DE69737229T2 - Peptid mit cortistatin- oder somatostatin-aktivität, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendungen - Google Patents

Peptid mit cortistatin- oder somatostatin-aktivität, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendungen Download PDF

Info

Publication number
DE69737229T2
DE69737229T2 DE69737229T DE69737229T DE69737229T2 DE 69737229 T2 DE69737229 T2 DE 69737229T2 DE 69737229 T DE69737229 T DE 69737229T DE 69737229 T DE69737229 T DE 69737229T DE 69737229 T2 DE69737229 T2 DE 69737229T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
seq
peptide
amino acid
dna
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE69737229T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69737229D1 (de
Inventor
Shuji Tsukuba-shi HINUMA
Shoji Tsukuba-shi FUKUSUMI
Chieko Sakai-shi KITADA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27319088&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE69737229(T2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Takeda Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Publication of DE69737229D1 publication Critical patent/DE69737229D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69737229T2 publication Critical patent/DE69737229T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/655—Somatostatins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/16—Somatostatin; related peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue physiologisch aktive Peptide mit einer Humansomatostatinartigen oder Cortistatin-artigen Aktivität und Vorläufer davon.
  • Hintergrund und Stand der Technik
  • Somatostatin wurde aus dem Hypothalamus von Schafen isoliert und als Wachstumshormon hemmender Faktor identifiziert (R. Guillemin et al., Science, Bd. 179, Seiten 77-79, 1973). Somatostatin ist aus 14 Aminosäureresten zusammengesetzt und hat eine cyclische Struktur, die durch die S-S-Bindung zwischen Cys in Position 3 und Cys in Position 14 entsteht (Somatostatin-14). Somatostatin-28, das aus Somatostatin-14 und 14 Aminosäureresten, die dem N-Ende des Somatostatin-14-Moleküls zugefügt wurden, zusammengesetzt ist, wurde auch gefunden.
  • Somatostatin ist weit verbreitet im zentralen Nervensystem und peripher tritt es in solchen Organen, wie der Milz und dem Gastrointestinaltrakt auf und weiterhin in den peripheren Nerven. Es ist nun bekannt, dass diese Substanz nicht nur die Sekretion des Wachstumshormons hemmt, sondern auch die Sekretion der Hypophysenhormone, wie das schilddrüsenstimulierende Hormon und Prolactin und Verdauungstrakthormone, wie Gastrin und Insulin, und dass es auch als Neurotransmitter wirkt (M. Brownstain et al., Endocrinology, Bd. 96, Seiten 1456-1461, 1975). Weiterhin wurde gefunden, dass es die Zellproliferation hemmt. Daher wurden verschiedene Derivate von Somatostatin synthetisiert und es wurde ihre klinische Anwendung versucht, um die Hormonübersekretion oder Tumorwachstum zu hemmen.
  • Über ein neues Neuropeptid, das in der Struktur dem Somatostatin ähnlich ist, wurde von einer Gruppe von Forschern bei Scrips Laboratories berichtet. Es wurde festgestellt, dass dieses Peptid mit dem Namen Rattencortistatin (dessen Vorläufer hier als Präprocortistatin bezeichnet wird) das Produkt eines Gens ist, das von dem Somatostatingen verschieden ist. Cortistatin hat jedoch die Eigenschaft, selektiv die REM-(Schnelle Augenbewegung)-Schlafphase während des Schlafs zu verkürzen und in der Hirnrinde Wellen mit niedriger Frequenz zu erzeugen. Weiterhin hemmt Cortistatin die Wirkungen von Acetyleholin, das selbst ein REM-Schlafinduktor ist. Es wird angenommen, dass Cortistatin als Modulator von neuralen Aktivitäten und des Schlafs wirkt (L. de Lecea et al., Nature, 381, 16. Mai 1996).
  • Die Aktivitäten von Somatostatin hängen von der Bindung an spezifische hochaffine Rezeptoren (Somatostatinrezeptoren) ab, die auf der Zellmembran vorhanden sind, und der nachfolgenden Übertragung des Signals über das GTP bindende Protein in das intrazelluläre Signalübertragungssystem. Zuerst wurde die Struktur des Somatostatinrezeptor-Subtyps 1 (im Folgenden manchmal als SSTR1 bezeichnet) und die des Subtyps 2 (im Folgenden manchmal hier als SSTR2 bezeichnet) bestimmt und darüber berichtet (Yamada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 89, Seiten. 251-255, 1992). Dann wurden DNAs, die für Subtyp 3 (im Folgenden manchmal als SSTR3 bezeichnet), Subtyp 4 (im Folgenden manchmal als SSTR4 bezeichnet) und Subtyp 5 (im Folgenden manchmal als SSTR5 bezeichnet) kloniert (SSTR3: Yamada et al., Molecular Endocrinology, Bd. 6, Seiten 2136-2142, 1992; SSTR4 und SSTR5: Yamada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 195, Seiten 844-852, 1993). Diese bis jetzt bekannten fünf Somatostatinrezeptor-Unterarten sind auf Aminosäureebene zu 42 bis 60% homolog miteinander.
  • Die Aktivitäten von Cortistatin zeigen sich wahrscheinlich auch bei seiner Bindung an die spezifischen Hochaffinitätsrezeptoren auf der Zellmembran und die nachfolgende Übertragung eines Signals über das GTP bindende Protein an das intrazelluläre Signalübertragungssystem. Tatsächlich unterliegt Cortistatin-14 einer Verdrängung ähnlich der von Somatostatin als Antwort auf die Bindung von [125I]-markiertem Somatostatin auf der Membran der Rattenhypophysenzelle GH4 (L. de Lecea et al., Nature, 381, 16. Mai 1996). Ein möglicher Unterschied in der Wirkung, z.B. auf den Schlaf, wurde jedoch zwischen Somatostatin-14 und Cortistatin-14, das an Ratten intraventrikulär verabreicht wurde, vorgeschlagen und Unterschiede in der Affinität und der Wirkungsstelle wurden zwischen den jeweiligen Peptiden im Hinblick auf Somatostatinrezeptor-Unterarten und Somatostatinrezeptor-artige Rezeptoren angenommen. Weiterhin wurde die Wahrscheinlichkeit angeführt, dass Cortistatin auch auf andere Rezeptoren als Somatostatinrezeptoren wirkt. Z.B. wird berichtet, dass GPR7 (U22491) und GPR8 (U22492) Rezeptoren mit großer Homologie mit Somatostatinrezeptoren sind, obwohl die Bindung an Somatostatin bis jetzt nicht festgestellt wurde [Genomics, 28, 84-91 (1995)]. Es wird als möglich angesehen, dass Cortistatin auch auf solche Rezeptoren wirkt. Wie oben erwähnt, spielt Cortistatin wahrscheinlich eine wichtige Rolle in der Regulierung von physiologischen Funktionen in vivo über spezifische Rezeptoren, aber bis jetzt sind keine Somatostatin-artigen oder Cortistatin-artigen Peptide beim Menschen bekannt.
  • Es wurde über Versuche berichtet, die unternommen wurden, um Genexpressionspegel zu bestimmen oder neue Gene in Organen und Zellen zu entdecken, indem Teilsequenzen (exprimierte Sequenz-Tags; abgekürzt als ESTs) von cDNA-Klonen statistisch aus cDNA-Bibliotheken ausgewählt werden. M.D. Adams et al. haben über eine Anzahl von ESTs berichtet, die aus einer Gehirn-cDNA-Bibliothek erhalten wurden (Nature Genetics, Bd. 4, Seiten 373-380, 1993).
  • Es wird erwartet, dass die neuen physiologisch aktiven Peptide mit Somatostatin-artiger oder Cortistatinartiger Aktivität die Entwicklung neuer Wirkstoffe, die zur Verhütung und Behandlung unter anderem von akuter bakterieller Meningitis, akutem Myokardinfarkt, akuter Pankreatitis, akuter viraler Enzephalitis, Respiratory Distress Syndrom bei Erwachsenen, alkoholischer Hepatitis, Alzheimer-Krankheit, Asthma, Arteriosklerose, atopischer Dermatitis, bakterieller Pneumonie, Blasenkrebs, Knochenbruch, Brustkrebs, Hyperphagie, Polyphagie, Brandwundenheilung, Karzinomen des Gebärmutterhalses, chronisch-lymphatischer Leukämie, chronisch-myelotischer Leukämie, chronischer Pankreatitis, Leberzirrhose, Kolorektalkrebs (Karzinom von Kolon/Rektum), Morbus Crohn, Demenz, diabetischen Komplikationen, z.B. diabetischer Nephropathie, diabetischer Neuropathie, diabetischer Retinopathie etc., Gastritis, Helicobacter-pylori-Infektion, Leberinsuffizienz, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, anderen Arten von Hepatitis, Herpes-Simplex-Virusinfektion, Varicella-Zoster-Virusinfektion, Morbus Hodgkin, Aidsvirusinfektion, Humanpapillomavirusinfektion, Hypercalcämie, Hypercholesterolämie, Hyperglyceridämie, Hyperlipämie, gemischten infektiösen Krankheiten, Influenzavirusinfektion, insulinabhängigem Diabetes mellitus (Typ I), invasiver Staphylokokkeninfektion, malignen Melanomen, Krebsmetastasenbildung, multiplen Myelomen, allergischer Rhinitis, Nephritis, Nicht-Hodgkin-Lymphomen, nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus (Typ II), nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Organtransplantation, Osteoarthritis, Osteomalazie, Osteopenie, Osteoporose, Eierstockkrebs, Morbus Bechterew, Magengeschwüren, peripheren Gefäßkrankheiten, Prostatakrebs, Reflux-Ösaphagitis, Nierenversagen, Polyarthritis, Schizophrenie, Sepsis, septischem Schock, schwerer systemischer Pilzinfektion, kleinzelligem Lungenkrebs, Rückenmarksschäden, Magenkrebs, systemischem Lupus erythematodes, vorübergehenden zerebralen ischämischen Attacken, Lungentuberkulose, Herzklappenkrankheit, mit vaskulärem, multiplem Infarkt verbundener Demenz, Wundheilung, Schlaflosigkeit, Arthritis und neurodegenerativen Krankheiten, wertvoll sein kann.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Peptide mit nützlichen physiologischen Aktivitäten, Vorläufer davon oder Salze davon, DNAs, die diese Peptide oder Vorläufer codieren, rekombinante Vektoren, transformierte Zellen, ein Verfahren zur Herstellung der Peptide oder Vorläufer, pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Peptide oder Vorläufer enthalten, Antikörper gegen die Peptide, ein Verfahren zum Screening und einen Kit zum Screening von Verbindungen und Salzen, die die Bindung der Peptide an Rezeptoren modifizieren können.
  • Als Ergebnis intensiver Forschungen, die gemacht wurden zur Lösung der obigen Probleme, waren die vorliegenden Erfinder erfolgreich darin, eine cDNA zu klonieren mit einer neuen Basensequenz, indem sie Primer konstruierten basierend auf der Sequenzinformation eines EST und RT-PCR unter Verwendung von Humanhirnpoly(A)+-RNA als Matrize durchführten. Weiterhin fanden die Erfinder der vorliegenden Erfindung, dass sich nützliche Somatostatin-artige oder Cortistatin-artige physiologisch aktive Peptide aus dem Protein, das von der auf obige Weise erhaltenen cDNA codiert wird, bilden. Basierend auf diesen Erkenntnissen machten die Erfinder der vorliegenden Erfindung weitere Untersuchungen. Als Ergebnis entwickelten sie die vorliegende Erfindung.
  • Die vorliegende Erfindung liefert somit:
    • (1) ein Peptid mit der unter SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz oder einer Aminosäuresequenz, die davon abgeleitet ist durch Deletion oder Substitution von 1 bis 5 Aminosäureresten (außer der in SEQ ID Nr. 31 oder SEQ ID Nr. 32 definierten Aminosäuresequenz), einen Vorläufer davon oder ein Salz des Peptids oder Vorläufers, wobei das Peptid Cortistatin- oder Somatostatinaktivität hat;
    • (2) ein Peptid oder Vorläufer, wie in Abschnitt (1) definiert, das die Aminosäuresequenz enthält, die unter SEQ ID Nr. 1 definiert ist, oder eine Aminosäuresequenz, die davon durch Deletion oder Substitution von 1 bis 5 Aminosäureresten abgeleitet ist;
    • (3) ein Peptid, wie oben in Abschnitt (1) definiert, das die Aminosäuresequenz enthält, die unter SEQ ID Nr. 1 definiert ist;
    • (4) ein Peptid, wie in Abschnitt (1) definiert, das die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 2 definiert ist, enthält;
    • (5) ein Peptid, wie oben in Abschnitt (1) definiert, das die Aminosäuresequenz enthält, die in SEQ ID Nr. 3 definiert ist;
    • (6) ein Peptid, wie in Abschnitt (1) definiert, das die Aminosäuresequenz enthält, die unter SEQ ID Nr. 35 bis SEQ ID Nr. 55 definiert ist;
    • (7) ein Vorläufer, wie oben in Abschnitt (1) definiert, der die Aminosäuresequenz enthält, die unter SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6 oder SEQ ID Nr. 7 definiert ist;
    • (8) eine DNA, die eine DNA enthält mit einer Nucleotidsequenz, die ein Peptid oder einen Vorläufer codiert, wie in Abschnitt (1) definiert;
    • (9) eine DNA, wie oben in Abschnitt (8) definiert, die die unter SEQ ID Nr. 13 definierte Nucleotidsequenz enthält;
    • (10) eine DNA, wie in Abschnitt (8) definiert, die die in SEQ ID Nr. 14 definierte Nucleotidsequenz enthält;
    • (11) eine DNA, wie in Abschnitt (8) definiert, die die in SEQ ID Nr. 15 definierte Nucleotidsequenz enthält;
    • (12) eine DNA, wie in Abschnitt (8) definiert, die die in einer der SEQ ID Nr. 16 bis SEQ ID Nr. 23 definierten Nucleotidsequenzen enthält;
    • (13) eine DNA, wie in Abschnitt (8) definiert, die die in einer der SEQ ID Nr. 62 bis SEQ ID Nr. 82 definierten Nucleotidsequenzen enthält;
    • (14) ein rekombinanter Vektor, der eine DNA enthält, wie sie in Abschnitt (8) definiert wurde;
    • (15) eine transformierte Zelle, die den rekombinanten Vektor, wie in Abschnitt (14) definiert, beherbergt;
    • (16) ein Verfahren zur Herstellung des oben in Abschnitt (1) definierten Peptids oder eines Vorläufers davon oder eines Salzes des Peptids oder Vorläufers, das umfasst, dass die transformierte Zelle, die oben in Abschnitt (15) definiert wurde, gezüchtet wird, wodurch die Produktion und Ansammlung des Peptids, Vorläufers oder Salzes, das oben in Abschnitt (1) definiert wurde, verursacht und dass dieses geerntet wird;
    • (17) eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Peptid, den Vorläufer oder das Salz, wie in Abschnitt (1) definiert, enthält;
    • (18) eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die in Abschnitt (8) definierte DNA enthält;
    • (19) ein Antikörper gegen das Peptid, das aus der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz besteht, der spezifisch das Peptid erkennen kann, nicht aber das Peptid erkennt, das aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 31 oder SEQ ID Nr. 32 besteht;
    • (20) ein Verfahren zum Screenen nach einer Verbindung oder einem Salz davon, die/das die Bindung des Peptids, Vorläufers oder Salzes, wie in Abschnitt (1) definiert, an einen Rezeptor, an den das Peptid, der Vorläufer oder das Salz konjugiert sein kann, oder ein Fragmentpeptid des Rezeptors oder ein Salz des Rezeptors oder Fragmentpeptid modifizieren kann, wobei das Verfahren einerseits umfasst, dass (i) das Peptid, der Vorläufer oder das Salz, wie in Abschnitt (1) definiert, mit dem Rezeptor, Fragmentpeptid oder Salz, an den das Peptid, der Vorläufer oder das Salz, wie in Abschnitt (1) definiert, konjugiert sein kann, in Kontakt gebracht wird und andererseits (ii) das Peptid, der Vorläufer oder das Salz, wie in Abschnitt (1) definiert, und eine zu testende Verbindung mit dem Rezeptor, Fragmentpeptid oder Salz in Kontakt gebracht wird, an den das Peptid, der Vorläufer oder das Salz, wie in Abschnitt (1) definiert, konjugiert sein kann, und das Ausmaß der Bindung des Peptids, Vorläufers oder Salzes, wie in Abschnitt (1) definiert, an den Rezeptor, das Fragmentpeptid oder das Salz bestimmt und verglichen wird zwischen den beiden obigen Fallen (i) und (ii);
    • (21) ein Verfahren zum Screenen nach einer Verbindung oder einem Salz davon, die/das die Bindung des Peptids, Vorläufers oder Salzes, wie oben in Abschnitt (1) definiert, an einen Rezeptor, an den das Peptid, der Vorläufer oder das Salz konjugiert sein kann, oder ein Fragmentpeptid des Rezeptors oder ein Salz des Rezeptors oder Fragmentpeptid, modifizieren kann, wobei das Verfahren einerseits umfasst, dass (i) das Peptid, der Vorläufer oder das Salz, wie in Abschnitt (1) definiert, mit Zellen oder einer Zellmembranfraktion in Kontakt gebracht wird, die den Rezeptor enthält, an den das Peptid, der Vorläufer oder das Salz, wie in Abschnitt (1) definiert, konjugiert sein kann und andererseits (ii) das Peptid, der Vorläufer oder das Salz, wie in Abschnitt (1) definiert, und eine zu testende Verbindung in Kontakt mit den Zellen oder der Zellmembranfraktion, die den Rezeptor enthält, an den das Peptid, der Vorläufer oder das Salz, wie in Abschnitt (1) definiert, konjugiert sein kann, bringt und (I) das Ausmaß der Bindung des Peptids, Vorläufers oder Salzes, wie in Abschnitt (1) definiert, an die Zellen oder Zellmembranfraktion, die den Rezeptor enthalten, bestimmt und vergleicht oder (II) die zellstimulierenden Aktivitäten, die durch den Rezeptor vermittelt werden in und zwischen den beiden Fällen (i) und (ii) vergleicht;
    • (22) Screening-Kit für eine Verbindung oder ein Salz davon, das die Bindung des Peptids, Vorläufers oder Salzes, wie oben in Abschnitt (1) definiert, an einen Rezeptor für das Peptid, den Vorläufer oder das Salz, oder ein Fragmentpeptid des Rezeptors oder ein Salz des Rezeptors oder Fragmentpeptids modifizieren kann, wobei der Kit das Peptid, den Vorläufer oder das Salz, wie in Abschnitt (1) definiert, enthält;
    • (23) ein Verfahren zur Herstellung des Peptids, Vorläufers oder Salzes, wie oben in Abschnitt (1) definiert, das umfasst, dass eine ein Aminoende bildende Aminosäure oder ein Peptid und eine das Carboxylende bildende Aminosäure oder ein Peptid einer Kondensation unterzogen werden, wonach, falls gewünscht, intramolekulare Disulfidbindungen gebildet werden.
  • Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin:
    • (24) ein Peptid, wie in Anspruch 1 definiert, das eine Aminosäuresequenz der Formel X1-X2-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-X3-Ser-X4 (I)enthält, worin X1 Asp-Arg-Met-Pro-Cys, Arg-Met-Pro-Cys, Met-Pro-Cys, Pro-Cys oder Cys bedeutet, X2 Arg oder Lys bedeutet, X3 Ser oder Thr bedeutet und X4 Cys-Lys oder Cys bedeutet (außer für die Aminosäuresequenz, bei der X1 Pro-Cys ist, X2 Lys ist, X3 Ser ist und X4 Cys-Lys ist);
    • (25) ein Verfahren zum Testen des Peptids, Vorläufers oder Salzes, wie oben in Abschnitt (1) definiert, das umfasst, dass der in oben in Abschnitt (19) definierte Antikörper mit dem Peptid, Vorläufer oder Salz, wie in Abschnitt (1) definiert, in Kontakt gebracht wird;
    • (26) ein Verfahren zum Testen des Peptids, Vorläufers oder Salzes, wie oben in Abschnitt (1) definiert, in einer Testlösung, das umfasst, dass der Antikörper, wie oben in Abschnitt (19) definiert, kompetitiv mit der Testlösung und dem Peptid, Vorläufer oder Salz, wie in Abschnitt (1) definiert, reagieren gelassen wird und in markierter Form auftritt und der Anteil des Peptids, Vorläufers oder Salzes, wie in Abschnitt (1) definiert, bestimmt wird und der Anteil, der in markierter Form an den Antikörper gebunden vorliegt, bestimmt wird;
    • (27) ein Verfahren zum Testen des oben in Abschnitt (1) definierten Peptids, Vorläufers oder Salzes in einer Testlösung, das umfasst, dass die Testlösung mit dem oben in Abschnitt (19) definierten Antikörper umgesetzt und an einem Träger immobilisierten Antikörper und einem weiteren in Abschnitt (19) definierten Antikörper, der in markierter Form vorliegt, entweder gleichzeitig oder aufeinander folgend umgesetzt wird und die Aktivität der Markierung an dem insolubilisierten Träger bestimmt wird;
    • (28) eine pharmazeutische Zusammensetzung, die den oben in Abschnitt (19) definierten Antikörper (bevorzugt den in Abschnitt (19) definierten Antikörper, der die Aktivitäten des Peptids, Vorläufers oder Salzes, wie in Abschnitt (1) definiert, neutralisieren kann) enthält;
    • (29) ein Oligonucleotidderivat (Antisense-DNA) oder ein Salz davon, das eine Nucleotidsequenz hat, die komplementär oder im Wesentlichen komplementär ist zu der der oben in Abschnitt (8) definierten DNA und die Expression der DNA hemmen kann;
    • (30) ein Oligonucleotidderivat wie oben in Abschnitt (29) definiert, bei dem die Nucleotidsequenz, die der Sequenz der in Abschnitt (8) definierten DNA im Wesentlichen komplementär ist, eine Nucleotidsequenz ist mit einer Homologie von nicht weniger als etwa 70% (bevorzugt nicht weniger als etwa 80%, bevorzugter nicht weniger als etwa 90%, am meisten bevorzugt nicht weniger als etwa 95%) bezogen auf die gesamte Nucleotidsequenz, die dieser DNA komplementär ist, oder einem Teil davon;
    • (31) eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das oben in Abschnitt (29) definierte Oligonucleotid oder Salz enthält;
    • (32) ein Oligonucleotid oder Salz davon, das eine Nucleotidsequenz enthält, die der Sequenz der oben in Abschnitt (8) definierten DNA komplementär oder im Wesentlichen komplementär ist und die Expression der DNA fördern kann;
    • (33) ein Oligonucleotidderivat, wie oben in Abschnitt (32) definiert, bei dem die Nucleotidsequenz, die der Sequenz der in Abschnitt (8) definierten DNA im Wesentlichen komplementär ist, eine Nucleotidsequenz ist mit einer Homologie von nicht weniger als etwa 70% (bevorzugt nicht weniger als etwa 80%, bevorzugter nicht weniger als etwa 90%, am meisten bevorzugt nicht weniger als etwa 95%) bezogen auf die gesamte Nucleotidsequenz, die zu dieser DNA komplementär ist, oder einem Teil davon;
    • (34) eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Oligonucleotid oder das oben in Abschnitt (32) definierte Salz davon enthält und
    • (35) eine pharmazeutische Zusammensetzung, wie oben in Abschnitt (34) definiert, die ein Mittel zur Behandlung oder Verhütung von Hormon produzierenden Tumoren, Akromegalie, Gigantismus, Demenz oder Magengeschwüren, ein Hormonsekretionshemmer, ein das Tumorwachstum hemmendes Mittel oder einen Modulator für Nervenaktivität oder Schlaf ist.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Nucleotidsequenz der in Beispiel 2 erhaltenen DNA, die das Peptid hCS-17 der vorliegenden Erfindung codiert, und einen Vorläufer davon.
  • 2 zeigt die Nucleotidsequenz der in Beispiel 2 erhaltenen DNA, die das Peptid hCS-17 der Erfindung codiert und einen Vorläufer davon und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz.
  • 3 zeigt die Nucleotidsequenz der DNA, die das Peptid hCS-17 der Erfindung codiert, und einen Vorläufer davon und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz. In 2 ist das Codon, das die 85. Aminosäure Seren codiert, TCC, während in 3 das entsprechende Codon TCT ist.
  • 4 zeigt die Ergebnisse einer Hydrophobizitätsanalyse der Aminosäuresequenz des in 2 gezeigten erfindungsgemäßen Vorläufers.
  • 5 zeigt die Ergebnisse eines Aminosäuresequenzvergleichs des Vorläufers (phCSP6) der Erfindung, wie in 2 gezeigt, mit Rattencortistatin (r-Cortistatin; U51919) und Rattensomatostatin (r-Somatostatin; J00788).
  • 6 zeigt die Ergebnisse der Untersuchung des Expressionsgrads der mRNA, die für das Peptid hCS-17 der Erfindung codiert in verschiedenen menschlichen Geweben mit Northem-Hybridisierung. Die hier getesteten Gewebe waren Hoden, Hirnrinde, Rückenmark, Corpus amygdaloideum, Nucleus caudatus und Hippocampus. Die Zahl (kb) auf der linken Seite bezieht sich auf die Größe eines RNA-Molekulargewichtsmarkers.
  • Im oberen Abschnitt sind die Ergebnisse gezeigt, die erhalten wurden, indem die DNA, die in dem Plasmid phCSP6 enthalten ist, die das Peptid hCS-17 der Erfindung codiert, als Sonde verwendet wurde. Im unteren Abschnitt sind die Ergebnisse gezeigt, die erhalten wurden unter Verwendung der DNA, die die Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (G3PDH) codiert als Sonde.
  • 7 zeigt die Ergebnisse der Untersuchung der Wirkung des Peptids hCS-17 der Erfindung und das Rattenelektroenzephalogramm. PBS bezieht sich auf das EEG-Muster, das nach Verabreichung von phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung gefunden wurde und hCS-17 bezeichnet das EEG-Muster, das nach Verabreichung von 1 nmol des Peptids hCS-17 der Erfindung bei Ratten gefunden wurde. CC bezieht sich auf das Elektroenzephalogramm der Hirnrinde. HIP bezieht sich auf das Elektroenzephalogramm des Hippocampus. EMG steht für Elektromyogramm. PRE steht für Vorverabreichung und min steht für Minuten.
  • 8 zeigt die Belegungszeit des auf Wachheit hindeutenden EEG-Musters während eines Gesamtmessraums von 4 Stunden nach Verabreichung des Peptids hCS-17 der Erfindung an Ratten. Die Ordinate zeigt den Prozentanteil der Belegungszeit bezogen auf die gesamte Messzeit. "Träger" auf der Abszisse bezieht sich auf die Ergebnisse, die bei Verabreichung von PBS erhalten wurden, "hCS-17" bezieht sich auf die Ergebnisse, die bei Verabreichung des reifen Peptids der vorliegenden Erfindung erhalten wurden und die Zahl zeigt die Verabreichungskonzentration.
  • 9 zeigt die Belegungszeit des auf leichten Schlaf mit langsamen Wellen hindeutenden EEG-Musters während des Gesamtmesszeitraums von 4 Stunden nach Verabreichung des Peptids hCS-17 der Erfindung an Ratten. Die Ordinate bezeichnet den Prozentanteil an Belegungszeit bezogen auf die gesamte Messzeit. "Träger" auf der Abszisse bezieht sich auf die Ergebnisse, die bei Verabreichung von PBS erhalten wurden, "hCS-17" bezieht sich auf die Ergebnisse, die bei Verabreichung des reifen Peptids der vorliegenden Erfindung erhalten wurden und die Zahl bezeichnet die Verabreichungskonzentration.
  • 10 zeigt die Belegungszeit des auf tiefen Schlaf mit langsamen Wellen deutenden Elektroenzephalogramm-Musters während des Gesamtmesszeitraums von 4 Stunden nach Verabreichung des Peptids bCS-17 der Erfindung; an Ratten. Die Ordinate bezeichnet den Prozentanteil an Belegungszeit bezogen auf die gesamte Messzeit. "Träger" auf der Abszisse bezieht sich auf die Ergebnisse, die bei Verabreichung von PBS erhalten wurden, "hCS-17" bezieht sich auf die Ergebnisse, die bei Verabreichung des reifen Peptids der vorliegenden Erfindung erhalten wurden und die Zahl bezeichnet die Verabreichungskonzentration.
  • 11 zeigt die Belegungszeit des auf paradoxen Schlaf hindeutenden Elektroenzephalogramm-Musters während des Gesamtmesszeitraums von 4 Stunden nach Verabreichung des Peptids hCS-17 der Erfindung an Ratten. Die Ordinate bezeichnet den Prozentanteil an Belegungszeit bezogen auf die gesamte Messzeit. "Träger" auf der Abszisse bezieht sich auf die Ergebnisse, die bei Verabreichung von PBS erhalten wurden, "hCS-17" bezieht sich auf die Ergebnisse, die bei Verabreichung des reifen Peptids der vorliegenden Erfindung erhalten wurden und die Zahl bezeichnet die Verabreichungskonzentration.
  • Beste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
  • Die Peptide mit einer Aminosäuresequenz, die identisch oder im Wesentlichen äquivalent bis identisch mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, ist, können irgendwelche Peptide sein, die aus verschiedenen Geweben vom Menschen und anderen warmblütigen Tieren stammen (z.B. Meerschweinchen, Ratte, Maus, Geflügel, Kaninchen, Schwein, Schaf, Rind, Affe etc.). Zu diesen Geweben gehören Zellen (z.B. Hepatozyten, Splenozyten, Nervenzellen, Gliazellen, β-Zellen der Pankreas, Myeolozyten, Mesangialzellen, Langerhans'sche Zellen, Epidermiszellen, Epithelzellen, Endothelzellen, Fibroblasten, Fibrozyten, Myozyten, Adipozyten, Immunzellen (z.B. Makrophagen, T-Zellen, B-Zellen, natürliche Killerzellen, Mastozyten, Neutrophile, Basophile, Eosinophile, Monozyten), Megarozyten, Synovialzellen, Chondrozyten, Osteozyten, Osteoblasten, Osteoklasten, Erustdrüsenzellen, Hepatozyten, interstitielle Zellen, die entsprechenden Vorläuferzellen, Stammzellen, Krebszellen etc.), alle Gewebe, in denen solche Zellen existieren, z.B. Gehirn, verschiedene Teile des Gehirn (z.B. Riechkolben, Mandelkern, Basalganglien, Hippocampus, Thalamus, Hypothalamus, Hirnrinde, Medula oblongata, Kleinhirn), Rückenmark, Hypophyse, Magen, Pankreas, Niere, Leber, Geschlechtsdrüsen, Schilddrüse, Gallenblase, Knochenmark, Nebennieren, Haut, Muskel, Lunge, Eingeweide (z.B. Dickdarm und Dünndarm), Blutgefäße, Herz, Thymus, Milz, Unterkieferdrüse, peripheres Blut, Prostata, Hoden, Eierstock, Plazenta, Uterus, Knochen, Gelenke, Skelettmuskel etc. Die oben erwähnten Peptide können auch synthetische Peptide sein.
  • Beispiele für die Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, im Wesentlichen äquivalent ist, sind eine Aminosäuresequenz, die nicht weniger als etwa zu 90%, bevorzugt zu nicht weniger als 80% und am meisten bevorzugt nicht weniger als etwa 95 Identität mit der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz hat usw.
  • Beispiele für das Peptid der vorliegenden Erfindung, das eine Aminosäuresequenz enthält, die im Wesentlichen äquivalent ist der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, sind ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen äquivalent ist der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist und mit einer qualitativ äquivalenten Aktivität des Peptids mit der gleichen Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1 dargestellt.
  • Die Peptide der vorliegenden Erfindung können ein Mutein des Peptids sein, das die in SEQ ID Nr. 1 dargestellte Aminosäuresequenz enthält (im Folgenden kann dies als hCS-17 beschrieben werden).
  • Der Ausdruck "qualitativ äquivalent der Aktivität" wird hier verwendet, um eine wesentliche Äquivalenz in qualitativer Form auszudrücken, z.B. eine Cortistatin-artige oder Somatostatin-artige Aktivität, wie unten erwähnt. Daher kann der Äquivalenzgrad z.B. in einem Bereich wie etwa dem 0,1- bis etwa 100-Fachen (bevorzugt etwa 0,5- bis 10-Fachen, bevorzugter 0,5- bis 2-Fachen) liegen. Unterschiede in quantitativer Form, wie die Potenz der Aktivität und die Molekülmasse des Proteins, sind jedoch unwichtig.
  • Aktivitäten, wie eine Cortistatin-artige oder Somatostatin-artige Aktivität können mit einer an sich bekannten Methode oder einer dazu analogen Methode gemessen werden. Z.B. können die Aktivitäten gemessen werden mit der in der japanischen Patentschrift (Kokai) Nr. 116979/1996 oder Nature, 381, 16. Mai 1996 etc. beschriebenen Methode gemessen werden.
  • Das Peptid der vorliegenden Erfindung schließt die so genannten Muteine ein, z.B. Proteine, die (1) eine Aminosäuresequenz enthalten, bei der wenige (1 bis 5) Aminosäurereste aus der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, deletiert sind, (2) eine Aminosäuresequenz, bei der wenige (1 bis 5) Aminosäurereste in der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz substituiert sind oder (3) Kombinationen davon.
  • Bevorzugt als Peptid der vorliegenden Erfindung sind z.B. Peptide mit einer Aminosäuresequenz der Formel X1-X2-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-X3-Ser-X4 (I)worin X1 Asp-Arg-Met-Pro-Cys, Arg-Met-Pro-Cys, Met-Pro-Cys, Pro-Cys oder Cys bedeutet, X2 Arg oder Lys bedeutet, X3 Ser oder Thr bedeutet und X4 Cys-Lys oder Cys bedeutet (außer die Aminosäuresequenz, in der X1 Pro-Cys ist, X2 Lys ist, X3 Ser ist und X4 Cys-Lys ist).
  • Typische Beispiele für Muteine vom Deletionstyp oder/und Substitutionstyp, die verwendet werden können, sind die folgenden:
    • (1) Ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von zwei Aminosäuren (Asp-Arg) am N-Ende davon (im Folgenden manchmal abgekürzt als hCS-15);
    • (2) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 3) enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von vier Aminosäuren (Asp-Arg-Met-Pro) am N-Ende (im Folgenden manchmal als hCS-13 abgekürzt);
    • (3) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 35) enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion einer Aminosäure (Lys) am C-Ende (im Folgenden manchmal abgekürzt als des Lys17-hCS-17);
    • (4) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 36) enthält, die aus der unter SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von zwei Aminosäuren (Asp-Arg) am N-Ende und einer Aminosäure (Lys) am C-Ende (im Folgenden manchmal abgekürzt als des Lys15-hCS-15);
    • (5) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 37) enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von vier Aminosäuren (Asp-Arg-Met-Pro) am N-Ende und einer Aminosäure (Lys) am C-Ende (im Folgenden manchmal abgekürzt als des Lys13-hCS-13);
    • (6) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 38) enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Substitution von Lys für den 6. Rest Arg (im Folgenden manchmal abgekürzt als [Lys6]hCS-17);
    • (7) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 39) enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von zwei Aminosäuren (Asp-Arg) am N-Ende und Substitution von Lys für den 4. Rest Arg (im Folgenden manchmal abgekürzt als [Lys4]hCS-15);
    • (8) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 40) enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von vier Aminosäuren (Asp-Arg-Met-Pro) am N-Ende und Substitution von Lys für den 2. Rest Arg (im Folgenden manchmal abgekürzt als [Lys2]hCS-13);
    • (9) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 41) enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion einer Aminosäure (Lys) am C-Ende und Substitution von Lys für den 6. Rest Arg (im Folgenden manchmal abgekürzt als des Lys17-[Lys6]hCS-17);
    • (10) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 42) enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 1. definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von zwei Aminosäuren (Asp-Arg) am N-Ende und einer Aminosäure (Lys) am C-Ende und Substitution von Lys für den 4. Rest Arg (im Folgenden manchmal abgekürzt als des Lys15-[Lys4]hCS-15);
    • (11) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 43) enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von vier Aminosäuren (Asp-Arg-Met-Pro) am N-Ende und einer Aminosäure (Lys) am C-Ende und Substitution von Lys für den 2. Rest Arg (im Folgenden manchmal abgekürzt als des Lys13-[Lys2]hCS-13);
    • (12) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 44) enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Substitution von Thr für den 14. Rest Ser (im Folgenden manchmal abgekürzt als [Thr14]hCS-17);
    • (13) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 45) enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von zwei Aminosäuren (Asp-Arg) am N-Ende und Substitution von Thr für den 12. Rest Ser (im Folgenden manchmal als [Thr12]hCS-15 bezeichnet);
    • (14) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 46) enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von vier Aminosäuren (Asp-Arg-Met-Pro) am N-Ende und Substitution von Thr für den 10. Rest Ser (im Folgenden manchmal als [Thr10]hCS-13 bezeichnet);
    • (15) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 47) enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von einer Aminosäure (Lys) am C-Ende und Substitution von Thr für den 14. Rest Ser (im Folgenden manchmal als des Lys17-[Thr14]hCS-1 bezeichnet);
    • (16) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 48) enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von zwei Aminosäuren (Asp-Arg) am N-Ende und einer Aminosäure (Lys) am C-Ende und Substitution von Thr für den 12. Rest Ser (im Folgenden manchmal als des Lys15-[Thr12]hCS-15 bezeichnet);
    • (17) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 49) enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von vier Aminosäuren (Asp-Arg-Met-Pro) am N- Ende und der Aminosäure (Lys) am C-Ende und Substitution von Thr für den 10. Rest Ser (im Folgenden manchmal als des Lys13-[Thr10]hCS-13 bezeichnet); (18) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 50), die aus der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Substitution von Lys für den 6. Rest Arg und Thr für den 14. Rest Ser (im Folgenden manchmal abgekürzt als [Lys6,Thr14]hCS-17);
    • (19) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 51) enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von zwei Aminosäuren (Asp-Arg) am N-Ende und Substitution von Lys für den 4. Rest Arg und von Thr für den 12. Rest Ser (im Folgenden manchmal abgekürzt als [Lys4,Thr12]hCS-15);
    • (20) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 52) enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von vier Aminosäuren (Asp-Arg-Met-Pro) am N-Ende und Substitution von Lys für den 2. Rest Arg und von Thr für den 10. Rest Ser (im Folgenden manchmal als [Lys2,Thr10]hCS-13 bezeichnet);
    • (21) ein Peptid, das eins, Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 53) enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz; abgeleitet ist durch Deletion einer Aminosäure (Lys) am C-Ende und Substitution von Lys für den 6. Rest Arg und von Thr für den 14. Rest Ser (im Folgenden manchmal als des Lys17-[Lys6,Thr14]hCS-17 bezeichnet);
    • (22) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 54) enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von zwei Aminosäuren (Asp-Arg) am N-Ende und einer Aminosäure (Lys) am C-Ende und Substitution von Lys für den 4. Rest Arg und Thr für den 12. Rest Ser (im Folgenden manchmal als des Lys15-[Lys4,Thr12]hCS-15 bezeichnet);
    • (23) ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 55) enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von vier Aminosäuren (Asp-Arg-Met-Pro) am N-Ende und einer Aminosäure (Lys) am C-Ende und Substitution von Lys für den 2. Rest Arg und Thr für den 10. Rest Ser (im Folgenden manchmal als des Lys19-[Lys1,Thr10]hCS-13 bezeichnet); etc.
