DE60028407T2

DE60028407T2 - Proteine und für diese kodierende dna

Info

Publication number: DE60028407T2
Application number: DE60028407T
Authority: DE
Inventors: Atsushi Tsukuba-shi NAKANISHI; Shigeru Tsukuba-shi MORITA
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-11-15
Filing date: 2000-11-14
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2020-11-15
Also published as: EP1231270A4; DE60028407D1; AU1309601A; EP1231270A1; WO2001036633A1; CN1390256A; US20050163767A1; KR20020059726A; EP1231270B1; US6844179B1; ATE328080T1; CA2391403A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf ein neues Protein und seine DNA, welche als diagnostische Marker oder Arzneimitteltarget für Bronchialasthma, chronisch-obstruktive Lungenerkrankung usw. und ebenso als ein Therapeutikum, ein Prophylaktikum oder dergleichen für Infektionskrankheiten, Immuninsuffizienz usw. nützlich sind.
STAND DER TECHNIK
Bronchialasthma ist eine chronische Entzündungskrankheit der Atemwege, was Atemwegsstenose zeigt, wobei die Symptome, wie paroxysmale Dyspnoe, pfeifendes Atemgeräusch, Husten usw. beobachtet werden. Viele Zellen, wie Bronchienepithelzellen, Mastzellen, eosinophile Zellen, T-Lymphozyten usw., sind bei ihrem Ausbruch und der Entwicklung involviert. Eine der wichtigsten Eigenschaften von Bronchialasthma ist, daß die Atemwege für Reizmittel (Atemwegshyperreaktivität) hyperreaktiv sind. Diese Atemwegshyperreaktivität ist der Atemwegsentzündung zuzuschreiben, die hauptsächlich aufgrund der Exfoliation von Bronchienepithelzellen durch Neurotransmitter, sekretiert aus den Zellen wie eosinophile Zellen usw., die in die Atemwege eindringen, verursacht wird, und es wird ebenso angenommen, daß genetische Faktoren oder Umweltfaktoren die Atemwegshyperreaktivität mit Komplikationen angreifen werden.
Wenn die Entzündungsreaktion der Atemwege durch äußere Reizmittel (Allergene, Abgase) oder Virusinfektion ausgelöst wird, werden die Adhäsionsmoleküle, einschließlich VCAM-1, ICAM-1 und dergleichen, auf Bronchienepithelzellen oder auf Kapillarendothelzellen um die Bronchien exprimiert [J. Allergy Clin. Immunol., 96, 941 (1995)], so daß Zytokine oder chemotaktische Substanzen produziert werden. Bei Patienten mit Bronchialasthma wird die Funktion der T-Helferzellen vom Th2-Typ aktiviert, um die Produktion von Zytokinen vom Th2-Typ, wie IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, GM-CSF usw., oder Chemokinen, wie Eotaxin, RANTES usw. zu erhöhen. IL-4 oder IL-13 weisen die Aktivität zum Induzieren der IgE-Produktion auf, und IL-3 oder IL-4 weisen die Aktivität zum Induzieren des Wachstums von Mastzellen auf. Außerdem differenzieren und proliferieren Eosinophile als Antwort auf IL-5, GM-CSF usw. und dringen in die Atemwege als Antwort auf Eotaxin oder RANTES ein [Allergy Asthma Proc., 20, 141 (1999)].
Epithelzellen, die die Bronchialschleimhaut bedecken, weisen nicht nur die Barrierefunktion, die direkte Durchlässigkeit von äußeren Reizmitteln in Submukosagewebe verhindert, und die Funktion, Schleimsekretionen oder Fremdstoffe auszuscheiden, auf, sondern regulieren ebenso die Bronchokonstriktion durch sekretierte Epithel-abgeleitete Glattmuskel-Relaxationsfaktoren usw. Eosinophile, die in die Atemwege des Patienten mit Bronchialasthma eindringen, setzen während der Degranulation von intrazellulären Granula Proteine wie aktiviertes MBP (Major Basic Protein), ECP (eosinophiles kationisches Protein) usw. frei [Compr. Ther., 20, 651 (1994)]. Durch die zytotoxische Wirkung dieser Granulaproteine treten die Exfoliation und Schäden der Epithelzellen auf. Die Exfoliation von Epithelzellen führt zur Exponierung von Sinnesnervenenden, zur Erhöhung der Epithelpermeabilität und zum Verlust der Epithel-abgeleiteten Glattmuskelrelaxationsfaktoren. Ebenso erhöhen Leukotrien C4 (LTC4) oder Blutplättchen-Aktivierungsfaktor (PAF), die durch Eosinophile produziert wurden, die Spannung des Bronchienglattmuskels. Es wird angenommen, daß sich, wenn sich die vorstehenden Veränderungen wiederholen, was es chronisch macht, die Bronchienwände verdicken würden, so daß Atemwegshyperreaktivität verursacht wird.
Wie oben erwähnt, ist es bekannt, daß die Gene der Zytokine oder Adhäsionsmoleküle, die oben beschrieben werden, immer stärker exprimiert werden, begleitet von der Entzündung der Atemwege, aber es gibt keinen Bericht über die systematische Analyse der Veränderung der Gene, deren Expression in der Läsion von Lunge/Bronchien lokalisiert ist und die mit dem Ausbruch der Atemwegshyperreaktivität verbunden sind.
Andererseits wurde Chitinaseaktivität in Blutplasma aus Patienten mit Gaucher-Krankheit nachgewiesen [J. Clin. Invest., 93, 1288 (1994)], das Protein wurde als einzige Chitinase bei einem Säuger gereinigt [J. Biol. Chem., 270, 2198 (1995)] und das Gen wurde geklont [J. Biol. Chem., 270, 26252 (1995)]. Diese Chitinase ist als ein Krankheitsmarker verwendet worden, aber es ist keine Beziehung zwischen Bronchialasthma und Chitinase berichtet worden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Protein, dessen Expression sich in der Lunge/Bronchien mit erhöhter Atemwegshyperreaktivität erhöht, oder Salze davon, sein Teilpeptid oder Salze davon, sein Signalpeptid; eine DNA, die das Protein codiert, sein Teilpeptid oder Signalpeptid; rekombinante Vektoren; Transformanten; Verfahren zur Herstellung des Proteins; pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend das Protein oder die DNA; Antikörper gegen das Protein; Verfahren zum Screenen von Verbindungen, die die Expression des Proteins unterdrücken oder beschleunigen; Verfahren zum Screenen von Verbindungen, die die Aktivität des Proteins unterdrücken oder beschleunigen; Verbindungen, die durch die Screening-Verfahren erhältlich sind; usw. bereit.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die betreffenden Erfinder führten intensive Studien durch, um die vorerwähnten Probleme zu lösen, und entdeckten infolgedessen ein Gen, dessen Expression sich in der/den Lunge/Bronchien eines Mausasthmamodels merklich erhöhte. Außerdem hatten die Erfinder, basierend auf der Basensequenz dieses Gens, beim Klonen einer cDNA mit einer neuen Basensequenz aus einer menschlichen Magen-cDNA-Bibliothek Erfolg, und fanden heraus, daß ein Protein, das durch die cDNA codiert wird, zu der Chitanasefamilie gehört.
Basierend auf diesen Ergebnissen setzten die Erfinder ihre Untersuchungen fort, um die vorliegende Erfindung zu erreichen.
Das heißt, die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die folgenden Merkmale.

(1) Protein, enthaltend die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, oder ein Salz hiervon.
(2) DNA, enthaltend eine DNA, die das Protein gemäß (1) codiert.
(3) DNA gemäß (2) mit der Basensequenz, die durch SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist.
(4) Rekombinanter Vektor, enthaltend die DNA gemäß (2).
(5) Transformante, transformiert mit dem rekombinanten Vektor gemäß (4).
(6) Verfahren zur Herstellung des Proteins gemäß (1) oder eines Salzes hiervon, umfassend das Kultivieren der Transformante von (5) und Produzieren und Akkumulieren des Proteins gemäß (1) und Sammeln desselben.
(7) Pharmazeutikum, umfassend das Protein gemäß (1) oder ein Salz hiervon oder die DNA gemäß (2).
(8) Antikörper gegen das Protein gemäß (1) oder ein Salz hiervon.
(9) Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder eines Salzes hiervon, die zur Förderung oder Inhibierung der Aktivität des Proteins gemäß (1) oder eines Salzes hiervon fähig ist, umfassend die Verwendung des Proteins gemäß (1) oder eines Salzes hiervon.
(10) Kit zum Screenen einer Verbindung oder eines Salzes hiervon, die zum Fördern oder Inhibieren der Aktivität des Proteins gemäß (1) oder eines Salzes hiervon fähig ist, umfassend das Protein gemäß (1) oder ein Salz hiervon.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Gewebeverteilung des ECF-L-Gens (mRNA) in einer normalen Maus und einer Modellmaus mit erhöhter Atemwegshyperreaktivität, wobei Lu, H, Li, Ki, Br, Thy, Sp, SI, LI, St und PBL Lunge, Herz, Leber, Niere, Gehirn, Thymus, Milz, Dünndarm, Dickdarm, Magen bzw. periphere Blutlymphozyte in Beispiel 2 bezeichnen.
2 zeigt einen Verabreichungsplan in dem in Beispiel 3 beschriebenen Experiment.
3 zeigt die Veränderung der Atemwegsreaktivität im Verlauf der Zeit durch die Verabreichung von Acetylcholin in einer Dosis von 500 μg/kg, wobei Ach Acetylcholin ist.
4 zeigt die Veränderung im Verlauf der Zeit in zahlreichen eingedrungenen Zellen in der alveolären Lavageflüssigkeit, die in Beispiel 3 gezeigt wird, wobei Mϕ, Eos, Neu und Lym Makrophage, Eosinophile, Neutrophile bzw. Lymphozyte bezeichnen.
5 zeigt die Veränderung des ECF-L-Gens (mRNA) im Verlauf der Zeit in einer Modellmaus mit erhöhter Atemwegshyperreaktivität, die in Beispiel 3 gezeigt wird.
6 gibt die Expressionsstelle des ECF-L-Gens auf gefrorenen Abschnitten von der Modellmaus mit erhöhter Atemwegshyperreaktivität und der normalen Maus an, gezeigt in Beispiel 4.
7 zeigt einen Vergleich der Basensequenz zwischen DNA (menschliches ECF-L), die das vom Menschen stammende ECF-L-artige Protein codiert, und dem Maus-ECF-L-Gen (Maus ECF-L).
8 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenz zwischen dem vom Menschen stammenden ECF-L-artigen Protein (menschliches ECF-L) und dem Maus-ECF-L-Gen (Maus ECF-L).
9 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenz zwischen dem vom Menschen stammenden ECF-L-artigen Protein (menschliches ECF-L) und anderen Proteinen (menschliche Chitotriosidase, menschliches HC-gp39prt, menschliches YKL-39), die zu der Chitinasefamilie gehören (fortgesetzt mit 10).
10 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenz zwischen dem vom Menschen stammenden ECF-L-artigen Protein (menschliches ECF-L) und anderen Proteinen (menschliche Chitotriosidase, menschliches HC-gp39prt, menschliches YKL-39), die zu der Chitinasefamilie gehören (Fortsetzung von 9).
11 zeigt die Gewebeverteilung des Gens (mRNA), das das vom Menschen stammende ECF-L-artige Protein codiert.
BESTE WEISE ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Das erfindungsgemäße Protein, enthaltend die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, (hierin nachstehend manchmal als erfindungsgemäßes Protein bezeichnet), kann jedes Protein sein, das aus jeglichen Zellen vom Menschen oder anderen Warmbluttieren (beispielsweise Meerschwein, Ratte, Maus, Huhn, Kaninchen, Schwein, Schaf, Rind, Affe usw.) stammt, wie Hepatozyt, Splenozyt, Nervenzellen, Glialzellen, β-Zellen der Bauchspeicheldrüse, Knochenmarkzellen, Mesangiumzellen, Langerhans-Zellen, Epidermiszellen, Epithelzellen, Becherzellen, Endothelzellen, Glattmuskelzellen, Fibroblasten, Fibrozyten, Myozyten, Fettzellen, Immunzellen (beispielsweise Makrophage, T-Zellen, B-Zellen, natürliche Killerzellen, Mastzellen, Neutrophile, Basophile, Eosinophile, Monozyten), Megakaryozyten, Synovialzellen, Chondrozyten, Knochenzellen, Osteoblasten, Osteoklasten, Brustdrüsenzellen, Hepatozyten- oder Interstitialzellen; oder die entsprechenden Präkursorzellen, Stammzellen, Krebszellen usw; oder jegliche Gewebe, wo diese Zellen vorliegen, wie Gehirn oder jede der Gehirnregionen (beispielsweise Bulbus olfactorius, Mandelkern, Basalganglien, Hippocampus, Thalamus, Hypothalamus, Hirnrinde, Medulla oblongata, Kleinhirn), Rückenmark, Hypophyse, Magen, Bauchspeicheldrüse, Niere, Leber, Geschlechtsdrüse, Schilddrüse, Gallenblase, Knochenmark, Nebenniere, Haut, Muskel, Lunge, Magen-Darm-Trakt (beispielsweise Dickdarm und Dünndarm), Blutgefäß, Herz, Thymus, Milz, Glandula submandibularis, peripheres Blut, Prostata, Hoden, Eierstock, Plazenta, Gebärmutter, Knochen, Gelenk, Skelettmuskel usw.; die Proteine können ebenso synthetische Proteine sein.
Als Aminosäuresequenz mit im wesentlichen derselben Aminosäuresequenz wie die, die durch SEQ ID Nr. 1 gezeigt wird, gibt es Aminosäuresequenzen mit mindestens etwa 80 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 90 % Homologie und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95 % Homologie, zu der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID Nr. 1 gezeigt wird.
Bevorzugte Beispiele des Proteins, enthaltend im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID Nr. 1 gezeigt wird, umfassen Proteine mit im wesentlichen derselben Aminosäuresequenz wie der Aminosäuresequenz, die durch die SEQ ID Nr. 1 gezeigt wird, und mit Eigenschaften, die im wesentlichen äquivalent zu der des Proteins mit der Aminosäuresequenz sind, die durch SEQ ID Nr. 1 gezeigt wird, usw.
Beispiele der Eigenschaften, die im wesentlichen äquivalent sind, umfassen Expressionsmuster, Expressionstiming, Chitinaseaktivität und dergleichen in der/den Lunge/Bronchien. Im wesentlichen äquivalent soll so verstanden werden, daß die Natur dieser Eigenschaften qualitativ äquivalent ist. Vorzugsweise sind das Expressionsmuster, das Expressionstiming, die Chitinaseaktivität usw. in der/den Lunge/Bronchien äquivalent, aber Unterschiede im Grad, wie Niveau dieser Eigenschaften, quantitativer Faktoren, wie Molekulargewicht des Proteins., können vorliegen und möglich sein.
Beispiele des erfindungsgemäßen Proteins umfassen sogenannte Muteine, wie Proteine, enthaltend 1) die Aminosäuresequenz, die durch die SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, von der mindestens 1 oder 2 (vorzugsweise etwa 1 bis etwa 30, stärker bevorzugt etwa 1 bis etwa 10 und am stärksten bevorzugt mehrere (1 bis 5)) Aminosäuren deletiert sind; 2) die Aminosäuresequenz, die durch die SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, zu der mindestens 1 oder 2 (vorzugsweise etwa 1 bis etwa 30, stärker bevorzugt etwa 1 bis etwa 10 und am stärksten bevorzugt mehrere (1 bis 5)) Aminosäuren hinzugefügt sind; 3) die Aminosäuresequenz, die durch die SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, in die mindestens 1 oder 2 (vorzugsweise etwa 1 bis etwa 30, stärker bevorzugt etwa 1 bis etwa 10 und am stärksten bevorzugt mehrere (1 bis 5)) Aminosäuren insertiert sind; 4) die Aminosäuresequenz, die durch die SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, bei der mindestens 1 oder 2 (vorzugsweise etwa 1 bis etwa 30, stärker bevorzugt etwa 1 bis etwa 10 und am stärksten bevorzugt mehrere (1 bis 5)) Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt sind; oder 5) eine Kombination der obigen Aminosäuresequenzen.
In der gesamten Beschreibung werden die Proteine gemäß dem konventionellen Weg zum Beschreiben von Proteinen dargestellt, das heißt, der N-Terminus (Aminoterminus) auf der linken und der C-Terminus (Carboxylterminus) auf der rechten Seite. Bei dem erfindungsgemäßen Protein, einschließlich dem Protein, enthaltend die Aminosäuresequenz, die durch die SEQ ID Nr. 1 gezeigt wird, liegt der C-Terminus normalerweise in Form einer Carboxylgruppe (-COOH) oder eines Carboxylats (-COO^–) vor, kann aber in Form eines Amids (-CONH₂) oder eines Esters (-COOR) vorliegen.
Beispiele der Estergruppe, die durch R dargestellt ist, umfassen eine C_1-6-Alkylgruppe wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl usw.; eine C_3-8-Cycloalkylgruppe wie Cyclopentyl, Cyclohexyl usw.; eine C_6-12-Arylgruppe wie Phenyl, α-Naphthyl usw.; ein C_7-14-Aralkyl wie eine Phenyl-C_1-2-alkylgruppe, beispielsweise Benzyl, Phenethyl usw.; eine α-Naphthyl-C_1-2-alkylgruppe wie α-Naphthylmethyl usw.; Pivaloyloxymethyl und dergleichen.
Wo das erfindungsgemäße Protein eine Carboxylgruppe (oder ein Carboxylat) an einer anderen Stellung als dem C-Terminus enthält, kann es amidiert oder verestert werden, und ein solches Amid oder ein solcher Ester ist ebenso in das erfindungsgemäße Protein einbezogen. Die Estergruppe kann dieselbe Gruppe wie die sein, die in bezug auf den obigen C-Terminus beschrieben wurde.
Außerdem umfassen Beispiele des erfindungsgemäßen Proteins Varianten der obigen Proteine, worin die Aminogruppe an dem N-Terminus (beispielsweise Methioninrest) des Proteins mit einer Schutzgruppe (beispielsweise einer C_1-6-Acylgruppe wie einer C_1-6-Alkanoylgruppe, beispielsweise Formylgruppe, Acetylgruppe usw.) geschützt ist; die, worin die N-terminale Region in vivo gespalten wird und die so gebildete Glutamylgruppe pyroglutaminiert wird; die, worin ein Substituent (beispielsweise -OH, -SH, Aminogruppe, Imidazolgruppe, Indolgruppe, Guanidinogruppe usw.) an der Seitenkette einer Aminosäure in dem Molekül mit einer geeigneten Schutzgruppe (beispielsweise einer C_1-6-Acylgruppe wie einer C_1-6-Alkanoylgruppe, beispielsweise Formylgruppe, Acetylgruppe usw.) geschützt wird, oder konjugierte Proteine wie Glykoproteine mit Zuckerketten.
Spezielle Beispiele des erfindungsgemäßen Proteins umfassen ein vom menschlichen Magen stammendes Protein, enthaltend die Aminosäuresequenz, die durch die SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, und dergleichen.
Das erfindungsgemäße Protein, enthaltend dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, die durch die SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, umfaßt außerdem beispielsweise Präkursorproteine, in denen mindestens eine oder zwei Aminosäuren, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 200, stärker bevorzugt etwa 1 bis etwa 100, und am stärksten bevorzugt etwa 1 bis etwa 50, Aminosäuren am N-Terminus oder (und) am C-Terminus des erfindungsgemäßen Proteins, das oben beschrieben ist, konjugiert werden (hierin nachstehend manchmal lediglich als das erfindungsgemäße Präkursorprotein bezeichnet).
Das erfindungsgemäße Präkursorprotein kann Proteine sein, die aus Zellen von beispielsweise Menschen und anderen Warmbluttieren stammen (beispielsweise Meerschweinchen, Ratte, Maus, Huhn, Kaninchen, Schwein, Schaf, Rind, Affe usw.), oder jedes Gewebe, in dem diese Zellen vorliegen; oder kann ebenso synthetische Proteine sein.
Das erfindungsgemäße Präkursorprotein kann jedes Protein sein, das zur Produktion des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Proteins fähig ist. Daher können Unterschiede in den quantitativen Faktoren wie Molekulargewicht des Proteins vorliegen und zulässig sein.
In dem erfindungsgemäßen Präkursorprotein liegt der C-Terminus normalerweise in Form einer Carboxylgruppe (-COOH) oder eines Carboxylats (-COO^–) vor, kann aber in Form eines Amids (-CONH₂) oder eines Esters (-COOR) wie in dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Protein vorliegen.
Wenn das erfindungsgemäße Präkursorprotein andere Carboxylgruppen (oder Carboxylate) als am C-Terminus enthält, umfaßt das Präkursorprotein außerdem Proteine, in denen die Carboxylgruppen amidiert oder verestert sind; die, worin die Aminogruppe des N-terminalen Aminosäurerestes (beispielsweise Methioninrest) mit einer Schutzgruppe geschützt ist; die, worin die N-terminale Region in vivo gespalten ist und das so gebildete Glutamin pyroglutaminiert ist; die, wobei ein Substituent an der Seitenkette einer Aminosäure in dem Molekül mit einer geeigneten Schutzgruppe geschützt ist; oder konjugierte Proteine wie die sogenannten Glykoproteine, an die Zuckerketten gebunden sind; usw., wie in dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Protein.
Spezielle Beispiele des erfindungsgemäßen Präkursorproteins sind ein Protein, bei dem das erfindungsgemäße Signalpeptid, enthaltend die Aminosäuresequenz, die durch die später beschriebene SEQ ID Nr. 2 dargestellt ist, an den N-Terminus des erfindungsgemäßen Proteins, das durch die SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, gebunden ist (d. h., ein Protein, enthaltend die Aminosäuresequenz, die durch die SEQ ID Nr. 5 dargestellt ist), und dergleichen.
Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Präkursorprotein, enthaltend das erfindungsgemäße Signalpeptid, das später beschrieben wird, das erfindungsgemäße Protein extrazellulär effizient sekretieren. Das Präkursorprotein ist ebenso als ein Zwischenprodukt zur Herstellung des erfindungsgemäßen Proteins nützlich.
Das erfindungsgemäße Präkursorprotein kann eine ähnliche Aktivität wie das erfindungsgemäße Proteins aufweisen und in ähnlicherweise wie das erfindungsgemäße Protein verwendet werden.
Das Teilpeptid (hierin nachstehend manchmal nur als das erfindungsgemäße Teilpeptid bezeichnet) des erfindungsgemäßen Proteins kann irgendein Peptid sein, so lange wie es ein Teilpeptid des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Proteins ist und vorzugsweise die Eigenschaften aufweist, die denen des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Peptids äquivalent sind. Beispiele des Teilpeptids umfassen Peptide, das mindestens 20, bevorzugt mindestens 50, stärker bevorzugt mindestens 70, noch stärker bevorzugt mindestens 100 und am stärksten bevorzugt mindestens 200, Aminosäuren in der konstituierenden Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Proteins enthält, und dergleichen.
Das erfindungsgemäße Teilpeptid kann Peptide sein, enthaltend die Aminosäuresequenz, von der mindestens 1 oder 2 (bevorzugt etwa 1 bis etwa 10 und stärker bevorzugt etwa mehrere (1 bis 5)) Aminosäuren deletiert sind; Peptide, zu denen mindestens 1 oder 2 (bevorzugt etwa 1 bis etwa 10 und stärker bevorzugt etwa mehrere (1 bis 5)) Aminosäuren hinzugefügt sind; Peptide, in die mindestens 1 oder 2 (bevorzugt etwa 1 bis etwa 10 und am stärksten bevorzugt mehrere (1 bis 5)) Aminosäuren insertiert sind; oder Peptide, bei denen mindestens 1 oder 2 (bevorzugt etwa 1 bis etwa 10 und am stärksten bevorzugt mehrere (1 bis 5)) Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt sind.
In dem erfindungsgemäßen Teilpeptid liegt der C-Terminus normalerweise in Form einer Carboxylgruppe (-COOH) oder eines Carboxylats (-COO^–) vor, aber kann in Form eines Amids (-CONH₂) oder eines Esters (-COOR) vorliegen, wie in dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Protein.
Wenn das erfindungsgemäße Teilpeptid andere Carboxylgruppen (oder Carboxylate) als am C-Terminus enthält, umfaßt das Teilpeptid außerdem Proteine, worin die Carboxylgruppen amidiert oder verestert sind; die, worin die Aminogruppe des N-terminalen Aminosäurerests (beispielsweise Methioninrest) mit einer Schutzgruppe geschützt sind; die, worin die N-terminale Region in vivo gespalten ist und das so gebildete Glutamin pyroglutaminiert ist; die, worin ein Substituent an der Seitenkette einer Aminosäure in dem Molekül mit einer geeigneten Schutzgruppe geschützt ist, oder konjugierte Proteine, wie die sogenannten Glykoproteine, an die Zuckerketten gebunden sind, usw., wie in dem oben beschriebenen Protein.
Das erfindungsgemäße Teilpeptid kann ebenso als ein Antigen zur Produktion von Antikörpern verwendet werden.
Als das erfindungsgemäße Signalpeptid werden die eingesetzt, die dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz enthalten, die beispielsweise durch die SEQ ID Nr. 2 dargestellt ist, und dergleichen (hierin nachstehend manchmal nur als das erfindungsgemäße Signalpeptid bezeichnet).
Das erfindungsgemäße Signalpeptid kann Proteine sein, die aus Zellen von beispielsweise Menschen oder anderen Warmbluttieren stammen (beispielsweise Meerschweinchen, Ratte, Maus, Huhn, Kaninchen, Schwein, Schaf, Rind, Affe usw.), oder jedes Gewebe, in dem diese Zellen vorliegen; oder kann ebenso synthetische Proteine sein.
Als die Aminosäuresequenz mit im wesentlichen derselben Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, die durch die SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist, gibt es Aminosäuresequenzen mit mindestens etwa 70 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 80 % Homologie, stärker bevorzugt mindestens etwa 90 % und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95 % Homologie zu der Aminosäuresequenz, die durch die SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist. Spezieller kann das Signalpeptid irgendein Peptid sein, das im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie die Aminosäuresequenz, die durch die SEQ ID Nr. 2 gezeigt wird, aufweist und die Funktion als ein Signalpeptid aufweisen kann. Daher können Unterschiede in quantitativen Faktoren wie Molekulargewicht des Proteins vorliegen und zulässig sein.
Das erfindungsgemäße Signalpeptid kann Peptide sein, enthaltend die Aminosäuresequenz, von der mindestens 1 oder 2 (bevorzugt etwa 1 bis etwa 10 und stärker bevorzugt mehrere (1 bis 5)) Aminosäuren deletiert sind; Peptide, zu denen mindestens 1 oder 2 (bevorzugt etwa 1 bis etwa 10 und stärker bevorzugt mehrere (1 bis 5)) Aminosäuren hinzugefügt sind; Peptide, in die mindestens 1 oder 2 (bevorzugt etwa 1 bis etwa 10 und stärker bevorzugt mehrere (1 bis 5)) Aminosäuren insertiert sind; oder Peptide, bei denen mindestens 1 oder 2 (bevorzugt etwa 1 bis etwa 10 und stärker bevorzugt mehrere (1 bis 5)) Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt sind.
Bei dem erfindungsgemäßen Signalpeptid liegt der C-Terminus normalerweise in Form einer Carboxylgruppe (-COOH) oder eines Carboxylats (-COO^–) vor, aber können in Form eines Amids (-CONH₂) oder eines Esters (-COOR) vorliegen, wie in dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Protein.
Wenn das erfindungsgemäße Signalpeptid andere Carboxylgruppen (oder Carboxylate) als am C-Terminus enthält, umfaßt das Signalpeptid außerdem Proteine, worin die Carboxylgruppen amidiert oder verestert sind; die, worin die Aminogruppe des N-terminalen Aminosäurerests (beispielsweise Methioninrest) mit einer Schutzgruppe geschützt ist; die, worin die N-terminale Region in vivo gespalten wird und das so gebildete Glutamin pyroglutaminiert ist; die, worin ein Substituent an der Seitenkette einer Aminosäure in dem Molekül mit einer geeigneten Schutzgruppe geschützt ist, oder konjugierte Proteine, wie die sogenannten Glykoproteine, an die Zuckerketten gebunden sind; usw., wie in dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Protein.
Spezielle Beispiele des erfindungsgemäßen Signalpeptids sind Peptide, enthaltend die Aminosäuresequenz, die durch die SEQ ID Nr. 2 dargestellt ist, worin das erfindungsgemäße Protein, enthaltend die Aminosäuresequenz, die durch die SEQ ID NR. 1 dargestellt ist, aus dem erfindungsgemäßen Präkursorprotein, enthaltend die Aminosäuresequenz, die durch die SEQ ID NR. 5 dargestellt ist, entfernt worden ist, und dergleichen.
Das erfindungsgemäße Signalpeptid kann eine Vielzahl von extrazellulären Sekretionsproteinen, einschließlich des erfindungsgemäßen Proteins, extrazellulär effizient sekretieren.
Das Protein, Präkursorprotein, Teilpeptid oder Signalpeptid der vorliegenden Erfindung kann in Form von Salzen mit physiologisch akzeptablen Säuren (beispielsweise anorganischen Säuren oder organischen Säuren) oder Basen (beispielsweise Alkalimetallsalzen), vorzugsweise in Form von physiologisch akzeptablen Säureadditionssalzen verwendet werden. Bei spiele von solchen Salzen sind Salze mit anorganischen Säuren (beispielsweise Salzsäure, Phosphorsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure), Salze mit organischen Säuren (beispielsweise Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Apfelsäure, Oxasäure, Benzoesäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure) und dergleichen.
Das Protein, Präkursorprotein, Teilpeptid oder Signalpeptid der vorliegenden Erfindung oder Salze davon können durch ein öffentlich bekanntes Verfahren hergestellt werden, das verwendet wird, um ein Protein aus oben beschriebenen menschlichen oder anderen Warmbluttierzellen oder -geweben zu reinigen. Alternativ können sie ebenso durch Kultivieren von Transformanten, die DNAs enthalten, die diese Proteine oder Peptide codieren, hergestellt werden. Außerdem können sie ebenso durch eine Modifikation der Verfahren zur Peptidsynthese hergestellt werden, die hierin nachstehend beschrieben wird.
Wo diese Proteine oder Peptide aus menschlichen oder Säugetiergeweben oder -zellen hergestellt werden, werden die menschlichen oder Säugetiergeweben oder -zellen homogenisiert, dann mit einer Säure oder dergleichen extrahiert, und das Extrakt wird isoliert und durch eine Kombination aus Chromatographietechniken, wie Umkehrphasenchromatographie, Ionenaustauschchromatographie und dergleichen, gereinigt.
Um das Protein, Präkursorprotein, Teilpeptid oder Signalpeptid der vorliegenden Erfindung oder Amide davon zu synthetisieren, können kommerziell erhältliche Harze, die für die Proteinsynthese genutzt werden können, verwendet werden. Beispiele von solchen Harzen umfassen Chlormethylharz, Hydroxymethylharz, Benzhydrylaminharz, Aminomethylharz, 4-Benzyloxybenzylalkoholharz, 4-Methylbenzhydrylaminharz, PAM-Harz, 4-Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethylharz, Polyacrylamidharz, 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-hydroxymethyl)phenoxyharz, 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl)phenoxyharz usw. Unter Verwendung dieser Harze werden Aminosäuren, in denen α-Aminogruppen und funktionelle Gruppen an den Seitenketten geeignet geschützt werden, auf dem Harz in der Reihenfolge der Sequenz des jeweiligen Proteins oder Peptids gemäß verschiedenen Kondensationsverfahren, die in der Technik öffentlich bekannt sind, kondensiert. Am Ende der Reaktion wird das Protein oder Peptid aus dem Harz entfernt und gleichzeitig werden die Schutzgruppen entfernt. Dann wird die intramolekulare Disulfidbin dungen bildende Reaktion in einer stark verdünnten Lösung durchgeführt, um das jeweilige Protein oder Peptid oder Amide davon zu erhalten.
Für die Kondensation der oben beschriebenen geschützten Aminosäuren kann eine Vielzahl von Aktivierungsreagenzien für die Proteinsynthese verwendet werden, aber Carbodiimide werden besonders bevorzugt eingesetzt. Beispiele von solchen Carbodiimiden umfassen DCC, N,N'-Diisopropylcarbodiimid, N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid usw. Für die Aktivierung durch diese Reagenzien werden die geschützten Aminosäuren in Kombination mit einem Racemisierungsinhibitor (beispielsweise HOBt, HOOBt) direkt zu dem Harz gegeben, oder die geschützten Aminosäuren werden zuvor in Form von symmetrischen Säureanhydriden, HOBt-Estern oder HOOBt-Estern aktiviert, gefolgt von der Zugabe der so aktivierten Aminosäuren zu dem Harz.
Lösungsmittel, die zur Verwendung geeignet sind, um die geschützten Aminosäuren zu aktivieren oder mit dem Harz zu kondensieren, können aus Lösungsmitteln ausgewählt werden, die dafür bekannt sind, daß sie für Proteinkondensationsreaktionen nützlich sind. Beispiele von solchen Lösungsmitteln sind Säureamide wie N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid, N-Methylpyrrolidon usw.; halogenierte Kohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid, Chloroform usw.; Alkohole wie Trifluorethanol usw.; Sulfoxide wie Dimethylsulfoxid usw.; Ether wie Pyridin, Dioxan, Tetrahydrofuran usw.; Nitrile wie Acetonitril, Propionitril usw.; Ester wie Methylacetat, Ethylacetat usw.; und geeignete Gemische aus diesen Lösungsmitteln. Die Reaktionstemperatur wird geeigneterweise aus dem Bereich ausgewählt, von dem bekannt ist, daß er auf Proteinbindungsreaktionen anwendbar ist, und wird normalerweise in dem Bereich von ungefähr –20 °C bis 50 °C ausgewählt. Die aktivierten Aminosäurederivate werden im allgemeinen in einem 1,5- bis 4fachen Überschuß verwendet. Die Kondensation wird unter Verwendung der Ninhydrinreaktion untersucht; wenn die Kondensation unzureichend ist, kann die Kondensation durch Wiederholen der Kondensationsreaktion ohne Entfernung der Schutzgruppen vervollständigt werden. Wenn die Kondensation selbst nach dem Wiederholen der Reaktion noch unzureichend ist, werden nicht umgesetzte Aminosäuren mit Essigsäureanhydrid oder Acetylimidazol acetyliert, um jede mögliche nachteilige Auswirkung auf die anschließende Reaktion zu beseitigen.
Beispiele der Schutzgruppen, die verwendet werden, um die Ausgangsaminogruppen zu schützen, umfassen Z, Boc, t-Pentyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, Adamantyloxycarbonyl, Trifluoracetyl, Phthaloyl, Formyl, 2-Nitrophenylsulphenyl, Diphenylphosphinothioyl, Fmoc usw.
Eine Carboxylgruppe kann durch beispielsweise Alkylveresterung (in Form von linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylestern der Alkyleinheit, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, t-Butyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, Cyclooctyl, 2-Adamantyl usw.), Aralkylveresterung (beispielsweise Veresterung in Form von Benzylester, 4-Nitrobenzylester, 4-Methoxybenzylester, 4-Chlorbenzylester, Benzhydrylester usw.), Phenacylveresterung, Benzyloxycarbonylhydrazidierung, t-Butoxycarbonylhydrazidierung, Tritylhydrazidierung oder dergleichen geschützt werden.
Die Hydroxylgruppe von Serin kann durch beispielsweise ihre Veresterung oder Veretherung geschützt werden. Beispiele von Gruppen, die geeigneterweise für die Veresterung verwendet werden, umfassen eine niedere C_1-6-Alkanoylgruppe wie Acetylgruppe, eine Aroylgruppe wie Benzoylgruppe, und eine Gruppe, die von Kohlensäure abgeleitet ist, wie Benzyloxycarbonylgruppe und Ethoxycarbonylgruppe. Beispiele einer Gruppe, die geeigneterweise für die Veretherung verwendet wird, umfassen eine Benzylgruppe, Tetrahydropyranylgruppe, t-Butylgruppe usw.
Beispiele von Gruppen zum Schützen der phenolischen Hydroxylgruppe von Tyrosin umfassen Bzl, Cl₂-Bzl, 2-Nitrobenzyl, Br-Z, t-Butyl usw.
Beispiele von Gruppen, die verwendet werden, um die Imidazoleinheit von Histidin zu schützen, umfassen Tos, 4-Methoxy-2,3,6-trimethyl-benzolsulfonyl, DNP, Benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc usw.
Beispiele der aktivierten Carboxylgruppen in den Ausgansaminosäuren umfassen die entsprechenden Säureanhydride, Azide, aktivierten Ester (Ester mit Alkoholen (beispielsweise Pentachlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, 2,4-Dinitrophenol, Cyanomethylalkohol, p-Nitrophenol, HONB, N-Hydroxysuccimid, N-Hydroxyphthalimid, HOBt)). Als die aktivierten Aminosäu ren, in denen die Aminogruppen in dem Ausgangsmaterial aktiviert sind, werden die entsprechenden Phosphoramide eingesetzt.
Um die Schutzgruppen zu beseitigen (abzuspalten), werden verwendet: die katalytische Reduktion unter Wasserstoffgasfluß in Gegenwart eines Katalysators, wie Pd-Ruß oder Pd-Kohlenstoff; eine Säurebehandlung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff, Methansulfonsäure, Trifluormethansulfonsäure oder Trifluoressigsäure, oder einer Mischlösung aus diesen Säuren; eine Behandlung mit einer Base wie Diisopropylethylamin, Triethylamin, Piperidin oder Piperazin; und Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak. Die Beseitigung der Schutzgruppe durch die oben beschriebene Säurebehandlung wird im allgemeinen bei einer Temperatur von ungefähr –20 °C bis 40 °C durchgeführt. Bei der Säurebehandlung ist es effizient, einen Kationenfänger, wie Anisol, Phenol, Thioanisol, m-Cresol, p-Cresol, Dimethylsulfid, 1,4-Butandithiol oder 1,2-Ethandithiol hinzuzugeben. Außerdem wird die 2,4-Dinitrophenylgruppe, bekannt als die Schutzgruppe für das Imidazol von Histidin, durch eine Behandlung mit Thiophenol entfernt. Die Formylgruppe, die als die Schutzgruppe des Indols von Tryptophan verwendet wird, wird durch die zuvor genannte Säurebehandlung in Gegenwart von 1,2-Ethandithiol oder 1,4-Butandithiol sowie durch eine Behandlung mit einem Alkali wie einer verdünnten Natriumhydroxidlösung und verdünntem Ammoniak entfernt.
Der Schutz der funktionellen Gruppen, die nicht in die Reaktion der Ausgangsmaterialien involviert sind, die Schutzgruppen, die Beseitigung der Schutzgruppen und die Aktivierung der funktionellen Gruppen, die in die Reaktion involviert sind, können geeigneterweise aus öffentlich bekannten Gruppen und öffentlich bekannten Verfahren ausgewählt werden.
In einem anderen Verfahren für den Erhalt der Amide des gewünschten Proteins oder Peptids wird beispielsweise die α-Carboxylgruppe der Carboxy-terminalen Aminosäure zuerst durch Amidierung geschützt; die Peptid(protein)kette wird dann von der Aminogruppenseite auf eine gewünschte Länge verlängert. Danach werden ein Protein oder Peptid, bei dem nur die Schutzgruppe der N-terminalen α-Aminogruppe der Peptidkette beseitigt worden ist, und ein Protein oder Peptid, bei dem nur die Schutzgruppe der C-terminalen Carboxylgruppe beseitigt worden ist, hergestellt. Die zwei Proteine oder Peptide werden in einem Gemisch aus den oben beschriebenen Lösungsmitteln kondensiert. Die Einzelheiten der Kondensationsreaktion sind dieselben wie oben beschrieben. Nachdem das geschützte Protein oder Peptid, das durch die Kondensation erhalten wurde, gereinigt wird, werden alle Schutzgruppen durch das oben beschriebene Verfahren beseitigt, um das gewünschte rohre Protein oder Peptid zu erhalten. Dieses rohe Protein oder Peptid wird durch verschiedene bekannte Reinigungsverfahren gereinigt. Die Lyophilisierung der Hauptfraktion ergibt das Amid des gewünschten Proteins oder Peptids.
Um das veresterte Protein oder Peptid herzustellen, wird beispielsweise die α-Carboxylgruppe der Carboxy-terminalen Aminosäure mit einem gewünschten Alkohol kondensiert, um den Aminosäureester herzustellen, gefolgt von der Verfahrensweise ähnlich der Herstellung des obigen amidierten Proteins oder Peptids, um das gewünschte veresterte Protein oder Peptid zu erhalten.
Das Teilprotein, Signalpeptid oder Salz davon der vorliegenden Erfindung kann durch öffentlich bekannte Verfahren zur Peptidsynthese oder durch Abspalten des Proteins oder Präkursorproteins der vorliegenden Erfindung mit einer geeigneten Peptidase hergestellt werden. Für die Verfahren für die Peptidsynthese kann beispielsweise entweder die Festphasensynthese oder Flüssigphasensynthese verwendet werden. Das heißt, das Teilpeptid oder die Aminosäuren, die das erfindungsgemäße Teilpeptid oder Signalpeptid bilden können, werden mit dem übrigen Teil kondensiert. Wo das Produkt Schutzgruppen enthält, werden diese Schutzgruppen entfernt, um das gewünschte Peptid zu erhalten. Öffentlich bekannte Verfahren zur Kondensation und Beseitigung der Schutzgruppen werden nachstehend in 1) bis 5) beschrieben.

