die Notwendigkeit der Identifizierung und Charakterisierung weiterer Rezeptoren und Liganden, die eine Rolle bei der Prävention, Verbesserung oder Korrektur von Funktionsstörungen oder Krankheiten spielen können, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Infektionen wie Bakterien-, Pilz-, Protozoen- und Virusinfektionen, insbesondere Infektionen, die durch HIV-1 oder HIV-2 verursacht werden; Schmerzen; Krebs; Anorexia nervosa, Bulimie; Kachexie; Übergewicht; Diabetes; Asthma; Parkinson'-Krankheit; sowohl akutes als auch kongestives Herzversagen; Hypotonie, Hypertonie; Harnverhaltung; Osteoporose; Angina pectoris; Herzmuskelinfarkt; Geschwüre; Asthma; Allergien; gutartiger Prostata-Hypertrophie; chronischem Nierenversagen; Nierenleiden; gestörter Glucosetoleranz; sexueller Funktionsstörungen und psychotischer und neurologischer Störungen, einschließlich Ängste, Schizophrenie, manischer Depression, Delirium, Demenz, schwerer mentaler Retardierung und Dyskinesien wie die Huntington-Krankheit oder das Gilles dela Tourett-Syndrom und andere.
Polypeptide und Polynucleotide, die den menschlichen 7-transmembranen G-Protein gekoppelten Neuropeptid Rezeptor HFGAN72 codieren, wurden identifiziert und werden in U.S.S.N. 08/846,704 und 08/846,705, die beide am 30. April 1997 eingereicht wurden, sowie in W0 96/34877, veröffentlicht am 7. November 1996, offenbart.
Die vorliegende Erfindung stellt Polypeptide und Polynucleotide zur Verfügung, die Polypeptide codieren, die Liganden für den HFGAN72-Rezeptor sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Zu diesen und anderen Zwecken ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, unter anderem Polypeptide bereitzustellen, die als Liganden für den HFGAN72-Rezeptor identifziert wurden.
Darüber hinaus ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Polynucleotide bereitzustellen, die HFGAN72-Rezeptor-Liganden codieren.
In Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren bereitgestellt, die isolierte HFGAN72-Rezeptor-Liganden-Polypeptide und Nucleinsäuremoleküle, einschließlich mRNAs, cDNAs und genomische DNAs, die diese Rezeptorligandenpolypeptide codieren, bereitgestellt.
Es ist ebenfalls eine Aufgabe der Erfindung, die Verwendung eines HFGAN72-Rezeptor-Liganden-Polypeptids bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Essstörung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Anorexia nervosa, Bulimie und Kachexie, bereitzustellen.
Es ist noch eine andere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Identifikation von Verbindungen bereitzustellen, die an HFGAN72-Rezeptor-Liganden binden und ihre Interaktion mit dem HFGAN72-Rezeptor aktivieren oder hemmen, umfassend das Inkontaktbringen einer Zelle, die auf der Oberfläche einen HFGAN72-Rezeptor exprimiert, wobei der Rezeptor mit einer zweiten Komponente assoziiert ist, die in der Lage ist, ein nachweisbares Signal in Reaktion auf die Bindung der HFGAN72-Rezeptor-Liganden an den Rezeptor bereitzustellen, mit einer Verbindung, die unter Bedingungen gescreent werden soll, die eine Bindung an den Rezeptor erlauben; und die Bestimmung, ob die Verbindung an die HFGAN72-Rezeptor-Liganden bindet und ihre Interaktion mit dem HFGAN72-Rezeptor aktiviert oder hemmt, durch Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Signals, das durch diese Interaktion erzeugt wird. Zusätzlich kann der Ligand zum Beispiel mit ¹²⁵I markiert und in Rezeptorbindungstests verwendet werden, um Antagonisten oder Agonisten zu identifizieren, die eine Bindung blockieren.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine Genomsequenz (SEQ ID NR: 1), die menschliche HFGAN72-Rezeptor-Liganden codiert. Großbuchstaben zeigen Exons (cDNA) (SEQ ID NR: 21).
2 zeigt eine abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 2), die zwei verschiedene menschliche HFGAN72-Rezeptor-Liganden, Lig 72A (SEQ ID NR: 3, angezeigt durch Bindestriche) und Lig 72B (SEQ ID NR: 4, angezeigt durch Sternchen), umfasst.
3 zeigt eine cDNA-Sequenz (SEQ ID NR: 5), die Ratten-HFGAN72-Rezeptor-Liganden umfasst.
4 zeigt eine abgeleitete Aminosäuresequenz von Ratten-HFGAN72-Rezeptor-Liganden (SEQ ID NR: 6), die die N-terminale Signal- und Leader-Sequenz einschließt, die durch den Heijin-Algorithmus vorhergesagt wurde (SEQ ID NR: 7). Ebenfalls in 4 gezeigt sind zwei Liganden, Lig 72A (SEQ ID NR: 8, angezeigt durch Bindestriche) und Lig 72B (SEQ ID NR: 9, angezeigt durch Sternchen).
5 zeigt eine Präpro-Region einer Aminosäuresequenz von Mäuse-HFGAN72-Rezeptor-Liganden, denen ein Abschnitt der N-terminalen Signalsequenz (SEQ ID NR: 10) fehlt. Diese Aminosäuresequenz umfasst zwei Liganden, Lig 72A (SEQ ID NR: 11, angezeigt durch Bindestriche) und Lig 72B (SEQ ID NR: 12, angezeigt durch Sternchen).
Glossar
Die folgenden veranschaulichenden Erklärungen sind bereitgestellt, um das Verständnis bestimmter Begriffe zu erleichtern, die hierin häufig, vor allem in den Beispielen, verwendet werden. Die Erklärungen werden aus praktischen Gründen bereitgestellt und sollen die Erfindung nicht beschränken.
„Isoliert" bedeutet „durch menschliche Hand" im Vergleich zu seinem natürlichen Zustand verändert; d.h., dass, wenn es in der Natur vorkommt, es im Vergleich zu seiner ursprünglichen Umwelt verändert oder aus ihr entfernt wurde oder beides. Zum Beispiel ist ein natürlich vorkommendes Polynucleotid oder ein Polypeptid, das natürlichenweise in einem lebenden Tier in seinem natürlichen Zustand vorkommt, nicht „isoliert", aber dasselbe Polynucleotid oder Polypeptid, das von den mit ihm existierenden Stoffen seines natürlichen Zustands getrennt wird, ist, wie der Begriff hierin verwendet wird, „isoliert". Zum Beispiel bedeutet der Begriff isoliert im Hinblick auf Polynucleotid, dass es von dem Chromosom und der Zelle, in der es natürlicherweise vorkommt, isoliert ist.
Als Teil der Isolierung oder danach können solche Polynucleotide mit anderen Polynucleotiden wie DNAs zum Beispiel für die Mutagenese, zur Bildung von Fusionsproteinen und für die Vermehrung oder Expression in einem Wirt verbunden werden. Die isolierten Polynucleotide, allein oder mit anderen Polynucleotiden wie Vektoren verbunden, können in Kultur oder in ganzen Organismen in Wirtszellen eingeführt werden. In Wirtszellen in Kultur oder in ganzen Organismen eingeführt, wären solche DNAs immer noch isoliert, wie der Begriff hierin verwendet ist, da sie nicht in ihrer natürlich vorkommenden Form oder Umwelt wären. Ähnlich können die Polynucleotide und Polypeptide in einer Zusammensetzung wie einem Medium, Formulierungen, Lösungen für das Einführen von Polynucleotiden oder Polypeptiden, zum Beispiel in Zellen, Zusammensetzungen oder Lösungen zum Beispiel für chemische oder enzymatische Reaktionen, die keine natürlich vorkommenden Zusammensetzungen sind, vorkommen und darin als isolierte Polynucleotide oder Polypeptide innerhalb der Bedeutung dieses Begriffs, wie hierin verwendet, verbleiben.
„Oligonucleotid(e)" bezieht sich auf relativ kurze Polynucleotide. Oft bezieht sich der Begriff auf einzelsträngige Desoxyribonucleotide, aber er kann sich unter anderem auch ebenso auf einzel- oder doppelsträngige Ribonucleotide, RNA:DNA-Hybride und doppelsträngige DNAs beziehen.
„Polynucleotid(e)" bezieht sich im Allgemeinen auf jedes Polyribonucleotid oder Polydesoxyribonucleotid, das unmodifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA sein kann. So bezieht sich Polynucleotide, wie hierin verwendet, unter anderem zum Beispiel auf einzel- und doppelsträngige DNA, DNA, die ein Gemisch ist aus einzel- und doppelsträngigen Regionen, einzel- und doppelsträngige RNA und RNA, die ein Gemisch ist aus einzel- und doppelsträngigen Regionen, Hybridmoleküle, die DNA und RNA umfassen, die einzelsträngig oder noch typischer doppelsträngig sein können, oder ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Regionen. Zusätzlich bezieht sich Polynucleotid, wie hierin verwendet, auf dreifachsträngige Regionen, umfassend RNA oder DNA oder sowohl RNA als auch DNA. Die Stränge in solchen Regionen können vom selben Molekül oder von verschiedenen Molekülen sein. Die Regionen können alles aus einem oder aus mehreren der Moleküle einschließen, beteiligen jedoch typischerweise nur eine Region von einigen Molekülen. Eines der Moleküle einer dreifach-helikalen Region ist häufig ein Oligonucleotid. Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff Polynucleotid auch DNAs oder RNAs, wie vorstehend beschrieben, die eine oder mehrere modifizierte Basen enthalten. Somit sind DNAs oder RNAs mit Rückgraten, die aus Stabilitätsgründen oder aus einem anderen Grund modifiziert sind, Polynucleotide, wie dieser Begriff hierin beabsichtigt ist. Darüber hinaus sind DNAs oder RNAs, die unübliche Basen wie Inosin, oder modifizierte Basen wie tritylierte Basen umfassen, um nur zwei Beispiele zu nennen, Polynucleotide, wie der Begriff hierin verwendet wird. Es ist zu verstehen, dass eine große Vielzahl an Modifikationen an DNA und RNA vorgenommen wurde, die vielen nützlichen Zwecken dienen, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Der Begriff Polynucleotid, wie hierin verwendet, umfasst solche chemisch, enzymatisch oder metabolisch modifizierten Formen von Polynucleotiden sowie die chemischen Formen von DNA und RNA, die für Viren und Zellen, einschließlich unter anderem einfache und komplexe Zellen, charakteristisch sind.