  • Es ist anzumerken, dass das Peptid mit der in SEQ ID Nr. 31 definierten Aminosäuresequenz (bekanntes aus Ratten stammendes Cortistatin; r-Cortistatin in 3) und das Peptid mit der in SEQ ID Nr. 32 definierten Aminosäuresequenz (bekanntes aus der Ratte stammendes Somatostatin; r-Somatostatin in 3) aus der Gruppe der Peptide der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen sind.
  • Wenn das erfindungsgemäße Peptid zwei oder mehr Cysteinreste aufweist, ist es bevorzugt, dass diese Cysteinreste eine intramolekulare Disulfidbindung bilden. Z.B. können im Fall von hCS-17 der 5. und 16. Cysteinrest, der 3. und 14. Cysteinrest im Fall von hCS-15 oder der 1. und 12. Cysteinrest im Fall von hCS-13 eine Disulfidbindung bilden.
  • Das Peptid der vorliegenden Erfindung schließt weiterhin solche Peptide ein, bei denen die Aminogruppe des N-terminalen Aminosäurerestes mit einer Schutzgruppe geschützt ist (z.B. C1-C6-Acyl, wie C1-C6-Alkanoyl, z.B. Formyl, Acetyl etc.), solche Peptide mit einer Pyroglutamylgruppe, die aus einer Glutamylgruppe abgeleitet ist, die bei der in-vivo-Abspaltung auf der N-terminalen Seite entsteht, solche Peptide, bei denen ein oder mehrere Substituenten (z.B. -OH, -SH, Amino, Imidazolgruppe, Indolgruppe, Guanidino) an den Seitenketten der intramolekularen Aminosäuren mit geeigneten Schutzgruppen geschützt sind (z.B. C1-C6-Acyl, wie z.B. C1-C6-Alkanoyl, z.B. Formyl, Acetyl; C1-C6-Alkyl, z.B. Methyl), komplexe Peptide, wie die so genannten Zuckerpeptide, die durch Bindung einer Zuckerkette entstehen und dgl.
  • Der Vorläufer der vorliegenden Erfindung kann irgendein Peptid oder Protein sein, mit dem Vorbehalt, dass es das oben erwähnte Peptid der vorliegenden Erfindung enthält. Z.B. werden Peptide oder Proteine verwendet, die durch Addition eines oder mehrerer (bevorzugt etwa 2 bis 100) Aminosäurereste am N-Ende oder/und C-Ende des erfindungsgemäßen Peptids entstehen. Von diesen sind Peptide oder Proteine, die durch Addition von einem oder mehreren (bevorzugt etwa 2 bis 100) Aminosäureresten an das N-Ende des Peptids der Erfindung entstehen, bevorzugt.
  • Genauer werden jeweils solche Peptide, die durch Addition eines oder mehrerer Aminosäurereste (vom C-Ende gezählt) der Aminosäuresequenz (die aus 88 Aminosäureresten aufgebaut ist), die unter SEQ ID Nr. 29 definiert ist, an das N-Ende des Peptids mit der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz entstehen, z.B. jeweils als Vorläufer der vorliegenden Erfindung verwendet.
  • Somit sind geeignet z.B.:
    • ➀ Ein Vorläuferpeptid, das die in SEQ ID Nr. 4 definierte Aminosäuresequenz (aus 29 Aminosäureresten aufgebaut) enthält (im Folgenden manchmal abgekürzt als hCS-29);
    • ➁ ein Vorläuferpeptid, das die in SEQ ID Nr. 5 definierte Aminosäuresequenz (aufgebaut aus 62 Aminosäureresten) enthält (im Folgenden manchmal abgekürzt als hCS-62);
    • ➂ ein Vorläuferpeptid, das die in SEQ ID Nr. 6 definierte Aminosäuresequenz (aufgebaut aus 85 Aminosäureresten) enthält (im Folgenden manchmal abgekürzt als hCS-85);
    • ➃ ein Vorläuferpeptid, das die in SEQ ID Nr. 7 definierte Aminosäuresequenz (aufgebaut aus 105 Aminosäureresten) enthält (im Folgenden manchmal abgekürzt als hCS-105);
    • ➄ ein Vorläuferpeptid, das eine Aminosäuresequenz enthält, die im Wesentlichen gleich ist wie die in SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6 oder SEQ ID Nr. 7 definierten Aminosäuresequenz und dgl.
  • Als Beispiele für das Vorläuferpeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen die gleiche ist wie die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6 oder SEQ ID Nr. 7 definiert ist, die verwendet werden können, sind die folgenden zu erwähnen:
    • (1) Ein Peptid, das ➀ eine Aminosäuresequenz enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 4 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten, ➁ eine Aminosäuresequenz, die aus der in SEQ ID Nr. 4 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Addition von etwa 1 bis 15 Aminosäureresten oder ➂ eine Aminosäuresequenz, die aus der in SEQ ID Nr. 4 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Substitution von etwa 1 bis 8 Aminosäureresten, die darin enthalten sind, durch andere Aminosäurereste;
    • (2) ein Peptid, das ➀ eine Aminosäuresequenz enthält, die von der in SEQ ID Nr. 5 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von etwa 1 bis 15 Aminosäureresten, ➁ eine Aminosäuresequenz, die von der in SEQ ID Nr. 5 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Addition von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten oder ➂ eine Aminosäuresequenz enthält, die von der in SEQ ID Nr. 5 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Substitution von etwa 1 bis 20 Aminosäureresten, die darin vorhanden sind, durch andere Aminosäurereste;
    • (3) ein Peptid, das ➀ eine Aminosäuresequenz enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 6 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten, ➁ eine Aminosäuresequenz, die aus der in SEQ ID Nr. 6 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Addition von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten oder ➂ Aminosäuresequenz, die von der in SEQ ID Nr. 6 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Substitution von etwa 1 bis 20 Aminosäureresten, die darin vorhanden sind, durch andere Aminosäurereste;
    • (4) ein Peptid, das ➀ eine Aminosäuresequenz enthält, die von der in SEQ ID Nr. 7 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten, ➁ eine Aminosäuresequenz, die von der in SEQ ID Nr. 7 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Addition von etwa 1 bis 20 Aminosäureresten oder ➂ eine Aminosäuresequenz enthält, die von der in SEQ ID Nr. 7 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Substitution von etwa 1 bis 20 Aminosäureresten, die darin vorhanden sind, durch andere Aminosäurereste und dgl.
  • Genauer wird unter anderem von Folgenden Verwendung gemacht:
    • ➀ Ein Vorläuferpeptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 56) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 4 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Substitution von Lys für den 18. Rest Arg (im Folgenden manchmal abgekürzt als [Lys18]hCS-29);
    • ➁ ein Vorläuferpeptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 57) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 4 definierten Aminosäuresequez abgeleitet ist durch Substitution von Thr für den 26. Rest Ser (im Folgenden manchmal abgekürzt als [Thr26]hCS-29);
    • ➂ ein Vorläuferpeptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 58) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 4 definierten Aminosäuresequez abgeleitet ist durch Substitution von Lys für den 18. Rest Arg und von Thr für den 26. Rest Ser (im Folgenden manchmal abgekürzt als [Lys18,Thr26]hCS-29);
    • ➃ ein Vorläuferpeptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 59) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 4 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Substitution von Lys für den 18. Rest Arg und Deletion des 29. Restes Lys (im Folgenden manchmal abgekürzt als des Lys29-[Lys18]hCS-29);
    • ➄ ein Vorläuferpeptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 60) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 4 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Substitution von Thr für den 26. Rest Ser und Deletion des 29. Restes Lys (im Folgenden manchmal abgekürzt als des Lys19-[Thr26]hCS-29);
    • ➅ ein Vorläuferpeptid, das eine Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 61) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 4 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Substitution von Lys für den 18. Rest Arg und von Thr für den 26. Rest Ser und durch Deletion des 29. Restes Lys (im Folgenden manchmal abgekürzt als des Lys29-[Lys 18Thr26]hCS-29);
    • ➆ ein Vorläuferpeptid, das eine Aminosäuresequenz enthält, die von den in SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6 oder SEQ ID Nr. 7 definierten Aminosäuresequenzen abgeleitet ist durch Deletion des C-terminalen Lys (im Folgenden manchmal abgekürzt als des Lys29 hCS-29, des Lys62 hCS-62, des Lys85 hCS-85 bzw. Lys105 hCS-105) und dgl.
  • Wenn das Vorläuferpeptid der vorliegenden Erfindung zwei oder mehr Cysteinreste hat, ist es bevorzugt, dass diese Cysteinreste eine intramolekulare Disulfidbindung bilden. Z.B. können im Fall von hCS-29 die Cysteinreste an den Positionen 17 und 28 eine Disulfidbindung bilden.
  • Wie das oben erwähnte Peptid der vorliegenden Erfindung schließt das Vorläuferpeptid der Erfindung weiterhin solche Peptide ein, bei denen die Aminogruppe am N-terminalen Aminosäurerest mit einer Schutzgruppe geschützt ist, solche Peptide mit einer Pyroglutamylgruppe, die von einer Glutamylgruppe abgeleitet ist, die bei in-vivo-Spaltung der N-terminalen Seite entsteht, solche Peptide, bei denen ein oder mehrere Substituenten an den Seitenketten der intramolekularen Aminosäuren mit geeigneten Schutzgruppen geschützt sind und komplexe Peptide, wie die so genannten Zuckerpeptide, die durch Bindung einer Zuckerkette und dgl. entstehen.
  • Die Peptide oder Vorläufer dieser Beschreibung werden gemäß den Konventionen zur Beschreibung von Peptiden dargestellt, d.h. das N-Ende (Aminoende) links und das C-Ende (Carboxylende) rechts. Das Peptid der vorliegenden Erfindung einschließlich des Proteins, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 enthält, ist gewöhnlich in Carboxyl-(-COOH)- oder Carboxylat-(COO–)-Form am C-Ende, kann aber auch in Form eines Amids(-CONH2) oder Esters(-COOR) sein.
  • R im Esterrest schließt eine C1-C6-Alkylgruppe (z.B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl etc., eine C3-C8-Cycloalkylgruppe (z.B. Cyclopentyl, Cyclohexyl etc.), eine C6-C12-Arylgruppe (z.B. Phenyl, α-Naphthyl etc.), eine C7-C24-Aralkylgruppe, wie Phenyl-C1-C2-alkylgruppe (z.B. Benzyl, Phenethyl etc.) und α-Naphthyl-C1-C2-alkyl (z.B. α-Naphthylmethyl etc.) ein, ebenso wie eine Pivaloyloxymethylgruppe, die oft zur Herstellung von Ester für die orale Verabreichung verwendet wird.
  • Wenn die Peptide oder Vorläufer der vorliegenden Erfindung eine Carboxyl- oder Carboxylatfunktion an irgendeiner anderen Position als dem C-Ende haben, ist die entsprechende Carboxamid- oder Esterform auch im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung enthalten. Die direkt oben erwähnten Ester können irgendwelche Ester sein, die für C-terminale Carboxylgruppen erwähnt sind.
  • Die Salze des Peptids oder Vorläufers der vorliegenden Erfindung schließen Salze ein, die physiologisch annehmbare Säureadditionssalze sind. Beispiele für solche Salze sind Salze mit anorganischen Säuren (z.B. Salzsäure, Phosphorsäure, Bromwasserstoffsäure oder Schwefelsäure etc.) und Salze mit organischen Säuren (z.B. Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Citronensäure, Äpfelsäure, Oxalsäure, Benzoesäure, Methansulfonsäure oder Benzolsulfonsäure etc.).
  • Das Peptid, der Vorläufer der vorliegenden Erfindung oder ein Salz davon können aus den Geweben oder Zellen von Menschen oder anderen warmblütigen Tieren mit an sich bekannten Reinigungstechniken oder, wie im Folgenden beschrieben, durch Kultivierung eines Transformanten, der eine DNA trägt, die das Protein codiert, gewonnen werden. Es kann auch mit den Verfahren zur Peptidsynthese, die weiter unten beschrieben werden, hergestellt werden.
  • Wenn das Peptid oder der Vorläufer der vorliegenden Erfindung aus den Geweben oder Zellen von Menschen oder anderen warmblütigen Tieren erzeugt wird, werden die Gewebe oder Zellen von Menschen oder anderen warmblütigen Tieren homogenisiert und das Peptid der vorliegenden Erfindung mit einer Saure etc. extrahiert. Das Peptid kann aus der extrahierten Lösung durch eine Kombination von Chromatographie, wie Reverse-Phase-Chromatographie, Ionenaustauschchromatographie usw. isoliert und gereinigt werden.
  • Zur Synthese des Peptids, des Vorläufers oder von deren Salzen, oder der Amidform der vorliegenden Erfindung können irgendwelche im Handel erhältliche Harze, die zur Proteinsynthese verfügbar sind, angewendet werden. Zu solchen Harzen gehören Chlormethylharz, Hydroxymethylharz, Benzhydrylaminoharz, Aminomethylharz, 4-Benzyloxybenzylalkoholharz, 4-Methylbenzhydrylaminoharz, PAM-Harz, 4-Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethylharz, Polyacrylamidharz, 4-(2',4'-Dimethoxyphenylhydroxymethyl)phenoxyharz und 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminoethyl)phenoxyharz. Unter Verwendung eines solchen Harzes können Aminosäuren zuerst an den funktionellen Gruppen der Seitenketten in geeigneter Weise geschützt werden und aufeinander folgend mit der α-Aminogruppe in der Reihenfolge, die der Aminosäuresequenz des jeweiligen Proteins entspricht, durch verschiedene Kondensationstechniken, die an sich bekannt sind, kondensiert werden. Nach Abschluss der letzten Kondensationsreaktion wird das Protein von dem Harz getrennt und die Schutzgruppen werden entfernt. Dann wird in hochverdünnter Lösung die Reaktion zur intramolekularen Disulfidbildung durchgeführt, um die jeweiligen Proteine oder Amide davon bereitzustellen.
  • Bezug nehmend auf die obige Kondensation geschützter Aminosäuren können verschiedene Aktivierungsmittel, von denen bekannt ist, dass sie für die Proteinsynthese geeignet sind, verwendet werden und Carbodiimidreagenzien sind besonders bevorzugt. Die Carbodiimidreagenzien schließen DCC, N,N'-Diisopropylcarbodiimid und N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminoprolyl)carbodiimid usw. ein. Für die Aktivierung durch diese Reagenzien können die geschützte Aminosäure und ein Racemisierungsinhibitor (z.B. HOBt, HOOBt etc.) direkt dem Harz zugefügt werden oder die geschützte Aminosäure kann vorher in Form eines symmetrischen Säureanhydrids, HOBt-Esters oder HOOBt-Esters aktiviert werden und dann dem Harz zugefügt werden.
  • Das für die oben erwähnte Aktivierung der geschützten Aminosäuren verwendete Lösungsmittel oder für die Konjugation an das Harz verwendete Lösungsmittel kann in geeigneter Weise ausgewählt werden aus den Lösungsmitteln, von denen bekannt ist, dass sie für Proteinkondensationsreaktionen nützlich sind. Beispiele für das Lösungsmittel sind saure Amide (z.B. N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid, N-Methylpyrrolidon etc.), halogenierte Kohlenwasserstoffe (z.B. Methylenchlorid, Chloroform etc.), Alkohole (z.B. Trifluorethanol etc.), Sulfoxide (z.B. Dimethylsulfoxid etc.), Ether (z.B. Pyridin, Dioxan, Tetrahydrofuran etc.), Nitrile (z.B. Acetonitril, Propionitril etc), Ester (z.B. Methylacetat, Ethylacetat etc.) und geeignete Mischungen dieser Lösungsmittel. Die Reaktionstemperatur kann aus einem Bereich ausgewählt werden, von dem bekannt ist, dass er für Proteinbildungsreaktionen nützlich ist, gewöhnlich ein Bereich von etwa –20°C bis etwa 50°C. Das aktivierte Aminosäurederivat wird im Allgemeinen in einem 1,5- bis 4-fachen Überschuss verwendet. Wenn die Kondensation sich als unzureichend erweist gemäß Ninhydrintest, kann die Reaktion wiederholt werden, um die Kondensation durchgehend ausreichend zu machen. Wenn eine ausreichende Kondensation nicht erreicht werden kann durch wiederholte Reaktion, kann unreagierte Aminosäure unter Verwendung von Essigsäureanhydrid oder Acetylimidazol acetyliert werden, um nachfolgende Reaktionen zu verhindern.
  • Die Schutzgruppen zum Schutz der Aminogruppe der Ausgangsverbindung schließen Z, Boc, t-Pentyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, Adamantyloxycarbonyl, Trifluoracetyl, Phthaloyl, Formyl, 2-Nitrophenylsulfenyl, Diphenylphosphinothioyl, Fmoc usw. ein.
  • Die Carboxylgruppe kann z.B. in Form eines Alkylesters (z.B. geradkettige, verzweigte oder cyclische Alkylester, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, t-Butyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, Cyclooctyl, 2- Adamantyl usw.), eines Aralkylesters (z.B. Benzyl, 4-Nitrobenzyl, 4-Methoxybenzyl, 4-Chlorbenzyl, Benzhydryl usw.), Phenacylesters, Benzyloxycarbonylhydrazids, t-Butoxycarbonylhydrazids oder Tritylhydrazids geschützt werden.
  • Die Hydroxylgruppe von Serin kann in Form eines Esters oder eines Ethers geschützt werden. Die Gruppe, die für die Veresterung geeignet ist, schließt von Carbonsäuren abgeleitete Acylgruppen, wie Niedrig-(C1-C6)-alkanoylgruppen (z.B. Acetyl etc.), eine Aroylgruppe (z.B. Benzoyl etc.), eine Benzyloxycarbonylgruppe, eine Ethoxycarbonylgruppe usw. ein. Die Gruppe, die zur Veretherung geeignet ist, schließt eine Benzylgruppe, eine Tetrahydropyranylgruppe, eine t-Butylgruppe usw. ein.
  • Die zum Schutz der phenolischen Hydroxylgruppe von Tyrosin verwendete Schutzgruppe schließt Bzl, C12-Bzl, 2-Nitrobenzyl, Br-Z, t-Butyl usw. ein.
  • Die für die Imidazolgruppe von Histidin verwendete Schutzgruppe schließt Tos, 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl, DNP, Benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc usw. ein.
  • Die Ausgangsverbindung mit aktivierten Carboxylgruppen schließt das entsprechende Säureanhydrid, Azid und aktive Ester (z.B. Ester mit Alkoholen, wie Pentachlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, 2,4-Dinitrophenol, Cyanomethylalkohol, p-Nitrophenol, HONB, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid, HOBt etc.) ein. Die Ausgangsverbindung mit aktivierten Aminogruppen schließt das entsprechende Phosphorylamid ein.
  • Das Verfahren zur Entfernung solcher Schutzgruppen schließt die katalytische Reduktion in einem Wasserstoffstrom in Gegenwart eines Katalysators (z.B. Pd-Schwarz oder Pd auf Kohlenstoff), die saure Behandlung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff, Methansulfonsäure, Trifluormethansulfonsäure, Trifluoressigsäure oder einer Mischung davon, Behandlung mit einer Base, wie Diisopropylethylamin, Triethylamin, Piperidin, Piperazin oder dgl., und die Reduktion mit Natriummetall in flüssigem Ammoniak ein. Die obige Abspaltung der Schutzgruppen durch Behandlung mit einer Same wird im Allgemeinen bei einer Temperatur von etwa –20 bis 40°C durchgeführt. Diese Säurebehandlung kann vorteilhafterweise in Gegenwart eines Kationenakzeptors, wie Anisol, Phenol, Thioanisol, m-Kresol, p-Kresol, Dimethylsulfid, 1,4-Butandithiol, 1,2-Ethandithiol oder dgl. durchgeführt werden. Die 2,4-Dinitrophenylgruppe, die zum Schutz der Imidazolgruppe von Histidin verwendet wird, kann durch Behandlung mit Thiophenol entfernt werden und die Formylgruppe, die zum Schutz der Indolgruppe von Tryptophan verwendet wird, kann nicht nur durch die obige Säurebehandlung in Gegenwart von 1,2-Ethandithiol, 1,4-Butandithiol oder dgl., wie vorher beschrieben, entfernt werden, sondern auch durch alkalische Behandlung mit verdünnter Natriumhydroxidlösung, verdünntem flüssigen Ammoniak oder dgl.
  • Das Verfahren nun Schutz irgendwelcher funktioneller Gruppen, die nicht an der vorgesehenen Reaktion teilnehmen sollten, die für einen solchen Schutz verwendete Schutzgruppe, das Verfahren zur Entfernung der Schutzgruppe und das Verfahren zur Aktivierung der funktionellen Gruppe, die an der vorgesehenen Reaktion beteiligt ist, können alle in geeigneter Weise aus den bekannten Methoden und Gruppen ausgewählt werden.
  • Eine alternative Methode zur Bereitstellung des Peptids oder Vorläufers in Amidform beinhaltet typischerweise, dass die α-Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure in Form eines Amids geschützt wird, die Peptidkette auf eine gewünschte Länge hin zum N-Ende verlängert wird, die N-terminale α-Aminosäure der entstehenden Peptidkette selektiv von Schutzgruppen befreit wird, um ein N-terminal nicht mit Schutzgruppen versehenes Fragment bereitzustellen, ein Peptidfragment hergestellt wird, bei dem die C-terminale Carboxylgruppe selektiv von einer Schutzgruppe befreit ist und die zwei Fragmente in einem Lösungsmittel kondensiert werden, z.B. einem gemischten Lösungsmittel, wie oben erwähnt. Die Kondensationsreaktion kann auf gleiche Art und Weise, wie vorher beschrieben, durchgeführt werden. Nach Reinigung des so durch Kondensation erhaltenen geschützten Peptids werden alle Schutzgruppen durch vorher beschriebene Verfahren entfernt, um das vorgesehen, Peptid in roher Form bereitzustellen. Dieses rohe Peptid wird mit geeigneten bekannten Reinigungstechniken gereinigt und lyophilisiert, um das gewünschte Peptidamid bereitzustellen.
  • Ein Verfahren zur Breitstellung des Peptids oder Vorläufers in Esterform beinhaltet, dass die α-Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure mit einem geeigneten Alkohol kondensiert wird, um den entsprechenden Ester herzustellen und dieser Ester dem gleichen Verfahren, wie vorher zur Reinigung des Peptidamids beschrieben, unterworfen wird, um den jeweiligen Peptidester bereitzustellen.
  • Das Peptid, der Vorläufer der vorliegenden Erfindung oder ein Salz davon können mit an sich bekannten Verfahren zur Peptidsynthese hergestellt werden. Das Peptid der vorliegenden Erfindung kann auch hergestellt werden, indem der Vorlaufer der vorliegenden Erfindung mit einer geeigneten Peptidase gespalten wird. Das Verfahren zur Peptidsynthese kann eine Festphasensynthese und/oder eine Flüssigphasensynthese sein. Das jeweilige Peptid kann nämlich hergestellt werden, indem ein Teilpeptid oder eine Aminosäure, die das Protein bilden kann, kondensiert werden mit dem restlichen Teil davon und, wenn das Peptid eine Schutzgruppe hat, die Schutzgruppe entfernt wird, wodurch ein gewünschtes Peptid hergestellt werden kann. Die bekannte Technologie zur Kondensation und Abspaltung von Schutzgruppen schließt Verfahren ein, die in den folgenden Literaturstellen beschrieben werden (1) bis (5).
    • (1) M. Bodanszky und M.A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York, 1966
    • (2) Schroeder und Luebke, The Peptide, Academic Press, New York, 1965
    • (3) Nobuo Izumiya et al., Fundamentals and Experiments in Peptide Synthesis, Maruzen, 1975
    • (4) Haruaki Yajima und Shumpei Sakakibara, Biochemical Experiment Series 1, Protein Chemistry IV, 205, 1977
    • (5) Haruaki Yajima (Herausgeber), Development of Drugs-Continued, 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten
  • Das Peptid mit mehr als zwei und einer geraden Anzahl von Disulfidbindungen im Molekül kann erhalten werden durch übliche Oxidationsmethoden. Die Oxidation wird gewöhnlich durch Luftoxidation oder Iodoxidation des Peptids durchgeführt.
  • Nach der Reaktion kann das Peptid der vorliegenden Erfindung isoliert und gereinigt werden mit einer Kombination üblicher Reinigungstechniken, wie Lösungsmittelextraktion, Destillation, Säulenchromatographie, Flüssigchromatographie und Umkristallisation. Wenn das oben isolierte Peptid in freier Form ist, kann es in ein geeignetes Salz mit bekannten Methoden oder dazu analogen Methoden umgewandelt werden. Andererseits kann es, wenn es als Salz isoliert wird, in die freie Form umgewandelt werden oder in irgendein anderes Salz davon mit bekannten Methoden oder dazu analogen Methoden.
  • Der Vorläufer der vorliegenden Erfindung ist nützlich zur Herstellung des Peptids der vorliegenden Erfindung. Außerdem hat der Vorläufer der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen die gleiche Aktivität wie das Peptid der vorliegenden Erfindung, d.h. eine Cortistatin-artige oder Somatostatin-artige Aktivität. Daher hat der Vorläufer der vorliegenden Erfindung den gleichen Nutzen wie das Peptid der vorliegenden Erfindung.
  • Solche Peptidfragmente einschließlich der Salze davon, die bei der Erzeugung des reifen Peptids der vorliegenden Erfindung durch Spaltung des Vorläufers der Erfindung gebildet werden, sind auch physiologisch nützliche Peptide. Nützlich als solche Peptidfragmente sind z.B. Peptide mit einer Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 10, SEQ ID Nr. 11 bzw. SEQ ID Nr. 12 definiert wird und dgl. Als Salze dieser Peptidfragmente können Salze der gleichen Art erwähnt werden, wie die oben im Hinblick auf Salze des Peptids und des Vorläufers der Erfindung erwähnten.
  • Diese Peptidfragmente und Salze können hergestellt werden, indem der oben erwähnte Vorläufer der Erfindung gespalten wird unter Verwendung einer geeigneten Peptidase oder mit der Peptidsynthesetechnik, die hier später erwähnt werden wird.
  • Diese Peptidfragmente und Salze sind z.B. auch nützlich als Antigene zur Verwendung zur Herstellung von Antikörpern gegen den Vorläufer der Erfindung. Diese Peptidfragmente und Salze sind weiterhin wichtig, um den Mechanismus der in-vivo-Bildung des Peptids der Erfindung zu untersuchen. Weiterhin haben sie eine das zentrale Nervensystem oder die reproduktive Funktion modulierende Wirkung und sind nützlich als Modulatoren für das zentrale Nervensystem oder die reproduktive Funktion.
  • Die DNA, die das Peptid oder den Vorläufer der Erfindung codiert, kann irgendeine DNA sein, vorausgesetzt, dass sie die Nucleotidsequenz enthält, die das oben erwähnte Peptid oder den Vorläufer der Erfindung codiert. Es kann eine genomische DNA, eine genomische DNA-Bibliothek, eine cDNA, die aus den oben erwähnten Zellen oder Geweben stammt, eine cDNA-Bibliothek, die aus den oben erwähnten Zellen oder Geweben stammt, oder eine synthetische DNA sein. Der Vektor, der zur Konstruktion der Bibliothek verwendet wird, kann irgendein Bakteriophage, ein Plasmid, ein Cosmid, Phagemid und dgl. sein. Weiterhin kann die gesamte RNA oder eine mRNA-Fraktion, die aus den oben erwähnten Zellen oder Geweben hergestellt wurde, direkt zur Amplifikation mit Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion-(im Folgenden abgekürzt als RT PCR)-Technik verwendet werfen.
  • Spezifisch kann z.B. die DNA, die ein Peptid mit der gleichen oder im Wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz, wie die in SEQ ID Nr. 1 definierte Aminosäuresequenz der Erfindung codiert, eine) DNA sein, die die Nucleotidsequenz enthält, die in SEQ ID Nr. 13 definiert ist, oder ➁ irgendeine DNA mit einer Nucleotidsequenz, die mit der in SEQ ID Nr. 13 definierten Nucleotidsequenz unter hochstringenten Bedingungen hybridisieren kann und ein Peptid codiert mit den gleichen Aktivitäten, wie die des Peptids mit der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz (z.B. Somatostatin-artige Aktivität, Cortistatin-artige Aktivität).
  • Nützlich als DNA, die mit der Nucleotidsequenz, die in SEQ ID Nr. 13 definiert ist, hybridisieren kann, ist z.B. eine DNA, die eine Nucleotidsequenz enthält mit einer Homologie von nicht weniger als etwa 70%, bevorzugt nicht weniger als etwa 80%, bevorzugter nicht weniger als etwa 90%, am meisten bevorzugt nicht weniger als etwa 95% bezogen auf die Nucleotidsequenz, die in SEQ ID Nr. 13 definiert ist.
  • Genauer ist als DNA, die ein Peptid codiert, das die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 1 definiert ist, enthält, eine DNA mit der Nucleotidsequenz, die in SEQ ID Nr. 13 definiert ist oder dgl. geeignet.
  • Die DNA, die für ein Muteinpeptid der vorliegenden Erfindung vom Deletionstyp codiert, das die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie die in SEQ ID Nr. 2 definierte Aminosäuresequenz enthält, ist z.B. ➀ eine DNA, die die in SEQ ID Nr. 14 definierte Nucleotidsequenz enthält oder ➁ irgendeine DNA mit einer Nucleotidsequenz, die mit der in SEQ ID Nr. 14 definierten Nucleotidsequenz unter hochstringenten Bedingungen hybridisieren kann und ein Peptid mit den gleichen Aktivitäten codiert, wie die des Peptids mit der in SEQ ID Nr 2 definierten Aminosäuresequenz (z.B. Somatostatin-artige Aktivität, Cortistatin-artige Aktivität).
  • Nützlich als DNA, die mit der in SEQ ID Nr. 14 definierten Nucleotidsequenz hybridisieren kann, ist z.B. eine DNA, die eine Nucleotidsequenz enthält mit einer Homologie von nicht weniger als etwa 70%, bevorzugt nicht weniger als etwa 80%, bevorzugter nicht weniger als etwa 90%, am meisten bevorzugt nicht weniger als etwa 95% bezogen auf die Nucleotidsequenz, die in SEQ ID Nr. 14 definiert ist.
  • Die DNA, die für ein Muteinpeptid der vorliegenden Erfindung vom Deletionstyp codiert, die die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie die in SEQ ID Nr. 3 definierte Aminosäuresequenz enthält, ist z.B. ➀ eine DNA, die die in SEQ ID Nr. 15 definierte Nucleotidsequenz enthält oder ➁ irgendeine DNA mit einer Nucleotidsequenz, die mit der in SEQ ID Nr. 15 definierten Nucleotidsequenz unter hochstringenten Bedingungen hybridisieren kann und ein Peptid mit den gleichen Aktivitäten codiert, wie die des Peptids mit der in SEQ ID Nr. 3 definierten Aminosäuresequenz (z.B. Somatostatin-artige Aktivität, Cortistatin-artige Aktivität).
  • Nützlich als DNA, die mit der in SEQ ID Nr. 15 definierten Nucleotidsequenz hybridisieren kann, ist z.B. eine DNA, die eine Nucleotidsequenz enthält mit einer Homologie von nicht weniger als etwa 70%, bevorzugt nicht weniger als etwa 80%, bevorzugter nicht weniger als etwa 90%, am meisten bevorzugt nicht weniger als etwa 95% bezogen auf die Nucleotidsequenz, die in SEQ ID Nr. 15 definiert ist.
  • Die Hybridisierung kann mit einer an sich bekannten Methode oder einer Modifikation durchgeführt werden, z.B. der in Molecular Cloning, 2. Auflage (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) beschriebenen Methode. Wenn eine kommerzielle Bibliothek verwendet wird, kann sie nach der in den beigefügten Betriebsanleitungen beschriebenen Methode durchgeführt werden. Bevorzugter kann sie unter hochstringenten Bedingungen durchgeführt werden.
  • Hochstringente Bedingungen beziehen sich z.B. auf die folgenden Bedingungen: eine Natriumkonzentration von etwa 19 bis 40 mM, bevorzugt etwa 19 bis 20 mM und eine Temperatur von etwa 50 bis 70°C, bevorzugt etwa 60 bis 65°C. Am meisten bevorzugt ist eine Natriumkonzentration von etwa 19 mM und eine Temperatur von etwa 65°C.
  • Die DNA, die eine Nucleotidsequenz enthält (z.B. die in SEQ ID Nr. 33 definierte Nucleotidsequenz), die für Rattencortistatin codiert mit der in SEQ ID Nr. 31 definierten Aminosäuresequenz und die DNA, die eine Nucleotidsequenz enthält (z.B. die in SEQ ID Nr. 34 definierte Nucleotidsequenz), die für Rattensomatostatin codiert mit der in SEQ ID Nr. 32 definierten Aminosäuresequenz sind aus der Gruppe von DNAs, die das Peptid der vorliegenden Erfindung codieren, ausgeschlossen.