1) M. Bodanszky & M.A. Ondetti: Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
2) Schroeder & Luebke: The Peptide, Academic Press, New York (1965)
3) Nobuo Izumiya, et al.: Peptide Gosei-no-Kiso to Jikken (Basics and experiments of peptide synthesis), veröffentlicht von Maruzen Co. (1975)
4) Haruaki Yajima & Shunpei Sakakibara: Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experiment) 1, Tanpakushitsu no Kagaku (Chemistry of Proteins) IV, 205 (1977)
5) Haruaki Yajima ed.: Zoku Iyakuhin no Kaihatsu (A sequel to Development of Pharmaceuticals), Bd. 14, Peptide Synthesis, veröffentlicht von Hirokawa Shoten

Nach Beendigung der Reaktion kann das Produkt durch eine Kombination von konventionellen Reinigungsverfahren gereinigt und isoliert werden, wie Lösungsmittelextraktion, Destillation, Säulenchromatographie, Flüssigchromatographie und Umkristallisierung, um das erfindungsgemäße Protein oder Peptid zu erhalten. Wenn das Protein oder Peptid, das durch die obigen Verfahren erhalten wurde, in freier Form vorliegt, kann das Peptid in ein geeignetes Salz durch ein öffentlich bekanntes Verfahren umgewandelt werden; wenn das Protein in einer Salzform vorliegt, kann es in eine freie Form oder andere, unterschiedliche Salzform durch ein öffentlich bekanntes Verfahren umgewandelt werden.
Die DNA, die das erfindungsgemäße Protein codiert, kann irgendeine DNA sein, so lange wie sie die Basensequenz enthält, die das oben beschriebene erfindungsgemäße Protein codiert. Die DNA kann ebenso irgendeine der genomischen DNA, genomischen DNA-Bibliothek, cDNA, die aus den oben beschriebenen Zellen oder Geweben stammt, cDNA-Bibliothek, die aus den oben beschriebenen Zellen oder Geweben stammt, und synthetische DNA sein.
Der Vektor, der für die Bibliothek verwendet werden soll, kann irgendeiner von Bakteriophage, Plasmid, Cosmid, Phagemid und dergleichen sein. Außerdem kann die DNA durch Umkehrtranskriptase-Polymerase-Kettenreaktion (hierin nachstehend als RT-PCR abgekürzt) mit der gesamten RNA- oder mRNA-Fraktion, hergestellt aus den oben beschriebenen Zellen oder Geweben, amplifiziert werden.
Speziell kann die DNA, die das erfindungsgemäße Protein codiert, beispielsweise eine DNA mit der Basensequenz, die durch die SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist, oder irgendeine DNA mit einer Basensequenz sein, die an eine DNA mit der Basensequenz, die durch die SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist, unter stark stringenten Bedingungen hybridisierbar ist und ein Protein codiert, das die Eigenschaften aufweist, die im wesentlichen zu denen des erfindungsgemäßen Proteins äquivalent sind.
Spezielle Beispiele der DNA, die zu der DNA mit der Basensequenz, die durch die SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist, unter stark stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, umfassen DNAs mit mindestens etwa 80 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 90 % Homologie und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95 % Homologie, zu der Basensequenz, die durch die SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist.
Die Hybridisierung kann durch öffentlich bekannte Verfahren oder durch eine Modifikation davon, beispielsweise gemäß dem Verfahren, das in Molecular Cloning, 2. Aufl., J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, (1989) beschrieben wird, durchgeführt werden. Eine kommerziell erhältliche Bibliothek kann ebenso gemäß den Instruktionen des beiliegenden Protokolls des Herstellers verwendet werden. Die Hybridisierung kann vorzugsweise unter stark stringenten Bedingungen durchgeführt werden.
Die hierin verwendeten stark stringenten Bedingungen sind beispielsweise die in einer Natriumkonzentration bei etwa 19 mM bis etwa 40 mM, bevorzugt etwa 19 mM bis etwa 20 mM bei einer Temperatur von etwa 50 °C bis etwa 70 °C, bevorzugt etwa 60 °C bis etwa 65 °C. Insbesondere sind Hybridisierungsbedingungen in einer Natriumkonzentration bei etwa 19 mM bei einer Temperatur von etwa 65 °C am stärksten bevorzugt.
Spezieller kann als die DNA, die das Protein mit der Aminosäuresequenz codiert, die durch die SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, eine DNA eingesetzt werden, die eine DNA mit der Basensequenz, die durch die SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist, enthält.
Die DNA, die das erfindungsgemäße Präkursorprotein codiert, kann jegliche DNA sein, so lange wie sie die Basensequenz enthält, die das oben beschriebene erfindungsgemäße Präkursorprotein codiert. Die DNA kann ebenso irgendeine der genomischen DNA, genomischen DNA-Bibliothek, cDNA, die aus den oben beschriebenen Zellen und Geweben stammt, cDNA-Bibliothek, die aus den oben beschriebenen Zellen und Gewebe stammt, und synthetische DNA sein.
Speziell kann die DNA, die das erfindungsgemäße Präkursorprotein codiert, beispielsweise irgendeine DNA mit der Basensequenz, die durch die SEQ ID Nr. 16 dargestellt ist, oder irgendeine DNA mit einer Basensequenz sein, die zu einer DNA mit der Basensequenz, die durch die SEQ ID Nr. 16 dargestellt ist, hybridisierbar ist, und ein Protein codiert, das das oben beschriebene erfindungsgemäße Protein produzieren kann.
Als DNA, die zu der DNA mit der Basensequenz, die durch die SEQ ID Nr. 16 dargestellt ist, unter stark stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, gibt es beispielsweise DNAs, enthal tend die Basensequenzen mit mindestens etwa 80 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 90 % Homologie und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95 % Homologie, zu der Basensequenz, die durch die SEQ ID Nr. 16 gezeigt wird.
Verfahren für die Hybridisierung und die stark stringenten Bedingungen, die verwendet werden können, sind dieselben wie die oben beschriebenen.
Spezieller werden DNAs, enthaltend eine DNA mit der Basensequenz, die durch die SEQ ID Nr. 16 dargestellt ist, und dergleichen als die DNA eingesetzt, die das erfindungsgemäße Präkursorprotein, enthaltend die Aminosäuresequenz, die durch die SEQ ID Nr. 5 dargestellt ist, codiert.
Die DNA, die das erfindungsgemäße Teilpeptid codiert, kann irgendein Peptid sein, so lange wie es eine Basensequenz enthält, die das oben beschriebene erfindungsgemäße Teilpeptid codiert. Die DNA kann ebenso irgendeine der genomischen DNA, genomischen DNA-Bibliothek, cDNA, die aus den oben beschriebenen Zellen oder Geweben stammt, cDNA-Bibliothek, die aus den oben beschriebenen Zellen oder Geweben stammt, und synthetische DNA sein.
Als DNA, die das erfindungsgemäße Teilpeptid codiert, werden beispielsweise eine DNA mit einem Teil der Basensequenz, die durch die SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist, eine DNA mit einer Basensequenz, die zu einer DNA mit der Basensequenz, die durch die SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist, unter stark stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, und einen Teil der DNA enthält, die ein Protein mit den Eigenschaften codiert, die im wesentlichen zu denen des erfindungsgemäßen Proteins äquivalent sind, und dergleichen eingesetzt.
Die DNA, die an die DNA mit der Basensequenz, die durch die SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist, hybridisierbar ist, weist dieselbe Signifikanz, wie oben beschrieben, auf.
Verfahren für die Hybridisierung und die stark stringenten Bedingungen, die verwendet werden können, sind dieselben wie die oben beschriebenen.
Die DNA, die das erfindungsgemäße Signalpeptid codiert, kann irgendein Peptid sein, so lange wie es eine Basensequenz enthält, die das oben beschriebene erfindungsgemäße Signalpeptid codiert. Die DNA kann ebenso irgendeine der genomischen DNA, genomischen DNA-Bibliothek, cDNA, die aus den oben beschriebenen Zellen oder Geweben stammt, cDNA-Bibliothek, die aus den oben beschriebenen Zellen oder Geweben stammt, und synthetische DNA sein.
Als DNA, die das erfindungsgemäße Signalpeptid codiert, werden beispielsweise eine DNA mit der Basensequenz, die durch die SEQ ID Nr. 4 dargestellt ist, eine DNA mit einer Basensequenz, die an einer DNA mit der Basensequenz, die durch die SEQ ID Nr. 4 dargestellt ist, unter stark stringenten Bedingungen hybridisierbar ist und ein Peptid codiert, das die Funktion als ein Signalpeptid zeigen kann, und dergleichen eingesetzt.
Als DNA, die an die DNA mit der Basensequenz, die durch die SEQ ID Nr. 4 dargestellt ist, unter stark stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, werden beispielsweise DNAs, enthaltend die Basensequenz mit mindestens etwa 70 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 80 % Homologie, stärker bevorzugt mindestens etwa 90 % Homologie und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95 % Homologie, zu der Basensequenz, die durch die SEQ ID Nr. 4 dargestellt ist, eingesetzt.
Verfahren für die Hybridisierung und die stark stringenten Bedingungen, die verwendet werden können, sind dieselben wie die oben beschriebenen.
Spezieller werden eine DNA, enthaltend eine DNA mit der Basensequenz, die durch die SEQ ID Nr. 4 dargestellt ist, und dergleichen als die DNA, die das erfindungsgemäße Signalpeptid, enthaltend die Aminosäuresequenz, die durch die SEQ ID Nr. 2 dargestellt ist, codiert, eingesetzt.
Zum Klonen der DNAs, die das Protein, Präkursorprotein, Teilpeptid oder Signalpeptid der vorliegenden Erfindung vollständig codieren (hierin nachstehend manchmal nur als das erfindungsgemäße Protein bezeichnet), kann die DNA entweder durch öffentlich bekanntes PCR unter Verwendung von synthetischen DNA-Primern, enthaltend einen Teil der Basensequenz des erfindungsgemäßen Proteins, amplifiziert werden, oder die DNA, die in einen geeigneten Vektor insertiert wird, kann durch Hybridisierung mit einem markierten DNA-Fragment oder synthetischer DNA, die einen Teil oder die gesamte Region des erfindungsgemäßen Proteins codiert, gescreent werden. Die Hybridisierung kann beispielsweise gemäß dem Verfahren durchgeführt werden, das in Molecular Cloning, 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) beschrieben wird. Wo die Hybridisierung unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen Bibliothek durchgeführt wird; können die Verfahrensweisen gemäß dem Protokoll durchgeführt werden, welches in den beiliegenden Instruktionen beschrieben ist.
Die Substitution der Basensequenz von DNA kann durch öffentlich bekannte Verfahren, wie das ODA-LA-PCR-Verfahren, das Gapped duplex Verfahren oder das Kunkel-Verfahren, oder seine Modifikation unter Verwendung eines öffentlich bekannten Kits, erhältlich als Mutan^TM-super Express Km oder Mutan^TM-K (beide hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd., Handelszeichen) usw., durchgeführt werden.
Die geklonte DNA, die das erfindungsgemäße Protein codiert, kann als solches in Abhängigkeit des Zwecks oder nach Bedarf nach der Digestion mit einem Restriktionsenzym oder nach der Zugabe eines Linkers dazu verwendet werden. Die DNA kann ATG als ein Translationsinitiationscodon an dem 5'-Ende davon und TAA, TGA oder TAG als ein Translationsterminationscodon an dem 3'-Ende davon enthalten. Diese Translationsinitiations- und -terminationscodone können ebenso unter Verwendung eines geeigneten synthetischen DNA-Adapters hinzugefügt werden.
Der Expressionsvektor des erfindungsgemäßen Proteins kann beispielsweise durch (a) Entfernen des gewünschten DNA-Fragments aus der DNA, die das erfindungsgemäße Protein codiert, (b) und dann Ligieren des DNA-Fragments mit einem geeigneten Expressionsvektor stromabwärts eines Promotors in dem Vektor hergestellt werden.
Beispiele des Vektors umfassen Plasmide, die aus E. Coli stammen (beispielsweise pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Plasmide, die aus Bacillus subtilis stammen (beispielsweise pUB110, pTP5, pC194), Plasmide, die aus Hefe stammen (beispielsweise pSH19, pSH15), Bakteriophagen wie λ-Phage usw., Tierviren wie Retrovirus, Vacciniavirus, Baculovirus usw. sowie pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo usw.
Der Promotor, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann jeder Promotor sein, wenn er gut mit einem Wirt, der für die Genexpression verwendet werden soll, übereinstimmt. Falls Tierzellen als Wirt verwendet werden, umfassen Beispiele des Promotors SRα-Promotor, SV40-Promotor, LTR-Promotor, CMV-Promotor, HSV-TK-Promotor usw.
Unter diesen wird der CMV-Promotor (CMV = Cytomegalovirus) oder SRα-Promotor bevorzugt verwendet. Wo der Wirt ein Bakterium der Gattung Escherichia ist, umfassen bevorzugte Beispiele des Promotor trp-Promotor, lac-Promotor, recA-Promotor, γPL-Promotor, lpp-Promotor, T7-Promotor usw. Falls Bakterien der Gattung Bacillus als Wirt verwendet werden, sind bevorzugte Beispiele des Promotors SPO1-Promotor, SPO2-Promotor, penP-Promotor usw. Wenn Hefe als Wirt verwendet wird, sind bevorzugte Beispiele des Promotors PHO5-Promotor, PGK-Promotor, GAP-Promotor, ADH-Promotor usw. Wenn Insektenzellen als Wirt verwendet werden, umfassen bevorzugte Beispiele des Promotors Polyhedrinpromptor, P10-Promotor usw.
Zusätzlich zu den vorstehenden Beispielen kann der Expressionsvektor außerdem gegebenenfalls einen Enhancer, ein Spleißsignal, ein Poly-A-Additionssignal, einen Selektionsmarker, SV40-Replikationsstartpunkt (hierin nachstehend manchmal als SV40ori abgekürzt) usw. enthalten. Beispiele des Selektionsmarkers umfassen Dihydrofolatreduktase-Gen (hierin nachstehend manchmal als dhfr-Gen abgekürzt) [Methotrexat-Resistenz (MTX-Resistenz)], Ampicillin-resistentes Gen (hierin nachstehend manchmal als Amp^r abgekürzt), Neomycinresistentes Gen (hierin nachstehend manchmal als Neo abgekürzt, G418-Resistenz) usw. Insbesondere wenn das dhfr-Gen als Selektionsmarker unter Verwendung von dhfr-Genmangel-Zellen des chinesischen Hamsters verwendet wird, kann die Selektion ebenso auf einem Thymidin-freien Medium durchgeführt werden.
Wenn notwendig, wird eine Signalsequenz, die mit einem Wirt übereinstimmt, zu dem N-Terminus des erfindungsgemäßen Proteins hinzugefügt. Beispiele der Signalsequenz, die verwendet werden kann, sind die PhoA-Signalsequenz, OmpA-Signalsequenz usw. bei der Verwendung von Bakterien der Gattung Escherichia als Wirt; α-Amylase-Signalsequenz, Subtilisin-Signalsequenz usw. bei der Verwendung von Bakterien der Gattung Bacillus als Wirt; MFα-Signalsequenz, SUC2-Signalsequenz usw. bei der Verwendung von Hefe als Wirt; bzw. Insulin-Signalsequenz, α-Interferon-Signalsequenz, Antikörpermolekül-Signalsequenz usw. bei der Verwendung von Tierzellen als Wirt.
Unter Verwendung des so konstruierten Vektors, enthaltend die DNA, die das erfindungsgemäße Protein codiert, können Transformanten hergestellt werden.
Beispiele des Wirt, der eingesetzt werden kann, sind Bakterien, die zu der Gattung Escherichia gehören, Bakterien, die zu der Gattung Bacillus gehören, Hefe, Insektenzellen, Insekten und Tierzellen usw.
Spezielle Beispiele der Bakterien, die zu der Gattung Escherichia gehören, umfassen Escherichia coli K12 DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)], HB 101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] usw.
Beispiele der Bakterien, die zu der Gattung Bacillus gehören, umfassen Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207–21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] usw.
Beispiele von Hefe umfassen Saccharomyces cereviseae AH22, AH22R^–, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris KM71 usw.
Beispiele von Insektenzellen umfassen für das Virus AcNPV die Spodoptera-frugiperda-Zelle (Sf-Zelle), MG1-Zelle, abgeleitet von Mitteldarm von Trichoplusia ni, High Five^TM-Zelle, abgeleitet vom Ei der Trichoplusia ni, Zellen, abgeleitet von Mamestra brassicae, Zellen, abgeleitet von Estigmena acrea usw.; und für das Virus BmNPV wird die Bombyx-mori-N-Zelle (BmN-Zelle) usw. verwendet. Beispiele der Sf-Zelle, die verwendet werden kann, sind Sf9-Zelle (ATCC CRL1711), Sf21-Zelle (beide Zellen werden in Vaughn, J. L. et al., In Vivo, 13, 213–217 (1977) beschrieben) usw.
Als das Insekt kann beispielsweise eine Larve von Bombyx mori verwendet werden [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
Beispiele von Tierzellen umfassen die Affenzelle COS-7, Vero, die Zelle des chinesischen Hamsters CHO (hierin nachstehend als CHO-Zelle bezeichnet), dhfr-Genmangel-Zellen des chinesischen Hamsters CHO (hierin nachstehend einfach als CHO-(dhfr^–)-Zelle abgekürzt), Maus-L-Zelle, Maus-AtT-20, Maus-Myelom-Zelle, Ratten-GH 3, menschliche FL-Zelle usw.
Bakterien, die zu der Gattung Escherichia gehören, können beispielsweise durch das Verfahren transformiert werden, das in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982) beschrieben wird, usw.
Bakterien, die zu der Gattung Bacillus gehören, können beispielsweise durch das Verfahren transformiert werden, das in Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979) beschrieben wird, usw.
Hefe kann beispielsweise durch das Verfahren transformiert werden, das in Methods in Enzymology, 194, 182–187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 1929 (1978) beschrieben wird, usw.
Insektenzellen oder Insekten können beispielsweise gemäß dem Verfahren transformiert werden, das in Bio/Technology, 6, 47–55 (1988) beschrieben wird, usw.
Tierzellen können beispielsweise gemäß dem Verfahren transformiert werden, das in Saibo Kogaku (Cell Engineering), Extraausgabe 8, Shin Saibo Kogaku Jikken Protocol (New Cell Engineering Experimental Protocol), 263–267 (1995) (veröffentlicht von Shujunsha), oder Virology, 52, 456 (1973), beschrieben wird.
Daher können die Transformanten, die mit den Expressionsvektoren transformiert wurden, welche die DNAs enthalten, die das erfindungsgemäße Protein codieren, erhalten werden.
Wo der Wirt Bakterien, die zu der Gattung Escherichia oder der Gattung Bacillus gehören, kann der Transformant geeignet in einem flüssigen Medium, welches Materialien enthält, die für das Wachstum der Transformante erforderlich sind, wie Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Materialien usw., kultiviert werden. Beispiele der Kohlenstoffquellen umfassen Glukose, Dextrin, lösliche Stärke, Saccharose usw.; Beispiele der Stickstoffquellen umfassen anorganische oder organische Materialien, wie Ammoniumsalze, Nitratsalze, Maisquellwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakt, Sojabohnenkuchen, Kartoffelextrakt usw.; und Beispiele der anorganischen Materialien sind Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat, Magnesiumchlorid usw. Außerdem können Hefe, Vitamine, Wachstumsbeschleunigungsfaktoren, usw. ebenso zu dem Medium zugegeben werden. Vorzugsweise wird der pH des Mediums auf etwa 5 bis etwa 8 eingestellt.
Ein bevorzugtes Beispiel des Mediums zum Kultivieren der Bakterien, die zu der Gattung Escherichia gehören, ist das M9-Medium, das mit Glukose und Casaminosäuren ergänzt wurde [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431–433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972]. Wenn notwendig, kann eine Chemikalie wie 3β-Indolylacrylsäure zu dem Medium zugegeben werden, wodurch der Promotor effizient aktiviert wird.
Wo die Bakterien, die zu der Gattung Escherichia gehören, als Wirt verwendet werden, wird die Transformante normalerweise bei etwa 15 °C bis etwa 43 °C für etwa 3 Stunden bis etwa 24 Stunden kultiviert. Wenn notwendig, kann die Kultur mit Sauerstoff angereichert oder gerührt werden.
Wo die Bakterien, die zu der Gattung Bacillus gehören, als Wirt verwendet werden, wird die Transformante im allgemeinen bei etwa 30 °C bis etwa 40 °C für etwa 6 Stunden bis etwa 24 Stunden kultiviert. Wenn notwendig, kann die Kultur mit Sauerstoff angereichert oder gerührt werden.
Wo Hefe als Wirt verwendet wird, wird die Transformante beispielsweise in Burkholders Minimalmedium [Bostian, K. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 4505 (1980)] oder in SD-Medium, das mit 0,5 % Casaminosäuren ergänzt wird [Bitter, G. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 5330 (1984)], kultiviert. Vorzugsweise wird der pH des Mediums auf etwa 5 bis etwa 8 eingestellt. Im allgemeinen wird die Transformante bei etwa 20 °C bis etwa 35 °C für etwa 24 Stunden bis etwa 72 Stunden eingestellt. Wenn notwendig, kann die Kultur mit Sauerstoff angereichert oder gerührt werden.
Wo Insektenzellen oder Insekten als Wirt verwendet werden, wird die Transformante beispielsweise in Grace-Insektenmedium (Grace, T. C. C., Nature, 195, 788 (1962)), zu dem ein geeignetes Additiv, wie immobilisiertes 10%iges Rinderserum, zugegeben wird, kultiviert. Vorzugsweise wird der pH des Mediums auf etwa 6,2 bis etwa 6,4 eingestellt. Normalerweise wird die Transformante bei etwa 27 °C für etwa 3 Tage bis etwa 5 Tage kultiviert, und wenn notwendig, kann die Kultur mit Sauerstoff angereichert oder gerührt werden.
Wo Tierzellen als Wirt eingesetzt werden, wird die Transformante beispielsweise in MEM-Medium, enthaltend etwa 5 % bis etwa 20 % fetales Rinderserum [Science, 122, 501 (1952)], DMEM-Medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI-1640-Medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], 199-Medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] usw. kultiviert. Vorzugsweise wird der pH des Mediums auf etwa 6 bis etwa 8 eingestellt. Die Transformante wird normalerweise bei etwa 30 °C bis etwa 40 °C für etwa 15 Stunden bis etwa 60 Stunden kultiviert, und wenn notwendig, kann die Kultur mit Sauerstoff angereichert oder gerührt werden.
Wie oben beschrieben, kann das erfindungsgemäße Protein in der Zellmembran der Transformante produziert werden.
Das erfindungsgemäße Protein kann aus der oben beschriebenen Kultur abgetrennt und durch die folgenden Verfahrensweisen gereinigt werden.