„Polypeptide", wie hierin verwendet, umfasst alle Polypeptide, wie nachstehend beschrieben. Die basische Struktur von Polypeptiden ist wohlbekannt und wurde in zahllosen Lehrbüchern und anderen Veröffentlichungen auf dem Fachgebiet beschrieben. In diesem Zusammenhang wird der Begriff hierin verwendet, um sich auf jedes Peptid oder Protein zu beziehen, das zwei oder mehr Aminosäuren umfasst, die durch Peptidbindungen in einer linearen Kette miteinander verbunden sind. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff sowohl auf kurze Ketten, die auf dem Fachgebiet üblicherweise zum Beispiel auch als Peptide, Oligopeptide und Oligomere bezeichnet werden, sowie auf längere Ketten, die auf dem Fachgebiet im Allgemeinen als Proteine bezeichnet werden und von denen es viele Typen gibt.
Es ist zu verstehen, dass Polypeptide oft andere Aminosäuren enthalten als die 20 Aminosäuren, die herkömmlicherweise als die 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren bezeichnet werden, und dass viele Aminosäuren, einschließlich der terminalen Aminosäuren, in einem bestimmten Polypeptid modifiziert sein können, entweder durch natürliche Prozesse wie die Prozessierung oder andere posttranslationale Modifikationen oder durch chemische Modifikationsverfahren, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind. Sogar die üblichen Modifikationen, die in Polypeptiden natürlich vorkommen, sind zu zahlreich, um erschöpfend hier aufgelistet zu werden, sie sind jedoch in Basistexten und in detaillierteren Monographien sowie in einer umfangreichen Forschungsliteratur gut beschrieben und somit dem Fachmann wohlbekannt. Bekannte Modifikationen, die in Polypeptiden der vorliegenden Erfindung vorhanden sein können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalente Anbindung von Flavin, kovalente Anbindung einer Häm-Einheit, kovalente Anbindung eines Nucleotids oder Nucleotid-Derivats, kovalente Anbindung eines Lipids oder eines Lipid-Derivats, kovalente Anbindung von Phosphotidylinosit, Quervernetzung, Zyklisierung, Disulfidbindungs-Bildung, Demethylierung, Bildung von kovalenten Querverbindungen, Bildung von Cystin, Bildung von Pyroglutamat, Formylierung, Gamma-Carboxylierung, Glycosylierung, GPI-Ankerbildung, Hydroxylierung, Iodierung, Methylierung, Myristoylierung, Oxidation, proteolytische Prozessierung, Phosphorylierung, Prenylierung, Racemisierung, Selenoylierung, Sulfatierung, Transfer-RNA-vermitteltes Zusetzen von Aminosäuren zu Proteinen wie Arginylierung und Ubiquitinierung. Solche Modifikationen sind dem Fachmann wohlbekannt und wurden detailliert in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben. Mehrere besonders übliche Modifikationen einschließlich der Glycosylierung, Lipid-Anheftung, Sulfatierung, Gamma-Carboxylierung von Glutaminsäureresten, Hydroxylierung und ADP-Ribosylierung sind in den meisten Basis-Texten wie PROTEINS – STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2. Ausgabe, T.E. Creighton, W. H. Freeman und Company, New York 1993, beschrieben. Zu diesem Thema sind auch detaillierte Übersichtsartikel erhältlich. Vgl. z.B. Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, Seiten 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION 0F PROTEINS, B.C. Johnson, Hrsg., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol., 1990, 182:626-646 und Rattan et al., "Protein Synthesis Posttranslational Modifications and Aging", Ann. N. Y. Acad. Sci., 1992, 663:48-62.
Es ist zu verstehen, wie wohlbekannt und wie vorstehend bemerkt, dass Polypeptide nicht immer vollständig linear sind. Zum Beispiel können Polypeptide als ein Ergebnis der Ubiquitinierung verzweigt sein, und sie können zirkulär sein, mit oder ohne Verzweigung, im Allgemeinen als ein Ergebnis von posttranslationalen Ereignissen, einschließlich natürlichen Prozessierungsereignissen und Ereignissen, die durch menschliche Manipulation hervorgebracht wurden und die nicht natürlich vorkommen. Zirkuläre, verzweigte und verzweigte, zirkuläre Polypeptide können durch natürliche, nicht-translationale Verfahren sowie durch vollständig synthetische Verfahren synthetisiert werden.
Modifikationen können irgendwo in einem Polypeptid stattfinden, einschließlich dem Peptid-Rückgrat, den Aminosäure-Seitenketten und den Amino- oder Carboxyl-Enden. In der Tat ist die Blockierung der Amino- oder der Carboxylgruppe in einem Polypeptid, oder beides, durch eine kovalente Modifikation in natürlich vorkommenden und synthetischen Polypeptiden üblich, und solche Modifikationen können in Polypeptiden der vorliegenden Erfindung ebenfalls vorkommen. Zum Beispiel wird der aminoterminale Rest von Polypeptiden, die vor der Prozessierung in E. coli hergestellt werden, fast immer N-Formylmethionin sein.
Die Modifikationen, die in einem Polypeptid auftreten, werden oft eine Funktion davon sein, wie es hergestellt wurde. Bei Polypeptiden, die durch die Expression eines clonierten Gens in einem Wirt hergestellt werden, werden die Eigenschaften und das Ausmaß der Modifikationen zum großen Teil durch die Modifkationskapazität der Wirtszelle nach der Translation und die Modifikationssignale, die in der Aminosäuresequenz des Polypeptids vorliegen, bestimmt. Zum Beispiel findet, wie bekannt, eine Glycosylierung oft nicht in Bakterienwirten wie E. coli statt. Entsprechend sollte ein Polypeptid, wenn eine Glycosylierung gewünscht ist, in einem glycosylierenden Wirt, im Allgemeinen einer eukaryontischen Zelle, exprimiert werden. Insektenzellen führen oft dieselben posttranslationalen Glycosylierungen aus wie Säugerzellen und aus diesem Grund wurden Insektenzell-Expressionssysteme entwickelt, um Säuger-Proteine, die unter anderem die natürlichen Glycosylierungsmuster haben, wirksam zu exprimieren. Ähnliche Betrachtungen gelten für andere Modifikationen.
Es ist zu verstehen, dass derselbe Modifikationstyp in demselben oder in unterschiedlichem Ausmaß an mehreren Stellen in einem bestimmten Polypeptid vorhanden sein kann. Auch kann ein bestimmtes Polypeptid viele Modifikationstypen enthalten.
Im Allgemeinen bezieht sich der Begriff Polypeptid, wie hierin verwendet, auf alle derartigen Modifikationen, insbesondere jene, die in Polypeptiden vorhanden sind, die durch die Expression eines Polynucleotids in einer Wirtszelle synthetisiert wurden.
„Variante(n)" von Polynucleotiden oder Polypeptiden sind, wie hierin verwendet, Polynucleotide oder Polypeptide, die sich von einem Referenz-Polynucleotid beziehungsweise -Polypeptid unterscheiden. Varianten in diesem Sinn werden nachstehend und anderswo in der vorliegenden Offenbarung detaillierter beschrieben.
Varianten umfassen Polynucleotide, die sich hinsichtlich der Nucleotidsequenz von einem anderen Referenz-Polynucleotid unterscheiden. Im Allgemeinen sind Unterschiede insofern beschränkt, dass die Nucleotidsequenzen der Referenz und der Variante insgesamt sehr ähnlich und in vielen Regionen identisch sind.
Wie nachstehend bemerkt, können Veränderungen der Nucleotidsequenz der Variante stumm sein. Das heißt, es kann sein, dass sie die Aminosäuren, die von dem Polynucleotid codiert werden, nicht verändern. Dort, wo Veränderungen auf stumme Veränderungen diesen Typs begrenzt sind, wird eine Variante ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz wie die Referenz codieren. Wie ebenfalls nachstehend bemerkt ist, können Veränderungen in der Nucleotidsequenz der Variante die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das durch das Referenz-Polynucleotid codiert wird, verändern. Solche Nucleotid-Veränderungen können Aminosäure-Substitutionen, -Additionen, -Deletionen, -Fusionen und -Verkürzungen in dem Polypeptid ergeben, das durch die Referenz-Sequenz codiert wird, wie nachstehend erörtert.
Varianten umfassen auch Polypeptide, die sich hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz von einem anderen Referenz-Polypeptid unterscheiden. Im Allgemeinen sind die Unterschiede begrenzt, so dass die Sequenzen der Referenz und der Variante insgesamt stark ähnlich und in vielen Regionen identisch sind.
Eine Variante und ein Referenz-Polypeptid können sich hinsichtlich der Aminosäuresequenz in einer oder mehreren Substitutionen, Additionen, Deletionen, Fusionen und Verkürzungen unterscheiden, die in jeglicher Kombination vorliegen können.
„Fusionsprotein", wie der Begriff hierin verwendet ist, ist ein Protein, das durch zwei, oft nicht miteinander verbundene, fusionierte Gene oder Fragmente davon codiert wird. EP-TO464 533 (Kanadisches Gegenstück 2045869) offenbart Fusionsproteine, die verschiedene Abschnitte der konstanten Region von Immunglobulin-Molekülen zusammen mit einem anderen menschlichen Protein oder einem Teil davon umfassen. In vielen Fällen ist die Verwendung einer Immunglobulin-Fc-Region als ein Teil eines Fusionsproteins für die Verwendung in der Therapie und der Diagnose vorteilhaft, was zum Beispiel, verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften (EP-A 0232 262) ergibt. Andererseits wäre es für einige Anwendungen wünschenswert, wenn man in der Lage wäre, den Fc-Abschnitt zu entfernen, nachdem das Fusionsprotein exprimiert, nachgewiesen und gereinigt wurde. Entsprechend kann es wünschenswert sein, die Bestandteile des Fusionsproteins mit einer chemisch oder enzymatisch spaltbaren Verbindungsregion zu verbinden. Dies ist der Fall, wenn der Fc-Abschnitt sich als ein Hindernis bei der Verwendung in der Therapie und der Diagnose erweist, zum Beispiel wenn das Fusionsprotein als ein Antigen für Immunisierungen verwendet werden soll. Beim Wirkstoffnachweis wurden zum Beispiel menschliche Proteine wie shIL5-α mit Fc-Abschnitten für die Verwendung in Absuch -Tests mit hohem Durchlauf fusioniert, um Antagonisten von hIL-5 zu identifizieren. Vgl., D. Bennett et al., Journal of Molecular Recognition, 1995, 8:52-58; und K. Johanson et al., The Journal of Biological Chemistry, 1995, 270(16) :9459-9471.
