KR20040053100A - 키티나아제, 키티나아제 유사 분자 및 염증성 질환과관련된 방법, 조성물 및 키트 - Google Patents

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조우 주
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예일 유니버시티
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주, 조우
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Abstract

본 발명은 키티나아제 유사 분자를 억제하는 것과 관련하여, 염증성 질환(예를 들어, 천식, COPD, 염증성 장질환, 아토피성 피부염, 알레르기, 알레르기성 비염, 경피증 등)을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 본 발명은 추가로 천식, COPD 등을 포함하나 이에 제한되지 않은 염증성 질환을 치료하기 위한 신규한 화합물을 확인하는 방법을 포함한다. 이는 본 발명이 처음으로, IL-13 및 키티나아제 유사 분자의 발현이 염증성 질환을 매개하고/거나 관련있으며, 키티나아제 유사 분자를 억제하므로써 상기 질환을 치료하고, 예방할 수 있음을 입증하였기 때문이다. 이와 같이, 본 발명은 키티나아제 유사 분자를 억제하여 염증성 질환을 치료하고 예방한다는 새로운 발견에 관한 것이다.

Description

키티나아제, 키티나아제 유사 분자 및 염증성 질환과 관련된 방법, 조성물 및 키트 {METHODS, COMPOSITIONS AND KITS RELATING TO CHITINASES AND CHITINASE-LIKE MOLECULES AND INFLAMMATORY DISEASE}
지난 20년 간 천식의 발병이 꾸준히 증가하여, 미국에서만 17백만 건으로 추정된다. 일단 주로 기도(airway) 평활근의 수축성 메카니즘의 기능이상으로 믿어지지만, 최근의 연구는 천식 및 기타 폐 질환에서 면역 시스템 및 염증의 역할을 지시하고 있다.
이제, 천식은 면역 시스템의 부적절한 자극에 기인하는 복합 염증성 질환으로서 특징지울 수 있다. 몇몇 경우에, 염증은 풍매 항원에 의해 유인된다. 다른 경우에, 외인성 유인이 정의될 수 없다(내인성 천식). 천식 염증에 관련된 면역 세포 및 매개체는 IgE, 비반세포, 호산구, T 세포, 인터루킨-4 (IL-4), IL-5, IL-9, IL-13 및 기타 사이토킨을 포함한다 [참고문헌: Bradding et al., 1994, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 10:471-480; Bradding et al., 1997, Airway Wall Remodeling in Asthma, CRC Press, Boca Raton, FL; Nicolaides et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:13175-13180; Wills-Karp, 1998, Science 282:2258-2260; Hamid et al., 1991, J. Clin. Invest. 87:1541-1546; Kotsimbos et al., 1996, Proc. Assoc. Am. Physicians 108:368-373). 이들 면역 세포 및 매제체 중에서, T-헬퍼형 2 (Th2) 세포 및 사이토킨의 역할이 점점 중요해지는데, 이들이 기도 염증의 개시 및 유지를 책임지고 있을 뿐만 아니라, 기도 리모델링의 B 세포 조절, 호산구 기능, 점액 반응, 및 자극에 매우 중요하기 때문이다 [참고문헌: Elias et al., 1999, J. Clin. Invest. 104:1001-1006; Ray et al., 1999, J. Clin. Invest. 104:985-993].
면역 매개 염증은 천식성 기도에서 기도 리모델링 또는 구조적 변형을 초래하는 것으로 생각된다. 리모델링의 최종 결과는 천식의 증상 및 생리학적 조절이상 모두에 기여하는 것으로 생각된다. 리모델링은 종종은 기도 비후, 점액 이형성, 상피조직 비대, 및 기도 섬유증을 특징으로 한다. 과대한 섬유증은 질환 중증도, 기도 과민반응(AHR) 및 불완전 가역 기도 폐색의 발생에 대한 기여를 심화시키는 것으로 널리 여겨진다[Elias et al., 1999, J. Clin. Invest. 104:1001-1006]. 따라서, 천식의 처치를 위한 치료법의 성공적 설계는 호흡기계내의 염증의 메커니즘 및 상처 및 외상 치유의 프로세스 모두를 이해하는 것이 필요하다.
2개의 유명한 사이토킨, IL-4 및 IL-13은 천식의 및 기타 폐 질환의 염증 및 기도 리모델링에 중요한 역할을 하는 것으로 믿어진다. IL-4 및 IL-13은 Th2 헬퍼 T 세포의 동일한 하부세트에 의해 모두 생성되고, 중첩되는 효과기 프로필을 가지며, 수용체 성분 및 신호 통로를 공유한다는 점에서 유사하다. 그러나, 천식의 AHR, 호산구 보충, 점액 과분비, 및 기타 증상에서 IL-4에 대비된 IL-13의 중요한 역할이 결정적으로 증명되었다[Wills-Karp,1998, Science 282:2258-2260, Grunig et al. 1998, Science 282:2261-2263). 생쥐 폐에서의 IL-13의 과발현은 메타콜린검사 후에 호산구, 림프구 및 대식세포 부화 염증, 점액 이형성, 기도 섬유증, 및 AHR을 초래하였다 [참고문헌: Zheng et al., 1999 J. Clin. Invest. 103:779-788]. 추가로,IL-13 프로모터 및 코팅 영역 모두의 다형성은 천식성 표현형과 관련된다 [참고문헌: Heizmann et al., 2000, Hum. Mol. Genet. 9:549-559]. 이들 결과는 이정상적 IL-13 생산이 천식 염증 및 기도 리모델링에 중요한 요인이라는 것을 제시한다.
염증성 폐 질환에서의 IL-13의 역할은 천식에 제한되지 않는다. 만성 패쇄 폐 질환(COPD, 임상적으로 만성기관지염, 폐공기증, 및 반성 패쇄 허파 질환으로 정의됨)은 오랜 동안 천식에서 유래된 분명한 질환으로 인식되었다. 그러나, 2개 질환 사이의 유사성이 주목되었고, "더치 가설(Dutch Hypothesis)"의 성립을 초래하였으며, 이것은 1961년에 최초 제안되었다. 더치 가설의 가장 최근의 수정안은, 몇몇 개인에 있어서, 천식 및 COPD가 분명한 프로세스가 아니라는 것과, 공통 병원성 메카니즘이 이들 질병의 근거가 된다는 것을 제안하였다. 가설은 추가로, 아토피, 천식, AHR 및/또는 증가된 수준의 IgE를 진행시키는 유전적 소인이 흡연자들에게 COPD를 진행하도록 한다는 것을 지시하였다 [참고문헌: Vestbo and Prescott, 1997, Lancet 350:1431-1434]. 추가로, 생쥐 폐에서의 IL-13의 과발현은 폐공기증 및 COPD-유사 점액 이형성을 초래하고, COPD를 앓고 있는 환자들로부터의 생검 및 부검 폐조직에서 IL-13이 과발현되었고, IL-13의 다형성은 COPD의 존재와 상호 관련되는 것으로 설명되었다. 이들 결과가 더치 가설의 관점에서 고찰되는 경우, 천식 및 COPD가 종래 생각 보다 더욱 밀접하게 연관되어 있을 뿐만 아니라, 이들 폐염증성 질환에서의 IL-13 조절이상의 중심 역할은 보다 뚜렷해졌다.
천식, COPD 및 관련 폐 염증성 질환의 기반 메카니즘 및 원인을 조망하기 위한 진전은 놀랍게도, 기관지 근육 수축의 기능부전으로서 생각되던 것이 이제 특이적 사이토킨 및 세포형과 연관될 수 있다는 사실을 고려하고 있다. 이러한 진전에도 불구하고, 천식은 결핵 및 AIDS와 함께 증가하는 치사율을 갖는 유일한 만성 질환이다. 또한, 2020년까지, COPD는 세계에서 사망 원인 중 4위가 될 것으로 기대된다.
천식으로 인한 증가하는 이환률 및 사망률을 고려하여, 천식 치료를 위한 약물의 비축이 보다 증가하고 있다.
천식 약물은 2개의 일반적 부류, 조절제 및 완화제에 속한다. 조절은 증상이 발생하기 전에 천식 발작의 방지하기 위한 것이고, 완화제는 천식 발작 중에 섭취되는 것이다. 조절제로는, 가용한 가장 유망하고 유효한 항-염증성 약물로서 폭 넓게 고려되는 코르티코스테로이드, 종종 아이들에게 사용되는 보다 온화한 항-염증제인 나트륨 크로몰린 및 네도크로밀, 기관지확장제인 지속성 베타-2 작용제가 있다. 완화제로는, 베타-2 작용제의 보충제 또는 대체물로서 종종 사용되는 단속성 베타-2 작용제 및 안티콜리너제닉스가 있다.
코르티코스테로이드 및 기타 치료제가 천식의 염증-매개 증상을 표적으로 하지만, 그들은 종종 광범위한 면역억제 특성 뿐만 아니라 유독한 부작용을 갖는다. 천식의 생리학적 및 생물학적 메카니즘을 규명하면, 특이적 및 유효한 약물의 개발이 즉시 가능할 것이고, 천식의 증상, 이환률 및 사망률이 현재의 증가율 보다는떨어질 것이다. 그러나, 기반 질환 메카니즘의 증가된 이해에 불구하고, 그리고 천식의 증가된 발생 및 그로 인한 이환률 및 사망에 불구하고, 천식, COPD 및 기타 염증성 질환에 대한 유효하고 안전한 치료법은 현재 제한적이다. 또한, COPD의 진행을 변경시킬 약리학적 약물이 없다.
따라서, 천식, COPD 및 기타 염증성 질환에 대한 특이적, 유효한 치료법에 대한 고대하고 급한 필요성이 존재하고 있다. 본 발명ㅇ은 이러한 필요성을 충적하는 것이다.
발명의 요약
질환이 키티나아제-유사 분자의 증가된 수준과 관련된 포유류에서의 염증성 질환을 치료하기 위한 방법이다. 본 방법은 유효량의 키티나아제-유사 분자 억제제를 포유류에 투여하여 포유류에서의 염증성 질환을 치료하는 것을 포함한다.
일면, 포유류는 인간이다.
또 다른 면에서, 키티나아제-유사 분자는 YM-1, YM-2, 산성 포유류 키티나아제(AMCase), 난관 당단백질 1, 연골 당단백질 1, 키토트리오시다제, 뮤신 9, 연골 당단백질-39, 및 연골세포 단백질 39로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 면에서, 키티나아제-유사 단백질 억제제는 화합물, 항체, 리보자임, 핵산, 및 안티센스 핵산 분자로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 면에서, 화합물은 알로사미딘, 글루코알로사미딘 A, 글루코알로사미딘 B, 메틸-N-데메틸알로사미딘, 데메틸알로사미딘, 디데메틸아로사미딘, 스틸로구아니딘, 스틸로구아니딘 유도체, 디펩티드 시클로-(L-Arg-D-Pro), 디펩티드 시클로-(L-Arg-L-Pro), 디펩티드 시클로-(D-Arg-D-Pro), 디펩티드 시클로-(D-Arg-L-Pro), 리보플라빈, 플라빈 유도체, 구리, 아연 및 수은으로 구성된 군으로부터 선택된다
추가의 일면에서, 항체는 특이적으로 키티나아제-유사 분자에 결합하며, 이것은 YM-1, YM-2, 산성 포유류 키티나아제(AMCase), 난관 당단백질 1, 연골 당단백질 1, 키토트리오시다제, 뮤신 9, 연골 당단백질-39, 및 연골세포 단백질 39로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 일면에서, 안티센스 핵산 분자는 키티나아제-유사 분자 또는 그 단편을 인코딩하는 단리된 핵산에 상보적인 단리된 핵산이다.
또 다른 일면에서, 리보자임은 단리된 효소 핵산으로서, 이것은 키티나아제-유사 분자를 인코딩하는 핵산으로부터 전사된 mRNA를 특이적으로 절단시킨다.
추가의 일면에서, 염증성 질환은 천식, 만성 패쇄 폐질환, 사이질 허파질환, 만성 패쇄 허파 질환, 만성 기관지염, 호산구성 기관지염, 호산구성 폐렴, 폐렴, 염증성 장질환, 아토피성 피부염, 아토피, 알러지, 알러지성 비염, 특발성 폐 섬유증, 피부경화증 및 폐공기증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 키티나아제 유사 분자의 증가된 수준과 관련된 포유 동물의 염증성 질환을 예방하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 유효량의 키티나아제 유사 분자 억제제를 포유 동물에 투여하여 포유 동물의 염증성 질환을 예방하는 것을 포함한다.
일면에서, 포유 동물은 사람이다.
또 다른 일면에서, 키티나아제 유사 분자는 YM-1, YM-2, 산성 포유동물 키티나아제(AMCase), 오비덕탈(oviductal) 글리코단백질 1, 연골 글리코단백질 1, 키토트리오시다아제, 뮤신 9, 연골 글리코단백질-39, 및 연골세포 단백질 39로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 일면에서, 키티나아제 유사 분자 억제제는 화합물, 항체, 리보자임, 핵산 및 안티센스 핵산 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 일면에서, 염증성 질환은, 천식, 만성 폐쇄성 기도질환, 간질성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 기관지염, 호산성 기관지염, 호산성 폐렴, 폐렴, 염증성 장질환, 아토피성 피부염, 아토피, 알러지, 알러지성 비염, 특발성 폐섬유증, 경피증 및 폐기종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 일면에서, 키티나아제 유사 분자는 YM 단백질이며, 추가로 키티나아제 유사 분자 억제제는 알로사미딘, 글루코알로사미딘 A, 글루코알로사미딘 B, 메틸-N-데메틸알로사미딘, 데메틸알로사미딘, 디데메틸알로사미딘, 스틸로구아니딘, 스틸로구아니딘 유도체, 디펩티드 시클로-(L-Arg-D-Pro), 디펩티드 시클로-(L-Arg-L-Pro), 디펩티드 시클로-(D-Arg-D-Pro), 디펩티드 시클로-(D-Arg-L-Pro), 리보플라빈, 플라빈 유도체, 구리, 아연 및 수은으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 일면에서, 키티나아제 유사 분자는 AMCase이다.
본 발명은 키티나아제의 증가된 수준과 관련된 포유 동물의 염증성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 유효량의 키티나아제 억제제를 포유동물에게 투여하여 포유 동물의 염증성 질환을 치료하는 것을 포함한다.
일면에서, 포유 동물은 사람이다.
또 다른 일면에서, 키티나아제는 산성 포유동물 키티나아제(AMCase)이고, 키티나아제 억제제는 화합물, 항체, 리보자임, 핵산 및 안티센스 핵산 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 일면에서, 화합물은 알로사미딘, 글루코알로사미딘 A, 글루코알로사미딘 B, 메틸-N-데메틸알로사미딘, 데메틸알로사미딘, 디데메틸알로사미딘, 스틸로구아니딘, 스틸로구아니딘 유도체, 디펩티드 시클로-(L-Arg-D-Pro), 디펩티드 시클로-(L-Arg-L-Pro), 디펩티드 시클로-(D-Arg-D-Pro), 디펩티드 시클로-(D-Arg-L-Pro), 리보플라빈, 플라빈 유도체, 구리, 아연 및 수은으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일면에서, 항체는 AMCase와 특이적으로 결합한다.
또 다른 일면에서, 안티센스 핵산 분자는 AMCase를 코드화하는 분리된 핵산에 보체인 분리된 핵산, 또는 이의 단편이다.
또 다른 일면에서, 염증성 질환은 천식, 만성 폐쇄성 기도질환, 간질성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 기관지염, 호산성 기관지염, 호산성 폐렴, 폐렴, 염증성 장질환, 아토피성 피부염, 아토피, 알러지, 알러지성 비염, 특발성 폐섬유증, 경피증 및 폐기종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 인터류킨-13의 증가된 수준과 관련된 포유 동물의 염증성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 유효량의 키티나아제 유사 분자 억제제를 포유 동물에게 투여하여 포유 동물의 염증성 질환을 치료하는 것을 포함한다.
일면에서, 포유 동물은 사람이다.
또 다른 일면에서, 키티나아제 유사 분자 억제제는 화합물, 항체, 리보자임, 핵산 및 안티센스 핵산 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 Th2 염증성 반응과 관련된 포유 동물의 염증성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 유효량의 키티나아제 유사 분자 억제제를 포유 동물에게 투여하여 포유 동물의 염증성 질환을 치료하는 것을 포함한다.
본 발명은 포유 동물의 염증성 질환을 치료하는데 유용한 화합물을 확인하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 염증성 질환이 걸린 포유 동물에 화합물을 투여하고, 포유동물 중의 키티나아제 유사 분자 수준과, 화합물을 투여하기 전의 포유 동물의 키티나아제 유사 분자의 수준을 비교하는 것을 포함하는 방법으로서, 화합물 투여 후의 포유동물중의 키티나아제 유사 분자의 수준이, 화합물 투여 전의 키티나아제 유사 분자의 수준과 비교하여 낮은 경우, 이는 화합물이 포유 동물의 염증성 질환을 치료하는데 유용하다는 것을 시사하며, 이에 따라 염증성 질환의 치료에 유용한 화합물을 확인하는 방법이다. 일면에서, 본 발명은 이러한 방법을 사용하여 확인된 화합물을 포함한다.
일면에서, 키티나아제 유사 분자의 수준은 키티나아제 유사 분자 핵산 발현의 수준 및 키티나아제 유사 분자 효소 활성의 수준으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 일면에서, 키티나아제 유사 분자는 YM-1, YM-2, 산성 포유동물 키티나아제(AMCase), 오비덕탈 글리코단백질 1, 연골 글리코단백질 1, 키토트리오시다아제, 뮤신 9, 연골 글리코단백질-39, 및 연골세포 단백질 39로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 일면에서, 포유 동물은 마우스이다.
추가의 일면에서, 마우스는 인터류킨 13을 구조적으로 발현시키는 트랜스제닉 마우스 및 인터류킨 13을 유도가능하게 발현시키는 트랜스제닉 마우스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 일면에서, 키티나아제 유사 분자는 AMCase이다. 또 다른 일면에서, 본 발명은 이러한 방법을 사용하여 확인된 화합물을 포함한다.
본 발명은 염증성 질환을 치료하는데 유용한 화합물을 확인하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 화합물을 세포에 접촉시키고, 세포중의 키티나아제 유사 분자의 수준을, 화합물과 접촉되지 않은 다른 방식으로 확인된 세포 중의 키티나아제 유사 분자의 수준을 비교하는 것을 포함하는 방법으로서, 화합물과 접촉한 세포 중의 키티나아제 유사 분자의 수준이, 화합물과 접촉되지 않은 세포 중의 키티나아제 유사 분자의 수준과 비교하여 낮은 경우, 이는 화합물이 염증성 질환을 치료하는데 유용하다는 것을 시사하며, 이에 따라 염증성 질환의 치료에 유용한 화합물을 확인하는 방법이다.
본 발명은 키티나아제 유사 분자의 증가된 수준과 관련된 포유 동물의 염증성 질환을 치료하기 위한 키트(kit)를 포함한다. 이러한 키트는 유효량의 키티나아제 유사 분자 억제제를 포함하고, 어플리케이터(applicator) 및 이를 사용하기위한 안내서를 추가로 포함한다.
일 측면에서, 키티나아제 유사 분자 억제제는 화학적 화합물, 항체, 리보자임, 안티센스 분자 및 핵산으로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 측면에서, 화학적 화합물을 알로사미딘, 글루코알로사미딘 A, 글루코알로사미딘 B, 메틸-N-데메틸알로사미딘, 데메틸알로사미딘, 디데메틸알로사미딘, 스틸로구아니딘, 스틸로구아니딘 유도체, 디펩티드 시클로-(L-Arg-D-Pro), 디펩티드 시클로-(L-Arg-L-Pro), 디펩티드 시클로-(D-Arg-D-Pro), 디펩티드 시클로-(D-Arg-L-Pro), 리보플라빈, 플라빈 유도체, 구리, 아연, 및 수은으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 키티나아제 유사 분자는 AMCase이다.
본 발명은 질병이 키티나아제 유사 분자의 증가된 수준과 관련된 포유동물의염증성 질병을 예방하기 위한 키트를 포함한다. 키트는 유효량의 키티나아제 유사 분자 억제제를 포함하고 추가로 이의 사용을 위한 어플리케이터 및 지시 자료를 초함한다.
도면의 간단한 설명
본 발명을 설명할 목적으로, 본 발명의 특정 구체예를 도면에 도시한다. 그러나, 본 발명은 도면에 도시된 구체예의 정확한 배열 및 수단에 한정되지 않는다.
도 1은 RT-PCR에 의해 측정된, COPD로 죽은 흡연자(S/C) 및 COPD 없는 비흡연자(N)의 검시 폐 조직으로부터의 IL-13 mRNA의 수준을 도시한다. 화살표는 IL-13 전사체를 가리킨다.
도 2는 도 2A 내지 도 2F를 포함하여, 대조군인 정상 마우스 및 CC10-IL13(IL-13을 지속적으로 발현) 마우스로부터의 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색된 폐 조직을 도시하는 이미지이다. 도 2A(이식유전자 (-), 100X) 및 도 2B(이식유전자 (+), 100X)는 각각 대조군 및 CC10-Il-13 마우스로부터의 조직학적 조직을 도시한다. 도 2B는 IL-13 과발현 마우스의 유조직(parenchyma)의 호산구, 림프구, 마크로파지 풍부 염증을 예증한다. 도 2C(이식유전자 (-), 250X) 및 도 2D(이식 유전자 (+), 250X)는 각각 대조군 정상 마우스 및 CC10-IL-13 유전자도입 마우스의 기도 상피 세포를 도시한다. 도 2D는 IL-13을 과발현하는 마우스의 기도 중의 상피 비대증을 도시한다.
도 3은 도 3A 내지 도 3B를 포함하여, 대조군 및 CC10-IL-13 마우스의 기도의 디아스타아제와의 과요오드산-쉬프(Schiff)(D-PAS) 염색을 도시하는 이미지이다. 도 3A는 이식유전자 (-) 마우스를 도시하고 도 3B는 이식유전자 (+) 마우스의 점막 이형성 및 술잔세포 과형성을 도시한다. 배율은 100X이다.
도 4는 도 4A 및 도 4B를 포함하여 CC10-IL-13 마유스의 기도의 3색 염색을 도시한다. 도 4A는 이식유전자 (-) 마우스의 콜라겐 침착을 도시한다. 도 4B는 이식유전자 (+) 마우스의 증강된 콜라겐 침착을 도시한다.
도 5는 유도성 CC10-rtTA-IL-13 유전자도입 마우스를 제조하는 데 사용되는 독시시클린(dox) 유도성 구조물의 개략도이다.
도 6은 도 6A 내지 도 6E를 포함하여 CC10-rtTA-IL-13 유도성 마우스로부터의 폐의 조직학적 및 형태계량학적 분석을 도시한다. 폐는 제거되고, 고정되어 가압되고, 현미경으로 진행되어 dox 투여 후의 이식유전자 유도 시 폐포 확대를 보인다. 도 6A는 dox 투여 후의 이식유전자 (+) 마우스를 도시한다. 도 6B는 dox 투여 후 1일째의 유도성 이식유전자 (+) 마우스를 도시한다. 도 6C는 dox 투여 후 1주째의 유도성 이식유전자 (+) 폐포를 도시한다. 도 6D는 dox 투여 후 1달째의 유도성 이식유전자 (+) 마우스의 상당한 폐포 확장을 보인다. 도 6E는 유도성 이식유전자 (+) 마우스의 형태계량적 분석을 도시하는 그래프이다. 4주령 이식유전자 (-) 및 (+) 마우스는 무작위로 정상 또는 dox 물로 처리하여 1달 동안 이러한 처리를 유지하였다. 폐를 제거하고 고정하여 가압하여 콜드 길이 측정(chord length measurement)을 수행하였다. 콜드 길이는 dox가 주어진 이식유전자 (-) 마우스 또는 정상 물이 주어진 이식유전자 (+) 마우스에서 보다 dox가 주어진 이식유전자 (+) 마우스에서 상당히 더 컸다.
도 7은 지속적으로 IL-13을 발현하는 유전자도입 마우스에서의 결정 침착을 도시한다. 결정은 다면이고 통상 바늘형이다.
도 8은 CC10-IL-13의 기관지폐포세척(BAL) 액으로부터의 부분적으로 정제된 결정을 포함하는 코마시블루 염색된 SDS-PAGE 겔을 도시한다. 단일 단백질 밴드가 약 45kDa의 분자량을 가졌다.
도 9는 역전사효소 폴리머라아제 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 측정된, 2월령의 이식유전자 (+) 및 (-) CC10-IL-13 마우스의 폐에서의 YM mRNA 수준을 도시한다.
