DE60226277T2

DE60226277T2 - Cytotoxisches protein und dessen verwendung

Info

Publication number: DE60226277T2
Application number: DE60226277T
Authority: DE
Inventors: Hiroyuki Ichikawa-shi OHNO; Hiromitsu Shinjuku-ku SAISHO; Hideki Midori-ku Chiba-shi TANZAWA
Original assignee: Fourier Inc Ichikawa-shi; Fourier Inc
Current assignee: Fourier Inc Ichikawa-shi; Fourier Inc
Priority date: 2001-12-05
Filing date: 2002-12-05
Publication date: 2009-07-16
Anticipated expiration: 2022-12-06
Also published as: EP1462457A1; ES2305323T3; AU2002354096A1; PL370704A1; HRP20040442A2; KR20050044708A; JP4776166B2; KR100628917B1; EP1462457A4; EP1462457B1; RU2004117155A; BR0215114A; US20080233556A1; JPWO2003048199A1; CA2469154C; US20090208972A1; MXPA04005459A; ATE393164T1; CO5590932A2; CN1599750B

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein neues zytotoxisches Protein (M-Toxin, schleimhautzerstörendes Toxin), das von Helicobacter pylori produziert wird, und dessen Verwendung.
Technischer Hintergrund
Es gibt Überlegungen dahingehend, dass viele Magenschleimhautentzündungen, Magengeschwüre und Magenkrebserkrankungen am Menschen von Helicobacter pylori herrühren. Es wird kein spezieller direkter zytotoxischer Faktor angegeben, der die Zerstörung von Magen-Epithelzellen und irreversiblen Zelltod zu Beginn dieser Erkrankungen hervorruft. Ein Faktor, der die pH-Umgebung und Immunreaktionen im Magen verändert, ein Faktor, der durch Helicobacter pylori an Magen-Epithelzellen haftet oder die Eigenschaften von Bakterien selbst verändert, wurden als Faktoren angegeben, die derartige Krankheiten entstehen lassen. Es ist jedoch bislang unklar, ob eine Zerstörung der Magenschleimhaut, die Gastritis, Magengeschwüre und Magenkrebs auslöst, an irgendeinem Prozess beteiligt ist, oder was ein direkter verantwortlicher Faktor für die Zerstörung der Magenschleimhaut ist. Es wurde lediglich ein vakuolisierendes Toxin mit Zytotoxizität isoliert, das jedoch schwache zytotoxische Wirkung und reversible zytotoxische Wirkung aufweist. Als tödlicher zytotoxischer Faktor eines pathogenen Faktors wurde es in vivo und in vitro nicht aufgefunden.
Viele Forscher gehen davon aus, dass Helicobacter pylori – wie vorstehend beschrieben – in der Umgebung des Magens in vivo einen direkten zytotoxischen Faktor für Magenschleimhautzellen sezerniert. In Anbetracht der Bedeutung dieser Erkrankungen wurden sämtliche Sequenzen des Gens 1996 bestätigt. Trotz Verwendung von Serum ist es aufgrund der Trennungsbedingungen, unter schwierigen Kulturbedingungen und Reinigungsbedingungen, sowie unbestimm ten Bewertungssystemen des Toxins jedoch unmöglich, das vermutete Toxin zu isolieren und zu identifizieren.
Proteine von Helicobacter pylori sind offenbart in Nature 1999, Bd. 397, Nr. 6715, S. 176–180; Nature 1997, Bd. 1388, Nr. 6642, S. 539–547, WO 01/70955 A2 und WO 97/37044 A1 .
Erfindungsgemäße Problemlösungen
Ein Problem besteht darin, das für die Entstehung von Gastritis, Magengeschwüren und Magenkrebs verantwortliche Protein von Helicobacter pylori aufzufinden, ein Verfahren zur Massenherstellung des toxischen Proteins zu schaffen, das neue M-Toxin zu identifizieren sowie Diagnose- und Screening-Verfahren zu schaffen. Mit Hilfe dieser Verfahren soll das verantwortliche Toxin des zytotoxischen Faktors für Magenschleimhautzellen unter Kontrolle gebracht, Präventions- und Behandlungsmittel für Magenschleimhautentzündungen, Magengeschwüre und Magenkrebs entwickelt und ein Verfahren zur Verwendung des Toxins gefunden werden.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eingehende Untersuchungen zur Lösung des vorstehend erwähnten Problems durchgeführt und ein neues Toxin identifiziert, das irreversiblen Zelltod verursacht, wenn Helicobacter pylori unter serumfreien Bedingungen kultiviert wird, d. h., ähnlich der Umgebung im Magen und abweichend vom Normalen. Es wurde gefunden, dass dieses Toxin pro Einheit 1000 bis 100000-mal stärker toxisch ist als das vorstehend erwähnte vakuolisierende Toxin, und es verursacht irreversiblen Zelltod bei Zellen verschiedener warmblütiger Tiere, darunter nicht nur Magen-Epithelzellen, sondern auch Immunzellen. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben wiederholt Forschungen zu diesen Aspekten betrieben, um zu der vorliegenden Erfindung zu gelangen.
Die Erfindung macht insbesondere das Folgende verfügbar: (1) Ein zytotoxisches Protein, umfassend ein Protein mit der durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz. (2) Ein Teilpeptid des in Anspruch 1 beschriebenen zytotoxischen Proteins, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein die gleiche zytotoxische Aktivität wie die durch SEQ ID NO: 1 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist. (3) Das zytotoxische Protein nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Protein mit Helicobacter pylori hergestellt wird. (4) Das zytotoxische Protein nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Protein erhalten wird durch Kultivieren einer Transformante, die mit einem Rekombinationsvektor transformiert ist, der DNA der SEQ ID NO: 2 enthält, die für das zytotoxische Protein nach Anspruch 1 oder 2 codiert. (5) Das zytotoxische Protein nach Anspruch 4, wobei die Transformante beim National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (IPOD) mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-8218 hinterlegt ist. (6) Ein Antitumormittel, das das zytotoxische Protein nach Anspruch 1 oder 2 enthält. (7) Ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch ist gegen das zytotoxische Protein und erhalten wird durch Immunisierung eines Säugers mit dem zytotoxischen Protein nach Anspruch 1 oder 2. (8) Der monoklonale Antikörper nach Anspruch 7, hergestellt mit einem Hybridomklon mit der Hinterlegungsnummer FERM-BP 8222. (9) Der monoklonale Antikörper nach Anspruch 7, hergestellt mit einem Hybridomklon mit der Hinterlegungsnummer FERM-BP 8223. (10) Der monoklonale Antikörper nach Anspruch 7, hergestellt mit einem Hybridomklon mit der Hinterlegungsnummer FERM-BP 8224. (11) Ein polyklonaler Antikörper, der spezifisch ist gegen das zytotoxische Protein und erhalten wird durch Immunisierung eines Säugers mit dem zytotoxischen Protein nach Anspruch 1 oder 2. (12) Verwendung des in einem der Ansprüche 7–11 beschriebenen monoklonalen Antikörpers oder polyklonalen Antikörpers zur Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Erfassung der Konzentration des zytotoxischen Proteins nach Anspruch 1 oder 2 in einer Prüfflüssigkeit. (13) Verfahren zum Screening auf eine Verbindung, die die zytotoxische Wirkung des Proteins nach Anspruch 1 oder 2 fördert oder hemmt, wobei die die Zellvermehrung hemmende Wirkung, die zytotoxische Wirkung oder der Zelltod beurteilt wird durch Vergleich zwischen Negativ- oder Positivkontrollgruppen mit Zellen von einem warmblütigen Tier. (14) Ein Kit, umfassend das Protein nach umfassend das Protein nach Anspruch 1 oder 2, zum Screening von Verbindungen oder deren Salzen, die die zytotoxische Wirkung des Proteins nach Anspruch 1 oder 2 fördern oder hemmen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine Anionenaustauschchromatographie der in Beispiel 1 erhaltenen Probe. a zeigt die Aktivität von M-Toxin für die jeweilige Fraktion und die Extinktion des eluierten Proteins. b zeigt eine SDS-PAGE mit Silber-Anfärbung von Fraktion 16 bis Fraktion 22 bei der Chromatographie von a. c zeigt die Banden des auf eine PVDF-Membran übertragenen Protein-Toxins im Elektroblotting. d und e zeigen die morphologischen Veränderungen von HeLa-Zellen 24 Stunden nach Einwirkung von Kontrollextrakt bzw. Zytotoxin, umfassend Extrakt in einer Konzentration von 1 nM. Maßstabsbalken 50 μm.
2 zeigt die zellmorphologische Veränderung mit dem in Beispiel 3 erhaltenen genrekombinanten Toxin. a zeigt eine Negativkontrolle von HeLa-Zellen nach 6 Stunden. b und c zeigen HeLa-Zellen nach 3 Stunden und nach 6 Stunden eines 5 nM-Zusatzes von rekombinantem M-Toxin. d zeigt normale humane CRL7407-Magenzellen (ATCC) einer Negativkontrolle nach 6 Stunden. e und f zeigen CRL7407-Zellen nach 3 Stunden und 6 Stunden eines 5 nM-Zusatzes von rekombinantem M-Toxin.
3 zeigt die Empfindlichkeit mehrerer Arten von Krebszellen auf M-Toxin in Beispiel 3, bestimmt mit Hilfe der WST-Methode. Die x-Achse zeigt die Konzentration von M-Toxin in einem Substrat, und die y-Achse zeigt direkt die Extinktion bei der Wellenlänge 415 nm oder ein entsprechendes Verhältnis, wenn die Extinktion der Negativkontrolle als 100% genommen wird. HLF: Hepatom bei der Ratte. Kolon 26: Kolonkarzinom bei der Maus.
4 ist wie in 3 gezeigt. T24: humanes Blasenkarzinom. OVK18: humanes Ovarialkarzinom. KLM-1: humanes Pankreaskarzinom. A-549: humanes Lungenkarzinom. Ca9-22: humanes Gingivakarzinom. CRL1500: Brustkrebs am Menschen.
5 zeigt das Western-Blotting mit monoklonalem Antikörper, das in Beispiel 8 durchgeführt wird. Alle stärkeren Verdünnungen der kultivierten Überstände von Hybridomzellen sind 20-fach.
6 zeigt die M-Toxin-Aktivität mit Calciumalginat als Adsorptionsmittel in Beispiel 9. Die Negativkontrolle enthält als Substrat nur 10 mM Tris-Puffer, pH 7,7, und die Positivkontrolle enthält ein Substrat und 10 mM M-Toxin. Die x-Achse zeigt die Nummer der jeweiligen Fraktion, die durch die Calciumalginat-Säule läuft. Die durchschnittliche Konzentration einer jeden Fraktion beträgt 10 nM, und jede der Fraktionen hat wenigstens 10 nM oder mehr. Werden rote Blutkörperchen zerstört, so steigt die Hämoglobin-Konzentration in der Lösung. Die y-Achse zeigt die Extinktion bei 415 nm.
7 zeigt – in Beispiel 10 – die Lebensfähigkeit von HeLa-Zellen in %, wobei die M-Toxin-Hemmungswirkung durch Adsorption an Aktivkohle in Beispiel 10 gezeigt ist. Die x-Achse zeigt die Nummer der jeweiligen eluierten Fraktion der Säule. Die M-Toxin-Konzentrationen sind im Durchschnitt 10 nM und betragen jeweils wenigstens 10 nM oder mehr. Die y-Achse zeigt den Prozentanteil, der erhalten wird durch Dividieren des Werts der Toxizität der jeweiligen Fraktion durch eine Positivkontrolle, gemessen mit Hilfe eines WST-Verfahrens.
8 ist wie in 7 gezeigt. Gezeigt ist die % Lebensfähigkeit von HeLa-Zellen an CM-Cellulose und Calciumalginat, wobei auch die M-Toxin-hemmende Wirkung durch Adsorption in Beispiel 10 gezeigt ist.
Beste Art der Durchführung der Erfindung
Das erfindungsgemäße Protein mit der durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz kann ein Protein sein, das von Bakterienstämmen von Helicobacter pylori stammt, zum Beispiel NCTC 11637, NCTC 11916, DT 61A, NCTC 11639, R85-13-6P, R85-13-12F, R85-13-11P, T81213-NTB, J99-4, U2-1, 85D08, MC903, MC123, Tx30a, 26695, UA 1182 und dergleichen, oder kann ein synthetisches Protein sein.
Ein Teilpeptid des erfindungsgemäßen Proteins kann ein Teilpeptid der vorstehend erwähnten erfindungsgemäßen Proteine sein und hat vorzugsweise ähnliche Wirkungen wie die Proteine dieser Erfindung (zum Beispiel eine die Zellvermehrung hemmende Wirkung, zytotoxische Wirkung oder dergleichen). Zum Beispiel kann ein Peptid einer Aminosäuresequenz mit wenigstens 20% oder mehr, vorzugsweise 50% oder mehr, mehr bevorzugt 70% oder mehr, noch mehr bevorzugt 90% oder mehr und sehr bevorzugt 95% oder mehr der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz und mit einer die Zellvermehrung hemmenden Wirkung, zytotoxischen Wirkung oder einer zum Zelltod führenden Wirkung verwendet werden. Bei dem erfindungsgemäßen Teilpeptid kann es sich um die folgenden Peptide handeln: 1–5 (vorzugsweise 1–3) Aminosäuren in der Aminosäuresequenz sind deletiert; 1–10 (vorzugsweise 1–5, mehr bevorzugt 1–3) Aminosäuren sind an die Aminosäuresequenz addiert; 1–5 (vorzugsweise 1–3) Aminosäuren sind in die Aminosäuresequenz inseriert; oder 1–5 (vorzugsweise 1–3) Aminosäuren sind durch andere Aminosäuren substituiert.
Zwar hat das erfindungsgemäße Teilpeptid normalerweise eine Carboxyl-Gruppe (-COOH) oder ein Carboxylat (-COO-) am C-Ende, wie bei den obigen Proteinen dieser Erfindung gezeigt, doch kann das C-Ende auch ein Amid (-CONH₂) oder Ester (-COOR) sein, worin R die gleiche Bedeutung wie vorstehend gezeigt hat. Wie bei den obigen erfindungsgemäßen Proteinen gezeigt, umfasst das Teilpeptid dieser Erfindung des Weiteren ein Peptid, bei dem die Amino-Gruppe des Aminosäurerests (zum Beispiel ein Methionin-Rest) am N-Ende mit einer Schutzgruppe geschützt ist; ein Protein, bei dem der Glutaminsäurerest am N-Ende, erzeugt durch Schneiden in vivo, in eine Pyroglutaminsäure-Gruppe umgewandelt ist; ein Protein, bei dem die Substituentengruppe an der Seitenkette einer Aminosäure im Molekül mit einer geeigneten Schutzgruppe geschützt ist; oder ein konjugiertes Protein oder dergleichen aus so genannten Glycoproteinen mit daran gebundener Zuckerkette. Das erfindungsgemäße Teilpeptid kann als Antigen zum Aufbau eines Antikörpers verwendet werden, so dass eine die Zellvermehrung hemmende Wirkung, zytotoxische Wirkung oder dergleichen nicht notwendigerweise erforderlich ist.