  • Genauer werden unter anderem die Folgenden verwendet:
    • (1) Eine DNA, die die in SEQ ID Nr. 14 definierte Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 14) enthält, als DNA, die für ein Mutein vom Deletionstyp codiert mit der in SEQ ID Nr. 2 definierten Aminosäuresequenz;
    • (2) eine DNA, die die in SEQ ID Nr. 15 definierte Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 15) enthält, als DNA, die für ein Mutein vom Deletionstyp codiert mit der in SEQ ID Nr. 3 definierten Aminosäuresequenz;
    • (3) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 62) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 13 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Deletion von drei Nucleotiden (AAA) am 3'-Ende als DNA, die für ein Mutein vom Deletionstyp codiert mit der in SEQ ID Nr. 35 definierten Aminosäuresequenz;
    • (4) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 63) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 14 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Deletion von drei Nucleotiden (AAA) am 3'-Ende als DNA, die für ein Mutein vom Deletionstyp codiert mit der in SEQ ID Nr. 36 definierten Aminosäuresequenz;
    • (5) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 64) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 15 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Deletion von drei Nucleotiden (AAA) am 3'-Ende als DNA, die ein Mutein vom Deletionstyp codiert mit der in SEQ ID Nr. 37 definierten Aminosäuresequenz;
    • (6) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 65) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 13 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Substitution von AAR (wobei R G oder A ist) für die Nucleotide 16 bis 18 AGG als DNA, die für ein Mutein vom Substitutionstyp codiert mit der in SEQ ID Nr. 38 definierten Aminosäuresequenz;
    • (7) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz enthält (SEQ ID Nr. 66), die von der in SEQ ID Nr. 14 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Substitution von AAR (wobei R G oder A ist) für die Nucleotide 10 bis 12 AGG als DNA, die für ein Mutein vom Substitutionstyp codiert mit der in SEQ ID Nr. 39 definierten Aminosäuresequenz;
    • (8) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 67) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 15 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Substitution von AAR (wobei R G oder A ist) für die Nucleotide 4 bis 6 AGG als DNA, die ein Mutein vom Substitutionstyp codiert mit der in SEQ ID Nr. 40 definierten Aminosäuresequenz;
    • (9) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 68) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 13 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Deletion von drei Nucleotiden (AAA) am 3'-Ende und Substitution von AAR (wobei R G oder A ist) für die Nucleotide 16 bis 18 AGG als DNA, die ein Mutein vom Substitutions/Deletionstyp codiert mit der in SEQ ID Nr. 41 definierten Aminosäuresequenz;
    • (10) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 69) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 14 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Deletion von drei Nucleotiden (AAA) am 3'-Ende und Substitution von AAR (wobei R G oder A ist) für die Nucleotide 10 bis 12 AGG als DNA, die ein Mutein vom Substitutions/Deletionstyp codiert mit der in SEQ ID Nr. 42 definierten Aminosäuresequenz;
    • (11) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 70) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 15 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Deletion von drei Nucleotiden (AAA) am 3'-Ende und Substitution von AAR (wobei R G oder A ist) für die Nucleotide 4 bis 6 AGG als DNA, die ein Mutein vom Substitutions/Deletionstyp codiert mit der in SEQ ID Nr. 43 definierten Aminosäuresequenz;
    • (12) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 71) enthält, die von der Nucleotidsequenz, die in SEQ ID Nr. 13 definiert ist, abgeleitet ist durch Substitution von ACN (wobei N A, C, G oder T ist) für die Nucleotide 40 bis 42 TCC als DNA, die ein Mutein vom Substitutionstyp codiert mit der in SEQ ID Nr. 44 definierten Aminosäuresequenz;
    • (13) eine DNA, die eine Nucleotidsequeuz (SEQ ID Nr. 72) enthält, die von der Nucleotidsequenz, die in SEQ ID Nr. 14 definiert ist, abgeleitet ist durch Substitution von ACN (wobei N A, C, G oder T ist) für die Nucleotide 34 bis 36 TCC als DNA, die ein Mutein vom Substitutionstyp codiert mit der in SEQ ID Nr. 45 definierten Aminosäuresequenz;
    • (14) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 73) enthält, die von der Nucleotidsequenz, die in SEQ ID Nr. 15 definiert ist, abgeleitet ist durch Substitution von ACN (wobei N A, C, G oder T ist) für die Nucleotide 28 bis 30 TCC als DNA, die ein Mutein vom Substitutionstyp codiert mit der in SEQ ID Nr. 46 definierten Aminosäuresequenz;
    • (15) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 74) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 13 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Deletion von drei Nucleotiden (AAA) vom 3'-Ende und durch Substitution von ACN (wobei N A, C, G oder T ist) für die Nucleotide 40 bis 42 TCC als DNA, die ein Mutein vom Deletions-/Substitutionstyp codiert mit der in SEQ ID Nr. 47 definierten Aminosäuresequenz;
    • (16) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 75) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 14 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Deletion von drei Nucleotiden (AAA) am 3'-Ende und durch Substitution von ACN (wobei N A, C, G oder T ist) für die Nucleotide 34 bis 36 TCC als DNA, die ein Mutein vom Deletions-/Substitutionstyp codiert mit der in SEQ ID Nr. 48 definierten Aminosäuresequenz;
    • (17) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 76) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 15 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Deletion von drei Nucleotiden (AAA) vom 3'-Ende und durch Substitution von ACN (wobei N A, C, G oder T ist) für die Nucleotide 28 bis 30 TCC als DNA, die ein Mutein vom Deletions-/Substitutionstyp codiert mit der in SEQ ID Nr. 49 definierten Aminosäuresequenz;
    • (18) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 77) enthält, die aus der in SEQ ID Nr. 13 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Substitution von AAR (wobei R G oder A ist) für die Nucleotide 16 bis 18 AGG und von ACN (wobei N A, C, G oder T ist) für die Nucleotide 40 bis 42 TCC als DNA, die ein Mutein vom Substitutionstyp codiert mit der in SEQ ID Nr. 50 definierten Aminosäuresequenz;
    • (19) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 78) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 14 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Substitution von AAR (wobei R G oder A ist) für die Nucleotide 10 bis 12 AGG und von ACN (wobei N A, C, G oder T ist) für die Nucleotide 34 bis 36 TCC als DNA, die ein Mutein vom Substitutionstyp codiert mit der in SEQ ID Nr. 51 definierten Aminosäuresequenz;
    • (20) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 79) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 15 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Substitution von AAR (wobei R G oder A ist) für die Nucleotide 4 bis 6 AGG und von ACN (wobei N A, C, G oder T ist) für die Nucleotide 28 bis 30 TCC als DNA, die für ein Mutein vom Substitutionstyp codiert mit der in SEQ ID Nr. 52 definierten Aminosäuresequenz;
    • (21) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 80) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 13 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Deletion von drei Nucleotiden (AAA) am 3'-Ende und Substitution von AAR (wobei R G oder A ist) für die Nucleotide 16 bis 18 AGG und von ACN (wobei N A, C, G oder T ist) für die Nucleotide 40 bis 42 TCC als DNA, die ein Mutein vom Deletion-/Substitutionstyp codiert mit der in SEQ ID Nr. 53 definierten Aminosäuresequenz;
    • (22) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 81) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 14 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Deletion von drei Nucleotiden (AAA) am 3'-Ende und Substitution von AAR (wobei R G oder A ist) für die Nucleotide 10 bis 12 AGG und von ACN (wobei N A, C, G oder T ist) für die Nucleotide 34 bis 36 TCC als DNA, die ein Mutein vom Deletion-/Substitutionstyp codiert mit der in SEQ ID Nr. 54 definierten Aminosäuresequenz;
    • (23) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 82) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 15 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Deletion von drei Nucleotiden (AAA) am 3'-Ende und Substitution von AAR (wobei R G oder A ist) für die Nucleotide 4 bis 6 AGG und von ACN (wobei N A, C, G oder T ist) für die Nucleotide 28 bis 30 TCC als DNA, die ein Mutein vom Deletions-/Substitutionstyp codiert mit der in SEQ ID Nr. 55 definierten Aminosäuresequenz und dgl.
  • Die DNA, die ein Vorläuferpeptid der vorliegenden Erfindung codiert mit der gleichen oder im Wesentlichen gleichen Aminosäuresequenz, wie die in SEQ ID Nr. 4 definierte Aminosäuresequenz ist z.B. ➀ eine DNA, die die in SEQ ID Nr. 16 oder SEQ ID Nr. 17 definierte Nucleotidsequenz enthält oder ➁ irgendeine DNA mit einer Nucleotidsequenz, die mit der in SEQ ID Nr. 16 oder SEQ ID Nr. 17 definierten Nucleotidsequenz unter hochstringenten Bedingungen hybridisieren kann und das Vorläuferpeptid codiert, das das oben erwähnte Peptid der vorliegenden Erfindung ergeben kann.
  • Nützlich als DNA, die mit der in SEQ ID Nr. 16 oder SEQ ID Nr. 17 definierten Sequenz hybridisieren kann, ist z.B. eine DNA, die eine Nucleotidsequenz enthält mit einer Homologie von nicht weniger als etwa 70%, bevorzugt nicht weniger als etwa 80%, bevorzugter nicht weniger als etwa 90%, am meisten bevorzugt nicht weniger als etwa 95% bezogen auf die in SEQ ID Nr. 16 oder SEQ ID Nr. 17 definierte Nucleotidsequenz.
  • Spezifischer wird eine DNA, die die in SEQ ID Nr. 16 oder SEQ ID Nr. 17 definierte Nucleotidsequenz enthält oder dgl. verwendet als DNA, die ein Vorläuferpeptid codiert mit der in SEQ ID Nr. 4 definierten Aminosäuresequenz.
  • Die DNA, die ein Vorläuferpeptid der vorliegenden Erfindung codiert, das die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz enthält wie die in SEQ ID Nr. 5 definierte Aminosäuresequenz ist z.B. ➀ eine DNA, die die in SEQ ID Nr. 18 oder SEQ ID Nr. 19 definierte Nucleotidsequenz enthält oder ➁ irgendeine DNA mit einer Nucleotidsequenz, die mit der in SEQ ID Nr. 18 oder SEQ ID Nr. 19 definierten Nucleotidsequenz unter hochstringenten Bedingungen hybridisieren kann und das Vorläuferpeptid codiert, das das oben erwähnte Peptid der vorliegenden Erfindung ergeben kann.
  • Nützlich als DNA, die mit der in SEQ ID Nr. 18 oder SEQ ID Nr. 19 definierten Sequenz hybridisieren kann, ist z.B. eine DNA, die eine Nucleotidsequenz enthält mit einer Homologie von nicht weniger als etwa 70%, bevorzugt nicht weniger als etwa 80%, bevorzugter nicht weniger als etwa 90%, am meisten bevorzugt nicht weniger als etwa 95% bezogen auf die in SEQ ID Nr. 18 oder SEQ ID Nr. 19 definierte Nucleotidsequenz.
  • Spezifischer wird eine DNA, die die in SEQ ID Nr. 18 oder SEQ ID Nr. 19 definierte Nucleotidsequenz enthält oder dgl. verwendet als DNA, die ein Vorläuferpeptid codiert mit der in SEQ ID Nr. 5 definierten Aminosäuresequenz.
  • Die DNA, die ein Vorläuferpeptid der vorliegenden Erfindung codiert, das die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz enthält wie die in SEQ ID Nr. 6 definierte Aminosäuresequenz ist z.B. ➀ eine DNA, die die in SEQ ID Nr. 20 oder SEQ ID Nr. 21 definierte Nucleotidsequenz enthält oder ➁ irgendeine DNA mit einer Nucleotidsequenz, die mit der in SEQ ID Nr. 20 oder SEQ ID Nr. 21 definierten Nucleotidsequenz unter hochstringenten Bedingungen hybridisieren kann und das Vorläuferpeptid codiert, das das oben erwähnte Peptid der vorliegenden Erfindung ergeben kann.
  • Nützlich als DNA, die mit der in SEQ ID Nr. 20 oder SEQ ID Nr. 21 definierten Sequenz hybridisieren kann, ist z.B. eine DNA, die eine Nucleotidsequenz enthält mit einer Homologie von nicht weniger als etwa 70%, bevorzugt nicht weniger als etwa 80%, bevorzugter nicht weniger als etwa 90%, am meisten bevorzugt nicht weniger als etwa 95% bezogen auf die in SEQ ID Nr. 20 oder SEQ ID Nr. 21 definierte Nucleotidsequenz.
  • Spezifischer wird eine DNA, die die in SEQ ID Nr. 20 oder SEQ ID Nr. 21 definierte Nucleotidsequenz enthält oder dgl. verwendet als DNA, die ein Vorläuferpeptid codiert mit der in SEQ ID Nr. 6 definierten Aminosäuresequenz.
  • Die DNA, die ein Vorläuferpeptid der vorliegenden Erfindung codiert, das die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz enthält wie die in SEQ ID Nr. 7 definierte Aminosäuresequenz ist z.B. ➀ eine DNA, die die in SEQ ID Nr. 22 oder SEQ ID Nr. 23 definierte Nucleotidsequenz enthält oder ➁ irgendeine DNA mit einer Nucleotidsequenz, die mit der in SEQ ID Nr. 22 oder SEQ ID Nr. 23 definierten Nucleotidsequenz unter hochstringenten Bedingungen hybridisieren kann und das Vorläuferpeptid codiert, das das oben erwähnte Peptid der vorliegenden Erfindung ergeben kann.
  • Nützlich als DNA, die mit der in SEQ ID Nr. 22 oder SEQ ID Nr. 23 definierten Sequenz hybridisieren kann, ist z.B. eine DNA, die eine Nucleotidsequenz enthält mit einer Homologie von nicht weniger als etwa 70%, bevorzugt nicht weniger als etwa 80%, bevorzugter nicht weniger als etwa 90%, am meisten bevorzugt nicht weniger als etwa 95% bezogen auf die in SEQ ID Nr. 22 oder SEQ ID Nr. 23 definierte Nucleotidsequenz.
  • Spezifischer wird eine DNA, die die in SEQ ID Nr. 22 oder SEQ ID Nr. 23 definierte Nucleotidsequenz enthält oder dgl. verwendet als DNA, die ein Vorläuferpeptid codiert mit der in SEQ ID Nr. 7 definierten Aminosäuresequenz.
  • Das Verfahren zur Hybridisierung und die zu verwendenden hochstringenten Bedingungen sind die gleichen, wie oben erwähnt.
  • Weiterhin wird Verwendung von Folgendem gemacht:
    • (1) Eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 83 oder SEQ ID Nr. 84) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 16 oder SEQ ID Nr. 17 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Substitution von AAR (wobei R G oder A ist) für die Nucleotide 52 bis 54 AGG als DNA, die ein Vorläuferpeptid codiert, das die unter SEQ ID Nr. 56 definierte Aminosäuresequenz enthält;
    • (2) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 85 oder SEQ ID Nr. 86) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 16 oder SEQ ID Nr. 17 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Substitution von ACN (wobei N A, C, G oder T ist) für die Nucleotide 76 bis 78 TCC als DNA, die ein Vorläuferpeptid codiert mit der in SEQ ID Nr. 57 definierten Aminosäuresequenz;
    • (3) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 87 oder SEQ ID Nr. 88) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 16 oder SEQ ID Nr. 17 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Substitution von AAR (wobei R G oder A ist) für die Nucleotide 52 bis 54 AGG und von ACN (wobei N A, C, G oder T ist) für die Nucleotide 76 bis 78 TCC als DNA, die ein Vorläuferpeptid codiert mit der in SEQ ID Nr. 58 definierten Aminosäuresequenz;
    • (4) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 89 oder SEQ ID Nr. 90) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 16 oder SEQ ID Nr. 17 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Deletion von drei Nucleotiden (AAA) am 3'-Ende und Substitution von AAR (wobei R G oder A ist) für die Nucleotide 52 bis 54 AGG als DNA, die ein Vorläuferpeptid codiert mit der in SEQ ID Nr. 59 definierten Aminosäuresequenz;
    • (5) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 91 oder SEQ ID Nr. 92) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 16 oder SEQ ID Nr. 17 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Deletion von drei Nucleotiden (AAA) am 3'-Ende und Substitution von ACN (wobei N A, C, G oder T ist) für die Nucleotide 76 bis 78 TCC als DNA, die ein Vorläuferpeptid codiert mit einer in SEQ ID Nr. 60 definierten Aminosäuresequenz;
    • (6) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 93 oder SEQ ID Nr. 94) enthält, die von der in SEQ ID Nr. 16 oder SEQ ID Nr. 17 definierten Nucleotidsequenz abgeleitet ist durch Deletion von drei Nucleotiden (AAA) am 3'-Ende und Substitution von AAR (wobei R G oder A ist) für die Nucleotide 52 bis 54 AGG und von ACN (wobei N A, C, G oder T ist) für die Nucleotide 76 bis 78 TCC als DNA, die ein Vorläuferpeptid codiert mit der in SEQ ID Nr. 61 definierten Aminosäuresequenz;
    • (7) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz enthält, die von der in einer der SEQ ID Nr. 16 bis SEQ ID Nr. 23 definierten Nucleotidsequenzen abgeleitet ist durch Deletion von drei Nucleotiden (AAA) am 3'-Ende als DNA, die ein Vorläuferpeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die von der in SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6 oder SEQ ID Nr. 7 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von Lys am C-Ende und dgl.
  • Die DNA, die ein Peptidfragment codiert, das bei Bildung eines reifen Peptids aus dem oben erwähnten Vorläufer der vorliegenden Erfindung gebildet wird, kann irgendeine DNA sein, mit dem Vorbehalt, dass sie eine Nucleotidsequenz enthält, die das oben erwähnte Peptidfragment codiert. Es kann eine genomische DNA, eine genomische DNA-Bibliothek, eine cDNA, die aus den oben erwähnten Zellen oder Geweben abgeleitet ist, eine cDNA-Bibliothek, die aus den oben erwähnten Zellen oder Geweben abgeleitet ist, oder eine synthetische DNA sein.
  • Z.B. kann eine DNA, die die in SEQ ID Nr. 24 oder SEQ ID Nr. 25 definierte Nucleotidsequenz enthält, als DNA verwendet werden, die ein Peptidfragment codiert, das die in SEQ ID Nr. 8 definierte Aminosäuresequenz aufweist; eine DNA, die die Nucleotidsequenz enthält, die in SEQ ID Nr. 26 definiert ist, kann z.B. als eine DNA verwendet werden, die ein Peptidfragment codiert, das die in SEQ ID Nr. 9 definierte Aminosäuresequenz enthält; eine DNA, die die in SEQ ID Nr. 27 definierte Nucleotidsequenz enthält, kann z.B. als DNA verwendet werden, die ein Peptidfragment codiert, das die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 10 definiert ist, enthält; eine DNA, die die in SEQ ID Nr. 28 definierte Nucleotidsequenz enthält, kann z.B. als DNA verwendet werden, die ein Peptidfragment codiert, das die in SEQ ID Nr. 11 definierte Aminosäuresequenz enthält, und eine DNA, die die in SEQ ID Nr. 29 oder SEQ ID Nr. 30 definierte Nucleotidsequenz enthält, kann z.B. als DNA verwendet werden, die ein Peptidfragment codiert, das die in SEQ ID Nr. 12 definierte Aminosäuresequenz enthält.
  • Als Mittel, um eine DNA, die das Peptid oder den Vorläufer der vorliegenden Erfindung codiert, zu klonieren, kann z.B. erwähnt werden (1) die Amplifikation der gewünschten DNA aus der oben erwähnten DNA-Bibliothek mit PCR-Technik unter Verwendung von synthetischen DNA-Primern mit einer Teilnucleotidsequenz einer DNA, die das Peptid oder den Vorläufer der vorliegenden Erfindung codiert oder (2) Selektion durch Hybridisierung einer DNA, die in einen geeigneten Vektor insertiert wird mit einem markierten DNA-Fragment oder synthetische DNA, die die gesamte Region eines Peptids oder Vorläufers der vorliegenden Erfindung oder einen Teil davon codiert.
  • Das Verfahren zur Hybridisierung ist das gleiche, wie oben erwähnt. Wenn eine kommerzielle Bibliothek verwendet wird, kann sie mit der folgenden Methode, die in dem beigefügten Benutzerhandbuch beschrieben ist, durchgeführt werden.
  • Eine Modifikation (Deletion, Addition, Substitution) von DNA-Nucleotidsequenzen kann mit einer an sich bekannten Methode bewirkt werden, z.B. der Gapped-Duplex-Methode oder Kunkel-Methode oder einer Modifikation davon unter Verwendung eines bekannten Kits, z.B. MutanTM-G (Takara Shuzo) oder MutanTM-K (Takara Shuzo) oder dgl.
  • Die so klonierte DNA, die ein Peptid oder einen Vorläufer der vorliegenden Erfindung codiert, kann je nach Wunsch und je nach Bedarf als solche verwendet werden oder nach Verdau mit Restriktionsenzymen oder nach Zufügung von Linker. Diese DNA hat ATG als Translationsstartcodon am 5'-Ende und kann TAA, TGA oder TAG als Translationsterminationscodon am 3'-Ende haben. Es ist auch möglich, dieses Translationsstartcodon und Translationsterminationscodon unter Verwendung geeigneter synthetischer DNA-Adapter zuzufügen.
  • Expressionsvektoren für die DNA, die das Peptid oder den Vorläufer der vorliegenden Erfindung codieren, können z.B. erzeugt werden, indem (a) das gewünschte DNA-Fragment aus einer DNA, die das Peptid oder den Vorläufer der vorliegenden Erfindung codiert, ausgeschnitten wird und (b) das DNA-Fragment mit einem geeigneten Expressionsvektor stromabwärts des Promotors davon eingefügt wird.
  • Der Vektor kann Plasmide einschließen, die von Escherichia coli abgeleitet sind, z.B. pBR322, pBR325, pUC12, pUC13 etc.; Plasmide, die von Bacillus subtilis abgeleitet sind, z.B. pUB110, pTP5, pC194 etc.; Plasmide, die von Hefen abgeleite sind, z.B. pSH19, pSH15 etc.; Bakteriophagen, wie den λ-Phagen; Tierviren, wie Retrovirus, Vacciniavirus etc.; Insektenviren und andere Vektoren, wie pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo usw.
  • Erfindungsgemäß kam jeder Promotor verwendet werden, solange er für die Wirtszelle geeignet ist, die zur Expression eines Gens verwendet wird. Wenn der Wirt eine Tierzelle ist, schließt der Promotor SR α, SV40-Promotor, LTR-Promotor, CMV-(Cytomegalovirus)-Promotor, HSV-TK-Promotor etc. ein, und CMV-Promotor und SR-α-Promotor werden bevorzugt verwendet. Wenn der Wirt für die Transformation Escherichia coli ist, ist der Promotor bevorzugt ein trp-Promotor, lac-Promotor, recA-Promotor, λ-PL-Promotor, lpp-Promotor, T7-Promotor etc. Wenn der Wirt für die Transformation Bacillus ist, ist der Promotor bevorzugt ein SP01-Promotor, SP02-Promotor, penP-Promotor etc. Wenn der Wirt eine Hefe ist, ist der Promotor bevorzugt ein PHO5-Promotor, PGK-Promotor, GAP-Promotor, ADH-Promotor, AOX1-Promotor etc. Wenn der Wirt eine Insektenzelle ist, schließt der Promotor Polyhedrinpromotor, P10-Promotor etc. ein.
  • Der Expressionsvektor kann, falls notwendig, weiter Enhancer, Spleißsignale, Polyadenylierungssignale, selektive Marker, SV40-Doppelursprung (hier als SV40 ori bezeichnet) enthalten. Beispiele für selektive Marker sind Dihydrofolatreduktase (im Folgenden als dhfr-Gen bezeichnet), Ampicillinresistenzgen (im Folgenden als Ampr bezeichnet), Neomycinreistenzgen (im Folgenden als Neor bezeichnet) usw. Das dhfr-Gen ergibt Methotrexat-(MTX)-Resistenz und Neo ergibt G418-Resistenz. Insbesondere wenn das dhfr-Gen als selektiver Marker für dhfr-gendefiziente Zelllinien vom Chinesischen Hamster verwendet wird, können Zellen, die mit dem jeweiligen Gen transfiziert sind, in einem thymidinfreien Medium selektiert werden.
  • Eine geeignete Signalsequenz für einen Wirt kann weiterhin der N-terminalen Seite des Proteins zugefügt werden. Wenn der Wirt Escherichia coli ist, kann die verwendbare Signalsequenz die PhoA-Signalsequenz, OmpA-Signalsequenz etc. einschließen. Wenn der Wirt Bacillus ist, kann sie die α-Amylasesignalsequenz, Subtilisinsignalsequenz etc. einschließen. Wenn der Wirt eine Hefe ist, kann sie die MF-Signalsequenz, SUC2-Signalsequenz etc. einschließen. Wenn der Wirt eine Tierzelle ist, kann sie die Insulinsignalsequenz, α-Interferonsignalsequenz, Antikörpermolekülsignalsequenz etc. einschließen.
  • Ein Transformant oder Transfektant wird erhalten, indem der so konstruierte Vektor verwendet wird, der die DNA trägt, die das Peptid der vorliegenden Erfindung codiert.
  • Der Wirt kann z.B. eine Escherichia-Art, Bacillus-Art, Hefezelle, Insektenzelle, Insekt, Tierzelle etc. sein.
  • Beispiele für Escherichia-Arten schließen Escherichia coli K12.DH1 (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America, Bd. 60, 160 (1968)), JM103 (Nucleic Acids Research, Bd. 9, 309 (1981)), JA221 (Journal of Molecular Biology, Bd. 120, 517 (1978)), HB101 (Journal of molecular Biology, Bd. 41, 459 (1969)), C600 (Genetics, Bd. 39, 440 (1954)) etc. ein.
  • Beispiele für Bacillusarten sind z.B. Bacillus subtilis MI114 (Gene, Bd. 24, 255 (1983)), 207-21 (Journal of Biochemistry, Bd. 95, 87 (1984)) etc.
  • Beispiele für Hefezellen sind z.B. Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R–, NA87-11A, DKD-5D oder 208-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913 oder Pichia pastoris HM71 etc.
  • Beispiele für Insektenzellen sind z.B. Spodoptera-frugiperda-Zellen (Sf-Zellen), MG1-Zellen, die aus den zentralen Eingeweiden von Trichoplusia ni abgeleitet sind, High-FiveTM-Zellen, die aus Eiern von Trichoplusia ni stammen, von Mamestra brassicae abgeleitete Zellen, von Estigmena acrea abgeleitete Zellen usw., wenn der Virus AcNPV ist und Bombyx-mori-N-Zellen (BmN-Zellen) usw., wenn der Virus BmNPV ist. Beispiele für die Sf-Zelle sind z.B. Sf9-Zelle (ATCC CRL 1711), Sf21-Zelle [beide J.L. Vaughn et al., In Vivo, 13, 213-217 (1977)] usw.
  • Beispiele für Insekten schließen Larven vom Seidenwurm (Bombyx-mori-Larven) (Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)) ein.
  • Beispiele für Tierzellen sind z.B. die vom Affen abgeleitete COS-7-Zelllinie, Verozelllinie, Zelllinie vom Eierstock des Chinesischen Hamsters (im Folgenden als CHO-Zelle bezeichnet), dhfr-gendefiziente Zelllinie vom Chinesischen Hamster (im Folgenden als CHO(dhfr–)-Zelle bezeichnet), Maus-L-Zellen, Maus-AtT-20, Mausmyelomazellen, Ratten-GH3, HumanFL, 293-Zellen, C127-Zellen, BALB3T3-Zellen, Sp-2/0-Zellen etc. Von diesen sind CHO-Zellen, CHO(dhfr–)-Zellen, 293-Zellen etc. bevorzugt.
  • Abhängig von den verwendeten Wirtszellen wird die Transformation unter Verwendung von für solche Zellen geeigneten Standardtechniken durchgeführt.
  • Die Transformation von Escherichia-Arten kann gemäß den Methoden durchgeführt werden, wie sie z.B. in Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Bd. 69, 2110 (1972) und Gene, Bd. 17, 107 (1982) etc. offenbart sind.
  • Eine Transformation von Bacillus-Arten kann durchgeführt werden gemäß den Methoden, wie sie z.B. in Molecular & General Genetics, Ed. 168, 111 (1979) etc. offenbart werden.
  • Die Transformation von Hefezellen kann mit solchen Methoden durchgeführt werden, wie sie z.B. in Methods in Enzymology, 194, 11:2-187 (1991) etc. offenbart werden.
  • Eine Transformation von Insektenzellen oder Insekten kann durchgeführt werden mit Methoden, wie sie z.B. in Bio/Technology, 6, 47-5 (1988) offenbart werden.
  • Die Transformation von Tierzellen kann mit Methoden durchgeführt werden, wie sie z.B. in Cell Engineering, Extraband 8, New Cell Engineering Experiment Protocol, 263-267 (1995) (Shujun Company), Virology, Bd. 52, 456 (1973) etc. offenbart werden.
  • Bei Einführung des Expressionsvektors in Zellen können bekannte Methoden, wie die Calciumphosphatmethode (F.L Graham und A.J. van der Eb: Virology, 52, 456-467 (1973)), Elektroporation (E. Neumann et al., EMBO Journal, 1, 841-845 (1982)) etc. verwendet werden.
  • Auf diese Weise wird ein Transformant, der mit dem Expressionsvektor, der die DNA, die das Peptid oder den Vorläufer der vorliegenden Erfindung codiert, enthält, transformiert ist, erhalten.
  • Mittlerweile kann als Methode, die eine stabile Expression des Peptids oder Vorläufen der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Tierzellen zulässt, die Methode erwähnt werden, die umfasst, dass durch klonale Selektion Tierzellen selektiert werden, in die der obige Expressionsvektor eingeführt wurde, der in das Chromosom integriert wurde. Um konkreter zu werden, wird die Transformantenselektion ausgeführt unter Verwendung der oben erwähnten selektiven Marker als Indikator. Weiterhin werden Tierzellen, die auf obige Art und Weise erhalten wurden unter Verwendung der selektiven Marker einer wiederholten klonalen Selektion unterzogen, wodurch eine stabile Tierzelllinie, die zur Expression des Peptids oder Vorläufers der vorliegenden Erfindung auf hohem Niveau fähig ist, erhalten werden. Wenn das dhfr-Gen als selektiver Marker verwendet wird, ist es auch möglich, eine Tierzelllinie mit höherer Expression zu erhalten, indem die Zellen gezüchtet werden, während die MTX-Konzentration nach und nach erhöht wird und eine resistente Zelllinie selektiert wird und dadurch intrazellulär die DNA amplifiziert wird, die das Peptid oder den Vorläufer der vorliegenden Erfindung codiert zusammen mit dem dhfr-Gen.
  • Das Peptid oder der Vorläufer der vorliegenden Erfindung oder ein Salz davon können erzeugt werden, indem der oben erwähnte Transformant unter solchen Bedingungen gezüchtet wird, die die Expression der DNA, die das Peptid oder den Vorläufer der vorliegenden Erfindung codiert, ermöglichen, um dadurch die Bildung und Ansammlung des Peptids oder Vorläufers der vorliegenden Erfindung zu bewirken.
  • Wenn ein Transformant, dessen Wirt ein Stamm der Gattung Escherichia oder Bacillus ist, gezüchtet wird, ist ein flüssiges Medium als Medium, das für die Kultivierung verwendet wird, geeignet und Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische und andere Materialien, die für das Wachstum des Transformanten notwendig sind, werden dem Medium zugefügt. Als Kohlenstoffquellen können Glucose, Dextrin, lösliche Stärke, Saccharose usw. erwähnt werden. Als Stickstoffquellen können anorganische oder organische Substanzen, wie Ammoniumsalze, Salpetersäure salze, Maiseinweichwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakt, Sojakuchen und Kartoffelextrakt ebenso erwähnt werden, wie anorganische Materialien, wie Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat, Magnesiumchlorid etc. Hefeextrakt, Vitamine, Wachstumsfaktoren und dgl. können auch zugefügt werden. Der pH-Wert des Mediums ist wünschenswerterweise etwa 5 bis 8.
  • Bevorzugt als Medium stur Kultivierung von Stämmen der Gattung Escherichia ist z.B. M9-Medium, das Glucose und Casaminosäuren enthält (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972). Falls notwendig, kann ein Mittel, wie 3 β-Indolylacrylsäure z.B. dem Medium zugefügt werden für ein effizientes Funktionieren des Promotors. Wenn der Wirt ein Stamm der Gattung Escherichia ist, wird die Kultivierung im Allgemeinen bei etwa 15 bis 43°C etwa 3 bis 24 Stunden lang, falls notwendig mit Belüftung und/oder Bewegung, durchgeführt.
  • Wenn der Wirt ein Stamm der Gattung Bacillus ist, wird die Kultivierung im Allgemeinen bei etwa 30 bis 40°C etwa 6 bis 24 Stunden lang, falls notwendig mit Belüftung und/oder Bewegung, durchgeführt.
  • Als Medium zur Kultivierung eines Transformanten, wenn der Wirt eine Hefe ist, kann z.B. Burkholder's Minimalmedium [K.L. Bostian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 77, 4505 (1980)] und SD-Medium, das 0,5% Casaminosäuren enthält [G.A. Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81, 5330 (1984)], erwähnt werden. Der pH-Wert des Mediums wird bevorzugt auf etwa 5 bis 8 eingestellt. Die Kultivierung wird im Allgemeinen bei etwa 20 bis 35°C etwa 24 bis 72 Stunden lang durchgeführt, falls notwendig mit Belüftung und/oder Bewegung.
  • Nützlich als Medium, um einen Transformanten zu kultivieren, wenn der Wirt eine Insektenzelle ist, ist Grace's Insektenmedium [T.C.C. Grace, Nature, 195, 788 (1962)], ergänzt mit solchen Zusätzen, wie 10% inaktiviertes Rinderserum in geeigneten Mengen. Der pH-Wert des Mediums wird bevorzugt auf etwa 6,2 bis 6,4 eingestellt. Die Kultivierung wird im Allgemeinen bei etwa 27°C etwa 3 bis 5 Tage lang durchgeführt, falls notwendig mit Belüftung und/oder Bewegung.
  • Nützlich als Medium zur Kultivierung eines Transformanten, wenn die Wirtszelle eine Tierzelle ist, ist z.B. MEM-Medium, das etwa 5 bis 20% fötales Kälberserum enthält [Science, Bd. 122, 501 (1952)], DMEM-Medium [Virology, Bd. 8, 396 (1959)], RPMI-1640-Medium [The Journal of the American Medical Association, Bd. 199, 519 (1967)], 199-Medium [Proceedings of the Society for the Biological Medicine, Bd. 73, 1 (1950)] und dgl. Der pH-Wert ist bevorzugt etwa 6 bis 8. Die Kultivierung wird im Allgemeinen bei etwa 30 bis 40°C etwa 15 bis 72 Stunden lang, falls notwendig mit Belüftung und/oder Bewegung, durchgeführt.
  • Insbesondere wenn CHO(dhfr–)-Zellen verwendet werden mit dem dhfr-Gen als selektivem Marker ist die Verwendung des DMEM-Mediums, das dialysiertes fötales Kälberserum enthält, das im Wesentlichen frei von Thymidin ist, bevorzugt.
  • Das Peptid oder der Vorläufer der vorliegenden Erfindung können aus der Kulturbrühe z.B. auf folgende Art und Weise isoliert und gereinigt werden.
  • Um das Peptid oder den Vorläufer der vorliegenden Erfindung aus gezüchteten Bakterien- oder anderen Zellen zu extrahieren, kann eine geeignete Methode verwendet werden, die z.B. beinhaltet, dass die Bakterien- oder anderen Zellen nach der Kultivierung mit einer bekannten Methode gesammelt werden, in einer geeigneten Pufferlösung suspendiert werden und mithilfe von Ultraschallwellen, Lysozym und/oder Einfrieren-Auftauen aufgerissen werden gefolgt von einer Zentrifugation oder Filtration, was einen rohen Extrakt ergibt, der das Peptid oder den Vorläufer der vorliegenden Erfindung enthält. Ein Protein denaturierendes Mittel, wie Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid und/oder ein Tensid, wie Triton X-100 kann in der Pufferlösung enthalten sein.
  • In Fallen, in denen das Peptid oder der Vorläufer in die flüssige Kulturphase ausgeschieden wird, werden Bakterien- oder andere Zellen nach Abschluss der Kultivierung von dem Überstand mit an sich bekannten Methoden getrennt und der Überstand wird gewonnen. Das Peptid oder der Vorläufer der vorliegenden Erfindung, die in dem so erhaltenen überstand oder Extrakt enthalten sind, kann mit an sich bekannten Isolierungs-/ Reinigungstechniken in einer geeigneten Kombination gereinigt werden. Als bekannte Isolierungs-/ Reinigungstechniken könner. Techniken erwähnt werden, die den Unterschied in der Löslichkeit ausnützen, wie Aussalzen oder Lösungsmittelausfällung, Techniken, die hauptsächlich den Unterschied im Molekulargewicht ausnützen, wie Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, Techniken, die den Unterschied in der elektrostatischen Ladung ausnutzen, wie Ionenaustauschchromatographie, Techniken, die eine spezifische Affinität ausnutzen, wie Affinitätschromatographie, Techniken, die den Unterschied in der Hydrophobizität ausnützen wie Reverse-Phase-Flüssigchromatographie, Techniken, die den Unterschied im isoelektrischen Punkt ausnutzen, wie isoelektrische Fokussierung usw.
  • In Fällen, in denen das so erhaltene Peptid oder der so erhaltene Vorläufer der vorliegenden Erfindung in freier Form vorliegt, kann das Peptid in freier Form mit bekannten Methoden oder dazu analogen Methoden in ein Salz davon umgewandelt werden. In dem Fall, in dem das so erhaltene Peptid oder der so erhaltene Vorläufer in Salzform ist, kann umgekehrt das Peptidsalz mit bekannten Methoden oder dazu analogen Methoden in eine freie Form umgewandelt werden oder in irgendein anderes Salz davon.
  • Das Peptid oder de- Vorläufer der vorliegenden Erfindung, das/der von dem Transformanten hergestellt wurde, kann in beliebiger Art und Weise modifiziert werden oder ein Polypeptid kann teilweise davon entfernt werden mit einem geeigneten Protein modifizierenden Enzym vor oder nach der Reinigung. Das Protein modifizierende Enzym kann Trypsin, Chymotrypsin, Arginylendopeptidase, Proteinkinase, Glycosidase etc. einschließen. Die Menge des Peptids oder des Vorläufers der vorliegenden Erfindung, die so erhalten wurde, kann mit einem Enzymimmunoassay (Enzyme linked immunoassay) unter Verwendung spezifischer Antikörper bestimmt werden.
  • Die Antikörper gegen das Peptid oder ein Salz davon sind Antikörper, wie polyklonale Antikörper und monoklonale Antikörper, die das Peptid oder ein Salz davon erkennen, aber nicht das Peptid erkennen, das aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 31 oder SEQ ID Nr. 32 besteht. Von den Antikörpern ist der Antikörper, der die Aktivität des Peptids oder eines Salzes davon neutralisieren kann, bevorzugt.
