DE69822200T2 - Verwendung neuer liganden des hfgan72 neuropeptiderezeptors und dessen antagonisten in der therapie - Google Patents

Verwendung neuer liganden des hfgan72 neuropeptiderezeptors und dessen antagonisten in der therapie Download PDF

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Description

  • Fachgebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft Medikamente für die Behandlung von Patienten, die einen HFGAN72-Rezeptorliganden brauchen, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines der HFGAN72-Rezeptorliganden. Ebenfalls als innerhalb des Umfangs der Erfindung angesehen werden Medikamente für die Behandlung von Patienten, die entweder einen Agonisten oder einen Antagonisten eines der HFGAN72-Rezeptorliganden brauchen, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge entweder des Agonisten oder des Antagonisten eines der HFGAN72-Rezeptorliganden.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Es ist recht fest begründet, dass viele medizinisch bedeutende biologischen Prozesse durch Proteine vermittelt werden, die an Signaltransduktionswegen, die G-Proteine und/oder sekundäre Botenstoffe, z.B. cAMP, einschließen (Lefkowitz, Nature (1991), 351: 353–354) beteiligt sind. Hier werden diese Proteine bezeichnet als Proteine, die an Reaktionswegen mit G-Proteinen oder PPG-Proteinen beteiligt sind. Einige Beispiele dieser Proteine schließen ein: die GPC-Rezeptoren wie die für adrenerge Agentien und Dopamin (Kobilka, B.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1987), 84: 46–50; Kobilka, B.K. et al., Science (1987), 238: 650–656; Bunzow, J.R. et al., Nature (1988), 336 : 783–787), G-Proteine selbst, Effektorproteine, z.B. Phospholipase C, Adenylcyclase und Phosphodiesterase und Antriebsproteine, z.B. Proteinkinase A und Proteinkinase C (Simon, M.I. et al., Science (1991), 252 : 802–808). Zum Beispiel ist bei einer Form der Signaltransduktion der Effekt der Hormonbindung die Aktivierung des Enzyms Adenylatcyclase in der Zelle. Die Enzymaktivierung durch Hormone ist abhängig von der Anwesenheit des Nucleotids GTP. GTP beinflusst auch die Hormonbindung. Ein G-Protein verbindet den Hormonrezeptor mit der Adenylatcyclase. Es wurde gezeigt, dass ein G-Protein GTP gegen gebundenes GDP austauscht, wenn es durch einen Hormonrezeptor aktiviert wird. Die GTP tragende Form bindet dann an die aktivierte Adenylatcyclase. Die Hydrolyse von GTP zu GDP, katalysiert vom G-Protein selbst, führt das G-Protein zurück in seine inaktive Grundform. Also spielt das G-Proteine eine doppelte Rolle, als ein Zwischenglied, welches das Signal vom Rezeptor zum Effektor weiterleitet und als eine Uhr, welche die Dauer des Signals kontrolliert.
  • Die Membranprotein-Gensuperfamilie von G-Protein gekoppelten Rezeptoren wurde dadurch charakterisiert, dass sie sieben vermeintliche Transmembrandomänen aufweist. Man vermutet, dass die Domänen transmembrane alpha-Helices darstellen, die durch extrazelluläre oder cytoplasmatische Schleifen verbunden sind. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren schließen eine breite Palette von biologisch aktiven Rezeptoren ein wie hormonelle, virale Wachstumsfaktoren und Neuro-Rezeptoren.
  • G-Protein-gekoppelte Rezeptoren wurden dadurch charakterisiert, dass sie diese sieben konservierten hydrophoben Bereiche von etwa 20 bis 30 Aminosäuren beinhalten, die mindestens acht divergente hydrophile Schleifen verbinden. Die Familie der G-Proteingekoppelten Rezeptoren schließt Dopaminrezeptoren ein, die an neuroleptische Arzneimittel binden, die zum Behandeln von psychotischen und neurologischen Störungen verwendet werden. Andere Beispiele für Mitglieder dieser Familie schließen Rezeptoren für Calcitonin, Adrenalin, Endothelin, cAMP, Adenosin, Muscarin, Acetylcholin, Serotonin, Histamin, Thrombin, Kinin, Follikel stimulierendes Hormon, Opsine, das endotheliale Differenzierungsgen 1, Rhodopsine, Duftstoffe und das Cytomegalovirus ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
  • Die meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren weisen einzelne konservierte Cysteinreste in jedem der ersten beiden extracellulären Schleifen auf, die Disulfidbrücken ausbilden, von denen angenommen wird, dass sie die funktionale Proteinstruktur stabilisieren. Die sieben transmembranen Regionen werden bezeichnet als TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6 und TM7. TM3 wurde mit der Signaltransduktion in Verbindung gebracht.
  • Die Phosphorylierung und Lipidierung (Palmitylierung oder Farnesylierung) von Cysteinresten kann die Signaltransduktion von einigen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren beeinflussen. Die meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren enthalten potentielle Phosphorylierungsstellen innerhalb der dritten cytoplasmatischen Schleife und/oder des Carboxyterminus. Bei einigen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren wie dem b-Adrenorezeptor vermittelt die Phosphorylierung durch Proteinkinase A und/oder spezifische Rezeptorkinasen die Rezeptordesensibilisierung.
  • Man nimmt an, dass die Ligandenbindungsstellen der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren bei einigen Rezeptoren hydrophile Höhlen umfassen, die von mehreren transmembranen Domänen der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren gebildet werden, wobei diese Höhlen von hydrophoben Resten der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren umgeben sind. Es wurde postuliert, dass der hydrophile Bereich jeder transmembranen Helix von G-Proteingekoppelten Rezeptoren nach innen zeigt und eine polare Ligandenbindungsstelle bildet. TM3 wurde in mehreren G-Protein-gekoppelten Rezeptoren mit dem Vorhandensein einer Ligandenbindungsstelle wie dem TM3 Asparaginsäurerest in Zusammenhang gebracht. TM5-Serine, ein TM6-Asparagin und TM6- oder TM7-Phenylananine werden ebenfalls mit der Ligandenbindung in Verbindung gebracht.
  • G-Protein-gekoppelte Rezeptoren können intrazellulär durch heterotrimere G-Proteine an verschiedene intrazelluläre Enzyme, Ionenkanäle und Transporter gekoppelt sein. Siehe Johnson et al., Endoc. Rev. (1989), 10, 317–331. Unterschiedliche G-Protein a-Untereinheiten stimulieren bevorzugt spezielle Effektoren, um verschiedene biologische Funktionen in einer Zelle zu vermitteln. Die Phosphorylierung cytoplasmatischer Reste von G-Proteingekoppelten Rezeptoren wurde als ein wichtiger Mechanismus zur Regulierung der G-Protein-Koppelung von einigen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren identifiziert. G-Proteingekoppelte Rezeptoren sind in einem Säugetier-Wirtsorganismus an zahlreichen Stellen zu finden.
  • Im Verlauf der letzten 15 Jahre wurden nahezu 350 therapeutische Mittel, die gegen Rezeptoren mit sieben transmembranen Domänen (7 TM) oder deren Liganden gerichtet sind, erfolgreich auf den Markt gebracht. Dies deutet darauf hin, dass diese Rezeptoren und deren Liganden eine begründete und gesicherte Geschichte als therapeutische Ziele haben. Offensichtlich besteht Bedarf für die Identifizierung und Charakterisierung weiterer Rezeptoren und Liganden, die bei der Prävention, Verbesserung oder Korrektur von Dysfunktionen oder Erkrankungen eine Rolle spielen können, einschließlich, aber nicht ausschließlich, Depressionen, Angstzustände, obsessive kompulsive Störung, Affektneurose/-Störung, depressive Neurose/Störung, Angstneurose, Dysthymie, Verhaltensstörung, Epilepsie, Anfälle, affektive Psychose, psychosexuelle Dysfunktion, Geschlechtsstörung, sexuelle Störung, Essstörungen wie Anorexie, Bulimie, Kachexie und Fettleibigkeit, Cushing-Syndrom/Krankheit, basophiles Adenom, Prolaktinom, Hyperprolaktinämie, Hypopituitarismus, Hypophysentumor/-adenom, Hypothalamuserkrankungen, Fröhlich-Syndrom, Adenohypophysenerkrankung, Hypophysenerkrankung, Hypophysenwachstumshormon, Adenohypophysenhypofunktion, Adenohypophysenhyperfunktion, Hypothalamus-Hypogonadismus, Kallman-Syndrom (Ansomnie, Hyposmie), funktionale oder psychogene Amenorrhoe, Hypothalamus-Hypothyreose, Hypothalamus-Nierendysfunktion, idiopathische Hyperprolaktinämie, Hypothalamus-Störungen durch Wachstumshormon-Defizienz, idiopathische Wachstumshormon-Defizienz, Minderwuchs, Gigantismus, Acromegalie, gestörte biologische und zirkadiane Rhythmen und Schlafstörungen, die mit Erkrankungen wie neurologischen Störungen, Herz- und Lungenerkrankungen, mentalen Erkrankungen und Abhängigkeiten in Zusammenhang stehen, Migräne, Hyperallergie, vermehrte oder übersteigerte Schmerzempfindlichkeit wie Hyperalgesie, Kausalgie und Allodynie, akuter Schmerz, Verbrennungsschmerz, atypischer Gesichtsschmerz, neuropathischer Schmerz, Rückenschmerz, komplexes regionales Schmerz-Syndrom I und II, Arthroseschmerz, Schmerz nach Sportverletzungen, Schmerz verbunden mit Infektionen, z.B. HIV, Post-Polio-Syndrom und Post-Herpes-Neuralgie, Phantomschmerz, Arbeitsschmerz, Krebsschmerz, Schmerz nach Chemotherapie, Schmerz nach Schlaganfall, postoperativer Schmerz, Neuralgie und Narkosetoleranz oder Narkoseunverträglichkeit, Schlafstörungen, Schlafapnoe, Müdigkeit, Narkolepsie, Schlaflosigkeit, Parasomnie, Jet-lag-Syndrom; und andere neurodegenerative Störungen, die unter anderem nosologische Entitäten wie Disinhibition-Demenz-Parkinson-Amyotrophie-Komplex und "pallido-ponto-nigrale" Degeneration einschließen.
  • Polypeptide und Polynucleotide, die den menschlichen G-Protein-gekoppelten Neuropeptidrezeptor mit 7 transmembranen Regionen HFGAN72, codieren, wurden identifiziert und sind offenbart in U.S.S.N. 08/846.704 (6) und 08/846.705 (7), beide eingereicht am 30. April 1997, sowie in WO 96/34877, veröffentlicht am 7. November 1996.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Polypeptide und Polynucleotide, welche Polypeptide codieren, die Liganden für den HFGAN72-Rezeptor darstellen, bereit.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung von (1) der Verwendung eines Antagonisten, der die Interaktion eines HFGAN72-Rezeptorliganden und eines HFGAN72-Rezeptors hemmt, wobei der Rezeptorligand ein Polypeptid ist, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens zu 95 % mit einer Aminosäuresequenz identisch ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR. 2–4 und 8–12, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Schlafstörungen, Schlafapnoe, Narkolepsie, Schlaflosigkeit, Parasomnie, dem Jet-lag-Syndrom, einem gestörten biologischen und zirkadianen Rhythmus, Schlafstörungen, die mit neurologischen Störungen, Lungenerkrankungen und Abhängigkeiten in Zusammenhang stehen, und einer obsessiven kompulsiven Störung und (2) der Verwendung eines Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu mindestens 95 % mit einer Aminosäuresequenz identisch ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR. 2–4 und 8–12, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer obsessiven kompulsiven Störung, einem gestörten biologischen und zirkadianen Rhythmus, Schlafstörungen, die mit neurologischen Störungen, Lungenerkrankungen, Abhängigkeiten in Zusammenhang stehen, Schlafstörungen, Schlafapnoe, Narkolepsie, Schlaflosigkeit, Parasomnie und dem Jet-lag-Syndrom.
  • Andere Gegenstände, Merkmale, Vorteile und Aspekte der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann aus der folgenden Beschreibung ersichtlich. Es sollte jedoch selbstverständlich sein, dass die folgende Beschreibung und die spezifischen Beispiele, die bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung deutlich machen sollen, nur zu Illustrationszwecken aufgeführt sind. Verschiedene Änderungen und Modifizierungen innerhalb des Geltungsbereichs der offenbarten Erfindung werden dem Fachmann beim Lesen der folgenden Beschreibung und beim Lesen der anderen Teile der vorliegenden Offenbarung schnell ersichtlich werden.
  • Kurzbeschreibung der Abbildungen
  • 1 zeigt eine genomische Sequenz (SEQ ID NR. 1), die menschliche HFGAN72-Rezeptorliganden codiert. Großbuchstaben zeigen Exons (cDNA, SEQ ID NR. 21).
  • 2 zeigt eine abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NR. 2), die zwei verschiedene menschliche HFGAN72-Rezeptorliganden umfasst, Lig 72a (SEQ ID NR. 3, gezeigt durch Gedankenstriche) und Lig 72b (SEQ ID NR. 4, gezeigt durch Sternchen).
  • 3 zeigt eine cDNA Sequenz (SEQ ID NR. 5), die Ratten HFGAN72-Rezeptorliganden codiert.
  • 4 zeigt eine abgeleitete Aminosäuresequenz von Ratten HFGAN72-Rezeptorliganden (SEQ ID NR. 6), welche die mit Hilfe des von Heijin-Algorithmus vorhergesagte N-terminale Signal- und Leit ("leader")-Sequenz (SEQ ID NR. 7) einschließt.
  • 4 zeigt auch sind zwei Liganden, Lig 72a (SEQ ID NR. 8, gezeigt durch Gedankenstriche) und Lig 72b (SEQ ID NR. 9, gezeigt durch Sternchen).
  • 5 zeigt einen Prä-Pro-Bereich einer Aminosäuresequenz von Maus HFGAN72-Rezeptorliganden, denen ein Teil der N-terminalen Signalsequenz fehlt (SEQ ID NR. 10). Diese Aminosäuresequenz umfasst zwei Liganden, Lig 72a (SEQ ID NR. 11, gezeigt durch Gedankenstriche) und Lig 72b (SEQ ID NR. 12, gezeigt durch Sternchen).
  • 6 zeigt die Proteinsequenz des HFGAN72-Rezeptors.
  • 7 zeigt die Proteinsequenz einer Spleiß ("splice")-Variante des HFGAN72-Rezeptors.
  • Glossar
  • Die folgenden erläuternden Erklärungen werden bereitgestellt, um das Verständnis bestimmter Begriffe zu erleichtern, die hier besonders in den Beispielen häufig verwendet werden. Die Erklärungen werden als Annehmlichkeit bereitgestellt und sollen die Erfindung nicht beschränken.
  • „Isoliert" bedeutet von Menschenhand gegenüber der natürlich vorkommenden Form verändert, d.h., dass es, falls es natürlich vorkommt, verändert wurde oder aus seiner Originalumgebung entfernt wurde, oder beides. Zum Beispiel ist ein natürlicherweise vorkommendes Polynucleotid oder ein Polypeptid, das natürlicherweise in einem lebenden Tier in seinem Naturzustand vorkommt, nicht „isoliert", aber das gleiche Polynucleotid oder Polypeptid, das von den koexistenten Materialien seines Naturzustands getrennt wurde, ist, so wie der Begriff hier verwendet wird, „isoliert". Zum Beispiel bedeutet der Begriff „isoliert" im Hinblick auf ein Polynucleotid, dass dieses vom Chromosom und der Zelle in der es natürlicherweise vorkommt getrennt wurde.
  • Als Teil der Isolierung oder nach der Isolierung können derartige Polynucleotide zum Beispiel mit anderen Polynucleotiden wie DNAs zur Mutagenese, um Fusionsproteine zu bilden und zur Propagierung oder Expression in einem Wirt verbunden werden. Die isolierten Polynucleotide können, allein oder verbunden mit anderen Polynucleotiden wie Vektoren, in Wirtszellen, in Kulturen oder in ganze Organismen, eingebracht werden. Eingebracht in Wirtszellen in Kulturen oder in ganze Organismen, würden derartige DNAs, so wie der Begriff hier verwendet wird, immer noch isoliert sein, da sie nicht in ihrer natürlicherweise vorkommenden Form oder Umgebung wären. Ähnlich können die Polynucleotide und Polypeptide in einer Verbindung wie zum Beispiel einem Medium, Formulierungen, Lösungen zur Einbringen von Polynucleotiden oder Polypeptiden, zum Beispiel in Zellen, Verbindungen oder Lösungen für chemische oder enzymatische Reaktionen vorkommen, die keine natürlicherweise vorkommenden Verbindungen sind und darin isolierte Polynucleotide oder Polypeptide innerhalb der Bedeutung des Begriffs, so wie er hier eingesetzt wird, bleiben.
  • „Oligonucleotid(e)" bezieht sich auf relativ kurze Polynucleotide. Der Begriff bezieht sich oft auf einzelsträngige Desoxyribonucleotide, kann sich aber auch unter anderem auf einzel- oder doppelsträngige Ribonucleotide, RNA-DNA-Hybride und doppelsträngige DNAs beziehen.