Als Salz des erfindungsgemäßen Proteins oder Teilpeptids können Salze physiologisch annehmbarer Säuren (zum Beispiel anorganische Säuren oder organische Säuren) oder Basen (zum Beispiel Alkalimetallsalze) verwendet werden, und vorzugsweise können physiologisch annehmbare Säureadditionssalze verwendet werden. Solche Salze sind beispielsweise Salze anorganischer Säuren (zum Beispiel Salzsäure, Phosphorsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure) und organischer Säuren (zum Beispiel Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Citronensäure, Äpfelsäure, Oxasäure, Benzoesäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure). Die Proteine und Salze dieser Erfindung können mit Hilfe bekannter Herstellungsverfahren für Proteine aus irgendeiner Art von Stämmen des vorstehend erwähnten Helicobacter pylori hergestellt werden oder durch Kultivieren einer Transformante, die eine für das nachstehend erwähnte Protein codierende DNA enthält. Sie können auch hergestellt werden gemäß dem nachstehend erwähnten Verfahren zur Synthese von Peptiden. Werden die Proteine aus irgendeiner Art von Stämmen von Helicobacter pylori hergestellt, so werden die Proteine in den Bakterienzellen nach Aufbrechen mit Ultraschall abzentrifugiert, dann werden sie durch Ammoniumsulfat-Fällung oder dergleichen extrahiert, und die extrahierte Flüssigkeit wird mittels kombinierter Chromatographie wie z. B. Anionenaustauschchromatographie und hydrophobe Chromatographie gereinigt und aufgetrennt.
Bei der Synthese des erfindungsgemäßen Proteins, Teilpeptids, der Salze oder Amide derselben können handelsübliche Harze zur Synthese von Proteinen verwendet werden. Beispielhaft für solche Harze sind die folgenden Harze: Chlormethyl-Harz, Hydroxymethyl-Harz, Benzhydrylamin-Harz, Aminomethyl-Harz, 4-Benzyloxybenzylalkohol-Harz, 4-Methylbenzhydrylamin-Harz, PAM-Harz, 4-Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl-Harz, Polyacrylamid-Harz, 4-(2',4'-Dimethoxyphenylhydroxymethyl)phenoxy-Harz, 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminoethyl)phenoxy-Harz. Unter Verwendung solcher Harze werden Aminosäuren, deren Amino-Gruppen und funktionelle Gruppen der Seitenketten in geeigneter Weise geschützt sind, mit Hilfe eines bekannten Kondensationsverfahrens auf dem Harz kondensiert, um zur gewünschten Proteinsequenz zu gelangen. Am Ende der von Reaktion wird das Protein vom Harz geschnitten und einige Schutzgruppen werden entfernt. Die gewünschten Proteine oder deren Amide werden dann mit Hilfe eines Verfahrens zur Bildung innerer Disulfid-Bindungen in einer hochverdünnten Lösung erhalten. Was die vorstehend erwähnte Kondensation der geschützten Aminosäuren anbelangt, so können mehrere Arten aktiver Reagenzien für die Proteinsynthese verwendet werden, und insbesondere können Carbodiimide verwendet werden. Als solche Carbodiimide können DCC, N,N-Diisopropylcarbodiimid, N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid und dergleichen verwendet werden. Bei der Aktivierung durch diese Carbodiimide kann die geschützte Aminosäure mit einem zusätzlichen Reagens zur Beschränkung der Racemisierung (zum Beispiel HOBt oder HOOBt) direkt dem Harz zugesetzt werden oder kann dem Harz nach vorheriger Aktivierung der geschützten Aminosäure als symmetrisches Säureanhydrid oder HOBt-Ester oder HOOBt-Ester zugesetzt werden.
Als Lösungsmittel, das bei der Aktivierung der geschützten Aminosäure oder bei der Kondensation mit dem Harz verwendet wird, kann eines der bekannten Lösungsmittel ausgewählt werden, die für die Protein-Kondensationsreaktion brauchbar sind. Als solche Lösungsmittel können Säureamide wie etwa N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid und N-Methylpyrrolidon, halogenierte Kohlenwasserstoffe wie z. B. Methylenchlorid und Chloroform, Alkohole wie etwa Trifluorethanol, Sulfoxide wie etwa Dimethylsulfoxid, Pyridin, Ether wie z. B. Dioxan und Tetrahydrofuran, Nitrile wie etwa Acetonitril und Propionitril, Ester wie etwa Methylacetat und Ethylacetat und Mischungen derselben verwendet werden. Die Reaktionstemperatur wird in geeigneter Weise aus den bekannten Bereichen ausgewählt, die bei der Reaktion zur Bildung von Protein-Bindungen angewandt werden können, und wird in geeigneter Weise von –20°C~50°C ausgewählt. Die aktivierten Aminosäure-Derivate werden normalerweise mit dem 1,5- bis 4-fachen des Moläquivalents eingesetzt. Ist die Kondensation laut Testergebnis der Ninhydrin-Reaktion nicht ausreichend, so können die Kondensationsreaktionen ohne Abspaltung der Schutzgruppen wiederholt werden, um hinreichende Kondensation zu ergeben. Kann eine hinreichende Kondensation durch die wiederholten Reaktionen nicht durchgeführt werden, so werden die unumgesetzten Aminosäuren mit Acetanhydrid oder Acetylimidazol acetyliert, so dass nachfolgende Reaktionen keinen Einfluss haben.
Als Schutzgruppen für die Amino-Gruppen der Ausgangsmaterialien können zum Beispiel Z, Boc, t-Pentyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, Adamantyloxycarbonyl, Trifluoracetyl, Phthaloyl, Formyl, 2-Nitrophenylsulfenyl, Diphenylphosphinothioyl, Fmoc und dergleichen verwendet werden. Die Carboxyl-Gruppen können zum Beispiel durch Alkyl-Veresterung (zum Beispiel Alkyl-Veresterung von linearen, verzweigten oder cyclischen Ketten von Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, t-Butyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, Cyclooctyl und 2-Adamantyl), Aralkyl-Veresterung (zum Beispiel Benzyl-Ester, 4-Nitrobenzyl-Ester, 4-Methoxybenzyl-Ester, 4-Chlorbenzyl-Ester, Benzhydryl-Ester), Phenacyl-Veresterung, Benzyloxycarbonyl/Hydrierung, t-Butoxycarbonyl/Hydrierung, Trityl/Hydrierung und dergleichen geschützt werden. Die Hydroxyl-Gruppe von Serin kann beispielsweise durch Veresterung oder Veretherung geschützt werden. Als geeignete Gruppen für diese Veresterung können zum Beispiel Niederalkanoyl-Gruppen (C_1-6) wie z. B. eine Acetyl-Gruppe, eine Acyl-Gruppe wie etwa eine Benzoyl-Gruppe oder von Carbonat abgeleitete Gruppen wie z. B. eine Benzyloxycarbonyl-Gruppe und Ethoxycarbo nyl-Gruppe verwendet werden. Als Gruppen, die für eine Veretherung geeignet sind, seien eine Benzyl-Gruppe, Tetrahydropyranyl-Gruppe und t-Butyl-Gruppe beispielhaft erwähnt. Als Schutzgruppen für die phenolischen Hydroxyl-Gruppen von Tyrosin können zum Beispiel Bzl, C₁₂-Bzl, 2-Nitrobenzyl, Br-Z und t-Butyl verwendet werden. Als Schutzgruppen für das Imidazol von Histidin können zum Beispiel Tos, 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl, DNP, Benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt und Fmoc verwendet werden.
Als aktivierte Carboxyl-Gruppen der Ausgangsmaterialien können zum Beispiel entsprechende Säureanhydride, Azide und aktivierte Ester (Ester von Alkoholen, zum Beispiel Pentachlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, 2,4-Dinitrophenol, Cyanmethylalkohol, p-Nitrophenol, HONB, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid und HOBt) verwendet werden. Als aktivierte Amino-Gruppen der Ausgangsmaterialien können zum Beispiel entsprechende Phosphorsäureamide verwendet werden. Als Verfahren zur Abspaltung (Eliminierung) der Schutzgruppen kann zum Beispiel eine katalytische Reduktion in einem Wasserstoffstrom in Gegenwart eines Katalysators aus Pd-Mohr oder Pd/Kohle, eine Säurebehandlung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff, Methansulfonsäure, Trifluormethansulfonsäure, Trifluoressigsäure oder Mischungen derselben, Basenbehandlung mit Diisopropylethylamin, Triethylamin, Piperidin, Piperazin oder dergleichen oder Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak angewandt werden. Die Eliminierungsreaktion unter Anwendung der obigen Säurebehandlung wird normalerweise bei einer Temperatur von –20°C~40°C durchgeführt. Bei der Säurebehandlung ist der Zusatz eines Kationen abfangenden Reagens wie etwa Anisol, Phenol, Thioanisol, m-Kresol, p-Kresol, Dimethylsulfid, 1,4-Butandithiol oder 1,2-Ethandithiol wirksam. Die als Schutzgruppe für das Imidazol von Histidin verwendete 2,4-Dinitrophenyl-Gruppe wird durch Thiophenol-Behandlung abgespalten. Die als Schutzgruppe für das Indol von Tryptophan verwendete Formyl-Gruppe wird durch Säurebehandlung in Gegenwart des obigen 1,2-Ethandithiols, 1,4-Butandithiols oder dergleichen abgespalten, kann aber auch durch Alkalibe handlung mit einer verdünnten Natriumhydroxid-Lösung, verdünntem Ammoniak oder dergleichen abgespalten werden.
Der Schutz funktioneller Gruppen, die nicht an der Reaktion der Ausgangsmaterialien teilnehmen sollen, und die Schutzgruppen, die Eliminierung der Schutzgruppen, die Aktivierung der funktionellen Gruppen, die an der Reaktion teilnehmen, oder dergleichen können in geeigneter Weise aus bekannten Gruppen und Hilfsmitteln ausgewählt werden. Zu den weiteren Verfahren zur Gewinnung von Amiden von Proteinen zählen zum Beispiel, dass eine α-Carboxyl-Gruppe der Aminosäure mit der Carboxyl-Endgruppe durch Amidierung geschützt wird, eine Peptid-Kette (Protein) an der Seite der Amino-Kette auf die gewünschte Kettenlänge verlängert wird, ein Protein, dessen Schutzgruppe der α-Amino-Gruppe am N-Ende der Peptid-Kette eliminiert ist, und ein Protein mit einer Schutzgruppe für die Carboxyl-Gruppe am C-Ende des Peptids hergestellt werden, und beide Peptide in einer Mischlösung wie vorstehend beschrieben kondensiert werden. Die Einzelheiten der Kondensationsreaktion sind wie vorstehend erwähnt. Das durch Kondensation erhaltene geschützte Protein wird gereinigt, alle Schutzgruppen werden mit Hilfe der obigen Verfahren entfernt, und ein rohes Protein kann erhalten werden. Das rohe Protein wird mit Hilfe einer bekannten Reinigungsmethode gereinigt, die Hauptfraktionen werden lyophilisiert, und das gewünschte Amid des Proteins kann erhalten werden. Zur Gewinnung von Estern des Proteins werden zum Beispiel α-Carboxyl-Gruppen von Aminosäuren des Carboxyl-Endes mit den gewünschten Alkoholen kondensiert, um Aminosäureester zu erhalten, die Ester werden behandelt wie bei den Amiden des Proteins gezeigt und die gewünschten Ester des Proteins können erhalten werden.
Das erfindungsgemäße Teilpeptid oder dessen Salze können mit Hilfe bekannter Methoden zur Synthese von Peptiden oder durch Schneiden des erfindungsgemäßen Proteins mit einer geeigneten Peptidase hergestellt werden. Als Verfahren zur Synthese des Peptids kann zum Beispiel ein Festphasen-Synthese verfahren oder Flüssigphasen-Syntheseverfahren angewandt werden. Insbesondere wird ein Teilpeptid, welches das erfindungsgemäße Teilpeptid bilden kann, oder eine Aminosäure mit den übrigen Teilen kondensiert, wobei das Produkt eine Schutzgruppe hat, die Schutzgruppe wird eliminiert und das gewünschte Peptid kann hergestellt werden.
Als bekannte Kondensationsverfahren und zur Eliminierung der Schutzgruppen seien die folgenden Methoden beispielhaft erwähnt. M. Bodanszky und M. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966); Schroeder und Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965); Nobuo Izumiya et al., Fundament and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., (1975); Haruaki Yajima und Shunpei Sakakibara, Biochemical Experiment Lectures 1, Chemistry of Proteins IV, 205 (1977); Haruaki Yajima (Hrsg.), Continued Development of Medicines, Bd. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten. Nach der Reaktion kann das erfindungsgemäße Teilpeptid mit Hilfe üblicher Reinigungsmethoden gereinigt werden, zum Beispiel Lösungsmittelextraktion, Destillation, Säulenchromatographie, Flüssigkeitschromatographie, Umkristallisieren und Kombinationen derselben. Nach Gewinnung des Teilpeptids mit Hilfe der obigen Verfahren kann es mit Hilfe eines bekannten Verfahrens oder eines ähnlichen Verfahrens in ein geeignetes Salz überführt werden. Nach Gewinnung des Salzes des Teilpeptids kann dieses mit Hilfe eines bekannten Verfahrens oder eines ähnlichen Verfahrens in die freie Verbindung überführt werden.
Als DNA, die für das erfindungsgemäße Protein codiert, können alle Verbindungen verwendet werden, die eine für das vorstehend erwähnte Protein dieser Erfindung codierende Basensequenz enthalten. Des Weiteren kann eine genomische DNA, eine Genom-DNA-Bibliothek, die vorstehend erwähnte, von Zellen und Geweben abgeleitete cDNA, die vorstehend erwähnte, von Zellen und Geweben abgeleitete cDNA-Bibliothek oder eine synthetische DNA verwendet werden. Ein Vektor, der in der Bibliothek verwendet wird, kann jeweils ausgewählt werden aus einem beliebigen Bakteriophagen, Plasmid, Cosmid, Phagemid und dergleichen. Bei Verwendung von Gesamt-RNA oder einer mRNA-Fraktion, her gestellt aus den obigen Zellen oder Geweben, kann diese direkt mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion mit reverser Transkriptase (im Folgenden als RT-PCR-Verfahren bezeichnet) amplifiziert werden. Als DNA, die für das erfindungsgemäße Protein codiert, seien die folgenden DNAs beispielhaft erwähnt: zum Beispiel eine DNA, die eine durch SEQ ID NO: 2 dargestellte Basensequenz enthält, oder eine DNA, die eine Basensequenz aufweist, die mit einer durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Basensequenz unter hochstringenten Bedingungen hybridisiert und für das Protein codiert, das im Wesentlichen die gleiche Aktivität wie das Protein dieser Erfindung aufweist (zum Beispiel zytotoxische Aktivität).
In einer weiteren Ausführungsform kann als DNA, die für ein Protein mit der durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz codiert, die DNA mit der durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Basensequenz verwendet werden.