도 10a 및 도 10b를 포함하는 도 10은 1개월령에서 시작하여 표준수 또는 독스 함유수(dox water)로 무작위 처리한 이식유전자 (-) 및 (+) CC10-rtTA-IL-13 마우스의 YM mRNA 수준을 도시한다. 도 10a에서, 1개월의 무작위 처리후 폐를 떼어내고, 총 폐 RNA를 분리하고, YM 유전자 발현을 RT-PCR을 사용하여 결정하였다. 도 10b는 표시된 시간 간격 동안 독스 함유수 또는 표준수 투여후의 YM mRNA를 도시한다(w=주, m=월) . mRNA 수준은 대조로서 액틴을 사용하여 정규화하였다.
도 11a 내지 도 11h를 포함하는 도 11는 폐조직중의 YM 발현을 검출하기 위한 CC10-IL-13 마우스 및 대조 마우스 폐조직의 인 시튜 하이브리드화를 도시한다. 도 11a 및 도 11b는 각각 안티센스 및 센스 프로브로 프로빙된 이식유전자 (+) 마우스의 폐조직을 도시한다. 도 11c 및 도 11d는 각각 안티센스 및 센스 프로브로 프로빙된 이식유전자 (-) 마우스의 폐조직을 도시한다. 도 11e 및 도 11f는 각각 안티센스 및 센스 프로브로 프로빙된 4주령 이식유전자 (+) 마우스의 폐조직을 도시한다. 도 11g 및 도 11h는 각각 안티센스 및 센스 프로브로 프로빙된 10주령 이식유전자 (+) 마우스의 폐조직을 도시한다.
도 12는 2개월령 이식유전자 (-) 및 이식유전자 (+) CC10-IL-13 동물로부터 얻은 BAL 액중의 키티나아제 활성을 도시하는 그래프이다(이식유전자 (-)에 대해 p < 0.05).
도 13a 및 도 13b를 포함하는 도 13은 CC10-rtTA-IL-13 마우스에서 각각 산성 포유동물 키티나아제 (AMCase) 발현 및 키티나아제 활성을 도시한다. 도 13a는 1개월령에서 독스 함유수 또는 표준수에 넣고 표시된 간격 동안 이러한 관리하에 유지시킨 이식유전자 (-) 및 (+) 마우스의 폐에서 AMCase를 코드화하는 mRNA 수준을 도시한다. AMCase 및 p-액틴 발현을 RT-PCR에 의해 평가하였다. 도 13b는 1개월령에서 표준수 또는 독스 함유수로 무작위 처리한 유도성 이식유전자 (+) 및 (-) 동물에서 키티나아제 활성을 도시하는 그래프이다. BAL 액 키티나아제 활성을 독스 함유수 또는 표준수 투여후 표시된 간격에서 평가하였다.
도 14a 내지 도 14d를 포함하는 도 14는 인 시튜 하이브리드화를 이용한, CC10-IL-13 마우스에서 AMCase 발현의 위치 측정을 도시한다. 도 14a 및 도 14b는 각각 안티센스 및 센스 프로브로 프로빙된 이식유전자 (+) 마우스의 폐조직을 도시한다. 도 14c 및 도 14d는 각각 안티센스 및 센스 프로브로 프로빙된 이식유전자 (-) 마우스의 폐조직을 도시한다.
도 15a 내지 도 15c를 포함하는 도 15는 각각 RT-PCR 및 키티나아제 활성 검정을 사용하여 측정한, 오발부민(OVA) 감작 및 시험감염 야생형 마우스에서의 YM 및 AMCase mRNA 발현 및 키티나아제 활성을 도시한다. 도 15a는 OVA 에어로졸 시험감염후 표시된 간격에서 YM mRNA 발현을 도시한다(d=일, h=시간). 도 15b는 OVA 에어로졸 시험감염후 표시된 간격에서 AMCase mRNA 발현을 도시한다. 도 15c는 OVA 에어로졸 시험감염 24시간 후 야생형으로부터 얻은 기관지폐포 세척(BAL)액에서 검출된 유의하게(*p<0.01) 높은 키티나아제 활성을 도시한다.
도 16a 내지 도 16g를 포함하는 도 16은 OVA 감작 및 후속 시험감염 야생형 동물에 대한 알로사미딘(allos)의 효과를 도시한다. 도 16a는 총 BAL 세포 회수에 대한 알로사미딘 일일 투여(lmg/kg)의 효과를 도시하는 그래프이다. 별표는 알로사미딘 투여후 총 BAL 세포 회수의 유의한 (p < 0.01) 감소를 나타낸다. 도 16b는 BAL액에서 호산구의 회수율에 대한 알로사미딘 일일 투여 (lmg/kg)의 효과를 도시하는 그래프이다. 별표는 알로사미딘 투여후 호산구 회수율의 유의한 (p<0.01) 감소를 나타낸다. 도 16c는 BAL액에서 회수된 호산구의 총수에 대한 알로사미딘 일일 투여 (lmg/kg)의 효과를 도시하는 그래프이다. 별표는 알로사미딘 투여후 총 호산구 회수의 유의한 (p<0.01) 감소를 나타낸다. 도 16d는 BAL액에서 회수된 림프구의 수에 대한 알로사미딘 일일 투여 (lmg/kg)의 효과를 도시하는 그래프이다. 별표는 알로사미딘 투여후 총 림프구 회수의 유의한 (p<0.01) 감소를 나타낸다. 도 16e는 총 BAL 세포 회수율에 대한 알로사미딘의 용량 의존적 효과를 도시하는 그래프이다. 알로사미딘 일일 용량을 1일째에 시작하여 투여하였고, OVA 에어로졸 시험감염후 2일 및 7일째에 총 BAL 회수에 대하여 동물을 평가하였다. 별표는 알로사미딘 투여후 총 BAL 세포 회수의 유의한 (p<0.01) 감소를 나타낸다. 도 16f는 BAL에서 호산구 회수율에 대한 알로사미딘의 용량 의존적 효과를 도시하는 그래프이다. 별표는 알로사미딘 투여후 총 BAL 세포 회수중 호산구 비율의 유의한 (p<0.01) 감소를 나타낸다. 도 16g는 BAL에서 총 호산구 회수율에 대한 알로사미딘의 용량 의존적 효과를 도시하는 그래프이다. 별표는 알로사미딘 투여후 총 호산구 BAL 세포 회수의 유의한 (p<0.01) 감소를 나타낸다.
도 17a 내지 도 17d를 포함하는 도 17은 5주령 CC10-IL-13 이식유전자 (+) 및 (-) 마우스에 대한 알로사미딘 투여(lmg/kg의 알로사미딘 또는 비히클 대조를 무작위 투여, 일일 용량을 14일간 복강내(i.p.) 투여)의 효과를 도시한다. 도 17a는 총 BAL 세포 회수에 대한 알로사미딘 투여의 효과를 도시하는 그래프이다. 도 17b는 BAL 호산구 회수에 대한 알로사미딘 투여의 효과를 도시하는 그래프이다.별표는 호산구 회수의 유의한 (p<0.01) 감소를 나타낸다. 도 17c는 BAL 림프구 회수에 대한 알로사미딘 투여의 효과를 도시하는 그래프이다. 별표는 림프구 회수의 유의한 (p<0.01) 감소를 나타낸다. 도 17d는 폐 크기에 대한 알로사미딘 투여의 효과를 도시하는 그래프이다. 폐를 꺼내어, 고정 압축하고, 본원에 기재된 체적 치환 방법을 사용하여 평가하였다.
도 18a 및 도 18b를 포함하는 도 18은 오발부민 유도 BAL 세포수에 대한 항-AMCase 항체의 효과를 도시한다. 도 18a는 총 오발부민 유도 BAL 세포수에 대한 항-AMCase 항체의 효과를 도시하는 그래프이다. 비시험감염(unchall) 마우스 및 오발부민에 대해 감작시키고 3일 연속 오발부민으로 시험감염시킨 마우스간의 비교를 7일째에 수행하였다. 최초 에어로졸 노출 전날에서 시작하여 하루걸러 0.5 ml의 항-AMCase 항체 또는 대조 혈청(serum)으로 마우스를 복강내 처리하였다. 도 18b는 감작 및 시험감염 마우스로부터 얻은 BAL 액의 호산구의 비율에 대한 항-AMCase 항체의 효과를 도시하는 그래프이다. 비시험감염(unchall) 마우스 및 오발부민에 대해 감작시키고 3일 연속 오발부민으로 시험감염시킨 마우스간의 비교를 7일째에 수행하였다. 최초 에어로졸 노출 전날에서 시작하여 하루걸러 0.5 ml의 항-AMCase 항체 또는 대조 혈청(serum)으로 마우스를 복강내 처리하였다.
도 19는 도 19a 내지 도 19f를 포함한다. 도 19a 내지 도 19d는 AMCase 안티센스 프로브를 사용하는, 천식 환자의 부검 폐 샘플의 인 시튜 하이브리드화를 사용하여 검출가능한 AMCase mRNA를 도시하는 이미지이다(도 19a). 폐질환이 없는 환자의 부검시 얻은 조직학적으로 정상인 대조 폐조직에서 AMCase mRNA는 안티센스프로브를 사용하여 검출되지 않았다(도 19b). 센스 프로브를 사용하는 인 시튜 하이브리드화에서는 치명적인 천식 조직(도 19c)이나 대조 조직(도 19d)에서 AMCase가 검출되지 않았다. 치명적 천식에서 상피세포(굵은 화살표) 및 마크로파지(가는 화살표) 염색이 검출되었다(도 19a). 도 19e 및 도 19f는 AMCase 안티센스 프로브를 사용하는, 천식 환자의 부검 폐 샘플에 존재하는 폐포 마크로파지에서의 인 시튜 하이브리드화를 사용하여 검출가능한 AMCase mRNA를 도시하는 이미지이다(도 19e). AMCase mRNA는 센스 프로브를 사용하여 검출되지 않았다(도 19f). 추가로, 폐질환이 없는 환자에서 얻은 대조 폐조직에서는 AMCase mRNA가 안티센스 또는 센스 프로브를 사용하여 검출되지 않았다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 키티나아제 유사 분자의 발현과 관련이 있거나 이에 의해 매개되는 포유동물의 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 포유동물에 키티나아제 유사 분자 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 본원에 기새된 데이터가 입증하는 바와 같이, 키티나아제 유사 분자 수준의 증가는 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 기질성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 기관지염, 호산성 기관지염, 호산성 폐렴, 폐렴, 염증성 장질환, 아토피성 피부염, 아토피, 알레르기, 알레르기성 비염, 특발성 폐섬유증, 경피증, 기종 등을 포함하나 이에 한정되지 않은 염증성 질환과 관련이 있고/거나 이를 매개한다.
본원에 개시된 데이터는 키티나아제 유사 분자의 증가된 발현, 존재 및/또는 활성이 조직 염증, 폐체적 증가, 기관지폐포 세척(BAL)액중의 호산구 증가, BAL액및 조직중의 림프구 증가, BAL액중의 총세포수 증가, 폐포 크기 증가, 기도 저항성 증가, 점액 화생 증가, 뮤신 발현 증가, 실질 섬유증 증가, 기도 리모델링 증가, 상피하 섬유증 증가, 기도 조직의 콜라겐 침착 증가, 폐조직의 상피 과형성, 매슨(Masson)체 유사 섬유성 병소내로 결정성 물질의 병소 구성 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 염증성 질환 관련 병인과 관련이 있고/거나 이를 매개하는 것을 보여준다.
본원에 개시된 데이터는 놀랍게도, 일부 키티나아제 유사 분자, 예를 들어 YM이 검출가능한 전통적인 키티나아제 활성이 없을지라도, 알로사미딘과 같은, 그러나 이에 한정되지 않은 키티나아제 유사 분자 억제제를 투여하는 것이 치료적으로 유익하고 질환을 치료한다는 것을 보여준다. 추가로, 본원에 개시된 데이터는 키티나아제 유사 분자의 억제제, 예를 들어 AMCase에 대한 항체의 투여가 치료 효과를 나타내어 질환을 치료한다는 것을 최초로 입증하고 있다. 실제로, 데이터는 질환의 발병 전에 키티나아제 유사 분자 억제제의 투여가 질환을 예방하는 작용을 한다는 것을 입증한다. 따라서, 본 발명은 키티나아제 유사 분자가 검출가능한 키티나아제 활성을 가지든 가지지 않던간에 염증성 질환에 걸린 포유동물에 키티나아제 유사 분자 억제제를 투여함으로써 키티나아제 유사 분자에 의해 매개되거나 이와 관련이 있는 염증성 질환을 치료 및/또는 예방하는 새로운 방법을 제공한다.
정의:
본원에서 사용된 하기 용어들 각각은 본 섹션에서 관련된 의미를 갖는다.
관사 "하나의"는 관사의 문법적 대상을 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나) 지칭하기 위해 사용된다. 예를 들어, "하나의 성분"은 한 성분 또는 하나 이상의 성분을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "애플리케이터"는 본 발명의 키티나아제 유사 분자 억제제 화합물, 항체, 핵산, 단백질, 및/또는 조성물을 포유동물에 투여하기 위한 피하 주사기, 피펫, 정맥내 주입기, 국소 크림 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 장치를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "키티나아제"는 미생물 및 포유동물 키티나아제를 포함하는 폴리펩티드 패밀리를 지칭한다. 본 발명의 키티나아제는 엔도키티나아제 방식으로 특이적으로 키틴을 분해한다는 점에서 검출가능한 키티나아제 활성을 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "키티나아제 유사 분자"는 공지된 키티나아제에 특정한 정도의 상동성에 의해 정의되지만, 검출가능한 키티나아제 활성을 나타내지 않을 수 있는 단백질을 포함하는 폴리펩티드 패밀리를 포함한다. 키티나아제 유사 분자는 산성 포유동물 키티나아제(호산구 화학주성 시토카인으로도 지칭됨, 예: 진뱅크 수탁 번호 AF290003 및 AF29004), YM1 (키티나아제 3 유사 3, ECF-L 전구체로도 공지되어 있음, 예: 진뱅크 수탁 번호 M94584), YM2(예: 진뱅크 수탁 번호 AF461142), 자궁관 당단백질 1(예: 진뱅크 수탁번호 XM_131100), 연골 당단백질 1(BRP-39, 키티나아제 3 유사 1, GP-39, YKL-40으로도 지칭됨, 예: 진뱅크 수탁 번호 X93035), 키토트리오시다아제(chitotriosidase)(예: 진뱅크 수탁 번호 NM_003465), 자궁관 당단백질 1(뮤신 9로도 지칭됨, 예: 진뱅크 수탁 번호NM_002557), 연골 당단백질-39 (키티나아제 3 유사 1, GP-39, YKL40으로도 공지되어 있음, 예: 진뱅크 수탁 번호 NM_001276), 및 연골세포 단백질 39(키티나아제 3 유사 2, YKL-39로도 공지되어 있음, 예: 진뱅크 수탁 번호 NM_004000)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 따라서, 당업자는, 본원의 교시내용이 제공되면, 본 발명이 검출가능한 키티나아제 활성을 갖는 키티나아제 유사 분자 뿐만 아니라, 가능한 키티나아제 유사 분자가 단백질 패밀리와 실질적인 서열 상동성을 공유한다는 점에서 상기 분자와 유사한 분자를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 이들 특정한 키티나아제 유사 분자에 한정되지 않으며, 본 발명은 이들과 실질적인 상동성을 공유하고/거나 검출가능한 키티나아제 활성을 갖는 다른 키티나아제 유사 분자를 포함하며, 당업계에 공지된 분자 뿐만 아니라 장래에 발견되는 분자들을 포함한다.
"코드화"는 누클레오티드(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 정의된 서열 또는 아미노산의 정의된 서열을 갖고 이로부터 얻어지는 생물학적 특성을 갖는, 생물학적 과정에서의 기타 중합체 및 고분자의 합성을 위한 주형으로서 기능하는 유전자, cDNA, 또는 mRNA와 같은 폴리누클레오티드의 특정 누클레오티드 서열의 고유한 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자는 그 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물계에서 단백질을 생성하는 경우, 그 단백질을 코드화한다. 누클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 통상 서열 목록으로 제공되는 누클레오티드 서열인 코딩 가닥과, 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비코딩 가닥 둘 모두는 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 코드화하는 것으로 언급될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "단편"은 핵산에 대해 적용될 때, 통상적으로 길이가 약 20개 이상의 누클레오티드, 전형적으로 약 50개 이상의 누클레오티드, 보다 전형적으로 약 50 내지 약 200개의 누클레오티드, 바람직하게는 적어도 약 200 내지 약 300개의 누클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 약 300개 내지 약 400개의 누클레오티드, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 400개 내지 약 500개의 누클레오티드, 보다더 바람직하게는 적어도 약 500개 내지 약 600개 누클레오티드, 심지어 더욱 바람직하게는 적어도 약 600개 내지 약 700개 누클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 약 700개 내지 약 800개 누클레오티드, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 800개 내지 약 900개, 보다 바람직하게는 적어도 약 900개 내지 약 1000개 누클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 약 1000개 내지 약 1100개, 보다 바람직하게는 적어도 약 1100개 내지 약 1200개 누클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 약 1200개 내지 약 1300개, 보다 바람직하게는 적어도 약 1300개 내지 약 1400개 누클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 약 1400개 내지 약 1500개, 보다 바람직하게는 적어도 약 1500개 내지 약 1550개, 더욱 바람직하게는 적어도 약 1550개 내지 약 1600개 누클레오티드, 보다 바람직하게는 적어도 약 1600개 내지 약 1620개 누클레오티드일 수 있고, 가장 바람직하게는 핵산 단편은 길이가 약 1625개 이상의 누클레오티드일 것이다.
본원에서 사용된 용어 "상동"은 2개의 중합체 분자간의, 예를 들어 2개의 핵산 분자간의, 예를 들어 2개의 DNA 분자 또는 2개의 RNA 분자간의, 또는 2개의 폴리펩티드 분자간의 서브유닛 서열 유사성을 지칭한다. 두 분자 모두에서 한 서브유닛 위치에 동일한 단량체 서브유닛이 존재하는 경우, 예를 들어 두 DNA 분자 각각에서 한 위치에 아데닌이 존재하는 경우, 이들은 그 위치에서 상동이다. 두 서열간의 상동성은 일치하거나 상동인 위치의 수의 직접적인 함수이다. 예를 들어, 두 화합물 서열에서 위치의 절반(예를 들어, 길이가 10개 서브유닛인 중합체에서 5개 위치)이 상동인 경우, 두 서열은 50% 상동이며, 위치의 90%, 예를 들어 10개중 9개 위치가 일치하거나 상동인 경우 두 서열은 90% 상동성을 공유한다. 예를 들어, DNA 서열 3'-ATTGCC-5' 및 3'-TATGGC-5'은 75% 상동성을 공유한다.
"키티나아제 유사 분자 억제제"는 세포 또는 조직에서 키티나아제 유사 분자의 수준을, 화합물 부재하의 동일한 세포 또는 조직에서 키티나아제 유사 화합물의 수준과 비교하여 검출가능하게 억제하는 화합물을 의미한다. 키티나아제 유사 분자의 수준은 그 분자를 코드화하는 핵산의 발현 수준, 검출가능한 키티나아제 유사 분자의 수준 및/또는 키티나아제 활성의 수준을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 키티나아제 유사 분자 억제제는 화합물(예를 들어, 알로사미딘, 글루코알로사미딘 A, 글루코알로사미딘 B, 메틸-N-데메틸알로사미딘, 데메틸알로사미딘, 디데메틸알로사미딘, 시클로구아니딘, 스틸로구아니딘 유도체, 디펩티드 시클로-(L-Arg-D-Pro), 디펩티드 시클로-(L-Arg-L-Pro), 디펩티드 시클로-(D-Arg-D-Pro), 디펩티드 시클로-(D-Arg-L-Pro), 리보플라빈, 플라빈 유도체), 구리, 아연, 수은, 항체, 리보자임, 안티센스 분자 및 핵산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "AMCase 억제제"는 상기 정의된 바와 같이, AMCase를억제하는 키티니아제 유사 분자 억제제를 포함한다. 이러한 억제제는 세포 또는 조직에서의 AMCase 발현 및/또는 활성을, 억제제 부재하의 세포 또는 조직, 또는 억제제 부재하의 동일한 세포 또는 조직에서의 AMCase 발현 및/또는 활성의 수준과 비교하여, 억제하는 화합물 뿐만 아니라, 리보자임, 안티센스 분자, 항체 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 억제제는 화합물, 리보자임, 안티센스 핵산 분자, 항체 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "유전자" 및 "재조합 유전자"는 본 발명의 폴리펩티드를 코드화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 이러한 천연 대립유전자 변이는 전형적으로 주어진 유전자의 누클레오티드 서열의 1 내지 5% 변이를 가져올 수 있다. 대안적인 대립유전자는 수많은 다양한 개체에서 관심있는 유전자를 서열화시켜 확인할 수 있다. 이것은 다양한 개체에서 동일한 유전자좌를 확인하기 위한 하이브리드화 프로브를 사용함으로써 용이하게 수행될 수 있다. 임의의 모든 누클레오티드 변이 및 천연 대립유전자 변이 결과 생성되며 기능 활성이 변화하지 않는 아미노산 다형 또는 변이는 본 발명의 범주내인 것으로 이해된다.
본원에서 사용된 용어 "지시 자료"는 본원에서 인용된 다양한 질환 또는 장애를 경감시키기 위한 키트내의 본 발명의 핵산, 펩티드 및/또는 조성물의 유용성을 알려주기 위해 사용될 수 있는 간행물, 기록, 도표 또는 임의의 다른 표현 매체를 포함한다. 임의로, 또는 대안적으로, 지시 자료는 포유동물의 세포 또는 조직의 질환 또는 장애를 경감시키는 하나 이상의 방법을 기술할 수 있다. 본 발명의 키트의 지시 자료는 예를 들어 본 발명의 핵산, 펩티드, 화합물 및/또는 조성물을포함하는 용기에 부속될 수 있고, 핵산, 펩티드, 화합물 및/또는 조성물을 포함하는 용기와 함께 적재될 수 있다. 대안적으로, 지시 자료는, 지시 자료와 화합물이 수용자에 의해 협동적으로 사용된다는 의도하에 용기와 따로 적재될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "염증성 질환"은 조직 상해, 세포 손상, 항원, 및/또는 감염성 질환에 대한 반응이 있는 상태를 지칭한다. 일부 경우에, 인과관계가 성립되지 않을 수 있다. 염증의 증상은 세포 침윤 및 조직 종창을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 염증성 질환의 정의내로 생각되는 질병 상태는 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 기질성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 기관지염, 호산성 기관지염, 호산성 폐렴, 폐렴, 염증성 장질환, 아토피성 피부염, 아토피, 알레르기, 알레르기성 비염, 특발성 폐섬유증, 경피증, 기종 등을 포함한다.
"분리된 핵산"은 천연 상태에서는 이의 측면에 위치한 서열로부터 분리된 핵산 분절 또는 단편, 예를 들어 정상적으로는 단편에 인접해 있는 서열, 예를 들어 자연적으로 존재하는 게놈내의 단편에 인접한 서열로부터 분리된 DNA 단편을 지칭한다. 이 용어는 또한 핵산에 자연적으로 수반되는 다른 성분, 예를 들어 DNA 또는 RNA, 또는 세포내에서 자연적으로 수반되는 단백질로부터 실질적으로 정제된 핵산에 적용된다. 따라서, 상기 용어는 예를 들어 벡터내로, 자가 복제성 플라스미드 또는 바이러스내로, 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA내로 삽입되거나, 다른 서열과는 독립적으로 분리된 분자(예를 들어, cDNA, 또는 PCR 또는 제한 효소 분해에 의해 생성된 게놈 단편 또는 cDNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 이것은 또한 추가의 폴리펩티드 서열을 코드화하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.
2개의 폴리누클레오티드를 "작동적으로 연결된"이라고 기술하는 것은 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 부분이, 두 폴리누클레오티드중 적어도 하나가 이것이 특징으로 하는 생리 효과를 다른 폴리누클레오티드에 대해 나타낼 수 있도록 핵산 부분내에 배열된 2개의 폴리누클레오티드를 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 유전자의 코딩 영역에 작동적으로 연결된 프로모터는 코딩 영역의 전사를 촉진할 수 있다.
바람직하게는, 목적하는 단백질을 코드화하는 핵산이 추가로 프로모터/조절 서열을 포함하는 경우, 프로모터/조절 서열은 목적 단백질 코딩 서열의 5' 말단에 위치하여 세포내에서 목적 단백질을 발현시키도록 한다. 함께, 목적 단백질을 코드화하는 핵산 및 이의 프로모터/조절 서열은 "이식유전자"를 포함한다.