  • „Polynucleotid(e)" bezieht sich üblicherweise auf jedes Polyribonucleotid oder Polydesoxyribonucleotid, welches nicht-modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte DNA oder RNA sein kann. Also bezieht sich zum Beispiel Polynucleotide, wie hier verwendet, unter anderem auf einzel- und doppelsträngige DNA, DNA, die eine Mischung aus einzel- und doppelsträngigen Bereichen ist, einzel- und doppelsträngige RNA und RNA, die eine Mischung aus einzel- und doppelsträngigen Bereichen ist, Hybridmoleküle, umfassend DNA und RNA, die einzelsträngig oder noch typischer doppelsträngig oder eine Mischung aus einzelsträngigen und doppelsträngigen Bereichen sein kann. Außerdem bezieht sich Polynucleotid, wie hier verwendet, auf dreisträngige Bereiche, umfassend RNA oder DNA oder sowohl RNA als auch DNA. Die Stränge in derartigen Bereichen können vom gleichen Molekül sein oder von verschiedenen Molekülen. Die Bereiche können eines oder mehrere der Moleküle vollständig einschließen, involvieren aber noch typischer nur einen Bereich von einigen der Moleküle. Eines der Moleküle in einem dreisträngigen Bereich ist häufig ein Oligonucleotid. Wie hier verwendet, schließt der Begriff Polynucleotid auch DNAs oder RNAs, wie vorstehend beschrieben, ein, die eine oder mehrere modifizierte Basen enthalten. Also sind DNAs oder RNAs, deren Rückgrat hinsichtlich Stabilität oder aus anderen Gründen modifiziert wurde, Polynucleotide, so wie dieser Begriff hier gemeint ist. Außerdem sind DNAs oder RNAs, die ungewöhnliche Basen wie Iosin oder modifizierte Basen wie tritylierte Basen umfassen, um nur zwei Beispiele zu nennen, Polynucleotide, so wie der Begriff hier verwendet wird. Es ist selbstverständlich, dass eine große Vielfalt von Modifikationen an DNA oder RNA vorgenommen wurden, die vielen nützlichen Zwecken dienen, die dem Fachmann bekannt sind. Der Begriff Polynucleotid, so wie er hier verwendet wird, umschließt derartige chemisch, enzymatisch oder metabolisch modifizierte Polynucleotidformen sowie die chemischen Formen von DNA und RNA, die charakteristisch sind für Viren und Zellen einschließlich, unter anderem, einfache und komplexe Zellen.
  • „Polypeptide", wie hier verwendet, schließt alle Polypetide, wie nachstehend beschrieben, ein. Die grundlegende Struktur von Polypeptiden ist wohlbekannt und wurde in unzähligen Lehrbüchern und anderen Publikationen auf dem Fachgebiet beschrieben. In diesem Zusammenhang wird der Begriff hier verwendet, um jedes Peptid oder Protein, umfassend zwei oder mehr Aminosäuren, die in einer linearen Kette durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind, zu bezeichnen. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff sowohl auf kurze Ketten, die auf dem Fachgebiet üblicherweise auch zum Beispiel als Peptide, Oligopeptide und Oligomere bezeichnet werden, und auf längere Ketten, die auf dem Fachgebiet üblicherweise als Proteine bezeichnet werden, von denen es viele Arten gibt.
  • Es ist selbstverständlich, dass Polypeptide häufig andere als die 20 Aminosäuren enthalten, die üblicherweise als die 20 natürlicherweise vorkommenden Aminosäuren bezeichnet werden, und dass viele Aminosäuren, einschließlich der terminalen Aminosäuren, in einem vorliegenden Polypeptid modifiziert sein können, entweder durch natürliche Verfahren wie Prozessierung und andere post-translationale Modifikationen oder durch chemische Modifikationstechniken, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind. Schon die herkömmlichen Modifikationen, die natürlicherweise bei Polypeptiden vorkommen, sind zu zahlreich, um sie hier erschöpfend aufzulisten aber sie sind in Grundlagentexten und in ausführlicheren Monographien sowie in umfangreicher Forschungsliteratur gut beschrieben und sind folglich dem Fachmann wohlbekannt. Bekannte Modifikationen, die in erfindungsgemäßen Polypeptiden vorhanden sein können beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalente Bindung von Flavin, kovalente Bindung einer Häm-Einheit, kovalente Bindung eines Nucleotids oder Nucleotidderivats, kovalente Bindung eines Lipids oder Lipidderivats, kovalente Bindung von Phosphotidylinositol, Vernetzung, Ringbildung, Bildung von Disulfidbrücken, Demethylierung, Bildung kovalenter Vernetzungen, Bildung von Cystin, Bildung von Pyroglutamat, Formylierung, gamma-Carboxylierung, Glycosylierung, Bildung von GPI-Ankern, Hydroxylierung, Iodierung, Methylierung, Myristolysierung, Oxidation, proteolytische Prozessierung, Phosphorylierung, Prenylierung, Racemisierung, Selenylierung, Sulfatierung, transfer-RNA vermittelte Anfügung von Aminosäuren an Proteine wie Arginylierung und Ubiquitinierung. Derartige Modifikationen sind dem Fachmann wohlbekannt und wurden im Detail in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben. Mehrere besonders häufige Modifizierungen, einschließlich Glycosylierung, Lipidbindung, Sulfatierung, gamma-Carboxylierung von Glutaminsäureresten, Hydroxylierung und ADP-Ribosylierung sind beschrieben in den meisten Grundlagentexten wie in T.E. Creighton: „PROTEINS – STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES", 2. Ausg. (1993), W. H. Freeman and Company, New York. Zu diesem Thema sind außerdem detaillierte Reviews erhältlich. Siehe Wold, F.: „Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects", Seite 1–12 in Johnson, B.C.: „POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS", Ausg. (1983), Academic Press, New York; Seifter et al.: „Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990), 182: 626–646 und Rattan et al.: „Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann. N.Y. Acad. Sci. (1992), 663: 48–62.
  • Es ist selbstverständlich, dass, wie wohlbekannt ist und vorstehend bemerkt wurde, Polypeptide nicht immer vollständig linear sind. Zum Beispiel können Polypeptide als Ergebnis einer Ubiquitinierung verzweigt sein und sie können ringförmig sein, mit oder ohne Verzweigung, üblicherweise als Ergebnis posttranslationaler Ereignisse, einschließlich natürlicher Prozessierungsereignisse und Ereignisse, die durch menschliche Manipulation hervorgerufen wurden und die natürlicherweise nicht auftreten. Zirkuläre, verzweigte und verzweigte zirkuläre Polypeptide können durch nicht-translationale natürliche Verfahren synthetisiert werden und auch durch vollständig synthetische Verfahren.
  • Modifizierungen können irgendwo in einem Polypeptid auftreten, einschließlich dem Peptidrückgrat, den Aminosäureseitenketten und den Amino- oder Carboxyltermini. Tatsächlich ist die Blockade der Amino- oder Carboxylgruppe oder beider Gruppen in einem Polypeptid durch kovalente Modifkation, in natürlicherweise vorkommenden und synthetischen Polypeptiden häufig und derartige Modifikationen können in erfindungsgemäßen Polypeptiden ebenfalls vorhanden sein. Zum Beispiel wird der aminoterminale Rest von Polypeptiden, die in E. coli hergestellt werden, vor der Prozessierung fast unveränderbar N-Formylmethionin sein.
  • Die Modifizierungen, die in einem Polypeptid vorkommen, werden häufig das Resultat davon sein wie es erzeugt wurde. Bei Polypeptiden, die erzeugt wurden durch Expression eines geclonten Gens in einem Wirt, wird zum Beispiel die Beschaffenheit und das Ausmaß von Modifikationen zum Großteil durch die Fähigkeit der Wirtszelle zur posttranslationalen Modifikation und die in der Aminosäuresequenz des Polypeptids vorhandenen Modifikationssignale bestimmt werden. Zum Beispiel tritt, wie wohlbekannt ist, in bakteriellen Wirten wie E. coli keine Glykosylierung auf. Demgemäß sollte, wenn eine Glykosylierung gewünscht ist, ein Polypeptid in einem glykosylierenden Wirt, üblicherweise in eukaryotischen Zellen, exprimiert werden. Insektenzellen führen häufig die gleichen posttranslationalen Glykosylierungen durch wie Säugerzellen und aus diesem Grund wurden Insektenzell-Expressionssysteme entwickelt, um Säugetierproteine, die unter anderem das native Glykosylierungsmuster aufweisen, effizient zu exprimieren. Ähnliche Berücksichtigungen gelten für andere Modifizierungen.
  • Es ist selbstverständlich, dass die gleiche Art von Modifikation zum gleichen oder unterschiedlichen Grad an verschiedenen Stellen in einem vorliegenden Polypeptid vorhanden sein kann. Ein vorliegendes Polypeptid kann auch verschiedene Arten von Modifikationen enthalten.
  • Im Allgemeinen umschließt der Begriff Polypeptid, wie hier verwendet, alle derartigen Modifikationen, besonders solche, die in Polypeptiden vorhanden sind, die durch Expression eines Polynucleotids in einer Wirtszelle synthetisiert wurden.
  • „Subjekt" bezieht sich, so wie der Begriff hier verwendet wird, auf ein Säugetier, insbesondere einen Menschen.
  • „Variante(n)" von Polynucleotiden oder Polypeptiden sind, so wie der Begriff hier verwendet wird, Polynucleotide oder Polypeptide, die sich von einem Referenzpolynucleotid oder -polypeptid unterscheiden. Varianten in diesem Sinne sind nachstehend und an anderer Stelle in der vorliegenden Offenbarung detaillierter beschrieben.
  • Varianten schließen Polynucleotide ein, die sich in der Nucleotidsequenz von einem anderen, einem Referenzpolynucleotid, unterscheiden. Üblicherweise sind Unterschiede beschränkt, so dass die Nucleotidsequenz der Referenz und der Variante insgesamt sehr ähnlich und in vielen Bereichen identisch sind.
  • Wie nachstehend angemerkt, können Änderungen in der Nucleotidsequenz der Variante still sein. Das heißt, sie können die Aminosäuresequenz, die von dem Polynucleotid codiert wird, nicht ändern. Wo Veränderungen auf stille Änderungen dieser Art beschränkt sind, wird eine Variante ein Polypeptid mit der gleichen Aminosäuresequenz wie die Referenz codieren. Wie nachstehend ebenfalls angemerkt, können Austausche in der Nucleotidsequenz der Variante die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das von dem Referenzpolynucleotid codiert wird, verändern. Wie nachstehend diskutiert, können aus derartigen Nucleotidaustauschen Aminosäuresubstitutionen, -additionen, -deletionen, –fusionen und Verkürzungen im Polypeptid resultieren, das von der Referenzsequenz codiert wird.
  • Varianten schließen auch Polypeptide ein, die sich in ihrer Aminosäuresequenz von einem anderen Polypeptid, einem Referenzpolypeptid, unterscheiden. Üblicherweise sind Unterschiede beschränkt, so dass die Sequenzen der Referenz und der Variante insgesamt sehr ähnlich und in manchen Bereichen identisch sind.
  • Eine Variante und ein Referenzpolypeptid können sich in ihrer Aminosäuresequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Additionen, Deletionen, Fusionen und Verkürzungen, die in jeder Kombination vorhanden sein können, unterscheiden.
  • Ein „Fusionsprotein" ist, so wie der Begriff hier verwendet wird, ein Protein, das von zwei, häufig nicht verwandten, fusionierten Genen oder Fragmenten davon codiert wird. EP-AO464 533 (kanadisches Äquivalent 2045869) offenbart Fusionsproteine, umfassend verschiedene Teile der konstanten Region von Immunglobulin-Molekülen zusammen mit einem anderen menschlichen Protein oder einen Teil davon. In vielen Fällen ist der Einsatz eines Immunglobulin Fc-Bereichs als ein Teil eines Fusionsproteins vorteilhaft für die Verwendung bei der Therapie oder Diagnose, was zum Beispiel in verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften resultiert (EP-A 0232 262). Andererseits würde es für einige andere Verwendungen wünschenswert sein, in der Lage sein zu können, den Fc-Teil zu entfernen, nachdem das Fusionsprotein exprimiert, nachgewiesen und gereinigt wurde. Entsprechend kann es wünschenswert sein, die Bestandteile des Fusionsproteins mit einem chemisch oder enzymatisch spaltbaren Verbindungsbereich zu verbinden. Dies ist der Fall wenn sich der Fc-Teil als Hindernis bei der Verwendung zur Therapie oder Diagnose erweist, zum Beispiel wenn das Fusionsprotein als Antigen zur Immunisierung verwendet werden soll. Bei der Suche nach neuen Arzneimitteln wurden zum Beispiel menschliche Proteine wie shIL5-α mit Fc-Teilen für die Verwendung in Hochdurchsatz-Durchmusterungsverfahren ("high-throughput screening assays) fusioniert, um Antagonisten von hIL-5 zu identifizieren. Siehe Bennett, D. et al., J. Mol. Recog. (1995), 8: 52–58, und Johanson, K. et al., J. Biol. Chem. (1995), 270 (16) : 9459–9471.
  • Also betrifft die Verwendung auch genetisch veränderte lösliche Fusionsproteine, umfassend einen HFGAN72-Rezeptorliganden oder einen Teil davon und verschiedene Teile der konstanten Region von schweren oder leichten Ketten von Immunglobulinen verschiedener Subklassen (IgG, IgM, IgA, IgE). Als ein Immunglobulin ist der konstante Teil der schweren Kette von menschlichem IgG, besonders IgG1, bevorzugt, wo die Fusion in der "Hinge"-Region stattfindet. In einer Ausführungsform kann der Fc-Teil einfach durch Einbau einer Spaltungssequenz entfernt werden; die mit dem Blutgerinnungsfaktor Xa gespalten werden kann. Diese Erfindung betrifft außerdem Verfahren zur gentechnischen Herstellung dieser Fusionsproteine und deren Verwendung zur Diagnose und Therapie. Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Polynucleotide, die derartige Fusionsproteine codieren.
  • „Bindungsmoleküle" (oder andernfalls „Interaktionsmoleküle" oder „Rezeptorkomponentenfaktoren" genannt) bezieht sich auf Moleküle; einschließlich Rezeptoren, die spezifisch an erfindungsgemäße Polypeptide binden oder mit diesen interagieren. Derartige Bindungsmoleküle sind ein Teil der vorliegenden Erfindung. Bindungsmoleküle können auch nicht natürlicherweise vorkommend sein wie Antikörper und von Antikörpern abgeleitete Reagenzien, die spezifisch an erfindungsgemäße Polypeptide binden.
  • Wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, wird die „Ähnlichkeit" zwischen zwei Polypeptiden durch Vergleich der Aminosäuresequenz eines Polypeptids und deren konservierte Aminosäureaustausche mit der Sequenz eines zweiten Polypeptids bestimmt. Außerdem ist auf dem Fachgebiet auch „Identität" bekannt, was das Maß an Sequenzverwandtschaft zwischen zwei Polypeptiden oder zwei Polynucleotidsequenzen bedeutet, wie durch die Identität der Übereinstimmung zwischen zwei Teilstücken derartiger Sequenzen bestimmt. Sowohl die Identität als auch die Ähnlichkeit kann ohne weiteres berechnet werden (Lesk, A.M., Hrsg.: „COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY" (1988), Oxford University Press, New York; Smith, D.W., Hrsg.: "BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS" (1993), Academic Press, New York; Griffin,A.M. und Griffin , H.G., Hrsg.: "COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I (1994), Humana Press, New Jersey; von Heinje, G.: SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY" (1987), Academic Press und Gribskov, M. und Devereux, J., Hrsg.: "SEQUENCE AND ANALYSIS PRIMER" (1991), M Stockton Press, New York). Es existieren eine Reihe von Verfahren, um die Identität und die Ähnlichkeit von zwei Polynucleotid- oder Polypeptidsequenzen zu messen und die Begriffe „Identität" und Ähnlichkeit" sind dem Fachmann wohlbekannt (Carillo, H. und Lipton, D., SIAM, J. Applied. Math. (1988), 48: 1073). Verfahren, die gewöhnlich eingesetzt werden, um die Identität oder Ähnlichkeit von zwei Sequenzen zu bestimmen, schließen die ein, die offenbart sind in Bishop, M.J., Hrsg.: „GUIDE TO HUGE COMPUTERS" (1994), Academic Press, San Diego, und Carillo, H. und Lipton, D., SIAM, J. Applied Math. (1988), 48: 1073, sind aber nicht darauf beschränkt. Bevorzugte Verfahren, um die Identität zu bestimmen, wurden so entworfen, dass sie die größte Übereinstimmung zwischen den zwei getesteten Sequenzen ermitteln. Verfahren, um die Identität und Ähnlichkeit zu bestimmen sind auch in Computerprogrammen kodifiziert. Bevorzugte Computerprogramm-Verfahren, um die Identität und Ähnlichkeit von zwei Sequenzen zu bestimmen, schließen das GCG Programmpaket ein (Devereux, J. et al., Nucl. Acids Res. (1984), 12 (1): 387), BLATP, BLASTN und FASTA (Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol. (1990), 215: 403) sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Polypeptiden und Polynucleotiden von HFGAN72-Rezeptorliganden. Diese Polypeptide schließen die Polypeptide eines menschlichen HFGAN72-Rezeptorliganden (SEQ ID NR. 2) und eines Maus Rezeptorliganden (SEQ ID NR. 10) ein, deren Aminosäuresequenzen in den 2 (SEQ ID NR. 2–4), 4 (SEQ ID NR. 6–9) und 5 (SEQ ID NR. 10–12) dargestellt sind. Die Erfindung betrifft auch Polypeptide, umfassend eine Aminosäuresequenz, die über ihre Gesamtlänge mindestens zu 95 % mit einer Aminosäuresequenz identisch ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR. 2–4 und 8–12, wobei 97 % Identität mit diesen Aminosäuresequenzen noch stärker bevorzugt wird.