Als DNA, die für das erfindungsgemäße Teilpeptid codiert, kann irgendeine der DNAs verwendet werden, welche die obige Basensequenz enthalten, die für das erfindungsgemäße Teilpeptid codiert. Des Weiteren kann eine genomische DNA, eine Genom-DNA-Bibliothek, die vorstehend erwähnte, von Zellen und Geweben abgeleitete cDNA, die vorstehend erwähnte, von Zellen und Geweben abgeleitete cDNA-Bibliothek oder eine synthetische DNA verwendet werden. Als DNA, die für das erfindungsgemäße Protein codiert, seien die folgenden DNAs beispielhaft erwähnt: zum Beispiel eine DNA, mit einer DNA-Teilsequenz, die eine durch SEQ ID NO: 2 dargestellte Basensequenz aufweist, oder eine DNA mit einer DNA-Teilsequenz, die eine Basensequenz aufweist, die mit einer durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Basensequenz unter hochstringenten Bedingungen hybridisiert und für das Protein codiert, das im Wesentlichen die gleiche Aktivität wie das Protein dieser Erfindung aufweist (zum Beispiel zytotoxische Aktivität).
Als Klonierungsverfahren für die DNA, die das erfindungsgemäße Protein oder das Teilpeptid einwandfrei codiert (im Folgenden werden bei der Beschreibung der Klonierung und Expression der DNA, die für diese Proteine und dergleichen codiert, diese Proteine und dergleichen je nachdem in Kurzform als erfindungsgemäßes Protein bezeichnet), wobei ein synthetischer DNA-Primer verwendet wird, der die Teilbasensequenz des erfindungsgemäßen Proteins aufweist, dient die Amplifikation mit Hilfe eines bekannten PCR-Verfahrens, oder die in einem geeigneten Vektor kombinierte DNA wird selektioniert durch Hybridisierung mit einer DNA-Fraktion oder einer synthetischen DNA, die einen Teil oder die gesamte Region des erfindungsgemäßen Proteins codiert. Das Hybridisierungsverfahren kann beispielsweise gemäß der Beschreibung in Molecular Cloning, 2. Aufl., J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press (1989), durchgeführt werden. Wird eine im Handel erhältliche Bibliothek verwendet, so kann nach der in den beigefügten Erläuterungen beschriebenen Methode verfahren werden. Bei Veränderungen der DNA-Basensequenzen unter Verwendung eines bekannten Kits wie etwa MutanTM-G (hergestellt von Takara Shuzou Co.), MutanTM-K (hergestellt von Takara Shuzou Co.) oder dergleichen können das Gapped-Duplex-Verfahren, das Kunkel-Verfahren, bekannte Verfahren oder ähnliche Verfahren durchgeführt werden. Die das klonierte Protein codierende DNA kann so eingesetzt werden wie sie ist oder kann gewünschtenfalls mit einem Restriktionsenzym verdaut werden oder einen Linker angefügt haben. Die DNA kann ATG, GTG oder TTG als Translationsstartcodon am 5'-Ende und TAA, TGA oder TAG als Translationsterminationscodon am 3'-Ende aufweisen. Translationsstartcodon und Translationsterminationscodon können mit Hilfe eines geeigneten synthetischen DNA-Adaptors angefügt werden. Der Expressionsvektor des erfindungsgemäßen Proteins kann beispielsweise so hergestellt werden, dass (i) eine gewünschte DNA aus der DNA geschnitten wird, die für das erfindungsgemäße Protein codiert, und (ii) die DNA-Fraktion stromabwärts vom Promotor in einem geeigneten Expressionsvektor gebunden wird.
Als Vektor kann ein von Escherichia coli abgeleitetes Plasmid (wie z. B. pBR322, pBR325, pUC12, pUC13 oder pET30), ein von Bacillus subtilis abgeleitetes Plasmid (wie z. B. pUB110, pTP5 oder pC194), ein Plasmid (wie etwa pSH19, pSH15), ein von Hefe abgeleiteter Bakteriophage, ein Bakteriophage wie etwa λ-Phage, ein tierisches Virus wie z. B. ein Retrovirus, ein Vakziniavirus, ein Bacu lovirus oder dergleichen, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV oder pcDNAI/Neo verwendet werden. Als Promotor, der bei dieser Erfindung zu verwenden ist, kann jeder Promotor verwendet werden, der für den zur Expression von Genen verwendeten Wirt geeignet ist. Werden zum Beispiel tierische Zellen als Wirt verwendet, so können SRα-Promotor, früher SV40-Promotor, HIV-LTR-Promotor, CMV-Promotor oder HSV-TK-Promotor als Beispiele angeführt werden. Unter diesen Promotoren bevorzugt verwendet werden der CMV(Cytomegalovirus)-Promotor und der SRα-Promotor. Ist der Wirt eine Spezies aus der Familie Escherichia, so ist ein trp-Promotor, lac-Promotor, recA-Promotor, λPL-Promotor, lpp-Promotor oder T7-Promotor bevorzugt. Ist der Wirt eine Spezies aus der Familie Bacillus, so ist ein SPO1-Promotor, SPO2-Promotor oder penP-Promotor bevorzugt. Ist der Wirt eine Hefe, so ist ein PHO5-Promotor, PGK-Promotor, GAP-Promotor oder ADH-Promotor bevorzugt. Ist der Wirt eine Insektenzelle, so ist ein Polyhedrin-Promotor, P10-Promotor oder dergleichen bevorzugt.
Außer den obigen Vektoren können, falls gewünscht, Vektoren als Expressionsvektoren verwendet werden, die einen Enhancer, einen SV40-Replikationsstartpunkt (im Folgenden bisweilen als SV40ori abgekürzt) oder dergleichen enthalten. Als Selektionsmarker seien das Gen für das Dihydrofolsäure-Reduktionsenzym (im Folgenden bisweilen als dbfr abgekürzt; Methotrexat(MTX)-Resistenz), das Ampicillin-Resistenzgen (im Folgenden bisweilen als Ampr abgekürzt), das Neomycin-Resistenzgen (im Folgenden bisweilen als Neor abgekürzt), das G418-Resistenzgen und das Kanamycin-Resistenzgen beispielhaft erwähnt. Wird insbesondere das dhfr-Gen als Selektionsmarker verwendet, wobei Zellen des chinesischen Hamsters, denen das dhfr-Gen fehlt, verwendet werden, so können rekombinante Zellen mit Hilfe eines Mediums selektioniert werden, das kein Thymidin enthält. Falls notwendig, wird des Weiteren eine an den Wirt angepasste Signalsequenz am N-Ende des erfindungsgemäßen Proteins angefügt. Ist der Wirt eine Spezies aus der Familie Escherichia, so kann eine PhoA-Signalsequenz, OmpA-Signalsequenz oder dergleichen verwendet wer den. Ist der Wirt eine Spezies aus der Familie Bacillus, so kann eine α-Amylase-Signalsequenz, eine Subtilisin-Signalsequenz oder dergleichen verwendet werden. Ist der Wirt eine Hefe, so kann eine MFα-Signalsequenz, eine SUC2-Signalsequenz oder dergleichen verwendet werden. Ist der Wirt eine tierische Zelle, so kann eine Insulin-Signalsequenz, eine α-Interferon-Signalsequenz, eine molekulare Antikörper-Signalsequenz oder dergleichen verwendet werden. Durch Verwendung eines Vektors, der die DNA enthält, die für ein solches erfindungsgemäßes konstruiertes Protein codiert, kann eine Transformante hergestellt werden.
Als Wirt kann zum Beispiel die Gattung Escherichia, die Gattung Bacillus, eine Hefe, Insektenzellen, Insekten, tierische Zellen oder dergleichen verwendet werden. Als Ausführungsform der Gattung Escherichia kann zum Beispiel Escherichia coli K12, DH1, DH5α (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 60, 160 (1968)), JM103 (Nucleic Acids Research, Bd. 9, 309 (1981)), JA221 (Journal of Molecular Biology, Bd. 120, 517 (1978)), HB101 (Journal of Molecular Biology, Bd. 41, 459 (1969)), C600 (Genetics, Bd. 39, 440 (1954)) oder dergleichen verwendet werden. Aus der Gattung Bacillus kann zum Beispiel Bacillus subtilis MI114 (Gene, Bd. 24, 255 (1983)), 207–21 (Journal of Biochemistry, Bd. 95, 87 (1984)) oder dergleichen verwendet werden. Als Hefe kann beispielsweise Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris KM71 oder dergleichen verwendet werden.
Ist das Virus AcNPV, so können als Insektenzellen zum Beispiel Spodoptera frugiperda-Zellen, Sf-Zellen, MG1-Zellen, die aus dem Mitteldarm von Trichoplusia ni stammen, High Five^TM-Zellen, die von Eiern von Trichoplusia ni stammen, von Mamestra brassicae stammende Zellen, von Estigmena acrea stammende Zellen oder dergleichen verwendet werden. Ist das Virus BmNPV, so können Bombyx mori-Zellen, BmN-Zellen oder dergleichen verwendet werden. Als Sf-Zellen können zum Beispiel Sf9-Zellen (ATCC CRL1711), Sf21-Zellen (Vaughn, J. L. et al., In Vivo, 13, 213–217 (1977)) oder dergleichen verwendet werden. Als Insekten können beispielsweise Larven von Seidenraupen verwendet werden (Maeda et al., Nature, Bd. 315, 592 (1985)). Als tierische Zellen können zum Beispiel COS-7-Affenzellen, Vero, Zellen des chinesischen Hamsters, d. h. CHO (im Folgenden abgekürzt als CHO-Zellen), Zellen des chinesischen Hamsters CHO, denen das dhfr-Gen fehlt, (im Folgenden abgekürzt als CHO(dhfr-)-Zellen), Maus-L-Zellen, Maus-AtT-20, Maus-Myelomzellen, Ratten-GH3, humane FL-Zellen oder dergleichen verwendet werden. Zudem können etliche Arten normaler humaner Zellen verwendet werden, zum Beispiel Leberzellen, Splenozyten, Nervenzellen, Neuroglia, Milz-β-Zellen, Knochenmarkzellen, Mesangiumzellen, Langerhans-Zellen, Hautzellen, Epithelzellen, Endothel, Fibroblasten, Fibrozyten, Muskelzellen, Fettzellen, Immunzellen (zum Beispiel Makrophagen, T-Zellen, B-Zellen, natürliche Killerzellen, Mastzellen, Neutrophile, Basophile, Eosinophile, Monozyten), Megakaryozyten, Synovialzellen, Knorpel, Knochenzellen, Osteoblasten, Osteoklasten, Brustdrüsenzellen, Leberzellen, Interstitialzellen oder Vorläuferzellen, Stammzellen oder Krebszellen dieser Zellen. Was die Transformation der Gattung Escherichia anbelangt, so kann diese zum Beispiel mit Hilfe der in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 69, 2110 (1972); Gene, Bd. 17, 107 (1982); beschriebenen Methode oder dergleichen durchgeführt werden.
Was die Transformation der Gattung Bacillus anbelangt, so kann diese zum Beispiel mit Hilfe der in Molecular & General Genetics, Bd. 168, 111 (1979), beschriebenen Methode oder dergleichen durchgeführt werden. Was die Transformation der Hefe anbelangt, so kann diese zum Beispiel mit Hilfe der in Methods in Enzymology, Bd. 194, 182–187 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 75, 1929 (1978), beschriebenen Methode oder dergleichen durchgeführt werden. Was die Transformation von Insektenzellen oder Insekten anbelangt, so kann diese zum Beispiel mit Hilfe der in Biotechnology 6, 47–55 (1988), beschriebenen Methode oder dergleichen durchgeführt werden.
Was die Transformation von tierischen Zellen anbelangt, so kann diese zum Beispiel mit Hilfe der in Cell Engineering, Extraband 8, New Cell Engineering Experiment Protocol, 263–267 1995), veröffentlicht von Shujunsha; und Virology, Bd. 52, 456 (1973), beschriebenen Methode durchgeführt werden. Mit den obigen Methoden können Transformanten erhalten werden, die mit Expressionsvektoren transformiert sind, welche die für das Protein codierende DNA enthalten. Bei der Kultivierung der Transformanten, deren Wirte die Gattung Escherichia oder die Gattung Bacillus ist, ist ein flüssiges Medium als Medium geeignet, das bei der Kultivierung zu verwenden ist. Im Medium sind Kohlenstoff-Quellen, Stickstoff-Quellen, anorganische und dergleichen enthalten, die für die Vermehrung der Transformanten notwendig sind. Als Kohlenstoff-Quellen seien Glucose, Dextrin, lösliche Stärke, Sucrose oder dergleichen beispielhaft erwähnt. Als Stickstoff-Quellen können zum Beispiel anorganische oder organische Materialien wie etwa Ammonium-Salze, Nitrate, Maisquellwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakt, Bohnenstücke, Kartoffelextrakt und dergleichen verwendet werden. Als anorganische Materialien seien Calciumchlorid, Mononatriumphosphat und Magnesiumchlorid beispielhaft erwähnt. Hefeextrakt, Vitamine, wachstumsstimulierende Materialien oder dergleichen können zugesetzt werden. Vorzugsweise beträgt der pH des Mediums etwa 5–8.
Als Medium zum Kultivieren der Gattung Escherichia ist zum Beispiel ein M9-Medium bevorzugt, das Glucose und Caseinhydrolysat enthält (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431–433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972). Um eine effiziente Wirkung des Promotors zu haben, kann zum Beispiel ein Reagens wie etwa 3β-Indolylacrylsäure zugesetzt werden. Ist der Wirt von der Gattung Escherichia, so wird die Kultivierung normalerweise bei einer Temperatur von etwa 15~43°C etwa 3~24 Stunden lang durchgeführt, gegebenenfalls mit Belüftung oder Rühren. Ist der Wirt eine Spezies aus der Familie Bacillus, so wird die Kultivierung normalerweise bei einer Temperatur von etwa 30~40°C etwa 6~24 Stunden lang durchgeführt, gegebenenfalls mit Belüftung oder Rühren.
Wird eine Transformante kultiviert, deren Wirt Hefe ist, so sei als Medium ein Burkholder-Minimalmedium (Bostian, K. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 77, 4505 (1980)) oder ein SD-Medium, das 0,5% Caseinhydrolysat enthält (Bitter, G. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81, 5330 (1984)) beispielhaft erwähnt. Vorzugsweise beträgt der pH des Mediums etwa 5–8. Die Kultivierung wird normalerweise bei einer Temperatur von etwa 20~35°C etwa 24~72 Stunden lang durchgeführt, gegebenenfalls mit Belüftung oder Rühren. Wird eine Transformante kultiviert, deren Wirt eine Insektenzelle oder ein Insekt ist, so kann als Medium Grace's Insekt Medium (Grace, T. C. C., Nature, 195, 788 (1962)) verwendet werden, indem in geeigneter Weise immobilisiertes 10% Rinderserum oder dergleichen zugesetzt wird. Vorzugsweise beträgt der pH des Mediums etwa 6,2 bis 5,4. Die Kultivierung wird normalerweise bei einer Temperatur von etwa 27°C etwa 3~5 Tage lang durchgeführt, gegebenenfalls mit Belüftung oder Rühren. Bei einer Transformante, deren Wirt eine tierische Zelle ist, kann als Medium beispielsweise ein MEM-Medium, das etwa 5–20% fetales Kälberserum enthält (Science, Bd. 122, 501 (1952)), ein DMEM-Medium (Virology, Bd. 8, 396 (1959)), ein RPMI 1640-Medium (The Journal of the American Medical Association, Bd. 199, 519 (1967)), ein 199-Medium (Proceeding of the Society for the Biological Medicine, Bd. 73, 1 (1950)) oder dergleichen verwendet werden. Vorzugsweise beträgt der pH des Mediums etwa 6–8. Die Kultivierung wird normalerweise bei einer Temperatur von etwa 30~40°C etwa 15~60 Stunden lang durchgeführt, gegebenenfalls mit Belüftung oder Rühren. Wie vorstehend beschrieben, kann das erfindungsgemäße Protein aus den Zellen der Transformanten hergestellt werden.