"구성적(Constitutive)" 발현은 유전자 생성물이 세포의 대부분 또는 모든 생리적인 조건하에서 살아있는 세포내에서 생성되는 상태이다.
"유도성" 발현은 유전자 생성물이 세포내의 신호의 존재에 반응하여 살아있는 세포내에서 생성되는 상태이다.
"재조합 폴리펩티드"는 재조합 폴리누클레오티드의 발현시 생성되는 폴리펩티드이다.
"폴리펩티드"는 펩티드 결합으로 연결된 아미노산 잔기, 관련된 천연의 구조 변이체, 및 이들의 합성의 비천연 유사체로 구성된 폴리머, 관련된 천연의 구조 변이체, 및 이들의 합성의 비천연 유사체를 의미한다. 합성 폴리펩티드는 예를 들어자동 폴리펩티드 합성기를 이용하여 합성될 수 있다.
용어 "단백질"은 통상적으로 거대 폴리펩티드를 의미한다.
용어 "펩티드"는 통상적으로 짧은 폴리펩티드를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "유전자도입 포유동물"은 생식 세포가 외래 핵산을 포함하는 포유동물을 의미한다.
본원에 사용된 "치료하다"는 환자가 염증성 질병의 증상을 경험하는 빈도를 감소시키는 것, 또는 환자의 질병의 자연 경과 및/또는 진행을 변경시키는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "안티센스 올리고누클레오티드"는 적어도 일부가 정상 세포 또는 질환 세포에 존재하는 핵산에 상보적인 핵산 폴리머를 의미한다. 가장 바람직하게는, 안티센스 올리고누클레오티드는 약 15개 내지 약 50개 누클레오티드를 포함한다. 본 발명의 안티센스 올리고누클레오티드는 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드 및 다른 올리고누클레오티드의 개질된 형태를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 항원상의 특이적 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자를 의미한다. 항체는 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 온전한 면역글로불린 또는 온전한 면역글로불린의 면역반응성 부분일 수 있다. 항체는 통상적으로 면역글로불린 분자의 사량체이다. 본 발명의 항체는 예를 들어 다클론 항체, 단클론 항체, Fv, Fab, F(ab)2, 뿐만 아니라 단쇄항체 및 인간화 항체를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다(참조: Harlow et al., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242: 423-426).
본원에 사용된 용어 "합성 항체"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성되는 항체, 예를 들어 본원에 설명된 박테리오파지에 의해 발현된 항체를 의미한다. 상기 용어는 또한, 항체를 엔코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되고 DNA 분자가 항체 단백질 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하는 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하고, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 이용가능하고 당 기술분야에 널리 공지된 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득된다.
폴리누클레오티드의 "일부"는 적어도 폴리누클레오티드의 약 15개 내지 약 50개의 연속적인 누클레오티드 잔기를 의미한다. 폴리누클레오티드의 일부는 폴리누클레오티드의 모든 누클레오티드 잔기를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 용어 "특이적으로 결합한다"는 키티나아제 유사 분자를 인식하고 결합하지만 시료 내의 다른 분자는 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 항체를 의미한다.
"예방적" 처치는 질병과 관련된 병변이 진전되는 위험을 감소시킬 목적으로 질병의 징후를 보이지 않거나 질병의 초기 징후만을 보이는 피검자에게 수행되는 치료이다.
본원에 사용된 용어, 질병을 "예방한다"는, 억제제의 부재하의 발병 및/또는 증상과 비교하여 키티나아제 유사 분자가 투여되는 경우에, 발병이 지연되고/거나 질병의 증상이 강도 및/또는 빈도 면에서 감소되는 것을 의미한다.
"치료적" 처치는 병변의 징후를 보이는 피검자에게 이러한 징후를 감소시키거나 제거할 목적으로 수행되는 치료이다.
I. 방법
A. 염증성 질병을 치료하는 방법
본 발명은 증가된 수준의 키티나아제 유사 분자와 관련된 염증성 질병을 치료하는 방법을 포함한다.
본 발명에서는 키티나아제 유사 분자 억제제를 사용하여 포유동물 바람직하게는 인간의 염증성 질병을 치료하는 방법이 고려된다. 이는, 본원의 개시 내용이 제공되는 경우에 당업자에 의해 인정되는 바와 같이, 키티나아제 유사 분자의 발현 및/또는 활성을 억제하는 것은 IL-13에 의해 매개되는 질병을 포함하는 염증성 질병을 위한 치료법이 되기 때문이다. 즉, 본원에 개시된 데이터는 IL-13의 발현에 의해 매개되거나 이와 관련되는 염증성 질병의 모델에서 키티나아제 유사 분자 억제제를 투여하는 것이 질병이 확립된 후에 이러한 질병을 치료한다는 것을 증명한다. 또한, 본 발명은 키티나아제 유사 분자 및 키티나아제 유사 분자 mRNA가 정상 조직의 키티나아제 유사 분자의 수준과 비교하여 염증성 질병 조직에 증가된 수준으로 존재한다는 발견에 관한 것이다. 이와 같이, 본 발명은 키티나아제 유사 분자 억제제(예: 알로사미딘)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 키티나아제 유사 분자 억제제를 사용하여 상기 질병을 치료하는 것에 관한 것이다.
놀랍게도, 키티나아제 유사 분자 억제제는 검출가능한 키티나아제 활성이 없는 경우에조차 질병을 치료하기 위해 투여될 수 있다. 이와 같이, 당업자는 본원에 제공된 개시 내용에 기초하여, 본 발명이 검출가능한 키티나아제 활성이 존재하는 경우에 질병을 치료하는 것에 한정되지 않고, 대신에 본 발명은 검출될 수 있는 키티나아제 활성이 없는 경우에조차 키티나아제 유사 분자의 발현과 관련되거나 이에 의해 매개되는 질병의 치료를 포함한다는 것을 인정할 것이다.
당업자는, 본원에 제공된 개시 내용에 기초하여, 키티나아제 유사 분자의 억제가 특히 리보자임 및/또는 키티나아제 유사 분자를 엔코딩하는 핵산의 발현을 억제하는 안티센스 분자에 의해 매개되는 것과 같은 키티나아제 유사 분자 발현의 억제를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 추가적으로, 당업자는 본 발명의 교시 내용에 의해, 키티나아제 유사 분자의 억제가 세포 내의 키티나아제 유사 분자 활성의 억제를 포함한다는 것을 인정할 것이다. 이러한 키티나아제 유사 분자 활성의 억제는 특히 알로사미딘, 1,10-페난트롤린, 글루코알로사미딘 A, 글루코알로사미딘 B, 메틸-N 데메틸알로사미딘, 데메틸알로사미딘, 디데메틸알로사미딘, 스틸로구아니딘, 스틸로구아니딘 유사체, 디펩티드 시클로-(L-Arg-D-Pro), 디펩티드 시클로-(L-Arg-L-Pro), 디펩티드 시클로-(D-Arg-D-Pro), 디펩티드 시클로-(D-Arg-L-Pro), 리보플라빈, 플라빈 유사체, 구리, 아연, 수은 등을 포함하는 키티나아제 효소 활성의 억제제를 사용하여 달성될 수 있다. 또한, 키티나아제 유사 분자 활성의 억제제에는 키티나아제 유사 분자에 특이적으로 결합하여 효소의 작용을 방지하는 항체가 포함된다. 이와 같이, 키티나아제 유사 분자 억제제는 키티나아제 유사 분자를 엔코딩하는 핵산의 전사, 번역, 또는 둘 모두를 억제하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않고, 이는 또한 키틴을 분해할 수 있는 능력을 포함하나 이에 한정되지 않는 펩티드의 활성을 억제하는 것도 포함한다.
본 발명은 포유동물의 염증성 질병을 치료하거나 예방하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 이러한 치료가 필요한 포유동물에게 키티나아제 유사 분자를 투여하는 것을 포함한다. 이는 본 발명의 교시 내용에 의해 당업자가 인정할 수 있는 바와 같이, 키티나아제 유사 분자를 억제하는 것이 염증성 질병을 치료하거나 예방하는 데 유용하기 때문이다. 키티나아제 유사 분자의 억제는 결과적으로, 본원에 개시된 데이터에 의해 충분히 증명되는 바와 같이 염증성 질병과 관련된 병변을 예방한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 다양한 억제제를 사용하여 키티나아제 유사 분자를 억제하는 것에 관한 것이다. 즉, 당업자는 본원에 제공된 개시 내용에 기초하여 키티나아제 유사 분자의 발현, 활성 및/또는 작용을 억제하는 화합물이 키티나아제 유사 분자를 억제하여 염증성 질병을 억제하는, 공지되었거나 개발될 항체, 안티센스 핵산, 리보자임, 소분자, 펩티도미메틱, 및 화학적 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다는 것을 이해할 것이다.
본 발명은 키티나아제 유사 분자가 시험관내 또는 생체내에서 검출가능한 키티나아제 활성을 보이거나 보이지 않는 키티나아제 유사 분자의 억제를 포함한다. 즉, 임의의 특정 이론에 구속되지 않기를 바라며, 세포, 조직, 또는 무세포 시스템에서 키티나아제 유사 분자가 검출가능한 키티나아제 활성을 보이는 지는 관계가 없다. 보다 구체적으로, 본원에 개시된 데이터에 의해 증명되는 바와 같이, 시험관내 또는 생체내에서 검출가능한 키티나아제 활성을 보이지 않는 키티나아제 유사 분자, 예를 들어 Ym은 질병 세포 및 조직에서 염증성 질병 병변을 보이지 않는 세포 또는 조직에 비하여 증가된 수준으로 발현되고, 특히 알로사미딘을 사용하여 Ym을 억제하는 것은 질병을 치료하고/거나 예방한다. 추가적으로, 본원에 개시된 데이터는 또한 세포 또는 조직의 증가된 수준의 키티나아제, AMCase가 염증성 질병과 관련되거나 이를 매개한다는 것을 증명한다. 더욱이, AMCase의 억제는 질병을 치료한다. 이러한 치료적 효과는 검출가능하지 않은 키티나아제 활성의 억제와 관련될 수 있거나, 이는 치료적 효과가 키티나아제 또는 키티나아제 유사 분자의 키티나아제 유사 활성에 관련되지 않는다는 것일 수 있고, 당업자는 본원의 개시 내용에 기초하여, 치료적 효과가 반드시 그런 것은 아니나 분자에 의해 임의의 키티나아제 활성과 상관관계를 가질 수 있다는 것을 인정할 것이다.
당업자는, 본원에 개시된 내용에 기초하여, 본 발명의 억제제가 포유동물에서 키티나아제 유사 분자의 발현, 활성, 또는 작용을 예방하거나 억제하는 분자 및 화합물을 포함한다는 것을 인정할 것이다. 즉, 본 발명은 키티나아제 유사 분자가 세포 또는 조직에서 검출될 수 없도록 키티나아제 유사 분자의 발현을 억제, 감소 및/또는 제거하는 안티센스 및/또는 안티센스 분자가 본 발명의 억제제라는 것을 고려한다. 예를 들어, 키티나아제 유사 분자를 분해하는 화합물이 이의 작용을 감소시킬 수 있고, 본 발명에서 고려되는 억제제일 수 있다.
키티나아제 유사 분자의 억제는 본원에 개시된 것들 뿐만 아니라 당 분야에 널리 공지된 방법 또는 앞으로 개발된 방법을 포함하는 다양한 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 즉, 당업자는 본원에 개시된 내용에 기초하여, 키티나아제 유사 분자 발현의 억제가 키티나아제 유사 분자를 엔코딩하는 핵산(예: mRNA)의 수준 및/또는 세포 또는 체액에 존재하는 키티나아제 유사 분자의 수준을 평가하는 방법을 사용하여 용이하게 평가될 수 있다는 것을 인정할 것이다. 더욱이, 당업자는 키티나아제 유사 분자의 억제가 본원에 예시된 바와, 같이 세포 또는 체액의 키티나아제 효소 활성의 억제를 결정하고/거나 당 분야에 널리 공지되거나 앞으로 개발된 방법을 사용함에 의해 평가될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
당업자는 본원에 개시된 내용에 기초하여, 본 발명이, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 간질성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive lung disease), 만성 기관지염, 호산구성 기관지염, 호산구성 폐렴, 폐렴, 염증성 장 질환, 아토피성 피부염, 아토피, 알레르기, 알레르기성 비염, 특발성 폐 섬유증, 경피증, 및 폐기종 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 염증성 질병의 치료를 포함한다. 본원에 개시된 바와 같이 이러한 질병은 증가된 키티나아제 유사 분자가 증가된 키티나아제 유사 분자 발현, 증가된 키티나아제 유사 분자 활성, 또는 둘 모두를 포함하나 이에 한정되지 않는 경우에 조직의 증가된 키티나아제 유사 분자와 관련되고/거나 이에 매개된다.
또한, 당업자는, 본원에 교시된 내용에 기초하여, 질병이 특히 증가된 IL-13 및/또는 증가된 IL-4 생성에 의해 매개되는 질병을 포함하는 조직에서의 증가된 키티나아제 유사 분자를 포함하는 임의의 질병을 포함한다는 것을 추가로 인정할 것이다. 이는, 본원에 보다 완전히 제시된 바와 같이, 본원에 개시된 데이터가 증가된 IL-13 및/또는 증가된 IL-4가 키티나아제 유사 분자를 매개하여 결과적으로 조직 염증, 증가된 폐 부피, 기관지폐포세척(BAL) 액 중의 증가된 호산구, BAL 액 중의 증가된 림프구, BAL 액 중의 증가된 총 세포 수, 증가된 폐포 크기, 폐 조직 중의 키티나아제 유사 분자를 포함하는 결정의 증가된 침착, 증가된 기도 저항, 증가된 점액 이형성, 증가된 뮤신 발현, 증가된 간질성 섬유증, 증가된 기도 재형성, 증가된 상피하 섬유증, 기도 조직 중의 증가된 콜라겐 침착, 폐 조직의 상피 비대증, 결정 물질의 메종체(Masson body) 유사 섬유증 중심으로의 병소 조직화 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 염증성 질병과 관련된 다양한 변화를 매개하고/거나 이와 관련된다는 것을 증명하기 때문이다.
따라서, 본원에 개시된 데이터는 염증성 질병에 걸린 포유동물에서 키티나아제 유사 분자의 억제(여기서, 질병은 IL-13 및/또는 IL-4의 증가된 발현에 의해 매개되거나 이와 관련된다)가 키티나아제 유사 분자의 수준의 감소를 매개하고 결과적으로 질병을 치료함에 의해 질병을 치료할 것이라는 것을 증명한다. 예를 들어, 이러한 데이터는 IL-13의 증가된 발현이 증가된 키티나아제 유사 분자 활성 및 증가된 키티나아제 유사 분자 발현을 매개하는 경우에 키티나아제 유사 분자 억제제(예: 알로사미딘)을 포유동물에게 투여함에 의한 다양한 조직 병변의 억제를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 추가로 포유동물의 Th2 염증 반응에 의해 매개되고/거나 이와 관련되는 염증성 질병을 치료하는 방법을 포함한다. 당업자는, 본 발명의 개시 내용 및 본 발명에 교시된 내용에 의해, Th2 염증 반응에 의해 매개되고/거나 이와 관련되는 염증성 질병이 천식, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 간질성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive lung disease), 만성 기관지염, 호산구성 기관지염, 호산구성 폐렴, 폐렴, 염증성 장 질환, 아토피성 피부염, 아토피, 알레르기, 알레르기성 비염, 특발성 폐 섬유증, 경피증, 및 폐기종 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 염증성 질병을 포함한다. 본원에 개시된 바와 같이, 이러한 질병은 포유동물에서 Th2 염증성 반응에 의해 매개되고 특히 증가된 IL-13 생성 및/또는 발현, 증가된 키티나아제 유사 분자 활성 및/또는 발현 등을 유발한다. 증가된 키티나아제 유사 분자는 증가된 키티나아제 유사 분자 발현, 증가된 키티나아제 유사 분자 활성, 또는 둘 모두를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 당업자는, 본원에 개시된 내용에 기초하여, 질병은 특히, 증가된 Th2 염증성 반응에 의해 매개되는 질병을 포함하는 조직의 증가된 키티나아제 유사 분자를 포함하는 임의의 질병을 포함한다는 것을 인정할 것이다. 이는 본원에 보다 완전히 제시되는 바와 같이, 본원에 개시된 데이터가 증가된 Th2 염증성 반응이 특히 증가된 IL-13 및/또는 증가된 IL-4 활성 및/또는 발현, 키티나아제 유사 분자의 증가를 유발하고, 결과적으로 BAL 액 중의 증가된 총 세포, 증가된 폐포 크기, 폐 조직 중의 키티나아제 유사 분자를 포함하는 결정의 증가된 침착, 증가된 기도 저항, 증가된 점액 이형성, 증가된 뮤신 발현, 증가된 간질성 섬유증, 증가된 기도재형성, 증가된 상피하 섬유증, 기관지폐포세척(BAL) 액 중의 증가된 호산구, BAL 액 중의 증가된 림프구 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 염증성 질병과 관련된 다양한 변화를 매개하고/거나 이와 관련된다는 것을 증명하기 때문이다.
따라서, 본원에 개시된 데이터는 증가된 Th2 염증 반응에 의해 매개되고/거나 이와 관련되는 염증성 질병에 걸린 포유동물의 키티나아제 유사 분자의 억제가 키티나아제 유사 분자의 수준의 감소를 매개하여 결과적으로 질병을 치료함에 의해 질병을 치료할 것이라는 것을 증명한다. 예를 들어, 이러한 데이터는 Th2 염증성 반응이 증가된 키티나아제 유사 분자 활성 및 증가된 키티나아제 유사 분자 발현을 매개하는 경우에 포유동물에 키티나아제 유사 분자 억제제(예: 알로사미딘)을 투여함에 의해 다양한 조직 병변의 억제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
당업자는 추가로 키티나아제 유사 분자가 공지된 키티나아제에 상당한 정도의 상동성을 보여서 특히 이의 아미노산 서열에 근거하여 키티나아제 패밀리 분자로서 분류되었거나 이로서 분류될 수 있는 분자라는 것을 인정할 것이다. 또한, 당업자는 본원에 제시된 개시 내용에 근거하여, 키니타아제 유사 분자가 공지된 키티나아제에 상동성을 보일 수 있지만, 키티나아제 분자는 이들이 당 분야에 공지된 검정에서 검출가능하게 키틴을 분해할 수 없다는 점에서 검출가능한 키티나아제 활성을 보일 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 이러한 키티나아제 유사 분자는 산성 포유동물 키티나아제(호산구 화학유인 시토카인), YM1(키티나아제 3 유사 3, ECF-L 전구체), YM2, 난관 당단백질 1, 연골 당단백질 1(BRP-39, 키티나아제 3 유사 1, GP-39, YKL-40), 키토트리오시다아제, 난관 당단백질 1(뮤신 9, 난관), 연골당단백질-39(키티나아제 3 유사 1, GP-39, YKL-40), 및 콘드로사이트 단백질 39(키티나아제 3 유사 2, YKL-39)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
키티나아제 유사 분자 억제제는 화학적 화합물, 단백질, 펩티도미메틱, 항체, 리보자임, 및 안티센스 핵산 분자를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는 것으로 해석되어야 한다.
당업자는 본원에 제공된 개시 내용에 기초하여 키티나아제 유사 분자 억제제가 키티나아제 유사 분자의 활성을 억제하는 화학적 화합물을 포함하는 것을 용이하게 인정할 것이다. 키티나아제 유사 분자 억제제는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 키티나아제 유사 분자 억제제의 일 군의 중요한 요소의 일부가 정의되어 있다(참조: Spindler and Spindler-Barth, 1999, Chitin and Chitinases, Birkhauser Verlag Basel, Switzerland). 추가적으로, 키티나아제 유사 분자 억제제는 화학 분야에서 당업자에게 널리 공지된, 화학적으로 개질된 화합물 및 유도체를 포함한다.
당업자는 키티나아제 유사 분자 억제제가 이미 공지된 키티나아제 유사 분자 억제제, 예를 들어, 알로사미딘(Allosamidine, Carbohydrate Chemistry Industrial Research Limited, Lower Hutt, New Zealand, and Eli Lilly and Co. , Greenfield, IN) 및 이의 유도체 (참조: 미국 특허 제 5,413, 991호), 글루코알로사미딘 A, 글루코알로사미딘 B, 메틸-N-데메틸알로사미딘(Nishimoto et al. , 1991, J. Antibiotics 44: 716-722), 데메틸알로사미딘(미국 특허 제 5,070, 191호), 및 디데메틸알로사미딘(Zhou et al., 1993, J. Antibiotics 46: 1582-1588)을포함하나 이에 한정되지 않는다. 추가로 고려되는 키티나아제 유사 분자 억제제는 스틸로구아니딘 및 이의 유도체(Kato et al. , 1995, Tetrahedron. Lett. 36: 21332136), 디펩티드 시클로-(L-Arg-D-Pro)(Izumida et al. , 1996, J. Antibiotics 49: 76-80), 이가 양이온(예: Cu2+, Zn2+, 및 Hg2+)(Izumida et al. , 1995, J. Mar. Biotechnol. 2: 163- 166; Funke and Spindler, 1989, Comp. Biochem Physiol. 94B: 691-695), 및 리포플라빈 및 플라빈 유도체(국제출원 공개 번호 제 WO 02/23991호)를 포함한다.
추가로 당업자는 상기 개시 내용과 본원에 예시된 방법에 의해, 키티나아제 유사 분자 억제제가 약리학 분야에 널리 공지된 범주, 예를 들어 본원에 상세히 기술되고/거나 당 분야에 공지된 키티나아제 유사 분자의 억제의 생리학적 결과에 의해 확인될 수 있는 앞으로 발견될 억제제를 포함한다는 것을 인정할 것이다. 따라서, 본 발명은 본원에 예시되고 개시된 바와 같이 임의의 특정 키티나아제 유사 분자 억제제에 어떤 식으로든 한정되지 않고; 차라리 본 발명은 본원에 공지되고 앞으로 발견되는 유용할 것이라고 당업자에 의해 이해될 억제제를 포함한다.
또한, 키티나아제 유사 분자를 동정하고 제조하는 방법은 천연 공급원(예를 들어, 스트렙토마이세스 속, 수도모나스 속, 스틸로텔라 아우란티움)으로부터 억제제를 수득하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않으며 당업자에게 널리 공지되어 있다. 대안적으로, 키티나아제 유사 분자 억제제는 화학적으로 합성될 수 있다. 추가로, 당업자는 본원에 제시된 교시 내용에 기초하여 키티나아제 유사 분자 억제제는 재조합 생물체로부터 수득될 수 있다는 것을 인정할 것이다. 키티나아제 유사 분자 억제제를 화학적으로 합성하고 천연 공급원으로부터 이들을 수득하는 조성물 및 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있고 특히 문헌(Yamada et al. , U. S. Patent Nos. 5,413, 991, and 5,070, 191)에 설명되어 있다.
당업자는 또한 본원에 개시된 내용에 근거하여 키티나아제 유사 분자 억제제가 키티나아제 유사 분자, 예를 들어, AMCase에 특이적으로 결합하여 이들 단백질의 작용을 억제하는 항체를 포함한다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, YM에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 널리 공지되어 있다(참조: Webb et al., 2001, J. Biol. Chem. 276: 41969-41976). 유사하게, 키티나아제 유사 분자에 대한 항체는 본원에 개시되거나 당업자에게 널리 공지된 표준 방법을 사용하여 제조될 수 있다(참조: Harlow et al. , 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York). 따라서, 본 발명은 어떤 식으로든 임의의 특정 항체에 한정되지 않고; 대신에 본 발명은 당 분야에 널리 공지되고/거나 앞으로 동정될 키티나아제 유사 분자와 특이적으로 결합하는 임의의 항체를 포함한다.
당업자는 항체가 단백질, 단백질은 엔코딩하는 핵산 구조물 또는 이들 둘 모두로서 투여될 수 있다는 것을 인정할 것이다. 세포 또는 조직에 단백질을 엔코딩하는 핵산 구조물 또는 단백질을 투여하기 위한 많은 벡터 및 다른 조성물 및 방법이 널리 공지되어 있다. 따라서, 본 발명은 키티나아제 유사 분자에 특이적인 항체 또는 항체를 엔코딩하는 핵산(예를 들어, 합성 항체)를 투여하는 방법을 포함한다(참조: Sambrook et al. , 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, New York; Ausubel et al. , 1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York).