Wenn das erfindungsgemäße Protein aus der Kultur oder Zellen extrahiert wird, wird die Transformante oder Zelle nach dem Kultivieren durch ein öffentlich bekanntes Verfahren gesammelt und in einem geeigneten Puffer suspendiert. Die Transformante oder Zelle wird dann durch öffentlich bekannte Verfahren, wie Ultraschallbehandlung, eine Behandlung mit Lysozym und/oder Gefrier-Auftau-Kreislauf, gefolgt von Zentrifugation, Filtration usw. zerstört. So kann das rohe Extrakt des Proteins erhalten werden. Der Puffer, der für die Verfahrensweisen verwendet wird, kann einen Proteinmodifikator, wie Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid, oder ein oberflächenaktives Mittel, wie Triton X-100^TM usw. enthalten. Wenn das erfindungsgemäße Protein in der Kulturlösung sekretiert wird, kann der Überstand nach Beendigung der Kultivierung von der Transformante oder Zelle durch ein öffentlich bekanntes Verfahren abgetrennt werden, um den Überstand zu sammeln.
Der Überstand oder das erfindungsgemäße Protein, der/das in dem so erhaltenen Extrakt enthalten ist, kann durch geeignetes Kombinieren der öffentlich bekannten Verfahren zur Abtrennung und Reinigung gereinigt werden. Diese öffentlich bekannten Verfahren zur Abtrennung und Reinigung umfassen ein Verfahren, welches den Unterschied in der Löslichkeit nutzt, wie Aussalzen, Lösungsmittelausfällung usw.; ein Verfahren, das hauptsächlich den Unterschied im Molekulargewicht nutzt, wie Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration, SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese usw.; ein Verfahren, das den Unterschied in der elektrischen Ladung nutzt, wie Ionenaustauschchromatographie usw.; ein Verfahren, das den Unterschied in der spezifischen Affinität nutzt, wie Affinitätschromatographie usw.; ein Verfahren, das den Unterschied in der Hydrophobie nutzt, wie Umkehrphasen-Hochleistungsflüssig-Chromatographie usw.; ein Verfahren, das den Unterschied im isoelektrischen Punkt nutzt, wie Isoelectrofokussierungs-Elektrophorese; und dergleichen.
Wenn das so erhaltene erfindungsgemäße Protein in freier Form vorliegt, kann das Protein in das Salz durch öffentlich bekannte Verfahren oder Modifikationen davon umgewandelt werden. Wenn andererseits das Protein in Form eines Salzes vorliegt, kann es in die freie Form oder in die Form eines anderen Salzes durch öffentlich bekannte Verfahren oder Modifikationen davon umgewandelt werden.
Das erfindungsgemäße Protein, das durch die Rekombinante produziert wurde, kann vor oder nach der Reinigung mit einem geeigneten Protein-modifizierenden Enzym behandelt werden, so daß das Protein geeignet modifiziert werden kann, um das Polypeptid teilweise zu entfernen. Beispiele des Protein-modifizierenden Enzyms umfassen Trypsin, Chymotrypsin, Arginylendopeptidase, Proteinkinase, Glykosidase und dergleichen.
Die Gegenwart des so produzierten erfindungsgemäßen Proteins kann durch einen Bindungstest an einen markierten Liganden und durch einen Enzymimmunassay unter Verwendung eines speziellen Antikörpers bestimmt werden.
Die Antikörper für das Protein, Präkursorprotein, Teilpeptid oder ihre Salze der vorliegenden Erfindung können polyklonale und monoklonale Antikörper sein, so lange wie sie das Protein, Präkursorprotein, Teilpeptid oder ihre Salze der vorliegenden Erfindung erkennen können.
Die Antikörper für das Protein, Präkursorprotein, Teilpeptid oder ihre Salze der vorliegenden Erfindung (hierin nachstehend manchmal gemeinsam als das erfindungsgemäße Protein bezeichnet) können durch ein öffentlich bekanntes Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers oder Antiserums unter Verwendung des erfindungsgemäßen Proteins als ein Antigen produziert werden.
[Herstellung des monoklonalen Antikörpers]
(a) Herstellung von Zellen, die monoklonale Antikörper produzieren
Das erfindungsgemäße Protein wird Warmbluttieren entweder einzeln oder zusammen mit Trägern oder Verdünnungsmitteln an der Stelle verabreicht, wo die Produktion von Antikörper durch die Verabreichung möglich ist. Um die Antikörperproduktivität bei der Verabreichung zu verstärken, kann das komplette Freundsche Adjuvans oder das inkomplette Freundsche Adjuvans verabreicht werden. Die Verabreichung wird normalerweise einmal aller zwei bis sechs Wochen und zwei- bis zehnmal insgesamt durchgeführt. Beispiele für verwendbare Warmbluttiere sind Affen, Kaninchen, Hunde, Meerschweinchen, Mäuse, Ratten, Schafe, Ziegen und Hühner, wobei die Verwendung von Mäusen und Ratten bevorzugt ist.
Bei der Herstellung von Zellen, die monoklonalen Antikörper produzieren, wird ein Warmbluttier, beispielsweise Mäuse, das mit einem Antigen immunisiert wurde, wobei der Antikörpertiter notiert wurde, ausgewählt, dann werden die Milz oder Lymphknoten nach zwei bis fünf Tagen seit der Endimmunisierung gesammelt, und die darin enthaltenden Antikörperproduzierenden Zellen werden mit Myelomzellen von homozoischen oder heterozoischen Tieren fusioniert, um Hybridome, die monoklonale Antikörper produzieren, zu erhalten. Die Messung des Antikörpertiters in Antiseren kann beispielsweise durch Umsetzen eines markierten Proteins, das später beschrieben wird, mit dem Antiserum, gefolgt von Analysieren der Bindungsaktivität des Markierungsmittels, das an den Antikörper gebunden ist, durchgeführt. Die Fusion kann beispielsweise durch das bekannte Verfahren von Koehler und Milstein durchgeführt werden [Nature, 256, 495, (1975)]. Beispiele des Fusionsbeschleunigers sind Polyethylenglykol (PEG), Sendai-Virus usw., wobei PEG bevorzugt eingesetzt wird.
Beispiele der Myelomzellen sind die, die aus Warmbluttieren gesammelt werden, wie NS-1, P3U1, SP2/0, AP-1 usw. Insbesondere wird P3U1 bevorzugt eingesetzt. Ein bevorzugtes Verhältnis der Anzahl der verwendeten Antikörper-produzierenden Zellen (Milzzellen) zu der Anzahl der Myelomzellen liegt in einem Bereich von ungefähr 1 : 1 bis 20 : 1. Wenn PEG (vorzugsweise PEG 1000 bis PEG 6000) in einer Konzentration von ungefähr 10 bis 80 % zugegeben wird, gefolgt von Inkubation bei 20 bis 40 °C, bevorzugt bei 30 bis 37 °C, für 1 bis 10 Minuten, kann eine effiziente Zellfusion durchgeführt werden.
Verschiedene Verfahren können zum Screenen von Hybridomen, die monoklonale Antikörper produzieren, verwendet werden. Beispiele von solchen Verfahren umfassen ein Verfahren, umfassend die Zugabe des Überstandes eines Hybridoms zu einer Festphase (beispielsweise eine Mikroplatte), an der das Protein als ein Antigen direkt oder zusammen mit einem Träger adsorbiert wurde, die Zugabe eines Anti-Immunoglobulin-Antikörpers (wo Mauszellen für die Zellfusion verwendet werden, wird Anti-Maus-Immunoglobulin-Antikörper verwendet), der mit einer radioaktiven Substanz oder einem Enzym oder Protein A markiert ist, und Detektieren des monoklonalen Antikörpers, der an die Festphase gebunden ist, und ein Verfahren, umfassend die Zugabe des Überstandes des Hybridoms zu einer Festphase, an die ein Anti-Immunoglobulin-Antikörper oder Protein A adsorbiert wurden, die Zugabe des Proteins, das mit einer radioaktiven Substanz oder einem Enzym markiert ist, und Detektieren des monoklonalen Antikörpers, der an die Festphase gebunden ist, oder dergleichen.
Der monoklonale Antikörper kann gemäß öffentlich bekannten Verfahren oder ihren Modifikationen gescreent werden. Im allgemeinen kann das Screenen in einem Medium für Tierzellen, das mit HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) ergänzt wurde, bewirkt werden. Irgendein Screening- und Wachstumsmedium kann eingesetzt werden, sofern das Hybridom darin wachsen kann. Beispielsweise kann RPMI-1640-Medium; enthaltend 1 % bis 20 %, bevorzugt 10 % bis 20 % fetales Rinderserum, GIT-Medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), enthaltend 1 bis 10 % fetales Rinderserum, ein serumfreies Medium zur Kultivierung eines Hybridoms (SFM-101, Nissui Seiyaku Co., Ltd.) und dergleichen, für das Screening- und Wachstumsmedium verwendet werden. Die Kultur wird im allgemeinen bei 20 °C bis 40 °C, bevorzugt bei 37 °C, für etwa 5 Tage bis etwa 3 Wochen, bevorzugt 1 bis 2 Wochen, normalerweise in 5 % CO₂ durchgeführt. Der Antikörpertiter des Kulturüberstandes eines Hybridoms kann wie in dem Assay für den Antikörpertiter in oben beschriebenen Antiseren bestimmt werden.
(b) Reinigung des monoklonalen Antikörpers
Die Abtrennung und Reinigung eines monoklonalen Antikörpers kann durch öffentlich bekannte Verfahren durchgeführt werden, wie Abtrennung und Reinigung von Immunoglobulinen [beispielsweise Aussalzen, Alkoholausfällung, isoelektrische Punktausfällung, Elektrophorese, Adsorption und Desorption mit Ionenaustauschern (beispielsweise DEAE), Ultrazentrifugation, Gelfiltration, oder ein spezielles Reinigungsverfahren, umfassend das Sammelns von nur einem Antikörper mit einem aktivierten Adsorbtionsmittel, wie einer Antigenbindenden Festphase, Protein A oder Protein G, und Dissoziieren der Bindung, um den Antikörper zu erhalten].
[Herstellung des polyklonalen Antikörpers]
Der erfindungsgemäße polyklonale Antikörper kann durch öffentlich bekannte Verfahren oder Modifikationen davon hergestellt werden. Beispielsweise wird ein Warmbluttier mit einem Immunogen (Proteinantigen) per se immunisiert, oder ein Komplex aus Immunogen und einem Trägerprotein wird gebildet, und ein Warmbluttier wird mit dem Komplex in einer Weise ähnlich dem oben beschriebenen Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikörper immunisiert. Das Produkt, enthaltend den Antikörper zu dem erfindungsgemäßen Protein, wird aus dem immunisierten Tier gesammelt, gefolgt von der Abtrennung und Reinigung des Antikörpers.
In dem Komplex aus Immunogen und Trägerprotein, der verwendet wird, um ein Warmbluttier zu immunisieren, kann der Typ des Trägerproteins und das Mischverhältnis von Träger zu Hapten irgendein Typ und irgendein Verhältnis sein, so lange wie der Antikörper effizient zu dem Hapten produziert wird, das durch Vernetzung an den Träger immunisiert wird. Beispielsweise wird Rinderserumalbumin, Rinderthyroglobulin oder Hemocyanin an Hapten in einem Träger-zu-Hapten-Gewichtsverhältnis von ungefähr 0,1 bis 20, bevorzugt etwa 1 bis etwa 5 gekoppelt.
Eine Vielzahl von Kondensierungsmitteln kann für die Kopplung des Trägers an Hapten verwendet werden. Glutaraldehyd, Carbodiimid, Maleimid-aktivierter Ester und -aktivierte Esterreagenzien, enthaltend eine Thiolgruppe oder Dithiopyridylgruppe, werden für die Kopplung verwendet.
Das Kondensationsprodukt wird den Warmbluttieren entweder allein oder zusammen mit Trägern oder Verdünnungsmitteln an der Stelle verabreicht, die den Antikörper durch die Verabreichung produzieren kann. Um die Antikörperproduktivität bei der Verabreichung zu verstärken, kann das komplette Freundsche Adjuvans oder das inkomplette Freundsche Adjuvans verabreicht werden. Die Verabreichung erfolgt normalerweise einmal aller 2 bis 6 Wochen und drei- bis zehnmal insgesamt.
Der polyklonale Antikörper kann aus dem Blut, Aszites usw., bevorzugt aus dem Blut von Warmbluttieren, die durch das oben beschriebene Verfahren immunisiert wurden, gesammelt werden.
Der polyklonale Antikörpertiter in Antiserum kann durch dasselbe Verfahren wie das für die Bestimmung des oben beschriebenen Serumantikörpertiters analysiert werden. Die Abtrennung und Reinigung des polyklonalen Antikörpers kann nach dem Verfahren für die Abtrennung und Reinigung von Immunoglobulinen, welches wie bei der Abtrennung und Reinigung des hierin oben beschriebenen monoklonalen Antikörpers durchgeführt wird, durchgeführt werden.
Die Antisense-DNA mit einer komplementären oder im wesentlichen komplementären Basensequenz zu der DNA, die das Protein, Präkursorprotein, Teilpeptid oder Signalpeptid der vorliegenden Erfindung codiert (hierin nachstehend werden diese DNAs manchmal gemeinsam als die erfindungsgemäße DNA in der folgenden Beschreibung der Antisense-DNA bezeichnet) kann jede Antisense-DNA sein, so lange wie sie eine Basensequenz besitzt, die zu der erfindungsgemäßen DNA komplementär oder im wesentlichen komplementär ist, und die Expression der DNA unterdrücken kann.
Die Basensequenz, die im wesentlichen zu der erfindungsgemäßen DNA komplementär ist, kann beispielsweise eine Basensequenz mit mindestens etwa 70 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 80 % Homologie, stärker bevorzugt mindestens etwa 90 % Homologie und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95 % Homologie, zu der vollständigen Basensequenz oder Teilbasensequenz der Basensequenz, die zu der erfindungsgemäßen DNA komplementär ist (d. h., komplementärer Strang zu der erfindungsgemäßen DNA), und dergleichen sein. In der gesamten Basensequenz des komplementären Strangs zu der erfindungsge mäßen DNA weist eine Antisense-DNA mindestens etwa 70 % Homologie, bevorzugt mindestens etwa 80 % Homologie, stärker bevorzugt mindestens etwa 90 % Homologie und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95 % Homologie, zu dem komplementären Strang der Basensequenz auf, die die N-terminale Region des erfindungsgemäßen Proteins codiert (beispielsweise die Basensequenz um das Initiationscodon). Diese Antisense-DNAs können unter Verwendung eines öffentlich bekannten DNA-Synthesizers usw. synthetisiert werden.
Hierin nachstehend werden das Protein, Präkursorprotein oder Teilpeptid, oder ihre Salze der vorliegenden Erfindung (hierin nachstehend manchmal nur als das erfindungsgemäße Protein bezeichnet) die DNA, die das Protein codiert (hierin nachstehend manchmal nur als die erfindungsgemäße DNA bezeichnet), der Antikörper zu dem Protein, Präkursorprotein, Teilpeptid oder Signalpeptid oder Salzen davon (hierin nachstehend manchmal nur als erfindungsgemäßer Antikörper bezeichnet) und die Antisense-DNA in bezug auf deren Nutzen erläutert.
Das erfindungsgemäße Protein kann als Krankheitsmarker genutzt werden, da die Expression dieser Proteine gewebespezifisch in der/den Lunge/Bronchien bei Asthmamodelltieren erhöht ist. Das heißt, diese Proteine sind als Marker zur frühzeitigen Diagnose bei Lungen/Thorax-Krankheiten, begleitet von der Entzündung der Lunge/Atemwege, Beurteilung der Schwere der Zustände oder vorhergesagten Entwicklung von Krankheiten nützlich.
(1) Therapeutikum und Prophylaktikum für die Krankheiten, mit denen das erfindungsgemäße Protein a verbunden ist
Das erfindungsgemäße Protein ist ein Mitglied der Chitinasefamilie. Eine Chitinase ist wichtig für den biologischen Schutzmechanismus gegen äußere Pathogene, wie Bakterien, Virus usw. Daher kann das erfindungsgemäße Protein oder die erfindungsgemäße DNA als ein Therapeutikum/Prophylaktikum für verschiedene Krankheiten, einschließlich Immunkrankheiten (beispielsweise Autoimmunkrankheit, Immundefizienz, allergische Krankheiten usw.), Infektionskrankheiten (beispielsweise HIV-Infektion (Human-Immunodefizienz-Virus), HBV-Infektion (Hepatitis-B-Virus), HCV-Infektion (Hepatitis-C-Virus), Tuberkuloseinfektion, opportunistische Infektion usw.), und dergleichen verwendet werden.
Wenn ein Patient ein reduziertes Niveau oder einen Mangel an dem erfindungsgemäßen Protein usw. in ihrem oder seinem Körper hat, wo der biologische Schutzmechanismus nicht aus reichend oder normal gezeigt wird, kann das erfindungsgemäße Protein seine Rolle ausreichend oder richtig für den Patienten bereitstellen durch (a) Verabreichen der erfindungsgemäßen DNA einem Patienten. um das erfindungsgemäße Protein im Körper zu exprimieren, (b) durch Einführen der erfindungsgemäßen DNA in eine Zelle, die das erfindungsgemäße Protein exprimiert, und dann Transplantieren der Zelle in den Patienten, (c) durch Verabreichen des erfindungsgemäßen Proteins dem Patienten, oder dergleichen.
Wo die erfindungsgemäße DNA als die oben beschriebenen Therapeutika/Prophylaktika verwendet werden, wird die DNA allein direkt einem Menschen oder anderem Warmbluttier verabreicht; alternativ wird die DNA in einen geeigneten Vektor, wie Retrovirusvektor, Adenovirusvektor, Adenovirus-assoziierten Virusvektor usw. eingeführt und dann einem Menschen oder anderem Warmbluttier in konventioneller Weise verabreicht. Die erfindungsgemäße DNA kann ebenso als solche oder mit Hilfsmitteln verabreicht werden, um ihre Aufnahme durch die Genkanone oder durch einen Katheter, wie ein Katheter mit einem Hydrogel, zu unterstützen.
Wo das erfindungsgemäße Protein als die zuvor genannten Therapeutika/Prophylaktika verwendet wird, ist es bevorzugt, selbige auf einem gereinigten Niveau von mindestens 90 %, bevorzugt mindestens 95 %, stärker bevorzugt mindestens 98 % und am stärksten bevorzugt mindestens 99 % zu verwenden.
Das erfindungsgemäße Protein kann oral, beispielsweise in Form von Tabletten, die nach Bedarf zuckerbeschichtet sein können, Kapseln, Elixieren, Mikrokapseln usw., oder parenteral in Form von injizierbaren Präparaten, wie einer sterilen Lösung und eine Suspension in Wasser oder mit einer anderen pharmazeutisch akzeptablen Flüssigkeit verwendet werden. Diese Präparate können durch Mischen des erfindungsgemäßen Proteins mit einem physiologisch akzeptablen bekannten Träger, einem Aromastoff, einem Trägerstoff, einem Vehikel, einem Antiseptikum, einem Stabilisator, einem Bindemittel usw. in einer Einheitsdosierungsform, die in einer allgemein akzeptierten Weise, die auf die Herstellung von pharmazeutischen Präparaten angewendet wird, erforderlich ist, hergestellt. Der Wirkstoff in dem Präparat wird in einer solchen Dosis eingestellt, daß eine geeignete Dosis innerhalb des spezifizierten angegebenen Bereiches erhalten wird.
Additive, die mit Tabletten, Kapseln usw. mischbar sind, umfassen ein Bindemittel wie Gelatine, Maisstärke. Tragant und Gummi arabicum, einen Trägerstoff wie kristalline Cellulose, ein Quellmittel wie Maisstärke, Gelatine und Alginsäure, ein Schmiermittel wie Magnesiumstearat, ein Süßungsmittel wie Saccharose, Lactose und Saccharin, und einen Aromastoff wie Pfefferminze, Akamonoöl oder Kirsche. Wenn die Einheitsdosis in Form von Kapseln vorliegt, können flüssige Träger wie Öle und Fette außerdem zusammen mit den oben beschriebenen Additiven verwendet werden. Eine sterile Zusammensetzung zur Injektion kann gemäß einer konventionellen Weise, die zur Herstellung eines Pharmazeutikums verwendet wird, beispielsweise durch Lösen oder Suspendieren der Wirkstoffe in einem Vehikel wie Wasser zur Injektion mit einem natürlich vorkommenden Pflanzenöl, wie Sesamöl und Kokosnußöl, usw. formuliert werden, um das Pharmazeutikum herzustellen.
Beispiele eines wässerigen Mediums zur Injektion umfassen physiologische Kochsalzlösung und eine isotonische Lösung, enthaltend Glukose und andere Hilfsmittel (beispielsweise D-Sorbitol, D-Mannitol, Natriumchlorid usw.), und können in Kombination mit einem geeigneten Auflösungshilfsmittel, wie einen Alkohol (beispielsweise Ethanol oder dergleichen), einem Polyalkohol (beispielsweise Propylenglykol und Polyethylenglykol), einem nichtionischen oberflächenaktiven Mittel (beispielsweise Polysorbat 80^TM, HCO-50 usw.), und dergleichen verwendet werden. Beispiele des öligen Mediums umfassen Sesamöl, Sojabohnenöl usw., das ebenso in Kombination mit einem Auflösungshilfsmittel, wie Benzylbenzoat, Benzylalkohol usw. verwendet werden kann. Das Mittel kann außerdem mit einem Puffer (beispielsweise Phosphatpuffer, Natriumacetatpuffer usw.), einem Desinfektionsmittel (beispielsweise Benzalkoniumchlorid, Procainhydrochlorid usw.), einem Stabilisator (beispielsweise menschliches Serumalbumin, Polyethylenglykol usw.), einem Konservierungsmittel (beispielsweise Benzylalkohol, Phenol usw.), einem Antioxidationsmittel usw. formuliert werden. Die so hergestellte Flüssigkeit zur Injektion wird normalerweise in eine geeignete Ampulle gefüllt.
Der Vektor, in den die erfindungsgemäße DNA eingeführt wird, kann ebenso zu pharmazeutischen Präparaten in einer Weise, die ähnlich der obigen Verfahrensweise ist, hergestellt werden. Diese Präparate werden im allgemeinen parenteral verwendet.
Da das so erhaltene pharmazeutische Präparat sicher und gering toxisch ist, kann das Präparat einem Menschen oder einem anderen Warmbluttier (beispielsweise Ratte, Maus, Meerschweinchen, Kaninchen, Huhn, Schaf, Schwein, Rind, Pferd, Katze, Hund, Affe, Schimpanse usw.) verabreicht werden.
Die Dosis des erfindungsgemäßen Proteins variiert in Abhängigkeit der Zielkrankheit, dem Patienten, dem es verabreicht werden soll, dem Applikationsweg usw. Beispielsweise beträgt bei der oralen Verabreichung für die Behandlung von Infektionskrankheiten die Dosis normalerweise etwa 0,1 mg bis etwa 100 mg, bevorzugt etwa 1,0 bis etwa 50 mg, und stärker bevorzugt etwa 1,0 bis etwa 20 mg pro Tag für einen Erwachsenen (bei 60 kg Körpergewicht). Bei der parenteralen Verabreichung variiert die Einzeldosis in Abhängigkeit des Patienten, dem sie verabreicht werden soll, der Zielkrankheit usw., aber es ist für die Behandlung von Infektionskrankheiten vorteilhaft, das Protein intravenös bei einer täglichen Dosis von etwa 0,01 bis etwa 30 mg, bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 20 mg, und stärker bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 10 mg für einen Erwachsenen (bei 60 kg Körpergewicht) zu verabreichen. Für andere Tierspezies kann die entsprechende Dosis, wenn sie auf 60 kg Körpergewicht umgerechnet wird, verabreicht werden.
(2) Screenen von Arzneimittelkandidatenverbindungen für Erkrankungen
Da das erfindungsgemäße Protein zu der Chitinasefamilie gehört, kann eine Verbindung oder ihr Salz, das zur Beschleunigung der Aktivitäten (beispielsweise eine Chitinaseaktivität usw.) des erfindungsgemäßen Proteins fähig ist, als Medikamente für die Behandlung/Vorbeugung von verschiedenen Krankheiten, einschließlich Immunkrankheiten (beispielsweise Autoimmunkrankheit, Immundefizienz, allergische Krankheit usw.), Infektionskrankheiten (beispielsweise HIV-Infektion, HBV-Infektion, HCV-Infektion, Tuberkuloseinfektion, opportunistische Infektion usw.), und dergleichen verwendet werden.
Andererseits wird das erfindungsgemäße Protein vor der Entzündung der/den Lungen/Bronchien in zunehmendem Maße exprimiert und kann daher als Medikament für die Behandlung/Vorbeugung von Lungen/Thorax-Krankheiten, die von der Entzündung der Lunge/Atemwege begleitet sind, einschließlich Bronchialasthma, chronisch-obstruktive Lungenerkrankung usw., verwendet werden.
Deshalb ist das erfindungsgemäße Protein als ein Reagens zum Screenen der Verbindung oder ihrer Salze, die zur Beschleunigung oder Inhibierung der Aktivitäten des erfindungsgemäßen Proteins fähig sind, nützlich.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt bereit:

(1) ein Verfahren zum Screenen der Verbindung oder ihrer Salze, die zur Beschleunigung der Aktivitäten (beispielsweise einer Chitinaseaktivität usw.) des Proteins, Präkursorproteins oder Teilpeptids oder ihrer Salze der vorliegenden Erfindung fähig sind (hierin nachstehend manchmal nur als Promotor bezeichnet), oder der Verbindung oder ihrer Salze, die zur Inhibierung der Aktivitäten des Proteins, Präkursorproteins oder Teilpeptids oder ihrer Salze der vorliegenden Erfindung fähig sind (hierin nachstehend manchmal nur als Inhibitor bezeichnet), welches die Verwendung des Proteins, Präkursorproteins oder Teilpeptids oder ihrer Salze der vorliegenden Erfindung umfaßt.

Spezieller stellt die vorliegende Erfindung beispielsweise bereit:

(2) ein Verfahren zum Screenen des Promotors oder des Inhibitors, umfassend das Vergleichen (i) des Falls, wo ein Chitinasesubstrat mit dem Protein, Präkursorprotein oder Teilpeptid oder ihren Salzen der vorliegenden Erfindung in Kontakt gebracht wird, und (ii) des Falls, wo ein Chitinasesubstrat und eine Testverbindung mit dem Protein, Präkursorprotein oder Teilpeptid oder ihren Salzen der vorliegenden Erfindung in Kontakt gebracht werden.

Speziell ist in dem oben beschriebenen Screening-Verfahren das Verfahren durch Messen von beispielsweise der Chitinaseaktivität des erfindungsgemäßen Proteins in den Fällen (i) und (ii) und Vergleichen der Fälle gekennzeichnet.
Beispiele des verwendeten Substrats sind 4-Methylumbelliferyl-β-D-N,N'-diacetylchitobiose, 4-Methylumbelliferyl-β-D-N,N',N''-triacetylchitobiose, p-Nitrophenyl-β-D-N,N',N''-triacetylchitobiose, Chitinazurblau usw.
Beispiele der Testverbindung sind ein Peptid, ein Protein, einen Nicht-Peptidverbindung, eine synthetische Verbindung, ein Fermentationsprodukt, ein Zellextrakt, ein Pflanzenextrakt, ein Tiergewebeextrakt und dergleichen. Diese Verbindungen können neue Verbindungen oder öffentlich bekannte Verbindungen sein.
Um das oben beschriebene Screening-Verfahren durchzuführen, wird das erfindungsgemäße Protein in einem Puffer, der zum Screenen geeignet ist, suspendiert, um Untersuchungsmaterial für das erfindungsgemäße Protein herzustellen. Irgendein Puffer mit einem pH von ungefähr 4 bis 10 (wünschenswerterweise einen pH von ungefähr 6 bis 8), wie ein Phosphatpuffer, Tris-hydrochloridpuffer usw. kann verwendet werden, so lange wie er die Reaktion zwischen dem erfindungsgemäßen Protein und dem Substrat nicht beeinträchtigt.
Die Chitinaseaktivität des erfindungsgemäßen Proteins kann durch ein öffentlich bekanntes Verfahren, das beispielsweise in J. Biol. Chem., 270, 2198 (1995) beschrieben ist, oder seiner Modifikation bestimmt werden.
Wenn beispielsweise eine Testverbindung die Chitinaseaktivität in dem oben beschriebenen Fall (ii) um mindestens etwa 20 %, bevorzugt mindestens 30 %, stärker bevorzugt mindestens etwa 50 %, im Vergleich zu dem obigen Fall von (i) erhöht, kann die Testverbindung als eine Verbindung gescreent werden, die die Chitinaseaktivität des erfindungsgemäßen Proteins beschleunigen kann. Andererseits kann eine Testverbindung als eine Verbindung gescreent werden, die die Chitinaseaktivität des erfindungsgemäßen Proteins inhibieren kann, wenn die Testverbindung die Chitinaseaktivität in dem oben beschriebenen Fall (ii) um mindestens etwa 20 %, bevorzugt mindestens 30 %, stärker bevorzugt mindestens etwa 50 %, im Vergleich zu dem obigen Fall von (i) inhibiert.
Das Kit zum Screenen gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt das Protein, Präkursorprotein oder Teilpeptid oder ihre Salze der vorliegenden Erfindung.
Die Verbindungen oder Salze davon, die unter Verwendung der Screening-Verfahren oder Screening-Kits der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, sind Verbindungen, die aus den oben beschriebenen Testverbindungen gescreent wurden, beispielsweise Peptide, Proteine, Nicht-Peptidverbindungen, synthetische Verbindungen, Fermentationsprodukte, Zellextrakte, Pflanzenextrakte, tierische Gewebeextrakte, Blutplasma usw., und sind die Verbindungen, die zur Beschleunigung oder Inhibierung der Aktivitäten (beispielsweise eine Chitinaseaktivität usw.) des erfindungsgemäßen Proteins fähig sind.
Als Salze dieser Verbindungen können dieselben Salze wie die des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Proteins eingesetzt werden.
Die Verbindungen, die zur Beschleunigung der Aktivitäten (beispielsweise eine Chitinaseaktivität usw.) des erfindungsgemäßen Proteins fähig sind, können als Medikamente für die Behandlung/Vorbeugung von verschiedenen Krankheiten, einschließlich Immunkrankheiten (beispielsweise Autoimmunkrankheit, Immundefizienz, allergische Krankheiten usw.), Infektionskrankheiten (beispielsweise HIV-Infektion, HBV-Infektion, HCV-Infektion, Tuberkuloseinfektion, opportunistische Infektion usw.), und dergleichen verwendet werden.
Andererseits können die Verbindungen, die zur Inhibierung der Aktivitäten des erfindungsgemäßen Proteins fähig sind, als Medikamente für die Behandlung/Vorbeugung von Lungen/Thorax-Krankheiten, begleitet durch die Entzündung der Lunge/Atemwege, einschließlich Bronchialasthma, chronisch-obstruktive Lungenerkrankung usw., verwendet werden.
Wenn die Verbindungen, die unter Verwendung der Screening-Verfahren oder Screening-Kits der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, als die oben beschriebenen Therapeutika/Prophylaktika verwendet werden, können sie in einer konventionellen Weise verwendet werden. Die Verbindungen können beispielsweise in Form von Tabletten, Kapseln, Elixieren, Mikrokapseln, einer sterilen Lösung, einer Suspension usw., wie in den Pharmazeutika, enthaltend das oben beschriebene erfindungsgemäße Protein, verwendet werden.
Da das so erhaltene pharmazeutische Präparat sicher und gering toxisch ist, kann das Präparat einem Menschen oder einem anderen Warmbluttier (beispielsweise Maus, Ratte, Kaninchen, Schaf, Schwein, Rind, Pferd, Huhn, Katze, Hund, Affe, Schimpanse usw.) verabreicht werden.
Die Dosis der Verbindung oder Salze davon variiert in Abhängigkeit ihrer Wirkung, der Zielkrankheit, des Patienten, dem sie verabreicht werden soll, dem Applikationsweg usw. Wenn die Verbindung, die zur Inhibierung der Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins fähig ist, für die Behandung von beispielsweise Bronchialasthma oral verabreicht wird, wird die Verbindung normalerweise in einer Dosis von etwa 0,1 bis etwa 100 mg, bevorzugt etwa 1,0 bis etwa 50 mg, und stärker bevorzugt etwa 1,0 bis etwa 20 mg pro Tag für einen Erwachsenen (bei 60 kg Körpergewicht) verabreicht. Bei der parenteralen Verabreichung variiert eine Einzeldosis der Verbindung in Abhängigkeit des Patienten, dem sie verabreicht werden soll, der Zielkrankheit usw., aber es ist für die Behandlung von Bronchialasthma vorteilhaft, die Verbindung, die zur Inhibierung der Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins fähig ist, intravenös in Form von Injektion in einer täglichen Dosis von etwa 0,01 bis etwa 30 mg, bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 20 mg, und stärker bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 10 mg für einen Erwachsenen (bei 60 kg Körpergewicht) zu verabreichen. Für andere Tierspezies kann die entsprechende Dosis, wenn sie auf 60 kg Körpergewicht umgerechnet wird, verabreicht werden.
Wenn andererseits die Verbindung, die zur Beschleunigung der Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins fähig ist, für die Behandlung von Infektionskrankheiten oral verabreicht wird, wird die Verbindung normalerweise in einer Dosis von etwa 0,1 bis etwa 100 mg, bevorzugt etwa 1,0 bis etwa 50 mg, und stärker bevorzugt etwa 1,0 bis etwa 20 mg pro Tag für einen Erwachsenen (bei 60 kg Körpergewicht) verabreicht. Bei der parenteralen Verabreichung variiert die Einzeldosis der Verbindung in Abhängigkeit des Patienten, dem sie verabreicht werden soll, der Zielkrankheit usw., aber es ist für die Behandlung von Infektionskrankheiten vorteilhaft, die Verbindung, die zur Beschleunigung der Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins fähig ist, intravenös in Form von Injektion in einer täglichen Dosis von etwa 0,01 bis etwa 30 mg, bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 20 mg, und stärker bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 10 mg für einen Erwachsenen (bei 60 kg Körpergewicht) zu verabreichen. Für andere Tierspezies kann die entsprechende Dosis, wenn sie auf 60 kg Körpergewicht umgewandelt wird, verabreicht werden.
(3) Screenen von Arzneimittelkandidatenverbindungen für Erkrankungen, mit denen das erfindungssemäße Protein verbunden sind
Das erfindungsgemäße Protein ist ein Sekretionsprotein. Deshalb kann die Verbindung oder ihr Salz, die zur Inhibierung der Aktivitäten des erfindungsgemäßen Proteins fähig ist, als Medikamente für die Behandlung/Vorbeugung von Lungen/Thorax-Krankheiten, die von der Entzündung der Lunge/Atemwege begleitet sind, einschließlich Bronchialasthma, chronischobstruktive Lungenerkrankung usw., eingesetzt werden.
Daher ist das erfindungsgemäße Protein als ein Reagens zum Screenen der Verbindung oder Salze davon, die zur Inhibierung der Aktivitäten des erfindungsgemäßen Proteins fähig ist, nützlich.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt bereit:

(1) ein Verfahren zum Screenen der Verbindung, die zur Inhibierung der Aktivitäten (beispielsweise einer Eosinophil-vermittelten chemotaktischen Aktivität usw.) des erfindungsgemäßen Proteins fähig ist (hierin nachstehend manchmal nur als Inhibitor bezeichnet), welches die Verwendung des erfindungsgemäßen Proteins umfaßt.

Spezieller stellt die vorliegende Erfindung beispielsweise bereit:

(2) ein Verfahren zum Screenen des Inhibitors, umfassend das Vergleichen (i) des Falls, wo ein Eosinophil mit dem erfindungsgemäßen Protein in Kontakt gebracht wird, und (ii) des Falls, wo ein Eosinophil und eine Testverbindung mit dem erfindungsgemäßen Protein in Kontakt gebracht werden.

Speziell ist in dem oben beschriebenen Screening-Verfahren das Verfahren durch Messen von beispielsweise der Eosinophil-vermittelten chemotaktischen Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins in den Fällen (i) und (ii) und deren Vergleichen gekennzeichnet.
Als Eosinophil wird beispielsweise Maus-Eosinophil eingesetzt, das durch ein öffentlich bekanntes Verfahren, welches beispielsweise in J. Leukocyte Biol., 60, 573 (1996) beschrieben ist, oder durch eine Modifikation davon hergestellt werden kann.
Beispiele der Testverbindung sind ein Peptid, ein Protein, eine Nicht-Peptidverbindung, eine synthetische Verbindung, ein Fermentationsprodukt, ein Zellextrakt, ein Pflanzenextrakt, ein Tiergewebeextrakt, und dergleichen. Diese Verbindungen können neue Verbindungen oder öffentlich bekannte Verbindungen sein.
Um das oben beschriebene Screening-Verfahren durchzuführen, wird das erfindungsgemäße Protein in einem Puffer, der zum Screenen geeignete ist, suspendiert, um einen Probenmaterial für das erfindungsgemäße Protein herzustellen. Irgendein Puffer mit einem pH von ungefähr 4 bis 10 (wünschenswerterweise einen pH von ungefähr 6 bis 8), wie ein Phosphatpuffer, Tris-hydrochloridpuffer usw. kann verwendet werden, so lange wie er die chemotaktische Reaktion von Eosinophilen nicht beeinträchtigt.
Die Eosinophil-vermittelte chemotaktische Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins kann durch ein öffentlich bekanntes Verfahren, das beispielsweise in Immunity, 4, 1 (1996) beschrieben ist, oder seine Modifikation bestimmt werden.
Wenn beispielsweise eine Testverbindung die Eosinophil-vermittelte chemotaktische Aktivität in dem oben beschriebenen Fall (ii) um mindestens etwa 20 %, bevorzugt mindestens 30 %, stärker bevorzugt mindestens etwa 50 %, im Vergleich zu dem obigen Fall von (i) erhöht, kann die Testverbindung als eine Verbindung gescreent werden, die zur Inhibierung der Eosinophil-vermittelten chemotaktischen Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins fähig ist.
Die Verbindungen oder Salze davon, die unter Verwendung der Screening-Verfahren oder Screening-Kits der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, sind Verbindungen, die aus den oben beschriebenen Testverbindungen gescreent wurden, beispielsweise Peptide, Proteine, Nicht-Peptidverbindungen, synthetische Verbindungen, Fermentationsprodukte, Zellextrakte, Pflanzenextrakte, Tiergewebeextrakte, Blutplasma usw., und sind die Verbindungen, die zur Inhibierung der Aktivitäten (beispielsweise einer Eosinophil-vermittelten chemotaktischen Aktivität usw.) des erfindungsgemäßen Proteins fähig sind.
Als Salze von diesen Verbindungen können dieselben Salze wie die des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Proteins eingesetzt werden.
Die Verbindung, die zur Inhibierung der Aktivitäten des erfindungsgemäßen Proteins fähig ist, ist als Medikament für die Behandlung/Vorbeugung von Lungen/Thorax-Krankheiten, die von der Entzündung der Lunge/Atemwege begleitet sind, einschließlich Bronchialasthma, chronisch-obstruktive Lungenerkrankung usw., nützlich.
Wenn die Verbindungen, die unter Verwendung der Screening-Verfahren oder Screening-Kits der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, als die oben beschriebenen Therapeutika/Prophylaktika verwendet werden, können sie in einer konventionellen Weise verwendet werden. Die Verbindungen können beispielsweise in Form von Tabletten, Kapseln, Elixieren, Mikrokapseln, einer sterilen Lösung, einer Suspension usw., wie in den Pharmazeutika, enthaltend das oben beschriebene erfindungsgemäße Protein, verwendet werden.
Da das so erhaltene pharmazeutische Präparat sicher und gering toxisch ist, kann das Präparat einem Menschen oder einem anderen Warmbluttier (beispielsweise Maus, Ratte, Kaninchen, Schaf, Schwein, Rind, Pferd, Huhn, Katze, Hund, Affe, Schimpanse usw.) verabreicht werden.
Die Dosis der Verbindung oder Salze davon variiert in Abhängigkeit ihrer Wirkung, der Zielkrankheit, des Patienten, dem sie verabreicht werden soll, dem Applikationsweg usw. Wenn die Verbindung, die zur Inhibierung der Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins fähig ist, für die Behandlung von beispielsweise Bronchialasthma oral verabreicht wird, wird die Verbindung normalerweise in einer Dosis von etwa 0,1 bis etwa 100 mg, bevorzugt etwa 1,0 bis etwa 50 mg, und stärker bevorzugt etwa 1,0 bis etwa 20 mg pro Tag für einen Erwachsenen (bei 60 kg Körpergewicht) verabreicht. Bei der parenteralen Verabreichung variiert eine Einzeldosis der Verbindung in Abhängigkeit des Patienten, dem sie verabreicht werden soll, der Zielkrankheit usw., aber es ist für die Behandlung von Bronchialasthma vorteilhaft, die Verbindung, die zur Inhibierung der Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins fähig ist, intravenös in Form von Injektion in einer täglichen Dosis von etwa 0,01 bis etwa 30 mg, bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 20 mg, und stärker bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 10 mg für einen Erwachsenen (bei 60 kg Körpergewicht) zu verabreichen. Für andere Tierspezies kann die entsprechende Dosis, wenn sie auf 60 kg Körpergewicht umgerechnet wird, verabreicht werden.
(4) Quantifizierung des erfindungsgemäßen Proteins
Der Antikörper des erfindungsgemäßen Proteins (hierin nachstehend manchmal nur als erfindungsgemäßer Antikörper bezeichnet) kann das erfindungsgemäße Protein spezifisch erkennen, und kann daher für eine Quantifizierung des erfindungsgemäßen Proteins in einer Testprobenflüssigkeit, insbesondere für eine Quantifizierung durch Sandwich-Immunassay verwendet werden.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt bereit:

(i) ein Verfahren zur Quantifizierung des erfindungsgemäßen Proteins in einer Testprobenflüssigkeit, umfassend das kompetitive Umsetzen des erfindungsgemäßen Antikörpers, einer Testprobenflüssigkeit und des markierten erfindungsgemäßen Proteins, und Messen des Anteils des markierten erfindungsgemäßen Proteins, das an den Antikörper gebunden ist; und,
(ii) ein Verfahren zur Quantifizierung des erfindungsgemäßen Proteins in einer Testprobenflüssigkeit, umfassend das Umsetzen der Testprobenflüssigkeit gleichzeitig oder kontinuierlich mit dem erfindungsgemäßen Antikörper, der auf einem Träger immobilisiert ist, und einem anderen markierten erfindungsgemäßen Antikörper, und dann Messen der Aktivität des Markierungsmittels auf dem unlöslichen Träger.