Zur Trennung und Reinigung des erfindungsgemäßen Proteins können zum Beispiel die folgenden Methoden in geeigneter Weise angewandt werden. Bei der Extraktion des erfindungsgemäßen Proteins aus den kultivierten Spezies oder Zellen nach der Kultivierung werden die Spezies oder Zellen mit Hilfe eines bekannten Verfahrens gewonnen, in einem geeigneten Puffer suspendiert und mittels Ultraschall, Lysozym und/oder Gefrieren/Auftauen oder dergleichen zerstört.
Anschließend wird die rohe extrahierte Flüssigkeit mit Protein durch Zentrifugation oder Filtration erhalten. Im Puffer kann ein Protein-Denaturierungsmittel wie etwa Harnstoff oder Guanidin-hydrochlorid oder ein oberflächenaktives Mittel wie z. B. Triton X-100^TM enthalten sein. Ist das Protein nach Beendigung der Kultivierung in die Medium-Flüssigkeit sezerniert, werden die Spezies oder Zellen und der Überstand mit Hilfe eines bekannten Verfahrens getrennt, und der Überstand wird gewonnen. Der so erhaltene Kulturüberstand oder das in der extrahierten Flüssigkeit enthaltene Protein wird mit Hilfe einer Kombination bekannter Trennungs- und Reinigungsverfahren gereinigt. Bei diesen bekannten Trennungs- und Reinigungsverfahren handelt es sich um Verfahren unter Nutzung von Aussalztechniken oder Löslichkeiten in einem Lösungsmittelfällungsverfahren, ein Dialyse-Verfahren, ein Verfahren unter Nutzung der unterschiedlichen Molekulargewichte wie etwa Ultrafiltration und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder dergleichen, ein Verfahren unter Nutzung von Ladungsunterschieden wie z. B. Ionenaustauschchromatographie, ein Verfahren unter Nutzung der unterschiedlichen Hydrophobie wie z. B. hydrophobe Chromatographie, ein Verfahren unter Nutzung der spezifischen Affinität wie etwa die Affinitätschromatographie, ein Verfahren unter Nutzung der unterschiedlichen Hydrophobie wie z. B. die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, ein Verfahren unter Nutzung von unterschiedlichen isoelektrischen Punkten wie etwa die Isoelektrophorese.
Wird ein solches Protein in freier Form erhalten, so kann es mit Hilfe eines bekannten Verfahrens oder eines ähnlichen Verfahrens in ein Salz überführt werden. Wird das Protein dagegen in Form eines Salzes erhalten, so kann dieses mit Hilfe eines bekannten Verfahrens oder eines ähnlichen Verfahrens in die freie Form oder ein anderes Salz überführt werden. Ein rekombinant hergestelltes Protein kann zudem vor oder nach der Reinigung des Proteins mit einem geeigneten Protein-Modifikationsenzym umgesetzt werden, um das Polypeptid gegebenenfalls zu modifizieren oder teilweise zu entfernen. Als Protein-Modifikationsenzym kann zum Beispiel Trypsin, Chymotrypsin, Arginylendopeptidase, Proteinkinase, Glycosidase oder dergleichen verwendet werden. Die Aktivität des so erhaltenen erfindungsgemäßen Proteins oder der Salze desselben kann mit Hilfe eines Bindungsexperiments mit einem markierten Liganden und Enzymimmunassay unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers oder dergleichen bestimmt werden.
Bei den Antikörpern für das Protein, das Teilpeptid oder die Salze dieser Erfindung kann es sich um einen polyklonalen Antikörper oder monoklonalen Antikörper handeln, mit der Maßgabe, dass die Antikörper das Protein, das Teilpeptid und die Salze erkennen können. Die Antikörper für das Protein, das Teilpeptid oder die Salze dieser Erfindung (in der folgenden Beschreibung der Antikörper kann dieses Protein und dergleichen kurz als erfindungsgemäßes Protein bezeichnet werden) können hergestellt werden durch Verwendung des Proteins als Antigen und mit Hilfe eines bekannten Herstellungsverfahrens für Antikörper oder Antiserum.
Herstellung eines monoklonalen Antikörpers
(a) Produktion von Zellen für die Herstellung monoklonaler Antikörper:
Das erfindungsgemäße Protein wird alleine oder mit einem Träger oder Verdünnungsmittel einem warmblütigen Tier an einer Stelle verabreicht, wo ein Antikörper aufgrund der Verabreichung entstehen kann. Zur Verbesserung der Wirksamkeit der Antikörperproduktion bei der Verabreichung kann komplettes Freundsches Adjuvans oder inkomplettes Freundsches Adjuvans verabreicht werden. Die Verabreichung erfolgt normalerweise einmal je 2~6 Wochen und insgesamt 2~10-mal. Die warmblütigen Tiere sind zum Beispiel Affen, Kaninchen, Hunde, Meerschweinchen, Mäuse, Ratten, Schafe, Ziegen, Hühner und dergleichen, vorzugsweise Mäuse und Ratten. Bei der Herstellung von Zellen zur Produktion eines monoklonalen Antikörpers wird das warmblütige Tier mit einem Antigen immunisiert, wobei zum Beispiel Mäuse verwendet werden. Eine Maus mit erkennbarem Antikörperwert wird aus den Mäusen ausgewählt, die Milz oder Lymphe wird 2~5 Tage nach der abschließenden Immunisierung entnommen, und die in der Milz oder Lymphe enthaltenen Zellen für die Produktion monoklonaler Antikörper werden mit Myelom-Zellen der gleichen oder einer anderen Tierart fusioniert, um ein Hybridom für die Produktion eines monoklonalen Antikörpers herzustellen. Der Antikörperwert im Antiserum kann beispielsweise mit Hilfe eines Verfahrens bestimmt werden, bei dem das Antiserum mit einem nachstehend angegebenen markierten Protein umgesetzt und die Aktivität des an den Antikörper gebundenen markierten Agens gemessen wird. Der Fusionsvorgang kann mit Hilfe eines bekannten Verfahrens erfolgen, beispielsweise mit dem Verfahren von Kohler und Milstein (Nature 256. 495 (1975)). Als fusionsförderndes Mittel kann zum Beispiel Polyethylenglycol (PEG), Sendai-Virus oder dergleichen verwendet werden, vorzugsweise PEG.
Als Myelome seien etwa Myelom-Zellen von warmblütigen Tieren wie z. B. NS-1, P3U1, SP2/0 und AP 1 beispielhaft erwähnt, wobei P3U1 bevorzugt ist. Das bevorzugte Verhältnis der Anzahl Antikörper produzierender Zellen (Milzzellen) zur Anzahl der Myelom-Zellen beträgt etwa 1:1~20:1. PEG (vorzugsweise PEG1000–PEG6000) wird in einer Konzentration von etwa 10~80% zugesetzt, und das Inkubieren wird bei einer Temperatur von 20~40°C, vorzugsweise 30~37°C 1~10 Minuten lang durchgeführt, womit die Zellfusion effizient erfolgt. Beim Screening eines Hybridoms aus der Produktion monoklonaler Antikörper können mehrere Arten von Verfahren angewandt werden, zum Beispiel ein Verfahren, bei dem ein Überstand einer Hybridom-Kultur einer festen Phase zugesetzt wird (etwa einer Mikrotiterplatte), die ein Proteinantigen direkt oder über einen Träger adsorbiert, und ein Immunglobulin-Antikörper, der mit einem radioaktiven Material oder einem Hefeenzym markiert ist (sind die Zellen zur Verwendung bei der Zellfusion von einer Maus, so wird ein Anti-Maus-Immunglobulin verwendet), oder Protein A zugesetzt wird, um so den an die feste Phase gebundenen monoklonalen Antikörper nachzuweisen; sowie ein Verfahren, bei dem ein Überstand einer Hybridom-Kultur einer festen Phase zugesetzt wird, die einen Immunglobulin-Antikörper oder Protein A adsorbiert, ein mit radioaktivem Material oder einem Hefeenzym markiertes Protein zugesetzt wird, und der an die feste Phase gebundene monoklonale Antikörper nachgewiesen wird. Die Se lektion des monoklonalen Antikörper kann mit Hilfe eines bekannten Verfahrens oder eines ähnlichen Verfahrens durchgeführt werden. Normalerweise wird diese mit Hilfe eines Mediums für tierische Zellen durchgeführt, dem HAT (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin) zugesetzt wird. Als Medium für die Selektion und Vermehrung kann jedes Medium verwendet werden, in dem das Hybridom sich vermehren kann. Beispielsweise kann ein RPMI-1640 Medium verwendet werden, das 1~20%, vorzugsweise 10~20% fetales Kälberserum enthält, ein GIT-Medium, das 1~10% fetales Kälberserum enthält (hergestellt von Wako Junyaku Kougyou Co.), oder ein Medium, das kein Serum für die Hybridom-Kultivierung enthält (SFM-101, Nissui Seiyaku Co.). Die Kultivierungstemperatur beträgt normalerweise 20~40°C, vorzugsweise etwa 37°C. Die Kultivierungszeit ist normalerweise 5 Tage~3 Wochen, vorzugsweise 1 Woche~2 Wochen. Die Kultivierung wird normalerweise in 5% Kohlendioxid durchgeführt. Der Antikörperwert des Überstands der Hybridom-Kultur kann bestimmt werden wie bei der vorstehend erwähnten Methode zur Messung des Antikörperwerts im Antiserum gezeigt.
(b) Reinigung des monoklonalen Antikörpers:
Die Abtrennung und Reinigung des monoklonalen Antikörpers kann mit Hilfe eines bekannten Verfahrens durchgeführt werden, beispielsweise mit einem Trennungs- und Reinigungsverfahren für Immunglobuline (etwa ein Aussalzverfahren, ein Verfahren mit Alkoholfällung, ein isoelektrisches Fällungsverfahren, ein Elektrophorese-Verfahren, ein Adsorptions-/Desorptionsverfahren mit einem Ionenaustauscher (zum Beispiel DEAE), ein Ultrazentrifugierverfahren, ein Gelfiltrationsverfahren oder ein spezielles Reinigungsverfahren, bei dem nur solche Antikörper gewonnen werden, die an ein aktives Adsorptionsmittel wie z. B. eine Antigen bindende feste Phase oder Protein A oder Protein G binden, und die Bindung gelöst wird, um den Antikörper zu erhalten).
Herstellung des polyklonalen Antikörpers
Der erfindungsgemäße polyklonale Antikörper kann mit Hilfe eines bekannten Verfahrens oder eines ähnlichen Verfahrens hergestellt werden. Unter Verwendung eines Immunantigens (Proteinantigen) selbst oder eines Komplexes aus Immunantigen und einem Trägerprotein wird beispielsweise ein warmblütiges Tier immunisiert, wobei das gleiche Verfahren wie bei dem vorstehend erwähnten Verfahren zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers angewandt wird, die den Antikörper für das erfindungsgemäße Protein enthaltenden Materialien werden gewonnen und der Antikörper wird abgetrennt und gereinigt. Was den Komplex aus Immunantigen zum Immunisieren des warmblütigen Tiers und Trägerprotein anbelangt, so sind die Art des Trägerproteins und das Mischungsverhältnis von Träger zu Hapten nicht von Bedeutung, vorausgesetzt, dass der Antikörper für das Hapten effizient hergestellt werden kann, wobei die Immunisierung durch Vernetzung mit dem Träger erfolgt. Zum Beispiel kann Rinderserumalbumin, Rindercycloglobulin, Hämocyanin oder dergleichen zur Bindung mit dem Hapten in einem Gewichtsverhältnis von etwa 0,1~20, vorzugsweise etwa 1~5 zu 1 Teil Hapten verwendet werden. Zur Bindung von Hapten und Träger können mehrere Arten von Kondensationsmitteln wie etwa aktive Esteragenzien, enthaltend Glutaraldehyd, Carbodiimid, aktive Maleinimidester, eine Thiol-Gruppe und eine Dithiopyridyl-Gruppe verwendet werden. Die Produkte aus der Kondensation werden alleine oder mit einem Träger oder Verdünnungsmittel denjenigen Teilen eines warmblütigen Tiers verabreicht, die imstande sind, den Antikörper zu produzieren. Zur Verbesserung der Wirksamkeit der Antikörperproduktion bei der Verabreichung kann komplettes Freundsches Adjuvans oder inkomplettes Freundsches Adjuvans verabreicht werden. Die Verabreichung erfolgt normalerweise einmal je 2~6 Wochen und insgesamt 3~10-mal. Der polyklonale Antikörper kann aus Blut, Aszites, vorzugsweise aus dem Blut des warmblütigen Tiers gewonnen werden, das mit Hilfe des obigen Verfahrens immunisiert ist. Der Wert des polyklonalen Antikörpers im Antiserum wird mit Hilfe des gleichen Verfahrens bestimmt, das bei der obigen Bestimmung des Antikörperwerts im Antiserum beschrieben ist. Die Trennung und Reinigung des polyklonalen Antikörpers kann mit Hilfe des gleichen Verfahrens der Trennung und Reinigung von Immunglobulin wie bei der obigen Trennung und Reinigung des monoklonalen Antikörpers erfolgen.
Die Behandlungsmittel, die das erfindungsgemäße Protein oder Teilpeptid und das erfindungsgemäße Protein und dergleichen enthalten, haben zytotoxische Wirkung gegen Krebs, so dass diese Mittel als Mittel zur Extraktion von erkranktem Gewebe (der Extrakt enthält Gesamt- und Teil-, vorzugsweise Teilextrakt) und insbesondere zur Behandlung von ortsfestem Krebs verwendet werden können. Wird das erfindungsgemäße Protein und dergleichen als Mittel zur Behandlung und Prävention verwendet, so wird es dann verwendet, wenn es zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95% oder mehr, mehr bevorzugt 98% oder mehr und besonders bevorzugt 99% oder mehr gereinigt ist.
Die hemmende Wirkung des erfindungsgemäßen Proteins auf die Proliferation von Krebszellen oder dergleichen kann mit Hilfe eines bekannten Verfahrens bestimmt werden, oder die zytotoxische Wirkung oder die zum Zelltod führende Wirkung wird mit Hilfe eines bekannten Verfahrens oder eines ähnlichen Verfahrens bestimmt, vorzugsweise mit Hilfe des Verfahrens, das in den nachstehend angegebenen Experimenten beschrieben ist. Als Testverbindungen seien Peptide, Proteine, Nichtpeptid-Verbindungen, synthetische Verbindungen, Fermentationsprodukte, Zellextrakte, Pflanzenextrakte, Extrakte tierischer Gewebe und Blutplasma beispielhaft erwähnt. Diese Verbindungen können neue Verbindungen oder bekannte Verbindungen sein.