  • Die Antikörper gegen das Peptid oder ein Salz davon (im Folgenden als Peptid der vorliegenden Erfindung bezeichnet) können mit dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannten Methoden oder dazu ähnlichen Methoden hergestellt werden unter Verwendung des Peptids der vorliegenden Erfindung als Antigen. Z.B. können monoklonale Antikörper und/oder polyklonale Antikörper mit der unten angegebenen Methode hergestellt werden.
  • Herstellung von monoklonalen Antikörpern:
  • (a) Herstellung von monoklonale Antikörper produzierenden Zellen
  • Das Peptid der vorliegenden Erfindung wird an warmblütige Tiere entweder allein oder zusammen mit Trägern oder Verdünnungsmitteln an der Stelle, die für die Antikörperproduktion günstig ist, verabreicht. Um die Antikörperproduktivität bei Verabreichung zu potenzieren, können komplettes Freund's Adjuvans oder inkomplettes Freund's Adjuvans verabreicht werden. Die Verabreichung wird gewöhnlich einmal alle 2 bis 6 Wochen und insgesamt zwei- bis zehnmal durchgeführt. Beispiele für anwendbare warmblütige Tiere sind Affen, Kaninchen, Hunde, Meerschweinchen, Mäuse, Ratten, Schafe, Ziegen und Geflügel. Die Verwendung von Mäusen und Ratten ist bevorzugt.
  • Um Zellen zu etablieren, die monoklonale Antikörper erzeugen, wird ein Tier mit nachweisbarem Antikörpertiter aus Tieren ausgewählt (z.B. Mäusen), die mit Antigenen immunisiert wurden, dann werden Milz oder Lymphknoten 2 bis 5 Tage nach der letzten Immunisierung gesammelt und Antikörper produzierende Zellen, die darin enthalten sind, werden mit Myelomzellen fusioniert, die aus homogenen oder heterogenen Tieren stammen, um monoklonale Antikörper produzierende Hybridomas zu erhalten. Die Messung des Antikörpertiters in Antiseren kann z.B. durchgeführt werden, indem ein markiertes Protein, das später erwähnt wird, mit dem Antiserum umgesetzt wird und anschließend die Bindungsaktivität von Markierungsmittel und Antikörper gemessen wird. Die Zellfusion kann z.B. mit der Methode von Koehler und Milstein durchgeführt werden (Nature, 256, 495, 1975). Beispiele für einen Fusionsbeschleuniger sind Polyethylenglycol (PEG), Sendaivirus etc. und die Verwendung von PEG ist bevorzugt.
  • Beispiele für Myelomzellen sind solche, die von warmblütigen Tieren stammen, wie NS-1, P3U1, SP2/0, AP-1 etc. und die Verwendung von P3U1 ist bevorzugt. Das bevorzugte Fusionsverhältnis der Anzahl Antikörper produzierender Zellen, die verwendet werden (Milzzellen) zu der Anzahl von Myelomzellen liegt in einem Bereich von etwa 1:1 bis 20:1. Wenn PEG (bevorzugt PEG 1000 bis PEG 6000) in einer Konzentration von etwa 10 bis 80% zugegeben wird und anschließend bei 20 bis 40°C, bevorzugt 30 bis 37°C 1 bis 10 Minuten lang inkubiert wird, kann eine effiziente Zellfusion durchgeführt werden.
  • Verschiedene Methoden können zum Screenen von Hybridomas, die einen monoklonalen Antikörper erzeugen, angewendet werden. Z.B. wird ein Überstand der Hybridomakultur einer Festphase (z.B. Mikroplatte) zugegeben, an der das Proteinantigen entweder direkt oder über einen Träger adsorbiert ist, dann wird Antiimmunglobulin-Antikörper (Antimausimmunglobulin-Antikörper wird verwendet, wenn die Zellen, die für die Zellfusion verwendet wurden, von der Maus stammen), der mit einer radioaktiven Substanz, einem Enzym oder dgl. markiert ist, oder Protein A zugegeben und dann werden monoklonale Antikörper, die an der festen Phase gebunden sind, nachgewiesen, oder ein Überstand der Hybridomakultur wird der Festphase zugefügt, an der Antiimmunglobulin oder Protein A adsorbiert ist, dann wird das mit einer radioaktiven Substanz oder einem Enzym markierte Protein zugefügt und monoklonale Antikörper, die an der Festphase gebunden sind, werden nachgewiesen.
  • Die Selektion und Klonierung der monoklonale Antikörper produzierenden Hybridomas kann mit dem Fachmann auf diesem Gebiet an sich bekannten Methoden oder dazu ähnlichen Methoden durchgeführt werden. Gewöhnlich wird es in einem Medium für Tierzellen, das HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) enthält, durchgeführt. Im Hinblick auf ein Medium für die Selektion, zum Klonieren und zum Wachstum kann jedes Medium verwendet werden, solange Hybridoma darin wachsen können. Beispiele für das Medium sind RPMI-1640-Medium (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Japan), das 1 bis 20% (bevorzugt 10 bis 20%) fötales Kälberserum (FCS) enthält, GIT-Medium (Wako Pure Chemical, Japan), das 1 bis 20% fötales Kälberserum enthält und ein geeignetes serumfreies Medium für Hybridomas (SFM-101; Nissui Seiyaku, Japan). Die Kulturtemperatur ist gewöhnlich 20 bis 40°C und bevorzugt etwa 37°C. Der Kulturzeitraum ist gewöhnlich 5 Tage bis 3 Wochen und bevorzugt 1 bis 2 Wochen. Die Kultur wird gewöhnlich in 5% Kohlendioxidgas durchgeführt. Der Antikörpertiter des des Überstands der Hybridomakultur kann auf gleiche Art und Weise gemessen werden wie bei der vorher erwähnten Messung des Antikörpertiters im Antiserum.
  • (b) Reinigung der monoklonalen Antikörper
  • Die Abtrennung und Reinigung der monoklonalen Antikörper kann mit Methoden durchgeführt werden zum Abtrennen/Reinigen von Immunglobulin, wie Aussalzen, Ausfällung mit Alkohol, isoelektrische Ausfällung, Elektrophorese, Adsorption/Deadsorption unter Verwendung von Ionenaustauschern, wie DEAE, Ultrazentrifugation, Gelfiltration, spezifische Reinigungsmethoden, bei denen nur ein Antikörper gesammelt wird durch Behandlung mit einem aktiven Adsorbens, wie einer Antigen bindenden Festphase, Protein A oder Protein G und die Bindung dissoziiert wird, wodurch der Antikörper erhalten wird.
  • Herstellung von polyklonalen Antikörpern
  • Polyklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung können mit an sich bekannten Methoden oder dazu analogen Methoden hergestellt werden. Die Methode umfasst, dass ein Immunogen (Antigenprotein) an sich oder ein Konjugat eines Immunogens mit einem Trägerprotein hergestellt wird, ein warmblütiges Tier auf gleiche Art und Weise, wie zur Herstellung der monoklonalen Antikörper beschrieben, immunisiert wird, eine Fraktion, die den Antikörper gegen das Peptid der vorliegenden Erfindung enthält, aus dem immunisierten Tier geerntet wird und der geerntete Antikörper gereinigt wird.
  • Bezug nehmend auf das Immunogen-Trägerprotein-Konjugat zur Verwendung für die Immunisierung eines warmblütigen Tiers, ist die Art des Trägerproteins und das Verhältnis von Träger und Hapten nicht besonders beschränkt, außer dadurch, dass die Produktion des Antikörpers gegen das Hapten, das mit dem jeweiligen Trägerprotein konjugiert ist und für die Immunisierung verwendet wird, effizient voranschreitet. So wird z.B. Rinderserumalbumin, Rinderthyroglobulin, Hämocyanin oder dgl. in einem Gewichtsverhältnis von etwa 0,1 bis 20, bevorzugt etwa 1 bis etwa 5 Teilen zu einem Teil Hapten gekuppelt.
  • Eine Vielzahl von Kondensationsmitteln kann für diese Kupplung zwischen Hapten und Träger verwendet werden. So kann z.B. ein Glutaraldehyd, Carbodiimid, Maleimid oder Thiol oder dithiopyridylgruppenhaltiges aktives Esterreagenz angewendet werden.
  • Das Kondensationsreaktionsprodukt wird einem warmblütigen Tier an einer Stelle verabreicht, die für die Antikörperproduktion günstig ist, entweder allein oder zusammen mit einem Träger oder Verdünnungsmittel. Zur Verstärkung der Antikörperproduktion kann komplettes Freund's Adjuvans oder inkomplettes Freund's Adjuvans verabreicht werden. Die Verabreichung wird im Allgemeinen in etwa alle 2 bis 6 Wochen insgesamt etwa drei- bis zehnmal durchgeführt.
  • Der polyklonale Antikörper kann aus dem Blut, der Ascitesflüssigkeit oder einer anderen Körperflüssigkeit, bevorzugt aus dem Blut des warmblütigen Tiers gewonnen werden.
  • Der polyklonale Antikörpertiter im Antiserum kann auf gleiche Art und Weise bestimmt werden, wie vorher für die Bestimmung der monoklonalen Antikörper beschrieben. Die Abtrennung und Reinigung der polyklonalen Antikörper kann mit der gleichen Methode durchgeführt werden wie für die Abtrennung und Reinigung von monoklonalen Antikörpern beschrieben.
  • Der Antikörper gegen das vorher erwähnte Teilpeptid, das durch Prozessierung des Vorläufers erzeugt wird, kann wie oben erwähnt hergestellt und verwendet werden. Die DNA mit einer Nucleotidsequenz, die der DNA, die das Protein, den Vorläufer oder das Teilpeptid der vorliegenden Erfindung codiert (im Folgenden auch als DNA der vorliegenden Erfindung bezeichnet) komplementär oder im Wesentlichen komplementär ist, kann irgendeine DNA sein mit einer Nucleotidsequenz, die der Sequenz der DNA der vorliegenden Erfindung komplementär oder im Wesentlichen komplementär ist und die Expression der DNA unterdrücken kann.
  • Die Nucleotidsequenz, die der DNA der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen komplementär ist, kann z.B. eine Nucleotidsequenz sein mit einer Identität von nicht weniger als etwa 70%, bevorzugt nicht weniger als etwa 80%, bevorzugter nicht weniger als etwa 90% und für noch bessere Ergebnisse nicht weniger als etwa 95% der Gesamtnucleotidsequenz oder Teilnucleotidsequenz der Nucleotidsequenz, die mit der DNA der vorliegenden Erfindung komplementär ist. Besonders bevorzugt ist eine Antisense-DNA mit einer Identität von nicht weniger als etwa 70%, bevorzugt nicht weniger als etwa 80%, noch bevorzugter nicht weniger als etwa 90% und für noch bessere Ergebnisse nicht weniger als etwa 95% der Nucleotidsequenz der Domäne, der vollständigen Nucleotidsequenz, die der DNA der vorliegenden Erfindung komplementär ist, die den N-terminalen Bereich des Peptids der vorliegenden Erfindung codiert (z.B. die Nucleotidsequenz der Domäne rund um das Startcodon). Die Antisense-DNA kann unter Verwendung bekannter DNA-Synthesehardware synthetisiert werden.
  • Das Peptid der vorliegenden Erfindung einschließlich eines Vorläufers davon und eines Salzes von Peptid oder Vorläufer ist ein Peptid mit nützlichen physiologischen Aktivitäten, wie einer Somatostatin-artigen und/oder Cortistatin-artigen Aktivität. Genauer hat es (i) eine Wachstumhormonsekretion hemmende Aktivität, (ii) hemmende Aktivität gegen die Sekretion von Hypophysenhormonen, wie Thyroid stimulierendes Hormon und Prolactin, (iii) eine hemmende Aktivität gegen die Sekretion von gastrointestinalen Hormonen, wie Gastrin und Insulin, (iv) Neurotransmitteraktivität, (v) Zellproliferation stimulierende Aktivität, (vi) hemmende Aktivität gegen Acetylcholin, das ein REM-Schlafinduktor ist, (vii) die Kontraktion der glatten Muskeln hemmende Aktivität usw. Daher kann das Peptid, der Vorläufer oder das Salz der Erfindung in verschiedenen Anwendungen angewendet werden.
  • Im Folgenden werden vershiedene typische Verwendungen für das Peptid, den Vorläufer oder das Salz der vorliegenden Erfindung (im Folgenden manchmal als Peptid oder Äquivalent der Erfindung bezeichnet), die DNA, die das Peptid oder den Vorläufer der vorliegenden Erfindung codiert (im Folgenden manchmal als DNA der Erfindung bezeichnet), den Antikörper gegen das Peptid oder Salz der vorliegenden Erfindung (im Folgenden manchmal als Antikörper der Erfindung bezeichnet) und das Oligonucleotidderivat oder Salz davon beschrieben.
  • (1) Wirkstoffe zur Behandlung oder Verhütung verschiedener Krankheiten
  • Wie oben erwähnt, hat das Peptid oder Äquivalent der vorliegenden Erfindung (i) eine Wachstumhormonsekretion hemmende Aktivität, (ii) hemmende Aktivität gegen die Sekretion von Hypophysenhormonen, wie thyreotropes Hormon und Prolactin, (iii) eine hemmende Aktivität gegen die Sekretion von gastrointestinalen Hormonen, wie Gastrin und Insulin, (iv) Neurotransmitteraktivität, (v) Zellproliferation stimulierende Aktivität, (vi) hemmende Aktivität gegen Acetylcholin, das ein REM-Schlafinduktor ist, (vii) die Kontraktion der glatten Muskeln hemmende Aktivität usw. Daher ist das Peptid oder Äquivalent der vorliegenden Erfindung nützlich als Wirkstoff zur Behandlung oder Verhütung verschiedener Krankheiten, die unter anderem durch Verlust oder Störung von Cortistatin oder Somatostatin in vivo entstehen oder durch verminderte Expression der DNA, die das Cortistatin oder Somatostatin codiert.
  • Spezifisch ist das Peptid oder Äquivalent der Erfindung nützlich als Wirkstoff, z.B. als therapeutisches oder prophylaktisches Mittel für Hormon produzierende Tumoren, Akromegalie, Gigantismus, Demenz, Diabetes, Magengeschwüre oder dgl., als Hormonsekretionsinhibitor, als Tumorwachstumsinhibitor oder als Modulator der neuralen Aktivität des Schlafs.
  • Weiterhin ist das Peptid oder Äquivalent der Erfindung oder die DNA der Erfindung nützlich als Wirkstoff, z.B. als therapeutisches oder prophylaktisches Mittel für verschiedene Krankheiten, wie unter anderem akute bakterielle Meningitis, akuten Myokardinfarkt, akute Pankreatitis, akute virale Enzephalitis, Respiratory Distress Syndrom bei Erwachsenen, alkoholische Hepatitis, Alzheimer-Krankheit, Asthma, Arteriosklerose, atopische Dermatitis, bakterielle Pneumonie, Blasenkrebs, Knochenbruch, Brustkrebs, Hyperphagie, Polyphagie, Brandwundenheilung, Karzinome des Gebärmutterhalses, chronisch-lymphatische Leukämie, chronischmyelotische Leukämie, chronische Pankreatitis, Leberzirrhose, Kolorektalkrebs (Karzinom von Kolon/Rektum), Morbus Crohn, Demenz, diabetische Komplikationen, z.B. diabetische Nephropathie, diabetische Neuropathie, diabetische Retinopathie etc., Gastritis, Helicobacter-pylori-Infektion, Leberinsuffizienz, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, anderen Arsen von Hepatitis, Herpes-Simplex-Virusinfektion, Varicella-Zoster-Virusinfektion, Morbus Hodgkin, Aidsvirusinfektion, Humanpapillomavirusinfektion, Hypercalcämie, Hypercholesterolämie, Hyperglyceridämie, Hyperlipämie, gemischte infektiöse Krankheiten, Influenzavirusinfektion, insulinabhängiger Diabetes mellitus (Typ I), invasive Staphylokokkeninfektion, maligne Melanome, Krebsmetastasenbildung, multiple Myelome, allergische Rhinitis, Nephritis, Nicht-Hodgkin-Lymphome, nicht-insulinabhängiger Diabetes mellitus (Typ II), nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, Organtransplantation, Osteoarthritis, Osteomalazie, Osteopenie, Osteoporose, Eierstockkrebs, Morbus Bechterew, Magengeschwüre, periphere Gefäßkrankheiten, Prostatakrebs, Reflux-Ösaphagitis, Nierenversagen, Polyarthritis, Schizophrenie, Sepsis, septischer Schock, schwere systemische Pilzinfektion kleinzelliger Lungenkrebs, Rückenmarksschäden, Magenkrebs, systemischer Lupus erythematodes, vorübergehende zerebrale ischämische Attacken, Lungentuberkulose, Herzklappenkrankheit, mit vaskulärem, multiplem Infarkt verbundene Demenz, Wundheilung, Schlaflosigkeit, Arthritis und neurodegenerative Krankheiten. Insbesondere ist das Peptid oder Äquivalent der Erfindung oder die DNA der Erfindung nützlich als Mittel zur Behandlung oder Verhütung von Schlaflosigkeit.
  • Bei der oben erwähnten medizinischen Anwendung des Peptids oder eines Äquivalents der Erfindung kann dieses oral in solchen Dosierungsformen verabreicht werden, wie gegebenenfalls mit Zucker beschichteten Tabletten, Kapseln, Elixieren, Mikrokapseln etc. oder parenteral in Form einer Injektion, was sterile Lösungen oder Suspensionen in Wasser oder einem pharmazeutisch annehmbaren flüssigen Medium außer Wasser einschließt. Solche Dosierungsformen können z.B. hergestellt werden, indem das Peptid oder Äquivalent der Erfindung mit einem oder mehreren Vertretern von physiologisch annehmbaren Trägern, Aromastoffen, Hilfsstoffen, Vehikeln, Konservierungsmitteln, Stabilisatoren, Bindemitteln usw. gemäß der Einheitsrezeptur, die allgemein für die pharmazeutische Herstellung erforderlich ist, vermischt wird. Der Gehalt des aktiven Inhaltsstoffs in diesen Präparaten ist so, dass eine geeignete Dosis innerhalb eines angegebenen Bereichs erhalten werden kann.
  • Wenn man das Peptid etc. der vorliegenden Erfindung verwenden möchte, wird man es in gereinigter Form verwenden, bevorzugt in einer Reinheit von mindestens 90%, bevorzugter mindestens 95%, noch bevorzugter mindestens 98% und am meisten bevorzugt mindestens 99%.
  • Additive, die Tabletten, Kapseln etc. zugemischt werden können, schließen Bindemittel, wie Gelatine, Maisstärke, Traganth und Gummi arabicum, Hilfsstoffe, wie kristalline Cellulose, Quellmittel, wie Maisstärke, Gelatine und Alginsäure, Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, Süßstoffe, wie Saccharose, Lactose und Saccharin, und Aromastoffe, wie Pfefferminz, Akamonoöl und Kirsch ein.
  • Wenn die Einheitsdosierungsform die Kapsel ist, können die oben erwähnten Materialien weiter flüssige Träger, wie Öle und Fette beinhalten. Sterile Zusammensetzungen zur Injektion können mit üblichen Methoden der pharmazeutischen Herstellung formuliert werden, wie durch Auflösen oder Suspendieren aktiver Inhaltsstoffe, natürlich vorkommender pflanzlicher Öle, wie Sesamöl, Kokosnussöl etc., in Trägern, wie Wasser zur Injektion, um pharmazeutische Zusammensetzungen zu erzeugen.
  • Wässrige Flüssigkeiten zur Injektion schließen physiologische Kochsalzlösung und isotonische Lösungen, die Glucose und andere Hilfsmittel enthalten, z.B. D-Sorbit, D-Mannit und Natriumchlorid, ein und können in Kombination mit geeigneten Auflösungshilfsstoffen, wie Alkoholen, z.B. Ethanol, Polyalkoholen, z.B. Propylenglycol und Polyethylenglycol, nichtionischen Tensiden, z.B. Polysorbat 80TM und HCO-50 etc. verwendet werden. Ölige Flüssigkeiten schließen Sesamöl und Sojaöl ein und können in Kombination mit Auflösungshilfsstoffen, wie Benzylbenzoat und Benzylalkohol verwendet werden. Weiterhin können die oben erwähnten Materialien auch mit Puffer, z.B. Phosphatpuffer und Natriumacetatpuffer; lindernden oder schmerzstillenden Mitteln, z.B. Benzalkoniumchlorid, Procainhydrochlorid; Stabilisatoren, z.B. Humanserumalbumin, Polyethylenglycol; Konservierungsmitteln, z.B. Benzylalkohol, Phenol; Antioxidantien etc. formuliert werden. Normalerweise wird ein geeignetes Gefäß mit der so hergestellten pharmazeutischen Zusammensetzung, z.B. einer injizierbaren Flüssigkeit gefüllt.
  • Die so erhaltenen Präparate sind sicher und von geringer Toxizität und können daher z.B. an Menschen und warmblütige Tiere verabreicht werden (z.B. Ratte, Maus, Meerschweinchen, Kaninchen, Huhn, Schaf, Schwein, Vieh, Pferd, Katze, Hund, Affe etc.).
  • Die Dosis des Peptids oder Äquivalents der Erfindung kann variieren abhängig von der zu behandelnden Krankheit, dem Individuum, dein sie verabreicht wird, dem Verabreichungsweg und anderen Faktoren. Im Allgemeinen wird jedoch eine tägliche Dosis von etwa 0,1 bis 100 mg, bevorzugt etwa 1,0 bis 50 mg, bevorzugter etwa 1,0 bis 20 mg des Peptids oder Äquivalents oral an menschliche Erwachsene verabreicht (deren Körpergewicht mit 60 kg angenommen wird) z.B. zur Behandlung von Schlaflosigkeit. Im Fall der parenteralen Verabreichung kann, obwohl die Menge des Peptids oder Äquivalents der Erfindung pro Dosis variieren kann abhängig von dem Individuum, dem es verabreicht wird, der zu behandelnden Krankheit und anderen Faktoren, das Peptid oder Äquivalent der Erfindung in geeigneter Weise intravenös in Form einer Injektion an menschliche Erwachsene verabreicht werden (deren Körpergewicht mit 60 kg angenommen wird), z.B. zur Behandlung von Schlaflosigkeit, in einer täglichen Dosis von etwa 0,01 bis 30 mg, bevorzugt etwa 0,1 bis 20 mg, bevorzugter etwa 0,1 bis 10 mg. Im Fall anderer Tierarten kann die Dosis entsprechend der oben erwähnten Dosis für 60 kg Körpergewicht verabreicht werden.
  • Der Vektor, in den die DNA der Erfindung insertiert ist, wird auch auf gleiche Art und Weise, wie oben, formuliert und allgemein parenteral verwendet.
  • (2) Mittel zur genetischen Diagnose
  • Eine Anormalität in dir DNA oder mRNA, die das Peptid oder den Vorläufer der Erfindung codiert (Genanormalität), kann, falls vorhanden, bei Menschen oder anderen warmblütigen Tieren (z.B. Ratte, Maus, Meerschweinchen, Kanincher., Huhn, Schaf, Schwein, Vieh, Pferd, Katze, Hund, Affe etc.) nachgewiesen werden unter Verwendung der DNA der Erfindung als Sonde. Daher ist die DNA z.B. nützlich als Mittel zur genetischen Diagnose verschiedener Krankheiten, die durch eine Störung oder Mutation der oben erwähnten DNA oder mRNA oder verringerte Expression davon oder einen erhöhten Pegel an DNA oder mRNA oder übermäßige Expression davon entstehen.
  • Die oben erwähnte genetische Diagnose unter Verwendung der DNA der Erfindung kann z.B. mit der an sich bekannten Northern Hybridisierung oder mit PCR-SSCP-Technik durchgeführt werden [Genomics, Bd. 5, Seiten 874-879 (1989); Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Bd. 86, Seiten 2766-2770 (1989)].
  • Somit ist die DNA der Erfindung nützlich als Mittel zur genetischen Diagnose z.B. von Hormon produzierenden Tumoren, Akromegalie, Gigantismus, Demenz, Diabetes, Magengeschwüren, Zwergwuchs, Agalaktie oder Hypogalaktie und dgl. und außerdem für solche Krankheiten, wie Alzheimer-Krankheit, Asthma, Arteriosklerose, atopische Dermatitis, Hyperphagie, Polyphagie, chronisch-lymphatische Leukämie, chronischmyelotische Leukämie, Morbus Crohn, diabetische Komplikationen, Hodgkin-Krankheit, Hypercalcämie, Hypercholesterolämie, Hyperglyceridämie, Hyperlipämie, insulinabhängiger Diabetes mellitus (Typ I), allergische Rhinitis, Schizophrenie, Schlaflosigkeit usw. Insbesondere ist sie nützlich als Mittel zur genetischen Diagnose von Schlaflosigkeit.
  • Wenn z.B. eine verminderte Expression der mRNA mit Northern-Hybridisierung nachgewiesen wird, kann die Diagnose so sein, dass die vermutete Krankheit ein Hormon erzeugender Tumor, Akromegalie, Gigantismus, Demenz, Diabetes, Magengeschwür oder Schlaflosigkeit ist oder die Möglichkeit der Manifestation einer solchen Krankheit in der Zukunft hoch ist.
  • Wenn andererseits eine übermäßige Expression der mRNA durch Northern-Hybridisierung nachgewiesen wird, kann die Diagnose so sein, dass die vermutete Krankheit Zwergwuchs, Agalaktie/Hypogalaktie oder Diabetes ist oder dass die Möglichkeit der Manifestation einer solchen Krankheit in der Zukunft hoch ist.
  • Wenn weiterhin eine DNA-Mutation mit der PCR-SSCP-Technik nachgewiesen wird, kann die Diagnose so sein, dass die vermutete Krankheit ein Hormon erzeugender Tumor, Akromegalie, Gigantismus, Demenz, Diabetes, Magengeschwür, Zwergwuchs, Agalaktie/Hypogalaktie und dgl. ist oder über Alzheimer-Krankheit, Asthma, Arteriosklerose, atopische Dermatitis, Hyperphagie, Polyphagie, chronisch-lymphatische Leukämie, chronisch-myelotische Leukämie, Morbus Crohn, diabetische Komplikationen, Hodgkin-Krankheit, Hypercalcämie, Hypercholesterolämie, Hyperglyceridämie, Hyperlipämie, insulinabhängiger Diabetes mellitus (Typ I), allergische Rhinitis Schizophrenie, Schlaflosigkeit oder dgl., oder dass die Möglichkeit der Manifestation einer solchen Krankheit in der Zukunft hoch ist.
  • (3) Test des Peptids, Vorläufers oder Salzes der Erfindung
  • Der Antikörper der Erfindung, der spezifisch das Peptid oder Äquivalent der Erfindung erkennt, kann z.B. zum Testen des Peptids oder Äquivalents der Erfindung in Testlösungen verwendet werden, insbesondere mit der Sandwich-Immunoassaytechnik.
  • Somit liefert die vorliegende Erfindung:
    • (i) ein Verfahren zum Nachweis des Peptids oder Äquivalents der Erfindung in einer Testlösung, das umfasst, dass ein Antikörper gegen das Peptid oder Äquivalent der Erfindung konkurrierend mit der Testlösung und dem Peptid oder Äquivalent der Erfindung, das in markierter Form vorliegt, reagiert und der Anteil an markiertem Peptid oder Äquivalent der Erfindung, das dann an den Antikörper gebunden hat, bestimmt wird und
    • (ii) ein Verfahren zum Nachweis des Peptids oder Äquivalents der Erfindung in einer Testlösung, das beinhaltet, dass die Testlösung mit dem Antikörper der Erfindung, insolubilisiert an einem Träger, und einem weiteren Antikörper der Erfindung, der in markierter Form vorhanden ist, entweder gleichzeitig oder aufeinander folgend umgesetzt wird und die Aktivität der Markierung auf dem insolubilisierenden Träger bestimmt wird.
  • Bei der oben unter (ii) erwähnten Testmethode ist es wünschenswert, dass ein Antikörper ein Antikörper ist, der die N-terminale Sequenz des Peptids oder Äquivalents der Erfindung erkennen kann und der andere Antikörper ein Antikörper ist, der mit der C-terminalen Sequenz des Peptids oder Äquivalents der Erfindung reagieren kann.
  • Weiterhin ist es auch möglich, das Peptid oder Äquivalent der Erfindung zu testen unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen das Peptid oder Äquivalent der Erfindung (im Folgenden als monoklonaler Antikörper der Erfindung bezeichnet) und zusätzlich ist es auch möglich, den Nachweis z.B. durch Gewebeanfärbung durchzuführen. Um diese Aufgaben zu erfüllen, kann entweder das Antikörpermolekül selbst oder ein F(ab')2-, Fab'- oder Fab-Anteil des Antikörpermoleküls verwendet werden.
  • Das Verfahren zum Testen des Peptids oder Äquivalents der Erfindung unter Verwendung des Antikörpers der Erfindung ist nicht auf irgendeine spezielle Methode beschränkt, sondern kann jede Testmethode sein, die umfasst, dass die Menge an Antikörper, Antigen oder Antikörper-Antigen-Komplex, die der Menge des Antigens entspricht, in einer Testlösung mit chemischen oder physikalischen Mitteln nachgewiesen wird (z.B. Peptidmenge) und die Menge an Antigen unter Verwendung einer Standardkurve berechnet wird, die unter Verwendung von Standardlösungen, die bekannte Mengen des Antigens enthielten, erstellt wurde. So kann z.B. nephelometrische, kompetitive, immunometrische oder Sandwichtechnik geeigneterweise verwendet werden. Aus Gründen der Empfindlichkeit und Spezifität ist die Sandwichtechnik, die weiter unten näher erläutert wird, besonders bevorzugt.
  • Als Markierung, die in der Testmethode unter Verwendung einer markierten Substanz angewendet wird, können Radioisotope, Enzyme, fluoreszierende Substanzen und lumineszierende Substanzen unter anderem erwähnt werden. Bevorzugt als Radioisotope sind z.B. [125I], [131I], [3H], [14C] etc. Als Enzyme sind solche, die stabil sind und eine hochspezifische Aktivität haben, bevorzugt und es können z.B. β-Galactosidase, β-Glucosidase, alkalische Phosphatase, Peroxidase, Malatdehydrogenase etc. erwähnt werden. Als fluoreszierende Substanzen können Fluorescamin, Fluoresceinisothiocyanat etc. erwähnt werden. Als lumineszierende Substanzen können Luminol, Luminolderivate, Luciferin, Lucigenin etc. erwähnt werden. Weiterhin kann das Biotin-Avidin-System zur Antikörper- oder Antigen-Markierungs-Kupplung verwendet werden.
  • Für die Unlöslichmachung des Antigens oder Antikörpers kann eine physikalische Adsorption und chemische Bindung verwendet werden, die allgemein zur Immobilisierung und Fixierung von Peptiden, Enzymen oder dgl. verwendet wird. Als Träger können unlösliche Polysaccharide, wie Agarose, Dextran und Cellulose, synthetische Harze, wie Polystyrol, Polyacrylamid und Silicone, oder Glas und dgl. erwähnt werden.
  • Für die Sandwichtechnik kann das Peptid oder Äquivalent der Erfindung in der Testlösung bestimmt werden, indem die Testlösung mit dem monoklonalen Antikörper der Erfindung in immobilisierter Form (erste Reaktion) und weiter mit einem weiteren monoklonalen Antikörper der Erfindung in markierter Form (zweite Reaktion) umgesetzt wird und die Aktivität der Markierung an dem für die Immobilisierung verwendeten Träger gemessen wird. Die erste und zweite Reaktion können in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden. Weiterhin können sie gleichzeitig oder eine nach der anderen durchgeführt werden. Die Markierung und das Verfahren zur Immobilisierung können die gleichen sein, wie weiter oben erwähnt. Weiterhin ist es bei Durchführung des Immunoassays mit Sandwichtechnik nicht immer notwendig, dass nur ein Antikörper als Festphasenantikörper oder markierter Antikörper verwendet wird. Eine Mischung von zwei oder mehr Antikörpern kann verwendet werden, um z.B. die Empfindlichkeit der Messung zu verbessern.
  • Beim Testen des Peptids oder Äquivalents der Erfindung mit der Sandwichtechnik gemäß der Erfindung sind der monoklonale Antikörper, der für die erste Reaktion verwendet wird, und der monoklonale Antikörper, der für die zweite Reaktion verwendet wird, bevorzugt Antikörper, die sich in der Bindungsstelle an das Peptid oder das Äquivalent der Erfindung unterscheiden. So sind die für die erste und zweite Reaktion verwendeten Antikörper so, dass dann, wenn der für die zweite Reaktion verwendete Antikörper einen C-terminalen Teil des Peptids oder Äquivalents der Erfindung erkennt, z.B. der für die erste Reaktion verwendete Antikörper ein Antikörper sein sollte, der eine andere Stelle als den C-terminalen Teil erkennt, z.B. den N-terminalen Teil.
  • Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper kann auch für andere Messsysteme als das Sandwichsystem verwendet werden, z.B. in kompetitiven, immunometrischen oder nephelometrischen Systemen.
  • Die kompetitive Technik beinhaltet, dass das Antigen in der Testlösung und das markierte Antigen um den Antikörper konkurrieren, dann nicht umgesetztes markiertes Antigen (F) von markiertem Antigen (B), das an den Antikörper gebunden ist, getrennt wird (B/F-Trennung), die Menge der Markierung entweder bei B oder F bestimmt wird und somit das Antigen in der Testlösung bestimmt wird. Für diese Reaktionsart können die Flüssigphasenmethode unter anderem unter Verwendung eines löslichen Antikörpers als Antikörper, von Polyethylenglycol für die B/F-Trennung und eines zweiten Antikörpers im Hinblick auf den Antikörper, oder die Festphasenmethode unter Verwendung eines insolubilisierten Antikörpers als erstem Antikörper oder unter Verwendung eines löslichen ersten Antikörpers und eines immobilisierten zweiten Antikörpers verwendet werden.
  • Bei der immunometrischen Technik reagieren das Antigen in der Testlösung und ein immobilisiertes Antigen kompetitiv mit einer vorbestimmten Menge an markiertem Antikörper und dann werden feste und flüssige Phase voneinander getrennt oder das Antigen in der Testlösung wird mit einer überschüssigen Menge an markiertem Antikörper umgesetzt, dann ein insolubilisiertes Antigen zugegeben, damit der nicht umgesetzte markierte Antikörper an die feste Phase gebunden werden kann und danach werden feste und flüssige Phase voneinander getrennt. Dann wird die Menge der Markierung in jeder Phase bestimmt und die Menge des Antigens in der Testlösung wird berechnet.
  • In der Nephelometrie wird weiterhin die Menge eines unlöslichen Niederschlags, der durch die Antigen-Antikörper-Reaktion entsteht, in einem Gel oder einer Lösung bestimmt. Sogar wenn die Menge des Antigens in der Testlösung gering ist und der Niederschlag nur eine geringe Menge ergibt, kann Lasernephelometrie, die die Beugung von Laserstrahlen verwendet, vorteilhaft verwendet werden.
  • Bei Anwendung dieser jeweiligen immunologischen Testtechniken für die Testmethode der Erfindung sind keine speziellen Bedingungen oder Arbeitsschritte erforderlich. Ein System zum Nachweis des Peptids oder Äquivalents der Erfindung kann entwickelt werden unter üblichen technischen Überlegungen, die sich für den Fachmann auf diesem Gebiet ergeben, unter solchen Bedingungen und Verfahrensschritten, die für die jeweiligen Techniken üblich sind. Bezüglich der Details dieser allgemeinen technischen Mittel kann auf verschiedene Überblicke, Monographien usw. Bezug genommen werden.
  • Z.B. kann auf Hiroshi Irie (Herausgeber): "Radioimmunoassay" (publiziert von Kodansha, 1974); Hiroshi Irie (Herausgeber): "Radioimmunoassay, A Sequel" (publiziert von Kodansha, 1979); Eiji Ishikawa et al. (Herausgeber): "Koso Men-eki Sokuteiho (Enzyme Immonoassay)" (publiziert von Igaku Shoin, 1978); Eiji Ishikawa et al. (Herausgeber): "Koso Men-eki Sokuteiho", 2. Auflage (publiziert von Igaku Shoin, 1982); Eiji Ishikawa et al. (Herausgeber): "Koso Men-eki Sokuteiho", 3. Auflage (publiziert von Igaku Shoin, 1987); Methods in Enzymology, Bd. 70 (Immunochemical Techniques (Teil A)), ibid., Bd. 73 (Immunochemical Techniques (Teil B)), ibid., Bd. 74 (Immunochemical Techniques (Teil C)), ibid., Bd. 84 (Immunochemical Techniques (Teil D: Selected Immunoassays)), ibid., Bd. 92 (Immunochemical Techniques (Teil E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibid., Bd. 121 (Immunochemical Techniques (Teil I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (publiziert von Academic Press) usw. Bezug genommen werden.
  • Auf die obige Art und Weise kann das Peptid oder Äquivalent der Erfindung mit guter Empfindlichkeit nachgewiesen werden unter Verwendung des Antikörpers der Erfindung.
  • Weiterhin können verschiedene Krankheiten, an denen das Peptid oder Äquivalent der Erfindung beteiligt ist, diagnostiziert werden, indem die Konzentration des Peptids oder Äquivalents der Erfindung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers bestimmt wird.