Somit bezieht sich diese Erfindung auch auf gentechnisch veränderte, lösliche Fusionsproteine, die sich aus einem HFGAN72-Rezeptorliganden oder einem Abschnitt davon und aus verschiedenen Abschnitten der konstanten Regionen von schweren oder leichten Ketten von Immunglobulinen verschiedener Unterklassen (IgG, IgM, IgA, IgE) zusammensetzen. Der konstante Abschnitt der schweren Kette von menschlichem IgG, insbesondere IgG1, wobei die Fusion in der Gelenk-Region stattfindet, wird als Immunglobulin bevorzugt. In einer Ausführungsform kann der Fc-Abschnitt einfach durch den Einschluss einer Spaltungssequenz, die mit Blut-Koagulationsfaktor Xa gespalten werden kann, entfernt werden. Diese Erfindung betrifft des Weiteren Verfahren für die Herstellung dieser Fusionsprotein durch Gentechnologie und deren Verwendung bei der Diagnose und Therapie. Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Polynucleotide, die solche Fusionsproteine codieren.
„Bindungsmoleküle" (oder anders „Interaktionsmoleküle" oder „Rezeptorkomponenten-Faktoren" genannt) betreffen Moleküle, einschließlich Rezeptoren, die spezifisch an Polypeptide der vorliegenden Erfindung binden oder damit interagieren. Solche Bindungsmoleküle sind ein Teil der vorliegenden Erfindung. Bindungsmoleküle können auch unnatürlich vorkommen, zum Beispiel als Antikörper und von Antikörpern abstammende Reagenzien, die spezifisch an Polypeptide der Erfindung binden.
Wie auf dem Fachgebiet bekannt, wird eine „Ähnlichkeit" zwischen zwei Polypeptiden durch Vergleichen der Aminosäuresequenz und seiner konservierten Aminosäure-Substituenten eines Polypeptids mit der Sequenz eines zweiten Polypeptids bestimmt. Des Weiteren, ebenfalls auf dem Fachgebiet bekannt, ist „Identität", was das Ausmaß der Sequenzverwandtschaft zwischen zwei Poylpeptid- oder zwei Polynucleotid-Sequenzen, bestimmt durch die Identität der Übereinstimmung zweier Stränge solcher Sequenzen, bedeutet. Sowohl die Identität als auch die Ähnlichkeit können gut berechnet werden (COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., Hrsg., Oxford University Press. New York, 1988; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS; Smith, D.W., Hrsg., Academic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART 1, Griffin, A.M. und Griffein, H.G. Hrsg., Humana Press, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press. 1987; und SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov, M. und Devereux, J. Hrsg., M. Stockton Press, New York, 1991). Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die Identität und Ähnlichkeit zwischen zwei Polynucleotid- oder Polypeptid-Sequencen zu messen, und die Begriffe "Identität" und "Ähnlichkeit" sind dem Fachmann wohlbekannt (Carillo, H. und Lipton, D., SIAM J. Applied Math., 1988, 48:1073). Verfahren, die üblicherweise verwendet werden, um Identität oder Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen zu bestimmen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf jene, die im GUIDE TO HUGE COMPUTERS, Martin J. Bishop, Hrsg., Academic Press, San Diego, 1994, und Carillo, H. und Lipton, D., SIAM J. Applied Math., 1988, 48:1073, offenbart sind. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung von Identität sind so ausgerichtet, dass sie die größte Übereinstimmung zwischen den beiden getesteten Sequenzen ergeben. Verfahren zur Bestimmung von Identität und Ähnlichkeit sind auch in Computerprogrammen codiert. Bevorzugte Computerprogramm-Verfahren zur Bestimmung von Identität und Ähnlichkeit umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf das GCG-Programmpaket (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research, 1984, 12(1):387), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F. et al., J. Molec. Biol., 1990, 215:403).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Polypeptide und Polynucleotide von neuen HFGAN72-Rezeptorliganden. Diese Polypeptide umfassen die Polypeptide eines menschlichen HFGAN72-Rezeptorliganden (SEQ ID NR: 2), eines Ratten-Rezeptorliganden (SEQ ID NR: 6) und eines Mäuse-Rezeptorliganden (SEQ ID NR: 10), deren Aminosäuresequenzen in den 2 (SEQ ID NR: 2-4), 4 (SEQ ID NR: 6-9) beziehungsweise 5 (SEQ ID NR: 10-12) abgebildet sind.
Neue Polypeptide identischer Masse, die Liganden für den HFGAN72-Rezeptor sind, wurden aus Rattenhirn und Rinder-Hypothalamus isoliert. Die Aminosäuresequenz des reifen Ratten-Polypeptids, Lig 72A, wurde bestimmt, und wird in 4 als SEQ ID NR: 8 gezeigt. Die genaue Masse des Peptid-MH+-Ions wurde unter Verwendung einer verspäteten MALDI-Extraktion gemessen und es wurde herausgefunden, dass sie 1286,6125 (berechnet 1286,6237) beträgt. Der Gln-Rest an der Position 9 (vgl. 3) wurde von Lys (beide Aminosäuren haben dieselbe Rest-Masse) durch Acetylierung des Peptids und erneutes Messen des Molekulargewichts unterschieden. Das Molekulargewicht verschob sich um 42 Da von 1286,6 auf 1328,6 (berechnet 1328,6), was anzeigt, dass nur eine Acetatgruppe angefügt wurde. Da Gln-Reste nicht acetyliert werden können und das N-Ende blockiert ist, lässt das Anfügen von nur einer Acetatgruppe stark annehmen, dass die C-terminale Sequenz eines abgebauten Moleküls QK und nicht KK ist. Basierend auf der Ähnlichkeit des Molekulargewichts wird angenommen, dass das Ratten-Polypeptid dieselbe Sequenz hat.
Ergebnisse aus der in situ-Hybridisierung bei Schnitten von adultem Rattenhirn zeigen, dass die HFGAN72-Rezeptorliganden sowohl im Hypothalamus als auch in den Hypothalamus-Neuronen stark exprimiert werden. Da die HFGAN72-Rezeptorliganden im Hypothalamus lokalisiert sind, wird angenommen, dass sie bei einer Vielzahl an neurologischen (z.B. Epilepsie, Schlaganfall, psychiatrischen (z.B. Ängsten, Depression) und/oder Ess-Störungen beteiligt sind.
Interessanterweise sind die Aminosäuresequenzen für Lig 72A beim Menschen (SEQ ID NR: 3), der Ratte (SEQ ID NR: 8) und der Maus (SEQ ID NR: 11) identisch. Es wurde herausgefunden, dass Lig 72B beim Menschen (SEQ ID NR: 4), der Ratte (SEQ ID NR: 9) und der Maus (SEQ ID NR: 12) mit dem HFGAN72-Rezeptor reagieren und somit dieselben Eigenschaften wie Lig 72A haben könnten.
Die Aktivität des Lig 72A und Lig 72B für den HFGAN72-Rezeptor wurden bestätigt. Versuche wurden auf mit Fura beladenen 293 Zellen, die mit dem HFGAN72-Rezeptor transfiziert waren, durchgeführt. Intrazelluläre Calciumspiegel wurden in den Zellen als Reaktion auf zunehmende Konzentrationen der Polypeptide der HFGAN72-Rezeptorliganden Lig 72A und Lig 72B gemessen. Der EC₅ ₀ des Polypeptids wurde auf 50 ng/ml geschätzt. Die Aktivierung des HFGAN72-Rezeptors durch sowohl Lig 72A als auch Lig 72B wurde als spezifisch bestimmt, da weder mit 293pCDN-Vektor transfizierte Zellen noch mit einem alternativen Clon eine Stimulierung beobachtet wurde.
Es wird angenommen, dass HFGAN72-Rezeptorliganden oder Fragmente, Analoga und Derivate dieser Liganden-Polypeptide bei der Modulierung von HFGAN72-Rezeptor-Aktivitäten von Nutzen sein können.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann ein rekombinantes Polypeptid, ein natürliches Polypeptid oder ein synthetisches Polypeptid sein. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist es ein rekombinantes Polypeptid.
Unter den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind in dieser Hinsicht Polypeptide, die aus den Aminosäuresequenzen der HFGAN72-Rezeptorliganden, die in den 2 (SEQ ID NR:2-4), 3 (SEQ ID NR: 6, 8 und 9) und 4 (SEQ ID NR: 10-12) und genauer, das reife Polypeptid Lig 72A, gezeigt in 2 als SEQ ID NR: 3, in 4 als SEQ ID NR: 8 und in 5 als SEQ ID NR: 11 gezeigt sind, bestehen.
Die Polypeptide und Polynucleotide der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt in einer isolierten Form bereitgestellt und sind vorzugsweise zur Homogenität gereinigt.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen die Polypeptide der SEQ ID NR: 2-4, 6, und 8-12 und im Besonderen das reife Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NR: 4, 8 und 11.
Fragmente oder Abschnitte der Polypeptide der vorliegenden Erfindung können für die Herstellung des entsprechenden Polypeptids voller Länge durch Peptidsynthese verwendet werden; deshalb können die Fragmente als Zwischenprodukte für die Herstellung der Polypeptide voller Länge verwendet werden. Fragmente können „frei stehend", d.h. nicht Teil von oder fusioniert mit anderen Aminosäuren oder Polypeptiden sein, oder sie können innerhalb eines größeren Polypeptids zusammengefasst sein, von dem sie einen Tei oder eine Region bilden. Wenn sie innerhalb eines größeren Polypeptids zusammengefasst sind, bilden die hier erörterten Fragmente am meisten bevorzugt eine einzelne, kontinuierliche Region. Es können jedoch mehrere Fragmente innerhalb eines einzigen größeren Polypeptids zusammengefasst sein. Zum Beispiel beziehen sich bestimmte bevorzugte Ausführungsformen auf Fragmente der Polypeptide von HFGAN72-Rezeptorliganden der vorliegenden Erfindung, zusammengefasst in einem Vorläufer-Polypeptid, das für die Expression in einem Wirt hergestellt wurde und das heterologe Prä- und Pro-Polypeptid-Regionen, die mit dem Amino-Ende der Polypeptid-Fragmente von HFGAN72-Rezeptorliganden fusioniert sind, und eine zusätzliche Region hat, die mit dem Carboxyl-Ende des Fragments fusioniert ist. Somit bezieht sich Fragmente in einer Ausführungsform der hierin beabsichtigten Bedeutung auf den Abschnitt oder die Abschnitte eines Fusions-Polypeptids oder Fusions-Proteins, das von HFGAN72-Rezeptorliganden abstammt.