Bei dem oben beschriebenen Verfahren (ii) zur Quantifizierung ist es bevorzugt, daß ein Antikörper die N-terminale Region des erfindungsgemäßen Proteins erkennen kann, während ein anderer Antikörper die C-terminale Region des erfindungsgemäßen Proteins erkennen kann.
Der monoklonale Antikörper zu dem erfindungsgemäßen Protein (hierin nachstehend manchmal als erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper bezeichnet) kann verwendet werden, um das erfindungsgemäße Protein zu analysieren. Außerdem kann das Protein mittels Gewebefärbung ebenso nachgewiesen werden. Für diese Zwecke kann das Antikörpermolekül per se verwendet werden oder F(ab')₂-, Fab'- oder Fab-Fraktionen des Antikörpermoleküls können ebenso verwendet werden.
Es gibt keine spezielle Einschränkung auf das Verfahren zur Quantifizierung des erfindungsgemäßen Proteins unter Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers; irgendein Verfahren kann verwendet werden, sofern es sich auf ein Verfahren bezieht, bei dem die Menge an Antikörper, Antigen oder Antikörper-Antigen-Komplex durch ein chemisches oder physikalisches Mittel in Abhängigkeit oder entsprechend der Menge an Antigen (beispielsweise der Menge eines Proteins) in einer Testprobenflüssigkeit, die analysiert werden soll, nachgewiesen und dann unter Verwendung einer Standardkurve, hergestellt durch eine Standardlösung, die die bekannte Menge an Antigen enthält, berechnet werden kann. Vorteilhafterweise werden beispielsweise Nephrometrie, kompetitive Verfahren, immunometrische Verfahren und Sandwich-Verfahren verwendet; hinsichtlich der Sensitivität und Spezifizität ist das Sandwich-Verfahren, das nachstehend beschrieben wird, besonders bevorzugt.
Beispiele des Markierungsmittels, das in dem Assayverfahren unter Verwendung der Markierungssubstanz verwendet wird, sind Radioisotope, Enzyme, fluoreszierende Substanzen, lumineszente Substanzen und dergleichen. Beispiele des Radioisotops sind [¹²⁵I], [¹³¹I], [³H], [¹⁴C] usw. Bevorzugte Beispiele des Enzyms sind die, die stabil sind und eine hohe spezifische Aktivität aufweisen, was β-Galactosidase, β-Glucosidase, alkalische Phosphatase, Peroxidase, Malatdehydrogenase usw. umfaßt. Beispiele der fluoreszierenden Substanz sind Fluoreszamin, Fluoreszeinisothiocyanat usw. Beispiele der lumineszenten Substanz sind Luminol, ein Luminolderivat; Luciferin, Lucigenin usw. Außerdem kann das Biotin-Avidin-System ebenso zum Binden eines Antikörpers oder Antigens an ein Markierungsmittel verwendet werden.
Bei der Immobilisierung von Antigenen oder Antikörpern kann die physikalische Adsorption verwendet werden. Alternativ kann die chemische Bindung, die für die Immobilisierung von Proteinen oder Enzymen konventionell verwendet wird, ebenso verwendet werden. Beispiele des Trägers umfassen unlösliche Polysaccharide, wie Agarose, Dextran und Cellulose; synthetische Harze, wie Polystyrol, Polyacrylamid und Silikon; Glas; usw.
Bei dem Sandwich-Verfahren wird eine Testprobenflüssigkeit mit einem immobilisierten erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper umgesetzt (erste Reaktion), dann mit einem anderen markierten erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper umgesetzt (zweite Reaktion), und die Aktivität des Markierungsmittels auf den unlöslichen Träger wird analysiert, wodurch die Menge des erfindungsgemäßen Proteins in der Testprobenflüssigkeit quantifiziert werden kann. Die erste und zweite Reaktion können in umgekehrter Reihenfolge, gleichzeitig oder nacheinander in einem Intervall durchgeführt werden. Der Typ des Markierungsmittels und das Verfahren zur Immobilisierung können dieselben wie hierin oben beschrieben sein. Bei dem Immunassay durch das Sandwich-Verfahren ist es nicht immer notwendig, daß der Antikörper, der für den markierten Antikörper und für die Festphase verwendet wird, ein Typ oder eine Spezies sein soll, sondern ein Gemisch aus zwei oder mehreren Antikörpern kann ebenso für den Zweck der Verbesserung der Meßempfindlichkeit usw. verwendet werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Analysieren des erfindungsgemäßen Proteins durch das Sandwich-Verfahren sind die bevorzugten monoklonalen Antikörper der vorliegen den Erfindung, die für die erste und zweite Reaktion verwendet werden, die Antikörper, deren Bindungsstellen zu dem erfindungsgemäßen Protein sich voneinander unterscheiden. Das heißt, die Antikörper, die in der ersten und zweiten Reaktion verwendet werden, sind jene, wobei, wenn der Antikörper, der in der zweiten Reaktion verwendet wird, die C-terminale Region des erfindungsgemäßen Proteins erkennt, der Antikörper, der die andere Stelle als die C-terminalen Regionen erkennt, beispielsweise die N-terminale Region erkennt, vorzugsweise in der ersten Reaktion verwendet wird.
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper kann in einem anderen Assaysystem als dem Sandwich-Verfahren, in einem kompetitiven Verfahren, einem immunometrischen Verfahren, einer Nephrometrie usw., verwendet werden.
Bei dem kompetitiven Verfahren werden ein Antigen in einer Testprobenflüssigkeit und ein markiertes Antigen konkurrierend mit einem Antikörper umgesetzt, dann werden das nicht umgesetzte markierte Antigen (F) und das markierte Antigen, das an den Antikörper (B) gebunden ist, getrennt (d. h., B/F-Trennung), und die markierte Menge von entweder B oder F wird gemessen, um die Menge des Antigens in der Testprobenflüssigkeit zu bestimmen. Bei den Reaktionen für ein solches Verfahren gibt es ein Flüssigphasenverfahren, bei dem ein löslicher Antikörper als der Antikörper verwendet wird und die B/F-Trennung durch Polyethylenglykol bewirkt wird, während ein zweiter Antikörper zu dem Antikörper verwendet wird, und ein Festphasenverfahren, bei dem ein immobilisierter Antikörper als der erste Antikörper verwendet wird oder ein löslicher Antikörper als der erste Antikörper verwendet wird, während ein immobilisierter Antikörper als der zweite Antikörper verwendet wird.
Bei dem immunometrischen Verfahren werden ein Antigen in einer Testprobenflüssigkeit und ein immobilisiertes Antigen konkurrierend mit einer gegebenen Menge eines markierten Antikörpers umgesetzt, gefolgt von der Abtrennung der Festphase von der Flüssigphase; oder ein Antigen in einer Testprobenflüssigkeit und eine überschüssige Menge des markierten Antikörpers werden umgesetzt, dann wird ein immobilisiertes Antigen unter Bindung eines nicht umgesetzten markierten Antikörpers an die Festphase zugegeben und die Festphase wird von der Flüssigphase abgetrennt. Danach wird die markierte Menge von jeder der Phasen gemessen, um die Antigenmenge in der Testprobenflüssigkeit zu bestimmen.
In der Nephrometrie wird die Menge an unlöslichem Sediment, das infolge der Antigen-Antikörper-Reaktion in einem Gel oder in einer Lösung hergestellt wurde, gemessen. Selbst wenn die Menge eines Antigens in einer Testprobenflüssigkeit gering ist und nur eine kleine Menge des Sediments erhalten wird, kann eine Lasernephrometrie unter Verwendung der Laserstreuung geeignet verwendet werden.
Bei der Anwendung von jedem dieser Immunassays für das Assayverfahren der vorliegenden Erfindung ist es nicht erforderlich, jegliche spezielle Bedingungen oder Vorgänge darzustellen. Das Assaysystem für das erfindungsgemäße Protein kann zusätzlich zu den Bedingungen und Vorgängen, die konventionell für jedes der Verfahren verwendet werden, konstruiert werden unter Berücksichtigung der technischen Überlegungen des Fachmanns. Für Einzelheiten von diesen technischen Mitteln kann auf eine Vielzahl von Überblicksartikeln, Referenzbüchern usw. verwiesen werden.
Beispielsweise Hiroshi Irie (ed.): „Radioimmunoassay" (veröffentlicht von Kodansha, 1974); Hiroshi Irie (ed.): „Radioimmunoassay; Second Series" (veröffentlicht von Kodansha, 1979); Eiji Ishikawa, et al. (ed.): „Enzyme Immunoassay" (veröffentlicht von Igaku Shoin, 1978); Eiji Ishikawa, et al. (ed.): „Enzyme Immunoassay" (zweite Auflage) (veröffentlicht von Igaku Shoin, 1982); Eiji Ishikawa, et al. (ed.): „Enzyme Immunoassay" (dritte Auflage) (veröffentlicht von Igaku Shoin, 1987); „Methods in Enzymology" Bd. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)); ibid., Bd. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)); ibid., Bd. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)); ibid., Bd. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)); ibid., Bd. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies und General Immunoassay Methods)); ibid., Bd. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (veröffentlicht von Academic Press); usw.)
Wie oben beschrieben, kann das erfindungsgemäße Protein mit hoher Empfindlichkeit unter Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers quantifiziert werden.
Wenn außerdem (1) ein erhöhtes Niveau des erfindungsgemäßen Proteins durch Quantifizieren des Niveaus des erfindungsgemäßen Proteins unter Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers nachgewiesen wird, kann diagnostiziert werden, daß man unter diesen Krankhei ten leidet, wie Lungen/Thorax-Krankheiten, begleitet von der Entzündung der Lunge/Atemwege, einschließlich Bronchialasthma, chronisch-obstruktive Lungenerkrankung usw., oder es ist höchstwahrscheinlich, daß man in der Zukunft unter diesen Krankheiten leidet..
Der erfindungsgemäße Antikörper kann zum Nachweis des erfindungsgemäßen Proteins, das in einer Testprobenflüssigkeit wie eine Körperflüssigkeit, ein Gewebe usw. vorliegt, eingesetzt werden. Der Antikörper kann ebenso verwendet werden, um eine Antikörpersäule zur Reinigung des erfindungsgemäßen Proteins herzustellen, das erfindungsgemäße Protein in jeder Fraktion bei der Reinigung nachzuweisen und das Verhalten des erfindungsgemäßen Proteins in den untersuchten Zellen zu analysieren.
(5) Gendiagnosemittel
Unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA, beispielsweise als eine Sonde, kann eine Abnormalität (Genabnormalität) der DNA oder mRNA, die das erfindungsgemäße Protein codiert, bei einem Menschen oder Warmbluttier (beispielsweise Ratte, Maus, Meerschweinchen, Kaninchen, Huhn, Schaf, Schwein, Rind, Pferd, Katze, Hund, Affe, Schimpanse usw.) nachgewiesen werden. Deshalb ist die erfindungsgemäße DNA als ein Gendiagnosemittel zum Nachweis von Schäden an der DNA oder mRNA, ihren Mutationen oder verringerter Expression, erhöhter Expression, Überexpression usw. der DNA oder mRNA nützlich.
Die oben beschriebene Gendiagnostik unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA kann beispielsweise durch den öffentlich bekannten Northern-Hybridisierungsassay oder den PCR-SSCP-Assay (Genomics, 5, 874–879 (1989); Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 86, 2766–2770 (1989)) usw. durchgeführt werden.
Falls Überexpression beispielsweise durch die Northern-Hybridisierung nachgewiesen wird oder die DNA-Mutation durch den PCR-SSCP-Assay nachgewiesen wird, kann diagnostiziert werden, daß es höchstwahrscheinlich ist, unter Krankheiten, wie Lungen/Thorax-Krankheiten, begleitet von der Entzündung der Lunge/Atemwege, einschließlich Bronchialasthma, chronisch-obstruktive Lungenerkrankung usw. zu leiden.
(6) Pharmazeutikum, umfassend eine Antisense-DNA
Eine Antisense-DNA, die an die erfindungsgemäße DNA bindet, um komplementär die Expression der DNA zu unterdrücken, kann als das Mittel für die Behandlung/Vorbeugung von Krankheiten, wie Lungen/Thorax-Krankheiten, begleitet von der Entzündung der Lunge/Atemwege, einschließlich Bronchialasthma, chronisch-obstruktive Lungenerkrankung usw., verwendet werden, da die Antisense-DNA die Produktion des erfindungsgemäße Proteins in vivo unterdrücken kann.
In dem Fall, daß die oben beschriebene Antisense-DNA als Therapeutika/Prophylaktika verwendet wird, treffen die Therapeutika/Prophylaktika für die oben beschriebenen verschiedenen Krankheiten, umfassend die erfindungsgemäße DNA, ebenso auf die Antisense-DNA zu.
Wenn die Antisense-DNA verwendet wird, wird beispielsweise die Antisense-DNA direkt verabreicht oder die Antisense-DNA wird in einen geeigneten Vektor, wie einen Retrovirusvektor, einen Adenovirusvektor, einen Adenovirus-verbundenen Virusvektor usw., eingeführt, gefolgt von der Behandlung in einer konventionellen Weise. Die Antisense-DNA kann wie sie ist oder mit einem physiologisch akzeptablen Träger verabreicht werden, um ihre Aufnahme durch die Genkanone oder durch einen Katheter, wie einen Katheter mit einem Hydrogel, zu unterstützen. Alternativ kann die Antisense-DNA als Aerosol hergestellt werden, welches lokal in die Luftröhre als ein Inhalationsmittel verabreicht wird.
Außerdem kann die Antisense-DNA auch als eine Oligonucleotidsonde für die Diagnose eingesetzt werden, um die Gegenwart der erfindungsgemäßen DNA in Geweben oder Zellen und die Zustände ihrer Expression zu untersuchen.
(7) Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den erfindungsgemäßen Antikörper
Die erfindungsgemäße DNA mit einer Aktivität zum Neutralisieren des erfindungsgemäßen Proteins kann als ein Medikament für Krankheiten, wie Lungen/Thorax-Krankheiten, begleitet von der Entzündung der Lunge/Atemwege, einschließlich Bronchialasthma, chronischobstruktive Lungenerkrankung usw., verwendet werden.
Das zuvor genannte Therapeutikum/Prophylaktikum für die oben beschriebenen Krankheiten, das den erfindungsgemäßen Antikörper enthält, kann einem Menschen oder anderen Warm bluttier (beispielsweise Ratte, Kaninchen, Schaf, Schwein, Rind, Katze, Hund, Affe usw.) in seiner flüssigen Form wie es ist oder als eine pharmazeutische Zusammensetzung in einer geeigneten Präparatform oral oder parenteral verabreicht werden. Die Dosis variiert in Abhängigkeit des Patienten, dem sie verabreicht werden soll, der Zielkrankheit, des Zustandes, dem Applikationsweg usw.; wenn das Mittel einem Erwachsenen für die Behandlung/Vorbeugung von beispielsweise Bronchialasthma verabreicht wird, wird der erfindungsgemäße Antikörper normalerweise intravenös verabreicht, etwa 1 bis etwa einmal am Tag, bevorzugt etwa ein- bis dreimal am Tag, in einer Einzeldosis von etwa 0,01 bis etwa 20 mg/kg Körpergewicht, bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht, und stärker bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 5 mg/kg Körpergewicht für einen Erwachsenen. Für die andere parenterale Verabreichung und orale Verabreichung kann eine Dosis, die der obigen Dosis entspricht, verabreicht werden; wenn der Zustand besonders schwer ist, kann die Dosis gemäß des Zustandes erhöht werden.
Der erfindungsgemäße Antikörper kann in sich selbst oder als eine geeignete pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung, die für die oben beschriebene Verabreichung verwendet wird, enthält einen pharmakologisch akzeptablen Träger mit den zuvor genannten Verbindungen oder Salzen davon, einem Verdünnungsmittel oder einem Trägerstoff. Eine solche Zusammensetzung wird in einem Präparat bereitgestellt, welches zur oralen oder parenteralen Verabreichung geeignet ist.
Das heißt, Beispiele der Zusammensetzung zur oralen Verabreichung umfassen feste oder flüssige Präparate, speziell Tabletten (einschließlich Dragees und filmbeschichtete Tabletten), Pillen, Körnchen, Pulverpräparate, Kapseln (einschließlich weiche Kapseln), Sirup, Emulsionen, Suspensionen usw. Eine solche Zusammensetzung wird durch öffentlich bekannte Verfahren hergestellt und enthält ein Vehikel, ein Verdünnungsmittel oder einen Trägerstoff, das/der konventionell in dem Gebiet der pharmazeutischen Präparate verwendet wird. Beispiele des Vehikels oder Trägerstoffes für Tabletten sind Lactose, Stärke, Saccharose, Magnesiumstearat usw.
Beispiele der Zusammensetzung zur parenteralen Verabreichung, die verwendet werden können, sind Injektionen, Zäpfchen, usw., und die Injektionen umfassen die Form von intravenösen, subkutanen, transkutanen, intramuskulären und Tröpfcheninjektionen usw. Diese Injek tionen werden durch öffentlich bekannte Verfahren hergestellt, beispielsweise durch Lösen, Suspendieren oder Emulgieren des zuvor genannten Antikörpers oder ihrer Salze in einem sterilen wässerigen oder öligen flüssigen Medium. Für das wässerige Medium zur Injektion werden beispielsweise physiologische Kochsalzlösung und isotonische Lösungen, die Glukose und ein anderes Hilfsmittel enthalten, usw. verwendet. Geeignete Auflösungshilfsmittel, beispielsweise Alkohol (beispielsweise Ethanol) Polyalkohol (beispielsweise Propylenglykol, Polyethylenglykol), nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel (beispielsweise Polysorbat 80^TM, HCO-50 (Polyoxyethylenaddukt (50 mol) von hydriertem Rizinusöl)) können in Kombination verwendet werden. Für die ölige Lösung werden beispielsweise Sesamöl, Sojabohnenöl und dergleichen verwendet, und Auflösungshilfsmittel wie Benzylbenzoat und Benzylalkohol können in Kombination verwendet werden. Die so hergestellte Flüssigkeit zur Injektion wird normalerweise in eine geeignete Ampulle gefüllt. Das Zäpfchen, das zur rektalen Verabreichung verwendet wird, wird durch Mischen des zuvor genannten Antikörpers oder seiner Salze mit einer konventionellen Zäpfchengrundlage hergestellt.
Die oben beschriebene orale oder parenterale pharmazeutische Zusammensetzung wird vorteilhafterweise in einer Einheitsdosierungsform hergestellt, die für die Dosis des Wirkstoffes geeignet ist. Beispiele einer solchen Einheitsdosierungsform umfassen Tabletten, Pillen, Kapseln, Injektionen (Ampullen), Zäpfchen usw. Es ist bevorzugt, daß der oben beschriebene Antikörper im allgemeinen in einer Dosis von 5 bis 500 mg pro Einheitsdosierungsform, 5 bis 100 mg, speziell für Injektionen und 10 bis 250 mg für andere Präparate enthalten ist.
Jede oben beschriebene Zusammensetzung kann außerdem andere aktive Komponenten enthalten, sofern die Formulierung mit dem Antikörper keine nachteilige Wechselwirkung verursacht.
(8) Tier mit transgener DNA
Die vorliegende Erfindung stellt einen nicht-menschlichen Säuger bereit, der DNA trägt, die das erfindungsgemäße Protein codiert, welche exogen (hierin nachstehend als die erfindungsgemäße exogene DNA abgekürzt) oder ihre variante DNA ist (manchmal einfach als die erfindungsgemäße exogene variante DNA bezeichnet).
Daher stellt die vorliegende Erfindung bereit:

(1) einen nicht-menschlichen Säuger, der die erfindungsgemäße exogene DNA oder ihre variante DNA trägt;
(2) den Säuger gemäß (1), wobei der nicht-menschliche Säuger ein Nagetier ist;
(3) den Säuger gemäß (2), wobei das Nagetier eine Maus oder Ratte ist; und
(4) einen rekombinanten Vektor, der die erfindungsgemäße exogene DNA oder ihre variante DNA trägt und in einem Säuger exprimieren kann.