  • Polypeptide identischer Masse, die Liganden des HFGAN72-Rezeptors sind, wurden aus Rattenhirn und Rinderhypothalamus isoliert. Die Aminosäuresequenz des reifen Ratten-Polypeptids, Lig 72a, wurde bestimmt und ist in 4 als SEQ ID NR. 8 gezeigt. Eine exakte Masse des MH+-Ions des Peptids wurde unter Verwendung von verzögerter Extraktion MALDI gemessen und lag bei 1286.6125 (kalk. 1286.6237). Der GIn-Rest an Position 9 (siehe 3) wurde von Lys (beide Aminosäuren haben die gleiche Restmasse) durch Acetylierung des Peptids und erneuter Messung des Molekulargewichts unterschieden. Das Molekulargewicht veränderte sich bei 42 Da, von 1286,6 auf 1328,6 (kalk. 1328,6), was also auf die Anfügung von nur einer Acetatgruppe hinweist. Da GIn-Reste nicht acetyliert werden können und der N-Terminus blockiert ist, spricht die Anfügung nur einer Acetatgruppe stark dafür, dass die C-terminale Sequenz eines verdauten Moleküls QK ist, nicht KK. Aufgrund der Ähnlichkeit der Molekulargewichte wird angenommen, dass das Ratten Polypeptid die gleiche Sequenz hat.
  • Ergebnisse von in situ-Hybridisierungen an Schnitten adulter Rattenhirne zeigen, dass die HFGAN72-Rezeptorliganden sowohl im Hypothalamus als auch in den Hypothalamusneuronen stark exprimiert werden. Da die HFGAN72-Rezeptorliganden im Hyothalamus lokalisiert sind, wird angenommen, dass sie bei einer Reihe von neurologischen Störungen (z.B. Epilepsie, Schlaganfall), psychiatrischen Störungen (z. B. Angstzustände, Depressionen) und/oder Essstörungen involviert sind.
  • Interessanterweise sind die Aminosäuresequenzen von Lig 72a identisch für Mensch (SEQ ID NR. 3), Ratte (SEQ ID NR. 8) und Maus (SEQ ID NR. 11). Es wurde herausgefunden, dass der menschliche Lig 72b (SEQ ID NR. 4), der der Ratte (SEQ ID NR. 9) und der der Maus (SEQ ID NR. 12) mit dem HFGAN72-Rezeptor interagieren und sie daher die gleichen Eigenschaften wie Lig 72a haben könnten.
  • Die Aktivität von Lig 72a und Lig 72b gegenüber dem HFGAN72-Rezeptor wurde bestätigt. Es wurden Experimente an Fura-beladenen 293-Zellen, die mit dem HFGAN72-Rezeptor transfiziert waren, durchgeführt. In den Zellen wurden die intrazellulären Calciummengen als Antwort auf dein Erhöhen der Konzentrationen der Polypeptide für die HFGAN72-Rezeptorliganden, Lig 72a und Lig 72b, gemessen. Der EC50-Wert des Polypeptids wurde auf 50 ng/ml geschätzt. Die Aktivierung des HFGAN72-Rezeptors durch sowohl Lig 72a als auch Lig 72b wurde als spezifisch bestimmt, da entweder mit 293pCDN Vektor-transfizierten Zellen oder mit einem alternativen Clon keine Stimulation beobachtet wurde. Es wird angenommen, dass HFGAN72-Rezeptorliganden oder Fragmente, Analoge oder Derivate dieser Ligandenpolypeptide bei der Vermittlung von HFGAN72-Rezeptor Aktivitäten nützlich sein könnten. Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch Fragmente, Analoge und Derivate dieser Polypeptide. Die Begriffe „Fragment", „Derivat" und „Analogon" bezeichnen, wenn sie sich auf das Polypeptid beziehen, ein Polypeptid, das im wesentlichen über die gleiche biologische Funktion oder Aktivität, d.h. Funktionen wie HFGAN72-Rezeptorliganden, verfügt oder über die Fähigkeit verfügt, irgenwelche Rezeptoren oder Bindungsmoleküle zu binden, sogar wenn das Polypeptid den Rezeptor nicht in gleicher Weise aktivieren kann. Daher schließt ein Analogon zum Beispiel ein Proprotein ein, das durch Abtrennen des Proprotein-Teils aktiviert werden kann, um ein aktives reifes Polypeptid oder einen Teil des HFGAN72-Liganden herzustellen.
  • Das Polypeptid kann ein rekombinantes Polypeptid, ein natürliches Polypeptid oder ein synthetisches Polypeptid sein. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist es ein rekombinantes Polypeptid.
  • Das Fragment, Derivat oder Analogon des Polypeptids kann eines sein, in dem (i) einer oder mehrere Aminosäurereste ausgetauscht wurden gegen einen konservierten oder nicht-konservierten Aminosäurerest (vorzugsweise einen konservierten Aminosäurerest) und ein derartiger ausgetauschter Aminosäurerest kann vom genetischen Code codiert sein oder nicht; (ii) einer oder mehrere Aminosäurereste eine substituierte Gruppe aufweisen; (iii) das reife Polypeptid fusioniert ist mit einer anderen Verbindung wie eine Verbindung, die die Halbwertszeit des Polypeptids verlängert (zum Beispiel Polyethylenglykol); oder (iv) die zusätzlichen Aminosäuren an das reife Polypeptid angefügt sind wie eine Lei ("leader")-Sequenz oder eine Sekretionssequenz oder eine Sequenz, die zur Reinigung des reifen Polypeptids eingesetzt wird, oder eine Proproteinsequenz. Derartige Fragmente, Derivate und Analoge werden aus den hier enthaltenen Lehren vom Fachmann als innerhalb des Umfangsbereichs liegend angesehen.
  • Bevorzugte Ausführungsformen beziehen sich auf die Verwendung von Polypeptiden, welche die Aminosäuresequenzen der HFGAN72 Rezeptorliganden aufweisen, die in den 2 (SEQ ID NR. 2–4), 3 (SEQ ID NR. 8 und 9) und 4 (SEQ ID NR. 10–12) dargestellt sind, und noch spezieller das reife Polypeptid, Lig 72a, das in 2 als SEQ ID NR. 3, in 4 als SEQ ID NR. 8 und in 5 als SEQ ID NR. 11 dargestellt ist, Varianten, Analoge, Derivate und deren Fragmente und Varianten, Analoge und Derivate der Fragmente. Weitere besonders bevorzugte Ausführungsformen sind in diesem Zusammenhang Polypeptide, Varianten, Analoge, Derivate und deren Fragmente und Varianten, Analoge und Derivate der Fragmente, welche die Aktivität oder Funktion von Lig 72a und Lig 72b beibehalten.
  • Unter bevorzugten Varianten sind die, die sich von einer Referenz durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden. Derartige Substitutionen sind die, bei denen eine in einem Polypeptid vorhandene Aminosäure gegen eine andere Aminosäure mit ähnlichen Eigenschaften ausgetauscht ist. Typischerweise als konservative Substitutionen angesehen werden Austausche, von einer gegen eine andere, der aliphatischen Aminosäuren Ala, Val, Leu und Ile; der Austausch der Hydroxylreste Ser und Thr, der Austausch der sauren Reste Asp und Glu, die Substitution zwischen den Amidresten Asn und Gln, der Austausch der basischen Reste Lys und Arg und Austausche zwischen den aromatischen Resten Phe und Tyr.
  • Außerdem in diesem Zusammenhang besonders bevorzugt sind Varianten, Analoge, Derivate und Fragmente und Varianten, Analoge und Derivate der Fragmente, welche die Aminosäuresequenz aufweisen, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Polypeptiden in den 2 (SEQ ID NR. 2–4), 4 (SEQ ID NR. 8 und 9) und 5 (SEQ ID NR. 10–12), in denen in jeder Kombination mehrere, wenige, 5 bis 10, 1 bis 5, 1 bis 3, 2, 1 oder keine Aminosäurereste substituiert, deletiert oder addiert sind,. Besonders bevorzugt unter diesen sind stille Substitutionen, Additionen und Deletionen, die nicht die Eigenschaften und Aktivitäten der Liganden verändern. Ebenfalls besonders bevorzugt in diesem Zusammenhang sind konservative Substitutionen. Am allermeisten bevorzugt sind Polypeptide, welche die Aminosäuresequenz aufweisen, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den 2 (SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 4), 4 (SEQ ID NR. 8 oder SEQ ID NR. 9) und 5 (SEQ ID NR. 10, SEQ ID NR. 11 oder SEQ ID NR. 12), ohne Substitutionen.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Polypeptide und Polynucleotide werden vorzugsweise in isolierter Form bereitgestellt und sind vorzugsweise bis zur Homogenität gereinigt.
  • Die Polypeptide zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen die Polypeptide mit der SEQ ID NR. 2–4 und 8–12 ein und insbesondere das reife Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR. 4, 8, und 11, sowie Polypeptide, die mindestens zu 95 % identisch mit diesen Polypeptiden sind und stärker bevorzugt mindestens 97 % Ähnlichkeit aufweisen.
  • Fragmente oder Teile der erfindungsgemäßen Polypeptide können eingesetzt werden zum Herstellen der entsprechenden vollständigen Polypeptide durch Peptidsynthese, dazu können die Fragmente als Zwischenprodukte zum Herstellen der vollständigen Polypeptide eingesetzt werden. Fragmente können „selbständig" sein, d.h. nicht Teil oder nicht mit anderen Aminosäuren oder Polypeptiden fusioniert, oder sie können von einem größeren Polypeptid, von dem sie einen Teil oder Bereich bilden, umfasst sein. Wenn sie von einem größeren Polypeptid umfasst sind, bilden die gerade diskutierten Fragmente am stärksten bevorzugt einen einzelnen zusammenhängenden Bereich. Allerdings können mehrere Fragmente von einem einzigen größeren Polypeptid umfasst sein. Zum Beispiel beziehen sich bestimmte bevorzugte Ausführungsformen auf Fragmente von Polypeptiden der erfindungsgemäßen HFGAN72-Rezeptorliganden, die von einem Vorläufer-Polypeptid umfasst wird, das entwickelt wurde zur Expression in einem Wirt und in dem heterologe Prä- und Propolypeptidregionen an den Aminoterminus der Polypeptidfragmente von HFGAN72-Rezeptorliganden angefügt sind und ein zusätzlicher Bereich an den Carboxyterminus der Fragmente angefügt ist. Daher bezieht sich „Fragmente" in einem Aspekt der hier beabsichtigten Bedeutung auf den Teil oder die Teile eines Fusionspolypeptids oder Fusionsproteins, die von HFGAN72-Rezeptorliganden stammen. Unter besonders bevorzugten Fragmenten zur Verwendung in der Erfindung sind Verkürzungsmutanten von HFGAN72-Rezeptorliganden. Verkürzungsmutanten schließen Polypeptide der HFGAN72-Rezeptorliganden ein, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den 2 (SEQ ID NR. 2–4), 4 (SEQ ID NR. 6, 8 und 9) und 5 (SEQ ID NR. 10–12) oder deren Varianten oder Derivate, außer der Deletion einer zusammenhängenden Serie von Resten (das heißt, eine zusammenhängende Region, ein zusammenhängender Teil oder Bereich), die den Aminoterminus einschließt oder einer zusammenhängenden Serie von Resten, die den Carboxyterminus einschließt, oder, wie in doppelten Verkürzungsmutanten, die Deletion von zwei zusammenhängenden Serien von Resten, von denen eine den Aminoterminus einschließt und eine den Carboxyterminus einschließt.
  • Es ist selbstverständlich, dass die Verwendung in der Erfindung unter anderem auch Polynucleotide betrifft, welche die vorstehend erwähnten Fragmente codieren, Polynucleotide, die an Polynucleotide hybridisieren, welche die Fragmente codieren, insbesondere solche, die unter stringenten Bedingungen hybridisieren, und Polynucleotide wie PCR-Primer zum Amplifizieren von Polynucleotiden, welche die Fragmente codieren. In diesem Zusammenhang sind solche Polynucleotide bevorzugt, die, wie vorstehend diskutiert, den bevorzugten Fragmenten entsprechen und am stärksten bevorzugt SEQ ID NR. 21, wie in 1 dargestellt, oder SEQ ID NR. 5, wie in 3 dargestellt.
  • Polypeptide von HFGAN72-Rezeptorliganden und Polynucleotide, die diese Polypeptide codieren, können in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, besonders für solche, die von den chemischen und biologischen Eigenschaften dieser Liganden Gebrauch machen. Zusätzliche Anwendungen betreffen die Behandlung von Erkrankungen von Zellen, Geweben und Organismen. Diese Aspekte der Erfindung werden durch die folgende Diskussion weiter illustriert.
  • Außerdem können Antikörper gegen einen HFGAN72-Rezeptorliganden eingesetzt werden, um die Interaktion eines derartigen Liganden mit dem HFGAN72-Rezeptor zu hemmen und sie können verwendbar sein bei der Behandlung von einer obsessiven kompulsiven Störung, einem gestörten biologischen und zirkadianen Rhythmus, Schlafstörungen, die mit neurologischen Störungen, Lungenerkrankungen und Abhängigkeiten in Zusammenhang stehen, Schlaftstörungen, Schlafapnoe, Narkolepsie, Schlaflosigkeit, Parasomnie und dem Jet-lag-Syndrom.
  • Verfahren zum Herstellen von Antikörpern, die in diesen Untersuchungen verwendbar sind, sind dem Fachmann wohlbekannt. Polypeptide, deren Fragmente oder andere Derivate oder deren Analoge oder Zellen, die diese exprimieren, können als Immunogen verwendet werden, um Antikörper dagegen herzustellen. Diese Antikörper können zum Beispiel polyclonale oder monoclonale Antikörper sein. Die vorliegende Erfindung schließt auch die Verwendung von chimären, einzelkettigen oder humanisierten Antikörpern ein sowie von Fab-Fragmenten oder das Produkt einer Fab-Expressionsbibliothek. Verschiedene auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Herstellung derartiger Antikörper und Fragmente verwendet werden.
  • Antikörper, die erzeugt wurden gegen die Polypeptide, die einer in der vorliegenden Erfindung verwendeten Sequenz entsprechen, können erhalten werden durch direkte Injektion der Polypeptide in ein Tier, vorzugsweise ein nicht-menschliches Tier. Der so erhaltene Antikörper wird dann die Polypeptide selbst binden. Auf diese Weise kann sogar eine Sequenz, die nur ein Fragment der Polypeptide codiert, verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die das vollständige native Protein binden. Derartige Antikörper können dann verwendet werden, um das Polypeptid aus Gewebe, welches das Polypeptid exprimiert, zu isolieren.
  • Zur Herstellung monoclonaler Antikörper, kann jede Technik verwendet werden, die Antikörper, die von kontinuierlichen Zellkulturen produziert werden, bereitstellt. Beispiele schließen die Hybridomtechnik (Kohler, G. und Milstein, C., Nature (1975)., 256: 495–497), die Triom-Technik, die menschliche B-Zell-Hybridomtechnik (Kozbor et al., Immunol. Today (1983), 4: 72) und die EBV-Hybridomtechnik zum Herstellen von menschlichen monoclonalen Antikörpern (Cole et al. in „MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY" (1985), Alan R. Liss, Inc., Seite 77–96) ein.
  • Techniken, die zur Herstellung von einzelkettigen Antikörpern (US Patent Nr. 4.946.778) beschrieben wurden, können verändert werden, um einzelkettige Antikörper gegen immunogene Polypeptidprodukte dieser Erfindung herzustellen. Ebenso können transgene Mäuse oder andere Organismen wie andere Säugetiere verwendet werden, um humanisierte Antikörper gegen immunogene erfindungsgemäße Polypeptidprodukte zu exprimieren.
  • HFGAN72-Rezeptorliganden könnten verwendet werden, um Proteine zu isolieren, die mit diesen interagieren und diese Interaktion könnte ein Ziel für die Interferenz sein.
  • Inhibitoren von Protein-Protein Interaktionen zwischen HFGAN72-Rezeptorliganden und anderen Faktoren könnten zur Entwicklung von Arzneimitteln zur Modulation der Aktivität von HFGAN72-Rezeptorliganden führen. Wie hier verwendet bezieht sich der Begriff modulieren auf das Beeinträchtigen der Funktion von HFGAN72-Rezeptorliganden.
  • Gene, die Proteine für Moleküle codieren, die HFGAN72-Rezeptoren binden, können anhand von zahlreichen Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, identifiziert werden, zum Beispiel durch Liganden-"panning" und FACS-Sortierung. Derartige Methoden sind in vielen Labor-Handbüchern beschrieben wie zum Beispiel in Coligan et al., Current Protocols in Immunology I (Rivett, A.J., Biochem. J. (1993), 291: 1–10): Kapitel 5 (1991).