Es ist zu verstehen, dass die Erfindung unter anderem auch Polynucleotide, die die zuvor erwähnten Fragmente codieren, Polynucleotide, die mit Polynucleotiden hybridisieren, die die Fragmente codieren, insbesondere jene, die unter stringenten Bedingungen hybridisieren, und Polynucleotide wie PCR-Primer für die Amplifikation von Polynucleotiden, die die Fragmente codieren, betrifft. In dieser Hinsicht sind bevorzugte Polynucleotide jene, die eine Nucleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NR: 1, 5 und 21 umfassen. Andere bevorzugte Polynucleotide sind jene, die eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NR: 2-4, 6 und 8-12 codieren.
Polypeptide von HFGAN72-Rezeptorliganden und Polynucleotide, die diese Polypeptide codieren, können in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung für verschiedene Anwendungsformen verwendet werden, insbesondere jene, die einen Nutzen aus den chemischen und biologischen Eigenschaften dieser Liganden ziehen. Zusätzliche Anwendungsformen betreffen die Diagnose und Behandlung von Störungen der Zellen, Gewebe und Organismen. Diese Ausführungsformen der Erfindung sind durch die folgende Diskussion weiter veranschaulicht.
Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sind dem Fachmann wohlbekannt. Polypeptide, ihre Fragmente oder andere Derivate oder Analoga davon oder Zellen, die sie exprimieren, können als ein Immunogen zur Herstellung von Antikörpern dazu verwendet werden. Diese Antikörper können zum Beispiel polyclonale oder monoclonale Antikörper, chimäre, einkettige und humanisierte Antikörper sowie Fab-Fragmente oder das Produkt einer Fab-Expressionsbank sein. Verschiedene, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können für die Herstellung solcher Antikörper und Fragmente verwendet werden.
Antikörper, die gegen die Polypeptide, die einer Sequenz der vorliegenden Erfindung entsprechen, gebildet werden, können durch direkte Injektion der Polypeptide in ein Tier, vorzugsweise nicht den Menschen, erhalten werden. Der so erhaltene Antikörper wird dann die Polypeptide selbst binden. Auf diese Weise kann sogar eine Sequenz, die nur ein Fragment der Polypeptide codiert, verwendet werden, um Antikörper zu bilden, die die gesamten natürlichen Polypeptide binden. Solche Antikörper können dann verwendet werden, um das Polypeptid aus Gewebe zu isolieren, das dieses Polypeptid exprimiert.
Für die Herstellung von monoclonalen Antikörpern kann jedes Verfahren, das Antikörper bereitstellt, die durch kontinuierliche Zelllinienkulturen hergestellt werden, verwendet werden. Beispiele umfassen das Hybridom-Verfahren (Köhler, G. und Milstein, C., Nature, 1975, 256:495-497, das Triom-Verfahren, das menschliche B-Zellen-Hybridom-Verfahren (Kozbor et al., Immunology Today, 1983, 4: 72 (1983) und das EBV-Hybridom-Verfahren zur Herstellung menschlicher monoclonalen Antikörper (Cole et al., Seiten 77-96 in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985)).
Verfahren, die für die Herstellung von einkettigen Antikörpern (US-Patent Nr. 4,946,778) beschrieben sind, können angepasst werden, um einkettige Antikörper gegen immunogene Polypeptid-Produkte dieser Erfindung herzustellen. Ebenfalls können transgene Mäuse oder andere Organismen wie andere Säuger verwendet werden, um humanisierte Antikörper gegen immunogene Polypeptid-Produkte dieser Erfindung zu exprimieren.
Die vorstehend beschriebenen Antikörper können verwendet werden, um Clone, die das Polypeptid exprimieren, zu isolieren oder zu identifizieren oder das Polypeptid der vorliegenden Erfindung durch Anheften des Antikörpers an einen festen Träger für die Isolierung und/oder Reinigung durch Affinitätschromatographie zu reinigen.
Zusätzlich können Antikörper gegen einen HFGAN72-Rezeptorliganden verwendet werden, um die Interaktion eines solchen Liganden mit dem HFGAN72-Rezeptor zu hemmen, und können bei der Behandlung von Krankheiten oder Störungen, einschließlich Anorexia nervosa, Bulimie und Kachexie von Nutzen sein.
HFGAN72-Rezeptorliganden könnten verwendet werden, um Proteine zu isolieren, die damit interagieren, und diese Interaktion könnte ein Ziel für eine Interferenz sein. Inhibitoren von Protein-Protein-Interaktionen zwischen HFGAN72-Rezeptorliganden und anderen Faktoren könnten zur Entwicklung von pharmazeutischen Mitteln für die Modulierung von HFGAN72-Rezeptorliganden-Aktivität führen. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „modulieren" auf die Beeinflussung der Funktion der HFGAN72-Rezeptorliganden.
Somit stellt die Erfindung auch ein Verfahren zur Identifikation von Bindungsmolekülen an HFGAN72-Rezeptorliganden bereit. Gene, die Proteine für Bindungsmoleküle an HFGAN72-Rezeptorliganden codieren, können durch zahlreiche Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, identifiziert werden, zum Beispiel durch Ligandenpanning und FACS-Sortieren. Solche Verfahren sind in vielen Labor-Handbüchern wie zum Beispiel Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1 (Rivett, A.J. Biochem. J. 291:1-10 (1993)): Kapitel 5 (1991) beschrieben.
Zum Beispiel stellt das Hefe-Zwei-Hybrid-System Verfahren zum Nachweis der Interaktion eines ersten Testproteins und eines zweiten Testproteins in vivo zur Verfügung, wobei die Wiederherstellung der Aktivität eines Transkriptions-Aktuators verwendet wird. Das Verfahren ist in US-Patent Nr. 5,283,173 offenbart; die Reagenzien sind bei Clontech und Stratagene erhältlich. Kurz, cDNA eines HFGAN72-Rezeptorliganden wird mit einer DNA bindenden Domäne eines Gal4-Transkriptionsfaktors fusioniert und in Hefezellen exprimiert. Angehörige der cDNA-Bank, erhalten aus Zellen von Interesse, werden mit einer Transaktivierungsdomäne von Gal4 fusioniert. cDNA-Clone, die Proteine exprimieren, die mit einem HFGAN72-Rezeptorliganden interagieren können, werden zur Wiederherstellung der Gal4-Aktivität und zur Transaktivierung der Expression eines Reporter-Gens wie Gal1-IacZ führen. Die cDNA des HFGAN72-Rezeptorliganden, die mit der DNA bindenden Domäne des Gal4-Transkriptionsfaktors fusioniert ist, kann in einer oder in mehreren Aminosäuren mutiert werden, wobei das Verfahren vorstehend beschrieben ist, um die Interaktion von Kinase mit Substrat zu verstärken.
Ein alternatives Verfahren ist das Absuchen von λgt11, λZAP (Stratagene) oder von äquivalenten cDNA-Expressionsbanken mit rekombinanten HFGAN72-Rezeptorliganden. Rekombinantes HFGAN72-Rezeptorliganden-Protein oder Fragmente davon werden mit kleinen Peptid-Markierungen wie FLAG, HSV oder GST fusioniert. Die Peptid-Markierungen können zweckmäßige Phosphorylierungs-Stellen für eine Kinase wie Herzmuskel-Kreatinkinase besitzen oder sie können biotinyliert sein. Rekombinante HFGAN72-Rezeptorliganden können mit 32[P] phosphoryliert sein oder unmarkiert verwendet und mit Streptavidin oder Antikörpern gegen die Markierungen nachgewiesen werden. λgt11-cDNA-Expressions-Banken werden aus Zellen von Interesse gemacht und werden mit den rekombinanten HFGAN72-Rezeptorliganden inkubiert, gewaschen und cDNA-Clone werden isoliert, die mit den HFGAN72-Rezeptorliganden interagieren. Vgl., z.B. T. Maniatis et al., vorstehend.
Ein anderes Verfahren ist das Absuchen einer Säuger-Expressions-Bank, in der die cDNAs in einen Vektor zwischen einem Säuger-Promotor und der Polyadenylierungsstelle cloniert werden und übergangsweise in COS- oder 293-Zellen transfiziert werden, gefolgt von einem Nachweis des Bindungsproteins 48 Stunden später durch die Inkubation von fixierten und gewaschenen Zellen mit einem markierten HFGAN72-Rezeptorliganden, der vorzugsweise iodiert ist, und dem Nachweis von gebundenen HFGAN72-Rezeptorliganden durch Autoradiographie. Vgl., Sims et al., Science 241 :585-589 (1988) und McMahan et al., EMBO J. 10 :2821-2832 (1991). Auf diese Weise können cDNA-Pools, die die cDNA enthalten, die das Bindungsprotein von Interesse codieren, selektiert werden und die cDNA von Interesse kann durch weitere Unterteilung jedes Pools, gefolgt von Zyklen der transienten Transfektion, Bindung und Autoradiogrpahie isoliert werden. Alternativ kann die cDNA von Interesse durch Transfektion der gesamten cDNA-Bank in Säugerzellen und Schwenken der Zellen auf einer Platte, die einen HFGAN72-Rezeptorliganden enthält, der an die Platte gebunden ist, isoliert werden. Zellen, die nach dem Waschen anheften, werden lysiert und die Plasmid-DNA wird isoliert, in Bakterien amplifiziert, und der Zyklus aus Transfektion und Panning wird wiederholt, bis ein einzelner cDNA-Clon erhalten wird. Vgl. Seed et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3365 (1987) und Aruffo et al., EMBO J. 6:3313 (1987). Wenn das Bindungsprotein sezerniert wird, kann seine cDNA durch ein ähnliches Vereinigungsverfahren erhalten werden, wenn einmal ein Bindungs- oder Neutralisierungsversuch für den Test von Überständen aus transient transfizierten Zellen eingerichtet ist. Allgemeine Verfahren zum Absuchen von Überständen sind in Wong et al., Science 228:810-815 (1985) offenbart.