Der nicht-menschliche Säuger, der die erfindungsgemäße exogene DNA oder ihre variante DNA trägt (hierin nachstehend einfach als das erfindungsgemäße DNA-transgene Tier bezeichnet), kann durch Transfektieren einer gewünschten DNA in einem unbefruchteten Ei, einem befruchteten Ei, einem Spermium, einer Keimzelle, enthaltend eine primordiale Keimzelle davon, oder dergleichen, vorzugsweise in dem Embryostadium bei der Entwicklung eines nicht-menschlichen Säugers (stärker bevorzugt in dem Einzelzell- oder befruchteten Zellstadium und im allgemeinen vor dem 8-Zellstadium), durch Standardmittel, wie das Calciumphosphatverfahren, das Elektropulsverfahren, das Lipofektionsverfahren, das Agglutinationsverfahren, das Mikroinjektionsverfahren, das Teilchenkanonenverfahren, das DEAE-Dextranverfahren usw. erzeugt werden. Es ist ebenso möglich, die erfindungsgemäße exogene DNA in eine Körperzelle, ein lebendes Organ, eine Gewebezelle, oder dergleichen durch das DNA-Transfektionsverfahren zu transfektieren, und die Transformante für die Zellkultur, Gewebekultur usw. zu verwenden. Außerdem können diese Zellen mit der oben beschriebenen Keimzelle durch ein öffentlich bekanntes Zellfusionsverfahren fusioniert werden, um das DNA-transgene Tier der vorliegenden Erfindung zu erzeugen.
Beispiele des nicht-menschlichen Säugers, der verwendet werden kann, umfassen Rind, Schwein, Schaf, Ziege, Kaninchen, Hunde, Katzen, Meerschweinchen, Hamster, Mäuse, Ratten und dergleichen. Vor allem werden Nagetiere, speziell Mäuse (beispielsweise C57B1/6-Stamm, DBA2-Stamm usw. für die reine Linie und für die Kreuzlinie, B6C3F₁-Stamm, BDF₁-Stamm, B6D2F₁-Stamm, BALB/c-Stamm, ICR-Stamm usw.) oder Ratten (z. B., Wistar, SD usw.) bevorzugt, da sie eine relativ kurze Ontogenese und Lebenszyklus aus Sicht der Erzeugung von Modelltieren für menschliche Krankheiten aufweisen.
„Säuger" in einem rekombinanten Vektor, der in den Säugern exprimiert werden kann, umfassen die zuvor genannten nicht-menschlichen Säuger und Menschen.
Die erfindungsgemäße exogene DNA bezieht sich auf die erfindungsgemäße DNA, die einmal isoliert und aus den Säugern extrahiert wurde, nicht die erfindungsgemäße DNA, die der nicht-menschliche Säuger inhärent besitzt.
Die erfindungsgemäße variante DNA umfaßt Mutanten, die aus einer Variation (beispielsweise Mutation usw.) in der Basensequenz der erfindungsgemäßen ursprünglichen DNA resultieren, speziell DNAs, die aus der Basenaddition, -deletion, -substitution mit anderen Basen usw. resultieren, und außerdem einschließlich abnormale DNA.
Unter der abnormalen DNA ist eine DNA zu verstehen, die das erfindungsgemäße abnormale Protein exprimiert und durch eine DNA veranschaulich ist, die ein Protein exprimiert, um die Funktionen des erfindungsgemäßen normalen Proteins zu unterdrücken.
Die erfindungsgemäße exogene DNA kann irgendeine von denen sein, die aus einem Säuger derselben Spezies oder von einer anderen Spezies stammen, wobei der Säuger das Zieltier ist. Beim Transfektieren der erfindungsgemäßen DNA ist es im allgemeinen vorteilhaft, die DNA als ein DNA-Konstrukt zu verwenden, in dem die DNA stromabwärts eines Promotors, der die DNA in dem Zieltier exprimieren kann, ligiert wird. Beispielsweise kann in dem Fall des Tranfektierens der erfindungsgemäßen menschlichen DNA ein DNA-transgener Säuger, der die erfindungsgemäße DNA in einem hohen Niveau exprimiert, durch Mikroinjizieren eines DNA-Konstrukts (beispielsweise Vektors usw.), das mit der erfindungsgemäßen menschlichen DNA ligiert wird, in ein befruchtetes Ei des nicht-menschlichen Zielsäugers stromabwärts verschiedener Promotoren hergestellt werden, die die DNA exprimieren können, welche aus verschiedenen Säugern (beispielsweise Kaninchen, Hunde, Katzen, Meerschweinchen, Hamster, Ratten, Maus usw.) stammt, die die erfindungsgemäße DNA tragen, welche zu der menschlichen DNA stark homolog ist.
Als Expressionsvektoren für das erfindungsgemäße Protein gibt es Escherichia coliabgeleitete Plasmide, Bacillus subtilis-abgeleitete Plasmide, Hefe-abgeleitete Plasmide, Bakteriophagen wie λ-Phage, Retroviren wie Moloney-Leukemie-Virus usw., und Tierviren wie Kuhpockenvirus, Baculovirus usw. Von diesen Vektoren werden Escherichia coli-abgeleitete Plasmide, Bacillus subtilis-abgeleitete Plasmide oder Hefe-abeleitete Plasmide usw. bevorzugt verwendet.
Beispiele von diesen Promotoren zur Regulierung der oben beschriebenen DNA-Expression umfassen 1) Promotoren für DNA, abgeleitet von Viren (beispielsweise Simian-Virus, Cytomegalovirus, Moloney-Leukemie-Virus, JC-Virus, Brustkrebsvirus, Poliovirus usw.), und 2) Promotoren, abgeleitet von verschiedenen Säugern (Mensch, Kaninchen, Hunde, Katzen, Meerschweinchen, Hamster, Ratten, Mäuse usw.), beispielsweise Promotoren von Albumin, Insulin II, Uroplakin II, Elastase, Erythropoietin, Endothelin, Muskelkreatinkinase, gliales fibrilläres Säureprotein, Glutathion-S-transferase, Blutplättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor β, Keratine K1, K10 und K14, Kollagentypen I und II, cyclische AMP-abhängige Proteinkinase-βI-Subeinheit, Dystrophin, Tartarat-resistente alkalische Phosphatase, atrialen natriuretischen Faktor, Endothelrezeptor Tyrosinkinase (im allgemeinen abgekürzt als Tie2), Natrium-Kalium-Adenosintriphosphorylase (Na, K-ATPase), leichte Neurofilamentkette, Metallothioneine I und IIA, Metalloproteinase-I-Gewebeinhibitor, MHC-Klasse I Antigen (H-2L), H-ras, Renin, Dopamin-β-hydroxylase, Thyroidperoxidase (TPO), Polypeptidkettenverlängerungsfaktor 1α (EF-1α), β-Actin, α- und schwere β-Myosinketten, leichte Myosinketten 1 und 2, Myelinbasenprotein, Thyroglobuline, Thy-1, Immunoglobuline, H-Kette variable Region (VNP), Serumamyloidkomponente P, Myoglobin, Troponin C, Glattmuskel-α-Actin, Preproencephalin A, Vasopressin usw. Unter diesen sind Cytomegalovirus-Promotoren, menschlicher Polypeptidverlängerungsfaktor 1α (EF-1α) Promotoren, menschliche und Huhn-β-Actin-Promotoren usw., die das Protein im gesamten Körper stark exprimieren können, bevorzugt.
Es ist bevorzugt, daß die oben beschriebenen Vektoren eine Sequenz zum Beenden der Transkription der gewünschten Messenger-RNA in dem DNA-transgenen Tier aufweisen (im allgemeinen Terminator genannt); beispielsweise eine Sequenz von jeder DNA, die aus Viren und verschiedenen Säugern stammt. SV40-Terminator des Simian-Virus usw. werden bevorzugt verwendet.
Außerdem kann für den Zweck der Erhöhung der Expression der gewünschten exogenen DNA auf ein höheres Niveau des Splicingsignal und die Enhancerregion jeder DNA, ein Teil des Introns einer eukaryotischen DNA am 5' stromaufwärts der Promotorregion oder zwi schen der Promotorregion und der Translationsregion oder am 3' stromabwärts der Translationsregion in Abhängigkeit vom Zweck ligiert werden.
Die Translationsregion für das normale erfindungsgemäße Protein kann unter Verwendung als Ausgangsmaterial der gesamten genomischen DNA oder ihres Anteils der Leber, Niere, Schilddrüsenzelle oder Fibroblasten, stammend vom Menschen oder verschiedenen Säugern (beispielsweise Kaninchen, Hunde, Katzen, Meerschweinchen, Hamster, Ratten, Mäuse usw.), oder von verschiedenen kommerziell erhältlichen genomischen DNA-Bibliotheken oder unter Verwendung der komplementären DNA, hergestellt durch ein öffentlich bekanntes Verfahren aus RNA der Leber, Niere, Schilddrüsenzelle oder fibroblastischen Ursprungs als Ausgangsmaterial, erhalten werden. Ebenso kann eine exogene abnormale DNA unter Verwendung der komplementären DNA, die durch ein öffentlich bekanntes Verfahren aus RNA menschlichen fibroblastischen Ursprungs als Auggangsmaterial hergestellt wurde, erhalten werden. Alternativ kann die Translationsregion für eine normale Proteintranslationsregion, erhalten durch die/das oben beschriebene Zelle oder Gewebe, durch Punktmutagenese variant gemacht werden.
Die Translationsregion kann durch eine konventionelle Genengineeringtechnik hergestellt werden, bei der die DNA stromabwärts des zuvor genannten Promotors und nach Bedarf stromaufwärts der Translationsterminationsstelle als ein DNA-Konstrukt, das in dem transgenen Tier exprimiert werden kann, ligiert wird.
Die erfindungsgemäße exogene DNA wird bei dem Zellstadium des befruchteten Eis in einer Weise transfektiert, so daß die DNA sicher in allen Keimzellen und somatischen Zellen des Zielsäugers vorliegt. Die Tatsache, daß die erfindungsgemäße exogene DNA in den Keimzellen des Tiers, hergestellt durch DNA-Transfektion, vorliegt, bedeutet, daß alle Nachkommen des hergestellten Tiers die erfindungsgemäße exogene DNA in allen Keimzellen und somatischen Zellen davon behalten werden. Die Nachkommen des Tiers, das die erfindungsgemäße exogene DNA vererbt, haben ebenso die erfindungsgemäße exogene DNA in allen Keimzellen und somatischen Zellen davon.
Der nicht-menschliche Säuger, in dem die erfindungsgemäße normale exogene DNA transfektiert worden ist, kann als DNA-tragendes Tier unter üblicher Zuchtumgebung unter Bestätigung, daß die exogene DNA durch Paarung stabil beibehalten wird, passagiert werden.
Durch die Transfektion der erfindungsgemäßen exogenen DNA in dem Stadium der befruchteten Eizelle wird die DNA im Überschuß in allen Keim- und somatischen Zellen gehalten. Die Tatsache, daß die erfindungsgemäße exogene DNA übermäßig in den Keimzellen des hergestellten Tiers nach der Transfektion vorliegt, bedeutet, daß die erfindungsgemäße exogene DNA übermäßig in allen Keimzellen und somatischen Zellen davon vorliegt. Die Nachkommen des Tiers, das die erfindungsgemäße exogene DNA vererbt, hat übermäßig die erfindungsgemäße DNA in allen Keimzellen und somatischen Zellen davon.
Durch den Erhalt eines homozygotischen Tiers mit der transfektierten DNA in sowohl den homologen Chromosomen als auch bei der Paarung eines männlichen und weiblichen Tiers können alle Nachkommen unter Beibehaltung der DNA passagiert werden.
Bei einem nicht-menschlichen Säuger, der die erfindungsgemäßen normale DNA trägt, ist die erfindungsgemäße normale DNA in einem hohen Niveau exprimiert worden, und kann schließlich die hervorgehobene Funktion des erfindungsgemäßen Proteins durch Beschleunigen der Funktion der endogenen normalen DNA entwickeln. Deshalb kann das Tier als ein pathologisches Modelltier für eine solche Krankheit verwendet werden. Beispielsweise ist es unter Verwendung des erfindungsgemäßen normalen DNA-transgenen Tieres möglich, den Mechanismus der hervorgehobenen Funktion des erfindungsgemäßen Proteins und den pathologischen Mechanismus der Krankheit, die mit dem erfindungsgemäßen Protein verbunden ist, aufzuklären und zu bestimmen, wie man die Krankheit behandelt.
Da außerdem ein Säuger, der die erfindungsgemäße exogene normale DNA transfektierte, ein Symptom der Erhöhung des freigesetzten erfindungsgemäßen Proteins zeigt, ist das Tier zum Screenen des Therapeutikums für eine Krankheit, die mit dem erfindungsgemäßen Protein verbunden ist, nutzbar.
Andererseits kann ein nicht-menschlicher Säuger mit der erfindungsgemäßen exogenen abnormalen DNA unter normalen Züchtungsbedingungen als DNA-tragendes Tier durch die Bestätigung der stabilen Erhaltung der exogenen DNA über Kreuzung passagiert werden. Außerdem kann die gewünschte exogene DNA als Ausgangsmaterial durch Einführen der DNA in das oben beschriebene Plasmid genutzt werden. Das DNA-Konstrukt mit einem Promotor kann durch konventionelle Genengineeringtechniken hergestellt werden. Die Transfektion der erfindungsgemäßen abnormalen DNA in dem Stadium des befruchteten Eis wird dahingehend konserviert, daß sie in allen Keim- und somatischen Zellen des unterzogenen Säugers vorliegt. Die Tatsache, daß die erfindungsgemäße abnormale DNA in den Keimzellen des Tiers nach der DNA-Transfektion vorliegt, bedeutet, daß alle Nachkommen des hergestellten Tiers die erfindungsgemäße abnormale DNA in allen Keim- und somatischen Zellen haben. Ein solcher Nachkomme, der die erfindungsgemäße exogene DNA passagiert, enthält die erfindungsgemäße abnormale DNA in allen Keim- und somatischen Zellen. Ein homozygotes Tier mit der eingeführten DNA auf beiden homologen Chromosomen kann erlangt werden, und dann können durch Paarung dieser männlichen und weiblichen Tiere alle Nachkommen zur Ader gelassen werden, um die DNA zu gewinnen.
Da der nicht-menschliche Säuger mit der erfindungsgemäßen abnormalen DNA die erfindungsgemäße abnormale DNA auf einem hohen Niveau exprimieren kann, kann das Tier die Nicht-Anpassungsfähigkeit vom Funktionsinaktivierungstyp des erfindungsgemäßen Proteins durch Inhibieren der Funktion der endogenen normalen DNA sein und kann als ihr Krankheitsmodelltier verwendet werden. Beispielsweise ist es unter Verwendung des erfindungsgemäßen abnormalen DNA-transgenen Tiers möglich, den Mechanismus der Funktionsinaktivierungtyp-Unverwendbarkeit des erfindungsgemäßen Proteins zu ermitteln und eine Untersuchung eines Verfahrens zur Behandlung dieser Krankheit durchzuführen.
Spezieller wird ebenso erwartet, daß das transgene Tier, welches die erfindungsgemäße abnormale DNA auf einem hohen Niveau exprimiert, als ein experimentelles Modell für die Aufklärung des Mechanismus der funktionellen Inhibierung (dominante negative Wirkung) des normalen Proteins durch das erfindungsgemäße abnormale Protein in der Nicht-Anpassungsfähigkeit durch Funktionsinaktivierung des erfindungsgemäßen Proteins dient.
Es wird ebenso erwartet, daß ein Säuger, der die erfindungsgemäße abnormale exogene DNA trägt, zum Screenen eines Kandidatenarzneimittels für die Behandlung der Nicht- Anpassungsfähigkeit durch Funktionsinaktivierung des erfindungsgemäßen Proteins dient, da das erfindungsgemäße Protein in einem solchen Tier in seiner freien Form erhöht wird.
Andere mögliche Anwendungen von zwei Arten der oben beschriebenen transgenen Tiere umfassen:

1) Verwendung als eine Zellquelle für die Gewebekultivierung;
2) Ermittlung der Beziehung zu einem Protein, das spezifisch durch das erfindungsgemäße Protein exprimiert oder aktiviert wird, durch direkte Analyse der DNA oder RNA in Gewebe des erfindungsgemäßen DNA-transgenen Tiers oder durch Analyse des Proteingewebes, exprimiert durch die DNA;
3) Untersuchung der Funktion von Zellen, die aus Geweben stammen, die normalerweise nur mit Schwierigkeiten unter Verwendung von Zellen von Gewebe, das die DNA trägt, kultiviert durch eine Standardgewebekulturtechnik, kultiviert werden;
4) Screenen eines Arzneimittels, das die Funktionen von Zellen unter Verwendung der in 3) oben beschriebenen Zellen verstärkt; und
5) Isolation und Reinigung des varianten erfindungsgemäßen Proteins und Herstellung eines Antikörpers dazu.

Außerdem können klinische Zustände einer Krankheit, die mit dem erfindungsgemäßen Protein verbunden ist, einschließlich der Nicht-Anpassungsfähigkeit durch Funktionsinaktivierung des erfindungsgemäßen Proteins, unter Verwendung des DNA-transgenen Tiers der vorliegenden Erfindung bestimmt werden. Ebenso können pathologische Ergebnisse an jedem Organ bei einem Krankheitsmodell, das mit dem erfindungsgemäßen Protein verbunden ist, ausführlicher erhalten werden, was zur Entwicklung eines neuen Verfahrens für die Behandlung sowie die Forschung und Therapie von jeglichen sekundären Krankheiten, die mit der Krankheit verbunden sind, führt.
Es ist ebenso möglich, eine freie DNA-transfektierte Zelle mit durch Entnehmen jedes Organs aus dem erfindungsgemäßen Tier mit transgener DNA, Zerkleinern des Organs und Abbauen mit einer Proteinase wie Trypsin usw. zu erhalten, gefolgt von der Herstellung der Kulturlinie oder kultivierten Zellen. Außerdem kann das erfindungsgemäße Tier mit transgener DNA zur Identifikation von Zellen dienen, die zur Herstellung des erfindungsgemäßen Proteins fähig sind, und für Studien zur Verbindung mit Apoptose, Differenzierung oder Propaga tion oder auf den Mechanismus der Signaltransduktion in diesen Eigenschaften, um darin irgendeine Abnormalität zu inspizieren. Daher kann das erfindungsgemäße Tier mit transgener DNA ein effektives Untersuchungsmaterial für das erfindungsgemäße Protein und zur Ermittlung der Funktion und Wirkung davon bereitstellen.
Um ein Arzneimittel für die Behandlung von Krankheiten, die mit dem erfindungsgemäßen Protein verbunden sind, einschließlich der Nicht-Anpassungsfähigkeit durch Funktionsinaktivierung des erfindungsgemäßen Proteins, unter Verwendung des erfindungsgemäßen DNA-transgenen Tiers zu entwickeln, kann ein effektives und schnelles Verfahren zum Screenen unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens zur Inspektion und des Verfahrens zur Quantifizierung usw. bereitgestellt werden. Es ist ebenso möglich, ein Verfahren für die DNA-Therapie für die Behandlung von Krankheiten, die mit dem erfindungsgemäßen Protein verbunden sind, unter Verwendung des erfindungsgemäßen DNA-transgenen Tiers oder eines Vektors, der zur Expression der erfindungsgemäßen exogenen DNA fähig ist, zu untersuchen und zu entwickeln.
(9) Knockout-Tier
Die vorliegende Erfindung stellt eine embryonale Stammzelle eines nicht-menschlichen Säugers bereit, die die inaktivierte erfindungsgemäße DNA trägt, und einen nicht-menschlichen Säuger, der die erfindungsgemäße DNA nicht exprimieren kann.
Daher stellt die vorliegende Erfindung bereit:

(1) eine nicht-menschliche embryonale Stammzelle, in der die erfindungsgemäße DNA inaktiviert ist;
(2) eine embryonale Stammzelle gemäß (1), worin die DNA durch Einführen eines Reportergens (beispielsweise β-Galactosidasegens, abgeleitet von Escherichia coli) inaktiviert ist;
(3) eine embryonale Stammzelle gemäß (1), die gegen Neomycin resistent ist;
(4) eine embryonale Stammzelle gemäß (1), wobei der nicht-menschliche Säuger ein Nagetier ist;
(5) eine embryonale Stammzelle gemäß (4), wobei das Nagetier eine Maus ist;
(6) ein nicht-menschlicher Säuger, der die erfindungsgemäße DNA nicht exprimieren kann, wobei die DNA inaktiviert ist;
(7) ein nicht-menschlicher Säuger gemäß (6), wobei die DNA durch Einführen eines Reportergens (beispielsweise β-Galactosidase, abgeleitet von Escherichia coli) darin inaktiviert ist, und das Reportergen unter Kontrolle eines Promotors für die erfindungsgemäße DNA exprimiert werden kann;
(8) ein nicht-menschlicher Säuger gemäß (6), wobei der nicht-menschliche Säuger ein Nagetier ist;
(9) ein nicht-menschlicher Säuger gemäß (8), wobei das Nagetier eine Maus ist; und
(10) ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung, die zur Beschleunigung oder Inhibierung der Promotoraktivität für die erfindungsgemäße DNA fähig ist, umfassend die Verabreichung einer Testverbindung einem Säuger von (7) und Nachweisen der Expression des Reportergens.