당업자는 본원에 개시된 내용에 기초하여 본 발명이 대상 키티나아제 유사 분자와 특이적으로 결합하는 항체, 또는 항체를 엔코딩하는 핵산을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항체 분자는 추가로 세포간 보유 서열을 포함하여 항체가 키티나아제 유사 분자와 결합하고 세포 표면에서의 발현 및/또는 이의 세포로부터의 방출을 방지한다. 이러한 항체는 종종 "세포내항체(intrabody)"라고도 하며, 당 분야에 널리 공지되어 있고 예를 들어 마라스코 등의 미국 특허 제 6,004, 490호 및 비얼리 등의 문헌(Beerli et al., 1996, Breast Cancer Research and Treatment 38: 11-17)에 설명되어 있다. 이와 같이, 본 발명은 세포상의 키티나아제 유사 분자 및/또는 이의 세포로부터의 분비를 억제하는 것을 포함하고, 여기서 당업자는 이러한 억제가 본원에 개시된 내용에 기초하여 잇점을 제공할 것이라는 것을 이해할 것이다.
본 발명은 키티나아제 유사 분자에 대한 화합물 및 항체로 제한되지 않는다. 본 기술 분야의 전문가라면 폴리펩티드의 발현을 억제하는 것은 폴리펩티드의 활성 및 기능을 억제하는 효과적인 방법이라는 것을 인지할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 키티나아제 유사 분자를 엔코딩하는 핵산의 발현을 억제함으로써 키티나아제 유사 분자의 억제를 위한 방법을 제공한다. 유전자의 발현을 억제하는 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 리보자임 또는 안티센스 올리고누클레오티드의 사용을 포함한다.
안티센스 올리고누클레오티드는 mRNA 분자의 어떠한 일부에 상보적인 DNA 또는 RNA 분자이다. 세포내에 존재하는 경우에, 안티센스 올리고누클레오티드는 기존의 mRNA 분자에 혼성화되어 유전자 생성물로의 번역을 억제한다. 안티센스 올리고누클레오티드를 사용한 유전자 발현의 억제는 본 기술 분야에 공지되어 있는데[Marcus-Sekura, 1988, Anal. Biochem. 172:289], 세포내에서 안티센스 올리고누클레오티드를 발현시키는 방법(Inoue, U.S. Patent No. 5,190,931)이 공지되어 있다.
본 발명에서는 본 기술 분야의 전문가에게는 공지된 방법에 의해서 합성되고 세포에 제공되는 안티센스 올리고누클레오티드가 고려된다. 예를 들어, 안티센스 올리고누클레오티드는 약 10 내지 약 100, 더욱 바람직하게는, 약 15 내지 약 50 누클레오티드 길이로 합성될 수 있다. 핵산 분자의 합성방법은 본 기술 분야에 공지되어 있는데, 비변화된 안티센스 올리고누클레오티드와 비교하여 생물학적 활성이 개선된 변화된 안티센스 올리고누클레오티드의 합성방법(Tullis, 1991, U.S. Patent 5,023,243)이 공지되어 있다.
유사하게, 유전자의 발현은 유전자의 프로모터 또는 다른 조절 요소에 안티센스 분자가 혼성화되어, 유전자의 전사에 영향을 줌으로써 억제될 수 있다. 목적 유전자와 상호작용하는 프로모터 또는 다른 조절 요소의 동정 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 이스트 투 하이브리드 시스템(yeast two hybrid system)[Bartel and Fields, eds., In: The Yeast Two Hybrid System, Oxford University Press, Cary, NC]과 같은 방법을 포함한다.
또한, 키티나아제 유사 분자를 발현하는 유전자의 억제는 리보자임의 사용을 통해서 수행될 수 있다. 유전자 발현을 억제하는 리보자임의 사용방법은 본 기술 분야에 공지되어 있다[문헌: Cech et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 17479; Hampel et al., 1989, Biochemistry 28:4929; Altman et al., U.S. Patent No. 5,168,053]. 리보자임은 다른 단일가닥 RNA 분자를 분해하는 기능을 지니는 촉매성 RNA 분자이다. 리보자임은 서열 특이적이며, 그로 인해서 특이적 누클레오티드 서열을 인식하도록 변화되어[문헌: Cech, 1988, J. Amer. Med. Assn. 260:3030], 특이적 mRNA 분자를 선택적으로 분해할 수 있다. 누클레오티르 서열 키티나아제 유사 분자를 제공하면, 본 기술 분야의 전문가라면 본원에 통합된 문헌 및 참고를 참조하면서 과도한 시험 없이 안티센스 올리고누클레오티드 또는 리보자임을 합성할 수 있다.
본 기술 분야의 전문가라면 키티나아제 유사 분자 유전자 발현 억제제들이 단독으로 또는 어떠한 조합으로 투여될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 또한, 키티나아제 유사 분자 억제제들이 동시에, 서로 전 및/또는 후에 투여될 수 있다는 면에서 일시적으로 단독 또는 이들의 어떠한 조합으로 투여될 수 있다. 본 기술 분야의 전문가라면, 본원에 제공된 문헌을 기초로 하여, 유전자 발현을 억제하는 키티나아제 유사 분자 억제제가 천식, COPD, 및 다른 염증성 질환을 치료하는데 사용될 수 있으며, 하나의 억제제가 단독으로 또는 치료 결과에 영향을 주는 다른 억제제와의 어떠한 조합으로 사용될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.
B. 염증성 질환을 예방하는 방법
본 기술 분야의 전문가라면, 본원에 상세된 방법을 포함한 본 발명에서 개시하고자 하는 것은 질환이 발병된 염증성 질환의 치료에 제한되는 것이 아니라는 것을 인지할 수 있을 것이다. 특히, 질환의 증상은 포유동물에게 유해한 것으로 확인될 필요는 없으며; 사실, 상기 질환은 치료제가 투여되기 전에 포유동물에서 검출될 필요가 없다. 즉, 본 발명에 의해서 효과를 보기 전에 염증성 질환으로부터의 상당한 병리현상이 나타날 필요가 없다. 따라서, 본 발명은, 본원에서 보다 상세하게 기재하고 있는 바와 같이, 포유동물의 염증성 질환을 예방하는 방법을 포함하는데, 본원의 어느 부분에서 기재하고 있는 바와 같이, 키티나아제 유사 분자 억제제는 염증성 질환의 발병전에 포유동물에게 투여되어 본원에 기재된 데이터에 의해서 입증된 질환을 예방할 수 있다.
본 기술 분야의 전문가라면, 본원에 기재된 개시사항으로부터, 염증성 질환의 예방이 염증성 질환에 대한 예방적 양으로서 키티나아제 유사 분자 억제제를 포유동물에게 투여함을 포함한다는 것을 알 수 있을 것이다. 본원에 상세된 바와 같이, 키티나아제 유사 분자 관련된 염증성 질환의 증상 및 병인에는 조직 염증화, 폐 용적 증가, 기관지 폐포(BAL)액내의 호산구 증가, BAL액내의 림프구 증가, BAL액내의 전체 세포 증가, 폐포 크기의 증가, 폐 조직내의 키티나아제 유사 분자로 구성된 결정 침착의 증가, 기도저항의 증가, 점막 이형성의 증가, 뮤신 발현의 증가, 실질성 섬유증의 증가, 기도 리모델링의 증가, 상피하 섬유증의 증가, 기도 조직내 콜라겐 침착의 증가, 폐조직내 상피 비대증, 및 메이슨체(Masson-body) 유사 섬유성 병소로의 결정성 물질의 집중적인 조직 등이 포함된다. 본원에 기재된 이들 병인 및 방법에 의해서, 당업자라면 질환 병리증상을 검출할 수 있기 전에 키티나아제 유사 분자 억제제를 사용하여 포유동물에서 염증성 질환을 인식하고 예방할 수 있다. 그 이유는 본원에 기재된 데이터가, 이로 한정되는 것은 아니지만, 알로사미딘(allosamidin)을 포함한 키티나아제 유사 분자 억제제를 투여하면, 질환이 알레르겐(예, 오발부민 감작화)에 의해서 유도되었든지, 포유동물이 질환(예, IL-13을 구성적으로 또는 유도적으로 과생성하는 유전자 이식 마우스)에 유전적으로 걸리기 쉽든지에 무관하게, 포유동물에서의 염증성 질환의 발병을 예방함을 입증하고 있기 때문이다. 따라서, 당업자라면, 본원에 기재된 개시사항을 기초로 하여, 본 발명이 키티나아제 유사 분자 억제제를 사용하여 키티나아제 유사 분자를 억제함을 포함하여 질환을 예방하는 방법을 포함한다는 것을 알 수 있을 것이다. 또한, 본원에서 보다 상세히 기재하고 있는 바와 같이, 키티나아제 유사 분자를 억제하는 방법은 키티나아제 유사 분자 활성을 억제할 뿐만 아니라 키티나아제 유사 분자를 엔코딩하는 핵산의 발현을 억제하는 광범위한 기술을 포함한다. 또한, 본원에 기재된 바와 같이, 당업자라면, 본원에서 교시하고 있는 사항에 의하면, 본 발명은 키티나아제 유사 분자의 발현 및/또는 활성이 매개하는 광범위하게 다양한 질환을 예방하는 방법을 포함한다. 질환이 키티나아제 유사 분자의 과발현 또는 활성 증가에 관련이 있는지를 검정하는 방법은 본원에 기재되어 있고/거나 본 기술 분야에 공지되어 있다. 또한, 본 발명은 장래에 발견될 질환의 치료 또는 예방을 포함한다.
본 발명은 또한 IL-13 매개된 염증성 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 그이유는, 본원에 기재된 데이터가, 여러 조직 중에서도, 폐에서의 IL-13 과발현은, 유도된 것이든 구성된 것이든 간에, 여러 작용중에서도 본원에 기재된 병리작용을 유도하는, 호흡기 조직에서의 키티나아제 유사 분자의 증가된 발현을 유도하거나 이와 관련이 있음을 입증하기 때문이다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 방법을 이용한 IL-13 매개된 염증성 질환을 치료하는 방법을 포함한다.
본 발명은 키티나아제 유사 분자 억제제를 투여하여 본 발명의 방법을 실시함을 포함하며; 당업자라면 본원에 기재된 개시사항을 기초로 하여, 적합한 키티나아제 유사 분자 억제제를 제형하고 이를 포유동물에게 투여하는 방법을 이해할 것이다. 사실, 키티나아제 유사 분자 억제제의 성공적인 투여는 본원에서 예시되고 있는 바와 같이 아주 감소되어 실시되고 있다. 그러나, 본 발명은 특정의 투여 방법 또는 치료 방법으로 한정되는 것이 아니다. 염증성 질환의 기술-인지된 모델을 사용하는 광범위한 감소 실시를 포함하여 본원에 기재된 개시사항을 알고 있는 당업자에게는, 키티나아제 유사 분자 억제제를 투여하는 방법이 약리학 분야의 전문가에 의해서 용이하게 결정할 수 있다는 것이 사실이다.
더욱 특히, 본원에 기재된 데이터는 IL-13 발현의 증가가 키티나아제 유사 분자(예, Ym, 및 AMCase 등) 수준의 증가를 매개하거나 이와 관련이 있으며, 다른 것들중에서도, 키티나아제 유사 분자와 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 키티나아제 유사 분자를 억제하면 염증성 질환을 예방, 완화, 및/또는 치료함을 입증하고 있다. 즉, 예를 들어, AMCase mRNA는 염증성 질환 세포 및/또는 조직에서 더 높은 수준으로 발현되고, AMCase와 특이적으로 결합하는 항체를 투여하면 염증성질환의 당분야-인지된 염증성 질환 동물 모델에서의 질환이 치료된다. 또한, 본원에 기재된 데이터는 화합물, 즉, 공지된 키티나아제 유사 분자 억제제인 알로사미딘을 사용한 Ym의 억제 및 Ym의 발현과 관련된 유사한 결과를 입증하고 있다. 당업자라면, 본 발명이 이들 키티나아제 유사 분자 또는 이들 키티나아제 유사 분자 억제제로 제한되는 것이 아니라는 것을 알 수 있을 것이며, 본원에 기재된 데이터는 키티나아제 유사 분자의 억제가 염증성 질환을 효과적으로 치료 및/또는 예방할 수 있다는 것을 입증하고 있다.
본원에 기재된 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 적절한 키티나아제 유사 분자 억제제가 혼합될 수 있으며, 혼합후에, 적절한 키티나아제 유사 분자 억제제를 포유동물에게 투여하는데 사용될 수 있는 화학적 조성물을 의미한다.
본 발명을 실시하는데 유용한 약제학적 조성물은 약 0.1ng/kg/일 내지 100mg/kg/일의 용량을 전달하도록 투여될 수 있다.
본 발명의 방법에 유용한 약제학적 조성물은 경구용 고체 제형, 안구용 제형, 좌제, 에어로졸, 국소용 제형 또는 그 밖의 유사한 제형으로 전신 투여될 수 있다. 적절한 키티나아제 유사 분자 억제제에 추가로, 약제학적 조성물은 약물의 투여를 증진시키거나 용이하게 하는 것으로 공지된 약제학적으로 허용되는 담체 및 그 밖의 성분을 함유할 수 있다. 다른 가능한 제형, 예컨대, 나노입자, 리포좀, 재봉입된 적혈구, 및 면역학적 시스템이 본 발명에 따른 적절한 키티나아제 유사 분자 억제제를 투여하는데 사용될 수 있다.
관심 질환을 치료 및/또는 예방하기에 효능적으로 유용한 화합물이 제형되고본원에 기재된 질환의 치료를 위해서 포유동물에게 투여될 수 있는 바와 같은, 본원에서 기재된 어떠한 방법을 사용함으로써 동정된 화합물이 본원에서 기재된다.
본 발명은 활성 성분으로 본원에서 개시된 질환의 치료에 유용한 화합물을 포함하는 약제학적 조성물의 제조 및 사용을 포함한다. 그러한 약제학적 조성물은 대상자에게 투여하기에 적합한 형태로 활성 성분 단독으로 구성되거나, 약제학적 조성물은 활성 성분 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 하나 이상의 추가 성분, 또는 이들의 어떠한 조합물을 포함할 수 있다. 활성 성분은 약제학적 조성물에 생리학적으로 허용되는 에스테르 또는 염의 형태로, 예컨대, 생리학적으로 허용되는 양이온 또는 음이온과 함께, 본 기술 분야에 공지된 바와 같이 존재할 수 있다.
본원에서 기재된 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 활성성분이 조합될 수 있고, 조합 후에, 대상자에게 활성성분을 투여하는데 사용될 수 있는 화학적 조성물을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "생리학적으로 허용되는" 에스테르 또는 염은 조성물이 투여되는 대상자에게 유해하지 않은 약제학적 조성물의 어떠한 다른 성분과 조화될 수 있는 활성 성분의 에스테르 또는 염 형태를 의미한다.
본원에 기재된 약제학적 조성물의 제형은 약리학 분야에서 공지되었거나 장래 개발될 어떠한 방법에 의해서 제조될 수 있다. 일반적으로, 그러한 제조 방법은 활성 성분을 담체 또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 관련시키고, 이어서, 필요하거나 바람직한 경우, 생성물을 요구되는 단일 또는 다수 용량 단위로 성형 또는 패키징 하는 단계를 포함한다.
본원에 제공된 약제학적 조성물의 설명이 기본적으로 사람에게 윤리적 투여에 적합한 약제학적 조성물에 관련되어 있지만, 당업자라면 그러한 조성물이 일반적으로 모든 종류의 동물에게 투여하기에 적합하다는 것을 이해할 것이다. 조성물을 다양한 동물에게 투여하기에 적합하게 하기 위해서 사람에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물의 변형을 이해할 수 있을 것이며, 통상의 기술을 가진 수의사라면 단지 통상의 실험으로 그러한 변형을 계획하고 수행할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여 대상은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 사람 및 다른 영장류, 소, 돼지, 말, 양, 고양이 및 개와 같은 시판 포유동물을 포함한 포유동물, 및 닭, 오리, 거위, 및 칠면조와 같은 시판 가금류를 포함한 가금류를 포함한다.
본 발명의 방법에 유용한 약제학적 조성물은 경구, 직장, 질, 비경구, 국소, 폐, 비내, 구강내, 정맥내, 안구내, 지주막내 또는 다른 투여경로에 적합한 제형으로 제조되거나, 패키징되거나, 시판될 수 있다. 그 밖의 고려되는 제형은 주입용 나노입자, 리포좀 제제, 활성성분을 함유하는 재봉입된 적혈구 및 면역학적 제형을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단일 용량 단위 또는 다수의 단일 용량 단위로서 대량으로 제조되거나, 패키징되거나, 판매될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "용량 단위"는 소정량의 활성성분을 포함하는 분리된 양의 약제학적 조성물이다. 활성성분의 양은 일반적으로 대상자에게 투여될 수 있는 활성성분의 용량 또는 그러한 용량의 통상적인 분획, 예를 들어, 그러한 용량의 1/2 또는 1/3과 동일하다.
본 발명의 약제학적 조성물중의 활성성분, 약제학적으로 허용되는 담체, 및 어떠한 추가 성분의 상대적인 양은 치료하고자 하는 대상자 그 자체, 크기, 및 상태, 및 조성물이 투여되는 경로에 따라 다양할 것이다. 예를 들어, 조성물은 0.1% 내지 100%(w/w) 활성 성분을 포함할 수 있다.
활성성분에 추가로, 본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 추가의 약제학적 활성제를 포함할 수 있다. 특별히 고려되는 추가의 제제는 구토억제제 및 시안화물과 같은 스캐빈저 및 시안산염 스캐빈저를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물의 조절된 또는 지연된 방출 제형이 통상의 기술을 사용함으로써 제조될 수 있다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 조성물의 제형은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 소정량의 활성성분을 함유하는 정제, 경질 또는 연질 캡슐, 교갑, 트로키제, 또는 로젠지를 포함한 분리된 고체 용량 단위의 형태로 제조되거나, 패키징되거나, 판매될 수 있다. 경구 투여에 적합한 다른 제형은, 이로 제한되는 것은 아니지만, 분말 또는 과립 제형, 수성 또는 유성 현탁액, 수성 또는 유성 용액, 또는 에멀션을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "유성" 액체는 탄소 함유 액체 분자를 포함하며 물 보다 덜 극성인 액체이다.
활성성분을 포함하는 정제는, 예를 들어, 활성성분을, 임의로 하나 이상의 추가성분과 함께 타정 또는 성형함으로써 제조될 수 있다. 타정된 정제는 하나 이상의 결합제, 윤활제, 부형제, 표면활성제, 및 분산제와 임의로 혼합된 분말 또는과립 제제와 같은 유동형의 활성성분을 적합한 장치에서 타정함으로써 제조될 수 있다. 성형된 정제는 활성성분, 약제학적으로 허용되는 담체, 혼합물을 적시는 충분한 액체의 혼합물을 적합한 장치에서 성형함으로써 제조될 수 있다. 정제의 제조에 사용된 약제학적으로 허용되는 부형제는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 불활성 희석제, 과립화제 및 붕해제, 결합제, 및 윤활제를 포함한다. 공지된 분산제는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 감자 전분 및 나트륨 전분 글리콜레이트를 포함한다. 공지된 표면활성제는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 나트륨 라우릴 술페이트를 포함한다. 공지된 희석제는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토오즈, 미세결정상 셀룰로오즈, 인산칼슘, 인산수소칼슘, 및 인산나트륨을 포함한다. 공지된 과립화 및 붕해제는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 옥수수 전분 및 알긴산을 포함한다. 공지된 결합제는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 젤라틴, 아카시아, 선-젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈, 및 히드록시프로필 메틸셀룰로오즈를 포함한다. 공지된 윤활제는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 실리카 및 탈그를 포함한다.
정제는 피복되지 않거나, 공지된 방법으로 피복되어 대상자의 위장관내에서 붕해가 지연됨으로써, 활성성분의 방출이 지연되어 흡수될 수 있다. 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 물질이 정제를 피복하는데 사용될 수 있다. 추가로 예를 들어, 정제는 미국특허 제4,256,108호; 제4,160,452호; 및 제4,265,874호에 기재된 방법을 이용함으로써 피복되어 삼투적으로 조절된 방출 정제를 형성시킬 수 있다. 정제는 또한 약제학적으로 우수하며맛있는 제제가 형성되도록 감미제, 착향제, 착색제, 보존제, 또는 이들의 어떠한 조합물을 포함할 수 있다.
활성성분을 포함하는 경질 젤라틴은 젤라틴과 같은 생리학적으로 분해 가능한 조성물을 사용함으로써 제조될 수 있다. 그러한 경질 젤라틴은 활성성분을 포함하며, 예를 들어, 불활성 고체 담체, 예컨대, 탄산칼슘, 인산칼슘, 또는 카올린을 포함한 추가의 성분을 포함할 수 있다.
활성성분을 포함하는 연질 젤라틴 캡슐은 생리학적으로 분해 가능한 조성물, 예컨대, 젤라틴을 사용함으로써 제조될 수 있다. 그러한 연질 캡슐은 물 또는 오일 매질, 예컨대, 땅콩유, 액체 파라핀, 또는 올리브 오일과 혼합될 수 있는 활성성분을 포함한다.
경구투여에 적합한 본 발명의 약제학적 조성물의 액체 제형은 사용전에 물 또는 다른 적합한 비히클과 재구성되는 액체 형태 또는 건조 생성물 형태로 제조되고, 패키징되고, 시판될 수 있다.
액체 현탁액은 수성 또는 유성 비히클에 활성성분을 현탁시키는 통상의 방법을 이용함으로써 제조될 수 있다. 수성 비히클은, 예를 들어, 물 및 등장성 염수를 포함한다. 유성 비히클은, 예를 들어, 아몬드 오일, 유성 에스테르, 에틸 알콜, 식물성 오일, 예컨대, 아라키스(arachis), 올리브, 참깨, 또는 코코넛 오일, 분별된 식물성 오일, 및 무기 오일, 예컨대, 액체 파라핀을 포함한다. 액체 현탁액은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 현탁제, 분산제 또는 습윤화제, 에멀션화제, 진통제, 보존제, 완충제, 염, 착향제, 착색제, 및 감미제를 포함한 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 유성 현탁액은 농후화제를 추가로 포함할 수 있다. 공지된 현탁제는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 소르비톨 시럽, 수소화된 식용 지방, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검, 아카시아 검, 및 셀룰로오즈 유도체, 예컨대, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈, 메틸셀룰로오즈, 및 히드록시프로필메틸셀룰로오즈를 포함한다. 공지된 분산제 또는 습윤화제는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 천연 포스페이티드, 예컨대, 레시틴, 알킬렌 옥시드와 지방산, 장쇄 지방족 알콜, 지방산과 헥시톨로부터 유도된 부분 에스테르, 또는 지방산과 헥시톨 무수물(예, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 헵타데카에틸렌옥시세타놀, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레이트, 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트)로부터 유도된 부분 에스테르의 축합 생성물을 포함한다. 공지된 에멀션화제는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 레시틴 및 아카시아를 포함한다. 공지된 보존제는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 메틸, 에틸, 또는 n-프로필-파라-히드록시벤조에이트, 아스코르빈산, 및 소르빈산을 포함한다. 공지된 감미제는, 예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 수크로스 및 사카린을 포함한다. 유성 현탁제에 사용하기 위한 공지된 농후화제는, 예를 들어, 밀납, 경질 파라핀, 및 세틸 알콜을 포함한다.
수성 또는 유성 용매중의 활성성분의 액체 용액은 액체 현탁액과 실질적으로 동일한 방법으로 제조될 수 있는데, 일차적인 차이는 활성성분이 용매에 현탁되는 것이 아니라 용해되는 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물의 액체 용액은 액체 현탁액과 관련하여 기재된 성분 각각을 포함할 수 있는데, 현탁제는 용매중의 활성성분의 용해에 필요가 없다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 수성 용매는, 예를 들어, 물 및 등장성 염수를 포함한다. 유성 용매는, 예를 들어, 아몬드 오일, 유성 에스테르, 에틸 알콜, 식물성 오일, 예컨대, 아라키스, 올리브, 참깨, 또는 코코넛 오일, 분별된 식물성 오일, 및 무기 오일, 예컨대, 액체 파라핀을 포함한다.