Ein anderes alternatives Verfahren ist die Isolierung von Proteinen, die mit einem HFGAN72-Rezeptorliganden direkt aus Zellen interagieren. Fusionsproteine eines HFGAN72-Rezeptorliganden mit GST oder kleinen Peptid-Markierungen werden hergestellt und auf Kügelchen immobilisiert. Biosynthetisch markierte oder unmarkierte Protein-Extrakte aus den Zellen von Interesse werden hergestellt, mit den Kügelchen inkubiert und mit Puffer gewaschen. Proteine, die mit einem HFGAN72-Rezeptorliganden interagieren, werden spezifisch von den Kügelchen eluiert und durch SDS-PAGE analysiert. Primäre Aminosäuresequenzdaten des Bindungspartners werden durch Microsequenzierung erhalten. Optional können die Zellen mit Mitteln behandelt werden, die eine funktionelle Reaktion wie Tyrosin-Phosphorylierung von zellulären Proteinen induzieren. Ein Beispiel für ein solches Mittel wäre ein Wachstumsfaktor oder Cytokin wie Interleukin-2.
Ein anderes alternatives Verfahren ist die Immunaffinitäts-Reinigung. Ein rekombinanter HFGAN72-Rezeptorligand wird mit inkubierten oder unmarkierten Zellextrakten inkubiert und mit anti-HFGAN72-Rezeptorliganden-Antikörpern immunpräzipitiert. Das Immunpräzipitat wird mit Protein A-Sepharose gewonnen und durch SDS-PAGE analysiert. Unmarkierte Proteine werden durch Biotinylierung markiert und mit Streptavidien auf SDS-Gelen nachgewiesen. Bindungspartner-Proteine werden durch Mikrosequenzierung analysiert. Des Weiteren können biochemische Standard-Reinigungsschritte, die dem Fachmann bekannt sind, vor der Mikrosequenzierung verwendet werden.
Noch ein weiteres alternatives Verfahren ist das Absuchen von Peptid-Banken auf Bindungspartner hin. Ein rekombinanter markierter HFGAN72-Rezeptorligand wird verwendet, um Peptide aus einer Peptid- oder Phosphopeptid-Bank auszuwählen, die mit einem HFGAN72-Rezeptorliganden interagieren. Die Sequenzierung der Peptide führt zur Identifikation von Consensus-Peptidsequenzen, die in interagierenden Proteinen gefunden werden könnten.
Insgesamt können HFGAN72-Rezeptorliganden-Bindungspartner, die durch eines dieser Verfahren oder andere Verfahren identifiziert werden, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, sowie jene vermutlichen Bindungspartner, die vorstehend erörtert wurden, in dem Testverfahren der Erfindung verwendet werden. Das Testen auf die Gegenwart eines HFGAN72-Rezeptorligand/Bindungspartner-Komplexes wird zum Beispiel durch das Hefe-Zwei-Hybrid-System, ELISA oder Immuntests unter Verwendung von Antikörpern, die für den Komplex spezifisch sind, ausgeführt. In Gegenwart von Teststoffen (d.h. Inhibitoren oder Antagonisten), die die Bildung der HFGAN72-Rezeptorligand/Bindungspartner-Interaktion unterbrechen oder hemmen, wird eine verringerte Menge an Komplex relativ zu einer Kontrolle, der der Teststoff fehlt, bestimmt werden.
Die Polypeptide der Erfindung können ebenfalls verwendet werden, um die HFGAN72-Rezeptorliganden-Bindungskapazität von HFGAN72-Rezeptorliganden-Molekülen in Zellen oder in zellfreien Molekülen zu bewerten.
Die HFGAN72-Rezeptorliganden der vorliegenden Erfindung können ebenfalls in einem Verfahren zum Absuchen von Verbindungen verwendet werden, die die Aktivierung des Liganden des HFGAN72-Rezeptors aktivieren (Agonisten) oder hemmen (Antagonisten).
Im Allgemeinen ist bei solchen Absuch-Verfahren die Bereitstellung geeigneter Zellen, die den HFGAN72-Rezeptor auf ihrer Oberfläche exprimieren, beteiligt. Solche Zellen umfassen Zellen von Säugern, Hefe, Drosophila oder E. coli. Insbesondere wird dann ein codierendes Polynucleotid mit einer Testverbindung und einem HFGAN72-Rezeptorliganden der vorliegenden Erfindung in Kontakt gebracht, um die Bindung, Stimulierung oder Hemmung einer funktionellen Reaktion zu beobachten.
Ein solches Absuch-Verfahren beteiligt die Verwendung von Melanophoren, die so transfiziert sind, dass sie den HFGAN72-Rezeptor exprimieren. Ein solches Absuch-Verfahren wird in WO 92/01810, veröffentlicht am 6. Februar 1992, beschrieben.
Somit kann zum Beispiel ein solcher Test für das Absuchen einer Verbindung, die Interaktion des Liganden mit dem HFGAN72-Rezeptor hemmt, durch Inkontaktbringen von melanophoren Zellen, die den Rezeptor codieren, sowohl mit einem HFGAN72-Rezeptorliganden der vorliegenden Erfindung und einer abzusuchenden Verbindung verwendet werden. Die Hemmung des Signals, das durch den Liganden erzeugt wird, zeigt an, dass eine Verbindung ein potenzieller Antagonist für den Rezeptor ist, d.h. die Aktivierung des Rezeptors durch HFGAN72 hemmt.
Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifikation von Verbindungen zur Verfügung, die an ein HFGAN72-Rezeptorliganden-Polypeptid, bestehend aus einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ ID NR: 2-4, 6 und 8-12 binden und die Interaktion dessen mit einem HFGAN72-Rezeptor hemmen, umfassend:

(a) Inkontaktbringen einer Zelle, die einen HFGAN72-Rezeptor auf ihrer Oberfläche exprimiert, wobei der Rezeptor mit einer zweiten Komponente assoziiert ist, die in der Lage ist, ein nachweisbares Signal in Reaktion auf das Binden einer Verbindung an den Rezeptor bereitzustellen, mit einer Verbindung, die unter Bedingungen abgesucht werden soll, die eine Bindung an den Rezeptor erlauben, und
(b) Bestimmen, ob die Verbindung an den HFGAN72-Rezeptorliganden bindet und die Interaktion mit HFGAN72-Rezeptor aktiviert, durch Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Signals, das durch die Interaktion des Rezeptorliganden mit dem Rezeptor erzeugt wird.

Das Absuchen kann für die Bestimmung einer Verbindung, die den Rezeptor aktiviert, durch Inkontaktbringen solcher Zellen mit Verbindungen, die abgesucht werden sollen, und Bestimmen, ob eine solche Verbindung ein Signal erzeugt, d.h., den Rezeptor aktiviert, was eine zweite Messenger-Reaktion wie, ohne darauf beschränkt zu sein, eine cAMP-Hemmung oder – Stimulierung, Calcium-Mobilisierung und GTPγS-Bindung ergibt, verwendet werden.
Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifikation von Verbindungen zur Verfügung, die an ein HFGAN72-Rezeptorliganden-Polypeptid, bestehend aus einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NR: 2-4, 6 und 8-12 binden und die Interaktion dessen mit einem HFGAN72-Rezeptor hemmen, umfassend:

(a) Inkontaktbringen einer Zelle, die einen HFGAN72-Rezeptor auf ihrer Oberfläche exprimiert, wobei der Rezeptor mit einer zweiten Komponente assoziiert ist, der in der Lage ist, ein nachweisbares Signal in Reaktion auf das Binden einer Verbindung an den Rezeptor bereitzustellen, mit einer Verbindung, die unter Bedingungen abgesucht werden soll, die eine Bindung an den Rezeptor erlauben, und
(b) Bestimmen, ob die Verbindung an den HFGAN72-Rezeptorliganden bindet und seine Interaktion mit HFGAN72-Rezeptor aktiviert, durch Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Signals, das durch die Interaktion des Rezeptorliganden mit dem Rezeptor erzeugt wird.

Ein anderes derartiges Absuch-Verfahren beteiligt die Einführung von RNA, die den HFGAN72-Rezeptor codiert, in Eizellen von Xenopus, um den Rezeptor übergangsweise zu exprimieren. Die Rezeptor-Oocyten können dann mit einem Rezeptorliganden der vorliegenden Erfindung und einer abzusuchenden Verbindung in Kontakt gebracht werden, gefolgt vom Nachweis der Hemmung oder Aktivierung eines Signals im Falle eines Absuchens auf Verbindungen, von denen man annimmt, dass sie die Aktivierung des Rezeptors durch den Liganden hemmen.
Ein anderes Verfahren beteiligt das Absuchen auf Verbindungen, die die Aktivierung des Rezeptors hemmen, durch Bestimmen der Bindungshemmung von markiertem HFGAN72-Rezeptorliganden der vorliegenden Erfindung an Zellen, die den Rezeptor auf ihrer Oberfläche haben. Ein solches Verfahren beteiligt die Transfektion einer eukaryontischen Zelle mit DNA, die den HFGAN72-Rezeptor so codiert, dass die Zelle den Rezeptor auf ihrer Oberfläche exprimiert, und das Inkontaktbringen des Zell- oder Zellmembran-Präparats in Gegenwart einer markierten Form eines HFGAN72-Rezeptorliganden mit einer Verbindung. Der Ligand kann z.B. durch Radioaktivität markiert werden. Wenn die Verbindung, wie durch eine Reduktion von markiertem Liganden, der an die Rezeptoren bindet, bestimmt, an den Rezeptor bindet, wird die Bindung des markierten Liganden an den Rezeptor gehemmt.
Noch ein anderes Absuch-Verfahren beteiligt die Verwendung einer FLIPR-Ausstattung für Absuchverfahren von Testverbindungen mit hohem Durchsatz, die die Mobilisierung von intrazellulären Calciumionen oder anderen Ionen durch Beeinflussung der Interaktion eines HFGAN72-Rezeptorliganden mit dem HFGAN72-Rezeptor hemmen.
HFGAN72-Rezeptoren werden im Säuger-Wirt gefunden und können somit für viele biologische Funktionen verantwortlich sein, einschließlich vielen Krankheiten. Entsprechend ist es wünschenswert, Verbindungen zu finden, die einerseits den HFGAN72-Rezeptor oder die Interaktion von HFGAN72-Rezeptorliganden und dem HFGAN72-Rezeptor stimulieren und die andererseits die Funktion des HFGAN72-Rezeptors hemmen können.