Die Verbindungen oder die Salze, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Screening-Verfahrens oder des Kits für das Screening erhalten werden, sind ausgewählt aus den obigen Testverbindungen, zum Beispiel Peptide, Proteine, Nichtpeptid-Verbindungen, synthetische Verbindungen, Fermentationsprodukte, Zellextrakte, Pflanzenextrakte, Extrakte tierischer Gewebe und Blutplasma. Diese Verbindungen haben eine Wirkung, die die zytotoxische Wirkung des erfindungsgemäßen Proteins oder dergleichen oder die hemmende Wirkung des erfindungsgemäßen Proteins auf die Proliferation von Krebszellen oder derglei chen hemmt. Als Salze dieser Verbindungen können Salze verwendet werden, die den Salzen des erfindungsgemäßen Proteins ähnlich sind.
Werden die mit dem Screening-Verfahren oder dem Screening-Kit erhaltenen Verbindungen als die obigen Behandlungsmittel verwendet, so können sie in der üblichen Weise eingesetzt werden. Zum Beispiel werden sie als Tabletten, Kapseln, Elixiere, Mikrokapseln, sterile Lösungen, Suspensionen oder dergleichen verwendet. Da die erhaltenen pharmazeutischen Präparate unbedenklich sind und geringe Toxizität aufweisen, können sie beispielsweise einem Menschen oder warmblütigen Tier (etwa Mäusen, Ratten, Kaninchen, Ziegen, Schweinen, Kühen, Pferden, Vögeln, Katzen, Hunden, Affen und dergleichen) verabreicht werden. Die Dosisgewichte der Verbindungen oder der Salze derselben richten sich nach der Wirkung, der Krankheit, dem Verabreichungsweg oder dergleichen. Bei Erwachsenen (mit einem angenommenen Gewicht von 60 kg) können etwa 0,1~100 mg Verbindung pro Tag, vorzugsweise etwa 1,0~50 mg, mehr bevorzugt etwa 1,0~20 mg verabreicht werden. Bei parenteraler Verabreichung beträgt die Dosierung der Verbindungen, die je nach Zielstellung, Krankheit und dergleichen variabel ist, bei einem Erwachsenen (mit einem angenommenen Gewicht von 60 kg) normalerweise und in geeigneter Weise etwa 0,01~30 mg Verbindung pro Tag, vorzugsweise etwa 0,1~20 mg, mehr bevorzugt etwa 0,1~10 mg durch intravenöse Injektion. Bei den anderen Tieren kann die auf das angenommene Gewicht von 60 kg bezogene Dosierung verwendet werden.
Screening von Kandidaten-Verbindungen als Medizin für Krankheiten: Da das erfindungsgemäße Protein oder dergleichen zytotoxische Wirkung aufweist, können die Verbindungen oder die Salze, die die Funktion (etwa zytotoxische Wirkung) des erfindungsgemäßen Proteins oder dergleichen fördern, beispielsweise als Mittel zur Behandlung von Krebs eingesetzt werden. Zum anderen können die Salze, welche die Funktion des erfindungsgemäßen Proteins oder dergleichen hemmen, beispielsweise als Mittel zur Behandlung und Prävention von Magenschleimhautentzündungen und Magengeschwüren eingesetzt werden. Demgemäß wird das erfindungsgemäße Protein oder dergleichen wir kungsvoll als Reagens zum Screening von Verbindungen oder Salzen verwendet, welche die Funktion des erfindungsgemäßen Proteins oder dergleichen fördern oder hemmen.
Insbesondere macht diese Erfindung (1) ein Screening-Verfahren verfügbar, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein oder das Teilpeptid oder die Salze dieser Erfindung verwendet werden und das Verfahren die Verbindungen screent, welche die Funktion (etwa zytotoxische Wirkung) des Proteins oder des Teilpeptids oder der Salze dieser Erfindung fördern, oder das Verfahren die Verbindungen screent, welche die Funktion (etwa zytotoxische Wirkung) des Proteins oder des Teilpeptids oder der Salze dieser Erfindung hemmen. Verbindungen, welche die Funktion fördern, können in Kurzform als "Promotoren" bezeichnet werden, und Verbindungen, welche die Funktion hemmen, werden im Folgenden mit der Kurzform "Hemmer" bezeichnet.
Zudem stellt die Erfindung (2) ein Kit zum Screening von Promotoren oder Hemmern bereit, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein oder das Teilpeptid oder die Salze dieser Erfindung enthalten sind. Das obige Kit kann im Folgenden kurz mit "erfindungsgemäßes Screening-Kit" bezeichnet sein.
In einer Ausführungsform, beispielsweise (1) oben, wird ein Screening-Verfahren auf Promotoren oder Hemmer bereitgestellt, dadurch gekennzeichnet, dass ein Vergleich zwischen Fall (i) und Fall (ii) angestellt wird. Der Fall (i) ist derjenige, dass das Protein oder das Teilpeptid oder die Salze dieser Erfindung mit einer Zelle in Kontakt gebracht werden, die eine normale Zelle ist, umfassend eine Blutzelle, die von einem Gewebe des obigen warmblütigen Tiers (vorzugsweise von einem Menschen) stammt, oder die vorstehend erwähnte Krebszelle. Der Fall (ii) ist derjenige, dass das Protein oder das Teilpeptid oder die Salze dieser Erfindung mit einer Zelle, die eine normale Zelle ist, umfassend eine Blutzelle, die von einem Gewebe des obigen warmblütigen Tiers (vorzugsweise von einem Menschen) stammt, oder die vorstehend erwähnte Krebszelle, und einer Testverbindung in Kontakt gebracht werden.
In einer weiteren Ausführungsform in (2) oben wird ein Kit zum Screening von Promotoren oder Hemmern bereitgestellt, dadurch gekennzeichnet, dass es das Protein oder das Teilpeptid oder die Salze dieser Erfindung sowie eine Zelle, die eine normale Zelle ist, umfassend eine Blutzelle, die von einem Gewebe des obigen warmblütigen Tiers (vorzugsweise von einem Menschen) stammt, oder die vorstehend erwähnte Krebszelle oder dergleichen enthält.
Weiterhin sind bei dem Screening-Verfahren die Fälle (i) und (ii) konkret dadurch gekennzeichnet, dass die zytotoxische Wirkung des erfindungsgemäßen Proteins und dergleichen bestimmt und verglichen wird.
Die zytotoxische Wirkung, Zellvermehrung hemmende Wirkung und zum Zelltod führende Wirkung des erfindungsgemäßen Proteins oder dergleichen kann mit Hilfe eines bekannten Verfahrens oder eines ähnlichen Verfahrens bestimmt werden. Mit etablierten Zelllinien und dergleichen, einem Substrat, das die Testverbindung enthält, einer Negativkontrolle, welche ein Substrat ist, das keine Testverbindung enthält, und einer Positivkontrolle, welche ein Substrat ist, das M-Toxin enthält, werden jedoch konkret diese drei oder zwei verwendet. Durch Vergleichen der Zellenzahl unter Bedingungen, die für eine statistische Signifikanz hinreichend sind, kann die hemmende Wirkung aufgrund der zytotoxischen Wirkung oder der die Zellvermehrung hemmenden Wirkung oder eine spezielle Probe mit hemmender Wirkung aufgrund der zytotoxischen Wirkung oder der die Zellvermehrung hemmenden Wirkung durch die Gegenwart oder Abwesenheit dieser Wirkungen oder deren Zunahme oder Abnahme nachgewiesen werden. Die bei dem Nachweisverfahren verwendeten Zellen sind zum Beispiel normale Zellen, umfassend eine Blutzelle, die von einem Gewebe des obigen warmblütigen Tiers (vorzugsweise von einem Menschen) stammt, oder die vorstehend erwähnten Krebszellen von mehreren Arten warmblütiger Tiere (zum Beispiel Karzinom des Endometriums, Endometriom, Brustkrebs, Magenkrebs, Leberkarzinom, Milzkrebs, Karzinom der Gallenblase, Kolonkarzinom, Prostatakarzinom, Lungenkrebs, Nierenkarzinom, Neuroblastom, Harnblasenkrebs, malignes Melanom, Zungenkrebs, Gingivakarzinom, Karzinome an Maus-Fibroblasten, den Nieren der afrikanischen grünen Meerkatze, der Leber von Ratten und dergleichen).
Als Testverbindungen seien Peptide, Proteine, Nichtpeptid-Verbindungen, synthetische Verbindungen, Fermentationsprodukte, Zellextrakte, Pflanzenextrakte, Extrakte tierischer Gewebe und dergleichen beispielhaft erwähnt. Diese Verbindungen können neue Verbindungen oder bekannte Verbindungen sein. Zur Durchführung des obigen Screening-Verfahrens wird das erfindungsgemäße Protein oder dergleichen in einem für das Screening geeigneten Puffer suspendiert, und die Proben des erfindungsgemäßen Proteins oder dergleichen werden hergestellt. Als Puffer kann ein Phosphat-Puffer mit einem pH von etwa 4~10 (vorzugsweise etwa pH 6~8), Tris-hydrochlorid-Puffer oder dergleichen verwendet werden, der die Reaktion des erfindungsgemäßen Proteins oder dergleichen und der Testverbindungen nicht hemmt.
Beispielhaft erwähnt als konkretes Screening-Verfahren nach der Screening-Prüfung sei ➀ ein Verfahren zur direkten Beobachtung der Zellveränderungen unter einem Mikroskop und Zählung der Zellen mit einem Hämozytometer oder dergleichen; ➁ ein Verfahren, bei dem die Veränderungen bei Kalium, Hämoglobinen und dergleichen erfasst werden, die aufgrund des Zelltods aus den Zellen heraus gelangen; ➂ ein Verfahren zur Bestimmung der verbleibenden Zellen nach Reaktion mit Tetrazolium-Salzen oder dergleichen; ➃ ein Verfahren zur Bestimmung der verbleibenden lebenden Zellen mit einer radioaktiv markierten Substanz; ➄ ein Verfahren zur Bestätigung des Zelltods durch Induktion von Zellapoptose und dergleichen. Als Verbindung, welche die zytotoxische Wirkung des erfindungsgemäßen Proteins oder dergleichen erhöht, kann beispielsweise eine Testverbindung ausgewählt werden, bei der die zytotoxische Wirkung im obigen Fall (ii) im Vergleich zu dem obigen Fall (i) um etwa 20% oder mehr, vorzugsweise 30% oder mehr, mehr bevorzugt 50% oder mehr erhöht wird. Zum anderen kann als Verbindung, welche die zytotoxische Wirkung des erfindungsgemäßen Proteins oder dergleichen hemmt, eine Testverbindung ausgewählt werden, bei der die zytotoxische Wirkung im obigen Fall (ii) im Vergleich zu dem obigen Fall (i) zu etwa 20% oder mehr, vorzugsweise 30% oder mehr, mehr bevorzugt 50% oder mehr gehemmt wird. Diese können als Verfahren zum Screening mit hohem Durchsatz durchgeführt werden. Im Folgenden wird als Verfahren O ein Verfahren zur Bestimmung von Hämoglobinen durch hämolytische Reaktion und als Verfahren ➂ ein WST-Verfahren verwendet. Bei diesen Verfahren werden CM-Cellulose und Calciumalginat als Adsorptionsmittel ausgewählt, welche die Anti-M-Toxin-Aktivität zeigen.
Des Weiteren ist es möglich, die Lösungen, die diese Anion-Kontrolle, Positivkontrolle und Testverbindungen enthalten, zu untersuchen und mit Tiermodellen zu vergleichen, um die Wirkungen der Tiertiter der Anti-M-Toxin-Materialien zu bestätigen. In diesen Fällen können viele Arten warmblütiger Tiere verwendet werden. Insbesondere können Maus, Ratte, Hund und Affe verwendet werden. Als Infektionsmodelle werden mongolische Wüstenmaus, Maus und Affe wirkungsvoll eingesetzt.
Werden die mit dem erfindungsgemäßen Screening-Verfahren oder Screening-Kit erhaltenen Verbindungen als die obigen Mittel zur Behandlung und Prävention verwendet, so können diese Verbindungen in der üblichen Weise eingesetzt werden. Unter Anwendung der gleichen Verfahren der pharmazeutischen Zubereitung des erfindungsgemäßen Proteins werden sie beispielsweise als Tabletten, Kapseln, Elixiere, Mikrokapseln, sterile Lösungen, Suspensionen oder dergleichen verwendet. Da die erhaltenen Präparate unbedenklich sind und geringe Toxizität aufweisen, können sie beispielsweise einem Menschen oder warmblütigen Tier (etwa Mäusen, Ratten, Kaninchen, Ziegen, Schweinen, Kühen, Pferden, Vögeln, Katzen, Hunden, Affen und dergleichen) verabreicht werden. Die Dosisgewichte der Verbindungen oder der Salze derselben richten sich nach der Wirkung, der Krankheit, dem Verabreichungsweg oder dergleichen. Werden die Verbindungen zur Verstärkung der Funktion des erfindungsgemäßen Proteins oder dergleichen als Geweberegenerationsmittel nach Entnahme des erkrankten Gewebes verwendet, so können bei Erwachsenen (mit einem angenommenen Gewicht von 60 kg) etwa 0,1~100 mg Verbindung pro Tag, vorzugsweise etwa 1,0~50 mg, mehr bevorzugt etwa 1,0~20 mg oral verabreicht werden. Bei den anderen Tieren kann die auf das angenommene Gewicht von 60 kg bezogene Dosierung verwendet werden.
Quantifizierung des Proteins oder des Teilpeptids oder der Salze dieser Erfindung:
Die Antikörper für das erfindungsgemäße Protein und dergleichen (im Folgenden bisweilen in Kurzform als erfindungsgemäße Antikörper bezeichnet) können das erfindungsgemäße Protein und dergleichen spezifisch erkennen und können daher zur Quantifizierung des erfindungsgemäßen Proteins und dergleichen in einer Prüfflüssigkeit verwendet werden, insbesondere zur Quantifizierung mit Hilfe einer Sandwich-Immuntechnik. Insbesondere macht die Erfindung (i) ein Verfahren zur Quantifizierung des erfindungsgemäßen Proteins und dergleichen in einer Prüfflüssigkeit verfügbar, dadurch gekennzeichnet, dass der erfindungsgemäße Antikörper und die Prüfflüssigkeit und das erfindungsgemäße Protein und dergleichen kompetitiv zur Reaktion gebracht und die Anteile des erfindungsgemäßen markierten Proteins, die an den Antikörper binden, bestimmt werden; und (ii) ein Verfahren zur Quantifizierung des erfindungsgemäßen Proteins und dergleichen in einer Prüfflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass die Prüfflüssigkeit und der auf einem Träger insolubilisierte Antikörper und der andere erfindungsgemäße markierte Antikörper gleichzeitig oder kontinuierlich umgesetzt werden und anschließend die Aktivität des Markierungsmittels auf dem unlöslichen Träger bestimmt wird. Bei dem obigen quantitativen Verfahren (ii) ist ein Antikörper vorzugsweise ein solcher Antikörper, der das N-Ende des erfindungsgemäßen Proteins und dergleichen erkennt, und der andere Antikörper ist ein Antikörper, der mit dem C-Ende des erfindungsgemäßen Proteins und dergleichen reagiert.