  • Genauer kann dann, wenn eine reduzierte Konzentration des Peptids oder Äquivalents der Erfindung nachgewiesen wird, die Diagnose so sein, dass die angenommene Krankheit z.B. ein Hormon erzeugender Tumor, Akromegalie, Gigantismus, Demenz, Diabetes, Magengeschwür oder Schlaflosigkeit ist, oder dass die Möglichkeit einer Manifestation dieser Krankheit in der Zukunft hoch ist.
  • Wenn andererseits eine erhöhte Konzentration des Peptids oder Äquivalents der Erfindung nachgewiesen wird, kann die Diagnose so sein, dass die zu erwartende Krankheit z.B. Zwergwuchs, Agalaktie/Hypogalaktie oder Diabetes ist oder dass die Möglichkeit der Manifestation einer solchen Krankheit in der Zukunft hoch ist.
  • Außerdem kann dann, wenn eine anormale Konzentration des Peptids der Erfindung nachgewiesen wird, die Diagnose so sein, dass die erwartete Krankheit unter anderem akute bakterielle Meningitis, akuter Myokardinfarkt, akute Pankreatitis, akute virale Enzephalitis, Respiratory Distress Syndrom bei Erwachsenen, alkoholische Hepatitis, Alzheimer-Krankheit, Asthma, Arteriosklerose, atopische Dermatitis, bakterielle Pneumonie, Blasenkrebs, Knochenbruch, Brustkrebs, Hyperphagie, Polyphagie, Wundheilung, Karzinom des Gebärmutterhalses, chronisch lymphatische Leukämie, chronisch-myelotische Leukämie, chronische Pankreatitis, Leberzirrhose, Kolorektalkrebs (Karzinom von Kolon/Rektum), Morbus Crohn, Demenz, diabetische Komplikationen, z.B. diabetische Nephropathie, diabetische Neuropathie, diabetische Retinopathie etc., Gastritis, Helicobacter-pylori-Infektion, Leberinsuffizienz, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, andere Arten von Hepatitis, Herpes-Simplex-Virusinfektion, Varicella-Zoster-Virusinfektion, Morbus Hodgkin, Aidsvirusinfektion, Humanpapillomavirusinfektion, Hypercalcämie, Hypercholesterolämie, Hyperglyceridämie, Hyperlipämie, gemischte infektiöse Krankheiten, Influenzavirusinfektion, insulinabhängiger Diabetes mellitus (Typ I), invasive Staphylokokkeninfektion, maligne Melanome, Krebsmetastasenbildung, multiple Myelome, allergische Rhinitis, Nephritis, Nicht-Hodgkin-Lymphome, nicht-insulinabhängiger Diabetes mellitus (Typ II), nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, Organtransplantation, Osteoarthritis, Osteomalazie, Osteopenie, Osteoporose, Eierstockkrebs, Morbus Bechterew, Magengeschwüre, periphere Gefäßkrankheiten, Prostatakrebs, Reflux-Ösaphagitis, Nierenversagen, Polyarthritis, Schizophrenie, Sepsis, septischer Schock, schwere systemische Pilzinfektion, kleinzelliger Lungenkrebs, Rückenmarksschäden, Magenkrebs, systemischer Lupus erythematodes, vorübergehende zerebrale ischämische Attacken, Lungentuberkulose, Herzklappenkrankheit, mit vaskulärem, multiplem Infarkt verbundene Demenz, Wundheilung, Arthritis und neurodegenerative Krankheiten, einschließt, oder dass die Möglichkeit der Manifestation einer solchen Krankheit in der Zukunft hoch ist.
  • Der Antikörper der Erfindung kann auch verwendet werden zum Nachweis des Peptids oder Äquivalents der Erfindung, das in Proben, die aus Körperflüssigkeiten oder Geweben stammen, vorliegt. Weiterhin kann er verwendet werden zur Herstellung von Antikörpersäulen zur Reinigung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung, zum Nachweis des Peptids oder Äquivalents der Erfindung in jeder Fraktion während des Reinigungsprozesses oder z.B. zur Analyse des Verhaltens des Peptids oder Äquivalents der Erfindung in Testzellen.
  • (4) Screening nach Kandidaten für medizinische Verbindungen
  • Das Peptid oder Äquivalent der Erfindung ist spezifisch konjugiert mit Somatostatinrezeptoren, Rezeptoren für das Peptid oder Äquivalent der Erfindung und solchen Rezeptoren, wie GPR7 und GPR8, an die das Peptid oder Äquivalent der Erfindung konjugiert sein kann (im Folgenden kurz als "Rezeptor(en)" bezeichnet) und daher ist es durch Konstruktion eines Liganden-Rezeptor-Bindungstestsystems unter Verwendung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung und des Rezeptors möglich, ein Screening nach Kandidaten für medizinische Verbindungen mit Somatostatin-artiger oder Cortistatin-artiger Aktivität durchzuführen oder ein Screening, nach Kandidaten für medizinische Verbindungen, die die Aktivität des Peptids oder Äquivalents der Erfindung oder von Somatostatin oder Cortistatin stimulieren oder hemmen können. Somit liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screening nach einer Verbindung oder einem Salz davon, die/das die Bindung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung an den Rezeptor oder die Rezeptoren modifizieren kann, das die Verwendung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung beinhaltet.
  • Genauer liefert die vorliegende Erfindung:
    • (I) ein Verfahren zum Screenen nach einer Verbindung oder einem Salz davon, die/das die Bindung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung an den Rezeptor modifizieren kann, das einerseits umfasst, dass (i) das Peptid oder Äquivalent der Erfindung mit dem Rezeptor, einem Fragmentpeptid, das davon abgeleitet ist, oder einem Salz des Rezeptors oder Fragmentpeptids in Kontakt gebracht wird und andererseits (ii) das Peptid oder Äquivalent der Erfindung und eine zu testende Verbindung mit dem Rezeptor, dem Fragmentpeptid oder Salz in Kontakt gebracht werden und ein Vergleich zwischen den beiden Fällen (i) und (ii) gemacht wird und
    • (II) ein Verfahren zum Screenen nach einer Verbindung oder einem Salz davon, die/das die Bindung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung an den Rezeptor modifizieren kann, das umfasst, dass einerseits (i) das Peptid oder Äquivalent der Erfindung mit Zellen oder einer Zellmembranfraktion, die den Rezeptor enthält, in Kontakt gebracht wird und andererseits (ii) das Peptid oder Äquivalent der Erfindung und eine zu testende Verbindung mit den Zellen oder einer Zellmembranfraktion, die den Rezeptor enthalten, in Kontakt gebracht wird und ein Vergleich zwischen den obigen Fallen (i) und (ii) gemacht wird.
  • Genauer ist das Screeningverfahren der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass z.B. das Ausmaß der Bindung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung an den Rezeptor oder die rezeptorhaltigen Zellen oder die zellstimulierenden Aktivitäten bestimmt werden oder in den Fallen (i) und (ii) gemessen werden und miteinander verglichen werden.
  • Die Verbindung, die die Bindung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung an die Rezeptoren modifizieren kann, schließt ➀ Verbindungen, die an die Rezeptoren binden und zellstimulierende Aktivität zeigen (so genannte Rezeptoragonisten), ➁ Verbindungen, die an die Rezeptoren binden und die zellstimulierende Aktivität von Agonisten hemmen (so genannte Rezeptorantagonisten), ➂ Verbindungen, die die Bindung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung an die Rezeptoren erhöhen und ➃ Verbindungen, die die Bindung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung an die Rezeptoren vermindern, ein.
  • Genauer liefert die vorligende Erfindung:
    • (Ia) ein Verfahren zum Screenen nach einer Verbindung oder einem Salz davon, die/das die Bindung eines Peptids oder Äquivalents der Erfindung an den Rezeptor modifizieren kann, das umfasst, dass einerseits (i) das Peptid oder Äquivalent der Erfindung in markierter Form in Kontakt mit dem Rezeptor, einem Fragmentpeptid, das davon abgeleitet ist, oder einem Salz des Rezeptors oder Fragmentpeptids in Kontakt gebracht wird und andererseits (ii) das markierte Peptid oder Äquivalent der Erfindung und eine zu testende Verbindung mit dem Rezeptor, Fragmentpeptid oder Salz in Kontakt gebracht werden und das Ausmaß der Bindung des markierten Peptids oder Äquivalents der Erfindung an den Rezeptor, das Fragmentpeptid oder Salz bestimmt und verglichen wird zwischen den beiden Fallen (i) und (ii);
    • (IIa) ein Verfahren zum Screenen nach einer Verbindung oder einem Salz davon, die/das die Bindung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung an den Rezeptor modifizieren kann, das umfasst, dass einerseits (i) das Peptid oder Äquivalent der Erfindung in markierter Form mit Zellen oder einer Zellmembranfraktion in Kontakt gebracht wird, die den Rezeptor enthalten/enthält, und andererseits (ii) das markierte Peptid oder Äquivalent der Erfindung und eine zu testende Verbindung mit den rezeptorhaltigen Zellen oder der rezeptorhaltigen Zellmembranfraktion in Kontakt gebracht werden und das Ausmaß der Bindung des markierten Peptids oder Äquivalents an die Zellen oder die Zellmembranfraktion zwischen den beiden Fällen (i) und (ii) bestimmt und verglichen wird;
    • (IIb) ein Verfahren zum Screenen nach einem Rezeptoragonisten, das umfasst, dass das Peptid oder Äquivalent der Erfindung mit Zellen, die den Rezeptor enthalten, in Kontakt gebracht wird und die so erhaltenen Daten über die zellstimulierenden Aktivitäten, die durch diesen Rezeptor vermittelt werden, bestimmt und verglichen werden (z.B. Arachidonsäurefreisetzung, Acetylcholinfreisetzung, Veränderung der intrazellulären Ca2+-Konzentration, Bildung von intrazellulärem cAMP, Bildung von intrazellulärem cGMP, Inositphosphatproduktion, Veränderung des Zellmembranpotenzials, intrazelluläre Proteinphosphorylierung, c-fos-Aktivierung, pH-Abfall, die Zellmigrationaktivität fördernde oder hemmende Aktivität etc., insbesondere eine die intrazelluläre cAMP-Bildung fördernde oder hemmende Aktivität) und
    • (IIc) ein Verfahren zum Screenen nach einem Rezeptorantagonisten, das umfasst, dass einerseits (i) das Peptid oder Äquivalent der Erfindung mit Zellen, die den Rezeptor enthalten, in Kontakt gebracht wird und andererseits (ii) das Peptid oder Äquivalent der Erfindung und eine zu testende Verbindung mit den rezeptorhaltigen Zellen in Kontakt gebracht werden und die so erhaltenen Daten über die zellstimulierenden Aktivitäten, die durch diesen Rezeptor vermittelt werden (z.B. Arachidonsäurefreisetzung, Acetylcholinfreisetzung, Veränderung der intrazellulären Ca2 +-Konzentration, Bildung von intrazellulärem cAMP, Bildung von intrazellulärem cGMP, Inositphosphatproduktion, Veränderung des Zellmembranpotenzials, intrazelluläre Proteinphosphorylierung, c-fos-Aktivierung, pH-Abfall, die Zellmigrationaktivität fördernde oder hemmende Aktivität etc., insbesondere eine die intrazelluläre cAMP-Bildung fördernde oder hemmende Aktivität) zwischen den obigen Fällen (i) und (ii) bestimmt und verglichen werden.
  • Bei den obigen Screeningverfahren (Ia) oder (IIa) können Verbindungen, die an den Rezeptor binden können und die Bindung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung an den Rezeptor modifizieren (oder hemmen) können, als Rezeptoragonisten oder Rezeptorantagonisten selektiert werden.
  • Bei den oben erwähnten Screeningmethoden (Ia) oder (IIa) können Verbindungen, die nicht an den Rezeptor binden können, aber die Bindung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung an den Rezeptor erhöhen können, als Verbindungen, die die Bindung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung an den Rezeptor erhöhen können, selektiert werden.
  • Bei den oben erwähnter.. Screeningmethoden (Ia) oder (IIa) können Verbindungen, die nicht an den Rezeptor binden können, aber die Bindung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung an den Rezeptor vermindern können, als Verbindungen ausgewählt werden, die die Bindung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung an den Rezeptor vermindern können.
  • Bei der oben erwähnten Screeningmethode (IIb) können Verbindungen, die an den Rezeptor binden können und die rezeptorvermittelte zellstimulierende Aktivität hemmen können (z.B. Arachidonsäurefreisetzung, Acetylcholinfreisetzung, Veränderung der intrazellulären Ca2 +-Konzentration, Bildung von intrazellulärem cAMP, Bildung von intrazellulärem cGMP, Inositphosphatproduktion, Veränderung des Zellmembranpotenzials, intrazelluläre Proteinphosphorylierung, c-fos-Aktivierung, pH-Abfall, die Zellmigrationaktivität fördernde oder hemmende Aktivität etc., insbesondere eine die intrazelluläre cAMP-Bildung fördernde oder hemmende Aktivität), insbesondere die intrazelluläre cAMP-Bildung hemmen können, als Rezeptoragonisten ausgewählt werden.
  • Bei der oben erwähnten Screeningmethode (IIc) können Verbindungen, die an den Rezeptor binden können und die zellstimulierende Aktivität des Peptids oder Äquivalents der Erfindung hemmen können, als Rezeptorantagonisten ausgewählt werden.
  • Insbesondere ist es bei dem Screeningverfahren der Erfindung wünschenswert, die oben erwähnten Screeningmethoden (Ia) oder (IIa) durchzuführen und Verbindungen auszuwählen, die die Bindung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung an den Rezeptor hemmen können, dann die so erhaltenen Verbindungen den oben erwähnten Screeningmethoden (IIb) oder (IIc) zu unterziehen und einerseits Verbindungen auszuwählen mit der oben erwähnten zellstimulierenden Aktivität als Rezeptoragonisten und andererseits Verbindungen, die die zellstimulierende Aktivität des Peptids oder Äquivalents der Erfindung hemmen können, als Rezeptorantagonisten auszuwählen.
  • Von den in der Screeningmethode der Erfindung zu verwendenden Rezeptoren schließt der Somatostatinrezeptor u.a. Somatostatinrezeptor-Subtyp 1 (SSTR1) oder Subtyp 2 (SSTR2) (Yamada et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 89, Seiten 251-255, 1992), Subtyp 3 (SSTR3) (Yamada et al., Molecular Endocrinology, Bd. 6, Seiten 2136-2142, 1992), Subtyp 4 (SSTR4) oder Subtyp 5 (SSTR5) (Yamada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 195, Seiten 844-852, 1993) etc. ein. Als GPR7 oder GPR8 können solche, die in Genomics, 28, 84-91 (1995) beschrieben werden, verwendet werden. Der Rezeptor für das Peptid oder Äquivalent der Erfindung; kann mit an sich bekannten Techniken für die Proteinreinigung erhalten werden und es ist auch möglich, den gewünschten Rezeptor zu erhalten, indem eine DNA, die den Rezeptor codiert, mit an sich bekannten Gentechnikmethoden kloniert wird und dann die Expression der DNA gemäß der oben erwähnten Methode, mit der die Expression des Peptids oder Äquivalents der Erfindung erreicht wird, zu verursachen.
  • Verwendbar als von dem Rezeptor abgeleitetes Fragmentpeptid sind Fragmentpeptide, die durch geeignete Spaltung des Peptids voller Länge erhalten werden.
  • Verwendbar als rezeptorhaltige Zellen sind solche Zellen, wie oben erwähnt, als Wirtszellen zur Verwendung in der Expression des Peptids oder Äquivalents der Erfindung. Von diesen sind CHO-Zellen oder dgl. jedoch bevorzugt. Die rezeporhaltigen Zellen können erzeugt werden, indem eine DNA verwendet wird, die den Rezeptor codiert und mit an ich bekannten Techniken, z.B. mit der oben erwähnten Methode zur Expression des Peptids der Erfindung. Die DNA, die den Rezeptor codiert, kann mit an sich bekannten gentechnischen Verfahren erhalten werden und die Somatostatinrezeptor-Subtypen 1 bis 5 und GPR7 oder GPR8 können z.B. gemäß den oben zitierten Literaturstellen erhalten werden.
  • Wenn die rezeptorhaltigen Zellen bei dem Screeningverfahren der Erfindung verwendet werden, können diese Zellen mit Glutaraldehyd, Formalin oder dgl. fixiert werden. Die Fixierung kann mit an sich bekannten Techniken durchgeführt werden. Weiterhin können Gehirn, Hypophyse, Lunge und andere Gewebe, die von verschiedenen Tieren stammen und Membranfraktionen davon als rezeptorhaltige Zellen verwendet werden.
  • Das markierte Peptid oder Äquivalent der Erfindung ist z.B. das Peptid oder Äquivalent der Erfindung, das mit [3H], [125I], [14C] oder [35S] oder dgl. markiert ist.
  • Als Testverbindung können Peptide, Proteine, Nichtpeptidverbindungen, synthetische Verbindungen, Fermentationsprodukte, Zellextrakte, Pflanzenextrakte, Tiergewebeextrakte usw. erwähnt werden. Diese Verbindungen können neue oder bekannte sein.
  • Spezifisch werden bei Durchführung der oben erwähnten Screeningmethoden (Ia) oder (IIa) zuerst Rezeptorstandards hergestellt, indem Zellen oder eine Zellfraktion, die den Rezeptor der Erfindung enthalten, oder der Rezeptor oder ein Fragmentpeptid davon in einem zum Screening geeigneten Puffer suspendiert werden. Der Puffer kann irgendein Puffer sein, der die Bindung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung an den Rezeptor nicht hemmt, z.B. Phosphatpuffer, Trishydrochloridpuffer oder dgl., der einen pH von etwa 4 bis 10 (wünschenswerterweise etwa 6 bis 8) hat. Um die nichtspezifische Bindung zu reduzieren, kann ein Tensid, wie CHAPS, Tween-80TM (Kao-Atlas), Digitonin oder Desoxycholat dem Puffer zugefügt werden. Um die Zersetzung des Rezeptors oder Liganden durch Proteasen zu hemmen, kann ein Proteaseinhibitor, wie PMSF, Leupeptin, Bacitracin, Aprotinir., E-64 (Produkt des Peptidinstituts) oder Pepstatin weiterhin zugefügt werden. Wenn andererseits die Zellen fixiert oder immobilisiert sind, kann die Bindung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung an den Rezeptor bewirkt werden, indem die Zellen in einem an Inkubationsgefäße immobilisierten Zustand verwendet werden, nämlich in Form von Zellen, so wie sie gewachsen sind, oder Zellen, die mit Glutaraldehyd oder Paraformaldehyd fixiert sind.
  • In diesem Fall wird u.a. ein Kulturmedium oder Hank's Lösung als Puffer verwendet. Eine vorbestimmte Menge (z.B. etwa 10.000 cpm bis 1.000.000 cpm im Fall von 2.000 Ci/mmol) des Peptids oder Äquivalents der Erfindung in markierter Form (z.B. mit [125I] markiertes Peptid oder Äquivalent der Erfindung) wird 0,01 ml bis 10 ml der Rezeptorlösung zugefügt und es wird dafür gesorgt, dass gleichzeitig 10–4 M bis 10–10 M der Testverbindung vorliegen. Um die nichtspezifische Bindung (NSB) festzustellen, werden auch Reaktionsröhrchen mit einem großen Überschuss des Peptids oder Äquivalents der Erfindung, das in unmarkierter Form zugefügt wurde, vorbereitet. Die Reaktion wird bei etwa 0 bis 50°C, wünschenswerterweise etwa 4 bis 37°C, etwa 20 Minuten bis 24 Stunden, wünschenswerterweise etwa 30 Minuten bis 3 Stunden, durchgeführt. Nach der Reaktion wird jede Reaktionsmischung durch ein Glasfaserfilter oder dgl. filtriert und nach dem Waschen mit einer geeigneten Menge des gleichen Puffers, die auf dem Glasfaserfilter zurückbleibende Radioaktivität (z.B. Radioaktivität von [125I]) gemessen unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers oder γ-Zahlers. Für die Filtration kann ein Verteiler oder Zellerntegerät verwendet werden; die Verwendung eines Zellerntegerätes ist wünschenswert, um die Effizienz zu verbessern. Wenn die Zahl (B0) ohne irgendeine antagonisierende Substanz minus die nichtspezifische Bindung (NSB), nämlich die Zahl (B0 – NSB) als 100% genommen wird, kann eine Testverbindung, die eine spezifische Bindung (B – NSB), die nicht mehr als 50% der Zahl (B0 – NSB) beträgt, als Kandidat für einen Agonisten oder Antagonisten ausgewählt werden.
  • Bei Durchführung der oben erwähnten Screeningmethode (IIb) oder (IIc) kann die rezeptorvermittelte zellstimulierende Aktivität (z.B. Arachidonsäurefreisetzung, Acetylcholinfreisetzung, Veränderung der intrazellulären Ca2 +-Konzentration, Bildung von intrazellulärem cAMP, Bildung von intrazellulärem cGMP, Inositphosphatproduktion, Veränderung des Zellmembranpotenzials, intrazelluläre Proteinphosphorylierung, c-fos-Aktivierung, pH-Abfall, die Zellmigrationaktivität fördernde oder hemmende Aktivität etc.) gemessen werden unter Verwendung einer bekannten Methode oder eines im Handel erhältlichen Testkits. Spezifisch werden Zellen, die den Rezeptor enthalten, zuerst auf Mehrnapfplatten oder dgl. kultiviert. Vor Durchführung des Screenings wird das Medium gegen ein frisches Medium oder gegen einen geeigneten Puffer, der keine Cytotoxizität zeigt, ausgetauscht. Die Testverbindung etc. wird dann zugegeben, nach einem vorbestimmten Inkubationszeitraum werden die Zellen extrahiert oder der Überstand gewonnen und das Produkt oder die Produkte, die gebildet wurden, werden mit den jeweiligen Methoden getestet. Wenn der Nachweis der Bildung einer Substanz (z.B. Arachidonsäure), die als Indikator der zellstimulierenden Aktivität ausgewählt wurde, durch ein zersetzendes Enzym, das in den Zellen vorhanden ist, beeinträchtigt wird, kann der Test in Gegenwart eines Inhibitors dieses zersetzenden Enzyms durchgeführt werden. Was die die cAMP-Produktion hemmende Aktivität oder dgl. betrifft, kann die Aktivität nachgewiesen werden als hemmende Aktivität gegenüber Zellen, in denen die Grundproduktion mit Forskolin oder dgl. erhöht wurde.
  • Der Screening-Kit der Erfindung beinhaltet das Peptid oder Äquivalent, bevorzugt zusammen mit Zellen oder einer Zellmembranfraktion, die den Rezeptor enthält oder den Rezeptor oder ein Fragmentpeptid davon enthält.
  • Als Beispiele des Screening-Kits der Erfindung können die folgenden erwähnt werden:
  • [Reagenzien zum Screenen]
    • ➀ Messpuffer und Waschpuffer
    • Hank's ausgeglichene Salzlösung (Gibco), ergänzt mit 0,05% Rinderserumalbumin (Sigma). Diese wird durch Filtration durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,45 μm sterilisiert und bei 4°C aufbewahrt. Sie kann jederzeit hergestellt werden.
    • ➁ Somatostatinrezeptorstandard
    • Somatostatinrezeptorhaltige CHO-Zellen, die auf 12-Napfplatten subkultiviert wurden mit 5 × 105 Zellen/Napf und unter den Bedingungen von 37°C und 5% CO2 plus 95% Luft 2 Tage lang kultiviert wurden.
    • ➂ Markiertes Peptid oder Äquivalent der Erfindung
    • Das Peptid oder Äquivalent der Erfindung markiert mit im Handel erhältlichem [3H], [125I], [14C], [35S] oder dgl. (z.B. [125I] hCS-17).
    • Es wird in gelöstem Zustand bei 4°C oder –20°C aufbewahrt und zu gegebener Zeit mit 1 μM Messpuffer verdünnt.
    • ➃ Standardlösung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung Das Peptid oder Äquivalent der Erfindung wird in PBS, das 0,1% Rinderserumalbumin (Sigma) enthält, auf 0,1 mM gelöst und bei –20°C aufbewahrt.
  • [Messmethode]
    • ➀ Rekombinanten Somatostatinrezeptor enthaltende CHO-Zellen, die auf 12-Napfgewebekulturplatten gezüchtet wurden, werden mit zwei Anteilen von jeweils 1 ml Messpuffer gewaschen und 490 μl Messpuffer werden jedem Napf zugefügt.
    • ➁ 5 μl einer 10–3 bis 10–10 M Lösung der Testverbindung werden zugefügt, dann werden 5 μl einer 5 nM Losung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung in markierter Form zugegeben und die Reaktion wird bei Raumtemperatur 1 Stunde lang fortschreiten gelassen. Um die nichtspezifische Bindung festzustellen, werden 5 μl einer 10 M Lösung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung statt der Testverbindung zugefügt.
    • ➂ Die Reaktionslösung wird entfernt und jeder Napf wird mit drei Anteilen mit jeweils 1 ml Waschpuffer gewaschen. Zellgebundenes markiertes Peptid oder Äquivalent der Erfindung wird gelöst unter Verwendung von 0,5 ml 0,2 n NaOH-1% SDS und die Lösung wird mit 4 ml Flüssigszintillator A (Wako Pure Chemical Industries) vermischt.
    • ➃ Die Radioaktivität wird gemessen unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers (Beckman) und als Prozent maximale Bindung (PMB) ausgedrückt gemäß der Formel [Mathematische Formel 1], die unten gezeigt ist. Wenn die Markienrung [125I] ist, kann die Radioaktivität direkt gemessen werden unter Verwendung eines Gammazählers ohne Flüssigszintillator zuzumischen.
  • [Mathematische Formel I]
    • PBM = [(B – NSB)/(B0 – NSB)] × 100wobei
      PMB:
      Prozent maximale Bindung ist;
      B:
      Wert, wenn die Testverbindung zugefügt wurde;
      NSB:
      nichtspezifische Bindung;
      B0:
      maximale Bindung
  • Wie oben erwähnt, ist das Peptid oder Äquivalent der Erfindung nützlich als Reagenz zum Screenen nach einer Verbindung, die die Bindung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung an den Rezeptor modifizieren kann.
  • Die Verbindung, einschließlich der Salze davon, die unter Verwendung der Screeningmethode oder des Screening-Kits der Erfindung erhalten wurde, ist eine Verbindung, die die Bindung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung an den Rezeptor modifizieren kann und genauer ➀ eine Verbindung, die an den Rezeptor binden kann, um die Stimulierung von Zellen durch Agonisten zu hemmen (so genannter Rezeptoragonist), ➁ eine Verbindung, die an den Rezeptor binden kann und eine zellstimulierende Aktivität hemmen kann (so genannter Rezeptorantagonist), ➂ eine Verbindung, die die Bindung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung an den Rezeptor erhöhen kann, oder ➃ eine Verbindung, die die Bindung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung an den Rezeptor vermindern kamt.
  • Der Rezeptoragonist hat alle oder einige der physiologischen Aktivitäten des Peptids oder Äquivalents der Erfindung oder von Somatostatin und ist daher nützlich als Wirkstoff, der sicher ist und eine geringe Toxizität hat, abhängig von den physiologischen Aktivitäten. Z.B. ist er nützlich als Inhibitor der Ausscheidung von Hormonen, wie Wachstumshormon, Hypophysenhormonen (z.B. schilddrüsenstimulierendes Hormon, Prolactin etc.), gastrointestinalen Hormonen (z.B. Gastrin, Insulin etc.) etc. Weiterhin ist er nützlich als therapeutisches oder prophylaktisches Mittel für hormonerzeugende Tumoren, Akromegalie, Gigantismus, Demenz, Diabetes, Magengeschwür und andere Krankheiten oder als Hormonsekretionsinhibitor, Tumorwachstumsinhibitor, Modulator der neuralen Aktivität oder des Schlafs oder dgl.
  • Andererseits hemmt der Rezeptorantagonist alle oder einige der physiologischen Aktivitäten des Peptids oder Äquivalents der Erfindung oder von Somatostatin und ist daher nützlich als sicherer Wirkstoff mit geringer Toxizität, um physiologische Aktivitäten zu hemmen. Z.B. ist er nützlich als Promotor der Sekretion von solchen Hormonen, wie Wachstumshormon, Hypophysenhormonen (z.B. schilddrüsenstimulierendem Hormon, Prolactin etc.), gastrointestinalen Hormonen (z.B. Gastrin, Insulin etc.) oder dgl. Er ist weiterhin nützlich als therapeutisches oder prophylaktisches Mittel für Zwergwuchs, Agalaktie/Hypogalaktie, Diabetes etc. oder als Modulator der Funktionen von mit der Verdauung in Beziehung stehenden Organen (z.B. Funktionsmodulator für solche Organe, wie Magen, Dünndarm, Pankreas, Leber etc.).
  • Die Verbindung, die die Bindung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung an den Rezeptor erhöhen kann, verbessert die physiologischen Aktivitäten des Peptids oder Äquivalents der Erfindung oder von Somatostatin und ist daher nützlich als Wirkstoff der gleichen Art, wie der oben erwähnte Rezeptoragonist.
  • Die Verbindung, die die Bindung des Peptids oder Äquivalents der Erfindung an den Rezeptor vermindern kann, unterdrückt die physiologischen Aktivitäten des Peptids oder Äquivalents der Erfindung oder von Somatostatin und ist daher nützlich als Wirkstoff der gleichen Art, wie der oben erwähnte Rezeptorantagonist.
  • Wenn die Verbindung, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Screeningmethode oder des erfindungsgemäßen Screening-Kits erhalten wurde, als oben erwähntes therapeutisches oder prophylaktisches Mittel verwendet wird, kann sie in üblicher Weise verwendet werden. Z.B. kann sie zu pharmazeutischen Präparaten oder Dosierungsformen verarbeitet werden, z.B. Tabletten, Kapseln, Elixieren, Mikrokapseln, sterilen Losungen oder Suspension n, auf gleiche Art und Weise wie im Fall der oben erwähnten Wirkstoffzusammensetzung, die das Peptid oder Äquivalent der Erfindung enthält und kann an Menschen oder warmblütige Tiere verabreicht werden.
  • Die so erhaltenen Präparate sind sicher und haben eine geringe Toxizität und können daher an Menschen oder warmblütige Tiere verabreicht werden (z.B. Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schafe, Schweine, Vieh, Pferde, Hühner, Katzen, Hunde, Affen. Schimpansen etc.).
  • Die Dosis der Verbindung kann variieren abhängig von der zu behandelnden Krankheit, dem Individuum, dem sie verabreicht wird, dem Verabreichungsweg und anderen Faktoren. Allgemein wird jedoch dann, wenn der Rezeptoragonist oral zur Behandlung von Schlaflosigkeit verabreicht wird, der Rezeptoragonist z.B. in einer täglichen Dosis von etwa 0,1 mg bis 100 mg, bevorzugt etwa 1,0 bis 50 mg, bevorzugter etwa 1,0 bis 20 mg pro erwachsenem Menschen (unter der Annahme des Körpergewichts von 60 kg) verabreicht. Für die nicht orale Verabreichung kann die Einheitsdosis des Rezeptoragonisten auch variieren abhängig von dem Individuum, dem es verabreicht wird, der zu behandelnden Krankheit und anderen Faktoren, im Fall der Verabreichung des Rezeptoragonisten in Form einer Injektion an einen erwachsenen Menschen (der 60 kg wiegt), zur Behandlung von Schlaflosigkeit ist es jedoch z.B. empfehlenswert, dass der Rezeptoragonist durch intravenöse Injektion in einer täglichen Dosis von etwa 0,1 bis 30 mg, bevorzugt etwa 0,1 bis 20 mg, bevorzugter etwa 0,1 bis 10 mg verabreicht wird. Im Fall von anderen Tieren kann eine Dosis, die der oben erwähnten Basisdosis bezogen auf 60 kg entspricht, verabreicht werden.
  • Andererseits kann für die orale Verabreichung des Rezeptorantagonisten zur Behandlung von Zwergwuchs der Rezeptorantagonist allgemein an erwachsene Menschen (die 60 kg wiegen) in einer täglichen Dosis von etwa 0,1 mg bis 100 mg, bevorzugt etwa 1,0 bis 50 mg, bevorzugter etwa 1,0 bis 20 mg verabreicht werden. Im Fall der nicht oralen Verabreichung kann die Einheitsdosis des Rezeptorantagonisten auch variieren abhängig von dem Individuum, an das verabreicht wird, der zu behandelnden Krankheit und anderen Faktoren variieren. Bei der parenteralen Verabreichung in Form einer Injektion an einen durchschnittlichen Erwachsenen (der 60 kg wiegt) zur Behandlung von Zwergwuchs ist es empfehlenswert, dass der Rezeptorantagonist durch intravenöse Injektion in einer täglichen Dosis von etwa 0,01 bis 30 mg, bevorzugt etwa 0,1 bis 20 mg, bevorzugter etwa 0,1 bis 10 mg verabreicht wird. Bei anderen Tieren kann auch eine Dosis, die der oben erwähnten Basisdosis bezogen auf 60 kg entspricht, verabreicht werden.
  • (5) Pharmazeutische Zusammensetzung, die das Oligonucleotidderivat oder ein Salz davon enthält
  • Das Oligonucleotidderivat oder Salz davon kann klassifiziert werden in ein Oligonucleotidderivat oder Salz davon, das an die DNA der Erfindung binden kann und dadurch die Expression der DNA oder des Peptids oder Äquivalents der Erfindung fördert (im Folgenden kurz als Oligonucleotidderivat A bezeichnet) oder ein Oligonucleotid oder Salz davon, das an die DNA der Erfindung binden kann und dadurch die Expression der DNA oder des Peptids oder Äquivalents der Erfindung hemmen kann (Antisense-DNA; im Folgenden kurz als Oligonucleotid B bezeichnet).
  • Wie vorher erwähnt, hat das Peptid oder Äquivalent der Erfindung (i) eine die Wachstumshormonsekretion hemmende Aktivität, (ii) eine hemmende Aktivität für die Sekretion von Hypophysenhormonen, wie schilddrüsenstimulierende Hormone und Prolactin, (iii) eine hemmende Aktivität gegenüber der Sekretion von gastrointestinalen Hormonen, wie Gastrin und Insulin, (iv) eine Neurotransmitteraktivität, (v) eine die Zellproliferation stimulierende Aktivität, (vi) eine hemmende Aktivität gegenüber den Aktivitäten von Acetylcholin, das ein REM-Schlafinduktor ist und (vii) eine die Kontraktion glatter Muskeln hemmende Aktivität u.a.
  • Daher fördert das Oligonucleotidderivat A die Funktionen des Peptids oder Äquivalents der Erfindung, das die obigen Aktivitäten in vivo erzeugt oder die Funktionen der DNA, die dieses codiert, und ist daher z.B. nützlich als Inhibitor der Sekretion bestimmter Hormone, wie Wachstumshormon, Hypophysenhormonen (z.B. schilddrüsenstimulierendem Hormon, Prolactin etc.) und von gastrointestinalen Hormonen (z.B. Gastrin, Insulin etc.). Es kann weiterhin als therapeutisches oder prophylaktisches Mittel für hormonerzeugende Tumoren, Akromegalie, Gigantismus, Demenz, Diabetes, Magengeschwür etc., als Hormonsekretionsinhibitor, Tumorproliferationsinhibitor, Modulator der neuralen Aktivität oder des Schlafs oder ähnlicher Wirkstoff verwendet werden.
  • Andererseits hemmt das Oligonucleotidderivat B (Antisense-DNA) die Funktionen des Peptids oder Äquivalents der Erfindung, das die oben erwähnten Aktivitäten in vivo erzeugt oder die DNA, die dieses codiert und ist daher nützlich z.B. als Promotor der Sekretion von Wachstumshormon, Hypophysenhormonen (z.B. schilddrüsenstimulierendem Hormon, Prolactin etc.), gastrointestinalen Hormonen (z.B. Gastrin, Insulin etc.) usw. Es kann weiterhin als therapeutisches oder prophylaktisches Mittel für Zwergwuchs, Agalaktie/Hypogalaktie, Diabetes oder dgl. oder Funktionsmodulator für mit der Verdauung in Beziehung stehende Organe (z.B. funktioneller Modulator für Magen, Dünndarm, Pankreas, Leber etc.) oder ähnlicher Wirkstoff verwendet werden.
  • Zur Verwendung als oben erwähnter Wirkstoff kann das Oligonucleotidderivat oder Salz davon zu pharmazeutischen Präparaten auf gleiche Art und Weise, wie die oben erwähnte pharmazeutische Zusammensetzung, die die DNA der Erfindung enthält, aufbereitet werden und kann an Menschen oder warmblütige Tiere verabreicht werden. Z.B. kann das Oligonucleotidderivat oder Salz davon an Menschen oder warmblütige Tiere in üblicher Art und Weise entweder so wie es ist oder nach Insertion in einen geeigneten Vektor, z.B. einen Retrovirusvektor, Adenovirusvektor oder Adenovirus-assoziierten Virusvektor verabreicht werden. Das Oligonucleotidderivat oder ein Salz davon können entweder, so wie sie sind, oder in Form von pharmazeutischen Präparaten, die diese zusammen mit einem physiologisch annehmbaren Träger, z.B. mit einem die Aufnahme fördernden Hilfsstoff enthalten, mithilfe einer Gen-Gun oder einem Katheter, z.B. einem Hydrogelkatheter, verabreicht werden.