Zum Beispiel wurde zuvor gezeigt, dass der HFGAN72-Rezeptor in vaskulären glatten Muskelzellen, die mit Serum behandelt wurden, hochreguliert und in Macrophagen, die mit oxidiertem LDL behandelt wurden, herabreguliert wurde, und er wurde ebenfalls in mit Stents versehenen Arterien gefunden. Entsprechend kann die Modulierung der Aktivität dieses Rezeptors mit Polypeptiden oder Fragmenten, Derivaten oder Varianten der Polypeptide der aktuellen Erfindung bei der Behandlung von kardiovaskulären Störungen von Nutzen sein. Die Isolierung dieses Liganden vom Gehirn und Hypothalamus zeigt ebenfalls eine ZNS-Relevanz an. Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Polypeptids bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR:3, SEQ ID NR:8 oder SEQ ID NR:11 bei der Herstellung eines Medikaments für die Herstellung einer Essstörung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Anorexia nervosa, Bulimie und Kachexie.
Beispiel 5 zeigt, dass die zentrale Verabreichung von Lig 72A (SEQ ID NR: 8) die Nahrungsaufnahme bei sich frei ernährenden Ratten über eine Dauer von 4 Stunden stimulierte. Diese Zunahme lag in etwa viermal über der von Kontroll-Ratten, die einen Träger erhielten. Diese Daten lassen annehmen, dass Lig 72A ein endogener Appetit-Regulator ist. Deshalb können Antagonisten seines Rezeptors bei der Behandlung von Fettleibigkeit und Diabetes von Nutzen sein, wohingegen die Agonisten und Antagonisten bei der Behandlung von Essstörungen wie unter anderem Anorexia nervosa, Bulimie und Kachexie von Nutzen sein können.
Des Weiteren zeigt Beispiel 6, dass Lig 72A (SEQ ID NR: 8) Antidiurese induzierte, wenn er intravenös in eine Ratte bei Bewußtsein gespritzt wurde, ohne die systemische oder renale Hämodynamik zu beeinträchtigen. Diese Daten lassen ebenfalls annehmen, dass ein HFGAN72-Rezeptor-Antagonist neue diuretische Aktivität besitzen würde und deshalb unter anderem bei der Behandlung von chronischem Nierenversagen, Diabetes vom Typ II, Nierenkrankheiten, kongestivem Herzversagen, verminderter Glucosetoleranz, Fettleibigkeit und sexueller Dysfunktion von Nutzen sein kann.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch Zusammensetzungen, die die vorstehend erörterten Polypeptide oder die Agonisten oder Antagonisten davon umfassen. Somit können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung, oder Agonisten oder Antagonisten dazu in Kombination mit (einem) unsterilen oder sterilen Träger(n) für die Verwendung bei Zellen, Geweben oder Organismen wie zum Beispiel einen pharmazeutischen Träger, der für die Verabreichung an ein Individuum geeignet ist, verwendet werden. Solche Zusammensetzungen umfassen zum Beispiel einen Medium-Zusatz oder eine therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptids der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten. Solche Träger können Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die Formulierungen sollten der Art der Verabreichung entsprechen.
Die Erfindung betrifft des Weiteren pharmazeutische Packungen und Kits, die einen oder mehrere Behälter umfassen, die mit einer oder mehreren der Zutaten der zuvor erwähnten Zusammensetzungen der Erfindung gefüllt sind. Einem solchen Behälter/solchen Behältern beigefügt kann eine Notiz in der Form sein, wie sie durch eine staatliche Behörde vorgeschrieben ist, die die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf von Pharmazeutika oder biologischen Produkten reguliert, wobei so die Zustimmung der Behörde zu der Herstellung, Verwendung oder dem Verkauf des Produkts für die Anwendung beim Menschen widergespiegelt, wird.
Polypeptide und andere Verbindungen der vorliegenden Erfindung können allein oder in Verbindung mit anderen Verbindungen wie therapeutischen Verbindungen verwendet werden.
Die Arzneimittel können auf jede wirksame, passende Weise, einschließlich unter anderem zum Beispiel der Verabreichung auf topischen, oralen, analen, vaginalen, intravenösen, intraperitonealen, intramuskulären, subkutanen, intranasalen oder intradermalen Wegen verabreicht werden.
Die Arzneimittel werden allgemein in einer für die Behandlung oder Prophylaxe einer spezifischen Indikation oder spezifischen Indikationen wirksamen Menge verabreicht. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen in einer Menge von mindestens etwa 10 μg/kg Körpergewicht verabreicht. In den meisten Fällen werden sie in einer Menge nicht über etwa 8 mg/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht werden. Vorzugsweise liegt die Dosis in den meisten Fällen bei etwa 10 μg/kg bis etwa 1 mg/kg Körpergewicht täglich. Es ist zu verstehen, dass die optimale Dosierung für jede Behandlungsmodalität und -indikation durch Standardverfahren bestimmt werden wird, wobei die Indikation, ihre Schwere, Verabreichungsweg, komplizierende Bedingungen und ähnliches in Betracht gezogen werden.
BEISPIELE: BIOLOGISCHE VERFAHREN
Bestimmte hierin verwendete Begriffe sind im vorstehenden Glossar erklärt.
Alle Beispiele wurden unter Verwendung von Standardverfahren ausgeführt, die dem Fachmann wohlbekannt und eine Routine sind, außer dort, wo sie anders detailliert beschrieben werden. Molekularbiologische Routineverfahren der folgenden Beispiele können, wie in Standard-Laborhandbüchern wie Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2.Ausgabe; Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), hierin als „Sambrook" bezeichnet, durchgeführt werden.
Beispiel 1: Clonierungsverfahren für die HFGAN72-Rezeptorliganden
a. Clonierungsverfahren für die Ratten-HFGAN72-Rezeptorliganden
Das degenerierte Intrapeptid-RT-PCR-Verfahren wurde verwendet, um die Sequenz für den Ratten-HFGAN72-Rezeptorliganden voller Länge zu erhalten.
Die Peptidsequenz QPLPDCCRQKTCSCRLYELLHGAGNHAGI (Aminosäuren 1-29 von SEQ ID NR: 6) wurde ausgewählt, um stark degenerierte Oligonucleotid-Primer herzustellen, die ihre Enden codieren. Die Sequenzen der Primer waren: CAACCNCTNCCNGACTGCTG (SEQ ID NR: 13) und ATNCCNGCNGCATGATT (SEQ ID NR: 14). An Position 3 des Primers von SEQ ID NR: 13 kann A mit G substituiert sein. An Position 7 des Primers von SEQ ID NR: 13 kann C mit T substituiert sein. An Position 15 des Primers von SEQ ID NR: 8 kann C mit T substituiert sein. An Position 18 von SEQ ID NR: 13 kann C mit T substituiert sein. An Position 12 des Primers von SEQ ID NR: 14 kann A mit G substituiert sein. An Position 15 des Primers von SEQ ID NR: 14 kann A mit G substituiert sein. Jede aller dieser Substitutionen kann in den Primern der SEQ ID NR: 13 und 14 vorliegen. In den Nucleotidsequenzen der vorstehenden Primer kann das Symbol „N" ein A, C, G oder T sein. Das cDNA-Fragment, das das Peptid codiert, wurde durch RT-PCR aus Rattenhirn-RNA gewonnen und durch Nucleotidsequenzierung bestätigt.
5'-RACE
Ein nicht degenerierter Oligonucleotid-Primer wurde basierend auf der Sequenz des vorstehenden RT-Produkts hergestellt (#1; GTTGCCAGCTCCG TGCAACAGTTCGTAGAGACGG) (SEQ ID NR: 15), und in einer 5'-RACE-Reaktion verwendet: Doppelsträngige cDNA wurde von polyA+-RNA aus Rattenhirn synthetisiert, mit dem Marathon-Adaptor (Clontech) ligiert und als Matrize für die initiale 5'-RACE-Reaktion mit dem Adaptor-Primer 1 (Clontech) und #1 als Primer verwendet. Eine verschachtelte PCR-Reaktion wurde mit einem Oligonucleotid CGGCAGGAACACGTCTTCTGGCG (#2) (SEQ ID NR: 16) und Adaptor-Primer 2 durchgeführt. Ein 5'-cDNA-Produkt von etwa 250 Bp, das das Peptid genau codiert, wurde erhalten.
3'-RACE
Zwei zusätzliche Oligonucleotide, TCCTTGGGTATTTGGACCACTGCACCGAAG (#3) (SEQ ID NR: 17) und ATACCATCTCTCCGCATTGCCTCTCCCTGA (#4) (SEQ ID NR: 18) wurden hergestellt, die einem Teil der vermutlichen nicht-codierenden 5'-Region der cDNA-Sequenz, die durch die vorstehende 5'-RACE-Reaktion erhalten wurde, entsprachen. Einzelsträngige Rattenhirn-cDNA wurde unter Verwendung eines Oligonucleotids CCTCTGAAGGTTCCAGAATCGATAGTAN (SEQ ID NR: 19) als spezifischem Primer für die reverse Transkription synthetisiert und als Matrize für eine 3'-RACE-Reaktion unter Verwendung von #3 und einem Anker-Primer (CCTCTGAAGGTTCCAGAATCGATAG) (SEQ ID NR: 20) verwendet. An Position 27 des Oligonucleotids von SEQ ID NR: 19 kann A entweder mit C oder G substituiert werden. In der Nucleotidsequenz des Oligonucleotids von SEQ ID NR: 19 kann das Symbol „N" ein A, C, G oder T sein. Das Produkt wurde einer verschachtelten PCR-Reaktion unter Verwendung von #4 und demselben Anker-Primer unterzogen. Ein diskretes Produkt von 0,6 kB, das die genaue 5'-cDNA-Sequenz enthielt, wurde erhalten. Die Sequenz voller Länge wurde auf cDNA-Produkten bestätigt, die von drei unabhängigen initialen 3'-RACE-Reaktionen erhalten wurden.
b. Clonierungsverfahren für die menschlichen und Mäuse-HFGAN72-Rezeptorliganden
Etwa 1,2 Millionen Plaques, jeweils von menschlichem (Clontech) und Mäuse (Stratagene)-Genbanken wurden durch Standard-Plaque-Hybridisierung abgesucht. Eine Ratten-DNA-Insertion voller Länge (etwa 0,5 kB), die beide HFGAN72-Rezeptorliganden, Lig 72 A und Lig 72B, codierte, wurde durch das Zufalls-Priming-Verfahren mit 32P markiert und wurde als Sonde verwendet. Hybridisierungs-positive Phagen wurden plaquegereinigt und genomische DNA-Fragmente, die Exons von HFGAN72-Rezeptorliganden enthielten, wurden durch Southern-Blotverfahren identifiziert und für die weitere Analyse in Plasmid-Vektoren subcloniert. Die vollständige Nucleotidsequenz des Genomfragments wurde aus Sequenzen der überlappenden Subclone zusammengeführt und die Sequenzen wurden durch Primer-Walking erhalten.