Mit einem monoklonalen Antikörper für das erfindungsgemäße Protein und dergleichen (im Folgenden bisweilen in Kurzform als erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper bezeichnet) kann zudem die Quantifizierung des erfindungsgemäßen Proteins und dergleichen durchgeführt werden, und weiterhin kann der Nachweis mittels Gewebeanfärbung durchgeführt werden. Hierzu können die Antikörpermoleküle selbst oder es kann eine F(ab')₂-, Fab'- oder Fab-Fraktion der Antikörpermoleküle verwendet werden. Die Quantifizierung des erfindungsgemäßen Proteins und dergleichen, das bei dieser Erfindung Verwendung findet, sollte keinen Einschränkungen unterliegen. Die Menge an Antikörper, Antigen oder Antikörper-Antigen-Komplex, die der Antigen-Menge (zum Beispiel die Menge an Protein) in der Prüfflüssigkeit entspricht, wird chemisch oder physikalisch nachgewiesen, wobei die erhaltene Menge mit Hilfe einer Standardkurve bestimmt wird, die sich mit einer Standardflüssigkeit ergibt, welche das Antigen in einer bekannten Menge enthält. Beispielsweise sind Nephelometrie, kompetitive Verfahren, immunometrische Verfahren und Sandwich-Verfahren bevorzugt anwendbar. Im Hinblick auf die Empfindlichkeit und Spezifität ist das nachstehend dargestellte Sandwich-Verfahren bevorzugt. Als Markierungsmittel, die bei einem Bestimmungsverfahren mit einer markierten Substanz verwendet werden, seien radioaktive Isotope, Enzyme, fluoreszierende Substanzen, lumineszente Substanzen und dergleichen beispielhaft erwähnt. Als radioaktive Isotope können zum Beispiel [¹²⁵I], [¹³¹I], [³H], [¹⁴C] verwendet werden. Als Enzyme können stabile und hochaktive Enzyme wie zum Beispiel β-Galactosidase, β-Glucosidase, alkalische Phosphatase, Peroxidase, Dehydrogenase für Äpfelsäure und dergleichen verwendet werden. Als fluoreszierende Substanz kann zum Beispiel Fluorescamin, Fluoresceinisothiocyanat und dergleichen verwendet werden. Als lumineszente Substanzen können beispielsweise Luminol, Luminol-Derivate, Luciferin, Lucigenin und dergleichen verwendet werden. Zur Bindung eines Antikörpers oder Antigens und eines Markierungsmittels kann zudem eine solche vom Biotin/Avidin-Typ verwendet werden.
Die Insolubilisierung eines Antigens oder Antikörpers kann mittels physikalischer Adsorption durchgeführt werden oder durch chemische Bindung, die normalerweise zur Insolubilisierung von Proteinen oder Enzymen angewandt wird. Als Träger seien unlösliche Polysaccharide wie z. B. Agarose, Dextran und Cellulose, synthetische Harze wie etwa Polystyrol, Polyacrylamid und Silicon oder Glas beispielhaft erwähnt. Beim Sandwich-Verfahren wird die Prüfflüssigkeit mit dem erfindungsgemäßen insolubilisierten monoklonalen Antikörper umgesetzt (Primärreaktion), dann wird sie mit dem anderen erfindungsgemäßen markierten monoklonalen Antikörper umgesetzt (Sekundärreaktion), und die Aktivität des Markierungsmittels auf dem insolubilisierten Träger wird bestimmt, um die Menge des erfindungsgemäßen Proteins in der Prüfflüssigkeit zu bestimmen. Primärreaktion und Sekundärreaktion können abgewandelt werden. Ansonsten können diese Reaktionen gleichzeitig oder unter Verschiebung der Anfangszeiten durchgeführt werden. Mit dem Markierungsmittel und der Insolubilisierungsmethode kann in der gleichen Weise wie mit diesen Reaktionen verfahren werden. Beim Immunassay unter Anwendung des Sandwich-Verfahrens muss der Antikörper, der als Antikörper für die feste Phase verwendet wird, nicht von der gleichen Art sein wie der Antikörper für die Markierung. Es kann eine Mischung aus zwei oder mehr Arten von Antikörpern verwendet werden, um die Empfindlichkeit der Bestimmung zu verbessern. Bei dem Bestimmungsverfahren des erfindungsgemäßen Proteins und dergleichen unter Anwendung der erfindungsgemäßen Sandwich-Methode weisen die bei der Primärreaktion und Sekundärreaktion verwendeten monoklonalen Antikörper vorzugsweise verschiedene Teile auf, an die das erfindungsgemäße Protein und dergleichen gebunden wird. Was insbesondere die für die Primärreaktion und Sekundärreaktion verwendeten Antikörper anbelangt, so erkennt der für die Primärreaktion verwendete Antikörper vorzugsweise einen anderen Teil als das C-Ende, beispielsweise das N-Ende, wenn zum Beispiel der für die Sekundärreaktion verwendete Antikörper das C-Ende des erfindungsgemäßen Proteins und dergleichen erkennt.
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper kann auch in anderen Bestimmungssystemen als dem Sandwich-Verfahren verwendet werden, etwa in einem kompetitiven Verfahren oder einem immunometrischen Verfahren oder in der Nephelometrie. Beim kompetitiven Verfahren werden Antigene und markierte Antigene in der Prüfflüssigkeit mit Antikörpern kompetitiv zur Reaktion gebracht, anschließend werden unumgesetzte markierte Antikörper (F) und an die Antikörper gebundene markierte Antigene (B) getrennt (B/F-Trennung), die Markie rungsmenge von B oder F wird bestimmt und die Antigenmenge quantifiziert. Beim Reaktionsverfahren werden lösliche Antikörper als Antikörper eingesetzt. Beispielhaft erwähnt als B/F-Trennung sei ein Flüssigphasenverfahren, wobei Polyethylenglycol oder der zweite Antikörper als der obige Antikörper verwendet wird, und ein Festphasenverfahren, bei dem ein Festphasen-Antikörper als erster Antikörper verwendet wird oder ein löslicher Antikörper als erster Antikörper verwendet wird und ein Festphasen-Antikörper als zweiter Antikörper verwendet wird. Beim immunometrischen Verfahren werden die Antigene und die Festphasen-Antigene in der Prüfflüssigkeit mit einer definierten Menge eines markierten Antikörpers kompetitiv zur Reaktion gebracht, und anschließend werden feste Phase und flüssige Phase getrennt. Alternativ werden die Antigene in der Prüfflüssigkeit und eine Überschussmenge des markierten Antikörpers zur Reaktion gebracht, die Festphasen-Antikörper werden zugesetzt, um die unumgesetzten markierten Antikörper an die feste Phase zu binden, und feste Phase und flüssige Phase werden getrennt. Die Markierungsmenge irgendeiner der beiden Phasen wird bestimmt, und die Antigen-Menge in der Prüfflüssigkeit wird bestimmt. Bei der Nephelometrie wird die Menge der unlöslichen Präzipitate bestimmt, die als Ergebnis der Antigen/Antikörper-Reaktion im Gel oder in Lösung auftreten. Wenn die Menge der Antigene in der Prüfflüssigkeit gering ist und eine geringe Menge Präzipitat erhalten wird, so kann die Lasernephelometrie mit Laserstreuung und dergleichen bevorzugt angewandt werden.
Bei Anwendung dieser immunologischen Bestimmungsmethoden auf das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren sind keine besonderen Bedingungen und neu festgelegten Arbeitsabläufe vonnöten. Unter Anwendung des üblichen Fachwissens auf diesem Gebiet auf die gebräuchlichen Bedingungen und Arbeitsweisen bei den jeweiligen Verfahren ist es möglich, die Bestimmungssysteme für das erfindungsgemäße Protein und dergleichen einzurichten. Was die Einzelheiten dieser üblichen technischen Hilfsmittel anbelangt, so sei auf die allgemeine und spezielle Literatur verwiesen. Zitiert seien hier beispielsweise Kan Irie (Hrsg.), Radioimmuno Assay, Kodan-sha (1974), Kan Irie (Hrsg.), Radioimmuno Assay, Fortsetzung, Kodansha (1979), Eiji Isbikawa et al. (Hrsg.), Immu noenzymometric Assay, Igaku Shoin (1978), Eiji Ishikawa et al. (Hrsg.), Immunoenzymometric Assay, 2. Aufl., Igaku Shoin (1982), Eiji Ishikawa et al. (Hrsg.), Immunoenzymometric Assay, 3. Aufl., Igaku Shoin (1987), Methods in ENZYMOLOGY, Bd. 70, Immunochemical Techniques (Teil A): ebenda, Bd. 73, Immunochemical Techniques (Teil B), ebenda, Vol. 74, Immunochemical Techniques (Teil C), ebenda, Bd. 84 (Immunochemical Techniques (Teil D: Selected Immunoassays), ebenda, Bd. 92 (Immunochemical Techniques (Teil E: Monoclonal Antibodies, und General Immunoassay Methods), ebenda, Bd. 121 (Immunochemical Techniques (Teil I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies), alle erschienen bei Academic Press Co.. Wie vorstehend beschrieben, kann durch Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers das erfindungsgemäße Protein und dergleichen sensitiv quantifiziert werden. Werden erhöhte Konzentrationen des erfindungsgemäßen Proteins und dergleichen in Patienten mit Helicobacter pylori-Infektion nachgewiesen, so können außerdem durch Quantifizieren der Konzentrationen des erfindungsgemäßen Proteins und dergleichen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers Patienten mit Krankheiten festgestellt werden wie zum Beispiel Magenschleimhautentzündung, Magengeschwür, Magenkrebs, Herzklappenerkrankung, Diabetes mellitus, verschiedene Karzinome (zum Beispiel Karzinom des Endometriums, Endometriom, Brustkrebs, Kolonkarzinom, Prostatakarzinom, Lungenkrebs, Leberkarzinom, Milzkrebs, Karzinom der Gallenblase, Nierenkarzinom, Neuroblastom, Harnblasenkrebs, malignes Melanom und dergleichen). Alternativ kann diagnostiziert werden, dass die Möglichkeit künftiger Morbidität hoch ist. Der erfindungsgemäße Antikörper kann zum Nachweis des erfindungsgemäßen Proteins und dergleichen in einer Prüfflüssigkeit wie etwa Körperflüssigkeit oder in Geweben verwendet werden. Er wird verwendet zur Herstellung einer Antikörpersäule zur Verwendung bei der Reinigung des erfindungsgemäßen Proteins und dergleichen, beim Nachweisen des erfindungsgemäßen Proteins und dergleichen in den jeweiligen Fraktionen der Reinigung und zur Analyse des Verhaltens des erfindungsgemäßen Proteins und dergleichen in Testzellen.
Die den erfindungsgemäßen Antikörper enthaltende Medizin, wobei der erfindungsgemäße Antikörper (neutralisierender Antikörper) eine neutralisierende Wirkung für die Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins und dergleichen aufweist, kann als Medizin zur Behandlung und Prävention von Krankheiten wie z. B. Magenschleimhautentzündung, Magengeschwür, Magenkrebs, Herzklappenerkrankung, Diabetes mellitus, verschiedene Karzinome (zum Beispiel Karzinom des Endometriums, Endometriom, Brustkrebs, Kolonkarzinom, Prostatakarzinom, Lungenkrebs, Nierenkarzinom, Neuroblastom, Harnblasenkrebs, malignes Melanom und dergleichen) verwendet werden. Der erfindungsgemäße humanisierte Antikörper für das erfindungsgemäße Protein und dergleichen kann als Medizin zur Behandlung und Prävention von Krankheiten wie z. B. Magenschleimhautentzündung, Magengeschwür, Magenkrebs, Herzklappenerkrankung, Diabetes mellitus, verschiedene Karzinome (zum Beispiel Karzinom des Endometriums, Endometriom, Brustkrebs, Kolonkarzinom, Prostatakarzinom, Lungenkrebs, Nierenkarzinom, Neuroblastom, Harnblasenkrebs, malignes Melanom und dergleichen) verwendet werden. Der humanisierte Antikörper kann nach den in Nat. Biotechnol. 14, 845–851 (1996); Nat. Genet. 15, 146–156 (1997); und PNAS 97(2), 722–727 (2000); beschriebenen Verfahren gebildet werden. Im Folgenden werden diese erfindungsgemäßen neutralisierenden Antikörper und humanisierten Antikörper in Kurzform als erfindungsgemäße Antikörper bezeichnet.
Die obigen Mittel zur Behandlung und Prävention, die den erfindungsgemäßen Antikörper enthalten, können oral oder parenteral als Flüssigkeit in dieser Form oder als medizinische Zusammensetzung in einer geeigneten Dosierform an Menschen oder Säuger (wie etwa Maus, Kaninchen, Ziege, Schwein, Kuh, Katze, Hund, Affe und dergleichen) verabreicht werden. Die Dosierung des Mittels richtet sich nach der Zielstellung, der Krankheit, dem Erkrankungszustand, dem Verabreichungsweg oder dergleichen. Werden die Mittel zur Behandlung und Prävention eines Tumors im Endometrium verwendet, so beträgt die Dosis des erfindungsgemäßen Antikörpers normalerweise 0,01~20 mg/kg Gewicht, vorzugsweise 0,1~10 mg/kg Gewicht, mehr bevorzugt 0,1~5 mg/kg Gewicht etwa 1~5 mal pro Tag, vorzugsweise etwa 1~3 mal pro Tag. Zweckmäßigerweise wird das Mittel durch intravenöse Injektion verabreicht. Die Dosierung bei anderweitiger, d. h. parenteraler oder oraler Verabreichung kann ebenfalls gemäß obiger Dosierung erfolgen. Bei schweren Erkrankungszuständen kann die Dosierung entsprechend dem Zustand erhöht werden. Der erfindungsgemäße Antikörper kann so verabreicht werden wie er ist oder in Form einer geeigneten medizinischen Zusammensetzung. Die zur Verabreichung verwendete medizinische Zusammensetzung enthält einen pharmakologisch annehmbaren Träger für den obigen Antikörper oder das Salz, ein Verdünnungsmittel oder einen Füllstoff. Eine solche Zusammensetzung kann als Dosierform bereitgestellt werden, die für die orale oder parenterale Verabreichung geeignet ist. Als Zusammensetzung für die orale Verabreichung ist die Dosierform beispielsweise fest oder flüssig, insbesondere eine Tablette (darunter mit Zucker überzogene Tabletten und mit einem Film überzogene Tabletten), eine Pille, ein Granulat, Pulver, eine Kapsel (darunter Weichkapseln), ein Sirup, eine Emulsion, Suspension oder dergleichen. Eine solche Zusammensetzung wird mit Hilfe bekannter Verfahren hergestellt und kann den normalerweise verwendeten Träger, ein Verdünnungsmittel oder einen Füllstoff enthalten. Als Träger für die Tablette und den Füllstoff kann beispielsweise Lactose, Stärke, Sucrose, Magnesiumstearat und dergleichen verwendet werden.
Die nachstehend angegebenen Sequenznummern des Sequenzprotokolls zeigen die folgenden Sequenzen.
SEQ ID NO: 1 zeigt eine von Helicobacter pylori 60190 abgeleitete Aminosäuresequenz (M-Toxin).