Die embryonale Stammzelle des nicht-menschlichen Säugers, bei der die erfindungsgemäße DNA inaktiviert ist, bezieht sich auf eine embryonale Stammzelle des nicht-menschlichen Säugers, die die Fähigkeit des nicht-menschlichen Säugers, die DNA durch künstliches Mutieren der erfindungsgemäßen DNA zu exprimieren, unterdrückt, oder die DNA weist keine wesentliche Fähigkeit, das erfindungsgemäße Protein (hierin nachstehend manchmal als erfindungsgemäße Knockout-DNA bezeichnet) durch im wesentlichen Inaktivieren der Aktivitäten des erfindungsgemäßen Protein, das durch die DNA codiert wird (hierin nachstehend nur als ES-Zelle bezeichnet), zu exprimieren, auf.
Als der nicht-menschliche Säuger treffen dieselben Beispiele, wie oben beschrieben, zu.
Techniken zum künstlichen Mutieren der erfindungsgemäßen DNA umfassen die Deletion eines Teils oder der gesamten DNA-Sequenz und Insertion von oder Substitution durch andere DNA mittles Gentechnik. Durch diese Variationen kann die erfindungsgemäße Knockout-DNA hergestellt werden, beispielsweise durch Verschieben des Ableserahmens eines Codons oder durch Auflösen der Funktion eines Promotors oder Exons.
Speziell kann die embryonale Stammzelle des nicht-menschlichen Säugers, bei der die erfindungsgemäße DNA inaktiviert ist, (hierin nachstehend nur als ES-Zelle mit der erfindungsgemäßen inaktivierten DNA oder die erfindungsgemäße Knockout-ES-Zelle bezeichnet), beispielsweise erhalten werden durch Isolieren der erfindungsgemäßen DNA, die der gewünsch te nicht-menschliche Säuger besitzt, Insertieren eines DNA-Fragments mit einer DNA-Sequenz, konstruiert durch Insertieren eines Arzneimittel-resistenten Gens, wie ein Neomycin-resistentes Gen oder ein Hygromycin-resistentes Gen, oder ein Reportergen, wie lacZ (β-Galactosidasegen) oder cat (Chloramphenicolacetyltransferasegen) usw. in seine Exonstelle, wodurch die Funktion des Exons unbrauchbar gemacht wird, oder Integrieren zu einem Chromosom des Zieltiers durch beispielsweise homologe Rekombination einer DNA-Sequenz, die die Gentranskription (beispielsweise Poly-A-Additionssignal usw.) in dem Intron zwischen Exonen terminiert, um so die Synthese der kompletten Messenger-RNA zu inhibieren und schließlich das Gen zu zerstören (hierin nachstehend einfach als Targetvektor bezeichnet). Die so erhaltenen ES-Zellen werden der Southern-Hybridisierungsanalyse mit einer DNA-Sequenz auf oder nahe der erfindungsgemäßen DNA als eine Sonde oder der PCR-Analyse mit einer DNA-Sequenz auf dem Targetvektor und einer anderen DNA-Sequenz nahe der erfindungsgemäßen DNA, die nicht in dem Targetvektor als Primer einbezogen ist, unterzogen, um die erfindungsgemäße Knockout-ES-Zelle zu selektieren.
Die Eltern-ES-Zellen, um die erfindungsgemäße DNA durch homologe Rekombination usw. zu inaktivieren, können von einem Stamm sein, der bereits wie oben beschrieben hergestellt wurde, oder können original gemäß einer Modifikation des bekannten Verfahrens von EVans and Kaufman, oben, hergestellt werden. Beispielsweise ist es in dem Fall von Maus-ES-Zellen derzeit in der Praxis bekannt, ES-Zellen des 129-Stammes zu verwenden. Da jedoch ihr immunologischer Hintergrund unbekannt ist, kann vorzugsweise die in C57BL/6-Maus oder die BDF₁-Maus (F₁-Hybrid zwischen C57BL/6 und DBA/2), worin die geringe Eizellenverfügbarkeit pro C57BL/6 in der C57BL/6-Maus durch Kreuzen mit DBA/2 verbessert worden ist, verwendet werden, anstelle des Erhalts einer reinen Linie von ES-Zellen mit dem klaren immunologischen genetischen Hintergrund und für andere Zwecke. Die BDF₁-Maus ist dahingehend vorteilhaft, wenn eine pathologische Modellmaus unter Verwendung von ES-Zellen, erhalten daraus, erzeugt wird, kann der genetische Hintergrund zu dem der C57BL/6-Maus durch Rückkreuzen mit der C57BL/6-Maus verändert werden, da ihr Hintergrund von der C57BL/6-Maus ist sowie dahingehend vorteilhaft ist, daß die Eizellenverfügbarkeit pro Tier hoch ist und die Eizellen robust sind.
Bei der Herstellung von ES-Zellen werden Blastozyten 3,5 Tage nach der Befruchtung üblicherweise verwendet. In der vorliegenden Erfindung werden Embryos vorzugsweise in dem 8-Zellstadium gesammelt, nachdem Kultivieren bis zu dem Blastozytenstadium werden die Embryos verwendet, um effizient eine große Anzahl von Embryonen im frühen Stadium zu erhalten.
Obwohl die verwendeten ES-Zellen von jedem Geschlecht sein können, sind männliche ES-Zellen im allgemeinen zur Erzeugung einer Keimzellinien-Chimäre günstiger und sind deshalb bevorzugt. Es ist ebenso wünschenswert, daß die Geschlechter so schnell wie möglich identifiziert werden, um die gewissenhafte Kultivierzeit zu sichern.
Die Verfahren zur Geschlechtsidentifikation der ES-Zelle umfassen das Verfahren, bei dem ein Gen in der Geschlechts-bestimmenden Region auf dem Y-Chromosom durch das PCR-Verfahren amplifiziert und detektiert wird. Wenn dieses Verfahren verwendet wird, ist eine Kolonie von ES-Zellen (etwa 50 Zellen) für die Geschlechtsbestimmungsanalyse ausreichend, wobei die Karyotypanalyse, beispielsweise G-Banding-Verfahren, etwa 10⁶ Zellen erfordert; daher kann eine erste Selektion von ES-Zellen in dem frühen Kulturstadium auf der Geschlechtsidentifikation basieren, und männliche Zellen können früh ausgewählt werden, was eine signifikante Menge an Zeit im frühen Kulturstadium einspart.
Eine zweite Selektion kann beispielsweise durch Bestimmung der Chromosomenzahl durch das G-Banding-Verfahren erreicht werden. Es ist normalerweise wünschenswert, daß die Chromosomenzahl der erhaltenen ES-Zellen 100 % der normalen Zahl ist. Wenn es jedoch schwierig ist, die Zellen mit der normalen Chromosomenzahl aufgrund physikalischer Vorgänge usw. in der Zellherstellung zu erhalten, ist es wünschenswert, daß die ES-Zelle wieder zu einer normalen Zelle geklont wird (beispielsweise in Mauszellen mit der Chromosomenzahl 2n = 40), nachdem das Gen der ES-Zellen zerstört wird.
Obwohl die so erhaltene embryonale Stammzellinie ein sehr hohes Wachstumspotential zeigt, muß sie mit großer Vorsicht subkultiviert werden, da sie gewöhnlich ihre ontogene Fähigkeit verliert. Beispielsweise wird die embryonale Stammzellinie bei etwa 37 °C in einem Kohlendioxidinkubator (bevorzugt etwa 5 % Kohlendioxid und etwa 95 % Luft, oder etwa 5 % Sauerstoff, etwa 5 % Kohlendioxid und 90 % Luft) in Gegenwart von LIF (1 bis 10.000 U/ml) auf geeigneten Feeder-Zellen wie STO-Fibroblasten kultiviert, mit einer Trypsin/EDTA-Lösung (normalerweise etwa 0,001 bis etwa 0,5 % Trypsin/etwa 0,1 bis etwa 5 mM EDTA, bevorzugt etwa 0,1 % Trypsin/1 mM EDTA) zum Zeitpunkt der Passage behandelt, wodurch separate einzelne Zellen erhalten wurden, die dann auf frisch hergestellten Feeder-Zellen gesät wurden. Diese Passage wird normalerweise aller 1 bis 3 Tage durchgeführt; es ist wünschenswert, daß die Zellen bei der Passage beobachtet werden, und auf Zellen, von denen festgestellt wird, daß sie in der Kultur morphologisch abnormal sind, wird, wenn überhaupt, verzichtet.
Wo ES-Zellen eine hohe Dichte in den Einzelschichten erreichen oder Zellaggregate in Suspension unter geeigneten Bedingungen bilden können, werden sie spontan zu verschiedenen Zelltypen differenzieren, beispielsweise Parietal- und Viszeralmuskeln, Herzmuskel oder dergleichen [M. J. Evans und M. H. Kaufman, Nature, 292, 154, 1981; G. R. Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, 7634, 1981; T. C. Doetschman et al., Journal of Embryology Experimental Morphology, 87, 27, 1985]. Die in der Expression der erfindungsgemäßen DNA unzureichenden Zellen, die aus den differenzierten ES-Zellen der vorliegenden Erfindung erhältlich sind, sind für die Untersuchung der Funktionen des erfindungsgemäßen Proteins zytologisch nützlich.
Der nicht-menschliche Säuger, der in der Expression der erfindungsgemäßen DNA unzureichend ist, kann von einem normalen Tier durch Messen der mRNA-Menge in dem Zieltier durch ein öffentlich bekanntes Verfahren und indirekten Vergleich der Expressionsgrade unterschieden werden.
Für den nicht-menschlichen Säuger gelten dieselben Beispiele wie oben.
In bezug auf den nicht-menschlichen Säuger, der in der Expression der erfindungsgemäßen DNA unzureichend ist, kann die erfindungsgemäße DNA durch Transfektieren eines Targetvektors, hergestellt wie oben beschrieben, zu embryonalen Stammzellen des nicht-menschlichen Säugers oder Oozyten davon und Durchführen der homologen Rekombination, bei der eine Targetvektor-DNA-Sequenz, worin die erfindungsgemäße DNA durch die Transfektion inaktiviert ist, durch die erfindungsgemäße DNA auf einem Chromosom einer embryonalen Stammzelle des nicht-menschlichen Säugers oder Embryos davon ersetzt wird, zerstört werden.
Die Knockout-Zellen mit der zerstörten erfindungsgemäßen DNA können durch Southern-Hybridisierungsanalyse mit einem DNA-Fragment auf oder nahe der erfindungsgemäßen DNA als eine Sonde oder durch PCR-Analyse unter Verwendung einer DNA-Sequenz auf dem Targetvektor und einer anderen DNA-Sequenz, die nicht in dem Targetvektor als Primer eingeschlossen ist, identifiziert werden. Wenn die embryonalen Stammzellen des nicht-menschlichen Säugers verwendet werden, wird eine Zellinie, worin die erfindungsgemäße DNA inaktiviert ist, durch homologe Rekombination geklont; die resultierende geklonte Zelllinie wird beispielsweise in einen nicht-menschlichen Säugerembryo oder Blastozyten bei einem geeigneten Stadium, wie dem 8-Zellstadium, injiziert. Die resultierenden chimären Embryos werden in die Gebärmutter des scheinschwangeren nicht-menschlichen Säugers transplantiert. Das resultierende Tier ist ein chimäres Tier, bestehend sowohl aus Zellen mit der normalen Position der erfindungsgemäßen DNA als auch denen mit einer künstlich mutierten Position der erfindungsgemäßen DNA.
Wenn einige Keimzellen des chimären Tiers eine mutierte Position der erfindungsgemäßen DNA aufweisen, kann ein Individuum, dessen gesamtes Gewebe aus Zellen mit einem mutierten Lokus der erfindungsgemäßen DNA besteht, aus einer Reihe von Nachkommen, die durch Kreuzungen zwischen einem solchen chimären Tier und einem normalen Tier erhalten wurden, beispielsweise durch Hautfarbenidentifikation usw. ausgewählt werden. Den so erhaltenen Individuen mangelt es normalerweise an heterozygoter Expression des erfindungsgemäßen Proteins. Die Individuen, denen es an homozygoter Expression des erfindungsgemäßen Proteins mangelt, können aus Nachkommen der Artenkreuzung zwischen den Heterozygoten erhalten werden.
Wenn eine Oozyte oder Eizelle verwendet wird, kann eine DNA-Lösung injiziert werden, beispielsweise in den Vorkern durch Mikroinjektion, wodurch ein transgener nicht-menschlicher Säuger mit einem Targetvektor, der in ein Chromosom davon eingeführt wird, erhalten wird. Aus solchen transgenen nicht-menschlichen Säugern können die mit einer Mutation an dem Lokus der erfindungsgemäßen DNA durch Auswahl, basierend auf der homologen Rekombination, erhalten werden.
Wie oben beschrieben, ermöglichen die Individuen, bei denen die erfindungsgemäße DNA zerstört ist, die Tierpassagezucht unter üblichen Zuchtbedingungen, nachdem die durch ihre Kreuzung erhaltenen Individuen als Knockout-Individuen nachgewiesen wurden.
Außerdem kann das Genitalsystem erhalten und durch konventionelle Verfahren beibehalten werden. Das heißt, durch Kreuzen von männlichen und weiblichen Tieren mit jeweils der inaktivierten DNA können homozygote Tiere mit der inaktivierten DNA an beiden Positionen erhalten werden. Die so erhaltenen Homozygoten können so gezüchtet werden, daß ein normales Tier und zwei oder mehrere Homozygoten aus einem Muttertier produziert werden können, um diese Homozygoten effizient zu erhalten. Durch Kreuzen von männlichen und weiblichen Heterozygoten werden Homozygoten und Heterozygoten mit der erfindungsgemäßen DNA proliferiert und passagiert.
Die embryonale Stammzelle des nicht-menschlichen Säugers, in der die erfindungsgemäße DNA inaktiviert ist, ist zur Herstellung eines nicht-menschlichen Säugers, dem es an der Expression der erfindungsgemäßen DNA mangelt, sehr nützlich.
Da es dem nicht-menschlichen Säuger, bei dem die erfindungsgemäße DNA inaktiviert ist, an verschiedenen biologischen Aktivitäten, die aus dem erfindungsgemäßen Protein abgeleitet werden, mangelt, kann ein solches Tier ein Krankheitsmodell sein, bei dem inaktivierte biologische Aktivitäten des erfindungsgemäßen Proteins vermutet werden, und bietet daher ein effektives Studienobjekt, um die Ursachen und Therapie für diese Krankheiten zu untersuchen.
(10) Verfahren zum Screenen einer Verbindung mit den therapeutischen/prophylaktischen Wirkungen für Krankheiten, verursacht durch Mangel, Schäden usw. der erfindungsgemäßen DNA.
Der nicht-menschliche Säuger, dem es an Expression der erfindungsgemäßen DNA mangelt, kann zum Screenen einer Verbindung mit den therapeutischen/prophylaktischen Wirkungen für Krankheiten (beispielsweise Infektionskrankheiten usw.), verursacht durch Mangel, Schäden usw. der erfindungsgemäßen DNA, eingesetzt werden.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung mit den therapeutischen/prophylaktischen Wirkungen für Krankheiten, verursacht durch Mangel, Schäden usw. der erfindungsgemäßen DNA, bereit, umfassend das Verabreichen einer Testverbindung dem nicht-menschlichen Säuger, dem es an Expression der erfindungsgemäßen DNA mangelt, und Beobachten und Messen einer Veränderung, die in dem Tier auftrat.
Für den nicht-menschliche Säuger, dem es an Expression der erfindungsgemäßen DNA mangelt, der für das Screening-Verfahren eingesetzt werden kann, gelten dieselben Beispiele, wie hierin oben angegeben ist.
Beispiele der Testverbindungen umfassen Peptide, Proteine, Nicht-Peptidverbindungen, synthetische Verbindungen, Fermentationsprodukte, Zellextrakte, Pflanzenextrakte, tierische Gewebeextrakte, Blutplasma und dergleichen, und diese Verbindungen können neue Verbindungen oder öffentlich bekannte Verbindungen sein.
Speziell wird der nicht-menschliche Säuger, dem es an Expression der erfindungsgemäßen DNA mangelt, mit einer Testverbindung behandelt; der Vergleich erfolgt mit einem intakten Tier zur Kontrolle, und eine Veränderung in jedem Organ, Gewebe, Krankheitszustände usw. des Tiers wird als Index verwendet, um die therapeutischen/prophylaktischen Wirkungen der Testverbindung zu bewerten.
Zur Behandlung eines Tiers, das mit einer Testverbindung getestet werden soll, werden beispielsweise die orale Verabreichung, intravenöse Injektion usw. angewendet und die Behandlung wird geeigneterweise in Abhängigkeit der Zustände des Testtiers, den Eigenschaften der Testverbindung usw. ausgewählt. Außerdem kann eine Menge einer Testverbindung, die verabreicht werden soll, in Abhängigkeit des Verabreichungsweges, Beschaffenheit der Testverbindung und dergleichen ausgewählt werden.
Wenn eine Verbindung mit den therapeutischen/prophylaktischen Wirkungen gegen Bronchialasthma gescreent wird, wird beispielsweise der nicht-menschliche Säuger, dem es an Expression der erfindungsgemäßen DNA mangelt, der Immunisierung mit einem Antigen (beispielsweise OVA), gefolgt von der Inhalation desselben Antigens (beispielsweise OVA) hinsichtlich der Atemwegshyperreaktivität unterzogen, die Testverbindung wird dem Tier verab reicht, und die Atemwegsresistenz, Eosinophilinfiltration usw. des Tiers wird im Laufe der Zeit gemessen.
Bei dem obigen Screening-Verfahren kann, wenn eine Testverbindung einem Tier, das getestet werden soll, verabreicht wird, und eine Inhibierung der Erhöhung in der Atemwegsresistenz des Testtiers durch die Antigeninhalation um mindestens etwa 10 %, bevorzugt mindestens etwa 30 % und stärker bevorzugt mindestens etwa 50 % festgestellt wird, die Testverbindung als Verbindung mit therapeutischer und prophylaktischer Wirkung für Bronchialasthma gescreent werden.
Die Verbindung, die unter Verwendung des obigen Screening-Verfahrens erhältlich ist, ist eine Verbindung, die aus den oben beschriebenen Testverbindungen gescreent wurde, und die therapeutische und prophylaktische Wirkung für Krankheiten (beispielsweise Bronchialasthma usw.), verursacht durch eine erhöhte Expression usw. des erfindungsgemäßen Proteins, zeigt. Deshalb kann die Verbindung als ein sicheres und gering toxisches Arzneimittel für die Behandlung/Vorbeugung von diesen Krankheiten eingesetzt werden. Außerdem können die Verbindungen, die aus einer Verbindung abgeleitet sind, die durch das obige Screenen erhältlich ist, ebenso eingesetzt werden.
Die durch das obige Screenen erhaltene Verbindung kann in Form von Salzen mit physiologisch akzeptablen Säuren (beispielsweise anorganischen Säuren oder organischen Säuren) oder Basen (beispielsweise Alkalimetallsalzen), vorzugsweise in Form von physiologisch akzeptablen Säureadditionssalzen verwendet werden. Beispiele von solchen Salzen sind Salze mit anorganischen Säuren (beispielsweise Salzsäure, Phosphorsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure), Salze mit organischen Säuren (beispielsweise Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Apfelsäure, Oxalsäure, Benzoesäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure) und dergleichen.
Ein Pharmazeutikum, umfassend die Verbindung, die durch das obige Screening-Verfahren erhalten wird, oder Salze davon, kann in einer Weise ähnlich dem Verfahren zur Herstellung des Pharmazeutikums, umfassend das oben beschriebene erfindungsgemäße Protein, hergestellt werden. Da die so erhaltene pharmazeutische Zusammensetzung sicher und gering toxisch ist, kann sie einem Menschen oder anderen Säuger (beispielsweise Ratte, Maus, Meer schweinchen, Kaninchen, Schaf, Schwein, Rind, Pferd, Katze, Hund, Affe usw.) verabreicht werden.
Obwohl die Dosis der Verbindung oder ihres Salzes, die verabreicht werden soll, in Abhängigkeit der Zielkrankheit, des Patienten, der sie verabreicht werden soll, dem Applikationsweg usw. variiert, wird in allgemeinen für die orale Verabreichung an einen Erwachsenen (bei 60 kg Körpergewicht) für die Behandlung von beispielsweise Bronchialasthma die Verbindung in einer täglichen Dosis von etwa 0,1 bis etwa 100 mg, bevorzugt etwa 1,0 bis etwa 50 mg, stärker bevorzugt etwa 1,0 bis etwa 20 mg verabreicht. Für die parenterale Verabreichung an einen Erwachsenen (bei 60 kg Körpergewicht) für die Behandlung von beispielsweise Bronchialasthma ist es vorteilhaft, die Zusammensetzung intravenös in Form eines injizierbaren Präparats in einer Einzeldosis von etwa 0,01 bis etwa 30 mg, bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 20 mg, stärker bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 10 mg zu verabreichen, obwohl die Einzeldosis in Abhängigkeit von dem speziellen Patienten, der speziellen Krankheit usw. variiert. Anderen Tieren kann die Zusammensetzung in der obigen Dosierung verabreicht werden, wobei diese auf ein Körpergewicht von 60 kg umgerechnet wird.
(11) Verfahren zum Screenen einer Verbindung, die zur Beschleunigung oder Inhibierung der Aktivitäten eines Promotors zu der erfindungsgemäßen DNA fähig ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder Salzen davon, die zur Beschleunigung oder Inhibierung der Aktivitäten eines Promotors zu der erfindungsgemäßen DNA fähig ist, bereit, umfassend das Verabreichen einer Testverbindung an einen nicht-menschlichen Säuger, dem es an Expression der erfindungsgemäßen DNA mangelt, und Detektieren der Expression des Reportergens.
Bei dem obigen Screening-Verfahren wird der nicht-menschliche Säuger, dem es an Expression der erfindungsgemäßen DNA mangelt, in dem zuvor genannten nicht-menschlichen Säuger, dem es an Expression der erfindungsgemäßen DNA mangelt, als ein Tier eingesetzt, bei dem die erfindungsgemäße DNA durch Einführung eines Reportergens inaktiviert ist, und das Reportergen unter Kontrolle eines Promotors zu der erfindungsgemäßen DNA exprimiert wird.
Dieselben Beispiele der Testverbindung gelten für spezifische Verbindungen, die für das Screenen verwendet werden.
Für das Reportergen gelten dieselben Beispiele, wie bei dem Screening-Verfahren. Bevorzugt werden β-Galactosidase (lacZ), lösliches alkalisches Phosphatasegen, Luciferasegen und dergleichen eingesetzt.
Da ein Reportergen unter Kontrolle eines Promotors zu der erfindungsgemäßen DNA in dem nicht-menschlichen Säuger, dem es an Expression der erfindungsgemäßen DNA mangelt, vorliegt, wobei die erfindungsgemäße DNA mit dem Reportergen substituiert wird, kann die Aktivität des Promotors durch Spurenexpression einer Substanz, die durch das Reportergen codiert ist, detektiert werden.
Wenn ein Teil der DNA-Region, die das erfindungsgemäße Protein codiert, mit beispielsweise β-Galactosidasegen (lacZ), abgeleitet von Escherichia coli, substituiert wird, wird β-Galactosidase in einem Gewebe, wo das erfindungsgemäße Protein ursprünglich exprimiert werden sollte, anstelle des erfindungsgemäßen Proteins exprimiert. Daher kann der Zustand der Expression des erfindungsgemäßen Proteins ohne weiteres in vivo eines Tieres durch Einfärben mit einem Reagens, beispielsweise 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-galactopyranosid (X-gal), das ein Substrat für β-Galactosidase ist, beobachtet werden. Speziell wird eine Maus, der es an dem erfindungsgemäßen Protein mangelt, oder ihr Gewebeschnitt mit Glutaraldehyd usw. fixiert. Nach dem Waschen mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) wird das System mit einer Färbelösung, enthaltend X-gal, bei Raumtemperatur oder etwa 37 °C für ungefähr 30 Minuten bis einer Stunde umgesetzt. Nachdem die β-Galactosidasereaktion durch Waschen des Gewebes mit 1 mM EDTA/PBS-Lösung terminiert wurde, wird die gebildete Farbe beobachtet. Alternativ kann mRNA, die lacZ codiert, in einer konventionellen Weise detektiert werden.
Die Verbindung oder Salze davon, die unter Verwendung des obigen Screening-Verfahrens erhalten wird/werden, sind Verbindungen, die aus den oben beschriebenen Testverbindungen gescreent werden, und zur Beschleunigung oder Inhibierung der Promotoraktivität zu der erfindungsgemäßen DNA fähig ist.
Die durch das obige Screening-Verfahren erhaltene Verbindung kann in Form von Salzen mit physiologisch akzeptablen Säuren (beispielsweise anorganischen Säuren oder organischen Säuren) oder Basen (beispielsweise Alkalimetallsalzen), vorzugsweise in Form von physiologisch akzeptablen Säureadditionssalzen verwendet werden. Beispiele von solchen Salzen sind Salze mit anorganischen Säuren (beispielsweise Salzsäure, Phosphorsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure), Salze mit organischen Säuren (beispielsweise Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Apfelsäure, Oxasäure, Benzoesäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure) und dergleichen.
Die Verbindungen oder Salze davon, die zur Beschleunigung der Promotoraktivität zu der erfindungsgemäßen DNAa fähig sind, können die Expression des erfindungsgemäßen Proteins a beschleunigen, wodurch die Aktivitäten des Proteins beschleunigt werden, und sind daher als sichere und gering toxische Medikamente für die Behandlung/Vorbeugung von Krankheiten, wie Infektionskrankheiten (beispielsweise HIV-Infektion, HBV-Infektion, HCV-Infektion, Tuberkuloseinfektion, opportunistische Infektion usw.), und dergleichen nützlich.
Andererseits können die Verbindungen oder Salze davon, die zur Inhibierung der Promotoraktivität zu der erfindungsgemäßen DNAa oder DNAb fähig sind, die Expression des erfindungsgemäßen Proteins inhibieren, wodurch die Aktivitäten des Proteins inhibiert werden, und sind daher als sichere und gering toxische Medikamente für Krankheiten, wie Lungen/Thorax-Krankheiten, begleitet durch die Entzündung der Lunge/Atemwege, einschließlich Bronchialasthma, chronisch-obstruktive Lungenerkrankung usw. nützlich.
Verbindungen, die aus den Verbindungen abgeleitet werden, die durch das obige Screenen erhalten werden, können ebenso verwendet werden.
Das Pharmazeutikum, umfassend die Verbindungen oder Salze davon, die durch das Screening-Verfahren erhalten wurden, können ebenso wie Pharmazeutika hergestellt werden, die das oben beschriebene erfindungsgemäße Protein umfassen.
Da die so erhaltene pharmazeutische Zusammensetzung sicher und gering toxisch ist, kann sie einem Menschen oder anderem Säuger (beispielsweise Ratte, Maus, Meerschweinchen, Kaninchen, Schaf, Schwein, Rind, Pferd, Katze, Hund, Affe usw.) verabreicht werden.
Die Dosis der Verbindung oder Salze davon variiert in Abhängigkeit der Zielkrankheit, des Patienten, dem sie verabreicht werden soll, dem Applikationsweg usw.; wenn beispielsweise die Verbindung, die zur Inhibierung der Promotoraktivität zu der erfindungsgemäßen DNA fähig ist, für die Behandlung von beispielsweise Bronchialasthma oral verabreicht wird, beträgt die Dosis normalerweise etwa 0,1 bis etwa 100 mg, bevorzugt etwa 1,0 bis etwa 50 mg, stärker bevorzugt etwa 1,0 bis etwa 20 mg pro Tag für einen Erwachsenen (bei 60 kg Körpergewicht). Bei der parenteralen Verabreichung für die Behandlung von beispielsweise Bronchialasthma variiert die Einzeldosis in Abhängigkeit des Patienten, dem sie verabreicht werden soll, der Zielkrankheit usw., aber es ist vorteilhaft, die Verbindung, die zur Inhibierung der Promotoraktivität zu der erfindungsgemäßen DNA fähig ist, beispielsweise intravenös bei einer täglichen Dosis von etwa 0,01 bis etwa 30 mg, bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 20 mg, stärker bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 10 mg für einen Erwachsenen (bei 60 kg Körpergewicht) zu verabreichen. Für andere Tierspezies kann die entsprechende Dosis, wenn sie auf 60 kg Körpergewicht umgerechnet wird, verabreicht werden.
Wenn andererseits die Verbindung, die zur Beschleunigung der Promotoraktivität zu der erfindungsgemäßen DNAa fähig ist, für die Behandlung von beispielsweise Infektionskrankheiten oral verabreicht wird, beträgt die Dosis normalerweise etwa 0,1 bis etwa 100 mg, bevorzugt etwa 1,0 bis etwa 50 mg, stärker bevorzugt etwa 1,0 bis etwa 20 mg pro Tag für einen Erwachsenen (bei 60 kg Körpergewicht). Beider parenteralen Verabreichung für die Behandlung von beispielsweise Infektionskrankheiten variiert die Einzeldosis in Abhängigkeit des Patienten, dem sie verabreicht werden soll, der Zielkrankheit usw. Wenn die Verbindung, die zur Inhibierung der Promotoraktivität zu der erfindungsgemäßen DNA fähig ist, einem Erwachsenen (bei 60 kg Körpergewicht) im allgemeinen in Form einer Injektion verabreicht wird, ist es vorteilhaft, die Verbindung intravenös bei einer täglichen Dosis von etwa 0,01 bis etwa 30 mg, bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 20 mg, stärker bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 10 mg zu verabreichen. Für andere Tierspezies kann die entsprechende Dosis, wenn sie auf 60 kg Körpergewicht umgerechnet wird, verabreicht werden.
Wie oben erwähnt, ist der nicht-menschliche Säuger, dem es an Expression der erfindungsgemäßen DNA mangelt, zum Screenen der Verbindung oder ihrem Salz, die zur Beschleunigung oder Inhibierung der Aktivität eines Promotors zu der erfindungsgemäßen DNA fähig ist, sehr nützlich und kann hervorragend zur Ermittlung von Ursachen für verschiedene Krankheiten, bei denen der Mangel an Expression der erfindungsgemäßen DNA vermutet wird, und zur Entwicklung von Prophylaktika/Therapeutika für diese Krankheiten betragen.
Außerdem kann das sogenannte transgene Tier (Gen-übertragenes Tier) unter Verwendung einer DNA, enthaltend eine Promotorregion des erfindungsgemäßen Proteins, unter Ligierung von Genen, die verschiedene Proteine stromabwärts codierten, und Injizieren derselben in Oozyten eines Tiers hergestellt werden. Es ist dann möglich, das Protein darin spezifisch zu synthetisieren und seine Aktivität in vivo zu untersuchen. Wenn ein geeignetes Reportergen zu der obigen Promotorstelle ligiert wird, und eine Zellinie, die das Gen exprimiert, hergestellt wird, kann das resultierende System zur Erforschung einer Verbindung mit geringem Molekulargewicht mit der Wirkung der spezifischen Beschleunigung oder Inhibierung der in-vivo-Produktivität des erfindungsgemäßen Proteins per se genutzt werden. Eine weitere Analyse der Promotorregion ermöglichen es, daß ein neues cis-Element oder ein Transkriptionsfaktor, der daran gebunden ist, gefunden wird.
In der Beschreibung und den Zeichnungen werden die Codes der Basen und Aminosäuren gemäß der IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature oder durch in der Technik übliche Codes angegeben. Beispiele davon werden nachstehend gezeigt. Für Aminosäuren, die ein optisches Isomer haben können, liegt die L-Form vor, wenn nicht anders angegeben.

DNA:: Desoxyribonucleinsäure
cDNA:: komplementäre Desoxyribonucleinsäure
A:: Adenin
T:: Thymin
G:: Guanin
C:: Cytosin
RNA:: Ribonucleinsäure
mRNA:: Messengerribonucleinsäure
dATP:: Desoxyadenosintriphosphat
dTTP:: Desoxythymidintriphosphat
dGTP:: Desoxyguanosintriphosphat
dCTP:: Desoxycytidintriphosphat
ATP:: Adenosintriphosphat
EDTA:: Ethylendiamintetraessigsäure
SDS:: Natriumdodecylsulfat
Gly:: Glycin
Ala:: Alanin
Val:: Valin
Leu:: Leucin
Ile:: Isoleucin
Ser:: Serin
Thr:: Threonin
Cys:: Cystein
Met:: Methionin
Glu:: Glutaminsäure
Asp:: Aspartinsäure
Lys:: Lysin
Arg:: Arginin
His:: Histidin
Phe:: Phenylalanin
Tyr:: Tyrosin
Trp:: Tryptophan
Pro:: Prolin
Asn:: Asparagin
Gln:: Glutamin
pGlu:: Pyroglutaminsäure

Substituenten, Schutzgruppen und Reagenzien, die in dieser Beschreibung verwendet werden, werden als nachstehende Codes dargestellt.