Beispiel 2: Reinigung von HFGAN72-Rezeptorliganden
Etwa 220 Gramm gefrorenes Rinder-Hypothalamusgewebe oder gefrorenes Rattenhirn-Gewebe, bezogen von Pel-Freez (Rogers, AR) wurden durch Polytron (15 mm Durchmesser) in 10 × Volumen von 70% (Volumen/Volumen) Aceton/1M Essigsäure/20 mM HCl bei Raumtemperatur homogenisiert. Die Homogenate wurden über Nacht bei 4°C gelagert, um größere Proteine auszufällen.
Am folgenden Tag wurden die Homogenate 30 Minuten bei 4°C bei 20.000 × g zentrifugiert. Die Zentrifugation wurde wiederholt, bis alle sichtbaren, unlöslichen Materialien von dem Überstand entfernt waren. Der Überstand wurde dann in mehrere große Glasflaschen aliquotiert, und jeder Flasche wurde ein gleiches Volumen Diethylether zugesetzt. Das Gemisch wurde 1-2 Minuten heftig geschüttelt, und man ließ die beiden Phasen 30 Minuten bei Raumtemperatur abscheiden. Die untere wässrige Phase (die trüb erscheint) wurde in frische Flaschen überführt und die Ether-Extraktion wurde zwei weitere Male wiederholt, um jegliches Aceton zu entfernen. Nach den Extraktionen wurde die wässrige Phase bei 20.000 × g 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde nochmals zentrifugiert, um alle unlöslichen Materialien zu entfernen. Der endgültige Überstand (etwa 500-600 ml) wurde dann durch einen Maschenfilter (Falcon Cell Strainer, Becton Dickinson, Co., Oxnard, CA) in eine Glasflasche filtriert. Das Filtrat wurde dann mit einem gleichen Volumen H₂O bei Raumtemperatur verdünnt und direkt auf zwei SepPak C18-Kartuschen von 10 Gramm (Gesamtbett 20 Gramm) geladen, die mit 0,1% (Volumen/Volumen) Trifluoressigsäure (TFA) voräqulibriert waren. Durch Ansetzen eines leichten Vakuums an die Kartuschen wurde die Durchflussrate so aufrechterhalten, dass die einzelnen Tröpfchen vom Austritt der Kartusche noch sichtbar waren. Jede Kartusche wurde mit 100 ml 5% CH₃CN/0,1% TFA gewaschen, und dann mit 30 ml 50% CH₃CN/0,1% TFA eluiert. Die ersten 6 Milliliter des Eluats wurden als Leervolumen verworfen. Das übrige Eluat wurde in silikonisierten Glasflaschen über Nacht lyophilisiert.
Das lyophilisierte Material wurde durch 10-20-minütige Beschallung in 24 Millilitern 1M Essigsäure gelöst oder bis keine sichtbaren unlöslichen Materialien mehr vorhanden waren. Der Extrakt wurde dann durch einen Mirex GV Spritzenfilter von 20 Micron (Millipore, Bedford, MA) filtriert. Die Hälfte (12 Milliliter) des filtrierten Extrakts wurde direkt auf eine C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule (Vydac 218TP510; 5 Micron, 10 mm × 250 mm semiprep; Hesperia, CA), prääquilibriert mit 3% CH₃CN/0,1% TFA, bei einer Durchflussrate von 3 Millilitern/Minute bei Raumtemperatur aufgetragen. Die Probe wurde über eine große (5 Milliliter oder größer) Probenschleife in vier Chargen von je 3 Millilitern aufgetragen. Ein Gradient von 10% – 40% CH₃CN in 0,1 % TFA wurde dann über 100 Minuten angewendet. Drei Milliliter (oder 1 Minute) -Fraktionen wurden in silikonisierten Glasröhrchen von 5 Millilitern aufgefangen. Die identische HPLC wurde für die übrige Hälfte des Extraks noch einmal wiederholt. 60 Microliter (1/50) von jeder Fraktion wurden beiseite gestellt und bei 293/HFGAN72-Zellen auf die Ca-Übergänge getestet, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und direkt auf eine Kationen-Austausch-HPLC-Säule (TosoHaas SP-5PW, 7,5 mm × 75 mm; Montgomeryville, PA), prääqulibriert mit 20 mM Na-Phosphat (pH 3,0)/30% CH₃CN bei Raumtemperatur aufgebracht. Ein 0-0,5 M Gradient von NaCl in 20 mM Na-Phosphat (pH 3,0)/30% CH₃CN wurde 60 Minuten lang bei einer Durchflussrate von 1 Milliliter/Minute angewendet. Fraktionen von 1 Milliliter wurden gesammelt, und 30 Microliter jeder Fraktion wurden für den Ca-Test verwendet.
Die aktiven Fraktionen (2-3 Fraktionen; 2-3 Milliliter) wurden gesammelt und 4-fach mit 0,1 % TFA verdünnt. Die verdünnte Probe wurde direkt auf eine analytische C18-Umkehrphasensäule (Vydac 218TP54; 4,6 mm × 250 mm), prääquilibriert mit 3% CH₃CN/0,1% TFA, bei einer Durchflussrate von 1 Milliliter/Minute aufgetragen. Die Säule wurde mit einem Säulen-Erhitzer bei 40°C gehalten. Ein 21%-36% Gradient von CH₃CN in 0,1%TFA wurde über 75 Minuten angewendet. Individuelle Peaks (bei einer Absorption von 210 nm überwacht) wurden manuell in silikonisierten Glasröhrchen von 5 Millilitern aufgefangen und 30 Microliter jeder Fraktion wurden getestet. An diesem Punkt hatte der aktive Peak bereits eine Reinheit von >70-80%.
Der aktive Peak (etwa 1 Milliliter) wurde 4-fach mit 0,1% TFA verdünnt, und direkt auf dieselbe C18-Säule geladen, dieses Mal jedoch mit 3% CH₃CN/20 mM Tris-HCl (pH 7,0 bei 40°C) prääquilibriert. Ein 3%-40% Gradient von CH₃CN in 20 mM Tris-HCl (pH 7,0) wurde 74 Minuten bei 40°C angewendet. Der Haupt-Peak bei 210 nm wurde manuell aufgefangen.
An diesem Punkt sollte die Probe bereits rein sein. Um die Reinheit zu bestätigen und um das Material zu entsalzen, wurde der aktive Peak (etwa 800 Microliter) 4-fach mit 0,1 % TFA verdünnt und direkt auf eine C8-Umkehrphasensäule (Vydac 228TP104; pH-stabile beschichtete C8; 4,6 mm × 250 ml), prääquilibriert mit 3% CH₃CN/0,1% TFA, bei einer Durchflussrate von 1 Milliliter/Minute aufgetragen. Ein 3%-36% Gradient von CH₃CN in 0,1% TFA wurde 66 Minuten bei 40°C angewendet. Der einzelne Peak bei 210 nm wurde manuell aufgefangen. Die biologische Aktivität wurde bestätigt. Das vorstehende Verfahren wurde verwendet, um Lig 72A zu reinigen.
Lig 72B wurde gefunden und durch Synthetisierung des Peptids basierend auf der cDNA-Sequenz und durch Testen des synthetisierten Produkts gereinigt.
Beispiel 3: Ca-Test auf Lig 72A und Lig 72B
Der Ca-Test wurde in Übereinstimmung mit Verfahren, beschrieben durch Sakuri et al., Nature 1990, 348:732-735 durchgeführt. Für den Test wurde ein kleiner Abschnitt jeder HPLC-Fraktion in ein silikonisiertes 1,5 Milliliter-Eppendorf-Röhrchen überführt und unter Vakuum bis zur Trockenheit evaporiert. Getrocknetes Material wurde in 20 Microlitern des Ca-Testpuffers (140 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM Na₂HPO₄/1 mM MgCl₂, 1,25 mM CaCl₂, 11 mM Glucose, 5 mM HEPES (pH 7,4) und 0,2% Rinderserumalbumin) durch Verwirbeln über 3 Minuten rekonstituiert. Für jeden Testpunkt wurden 10 Microliter der rekonstituierten Lösung verwendet. Die Zellen wurden mit Fura-2/AM in Übereinstimmung mit Standardverfahren aufgetragen. Das intrazelluläre Ionenanalysegerät Jasco CF-110 (Easton, MD) mit 0,5 ml-Testkuvetten wurde verwendet. Die 293/FGAN72-Zellen und nicht-transfizierte 293-Zellen wurden parallel verwendet, um die Spezifität der Reaktion zu gewährleisten. Endothelin-1 (Endkonzentration 1-100 nM) wurde als positiver Kontroll-Ligand verwendet.
Beispiel 4: Bestimmung der Aminosäuresequenzen von Lig 72A und Lig 72B
Ein Lys-C-Aufschluss des reduzierten und alkylierten Lig 72A in 50 mM Tris-Puffer, pH 9,0, wurde für die Sequenzanalyse verwendet. Eine Hälfte der Probe (etwa 25 Microliter) wurde gereinigt und mittels einer Microsäule, die mit Poros RII-Harz gepackt war, aufkonzentriert. Die Peptide wurden mit 2 Microlitern 70% Methanol, 5% Ameisensäure eluiert und auf eine Nanoelektrospray-Nadel überführt. Die Probe wurde unter Verwendung von Nanoelektrospray-Ionisierung auf einem PE-Sciex-Dreifach-Quadrupolmassenspektrometer analysiert. Ein einziges Peptid mit einem Molekulargewicht von 1286,6 wurde beobachtet. Dieses Peptid wurde unter Verwendung von kollisionsinduzierter Dissoziations(CID)-Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) sequenziert. Um die Interpretation der Daten zu erleichtern, wurden Fragmente des Peptids ebenfalls in der Elektrospray-Quelle gebildet, die danach durch CID-Tandem-MS (ein Verfahren, das als MS³ bezeichnet wird) sequenziert wurden. Die Fragmente, die gebildet wurden, unterschieden sich durch den Verlust von aufeinanderfolgenden N-terminalen Aminosäuren, die mit dem des-3-Peptidfragment beginnen und durch das des-5-Fragment weitergehen.