SEQ ID NO: 2 zeigt die Basensequenz der DNA, die für das von Helicobacter pylori 60190 abgeleitete erfindungsgemäße Protein (M-Toxin) mit der durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz codiert.
SEQ ID NO: 3 zeigt die Basensequenz einer in Beispiel 3 verwendeten (synthetischen) Primer-DNA.
SEQ ID NO: 4 zeigt die Basensequenz einer in Beispiel 3 verwendeten (synthetischen) Primer-DNA.
Die im nachstehend angegebenen Beispiel 3 erhaltene Transformante Escherichia coil M-Toxin/pET30EK/LICIDH5α wurde am 17. Oktober 2002 beim National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (IPOD) mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-8218 hinterlegt. Des Weiteren wurde der im nachstehend angegebenen Beispiel 4 erhaltene Hybridomklon Nr. 4 als BALB-c/P3U1/004-1G9 am 23. Oktober 2002 beim National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (IPOD) mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-8222 hinterlegt. Weiterhin wurde der Hybridomklon Nr. 110 als BALB-c/P3U1/101-1C10 am 23. Oktober 2002 beim National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (IPOD) mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-8223 hinterlegt. Der Hybridomklon Nr. 116 wurde als BALB-c/P3U1/116-5D7 am 23. Oktober 2002 beim National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (IPOD) mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-8224 hinterlegt.
Beispiele
Die Erfindung lässt sich anhand der folgenden Beispiele besser verstehen. Diese Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, jedoch nicht so ausgelegt werden, dass die den Umfang der Erfindung einschränken. Die Genmanipulation unter Verwendung von E. coil erfolgte gemäß dem in Molecular Cloning beschriebenen Verfahren.
Beispiel 1:
Verfahren zur Reinigung und Extraktion des erfindungsgemäßen Toxins aus Helicobacter pylori
Helicobacter pylori kann erhalten werden als separierter Stamm, der bereits eingeführt ist (zum Beispiel von der American Type Culture Collection), oder durch Kultivieren eines Stamms, der aus klinischen Testproben abgetrennt wurde. Bei diesem Beispiel wurde der separierte Stamm Helicobacter pylori 60190 verwendet. Unter Verwendung eines Agar-Mediums, wobei 5% Rinderserum (herge stellt von Sigma Co.) einem Agar-Hirn-Herz-Infusionsmedium (hergestellt von Difco Co.) zugesetzt wurden, wurde dieser separierte Stamm in 2–5 Passagen etwa 1–2 Wochen bei einer Temperatur von 37°C und einer Luftfeuchtigkeit von 90% oder mehr unter mikroaeroben Bedingungen (5–10% CO₂) subkultiviert. Unter einem Mikroskop wurde bestätigt, dass die Zellen nicht abgestorben waren oder keine kolloidale Form hatten, sondern sich zufriedenstellend vermehrt hatten. Die Zellen wurden auf eine Agar-Kulturplatte mit Hirn-Herz-Infusion (hergestellt von Difco Co.) überführt, die kein Serum, sondern 5% 2,6-Di-O-methyl-β-cyclodextrin enthielt. Nachdem die Kultivierungs- und Wachstumsbedingungen unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend beschrieben bestätigt waren, wurden die Zellen in Kulturen überführt, die 2,6-Di-O-methyl-β-cyclodextrin in stufenweise abnehmender Konzentration enthielten, d. h., 2%, 1% und 0,5%.
Die Zellen wurden in einer Flüssigkultur mit Hirn-Herz-Infusion, enthaltend 0,5% 2,6-Di-O-methyl-β-cyclodextrin, bei einer Temperatur von 37°C unter mikroaeroben Bedingungen und unter Bewegung mit einem Rundschüttler bei 100–120 U/min etwa 16 Stunden kultiviert. Pellets aus Bakterienzellen wurden durch 20 Minuten Zentrifugieren bei 10000 × g gewonnen. Diese wurden in 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,7 (im Folgenden abgekürzt als Puffer A; der pH ist insgesamt 6,1 oder mehr, da der pH des gewünschten Proteins 6,08 ist), suspendiert und beschallt. Nach Aufbewahren über Nacht bei einer Temperatur von –80°C wurden die Zellen erneut beschallt und 60 Minuten bei 10000 × g zentrifugiert. Es wurde nur die oberste Schicht der drei getrennten Schichten extrahiert.
Die Extraktflüssigkeit wurde mit einer 70% Ammoniumsulfat-Lösung grob gereinigt. Der resultierende Extrakt wurde mittels Ionenaustauschchromatographie mit Anionenaustauscher-Harzperlen mit relativ großem Teilchendurchmesser (DEAE Sephacel von Amersham Pharmacia Biotech AB) gereinigt. Puffer A wurde als Äquilibrierungspuffer verwendet, und eine Mischung aus Puffer A und einer Lösung von 0,3 M NaCl-Salz wurde als Elutionsmittel eingesetzt. Mit dem Puffer A und dem Elutionsmittel wurden die Zellen mittels Konzentrationsgra dient extrahiert. Eine geeignete Menge einer jeden Fraktion wurde tropfenweise in Vertiefungen mit eingeimpften HeLa-Zellen gegeben, und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde in jeder Vertiefung bewertet. Die Bewertung wurde durchgeführt unter Anwendung eines WST-Assay mit Cell Counting Kits (DOJIN Laboratories). Durch Vergleichen mit einer Kontrolle wurden Fraktionen, die erheblich geringere Lebensfähigkeit aufweisen, und Fraktionen mit relativ übereinstimmenden Zunahmekurven an Protein zusammen mit den Ergebnisse der Elektrophorese bewertet, um als Probenfraktionen für den nächsten Reinigungsprozess verwendet zu werden.
Ausgewählt wurde eine hydrophobe Chromatographie (Phenyl Sepharose CL-4B, Amersham Pharmacia Biotech AB), die ein anderes Trennungssystem als das für das nächste Mal aufweist. Verwendet wurde ein Äquilibrierungspuffer, der 1 M Ammoniumsulfat in 10 mM Phosphat-Puffer enthielt. Es wurde ein Elutionspuffer verwendet, der 40% Ethylenglycol in 10 nM Phosphat-Puffer enthielt. Nach Extraktion der Zellen mittels Konzentrationsgradient wurde jede Probe mit Hilfe des gleichen Verfahrens wie vorstehend beschrieben bewertet.
Die mit Hilfe des obigen Verfahrens extrahierten Proben wurden mittels Anionenaustauschchromatographie mit Perlen, die einen relativ kleinen Teilchendurchmesser aufweisen (Resource Q von Amersham Pharmacia Biotech AB), erneut extrahiert. Puffer A wurde als Äquilibrierungspuffer verwendet, und eine Mischung aus Puffer A und einer Lösung von 1 M NaCl-Salz wurde als Elutionspuffer verwendet. Mit Hilfe dieser Chromatographie wurde schließlich eine einzelne Proteinbande mit einem Molekulargewicht von etwa 41000 erhalten. Art und Reihenfolge dieser Chromatographien können geändert werden, und es können weitere dazukommen.
Nachdem die resultierende Signalbande mit Coomassie Brilliant Blue angefärbt worden war, wurde sie mit einer Blotting-Apparatur auf eine Nitrocellulose-Membran (oder Polyvinylidendifluorid-Membran) überführt und mit einem Aminosäure-Sequencer analysiert. Im Ergebnis – wie vorstehend beschrieben – gab es bei den Aminosäuresequenzen der N-Enden von Genlocus HP1037 einer registrierten Datenbank (Helicobacter pylori 22695) 95% Übereinstimmung (19 Basen von 20 Basen; 1)
Beispiel 2:
Aminosäuresequenzen und DNA-Sequenzen mittels gentechnischem Herstellungsverfahren
In diesem Beispiel wurde ein separierter Stamm von Helicobacter pylori 60190 verwendet. Wie vorstehend beschrieben, waren alle Genanalysen verschiedener Stämme von Helicobacter pylori 22695 bereits durchgeführt. Der homologe Genlocus kann mit Hilfe einer Datenbanksuche (TIGR: The Institute for Genomic Research) ermittelt werden. Es wurde gefunden, dass der Genlocus HP1037 von Helicobacter pylori 22695 für das homologe Protein codiert.
Mit den Ergebnissen wurde die Klonierung des erfindungsgemäßen Proteins durchgeführt. Dabei wurde Helicobacter pylori 60190 als Matrize verwendet, und zunächst wurden zweckmäßigerweise mehrere Gruppen geeigneter Primer auf der Grundlage von Genlocus HP1037 und Genlocus HP1036 stromaufwärts und Genlocus HP1038 stromabwärts gebildet (an der 5'-Seite und 3'-Seite), um die Sequenzierung durchzuführen. Es wurde eine DNA-Polymerase mit Proofreading-Funktion verwendet. Jede Primer-Gruppe war so aufgebaut, dass sie ausreichend wechselseitige Primer-Teile enthielt, und es wurden mehrere Sequenzierungen von der 5'-Seite und 3'-Seite aus durchgeführt. Die resultierenden DNA-Sequenzen sind in SEQ ID NO: 2 des Sequenzprotokolls gezeigt. Die Aminosäuresequenzen sind in SEQ ID NO: 1 gezeigt.
Beispiel 3
Expressionsexperiment zum toxischen Protein durch Genrekombination
Für das Expressionsexperiment wurde E. coli verwendet. Für die Expression wurde der Vektor pET-30EK/LIC (hergestellt von Novagen Co.) und E. coli BL21 (DE3) verwendet. Der Sinn-Primer war SEQ ID NO: 3, der GACGACGACAAG an der 5'-Seite der Sinnkette zur Codierung des von Helicobacter pylori 60190 stammenden toxischen Proteins inseriert, das in Beispiel 2 kloniert wurde. Der Antisinn-Primer war SEQ ID NO: 4, der GAGGAGAAGCCCGGTTA an der 5'-Seite inseriert. Die zu inserierenden Gene wurden mit Hilfe eines PCR-Verfahrens unter Verwendung der obigen Primer gebildet. Die inserierten Gene wurden mit T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von 25 mM dATP und 100 mM DTT hergestellt, um an die LIC-Stelle des Vektors zu passen, und in Gegenwart von 25 mM EDTA erwärmt. Die gebildete Rekombinante wurde erneut sequenziert, um zu bestätigen, dass sie mit SEQ ID NO: 1 identisch war. Zur Expression wurde sie dann in E. coli BL21 (DE3) transformiert und in einem 30 μg/ml Kanamycin enthaltenden Medium kultiviert.
Es wurde eine Schüttelkultur bei einer Temperatur von 37°C mit 250 U/min durchgeführt, um eine OD₆₀₀ von 0,4 zu erhalten. Isopropyl-β-thiogalactosid wurde zugesetzt, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten, und die Mischung wurde 2 Stunden weitergeschüttelt. Da das fusionierte Protein einen Einschlusskörper bildete, wurde E. coli durch Zentrifugieren isoliert, und der Einschlusskörper des Proteins wurde mit einem BugBuster-Reagens und Benzonase-Nuclease (beide erhältlich von Novagen Co.) erhalten. Das Protein wurde mit Hilfe eines Elektrophorese-Verfahrens mit Natriumdodecylsulfat/Polyacrylamid-Gel (SDS-PAGE) abgetrennt, und die entsprechende einzelne Bande wurde mittels Silberanfärbung bestätigt. Das Protein wurde dann umgefaltet und mit einem WST-Reagens (Dojin Chemical Laboratories Ltd. Cell Counting Kit) unter Verwendung von HeLa-Zellen und den anderen Warmblüterzellen mit der Kontrolle verglichen. Schließlich wurden signifikante Überlebensunterschiede ausgewertet, und es wurde gefunden, dass das Expressionsprotein gleiche Aktivität hatte wie das gereinigte Protein. Es wurde gefunden, dass das Expressionsprotein die gleiche Aktivität gegenüber normalen humanen Magenzellen wie HeLa-Zervixkarzinomzellen hatte (2). Auch wurde gefunden, dass das Protein nicht nur gegenüber den anderen humanen Geweben, sondern auch gegenüber Sängerzellen breite Wirkung aufwies (3, 4).