Me:: Methylgruppe
Et:: Ethylgruppe
Bu:: Butylgruppe
Ph:: Phenylgruppe
TC:: Thiazolidin-4(R)-carboxamidgruppe
Tos:: p-Toluolsulfonyl
CHO:: Formyl
Bzl:: Benzyl
Cl₂Bzl:: 2,6-Dichlorbenzyl
Bom:: Benzyloxymethyl
Z:: Benzyloxycarbonyl
Cl-Z:: 2-Chlorbenzyloxycarbonyl
Br-Z:: 2-Brombenzyloxycarbonyl
Boc:: t-Butoxycarbonyl
DNP:: Dinitrophenol
Trt:: Trityl
Bum:: t-Butoxymethyl
Fmoc:: N-9-Fluorenylmethoxycarbonyl
HOBt:: 1-Hydroxybenztriazol
HOOBt:: 3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin
HONB:: 1-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboxyimid
DCC:: N,N'-Dichlorhexylcarbodiimid

Die Sequenzidentifikationsnummern in der Sequenzauflistung der Beschreibung geben die folgenden Sequenzen an.
[SEQ ID Nr. 1]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz des (reifen) erfindungsgemäßen Proteins, das aus dem menschlichen Magen stammt.
[SEQ ID Nr. 2]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Signalpeptids.
[SEQ ID Nr. 3]
Diese zeigt die Basensequenz der DNA, die das vom menschlichen Magen abgeleitete (reife) erfindungsgemäße Protein mit der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, codiert.
[SEQ ID Nr. 4]
Diese zeigt die Basensequenz der DNA, die das erfindungsgemäße Signalpeptid mit der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID Nr. 2 dargestellt ist, codiert.
[SEQ ID Nr. 5]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz des Präkursorproteins des vom menschlichen Magen abgeleiteten erfindungsgemäßen Proteins
[SEQ ID Nr. 6]
Diese zeigt die Basensequenz von Primer PR1, der in Vergleichsbeispiel 1 verwendet wird.
[SEQ ID Nr. 7]
Diese zeigt die Basensequenz von Primer PR2, der in Vergleichsbeispiel 1 verwendet wird.
[SEQ ID Nr. 8]
Diese zeigt die Basensequenz von Primer PR3, der in den Vergleichsbeispielen 1 und 4 verwendet wird.
[SEQ ID Nr. 9]
Diese zeigt die Basensequenz von Primer PR4, der in Vergleichsbeispiel 1 verwendet wird.
[SEQ ID Nr. 10]
Diese zeigt die Basensequenz von Primer PR5, der in Vergleichsbeispiel 1 verwendet wird.
[SEQ ID Nr. 11]
Diese zeigt die Basensequenz von Primer PR6, der in Vergleichsbeispiel 1 verwendet wird.
[SEQ ID Nr. 12]
Diese zeigt die Basensequenz von Primer PR7, der in Vergleichsbeispiel 1 verwendet wird.
[SEQ ID Nr. 13]
Diese zeigt die Basensequenz von Primer PR8, der in Vergleichsbeispiel 1 verwendet wird.
[SEQ ID Nr. 14]
Diese zeigt die Basensequenz der cDNA, enthaltend das ECF-L-Gen mit vollständiger Länge, das in Vergleichsbeispiel 2 erlangt wird.
[SEQ ID Nr. 15]
Diese zeigt die Basensequenz der ECF-L-Gensonde, die in Vergleichsbeispiel 2 verwendet wird.
[SEQ ID Nr. 16]
Diese zeigt die Basensequenz des Klons hECF-L-2, der in Vergleichsbeispiel 5 erlangt wird.
[SEQ ID Nr. 17]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz des Proteins, welches das ECF-L-Gen mit vollständiger Länge codiert, das in Vergleichsbeispiel 1 erlangt wird.
[SEQ ID Nr. 18]
Diese zeigt die Aminosäuresequenz des ECF-L (reifen) Proteins.
BEISPIELE
Hierin nachstehend wird die vorliegende Erfindung in bezug auf die Beispiele ausführlicher beschrieben, aber soll nicht darauf beschränkt werden. Die Genmanipulationsverfahren unter Verwendung von Escherichia coli wurden gemäß dem Verfahren durchgeführt, das in Molecular Cloning beschrieben wird.
Escherichia coli JM109/pT7-mECFL, welches das Plasmid trägt, das in Beispiel 1 durch Klonen von Maus-ECF-L-DNA-Fragment mit vollständiger Länge zu pT7-Blue-T-Vektor erhalten wurde, wurde bei dem Ministry of International Trade and Industry, Agency of Industrial Science and Technology, National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH) bei 1–3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan (Postleitzahl 305-8566), mit der Zugangsnummer FERM BP – 6881 am 20. September 1999 und bei dem Institute for Fermentation, Osaka (IFO) bei 17–85, Juso honcho 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japan (Postleitzahl 532 – 8686), mit der Zugangsnummer IFO 16315 am 24. August 1999 hinterlegt.
Escherichia coli DH5α/pcDNA-hECFL, welches das Plasmid pcDNA-hECFL trägt, das in Beispiel 6 erhalten wurde, wurde bei dem NIBH mit der Zugangsnummer FERM BP – 6878 am 20. September 1999 und beim IFO mit der Zugangsnummer IFO 16312 am 24. August 1999 hinterlegt.
BEISPIEL 1 (VERGLEICH)
Klonen des ECF-L-Gens, welches erhöhte Expression in einer Modellmaus mit erhöhter Atemwegshyperreaktivität zeigt
Modellmäuse mit erhöhter Atemwegshyperreaktivität wurden durch Sensibilisierung durch intraperitoneale Injektion von 400 μl Kochsalzlösung, enthaltend 200 μl OVA (Ovalbumin) und 2 mg Alumen, in BALB/c-Mäuse (männlich, 6 Wochen alt), und dann Verstärkung durch intraperitoneale Injektion von 20 μg Kochsalzlösung, enthaltend 10 μg OVA und 1 mg Alumen, dem Tier eine Woche danach, gefolgt von Inhalation von 5 % OVA-Lösung, gelöst in PBS auf ½-Konzentration für 25 Minuten unter nicht anästhetischen und spontanen Respirationsbedingungen über 7 aufeinanderfolgende Tage eine Woche danach, erhalten. Die Steroidgruppe wurde durch intraperitoneale Injektion von 1 mg/kg Dexamethason eine Stunde vor der OVA-Inhalation hergestellt. Die Aerozollization wurde unter Verwendung eines Ultraschallverneblers (Soniclizer 305, ATOM Medical) bewirkt. Die Verstärkung der Atemwegshyperreaktivität wurde durch das Konzett-Rossler-Verfahren in bezug auf die Bronchokonstriktion bestimmt, induziert durch Acetylcholin (62,5–2000 μg/kg), das 24 Stunden nach der Endantigeninhalation gegeben wurde. Broncho-alveoläre Lavageflüssigkeit (BALF) wurde nach dem Tod unter Pentobarbitalanästhesie durch Einführen einer Luftröhrenkanüle in das Tier und dreimaliges Waschen mit 0,5 ml PBS hergestellt. Dann wurde ein Abstrichprobe unter Verwendung von Cytospin (700 U/min, 1 min) hergestellt. Nach der Diff-Quick-Einfärbung und mikroskopischer Untersuchung wurde der Anteil von Makrophagen, Eosinophilen, Neutrophilen, Lymphozyten und anderen Zellen berechnet.
Poly-(A)-+RNA, die als Probe verwendet wurde, wurde durch Extrahieren der gesamten RNA aus der/den Lunge/Bronchien von normalen Mäusen, der/den Lunge/Bronchien von Modellmäusen mit erhöhter Atemwegshyperreaktivität und ihre Dexamethasongruppe unter Verwendung von ISOGEN (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), und dann Führen durch die Oligo-dT-Cellulosesäule (hergestellt von Pharmacia) hergestellt. Unter Verwendung von 2 μg aliquoten Teilen von jeder dieser Poly-(A)-+RNAs als Ausgangsmaterial wurden cDNA-Fragmente (Fragmente, worin ein Teil der cDNA durch PCR amplifiziert ist), spezifisch exprimiert in der/den Lunge/Bronchien von Modellmäusen mit erhöhter Atemwegshyperreaktivität, durch Subtraktion unter Verwendung PCR-Select-cDNA-Subtraktionskit (hergestellt von Clontech Laboratories, Inc.) gesammelt. Die Adaptersequenz für die Subtraktion, die zu dem resultierenden PCR-Fragment an beiden Enden davon hinzugefügt wurde, wurde durch Digestion mit dem Restriktionsenzym RsaI entfernt, um es zu einem DNA-Fragment mit glatten Enden zu verändern. Das Fragment wurde dann zu pT7Blue-T-Vektor subgeklont (hergestellt von Novagen, Inc.). Die DNA-Basensequenz des subgeklonten cDNA-Fragments wurde decodiert, und basierend auf der decodierten Basensequenz wurde die Homologiesuche durch Blast-N unter Verwendung der öffentlichen Geneble-Datenbank fortgesetzt.
Das Ergebnis offenbarte, daß 10 von insgesamt 120 untersuchten Klonen übereinstimmen mit der Basensequenz, die ein bekanntes Maus-ECF-L-Gen codiert (GENEBANK ACCESSION NUMBER: D87757). So wurde die cDNA aus Poly-(A)-+RNA in der Lunge von Modellmäusen mit erhöhter Atemwegshyperreaktivität unter Verwendung von cDNA-Synthesekit synthetisiert (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.). Diese cDNA wurde als Matrize verwendet, und PCR wurde unter Verwendung von 2 Primern der 5'-Nicht-Translationsregion (PR1: SEQ ID Nr. 6) und 3'-Nicht-Translationsregion (PR2: SEQ ID Nr. 7) des ECF-L-Gens durchgeführt, um das ECF-L-Gen mit vollständiger Länge zu erhalten (SEQ ID Nr. 14). Unter Verwendung von Takara EX Taq (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) wurde nach der Inkubation bei 98 °C für eine Minute die Reaktion durch Wiederholen von 30 Zyklen in Thermal Cycler Gene Amp PCR System 9700 (hergestellt von Perkin-Elmer, Inc.), bei dem ein Zyklus so eingestellt ist, daß er 98 °C für 10 Sekunden, 60 °C für 1 Minute und dann 72 °C für 3 Minuten umfaßt, und schließlich durch Umsetzen bei 72 °C für 10 Minuten durchgeführt. Das resultierende ECF-L-DNA-Fragment mit vollständiger Länge wurde zu pT7-Blue-T-Vektor geklont. Unter Verwendung von synthetischen Primern (PR1 bis 8: SEQ ID Nr. 6–13) wurde die Zyklussequenzierung durchgeführt, um die Basensequenz des Produktes, das mittels eines Fluoreszenz-DNA-Sequenzers erhalten wurde (ABI PRISM TM377, hergestellt von Perkin-Elmer, Inc.), zu bestätigen
BEISPIEL 2 (VERGLEICH)
Analyse der Gewebeverteilung auf dem ECF-L-Gen in Modellmäusen mit erhöhter Atemwegshyperreaktivität
Jedes Organ (Lunge, Herz, Leber, Niere, Gehirn, Thymus, Milz, Dünndarm, Dickdarm, Magen) wurde aus normalen Mäusen und Modellmäusen mit erhöhter Atemwegshyperreaktivität isoliert, und die Total-RNAs wurden daraus unter Verwendung von ISOGEN präpariert (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Die Total-RNAs wurden durch eine Oligo-dT-Cellulosesäule geführt (hergestellt von Pharmacia, Inc.), wodurch Poly-(A)-+RNAs hergestellt wurden. Nachdem 0,5 μg dieser Poly-(A)-+RNAs auf 1,1 % Agarose gelelektrophorese, enthaltend 2,2 M Formalin, der Elektrophorese unterzogen wurden, wurden die RNAs auf Nylonmembranfiltern (Hybond-N+, hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech, Inc.) durch Trockenblotting für 18 Stunden geblottet. Die RNAs wurden auf Nylonmembranfiltern durch UV-Behandlung fixiert, gefolgt von Hybridisierung bei 65 °C in Express-Hyb-Hybridisierungslösung (hergestellt von Clontech Laboratories, Inc.). Andererseits wurde eines der ECF-L-cDNA-Fragmente, gezeigt als Sonde in Beispiel 1 (SEQ ID Nr. 15), mit [α-³²P]-dCTP und Bca-BEST-Labeling-Kit markiert (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.). Die Hybridisierung wurde bei 65 °C für 2 Stunden in Express-Hyb-Hybridisierungslösung durchgeführt. Die Filter wurden schließlich mit 0,1 × SSC in 0,1 % SDS-Lösung bei 50 °C gespült, gefolgt von der Detektion unter Verwendung von BAS-2000 (hergestellt von Fuji Photo Film Co., Ltd.). Als Ergebnis wurde die Expression des ECF-L-Gens (mRNA) in der Lunge, Thymus und Magen bei normalen Mäusen beobachtet. Bei Mäusen mit erhöhter Atemwegshyperreaktivität wurde die Expression merklich in der Lunge beobachtet, was angibt, daß die Expression stark mit erhöhter Atemwegshyperreaktivität induziert wurde. Eine Erhöhung der Expression wurde ebenso im Thymus und Magen festgestellt (1).
BEISPIEL 3 (VERGLEICH)
Analyse des ECF-L-Gens im Zeitverlauf in Modellmäusen mit erhöhter Atemwegshyperreaktivität
Unter Verwendung der Modellmäuse mit erhöhter Atemwegshyperreaktivität, die in dem obigen Beispiel 1 erläutert wurden, wurden die erhöhte Atemwegshyperreaktivität und die Anzahl an infiltrierten Zellen in alveolären Lavageflüssigkeiten vor der OVA-Inhalation und am Tage 2, 3, 4, 5, 6 und 7 nach der OVA-Inhalation gemessen, wie in Beispiel 1 (2, 3 und 4). Außerdem wurde die Lunge vor der OVA-Inhalation und am Tage 1, 2, 3, 5 und 7 nach der OVA-Inhalation isoliert, und der Northern-Blot-Analyse unterzogen, wie in Beispiel 2 (5). Als Ergebnis wurden die erhöhte Atemwegshyperreaktivität und Infiltration von Eosinophilen in alveolärer Lavageflüssigkeit an oder nach Tag 4 nach der OVA-Inhalation induziert, während die Expression des ECF-L-Gens merklich von Tag 2 an nach der OVA-Inhalation induziert wurde. Das heißt, die Expression des ECF-L-Gens trat vor der erhöhten Atemwegshyperreaktivität und Eosinophilinfiltration auf, aber das ECF-L-Gen wurde nicht als Folge der Atemwegsentzündung exprimiert, was auf die Möglichkeit schließen läßt, daß die Induktion der ECF-L-Genexpression die erhöhte Atemwegshyperreaktivität und Eosinophilinfiltration in die alveolären Lavageflüssigkeiten verursachen würde.
BEISPIEL 4 (VERGLEICH)
Identifikation der ECF-L-Gen-Expressionsstelle in der Modellmaus mit erhöhter Atemwegshyperreaktivität
Nach der Perfusion in der Lunge von normalen Mäusen und Modellmäusen mit erhöhter Atemwegshyperreaktivität und Fixierung mit 4 % Paraformaldehyd wurde die Lunge isoliert und bei 4 °C über Nacht fixiert. Danach wurde eine Saccharose-HBSS-Lösung ersetzt, um schließlich eine 18%ige Saccharose-HBSS-Lösung durch allmähliche Erhöhung der Konzentration von Saccharose zu erreichen, und die Lunge wurde auf Trockeneis eingefroren. Nach dem Stehenlassen in einer Gefrierkammer bei –14 °C für 3 Stunden wurde die gefrorene Lunge in eine Dicke von 10 bis 15 μl geschnitten und auf einen APS-beschichteten Glasobjektträger gegeben. Zur Herstellung einer DIG-markierten Sonde wurde das ECF-L DNA-Fragment von 0,6 kb durch PCR unter Verwendung des ECF-L-Genfragments mit vollständiger Länge, das in Beispiel 1 erhalten wurde, als eine Matrize und unter Verwendung synthetischer Primer amplifiziert (PR3: SEQ ID Nr. 8, PR6: SEQ ID Nr. 11). Unter Verwendung von Takara EX Taq (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) wurde nach der Inkubation bei 94 °C für 1 Minute die Reaktion durch Wiederholen von 30 Zyklen in dem Thermal Cycler Gene Amp PCR System 9700 (hergestellt von Perkin-Elmer, Inc.), in dem ein Zyklus so eingestellt ist, daß er 94 °C für 10 Sekunden, 60 °C für 30 Sekunden und dann 72 °C für 90 Sekunden umfaßt, und schließlich durch Umsetzen bei 72 °C für 10 Minuten durchgeführt. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde in den pCRII-TOPO-Vektor eingeführt (hergestellt von Invitrogen, Inc.), und von beiden Seiten des Vektors durch SF6-RNA-Polymerase und T7-RNA-Polymerase unter Verwendung des DIG-Labeling-Kit (hergestellt von Boehringer Mannheim) gemäß dem beiliegenden Handbuch verlängert, um eine DIG-markierte Antisense- und Sense-Sonde herzustellen. Die In-situ-Hybridisierung wurde unter Verwendung des ISHR-Starter-Kit (hergestellt von Nippon Gene Co., Ltd.) gemäß dem dazu beiliegenden Handbuch durchgeführt. Als Ergebnis wurde herausgefunden, daß das ECF-L-Gen stark in den Modellmäusen mit erhöhter Atemwegshyperreaktivität exprimiert wurde. Bei den normalen Mäusen wurde keine Expression des ECF-L-Gens in irgendeinem Teil der Lunge beobachtet (6).
BEISPIEL 5
Klonen eines Gens, das das vom Menschen abgeleitete ECF-L-artige Protein codiert
Unter Verwendung des Maus-ECF-L-Gens mit vollständiger Länge, gezeigt in Vergleichsbeispiel 1 als Sonde, wurde die Northern-Blot-Analyse auf menschlichen RNA-Masterblot durchgeführt (hergestellt von Clontech Laboratories, Inc.). Die Hybridisierung wurde bei 68 °C für 2 Stunde in Express Hyb Hybridisierungslösung durchgeführt, und das Abspülen wurde schließlich mit 0,1 × SSC in 0,1 % SDS-Lösung bei 50 °C durchgeführt. Zur Detektion wurde BAS-2000 (hergestellt von Fuji Photo Film Co., Ltd.) verwendet. Als Ergebnis wurde ein deutliches Signal in dem Magen nachgewiesen. Es wurde daher entschieden, einen menschlichen Gegenpart des ECF-L-Gens aus der menschlichen Magen-cDNA-Bibliothek zu erwerben.
Nachdem die menschliche Magen 5'-stretch plus cDNA-Bibliothek (unter Verwendung von λgt11-Phagen-DNA als ein Vektor, hergestellt von Clontech Laboratories, Inc.) zu E. coli Y1090r infiziert wurde, wurden etwa 200.000 Plaques jeweils in 7 weiche Agarplatten gesät und über Nacht bei 37 °C kultiviert, um Plaques zu bilden. Nach dem die Plaques zu einem Nylonmembranfilter übertragen wurden (Hybond-N, hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech, Inc.), wurden die Plaques nacheinander mit einer Denaturationslösung (0,5N NaOH, 1,5M NaCl), einer Neutralisationslösung (0,5M Tris Cl pH 8,0, 1,5M NaCl) und 2 × SSC behandelt. Nach dem Lufttrocknen wurden UV-Strahlen ausgestrahlt, um die Phagen-DNA auf dem Nylonmembranfilter zu fixieren. Die Plaquehybridisierung wurde bei 68 °C für mindestens 3 Stunden in Express-Hyb-Hybridisierungslösung, enthaltend eine markierte Sonde, durchgeführt. Nachdem der Filter schließlich mit 0,1 × SSC in 0,1 % SDS-Lösung bei 50 °C gespült wurde, wurde ein Autoradiogramm aufgenommen, um die Plaques, die mit der Sonde hybridisierbar sind, zu begutachten. Lambda-DNA wurde aus 7-Phagenklonen, hECF-L-1, 2, 3, 10, 13, a und b hergestellt, die zu einzelnen Klonen durch Wiederholen dieser Verfahrensweise unter Verwendung von QIAGEN LAMBDA MINIKIT (hergestellt von Qiagen) gemäß dem beiliegenden Handbuch gereinigt wurden. Anschließend wurde eine Reaktion unter Verwendung von BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (hergestellt von Perkin-Elmer, Inc.), und die Basensequenz des eingeführten cDNA-Fragments wurde unter Verwendung des DNA-Sequenzers 377 bestimmt (hergestellt von Perkin-Elmer, Inc.). Die Ergebnisse offenbarten, daß die erhalten 7 Klone dasselbe DNA-Fragment enthielten, und Klon hECF-L-2, welches das längste DNA-Frament enthielt, wies 1678 Basen auf (SEQ ID Nr. 16). Das cDNA-Fragment codierte ein vom Menschen abgeleitetes neues ECF-L-artiges Protein, das aus 476 Aminosäuren besteht (SEQ ID Nr. 5). Das Protein wies 70 % Homologie in ihrem Basenniveau und 68 % Homologie in ihrem Aminosäureniveau zu Maus-ECF-L auf (7 und 8). Weitere Homologiesuche durch Blast N unter Verwendung der Geneble-Datenbank offenbarte, daß die cDNA ein neues Gen war, welches zu einer Chitinase gehört (9 und 10). Dieses Protein wies eine Sequenz auf, die sich an der katalytischen Mitte von Chitinase aufspart, und zeigte 57 % Homologie in dem DNA-Niveau und 51 % Homologie in dem Aminosäureniveau zur menschlichen Chitotrioxidase [J. Biol. Chem., 270, 26252 (1995)], die als die einzige Chitinase beim Menschen berichtet wird.
BEISPIEL 6
Konstruktion des Vektors, um ein Gen, das das vom Menschen abgeleitete neue ECF-L-artige Protein codiert, in Tierzellen zu exprimieren
Nachdem die λgt11-Phagen-DNA, in die das Gen, das das vom Menschen abgeleitete ECF-L-artige Protein, welches in Beispiel 5 gezeigt ist, codiert, eingeführt worden ist, mit EcoRI digeriert wurde, wurde das resultierende DNA-Fragment mit 1,7 kbp, enthaltend das Gen, das das vom Menschen abgeleitete ECF-L-artige Protein codiert, in das pcDNA-3,1-Plasmid eingeführt (hergestellt von Invitrogen, Inc.), ebenso mit EcoRI digeriert, um das Plasmid pcDNA-hECFL zu erhalten, welches das Gen, das das vom Menschen abgeleitete ECF-L-artige Protein codiert, stromabwärts des Cytomegalovirus-Enhancer/Promotor trägt und mit einem Neomycin-resistenten Gen als Selektionsmarker.
BEISPIEL 7
Expression des Gens, das das vom Menschen abgeleitete neue ECF-L-artige Protein in COS-7-Zellen codiert, und Assay für die Chitinaseaktivität
COS-7-Zellen, 9 × 10⁵, wurden für 24 Stunden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fetalem Kalbsserum (FKS), kultiviert und 7,5 μg des Expressionsplasmids (pcDNA – hECFL), gezeigt in Beispiel 6, wurden unter Verwendung von Lipofectamin (GIBCO BRL) transfektiert. 2 Tage nach der Transfektion wurde das Medium mit FKS-freiem DMEM ersetzt, und die Inkubation wurde für 4 Tage fortgesetzt, wodurch der Kulturüberstand erhalten wurde. Die Chitinaseaktivität wurde gemäß dem Bericht von Renkema, G. H. et al. [J. Biol. Chem., 20, 2198 (1995)] analysiert. Das heißt, 100 μl des oben beschriebenen Kulturüberstandes wurden zu 100 μl eines Reaktionspuffers zugegeben (McII-vain-Puffer, pH 5,2), in dem ein fluoreszierendes Substrat (4-Methylumbelliferyl-β-D-N,N'-diacetylchitobiosid (4MU-Chitobioside), 4-Methylumbellieryl-β-D-N,N,N'-triacetylchitotriosid (4-MU-Chitotriosid)) in einer Endkonzentration von 0,027 mM gelöst wurde, gefolgt von der Inkubation bei 37 °C für 30 Minuten. Durch die Zugabe von 1 ml eines Reaktionsterminationspuffers (0,3M Glycin/NaOH Puffer, pH 10,6) wurde die Reaktion beendet, und die Chitinaseaktivität wurde unter Verwendung einer Fluoreszenzmeßvorrichtung gemessen (Anregungswellenlänge von 355 nm, Meßwellenlänge von 460 nm). Für die negative Kontrolle wurde der Kulturüberstand aus den Plasmid-nicht-transfektierten COS-7-Zellen verwendet und 0,001 U Serratia-marcescens-Chitinase wurde für die positive Kontrolle verwendet. Als Ergebnis wurde die Chitanaseaktivität in dem Kulturüberstand aus den Expressionsplasmid-(pcDNA – hECFL)-transfektierten COS-7-Zellen nachgewiesen.
BEISPIEL 8
Analyse der Gewebeverteilung des Gens, das das vom Menschen abgeleitete neue ECF-L-artige Protein codiert
Unter Verwendung des DNA-Fragments (1,7 kbp), eingeführt mit dem Gen, das das vom Menschen abgeleitete neue ECF-L-artige Protein codiert, das in Vergleichsbeispiel 1 als Sonde gezeigt wird, wurde die Northern-Blot-Analyse auf menschlichem RNA-Masterblot durchgeführt (hergestellt von Clontech Laboratories, Inc.). Die Hybridisierung wurde bei 68 °C für 2 Stunde in Express-Hyb-Hybridisierungslösung, enthaltend eine markierte Sonde, durchgeführt, und das Abspülen wurde schließlich 0,1 × SSC in 0,1 % SDS-Lösung bei 50 °C durchgeführt. Zur Detektion wurde BAS-2000 (hergestellt von Fuji Photo Film Co., Ltd.) verwendet. Als Ergebnis wurde ein deutliches Signal in dem Magen nachgewiesen, und die Expression wurde ebenso in der Lunge und Embryolunge beobachtet (11).
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Das erfindungsgemäße Protein und die DNA, die diese codiert, können als Therapeutika/Prophylaktika für Krankheiten, wie Infektionskrankheiten eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Protein ist ebenso als ein Reagens zum Screenen einer Verbindung oder ihrer Salze, die zur Beschleunigung oder Inhibierung der Aktivitäten des erfindungsgemäßen Proteins fähig ist, nützlich. Außerdem kann eine Verbindung oder ihre Salze, die zur Inhibierung der Aktivitäten des erfindungsgemäßen Proteins fähig ist, oder ein Neutralisationsantikörper, der die Aktivitäten des erfindungsgemäßen Proteins inhibiert, als Therapeutika/Prophylaktika für Krankheiten, einschließlich Bronchialasthma, chronisch-obstruktive Lungenerkrankung usw. verwendet werden. Außerdem können die Antikörper gegen das erfindungsgemäße Protein das erfindungsgemäße Protein spezifisch erkennen und können zur Quantifikation des erfindungsgemäßen Proteins in einer Testprobenflüssigkeit verwendet werden.

Claims

Protein, enthaltend die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, oder ein Salz hiervon.
DNA, enthaltend eine DNA, die das Protein nach Anspruch 1 codiert.
DNA nach Anspruch 2 mit der Basensequenz, die durch SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist.
Rekombinanter Vektor, enthaltend die DNA nach Anspruch 2.
Transformante, transformiert mit dem rekombinanten Vektor nach Anspruch 4, wobei ein Mensch ausgeschlossen ist.
Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 1 oder eines Salzes hiervon, umfassend das Kultivieren der Transformante von Anspruch 5 und Produzieren und Akkumulieren des Proteins nach Anspruch 1 und Sammeln des Proteins.
Pharmazeutikum, umfassend das Protein nach Anspruch 1 oder ein Salz hiervon oder die DNA nach Anspruch 2.
Antikörper, der spezifisch das Protein nach Anspruch 1 oder ein Salz hiervon erkennt.
Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder eines Salzes hiervon, die zur Förderung oder Inhibierung der Aktivität des Proteins nach Anspruch 1 oder eines Salzes hiervon fähig ist, umfassend die Verwendung des Proteins nach Anspruch 1 oder eines Salzes hiervon.
Kit zum Screenen einer Verbindung oder eines Salzes hiervon, die zum Fördern oder Inhibieren der Aktivität des Proteins nach Anspruch 1 oder eines Salzes hiervon fähig ist, umfassend das Protein nach Anspruch 1 oder ein Salz hiervon.