Lig 72B wurde durch direkte Edman-Sequenzierung unter Verwendung eines G1000A-Protein-Sequenzierungsgeräts von Hewlett Packard, das mit on-line-Pth (Phenylthiohydantoin)-Aminosäure-Analyse ausgestattet war, identifiziert. Das Molekulargewicht des Peptids wurde durch Matrix unterstützte Laser-Desorptions-Ionisierungs-Massenspektrometrie (MALDI-MS) auf 2935,9 Da bestimmt, was anzeigt, dass das prozessierte Peptid in voller Länge und am C-terminalen Rest amidiert war.
Beispiel 5: Lig 72A-Rattenfütterungsversuch
Unter Verwendung von Standardverfahren wurde eine chirurgische Implantierung einer Kanüle in das linke laterale Ventrikel von männlichen Sprague Dawley-Ratten durchgeführt, wobei ein stereotaktischer Rahmen verwendet wurde. Die Position jeder Kanüle wurde unter Verwendung einer submaximalen Dosis (2,35 nMol) Schweine-Neuropeptid Y (NPY) verifiziert, ein Peptid, von dem bekannt ist, dass es die Nahrungsaufnahme bei Ratten stimuliert, und das als positive Kontrolle in Nahrungsversuchen verwendet werden kann. Nachfolgend erhielten 9 Ratten zufallsverteilt über einen Zeitraum von 2 Wochen 3 Dosen an Lig 72A (2,34, 7,02 und 23,4 nMol). Die Nahrungsaufnahme wurde während der ersten beiden Stunden stündlich und wieder nach 4 Stunden gemessen, und das Körpergewicht wurde auf einer täglichen Basis überwacht.
Die Ergebnisse zeigen, dass Lig 72A die Nahrungsaufnahme in sich frei ernährenden Ratten über einen Zeitraum von 4 Stunden erhöht. Die Zunahme lag in etwa 4-mal über der von Kontrollratten, die ein Vehikel erhielten. Alle Dosen von Lig 72A ergaben dieselbe Reaktion, was nahe legt, dass sogar 2,34 nMol an der Spitze der Dosis-Reaktionskurve liegen und dass geringere Dosen untersucht werden müssen, um weitere Information über das Potenzial zu erhalten. Die Reaktionsdauer für Lig 72A erschien länger zu sein als die für NPY. Diese Daten legen nahe, dass Lig 72A ein endogener Regulator des Appetits sein kann und dass Antagonisten seines Rezeptors bei der Behandlung von Fettleibigkeit und Diabetes von Nutzen sein können, wohingegen Agonisten oder Antagonisten bei der Behandlung von Essstörungen wie unter anderem Anorexia nervosa, Bulimie und Kachexie nützlich sein können.
Beispiel 6: Antidiuretische Wirkung von Lig 72A bei der Ratte bei Bewußtsein
Die Wirkungen von Lig 72A auf den arteriellen Blutdruck (MAP), die Herzfrequenz (HR), den renalen Blutfluss (RBF) und die glomeruläre Filtrationsrate (GFR) sowie auf die Ausscheidung von gelösten Stoffen und Wasser durch die Nieren wurden in ständig an Instrumente angeschlossenen, männlichen Sprague Dawley (390-440 g)-Ratten (n=5), die bei Bewußtsein waren, bestimmt. Einzelheiten der Operation und der chronischen Behandlung wurden zuvor veröffentlicht (Kidney Int. 15:419-426, 1979). Kurz, unter Betäubung wurden Katheter über die femoralen Gefäße in die abdominale Aorta und die untere Vena cava implantiert. Zusätzlich wurde eine mit Silicongummi überzogene Kanüle aus rostfreiem Stahl in die Harnblase eingenäht. Während der Reconvaleszenz (6-8 Tage) wurden die Ratten einzeln untergebracht, hatten freien Zugang zu Futter und Wasser und wurde an einen Plastik-Zwinger gewöhnt.
Während der Versuchszeiträume wurden die Ratten in einen Zwinger gegeben und Verbindungen wurden für die Aufzeichnung des Blutdrucks und der Herzfrequenz und das Auffangen des Urins hergestellt. Während des Experiments wurde isotonische Kochsalzlösung, enthaltend 10% Inulin und 2% PAH, i.v. in einer Geschwindigkeit von 20 μl/min infundiert. Nach einer Stunde Äquilibrierung folgte zweimal ein 20-minütiges Auffangen von Urin (Kontrolle). Eine Blutprobe wurde in der Mitte des zweiten Auftangens genommen, und dann wurde Lig 72A i.v. in einer Geschwindigkeit von 1 μg/kg/min über 90 min infundiert, währenddessen dreimal ein 30-minütiges Auffangen von Urin durchgeführt wurde, und eine andere Blutprobe wurde zwischen dem zweiten und dem dritten Zeitraum genommen.
Urin- und Plasmakonzentrationen von Inulin und PAH wurden durch Spektrophotometrie bestimmt und die Elektrolyte wurden durch ein Synchron AS8 Clinical Analyzer (Beckman Intrument Inc., Brea, CA.) gemessen. Die glomeruläre Filtrationsrate (GFR) wurde aus der Nierenclearance von Inulin, dem Nierenplasmafluss (RPF) als der Clearance von PAH, dem Nieren-Blutfluss (RBF) als RPF/(1-Hämatokrit) geschätzt. Clearance und Exkretionsraten wurden unter Verwendung von Standardverfahren berechnet und werden pro 100 g Körpergewicht angegeben. Alle Werte stellen maximale Veränderungen dar, exprimiert als absolute Werte und dargestellt als Gruppenmittelwerte ± SEM. Statistische Analysen wurden unter Verwendung der Analyse der Varianz (ANOVA) durchgeführt. Ein Wert von P < 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet.
Der Blutdruck der Kontrolle betrug: 119 ± 3,2 mmHg, die Herzfrequenz betrug: 405 ± 9,9 Schläge/min., und keine Funktion wurde durch Lig 72A verändert. GFR und RBF stiegen während der Infusion des Peptids mäßig (nicht signifikant) von 923 ± 80 auf 1032 ± 103 beziehungsweise von 5444 ± 410 auf 6385 ± 910 μl/min/100g an. Im Gegensatz dazu wurden größere Veränderungen durch Lig 72A: im Urinfluss, von 22 ± 3 auf 8,2 ± 1,5 µl/min/100g (p < 0,05); in der fraktionalen Exkretion von Natrium und Kalium von 1,58 ± 0,3 auf 0,78 ± 0,2 beziehungsweise von 46 ± 6 auf 32 ± 2 % (p < 0,05) ausgelöst. Die Veränderungen bei der Clearance von Osmolen (von 39 ± 4 auf 30,3 ± 3 μl/min/100g) und freiem Wasser (von –17,3 ± 2 auf 22,1 ± 2 μl/min/100g) waren nicht statistisch signifikant.
Die Ergebnisse zeigen an, dass Lig 72A Antidiurese induziert, wenn es intravenös in die Ratte bei Bewußtsein injiziert wird, ohne systemische oder renale Hämodynamik zu beeinflussen. Die Daten legen ebenfalls nahe, dass ein HFGAN72-Rezeptor-Antagonist neue diuretische (natriuretische) Aktivität besitzt und deshalb unter anderem bei der Behandlung von chronischem Nierenversagen, Diabetes vom Typ II, Nierenkrankheiten, kongestivem Herzversagen, verminderter Glucosetoleranz, Fettleibigkeit und sexueller Dysfunktion von Nutzen sein kann. SEQUENZPROTOKOLL
Die vorstehende Beschreibung offenbart die Erfindung vollständig, einschließlich bevorzugter Ausführungsformen davon. Modifikationen und Verbesserungen der hierin spezifisch offenbarten Ausführungsformen sind innerhalb der Reichweite der folgenden Patentansprüche. Ohne weitere Ausarbeitung wird angenommen, dass ein Fachmann unter Verwendung der vorhergehenden Beschreibung die vorliegende Erfindung in ihrem vollständigsten Ausmaß verwenden kann. Deshalb sind die hierin bereitgestellten Beispiele als rein veranschaulichend zu betrachten und sind auf keine Weise eine Beschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Die Ausführungsformen der Erfindung, in welchen ein ausschließliches Eigentum oder Privileg eingefordert wird, sind wie folgt definiert.

Claims

Polypeptid bestehend aus einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 2-4, 6 und 8-12.
Polynucleotid codierend für eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 2-4, 6 und 8-12.
Polynucleotid umfassend eine Nucleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1, 5 und 21.
Verwendung eines Polypeptids bestehend aus einer Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 8 oder SEQ ID Nr. 11 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Ernährungsstörung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Anorexia nervosa, Bulimie und Cachexia.
Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die binden und die Interaktion eines HFGAN72-Rezeptor-Liganden-Polypeptids bestehend aus einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 2-4, 6 und 8-12 mit dem HFGAN72-Rezeptor aktivieren, umfassend: (a) Inkontaktbringen einer Zelle, die auf ihrer Oberfläche einen HFGAN72-Rezeptor exprimiert, wobei der Rezeptor assoziiert ist mit einer zweiten Komponente, die zur Bereitstellung eines nachweisbaren Signals in Reaktion auf das Binden einer Verbindung an den Rezeptor fähig ist, mit einer Verbindung, die unter Bedingungen gescreent werden soll, die eine Bindung an den Rezeptor erlauben; und (b) Bestimmen, ob die Verbindung bindet und die Interaktion von HFGAN72-Rezeptor-Ligand und HGFAN72-Rezeptor aktiviert durch Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Signals, das durch die Interaktion des Rezeptor-Liganden mit dem Rezeptor erzeugt wird.
Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die binden und die Interaktion eines HFGAN72-Rezeptor-Ligand-Polypeptids bestehend aus einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 2-4, 6 und 8-12 mit einem HFGAN72-Rezeptor hemmen, umfassend: (a) Inkontaktbringen einer Zelle, die auf ihrer Oberfläche einen HFGAN72-Rezeptor exprimiert, wobei der Rezeptor assoziiert ist mit einer zweiten Komponente, die zur Bereitstellung eines nachweisbaren Signals in Reaktion auf das Binden einer Verbindung an den Rezeptor fähig ist, mit einer Verbindung, die unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor erlauben, gescreent werden soll; und (b) Bestimmen, ob die Verbindung bindet und die Interaktion von HFGAN72-Rezeptor-Ligand und HGFAN72-Rezeptor hemmt, durch Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Signals, das durch die Interaktion des Rezeptor-Liganden mit dem Rezeptor erzeugt wird.
Polypeptid bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 4.
Polypeptid bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. B.