본 발명의 약제학적 제제의 분말형 및 과립형 제형은 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 그러한 제형은 대상자에게 직접 투여되거나, 예를 들어, 정제를 형성시키거나, 캡슐을 충진시키거나, 수성 또는 유성 비히클을 첨가함으로써 수성 또는 유성 현탁액 또는 용액을 제조하는데 사용될 수 있다. 이들 제형 각각은 하나 이상의 분산제, 또는 습윤화제, 현탁제, 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 추가의 부형제, 예컨대, 충진제 및 감미제, 착향제, 또는 착색제가 또한 이들 제형에 포함될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 수중유 에멀션 또는 유중수 에멀션의 형태로 제조되거나, 패키징되거나, 판매될 수 있다. 유성상은 식물성 오일, 예컨대, 올리브 또는 아라키스 오일, 무기 오일, 예컨대, 액체 파라핀, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 그러한 조성물은 하나 이상의 에멀션화제, 예컨대, 천연 검, 예컨대, 아카시아 검 또는 트라가칸트 검, 천연 포스파디트, 예컨대, 대두, 또는 레시틴 포스파티드, 지방산과 헥시톨 무수물, 예컨대, 소르비탄 모노스테아레이트의 조합으로부터 유도된 에스테르 또는 부분 에스테르, 및 상기 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드, 예컨대, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트의 축합 생성물을 추가로 포함한다. 이들 에멀션은 또한, 예를 들어, 감미제 또는 착향제를 포함한 추가의 성분을 함유할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 직장 투여에 적합한 제형으로 제조되거나, 패키징되거나, 판매될 수 있다. 그러한 조성물은, 예를 들어, 좌제, 보유 관장 제제, 및 직장 또는 결장 세척을 위한 용액의 형태일 수 있다.
좌제 제형은 활성성분을 실온(즉, 약 20℃)에서 고체이며 대상자의 직장 온도(즉, 건강한 사람의 경우 약 37℃)에서 액체인 비자극성의 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 부형제는, 예를 들어, 이로 한정되는 것은 아니지만, 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 및 다양한 글리세라이드를 포함한다. 좌제 제형은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 항산화제 및 보존제를 포함한 다양한 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다.
직장 또는 결장 세척을 위한 보유 관장 제제 또는 용액은 활성성분을 약제학적으로 허용되는 액체 담체와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 본 기술분야에 공지된 바와 같이, 관장 제제는 대상자 직장의 해부학적 구조에 적합한 전달 장치를 사용함으로써 투여되며 그 장치 내에 패키징될 수 있다. 관장 제제는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 항산화제 및 보존제를 포함한 다양한 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 질내 투여에 적합한 제형으로 제조되거나, 패키징되거나, 판매될 수 있다. 그러한 조성물은, 예를 들어, 좌제, 함침되거나 피복된 질내 삽입 가능한 재료, 예컨대, 탐폰, 두쉬(douche) 제제, 또는 젤 또는 크림 또는 질 세척용 용액의 형태일 수 있다.
재료를 화학적 조성물로 함침시키거나 피복하는 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 이로 한정되는 것은 아니지만, 화학적 조성물을 표면상에 침착 또는 결합시키는 방법, 화학적 조성물을 재료의 합성 동안 재료(즉, 생리학적으로 분해 가능한 재료)의 구조내로 혼입시키는 방법, 및 후속되는 건조와 함께 또는 그러한 건조 없이, 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액을 흡수 물질내로 흡수시키는 방법을 포함한다.
질 세척용 두쉬 제제 또는 용액은 활성성분을 약제학적으로 허용되는 액체 담체와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 본 기술 분야에 공지된 바와 같이, 두쉬 제제는 대상자 질의 해부학적 구조에 적합한 전달 장치를 사용함으로써 투여되거나, 그러한 장치내에 패키징될 수 있다. 두쉬 제제는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 항산화제, 항생제, 항균제, 및 보존제를 포함한 다양한 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어, 약제학적 조성물의 "비경구 투여"는 대상자의 조직의 물리적인 침습에 의해서 특정되는 어떠한 투여 경로 및 조직내의 침습을 통한 약제학적 조성물의 투여를 포함한다. 비경구 투여는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 조성물의 주사, 수술에 의한 조성물을 적용, 및 조직-투과 비수술적 상처 등을 통한 조성물의 적용에 의한 약제학적 조성물의 투여를 포함한다. 특히, 비경구 투여는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 피하, 복강내, 정맥내, 근육내, 대조내 주사(intracisternal injection), 및 신장 투석 주입 기술을 포함하는 것으로 고려된다.
비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물의 제형은 약제학적으로 허용되는 담체, 예컨대, 무균수 또는 무균의 등장성 염수와 혼합된 활성성분을 포함한다. 그러한 제형은 일시 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조되거나, 패키징되거나, 판매될 수 있다. 주사 가능한 제형은 단위 용량형, 예컨대, 보존제를 함유하는 앰플 또는 다수 용량 용기내에 제조되거나, 패키징되거나, 판매될 수 있다. 비경구 투여용 제형은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 유성 또는 수성 비히클중의 현탁액, 용액, 에멀션, 페이스트, 이식 가능한 지연 방출 또는 생분해 가능한 제형을 포함한다. 그러한 제형은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 현탁제, 안정화제, 또는 분산제를 포함한 하나 이상의 추가의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형의 한 가지 구체예에서, 활성성분은 비경구 투여 전에 적합한 비히클(예, 발열물질이 없는 무균수)과의 재구성을 위한 건조 형태(즉, 분말 또는 과립)로 제공된다.
약제학적 조성물은 무균의 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액 또는 용액의 형태로 제조되거나, 패키징되거나, 판매될 수 있다. 이러한 현탁액 또는 용액은 공지된 기술에 따라서 제형될 수 있으며, 활성성분에 추가로, 추가의 성분, 예컨대, 본원에 기재된 분산제, 습윤화제, 또는 현탁제를 포함할 수 있다. 그러한 무균의 주사 가능한 제형은 비독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매, 에컨대, 물 또는 1,3-부탄디올을 사용함으로써 제조될 수 있다. 그 밖의 적합한 희석제 및 용매는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 링거용액(Ringer's solution), 등장성 염화나트륨 용액, 및 비휘발성 오일, 예컨대, 합성 모노- 또는 디-글리세라이드를 포함한다. 유용한 그 밖의 비경구 투여 가능한 제형은 미세결정상 형태로, 리포좀 제제로, 또는 생분해 가능한 폴리머 시스템의 성분으로서 활성성분을 포함하는 제제를 포함한다. 지연된 방출 또는 이식용 조성물은 약제학적으로 적합한 폴리머 또는 소수성 물질, 예컨대, 에멀션, 이온교환수지, 거의 불용성의 폴리머, 또는 거의 불용성의 염을 포함할 수 있다.
국소 투여에 적합한 제형은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 액체 또는 반액체 제제, 예컨대, 바르는 약(liniment), 로션, 수중유 또는 유중수 에멀션, 예컨대, 크림, 연고 또는 페이스트, 및 용액 또는 현탁액을 포함한다. 국소 투여 가능한 제제는, 예를 들어, 약 1% 내지 약 10%(w/w)의 활성성분을 포함하지만, 활성성분의 농도는 용매중의 활성성분의 용해도 한계까지 높을 수 있다. 국소 투여용 제형은 본원에 기재된 하나 이상의 추가의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 구강을 통한 폐 투여에 적합한 제형으로 제조되거나, 패키징되거나, 판매될 수 있다. 그러한 제형은 활성성분을 포함하며, 직경이 약 0.5 내지 약 7 나노메터, 바람직하게는, 약 1 내지 약 6 나노메터인 건조 입자를 포함할 수 있다. 그러한 조성물은 통상적으로는 추진체 스트림이 유도되어 건조 분말을 분산시키는 건조 분말 저장기를 포함한 장치, 또는 자체 추진 용매/분말-분산 용기, 예컨대, 밀봉된 용기내에 저비점 추진체에 용해되거나 현탁된 활성성분을 포함하는 장치를 사용함으로써 투여되는 건조 분말의 형태이다. 바람직하게는, 그러한 분말은 95중량% 이상의 입자가 직경이 0.5 나노메터 이상이며, 95수% 이상의 입자가 직경이 7나노메터 미만인 입자를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 95중량% 이상의 입자가 직경이 1 나노메터 초과이고, 90수% 이상의 입자가 직경이 6 나노메터 미만이다. 건조 분말 조성물은, 바람직하게는, 설탕과 같은 고체의 미세 분말 희석제를 포함하며, 통상적으로 단위 용량형으로 제공된다.
저비점 추진체는, 일반적으로는 대기압 하에 65℉ 미만의 비점을 지니는 액체 추진체를 포함한다. 일반적으로는, 추진체는 조성물의 50 내지 99.9%(w/w)를 구성하며, 활성성분이 조성물의 0.1 내지 20%(w/w)를 구성할 수 있다. 추진체는 추가의 성분, 예컨대, 액체 비이온성 또는 고체 음이온성 계면활성제 또는 고체 희석제(바람직하게는, 활성성분을 포함하는 입자와 동일한 입자 크기를 지님)를 추가로 포함할 수 있다.
폐 전달을 위해 제형된 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 용액 또는 현탁액의 적하제의 형태로 활성성분을 제공할 수 있다. 그러한 제형은 활성성분을 포함하는 임의로 무균인 수성 또는 묽은 알콜 용액 또는 현탁액으로 제조되거나, 패키징되거나, 판매될 수 있으며, 통상적으로는 분무 또는 분사 장치를 사용함으로써 투여될 수 있다. 그러한 제형은, 이로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 착향제, 예컨대, 사카린 나트륨, 휘발성 오일, 완충제, 표면활성제, 또는 보존제, 예컨대, 메틸히드록시벤조에이트를 포함한 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 투여 경로에 의해서 제공된 적하제는 바람직하게는 약 0.1 내지 약 200나노메터의 평균 직경을 지닌다.
폐 전달에 유용한 본원에 기재된 제형은 본 발명의 약제학적 조성물의 비내 전달에 유용하다.
비내 투여에 적합한 다른 제형은 활성성분을 포함하며 약 0.2 내지 500 마이크로메터의 평균 입자를 지니는 조잡한 분말이다. 그러한 제형은 스너프(snuff)에 의한 방법, 즉, 콧구멍에 근접 고정된 분말의 용기로부터 코로 통과시키는 신속한 흡입에 의한 방법으로 투여된다.
비 투여에 적합한 제형은 예를 들어, 약 0.1%(w/w) 내지 100%(w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있으며, 추가로 본원에 설명된 하나 이상의 부가 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 약제 조성물은 구강 투여에 적합한 제형으로 제조되고, 패키징되거나 판매될 수 있다. 이러한 제형은 예를 들어, 통상적인 방법으로 제조된 정제 또는 로젠지 형태일 수 있으며, 예를 들어, 0.1 내지 20%(w/w)의 활성 성분을 함유할 수 있으며, 나머지는 경구적으로 용해가능하거나 분해가능한 조성물, 및 선택적으로 본원에 설명된 하나 이상의 부가 성분을 포함한다. 대안적으로, 경구 투여에 적합한 제형은 활성 성분을 포함하는 분말, 에어로졸화되거나 분무되는 용액 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 이러한 분말화되거나, 에어로졸화되거나 분무되는 제형이 분산되는 경우, 바람직하게는 평균 입자 또는 소적 크기가 약 0.1 내지 약 200 나노미터이며, 추가로 본원에 설명된 하나 이상의 부가 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 약제 조성물은 안구 투여에 적합한 제형으로 제조되거나, 패키징되거나 판매될 수 있다. 이러한 제형은 예를 들어, 수성 또는 유성 액체 담체중의 0.1 내지 1.0%(w/w)의 활성 성분 용액 또는 현탁액을 포함하는 점안약의 형태일 수 있다. 이러한 점안약은 추가로 완충제, 염, 또는 본원에 설명된 하나 이상의 부가성분을 포함할 수 있다. 안구로 투여가능한 유용한 기타 제형은 결정섬유소형 또는 리포좀성 제조물중의 활성 성분을 포함하는 제형을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "부가 성분"은 하나 이상의 하기 성분을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 부형제; 표면 활성제; 분산제; 불활성 희석제; 과립화제 및 분해제; 결합제; 윤활제; 감미제; 방향제; 착색제; 방부제; 생리학적으로 분해가능한 조성물 예컨대, 젤라틴; 수성 비히클 및 용매; 유성 비히클 및 용매; 현탁제; 분산제 또는 습윤제; 에멀션화제, 진통제; 완충제; 염; 증점제; 충전제; 에멀션화제; 항산화제; 항생제; 항진균제; 안정화제; 및 약제학적으로 허용되는 중합성 또는 소수성 물질. 본 발명의 약제 조성물중에 포함될 수 있는 기타 "부가 성분"은 당해분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 본원에 참고 문헌으로 인용된 문헌[Genaro, ed., 1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA]에 기재되어 있다.
동물 바람직하게는, 사람에 투여될 수 있는 본 발명의 화합물의 통상적인 투여량은 동물 체중 kg 당 약 0.01mg 내지 약 100g이다. 투여되는 정확한 용량은 동물의 종류, 치료할 질환 상태, 동물의 연령 및 투여 경로를 포함하나, 이에 제한되지 않는 많은 인자에 따라 변할 것이다. 바람직하게는, 화합물의 투여량은 동물 체중 kg 당 약 1mg 내지 약 100mg으로 변할 것이다. 더욱 바람직하게는, 용량은 동물의 체중 kg 당 약 1㎍ 내지 약 1g으로 변할 것이다. 화합물은 하루에 수회에 걸쳐 빈번히 동물에 투여될 수 있거나, 1일 1회, 1주에 1회, 매 2주당 1회, 한달에 1회씩 덜 빈번하게, 또는 몇달에 1회 또는 1년에 1회 또는 그 미만과 같이 더욱 덜빈번하게 투여될 수 있다. 투여 빈도는 당업자에게 자명할 것이며, 치료할 질환의 유형 및 중증 정도, 동물의 유형 및 연령 등(여기에 제한되는 것은 아님)과 같은 여러 인자에 의존적일 것이다.
E. 유용한 화합물을 확인하는 방법
본 방법은 염증성 질환을 치료하는 화합물 또는 중간물을 확인하는 방법을 포함한다. 당업자는 본원에 제공된 사항을 기초로 하여, 키티나아제 유사 분자의 발현 및/또는 활성 평가가 무엇보다도 세포 또는 조직중에서 키티나아제 유사 분자 또는 이를 코드화하는 mRNA의 수준 등을 평가하고, 그 후 이 수준을 본 화합물이 투여되지 않는 동일한 세포 또는 조직에서의 수준과 비교하므로써 수행될 수 있음을 인식할 수 있을 것이다. 대안적으로, 화합물과 접촉된 세포 또는 조직내의 키티나아제 유사 분자 또는 이를 코드화하는 mRNA의 수준을 화합물이 투여되기 전의 세포 또는 조직중의 키티나아제 유사 분자 또는 이의 mRNA 수준과 비교할 수 있다. 당업자는 이러한 화합물이 염증성 질환을 치료하고/거나 예방하고, IL-13 매개된 염증성 질환을 치료하고 예방하고/거나 Th2 염증 반응과 관련되고/거나 이에 매개된 질환을 치료하는데 유용한 치료제일 수 있음을 이해할 것이다.
당업자에게는 추가로 키나아제형 분자를 억제하는데 유용한 화합물을 확인하는 방법이 화합물을 세포, 조직 또는 동물에 투여하는 방법을 포함한다는 것이 자명할 것이다. 즉, 본원의 내용이 제공되는 경우, 당업자는 본원에 기재된 교시 내용이 키티나아제 유사 분자를 발현하는 세포 또는 조직에서 키티나아제 유사 분자를 억제하는데 유용한 화합물을 확인하는데 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 이러한 세포 및 조직은 당해분야에 널리 공지되어 있으며, 변형된 발현 IL-13, IL-4, 및/또는 키티나아제 유사 분자를 갖는 사람 이외의 트랜스제닉 동물, 또는 염증성 질환을 갖는 트랜스제닉 동물로부터 유도된 세포 및 조직, 및/또는 이들로부터 유도된 세포 또는 조직을 포함한다.
또한, 키티나아제 유사 분자를 발현하는 세포 또는 조직은 화합물과 접촉되고, 키티나아제 유사 분자의 수준이 평가되고, 화합물이 투여되기 전의 세포 및/또는 조직중의 키티나아제 유사 분자의 수준과 비교할 수 있다. 또한, 키티나아제 유사 분자의 수준을 화합물이 투여되지 않는 동일한 세포 또는 조직중의 키티나아제 유사 분자의 수준과 비교할 수 있다.
본원에 제공된 사항을 기초로 하여, 당업자에게는 세포 또는 조직이 내인성 키티나아제 유사 분자를 발현할 수 있으며, 추가로 본 발명이 변형되어 다른 조직에서는 발현하지 않는 키티나아제 유사 분자를 발현시키는 세포 또는 조직을 포함한다는 것이 자명하며, 예를 들어, 관심있는 키티나아제 유사 분자를 코드화하는 핵산을 통상적으로 이들이 발현되지 않는 세포 또는 조직내로 유입시켜 발현시키거나, 핵산이 세포 또는 조직으로 도입시킨 후, 상이한 수준으로 발현시키는 것이 자명하다. 이와 같이, 본 발명은 세포, 조직 또는 동물을 포함하는 과다 검정법(wide plethora of assay)을 포함하며, 여기서 키티나아제 유사 분자의 수분은 화합물의 존재 또는 부재하에 평가될 수 있다. 따라서, 당업자는 본원에 기재된 방법을 사용하여 화합물을 확인하고, 당해분야에 공지된 세포 배양 및 세포 증식법을 사용하여 키티나아제 유사 분자의 수준에 영향을 끼치는 화합물의 능력을평가할 수 있을 것이다.
당업자는 본원에 제공된 사항을 기초로 하여, 본 발명이 포유동물의 염증성 질환을 치료하는데 유용한 화합물을 확인하는 방법을 포함한다는 것을 숙지할 것이다. 본원의 기법이 당업자에게 제공되는 경우, 당업자는 본 방법이 세포 또는 조직에서 염증성 질환을 치료하는 화합물을 확인하는 것을 포함한다는 것을 알 수 있을 것이다. 상기 방법은 포유동물(이들의 세포 또는 조직을 포함), 바람직하게는 호흡기에서 키티나아제 유사 분자의 발현 및/또는 활성을 억제하는 물질 또는 화합물을 확인하는 것을 포함한다. 이는 본원에 설명된 바와 같이, 키티나아제 유사 분자의 발현 또는 활성의 억제가 치료학적 이점을 제공하여, 키티나아제 유사 분자의 증가된 발현 또는 활성과 관련되거나 이에 매개되는 염증성 질환을 치료하거나 예방한다는 것을 데이타가 입증하고 있기 때문이다. 이는 본 발명이 처음으로, 증가된 수준의 키티나아제 유사 분자가 이러한 질환과 관련되거나 매개되어 있고, 키티나아제 유사 분자 억제제(예를 들어, 알로사미딘, 키티나아제 유사 분자에 대한 특이적 항체, 예컨대, 여기에 제한되는 것은 아니지만, AMCase와 특이적으로 결합하는 항체)를 사용하여 키티나아제 유사 분자(예를 들어, YM, AMCase 등)를 억제하는 것이 이러한 질환을 예방하고/거나 치료한다는 것을 발견하였기 때문이다.
이와 같이, 본 발명의 교시 내용을 숙지한 당업자에게는 키티나아제 유사 분자를 억제하는 화합물이 염증성 질환을 치료하거나 예방하는 효능있는 치료제이며, 이러한 화합물의 확인은 이러한 질환에 대한 잠재적인 치료제를 확인하는 것임이 자명할 것이다.
본 방법은 염증성 질환을 갖는 포유동물에 화합물을 투여하고, 화합물 투여 전 및 후에 포유동물의 키티나아제 유사 분자의 수준을 비교하는 것을 포함한다. 작업자(routineer)는 본원에 제공된 내용을 기초로 하여, 화합물 투여전의 키티나아제 유사 분자 또는 이의 mRNA의 수준과 비교하여, 화합물 투여 후 포유동물에서의 키티나아제 유사 분자 또는 이를 코드화하는 mRNA의 더 낮은 수준은, 이 화합물이 포유동물의 염증성 질환을 치료하는데 유용하다는 것을 나타내는 것임을 알 것이다.
이는 본원에서 이전에 언급된 바와 같이, 동물에서 키티나아제 유사 분자의 억제가 증가된 키티나아제 유사 분자 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 예를 들어, 증진된 조직 리모델링 및 섬유증을 수반한 염증성 질환을 치료하거나 예방한다는 것이 밝혀졌기 때문이다. 당업자에게는 또한, 본원에 제공된 사항에 있어서, 포유동물의 세포 또는 조직을 포함하여, 포유동물에서 키티나아제 유사 분자의 수준을 측정하는 검정법이 당해분야에 널리 공지된 검정법, 또는 앞으로 개발된 검정법을 포함하며, 이들 모두는 화합물의 투여 전 및 후의 포유동물( 또는 이들의 세포 또는 조직)에서 키티나아제 유사 분자의 수준을 평가하는데 사용될 수 있다는 것이 자명할 것이다. 당업자에게는 추가로, 본원에 기재된 바와 같이 키티나아제 유사 분자의 수준이 키티나아제 유사 분자의 활성 수준 및 키티나아제 유사 분자의 발현 수준을 포함한다는 것이 자명할 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 방법을 사용하여 확인된 화합물을 포함한다.
본 발명은 추가로, 키티나아제 유사 분자를 억제하여, 포유동물에서 염증성질환에 유용한 화합물을 확인하는 방법을 포함한다. 더욱 상세하게는, 이러한 방법은, 화합물이 투여되지 않은 포유동물(또는 이들의 세포 또는 조직)과 비교하여 화합물이 투여된 동일한 포유동물(또는 이들의 세포 또는 조직)에서의 키티나아제 유사 분자의 발현, 생성 또는 활성의 수준을 평가하는 것을 포함한다. 또한, 이러한 방법은 관심있는 화합물의 투여 전 및 후에, 동일한 포유동물, 이들의 세포 또는 조직에서 키티나아제 유사 분자의 수준을 비교하는 것을 포함한다. 화합물이 투여되지 않은 동일한 포유동물 또는 화합물이 투여되기 전의 똑같은 포유동물과 비교할 경우, 화합물이 투여된 포유동물에서의 키티나아제 유사 분자 발현, 생성 또는 활성의 더 낮은 수준은 화합물이 키티나아제 유사 분자를 억제하는데 유용하며, 따라서 포유동물에서 염증성 질환을 치료하고/거나 예방하는데 유용한 잠재적인 치료제라는 것을 암시한다. 이는, 본 발명이 처음으로, 키티나아제 유사 분자가 염증성 질환의 상태에서 명백한 역할을 하고 있으며, 키티나아제 유사 분자의 억제로 인해 염증성 질환을 갖는 공지된 동물 모델에서 질환을 치료하고/거나 예방한다는 것을 밝혀냈기 때문이다. 본원에서 입증된 바와 같이, 분명히, 키티나아제 유사 분자를 억제하는 화합물은 본원에 기재된 데이타에 의해 입증된 바와 같이 염증성 질환의 치료 및 예방에 유용한 중요한 치료학적 화합물이다.
본원에 더욱 상세히 설명된 바와 같이, 많은 염증성 질환의 병리는 감염된 세포 또는 조직에서 IL-13의 발현에 의해 매개된다. 또한, 본원을 숙지한 당업자에게는 자명한 바와 같이, IL-13 매개된 염증성 질환의 병리는 부분적으로는 감염된 세포, 기관 또는 시스템에서 키티나아제 유사 분자의 발현으로 인한 것이다.상기 상세히 설명된 방법은 본원에 기재된 방법을 사용하여 키티나아제 유사 분자의 수준이 용이하게 평가될 수 있는 포유동물을 포함한다. 이와 같이, 본 발명은 염증성 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있는 화합물을 확인하는데 유용한 포유동물을 포함한다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 호흡기에서 IL-13을 구성적으로 또는 유도가능하게 발현하는 트랜스제닉 동물을 포함한다. 본원에 제공된 내용을 기초로 하여, 화합물이 투여될 경우, 이러한 트랜스제닉 포유동물은, 검정법이 키티나아제 유사 분자 발현에 대한 것이든 또는 키티나아제 유사 분자 활성에 대한 것이든 키티나아제 유사 분자의 수준에 대해 용이하게 검정될 수 있다. 화합물이 키티나아제 유사 분자를 억제하는지의 여부를 평가하기 위해 사람 이외의 트랜스제닉 포유동물을 사용하여 염증성 질환을 치료하고/거나 예방하는데 유용한 화합물을 확인하는 이러한 방법은 본 발명에 포함된다.
Ⅱ. 키트
본 발명은 본원에 설명된 바와 같이, 키티나아제 유사 분자의 억제가 포유동물에서 염증성 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하기 때문에 포유동물에서의 키티나아제 유사 분자의 억제와 관련된 유용한 다양한 키트를 포함한다. 이와 같이, 한 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 염증성 질환을 치료하기 위한 키트를 포함한다. 키트는 추가로, 어플리케이터(applicator) 및 본원에 제공된 기법에 따라 사용되는 사용 지시서를 포함한다.