Beispiel 4
Bildung des monoklonalen Antikörpers gegen M-Toxin
Das umgefaltete Expressions-M-Toxin, 240 μg, wurde BALB/C-Mäusen an mehreren Stellen zweimal subkutan verabreicht. 4 Tage nach der abschließenden Immunisierung wurde die Mausmilz herausgeschnitten, mit einem Edelstahlsieb druckfiltriert und in modifiziertem Eagle-Minimalmedium (MEM) suspendiert, um eine Suspensionslösung von Milzzellen zu erhalten. Als Zellen für die Zellfusion wurden Myelom-Zellen P3-X63. Ag 8. U1 (P3U1) verwendet, die von BALB/C-Mäusen stammten (Current Topics in Microbiology and Immunology 81, 1 (1978)). Die Zellfusion wurde gemäß dem ursprünglichen Verfahren durchgeführt (Nature 256, 495 (1975)). Dabei wurden die Milzzellen und P3U1 jeweils dreimal mit MEM gewaschen, das kein Serum enthielt, und in einem Verhältnis von Milzzellen zu P3U1-Anzahl von 6,6:1 gemischt. Die Zellen wurden durch 15 Minuten Zentrifugieren bei 750 × g präzipitiert. Der gesamte Überstand wurde entfernt, und das Präzipitate wurde abgelöst, es wurden 0,3 ml 45% Polyethylenglycol (PEG) 6000 (hergestellt von Wako Junyaku Co.) zugesetzt, und die Mischung wurde zur Durchführung der Fusion 7 Minuten in einem Warmwasserbehälter mit 37°C stehengelassen. Nach der Fusion wurden die Zellen mit einer kleinen Menge MEM versetzt, wobei insgesamt 15 ml MEM zugesetzt wurden. Die Mischung wurde 15 Minuten mit 750 × g zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Das Zellpräzipitat wurde in 10% fetales Kälberserum enthaltendem GIT-Medium (hergestellt von Wako Junyaku Co.) (GIT 10% FCS) suspendiert, um P3U1 zu 2·10⁵ pro 1 ml zu ergeben, und in Mikrotiterplatten mit 24 Vertiefungen (hergestellt von Iwaki Co.) mit 1 ml pro Vertiefung in 168 Vertiefungen überimpft. Nach dem Impfen wurden die Zellen in einem Brutschrank mit 5% Kohlendioxid bei einer Temperatur von 37°C inkubiert. Nach 24 Stunden wurde ein GIT/10% FCS-Medium (HAT-Medium), enthaltend HAT (1·10^–4 M Hypo xanthin, 4·10^–7 M Aminopterin und 1,6·10^–3 M Thymidin), mit 1 ml pro Vertiefung zugesetzt, um die HAT-selektive Kultivierung einzuleiten. Nach 4 und 7 Tagen wurde die alte Flüssigkeit verworfen und die HAT-selektive Kultivierung wurde fortgesetzt durch Zugabe von 1 ml HAT-Medium. Vermehrung des Hybridoms zeigte sich nach 9 Tagen der Zellfusion, und der Überstand wurde aufgefangen. Der Antikörperwert im Überstand wurde mit Hilfe des folgenden Verfahrens bestimmt. Dabei wurden 100 μl Kulturüberstand und 100 μl HRP-markiertes M-Toxin, 200-fach verdünnt mit Puffer C, in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte gegeben, die den Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper bindet, und über Nacht bei einer Temperatur von 4°C umgesetzt. Nach Waschen der Platten mit PBS, um Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper bindende Mikrotiterplatten zu ergeben, wurde zunächst eine 0,1 M-Carbonat-Pufferlösung, pH 9,6, enthaltend Ziege-Antimaus-Immunglobulin-Antikörper (IgG-Fraktion, hergestellt von DAKO Co.) zu 100 μg/ml, in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit 100 μl pro Platte pipettiert und 24 Stunden bei einer Temperatur von 4°C stehengelassen. Anschließend wurden die Platten mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4) gewaschen, 25% Block Ace (Warenzeichen, hergestellt von Yukijirushi Milk Products Co.) und PBS, pH 7,2, enthaltend 0,1%, NaN₃, wurden mit je 300 μl zupipettiert, um überschüssige Bindungsstellen in den Vertiefungen zu blockieren, und wenigstens 24 Stunden bei einer Temperatur von 4°C behandelt. Jede Vertiefung der obigen Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper bindenden Mikrotiterplatte wurde mit 100 μl Maus-Antiserum, verdünnt mit EC-Puffer [0,02 M Phosphat-Puffer, pH 7,0, enthaltend 0,2% BSA, 0,4 M NaCl, 0,4% Block Ace, 0,05% CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat), 2 mM EDTA und 0,1% NaN₃], versetzt und 16 Stunden bei einer Temperatur von 4°C umgesetzt. Dann wurden die Platten mit PBS, pH 7,4, gewaschen, und 100 μl HRP-markiertes umgefaltetes Toxin-Protein wurden zugesetzt und 7 Stunden bei Raumtemperatur zur Reaktion belassen. Das obige umgefaltete Toxin-Protein wurde in obigem Beispiel 3 hergestellt durch 100-faches Verdünnen mit Puffer C [0,02 M Phosphat-Puffer, pH 7,0, enthaltend 1% BSA, 0,4 M NaCl und 2 mM EDTA]. Die Platten wurden anschließend mit PBS, pH 7,4, gewaschen, 100 μl TMB-Mikrotiterplatten-Peroxidase-Ersatzsystem (KIRKEGAARD & PERRY LAB, zu beziehen durch Funakoshi Yakuhin) wurden zugegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt, um die Enzymaktivität auf der festen Phase zu bestimmen. Nachdem die Reaktion durch Zugabe von 100 μl 1 M Phosphorsäure zum Stillstand gebracht war, wurde die Extinktion bei 450 nm mit einem Plattenlesegerät bestimmt (MTP-120, hergestellt von Corona Co.). Nach diesen Verfahren wurde die Enzymaktivität auf der festen Phase bestimmt. Im Ergebnis wurden 18 Vertiefungen, bei denen der Antikörperwert gefunden wurde, aus 123 Vertiefungen ausgewählt, und die Hybridome wurden eingefroren und aufbewahrt. Hybridome von 6 Vertiefungen, Nr. 4, Nr. 53, Nr. 61, Nr. 76, Nr. 101 und Nr. 116, wurden mit Hilfe der Verdünnungsmethode kloniert. Bei der Klonierung wurden Thymozyten von BALB/C-Mäusen als Feeder-Zellen mit 5·10⁵ pro Vertiefung zugesetzt. Nach dem Klonieren wurde der Antikörperwert des Überstands mit Hilfe des gleichen Verfahrens bestimmt. Positive Klone waren Nr. 4, Nr. 101 und Nr. 116. Diese Klone wurden als Antikörper produzierende Hybridome für Expressions-M-Toxin verwendet.
Beispiel 5
Bestimmung der Klasse und Subklasse der monoklonalen Antikörper
Mit dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren wurden Anti-Kaninchen-IgG bindende Mikrotiterplatten hergestellt. Dabei wurde 0,1 M Carbonat-Puffer, pH 9,6, enthaltend Ziege-Antikaninchen-Immunglobulin-Antikörper zu 100 μg/ml, in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit 100 μl pro Platte pipettiert und 24 Stunden bei einer Temperatur von 4°C stehengelassen. Anschließend wurden die Platten mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4) gewaschen, 25% Block Ace (Warenzeichen, hergestellt von Yukijirushi Milk Products Co.) und PBS, pH 7,2, enthaltend 0,1%, NaN₃, wurden mit je 300 μl zupipettiert, um überschüssige Bindungsstellen in den Vertiefungen zu blockieren, und wenigstens 24 Stunden bei einer Temperatur von 4°C behandelt. Die den Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper bindenden Mikrotiterplatten wurden mit 50 μl EC-Puffer und 100 μl subtypspezifischem Antikörper, enthalten in einem Isotyp-Bestimmungskit, das von Bio-Rad Laboratories hergestellt wird, versetzt, um einen Tag lang bei einer Temperatur von 4°C zu reagieren. Nach Waschen der Platten mit PBS, pH 7,4, wurde der Kulturüberstand der vorstehend beschriebenen Hybridome zugesetzt und einen Tag lang bei einer Temperatur von 4°C umgesetzt. Die Platten wurden mit PBS, pH 7,4, gewaschen, und 100 μl HRP-markiertes umgefaltetes Toxin-Protein, das in obigem Beispiel 3 hergestellt wurde durch 100-faches Verdünnen mit Puffer C [0,02 M Phosphat-Puffer, pH 7,0, enthaltend 1% BSA, 0,4 M NaCl und 2 mM EDTA], wurden zugesetzt und 6 Stunden bei Raumtemperatur zur Reaktion belassen. Die Platten wurden mit PBS, pH 7,4, gewaschen, und die Enzymaktivität auf der festen Phase wurde mit Hilfe des in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens bestimmt. Wie sich zeigte, waren die Subklassen des von diesen Hybridomen produzierten monoklonalen Antikörpers Nr. 4 (IgG1), Nr. 101 (IgG2b) und Nr. 116 (IgG2a).
Beispiel 6
Verfahren zur Herstellung von Hybridomen aus Maus-Aszitesflüssigkeit
Die Hybridome Nr. 4, Nr. 101 und Nr. 116 waren aus Maus-Aszites. Mineralöl, 0,5 ml, war vorher parenteral an Mäuse verabreicht worden. Den Mäusen (BALB/C, weiblich) wurde das Obige zu 1–3·10⁶ Zellen/Maus parenteral verabreicht, und der den Antikörper enthaltende Aszites wurde nach 6–20 Tagen aufgefangen. Der monoklonale Antikörper wurde mit einer Protein A-Säule aus dem erhaltenen Aszites gereinigt. Dabei wurden etwa 25 ml des Aszites mit dem gleichen Volumen Bindungspuffer (3,5 M NaCl, 1,5 M Glycin, enthaltend 0,05% NaN₃, pH 9,0) verdünnt, die Lösung wurde auf eine Agarose-Säule mit rekombinantem Protein A (Repligen Co.) präzipitiert, die vorher mit Bindungspuffer äquilibriert worden war, und der spezifische Antikörper wurde mit Elutionspuffer (0,1 M Citronensäure-Puffer, pH 3,0 enthaltend 0,05% NaN₃) eluiert. Die Elutionsflüssigkeit wurde mit PBS, pH 7,4, bei einer Temperatur von 4°C 2 Tage lang dialysiert und zur Abtrennung von Bacilli mit einem Filter mit 0,22 μm (hergestellt von Millipore Co.) filtriert oder bei einer Temperatur von –80°C aufbewahrt.
Beispiel 7
Herstellung von polyklonalem Antikörper gegen M-Toxin
Das erfindungsgemäße zytotoxische Protein M-Toxin, 4,1 mg, wurde mit komplettem Freundschen Adjuvans gemischt, und die Mischung wurde Kaninchen zur Immunisierung subkutan verabreicht. Nach einer Woche wurde die gleiche Menge M-Toxin mit inkomplettem Freundschen Adjuvans gemischt, und die Mischung wurde anschließend Kaninchen zur Immunisierung subkutan verabreicht. Nach der Immunisierung wurde das abgenommene Blut zentrifugiert, um Hämozyten-Bestandteile zu entfernen, und es wurde ein Antiserum erhalten.
Beispiel 8
Analyse von M-Toxin mittels Western-Blotting
SDS-Probenpuffer, enthaltend 2-Mercaptoethanol, wurde dem in Beispiel 3 erhaltenen Überstand zugesetzt, die Mischung wurde einer Elektrophorese mit Peptid-PAGE (TEFCO) unterzogen und elektrisch auf eine PVDF-Membran (Amersham) überführt. Die in Beispiel 4 und Beispiel 6 erhaltenen Antikörper (2 μg/ml) wurden jeweils als primärer Antikörper verwendet. Mit HRP (Meerrettichperoxidase) markierte Anti-Kaninchen- und Anti-Maus-IgG-Antikörper (2000-fache Verdünnung; Dako) wurden als sekundärer Antikörper verwendet. Die Anfärbung wurde mit einem ECL Western Blot Detection System (Amersham) durchgeführt. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass der jeweilige primäre Antikörper das Expressionsprotein erkennt. (5).
Beispiel 9
Aktivkohle (0,2~0,1 mm Durchmesser), CM-Cellulose und Calciumalginat, jeweils 0,5 ml, wurden in drei Säulen eingefüllt. Nach Äquilibrierung mit 10 mM Tris-Puffer, pH 7,7, wurden 0,5 ml 400 nM M-Toxin mit der Aktivität der Umfaltung in jede Säule gegeben, und die Säulen wurden zugestöpselt und 60 Minuten bei einer Temperatur von 25°C stehengelassen. Daneben wurden Tris-Puffer alleine und ein das gleiche M-Toxin enthaltender Tris-Puffer unter den gleichen Bedingungen stehengelassen. Alle Säulen wurden dann geöffnet, jeweils 100 μl, die aus den Säulen tropften, wurden abgetrennt, des Weiteren wurden jeweils 0,5 ml Tris-Puffer einer jeden Säule zugegeben, und jeweils 100 μl wurden aufgefangen. Vollblut von normalen Erwachsenen wurde 2–3 mal mit 800 × g 10 Minuten lang zentrifugiert, bis der Überstand transparent war. 990 μl 10 mM Tris-Puffer, versetzt mit 10 μl der präzipitierten Erythrozyten, wurden als Positivkontrolle verwendet. In ähnlicher Weise wurden 10 μl der präzipitierten Erythrozyten, die zu 10 mM Tris-Puffer mit 0,9% Salz gegeben wurden, als Negativkontrolle verwendet. Von den obigen Säulen wurden Proben genommen. Die Proben wurden mit 1 Volumen Erythrozyten pro 100 Volumina Probe versetzt. Die Kontrollen und die Proben wurden anhand der eluierten relativen Hämoglobin-Konzentration mit einem Multiplattenlesegerät (Biorad) durch Messen der Extinktion bei 415 nm (6) verglichen.
Beispiel 10
HeLa-Zellen (humane Zervixkarzinomzellen) wurden der Einwirkung der Fraktionen aus jeder der Säulen von Beispiel 9 ausgesetzt, und die Lebensfähigkeit wurde mit Hilfe eines WST-Verfahrens unter Verwendung eines Tetrazolium-Salzes bestimmt. Die HeLa-Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen mit einem Anteil von 10000 Zellen pro Vertiefung 24 Stunden lang kultiviert. Eine Negativkontrolle mit Kulturflüssigkeit alleine, die jeweilige Probenflüssigkeit und eine Positivkontrolle mit 20 nM Toxin-Protein wurden jeweils den Vertiefungen zu gesetzt, und es wurde 12 Stunden bei einer Temperatur von 37°C kultiviert. Mit einem Cell Counting Kit (DOJIN LABORATORIES Ltd. Co.) wurden die Anteile lebensfähiger Zellen, erfasst mit Hilfe eines WST-Verfahrens, anhand der Extinktion bei der Wellenlänge 415 nm gemessen (7, 8).
Industrielle Anwendbarkeit
Das Protein und das Teilpeptid dieser Erfindung und dergleichen können zum Beispiel als Mittel zur Behandlung von Karzinomen verwendet werden. Der erfindungsgemäße Antikörper kann zur Identifizierung des erfindungsgemäßen Proteins in Blut, Geweben, Urin und Exkrementen, die einem zu untersuchenden Patienten entnommen wurden, und zur Bestätigung einer Helicobacter pylori-Infektion verwendet werden. Des Weiteren wird er zur Quantifizierung des erfindungsgemäßen Proteins verwendet. Das erfindungsgemäße Protein kann als Mittel zum Screening von Verbindungen verwendet werde, welche die Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins steigern oder hemmen.
Sequenzprotokoll

Claims

Zytotoxisches Protein, umfassend ein Protein mit der durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz.
Teilpeptid des in Anspruch 1 beschriebenen zytotoxischen Proteins, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein die gleiche zytotoxische Aktivität wie die durch SEQ ID NO: 1 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.
Zytotoxisches Protein nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Protein mit Helicobacter pylori hergestellt wird.
Zytotoxisches Protein nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Protein erhalten wird durch Kultivieren einer Transformante, die mit einem Rekombinationsvektor transformiert ist, der DNA der SEQ ID NO: 2 enthält, die für das zytotoxische Protein nach Anspruch 1 oder 2 codiert.
Zytotoxisches Protein nach Anspruch 4, wobei die Transformante beim National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (IPOD) mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-8218 hinterlegt ist.
Antitumormittel, das das zytotoxische Protein nach Anspruch 1 oder 2 enthält.
Monoklonaler Antikörper, der spezifisch ist gegen das zytotoxische Protein und erhalten wird durch Immunisierung eines Säugers mit dem zytotoxischen Protein nach Anspruch 1 oder 2.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 7, hergestellt mit einem Hybridomklon mit der Hinterlegungsnummer FERM-BP 8222.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 7, hergestellt mit einem Hybridomklon mit der Hinterlegungsnummer FERM-BP 8223.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 7, hergestellt mit einem Hybridomklon mit der Hinterlegungsnummer FERM-BP 8224.
Polyklonaler Antikörper, der spezifisch ist gegen das zytotoxische Protein und erhalten wird durch Immunisierung eines Säugers mit dem zytotoxischen Protein nach Anspruch 1 oder 2.
Verwendung des in einem der Ansprüche 7–11 beschriebenen monoklonalen Antikörpers oder polyklonalen Antikörpers zur Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Erfassung der Konzentration des zytotoxischen Proteins nach Anspruch 1 oder 2 in einer Prüfflüssigkeit.
Verfahren zum Screening auf eine Verbindung, die die zytotoxische Wirkung des Proteins nach Anspruch 1 oder 2 fördert oder hemmt, wobei die Wirkung beurteilt wird an von einem warmblütigen Tier stammenden Zellen durch Vergleich zwischen einer Negativkontrolle, die die Testverbindung nicht enthält, und einer Positivkontrolle, die die Testverbindung enthält.
Kit, umfassend das Protein nach Anspruch 1 oder 2, zum Screening von Verbindungen oder deren Salzen, die die zytotoxische Wirkung des Proteins nach Anspruch 1 oder 2 fördern oder hemmen.