  • (6) Pharmazeutische Zusammensetzung, die den Antikörper der Erfindung enthält
  • Der Antikörper der Erfindung, der die Aktivitäten des Peptids oder Äquivalents der Erfindung neutralisieren kann, hemmt alle oder einige der physiologischen Aktivitäten des Peptids oder Äquivalents der Erfindung oder von Somatostatin oder Cortistatin und kann daher als Wirkstoff als Promotor der Sekretion von Hormonen, wie Wachstumshormon, Hypophysenhormonen (z.B. schilddrüsenstimulierendes Hormon, Prolactin etc.) und gastrointestinalen Hormonen (z.B. Gastrin, Insulin etc.) und weiterhin als therapeutisches oder prophylaktisches Mittel für Zwergwuchs, Agalaktie/Hypogalaktie, Diabetes usw., als Funktionsmodulator für mit der Verdauung in Beziehung stehende Organe (z.B. als funktioneller Modulator für Magen, Dünndarm, Pankreas, Leber etc.) oder ähnlicher Wirkstoff verwendet werden.
  • Das therapeutische oder prophylaktische Mittel für die oben erwähnten Krankheiten, das den Antikörper der Erfindung enthält, kann oral oder nicht oral an Menschen oder Säugetiere (z.B. Ratten, Kaninchen, Schafe, Schweine, Vieh, Katzen, Hunde, Affen etc.) in Form von Lösungen oder geeigneten Dosierungsformen verabreicht werden. Die Dosis kann variieren abhängig von dem Individuum, an das verabreicht wird, der zu behandelnden Krankheit, den Symptomen oder Bedingungen, dem Verabreichungsweg und anderen Faktoren variieren. Allgemein ist es jedoch empfehlenswert, dass bei Verwendung für die Behandlung oder Verhütung von Zwergwuchs bei Erwachsenen z.B. der Antikörper durch intravenöse Injektion in einer einzelnen Dosis von etwa 0,01 bis 20 mg/kg Körpergewicht, bevorzugt etwa 0,1 bis 10 mg/kg Körpergewicht, noch bevorzugter etwa 0,1 bis 5 mg/kg Körpergewicht etwa ein- bis fünfmal am Tag, bevorzugt etwa ein- bis dreimal am Tag verabreicht wird. In anderen Fallen der nicht oralen Verabreichung und der oralen Verabreichung können entsprechende Dosen verabreicht werden. Insbesondere kann bei schweren Fallen die Dosis erhöht werden je nach dem Schweregrad der Krankheit.
  • Der Antikörper kann entweder so wie er ist oder in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung für die oben erwähnte Verabreichung umfasst den Antikörper oder ein Salz davor. und einen pharmakologisch annehmbaren Träger, ein Verdünnungsmittel oder einen Hilfsstoff Eine solche Zusammensetzung wird als Dosierungsform bereitgestellt, die für orale oder nicht orale Verabreichung geeignet ist.
  • So schließt z.B. die Zusammensetzung für orale Verabreichung feste oder flüssige Dosierungsformen ein, insbesondere Tabletten (einschließlich mit Zucker beschichtete Tabletten und filmbeschichtete Tabletten), Pillen, Körnchen, Pulver, Kapseln (einschließlich Weichkapseln), Sirupe, Emulsionen, Suspensionen etc. Solche Zusammensetzungen werden mit an sich bekannten Techniken hergestellt und enthalten Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoffe, die allgemein auf dem Gebiet der Pharmazie angewendet werden. Z.B. werden Lactose, Stärke, Saccharose, Magnesiumstearat usw. als Träger oder Hilfsstoffe für Tabletten verwendet.
  • Die Zusammensetzung für nicht orale Verabreichung ist z.B. eine Injektion, ein Zäpfchen oder dgl. Die Injektion schließt Dosierungsformen ein, wie Injektionen zur intravenösen, subcutanen, intradermalen oder intramuskulären Verabreichung oder Infusionen u.a. Solche Injektionen werden mit an sich bekannten Techniken hergestellt, z.B. indem der oben erwähnte Antikörper oder ein Salz davon in einer sterilen wässrigen oder ölhaltigen Flüssigkeit, die allgemein für Injektionen verwendet wird, gelöst, suspendiert oder emulgiert wird. Verwendbar als wässriges Medium für Injektionen sind z.B. physiologische Kochsalzlösung und isotonische Lösungen, die Glucose und andere Hilfsstoffe enthalten. Geeignete Mittel zur Förderung der Auflösung, wie Alkohole (z.B. Ethanol), mehrwertige Alkohole (z.B. Propylenglycol, Polyethylenglycol), nichtionische Tenside (z.B. Polysorbat 80, HCO-50 (Polyoxyethylen (50 Mol) Addukt von hydriertem Rizinusöl)] etc. können kombiniert verwendet werden. Geeignet als ölhaltiges Medium sind z.B. Sesamöl, Sojaöl und dgl. und Benzylbenzoat, Benzylalkohol oder dgl. können kombiniert als die Auflösung förderndes Mittel verwendet werden. Die hergestellten Injektionen werden im Allgemeinen in geeignete Ampullen abgefüllt. Das Zäpfchen für die rektale Verabreichung wird hergestellt, indem der oben erwähnte Antikörper oder ein Salz davon mit einem üblichen Zäpfchengrundstoff vermischt wird.
  • Die oben erwähnte pharmazeutische Zusammensetzung für die orale oder nicht orale Verabreichung wird in geeigneter Weise in Form von Einheitsdosierungsformen hergestellt, die für die Verabreichung des aktiven Inhaltsstoffs geeignet sind. Als Beispiele für solche Einheitsdosierungsformen können Tabletten, Pillen, Kapseln, Injektionen (Ampullen) und Zäpfchen erwähnt werden. Allgemein enthält jede Einheitsdosierungsform bevorzugt 5 bis 500 mg, insbesondere 5 bis 10 mg im Fall von Injektionen und 10 bis 250 mg im Fall von anderen Dosierungsformen, des oben erwähnten Antikörpers.
  • Jede oben erwähnte Zusammensetzung kann weitere oder andere aktive Inhaltsstoffe enthalten, wenn diese nicht unerwünschte Wechselwirkungen zeigen, wenn sie mit dem oben erwähnten Antikörper formuliert werden.
  • (7) Herstellung von nichtmenschlichen Tieren, die die DNA der Erfindung enthalten
  • Nichthumane transgene Tiere, die das Peptid oder Äquivalent der Erfindung exprimieren können, können erzeugt werden unter Verwendung der DNA der Erfindung. Als nichtmenschliche Tiere können Säugetiere (z.B. Ratte, Maus, Kaninchen, Schaf, Schwein, Vieh, Katze, Hund, Affe etc.) und andere (im Folgenden kurz als Tiere bezeichnet) verwendet werden. Insbesondere sind Mäuse, Ratten, Kaninchen und dgl. bevorzugt.
  • Um die DNA der Erfindung in das Zieltier zu überführen, ist es im Allgemeinen vorteilhaft, die DNA als ein Genkonstrukt zu verwenden, das erhalten wurde, indem diese stromabwärts eines Promotors, der die Expression der DNA in den Tierzellen bewirken kann, eingefügt wird. Im Fall des Transfers einer von einem Kaninchen abgeleiteten DNA der Erfindung wird ein Genkonstrukt, das entsteht, indem diese DNA stromabwärts eines Promotors, der aus verschiedenen von Tieren abgeleiteten Promotoren ausgewählt sein kann, mit hoher Homologie, der die Expression der DNA der Erfindung in Tierzellen verursachen kann, eingeführt wird, z.B. in befruchtete Kanincheneier durch Mikroinjektion, wodurch transgene Tiere, die die DNA tragen und das Peptid oder Äquivalent der Erfindung in hohem Ausmaß produzieren, erzeugt werden können. Ubiquitäre Expressionspromotoren, wie von Virus stammende Promotoren und Metallothioneinpromotoren können z.B. auch als Promotor verwendet werden.
  • Der Transfer der DNA der Erfindung im Zustand von befruchteten Eizellen wird auf eine solche Art und Weise sichergestellt, dass die DNA in allen Embryozellen und somatischen Zellen des Zieltiers vorhanden ist. Das Auftreten des Peptids oder Äquivalents der Erfindung in Embryozellen des nach DNA-Transfer erzeugten Tiers bedeutet, dass alle Nachkommen des Tiers, die erzeugt werden, das Peptid oder Äquivalent der Erfindung in allen Embryozellen und somatischen Zellen davon haben. Nachkommen dieser Art von Tieren, die das Gen geerbt haben, haben das Peptid oder Äquivalent der Erfindung in allen Embryozellen und somatischen Zellen.
  • Die transgenen Tiere, die die DNA der Erfindung tragen, können nach Bestätigung, dass das Gen nach der Paarbildung stabil erhalten geblieben ist, als Tiere gezüchtet werden, die die DNA tragen durch Passage unter üblichen Züchtungsbedingungen. Weiterhin können homozygote Tiere, bei denen das eingeführte Gen in beiden homologen Chromosomen vorhanden ist, erhalten werden, indem männliche und weibliche Tiere gepaart werden, die jeweils die gewünschte DNA tragen und indem diese männlichen und weiblichen homozygoten Tiere gepaart werden, ist es möglich, die Vermehrung zu bewirken durch Passage in einer Art und Weise, dass alle Nachkommen die DNA tragen können.
  • Die Tiere, in die die DNA der Erfindung transferiert wurde, die eine starke Expression des Peptids oder Äquivalents der Erfindung zeigen, sind nützlich als Tiere zum Screenen für therapeutische oder prophylaktische Mittel für Krankheiten, die z.B. durch eine übermäßige Expression des Peptids oder Äquivalents der Erfindung verursacht werden.
  • Die transgenen Tiere, die die DNA der Erfindung tragen, können auch als Quelle für Zellen oder Zellgewebe verwendet werden. Z.B. können Analysen, die das Peptid oder Äquivalent der Erfindung betreffen, direkt durchgeführt werden, indem die DNA oder RNA in Geweben der transgenen Tiere (z.B. Mäuse), die die DNA der Erfindung tragen, analysiert wird oder indem analysiert wird, in welchen Geweben das Peptid der Erfindung, das durch das Gen exprimiert wird, vorhanden ist. Indem Zellen eines Gewebes, das das Peptid oder Äquivalent der Erfindung enthält, mit Standardgewebekulturtechniken gezüchtet werden, ist es möglich, die Funktionen von Zellen, die von Geweben abstammen, die im Allgemeinen schwierig zu züchten sind, zu untersuchen, z.B. solche, die aus Gehirn oder peripheren Geweben stammen. Unter Verwendung solcher Zellen ist es auch möglich, Wirkstoff, auszuwählen, die die Funktionen verschiedener Gewebe verstärken können.
  • Weiterhin ist es möglich, das Peptid oder Äquivalent der Erfindung zu isolieren und zu reinigen, wenn es eine Zelllinie mit hoher Expression ist.
  • In der vorliegenden Beschreibung und den Zeichnungen sind die Nucleotide und Aminosäuren, wenn sie durch Abkürzungen angegeben sind, mit den Abkürzungen gemäß IUPAC-IUB Commission an Biochemical Nomenclature oder mit Abkürzungen, die allgemein auf dem relevanten Gebiet verwendet werden, angegeben. Beispiele sind unten gezeigt. Wenn optische Isomere möglich sind im Hinblick auf Aminosäuren, ist die L-Form gemeint, wenn nicht anders angegeben.
    • DNA:
    Desoxyribonucleinsäure
    cDNA:
    komplementäre Desoxyribonucleinsäure
    A:
    Adenin
    T:
    Thymin
    G:
    Guanin
    C:
    Cytosin
    RNA:
    Ribonucleinsäure
    mRNA:
    Messenger-Ribonucleinsäure
    dATP:
    Desoxyadenosintriphosphat
    dTTP:
    Desoxythymidintriphosphat
    dGTP:
    Desoxyguanosintriphosphat
    dCTP:
    Desoxycytidintriphosphat
    dNTPs:
    Mischung von dATP, dTTP, dGTP und dCTP
    ATP:
    Adenosintriphosphat
    EDTA:
    Ethylendiamintetraessigsäure
    SDS:
    Natriumdodecylsulfat
    EIA:
    Enzymimmunoassay
    Gly:
    Glycin
    Ala:
    Alanin
    Val:
    Valin
    Leu:
    Leucin
    Ile:
    Isoleucin
    Ser:
    Serin
    Thr:
    Threonin
    Cys:
    Cystein
    Met:
    Methionin
    Glu:
    Glutaminsäure
    Asp:
    Asparaginsäure
    Lys:
    Lysin
    Arg:
    Arginin
    His:
    Histidin
    Phe:
    Phenylalanin
    Tyr:
    Tyrosin
    Trp:
    Tryptophan
    Pro:
    Prolin
    Asn:
    Asparagin
    Gin:
    Glutamin
    pGlu:
    Pyroglutaminsäure
  • Die Substituenten, Schutzgruppen und Reagenzien, die häufig in der vorliegenden Beschreibung auftauchen, sind unten in Form von Abkürzungen gezeigt.
    • Me:
    Methylgruppe
    Et:
    Ethylgruppe
    Bu:
    Butylgruppe
    Ph:
    Phenylgruppe
    TC:
    Thiazolidin-4(R)-carboxamidgruppe
    BHA:
    Benzhydrylamin
    pMBHA:
    p-Methylbenzhydrylamin
    Tos:
    p-Toluolsulfonyl
    CHO:
    Formyl
    cHex:
    Cyclohexyl
    OcHex:
    Cyclohexylester
    Bzl:
    Benzyl
    Born:
    Benzyloxymethyl
    Z:
    Benzyloxycarbonyl
    Br-Z:
    2-Brombenzyloxycarbonyl
    Boc:
    t-Butyloxycarbonyl
    DNP:
    Dinitrophenyl
    Trt:
    Trityl
    Bum:
    t-Butoxymethyl
    DCM:
    Dichlormethan
    Fmoc:
    N-9-Fluorenylmethoxycarbonyl
    HOBt:
    1-Hydroxybenzotriazol
    HOOBt:
    3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazol
    DCC:
    N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
    TFA:
    Trifluoressigsäure
    DIEA:
    Diisopropylethylamin
    PAM:
    Phenylacetamidomethyl
    MeBzl:
    4-Methylbenzyl
    Cl-Z:
    2-Chlorbenzyloxycarbonyl
    DCC:
    N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
    DMF:
    N,N-Dimethylformamid
    NMP:
    N-Methyl-2-pyrrolidon
    EDTA:
    Ethylendiamintetraessigsäure
    SDS:
    Natriumdodecylsulfat
  • In der vorliegenden Beschreibung beziehen sich die sequenzidentifizierenden Zahlen in dem Sequenzprotokoll jeweils auf die folgenden.
  • [SEQ ID Nr. 1]
  • Die Aminosäuresequenz eines reifen Peptids der Erfindung (von Rest 89 bis Rest 105 der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz; hCS-17).
  • [SEQ ID Nr. 2]
  • Die Aminosäuresequenz eines Peptids, das aus dem reifen Peptid, wie in SEQ ID Nr. 1 definiert, stammt durch Deletion von zwei Aminosäuren (Asp-Arg) am N-Ende davon (von Rest 91 bis Rest 105 der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz; hCS-15).
  • [SEQ ID Nr. 3]
  • Die Aminosäuresequenz eines Peptids, das von dem reifen Peptid abgeleitet ist, das unter in SEQ ID Nr. 1 definiert ist, durch Deletion von vier Aminosäuren (Asp-Arg-Met-Pro) am N-Ende davon (von Rest 93 bis Rest 105 der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz; hCS-13).
  • [SEQ ID Nr. 4]
  • Die Aminosäuresequenz eines Vorläufers der Erfindung (von Rest 77 bis Rest 105 der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz; hCS-29).
  • [SEQ ID Nr. 5]
  • Die Aminosäuresequenz eines Vorläufers der Erfindung (von Rest 44 bis Rest 105 der in 2. gezeigten Aminosäuresequenz; hCS-62).
  • [SEQ ID Nr. 6]
  • Die Aminosäuresequenz eines Vorläufers der Erfindung (von Rest 21 bis Rest 105 der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz; hCS-85).
  • [SEQ ID Nr. 7]
  • Die Aminosäuresequenz, eines Vorläufers der Erfindung (von Rest 1 bis Rest 105 der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz; hCS-105).
  • [SEQ ID Nr. 8]
  • Die Aminosäuresequenz eines Fragmentpeptids (von Rest 77 bis Rest 88 der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz).
  • [SEQ ID Nr. 9]
  • Die Aminosäuresequenz eines Fragmentpeptids (von Rest 44 bis Rest 76 der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz).
  • [SEQ ID Nr. 10]
  • Die Aminosäuresequenz eines Fragmentpeptids (von Rest 21 bis Rest 43 der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz).
  • [SEQ ID Nr. 11]
  • Die Aminosäuresequenz eines Fragmentpeptids (von Rest 1 bis Rest 20 der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz).
  • [SEQ ID Nr. 12]
  • Die Aminosäuresequenz eines Fragmentpeptids (von Rest 1 bis Rest 88 der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz).
  • [SEQ ID Nr. 13]
  • Eine Nucleotidsequenz, die die in SEQ ID Nr. 1 definierte Aminosäuresequenz codiert (von Nucleotid 268 bis Nucleotid 318 in der in 2 gezeigten Nucleotidsequenz).
  • [SEQ ID Nr. 14]
  • Eine Nucleotidsequenz, die die in SEQ ID Nr. 2 definierte Aminosäuresequenz codiert (von Nucleotid 274 bis Nucleotid 318 in der in 2 gezeigten Nucleotidsequenz).
  • [SEQ ID Nr. 15]
  • Eine Nucleotidsequenz, die die in SEQ ID Nr. 3 definierte Aminosäuresequenz codiert (von Nucleotid 280 bis Nucleotid 318 der in 2 gezeigten Nucleotidsequenz).
  • [SEQ ID Nr. 16]
  • Eine Nucleotidsequenz, die die in SEQ ID Nr. 4 definierte Aminosäuresequenz codiert (von Nucleotid 232 bis Nucleotid 318 in der in 2 gezeigten Nucleotidsequenz).
  • [SEQ ID Nr. 17]
  • Eine Nucleotidsequenz, die die in SEQ ID Nr. 4 definierte Aminosäuresequenz codiert (von Nucleotid 229 bis Nucleotid 315 in der in 3 gezeigten Nucleotidsequenz).
  • [SEQ ID Nr. 18]
  • Eine Nucleotidsequenz, die die in SEQ ID Nr. 5 definierte Aminosäuresequenz codiert (von Nucleotid 133 bis Nucleotid 318 in der in 2 gezeigten Nucleotidsequenz).
  • [SEQ ID Nr. 19]
  • Eine Nucleotidsequenz, die die in SEQ ID Nr. 5 definierte Aminosäuresequenz codiert (von Nucleotid 130 bis Nucleotid 315 in der in 3 gezeigten Nucleotidsequenz).
  • [SEQ ID Nr. 20]
  • Eine Nucleotidsequenz, die die in SEQ ID Nr. 6 definierte Aminosäuresequenz codiert (von Nucleotid 64 bis Nucleotid 318 in der in 2 gezeigten Nucleotidsequenz).
  • [SEQ ID Nr. 21]
  • Eine Nucleotidsequenz, die die in SEQ ID Nr. 6 definierte Aminosäuresequenz codiert (von Nucleotid 61 bis Nucleotid 315 in der in 3 gezeigten Nucleotidsequenz).
  • [SEQ ID Nr. 22]
  • Eine Nucleotidsequenz, die die in SEQ ID Nr. 7 definierte Aminosäuresequenz codiert (von Nucleotid 4 bis Nucleotid 318 in der in 2 gezeigten Nucleotidsequenz).
  • [SEQ ID Nr. 23]
  • Eine Nucleotidsequenz, die die in SEQ ID Nr. 7 definierte Aminosäuresequenz codiert (von Nucleotid 1 bis Nucleotid 315 in der in 3 gezeigten Nucleotidsequenz).
  • [SEQ ID Nr. 24]
  • Eine Nucleotidsequenz, die die in SEQ ID Nr. 8 definierte Aminosäuresequenz codiert (von Nucleotid 232 bis Nucleotid 267 in der in 2 gezeigten Nucleotidsequenz).
  • [SEQ ID Nr. 25]
  • Eine Nucleotidsequenz, die die in SEQ ID Nr. 8 definierte Aminosäuresequenz codiert (von Nucleotid 229 bis Nucleotid 264 in der in 3 gezeigten Nucleotidsequenz).
  • [SEQ ID Nr. 26]
  • Eine Nucleotidsequenz, die die in SEQ ID Nr. 9 definierte Aminosäuresequenz codiert (von Nucleotid 133 bis Nucleotid 231 in der in 2 gezeigten Nucleotidsequenz).
  • [SEQ ID Nr. 27]
  • Eine Nucleotidsequenz, die die in SEQ ID Nr. 10 definierte Aminosäuresequenz codiert (von Nucleotid 64 bis Nucleotid 132 in der in 2 gezeigten Nucleotidsequenz).
  • [SEQ ID Nr. 28]
  • Eine Nucleotidsequenz, die die in SEQ ID Nr. 11 definierte Aminosäuresequenz codiert (von Nucleotid 4 bis Nucleotid 63 in der in 2 gezeigten Nucleotidsequenz).
  • [SEQ ID Nr. 29]
  • Eine Nucleotidsequenz, die die in SEQ ID Nr. 12 definierte Aminosäuresequenz codiert (von Nucleotid 4 bis Nucleotid 267 in der in 2 gezeigten Nucleotidsequenz).
  • [SEQ ID Nr. 30]
  • Eine Nucleotidsequenz, die die in SEQ ID Nr. 12 definierte Aminosäuresequenz codiert (von Nucleotid 1 bis Nucleotid 264 in der in 3 gezeigten Nucleotidsequenz).
  • [SEQ ID Nr. 31]
  • Die Aminosäuresequenz des bekannten aus der Ratte stammenden Cortistatins.
  • [SEQ ID Nr. 32]
  • Die Aminosäuresequenz des bekannten aus der Ratte stammenden Somatostatins.
  • [SEQ ID Nr. 33]
  • Eine Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz des bekannten von der Ratte stammenden Cortistatins codiert, wie in SEQ ID Nr. 31 definiert.
  • [SEQ ID Nr. 34]
  • Eine Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz des bekannten von der Ratte stammenden Somatostatins codiert, wie in SEQ ID Nr. 32 definiert.
  • [SEQ ID Nr. 35]
  • Die Aminosäuresequenz (16 Aminosäurereste) eines Peptids vom Deletionstyp.
  • [SEQ ID Nr. 36]
  • Die Aminosäuresequenz (14 Aminosäurereste) eines Peptids vom Deletionstyp.
  • [SEQ ID Nr. 37]
  • Die Aminosäuresequenz (12 Aminosäurereste) eines Peptids vom Deletionstyp.
  • [SEQ ID Nr. 35]
  • Die Aminosäuresequenz eines Peptids, das aus dem Peptid mit der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz durch Deletion einer Aminosäure (Lys) aus dem C-Ende davon abgeleitet ist (des Lys17 hCS-17).
  • [SEQ ID Nr. 36]
  • Die Aminosäuresequenz eines Peptids, das von dem Peptid mit der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von zwei Aminosäuren (Asp-Arg) am N-Ende davon und einer Aminosäure (Lys) am C-Ende davon (des Lys15 hCS-15).
  • [SEQ ID Nr. 37]
  • Die Aminosäuresequenz eines Peptids, das von dem Peptid mit der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von vier Aminosäuren (Asp-Arg-Met-Pro) am N-Ende davon und einer Aminosäure (Lys) am C-Ende davon (des Lys13 hCS-13).
  • [SEQ ID Nr. 38]
  • Die Aminosäuresequenz eines Peptids, das von dem Peptid mit der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Substitution von Lys für den 6. Rest Arg ([Lys6]hCS-17).
  • [SEQ ID Nr. 39]
  • Die Aminosäuresequenz eines Peptids, das von dem Peptid mit der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von zwei Aminosäuren (Asp-Arg) am N-Ende davon und durch Ersatz von Lys für den 4. Rest Arg ([Lys4]hCS-15).
  • [SEQ ID Nr. 40]
  • Die Aminosäuresequenz eines Peptids, das von dem Peptid mit der in SEQ ID Nr. 1. definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von vier Aminosäuren (Asp-Arg-Met-Pro) am N-Ende davon und durch Ersatz von Lys für den 2. Rest Arg ([Lys2]hCS-13).
  • [SEQ ID Nr. 41]
  • Die Aminosäuresequenz eines Peptids, das von dem Peptid mit der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion einer Aminosäure (Lys) am C-Ende davon und durch Ersatz von Lys für den 6. Rest Arg (des Lys17[Lys6]hCS-17).
  • [SEQ ID Nr. 42]
  • Die Aminosäuresequenz eines Peptids, das von dem Peptid mit der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von zwei Aminosäuren (Asp-Arg) am N-Ende davon und einer Aminosäure (Lys) am C-Ende davon und durch Ersatz von Lys für den 4. Rest Arg (des Lys15[Lys4]hCS-15).
  • [SEQ ID Nr. 43]
  • Die Aminosäuresequenz eines Peptids, das von dem Peptid mit der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von vier Aminosäuren (Asp-Arg-Met-Pro) am N-Ende davon und einer Aminosäure (Lys) am C-Ende davon und Substitution bzw. Ersatz von Lys für den 2. Rest Arg (des Lys13[Lys2]hCS-13).
  • [SEQ ID Nr. 44]
  • Die Aminosäuresequenz eines Peptids, das von dem Peptid mit der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Ersatz von Thr für den 14. Rest Ser ([Thr14]hCS-17).
  • [SEQ ID Nr. 45]
  • Die Aminosäuresequenz eines Peptids, das von dem Peptid mit der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von zwei Aminosäuren (Asp-Arg) am N-Ende davon und Ersatz von Thr für den 12. Rest Ser ([Thr12]hCS-15).
  • [SEQ ID Nr. 46]
  • Die Aminosäuresequenz eines Peptids, das von dem Peptid mit der in SEQ ID Nr. 1 definierten. Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von vier Aminosäuren (Asp-Arg-Met-Pro) am N-Ende davon und Ersatz von Thr für den 10. Rest Ser ([Thr10]hCS-13).
  • [SEQ ID Nr. 47]
  • Die Aminosäuresequenz eines Peptids, das von dem Peptid mit der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion einer Aminosäure (Lys) am C-Ende davon und Ersatz von Thr für den 14. Rest Ser (des Lys17[Thr14]hCS-17).
  • [SEQ ID Nr. 48]
  • Die Aminosäuresequenz eines Peptids, das von dem Peptid mit der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von zwei Aminosäuren (Asp-Arg) am N-Ende davon und einer Aminosäure (Lys) am C-Ende davon und Ersatz von Thr für den 12. Rest Ser (des Lys15[Thr12]hCS-15).
  • [SEQ ID Nr. 49]
  • Die Aminosäuresequenz eines Peptids, das von dem Peptid mit der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von vier Aminosäuren (Asp-Arg-Met-Pro) am N-Ende davon und einer Aminosäure (Lys) am C-Ende davon und Ersatz von Thr für den 10. Rest Ser (des Lys13[Thr10]hCS-13).
  • [SEQ ID Nr. 50]
  • Die Aminosäuresequenz eines Peptids, das von dem Peptid mit der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Ersatz von Lys für den 6. Rest Arg und durch Ersatz von Thr für den 14. Rest Ser ([Lys6,Thr14]hCS-17).
  • [SEQ ID Nr. 51]
  • Die Aminosäuresequenz eines Peptids, das von dem Peptid mit der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von zwei Aminosäuren (Asp-Arg) am N-Ende davon und Ersatz von Lys für den 4. Rest Arg und Ersatz von Thr für den 12. Rest Ser ([Lys4,Thr12]hCS-15).
  • [SEQ ID Nr. 52]
  • Die Aminosäuresequenz eines Peptids, das von dem Peptid mit der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von vier Aminosäuren (Asp-Arg-Met-Pro) am N-Ende davon und Ersatz von Lys für den 2. Rest Arg und Ersatz von Thr für den 10. Rest Ser ([Lys2,Thr10]hCS-13).
  • [SEQ ID Nr. 53]
  • Die Aminosäuresequenz eines Peptids, das von dem Peptid mit der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion einer Aminosäure (Lys) am C-Ende davon und Ersatz von Lys für den 6. Rest Arg und Ersatz von Thr für den 14. Rest Ser (des Lys17[Lys6,Thr14]hCS-17).
  • [SEQ ID Nr. 54]
  • Die Aminosäuresequenz eines Peptids, das von dem Peptid mit der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von zwei Aminosäuren (Asp-Arg) am N-Ende davon und einer Aminosäure (Lys) am C-Ende davon und Ersatz von Lys für den 4. Rest Arg und Ersatz von Thr für den 12. Rest Ser (des Lys15[Lys4,Thr12]hCS-15).
  • [SEQ ID Nr. 55]
  • Die Aminosäuresequenz eines Peptids, das von dem Peptid mit der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Deletion von vier Aminosäuren (Asp-Arg-Met-Pro) am N-Ende davon und einer Aminosäure (Lys) am C-Ende davon und Ersatz von Lys für den 2. Rest Arg und Ersatz von Thr für den 10. Rest Ser (des Lys13[Lys2,Thr10]hCS-13).
  • [SEQ ID Nr. 56]
  • Die Aminosäuresequenz eines Vorläuferpeptids, das von einem Vorläuferpeptid mit der in SEQ ID Nr. 4 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Ersatz von Lys für den 18. Rest Arg ([Lys18]hCS-29).
  • [SEQ ID Nr. 57]
  • Die Aminosäuresequenz eines Vorläuferpeptids, das von einem Vorläuferpeptid mit der in SEQ ID Nr. 4 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Ersatz von Thr für den 26. Rest Ser ([Thr26]hCS-29).
  • [SEQ ID Nr. 58]
  • Die Aminosäuresequenz eines Vorläuferpeptids, das von einem Vorläuferpeptid mit der in SEQ ID Nr. 4 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Ersatz von Lys für den 18. Rest Arg und Ersatz von Thr für den 26. Rest Ser ([Lys18,Thr26]hCS-29).
  • [SEQ ID Nr. 59]
  • Die Aminosäuresequenz eines Vorläuferpeptids, das von einem Vorläuferpeptid mit der in SEQ ID Nr. 4 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Ersatz von Lys für den 18. Rest Arg und Deletion des 29. Restes Lys (des Lys29[Lys18]hCS-29).
  • [SEQ ID Nr. 60]
  • Die Aminosäuresequenz eines Vorläuferpeptids, das von einem Vorläuferpeptid mit der in SEQ ID Nr. 4 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Ersatz von Thr für den 26. Rest Ser und Deletion des 29. Restes Lys (des Lys29[Thr26]hCS-29).
  • [SEQ ID Nr. 61]
  • Die Aminosäuresequenz eines Vorläuferpeptids, das von einem Vorläuferpeptid mit der in SEQ ID Nr. 4 definierten Aminosäuresequenz abgeleitet ist durch Ersatz von Lys für den 18. Rest Arg und Thr für den 26. Rest Ser (des Lys29[Lys18,Thr26]hCS-29).
  • [SEQ ID Nr. 62]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Mutein vom Deletionstyp mit der in SEQ ID Nr. 35 definierten Aminosäureseguenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 63]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Mutein vom Deletionstyp mit der in SEQ ID Nr. 36 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 64]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Mutein vom Deletionstyp mit der in SEQ ID Nr. 37 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 65]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Mutein vom Deletionstyp mit der in SEQ ID Nr. 38 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 66]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Mutein vom Deletionstyp mit der in SEQ ID Nr. 39 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 67]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Mutein vom Deletionstyp mit der in SEQ ID Nr. 40 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 68]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Mutein vom Deletionstyp mit der in SEQ ID Nr. 41 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 69]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Mutein vom Deletionstyp mit der in SEQ ID Nr. 42 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 70]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Mutein vom Deletionstyp mit der in SEQ ID Nr. 43 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 71]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Mutein vom Deletionstyp mit der in SEQ ID Nr. 44 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 72]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Mutein vom Deletionstyp mit der in SEQ ID Nr. 45 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 73]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Mutein vom Deletionstyp mit der in SEQ ID Nr. 46 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 74]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Mutein vom Deletionstyp mit der in SEQ ID Nr. 47 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 75]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Mutein vom Deletionstyp mit der in SEQ ID Nr. 48 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 76]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Mutein vom Deletionstyp mit der in SEQ ID Nr. 49 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 77]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Mutein vom Deletionstyp mit der in SEQ ID Nr. 50 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 78]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Mutein vom Deletionstyp mit der in SEQ ID Nr. 51 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 79]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Mutein vom Deletionstyp mit der in SEQ ID Nr. 52 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 80]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Mutein vom Deletionstyp mit der in SEQ ID Nr. 53 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 81]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Mutein vom Deletionstyp mit der in SEQ ID Nr. 54 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 82]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Mutein vom Deletionstyp mit der in SEQ ID Nr. 55 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 83]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Vorläuferpeptid mit der in SEQ ID Nr. 56 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 84]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Vorläuferpeptid mit der in SEQ ID Nr. 56 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 85]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Vorläuferpeptid mit der in SEQ ID Nr. 57 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 86]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Vorläuferpeptid mit der in SEQ ID Nr. 57 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 87]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Vorläuferpeptid mit der in SEQ ID Nr. 58 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 88]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Vorläuferpeptid mit der in SEQ ID Nr. 58 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 89]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Vorläuferpeptid mit der in SEQ ID Nr. 59 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 90]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Vorläuferpeptid mit der in SEQ ID Nr. 59 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 91]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Vorläuferpeptid mit der in SEQ ID Nr. 60 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 92]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Vorläuferpeptid mit der in SEQ ID Nr. 60 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 93]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Vorläuferpeptid mit der in SEQ ID Nr. 61 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 94]
  • Die Nucleotidsequenz einer DNA, die das Vorläuferpeptid mit der in SEQ ID Nr. 61 definierten Aminosäuresequenz codiert.
  • [SEQ ID Nr. 95]
  • Die Nucleotidsequenz eines Primers, der für die Klonierung einer cDNA verwendet wird, die menschliches Somatostatinrezeptorprotein-Subtyp 1 (SSTR1) codiert.
  • [SEQ ID Nr. 96]
  • Die Nucleotidsequenz eines Primers, der zur Klonierung einer cDNA verwendet wird, die menschliches Somatostatinrezeptorprotein-Subtyp 1 (SSTR1) codiert.
  • [SEQ ID Nr. 97]
  • Die Nucleotidsequenz eines Primers, der zur Klonierung einer cDNA verwendet wird, die menschliches Somatostatinrezeptorprotein-Subtyp 2 (SSTR2) codiert.
  • [SEQ ID Nr. 98]
  • Die Nucleotidsequenz eines Primers, der zur Klonierung einer cDNA verwendet wird, die menschliches Somatostatinrezeptorprotein-Subtyp 2 (SSTR2) codiert.
  • [SEQ ID Nr. 99]
  • Die Nucleotidsequenz eines Primers, der zur Klonierung einer cDNA verwendet wird, die menschliches Somatostatinrezeptorprotein-Subtyp 3 (SSTR3) codiert.
  • [SEQ ID Nr. 100]
  • Die Nucleotidsequenz eines Primers, der zur Klonierung einer cDNA verwendet wird, die menschliches Somatostatinrezeptorprotein-Subtyp 3 (SSTR3) codiert.
  • [SEQ ID Nr. 101]
  • Die Nucleotidsequenz eines Primers, der zur Klonierung einer cDNA verwendet wird, die menschliches Somatostatinrezeptorprotein-Subtyp 4 (SSTR4) codiert.
  • [SEQ ID Nr. 102]
  • Die Nucleotidsequenz eines Primers, der zur Klonierung einer cDNA verwendet wird, die menschliches Somatostatinrezeptorprotein-Subtyp 4 (SSTR4) codiert.
  • [SEQ ID Nr. 103]
  • Die Nucleotidsequenz eines Primers, der zur Klonierung einer cDNA verwendet wird, die menschliches Somatostatinrezeptorprotein-Subtyp 5 (SSTR5) codiert.
  • [SEQ ID Nr. 104]
  • Die Nucleotidsequenz eines Primers, der zur Klonierung einer cDNA verwendet wird, die menschliches Somatostatinrezeptorprotein-Subtyp 5 (SSTR5) codiert.
  • [SEQ ID Nr. 105]
  • Die Nucleotidsequenz eines Primers, der zur Klonierung einer DNA verwendet wird, die das Peptid der Erfindung codiert.
  • [SEQ ID Nr. 106]
  • Die Nucleotidsequenz eines Primers, der zur Klonierung einer DNA verwendet wird, die das Peptid der Erfindung codiert.