본 발명은 화합물, 예컨대 키티나아제 유사 분자와 특이적으로 결합하는 항체 및 이러한 항체를 코드화하는 핵산, 키티나아제 유사 분자를 코드화하는 핵산에상보적이며, 전사와 관련하여 안티센스 배향을 띠는 핵산, 단일 가닥 키티나아제 유사 분자 RNA를 절단할 수 있는 리보자임, 어플리케이터, 및 본 발명의 방법을 수행하기 위해 본 화합물의 용도를 설명한 설명서를 포함하는 다양한 키트를 포함한다. 예시적인 키트가 하기에 설명되어 있지만, 기타 유용한 키트의 내용물은 본 발명의 견지에 있어서 당업자에게 자명할 것이다. 이들 키트 각각은 본 발명내에 포함된다.
한 양태에서, 본 발명은 염증성 질환 및 IL-13에 의해 매개된 염증성 질환을 치료하거나 예방하는 키트를 포함한다. 키트는 본원에 설명된 방법에 따라 사용된다. 간단하게는, 키트는 키티나아제 유사 분자를 억제시키는 화학적 화합물, 또는 키티나아제 유사 분자를 코드화하는 핵산에 상보적인 핵산(여기서, 핵산은 전사와 관련하여 안티센스 배향되어 키티나아제 유사 분자의 발현을 감소시킴), 키티나아제 유사 분자와 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이러한 항체를 코드화하는 핵산과 포유동물을 접촉시키는데 사용될 수 있으며, 키티나아제 유사 분자의 감소된 발현, 양 또는 활성은 포유동물에서 이로운 영향을 매개시킨다. 게다가, 키트는 어플리케이터 및 키트 사용 설명서를 포함한다. 이러한 사용 설명서에는 본원에 제공된 예를 수록하였다.
키트는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 조성물은 본원에 언급된 바와 같이 적당량으로 제공된다. 또한, 투여 경로 및 투여 빈번도는 본원에 이미 설명된 바와 같다.
본 발명을 하기 실시예와 관련하에 설명하겠다. 이러한 실시예는 단지 설명을 위해 제공되 것이며, 본 발명이 어떤 식으로든 이러한 실시예로 제한되어서는 안되며, 본원에 제공된 교시의 결과로서의 증거가 되는 다양한 변형을 포함하도록 구성되어야 한다.
이러한 실시예에 제공된 구체예에 사용된 재료 및 방법이 설명될 것이다.
재료 및 방법
트랜스제닉 마우스의 생성: CC10-IL-13 구성물을 사용하여 허파 조직 특이적 IL-13을 구성적으로 발현하는 트랜스제닉 마우스를 생성시켰다. 상기 구성물은 클라라(Clara) 세포 10 kDa 단백질(CC10) 프로모터, 뮤린 IL-13 cDNA, 역 테트라사이클린 트랜스액티베이터(rtTA), 및 사람 성장 호르몬 인트론 및 폴리아데닐화 서열(hGH)을 포함하는 구성물을 문헌[Zhu et al. 1999, J.Clin.Invest. 103:779-788]에 설명된 바와 같이 제조하였다. 표준 수정란 주입을 문헌[Hogan et al. 1986, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York]에 설명된 바와 같이 수행하였다. 생성된 마우스를 스크리닝하고, 서던 블롯 및 PCR을 이용하여 생성된 동물을 확인하였다. 이러한 마우스를 문헌[Zhu et al. 1999, J.Clin.Invest. 103:779-788]에 설명된 바와 같이 C57BL/6 백그라운드로 만들어 냈다.
외부적으로 조정가능한 트랜스제닉 마우스계 생성물은 두개의 구성물을 포함한다. 문헌[Zheng et al. 2000, J.Clin.Invest. 106:1081-1093]에 설명된 바와 같이 첫 번째 구성물(CC10-rtTA-hGH)은 CC10 프로모터, rtTA 트랜스액티베이터, hGH인트론, 핵 국부화 및 폴리아데닐화 서열을 포함한다. rtTA 융합 단백질은 변이된 tet 오퍼레이터 결합 단백질(tet-OBP) 및 헤르페스바이러스 VP-16 트랜스액티베이터(Gossen et al., 1995, Science 268:1766-1769)를 포함한다. 두 번째 구성물(tet-O-CMV-IL-13)은 중합체성 테트라사이클린 오퍼레이터(tet-O), 최소 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, IL-13 cDNA 및 hGH 인트론, 폴리아데닐화 및 핵 국부화 시그널을 포함하며, 이는 문헌[Ray et al. and Zheng et al. 1997, J.Clin.Invest. 100:2501-2511 and 2000, J.Clin.Invest. 106:1081-1093]에 설명된 바와 같이 제조되었다. 트랜스제닉 마우스를 문헌[Hogan et al., 1986, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cols Spring Harbor, New York]에 설명된 바와 같이 난모세포로의 구성물들의 동시 미세주입에 의해 제조하였다. 4개의 생성된 마우스를 C57BL/6 마우스와 교배시켜 허파에서 발현가능한 IL-13을 갖는 트랜스제닉 마우스를 생성시켰다.
항-AMCase 항체의 생성 및 투여
당해분야에 공지된 방법 및 예를 들어 문헌[Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York]에 설명된 방법을 이용하여 AMCase(ADKADGLYPVADDRNAFWQ; SEQ ID NO:13)로부터 유래된 펩티드로 토끼를 면역화시켜 AMCase에 대한 폴리클로날 항체를 생성시켰다.
야생형 마우스를 OVA에 민감화시키고, 본원에 설명된 바와 같이 연 3일째에 OVA로 자극하였다. 민감하게 된 마우스에 첫번째 에어로졸에 노출시키기 전날부터 출발하여 2틀에 한번씩 복막내로 0.5ml의 항-AMCase 항체 또는 대조군 혈청을 투여하였다.
조직 검정: 마우스를 경부 탈구에 의해 희생시키고, 정중 흉골절개술을 수행하였다. 오른쪽 심장에 칼슐 및 마그네슘 유리 포스페이트 완충 염수(PBS)를 살포하였다. 심장과 폐를 일괄적으로 회수하고, 폐를 중성의 완충된 10% 포르말린으로 25cm 압력으로 고정시켰다. 그 후, 이들을 10% 포르말린중에 밤새 고정시키고, 파라핀에 함침시키고, 5㎛로 섹션하고, 염색하였다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E), 말로리스 트리크롬(Mallory's trichrome), 디아스타아제를 갖는 과요오드산-시프(Schiff)(D-PAS), pH 2.5의 알시안 블루, PAS/알시안 블루, 변형된 콩고 레드(Congo red) 및 파파니코라우(Papanicolau) 염료를 조직 검정에 사용하였다.
히드록시프롤린 검정
히드록시프롤린 함량을 검정하므로써 총 폐 콜라겐을 측정하였다. 간단하게는, 폐를 특정 시간에 채취하고, 티슈 테아러(Tissue Tearor)(PRO-Scientific, Monroe, CT)를 갖는 pH 7.4의 2ml PBS중에 균질화시켰다. 그 후, 1.5밀리리터의 각 샘플(모두 폐)을 120℃에서 8시간 동안 1ml의 6N HCl중에 분해시켰다. 5마이크로리터의 시트레이트/아세테이트 완충제(5% 시트르산, 7.24% 나트륨 아세테이트, 3.4% 수산화나트륨 및 1.2% 결정 아세트산, pH 6.0) 및 100㎕의 클로라민-T 용액(282mg의 클로라민-T, 2ml의 n-프로판올, 2ml의 H2O, 및 16ml의 시트레이트/아세테이트 완충제)을 5㎕의 샘플에 첨가하고, 샘플을 20분 동안 실온하에서 방치하였다. 그 후, 100㎕의 에리히 용액(Ehrlich's solution)(2.5g의 4-(디메틸아미노)벤즈알데히드)(Aldrich, Milwaukee, WI), 9.3ml의 n-프로판올 및 3.9ml의 70% 과염소산(Eastman Kodak, Rochester, NY)을 각각의 샘플에 첨가하고, 샘플을 65℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 10분 동안 냉각시키고, 벡맨(Beckman) DU 640 분광광도게(Fullerton, CA)상에서 550nm에서 해독하였다. 0-10㎍의 히드록시프롤린(Sigm, St.Louis, MO) 농도가 표준 곡성을 구성하는데 사용되었다(Keane et al. J Immunol. 1999, 163:5686-82).
기관지폐포세척(BAL) 및 IL-13 수준의 적량: 마우스를 경추탈골로 치사시키고, 정중 흉골절개술을 수행하였다. 기관을 블런트 디섹션하여 분리하고, 작은 칼리버 배관을 삽입하고, 기도에 고정시켰다. 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)을 갖는 0.75ml의 PBS를 3회 연속하여 적가하고, 완만히 흡입시켜 풀링시켰다. 각각의 BAL 샘플을 원심분리하고, 상청액을 -70℃에서 저장하였다. 혈구계산판을 사용하여 세포 수를 평가하고, 시토스핀 제조물상에서 세포 디퍼련설 카운트(cellular differential count)를 수행하였다. IL-13 수준을 사용 설명서에 따라 통상적인 키트를 사용하여 ELISA에 의해 측정하였다(R&D Systems, Minneapolis, MN).
생리학적 기도 평가 검정: 연령 및 성별이 매치된 한배 새끼를 침입성 및 비침입성 생리학적 평가법에 의해 평가하였다.
비침입성 기법은 제어되지 않으며, 지각이 있는 마우스에서 기도 과민반응(AHR)의 수준 및 베이스라인 기도 저항성을 측정하는데 사용되었다. 즉, 문헌[Hamelmann et al. 1997, Am.J.Resp.Crit.Care Med. 156:766-775, and Klineet al., 1998, J.Immunol. 160:2555-2559]에 설명된 바와 같이 전신 체적기록법(Buxco Electronics Inc., Troy, NY)을 이용한 기압 기도저항측정기(baromatric plethysmography)를 사용하여 동물을 평가하였다. 간단하게는, 마우스를 상이한 압력 변환기를 사용하여 컴퓨터와 인터페이스로 접속된 전신 체적기록기에 위치시켰다. 주기적으로 변동하는 부피, 호흡 속도 및 증가된 포즈(Penh) 측정을 수행하였다. 기도 저항성을 Penh= [(Te/0.3Tr)-1] X [2Pef/3Pif]로 나타내었으며, 여기서, Penh는 증가된 포즈이며, Te는 호기 시간(초)이며, Tr는 이완 시간(초)이며, Pef는 최대 호기 흐름(ml)이며, Pif는 최대 흡기 흐름(ml/s)이다. 메타콜린(Sigma Chemical Company, St.Louis, MO)의 증가된 양을 분무기를 사용하여 120초 동안 투여하고, Penh를 다음 5분에 걸쳐 측정하였다.
침입성 생리학적 평가를 마취되고(펜토바르비탈, 90mg/kg), 기관형성된(18 게이지 안지오카테터) 연령- 및 성별- 매치된 마우스에서 수행하였다. 마우스 폐 부피의 변화를, 인라인 마이크로스위치 압력 변환기를 사용한 플렉시글래스 챔버(Plexiglass chamber)내의 압력을 측정하므로써 기도저항측정법으로 측정하였다. 기도저항측정 및 동물 인공호흡기를 갖는 라인에 위치한 제 2의 마이크로스위치 압력 변환기에 의해 측정된 바와 같은 부피 시그널 및 경폐압간의 차이에 의해 흐름을 측정하였다. 저항성(제거된 기관형성 카테터로 인한 저항성)을 암두르 및 메드(Amdur and Mead, 1958, Am.J.Physiol, 192:364-368)의 방법을 이용하여 측정하였다. 폐 저항성의 베이스라인 측정치는 분당 150 호흡 속도 및 0.4ml의 부피에서 마우스를 환기시키므로써 수득하였다. PBS중의 증가된 농도의 메타콜린을 약 1-3㎛의 입자 직경을 생성시키는 데빌비스 에어로조닉 분무기(Devilbiss Aerosonic nebulizer: Model 5000, Devilbiss Health Care, Somerset, PA)를 사용하여 분무시키므로써 투여하였다. 폐 저항성을 정확히 1분 후에 계산하였다. 베이스라인과 비교하여 폐 저항성이 최소한 2배가 될 때까지 메타콜린의 양을 점차적으로 증가시켜 투여하였다. 모든 동물들은 1 내지 100mg/ml의 메타콜린의 일련의 3배 증가된 양을 수용하였다. 데이타는 PC100(자극도 100)로서 나타내었으며, 이는 선형회귀분석에 의해 계산되 바와 같이 폐 저항성이 100% 베이스라인 위에 위치한 용량을 의미한다.
폐 부피 평가:폐 부피를 문헌[Zheng et al., 2000, J.Clin.Invest, 106:1081-1093]에 설명된 바와 같이 정확히 평가하였다.
독시사이클린 투여: 이식유전자 활성이 요구될 때 까지 모든 유도가능한 이식유전자 마우스에 일반적인 물을 공급하였다. 독시사이클릭(독스:dox)(0.5mg/ml)을 물에 첨가하였다. 독스 함유 물병을 알루미늄 호일로 감싸서 독스가 광분해 되지 않게 하였다.
mRNA 검정: 노던 블롯 및 역-전사효소 폴리머라아제 사슬 반응(RT-PCT)을 사용하여 mRNA 수준을 평가하였다. 총 세포 RNA를 사용 설명서에 따라 트리졸(TRIZOLTM)(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 마우스 조직으로부터 추출하였다. YM에 특이적인 프라이머(YM-1 퍼워드 프라이머: TGGAATTGGTGCCCCTACAA;SEQ ID NO: 1, YM-1 역 프라이머: AACTTGCACTGTGTATATTG; SEQ ID NO:2, YM-2 퍼워드 프라이머: AACCTCAGACAT TCATTA; SEQ ID NO:3, YM-2 역 프라이머: TGGTCCTTCCAGTAGGTAATA; SEQ ID NO:4, YM-3 퍼워드 프라이머: TATAAATCTCCATTTGACAC; SEQ ID NO:5, YM-3 역 프라이머; CCTAATTTATTGTCCTTGAC;SEQ ID NO:6) 및 AMCase에 특이적인 프라이머(AMCase 퍼워드 프라이머: ATCTGCAGTGGACACACCTTCATCCTGA;SEQ ID NO:7, AMCase 역 프라이머; ATGAATTCAACAAGCCCTGCTTGACAAT;SEQ ID NO:8)를 RT-PCR에 사용하여 이들 전사물을 증폭시키고 검출하였다. 역 전사 및 PCR을 사용 설명서에 따라 프로메가(Promega: Madison, WI)로부터의 액세스(Access) RT-PCR 키트를 사용하여 수행하였다.
뮤린 폐의 동일계 하이브리드화: 동일계 하이브리드화를 이용하여 트랜스제닉 동물에서 YM 및 AMCase를 국부화 발현시켰다. 폐 조직을 포름알데히드중에 고정시키고, 파라핀으로 처리하였다. 5 마이크론 섹션을 절단시키고, 파라핀을 제거하고, 프로테이나아제 K(20㎍/ml, 37℃, 20분)로 처리하였다. 그 후, 조직을 실온하에서 0.1M 트리에틸놀라민/0.25% 아세트산 무수물(pH8)로 10분 동안 처리하고, PBS로 린스하였다. YM에 대한 안티센스 및 센스 프로브(YM 안티센스 프로브: TCCTCGAGACCCAGGGTACTGC;SEQ ID NO:9, YM 센스 프로브: TATCTAGAGGATCTTCCTACCAGC;SEQ ID NO:10) 및 AMCase에 대한 안티센스 및 센스 프로브(AMCase 안티센스 프로브: TCGCTCGAGAACAAGCCCTGCTTGACAAT;SEQ ID NO:11, AME아제 센스 프로브:GCTCTAGATGGACACACCTTCATCCTGA;SEQ ID NO:12)를, 다중 클로닝 부위의 측면에 위치한 T3 및 T7 프라이머 서열을 갖는 벡터 pBSⅡ KS로 마우스 AMCasecDNA 또는 YM cDNA 단편을 클로닝시키므로써 생성시켰다(Stratagene, La Jolla, CA). 혼입된 XbaI 및 XhoI 제한 효소 부위를 갖는 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하여 IL-13 이식유전자(+) 마우스의 총 폐 RNA로부터 DNA 단편을 증폭시켰다. RT-PCR 생성물을 XbaI 및 XhoI으로 절단시키고, 벡터 pBSⅡ KS로 클로닝시켰다. 센스 및 안티센스 RNA 프로브를 생성시키고, 디곡시제닌 RNA 라벨링 키트(Roche, Indanapolis, IN)로 라벨링시키고, 65℃에서 변성시키고, 6ng/㎕의 통상적으로 구입가능한 하이브리드화 완충제(Ambion, Austin, TX)에 첨가하고, 하이브리드화 혼합물을 조직과 함께 52℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 그 후, 조직을 실온하에서 5분 동안 실온에서 4 x SSC로 2회, 10분 동안 37℃에서 2 x SSC로 2회 세척하고, 45분 동안 37℃에서 RN아제 A(10㎍/ml)와 인큐베이션시켰다. 그 후, 10분 동안 실온하에서 2 x SSC로 2회 세척하고, 20분 동안 50℃에서 0.2 x SSC로 3회 세척하였다. 제조업자에 의해 설명된 바와 같이 알칼리성 포스페이트(Roche) 및 그 후, 4-니트로블루 테트라졸륨 클로라이드/5-브로모-4-클로로-3-인도일포스페이트로 라벨링된 디곡시제닌에 대한 양(sheep) 항체(Abs)와 밤새 인큐베이션시키므로써 프로브를 검출하였다.
결정 정제 및 검정: 문헌[Gueo et al., 2000, J.Biol.Chem. 275:8031-8037]에 설명된 바와 같은 피콜(ficoll)-구배 세척 공정을 이용하여 결정을 정제하였다. 간단하게는, IL-13 트랜스제닉 마우스로부터 BAL 유체를 1.119g/ml의 밀도를 갖는 히스토파퀴(Histopaque)-1.119g/ml(Sigma, St.Louis, MO)의 상부에 1:5의 비로 로딩하고, 10분 동안 4℃에서 250 x g로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 PBS중에 재현탁시키고, 상기 설명된 바와 같이 2회 더 원심분리하였다. 생성된 펠렛을 SDS-PAGE 샘플 완충액중에 용해시키고, 전기영동 전에 10분 동안 비등시켰다. 트리스-글리신 4-20% 구배 겔(BioRad, Hercules, CA)을 사용하여 환원 조건하에 SDS-폴리아크릴라이드 겔 전기영동을 수행하였다. 단백질 밴드를 콤마시에 블루(Commassie Blue)로 염색하여 가시화시키고, 스칼펠(scalpel)로 절제하고, 겔중의 트립신 분해로 처리하여 질량분석계 검정을 수행하였다. 약 40kDa의 콤마시에 블루 염색된 담백질 밴드를 절제하고, 50mM 암모늄 중탄산염, 50% 아세토니트릴로 30분 동안 세척한 후, 10mM 암모늄 중탄산염, 50% 아세토니트릴로 추가로 30분 동안 세척하였다. 세척 후, 겔 조각을 건조시키고, 15㎕의 10mM 암모늄 중탄산염중의 0.1㎍의 변형된 트립신(Promega, Madison, WI)으로 재수화시켰다. 37℃하에서 24시간 동안 절단을 수행하였다. 매트릭스 지원 레이저 이탈 이온화 질량 분석법(MALDI-MS)을 반사 모드의 마이크로매스 토프스펙 SE 질량분석기(Micromass TofSpec SE mass spectrometer)(Micromass, Beverly, MA)를 사용하여 1.0㎕(<5%)의 다이제스트로 수행하였다. MALDI-MS 전에, 샘플을 1.0㎕의 알파-시아노-4-히드록시 신남산 매트릭스 용액(0.05% 트리플루오로아세트산, 50% 아세토니트를중의 4.5mg/ml)과 1㎕의 내부 삽입물을 혼합하고, 새로운 단일 사용 표적으로 스폿팅하였다. 그 후, 샘플을 실온하에서 공기 건조시켰다. 사용된 내부 삽입물은 50 펨토몰의 브라디키닌(모노이소토픽 M+H는 1060.57임) 및 125fmol의 ACTH 클립 18-39(모노이소토픽 M+H는 2465.20임)이다. 총 92 펩티드 매스(모노이소토픽)를 펩티드 서치(non-redundant database at the EMBL) 및 프로파운드(ProFound: atRockefeller University for non-redundant database at NCBI)를 사용한 펩티드 질량 데이타베이스 분석을 위해 제공하였다. 연산을 이용하여, 92개의 펩티드 질량중 24개가 마우스 키티나아제 3형 3 단백질(또한, YM-1 및 ECFL-프리커서)과 최소 59% 적용범위로 매치되었다. 첫번째 패스의 비매칭된 펩티드 질량을 이용한 후속 분석은 어떠한 의미있는 매치도 나타내지 않았다.
키티나아제 활성 검정: 이전에 설명된 바와 같이 수집된 BAL 유체를 키티나아제 활성 검정에 사용하였다. BAL중의 키티나아제 활성을 형광검정법에 의해 평가하였다. 형광성 4-메틸움벨리페릴 β-D-N,N'-디아세틸키토비오사이드를 기재로서 사용하였다. 하기와 같이 검정을 수행하였다. BAL 샘플을 시트레이트/포스페이트 완충제(0.1M/0.2M)(pH 5.2)중의 0.02M의 기질과 함께 인큐베이션시켰다. 37℃에서 15분 후, pH 10.6의 0.3M 글리신/NaOH 완충제 1ml를 첨가하므로써 반응을 중단시키고, 350nm의 여기 및 450nm의 발광에서 형광분석 측정기로 측정하였다. 표준 곡선은 4-메틸움벨리페론(Sigma)으로부터 유도된 것이다. 세라티아 마르세센스(Serratia marcescenes)로부터의 키티나아제 추출물을 양성 대조군(Sigma)으로서 사용하였다.
에어로알레르겐 오발부민(OVA: Aeroallergen Ovalbumin) 감작 및 공격 시험: 양(Yang) 등의 문헌[1998, J. Exp. Med. 188: 1739-1750]에 기술된 프로토콜을 변형시킨 변형 프로토콜을 사용하여 OVA 감작 및 공격 시험을 수행하였다. 요약하면, 알룸(Resorptar; Indergen, New York, NY)에 복합된 조류의 OVA(Sigma) 20μg이 함유되어 있는 주사액을 마우스의 복막내로 주입하였다. 이러한 과정을 5일 후에 반복하였다. 추가의 7일 후에, 동물들에, 엔도톡신이 없는 PBS 중의 OVA(1% w/v)를 에어로졸 공격(challenge)하거나, 엔도톡신이 없는 PBS 만을 단독으로 투여하였다. 에어로졸 공격(challenge)은 마우스를 40분 동안 놓아 둔 밀폐된 27x20x10cm 규격의 가소성 에어로졸 챔버에서 수행하였다. 에어로졸은 옴론 NE-U07 초음파 네불라이저(Omron NE-U07 ultrasonic nebulizer)(Omron Healthcare, Vernon Hills, IL)를 사용하여 발생시켰다. 마우스에 OVA를 공격(challenge)하고 나서 24시간, 48시간, 및 7일 후에 마우스를 절명시켰다.