  • Zum Beispiel stellt das "yeast two hybrid system", Verfahren zum in vivo Nachweis der Interaktion zwischen einem ersten Testprotein und einem zweiten Testprotein bereit, wobei die Wiederherstellung der Aktivität eines transkriptionalen Aktivators verwendet wird. Das Verfahren ist offenbart im US-Patent Nr. 5,283,173, die Reagentien sind erhältlich von Clontech und Stratagene. Kurz gesagt wird die cDNA eines HFGAN72-Rezeptorliganden wird mit einer DNA-Bindungsdomäne des Transkriptionsfaktors Gal4 fusioniert und in Hefezellen exprimiert. Anhänge von cDNA aus Bibliotheken, die aus interessierenden Zellen erhalten werden, werden mit einer Transaktivierungsdomäne von Gal4 fusioniert. cDNA-Clone, die Proteine exprimieren, die mit einem HFGAN72-Rezeptorliganden interagieren können, werden zur Wiederherstellung der Aktivität von Gal4 und zur Transaktivierung der Expression eines Reportergens wie Gal1-lacZ führen. Die cDNA des HFGAN72-Rezeptorliganden, die mit der DNA-Bindungsdomäne des Transkriptionsfaktors Gal4 fusioniert ist, kann in einer oder mehreren Aminosäuren mutiert sein, das entsprechende Verfahren ist vorstehend beschrieben, um die Interaktion der Kinase mit dem Substrat zu verstärken.
  • Ein alternatives Verfahren ist die Durchmusterung von λgt11, λZAP (Stratagene) oder äquivalenten cDNA-Expressionsbibliotheken mit rekombinanten HFGAN72-Rezeptorliganden. Rekombinante Proteine für HFGAN72-Rezeptorliganden oder deren Fragmente werden mit kurzen Peptid-Markierungen ("tags") wie FLAG, HSV oder GST fusioniert. Die Peptid-Markierungen ("tags") können geeignete Phosphorylierungsstellen für eine Kinase wie die Herzmuskel-Kreatinkinase besitzen oder sie können biotinyliert werden. Rekombinante HFGAN72-Rezeptorliganden können mit 32P phosphoryliert sein oder unmarkiert verwendet werden und mit Streptavidin oder Antikörpern gegen die Markierungen ("tags") nachgewiesen werden. λgt11-Expressionsbibliotheken werden aus interessierenden Zellen hergestellt und mit den rekombinanten HFGAN72-Rezeptorliganden inkubiert, gewaschen und es werden cDNA-Clone isoliert, die mit den HFGAN72-Rezeptorliganden interagieren. Siehe z.B. T. Maniatis, et al., supra.
  • Ein anderes Verfahren ist die Durchmusterung einer Säugetier-Expressionsbibliothek in der die cDNAs in einem Vektor zwischen eine Säugetier-Promotor und eine -Polyadenylierungsstelle cloniert werden und transient in COS- oder 293-Zellen transfiziert werden, gefolgt vom Nachweis des bindenden Proteins 48 Stunden später durch Inkubation fixierter und gewaschener Zellen mit einem markierten, vorzugsweise jodierten, HFGAN72-Rezeptorliganden und dem Nachweis gebundener HFGAN72-Rezeptorliganden durch Autoradiographie. Siehe Sims et al., Science (1988), 241: 585–589 und McMahan et al., EMBO J. (1991), 10: 2821–2832. Auf diese Weise können Pools von cDNAs, welche die cDNA enthalten, die das bindende interessierende Protein codiert, ausgewählt werden und die interessierende cDNA kann durch weitere Subdivision jedes Pools isoliert werden, gefolgt von Zyklen transienter Transfektion, Bindung und Autoradiographie. Alternativ kann die interessierende DNA isoliert werden durch Transfektion der gesamten cDNA-Bibliothek in Säugetierzellen und "panning" der Zellen auf einer Schale, die einen HFGAN72-Rezeptorliganden an die Platte gebunden enthält. Zellen, die nach dem Waschen anhaften, werden lysiert und die Plasmid-DNA wird isoliert, in Bakterien amplifiziert und der Zyklus aus Transfektion und "panning" wird wiederholt bis ein einzelner cDNA-Clon erhalten wird. Siehe Seed et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987), 84: 3365 und Aruffo et al., EMBO J. (1987), 6: 3313. Falls das bindende Protein sezerniert wird, kann dessen cDNA mit einer ähnlichen Pool-Strategie erhalten werden, wenn erst ein Bindungs- oder Neutralisierungstest für die Untersuchung der Überstände transient transfizierter Zellen etabliert wurde. Allgemeine Verfahren zum Durchmustern von Überständen sind offenbart in Wong et al., Science (1985), 228: 810–815.
  • Ein anderes alternatives Verfahren ist die Isolierung von Proteinen, die mit einem HFGAN72-Rezeptorliganden interagieren, direkt aus Zellen. Fusionsproteine aus einem HFGAN72-Rezeptorliganden und GST- oder kleinen Peptid-Markierungen ("tags") werden hergestellt und an Kügelchen immobilisiert. Es werden biosynthetisch markierte oder unmarkierte Proteinextrakte aus den interessierten Zellen hergestellt, mit den Kügelchen inkubiert und mit Puffer gewaschen. Proteine, die mit einem HFGAN72-Rezeptorliganden interagieren, werden spezifisch von den Kügelchen eluiert und mittels SDS-PAGE analysiert. Durch Microsequenzierung werden die primären Aminosäure-Sequenzdaten der Bindungspartner erhalten. Wenn gewünscht, können die Zellen mit Mitteln behandelt werden, die eine funktionelle Antwort wie die Tyrosinphosphorylierung zellulärer Proteine induzieren. Ein Beispiel für ein derartiges Mittel wäre ein Wachstumsfaktor oder Cytokin wie Interleukin-2.
  • Ein anderes alternatives Verfahren ist die Immunaffinitätsreinigung. Ein rekombinanter HFGAN72-Rezeptorligand wird mit markierten oder unmarkierten Zellextrakten inkubiert und mit anti-HFGAN72-Rezeptorligand Antikörpern immunpräzipitiert. Das Immunpräzipität wird mit Protein-A-Sepharose gewonnen und mittels SDS-PAGE analysiert. Unmarkierte Proteine werden durch Biotinylierung markiert und in SDS-Gelen mit Streptavidin nachgewiesen. Bindungspartnerproteine werden durch Microsequenzierung analysiert. Außerdem können vor der Microsequenzierung dem Fachmann bekannte biochemische Standard-Reinigungsschritte verwendet werden.
  • Noch ein anderes alternatives Verfahren ist das Durchmustern von Peptidbibliotheken auf Bindungspartner. Ein rekombinanter markierter ("tagged") oder markierter ("label") HFGAN72-Rezeptorligand wird verwendet, um Peptide aus einer Peptid- oder Phosphopeptidbibliothek auszuwählen, die mit einem HFGAN72-Rezeptorliganden interagieren. Die Sequenzierung der Peptide führt zur Identifizierung von Consensus-Peptidsequenzen, die in interagierenden Proteinen gefunden werden könnten.
  • Zusammengefasst können Bindungspartner von HFGAN72-Rezeptorliganden, die durch diese Verfahren oder durch andere Verfahren die dem Fachmann bekannt wären, identifiziert werden, sowie die vorstehend diskutierten vermeintlichen Bindungspartner in dem Testverfahren verwendet werden. Die Untersuchung des Vorhandenseins eines HFGAN72-Rezeptorligand/Bindungspartner-Komplexes wird zum Beispiel im Hefe Two-Hybrid-System ("yeast-two-hybrid-system"), im ELISA oder in Immunassays unter Verwendung von Antikörpern, die für den Komplex spezifisch sind, erreicht. In der Gegenwart von Testsubstanzen (z.B. Inhibitoren oder Antagonisten), welche die Bildung der HFGAN72-Rezeptorligand/Bindungspartner- Interaktion unterbrechen oder hemmen, wird eine verringerte Menge des Komplexes relativ zu einer Kontrolle, in der die Testsubstanz fehlt, bestimmt.
  • HFGAN72-Rezeptorligand Polypeptide können auch verwendet werden, um die HFGAN72-Rezeptorligand-Bindungskapazität von HFGAN72-Rezeptorligand bindenden Molekülen in Zellen oder zellfreien Präparaten zu untersuchen.
  • Die HFGAN72-Rezeptorliganden können auch in einem Verfahren zur Suche nach Verbindungen, welche die Aktivierung des HFGAN72-Rezeptors durch den Liganden hemmen (Antagonisten), eingesetzt werden.
  • Im Allgemeinen beinhalten derartige Suchverfahren das Bereitstellen geeigneter Zellen, die den HFGAN72-Rezeptor auf ihrer Oberfläche exprimieren. Derartige Zellen schließen Zellen von Säugetieren, Hefe, Drosophila oder E. coli ein. Im Besonderen wird ein Polynucleotid, das den HFGAN72-Rezeptor codiert, eingesetzt, um Zellen damit zu transfizieren, um dadurch den Rezeptor zu exprimieren. Der exprimierte Rezeptor wird dann mit einer Testverbindung und einem erfindungsgemäßen HFGAN72-Rezeptorliganden in Kontakt gebracht, um die Bindung sowie die Stimulation oder die Hemmung einer funktionellen Antwort zu untersuchen.
  • Ein derartiges Durchmusterungsverfahren schließt die Verwendung von Melanophoren ein, die transfiziert werden, um den HFGAN72-Rezeptor zu exprimieren. Ein derartige Durchmusterungstechnik ist beschrieben in WO 92/01810, veröffentlicht am 6. Februar 1992.
  • Also kann ein derartiger Test zum Beispiel eingesetzt werden zur Suche nach einer Verbindung, welche die Interaktion des Liganden mit dem HFGAN72-Rezeptor inhibiert, durch Inkontaktbringen von Melanophor-Zellen, die den Rezeptor codieren, mit sowohl einem erfindungsgemäßen HFGAN72-Rezeptorliganden und einer zu untersuchenden Verbindung. Die Hemmung des Signals, das durch den Liganden erzeugt wird, deutet darauf hin, dass eine Verbindung ein potentieller Rezeptorantagonist ist, d.h. sie inhibiert die Aktivierung des Rezeptors durch HFGAN72.
  • Die Überprüfung kann eingesetzt werden zum Auffinden einer Verbindung, die den Rezeptor aktiviert, durch Inkontaktbringen derartiger Zellen mit zu untersuchenden Verbindungen und Bestimmen, ob eine derartige Verbindung ein Signal erzeugt, d.h. den Rezeptor aktiviert, was zu einer Second-Messenger-Antwort wie unter anderem cAMP-Hemmung oder -Stimulierung, Calcium-Mobilisierung und GTPγS-Bindung führt.
  • Eine andere derartige Durchmusterungstechnik beinhaltet das Einbringen von RNA, die den HFGAN72-Rezeptor codiert, in Xenopus Oocyten, um den Rezeptor transient zu exprimieren. Im Fall der Suche nach Verbindungen, von denen angenommen wird, dass sie die Aktivierung des Rezeptors durch den Liganden hemmen, können die Rezeptor-Oocyten dann mit einem erfindungsgemäßen Rezeptorliganden und einer zu untersuchenden Verbindung in Kontakt gebracht werden, gefolgt vom Nachweis der Hemmung oder Aktivierung eines Signals.
  • Ein anderes Verfahren beinhaltet die Suche nach Verbindungen, welche die Aktivierung des Rezeptors hemmen, durch Bestimmung der Hemmung der Bindung eines markiertem erfindungsgemäßen HFGAN72-Rezeptorliganden an Zellen, die den Rezeptor auf ihrer Oberfläche tragen. Ein derartiges Verfahren beinhaltet die Transfektion einer eukaryotischen Zelle mit DNA, die den HFGAN72-Rezeptor codiert, so dass die Zelle den Rezeptor auf ihrer Oberfläche exprimiert, und Inkontaktbringen der Zelle oder des Zellmembranpräparats mit einer Verbindung in Gegenwart einer markierten Form eines HFGAN72-Rezeptorliganden. Die Menge des markierten Liganden, die an den Rezeptor gebunden ist, wird gemessen, z.B. durch Messung der Radioaktivität des Rezeptors. Falls die Verbindung an den Rezeptor bindet, was durch eine Reduzierung des markierten Liganden, der an den Rezeptor bindet, bestimmt wird, wird die Bindung des markierten Liganden an den Rezeptor gehemmt.
  • Noch eine andere Durchmusterungstechnik beinhaltet die Verwendung von einer FLIPR-Ausrüstung zur Schnellsuche von Testverbindungen, welche die Mobilisierung intrazellulärer Calciumionen oder anderer Ionen durch Beeinflussung der Interaktion eines HFGAN72-Rezeptorliganden mit dem HFGAN72-Rezeptor hemmen.
  • HFGAN72-Rezeptoren sind in Säugetieren zu finden und könnten daher für viele biologische Funktionen, einschließlich vieler pathologischer Situationen, verantwortlich sein. Demgemäß ist es wünschenswert, Verbindungen zu finden, die den HFGAN72-Rezeptor oder die Interaktion von HFGAN72-Rezeptorliganden und des HFGAN72-Rezeptors einerseits stimulieren und andererseits die Funktion den HFGAN72-Rezeptor hemmen können.
  • Zum Beispiel wurde vorläufig gezeigt, dass der HFGAN72-Rezeptor in vaskulären glatten Muskelzellen, die mit Serum behandelt wurden, hochreguliert ist, in Makrophagen, die mit oxidiertem LDL behandelt wurden, herunterreguliert ist und dass er auch in gedehnten Arterien zu finden ist. Demgemäss könnte die Modulierung der Aktivität dieses Rezeptors mit erfindungsgemäßen Polypeptiden oder Fragmenten, Derivaten oder Varianten der erfindungsgemäßen Polypeptide verwendbar sein bei der Behandlung kardiovaskulärer Erkrankungen. Die Isolierung dieses Liganden aus dem Gehirn und dem Hypothalamus deutet zudem auf eine ZNS-Relevanz hin. Also betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des HFGAN72-Rezeptorliganden oder von Verbindungen, welche die Interaktion eines derartigen Liganden mit dem HFGAN72-Rezeptor modulieren, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von einer obsessiven kompulsiven Störung, einem gestörten biologischen oder zirkadianen Rhythmus, Schlafstörungen, die mit neurologischen Störungen, Lungenerkrankungen, Abhängigkeiten in Zusammenhang stehen, Schlafstörungen, Schlafapnoe, Narkolepsie, Schlaflosigkeit, Parasomnie und dem Jet-lag-Syndrom.
  • Also können die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Polypeptide oder Agonisten oder dagegen gerichtete Antagonisten in Verbindung mit einem nicht sterilen oder sterilen Träger oder von Trägern zur Verwendung mit Zellen, Geweben oder Organismen, so wie ein pharmazeutischer Träger, der für die Verabreichung an ein Subjekt geeignet, ist eingesetzt werden. Derartige Verbindungen umfassen zum Beispiel einen Mediumszusatz oder eine therapeutisch wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten. Derartige Träger können Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerol, Ethanol und Kombinationen daraus einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Formulierung sollte für den Verabreichungsmodus geeignet sein.
  • Polypeptide und andere Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können allein oder zusammen mit anderen Verbindungen wie therapeutische Verbindungen eingesetzt werden.
  • Die Arzneimittel können auf jede wirksame, geeignete Weise verabreicht werden, einschließlich, zum Beispiel, topikale, orale, anale, vaginale, intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, subcutane, intranasale oder intradermale Verabreichung und andere.
  • Die Arzneimittel werden gewöhnlich in einer Menge verabreicht, die bei der Behandlung oder Prophylaxe einer spezifischen Indikation oder spezifischen Indikationen wirksam ist. Im Allgemeinen werden die Verbindungen in einer Menge von mindestens 10 μg/kg Körpergewicht verabreicht. In den meisten Fällen werden sie in einer Menge nicht über etwa 8 mg/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht werden. Vorzugsweise liegt die Dosis in den meisten Fällen bei etwa 10 μg/kg Körpergewicht bis etwa 1 mg/kg Körpergewicht täglich. Es ist selbstverständlich, dass die optimale Dosierung durch Standardverfahren für jede Behandlungsmodalität und Indikation bestimmt wird, wobei die Indikation, deren Schwere, die Verabreichungsform, komplizierende Bedingungen und dergleichen berücksichtigt werden.
  • BEISPIELE: BIOLOGISCHE VERFAHREN
  • Bestimmte hier verwendete Begriffe sind im vorangegangenen Glossar erklärt.
  • Alle Beispiele wurden, wenn nicht andernfalls detaillierter ausgeführt, unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, die dem Fachmann wohlbekannt sind und für ihn zur Routine gehören. Die molekularbiologischen Routinetechniken in den folgenden Beispielen können wie in Standard Laborhandbüchern wie Sambrook et al.: „MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL", 2. Ausg. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., hier zitiert als „Sambrook", durchgeführt werden.
  • Beispiel 1: Verfahren zur Clonierung der HFGAN72-Rezeptorliganden
  • a. Verfahren zur Clonierung der Ratten-HFGAN72-Rezeptorliganden
  • Um die vollständige Sequenz des HFGAN72-Rezeptorliganden der Ratte zu erhalten, wurde ein Intrapeptid degeneriertes RT-PCR-Verfahren verwendet.
  • Die Peptidsequenz QPLPDCCRQKTCSCRLYELLHGAGNHAGI (Aminosäure 1–29 der SEQ ID NR. 6) wurde ausgewählt, um hochdegenerierte Oligonucleotid-Primer zu entwerfen, die für die Enden der Sequenz codieren. Die Sequenzen der Primer lauteten: CAACCNCTNCCNGACTGCTG (SEQ ID NR. 13) und ATNCCNGCNGCATGATT (SEQ ID NR. 14). An Position 3 des Primers mit der SEQ ID NR. 13 kann A gegen G ausgetauscht sein. An Position 7 des Primers mit der SEQ ID NR. 13 kann C gegen T ausgetauscht sein. An Position 15 des Primers mit der SEQ ID NR. 13 kann C gegen T ausgetauscht sein. An Position 18 von SEQ ID NR. 13 kann C gegen T ausgetauscht sein. An Position 12 des Primers mit der SEQ ID NR. 14 kann A gegen G ausgetauscht sein. An Position 15 des Primers mit der SEQ ID NR. 14 kann A gegen G ausgetauscht sein. Jeder dieser Austausche kann in den Primern mit der SEQ ID NR. 13 und 14 vorhanden sein. In den Nucleotidsequenzen der vorstehenden Primer steht das Symbol „N" für A,C,G oder T. Das cDNA-Fragment, welches das Peptid codiert, wurde durch RT-PCR aus RNA aus Rattenhirn erhalten und durch Nucleotidsequenzierung bestätigt.
  • 5'-RACE
  • Basierend auf der Sequenz des vorstehenden RT-PCR-Produkts wurde ein nichtdegenerierter Oligonucleotid-Primer (#1, GTT GCC AGC TCC GTG CAA CAG TTC GTA GAG-ACGG, SEQ ID NR. 15) entworfen und in einer 5'-RACE-Reaktion verwendet. Aus Rattenhirn PolyA+-RNA wurde doppelsträngige cDNA synthetisiert, an den Marathon Adaptor (Clontech) ligiert und als Matrize für die initiale 5'-RACE-Reaktion mit den Primern Adaptor-Primer 1 (Clontech) und #1 verwendet. Eine ineinandergesetzte ("nested") PCR Reaktion wurde durchgeführt mit einem Oligonucleotid CGG CAG GAA CAC GTC TTC TGG CG (#2, SEQ ID NR. 16) und dem Adaptor-Primer 2. Es wurde ein ungefähr 250-bp umfassendes 5'-cDNA-Produkt, welches das Peptid korrekt codiert, erhalten.
  • 3'-RACE
  • Es wurden zwei zusätzliche Oligonucleotide entworfen, TCC TTG GGT ATTT-GGA CCA CTG CAC CGA AG (#3, SEQ ID NR. 17) und ATA CCA TCT CTC C-GG ATT GCC TCT CCC TGA (#4, SEQ ID NR. 18), die einem Teil des vermeintlichen 5'-nichtcodierenden Bereichs der cDNA-Sequenz, die durch die vorstehende 5'-RACE-Reaktion erhalten wurde, entsprechen. Einzelsträngige Rattenhirn cDNA wurde unter Verwendung eines Oligonucleotids CCT CTG AAG GTT CCA GAA TCG ATA GTAN (SEQ ID NR. 19) als ein spezifischer Primer für die Reverse Transkription synthetisiert und als Matrize für eine 3'-RACE unter Verwendung von #3 und einem Anker-Primer (CCT CTG AAG GTT CCA GAA TCG ATAG, SEQ ID NR. 20) verwendet. An Position 27 des Oligonucleotids mit der SEQ ID NR. 19 kann A gegen entweder C oder G ausgetauscht sein. In der Nucleotid-Sequenz des Oligonucleotids mit der SEQ ID NR. 19 steht „N" für ein A, C, G oder T. Das Produkt wurde unter Verwendung von #4 und dem gleichen Anker-Primer einer ineinandergesetzten ("nested") PCR-Reaktion unterworfen. Ein einzelnes 0,6 kb-Produkt, das die korrekte 5'-cDNA-Sequenz enthielt, wurde erhalten. Die vollständige Sequenz wurde bestätigt mit cDNA-Produkten, die aus drei unabhängigen initialen 3'-RACE-Reaktionen erhalten wurden.
  • b. Clonierungsverfahren der HFGAN72-Rezeptorliganden des Menschen und der Maus
  • Schätzungsweise jeweils 1,2 Millionen Plaques aus menschlichen (Clontech) und Maus (Stratagene) Genombibliotheken wurden anhand von Standard-Plaque-Hybridisierung durchmustert. Ein vollständiges (ca. 0,5 kb) Ratten cDNA-Insert, das beide HFGAN72-Rezeptorliganden, Lig 72 a und Lig 72b codierte, wurde durch das „Random-Priming"-Verfahren 32P-markiert und als Sonde verwendet. In der Hybridisierung positive Phagen wurden Plaque-gereinigt und genomische DNA-Fragmente, die Exons von HFGAN72-Rezeptorliganden enthielten, wurden durch Southern-Blot identifiziert und für weitere Analysen in Plasmidvektoren subcloniert. Die vollständige Nucleotid-Sequenz des genomischen Fragments wurde zusammengesetzt aus Sequenzen der überlappenden Subclone und die Sequenzen wurden durch „Primer-Walking" erhalten.
  • Beispiel 2: Reinigung von HFGAN72-Rezeptorliganden
  • Etwa 220 g gefrorenes Hypothalamusgewebe vom Rind oder gefrorenes Rattenhirngewebe, gekauft von Pel-Freez (Rogers, AR), wurden bei Zimmertemperatur im 10-fachen Volumen 70 % (Volume/Volume) Aceton/1M Essigsäure/20 mM HCl durch ein Polytron (15 mm Durchmesser) homogenisiert. Die Homogenisate wurden über Nacht bei 4°C aufbewahrt, um große Proteine zu präzipitieren.
  • Am folgenden Tag wurden die Homogenisate bei 20.000 × g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die Zentrifugation wurde solange wiederholt, bis alle sichtbaren nichtlöslichen Materialien aus dem Überstand entfernt waren. Dann wurde der Überstand in mehrere große Glasflaschen aliquotiert und es wurde ein gleiches Volumen Diethyläther in jede Flasche zugegeben. Die Mischung wurde für 1–2 Minuten kräftig geschüttelt und die zwei Phasen konnten sich für 30 Minuten bei Zimmertemperatur trennen. Die untere wässrige Phase (die trüb erscheint) wurde in frische Flaschen überführt und die Ätherextraktion wurde noch zwei weitere Male wiederholt, um jegliches Aceton zu entfernen. Nach den Extraktionen wurde die wässrige Phase 30 Minuten mit 20.000 × g bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde erneut zentrifugiert, um alle nicht-löslichen Materialien zu entfernen. Der finale Überstand (schätzungsweise 500–600 ml) wurde dann durch einen Netzfilter (Falcon Cell Strainer, Becton Dickinson, Co., Oxnard, CA) in eine Glasflasche gefiltert. Das Filtrat wurde dann mit einem gleichen Volumen H2O bei Zimmertemperatur verdünnt und direkt auf zwei 10-Gramm-Kartuschen mit SepPaqk C18 (insgesamt 20 Gramm Kartuschenmaterial), die mit 0,1 % (Volumen/Volumen) Trifluoressigsäure (TFA) voräquilibriert waren, geladen. Durch Anlegen eines leichten Vakuums an die Kartuschen, wurde die Durchflussrate so aufrechterhalten, dass die einzelnen Tropfen am Kartuschenausgang noch sichtbar waren. Jede Kartusche wurde mit 100 m15 % CH3CN/0,1 % TFA gewaschen und dann mit 30 ml 50 % CH3CN/0,1 % TFA eluliert. Die ersten sechs Milliliter des Eluats wurden verworfen. Das restliche Eluat wurde in einem silikonisierten Glaskolben über Nacht lyophilisiert.
  • Das lyophilisierte Material wurde in 24 ml 1 M Essigsäure durch Ultraschalleinwirkung für 10–20 Minuten oder bis kein unlösliches Material mehr sichtbar war, gelöst. Der Extrakt wurde dann durch einen 20-Mikrometer Mirex GV Spritzenfilter (Millipore, Bedford, MA) gefiltert. Die Hälfte (12 ml) des gefilterten Extrakts wurde direkt auf eine C18 Umkehrphasen-HPLC-Säule (Vydac 218TP510; 5 Mikrometer; 10 mm × 250 semiprep; Hesperia, CA) geladen, die mit 3 % CH3CN/0,1 % TFA bei einer Durchflussrate von 3 ml/Minute bei Zimmertemperatur voräquilibriert worden war. Die Probe wurde in vier 3 ml-Einzelgaben über eine große Probenschleife (5 ml oder größer) geladen. Dann wurde für 100 Minuten ein 10–40%-Gradient von CH3CN in 0,1 % TFA angelegt. Fraktionen von 3 ml (oder 1 Minute) wurden in silikonisierte 5 ml Glasröhrchen gesammelt. Die gleiche HPLC wurde für die verbleibende Hälfte des Extrakts noch einmal wiederholt. 60 ml (1/50) von jeder Faktion wurden aufbewahrt und mit 293/HFGAN72-Zellen wie in Beispiel 2 auf Ca-Transienten untersucht.
  • Die aktiven Fraktionen wurden gepoolt und direkt auf eine Kationenaustauscher-HPLC-Säule (TosoHaas SP-5PW; 7,5 mm × 75 mm, Montgomeryville, PA), die mit 20 mM Na-Phosphat (pH 3,0)/30 % CH3CN bei Zimmertemperatur voräquilibriert wurde. Ein 0–0,5 M Gradient von NaCl in 20 mM Na-Phosphat (pH 3,0)/30 % CH3CN wurde für 60 Minuten bei einer Durchflussrate von 1 ml/Minute angelegt. 1 ml-Fraktionen wurden gesammelt und 30 μl jeder Fraktion wurden für den Ca-Test verwendet.
  • Die aktiven Fraktionen (2–3 Fraktionen; 2–3 ml) wurden gepoolt und mit 0,1 % TFA vierfach verdünnt. Die verdünnte Probe wurde direkt auf eine analytische C18 Umkehrphasen-Säule (Vydac 218TP54; 4,6 mm × 250 mm), die mit 3 % CH3CN/0,1 % TFA bei einer Durchflussrate von 1 ml/Minute voräquilibriert worden war, geladen. Die Säule wurde mit einem Säulenheizer auf 40°C gehalten. Für 75 Minuten wurde ein 21–36 %-Gradient von CH3CN in 0,1 % TFA angelegt. Einzelne Peaks (kontrolliert bei einer Absorption von 210 nm) wurden manuell in silikonisierte 5 ml-Glasröhrchen gesammelt und 30 μl jeder Fraktion wurden getestet. An dieser Stelle war der aktive Peak schon >70–80 % rein.
  • Der aktive Peak (etwa 1 ml) wurde mit 0,1 % TFA vierfach verdünnt und direkt auf die gleiche C18 Säule geladen, aber diesmal wurde diese mit 3 % CH3CN/20 mM Tris-HCL (pH 7,0 bei 40°C) voräquilibriert. Für 74 Minuten wurde bei 40°C ein 3–40 %-Gradient von CH3CN in 20 mM Tris-HCl (pH 7,0) angelegt. Der Hauptpeak bei 210 nm wurde manuell gesammelt.
  • An dieser Stelle sollte die Probe schon rein sein. Um die Reinheit zu überprüfen sowie das Material zu entsalzen wurde der aktive Peak (etwa 800 μl) mit 0,1 % TFA vierfach verdünnt und direkt auf eine C8 Umkehrphasen-Säule (Vydac 228TP104; pH-konstant beschichtet; 4,6 mm × 250 mm), die mit 3 % CH3CN/0,1 % TFA bei einer Durchflussrate von 1 ml/Minute voräquilibriert worden war. Für 66 Minuten wurde bei 40°C ein 3–36 %-Gradient von CH3CN in 0,1 % TFA angelegt. Der einzelne 210 nm-Peak wurde manuell gesammelt. Die biologische Aktivität wurde bestätigt. Das vorstehende Verfahren wurde verwendet, um Lig 72a zu reinigen.
  • Lig 72b wurde gefunden und gereinigt durch Synthetisieren des Peptids ausgehend von der cDNA-Sequenz und Testen des synthetisierten Produkts.
  • Beispiel 3: Ca-Test für Lig 72a und Lig 72b
  • Der Ca-Test wurde durchgeführt in Übereinstimmung mit Verfahren, die beschrieben wurden von Sakuri et al., Nature (1990), 348: 732–735. Für den Test wurde ein kleiner Teil jeder HPLC-Fraktion in ein silikonisiertes 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt und unter Vakuum vollständig getrocknet. Das getrocknete Material wurde in 20 ml Ca-Test-Puffer (140 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM Na2HPO4/1 mM MgCl2, 1,25 mM CaCl2, 11 mM Glucose, 5 mM HEPES (pH 7,4) und 0,2 % Rinderserumalbumin) durch dreiminütiges Vortexen aufgenommen. Für jeden Testpunkt wurden 10 μl der rekonstituierten Lösung verwendet. In Übereinstimmung mit Standardverfahren wurden die Zellen mit Fura-2/AM beladen. Es wurde ein Jasco CAF-110 Analysegerät für intrazelluläre Ionen (Easton, MD) mit 0,5 ml-Testküvetten verwendet. 293/HFGAN72-Zellen und nicht-transfizierte 293-Zellen wurden parallel analysiert, um die Spezifität der Antwort sicherzustellen. Endothelin-1 (Endkonzentration 1–100 nM) wurde als Liganden Positivkontrolle verwendet.
  • Beispiel 4: Bestimmung der Aminosäure-Sequenzen von Lig 72a und Lig 72b
  • Ein Lys-C-Verdau des reduzierten und alkylierten Lig 72a in 50 mM Tris-Puffer, pH 9,0 wurde für die Sequenzanalyse verwendet. Eine Hälfte der Probe (schätzungsweise 25 μl) wurde gereinigt und auf einer mit Poros RII-Harz gepackten Microsäule konzentriert. Die Peptide wurden eluiert mit 2 l 70 % Methanol, 5 % Ameisensäure und in eine Nanoelektrosprühnadel überführt. Die Probe wurde unter Verwendung der Nanoelektrosprühionisierung in einem PE-Sciex dreifach Quadrupol-Massenspektrometer analysiert. Ein einziges Peptid mit einem Molekulargewicht von 1286,6 wurde beobachtet. Dieses Peptid wurde unter Verwendung der kollisionsinduzierten Dissoziations (CID)-Tandemmassenspektrometrie (MS/MS) sequenziert. Um die Interpretation der Daten zu erleichtern, wurden in der Elektrosprühquelle auch Fragmente des Peptids erzeugt, die anschließend durch CID-Tandem-MS (eine als MS bezeichnete Technik) sequenziert wurden.
  • Die Fragmente, die erzeugt wurden, unterschieden sich voneinander durch den Verlust sukzessiver N-terminaler Aminosäuren, angefangen mit dem des 3-Peptidfragment und weiter bis zum des 5-Fragment.
  • Lig 72b wurde durch direkte Edman-Sequenzierung unter Verwendung eines Hewlett Packard G1000A Proteinsequencers, ausgestattet mit angeschlossener Pth (Phenylthiohydantoin)-Aminosäureanalyse, identifiziert. Das Molekulargewicht des Peptids wurde durch Matrix-gestützte Laserdesorption-Ionsierungsmassenspektrometrie (MALDI-MS) auf 2935,9 Da bestimmt, was darauf hindeutet, dass das prozessierte Peptid vollständig und am C-terminalen Rest amidiert vorlag.
  • Beispiel 5: Gewebelokalisationsdaten für Lig 72a
  • a. Immunhistochemieverfahren
  • Die Lokalisation des Lig 72a-Peptids wurde durchgeführt unter Verwendung von Standardtechniken zur indirekten Immunfloureszenz. Kurz gesagt wurden Ratten transcardial mit 500 ml 4 % Paraformaldehyd (Sigma) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) perfusionsfixiert. Die Rattenhirne wurden entnommen und im gleichen Fixativ über Nacht gelagert. In Intervallen von 1 mm wurden coronale Schnitte (50 μm) aus den Vor-, Mittel- und Hinterhirnregionen angefertigt und in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) gesammelt. Die Schnitte wurden für fünf Stunden bei Zimmertemperatur mit polyclonalen Kaninchen-Antikörpern gegen das 33 Aminosäuren umfassende Lig 72a Peptid (1:100 Verdünnung in PBS mit 0,1 % Triton X-100 (Sigma)) inkubiert. Kontrollen für die Spezifität der Lokalisation wurden erzeugt durch Inkubieren serieller Schnitte entweder mit Puffer oder normalem Kaninchenserum (1:100 Verdünnung) oder mit Antiserum, das mit einem Überschuss an Lig 72a Peptid oder Lig 72b Peptid voradsorbiert worden war. Die Schnitte wurden dreimal in PBS gewaschen und dann mit Texas-Rot-konjugiertem Ziegeanti-Kaninchen Zweitantikörper (Vector Labs., 30 μg/ml in PBS mit 0,1 % Triton X-100) inkubiert. Die Schnitte wurden dreimal in PBS gewaschen, auf Gelatine-beschichtete Objektträger aufgebracht, unter Verwendung von Vectashield Eindeckelmedium (Vector Labs.) eingedeckelt und unter einem Fluoreszenzmikroskop (Leica DMRB, Anregung bei 596 nm, 615 nm Emission), das an ein Ultrapix 400 CCD Kamerasystem (Astrocam) angeschlossen war, unter Verwendung der DataCell Bildauflösungsmöglichkeiten und der Optimas Software untersucht.
  • b. Lig 72a Gewebelokalisationsdaten und mögliche therapeutische Folgerungen
  • Die Verwendung des vorstehenden immunhistochemischen Verfahrens ergab Informationen über die Lokalisation von Lig 72a im Gehirn. Lig 72a wird im Hypothalamus (Zellkörper und Nervenendigungen) exprimiert, der in Zusammenhang steht mit hormoneller Kontrolle, Ernährung, Sexualverhalten und Temperaturkontrolle. Es wird angenommen, dass der Hypothalamus mit den folgenden Neurotransmittersystemen interagiert: 5-HT, DA und Neuropeptide. Aufgrund der Lokalisation von Lig 72a im Hypothalamus (Zellkörper und Nervenendigungen) wird angenommen, dass Lig 72a eine Rolle spielen könnte bei der Vorbeugung, Verbesserung oder Korrektur von Dysfunktionen und Erkrankungen, einschließlich, aber nicht ausschließlich, Depressionen, Angstzustände, obsessive kompulsive Störung, Affektneurose/-Störung, depressive Neurose/Störung, Angstneurose, Dysthymie, Verhaltensstörung, affektive Psychose, psychosexuelle Dysfunktion, Geschlechtsstörung, sexuelle Störung, einem gestörten biologischen und zirkadianen Rhythmus, Essstörungen wie Anorexie, Bulimie, Kachexie und Obesität, Cushing-Syndrom/-Krankheit, basophiles Adenom, Prolaktinom, Hyperprolaktinämie, Hypopituitarismus, Hypophysentumor/-adenom, Hypothalamuserkrankungen, Fröhlich-Syndrom, Adenohypophysenerkrankung, Hypophysenerkrankung, Hypophysenwachstumshormon, Adenohypophysenhypofunktion, Adenohypophysenhyperfunktion, Hypothalamus-Hypogonadismus, Kallman-Syndrom (Ansomnie, Hyposmie), funktionale oder psychogene Amenorrhoe, Hypothalamus-Hypothyreose, Hypothalamus-Nierenstörung, idiopathische Hyperprolaktinämie, Hypothalamus-Störungen durch Wachstumshormon-Defizienz, idiopathische Wachstumshormon-Defizienz, Minderwuchs, Gigantismus, Acromegalie und andere.
  • Lig 72a wird auch in der Raphe (Nervenendigungen) exprimiert, die mit dem Geruchsinn und Nozizeption in Zusammenhang steht. Es wird angenommen, dass die Raphe (Nervenendigungen) mit dem 5-HT Neurotransmittersystem interagiert. Aufgrund der Lokalisation von Lig 72a in der Raphe (Nervenendigungen) wird angenommen, dass Lig 72a eine Rolle spielen könnte bei der Vorbeugung, Verbesserung oder Korrektur von Dysfunktionen oder Erkrankungen einschließlich, aber nicht ausschließlich, Depression, Angstzustände, Affektneurose/-Störung, depressive Neurose/Störung, Angstneurose, Dysthymie, Verhaltensstörung, affektive Psychose, obsessive kompulsive Störung, gestörte biologische und zirkadiane Rhythmen und Schlafstörungen, die mit Erkrankungen wie neurologischen Erkrankungen, Herz- und Lungenerkrankungen, mentalen Erkrankungen und Abhängigkeiten einhergehen, und andere.
  • Lig 72a wird auch in der zentralen Grauen Substanz (Nervenendigungen) exprimiert, die mit Nozizeption und Schlaflosigkeit in Zusammenhang steht. Es wird angenommen, dass die zentrale Graue Substanz mit den folgenden Neurotransmittersystemen interagiert: 5-HT, NA, Adr und Ach. Aufgrund der Lokalisation von Lig 72a in der zentralen Grauen Substanz (Nervenendigungen) wird angenommen, dass Lig 72a eine Rolle spielen könnte bei der Vorbeugung, Verbesserung und Korrektur von Dysfunktionen und Erkrankungen, einschließlich, aber nicht ausschließlich, Migräne, vermehrte oder übersteigerte Schmerzempfindlichkeit wie Hyperalgesie, Kausalgie und Allodynie, akuter Schmerz, Verbrennungsschmerz, atypischer Gesichtsschmerz, neuropathischer Schmerz, Rückenschmerz, komplexes regionales Schmerz-Syndrom I und II, Arthroseschmerz, Schmerz nach Sportverletzungen, Schmerz verbunden mit Infektionen, z.B. HIV, Post-Polio-Syndrom und Post-Herpes-Neuralgie, Phantomschmerz, Arbeitsschmerz, Krebsschmerz, Schmerz nach Chemotherapie, Schmerz nach Schlaganfall, postoperativer Schmerz, Neuralgie und Narkosetoleranz oder Narkoseunverträglichkeit und andere.
  • Lig 72a wird auch im Locus coeruleus (Nervenendigungen) exprimiert, der mit Schlaf/Wach-Mustern in Zusammenhang steht. Es wird angenommen, dass der Locus coeruleus (Nervenendigungen) mit den Neurotransmittersystemen NA und GABA interagiert. Aufgrund der Lokalisation von Lig 72a im Locus coeruleus (Nervenendigungen) wird angenommen, dass Lig 72a eine Rolle spielen könnte bei der Vorbeugung, Verbesserung oder Korrektur von Dysfunktionen oder Erkrankungen einschließlich, aber nicht ausschließlich, Schlafstörungen, Schlafapnoe, Narkolepsie, Schlaflosigkeit, Parasomnie, Jet-lag-Syndrom, Müdigkeit, einem gestörten biologischen und zirkadianen Rhythmus und Schlafstörungen, die mit Erkrankungen wie neurologischen Störungen, Herz- und Lungenerkrankungen, Geisteskrankheit und Abhängigkeiten in Zusammenhang stehen, und andere.
  • Lig 72a wird auch im mesencephalen trigeminalen Nucleus (Nervenendigungen) exprimiert, der mit Nozizeption in Zusammenhang steht. Es wird angenommen, dass der mesencephale trigeminale Nucleus (Nervenendigungen) mit den Neurotransmittersystemen NA und GABA interagiert. Aufgrund der Lokalisation von Lig 72a im mesencephalen trigeminalen Nucleus (Nervenendigungen) wird angenommen, dass Lig 72a eine Rolle spielen könnten bei der Vorbeugung, Verbesserung oder Korrektur von Dysfunktionen oder Erkrankungen einschließlich, aber nicht ausschließlich, Migräne, vermehrte oder übersteigerte Schmerzempfindlichkeit wie Hyperalgesie, Kausalgie und Allodynie, akuter Schmerz, Verbrennungsschmerz, atypischer Gesichtsschmerz, trigeminale Neuralgie, neuropathischer Schmerz, Rückenschmerz, komplexes regionales Schmerz-Syndrom I und II, Arthroseschmerz, Schmerz nach Sportverletzungen, Schmerz verbunden mit Infektionen, z.B. HIV, Post-Polio-Syndrom und Post-Herpes-Neuralgie, Phantomschmerz, Arbeitsschmerz, Krebsschmerz, Schmerz nach Chemotherapie, Schmerz nach Schlaganfall, postoperativer Schmerz, Neuralgie, Narkosetoleranz oder Narkoseunverträglichkeit und andere.
  • Lig 72a wird auch in der Amygdala (Zellkörper) exprimiert, die mit Aggression und Angstzuständen in Zusammenhang steht. Es wird angenommen, dass die Amygdala (Zellkörper) mit den folgenden Neurotransmittersystemen interagiert: 5-HT und Neuropeptide. Aufgrund der Lokalisation von Lig 72a in der Amygdala (Zellkörper) wird angenommen, dass Lig 72a ein Rolle spielen könnten bei der Vorbeugung, Verbesserung oder Korrektur von Dysfunktionen oder Erkrankungen einschließlich, aber nicht ausschließlich, Depressionen, Angstzustände, Affektneurose/-Störung, depressive Neurose/Störung, Angstneurose, Dysthymie, Verhaltensstörung, affektive Psychose, Epilepsie, Wachstumsstörungen und andere.
  • Außerdem wird Lig 72a im retrosplenialen Cortex (Zellkörper) exprimiert, der mit sensorischen/thalamischen Funktionen in Zusammenhang steht. Es wird angenommen, dass der retrospleniale Cortex (Zellkörper) mit den Neurotransmittersystemen Glu, Gly, Ach und GABA interagiert.
  • Lig 72 a wird auch im occipitalen Cortex (Zellkörper) exprimiert, der mit sensorischen/IC/geniculaten Funktionen in Zusammenhang steht. Es wird angenommen, dass der occipitale Cortex (Zellkörper) mit den Neurotransmittersystemen Glu, Gly, Ach und GABA interagiert.
  • Außerdem wird Lig 72a im temporalen Cortex (Zellkörper) exprimiert, der mit dem primären visuellen Cortex in Zusammenhang steht. Es wird angenommen, dass der temporale Cortex (Zellkörper) mit den Neurotransmittersystemen Glu, Gly, Ach und GABA interagiert.
  • Beispiel 6: Lig 72a Fütterungsstudien
  • a. Akute Effekte der icv Verabreichung von Lig 72a auf das Essverhalten von übersättigten Ratten
  • 1. Tiere
  • Männliche Spraque-Dawley Ratten (260–290 g bei Ankunft) wurden von den Charles River Aufzuchtlaboren bezogen. Sie wurden für mindestens fünf Tage zu fünft in Gruppen bei kontrollierten Licht- (12 h Licht/Dunkel-Zyklus) und Temperaturbedingungen (21°C ± 2) gehalten. Futter (Futterpellets) und Wasser war ad libitum verfügbar.
  • 2. Chirurgische Präparation
  • Alle Ratten (300g) wurden ungefähr eine Stunde vor der Narkose mit Domitor (0,04 ml/100 g i.m. oder s.c.) und Sublimase (0,9 ml/100g i.p.), mit Synulox (0,1 ml/100 g s.c.) vorbehandelt. Die Ratten wurden in eine stereotaxische Vorrichtung eingesetzt und ihnen wurde unter sterilen Bedingungen eine Führungskanüle in den lateralen Hirnventrikel implantiert. Die Koordinaten, die verwendet wurden, um die korrekte Positionierung des Implantats zu planen, waren: 0,8 mm posterior zum Bregma, 1,6 mm lateral der Mittellinie und 4,5 mm ventral zur Schädeloberfläche, die Schnittlinie wurde 3,2 mm unter der intraauriculären Linie gesetzt. Nach der Operation wurde Zenecarp als Analgetikum gegeben (0,03 ml/100 g s.c.) und die Betäubung wurde unter Verwendung von Antisedan und Nubain (50:50 % v/v 0,02 ml/100 g i.p.) aufgelöst. Die Ratten wurden dann einzeln für eine Erholungsdauer von mindestens fünf Tagen unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend gehalten und die Körpergewichte wurden für die Fortdauer der Studie täglich überprüft. Nach der Erholung von der Operation wurden die Ratten in Gitterbodenkäfige überführt, so dass Messungen der Nahrungsmittelaufnahme durchgeführt werden konnten. Die Position der Kanüle wurde dann durch zentrale Verabreichung von Schweine-NPY (2,3 nmol) bestätigt. Für einen positiven Test wurden über eine Dauer von vier Stunden mindestens 5,8 g Nahrung gegessen.
  • 3. Verabreichung von Verbindungen
  • In diesen Experimenten wurden nur positiv getestete Tiere (n = 9–10) verwendet. Die Studien wurden nach einem Multidosis-Überkreuzschema durchgeführt, wobei die Folge der Dosierung unter Verwendung des "Latin-square"-Prinzips bestimmt wurde und mindestens ein Erholungstag zwischen den Verabreichungen gelassen wurde. Alle Mengen wurden in einem Volumen von 5 ml über 10 Sekunden gegeben und der Injektor blieb für weitere 60 Sekunden an Ort und Stelle, um die vollständige Verteilung des Peptids sicherzustellen. Alle icv Verabreichungen begannen um 9 Uhr und die Nahrungsaufnahme wurde initial in Intervallen von ein, zwei und vier Stunden in der ersten Studie gemessen, mit zusätzlichen Messungen nach sechs und 24 Stunden in der zweiten Studie.
  • 4. Herstellung der Verbindung
  • Lig 72a wurde in sterilem Wasser gelöst, um die höchste Dosierung herzustellen und aus dieser Stocklösung wurden die individuellen Dosierungen hergestellt. Sowohl Schweineals auch Ratten-NPY wurde bis zu einer Konzentration von 2,3 nmol in sterilem Wasser gelöst; ersteres wurde als Positivkontrolle verwendet während letzteres verwendet wurde, um die Position der Kanüle zu verifizieren. Wasser allein wurde als Lösemittelkontrolle verwendet.
  • b. Chronische Effekte der icv Infusion von Lig 72a und Lig 72b auf Essverhalten, Wasseraufnahme und BAT-Temperatur von übersättigten Ratten
  • 1. Tiere
  • Männliche Spraque-Dawley-Ratten (270–280 g bei Ankunft) wurden von den Charles River Aufzuchtlabors bezogen. Sie wurden für mindestens fünf Tage zu fünft in Gruppen bei kontrollierten Licht- (12 h Licht/Dunkel-Zyklus) und Temperaturbedingungen (21°C ± 2) gehalten. Futter (Futterpellets) und Wasser war ad libitum verfügbar.
  • 2. Chirurgische Präparation
  • Alle Ratten (300 g) wurden vor der Positionierung in einer stereotaxischen Vorrichtung mit Domitor (0,04 ml/100 g i.m. oder s.c.) und Sublimase (0,9 ml/100 g i.p.) betäubt. Eine L-förmige Führungskanüle wurde unter sterilen Bedingungen in den lateralen Gehirnventrikel implantiert. Die Koordinaten, die verwendet wurden, um die korrekte Positionierung des Implantats zu planen, waren: 0,8 mm posterior zum Bregma, 1,6 mm lateral der Mittellinie und 4,5 mm ventral zur Schädeloberfläche, die Schnittlinie wurde 3,2 mm unter der intraauriculären Linie gesetzt. Jeder Ratte wurde dann eine osmotische Minipumpe (Alzet, Model 2001, Durchflussrate 1 μl/h), die steriles Wasser enthielt, subcutan implantiert. Diese wurde über einen Katheter, der ebenfalls steriles Wasser enthielt mit der icv Kanüle verbunden. In das braune Fettgewebe (BAT) zwischen den Schulterblättern wurde dann eine Temperatursonde implantiert. Nach der Operation wurde die Betäubung unter Verwendung von Antisedan und Nubain ( 50:50 % v/v 0,02 ml/100 g i.p.) aufgehoben. Die Ratten wurden dann unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend beschrieben für eine Erholungsdauer von drei Tagen einzeln gehalten.
  • Sieben Tage nach der Operation wurden die Pumpen unter Isoflurangas entfernt und durch eine frische Pumpe ersetzt, die entweder Lig 72a (18 nmol/Tag), Lig 72b (18 nmol/Tag) oder Wasser enthielt. Die Position der Kanüle wurde am Ende des Experiments verifiziert, durch icv Verabreichung von Evans Blue Farbstoff gefolgt von der Dissektion des Gehirns, um die Färbung der Ventrikel zu kontrollieren.
  • 3. Herstellung der Verbindung
  • Sowohl Lig 72a als auch Lig 72b wurde bis zu einer Konzentration von 18 nmol/24 μl in sterilem Wasser gelöst. Wasser allein wurde verwendet, um die ersten Pumpen zu füllen und als Lösemittelkontrolle in den zweiten Pumpen. Mindestens vier Stunden vor Implantation wurden alle Pumpen an Katheter angeschlossen und bei 37°C volllaufen gelassen, um kontinuierliches Pumpen sicherzustellen und die Möglichkeit des Klumpens innerhalb der Röhre oder den Verschluß durch umliegendes Gewebe zu minimieren.
  • 4. Futter- und Wasseraufnahmen und Messungen der BAT-Temperatur
  • Nach Erholung von der Operation wurden die Ratten in Gitterbodenkäfige überführt, so dass Messungen der Futteraufnahme durchgeführt werden konnten. An drei Tagen während der Studie wurde zu verschiedenen Intervallen sowohl der Futter- als auch der Wasserverbrauch gemessen, z.B. 8–13 Uhr, 13–18 Uhr und 18–8 Uhr. Die BAT-Temperatur wurde an diesen Tagen um 13 Uhr gemessen und die Körpergewichte wurden für die Dauer der Studie täglich überprüft. Die drei Tage waren wie folgt: Tag 6 der Lösemittelinfusion (erste Pumpe), Tag 3 der Behandlung/Lösemittelinfusion (zweite Pumpe), Tag 7 der Behandlung/Lösemittelinfusion (zweite Pumpe).
  • Beispiel 7: Fortbewegungsaktivität und Putzstudien
  • a. Operation (vollständig dargestellt in SOP PSY026A)
  • Die Ratten wurden über Nacht im Operationsraum gehalten. Die Betäubung bestand aus Domitor (im)/Sublimase (ip) mit, wenn geeignet, lokaler Verabreichung von Intra-Epicaine. Die Augen wurden mit Lacrilube behandelt, um übermäßiges Austrocknen zu vermeiden. Die Operation wurde unter Verwendung von stereotaxischen Standardtechniken und unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Nach der Betäubung und der Schädelpräparation wurden an den passenden Stellen auf der Oberfläche Löcher gebohrt, um die Implantation einer unilateralen Kanüle zu ermöglichen sowie die Plazierung von Ankerschrauben (eine auf jeder Schädelplatte) für eine dentale Kopfkappe aus Acryl, welche die Führungskanüle in Position hält.
  • Die stereotaxischen Koordinaten waren (vom Schnittpunkt von Bregma und Mittellinie):
    • Schnittlinie gesetzt bei –3,2 mm,
    • anterior-posterior: –0,8 mm
    • lateral: +/– 1,5 mm (d.h. Kanüle links oder rechts der Mittellinie),
    • dorsal-ventral: –4,1 mm (von der Schädeloberfläche).
  • Ein Obturator (Kanülenattrappe) wurde in die Kanüle gesetzt, um dem Auftreten von Blockaden und dem Verlust von Ventrikelflüssigkeit vorzubeugen. Die Betäubung wurde aufgehoben und eine Analgesie wurde durch Antisedan/Nubain erreicht. Die Tiere wurde während der gesamten post-operativen Erholung in einem warmen Käfig beobachtet bis der Aufrichtungsreflex wieder einsetzte, wobei sie einzeln gehalten wurden. Die Tiere erhielten 5 Tage post-operative Pflege durch die LAS Veterinärabteilung. Die gesamten operativen Arbeiten entsprachen LAS SOP 25 (Veterinärmedizinische Verfahren).
  • b. Injektionsverfahren
  • Das nachstehend beschriebene Injektionsverfahren wurde für alle nachfolgenden Studien befolgt:
  • Die Injektionseinheit (vorher in Ethanol absolut aufbewahrt) wurde in steriler Kochsalzlösung gespült und an ein steriles Stück Portex-Verbindung angeschlossen. Die Einheit wurde dann mit einem Vetwipe abgewischt, um sie nach der Handhabung wieder zu sterilisieren. Das Verbindungsstück wurde mit steriler Kochsalzlösung ausgespült, gefüllt und an eine Hamilton-Mikrospritze aus Glas angeschlossen. 1 μl Luft wurde aufgezogen, um eine Luftblase bereitzustellen, um die Arzneimittellösung von der Kochsalzlösung zu trennen. Ein geeignetes Volumen der Arzneimittellösung wurde in das Verbindungsstück aufgezogen und die Spritze wurde in einer Mikroinfusionspumpe fixiert, die auf ein Pumpvolumen von 5 μl/min programmiert war. Die Ratte wurde sanft gehalten und die Kanülenattrappe wurde entfernt. Die Injektionseinheit wurde vollständig in die Führungskanüle bis zu deren Spitze eingeführt. 5 μl Arzneimittel wurden über eine Dauer von 60 sec injiziert und die Injektionseinheit wurde für bis zu 90 sec an Ort und Stelle gelassen, um die vollständige Diffusion des Arzneimittels zu ermöglichen. Die Injektionseinheit wurde entfernt und die Kanülenattrappe wieder eingesetzt.
  • Jegliche Reste der Arzneimittellösung wurden verworfen, das Verbindungsstück wurde mit steriler Kochsalzlösung ausgespült und die Injektionseinheit wurde mit einem Vetwipe gereinigt. Typischerweise ist das Arzneimittellösemittel sterile Kochsalzlösung obwohl, wenn nötig, destilliertes Wasser verwendet werden kann. Maximal 10 Injektionen können pro Ratte durchgeführt werden, nicht mehr als zwei pro Woche.
  • c. Bestätigung der Lage der Kanüle
  • Dieser Teil des Experiments wurde sieben Tage nach der Operation durchgeführt. Eine geeignete Lage der Kanüle wird angezeigt durch eine intensive dipsogene Antwort auf 100 ng Angiotensin II (AII) i.c.v. Um einen dipsogenen Effekt zu induzieren, wird ein Zugang zu den AII-Rezeptoren, die sich auf circumventriculären Organen um den dritten Ventrikel befinden, benötigt. Die Zeit, die über eine Dauer von fünf Minuten nach AII Gabe mit Trinken verbracht wird, wird notiert. Dies neigt dazu, ein Alles oder Nichts-Effekt zu sein aber Ratten verbringen im Durchschnitt 150s mit Trinken. Die Unfähigkeit zu Trinken (< 50 s) bei mindestens zwei separaten Gelegenheiten läßt auf eine inkorrekt placierte Kanüle schließen. Dies kann verifiziert werden durch Injektion von Cresylviolett und eine Hirnsektion.
  • d. Putz-Verfahren
  • Es wurden 17 Tiere von JH/icv/Gp01 verwendet. Die Tiere wurden zufällig einer von drei Behandlungsgruppen zugeteilt.
    • A – Lösemittel destilliertes Wasser 5μl icv,
    • B – Lig 72a 30μg in 5 μl icv,
    • C – Lig 72a 10 μg in 5 μl icv.
  • Tag 1: 6,15 mg Lig 72a wurden in 1,025 ml sterilem Wasser (Fresenius Lot Nr. 23174) gelöst, um eine 6 mg/ml Lösung (c.f. 30 μg in 5 μl) zu erhalten. Aus dieser Lösung wurden nach Bedarf serielle Verdünnungen hergestellt. Die Stocklösung wurde zur weiteren Verwendung eingefroren.
  • Tag 2: 6,26 mg Lig 72a wurden in 1,04 ml sterilem Wasser (Fresenius Lot Nr. 23174) gelöst, um eine 6 mg/ml (c.f. 30 μg in 5 μl) zu erhalten. Aus dieser Lösung wurden nach Bedarf serielle Verdünnungen hergestellt.
  • Die Tiere wurden für, eine Dauer von 15 Minuten an die Käfige gewöhnt. Nach dieser Zeit wurden die Tiere unter Verwendung des Verfahrens, das auf Seite 2 dieser LNB (LNB 96978) dargestellt ist, gespritzt und im Abstand von zwei Minuten für insgesamt eine Stunde beobachtet. Sämtliche zu beobachtenden Verhaltensweisen wurden notiert. Bei jedem Tier wurde sofort vor Verabreichung und eine Stunde danach die Rektaltemperatur gemessen.
  • e. LMA-Verfahren
  • Es wurden 12 Tiere von JH/icv/Gp01 (siehe Seite 1 dieser LNB (LNB 96978) verwendet. Die Tiere wurden zufällig einer von drei Behandlungsgruppen zugeteilt:
    • A – Lösemittel destilliertes Wasser 5μl icv,
    • B – Lig 72a 10 μg in 5 μl icv,
    • C – Lig 72a 30 μg in 5 μl icv.
  • 3,97 mg Lig 72a wurden in 0,66 ml sterilem Wasser (Arnolds Lot Nr. 022 –Verfallsdatum 09/98), um eine 6 mg/ml Lösung (c.f. 30 μg in 5 μl) zu erhalten. Aus dieser Lösung wurden nach Bedarf serielle Verdünnungen hergestellt.
  • Die Tiere wurden unter Verwendung des Verfahrens, das auf Seite 2 dieser LNB (LNB 96978) dargestellt ist, gespritzt und sofort in die Kammer zur Bestimmung der Fortbewegungsaktivität eingesetzt. Die Aktivität wurde für eine Stunde in 5-Minuten-Intervallen gemessen. Die Aktivität wurde in AM1052 Aktivitätskammern (Lipton Instruments) überwacht.
  • f. Datenanalyse
  • Die Daten wurden aufgezeichnet und die Ergebnisse wurden ausgedrückt als log10 Gesamtmittelwert von Zählungen für jede Behandlungsgruppe +/– Standardabweichung. Veränderungen wurden beurteilt unter Verwendung einer einseitigen Variantenanalyse mit post-hoc-Analyse, die unter Verwendung des Dunnett-T-Tests durchgeführt wurde.
  • Eine getrennte Analyse wurde durchgeführt für jedes der nachstehenden Datensegmente:
    • 1. Gesamtaktivität über eine Stunde (Perioden 1–12)
    • 2. Gesamtaktivität von 0 bis 30 Minuten (Perioden 1–6)
    • 3. Gesamtaktivität von 30 bis 60 Minuten (Perioden 6–12)
    • 4. Gesamtanzahl der Durchquerungen während einer Stunde (Perioden 1–12)
  • Beispiel 8: Hypothermie-Verfahren
  • Es wurden 24 JH/icv/Gp02-Ratten verwendet. Die Tiere wurden in eine von vier Behandlungsgruppen eingeteilt:
    • A – Lösemittel destilliertes Wasser 5 μl icv
    • B – Lig 72a 1,0 μg in 5 μl icv
    • C – Lig 72a 3,0 μg in 5 μl icv
    • D – Lig 72a 10,0 μg in 5 μl icv
  • 2,80 mg Lig 72a wurden in 1,40 ml sterilem Wasser (Arnolds lot nr. 022 – Verfallsdastum 09/98) gelöst, um eine 2 mg/ml Lösung (c.f. 10 μg in 5 μl) zu erhalten. Aus dieser Lösung wurden nach Bedarf serielle Verdünnungen hergestellt. Die Stocklösung wurde zur weiteren Verwendung eingefroren.
  • Die Rektaltemperatur wurde überwacht unter Verwendung eines elektrischen Thermometers (COMARK, Modell 9001), das an eine Rektalsonde (COMARK, Modell BS4937K) angeschlossen war, die ungefähr 5 cm ins Rektum eingeführt wurde und dort gelassen wurde bis ein konstanter Wert abgelesen werden konnte. Die Temperaturmessungen erfolgten 30 Minuten (–30) und direkt vor der Verabreichung von Lig 72a. Weitere Messungen erfolgten 15, 30, 45 und 60 Minuten nach Injektion.
  • a. Datenanalyse
  • Die durch das vorstehende Verfahren erhaltenen Daten wurden aufgezeichnet. Die Temperatur zu jedem Zeitpunkt wurde dargestellt gegen die Temperatur zum Zeitpunkt 0. Für jedes Tier wurde die Abnahme des Wertes "Peak" berechnet (unabhängig von der Zeit) und graphisch dargestellt. Temperaturveränderungen wurden unter Verwendung einer einseitigen Variantenanalyse mit post-hoc-Analyse beurteilt, die unter Verwendung des Dunnett-t-Tests durchgeführt wurde.
  • Beispiel 9: X-LABYRINTH ("MAZE")-Verfahren
  • a. Apparatur
  • Das X-Labyrinth ist aus schwarzem Perspex gebaut und besteht aus zwei geschlossenen Armen, die 42 cm lang, 15 cm breit und 11 cm hoch sind, und zwei offenen Armen mit der gleichen Länge und Breite aber mit einer Wand, die nur 1 cm hoch ist. Die Arme sind in x-Form angeordnet, so dass sie einander direkt gegenüber liegen.
  • b. Verfahren
  • Es wurde herausgefunden, dass die Leistung der Ratten sehr stark von einer Reihe externer Faktoren abhängig ist, z.B. Lichtmengen und räumliche Position der Arme des Labyrinths. Ein Lichtüberschuss im Arm kann in der Ratte Angst auslösen und daher die Ratte veranlassen, den gegenüberliegenden Arm zu betreten. Also muss die Lichtmenge so ausgewogen wie möglich sein. Deshalb wurde vor der Untersuchung von Lig 72a ein Versuch durchgeführt, um zu überprüfen, ob die Versuchsparameter, z.B. Lichtmengen und räumliche Positionen akzeptabel waren.
  • c. Experiment 1
  • Es wurden 10 männliche SD-Ratten (Charles River, UK, Ankunftsdatum 4. September 1997) verwendet. Die Lichtmengen wurden unter Verwendung eines IsoTech IS350 Lichtmeßintruments gemessen. Die Messungen waren wie folgt: Mitte: 315
    offener Arm, Ende 1 – 296 geschlossener Arm, Ende 1 – 250
    offener Arm, Ende 2 – 314 geschlossener Arm, Ende 2 – 261
  • Die Aktivität wurde automatisch unter Verwendung eines Videotrack Datenaufnahmesystems (CPL systems, UK) gemessen.
  • d. Experiment 2
  • Es wurden 40 JH/icv/Gp03-Ratten verwendet. Die Tiere wurden in eine von drei Behandlungsgruppen eingeteilt:
    • A – Lösemittel destilliertes Wasser 5 μl icv (N = 10)
    • B – Lig 72a 1,0 μg in 5 μl icv (N = 10)
    • C – Lig 72a 10,0 μg in 5 μl icv (N = 10)
  • 2,72 mg Lig 72a wurden in 1,36 ml sterilem Wasser (Arnolds Lot Nr. 022 – Verfallsdatum 09/98) gelöst, um eine 2 mg/ml Lösung (c.f. 10 μg in 5 μl) zu erhalten. Aus dieser Stocklösung wurden nach Bedarf serielle Verdünnungen hergestellt. Die Stocklösung wurde zur weiteren Verwendung eingefroren.
  • Den Tieren wurde die Testverbindung verabreicht und fünf Minuten später wurden sie in den mittleren Teil des X-Labyrinths gesetzt. Die Aktivität der Tiere wurde für eine Dauer von fünf Minuten unter Verwendung eines Videotrack Datenregistriersystems (CPL systems, UK) verfolgt. Die Daten wurden auch auf Videokassetten aufgezeichnet, um wenn nötig eine nachträgliche Versuchsanalyse zu ermöglichen.
  • Die folgenden Parameter wurden vom System automatisch gemessen:
    • Gesamtzeit in offenen Armen (sec)
    • Gesamtzahl der Eintritte in offene Arme
    • Gesamtzeit in geschlossenen Armen (sec)
    • Gesamtzahl der Eintritte in geschlossene Arme
    • Gesamte zurückgelegte Distanz (Meter)
    • Durchschnittliche Geschwindigkeit (m/sec)
  • Folgendes wurde ebenfalls durch das Videotrack System berechnet:
    • % Zeit in offenen Armen
    • % Eintritte in offene Arme
    • % "open end time"
    • % Eintritte am offenen Ende
  • Zusätzliche Verhaltensweisen wurden registriert. Diese Verhaltensweisen sind nachstehend gezeigt:
    • Gesamt-Putzzeit (sec)
    • Zahl der Aufrichtungen
    • Zahl der Streckversuche
    • Zahl der Kopfsenkungen
  • e. Datenanalyse
  • Die Daten wurden automatisch vom Videotrack-System registriert und für jeden vorstehenden Parameter wurden die Mittelwerte (+/– Standardabweichung) errechnet. Die Daten wurden unter Verwendung der einseitigen Variantenanalyse ausgewertet.
  • Die resultierenden Daten, die mit den vorstehenden Verfahren erhalten wurden, zeigen, dass Lig 72a durch icv Injektion in adulte Ratten nach den vorstehenden Verfahren übermäßiges Putzen induziert und zwar in einem Ausmaß, das gegenüber den Kontrollratten statistisch signifikant ist. Übermäßiges Putzen bei Nagetieren wurde als Tiermodell einer obsessiven kompulsiven Störung verwendet. Siehe z.B. Altemus et al.: „Chronic fluoxetine treatment reduces hypothalamic vasopressin secretion in vitro", Brain Research (1992), 593: 311–313. Daher stützen diese Ergebnisse die Behauptung des Anmelders, dass entweder Lig 72a oder ein Agonist oder ein Antagonist der Interaktion von Lig 72a und HFGAN72 bei der Behandlung von Personen, die an einer obsessiven kompulsiven Störung leiden, eine Rolle spielen könnte. Außerdem unterstützen die Ergebnisse dieser Putzdaten die Ergebnisse der vorstehenden Gewebelokalisationsdaten (siehe Beispiel 5), die zeigen, dass Lig 72a eine Rolle spielen könnte bei der Vorbeugung, Verbesserung oder Korrektur von Störungen oder Erkrankungen, einschließlich aber nicht ausschließlich einer obsessiven kompulsiven Störung, da Lig 72a im Hypothalamus (Zellkörper und Nervenendigungen) exprimiert wird. Wie vorstehend in Beispiel 5 in Hinsicht auf die Gewebelokalisationsdaten erklärt, steht die obsessive kompulsive Störung in Zusammenhang mit dem Hypothalamus (Zellkörper und Nervenendigungen).
  • Außerdem offenbaren die resultierenden Daten, die anhand der vorstehenden Verfahren gewonnen wurden, dass Lig 72a die Fortbewegungsaktivität in einem statistisch signifikanten Maß ansteigen läßt, wenn es in Dosierungen von 3 und 10 μg/Ratte icv in adulte Ratten injiziert wird. Diese Ergebnisse stützen die Behauptung des Anmelders, dass entweder Lig 72a, Lig 72b oder ein Antagonist oder ein Agonist der Interaktion von Lig 72a und HFGAN72 oder von Lig 72b und HFGAN72 eine Rolle spielen könnte bei der Vorbeugung, Verbesserung oder Korrektur von Dysfunktionen oder Erkrankungen, einschließlich, aber nicht ausschließlich, Schlafstörungen, Schlafapnoe, Narkolepsie, Schlaflosigkeit, Parasomnie, dem Jet-lag-Syndrom, einem gestörten biologischen und zirkadianen Rhythmus und Schlafstörungen, die unter anderem mit Erkrankungen wie neurologischen Erkrankungen, Herz- und Lungenerkrankungen, Geisteskrankheit und Abhängigkeiten in Zusammenhang stehen. Außerdem stützen die Ergebnisse dieser Fortbewegungsdaten die vorstehenden Gewebelokalisationsdaten (siehe Beispiel 5), die zeigen, dass Lig 72a eine Rolle spielen könnte bei der Vorbeugung, Verbesserung oder Korrektur von Dysfunktionen oder Erkrankungen, einschließlich, aber nicht ausschließlich, einer obsessiven kompulsiven Störung, da Lig 72a im Hypothalamus (Zellkörper und Nervenendigungen) exprimiert wird. Wie vorstehend in Beispiel 5 in Hinblick auf die Gewebelokalisationsdaten erklärt, steht der Lokus coeruleus (Nervenendigungen) in Zusammenhang mit Schlaf/Wach-Mustern.
  • Beispiel 10: Chromosomenlokalisationsdaten für Lig 72
  • Das Radiation Hybrid-Mapping zeigte, dass das menschliche Lig 72 prä-pro-Gen am stärksten mit dem MIT STS Marker WI-6595 und UTR9641 verknüpft ist. Die abgeleitete cytogenetische Lokation zwischen diesen Markern ist 17q21. Interessanterweise deutet die Lokalisation auf Chromosom 17q21 darauf hin, dass das Lig 72 prä-pro-Gen ein mögliches Gen für eine Gruppe von neurodegenerativen Störungen die zusammen „Chromosom 17-verknüpfte Demenz" genannt werden, was nosologische Entitäten wie Disinhibition-Demenz-Parkinson-Amyotrophie-Komplex (DDPAC: MIM Nr. *600274) und die "pallido-pontonigrale" Degeneration (PPND: MIM Nr. * 168610) einschließt, die allelisch sein können. Sowohl DDPAC als auch PPND wurden auf Chromosom 17q21–22 festgelegt (Wijker et al., Hum. Mol. Genet. (1996), 5: 151–154; Wilhelmsen et al., MAPtau. Ann. Neurol. (1997), 41: 139–140.
  • Beispiel 11: Lig 72a-Schlafstudien
  • a. Tiere
  • Männliche "hooded lister" Ratten (Charles River, 150–200 g bei Ankunft) wurden für mindestens 21 Tage vor Studienbeginn zu viert in Gruppen bei einem umgekehrten 12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus (6 Uhr – 18 Uhr dunkel, 18 Uhr – 6 Uhr hell) gehalten. Zugang zu Futter und Wasser war ad libidum möglich.
  • b. Chirurgische Präparation
  • Die Betäubung erfolgte mit Domitor (0,4 mg/kg i.m.) und Sublimase (0,45 mg/kg i.p.). Nach der Betäubung wurden die Ratten in eine stereotaxische Vorrichtung eingeschlossen und die Schnittlinie wurde 3,2 mm unter der intraauriculären Linie gesetzt. Unter sterilen Bedingungen wurde eine Führungskanüle mit Halterungs ("keeper")-Kanüle unter Verwendung der folgenden Koordinaten: 0,8 mm posterior des Bregma, –1,6 mm lateral der Mittellinie und 4,5 mm ventral der Schädeloberfläche, in den lateralen Hirnventrikel implantiert. Silberchlorid-Ballelektroden zur EEG-Aufzeichnung wurden durch Bohrlöcher im Schädel über dem linken/rechten frontalen Cortex und dem linken rechten occipitalen Cortex implantiert. Silberelektroden für EMG-Aufzeichnungen wurden auch in der rechten/linken Nackenmuskulatur placiert. Alle Elektroden wurden an einen sechspoligen Verbindungsblock gelötet und mit Dentalzement und drei cortikalen Schrauben an Ort und Stelle gesichert. Nach dem Vernähen des Schnittes wurde die Betäubung mit Antisedan (1 mg/kg s.c.) und Nubain (2 mg/kg s.c.) aufgelöst. Die Tiere durften sich in einem geheizten Inkubator erholen bis der Aufrichtungsreflex wieder einsetzte und die Nahrungsaufnahme einsetzte.
  • Nach der Erholung wurden die Tiere in Paaren gehalten. In den nächsten sieben Tagen oder bis sich das Körpergewicht auf Werte vor der Operation einstellte wurden keine Verfahren durchgeführt.
  • Die Position der Kanüle wurde verifiziert durch eine intensive dipsogene Antwort auf 100 ng Angiotensin II, die in den lateralen Ventrikel infundiert wurden.
  • c. Schlafstudien-Verfahren
  • Während den Schlafstudien wurden die Ratten einzeln gehalten und sie durften sich mindestens sechs Stunden an die neue Umgebung gewöhnen. Die Studie wurde auf der Basis randomisierter Überkreuzung entworfen, wobei jedes Tier im Abstand von sieben Tagen sowohl das Lösemittel als auch eine Einzeldosis Lig 72a erhielt. Lösemittel (steriles Wasser) oder 1 (n = 6), 10 (n = 9) oder 30 μg (n = 6) Lig 72a wurde in einem Volumen von 2,5 μl icv am Beginn des normalen Schlafzyklus (18 Uhr) der Ratten verabreicht. Die Zahlen der Ratten in den Lösemittelgruppen waren gleich denen in den entsprechenden Behandlungsgruppen. Lig 72a löst sich bei einem sehr niedrigen pH-Wert (2–3) in Wasser. Dieser pH-Wert wurde durch Zugabe von Natriumhydroxid auf pH 5–6 rückgepuffert. Die EEG- und EMG-Signale wurden über Leitungen, die an den sechspoligen Verbindungsblock angefügt waren, auf den PC übertragen. Ein Drehmechanismus ermöglichte die Bewegungsfreiheit der Tiere. Am Ende des Aufzeichnungszeitraumes kamen die Ratten wieder in ihre Käfige zurück.
  • d. Datenanalyse
  • Während der 12 stündigen Schlafdauer wurden kontinuierlich 10-Sekunden Zeitabschnitte von EEG- und EMG-Signalen aufgenommen ("Sleep-Stage-Capture" v3,03, geschrieben im Haus). Die prozentuale Zeit in jedem der vier Schlafstadien (Erwachen, Kurzwellenschlaf (SWS) 1 und 2 und REM-Schlaf (PS)) wurde über einstündige Zeiträume errechnet (("Sleep-Stage-Capture" v3,03, geschrieben im Haus). Die Daten sind für alle vier Schlafstadien als Bereich unter der Kurve (AUC) über den Zeitraum 2–3 Stunden nach Verabreichung dargestellt.
  • e. Ergebnisse
  • In Tabelle 1 sind die Daten dargestellt, die zeigen, dass Lig 72a einen Dosisabhängigen Anstieg des Erwachens für bis zu drei Stunden nach Verabreichung auslöst. Es scheint, dass bei der höchsten Dosierung (30 μg) dieser Anstieg des Erwachens hauptsächlich einer Verringerung des REM-Schlaf und auch des SWS 2 zuzuschreiben ist. Der Anteil des SWS 1 blieb in allen Behandlungsgruppen unverändert. Es konnte keine signifikante Veränderung der Anteile der Schlafstadien durch das Lösemittel über einen Zeitraum von 4-12 Stunden nach Verabreichung beobachtet werden.
  • Tabelle 1: AUC (Mittelwert +/– Standardabweichung) für jedes Schlafstadium während der zweiten und dritten Stunde nach Verabreichung. Die statistische Signifikanz (* = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001 wurde bestimmt durch einseitige ANOVA, wobei mit Lig 72a behandelte Gruppen mit den entsprechenden Lösemittel-Gruppen verglichen wurden.
  • Werte in Klammern repräsentieren % Veränderung gegenüber der entsprechenden Lösemittel-Gruppe („+" repräsentiert einen Anstieg und „-" einen Abfall).
  • Figure 00460001
  • Die vorstehende Beschreibung offenbart die Erfindung vollständig, einschließlich deren bevorzugte Ausführungsformen. Modifikationen und Verbesserungen der Ausführungsformen, die hier spezifisch offenbart wurden, liegen innerhalb des Geltungsbereichs der folgenden Patentansprüche. Ohne eine weitere genaue Darlegung wird angenommen, dass ein Fachmann unter Verwendung der vorangegangenen Beschreibung die vorliegende Erfindung in ihrem weitesten Ausmaß gebrauchen kann. Daher sollen die hier bereitgestellten Beispiele hauptsächlich verdeutlichend aufgefasst werden und sind nicht in irgendeiner Weise eine Beschränkung des Geltungsbereichs der vorliegenden Erfindung.
  • SEQUENZPROTOKOLL
  • (1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN
  • (i) ANMELDER
    • Jim Hagan
    • Guy Kennett
    • Saraswati Patel
    • Jonathan Terrett
    • David Piper
    • Martin Smith
    • Neil Upton
  • (ii) TITEL DER ERFINDUNG: NEUARTIGE LIGANDEN DES NEUROPEPTID-REZEPTORS HFGAN72 UND AGONISTEN ODER DEREN ANTAGONISTEN
  • (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 21
  • (iv) KORRESPONDENZ ADRESSE:
    • (A) ADRESSAT: SmithKline Beecham Corporation
    • (B) STRASSE: 709 Swedeland Road
    • (C) STADT: King of Prussia
    • (D) STAAT: PA
    • (E) LAND:
    • (F) ZIP: 19406
  • (v) COMPUTERLESBARE FORM:
    • (A) ART DES MEDIUMS: Diskette
    • (B) COMPUTER: IBM kompatibel
    • (C) BETRIEBSSYSTEM: DOS
    • (D) SOFTWARE: FastSEQ für Windows, Version 2.0
  • (vi) DERZEITIGE ANTRAGSDATEN:
    • (A) ANTRAGSNUMMER: Unbekannt
    • (B) DATUM DER EINREICHUNG: 11. Dezember 98
    • (C) KLASSIFIKATION:
  • (vi) DERZEITIGE ANTRAGSDATEN:
    • (A) ANTRAGSNUMMER: 60/069.459
    • (B) DATUM DER EINREICHUNG: 15. Dezember 97
    • (C) KLASSIFIKATION:
  • (vi) DERZEITIGE ANTRAGSDATEN:
    • (A) ANTRAGSNUMMER: 60/069.785
    • (B) DATUM DER EINREICHUNG: 16. Dezember 97
    • (C) KLASSIGFIKATION:
  • (viii) ANWALT/AGENT INFORMATIONEN:
    • (A) NAME: Hecht, Elizabeth J.
    • (B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 41.824
    • (C) REFERENZ-/LISTENNUMMER: P50745
  • (ix) TELEKOMUNIKATIONSINFORMATIONEN
    • (A) TELEFON: 610–270–5009
    • (B) TELEFAX: 610–270–5090
    • (C) TELEX:
  • (2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 1
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
    • (A) LÄNGE: 1970 Basenpaare
    • (B) TYP: Nucleinsäure
    • (C) STRANGFORM: einzel
    • (D) Topologie: linear
  • (ii) MQLEKÜTLTYP: genomische DNA
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR 1
    Figure 00500001
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 2
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
    • (A) LÄNGE: 131 Aminosäuren
    • (B) TYP: Aminosäure
    • (C) STRANGFORM: einzel
    • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 2
    Figure 00510001
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 3
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
    • (A) LÄNGE: 31 Aminosäuren
    • (B) TYP: Aminosäure
    • (C) STRANGFORM: einzel
    • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 3
    Figure 00520001
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 4
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
    • (A) LÄNGE: 28 Aminosäuren
    • (B) TYP: Aminosäure
    • (C) STRANGFORM: einzel
    • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 4
    Figure 00520002
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 5
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
    • (A) LÄNGE: 585 Basenpaare
    • (B) TYP: Nucleinsäure
    • (C) STRANGFORM: einzel
    • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 5:
    Figure 00530001
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 6
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
    • (A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
    • (B) TYP: Aminosäure
    • (C) STRANGFORM: einzel
    • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 6
    Figure 00530002
  • Figure 00540001
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 7
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
    • (A) LÄNGE: 32 Aminosäuren
    • (B) TYP: Aminosäure
    • (C) STRANGFORM: einzel
    • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 7:
    Figure 00540002
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 8
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
    • (A) LÄNGE: 33 Aminosäuren
    • (B) TYP: Aminosäure
    • (C) STRANGFORM: einzel
    • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 8
    Figure 00550001
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 9
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
    • (A) LÄNGE: 27 Aminosäuren
    • (B) TYP: Aminosäure
    • (C) STRANGFORM: einzel
    • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 9
    Figure 00550002
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 10
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
    • (A) LÄNGE: 123 Aminosäuren
    • (B) TYP: Aminosäure
    • (C) STRANGFORM: einzel
    • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 10
    Figure 00560001
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 11
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
    • (A) LÄNGE: 33 Aminosäuren
    • (B) TYP: Aminosäure
    • (C) STRANGFORM: einzel
    • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 11
    Figure 00560002
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 12
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
    • (A) LÄNGE: 28 Aminosäuren
    • (B) TYP: Aminosäure
    • (C) STRANGFORM: einzel
    • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 12
    Figure 00570001
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 13
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
    • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
    • (B) TYP: Nucleinsäure
    • (C) STRANGFORM: einzel
    • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 13
    Figure 00570002
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 14
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
    • (A) LÄNGE: 17 Basenpaare
    • (B) TYP: Nucleinsäure
    • (C) STRANGFORM: einzel
    • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 14
    Figure 00580001
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 15
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
    • (A) LÄNGE: 34 Basenpaare
    • (B) TYP: Nucleinsäure
    • (C) STRANGFORM: einzel
    • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 15
    Figure 00580002
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 16
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
    • (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
    • (B) TYP: Nucleinsäure
    • (C) STRANGFORM: einzel
    • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 16
    Figure 00590001
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 17
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
    • (A) LÄNGE: 30 Basenpaare
    • (B) TYP: Nucleinsäure
    • (C) STRANDEDNESS: einzel
    • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 17
    Figure 00590002
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 18
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
    • (A) LÄNGE: 30 Basenpaare
    • (B) TYP: Nucleinsäure
    • (C) STRANGFORM: einzel
    • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 18
    Figure 00600001
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 19
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
    • (A) LÄNGE: 28 Basenpaare
    • (B) TYP: Nucleinsäure
    • (C) STRANGFORM: einzel
    • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 19
    Figure 00600002
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 20
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
    • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
    • (B) TYP: Nucleinsäure
    • (C) STRANGFORM: einzel
    • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 20
    Figure 00600003
  • (2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NR. 21
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
    • (A) LÄNGE: 577 Basenpaare
    • (B) TYP: Nucleinsäure
    • (C) STRANGFORM: einzel
    • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 21
    Figure 00610001

Claims (2)

  1. Verwendung eines Antagonisten, der die Wechselwirkung eines HFGAN72-Rezeptorliganden und eines HFGAN72-Rezeptors hemmt, wobei der Rezeptorligand ein Polypeptid ist, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens zu 95% mit einer Aminosäuresequenz identisch ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR 2–4 und 8–12, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Schlafstörungen, Schlafapnoe, Narkolepsie, Schlaflosigkeit, Parasomnie, dem Jet-lag-Syndrom, einem gestörten biologischen und zirkadianen Rhythmus, Schlafstörungen, die mit neurologischen Störungen, Lungenerkrankungen, Abhängigkeiten in Zusammenhang stehen, und einer obsessiven kompulsiven Störung.
  2. Verwendung eines Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu mindestens 95% mit einer Aminosäuresequenz identisch ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR 2–4 und 8–12, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Schlafapnoe, Narkolepsie, Schlaflosigkeit, Parasomnie, dem Jet-lag-Syndrom, einem gestörten biologischen und zirkadianen Rhythmus, Schlafstörungen, die mit neurologischen Störungen, Lungenerkrankungen, Abhängigkeiten in Zusammenhang stehen, und einer obsessiven kompulsiven Störung.
DE69822200T 1997-12-15 1998-12-15 Verwendung neuer liganden des hfgan72 neuropeptiderezeptors und dessen antagonisten in der therapie Expired - Lifetime DE69822200T2 (de)

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US69459P 1997-12-15
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DE69822200T Expired - Lifetime DE69822200T2 (de) 1997-12-15 1998-12-15 Verwendung neuer liganden des hfgan72 neuropeptiderezeptors und dessen antagonisten in der therapie

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EP (1) EP1037655B1 (de)
JP (1) JP2003527302A (de)
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WO (1) WO1999030670A2 (de)

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US6664229B2 (en) 2003-12-16
DE69822200D1 (de) 2004-04-08
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