  • Der Transformant Escherichia coli JM109/phCSP6, der in Beispiel 2, das später erwähnt wird, erhalten wurde, wurde bei dem Ministry of International Trade and Industry National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH) am 6. Juni 1996 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5564 und beim Institute for Fermentation, Osaka (IFO) am 5. Juni 1996 mit der Hinterlegungsnummer IFO 15967 hinterlegt.
  • Die folgenden Referenzbeispiele und Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung im Detail. Sie sind jedoch in keiner Weise für den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung beschränkend. Die Genmanipulationsverfahren, die in Molecular Cloning beschrieben werden, wurden befolgt bei der genetischen Manipulation von Escherichia coli.
  • Referenzbeispiel 1
  • Herstellung von Zellen zur Expression von menschlichem Somatostatinrezeptorprotein-Subtyp 1 (SSTR1)
  • (1) Klonierung von DNA für menschliches Somatostatinrezeptorprotein-Subtyp 1 (SSTR1)
  • Die DNA-Oligomere S1-1 und S1-2 wurden synthetisiert basierend auf der Nucleotidsequenz von menschlicher SSTR1-cDNA, wie berichtet (Yamada et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 89, Seiten 251-255, 1992). Die Sequenz von S1-1 war 5'-GGTCGACCTCAGCTAGGATGTTCCCCAATG-3' (SEQ ID Nr. 95) und die von S1-2 war 5'-GGTCGACCCGGGCTCAGAGCGTCGTGAT-3' (SEQ ID Nr. 96).
  • Menschliche chromosomale DNA (Clontech, Katalog Nr. CL6550-1) wurde als Matrize verwendet. Die DNA-Oligomere, die oben erwähnt wurden (jeweils 25 pmol) wurden zu 0,5 ng der DNA zugefügt und die Polymerase-Kettenreaktion wurde durchgeführt unter Verwendung von 2,5 Einheiten Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene). Die Zusammensetzung der Reaktionsmischung war, wie im Handbuch angegeben, das der Pfu-DNA-Polymerase beigefügt war.
  • Die Reaktion wurde in 35 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus umfasst: 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 63°C und 2 Minuten bei 75°C. Mit 1% Agarosegelelektrophorese der Reaktionsmischung wurde die spezifische Amplifikation eines DNA-Fragments mit der gewünschten Größe (etwa 1,2 kb) bestätigt. Dieses DNA-Fragment wurde von dem Agarosegel in üblicher Weise gewonnen und mit pUC118 verbunden, der an der HincII-Stelle geschnitten worden war und anschließend in kompetente Zelle eingeführt, nämlich Escherichia coli JM109. Ein Transformant, der ein Plasmid beherbergte, das das DNA-Fragment enthielt, wurde ausgewählt und die Nucleotidsequenz des insertierten DNA-Fragments wurde bestätigt mit einem Nucleotidsequenzanalyse-ALF-DNA-Sequenzautomaten (Pharmacia) unter Verwendung eines fluoreszierenden Farbstoffs, wonach die von der Nucleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz vollständig mit der Sequenz übereinstimmte, die in dem oben zitierten Yamada-et-al.-Bericht beschrieben war.
  • (2) Konstruktion eines Expressionsplasmids mit Humansomatostatinrezeptorprotein-Subtyp-1-(SSTR1)-DNA
  • pAKKO-111 wurde als Expressionsvektor für die Expression in CHO-Zellen verwendet. pAKKO-111 wurde auf folgende Art und Weise konstruiert. Ein 1,4-kb-DNA-Fragment, das den SR-α-Promotor und das Poly(A)-Additionssignal enthielt, wurde aus pTB 1417 erhalten, der in Japanese Kokai Tokkyo Koho H05-076385 beschrieben wurde, durch Behandlung mit HindIII und ClaI. Getrennt davon wurde ein 4,5-kb-DNA-Fragment, das das Dihydrofolatreduktase-(DHFR)-Gen enthielt, erhalten aus pTB348 [K. Naruo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 128, 256-264 (1985)] durch Behandlung mit ClaI und SalI. Bei diesen DNA-Fragmenten wurden durch Behandlung mit T4-Polymerase glatte Enden erzeugt und diese dann unter Verwendung von T4-Ligase miteinander verbunden, wodurch das pAKKO-111-Plasmid erzeugt wurde.
  • Dann wurden 5 μg des Plasmids, das wie oben beschrieben in (1) erhalten worden war und das menschliche SSTR1-DNA-Fragment enthielt, mit dem Restriktionsenzym SalI verdaut, dann wurde eine 1% Agarosegelelektrophorese durchgeführt und ein 1,2-kb-DNA-Fragment, das menschliches SSTR1 codierte, wurde gewonnen. 1 μg des oben erwähnten Expressionsvektors pAKKO-111 (5,5 kb) wurde mit SalI verdaut, um eine Klonierungsstelle zur Insertion des humanen SSTR1-DNA-Fragments herzustellen. Das Expressionsvektorfragment und das 1,2-kb-DNA-Fragment wurden miteinander verbunden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase, die Reaktionsmischung wurde in Escherichia coli JM109 mit der Calciumchloridmethode eingeführt und von den Transformanten wurde ein Expressionsplasmid, pA1-11-SSTR1, erhalten, bei dem das Human-SSTR1-DNA-Fragment in der richtigen Reihenfolge bezogen auf den Promotor insertiert war. Ein Transformant, der dieses Plasmid beherbergte, wird als Escherichia coli JM109/pA-1-11-SSTR1 bezeichnet.
  • (3) Einführung der Humansomatostatinrezeptorprotein-Subtyp-1-(SSTR1)-DNA in CHO-(dhfr–)-Zellen und Expression
  • CHO(dhfr–)-Zellen (1 × 106 Zellen) wurden auf HAM-F12-Medium, das 10% fatales Rinderserum enthielt, in einer Schale mit einem Durchmesser von 8 cm 24 Stunden lang gezüchtet. In diese Zellen wurden 10 μg Human-SSTR1-cDNA-Expressionsplasmid pA-1-11-SSTR1, das wie oben in (2) beschrieben, erhalten worden war, mit der Calciumphosphatmethode (Cell Phect Transfection Kit; Pharmacia) eingeführt. 24 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium gegen Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM), das 10% dialysiertes fatales Rinderserum enthielt, ausgetauscht, und Zellen, die eine Kolonie auf diesem Medium bildeten (nämlich DHFR+-Zellen) wurden ausgewählt. Weiterhin wurden die selektierten Zellen mit der Methode der begrenzenden Verdünnung behandelt zur Klonierung einer einzelnen Zelle und die Somatostatinrezeptorproteinaktivität wurde auf folgende Art und Weise gemessen. Die Human-SSTR1-cDNA exprimierende Zelllinie wurde mit Messpuffer [50 mM Trishydrochlorid, 1 mM EDTA, 5 mM Magnesiumchlorid, 0,1% Rinderserumalbumin (BSA), 0,2 mg/ml Bacitracin, 10 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Pepstatin, 200 Einheiten/ml Aprotinin (pH 7,5)], verdünnt, die Anzahl der Zellen wurde auf 2 × 104 pro 200 μl eingestellt. Die Zellsuspension wurde in 200-μl-Anteilen in Röhrchen verteilt, 2 μl 5 nM [125I]-Somatostatin-14 (2.000 Ci/mmol, Amersham) wurden jedem Röhrchen zugefügt und die Inkubation wurde 60 Minuten lang bei 25°C durchgeführt. Getrennt davon wurde zur Messung der nichtspezifischen Bindung (NSB) ein Röhrchen, dem 2 μl Somatostatin-14 (10–4 M) zugefügt worden waren, inkubiert. Waschpuffer [50 mM Trishydrochlorid, 1 mM EDTA, 5 mM Magnesiumchlorid (pH 7,5)] (1,5 ml) wurden zugefügt und anschließend wurde durch GF/F-Glasfaserfilterpapier (Whatman) filtriert und mit dem gleichen Puffer (1,5 ml) gewaschen. Das [125I] auf dem Filterpapier wurde mit einem Gammazähler gemessen. Auf diese Art und Weise wurde eine Zelllinie mit hoher Somatostatin bindender Aktivität, SSTR-1-8-3, selektiert.
  • Referenzbeispiel 2
  • Erzeugung von humanes Somatostatinrezeptorprotein-Subtyp 2 (SSTR2) exprimierenden Zellen
  • (1) Klonierung von cDNA von Humansomatostatinrezeptorprotein-Subtyp 2 (SSTR2)
  • Die DNA-Oligomere PT-1 und PT-2 wurden synthetisiert basierend auf der Nucleotidsequenz von Human-SSTR-2-cDNA, wie berichtet (Yamada et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 89, Seiten 251-255, 1992). PT-1 war ein Oligomer mit der Nucleotidsequenz 5'-GGTCGACACCATGGACATGGCG GATGAG-3' (SEQ ID Nr. 97) und enthielt eine Sequenz, die das Restriktionsenzym SalI am 5'-Ende erkennt und enthielt eine Sense-Sequenz von –2 bis +18 (Translationsstartstelle, die als +1 definiert ist). ST-2 war ein Oligomer mit einer Sequenz 5'-GGTCGACAGTTCAGATACTGGTTTGG-3' (SEQ ID Nr. 98) und enthielt eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym SalI am 5'-Ende und eine Antisense-Sequenz im Bereich von +1095 bis +1114.
  • Menschliche cDNA aus der Hypophyse (Clontech, Katalog Nr. 7173-1) wurde als Matrize verwendet. Die oben erwähnten DNA-Oligomere (jeweils 25 pmol) wurden 1 ng der cDNA zugefügt und die Polymerase-Kettenreaktion wurde durchgeführt unter Verwendung von 2,5 Einheiten TagDNA-Polymerase (Takara Shuzo). Die Zusammensetzung der Reaktionsmischung war so, wie in dem der TagDNA-Polymerase beigefügten Handbuch angegeben.
  • Die Reaktion wurde in 30 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus umfasste: 30 Sekunden bei 94°C, 20 Sekunden bei 52°C und 60 Sekunden bei 72°C. Die Reaktionsmischung wurde einer 1% Agarosegelelektrophorese unterzogen und danach wurde die spezifische Amplifikation eines DNA-Fragments mit der gewünschten Größe (etwa 1,1 kb) bestätigt. Das DNA-Fragment wurde aus dem Agarosegel in üblicher Weise gewonnen und mit pUC118, der an der HincII-Stelle gespalten worden war, verbunden, gefolgt von einer Einführung in kompetente Zellen, nämlich Escherichia coli JM109. Zwei transformierte Stämme (Nr. 5 und Nr. 7), die ein Plasmid beherbergten, das das DNA-Fragment enthielt, wurden ausgewählt und mit einem Nucleotidsequenzautomaten 373A (Applied Biosystems) analysiert zur Bestätigung der Nucleotidsequenz des insertierten DNA-Fragments, wobei eine Ein-Punkt-Mutation bestätigt wurde in der Sequenz eines Fragments mit 770 Basen zwischen SalI und BstPI von Stamm 5 und eine Ein-Punkt-Mutation bestätigt wurde in der Sequenz eines Fragments mit 360 Basen zwischen BstPI-SalI im Stamm 7. Daher wurden die Fragmente, die nach Entfernung des BstPI-SalI-Fragments von Stamm Nr. 5 und des BstPI-SalI-Fragments von Stamm 7 zurückblieben, mit Agarosegelelektrophorese gereinigt und durch die Ligierungsreaktion verbunden, um ein Plasmid zu konstruieren. Es wurde bestätigt, dass die Nucleotidsequenz des insertierten DNA-Fragments dieses Plasmids vollständig übereinstimmte mit der Nucleotidsequenz der menschlichen SSTR2-cDNA, wie in dem oben zitierten Yamada-et-al.-Report beschrieben.
  • (2) Konstruktion eines Expressionsplasmids mit Humansomatostatinrezeptorprotein-Subtyp-2-(SSTR2)-cDNA
  • Der für die Expression in CHO-Zellen verwendete Expressionsvektor war pAKKO-111, wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben (1).
  • Das das Human-SSTR2-cDNA-Fragment enthaltende Plasmid (5 μg), das wie oben in (1) beschrieben, erhalten worden war, wurde mit dem Restriktionsenzym SalI verdaut und einer 1% Agarosegelelektrophorese unterzogen und ein 1,1-kb-DNA-Fragment, das Human-SSTR2 codierte, wurde gewonnen. 1 μg des oben erwähnten Expressionsvektors pAKKO-111 (5,5 kb) wurde mit SalI verdaut zur Herstellung einer Klonierungsstelle für die Insertion des Human-SSTR2-cDNA-Fragments. Dieses Expressionsvektorfragment und das 1,1-kb-DNA-Fragment wurden miteinander verbunden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase, die Ligierungsmischung wurde in Escherichia coli JM109 mit der Calciumchloridmethode eingeführt und von den Transformanten wurde ein Expressionsplasmid, pAC01, bei dem das Human-SSTR2-cDNA-Fragment in der richtigen Reihenfolge bezogen auf den Promotor insertiert war, erhalten. Ein Transformant, der dieses Plasmid pAC01 beherbergt, wird als Escherichia coli JM109/pAC01 bezeichnet.
  • (3) Einführung der Humansomatostatinrezeptorprotein-Subtyp-2-(SSTR2)-cDNA in CHO(dhfr–)-Zellen und Expression
  • CHO(dhfr–)-Zellen (1 × 106 Zellen) wurden auf HAM-F12-Medium, das 10% fötales Rinderserum enthielt, in einer Schale mit einem Durchmesser von 8 cm 24 Stunden lang gezüchtet. In diese Zellen wurden 10 μg des Human-SSTR2-cDNA-Expressionsplasmids pAC01, das wie oben in (2) beschrieben, erhalten worden war, mit der Calciumphosphatmethode (Cell Phect Transfection Kit; Pharmacia) eingeführt. 24 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium gegen DMEM, das 10% dialysiertes fötales Rinderserum enthielt, ausgetauscht, und Zellen, die auf diesem Medium eine Kolonie bildeten (nämlich DHFR+-Zellen) wurden ausgewählt. Weiterhin wurden die ausgewählten Zellen mit der Methode der begrenzenden Verdünnung behandelt, um eine einzelne Zelle zu klonieren und eine Zelllinie, SSTR2-HS5-9, die menschliches SSTR2 stark exprimieren konnte, wurde ausgewählt.
  • Referenzbeispiel 3
  • Herstellung von Humansomatostatinrezeptorprotein-Subtyp 3 (SSTR3) exprimierenden Zellen
  • (1) Klonierung von Humansomatostatinrezeptorprotein-Subtyp-3-(SSTR3)-DNA
  • Die DNA-Oligomere S3-1 und S3-2 wurden synthetisiert basierend auf der Nucleotidsequenz von Human-SSTR-3-cDNA, wie berichtet (Yamada et al., Molecular Endocrinology, Bd. 6, Seiten 2136-2142, 1992). Die Sequenz von S3-1 war 5'-GGTCGACCTCAACCATGGACATGCTTCATC-3' (SEQ ID Nr. 99) und die Sequenz von S3-2 war 5'-GGTCGACTTTCCCCAGGCCCCTACAGGTA-3' (SEQ ID Nr. 100).
  • Menschliche chromosomale DNA (Clontech, Katalog Nr. CL6550-1) wurde als Matrize verwendet. Die oben erwähnten DNA-Oligomere (jeweils 25 pmol) wurden 0,5 ng der DNA zugefügt und die Polymerase-Kettenreaktion wurde durchgeführt unter Verwendung von 2,5 Einheiten Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene). Die Zusammensetzung der Reaktionsmischung war wie in dem der Pfu-DNA-Polymerase beigefügten Handbuch angegeben.
  • Die Reaktion wurde in 35 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus umfasste: 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 63°C und 2 Minuten bei 75°C. Nach 1% Agarosegelelektrophorese der Reaktionsmischung wurde die spezifische Amplifikation eines DNA-Fragments mit der gewünschten Größe (etwa 1,3 kb) bestätigt. Die Nucleotidsequenz des DNA-Fragments wurde bestätigt mit der in Referenzbeispiel 1 (1) beschriebenen Methode. Die von der Nucleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz stimmte vollständig überein mit der in dem oben zitierten Yamada-et-al.-Report beschriebenen Sequenz.
  • (2) Konstruktion eines Expressionsplasmids mit Humansomatostatinrezeptorprotein-Subtyp-3-(SSTR3)-DNA
  • Der Expressionsvektor, der zur Expression in CHO-Zellen verwendet wurde, war pAKKO-111, wie in Referenzbeispiel 1 (2) beschrieben. Das Human-SSTR3-DNA-Fragment enthaltende Plasmid (5 μg), das wie oben in (1) beschrieben, erhalten worden war, wurde mit dem Restriktionsenzym SalI verdaut und einer 1% Agarosegelelektrophorese unterzogen und ein 1,3-kb-DNA-Fragment, das Human-SSTR3 codierte, wurde gewonnen. 1 μg des oben erwähnten Expressionsvektors pAKKO-111 (5,5 kb) wurde mit SalI verdaut zur Erzeugung einer Klonierungsstelle für die Insertion des Human-SSTR3-DNA-Fragments. Dieses Expressionsvektorfragment und das 1,3-kb-DNA-Fragment wurden miteinander verbunden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase, die Reaktionsmischung wurde in Escherichia coli JM109 mit der Calciumchloridmethode eingeführt und von den Transformanten wurde ein Expressionsplasmid, pA-1-11-SSTR3 mit dem in der richtigen Reihenfolge bezogen auf den Promotor insertierten Human-SSTR3-DNA-Fragment erhalten. Ein Transformant, der dieses Plasmid pA-1-11-SSTR3 beherbergt, wird als Escherichia coli JM109/pA-1-11-SSTR3 bezeichnet.
  • (3) Einführung der Humansomatostatinrezeptorprotein-Subtyp-3-(SSTR3)-DNA in CHO(dhfr–)-Zellen und Expression
  • CHO(dhfr–)-Zellen (1 × 106 Zellen) wurden auf HAM-F12-Medium, das 10% fötales Rinderserum enthielt, in einer Schale mit einem Durchmesser von 8 cm 24 Stunden lang gezüchtet. In diese Zellen wurden 10 μg Human-SSTR3-DNA-Expressionsplasmid pA-1-11-SSTR3, das wie oben in (2) beschrieben, erhalten worden war, mit der Calciumphosphatmethode (Cell Phect Transfection Kit; Pharmacia) eingeführt. 24 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium gegen DMEM, das 10% dialysiertes fötales Rinderserum enthielt, ausgetauscht, und Zellen, die auf diesem Medium eine Kolonie bildeten (nämlich DHFR+-Zellen) wurden ausgewählt. Weiterhin wurden die selektierten Zellen mit der Methode der begrenzenden Verdünnung behandelt, um eine einzelne Zelle zu klonieren und bei den so klonierten Zellen wurde die Somatostatinrezeptorprotein exprimierende Fähigkeit mit dem in Referenzbeispiel 1 (3) beschriebenen Bindungstest bestimmt und eine Zelllinie mit hoher Somatostatinbindungsaktivität, SSTR3-15-19, wurde ausgewählt.
  • Referenzbeispiel 4
  • Herstellung von Humansomatostatinrezeptorprotein-Subtyp 4 (SSTR4) exprimierenden Zellen
  • (1) Klonierung von Humansomatostatinrezeptorprotein-Subtyp-4-(SSTR4)-DNA
  • Die DNA-Oligomere S4-1 und S4-2 wurden synthetisiert basierend auf der Nucleotidsequenz von Human-SSTR-4-cDNA, wie berichtet (Rohrer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 90, Seiten 4196-4200, 1993). Die Sequenz von S4-1 war 5'-GGCTCGAGTCACCATGAGCGCCCCCTCG-3' (SEQ ID) Nr. 101) und die Sequenz von S4-2 war 5'-GGGCTCGAGCTCCTCAGAAGGTGGTGG-3' (SEQ ID Nr. 102).
  • Humane chromosomale DNA (Clontech, Katalog Nr. CL6550-1) wurde als Matrize verwendet. Die oben erwähnten DNA-Oligomere (jeweils 25 pmol) wurden 0,5 ng der DNA zugefügt und die Polymerase-Kettenreaktion wurde durchgeführt unter Verwendung von 2,5 Einheiten Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene). Die Zusammensetzung der Reaktionsmischung war wie in dem der Pfu-DNA-Polymerase beigefügten Handbuch angegeben.
  • Die Reaktion wurde in 35 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus umfasste: 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 63°C und 2 Minuten bei 75°C. Bei 1% Agarosegelelektrophorese der Reaktionsmischung wurde die spezifische Amplifikation eines DNA-Fragments mit der gewünschten Größe (etwa 1,2 kb) bestätigt. Die Nucleotidsequenz des DNA-Fragments wurde mit der in Referenzbeispiel 1 (1) beschriebenen Methode bestätigt.
  • Die aus der Nucleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz stimmte vollständig überein mit der in dem oben zitierten Rohrer-et-al.-Report beschriebenen Sequenz.
  • (2) Konstruktion eines Expressionsplasmids mit Humansomatostatinrezeptorprotein-Subtyp-4-(SSTR4)-DNA
  • Der für die Expression in CHO-Zellen verwendete Expressionsvektor war pAKKO-111, wie in Referenzbeispiel 1 (2) beschrieben.
  • Das Human-SSTR4-DNA-fragmenthaltige Plasmid (5 μg), das wie oben in (1) beschrieben, erhalten worden war, wurde mit dem Restriktionsenzym XhoI verdaut und einer 1% Agarosegelelektrophorese unterzogen und ein 1,2-kb-DNA-Fragment, das Human-SSTR4 codierte, wurde gewonnen. 1 μg des oben erwähnten Expressionsvektors pAKKO-111 (5,5 kb) wurde mit SalI verdaut zur Erzeugung einer Klonierungsstelle für die Insertion des Human-SSTR4-DNA-Fragments. Dieses Expressionsvektorfragment und das 1,2-kb-DNA-Fragment wurden miteinander verbunden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase, die Reaktionsmischung wurde in Escherichia coli JM109 mit der Calciumchloridmethode eingeführt und von den Transformanten wurde ein Expressionsplasmid, pA-1-11-SSTR4, erhalten, in dem das Human-SSTR4-DNA-Fragment in der richtigen Reihenfolge bezogen auf den Promotor insertiert war. Ein Transformant, der dieses Plasmid pA-1-11-SSTR4 beherbergt, wird als Escherichia coli JM109/pA-1-11-SSTR4 bezeichnet.
  • (3) Einführung von Humansomatostatinrezeptorprotein-Subtyp-4-(SSTR4)-DNA in CHO(dhfr–)-Zellen und Expression
  • CHO(dhfr–)-Zellen (1 × 106 Zellen) wurden auf HAM-F12-Medium, das 10% fötales Rinderserum enthielt, in einer Schale mit einem Durchmesser von 8 cm 24 Stunden lang gezüchtet. In diese Zellen wurden 10 μg des Human-SSTR4-DNA-Expressionsplasmids pA-1-11-SSTR4, das wie oben in (2) beschrieben, erhalten worden war, mit der Calciumphosphatmethode (Cell Phect Transfection Kit; Pharmacia) eingeführt. 24 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium gegen DMEM, das 10% dialysiertes fötales Rinderserum enthielt, ausgetauscht, und Zellen, die auf diesem Medium eine Kolonie bildeten (nämlich DHFR+-Zellen) wurden ausgewählt. Weiterhin wurden die ausgewählten Zellen der Methode der begrenzenden Verdünnung unterzogen, um eine einzelne Zelle zu klonieren und bei der so klonierten Zelle wurde die Somatostatinrezeptorproteinexpressionsfähigkeit mit dem in Referenzbeispiel 1 (3) beschriebenen Bindungstest bestimmt. Auf diese Art und Weise wurde eine Zelllinie mit hoher Somatostatin bindender Aktivität, SSTR4-1-2, ausgewählt.
  • Referenzbeispiel 5
  • Herstellung von Humansomatostatinrezeptorprotein-Subtyp 5 (SSTR5) exprimierenden Zellen
  • (1) Klonierung von Humansomatostatinrezeptorprotein-Subtyp-5-(SSTR5)-DNA
  • Die DNA-Oligomere S5-1 und S5-2 wurden synthetisiert basierend auf der Nucleotidsequenz von Human-SSTR-5-cDNA, wie berichtet (Yamada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 195, Seiten 844-852, 1993). Die Sequenz von S5-1 war 5'-GGTCGACCACCATGGAGCCCCTGTTCCC-3' (SEQ ID Nr. 103) und die Sequenz von S5-2 war 5'-CCGTCGACACTCTCACAGCTTGCTGG-3' (SEQ ID Nr. 104).
  • Humane chromosomale DNA (Clontech, Katalog Nr. CL6550-1) wurde als Matrize verwendet. Die oben erwähnten DNA-Oligomere (jeweils 25 pmol) wurden 0,5 ng der DNA zugefügt und die Polymerase-Kettenreaktion wurde durchgeführt unter Verwendung von 2,5 Einheiten Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene). Die Zusammensetzung der Reaktionsmischung war wie in dem der Pfu-DNA-Polymerase beigefügten Handbuch angegeben.
  • Die Reaktion wurde in 35 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus umfasste: 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 66°C und 2 Minuten bei 75°C. Bei 1% Agarosegelelektrophorese der Reaktionsmischung wurde die spezifische Amplifikation eines DNA-Fragments mit der gewünschten Größe (etwa 1,1 kb) bestätigt. Die Nucleotidsequenz des DNA-Fragments wurde mit der in Referenzbeispiel 1 (1) beschriebenen Methode bestätigt. Die aus der Nucleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz stimmte vollständig überein mit der in dem oben zitierten Yamada-et-al.-Report beschriebenen Sequenz.
  • (2) Konstruktion eines Expressionsplasmids mit Humansomatostatinrezeptorprotein-Subtyp-5-(SSTR5)-DNA
  • Der für die Expression in CHO-Zellen verwendete Expressionsvektor war pAKKO-111, wie in Referenzbeispiel 1 (2) beschrieben.
  • Das Human-SSTR5-DNA-fragmenthaltige Plasmid (5 μg), das wie oben in (1) beschrieben, erhalten worden war, wurde mit dem Restriktionsenzym SalI verdaut und einer 1% Agarosegelelektrophorese unterzogen und ein 1,1-kb-DNA-Fragment, das Human-SSTR5 codierte, wurde gewonnen. 1 μg des oben erwähnten Expressionsvektors pAKKO-111 (5,5 kb) wurde mit SalI verdaut zur Erzeugung einer Klonierungsstelle für die Insertion des Human-SSTR5-DNA-Fragments. Dieses Expressionsvektorfragment und das 1,1-kb-DNA-Fragment wurden miteinander verbunden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase, die Reaktionsmischung wurde in Escherichia coli JM109 mit der Calciumchloridmethode eingeführt und von den Transformanten wurde ein Expressionsplasmid erhalten, in dem pA-1-11-SSTR5 mit dem Human-SSTR5-DNA-Fragment in der richtigen Reihenfolge bezogen auf den Promotor insertiert war. Ein Transformant, der dieses Plasmid pA-1-11-SSTR5 beherbergt, wird als Escherichia coli JM109/pA-1-11-SSTR5 bezeichnet.
  • (3) Einführung von Humansomatostatinrezeptorprotein-Subtyp-5-(SSTR5)-DNA in CHO(dhfr–)-Zellen und Expression
  • CHO(dhfr–)-Zellen (1 × 106 Zellen) wurden auf HAM-F12-Medium, das 10% fötales Rinderserum enthielt, in einer Schale mit einem Durchmesser von 8 cm 24 Stunden lang gezüchtet. In diese Zellen wurden 10 μg des Human-SSTR5-cDNA-Expressionsplasmids pA-1-11-SSTR5, das wie oben in (2) beschrieben, erhalten worden war, mit der Calciumphosphatmethode (Cell Phect Transfection Kit; Pharmacia) eingeführt. 24 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium gegen DMEM, das 10% dialysiertes fötales Rinderserum enthielt, ausgetauscht, und Zellen, die auf diesem Medium eine Kolonie bildeten (nämlich DHFR+-Zellen) wurden ausgewählt. Weiterhin wurden die ausgewählten Zellen der Methode der begrenzenden Verdünnung unterzogen, um eine einzelne Zelle zu klonieren und bei den so klonierten Zellen wurde die Somatostatinrezeptorproteinexpressionsfähigkeit mit dem in Referenzbeispiel 1 (3) beschriebenen Bindungstest bestimmt. Auf diese Art und Weise wurde eine Zelllinie mit hoher Somatostatin bindender Aktivität, SSTR5-32-4, ausgewählt.
  • Referenzbeispiel 6
  • Herstellung von humansomatostatinrezeptorhaltigen Zellmembranfraktionen
  • Die Humansomatostatinrezeptor exprimierenden CHO-Zelllinien SSTRl-8-3, SSTR2-HS5-9, SSTR3-15-19, SSTR4-1-2 und SSTR5-32-4 (jeweils 109 Zellen) wurden jeweils in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung, die mit 5 mM EDTA ergänzt war (PBS-EDTA) suspendiert und zentrifugiert. Zu jedem Zellpellet wurden 10 ml Zellhomogenisierungspuffer (10 mM NaHCO3, 5 mM EDTA, pH = 7,5) zugefügt und anschließend mit einem Polytron-Homogenisator homogenisiert. Das Homogenisat wurde mit 400 × g 15 Minuten lang zentrifugiert und der erhaltene Überstand wurde weiter 1 Stunde lang mit 100.000 × g zentrifugiert, was eine Membranfraktion als Niederschlag ergab. Dieser Niederschlag wurde in 2 ml Testpuffer (25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,1% BSA, 0,25 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), 1 μg/ml Pepstatin, 20 μg/ml Leupeptin, 10 μg/ml Phosphoramidon, pH = 7,5) suspendiert und die Suspension wurde 1 Stunde lang mit 100.000 × g zentrifugiert. Die als Niederschlag gewonnene Membranfraktion wurde wiederum in 20 ml Testpuffer suspendiert und die Suspension in Röhrchen verteilt, bei –80°C aufbewahrt und jedes Mal kurz vor der Verwendung aufgetaut.
  • Beispiel 1
  • Synthese von cDNA aus einer Poly(A)+-RNA-Fraktion aus menschlichem Gehirn und Amplifikation einer physiologisch aktiven Peptid-cDNA mit RT-PCR-Technik
  • Zu 5 μg einer Poly(A)+-RNA-Fraktion aus menschlichem Gehirn, die von Clontech erworben worden war, wurde eine statistische DNA-Hexamermischung (BRL) als Primer zugegeben und eine komplementäre DNA-Synthese wurde durchgeführt unter Verwendung der aus Moloney-Mausleukämievirus stammenden reversen Transkriptase (BRL) und des beigefügten Puffers. Nach der Reaktion wurde das Produkt mit Phenol-Chloroform (1:1) extrahiert und mit Ethanol ausgefällt und der Niederschlag wurde in 30 μl TE (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA) gelost. Unter Verwendung von 1 μl der so präparierten cDNA als Matrize wurde die Amplifikation durchgeführt mit PCR unter Verwendung der folgenden zwei Primer:
    5'-ACAAAGATGCCATTGTCCCCCGGCCTCCT-3' (SEQ ID NO:105)
    5'-TTCAGGTCTGTAATTAAACTTGCGTGA-3' (SEQ ID NO: 106)
  • Die Zusammensetzung der Reaktionsmischung war wie folgt: synthetische DNA-Primer (5'-Primersequenz und 3'-Primersequenz) jeweils 10 pmol, 0,25 mM dNTPs, ex Taq DNA-Polymerase 0,5 μl und der dem Enzym beigefügte Puffer 10 μl, wobei die gesamte Reaktionsmischung 100 μl ergab. Die Amplifikation wurde durchgeführt unter Verwendung einer Thermal-Cycler-Vorrichtung (Perkin Elmer) in 35 Zyklen, die jeweils umfassten: 30 Sekunden bei 95°C, 1 Minute bei 65°C und 30 Sekunden bei 72°C. Das Amplifikationsprodukt wurde mit 1,2% Agarosegelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung identifiziert.
  • Beispiel 2
  • Subklonierung des PCR-Produkts in einem Plasmidvektor und Selektion eines neuen physiologisch aktiven Peptidkandidatenklons
  • Das nach der in Beispiel 1 durchgeführten PCR erhaltene Reaktionsprodukt wurde aufgetrennt unter Verwendung eines 1,2% Agarosegels, die Bande wurde mit einer Rasierklinge herausgeschnitten und dann wurde die DNA durch SUPRECOITM-(Takara)-Behandlung, Phenolextraktion und Ethanolextraktion gewonnen. Die gewonnene DNA wurde in dem Plasmidvektor pCRTMII nach der Vorschrift des TA-Klonierungskits (Invitogen) subkloniert. Diese wurde in Escherichia-coli-JM109-kompetente Zellen (Takara Shuzo) eingeführt und danach wurden Klone mit dem cDNA-Insertfragment ausgewählt in LB-Agarmedium, das Ampicillin, IPTG und X-gal enthielt und indem ein weiß gefärbter Klon alleine unter Verwendung eines sterilen Zahnstochers isoliert wurde, wodurch ein Transformant, Escherichia coli JM109/phCSP6, erhalten wurde.
  • Dieser Klon wurde über Nacht in ampicillinhaltigem LB-Medium gezüchtet und eine Plasmid-DNA wurde erzeugt unter Verwendung eines automatischen Plasmidextraktors (Kurabo). Ein Teil der hergestellten DNA wurde mit EcoRI gespalten und die Größe des darin insertierten cDNA-Fragments wurde bestätigt. Ein weiterer Teil der verbleibenden DNA wurde weiterhin einer RNase-Behandlung, Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolausfällung zum Zwecke der Einengung unterzogen. Die Reaktion zur Bestimmung der Nucleotidsequenz wurde durchgeführt unter Verwendung eines DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (ABI) und die Decodierung wurde durchgeführt unter Verwendung eines auf Fluoreszenz basierenden Sequenzautomaten. Die erhaltene Information über die Nucleotidsequenz wurde verarbeitet unter Verwendung eines DNA-SIS-Systems (Hitachi System Engineering). Die so bestimmte Nucleotidsequenz ist in 1 gezeigt.
  • Basierend auf der bestimmten Nucleotidsequenz (1) wurde eine Homologiesuche durchgeführt und als Ergebnis wurde gefunden, dass das in das von dem Transformanten Escherichia coli JM109/phCSP6 beherbergte Plasmid insertierte cDNA-Fragment ein neues physiologisch aktives Peptid codiert. Weiterhin wurde zur Bestätigung dieser Tatsache die Nucleotidsequenz in eine Aminosäuresequenz umgewandelt unter Verwendung eines DNASIS-Systems (Hitachi System Engineering) (2) gefolgt von einer Homologiesuche basierend auf dem Hydrophobizitätsdiagramm (4) und auf der Aminosäuresequenz, wobei die Homologie mit Rattencortistatin (U51919) und Rattensomatostatin (J00788) gefunden wurde (5).
  • Die Abkürzungen in den obigen Klammem sind Seriennummern, die bei Registrierung der Daten bei der NBRF-PIR vergeben wurden und die allgemein als Hinterlegungsnummern geführt werden.
  • Beispiel 3
  • Synthese des Humanpeptids hCS-17 (SEQ ID Nr. 1): Asp-Arg-Met-Pro-Cys-Arg-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Ser-Ser-Cys-Lys
  • 1) Synthese von Boc-Asp(OcHex)-Arg(Tos)-Met-Pro-Cys(MeBzl)-Arg(Tos)-Asn-Phe-Phe-Trp(CHO)-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Phe-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeBzl)-Lys(Cl-Z)-OCH,-PAM-Harz
  • Der Reaktor eines Peptidsyntheseautomaten, ABI-410A, wurde mit einem im Handel erhältlichen Harz, Boc-Lys(Cl-Z)-OCH2PAM (0,65 mmol/g), beladen und dann wurden Boc-Cys(MeBzl), Boc-Ser(Bzl), Boc-Phe, Boc-Thr(Bzl), Boc-Lys(Cl-Z), Boc-Trp(CHO), Boc-Asn, Boc-Arg(Tos), Boc-Pro, Boc-Met, Moc-Asp(OcHex) der Kondensation mit der Boc/HOBT/NMP-Technik in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 1) vom C-Ende des Humancortistatin-artigen Peptids unterzogen. Die Kondensationsreaktion wurde mit einem Ninhydrintest überprüft und, wenn gefunden wurde, dass die Aminogruppe nicht umgesetzt worden war, wurde die Kondensationsreaktion wiederum durchgeführt, bis eine ausreichende Kondensation erhalten worden war und nach Addition aller Aminosäuren an das Harz, wie durch die Sequenz vorgegeben, wurden 0,9235 g des geschützten Peptidhärzes erhalten.