YM 및 AMCase의 상대적인 유도:12,200개의 올리고누클레오티드를 포함한 아피메트릭스(Affymetrix) 뮤린 GENE CHIP 어레이(Santa Clara, CA)를 사용하여 뮤린 폐에서의 IL-13 유도 유전자 발현을 분석하였다. IL-13 발현 마우스, 독스(dox) 유도성 마우스 및 대조용 마우스에서의 유전자 발현 수준을 분석하였다. 상기 발현 수준은 하우스키핑 유전자(예, 악틴, GAPDH, 헥소키나아제 등)를 사용하여 표준화하였고, 자극 지수는 이식유전자 (+) 동물에서의 목표 비율을 이식유전자 (-) 동물에서의 목표 비율로 나눔으로써 계산하였다. 유사한 유전자 발현 연구를 IL-13을 구성적으로 발현시키는 마우스와 대조군에서 수행하였다. GENE CHIP 분석은 다음과 같이 수행하였다. 트리졸 시약(Trizol reagent)(Life Technologies, Gaithersburg, MD)을 사용하여 총 RNA를 IL-13 트랜스제닉 마우스와 한배 새끼 네거티브 대조군의 폐로부터 단리시켰다. 아피메트릭스 GENE CHIP 분석용 샘플을 제조하기 위해, cDNA 합성용 수퍼스크립트 초이스 시스템(Life Technologies)과 함께 변형된 올리고-dT 프라이머 및 5' T7 RNA 폴리머라아제 프로모터 올리고 프라이머를 사용함으로써 의해 총 RNA 15μg으로부터 cDNA를 생성시켰다. 페놀-클로로폼 추출 및 에탄올 침전 후에, 1/2 cDNA 반응(0.5-1.0μg)을, 제조업자의 프로토콜에 따라 비오틴화된 UTP 및 CTP(BioArray High Yield kit, Enzo Biochem, Farmingdale, NY)와의 시험관내 전사 반응을 위한 템플레이트로서 사용하였다. 생성된 cRNA를 친화도 레진 칼럼(RNeasy, Qiagen, Valencia, CA)상에서 정제하고, 자외선(UV) 흡수에 의해 정량화하였다. 각각의 반응을 위해, 15μg의 비오틴화된 cRNA를, 35분 동안 94℃에서 40mM 트리스-아세테이트(pH 8.1), 1,000mM 포타슘 아세테이트 및 30mM 마그네슘 아세테이트에서 인큐베이션시킴으로써 평균 크기를 갖는 50개의 누클레오티드로 임의로 단편화시켰다. 단편화된 cRNA를 2개의 분취액으로 나누고, 이들 각각을 제조업자의 프로토콜에 따른 Mul1K 아피메트릭스 GENE CHIP에의 하이브리다이제이션에 사용하였고(Affymetrix, Santa Clara, CA), 이때 모든 샘플에 대한 데이터를 이중으로 하였다. 각각의 타깃 어레이를 세척하고 스캐닝하였다(Hewlett-Packard, GeneArray Scanner G2500A). 데이터를 아피메트릭스 GENE CHIP 소프트웨어 알고리즘으로 분석하여, 값들을 규격화시킨 후의 "평균 차이" 및/또는 차이의 정도를 생성시켰다. 야생형 C57BL/6 한배 새끼 대조군으로부터 얻은 값을 기준선으로 사용하여 IL-13 트랜스제닉 마우스로부터 얻은 값들을 상대적인 증분(relative fold-increases)으로 나타내었다.
리보누클레아제 보호 분석:mCK-1 템플레이트 키트(PharMingen San Diego, CA)를 사용하여 리보누클레아제 보호 분석을 수행하였다. 리보누클레아제 보호 분석은 예를 들어 샘부르크(Sambrook) 등의 문헌[1989, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York] 및 오수벨(Ausubel) 등의 문헌[1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York]에 기술된 바와 같이 수행하였다.
알로사미딘(Allosamidin) 투여:알로사미딘(Eli Lilly and Co., Greenfield, IN and Industrial Research Limited, Lower Hutt, New Zealand)을 유도 가능한 IL-13 과다발현 마우스와 OVA에 노출된 야생형 마우스에 투여하였다. 0.1mg/kg 내지 10mg/kg 알로사미딘을 복막내로 또는 부형제 대조약(PBS)을 마우스에 투여하였다. 그런 다음, 이 동물들을 절명시키고, BAL 액(fluid) 분석, 조직학적 및 모르포메트릭 분석, 및 폐 부피 평가를 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 수행하였다.
본 실시예에 제시된 실험 결과는 이하 기술된다.
IL-13을 구성적으로 발현시키는 트랜스제닉 마우스:IL-13을 구성적으로 발현시키는 이식유전자 (+) 마우스는 BAL 액에서 고수준의 IL-13(2.1ng/ml 이하)과 폐에서 검출 가능할 정도의 IL-13 mRNA를 나타내었다. IL-13 mRNA는 트랜스제닉 마우스의 피부와 내장 기관에서는 검출할 수 없었는데, 이는 IL-13의 폐 특이적 발현을 나타낸다. 이식유전자 (-) 마우스는 BAL 액에서 또는 폐에서 검출 가능할 정도의 IL-13 또는 IL-13 mRNA를 나타내지 않았다.
이식유전자 (+) 마우스의 조직학적 분석은 복합적인 천식 유사 특징을 나타내었다. 이들 특징은 작고 큰 기도 주변과 이에 인접한 유조직에서의 호산구, 림프구 및 대식세포 풍부 염증성 반응을 포함한다. 이러한 반응은 어린 동물 또는저수준의 BAL IL-13에 의한 동물에서 보다 마일드하였으며, 늙은 동물 또는 고수준의 BAL IL-13에 의한 동물에서는 현저하였다. 상피 비대는 전도(conducting) 뿐만 아니라 소기도(small airways)에서도 분명히 나타났다(도 2 참조).
폐 특이적 IL-13의 구조적 발현은 또한 COPD 유사 꽈리 확장 및 벽 파열 뿐만 아니라 결정 물질의 마손 바디 유사 피브로틱 포시(Masson body-like fibrotic foci)로의 국소 오거니제이션(organization)을 결과하였다: 추가로, 길고 가는 바늘과 같은 결정이 이식유전자 (+) 동물의 대식세포, 꽈리 및, 가끔은, 기도에서 발견되었다.
점액 화생(mucus metaplasia) 및 증대된 뮤신 유전자 발현이 천식과 COPD 둘 모두의 특성이므로, 기도 점액에 대한 구조적 IL-13 발현의 효과는 당연한 것이었다. PAS 및 알시안(alcian) 둘 모두의 청색에 의한 착색을 통해, 점액 축적이 이식유전자 (+) 마우스의 기도에서는 현저하지만 이식유전자 (-) 한배 새끼에서는 그렇지 못하였음을 알 수 있었다(도 3 참조). 뮤신 유전자 MUC5AC, MUC2 및 MUC4 mRNA의 현저한 증가는 또한 이식유전자 (+) 마우스에서 분명하였다.
상피밑 섬유증에 의한 기도 재형성은 천식 기도의 잘 입증된 특징이며, 질환의 치료 및 패어런키몰(parenchymal) 섬유증은 종종 폐기종의 일면으로 나타난다. 이러한 염증성 질환의 특징은 증가된 콜라겐 침착과 관련이 있다. 따라서, 마손즈(Masson's) 3색 착색, 시리우스(sirius) 레드 및 히드록시프롤린 분석을 사용하여, 이식유전자 (+) 및 (-) 동물의 기도에의 콜라겐 침착을 평가하였다.
소량의 콜라겐이 트랜지진 (-) 동물의 기도벽의 내부와 기도벽 근처에서 발견되었으며, 느슨하게 패킹된 콜라겐이 기관지 혈관 다발에서 검출되었다. 이와 대조적으로, 인간의 기도 장애에서 발견되는 것과 유사하게, 증대된 콜라겐 침착이 이식유전자 (+) 동물의 작고 큰 기도의 상피밑 영역 및 아벤티시아(aventitia)에서 발견되었다(도 4 참조). 흉터형성 및 패어런키몰 섬유증이 늙은 동물에서 관찰되었고, 이들 특징은 나이가 들어감에 따라 증가하였다. 증가된 수준의 히드록시프롤린이 IL-13 생성후 4-6주 만큼 이른 때에 검출될 수 있었으며, 3월령의 늙은 동물의 히드록시프롤린 수준은 이식유전자 (-) 동물 보다 상당히 높았다(4.1배, p<0.001).
천식 및 COPD 환자 둘 모두는 기도 폐색 및 AHR(메타콜린과 같은 비특이적 길항제에 대한 과대 기관지연축 반응)을 나타내었다. 따라서, IL-13 트랜스제닉 동물 모델에서 이러한 기도 변경이 일어나는 지를 결정하기 위해 연구를 수행하였다. 기준선 기도 저항은 이식유전자 (+) 동물에서 마일드하게 상승하였다. 또한, 침입성 및 비침입성 평가 방법을 사용하여 결정한 바에 따르면, AHR은 메타콜린의 투여후에 관찰되었다. 이들 데이터는 천식 유사 및 COPD 유사 생리학적 변경이 IL-13 트랜스제닉 모델에서 일어남을 나타낸다.
유도 가능한 트랜스제닉 마우스:폐 특이적 유도 가능한 트랜스제닉 동물 시스템을 이용하여 뮤린 폐에서의 IL-13 발현을 일시적으로 조절하였다. 이는 천식 및 COPD에서 발견된 IL-13 발현의 왁스형성 및 감쇠 패턴을 모방한 것이고, 다른 트랜스제닉 모델에서 발견되는 자궁 또는 신생아 유전자 발현에 의해 야기된 비정상을 회피하는 것이다.
유도 가능한 트랜스제닉 마우스를 1월령까지 보통의 (독스가 없는) 물에서 자라게 하였다. 독스가 있는 물 또는 보통의 물에서 키운 이식유전자 (-) 동물로부터의 BAL 액에서는 IL-13이 검출되지 않았다. 독스가 없는 경우, 이식유전자 (+) 동물에서는 BAL IL-13≤75pg/ml이 발견되었다. 독스 투여 24 시간 이내에, 이식유전자 (+) 동물은 증가된 BAL IL-13 수준을 나타내었고, 독스 투여후 96 시간 이내에, 약 0.5 내지 1.5ng/ml 범위의 정상 수준을 나타내었다. IL-13 mRNA는 이식유전자 (+) 동물의 폐조직에서만 검출할 수 있었다.
H&E 및 3색 착색법을 통해, 보통의 물 또는 독스 함유 물이 제공된 이식유전자 (-) 마우스로부터 얻은 폐가 어떠한 조직학적 비정상을 나타내지 않을 뿐만 아니라 이들 폐가 보통의 물이 제공된 이식유전자 (+) 마우스로부터 얻은 폐와 구별되지 않음도 입증되었다. 그러나, 보통의 물이 제공된 이식유전자 (+) 마우스에서는 D-PAS 착색 후에 마일드한 점액 화생이 관찰되었다.
반대로, 독스가 함유된 물이 제공된 이식유전자 (+) 마우스는 현저한 염증, 점액, 및 구조 변경을 나타내었다. 독스 투여후 7일째에, BAL 액에서의 염증은 현저하였다. 이 시점에, 독스가 함유된 물이 제공된 이식유전자 (+) 마우스에서의 BAL 액으로부터의 세포 회복율은 7.5배 증가하였고, BAL 액 호산구의 증가율(63%, p<0.001)은 현저하였다. 이들 마우스에서의 림프구 및 대식세포 회복율도 현저하게 증가하였다(p<0.01). 또한, 단핵성의, 림프구의 및 호산구적 침입은 점액 화생에서의 증가와 같이 기도 및 기관지주변 구조에서 현저하였다. 게다가, MUC-5AC, MUC-2 및 MUC-4 mRNA에서의 실질적인 증가도 주목되었다. 독스의 장기간 투여는상피밑 섬유증, 꽈리 확장, 및 결정 침착(IL-13을 구성적으로 발현시키는 트랜스제닉 마우스에서 관찰되는 것과 매우 유사함)을 결과하였다.
COPD에서의 폐기종은 병리학적으로 폐의 말단 기관지 원위부에 있는 에어스페이스(airspaces)의 비정상적인 확장으로 정의된다[참고문헌: Senior and Shapiro, 1998, Fishman's Pulmonary Diseases and Disorders, Vol. 1, McGraw-Hill, NY]. 이미 주지된 바와 같이, IL-13을 구성적으로 발현시키는 마우스는 확장된 꽈리를 나타내었다. 이러한 확장이 정상적으로 형성된 폐에서의 폐 조직의 결점 전개로 인한 것인지 아니면 이의 파괴로 인한 것인지를 결정하기 위해, 충분한 폐 전개가 완료된 후에 유도 가능한 트랜스제닉 (+) 마우스에게 독스 함유 물만을 제공하였다. 독스 투여후, 조직학적 및 모르포메트릭 기술 둘 모두를 사용한 결과, IL-13 유도된 꽈리 확장은 분명하였다. 독스 부재의 경우, 이식유전자 (+) 및 (-) 동물 둘 모두에서 정상적인 꽈리가 관찰되었다(도 6 참조).
IL-13 과다발현 마우스에서의 YM 결정 침착:이미 주지된 바와 같이, 유도 가능한 및 구조적 IL-13 이식유전자 마우스 둘 모우에서 결정이 관찰되었다. 결정의 존재는 용량과 시간 둘 모두에 좌우되었다. 구조적 IL-13 마우스의 경우에, 결정은 평가된 가장 이른 시점에서(1개월) 관찰할 수 있었고, 침입성 결정 축적은 3월령의 동물에게서 관찰되었다. 유사하게, 유도 가능한 IL-13 마우스는 독스 투여후 거의 동일한 시간 간격으로 기도의 다양한 조직 및 세포에서 결정을 나타내었다. 어린 마우스에 경우에, 결정은 대식세포, 패어런키마 및 꽈리에서 가장 보편적으로 관찰되었고, 원위 기도에서 덜 보편적으로 관찰되었다. 늙은 동물의 경우에, 결정성 침착물로 완전히 채워진 많은 꽈리를 포함한, 상당한 꽈리 및 패어런키몰 결정 침착이 관찰되었다. 결정은 다면체의, 종종은, 바늘 형상을 하고 있었으며 이의 길이는 대략 20-120μm이었다(도 7 참조).
결정은 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같은 피콜(ficoll) 밀도 구배 방법을 사용하여 구조적 IL-13 트랜스제닉 (+) 마우스로부터의 BAL 액으로부터 정제되었다. 이들 결정을 분석하여 이들 결정이 YM 단백질로 구성되어 있음을 결정하였다. 이 샘플에서는 어떠한 다른 펩티드도 발견되지 않았으며, 이식유전자 (-) 동물에서는 YM 단백질도 검출되지 않았는데, 이는 IL-13 이식유전자 (+) 동물에 있는 결정이 YM 단백질을 포함하고 있음을 나타낸다.
IL-13 과다발현 마우스에서의 YM 유전자 발현:YM 단백질 발현이 IL-13에 의해 유도되었는지의 여부를 결정하기 위해, RT-PCR을 본원에 기술된 바와 같이 수행하였다. 이식유전자 (-) 동물로부터의 전체 폐 RNA에 있어, YM mRNA는 분석의 하위 민감도 한계 또는 그 근처였다(도 9 참조). 엄격하게 대비하여 보면, IL-13을 구성적으로 발현시키는 트랜스제닉 마우스의 경우에, YM mRNA는 평가된 모든 시점(1 내지 3월령의 마우스)에서 검출되었다. 독스가 제공되지 않은 유도 가능한 이식유전자 (+) 마우스는 저수준의 YM mRNA를 나타내었는데, 이는 마일드하게 "리키(leaky)한" 시스템임을 나타낸다. 독스의 투여시, 독스의 도입후 48시간만에 YM mRNA의 현저한 증가가 관찰되었고, 독스가 투여되는 3개월에 걸쳐 고수준의 YM mRNA 발현이 지속되었다(도 10 참조).
인시츄 하이브리다이제이션(In situ hybridization)을 사용하여 YM 단백질생성 부위를 IL-13 트랜스제닉 동물에 집중시켰다. 이식유전자 (-) 마우스에서는 YM mRNA를 관찰할 수 없었지만, 이식유전자 (+) 동물에서는 안티센스 프로브를 사용하여 현저한 수준의 YM mRNA를 관찰할 수 있었다. 이식유전자 (+) 동물의 경우에, YM은 대식세포와 기도 상피 세포에 강하게 집중되었다. 센스 올리고누클레오티드를 사용하여 동일한 조직이 프로빙되었을 때 YM 착색이 검출되지 않았다(도 11 참조)는 사실에 주목해야 하는데, 이는 이들 결과의 특이성을 확증한다.
YM mRNA 발현의 시토킨 유도가 IL-13 특이적인지를 확인하기 위해, 다양한 다른 트랜스제닉 마우스로부터의 전체 폐 RNA를 사용하여 RT-PCR 분석을 수행하였다. IL-4 트랜스제닉 마우스는 IL-13 트랜스제닉 마우스와 유사하게, 이들 폐에서의 과대 수준의 YM을 발현시켰다. 이는 IL-4가 본원의 다른 곳에서 이미 언급한 바와 같이 인간 기도 장애에 또다른 중요한 시토킨임을 나타내는 것과 일치한다. IL-6, IL-11, 혈관 내피 성장 인자165(VEGF) 및 IL-10을 구성적으로 발현시키는 트랜스제닉 마우스는 IL-13 이식유전자(-) 한배새끼 대조군의 수준과 필적할 만한 YM mRNA 수준을 나타내었으며, 이는 Th2 우세 호흡 염증에서 중요한 역할을 하는 것으로 가정된 시토킨, 즉, IL-13과 IL-4도 또한 YM 발현의 효능적 및 특이적 인듀서(inducer)임을 확인시켜준다.
IL-13 과다발현 마우스로부터의 BAL 액에서의 키티나아제(Chitinase) 활성:본원의 다른 곳에 기술된 방법을 사용하여, IL-13을 구성적으로 발현시키는 이식유전자 (+) 및 (-) 마우스로부터의 BAL 액에서의 키티나아제 활성을 분석하였다. 이식유전자 (-) 마우스로부터 얻은 BAL 액의 키티나아제 활성 수준은 75유니트/ml 이하였다. 이와 대비하여, 이식유전자 (+) 마우스에서는 현저하게 증가된 키티나아제 활성이 검출되었다(도 12 참조). 즉, 키티나아제 활성은 1월령의 이식유전자 (+) 동물에서 검출되었고, 동물의 연령이 증가함에 따라 키티나아제 활성도 지속적으로 증가하였다. 유사하게, 독스 투여후 2일 째에 유도 가능한 이식유전자 (+) 동물에서도 키티나아제 활성이 검출되었으며, 이러한 활성은 시간이 경과함에 따라 함께 증가하였다. IL-4를 과다발현시키는 트랜스제닉 마우스에서도 또한 키티나아제 활성의 증가를 나타내었다. 그러나, IL-6, IL-11, VEGF 및 IL-10 이식유전자 (+) 동물로부터 얻은 BAL 액에서의 키티나아제 활성은 바닥 수준이었다. 이들 데이터는 키티나아제 활성의 증가가 IL-13 및/또는 IL-4 발현의 증가와, 그리고 폐 조직에서의 YM 단백질 발현 및 결정 침착의 증가와 관련이 있음을 나타낸다.
IL-13 트랜스제닉 마우스에서의 AMCase 발현:상충되는 보고서들은 YM이 키티나아제 활성을 갖거나 갖지 않을 수도 있음을 지적하였다. 예를 들어, 정제 및 재조합 YM 둘 모두는 다수의 분석에 있어 키티나아제 활성을 입증하는데 실패하였는데, 이는 YM이 키티나아제가 아니라 오히려 키티나아제 유사 분자임을 나타낸다[참고문헌: Chang et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:17497-17506]. IL-13 이식유전자 (+) 마우스로부터의 BAL 액은 검출 가능한 키티나아제 활성을 나타내며, 이는 키티나아제계 단백질이 이들 마우스의 BAL 액에 존재할 수도 있음을 나타낸다. 현재까지, AMCase는 진정한 키티나아제 활성을 입증하는 뮤린 시스템에서 확인된 유일한 효소이다. AMCase 발현이 IL-13 이식유전자 (+) 마우스 폐에서 증가되었는지를 결정하기 위해, 상기한 바와 같이 AMCase에 특이적인 RT-PCR 프라이머를 사용하였다. 이식유전자 (-) 한배새끼 대조군에서의 mRNA 수준은 이용된 분석의 검출 한계 근처이거나 이 검출 한계보다 낮았다. 역으로, AMCase mRNA 수준에서의 현저한 증가가 구조적 및 유도 가능한 IL-13 트랜스제닉 모델 둘 모두에서 관찰되었다. 전자의 경우는 1월령 내지 3월령의 동물에서 관찰되었고, 후자의 경우는 독스 투여후 7일째의 동물에서 관찰되었다. 본원에서 평가된 다른 트랜스제닉 동물(IL-10, VEGF, IL-6 및 IL-11)로부터의 폐에서는 검출되지 않은 것으로 볼 때, AMCase 발현은 YM 단백질 발현과 유사하게 IL-13 트랜스제닉 동물에 특이적이었다.
인시츄 하이브리다이제이션을 사용하여 AMCase 생성을 IL-13 트랜스제닉 마우스에 집중시켰다. AMCase mRNA의 현저한 축적이 상피 세포에서 검출되었고, 이보다 덜한 축적이 대식세포에서 검출되었다. 이와 대비하여, 이식유전자 (-) 마우스에서는 AMCase mRNA가 검출되지 않았다(도 14 참조).
OVA 유도된 뮤린 천식 모델에서의 키티나아제 유전자 발현:YM 단백질 및/또는 AMCase가 표준 Th2 유도된 뮤린 천식 모델에서 유도되는지를 조사하기 위한 연구를 수행하였다. 이러한 목적으로, OVA 감작된 야생형 마우스의 폐의 이들 두 유전자들의 발현 및 BAL 액의 키티나아제 활성을 조사하였다. OVA 감작되었지만 OVA 공격(challenge)이 없는 동물의 경우에, mRNA 수준과 BAL 액 키티나아제 활성은 분석의 검출 수준 한계에 가까웠다. 그러나, OVA 공격(challenge)후에, YM 및 AMCase mRNA 수준은 용이하게 검출되었으며, 이 수준은 항원 투여후 7일 동안 지속되었다. BAL 액 키티나아제 활성도 그에 따라 증가하였다(도 15).
YM 및 AMCase의 상대적인 유도:12,200 올리고누클레오티드가 포함되어 있는 아피메트릭스 GENE CHIPS를 사용하여 독스가 제공된 1월령 내지 2월령의 유도 가능한 트랜스제닉 동물에서의 IL-13 유도된 유전자 발현 변경을 평가하고, 이를 이식유전자 (-) 한배새끼 대조군과 비교하였다. GENE CHIP 분석을 통해, 200 초과의 유전자가 적어도 2.5배까지 증가하였고, 대략 140 유전자가 독스 투여까지 하향 조절되었음을 알 수 있었다. 중요한 것은, 독스 투여후에 가장 현저하게 유도된 유전자가 YM이었다는 것이다(자극 지수, 64.1±0.5). AMCase는 상기 칩(chip)에 존재하지 않았지만, 또다른 키티나아제계 유전자인 BRP39는 어레이에서 12번째의 가장 현저하게 유도된 유전자였다(자극 지수, 7.1±0.5). 독스 투여가 이식유전자 (-) 동물의 유전자 발현을 상당히 변경시키는 원인이 아님에 주목해야 한다.
AMCase가 GENE CHIP에 존재하지 않았기 때문에, RT-PCR, 노던 블롯 분석 및 리보누클레아제 보호 분석을 포함한 다른 방법을 이용하였다. 모두 AMCase가 IL-13의 중요한 다운스트림 표적임을 나타내었다. 이는 AMCase가 IL-13 유도된 호흡 염증의 발병 과정 중에 유도되며 이의 발병과 잠재적으로 연루됨을 추가로 나타낸다.
뮤린 천식 모델에서의 알로사미딘의 효과:알로사미딘은 공지된 키티나아제의 효능적 및 선택적 억제제이다. 야생형 마우스를 OVA로 감작시키고 여러날 후에 OVA로 공격(challenge)시켰다. OVA 공격 이전의 어느 날, 마우스를 임의로 2개의 그룹으로 나누고, 알로사미딘을 포함한 1회분 용량 또는 부형제 대조약을 포함한 1회분 용량을 복막내로 매일 투여하였다. OVA 감작 및 공격 모델은 인간의 천식 증상과 유사하게, 현저한 점액 화생 및 술잔 세포 증식과 함께 활발한 호산구 및 림프구 풍부 염증 반응을 결과하였다. 알로사미딘 투여는 OVA 공격된 폐에의 전체 세포, 호산구 및 림프구 유입의 용량 의존형 억제를 결과하였다(도 16 참조). 이러한 억제 효과는 시험 용량이 가장 높았을 때(10mg/kg) 가장 현저하였고 시험 용량이 가장 낮았을 때에도(1mg/kg) 여전히 현저하였다. 그러므로, 알로사미딘은 기술분야에서 인정된 인간 천식의 뮤린 모델에서 항원 유도된 염증을 억제하였다.
유사하게, 6주령의 이식유전자 (+) IL-13 마우스에게 임의로 알로사민(1mg/kg)을 포함한 1회분 용량 또는 부형제 대조약을 포함한 1회분 용량을 40일 동안 매일 투여하였다. 그런 다음, 이 동물들을 절명시키고 IL-13 표현형을 평가하였다. 부형제 대조약을 투여한 이식유전자 (+) 마우스와 비교하여, 알로사미딘을 투여한 이식유전자 (+) 마우스는 현저하게 감소된 BAL 액 세포 회복율, 감소된 조직 염증, 및 BAL 및 조직 호산구 및 림프구에 있어서의 현저한 감소를 보여주었다. 모르포메트릭, 조직학, 및 폐 부피 평가 분석을 통해, 알로사미딘으로 치료한 동물이 감소된 폐 부피와 한배새끼 대조군보다 작은 꽈리를 나타냄을 알 수 있었으며, 이는 알로사미딘이 IL-13 유도된 염증과 폐 재형성 둘 모두의 효능성 억제제임을 나타낸다. 이들 실험에서, 알로사미딘 투여가 IL-13을 구성적으로 발현시키는 트랜스제닉 마우스의 출생 후, 즉, 천식 유사 표준형이 개시된 후 6주째에 개시되었다는 점을 주목하는 것은 중요하다. 이들 마우스와 COPD에 있어서의 이와 같은 알로사미딘 치료는 병리학적인 반응이 개시된 후에서 조차 폐의 병리상태의 진행을 감소시켰다. 이는 호흡 염증성 질환이 진단되고 어느 정도 진행된 후에 약제 조성물이 투여되는 인간의 치료 상황과 유사하다. 이들 결과는 만성적인 병리상태가 수립된 이후에도 키티나아제 유사 분자의 억제제가 질환을 성공적으로 치료할 수 있음을 나타낸다.
뮤린 천식 모델에 있어서의 안티-AMCase 항체의 효과
야생형 마우스를 OVA로 감작시키고 여러날 후에 OVA로 공격(challenge)하였다. OVA 공격 이전의 어느 날, 마우스를 임의로 2개의 그룹으로 나누고 안티-AMCase 항체 또는 혈청 대조군을 포함한 1회분 용량을 매일 투여하였다. OVA 감작 및 공격 모델은 인간의 천식 증상과 유사하게, 현저한 점액 화생 및 술잔 세포 증식과 함께 활발한 호산구 및 림프구 풍부 염증 반응을 결과하였다. 안티-AMCase 항체 투여는 이들 OVA 공격된 폐의 BAL 액에의 전체 세포 및 호산구 유입의 상당한 억제를 결과하였다(도 18 참조). 전체 세포 및 호산구 염증에서의 유사한 감소는 OVA 감작되고 공격된 길다란 조직에서 두드러졌다. 그러므로, 안티-AMCase는 기술분야에서 인정된 인간 천식의 뮤린 모델에서 항원 유도된 염증을 억제하였다.
인간 폐 조직에서의 AMCase 발현
기술분야에서 인정된 인간 천식의 마우스 모델의 관찰을, 인시츄 하이브리다이제이션을 사용하여 부검시에 얻은 인간 폐 조직에서 AMCase의 발현을 평가하는 것으로 확대하였다. 요약하면, 마우스 AMCase 및 Ym-1 mRNA의 검출을 위한 인시츄 하이브리다이제이션과 관련하여 본원의 다른 곳에 이미 기술된 프로토콜과 유사하게, 정상적인 폐 조직과 천식성 폐 조직을 생검법에 의해 획득하고 이를 포름알데히드에 고정시키고 파라핀에서 처리하였다. 5미크론의 섹션을 절단하고, 이로부터파라핀을 제거하고, 이를 프로티나아제 K(20μg/ml, 37℃, 20분)로 처리하였다. 그런 다음, 이 조직을 실온에서 10분 동안 0.1M 트리에틸놀아민/0.25% 아세트산 무수물(pH 8)로 처리하고, PBS에서 세정시켰다.
인간 AMCase에 대한 ISH 프로브에 대한 템플레이트를 리서치 제너틱스, 인크(Research Genetics, Inc; Huntsville, Alabama)로부터 발현된 시퀀스 태그(EST: expressed sequence tag) 클론 5182357로서 구입하였다. 상기 클론을 삽입 단편의 측면에 있는 T7 및 SP6 프로모터 서열을 포함한 벡터 pCMV-SPORT6을 사용하여 발생시켰다. 상기 클론의 서열은 누클레오티드 769-1538(서열번호: 14)로부터의 인간 AMCase mRNA에 필적하였다. 상기 클론의 서열은 예일 대학의 케크 바이오테크놀로지 래버러토리(Keck Biotechnology Laboratory)에서 누클레오티드 시퀀싱을 수행함으로써 확인하였다. 센스 및 안티센스 RNA 프로브를 시험관내에서 전사시키고 디고시제닌(digoxigenin) RNA 라벨링 키트(Roche, Indianapolis, IN)로 라벨링시키고, 65℃에서 변성시키고, 이를 입수 가능한 하이브리다이제이션 완충액(Ambion, Austin, TX)(6ng/μl)에 가하고, 상기 하이브리다이제이션 혼합물을 52℃에서 하룻밤 조직과 함께 인큐베이션시켰다. 그런 다음, 상기 조직을 실온에서 5분 동안 4xSSC로 2회 세척하고, 37℃에서 10분 동안 2xSSC로 2회 세척한 후, 37℃에서 45분 동안 RNase A(10μg/ml)와 함께 인큐베이션시켰다. 그런 다음, 이를 실온의 2xSSC 중에서 10분씩 2회 세척하고 50℃의 0.2xSSC 중에서 20분씩 3회 세척하였다. 제조업자에 의해 기술된 바에 따라, 알칼리성 포스파타아제(Roche)와 컨쥬게이션된 디고시제닌에 대한 양(sheep) 항체, 이어서 4-니트로불루 테트라졸리움 클로라이드/5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트와 함께 밤새 인큐베이션시킴으로써 프로브를 검출하였다.
조직학적으로 정상적인 인간 폐 조직("대조용 조직")에서의 AMCase의 발현을 치명적인 천식("치명적인 천식")으로 인해 사망한 인간 환자로부터 얻은 조직에서의 AMCase 발현과 비교하였다. 인시츄 하이브리다이제이션을 사용하여, AMCase mRNA는 센스 프로브를 사용하여 치명적인 천식 폐 샘플에서는 검출되었으나 대조용 폐 조직에서는 검출되지 않았다(각각 도 19a 및 19b 참조). AMCase mRNA는 치명적인 천식 조직의 상피 세포와 대식세포에 집중되었다. 더 나아가서, 센스 프로브는 치명적인 천식 또는 대조용 폐 조직에서 mRNA 엔코딩 AMCase를 검출하지 못했는데, 이는 프로브의 특이성을 입증하는 것이다. 또한, 폴리-dT 프로브는 샘플 둘 모두에 있는 미손상 mRNA를 강조하였다.
인간 꽈리 대식 세포에서의 AMCase mRNA의 발현도 또한 평가하였다. AMCase 안티센스 프로브를 사용하는 인시츄 하이브리다이제이션은 치명적인 천식 폐 샘플(도 19e 참조)에서 검출 가능한 AMCase mRNA를 나타내었지만 대조용 샘플에서는 그렇지 못했다. AMCase mRNA는 센스 AMCase 프로브를 사용하여 치명적인 폐 샘플에서 검출되지 않았는데, 이는 인시츄 하이브리다이제이션 과정의 특이성을 입증하는 것이다.
이들 데이터는 기술분야에서 인정된 인간 천식의 마우스 모델을 사용하여 얻은 결과가 인간의 생체내 데이터와 일치함을 확인시켜준다. 즉, 본원에 기술된 데이터는 AMCase mRNA 발현이 크게 감소되었으며, AMCase mRNA가 치명적인 천식 폐조직에서 검출 가능한 수준으로 존재하지만 조직학적으로 정상적인 폐 조직에서는 검출할 수 없기 때문에 인간의 천식과 상호 관련성이 있음을 처음으로 입증하는 것이다. 이들 결과는 키티나아제 유사 분자의 발현이 포유류의 염증성 질환과 관련이 있으며/거나 이를 중재한다는 상기한 입증을 추가로 지지한다. 이와 같이, 본원에 기술된 데이터는 키티나아제 유사 분자 억제제를 사용하여 AMCase의 억제가 인간을 포함한 포유류의 천식을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 염증성 질환을 치료하고/거나 예방할 수 있음을 추가로 지지한다.
결론
본 발명은 알러지와 아토피성 천식 특성을 나타내는 Th2 염증성 반응과 이들 질환과 관련이 있는 염증성 및 기도 재형성 반응이 기생충 및 그 밖의 병원균과 싸우도록 처음으로 개발된 Th2 염증성 반응으로부터 발달되었음을 강하게 시사하는 실험적 증거에 일부 기초하고 있다. 이와 같이, 천식 및 그 밖의 염증성 질환은 기생충 및 병원균 의존 방식으로 도출된 불량하게 조절된 Th2 반응의 결과이다.
기생충 및 그 밖의 병원균의 방대한 어레이는 키틴을 함유한다. 이것은 갑각류 및 곤충의 외골격, 진균의 벽, 곤충의 소화관, 기생성 선충의 미세사상충 외피 및 연충성 기생충의 성분에서 중요한 성분이다. 키틴은 β-1,4-결합의 N-아세틸글루코사민 잔기의 중합체이고, 셀룰로오스 다음으로, 자연에서 두번째로 풍부한 폴리사카라이드이며, 포유류 대응부는 전혀 가지지 않는다. 키틴은, 두께에 따라, 숙주 방어로부터, 그리고 주변 환경으로부터 유기체를 보호하는데 매우 중요한 단단하거나 유연한 코팅일 수 있기 때문에, 기생충 및 그 밖의 병원균의 외면을 포함한다. 따라서, 키틴은 숙주/병원균의 계면에 존재하므로, 주요 항원인데, 왜냐하면, 면역계에 노출되기 때문이다. 사실상, 키틴은 면역원성이 양호하지 않은 펩티드에 대한 면역글로불린 반응을 증대시키며, Th1 방향으로 면역 반응을 이동시킬 수 있는, 효능있는 T 및 B 세포 애주번트인 것으로 입증되었다[참조: Seferian and Martinez, 2000, Vaccine 19:661-668; Shibata et al., 2000 J. Immunol. 164:1314-1321].
특히, 숙주 면역 반응과 관련하여, 기생충 및 인간의 공동 진화 및 포유 동물에서의 키틴의 완전 결여를 입증하는 방대한 양의 증거가 제시되면, 특정 이론에 결부시키지 않고도, 포유류는 키틴을 지니고 있는 기생충에 대한 고유의 방어로서 키티나아제를 생성시켰다고 여기는 것은 타당하다. 키티나아제는 포유 동물에서 확인되었다. 키토트리오시다아제 및 YKL-39는 인간에 있어서 기술되었으며, YM 단백질은 마우스에 있어서 기술되었고, 산성 포유류 키티나아제(AMCase), 오비덕틴 및 YKL-40은 마우스 및 사람 둘 모두에 있어서 기술되었다[참조: Boot et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6770-6778; Boot et al., 1998, J. Biol. Chem. 273:25680-25685; Ward et al., 2001, Am. J. Pathol. 158:323-332; Chang et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:17497-17506; Jin et al., 1998, Genetics 54:316-322; Bleau et al., 1999, EXS 87:211-221]. 상반되는 보고서 및 미생물의 키티나아제에 일부 서열 상동성에도 불구하고, 키토트리오시다아제 및 AMCase는 실제로 키티나아제 활성을 갖는 것으로 입증되었다[참조: Boot et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6770-6778]. 포유류 키티나아제 중에서, YM-1 및 AMCase는화학주성(chemotactic) 인자 및 성장 인자와 같은 특성을 갖는 것으로 확인되었다. YM-1은 생리학적 조건 하에서 용이하게 결정을 형성하는 45kDa의 단일쇄 펩티드이다. YM계 단백질은 호산성이며, CD4+T 세포 유인성이고, 뿐만 아니라 렉틴 활성을 갖는 것으로 확인되었다[참조: Owhashi et al., 2000, J. Bio. Chem. 275:1279-1286; Chang et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:17497-17506). AMCase는 키티나아제 활성을 입증하는 50kDa 단백질이다. 이는 또한 섬유아세포 성장 증진제로서 보고되었다[Guoping et al., 1997, J.Cell.Biochem. 67:257-264]. 본원에 기재된 데이터에 의해 입증되는 바와 같이, YM 단백질 및 AMCase 둘 모두는 IL-13 유도되고 Th2 매개된 천식 모델의 폐에서 고도로 발현되었다.
특정 이론에 의해 제한하고자 하는 것은 아니지만, 천식 질환에서 키틴의 역할과 연결하에 살펴보면, 천식 및 기타 호흡기 염증성 질환에서 키티나아제 역할의 새로운 발견이 다음과 같이 고찰될 수 있다. 비아토피성의 비천식 대상에서, 기생충 또는 진균류에 노출된 후에 항원으로서의 키틴으로의 노출은 Th1 경로에 대한 면역 반응을 분극화시키며, 이는 기생충을 효과적으로 제거하거나 제거할 수 없다. 그러나, 아토피성 대상 또는 이반적으로 천식 또는 아토피성이 대상에서, IL-13 및/또는 IL-4가 생성되며, 이는 YM, AMCase 및 가능하게는, 기타 키티나아제 및 키티나아제 유사 분자의 발현을 상향조절한다. 이전에 상세히 설명된 바와 같은 키틴은 IgE 생성물을 증가시킨다. YM 단백질은 단독으로 또는 기타 분자와 함께 호산성 및 CD4+T 세포 화학주성을 갖는다. 따라서, YM 단백질은 폐에 대한 호산성을유인할 뿐만 아니라, 이의 카보히드레이트-결합 및 결정-형성 특성에 의해 매개되는 조직 손상을 초래한다. AMCase는 실질적으로 키틴을 분해하여 병원체를 제거한다. 키틴 특성을 유도하는 Th1으로 인해, AMCase 활성 및 그 후의 키틴 분해는 면역계를 아토피 및 천식 염증성 질환의 Th2 반응 특성으로 유도한다.
본 발명은 키티나아제 유사 분자 억제제를 사용하여 천식, COPD 및 기타 염증성 질환을 치료하기 위한 방법 및 치료제를 포함한다. 본 발명은 추가로 IL-13, IL-4 키티나아제 및 키티나아제 유사 분자 억제제와 관련된 천식, COPD 및 기타 염증성 질환을 치료하기 위한 신규한 치료제를 확인하는 방법을 포함한다.
본원에 인용된 각각의 및 모든 특허, 특허 출원 및 공개 문헌은 전체가 본원의 참고 문헌으로서 인용되었다.
본 발명이 특정 구체예와 관련하여 설명되어 있지만, 본 발명의 기타 구체예 및 변형이 본 발명의 진정한 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 당업자에 의해 안출될 수 있음이 분명하다. 첨부된 청구범위는 이러한 모든 구체예 및 등가 변형예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
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Claims (41)

  1. 유효량의 키티나아제 유사 분자 억제제를 포유류에 투여함으로써 포유류의 염증성 질환을 치료하는 것을 포함하여, 키티나아제 유사 분자의 수준 증가와 관련된 포유류의 염증성 질환을 치료하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 포유류가 인간임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 키티나아제 유사 분자가 YM-1, YM-2, 산성 포유류 키티나아제 (AMCase), 난관 당단백질 1, 연골 당단백질 1, 키토트리오시다아제, 뮤신 9, 연골 당단백질-39 및 연골세포 단백질 39로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 키티나아제 유사 분자 억제제가 화학적 화합물, 항체, 리보자임, 핵산 및 안티센스 핵산 분자로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 화학적 화합물이 알로사미딘, 글루코알로사미딘 A, 글루코알로사미딘 B, 메틸-N-데메틸알로사미딘, 데메틸알로사미딘, 디데메틸알로사미딘, 스틸로구아니딘, 스틸로구아니딘 유도체, 디펩티드 시클로-(L-Arg-D-Pro), 디펩티드 시클로-(L-Arg-L-Pro), 디펩티드 시클로-(D-Arg-D-Pro), 디펩티드 시클로-(D-Arg-L-Pro), 리보플라빈, 플라빈 유도체, 구리, 아연 및 수은으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 항체가 YM-1, YM-2, 산성 포유류 키티나아제 (AMCase), 난관 당단백질 1, 연골 당단백질 1, 키토트리오시다아제, 뮤신 9, 연골 당단백질-39 및 연골세포 단백질 39로 구성된 군으로부터 선택되는 키티나아제 유사 분자와 특이적으로 결합함을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 4항에 있어서, 안티센스 핵산 분자가 키티나아제 유사 분자를 엔코딩하는단리된 핵산 분자 또는 이의 단편과 상보적인 단리된 핵산임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 4항에 있어서, 리보자임이 키티나아제 유사 분자를 엔코딩하는 핵산으로부터 전사된 mRNA를 특이적으로 절단하는 단리된 효소성 핵산임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 염증성 질환이 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 간질성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 기관지염, 호산구성 기관지염, 호산구성 폐렴, 폐렴, 염증성 장질환, 아토피성 피부염, 아토피, 알레르기, 알레르기성 비염, 특발성 폐섬유증, 피부경화증 및 기종으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 유효량의 키티나아제 유사 분자 억제제를 포유류에 투여함으로써 포유류의 염증성 질환을 예방하는 것을 포함하여, 키티나아제 유사 분자의 수준 증가와 관련된 포유류의 염증성 질환을 예방하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 포유류가 인간임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 키티나아제 유사 분자가 YM-1, YM-2, 산성 포유류 키티나아제 (AMCase), 난관 당단백질 1, 연골 당단백질 1, 키토트리오시다아제, 뮤신 9, 연골 당단백질-39 및 연골세포 단백질 39로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 10항에 있어서, 키티나아제 유사 분자 억제제가 화학적 화합물, 항체, 리보자임, 핵산 및 안티센스 핵산 분자로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 10항에 있어서, 염증성 질환이 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 간질성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 기관지염, 호산구성 기관지염, 호산구성 폐렴, 폐렴, 염증성 장질환, 아토피성 피부염, 아토피, 알레르기, 알레르기성 비염, 특발성폐섬유증, 피부경화증 및 기종으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 10항에 있어서, 키티나아제 유사 분자가 YM 단백질이며, 추가로 키티나아제 유사 분자 억제제가 알로사미딘, 글루코알로사미딘 A, 글루코알로사미딘 B, 메틸-N-데메틸알로사미딘, 데메틸알로사미딘, 디데메틸알로사미딘, 스틸로구아니딘, 스틸로구아니딘 유도체, 디펩티드 시클로-(L-Arg-D-Pro), 디펩티드 시클로-(L-Arg-L-Pro), 디펩티드 시클로-(D-Arg-D-Pro), 디펩티드 시클로-(D-Arg-L-Pro), 리보플라빈, 플라빈 유도체, 구리, 아연 및 수은으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 10항에 있어서, 키티나아제 유사 분자가 AMCase임을 특징으로 하는 방법.
  17. 유효량의 키티나아제 억제제를 포유류에 투여함으로써 포유류의 염증성 질환을 치료하는 것을 포함하여, 키티나아제의 수준 증가와 관련된 포유류의 염증성 질환을 치료하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 포유류가 인간임을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17항에 있어서, 키티나아제가 산성 포유류 키티나아제 (AMCase)이며, 키티나아제 억제제가 화학적 화합물, 항체, 리보자임, 핵산, 핵산 및 안티센스 핵산 분자임을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 화학적 화합물이 알로사미딘, 글루코알로사미딘 A, 글루코알로사미딘 B, 메틸-N-데메틸알로사미딘, 데메틸알로사미딘, 디데메틸알로사미딘, 스틸로구아니딘, 스틸로구아니딘 유도체, 디펩티드 시클로-(L-Arg-D-Pro), 디펩티드 시클로-(L-Arg-L-Pro), 디펩티드 시클로-(D-Arg-D-Pro), 디펩티드 시클로-(D-Arg-L-Pro), 리보플라빈, 플라빈 유도체, 구리, 아연 및 수은으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 19항에 있어서, 항체가 AMCase와 특이적으로 결합함을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 19항에 있어서, 안티센스 핵산 분자가 AMCase를 엔코딩하는 단리된 핵산 또는 이의 단편과 상보적인 단리된 핵산임을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 17항에 있어서, 염증성 질환이 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 간질성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 기관지염, 호산구성 기관지염, 호산구성 폐렴, 폐렴, 염증성 장질환, 아토피성 피부염, 아토피, 알레르기, 알레르기성 비염, 특발성 폐섬유증, 피부경화증 및 기종으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  24. 유효량의 키티나아제 유사 분자 억제제를 포유류에 투여함으로써 인터류킨-13의 수준 증가와 관련된 포유류의 염증성 질환을 치료하는 것을 포함하여, 인터류킨-13의 수준 증가와 관련된 포유류의 염증성 질환을 치료하는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 포유류가 인간임을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 24항에 있어서, 키티나아제 유사 분자 억제제가 화학적 화합물, 항체, 리보자임, 핵산 및 안티센스 핵산 분자로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  27. 유효량의 키티나아제 유사 억제제를 포유류에 투여함으로써 Th2 염증 반응과 관련된 포유류의 염증성 질환을 치료하는 것을 포함하여, Th2 염증 반응과 관련된 포유류의 염증성 질환을 치료하는 방법.
  28. 화합물을 염증성 질환을 앓고있는 포유류에 투여하고, 포유류의 키티나아제 유사 분자의 수준을 상기 화합물을 투여하기 전의 포유류의 키티나아제 유사 분자의 수준과 비교하는 것을 포함하며, 상기 화합물을 투여한 후의 포유류의 키티나아제 유사 분자의 수준이 상기 화합물을 투여하기 전의 포유류의 키티나아제 유사 분자의 수준과 비교하여 낮은 경우에 상기 화합물이 상기 포유류의 염증성 질환을 치료하는 데에 유용함을 나타냄으로써 염증성 질환을 치료하는 데에 유용한 화합물이 확인되는, 포유류의 염증성 질환을 치료하는 데에 유용한 화합물을 확인하는 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 키티나아제 유사 분자의 수준이 키티나아제 유사 분자 핵산 발현의 수준 및 키티나아제 유사 분자 효소 활성의 수준으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 28항에 있어서, 키티나아제 유사 분자가 YM-1, YM-2, 산성 포유류 키티나아제 (AMCase), 난관 당단백질 1, 연골 당단백질 1, 키토트리오시다아제, 뮤신 9, 연골 당단백질-39 및 연골세포 단백질 39로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 28항에 있어서, 포유류가 마우스임을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 마우스가 인터류킨 13을 구성적으로 발현하는 트랜스제닉 마우스 및 인터류킨 13을 유도적으로 발현하는 트랜스제닉 마우스로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 28항의 방법을 사용하여 확인된 화합물.
  34. 제 28항에 있어서, 키티나아제 유사 분자가 AMCase임을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 34항의 방법을 사용하여 확인된 화합물.
  36. 세포를 화합물과 접촉시키고, 세포의 키티나아제 유사 분자의 수준을 상기 화합물과 접촉시키지 않은 동일한 다른 세포의 키티나아제 유사 분자의 수준과 비교하는 것을 포함하며, 상기 화합물과 접촉시킨 세포의 키티나아제 유사 분자의 수준이 상기 화합물과 접촉시키지 않은 세포의 키티나아제 유사 분자의 수준과 비교하여 낮은 경우에 상기 화합물이 염증성 질환을 치료하는 데에 유용함을 나타냄으로써 염증성 질환을 치료하는 데에 유용한 화합물이 확인되는, 염증성 질환을 치료하는 데에 유용한 화합물을 확인하는 방법.
  37. 유효량의 키티나아제 유사 분자 억제제를 포함하며, 어플리케이터 (applicator) 및 이의 사용 설명서를 추가로 포함하는, 키티나아제 유사 분자의 수준 증가와 관련된 포유류의 염증성 질환을 치료하기 위한 키트.
  38. 제 37항에 있어서, 키티나아제 유사 분자 억제제가 화학적 화합물, 항체, 리보자임, 안티센스 분자 및 핵산으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 키트.
  39. 제 38항에 있어서, 화학적 화합물이 알로사미딘, 글루코알로사미딘 A, 글루코알로사미딘 B, 메틸-N-데메틸알로사미딘, 데메틸알로사미딘, 디데메틸알로사미딘, 스틸로구아니딘, 스틸로구아니딘 유도체, 디펩티드 시클로-(L-Arg-D-Pro), 디펩티드 시클로-(L-Arg-L-Pro), 디펩티드 시클로-(D-Arg-D-Pro), 디펩티드 시클로-(D-Arg-L-Pro), 리보플라빈, 플라빈 유도체, 구리, 아연 및 수은으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 키트.
  40. 제 39항에 있어서, 키티나아제 유사 분자가 AMCase임을 특징으로 하는 키트.
  41. 유효량의 키티나아제 유사 분자 억제제를 포함하며, 어플리케이터 및 이의 사용 설명서를 추가로 포함하는, 키티나아제 유사 분자의 수준 증가와 관련된 염증성 질환을 예방하기 위한 키트.
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