  • 2) Das in (1) erhaltene Harz (0,15 g) wurde mit 1,7 g para-Kresol, 2,5 ml 1,4-Butandithiol und 25 ml Fluorwasserstoff 1 Stunde bei 0°C behandelt. Fluorwasserstoff und 1,4-Butandithiol wurden bei vermindertem Druck abdestilliert, 100 ml Diethylether wurden zu dem Rückstand zugefügt und nach Rühren wurde der Feststoff auf einem Glasfilter gesammelt und getrocknet. Dieser Rest wurde in 50 ml 50% (V/V; dies trifft auch im Folgenden zu) wässrige Essigsäurelösung suspendiert und die Suspension wurde zur Extraktion des Peptids gerührt. Der Extrakt wurde von dem Harz getrennt, auf etwa 5 ml bei vermindertem Druck eingeengt und auf eine Sephadex-G-25-Säule (2 × 90 cm) aufgetragen und anschließend mit 50% Essigsäure-Wasser entwickelt. Die 120-170-ml-Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wurde in 2 ml 2 M wässriger Ammoniumacetatlösung gelöst, weiter auf 400 ml verdünnt durch Zugabe von entlüftetem destilliertem Wasser, der pH-Wert durch Zugabe von verdünntem wässrigem Ammoniak auf 8 eingestellt und durch langsames Durchblasen von Luft durch die Lösung bei Raumtemperatur oxidiert. Nach Bestätigung des Verschwindens des Peaks des Rohmaterialpeptids mit HPLC wurde der pH-Wert auf 4 oder darunter eingestellt durch Zugabe von Essigsäure und die Lösung wurde auf eine Reverse-Phase-Säule (LiChroprep RP-18, 2,6 × 10 cm; E. Merck) aufgetragen und die Gradientenelution wurde durchgeführt von 0,1% Trifluoressigsäure-Wasser bis 50% wässriger Acetonitrillösung, die 0,1% Trifluoressigsäure enthielt. Die eluierten Fraktionen, die den Konzentrationen von 30 bis 35% entsprachen, wurden vereinigt und lyophilisiert, was 38 mg eines weißen Pulvers ergab. Dann wurde dieses weiße Pulver auf eine schwach saure Ionenaustauscher-Chromatographiesäule (Cellulofine C-500, 2,6 × 5 cm; Seikagaku Corp.) aufgetragen und anschließend erfolgte eine Gradientenelution mit Ammoniumacetat-Wasser. Die eluierten Fraktionen, die etwa 0,3 M Aminoniumacetat entsprachen, wurden vereinigt und lyophilisiert, was 18,8 mg eines Pulvers ergab. Das erhaltene Produkt wurde weiterhin auf eine Sephadex-G-25-Gelfiltrationssäule (2 × 90 cm) aufgetragen unter Verwendung von 50% Essigsäure-Wasser und mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert. Die 183-225-ml-Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert, was 18,24 mg des Humanpeptids hCS-17 ergab.
    (M+H)+ gemäß massenspektrometrischer Analyse: 2150,9460 (berechneter Wert: 2150,9730) Elutionszeit bei HPLC: 19,3 Minuten Säulenbedingungen:
    Säule: WakosilTM 5C18 (4,6 × 100 mm)
    Elutionsmittel: Lösung A (0,1% TFA-Wasser)
    Lösung B 50% Acetonitril-Wasser enthaltend 0,1% TFA; Flution mit einem Gradienten
    mit linearer Konzentration (25 Minuten) von Lösung A bis Lösung B
    Durchflussrate: 1,0 ml/mm
  • Beispiel 4
  • Synthese des Humanpeptids hCS-15 vom Deletionstyp (SEQ ID Nr. 2): Met-Pro-Cys-Arg-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Ser-Ser-Cvs-Lys
  • 1) Synthese Boc-Met-Pro-Cys(MeBzl)-Arg(Tos)-Asn-Phe-Phe-Trp(CHO)-Lys(Cl-)-Thr(Bzl)-Phe-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeBzl)-Lys(Cl-Z)-OCH,-PAM-Harz
  • Gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 wurden alle notwendigen Aminosäuren dem Harz in der Reihenfolge, wie durch die Sequenz vorgegeben, zugefügt, was 0,477 g des geschützten Peptidharzes ergab.
  • 2) 0,20 g des in (1) erhaltenen Harzes wurden einer Behandlung mit Fluorwasserstoff, Oxidation mit Luft zur Bildung der S-S-Bindung und chromatographischen Reinigung unterzogen, was 17,7 mg des Humanpeptids hCS-15 vom Deletionstyp ergab.
    (M+H)+ gemäß massenspektrometrischer Analyse: 1879,7610 (berechneter Wert: 1879,7850) Elutionszeit bei HPLC: 19,6 Minuten Säulenbedingungen:
    Saute: WakosilTM 5C18 (4,6 × 100 mm)
    Elutionsmittel: Lösung A (0,1% TFA-Wasser)
    Lösung B 50% Acetonitril-Wasser enthaltend 0,1% TFA; Flution mit einem Gradienten
    mit linearer Konzentration (25 Minuten) von Lösung A bis Lösung B
    Durchflussrate: 1,0 ml/mm
  • Beispiel 5
  • Synthese von Humanpeptid hCS-13 vom Deletionstyp (SEQ ID Nr. 3): Cys-Arg-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Ser-Ser-Cys-Lys
  • 1) Synthese Boc-Cys(MeBzl)-Arg(Tos)-Asn-Phe-Phe-Trp(CHO)-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Phe-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Cvs(MeBzl)-Lys(Cl-Z)-OCH,-PAM-Harz
  • Mit dem Verfahren von Beispiel 3 wurden alle notwendigen Aminosäuren dem Harz in der durch die Sequenz vorgegebenen Reihenfolge zugefügt, was 0,603 g des geschützten Peptidharzes ergab.
  • 2) 0,14 g des in (1) erhaltenen Harzes wurden einer Behandlung mit Fluorwasserstoff, Oxidation mit Luft zur Bildung der S-S-Bindung und chromatographischen Reinigung unterzogen, was 17,7 mg des Humanpeptids hCS-13 vom Deletionstyp ergab.
    (M+H)+ gemäß massenspektrometrischer Analyse: 1651,5830 (berechneter Wert: 1651,7510) Elutionszeit bei HPLC: 19,0 Minuten Säulenbedingungen:
    Säule: WakosilTM 5C18 (4,6 × 100 mm)
    Elutionsmittel: Lösung A (0,1% TFA-Wasser)
    Lösung B 50% Acetonitril-Wasser enthaltend 0,1% TFA; Flution mit einem Gradienten
    mit linearer Konzentration (25 Minuten) von Lösung A bis Lösung B
    Durchflussrate: 1,0 ml/min
  • Beispiel 6
  • Synthese von Human-des-Lys17-hCS-17 vom Deletionstyp (SEQ ID Nr. 35): Asp-Arg-Met-Pro-Cys-Arg-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Ser-Ser-Cys
  • Das obige Peptid kann auf gleiche Art und Weise wie in Beispiel 3 synthetisiert werden unter Verwendung von Boc-Cys(MeBzl)-OCH2-PAM-Harz statt des Boc-Lys(Cl-Z)-OCH2-PAM-Harzes von Beispiel 3.
  • Beispiel 7
  • Synthese des Humanpeptids des Lys15 hCS-15 vom Deletionstyp (SEQ ID Nr. 36): Met-Pro-Cys-Arg-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Ser-Ser-Cys
  • Das obige Peptid kann auf gleiche Art und Weise synthetisiert werden wie in Beispiel 4 unter Verwendung von Boc-Cys(MeBzl)-OCH2-PAM-Harz anstelle des Boc-Lys(Cl-Z)-OCH2-PAM-Harzes.
  • Beispiel 8
  • Synthese des Humanpeptids des Lys13 hCS-13 vom Deletionstyp (SEQ ID Nr. 37): Cys-Arg-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Ser-Ser-Cys
  • Das obige Peptid kann auf gleiche Art und Weise wie in Beispiel 5 synthetisiert werden unter Verwendung von Boc-Cys(MeBzl)-OCH2-PAM-Harz anstelle von. Boc-Lys(Cl-Z)-OCH2-PAM-Harz.
  • Beispiel 9
  • Northern Hybridisierung von phCSP6
  • Zum Nachweis der Expression des neuen physiologisch aktiven Peptids, das von phCSP6 codiert wird, in menschlichen Organen auf mRNA-Ebene, wurde eine Northern Hybridisierung durchgeführt. Die für den Northern Blot verwendeten Filter waren Human Multiple tissue Northern Blot, II, und Human Brain Multiple tissue Northern Blot II und III (CL 7760-1, CL 7759-1, CL 7755-1 und CL 7750-1; Clontech). Die Hybridisierung wurde durchgeführt, indem die oben erwähnten Filter und die Sonde, die durch Spaltung von pHCSP6 mit EcoRI hergestellt worden war, inkubiert wurden, das so herausgeschnittene Fragment mit etwa 300 bp gewonnen wurde und markiert wurde, indem es dazu gebracht wurde, [32P]dCTP (du Pont) aufzunehmen unter Verwendung eines statistischen DNA-Markierungskits (Amersham), in Express-Hybri-Lösung (Clontech) 1 Stunde bei 68°C. Die Filter wurden mit 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C gewaschen und an der Luft getrocknet und anschließend wurden 18 Tage lang bei –80°C Röntgenfilme (XAR5, Kodak) belichtet. Die so erhaltenen Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Die mit Northern Blot erhaltenen Ergebnisse unter Verwendung von G3PDH (Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase) als innerer Kontrolle, sind auch in 6 gezeigt.
  • Aus diesen Ergebnissen ist zu erkennen, dass das Gen für das neue physiologisch aktive Peptid, das von phCSP6 codiert wird, in Hoden, Caudatus nucleus, Rückenmark, Hirnrinde, Corpus amygdaloideum, Hippocampus etc. exprimiert wird.
  • Beispiel 10
  • Messung der Hemmung der Bindung von [125I]-Somatostatin in Prozent
  • Die in Referenzbeispiel 6 erzeugten Membranfraktionen worden jeweils auf 3 μg/ml mit Testpuffer verdünnt. Jeweils 173 μl jeder Verdünnung wurden in Röhrchen verteilt und 2 μl einer Lösung der Testverbindung in Dimethylsulfoxid (DMSO) und 25 μl 200 pM radioaktiv markiertes Somatostatin ([125I]-Somatostatin; Amersham) wurden gleichzeitig zugefügt. Für die Messung der maximalen Bindung wurden Reaktionsmischungen hergestellt, indem 2 μl DMSO und 25 μ1 200 pM [125I]-Somatostatin zugefügt wurden. Weiterhin wurden für die Messung der nichtspezifischen Bindung Reaktionsmischungen gleichzeitig hergestellt, indem 2 μl 100 μM Somatostatinlösung in DMSO und 25 μl 200 pM [125I]-Somatostatin zugefügt wurden. Nach 60 Minuten Reaktion bei 25°C wurde jede Reaktionsmischung saugfiltriert unter Verwendung von mit Polyethylenimin behandelten Whatman-Glasfiltern (GF-B). Nach Filtration wurde die Radioaktivität von [125I]Somatostatin, die auf dem Filterpapier zurückblieb, gemessen. Für jede Testsubstanz wurde die Hemmung der Bindung in Prozent (%) berechnet gemäß der Formel: PBM = (B – NSB)/(B0 – NSB) × 100(wobei PBM: Prozent maximale Bindung; B: Radioaktivität, wenn die Testprobe zugefügt wurde; B0: maximal gebundene Radioaktivität; NSB: nichtspezifisch gebundene Radioaktivität). Weiterhin wurde die Hemmung in Prozent gemessen, wobei die Konzentration der Testsubstanz variierte und die Konzentration jeder Testsubstanz, die für eine 50%ige Hemmung der Bindung erforderlich war (IC50-Wert), wurde mit der Hill-Plot-Technik berechnet.
  • Die IC50-Werte für hCS-13, hCS-15 und hCS-17 wurden auf die obige Art und Weise bestimmt, wie in Tabelle 1 gezeigt. Aus Tabelle 1 wurde abgeleitet, dass hCS-13, hCS-15 und hCS-17 die Bindung von [125I]-Somatostatin gegenüber allen Rezeptoren SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4 und SSTR5 stark hemmten. Tabelle 1
    Ligand IC50 (nM)
    SSTR1 SSTR2 SSTR3 SSTR4 SSTR5
    hCS-13 hCS-15 hCS-17 6 7 7 0,3 0,8 0,6 0,7 0,9 0,6 0,5 0,6 0,5 0,5 0,6 0,4
  • Beispiel 11
  • Die cAMP-Akkumulation hemmende Aktivitäten von hCS15 und hCS17 in Humansomatostatinrezeptor exprimierenden CHO-Zellen
  • Um die intrazelluläre Akkumulation von cyclischem Adenosin-3',5'-monophosphat (CAMP) zu messen, wurden Humansomatostatinrezeptor exprimierende Zelllinien SSTR2-HS5-9, SSTR3-15-19, SSTR4-1-2 bzw. SSTR5-32-4, die in Referenzbeispiel 2 (3), Referenzbeispiel 3 (3), Referenzbeispiel 4 (3) bzw. Referenzbeispiel 5 (3) beschrieben wurden, in 24-Napfplatten vervielfältigt bis zum Zusammenfließen. Diese Zellen wurden zweimal mit jeweils 1 ml Medium A [Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM), 20 mM 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethansulfonsäure (HEPES) (pH 7,5), 0,2% BSA, 0,2 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX)] gewaschen und dann wurden 400 μl Medium A jedem Napf zugefügt und die Inkubation 1 Stunde lang bei 37°C durchgeführt. Jedem Napf wurden 50 μl hCS-15- oder hCS-17-Lösung (jeweils mit Medium A verdünnt auf eine Konzentration, die das 10-Fache der Endkonzentration war) und 50 μl Forskolinlösung (Endkonzentration: 10 μM) zugefügt und die Inkubation wurde 30 Minuten lang bei 37°C durchgeführt. Die Zellen wurden zweimal mit jeweils 1 ml Medium A gewaschen und dann wurden 500 μl Medium A und 100 μl 20% wässrige Perchlorsäurelösung jedem Napf zugefügt und anschließend 20 Minuten bei 4°C zur Zelllyse stehen gelassen. Diese Lysatlösung wurde in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und zentrifugiert (15.000 U/min, 10 Minuten) und 500 μl des Überstands wurden in ein weiteres Eppendorf-Röhrchen überführt und mit 60 mM wässriger HEPES-Lösung, die 1,5 M Kaliumchlorid enthielt, neutralisiert. Die Menge an cAMP, die in diesem Extrakt enthalten war, wurde bestimmt unter Verwendung eines Amersham-Kits (cAMP EIA System). Als Ergebnis wurde die intrazelluläre cAMP-Ansammlung bei Stimulierung mit Forskolin (10 μM) in CHO-Zellen, in denen jeder Subtyp von Humansomatostatinrezeptor dazu gebracht worden war, einzeln exprimiert zu werden, abhängig von der Konzentration von hCS-15 oder hCS-177 reduziert. Die ED50-Werte, die bei dieser Gelegenheit gefunden wurden, sind in Tabelle 2 gezeigt. Es wurde auf diese Art und Weise festgestellt, dass, weil hCS-15 und hCS-177 die Adenylatcyclaseaktivität in CHO-Zellen, die SSTR2, SSTR3, SSTR4 und SSTR5 exprimieren, hemmen, sie eine Agonistaktivität gegenüber diesen Rezeptoren haben. Tabelle 2
    Peptid ED50 (nM)
    SSTR2 SSTR3 SSTR4 SSTR5
    hCS-15 hCS-17 7 5 1 1 0,2 0,1 0,2 0,2
  • Beispiel 12
  • Wirkung von hCS-17 auf das Rattenelektroenzephalogramm
  • Unter Verwendung von männlichen Jcl:Wistar-Ratten (b. Gewicht 300 bis 350 g, ungefähr) unter Pentobarbitalanästhesie (50 mg/kg, i.p.) wurde der Kopf in einer Rattenhirnstereotaxievorrichtung immobilisiert und der Aufnehmer wurde gedreht zur Anordnung einer Schraubelektrode für die Rindenableitung und einer bipolaren Elektrode aus rostfreiem Stahl für die Ableitung des Hippocampus (A: –2,6, L: 2,5, H: 3,5, Pellegrino und Cushman Brain Atlas). Eine bipolare Nadelelektrode aus rostfreiem Stahl zur Aufzeichnung eines Elektromyogramms wurde auch in die Muskelschicht im dorsozervikalen Bereich insertiert. Alle Elektroden wurden mit einer Buchse am Schädel verbunden und mit Dentalzement fixiert. Für die Verabreichung der Testwirkstofflösung in das Paracel wurde eine 27-G-Führungskanüle aus rostfreiem Stahl in solcher Art und Weise insertiert, dass die Koordinaten ihrer Spitze A: –0,4, L: 1,7, H: 1,7 waren und sie wurde zusammen mit den EEG-Elektroden unter Verwendung von Dentalzement fixiert. Ein Stilett wurde in die Führungskanüle eingesetzt, um ein Verstopfen der Kanülenbohrung durch Gewebe und Blut zu verhindern. Nach der postoperativen Erholung wurde das Tier dem Versuch unterzogen. Die Ratte wurde an die Versuchsumgebung mindestens 1 Stunde lang akklimatisiert und erhielt entweder hCS-17 gelöst in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder PBS in das Paracel über eine 30-G-Infusionskanüle. Das Elektroenzephalogramm wurde 4 Stunden lang nach Verabreichung des Testwirkstoffs aufgezeichnet. Das Dosisvolumen war 5 μl und die Dosis war 0,1 oder 1 nmol. Kontrolltiere wurden in gleicher Weise mit PBS dosiert. Alle elektrischen Informationen wurden an einem Polygraph aufgezeichnet und in analogen und digitalen Formaten dargestellt unter Verwendung eines Elektroenzephalogrammanalysators.
  • Schlaf-Wachzeit wurden aufgezeichnet durch visuelles Ablesen des Polygramms und ausgewertet durch Frequenzanalyse und Stromanalyse und in die folgenden Kategorien klassifiziert.
    • (1) Wachheit: Die corticale Ableitung zeigt Alphawellen (niedrige Amplitude, schnelle Wellen) und die Hippocampusableitung zeigt Thetawellen (rhythmische Wellen). Während dieser Zeit ist die elektromyographische Aktivität hoch.
    • (2) SWS1 (Schlaf mit leichten und langsamen Wellen) und SWS2 (Schlaf mit tiefen und langsamen Wellen): Die Ratte nimmt eine Schlafhaltung an und Deltawellen (Spindelwellen) oder langsame Wellen mit hoher Amplitude erscheinen in der Gehirnrinde und langsame Wellen mit hoher Amplitude erscheinen in der Hippocampusableitung. Während dieses Zeitraums ist die elektromyographische Aktivität verringert (SWS1) oder nicht vorhanden (SWS2).
    • (3) PS (Paradoxer Schlaf): Alphawellen (schnelle Wellen, niedrige Amplitude) erscheinen in der Hirnrinde und Thetawellen (rhythmische Wellen) in der Hippocampusableitung. Während dieses Zeitraums gibt es keine elektromyographische Aktivität. Unter Verwendung von 5 bis 6 Ratten pro Gruppe wurde hCS-17 bzw. PBS der gleichen Ratte injiziert, um die jeweilige Wirkung auf das Wachverhalten auszuwerten. Die Analyse bezüglich der statistischen Signifikanz erfolgte mit dem gepaarten t-Test.
  • Das typische EEG-Muster direkt nach Injektion von 1 nmol hCS-17 ist in 7 gezeigt. Direkt nach Verabreichung von hCS-17 trat eine Abflachung der corticalen und hippocampalen EEG-Muster auf und bestand für 3 bis 5 Minuten lang fort. Diese Abflachung der EEG-Muster wurde bei 2 von 5 Tieren in der 0,1-nmol-Gruppe und 4 von 6 Tieren in der 1-nmol-Gruppe gefunden.
  • Die Beschäftigungszeiten bezogen auf die Gesamt-EEG-Aufzeichnungszeit von 4 Stunden in Prozent sind in den 8 bis 11 gezeigt. Die hCS-17-0,1-mmol-Gruppe unterschied sich nicht von der PBS-Kontrollgruppe in Bezug auf die Wachzeit, zeigte aber eine Tendenz zu einer Verringerung von SWS1 und zu einer Erhöhung von SWS2. PS war signifikant verringert Die hCS-17-1-nmol-Gruppe zeigte eine signifikante Verringerung bei SWS1, eine Erhöhung bei SWS2 und eine Abnahme bei PS.
  • Die obigen Ergebnisse zeigten, dass das reife Peptid hCS-7 der Erfindung eine Schlaf modulierende Wirkung hat.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Die Peptide der vorliegenden Erfindung und Vorläufer davon einschließlich der Salze davon haben Somatostatin-artige oder Cortistatin-artige Aktivitäten, z.B. (i) eine Wachstumhormonsekretion hemmende Aktivität, (ii) hemmende Aktivität auf die Sekretion von Hypophysenhormonen, wie schilddrüsenstimulierendem Hormon und Prolactin, (iii) eine hemmende Aktivität auf die Sekretion von Hormonen des Verdauungstrakts, wie Gastrin und Insulin, (iv) Neurotransmitteraktivität, (v) Zellproliferation stimulierende Aktivität, (vi) hemmende Aktivität gegenüber Acetylcholin, das ein REM-Schlafinduktor ist, (vii) die Kontraktion der glatten Muskeln hemmende Aktivität usw. Daher sind die Peptide, Vorläufer und Salze der Erfindung nützlich als Wirkstoffe, z.B. als therapeutische oder prophylaktische Mittel für Hormon erzeugende Tumoren, Akromegalie, Gigantismus, Demenz, Diabetes, Magengeschwüre und dgl., als Hormonsekretionsinhibitoren, Tumorwachstumsinhibitoren, Modulatoren der neuralen Aktivität oder des Schlafs usw.
  • Die DNAs, die Peptid oder Vorläufer der Erfindung codieren, sind z.B. nützlich als Mittel zur Gentherapie oder Verhütung von Hormon erzeugenden Tumoren, Akromegalie, Gigantismus, Demenz, Diabetes, Magengeschwüre und dgl., als Hormonsekretionsinhibitoren, Tumorwachstumsinhibitoren, Modulatoren der neuralen Aktivität oder des Schlafs usw. Weiterhin sind die DNAs der Erfindung nützlich als Mittel zur Gendiagnose von Krankheiten, wie z.B. Hormon erzeugenden Tumoren, Akromegalie, Gigantismus, Demenz, Diabetes, Magengeschwüre und dgl.
  • Die Antikörper gegen das Peptid oder Salz der Erfindung können spezfisch das Peptid oder Salz der Erfindung erkennen und können daher verwendet werden, um das Peptid oder Äquivalent der Erfindung in Testlösungen nachzuweisen.
  • Die Peptide, Vorläufer oder Salze der Erfindung sind nützlich als Reagenzien zum Screenen von Verbindungen oder Salzen davon, die die Bindung der Peptide, Vorläufer oder Salze der Erfindung an Rezeptoren modifizieren können.
  • Die Verbindungen oder Salze davon, die durch das Screening erhalten werden, sind nützlich als Wirkstoffe, z.B. als therapeutische oder prophylaktische Mittel für verschiedene Krankheiten.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00820001
  • Figure 00830001
  • Figure 00840001
  • Figure 00850001
  • Figure 00860001
  • Figure 00870001
  • Figure 00880001
  • Figure 00890001
  • Figure 00900001
  • Figure 00910001
  • Figure 00920001
  • Figure 00930001
  • Figure 00940001
  • Figure 00950001
  • Figure 00960001
  • Figure 00970001
  • Figure 00980001
  • Figure 00990001
  • Figure 01000001
  • Figure 01010001
  • Figure 01020001
  • Figure 01030001
  • Figure 01040001
  • Figure 01050001
  • Figure 01060001
  • Figure 01070001
  • Figure 01080001
  • Figure 01090001
  • Figure 01100001
  • Figure 01110001
  • Figure 01120001
  • Figure 01130001
  • Figure 01140001
  • Figure 01150001
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 01160001
  • Figure 01170001
  • Figure 01180001
  • Figure 01190001
  • Figure 01200001
  • Figure 01210001
  • Figure 01220001
  • Figure 01230001
  • Figure 01240001
  • Figure 01250001
  • Figure 01260001
  • Figure 01270001
  • Figure 01280001
  • Figure 01290001
  • Figure 01300001
  • Figure 01310001
  • Figure 01320001
  • Figure 01330001
  • Figure 01340001
  • Figure 01350001
  • Figure 01360001
  • Figure 01370001
  • Figure 01380001
  • Figure 01390001
  • Figure 01400001
  • Figure 01410001
  • Figure 01420001
  • Figure 01430001
  • Figure 01440001
  • Figure 01450001
  • Figure 01460001
  • Figure 01470001
  • Figure 01480001
  • Figure 01490001
  • Figure 01500001
  • Figure 01510001

Claims (23)

  1. Peptid enthaltend die in SEQ ID Nr. 1 definierte Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz, die davon durch Deletion oder Substitution von 1 bis 5 Aminosäureresten abgeleitet ist, ein Vorläufer davon oder ein Salz des Peptids oder Vorläufers, wobei das Peptid nicht die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 31 oder SEQ ID Nr. 32 enthält, und wobei das Peptid eine Kortistatin- oder Somatostatinaktivität aufweist.
  2. Peptid oder Vorläufer nach Anspruch 1, das/der die in SEQ ID Nr. 1 definierte Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz, die davon durch Deletion oder Substitution von 1 bis 5 Aminosäureresten abgeleitet ist, enthält.
  3. Peptid nach Anspruch 1, das die in SEQ ID Nr. 1 definierte Aminosäuresequenz enthält.
  4. Peptid nach Anspruch 1, das die in SEQ ID Nr. 2 definierte Aminosäuresequenz enthält.
  5. Peptid nach Anspruch 1, das die in SEQ ID Nr. 3 definierte Aminosäuresequenz enthält.
  6. Peptid nach Anspruch 1, das eine der in SEQ ID Nr. 35 bis SEQ ID Nr. 55 definierten Aminosäuresequenzen enthält.
  7. Vorläufer nach Anspruch 1, der die in SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6 oder SEQ ID Nr. 7 definierte Aminosäuresequenz enthält.
  8. DNA enthaltend eine DNA mit einer Nucleotidsequenz, die das Peptid oder den Vorläufer gemäß Anspruch 1 codiert.
  9. DNA nach Anspruch 8, die die in SEQ ID Nr. 13 definierte Nucleotidsequenz enthält.
  10. DNA nach Anspruch 8, die die in SEQ ID Nr. 14 definierte Nucleotidsequenz enthält.
  11. DNA nach Anspruch 8, die die in SEQ ID Nr. 15 definierte Nucleotidsequenz enthält.
  12. DNA nach Anspruch 8, die eine der in SEQ ID Nr. 16 bis SEQ ID Nr. 23 definierten Nucleotidsequenzen enthält.
  13. DNA nach Anspruch 8, die eine der in SEQ ID Nr. 62 bis SEQ ID Nr. 82 definierten Nucleotidsequenzen enthält.
  14. Rekombinanter Vektor enthaltend die DNA gemäß Anspruch 8.
  15. Transformierte Zelle, die den rekombinanten Vektor von Anspruch 14 beherbergt.
  16. Verfahren zur Erzeugung des Peptids, des Vorläufers oder des Salzes gemäß Anspruch 1, das umfasst, dass die transformierte Zelle, die in Anspruch 15 beansprucht wird, gezüchtet wird, um dadurch die Produktion und Ansammlung des Peptids, Vorläufers oder Salzes gemäß Anspruch 1 zu erreichen und das Produkt dann geerntet wird.
  17. Pharmazeutische Zusammensetzung, die das Peptid, den Vorläufer oder das Salz gemäß Anspruch 1 enthält.
  18. Pharmazeutische Zusammensetzung, die die DNA gemäß Anspruch 8 enthält.
  19. Antikörper gegen ein Peptid, das aus der in SEQ ID Nr. 1 definierten Aminosäuresequenz besteht oder ein Salz dieses Peptids, der das Peptid oder Salz spezifisch erkennen kann, aber nicht das Peptid erkennt, das aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 31 oder SEQ ID Nr. 32 besteht.
  20. Verfahren zum Screenen nach einer Verbindung oder einem Salz davon, die/das die Bindung des Peptids, Vorläufers oder Salzes gemäß Anspruch 1 an einen Rezeptor, mit dem das Peptid, der Vorläufer oder das Salz konjugiert sein kann, oder ein Fragmentpeptid dieses Rezeptors oder ein Salz des Rezeptors oder Fragmentpeptids, modifizieren kann, wobei das Verfahren umfasst, dass einerseits (i) das Peptid, der Vorläufer oder das Salz gemäß Anspruch 1 mit dem Rezeptor, Fragmentpeptid oder Salz, an den das Peptid, der Vorläufer oder das Salz gemäß Anspruch 1 konjugiert sein kann, in Kontakt gebracht wird und, andererseits, (ii) das Peptid, der Vorläufer oder das Salz gemäß Anspruch 1 und eine zu testende Verbindung mit dem Rezeptor, Fragmentpeptid oder Salz, mit dem das Peptid, der Vorläufer oder das Salz gemäß Anspruch 1 konjugiert sein kann, in Kontakt gebracht wird und das Ausmaß der Bindung des Peptids, Vorläufers oder Salzes gemäß Anspruch 1 an den Rezeptor, das Fragmentpeptid oder das Salz bestimmt und für die obigen Fälle (i) und (ii) verglichen wird.
  21. Verfahren zum Screenen nach einer Verbindung oder einem Salz davon, die/das die Bindung des Peptids, Vorläufers oder Salzes gemäß Anspruch 1 an einen Rezeptor, an den das Peptid, der Vorläufer oder das Salz konjugiert sein kann, oder ein Fragmentpeptid des Rezeptors oder ein Salz des Rezeptors oder Fragmentpeptids, modifizieren kann, wobei das Verfahren umfasst, dass einerseits (i) das Peptid, der Vorläufer oder das Salz gemäß Anspruch 1 mit Zellen oder einer Zellmembranfraktion in Kontakt gebracht werden, die den Rezeptor enthalten, an den das Peptid, der Vorläufer oder das Salz gemäß Anspruch 1 konjugiert sein kann und andererseits (ii) das Peptid, den Vorläufer oder das Salz gemäß Anspruch 1 und eine zu testende Verbindung mit den Zellen oder der Zellmembranfraktion, die den Rezeptor enthalten, an den das Peptid, der Vorläufer oder das Salz gemäß Anspruch 1 konjugiert sein kann, in Kontakt gebracht werden und (I) das Ausmaß der Bindung des Peptids, des Vorläufers oder des Salzes gemäß Anspruch 1 an die Zellen oder die Zellmembranfraktion, die den Rezeptor enthalten, bestimmt und verglichen wird oder (II) die zellstimulierende Aktivität, die durch den Rezeptor vermittelt wird, bestimmt und für die beiden Fälle (i) und (ii) verglichen wird.
  22. Kit zum Screenen einer Verbindung oder eines Salzes davon, die/das die Bindung des Peptids, Vorläufers oder Salzes gemäß Anspruch 1 an einen Rezeptor für das Peptid, den Vorläufer oder das Salz, oder ein Fragmentpeptid des Rezeptors oder ein Salz des Rezeptors oder Fragmentpeptids modifizieren kann, wobei der Kit das Peptid, den Vorläufer oder das Salz gemäß Anspruch 1 enthält.
  23. Verfahren zur Erzeugung des Peptids, des Vorläufers oder Salzes gemäß Anspruch 1, das umfasst, dass eine das Aminoende bildende Aminosäure oder ein Peptid und eine das Carboxylende bildende Aminosäure oder ein Peptid einer Kondensation unterzogen werden, gegebenenfalls gefolgt von der Bildung einer intramolekularen Disulfidbindung.
DE69737229T 1996-06-07 1997-06-05 Peptid mit cortistatin- oder somatostatin-aktivität, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendungen Expired - Fee Related DE69737229T2 (de)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP14605296 1996-06-07
JP14605296 1996-06-07
JP24771096 1996-09-19
JP24771096 1996-09-19
JP27242296 1996-10-15
JP27242296 1996-10-15
PCT/JP1997/001911 WO1997046668A1 (fr) 1996-06-07 1997-06-05 Peptide, procede de production et mode d'utilisation correspondants

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69737229D1 DE69737229D1 (de) 2007-02-22
DE69737229T2 true DE69737229T2 (de) 2008-01-31

Family

ID=27319088

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69737229T Expired - Fee Related DE69737229T2 (de) 1996-06-07 1997-06-05 Peptid mit cortistatin- oder somatostatin-aktivität, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendungen

Country Status (6)

Country Link
US (1) US7074761B1 (de)
EP (1) EP0911393B1 (de)
AU (1) AU2978697A (de)
CA (1) CA2257108A1 (de)
DE (1) DE69737229T2 (de)
WO (1) WO1997046668A1 (de)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5902398A (en) * 1996-12-31 1998-07-31 Human Genome Sciences, Inc. Cortistatin polypeptides
US7488590B2 (en) 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
PT2319928E (pt) 1998-10-23 2013-06-28 Kirin Amgen Inc Péptidos diméricos de trombopoietina que simulam a ligação ao receptor mpl e têm actividade trombopoiética
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
EP1230928A4 (de) * 1999-11-18 2004-01-28 Takeda Chemical Industries Ltd Verwendung von peptid
EP1372717A2 (de) * 2001-03-23 2004-01-02 Aphton Corporation Kombinationsbehandlung von pankreaskrebs
US20090191232A1 (en) * 2001-05-04 2009-07-30 Gevas Philip C Combination therapy for the treatment of tumors
CA2450898A1 (en) * 2001-07-09 2003-01-23 Aphton Corporation Treatment and prevention of cancerous and pre-cancerous conditions of the liver, lung and esophagus
CA2490409A1 (en) 2002-06-28 2004-01-08 Centocor, Inc. Mammalian ch1 deleted mimetibodies, compositions, methods and uses
WO2004088326A2 (en) * 2003-03-28 2004-10-14 Aphton Corporation Gastrin hormone immunoassays
WO2006010057A2 (en) 2004-07-08 2006-01-26 Amgen Inc. Therapeutic peptides
CN101048659B (zh) * 2004-09-22 2013-03-13 受体生物技术公司 抗前胃泌素单克隆抗体
CN101103045B (zh) 2004-09-24 2015-11-25 安姆根有限公司 修饰的Fc分子
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
US9283260B2 (en) 2006-04-21 2016-03-15 Amgen Inc. Lyophilized therapeutic peptibody formulations
EP2663574A4 (de) * 2011-01-10 2014-12-17 Scripps Research Inst Retroviren-replikationshemmer
WO2017181061A1 (en) * 2016-04-15 2017-10-19 Ra Pharmaceuticals, Inc. Ras binding peptides and methods of use
KR20200015943A (ko) 2017-06-15 2020-02-13 캔설 어드밴스 아이엔씨 종양 및 암에 대한 체액성 및 세포 면역을 유도하기 위한 조성물 및 방법

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6074872A (en) * 1996-05-15 2000-06-13 The Scripps Research Institute Cortistatin: nucleic acids that encode these neuropeptides
AU5902398A (en) * 1996-12-31 1998-07-31 Human Genome Sciences, Inc. Cortistatin polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
EP0911393A4 (de) 2002-09-18
US7074761B1 (en) 2006-07-11
EP0911393B1 (de) 2007-01-10
DE69737229D1 (de) 2007-02-22
WO1997046668A1 (fr) 1997-12-11
EP0911393A1 (de) 1999-04-28
CA2257108A1 (en) 1997-12-11
AU2978697A (en) 1998-01-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69737229T2 (de) Peptid mit cortistatin- oder somatostatin-aktivität, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendungen
DE69838986T2 (de) Polypeptide, deren herstellung und verwendung
DE69636437T2 (de) Ligand polypeptide für hypophyse g-protein gekoppeltes rezeptor-protein, deren herstellung und anwendung
DE60128916T2 (de) Neues, physiologisch aktives peptid und dessen verwendung
DE69730607T2 (de) Fas ligand ähnliches protein, seine herstellung und verwendung
DE60119714T2 (de) Peptidderivat
US5892004A (en) Method for preparing PACAP receptor protein
US6399316B1 (en) PACAP receptor protein, method for preparing said protein, and use thereof
DE69935159T2 (de) Screening-verfahren
DE69836626T2 (de) Proteine mit lecithin-cholesterin acetyltransferase-ähnlicher aktivität, deren herstellung und verwendung
DE69736158T2 (de) Glutamine: Fructose-6-Phosphat Amidotransferase (GFAT), ihre Herstellung und Verwendung
DE69837271T2 (de) Mutanten des Thyroid-stimulierenden Hormons
DE69925116T2 (de) Neue, physiologisch aktive peptide und ihre verwendung.
US7217808B2 (en) RFRP-3 and DNA thereof
DE60129933T2 (de) Verfahren zum screening
US20020155533A1 (en) PACAP receptor protein, method for preparing said protein, and use thereof
US7662574B2 (en) Use of a G protein-coupled receptor and its cognizant ligand in the identification of compounds that affect prolactin secretion
Martínez et al. Adrenomedullin
JP4175678B2 (ja) 新規ペプチド、その製造法および用途
CA2335648A1 (en) A novel g protein-coupled receptor protein and its dna
DE60222124T2 (de) Screening-verfahren
DE60226277T2 (de) Cytotoxisches protein und dessen verwendung
CA2395714A1 (en) Novel tachykinin-like polypeptides and use thereof
CA2265458A1 (en) Novel protein, its production and use
EP1138693A1 (de) G-protein-gekoppeltes rezeptor protein und dessen dns

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee