DE60130782T2 - Atemwegspezifische, trypsin-ähnliche enzyme und verfahren zu deren anwendung - Google Patents

Atemwegspezifische, trypsin-ähnliche enzyme und verfahren zu deren anwendung Download PDF

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen der hemmenden Aktivität einer Verbindung oder eines Polypeptids (einschließlich Proteinen und Antikörpern), unter Verwendung eines Systems zum Nachweisen oder Untersuchen der Schleimsekretion fördernden Wirkung, der Entzündung auslösenden Wirkung, der intrazellulären Calciumeinstrom auslösenden Wirkung und der Protease-aktivierter-Rezeptor aktivierenden Wirkung des Enzyms, welches atemwegsspezifische Trypsin-ähnliche Enzymproteine umfasst, deren Strukturen neu erklärt werden.
  • Hintergrund
  • In den letzten Jahren wurde ein humanes Trypsin-ähnliches Atemwegsenzym (nachfolgend hier als "atemwegsspezifisches Trypsin-ähnliches Enzym" oder "AST" (atemwegsspezifische Trypsin-ähnliche Protease) bezeichnet) aus dem Sputum eines humanen Patienten mit chronischer Atemwegsentzündung aufgereinigt (die JP-A 7-067640 (nachfolgend bedeutet hier JP-A "ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung"), Yasuoka S. et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 16: S. 300-308, 1997), seine Aminosäuresequenz und seine cDNA-Sequenz wurde aufgeklärt ( JP-A 8-89246 , US-5804410 , EP-699763 , Yamaoka K. et al., J. Biol. Chem., 273 (19); 11895-11901, 1998).
  • Mehrere Aktivitäten des Enzyms wurden in vitro untersucht. Es wird angenommen, dass das Enzym an den Krankheitszuständen einer Atemwegsentzündung beteiligt sein kann, da das Enzym an ziliären Bewegungen des Schleims beteiligt ist und weiterhin eine Wirkung aufweist, um die Herstellung von Zytokinen, wie IL-8, GM-CSF, aus humanen Bronchialepithel-Zelllinien zu verstärken (Toshika Terao, et al., 1998, The Japanese Respiratory Society). Da das Enzym enzymatische Aktivitäten, wie eine Fibrinogen abbauende Aktivität (Yoshinaga S. et al., J. Med. Invest., 45: 77-86, 1998) und eine Plasminogenaktivator (Prourokinase) aktivierende Wirkung (Sumiko Yoshinaga, et al., 1998 Conference an Proteases and Inhibitors in Pathophysiology and Therapeutics) aufweist, wird weiterhin angenommen, dass das Enzym durch die Bildung von Fibrin auf der basalen Oberfläche eines Atemwegs entzündungshemmend wirken kann, den Krankheitszustand eines chronischen Atemwegs-Patienten modifizieren kann und weiterhin an einer Metastase und desgleichen beteiligt sein kann.
  • Andererseits stellt ein Protease-aktivierter Rezeptor (Protease-aktivierter Rezeptor, nachfolgend hier als "PAR" bezeichnet), der als ein Rezeptor definiert ist, dessen Signaltransduktion durch die Aktivität der Protease gefördert wird, einen Rezeptor dar, welcher die Signale durch die Protease vermittelt, und ein Thrombinrezeptor (humaner PAR-1), welcher in humanen Blutplättchen vorkommt, wurde 1991 kloniert (Vu U K-H et al., Cell, 64: 1057-1068, 1991). Nachfolgend wurden Maus-PAR-1 (Coughlin, S. R., unveröffentlicht, Zugangsnr. L03529, 1992), Ratten-PAR-1 (Runge M. S. et al., J. Biol. Chem., 267: 16975-16979, 1992), Maus-PAR-2 (Nystedt S. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 91: 9208-9212, 1994), humaner PAR-2 (Bohm S. K., Biochem. J., 314: 1009-1016, 1996), Ratten-PAR-2 (Saifeddine M. et al., Br. J. Pharmacol., 118(3): 521-530, 1996), humaner und Maus-PAR-3 (Ishihara H. et al., Nature, 386: 502-506, 1997), Maus-PAR-4 (Kahn M. L. et al., Nature, 394: 690-694, 1998), humaner PAR-4 (Xu W-F et al., Proc Natl Acad Sci USA, 95: 6642-6646, 1998) und desgleichen kloniert. Viele Berichte, dass PAR-1 und PAR-2 an verschiedenen pathologischen Zuständen, wie einer Entzündung, beteiligt sind, wurden gemacht (Dery O. et al., Am. J. Physiol., 274: C1429-C1452, 1998).
  • In Bezug auf die Aktivierung des PAR-2 wurde berichtet, dass Trypsin (Nystedt S. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 91, 9208-9212, 1994) und Tryptase (Schwartz, L.
  • B. et al., J. Immunol., 126: 1290-1294, 1981) den PAR-2 aktivieren (Molino M. et al., J. Biol. Chem., 272: 4043-4049, 1997).
  • Es liegt ein Bericht vor, dass der PAR-2 an der Regulation der pankreatischen Sekretion im Pankreas (Bohm S. K., Biochem. J., 314, 1009-1016, 1996), der Aktivierung der Ionenkanäle und desgleichen (Nguyen T. D. et al., J. Clin. Invest., 103: 261-269, 1999) beteiligt ist, und ein Bericht, dass der PAR-2 weiterhin an der Regulation der Bewegungen des Duodenums und desgleichen beteiligt ist (Kawabata A. et al., Br. J. Pharmacol., 128(4): 865-872, 1999).
  • Andererseits gibt es Berichte, dass die Tryptase, die aus Mastzellen freigesetzt wird, nur als ihr Tetramer eine enzymatische Aktivität aufweist (Schwartz, L. B. et al., J. Biol. Chem., 256: 11939-11943, 1981) und an Hautentzündung (Steinhoff M. et al., Exp. Dermatol., 8: 282-294, 1999) und Lungenentzündung (Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., 278: L193-L201, 2000) beteiligt ist.
  • Es gibt jedoch viele noch unbekannte Aspekte bezüglich der Wirkungen der Tryptase und der Aktivierung des PAR-2, und andere PAR-2 aktivierende Enzyme sind nicht vollständig aufgeklärt. Weiterhin gibt es einen Bericht, welcher das Vorhandensein des oben erwähnten Trypsinogens im Atemweg als ein Enzym zum Aktivieren des PAR-2 im Atemweg nahe legt. Die Aktivität und die Menge des Trypsinogens sind jedoch vollständig unbekannt, und es wurde nur das Vorhandensein eines Proteins durch Immunhistochemie gezeigt (Cocks T. M. et al., Nature, 398: 156-160, 1999). Es wurde weiterhin nicht berichtet, dass ein atemwegsspezifisches Enzym vorkommt, welches PAR-2 aktiviert.
  • Einerseits wird bei chronischen entzündlichen Atemwegserkrankungen die Verschlimmerung der pathologischen Zustände aufgrund der Hypersekretion von Schleim als ein pathologischer Zustand angeführt, welcher zusammen mit einer anhaltenden Entzündung zu einem Problem wird (Jeffery, P. K. et al., Am. J. Respir. Crit. Dare. Med., 150: S6-13, 1994). Die Wirkungen von Makrolid-Arzneimitteln, wie Erythromycin, gegen DPB (diffuse Panbronchiolitis), welche zu den oben beschriebenen Erkrankungen gehört, sind bekannt (Nagai, H. et al., Respiration, 58(3-4): 145-149), aber die Makrolid-Arzneimittel werden vorzugsweise nicht in Europa, den USA und desgleichen verwendet, da sie Antibiotika darstellen.
  • Weiterhin wurde von verschiedenen Theorien bezüglich der Zielmoleküle berichtet, welche hauptsächlich eine Förderung von überschüssiger Schleimbildung, und eine Sekretionszellproliferation verursachen (Christian, P. et al., J. Clin. Invest., 85: 682-689, 1990), aber es gibt noch kein wirksames therapeutisches Arzneimittel unter den Arzneimitteln, welches auf der Grundlage der Theorien entwickelt wurde. Ein Arzneimittel, welches zum Kontrollieren der Förderung von überschüssiger sekretiver Schleimbildung wirksam ist, wird daher allgemein für chronische entzündliche Atemwegserkrankungen, welche von COPD (chronisch obstruktive Lungenerkrankung, für engl.: Chronic Obstructive Pulmonary Disease) dargestellt werden, gewünscht.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt darin, ein Verfahren zum Screenen eines Mittels zum Hemmen der Schleimbildung fördernden Wirkung, der EGFR (für engl.: Epidermal Growth Factor Receptor)-Weg aktivierenden Wirkung, der Entzündung fördernden Wirkung (aufgrund der Förderung der Zytokinherstellung oder desgleichen), der intrazellulären Calciumeinstrom auslösenden Wirkung und einer PAR (Protease-aktivierter Rezeptor, der als ein Rezeptor, dessen Signaltransduktion durch die proteolytische Aktivität verursacht wird, definiert ist) aktivierenden Wirkung des aktiven AST mit der richtigen Struktur, und weiterhin ein Überprüfungssystem zum Nachweisen der hemmenden Aktivität zu konstruieren.
  • Es kann nämlich erwartet werden, dass die Verbindung oder das Polypeptid, welche/s die Aktivitäten des AST, das durch Verwenden des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wurde, hemmt, oder die Verbindung oder das Polypeptid, welche/s die Schleimbildung fördernde Wirkung, die EGFR-Weg aktivierende Wir kung, die Entzündung fördernde Wirkung, die intrazelluläre Calciumeinstrom auslösende Wirkung und die PAR aktivierende Wirkung des AST hemmt, zum Hemmen oder Modifizieren der physiologischen Wirkungen des AST, wie eine Sekretion fördernde oder Schleimbildung fördernde Wirkung für die sekretorischen Zellen, eine Fibrinogenolyse-Gerinnungssystemwirkung, eine Atmwegsumbauwirkung, eine Atemwegsentzündungswirkung, Wirkungen für die Proliferation und Unterdrückung von Fibroblasten, Epitheliozyten, Zilien tragenden Zellen, glatten Muskelzellen, Becherzellen, mit der Proliferation und Metastase von Krebs verbundene Wirkungen, Wirkungen für mukoziliäre Bewegungen und eine Anti-Virusinfektionswirkung, und zum Verbessern und Behandeln von pathologischen Zuständen verwendet werden kann.
  • Da das AST weiterhin den PAR aktiviert, kann erwartet werden, dass die Verbindung oder das Polypeptid zum Hemmen oder Modifizieren der physiologischen Wirkungen des PAR, wie Sekretion fördernde Wirkung (die Schleimbildung fördernden Wirkungen von Schleimdrüsenzellen, serösen Drüsenzellen und Becherzellen, Serektion fördernde Wirkungen für Nervenzellen, neuroendokrine Zellen, eine Chloridionen-Sekretion fördernde Wirkung in Atemwegsepithelzellen und desgleichen) für sekretorische Zellen, die Relaxationswirkungen von Blutgefäßen, Atemwegen, Verdauungstrakten und desgleichen über Epithelzellen oder Endothelzellen, eine glatte Muskel kontrahierende Wirkung, die entzündlichen Zytokinherstellung induzierenden und verstärkenden Wirkungen der Fibroblasten, Epithelzellen und desgleichen, Wirkungen für die Proliferation und Unterdrückung von Zellen, wie Fibroblasten, Epithelzellen (Zilien tragende Zellen, Becherzellen, Baselzellen), glatte Muskelzellen, sekretorische Drüsenzellen und die Überempfindlichkeit verstärkende Wirkung für Nervenzellen, und zum Verbessern und Behandeln von pathologischen Zuständen verwendet werden kann.
  • Da das AST weiterhin den EGFR-Weg aktiviert, kann erwartet werden, dass die Verbindung oder das Polypeptid zum Hemmen oder Modifizieren von physiologischen Wirkungen, welche durch die Aktivierung des EGFR verursacht wurden, wie Sekretionsprodukt-Herstellungs fördernde Wirkungen und Zytokinherstellung för dernde Wirkungen für sekretorische Zellen (Schleimdrüsenzellen, seröse Drüsenzellen, Becherzellen, squamöse Zellen, Krebszellen und desgleichen), entzündliche Zytokinherstellung induzierende und verstärkende Wirkungen für verschiedene Zellen mit EGFR-Weg, wie Fibroblasten, Endothelzellen, Epithelzellen und glatte Muskelzellen, und Zell proliferierende Wirkungen für verschiedene Zellen mit EGFR-Weg, wie Fibroblasten, Endothelzellen, Epithelzellen, Zilien tragende Zellen, Becherzellen, Basalzellen, squamösen Zellen, Krebszellen, glatten Muskelzellen und sekretorische Drüsenzellen, und zum Verbessern und Behandeln von pathologischen Zuständen verwendet werden kann.
  • Durch die direkten und indirekten Wirkungen des AST kann die Verbindung oder das Polypeptid als ein diagnostisches Arzneimittel oder für ein Überprüfungssystem zum Screenen neuer Arzneimittel für chronische Atemwegsentzündung (chronisch obstruktive Lungenerkrankungen (einschließlich chronischer Bronchitis, Lungenemphysem, diffuser Panbronchiolitis und Bronchiektase), bronchitischem Asthma), Sinobronchitis, Lungenfibrose, respiratorische Anaphylaxie, Lungenhochdruck, Erkrankungen, welche durch Fibrinogenolyse-Gerinnungssystem-Störungen verursacht werden, weit definierten Atemwegsgewebekrebs, Arthritis und entzündliche Hauterkrankungen verwendet werden.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung berücksichtigten die oben beschriebenen Zustände und erforschten intensiv Verfahren zum Aufreinigen des AST. Als Ergebnis wurde ein Verfahren zum effizienten Aufreinigen des aktiven AST aus Sputum oder rekombinanten Insektenzellen etabliert. Folglich war es möglich, das AST in einer größeren Menge zu erhalten. Das erhaltene, gereinigte Protein wurde verwendet, um seine Aminosäuresequenz zu bestimmen. Dadurch wurde zum ersten Mal aufgeklärt, dass die Struktur des gereinigten aktiven AST eine Proteinstruktur aufweist, in welcher eine Propeptideinheit mit einer Trypsin-ähnlichen Proteineinheit über eine Disulfidbindung verbunden ist, zusätzlich zu der bereits bekannten Aminosäurestruktur, welche ähnlich zu der eines Trypsin-ähnlichen Proteins ist.
  • Weiterhin wurde gefunden, dass das Enzym in großen Mengen im Bronchialepithel und den Bronchialdrüsen, insbesondere den Zilien tragenden Epithelzellen, Basalzellen, spezifisch exprimiert wird und lokalisiert ist. Es wurde auch gefunden, dass das AST mit der Struktur eine Fähigkeit zum Aktivieren des PAR aufweist. Zusätzlich wurde gefunden, dass das AST die Herstellung von Schleim in einer Zelllinie mit der Fähigkeit zur Schleimsekretion, welche aus einem respiratorischen Organ stammt, fördert. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten Forschung auf der Grundlage der Ergebnisse durch und erreichten folglich die vorliegende Erfindung.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben einen rekombinanten Baculovirusvektor auf der Grundlage der cDNA-Sequenz von HAST (nämlich humanem AST) in Insektenzellen hergestellt ( JP-A 8-89246 , US 5804410 , EP 699763 und Yamaoka K. et al., J. Biol. Chem., 273 (19): 11895-11901, 1998) und das rekombinante Protein exprimiert. Das aktive Protein wurde aus dem rekombinanten Protein durch das in Beispiel 1 gezeigte Reinigungsverfahren aufgereinigt, und die Primärstruktur des aktiven Proteins wurde bestimmt. Folglich wurde gefunden, dass das aktive Protein ein Protein mit einer Struktur enthält, in welcher eine Teilsequenz einer Propeptideinheit, welche eine Aminosäuresequenz zwischen Methionin (Met) an der 1. Position und Arginin (Arg) an der 186. Position (konkret, eine Propeptideinheit, welche bei Asparagin (Asn) an der 145. Position oder bei Asparaginsäure (Asp) an der 162. Position beginnt) umfasst, mit einer Trypsin-ähnlichen Proteineinheit über eine Disulfidbindung verbunden ist, zusätzlich zu dem bereits berichteten Protein mit Trypsin-ähnlicher Struktur ( JP A 7-067640 , S. Yasuoka et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 16: S. 300-308, 1997, eine Trypsin-ähnliche Proteineinheit, welche bei Isoleucin (Ile) an der 187. Position beginnt). Und es wurde entdeckt, dass das Protein mit der oben erwähnten Struktur den Hauptbestandteil des aktiven AST darstellt.
  • Weiterhin wurde natürliches HAST aus Sputum aufgereinigt, und die Aminosäuresequenz des natürlichen HAST wurde ähnlich bestimmt. Folglich wurde wiederum gefunden, dass es ein Protein mit einer Struktur gibt, in welcher eine Teilsequenz einer Propeptideinheit (konkret, eine Propeptideinheit, welche bei Isoleucin (Ile) an der 173. Position beginnt) mit einer Trypsin-ähnlichen Proteineinheit, welche am Isoleucin (Ile) an der 187. Position beginnt, über eine Disulfidbindung verbunden ist. Und es wurde gefunden, dass das Protein mit der Struktur den Hauptbestandteil des aktiven AST darstellt.
  • Unterdessen wurde angenommen, dass das HAST spezifisch im Menschen vorkommt, und es wurde HAT (humane Atemwegs-Trypsin-ähnliche Protease) genannt ( JP-A 7-067640 , S. Yasuoka et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 16: S. 300-308, 1997). Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben jedoch eine PCR (Polymerasekettenreaktion) unter Verwendung eines degenerierten Primers durchgeführt, welcher auf der Grundlage der Homologie mehrerer Serinproteasen hergestellt wurde, und weiterhin unter Verwendung einer cDNA als Matrize, welche aus einem Maus-Atemweg hergestellt wurde, und die Sequenz des erhaltenen DNA-Fragments bestimmt. Folglich wurde zum ersten Mal gefunden, dass ein HAST-ähnliches Protein auch in einem Tier, wie einer Maus, vorkommt, welches keine aufrechte, zweifüßige Fortbewegung durchführt. Zusätzlich wurde die vollständige cDNA, welche das AST-ähnliche Protein der Maus kodiert, durch Ausführen einer 5'-RACE (schnelle Vervielfältigung von cDNA-Enden, engl.: Rapid Amplification of cDNA Ends), 3'-RACE erhalten. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben die Gewebsspezifität der Genexpression untersucht und auch eine atemwegsspezifische Expression in der Maus beobachtet. Weiterhin wurde das erhaltene Maus-AST-Gen in Insektenzellen als eine Rekombinante exprimiert, und die Primärstruktur des Proteins wurde bestimmt. Folglich wurde aufgeklärt, dass das Maus-AST, ähnlich wie das humane AST (HAST), ebenfalls ein Enzym mit einer Struktur darstellt, in welcher die Teilsequenz eines Propeptids, welches eine Aminosäuresequenz zwischen Methionin (Met) an der 1. Position und Arginin (Arg) an der 186. Position umfasst, mit einer Trypsin-ähnlichen Proteineinheit, welche bei Isoleucin (Ile) an der 187. Position beginnt, über eine Disulfidbindung verbunden ist. Durch das ähnliche Verfahren war auch das Klonieren von Hamster-AST und das Klonieren von Meerschweinchen-AST erfolgreich.
  • Zusätzlich wurde durch Verfahren, welche den oben beschriebenen Verfahren ähnlich sind, zum ersten Mal gefunden, dass HAST-ähnliche Proteine auch in höheren Säugern, wie Affe, Schwein, Hund, Kaninchen und Rind vorkommen. Konkret wurde ein degenerierter Primer, welcher auf der Grundlage von cDNA-Sequenzen von humanen und Nagetier-ASTs entworfen wurde, hergestellt, und eine PCR wurde unter Verwendung einer cDNA als Matrize, welche aus einer aus dem Atemweg eines höheren Säugers extrahierten Gesamt-RNA synthetisiert wurde, durchgeführt, um die cDNA-Teilsequenz des AST des höheren Säugers zu amplifizieren, gefolgt durch ein Bestimmen der DNA-Sequenz. Ein Primer für eine RACE wurde auf der Grundlage der bestimmten DNA-Sequenz hergestellt, und eine 5'-RACE, 3'-RACE wurde durchgeführt, um die vollständige cDNA zu erhalten, welche das HAST-ähnliche Protein kodiert. Das so erhaltene Säuger-AST-Gen wurde transient in kultivierten humanen Zellen exprimiert, und es wurde folglich gefunden, dass eine Trypsin-ähnliche Aktivität, welche der des humanen AST (HAST) ähnlich ist, exprimiert werden kann. Weiterhin wurde ein Affen-AST-Gen in Insektenzellen als eine Rekombinante exprimiert, und die Primärstruktur des Proteins wurde bestimmt. Folglich wurde die N-terminale Aminosäuresequenz einer Trypsin-ähnlichen Proteineinheit, welche bei IIGG beginnt, und die Aminosäureteilsequenz eines Propeptids, welches bei DQAA beginnt, in jeweils äquimolaren Mengen nachgewiesen. Und es wurde auch geklärt, dass das Affen-AST, ähnlich wie das humane AST, auch ein Enzym mit einer Struktur darstellt, in welcher eine Propeptidteilsequenz, welche eine Aminosäuresequenz zwischen Methionin (Met) an der 1. Position und Arginin (Arg) an der 186. Position umfasst, mit einer Trypsin-ähnlichen Proteineinheit, welche bei Isoleucin (Ile) an der 187. Position beginnt, über eine Disulfidbindung verbunden ist.
  • Die oben beschriebene Entdeckung des Vorkommens des Tier-AST ermöglicht die Überprüfung der Expression des Tier-AST auf einer Gen-Ebene oder auf einer Protein-Ebene, und die Überprüfung der Expression und Aktivität des Tier-AST in einem Tiermodell für Erkrankungen ist sehr nützlich zum Aufklären der Beteiligung des AST an dem pathologischen Zustand. Zusätzlich kann die Beteiligung des AST in einem pathologischen Modelltier durch Hemmen der Expression des AST mit einem Antisense-Oligonukleotid oder durch Transduzieren eines Expressionsvektors, um die Expression des AST zu verstärken, untersucht werden. Weiterhin wird Information bereitgestellt, welche wichtig für die Überprüfung der medizinischen Wirksamkeit eines AST-Hemmstoffs oder eines hemmenden Polypeptids (einschließlich Proteinen und Antikörpern) in einem Tiermodell ist, und auch wichtig für die Untersuchung und Überprüfung eines Artunterschiedes zwischen den Tieren.
  • Als nächstes ließ man ein rekombinantes AST mit der oben beschriebenen Struktur auf eine rekombinante, PAR exprimierende Insektenzelle wirken, und die Aktivierung des PAR wurde überprüft, wobei der Calciumeinstrom als ein Indikator verwendet wurde. Folglich wurde zum ersten Mal gefunden, dass AST den PAR aktiviert, und dass der Calciumeinstrom in der Insektenzelle, in welcher PAR1 und PAR2 exprimiert werden, verursacht wird.
  • Weiterhin haben sie zum ersten Mal gefunden, dass das AST den PAR in normalen humanen Atemwegs-Epithelzellen und in einer Atemwegs-Epithelzelllinie aktiviert, um einen Calciumeinstrom zu verursachen, und dass das AST mit der Struktur eine Förderung der IL-8 Herstellung und eine Zellproliferation mit einem Signaltransduktionssystem, welches der PAR vermittelt, verursacht, und es wurde aufgeklärt, dass das AST den Krankheitszustand einer Atemwegserkrankung mit dem Signaltransduktionssystem, welches der PAR vermittelt, modifiziert. Und ein Screeningsystem wurde, basierend auf der enzymatischen Aktivität oder auf der PAR-Aktivierungswirkung eines rekombinanten AST-Proteins mit der Struktur, auf der Grundlage der Ergebnisse konstruiert.
  • Zusätzlich wurde zum ersten Mal gefunden, dass in einer humanen Schleim sezernierenden Zelllinie das AST mit der Struktur die Schleimbildung fördert, den intrazellulären Calciumeinstrom verursacht, einen EGFR-Weg und desgleichen aktiviert, um eine Förderung der IL-8-Herstellung und eine Zellproliferation zu verursachen. Und es wurde aufgeklärt, dass in einer chronischen Atemwegserkrankung, in welcher die Schleimbildung gefördert ist, das AST die Schleimbildung för dert, den intrazellulären Calciumeinstrom verursacht, den PAR, den EGFR-Weg und desgleichen aktiviert, um die Förderung der IL-8-Herstellung und die Zellproliferation zu verursachen, und so den pathologischen Zustand zu modifizieren.
  • Weiterhin wurde daher gefunden, dass ein Screeningsystem auf der Grundlage der enzymatischen Aktivität oder der Schleimbildung fördernden Aktivität, der PAR aktivierenden Wirkung, der intrazellulären Calciumeinstrom auslösenden Wirkung, der EGFR-Weg aktivierenden Wirkung und der IL-8-Herstellung verstärkenden Wirkung des rekombinanten AST-Proteins mit der oben beschriebenen Struktur konstruiert werden kann, und die vorliegende Erfindung wurde somit vervollständigt.
  • Die vorliegende Erfindung basiert nämlich auf dem AST mit der Struktur, in welcher die Propeptideinheit mit der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit über die Disulfidbindung verbunden ist.
  • Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung das Hemmstoff- oder hemmende Polypeptid-Screening-System unter Verwendung der Schleimbildung fördernden Wirkung, der PAR aktivierenden Wirkung, der intrazellulären Calciumeinstrom auslösenden Wirkung, der EGFR-Weg aktivierenden Wirkung und der IL-8-Herstellung verstärkenden Wirkung oder der Zellproliferation fördernden Wirkung des Enzyms mit der Struktur als Indikator dar.
  • Die vorliegende Erfindung wird konkreter wie folgt beschrieben.
    • 1. Verfahren zum Screenen für ein(e) zur Hemmung von AST befähigte(s) Verbindung oder Polypeptid, durch Mischen: (i) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzyms mit einer Struktur, in welcher eine Propeptideinheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-170 bis Arg an der 186. Position der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, mit einer Trypsin-ähnlichen Proteineinheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von Ile an der 187. Position bis Ile an der 418. Position der in SEQ ID NR.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz gebildet ist, oder (ii) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Säugerenzyms, welches ein Teil eines Gegenstück-Säugerproteins ist, welches 66% oder mehr Homologie mit dem in SEQ ID NR.: 1 dargestellten atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzym aufweist, und eine Struktur aufweist, in welcher eine der Propeptideinheit entsprechende Einheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-170 bis Arg an der 186. Position mit einer der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit entsprechenden Einheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von Ile an der 187. Position bis Ile an der 418. Position, über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit gebildet ist, oder (iii) einer das Enzym exprimierenden Zelle, oder (iv) eines das Enzym exprimierenden Gewebes, der Verbindung oder des Polypeptids, welche(s) untersucht werden soll, und weiter einer PAR exprimierenden Zelle, und dann das Verwenden der PAR-Aktivierung als Indikator.
    • 2. Nachweisverfahren nach Anspruch 1, wobei der Protease-aktivierte Rezeptor PAR2 ist.
    • 3. Verfahren zum Screenen für ein(e) zur Hemmung von AST befähigte(s) Verbindung oder Polypeptid, durch Mischen: (i) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzyms mit einer Struktur, in welcher eine Propeptideinheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-170 bis Arg an der 186. Position der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, mit einer Trypsin-ähnlichen Proteineinheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von Ile an der 187. Position bis Ile an der 418. Position der in SEQ ID NR.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz gebildet ist, oder (ii) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Säugerenzyms, welches ein Teil eines Gegenstück-Säugerproteins ist, welches 66% oder mehr Homologie mit dem in SEQ ID NR.: 1 dargestellten atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzym aufweist, und eine Struktur aufweist, in welcher eine der Propeptideinheit entsprechende Einheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-170 bis Arg an der 186. Position mit einer der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit entsprechenden Einheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von Ile an der 187. Position bis Ile an der 418. Position, über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit gebildet ist, oder (iii) einer das Enzym exprimierenden Zelle, oder (iv) eines das Enzym exprimierenden Gewebes, der Verbindung oder des Polypeptids, welche(s) untersucht werden soll, und weiter einer Zelle mit einer intrazellulären Calciumeinströmbefähigung, und dann das Verwenden des intrazellulären Calciumeinstroms als Indikator.
    • 4. Verfahren zum Screenen für ein(e) zur Hemmung von AST befähigte(s) Verbindung oder Polypeptid, durch Mischen: (i) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzyms mit einer Struktur, in welcher eine Propeptideinheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-1 70 bis Arg an der 186. Position der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, mit einer Trypsin-ähnlichen Proteineinheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von Ile an der 187. Position bis Ile an der 418. Position der in SEQ ID NR.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz gebildet ist, oder (ii) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Säugerenzyms, welches ein Teil eines Gegenstück-Säugerproteins ist, welches 66% oder mehr Homologie mit dem in SEQ ID NR.: 1 dargestellten atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzym aufweist, und eine Struktur aufweist, in welcher eine der Propeptideinheit entsprechende Einheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-170 bis Arg an der 186. Position mit einer der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit entsprechenden Einheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von He an der 187. Position bis Ile an der 418. Position, über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit gebildet ist, oder (iii) einer das Enzym exprimierenden Zelle, oder (iv) eines das Enzym exprimierenden Gewebes, der Verbindung oder des Polypeptids, welche(s) untersucht werden soll, und weiter einer Zelle mit einer Schleimbildungsfähigkeit, und dann das Verwenden des Sekretionsprodukts als Indikator.
    • 5. Nachweisverfahren nach Anspruch 4, wobei ein Verfahren zum Untersuchen der Schleimbildungsfähigkeit ein AB-PAS Anfärbeverfahren ist.
    • 6. Nachweisverfahren nach Anspruch 4, wobei der Indikator der Schleimbildungsfähigkeit die Menge von exprimiertem Muc5AC ist.
    • 7. Nachweisverfahren nach Anspruch 4, wobei der Indikator der Schleimbildungsfähigkeit die Menge von freigesetztem oder hergestellten EGF, HB-EGF, TGF-α, Amphiregulin oder Betacellulin ist.
    • 8. Nachweisverfahren nach Anspruch 4, wobei der Indikator der Schleimbildungsfähigkeit die Aktivierung eines EGF-R Signaltransduktionswegs ist.
    • 9. Verfahren zum Screenen für ein(e) zur Hemmung von EGF, HB-EGF, TGF-α, Amphiregulin oder Betacellulin befähigte(s) Verbindung oder Polypeptid, durch Mischen: (i) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzyms mit einer Struktur, in welcher eine Propeptideinheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-170 bis Arg an der 186. Position der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, mit einer Trypsin-ähnlichen Proteineinheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von Ile an der 187. Position bis Ile an der 418. Position der in SEQ ID NR.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz gebildet ist, oder (ii) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Säugerenzyms, welches ein Teil eines Gegenstück-Säugerproteins ist, welches 66% oder mehr Homologie mit dem in SEQ ID NR.: 1 dargestellten atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzym aufweist, und eine Struktur aufweist, in welcher eine der Propeptideinheit entsprechende Einheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-170 bis Arg an der 186. Position mit einer der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit entsprechenden Einheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von Ile an der 187. Position bis Ile an der 418. Position über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit gebildet ist, oder (iii) einer das Enzym exprimierenden Zelle, oder (iv) eines das Enzym exprimierenden Gewebes, der Verbindung oder des Polypeptids, welche(s) untersucht werden soll, und weiter einer Zelle mit EGF, HB-EGF, TGF-α, Amphiregulin oder Betacellulin, und dann das Verwenden der Freisetzungsmenge von EGF, HB-EGF, TGF-α, Amphiregulin oder Betacellulin als Indikator.
    • 10. Verfahren zum Screenen für ein(e) zur Hemmung von AST befähigte(s) Verbindung oder Polypeptid, durch Mischen: (i) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzyms mit einer Struktur, in welcher eine Propeptideinheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-170 bis Arg an der 186. Position der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, mit einer Trypsin-ähnlichen Proteineinheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von Ile an der 187. Position bis Ile an der 418. Position der in SEQ ID NR.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz gebildet ist, oder (ii) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Säugerenzyms, welches ein Teil eines Gegenstück-Säugerproteins ist, welches 66% oder mehr Homologie mit dem in SEQ ID NR.: 1 dargestellten atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzym aufweist, und eine Struktur aufweist, in welcher eine der Propeptideinheit entsprechende Einheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-170 bis Arg an der 186. Position mit einer der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit entsprechenden Einheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von Ile an der 187. Position bis Ile an der 418. Position über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit gebildet ist, oder (iii) einer das Enzym exprimierenden Zelle, oder (iv) eines das Enzym exprimierenden Gewebes, der Verbindung oder des Polypeptids, welche(s) untersucht werden soll, und weiter einer Zelle mit einem EGFR-Signaltransduktionsweg, und dann das Verwenden der Aktivierung des EGFR-Signaltransduktionsweges als Indikator.
    • 11. Verfahren zum Screenen für ein(e) zur Hemmung von AST befähigte(s) Verbindung oder Polypeptid, durch Mischen: (i) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzyms mit einer Struktur, in welcher eine Propeptideinheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-170 bis Arg an der 186. Position der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, mit einer Trypsin-ähnlichen Proteineinheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von Ile an der 187. Position bis Ile an der 418. Position der in SEQ ID NR.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz gebildet ist, oder (ii) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Säugerenzyms, welches ein Teil eines Gegenstück-Säugerproteins ist, welches 66% oder mehr Homologie mit dem in SEQ ID NR.: 1 dargestellten atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzym aufweist, und eine Struktur aufweist, in welcher eine der Propeptideinheit entsprechende Einheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-170 bis Arg an der 186. Position mit einer der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit entsprechenden Einheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von ILe an der 187. Position bis Ile an der 418. Position, über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit gebildet ist, oder (iii) einer das Enzym exprimierenden Zelle, oder (iv) eines das Enzym exprimierenden Gewebes, der Verbindung oder des Polypeptids, welche(s) untersucht werden soll, und weiter einer Zelle und das Verwenden der Freisetzungsmenge oder Expressionsmenge von IL-8 oder der Transkriptionsaktivität des IL-8-Promotors als Indikator.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Ergebnisse der AB-PAS-Färbung in einer Schleim sezernierenden Zelllinie NCI-H292 durch das Hinzufügen von EGF-L.
  • 2 zeigt die Ergebnisse der AB-PAS-Färbung in einer Schleim sezernierenden Zelllinie NCI-H292 durch das Hinzufügen von dem erfindungsgemäßem HAST oder EGF-L.
  • 3 zeigt die Ergebnisse der AB-PAS-Färbung in einer Schleim sezernierenden Zelllinie NCI-H292 durch das Hinzufügen von dem erfindungsgemäßen HAST und einem Serinproteasehemmstoff.
  • 4 zeigt die Ergebnisse der AB-PAS-Färbung in einer Schleim sezernierenden Zelllinie NCI-H292 durch das Hinzufügen von dem erfindungsgemäßen HAST oder thermisch behandeltem HAST.
  • 5 zeigt die Assayergebnisse der mRNA-Mengen von Muc5AC, wenn ein Proteasehemmstoff gleichzeitig zu einer Schleim sezernierenden Zelllinie NCI-H292 hinzugefügt wurde, zu welcher das erfindungsgemäße HAST hinzugefügt wurde.
  • 6 zeigt die Assayergebnisse der mRNA-Mengen von Muc5AC, wenn ein EGFR neutralisierender Antikörper oder ein Proteasehemmstoff gleichzeitig zu einer Schleim sezernierenden Zelllinie NCI-H292 hinzugefügt wurde, zu welcher das erfindungsgemäße HAST hinzugefügt wurde.
  • 7 zeigt die Assayergebnisse der mRNA-Mengen von Muc5AC in einer Schleim sezernierenden Zelllinie NCI-H292, zu welcher das erfindungsgemäße AST, Trypsin, Tryptase oder Elastase hinzugefügt wurde.
  • 8 zeigt Assayergebnisse, welche zeigen, dass die Förderung der IL-8-Freisetzung aus einer Atemwegs-Epithelzelllinie BEAS-2B durch das Hinzufügen von erfindungsgemäßem AST mit Proteasehemmstoffen gehemmt wird.
  • 9 zeigt, dass die Förderung der IL-8-Freisetzung aus einer Atemwegs-Epithelzelllinie BEAS-2B durch das Hinzufügen von erfindungsgemäßem AST auf einer Transkriptionsebene stattfindet.
  • 10 zeigt, dass das erfindungsgemäße AST die Tyrosinphosphorylierung von EGFR in einer Schleim sezernierenden Zelllinie NCI-H292 fördert.
  • 11 ist eine Figur, welche die Homologie der Aminosäuresequenz von humanem AST und Maus-AST zeigt.
  • 12 zeigt den Calciumeinstrom in PAR exprimierende Insektenzellen aufgrund des erfindungsgemäßen AST.
  • 13 zeigt den Calciumeinstrom aufgrund des erfindungsgemäßen AST in normalen humanen Atemwegs-Epithelzellen.
  • 14 zeigt den Calciumeinstrom aufgrund des erfindungsgemäßen AST in der Atemwegs-Epithelzelllinie.
  • 15 zeigt die Ergebnisse der Überprüfung der hemmenden Aktivitäten der erfindungsgemäßen Anti-AST-Antikörper.
  • 16 zeigt die Standardkurve eines Assaysystems unter Verwendung des erfindungsgemäßen polyklonalen Anti-AST-Antikörpers gegen ein rekombinantes AST.
  • 17 zeigt die Assay-Ergebnisse von AST in Sputum durch ein Assaysystem unter Verwendung des erfindungsgemäßen polyklonalen Anti-AST-Antikörpers.
  • 18 zeigt die Ergebnisse, welche durch Untersuchen der antigenen Reaktivität der flüssigen Phase von dem erfindungsgemäßen monoklonalen Anti-AST- Antikörper und polyklonalem Anti-AST-Antikörper mit dem rekombinanten AST erhalten wurden.
  • 19 zeigt die Standardkurve eines Assaysystems unter Verwendung des erfindungsgemäßen monoklonalen Anti-AST-Antikörpers und des polyklonalen Anti-AST-Antikörpers gegen das rekombinante AST.
  • Beste Weise, um die Erfindung auszuführen
  • In dem atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzym, auf das sich die vorliegende Erfindung bezieht, welches die gesamte in SEQ ID NR: 1 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst, ist die Propeptideinheit mit der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit über die Disulfidbindung von Cys an 173. Position mit Cys an der 292. Position verbunden. In dem atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Säugerenzym, auf das sich die vorliegende Erfindung bezieht, welches die 66% oder mehr Homologie mit der in SEQ ID NR: 1 dargestellten Aminosäuresequenz aufweist, ist eine der Propeptideinheit entsprechende Einheit mit einer der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit entsprechenden Einheit über die Disulfidverbindung einer dem Cys an der 173. Position entsprechenden Cysteineinheit mit einem, dem Cys an der 292. Position entsprechenden Cysteineinheit, in dem durch die SEQ ID NR: 1 dargestellten AST verbunden.
  • In einem Fall des humanen AST stellt die Propeptideinheit eine Propeptideinheit dar, deren N-terminale (aminoterminale) Aminosäure eine Aminosäure zwischen Asn an der 145. Position und Ile an der 170. Position darstellt. Eine Propeptideinheit, welche von einem von Asn an der 145. Position, Asp an der 162. Position und Ile an der 170. Position bis Arg an der 186. Position als de C-Terminus (Carboxylterminus) reicht, ist insbesondere bevorzugt. Eine Propeptideinheit, welche von einem von Asp an der 162. Position und Ile an der 170. Position bis Arg an der 186. Position reicht, ist am meisten bevorzugt.
  • Das AST oder die AST exprimierende Zelle, welche in dem Verfahren zum Screenen der AST hemmenden Aktivität der Verbindung oder des Polypeptids, welche(s) untersucht werden soll, verwendet wird, stellt im Allgemeinen das oben erwähnte AST mit der Struktur dar oder eine Zelle, welche das AST herstellt, vorzugsweise eine AST-exprimierende Zelle oder ein Organ, ein Gewebe, welches aus einem oralen Gewebe, nasalen Gewebe, paranasalen Sinusgewebe, pharyngealen Gewebe, laryngealen Gewebe, der Luftröhre, Bronchien- oder Lungengewebe stammt, eine Zelle, welche aus dem Gewebe oder aus einer Zelllinie davon stammt. Die Zelle oder Zelllinie, welche aus dem Gewebe stammt, schließt Krebszellen und Krebszelllinien ein. Insbesondere Epithelzellen, insbesondere Zilien tragende Epithelzellen oder Basalzellen oder Zelllinien, welche aus den Zellen stammen, sind bevorzugt. Das gereinigte AST mit der oben beschriebenen Struktur ist am meisten bevorzugt, um für eine Überprüfung bereitgestellt zu werden.
  • In dem Verfahren zum Screenen der hemmenden Aktivität der Verbindung oder des Polypeptids, welche(s) untersucht werden soll, gegenüber der Schleimbildung fördernden Wirkung aufgrund des AST, wird die Färbungsmenge des Schleimglykoproteins durch ein AB-PAS-Anfärbeverfahren, die Freisetzungsmenge eines Schwefelsäure markierten Polymers, die Herstellungsmenge von Mucin, die mRNA-Expressionsmenge von Mucin (insbesondere Muc5AC), die Promotor-Transkriptionsaktivität des Mucins (insbesondere Muc5AC), die Liganden herstellende oder freisetzende Menge eines EGF-Rezeptors, die phosphorylierte Tyrosinmenge eines Proteins, welches an dem EGF-Rezeptor-Signaltranduktionsweg beteiligt ist oder die Menge einer phosphorylierten MAPK (MAP-Kinase) vorzugsweise als Indikator der Schleimbildung fördernden Wirkung angeführt.
  • In einem Verfahren zum Screenen der hemmenden Aktivität der Verbindung oder des Polypeptids, welche(s) untersucht werden soll, gegenüber der EGFR-Weg aktivierenden Wirkung aufgrund des AST, kann die Spaltungs- oder Freisetzungsmenge des EGFR-L (EGFR-Ligand), das Assayziel des bereits erwähnten EGFR-Signaltransduktionssystems (Wells A., Int. J. of Biochem. & Cell Biology, 31: 637-643, 1999), ein durch die Signaltransduktion verursachtes Phänomen o der desgleichen als Indikator der EGFR-Weg-Aktivierung verwendet werden, um die EGFR-Signaltranduktionssystem-Aktivierung aufgrund des AST zu untersuchen.
  • Der Indikator der EGFR-Weg-Aktivierung schließt einen intrazellulären Calciumeinstrom, einen Zellproliferationsassay, den Assay der Transkriptionsaktivität eines Gens (IL-8, IL-6, GM-CSF oder desgleichen), welches ein Transkriptionselement, wie NFkB oder AP-1 enthält, den Assay eines hergestellten Proteins, den Assay einer Inositolphosphat abbauenden Aktivität in Zellen, den Assay der Prostaglandin-E2-Herstellung, den Assay von Thromboxan A2, den Assay von cAMP (cyclisches AMP), den Assay einer Schleimbildungsmenge, die Herstellungsmenge von Mucin, die mRNA-Expressionsmenge von Mucin (insbesondere Muc5AC), die Promotor-Transkriptionsaktivität des Mucins (insbesondere Muc5AC) und die phosphorylierte Tyrosinmenge eines Proteins (die phosphorylierte Tyrosinmenge von EGFR, MAPK (MAP-Kinase) oder desgleichen), welches an einem EGF-Rezeptor-Signaltransduktionsweg beteiligt ist, ein.
  • In einem Verfahren zum Screenen der hemmenden Aktivität der Verbindung oder des Polypeptids, welche(s) untersucht werden soll, gegenüber der PAR aktivierenden Wirkung aufgrund des AST, kann die PAR-Signaltransduktionssystem-Aktivierung aufgrund des AST mit dem bereits erwähnten Assayziel als Indikator der PAR-Signaltransduktions-Aktivierung untersucht werden.
  • Der Indikator der PAR-Signaltransduktions-Aktivierung schließt einen intrazellulären Calciumeinstrom, einen Zellproliferationsassay, den Assay der Transkriptionsaktivität oder des hergestellten Proteins eines Gens (IL-8, IL-6, GM-CSF oder desgleichen), welches ein Transkriptionselement, wie NFkB oder AP-1 enthält, den Assay einer Inositolphosphat abbauenden Aktivität in Zellen, den Assay der Prostaglandin-E2-Herstellung, den Assay von Thromboxan A2, den Assay von cAMP (cyclisches AMP), ein Verfahren zum direkten oder indirekten Untersuchen der Herstellung von NO (Stickstoffmonoxid), den Assay der Calciumfreisetzung oder der elektrischen Leitfähigkeit mit Xenopus Oocyten, den Assay einer Chlorid ionen-Transportmenge über einen Chloridkanal und den Assay einer sezernierten Schleimmenge ein.
  • Zusätzlich ist die AST exprimierende Zelle vorzugsweise eine rekombinante Zelle, die das Enzym exprimiert. Weiterhin stammt die AST exprimierende Zelle oder ein Gewebe, welche(s) das Enzym exprimiert, vorzugsweise aus einem oralen Gewebe, nasalen Gewebe, paranasalen Sinusgewebe, pharyngealen Gewebe, laryngealen Gewebe, der Luftröhre, Bronchien- oder Lungengewebe oder ist vorzugsweise eine Zelle, welche aus dem Gewebe, einem Organ oder dem Gewebe, oder einer Zelllinie davon stammt. Die Zelle oder die Zelllinie, welche aus dem Gewebe stammt, schließt Krebszellen und Krebszelllinien ein. Insbesondere sind Epithelzellen, insbesondere Atemwegs-Epithelzellen, weiterhin insbesondere Zilien tragende Epithelzellen oder Basalzellen oder Zelllinien, welche aus den Zellen stammen, bevorzugt. Zusätzlich schließt die AST-exprimierende Zelle Becherzellen oder eine Zelllinie ein, welche aus den Becherzellen stammt, Schleimdrüsenzellen oder eine Zelllinie, welche aus den Schleimdrüsenzellen stammt, und seröse Drüsenzellen oder eine Zelllinie, welche aus den serösen Drüsenzellen stammt.
  • Die Zellen zum Überprüfen der Sekretion schließen eine Schleim sezernierende Zelllinie, NCI-H292 ein und schließen weiterhin vorzugsweise Zellen mit sekretorischer Fähigkeit, ein Organ oder Gewebe, welches in einem oralen Gewebe, nasalen Gewebe, paranasalen Sinusgewebe, pharyngealen Gewebe, laryngealen Gewebe, der Luftröhre, Bronchien- oder Lungengewebe vorkommt, vorzugsweise Atemwegsepithelzellen, insbesondere Zilien tragende Epithelzellen oder Basalzellen oder Zelllinien, welche aus den Zellen stammen, ein. Die Zellen oder die Zelllinie, welche aus dem Gewebe stammt/en, schließt/en Krebszellen und Krebszelllinien ein. Zusätzlich schließen die Zellen mit sekretorischer Fähigkeit vorzugsweise Becherzellen oder eine Zelllinie, welche aus den Becherzellen stammt, Schleimdrüsenzellen oder eine Zelllinie, welche der den Schleimdrüsenzellen stammt, und seröse Drüsenzellen oder eine Zelllinie, welche aus den serösen Drüsenzellen stammt, ein. Als Zelllinien etablierte NCI-H292 Zellen, A549-Zellen und desgleichen werden am meisten bevorzugt für die Überprüfung bereitgestellt.
  • Die PAR exprimierenden Zellen schließen PAR exprimierende rekombinante Insektenzellen ein, und schließen weiterhin vorzugsweise PAR exprimierende Zellen, ein Organ oder Gewebe, welches in einem oralen Gewebe, nasalen Gewebe, paranasalen Sinusgewebe, pharyngealen Gewebe, laryngealen Gewebe, der Luftröhre, Bronchien- oder Lungengewebe vorkommt, insbesondere vorzugsweise Atemwegs-Epithelzellen, insbesondere Zilien tragende Epithelzellen oder Basalzellen oder Zelllinien, welche aus den Zellen stammen, ein. Zusätzlich schließen die PAR exprimierenden Zellen vorzugsweise Becherzellen oder eine Zelllinie, welche aus den Becherzellen stammt, Schleimdrüsenzellen oder eine Zelllinie, welche aus den Schleimdrüsenzellen stammt, seröse Drüsenzellen oder eine Zelllinie, welche aus den serösen Drüsenzellen stammt, glatte Muskelzellen des Atemwegs, Lungenfibroblasten und Nervenzellen ein. Als eine Zelllinie etablierte BEAS-2B werden am meisten bevorzugt für die Überprüfung bereitgestellt.
  • Die konkreten Bespiele des PAR stellen Protease-aktivierende Rezeptoren dar, welche mit dem AST aktiviert werden, vorzugsweise PAR1 und PAR2 von den bekannten PAR1, PAR2, PAR3 und PAR4, am meisten bevorzugt PAR2 von den vier PARs.
  • Die EGFR-L exprimierenden Zellen schließen rekombinante EGFR-L exprimierende Tierzellen ein, und schließen weiterhin vorzugsweise Zellen, Organe oder Gewebe, welche in einem oralen Gewebe, nasalen Gewebe, paranasalen Sinusgewebe, pharyngealen Gewebe, laryngealen Gewebe, der Luftröhre, Bronchien- oder Lungengewebe vorkommen, insbesondere vorzugsweise Atemwegsepithelzellen, insbesondere Zilien tragende Epithelzellen oder Basalzellen oder Zelllinien, welche aus den Zellen stammen, ein. Zusätzlich schließen die EGFR-L exprimierenden Zellen vorzugsweise Becherzellen oder eine Zelllinie, welche aus den Becherzellen stammt, Schleimdrüsenzellen oder eine Zelllinie, welche aus den Schleimdrüsenzellen stammt, seröse Drüsenzellen oder eine Zelllinie, welche aus den serösen Drüsenzellen stammt, glatte Muskelzellen des Atemwegs, Lungenfibroblasten und Nervenzellen ein.
  • Konkrete Beispiele schließen als Zelllinien etablierte HCI-H292, A549 und desgleichen ein. Rekombinante EGFR-L exprimierende Insektenzellen oder Tierzellen werden vorzugsweise für eine Überprüfung bereitgestellt.
  • Das konkrete Beispiel für den EGFR-L ist im Allgemeinen EGFR-L, welcher mit dem AST freigesetzt werden soll, und schließt die bekannten EGF, HB-EGF, TGF-α, Amphiregulin und Betacellulin ein. EGF und HB-EGF befinden sich vorzugsweise unter den bekannten Substanzen, und EGF ist am meisten bevorzugt.
  • Die EGFR exprimierenden Zellen schließen die NCI-H292 Zelllinie ein, und schließen weiterhin vorzugsweise Zellen, Organe oder Gewebe, welche in einem oralen Gewebe, nasalen Geweben, paranasalen Sinusgewebe, pharyngealen Gewebe, laryngealen Gewebe, der Luftröhre, Bronchien- oder Lungengewebe vorkommen, insbesondere vorzugsweise Atemwegsepithelzellen, insbesondere Zilien tragende Epithelzellen, squamöse Zellen, Basalzellen oder Krebszellen oder Zelllinien, welche aus den Zellen stammen, ein. Zusätzlich schließen die EGFR-L exprimierenden Zellen vorzugsweise Becherzellen oder eine Zelllinie, welche aus den Becherzellen stammt, Schleimdrüsenzellen oder eine Zelllinie, welche aus den Schleimdrüsenzellen stammt, seröse Drüsenzellen oder eine Zelllinie, welche aus den serösen Drüsenzellen stammt, glatte Muskelzellen des Atemwegs, Lungenfibroblasten und Nervenzellen ein. Die EGFR-L exprimierenden Zellen sind am meisten vorzugsweise als Zelllinien etablierte HCI-H292, A549 und desgleichen.
  • Das konkrete Beispiel für den EGFR-L ist im Allgemeinen EGFR-L, welcher mit dem AST freigesetzt werden soll, und schließt die bekannten EGF, HB-EGF, TGF-α, Amphiregulin und Betacellulin ein. EGF und HB-EGF befinden sich vorzugsweise unter den bekannten Substanzen, und EGF ist am meisten bevorzugt.
  • Varianten des Säuger-AST-Gens, welches in der vorliegenden Erfindung beschrieben wird, schließen das der Maus ein, welches durch eine in SEQ ID NR: 5 oder SEQ ID NR: 6 dargestellte mRNA oder cDNA kodiert wird. Ähnlich schließen weitere Varianten des Säuger-AST, welches in der vorliegenden Erfindung beschrieben wird, jene vom Affen, Schwein, Hund, Kaninchen, Rind, Hamster und Meerschweinchen ein, wobei die mRNA oder cDNA, die jene ASTs kodiert, durch SEQ ID NR: 27, 29, 31, 33, 35, 37 oder 39 dargestellt sind.
  • Expressionsvektoren, welche das AST kodieren, das in der vorliegenden Erfindung erwähnt wird, und welche mit der vollständigen oder teilweisen Information der Nukleinsäuresequenzen hergestellt werden, können hergestellt werden, sowie eine Zelle, welche mit dem Expressionsvektor transfiziert oder transformiert wird, ein Verfahren zum Herstellen des AST, welches das Kultivieren der Zellen und anschließende Gewinnen des aktiven AST mit der Struktur aus der Kulturflüssigkeit oder den kultivierten Zellen umfasst, und das AST, welches durch das Herstellungsverfahren erhalten wird. Weiterhin kann das natürliche Säuger-AST aus der Körperflüssigkeit, Zellen oder Zelllinien eines Säugers, in welchem das natürliche Säuger-AST vorkommt, aufgereinigt werden.
  • Durch die erfindungsgemäßen Verfahren identifizierte Verbindungen können verwendet werden, um einen Säuger zu behandeln, welcher eine Erkrankung aufweist, die durch den Aktivierungsüberschuss oder die Hochregulation des oben beschriebenen AST gekennzeichnet ist.
  • Die Erkrankung, die durch den Aktivierungsüberschuss oder die Hochregulation des oben beschriebenen AST gekennzeichnet ist, schließt chronische Atemwegsentzündung, chronische obstruktive Lungenerkrankungen, chronische Bronchitis, Lungenemphysem, diffuse Panbronchiolitis, Bronchiektase, Asthma, Sinobronchitis, Fibrose, Nervenüberempfindlichkeit, Erkrankungen aufgrund von Fibrinogenolyse-Gerinnungssystem-Störungen, Krebs, Arthritis und entzündliche Hauterkrankungen ein und schließt insbesondere entzündliche Erkrankungen des respiratorischen Systems und Erkrankungen, deren pathologische Zustände durch Sekretionsstörungen in oralen Geweben, nasalen Geweben, paranasalen Sinusgeweben, pharyngealen Geweben, laryngealen Geweben, Luftröhren, den Bronchien- oder Lungengeweben verursacht werden, extrazelluläre Substratsynthesestörun gen, Zellvervielfältigungsstörungen, Zelldifferenzierungsstörungen, Nervensystemstörungen, Immunsystemstörungen, Störungen des mukoziliären Transportsystems oder Störungen des Fibrinogenolyse-Gerinnungssystems ein.
  • Die Erkrankung, welche durch die Schleimbildungsförderung, die Entzündungsförderung, die Förderung des intrazellulären Calciumeinstroms, die EGFR-Weg-Aktivierung oder die PAR-Aktivierung aufgrund des AST gekennzeichnet ist, schließt chronische Atemwegsentzündung, chronische obstruktive Lungenerkrankungen, chronische Bronchitis, Lungenemphysem, diffuse Panbronchiolitis, Bronchiektase, Asthma, Sinobronchitis, Fibrose, Nervenüberempfindlichkeit, Erkrankungen aufgrund von Fibrinogenolyse-Gerinnungssystem-Störungen, Krebs, Arthritis und entzündliche Hauterkrankungen ein und schließt insbesondere entzündliche Erkrankungen des respiratorischen Systems und Erkrankungen, deren pathologische Zustände durch Sekretionsstörungen in oralen Geweben, nasalen Geweben, paranasalen Sinusgeweben, pharyngealen Geweben, laryngealen Geweben, Luftröhren, den Bronchien- oder Lungengeweben verursacht werden, extrazelluläre Substratsynthesestörungen, Zellvervielfältigungsstörungen, Zelldifferenzierungsstörungen, Nervensystemstörungen, Immunsystemstörungen, Störungen des mukoziliären Transportsystems oder Störungen des Fibrinogenolyse-Gerinnungssystems ein.
  • In den Beispielen 13, 14 der vorliegenden Erfindung wird die Schleimbildung fördernde Wirkung des AST mit der NCI-H292 Zelllinie überprüft, und die Zelle, die in dem System zum Screenen der Hemmung der Schleimbildungsförderung der AST-Hemmstoffe verwendet wird, ist vorzugsweise eine Zelle mit einer Sekretionsfähigkeit, weiter bevorzugt eine Zelle, ein Organ oder Gewebe mit der Sekretionsfähigkeit in einem respiratorischen System. Die als Zelllinie etablierte NCI-H292 Zelle, A549 Zelle oder desgleichen wird am meisten bevorzugt, um für die Überprüfung bereitzustehen.
  • Das Sekretionsprodukt, welches als Indikator verwendet wird, stellt eine organische Substanz oder eine inorganische Substanz dar, und die organische Substanz ist vorzugsweise ein Glykoprotein, weiter vorzugsweise ein Schleim. Mucin, welches ein Bestandteil des Schleims darstellt, ist am meisten bevorzugt als Sekretionsindikator aus Beziehungen mit pathologischen Zuständen (Tsuda, T. et al., "Molecular Biology of Respiratory Diseases"; 87-92, 1998). Weiterhin sind Muc5AC (Meerzaman, D. et al., J. Biol. Chem., 269: 12932-12939, 1994), Muc2 (Gum, J. R. Jr., et al., J. Biol. Chem. 269 (4): 2440-2446, 1994) und desgleichen, welche in pathologischen Zuständen der Hypersekretion, wie COPD beachtet werden, insbesondere unter den Mucinen bevorzugt.
  • Die Ausführungsform des Assayindikators in dem HAST Hemmstoff-Screeningsystem, das auf der Schleimbildung fördernden Wirkung basiert, schließt vorzugsweise (1) einen Enzym-Immunassay unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers 17Q2 (humanes Atemwegsmucin wird als Antigen verwendet), welcher ein Antikörper gegen das Mucin-Antigen darstellt (Thomas, E. et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 14: 104-112, 1996) oder desgleichen, das Schleim färbende Verfahren (AB-PAS Färbung), welches in Beispiel 13 gezeigt wird, und ein Verfahren zum Untersuchen der Freisetzungsmenge eines Schwefelsäure markierten Polymers, auf der Ebene der Glykoproteine und (2) ein Echtzeit-PCR-Verfahren, welches in Beispiel 14 als Verfahren zum Untersuchen der mRNA-Menge des Mucins (vorzugsweise Muc5AC, Muc2) offenbart wird, und ein Reportergen-Assaysystem unter Verwendung der Promotordomäne des Mucins als ein Verfahren zum Überprüfen der Transkriptionsaktivität des Gens, auf der Ebene der Gene ein.
  • Da der Muc5AC mRNA-Anstieg, welcher auf der Aktivität des HAST basiert, mit dem EGF-R neutralisierenden Antikörper blockiert wird, wie in Beispiel 14 gezeigt ist, kann zusätzlich abgeschätzt werden, dass die Signaltransduktion des EGF-R-Wegs einer der Hauptwege der Schleimbildungsförderung aufgrund des AST werden kann (Takeyama, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 3081-3086, 1999). Die Wirkung des AST-Hemmstoffs kann durch Quantifizieren der Reaktion untersucht werden, die an dem EGF-R-Signaltransduktionsweg beteiligt ist (Louis, M. L. et al., Current Opinion in Cell Biology, 11: 177-183, 1999). Wenn die Reaktionen in dem oben beschriebenen verwandten Weg quantifiziert werden können wird es für alle Reaktionen möglich sein, dass sie als Assayindikatoren verwendet werden. Zum Beispiel können die Phosphorylierung des Tyrosinrestes des EGF-R und die Phosphorylierung der MAPK (Mitogen aktivierten Proteinkinase) in Zielzellen als Indikatoren in einem Immunassay verwendet werden.
  • Die Ausführungsform des AST-Hemmstoff-Screeningsystems, das auf der Schleimbildung fördernden Wirkung basiert, schließt einen Assay der Schleimbildung hemmenden Wirkung ein, welcher das Hinzufügen des AST zu einem Gewebe, Organ oder einer kultivierten Zelle, welche eine Schleim sezernierende Fähigkeit aufweist, das Hinzufügen einer Verbindung oder desgleichen und anschließend das Untersuchen der Menge des Sekretionsprodukts, der Menge der mRNA, der Transkriptionsaktivität des Gens oder desgleichen umfasst. Weiterhin kann, wie oben beschrieben, die Hemmwirkung durch ein Verfahren zum direkten Untersuchen des Gehalts des EGFR-L in dem Organ oder dem Zellkulturüberstand, durch ein Verfahren für das Hinzufügen zu irgendeinem anderen Zellsystem und einem anschließenden indirekten Untersuchen des Gehalts des EGFR-L oder desgleichen festgestellt werden. Der zu untersuchende EGFR-L schließt vorzugsweise EGF (Epidermaler Wachstumsfaktor, engl.: Epidermal Growth Factor, Carpenter, G. et al., J. Biol. Chem., 265: 7709-7712, 1990), HB-EGF (Heparin bindender EGF-ähnlicher Wachstumsfaktor, engl.: Heparin-binding EGF-like Growth Factor, Abraham, J. A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 190: 125-133, 1993), TGF-α (transformierender Wachstumsfaktor-α, engl.: Transforming Growth Faktor-α, Lee, D. C. et al., Pharm. Rev., 47: 51-85, 1995) Amphiregulin (Plowman, G. D. et al., Mol. Cell. Biol., 10: 1969-1981, 1990) und Betacellulin (Shing, Y. et al., Science, 259: 1604-1607, 1993) (Gerhard, R. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1333: F179-F199, 1997) ein. EGF, HB-EGF sind insbesondere bevorzugt.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend detaillierter durch Beispiele erklärt werden, aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Beispiele beschränkt.
  • [Beispiel 1] Herstellung von AST
  • Die Aufreinigung eines aktiven natürlichen AST aus Sputum wurde durch dasselbe Verfahren, wie das unten beschriebene Verfahren zum Aufreinigen eines rekombinanten AST durchgeführt.
  • Die Aufreinigung eines rekombinanten HAT wurde durch Herstellen eines rekombinanten Baculovirusvektors auf der Grundlage einer cDNA-Sequenz, welche in den JP-A 8-89246 , US-5804410 , EP-699763 und in Yamaoka K. et al., J. Biol. Chem., 273(19): 11895-11901, 1998, offenbart wird, durch Infizieren von Insektenzellen mit dem rekombinanten Baculovirusvektor, um das rekombinante AST (rAST) herzustellen und anschließend durch Reinigen des rAST aus der Zellfraktion des Produkts, durchgeführt. Den Insektenzellen (Tn-5-Zellen) wurde nämlich erlaubt, bis zu einer Dichte von 5 × 106 Zellen/mol in einer einzelnen Schicht zu wachsen, und das Kulturmedium wurde anschließend entfernt. Ein serumfreies Kulturmedium, welches das rekombinante AST exprimierende Baculovirus enthielt, wurde zu den gewachsenen Insektenzellen in einer MOI (Multiplizität der Infektion) von 0,2 bis 0,5 pro Zelle hinzugefügt, um die Insektenzellen mit dem rekombinanten AST exprimierenden Baculovirus zu infizieren, und die infizierten Insektenzellen wurden für drei Tage kultiviert, um das AST zu exprimieren. Die Identifikation des exprimierten Proteins wurde durch ein Western-Blot-Verfahren unter Verwendung einer SDS-PAGE und eines Anti-AST-Peptidantikörpers (Anal. Biochem., 112, 195-203, 1981) durchgeführt.
  • Das Kulturprodukt wurde zentrifugiert (ungefähr 500 × g), um die Zellen vom Überstand zu trennen. Die 450 ml entsprechenden Zellen wurden in 100 ml M-PER (Säugerprotein-Extraktionsreagens, engl.: Mammalian Protein Extraction Reagent, von PIERCE Corp. hergestellt), bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert und weiterhin einer Ultraschall-Aufschlussbehandlung auf Eis für 15 Minuten ausgesetzt, um die Zellen zu lysieren. Das erhaltene Lysat wurde bei 10.000 rpm bei 4°C für 30 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wurde gewonnen. Der gewon nene Überstand wurde mit 1 Liter 50 mM Natriumacetat (pH-Wert 4)/0,01% PEG 6000 bei Raumtemperatur für 2 Stunden unter Rühren dialysiert, und anschließend bei 10.000 rpm bei 4°C für 30 Minuten zentrifugiert, um den Überstand zu gewinnen.
  • Nachfolgend wurde die gewonnene Probe mit BSA (Endkonzentration: 100 μg/ml) gemischt, zweimal mit 2 Litern 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 8)/0,5 M NaCl/0,01% PEG 6000 analysiert und anschließend bei 10.000 rpm bei 4°C für 30 Minuten zentrifugiert, um den Überstand zu gewinnen. Der gewonnene Überstand wurde auf Benzamidin-Sepharose 6B (10 ml Bettvolumen) gebracht, mit 100 ml 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 8)/0,5 M NaCl/0,01% PEG 6000 in einer Säule gewaschen, weiterhin mit 80 ml einer 10 mM Natriumphosphatpufferlösung (pH-Wert 7,5) in der Säule gewaschen und anschließend der Elution des gebundenen Proteins mit 10 mM HCl (pH-Wert 2) ausgesetzt. Nach der Elution wurde die Absorption (280 nm) jeder Fraktion untersucht, und die Hauptpeak-Fraktionen wurden gesammelt. Die gesammelten Hauptpeak-Fraktionen wurden einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unterzogen, um das Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 30 kD nachzuweisen und zu identifizieren, welches als die gereinigte rAST-Probe eingefroren und gelagert wurde.
  • [Beispiel 2] Aktivitätsassay von AST
  • 50 μl einer AST enthaltenden Lösung wurden zu 1,0 ml einer 50 mM Tris-HCl Pufferlösung (pH-Wert 8,6) hinzugefügt, welche 100 μM eines synthetischen Substrats Boc-Phe-Ser-Arg-MCA (MCA: Methylcoumarinamid) für Trypsin und 0,01% BSA enthielt, und anschließend bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Nachfolgend wurde 1 ml 30% Essigsäure hinzugefügt, und das hergestellte 7-Amino-4-methylcoumarin (AMC) wurde durch eine Fluorometrie untersucht (Fluoreszenzlicht: 460 nm, Anregungslicht: 380 nm). Die enzymatische Aktivität wurde berechnet. Die Aktivität zum Herstellen von 1 pM AMC für eine Minute wurde als eine Einheit definiert.
  • [Beispiel 3] Bestimmung der Aminosäuresequenzen von rekombinantem AST und natürlichem AST
  • Das in Beispiel 1 erhaltene Protein wurde einer SDS-PAGE unter jeweils reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen ausgesetzt. Nach jeder Elektrophorese wurde das Protein im Gel auf eine PVDF (Polyvinylidendisulfid)-Membran übertragen (Immobilon-P-Transfermembran, Millipore Corp.) und anschließend in einer Coomassie Blau R-250 Lösung (0,1% einer 50% Methanollösung) gefärbt. Die Bande des AST-Proteins an einer Stelle in der Nähe von ungefähr 30 kD wurde ausgeschnitten, und die Aminosäuresequenz des AST-Proteins wurde bestimmt.
  • Folglich wurde bezüglich des rekombinanten AST, welches in den Insektenzellen exprimiert wurde, eine Aminosäuresequenz, beginnend mit I-L-G-G, unter der reduzierenden Bedingung identifiziert. Drei Arten von Banden wurden unter der nicht reduzierenden Bedingung identifiziert. Wenn die drei Arten der Proteine nacheinander als (a), (b) und (c), vom Protein mit dem größten Molekulargewicht, bezeichnet wurden, betrugen die Gehalte von (a), (b) und (c) jeweils 8%, 87% und 5%, welche durch das Färben mit Silber abgeschätzt wurden. Die Banden wurden ausgeschnitten, und anschließend wurden die Aminosäuresequenzen der Proteine bestimmt. Die bestimmten Aminosäuresequenzen waren (a) eine Aminosäuresequenz, beginnend mit N-S-G-N-L-E-I-N und I-L-G-G-T-E-A-E in jeweils äquivalenten Molanteilen, (b) eine Aminosäuresequenz, beginnend mit D-Q-A-A-A-N-W-L und I-L-G-G-T-E-A-E in jeweils äquivalenten Molanteilen und (c) eine Aminosäuresequenz, beginnend mit I-L-G-G-T-E-A-E. Das vorher erwähnte AST ist das Protein, welches die Struktur (c) aufweist.
  • Aus den oben beschriebenen Ergebnissen wurde gefunden, dass die Hauptbande (87%) des gereinigten rAST die Struktur (b) aufwies, in der eine Propeptideinheit, beginnend mit D-Q-A-A-A-N-W-L mit einer Trypsin-ähnlichen Proteineinheit, beginnend mit I-L-G-G-T-E-A-E über eine Disulfidbindung verbunden war. Die Struktur weist die Aktivität auf.
  • Andererseits wurde bezüglich des aus dem Sputum aufgereinigten AST eine Aminosäuresequenz, beginnend mit der bereits erwähnten I-L-G-G unter der reduzierenden Bedingung identifiziert. Mittlerweile konnten die Peaks der Aminosäuren jeweils identifiziert werden, zusätzlich zu I-L-G-G unter der nicht reduzierenden Bedingung. Die Sequenz wurde als I-N-E-Leerzeichen-G-A-G-P gelesen (das erste I war dasselbe wie das des Hauptpeaks). Die Sequenz stimmte mit der Aminosäuresequenz des humanen AST überein, beginnend mit I an der 170. Position des Propeptids. Dabei wurde zum ersten Mal gefunden, dass das natürliche AST, welches aus dem Sputum stammte, hauptsächlich eine Struktur aufwies, in der das Propeptid über eine Disulfidbindung verbunden war, ähnlich wie das rekombinante AST. Es wurde aufgeklärt, dass das natürliche AST eine Struktur aufwies, in welcher das Cystein der Disulfidbindung auf der Propeptid (leichte Kette)-Seite das Cystein an der 173. Position war, und in welcher die Trypsin-ähnliche Enzymeinheit (schwere Kette) mit der Cysteineinheit, welche dem Cystein an der 292. Position durch einen Strukturhomologie-Vergleich mit der anderen Trypsinsubstanz entsprach, über die Disulfidbindung verbunden war.
  • [Beispiel 4] Herstellung von verschiedenen rekombinanten humanen PAR exprimierenden Zellen
  • (1) Erhalt von PAR-cDNA und Herstellung von PAR-cDNA enthaltendem Transfervektor
  • RNA wurde aus normalen humanen Atemwegsepithelzellen extrahiert, und cDNA wurde unter Verwendung eines cDNA-Synthesekits (von Amersham Pharmacia Biotech. Corp. hergestellt), synthetisiert. PAR-1 wurde mit den Primern PAR1F (SEQ ID NR: 7) und PAR1R (SEQ ID NR: 8) durch eine PCR amplifiziert, und PAR-2 wurde mit den Primern PAR2F (SEQ ID NR: 9) und PAR2R (SEQ ID NR: 10) durch eine PCR amplifiziert. PAR-3 wurde auch mit den Primern PAR3F (SEQ ID NR: 11) und PAR3R (SEQ ID NR: 12) durch eine PCR amplifiziert. PAR-4 wurde weiterhin mit den Primern PAR4F (SEQ ID NR: 13) und PAR4R (SEQ ID NR: 14) mit einer 1/100 Menge einer aus humaner Prostatadrüse stammender cDNA (von Clontech bezogen) durch eine PCR amplifiziert. Die PCR-Reaktionslösung wurde einer Agarose-Gelelektrophorese ausgesetzt. Folglich wurde die Bande des cDNA-Fragments von PAR-1, PAR-2, PAR-3 oder PAR-4 erkannt. Das DNA-Fragment wurde aus dem Gel extrahiert und gereinigt mit einem DNA-Reinigungskit (unter Verwendung von QIAE XII, hergestellt von QIAGEN Corp.). Das gereinigte DNA-Fragment wurde mit EcoRI, BamHI (BgI II in Bezug auf PAR-4) gespalten und anschließend mit einem Fragment ligiert, welches durch Spalten eines Baculovirus-Transfervektors pVL 1393 (Invitrogen Corp.) mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI erhalten wurde. Die erhaltene Reaktionslösung wurde verwendet, um Escherichia coli JM 109 zu transformieren, und Plasmide wurden aus mehreren Transformantenkolonien extrahiert. Mehrere Klone der extrahierten Plasmide wurden gereinigt (unter Verwendung eines Plasmidextraktionskits, hergestellt von QIAGEN Corp.). Die DNA-Sequenzen wurden unter Verwendung der gereinigten Plasmide mit einem automatischen Fluoreszenz-Sequenzierautomaten, hergestellt von ABI Corp. bestimmt. Folglich wurde gefunden, dass die DNA-Fragmente den PAR kodieren.
  • (2) Herstellung von rekombinantem Baculovirus zum Exprimieren von PAR
  • Das BaculoGoldTM Transfektionskit, hergestellt von PharMingen Corp. wurde zum Herstellen von einem rekombinanten Baculovirus verwendet. Die Insektenzellen Sf9 wurden auf eine 35 mm Schale in einer Dichte von 1 × 106 Zellen/ml gesät und bei Raumtemperatur für 30 Minuten angeheftet. Andererseits wurden 0,5 mg BaculoGoldTM-DNA und 2 μg pVL-PAR-Plasmid-DNA miteinander gemischt, für 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und anschließend gut mit 0,5 ml eines Transfektionspuffers B (25 mM HEPES, pH-Wert 7,1, 125 mM CaCl2, 140 mM NaCl) gut gemischt. Anschließend wurde das Kulturmedium der gesäten Sf9-Zellen herausgenommen und anschließend mit 0,5 ml eines Transfektionspuffers A (Grace-Kulturmedium, welches 10% Rinderserum enthielt) gemischt. Eine Lösung aus DNA im Transfektionspuffer B wurde schrittweise auf das Gemisch getropft, um die Kotransfektion durchzuführen, und bei 27°C für 4 Stunden inkubiert.
  • Anschließend wurde das Kulturmedium durch neues Grace-Kulturmedium (welches 10% Rinderserum enthielt) ersetzt. Fünf Tage später wurde der Kulturüberstand, welcher die rekombinanten Viren enthielt, gewonnen. 100 μl Kulturüberstand und 200 μm EX-CELL 405 Kulturmedium wurden hergestellt und anschließend verwendet, um die Sf9-Zellen (1 × 106 Zellen/Schale) bei Raumtemperatur für eine Stunde zu infizieren. Der Überstand wurde herausgenommen, tropfenweise mit 2 ml 1% SeaPlaque-Agarose enthaltendem Grace-Kulturmedium (42°C) gemischt und bei Raumtemperatur für 10 Minuten stehen gelassen, bis die Agarose fest wurde. Anschließend wurde das Gemisch bei 27°C für 5 Tage kultiviert. Am fünften Tag wurde eine Neutralrot/PBS (Phosphat gepufferte Salzlösung)-Lösung (0,1 g/l) in einem Volumen von 1 ml/Schale hinzugefügt, und am sechsten Tag wurden die Virus-Plaques beobachtet und identifiziert. Mehrere einzelne Virus-Plaques wurden zusammen mit der Agarose mit einer Pasteur-Pipette herausgenommen und anschließend mit Grace-Kulturmedium gemischt, um die Viren im Kulturmedium zu diffundieren. Die von Einzelplaques stammende Virusflüssigkeit wurde verwendet, um die Sf9-Zellen (in einer 25 cm2 Flasche kultiviert), welche in der Einzelschicht kultiviert wurden, zu infizieren. Die infizierten Zellen wurden bei 27°C für 5 Tage kultiviert, und die Virusflüssigkeit wurde anschließend gewonnen. 1 ml der Virusflüssigkeit wurde in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen gebracht und anschließend bei 15.000 rpm bei 4°C für 30 Minuten zentrifugiert, um die Viruspartikel zu präzipitieren. Die Präzipitate wurden in 200 μl TE (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA)-Pufferlösung suspendiert, mit 50 μl Lyse-Pufferlösung (10% SDS, 1 mM EDTA) gemischt und bei 60°C für 20 Minuten inkubiert. Weiterhin wurden eine Phenol/Chloroform-Extraktion und eine Ethanol-Präzipitation durchgeführt, um die Virus-DNA in der Reaktionslösung zu gewinnen. Ein Zehntel der gewonnenen Virus-DNA wurde verwendet, um eine PCR-Amplifikation mit den Primern BacF (SEQ ID NR: 15) und BacR (SEQ ID NR: 16) durchzuführen. So wurde identifiziert, dass die PAR-cDNA in der DNA enthalten war. Das rekombinante Baculovirus zum Exprimieren des PAR wurde VL-PAR genannt. Die Virusflüssigkeit wurde angemessen verdünnt und anschließend einem Plaque-Assay und der Prüfung des Titers ausgesetzt. Weiterhin wurde die Virusflüssigkeit verwendet, um die Sf9-Zellen zu infizieren, um die Virusflüssigkeit mit einer hohen Konzentration von un gefähr 1-5 × 107 pfu (Plaque bildende Einheit, engl.: Plaque forming unit)/ml zu erhalten. Die Virusflüssigkeit wurde bei 4°C und –8°C gelagert.
  • (3) Expression von PAR in Insektenzellen mit rekombinantem Baculovirus
  • Das oben erhaltene rekombinante Baculovirus VL-PAR zum Exprimieren des PAR wurde verwendet, um 1,0 × 107 Sf9-Zellen, welche in einer 75 cm2 Flasche mit einer MOI = 2 gesät waren, zu infizieren und wurde anschließend stehen gelassen und stationär bei 27°C für 40 Stunden kultiviert. Nach der Kultur wurden die infizierten Zellen gewonnen und anschließend einem Calciumeinstrom-Experiment ausgesetzt, um die Funktion des PAR zu bestätigen.
  • [Beispiel 5] Überprüfung des Calciumeinstroms aufgrund von humanem AST mit PAR exprimierenden Insektenzellen
  • Die gewonnenen, infizierten Zellen (ungefähr 5 × 106 Zellen) wurden einmal mit HEPES-Tyrode-Pufferlösung-Ca2+(–), pH-Wert 7,4, gewaschen und anschließend in 5 ml HEPES-Tyrode-Pufferlösung (welche Fura2-AM, 1 μg/ml enthielt) suspendiert, um das Fura2-AM auf die Zellen bei 27°C für 30 Minuten zu laden. Die Suspension wurde mit 800 rpm bei Raumtemperatur für 5 Minuten zentrifugiert, um die Zellen zu gewinnen. Die Zellen wurden zweimal mit HEPES-Tyrode-Pufferlösung-Ca2+(–), pH-Wert 7,4, gewaschen und anschließend in 5 ml HEPES-Tyrode-Pufferlösung-Ca2+(–), pH-Wert 7,4, resuspendiert. Die Zellsuspension wurde mit 5 μl 1 M CaCl2 gemischt, um eine Endkonzentration von 1 mM CaCl2 zu ergeben und anschließend in einem beschatteten Zustand bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert. Die hergestellten Fura2-AM-beladenen, infizierten Zellen wurden in einer 96-Vertiefungsplatte mit einem Volumen von 100 μl/Vertiefung verteilt, weiterhin der Verteilung von HEPES-Tyrode-Pufferlösung-Ca2+(+), pH-Wert 7,4, mit einem Volumen von 80 μl/Vertiefung ausgesetzt und anschließend mit einem Fluoreszenz-Arzneimittel-Screeningsystem (von Hamamatsu Photonics Co. hergestellt) untersucht. Es wurde nämlich [die Intensität von 500 nm Fluoreszenzlicht aufgrund von 340 nm Anregungslicht]/[die Intensität von 500 nm Fluo reszenzlicht aufgrund von 380 nm Anregungslicht] untersucht (was die Konzentration von Calcium in den Zellen widerspiegelt).
  • AST (0,2 bis 2 Einheiten/ml), Trypsin (welches aus Rinderpankreas stammte, 0,1 bis 10 Einheiten/ml), humanes Thrombin (0,1 bis 10 Einheiten/ml) oder SFLLRNamid (Agonisten-Peptid für PAR-1, -2) oder SLIGRL (Agonisten-Peptid für PAR-2, 10 bis 100 μM) wurden zu den Zellen hinzugefügt, um die Zellen zu stimulieren, und die Calciumkonzentrationen in den Zellen wurden mit dem Zeitverlauf untersucht. Folglich wurde der spezifische Calciumeinstrom in den Insektenzellen beobachtet, welche mit dem rekombinanten Baculovirus zum Exprimieren des PAR infiziert waren. Mit dem Ergebnis wurde belegt, dass der Funktion aufweisende PAR in den Insektenzellen exprimiert wurde.
  • Die Ca2+-Einströme von PAR-1 bis PAR-4 sind jeweils unten gezeigt.
  • Für PAR-1 wurde der Ca2+-Einstrom bei AST (2 Einheiten/ml), Trypsin (0,1 bis 10 Einheiten/ml), Thrombin (0,1 bis 10 Einheiten/ml) und SFLLRNamid (10 bis 100 μM) beobachtet.
  • Für PAR-2 wurde der Ca2+-Einstrom bei AST (2 Einheiten/ml), Trypsin (0,1 bis 10 Einheiten/ml), Thrombin (0,1 bis 10 Einheiten/ml), SFLLRNamid (10 bis 100 μM) und SLIGRL (10 bis 100 μM) beobachtet.
  • Für PAR-4 wurde der Ca2+-Einstrom bei AST (2 Einheiten/ml), Trypsin (0,1 bis 10 Einheiten/ml) und Thrombin (0,1 bis 10 Einheiten/ml) beobachtet (siehe 12).
  • [Beispiel 6] Experiment zum Calciumeinstrom aufgrund von AST mit Atemwegs-Epithelzellen
  • (1) Experiment zum Calciumeinstrom aufgrund von AST mit normalen humanen Atemwegs-Epithelzellen
  • Der Ca2+-Einstrom aufgrund von AST wurde mit konfluenten, normalen Epithelzellen, welche an drei 10 cm Schalen angeheftet waren (bezogen von BioWhittaker Corp.) untersucht. Die Zellen wurden mit einer 10 mM EDTA/HEPES-Tyrode-Pufferlösung für 10 Minuten abgelöst, durch eine Zentrifugierbehandlung bei 800 rpm bei Raumtemperatur für 5 Minuten gewonnen und anschließend in 5 ml HEPES-Tyrode-Pufferlösung-Ca2+(–), pH-Wert 7,4, resuspendiert. Die gewonnenen Zellen (ungefähr 1,2 × 106 Zellen) wurden in 5 ml HEPES-Tyrode-Pufferlösung (1 μg/ml, welche Fura2-AM enthielt) suspendiert, um das Fura2-AM bei 37°C für eine Stunde auf die Zellen zu laden. Die Zellen wurden durch eine Zentrifugierbehandlung bei 800 rpm bei Raumtemperatur für 5 Minuten gewonnen, zweimal mit HEPES-Tyrode-Pufferlösung-Ca2+(–), pH-Wert 7,4, gewaschen und anschließend in 1,3 ml HEPES-Tyrode-Pufferlösung-Ca2+(–), pH-Wert 7,4, resuspendiert. Die Zellsuspension wurde mit 5 μl 1 M CaCl2 gemischt, um eine Endkonzentration von 1 mM CaCl2 zu ergeben, und anschließend in einem beschatteten Zustand bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert. Die hergestellten mit Fura2-AM beladenen, infizierten Zellen wurden in einer 96-Vertiefungsplatte mit einem Volumen von 100 μl/Vertiefung verteilt, weiterhin der Verteilung von HEPES-Tyrode-Pufferlösung-Ca2+(+), pH-Wert 7,4, mit einem Volumen von 80 μl/Vertiefung ausgesetzt und anschließend mit einem Fluoreszenz-Arzneimittel-Screeningsystem untersucht (Hamamatsu Photonics Co.). Es wurde nämlich [die Intensität von 500 nm Fluoreszenzlicht aufgrund von 340 nm Anregungslicht]/[Intensität von 500 nm Fluoreszenzlicht aufgrund von 380 Anregungslicht] untersucht (was die Konzentration des Calciums in den Zellen widerspiegelt).
  • AST (2 Einheiten/ml), aus Rinderpankreas stammendes Trypsin (1 bis 100 Einheiten/ml), humanes Thrombin (1 bis 100 Einheiten/ml), SFLLRNamid oder SLIGRL (10 bis 100 μg) wurden hinzugefügt, um die Zellen zu stimulieren, und die Calciumkonzentrationen in den Zellen wurden anschließend mit dem Zeitverlauf untersucht.
  • Folglich wurde ein Ca2+-Einstrom bei AST (2 Einheiten/ml), Trypsin (10 bis 100 Einheiten/ml) und SFLLRNamid (100 μM) beobachtet (siehe 13).
  • (2) Experiment zum Calciumeinstrom aufgrund von AST mit einer Atemwegs-Epithelzelllinie
  • Der Ca2+-Einstrom aufgrund von AST wurde mit Bezug auf eine Atemwegs-Epithelzelllinie BEAS-2B untersucht. Die kofluenten Zellen, welche an sechs 10 cm Schalen angeheftet waren, wurden verwendet. Die Zellen wurden mit einer 10 mM EDTA/HEPES-Tyrode-Pufferlösung für 10 Minuten abgelöst, durch eine Zentrifugierbehandlung bei 1500 rpm bei Raumtemperatur für 5 Minuten gewonnen und anschließend in 10 ml HEPES-Tyrode-Pufferlösung-Ca2+(–), pH-Wert 7,4, resuspendiert. Die gewonnenen Zellen (ungefähr 1,1 × 107 Zellen) wurden in 11 ml HEPES-Tyrode-Pufferlösung (1 μg/ml, welche Fura2-AM enthielt) suspendiert, um das Fura2-AM bei 37°C für 30 Minuten aufzuladen. Die Zellen wurden durch eine Zentrifugierbehandlung bei 1500 rpm bei Raumtemperatur für fünf Minuten gewonnen, zweimal mit HEPES-Tyrode-Pufferlösung-Ca2+(–), pH-Wert 7,4, gewaschen und anschließend in 11 ml HEPES-Tyrode-Pufferlösung-Ca2+(–), pH-Wert 7,4, resuspendiert. Die Zellsuspension wurde mit 11 ml 1 M CaCl2 gemischt, um eine Endkonzentration von 1 mM CaCl2 zu ergeben, und anschließend in einem beschatteten Zustand bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert. Die hergestellten mit Fura2-AM beladenen, infizierten Zellen wurden in einer 96-Vertiefungsplatte mit einem Volumen von 100 μl/Vertiefung verteilt, weiterhin der Verteilung von HEPES-Tyrode-Pufferlösung-Ca2+(+), pH-Wert 7,4, mit einem Volumen von 80 μl/Vertiefung ausgesetzt und anschließend mit einem Fluoreszenz-Arzneimittel-Screeningsystem untersucht (Hamamatsu Photonics Co.). Es wurde nämlich [die Intensität von 500 nm Fluoreszenzlicht aufgrund von 340 nm Anregungslicht]/[Intensität von 500 nm Fluoreszenzlicht aufgrund von 380 Anregungslicht] untersucht (was die Konzentration des Calciums in den Zellen widerspiegelt).
  • AST (0,2 bis 2 Einheiten/ml), aus Rinderpankreas stammendes Trypsin (0,1 bis 100 Einheiten/ml), humanes Thrombin (0,1 bis 100 Einheiten/ml) oder SFLLRNamid oder SLIGRL (PAR Agonisten-Peptid, 10 bis 100 μM) wurden hinzugefügt, um die Zellen zu stimulieren, und die Calciumkonzentrationen in den Zellen wurden anschließend mit dem Zeitverlauf untersucht.
  • Folglich wurde der Ca2+-Einstrom bei AST (2 Einheiten/ml), Trypsin (10 bis 100 Einheiten/ml) und SFLRRNamid (100 μM) beobachtet (siehe 14).
  • [Beispiel 7] IL-8-Freisetzung aus einer Atemwegs-Epithelzelllinie (BEAS-2B) aufgrund von HAST
  • 1). Zellen
  • Es wurden Tests mit BEAS-2B durchgeführt (Atemwegs-Epithelzelllinie, bezogen von ATCC). LHC-9 (hergestellt von Biofluid Corp.) wurde für gewöhnliche Kulturen verwendet. Wenn die Zellen für den Test verwendet wurden, wurden die Zellen in LHC-8 (welches kein Hydrokortison enthielt, hergestellt von Biofluid Corp.) suspendiert, auf eine 96-Vertiefungsplatte (hergestellt von Falcon Corp.), welche mit Kollagen (hergestellt von Collagen Corp.)/BSA (hergestellt von Boehringer Mannheim GmbH)/Fibronektin (Sigma Corp.) beschichtet war, in einer Dichte von 5,0 × 104 Zellen/cm2 ausgesät und anschließend für 24 Stunden kultiviert. Nachdem die normale Aufnahme der Zellen identifiziert wurde, wurden die Zellen mit einem Arzneimittel behandelt.
  • 2) Arzneimittelbehandlung
  • HAST (100 mU/ml) und TNF-α (hergestellt von R&D) (1 mg/ml) wurden mit einer festgesetzten Konzentration von Benzamidin oder Leupeptin in LHC-8 (welches kein Hydrokortison enthielt) für 30 Minuten auf Eis umgesetzt und anschließend bei 37°C erhitzt. Die erhitzte Reaktionslösung wurde vollständig mit der Zellkulturlösung in den Vertiefungen ausgetauscht, um die Arzneimittelbehandlung zu beginnen. Nach der Kultur für 24 Stunden, wurde der Kulturüberstand gewonnen und bei –80°C gelagert, bis der Assay der IL-8-Herstellung durchgeführt wurde.
  • 3) IL-8 Konzentrationsassay
  • Die Konzentration von IL-8 im Kulturüberstand wurde durch ein Sandwich-ELISA-Verfahren unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren Antikörpers untersucht. Monoklonaler Maus-Anti-Mensch-IL-8-Capture Antikörper (hergestellt von Biosource Corp.), der mit PBS auf eine Konzentraton von 1 μg/ml eingestellt war, wurde zu einer 96-Vertiefungs-EIA-Platte (hergestellt von Maxi Sorp. Nunc Corp.) mit einem Volumen von 50 μl/Vertiefung hinzugefügt und anschließend bei 4°C über Nacht stehen gelassen, um den Antikörper zu immobilisieren. Der immobilisierte Antikörper wurde fünfmal mit 250 μl/Vertiefung einer Waschpufferlösung (PBS, welches 0,05% Tween 20 enthielt (hergestellt von BioRad Corp.)) gewaschen, mit 250 μl/Vertiefung einer Blockierungspufferlösung (PBS, welches 1% BSA (hergestellt von Boehringer Mannheim GmbH) und 0,05% Natriumazid enthielt) gemischt und anschließend bei 4°C über Nacht stehen gelassen, um die Blockierungsbehandlung durchzuführen. Das blockierte Produkt wurde fünfmal mit 250 μl/Vertiefung einer Waschpufferlösung gewaschen, mit 50 μl/Vertiefung des Kulturüberstands, welcher mit der Blockierungspufferlösung 50-fach verdünnt war oder mit IL-8 Standard, welcher mit der Blockierungspufferlösung hergestellt wurde, gemischt und bei Raumtemperatur für eine Stunde umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde fünfmal mit 250 μl/Vertiefung der Waschpufferlösung gewaschen, mit 50 μl/Vertiefung eines monoklonalen Maus-Anti-Mensch IL-8-Biotin-Antikörpers (hergestellt von Biosource Corp.), welcher mit einer Verdünnungspufferlösung (PBA, welches 1% BSA und 0,05% Tween 20 enthielt) in einer Konzentration von 0,05 μg/ml hergestellt war, gemischt und bei Raumtemperatur für eine Stunde umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde fünfmal mit 250 μl/Vertiefung der Waschpufferlösung gewaschen, mit 50 μl/Vertiefung HRP-Streptavidin (hergestellt von Genzyme Corp.), welches mit der Verdünnungspufferlösug 6000-fach verdünnt war, gemischt und für 15 Minuten umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde fünfmal mit 250 μl/Vertiefung der Waschpufferlösung gewaschen und anschließend mit 100 μl/Vertiefung TMB Mikrovertiefungs-Peroxidasesubstrat (hergestellt von KPL Corp.) für ungefähr 15 Minuten behandelt, um die Farbe zu entwickeln. 100 μl/Vertiefung 1 M Schwefelsäure wurde hin zugefügt, um die Farbentwicklungsreaktion abzustoppen, und anschließend wurde sofort die Absorption des Produkts bei 450 nm mit einem ThermoMax Mikroplattenlesegerät (hergestellt von Molecular Devices Corp.) untersucht. Für die Absorption jeder Probe wurde eine Regression gegenüber einer Standardkurve vorgenommen, welche aus den Absorptionen von Standards erstellt wurde, um die Konzentration des IL-8 in der Probe zu berechnen. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt. Folglich wurde gezeigt, dass die Freisetzung des IL-8 aus den Atemwegsepithelzellen, welche durch das HAST verursacht wurde, durch Hemmen der Aktivität des HAST mit den Protease-Hemmstoffen gehemmt wurde.
  • [Beispiel 8] Transkriptionelle Aktivierung des IL-8 Promotors durch HAST
  • 1) Klonierung der IL-8 Promotordomäne
  • Ungefähr 1,5 kB und 162 bp der Promotordomänen (Mukaida N. et al., J. Immunol., 143: 1366-1377, 1989) von IL-8 wurden mit einer LA-PCR (hergestellt von Takara Shuzo Co.) unter Verwendung humaner Genom-DNA als Matrize, eines vorwärts gerichteten Primers: IL8-1481; CCCAGATCTGAATTCAGTAACCCAGGCATTATTTTATC, eines vorwärts gerichteten Primers: IL8-162: AACTTTGGATCCACTCCGTATTTGATAAGG, eines rückwärts gerichteten Primers: IL8LUC-R: CATGTTTACACACAGTGAGAATGGTTCCTTCC kloniert. Die PCR wurde bei 98°C für 20 sek, bei 58°C für eine Minute und bei 68°C für 5 Minuten in 25 Zyklen durchgeführt. Die erhaltenen DNA-Fragmente der Promotordomänen von ungefähr 1,5 Kb und ungefähr 0,25 Kb wurden jeweils IL8-1481 und IL8-162 genannt.
  • 2) Konstruktion eines IL-8 Reporterplasmids
  • Ein DNA-Fragment, welches von ATG (Startcodon der Translation) bis zur NarI-Stelle im Luciferasegen von pGL3-Basic (hergestellt von Promega Corp.) enthielt, wurde durch ein PCR-Verfahren unter Verwendung eines vorwärts gerichteten Primers: IL8LUC-F; CTGTGTGTAAACATGGAAGACGCCAAAAACATAAA und eines rückwärts gerichteten Primers: LUC2087R: CGGGAGGTAGATGAGATGTG amplifiziert. Dieses N-terminale DNA-Fragment des Luciferasegens wurde an das IL8-1481 und das IL8-162 durch ein PCR-Verfahren ligiert, um die PCR-Fragmente IL8-1481-Luc (ungefähr 2 Kb) und IL8-162-Luc (ungefähr 800 bp) zu erhalten. Die PCR-Fragmente wurden mit BamHI und NarI gespalten und anschließend in den Aufwärtsstrang des Luciferasegens mit der BgIII- und der NarI-Stelle des pGL3-Basic eingefügt, um die Reporterplasmide pGL-IL8-1418, pGL3-IL8-162 zu konstruieren.
  • 3) Zellen
  • Es wurden Tests mit BEAS-2B (Atemwegs-Epithelzelllinie, bezogen von ATCC) durchgeführt. Eine gewöhnliche Kultur wurde mit LHC-9 (hergestellt von Biofluid Corp.) durchgeführt. Wenn die Zelllinie für den Test verwendet wurde, wurde die Zelllinie in LHC-8 (welches kein Hydrokortison enthielt, hergestellt von Biofluid Corp.) suspendiert, auf eine 96-Vertiefungsplatte (hergestellt von Falcon Corp.), welche mit Kollagen (hergestellt von Collagen Corp.)/BSA (hergestellt von Boehringer Mannheim Corp.)/Fibronektin (hergestellt von Sigma Corp.) beschichtet war, in einer Dichte von 2,0 × 104 Zellen/cm2 gesät und anschließend 24 Stunden kultiviert. Nachdem identifiziert wurde, dass die Zellen normal aufnahmen, wurde die transiente Geneinführung durchführt.
  • 4) Transiente Geneinführung
  • Eine transiente Geneinführung wurde mit LipofectAmine PLUS-Reagens (hergestellt von Gibco Corp.) durchgeführt. Die Kulturlösung in der 96-Vertiefungsplatte wurde durch 50 μl frisches LHC-8 (welches kein Hydrokortison enthielt, hergestellt von Biofluid Corp.) ersetzt. Ein Transfektions-Kulturmedium, welches 0,01 μg eines Kontrollplasmids, 0,09 μg eines Reporterplasmids (pGL3-Basic oder pGL3-IL8-1481 oder pGL3-IL8-162), 0,5 μl LipofectAmine-Reagens (hergestellt von Gibco Corp.) und 0,5 μl PLUS-Reagens (hergestellt von Gibco Corp.) enthielt, in 20 μl LHC-8 (welches kein Hydrokortison enthielt, hergestellt von Biofluid Corp.), wurde mit einem Volumen von 20 μl/Vertiefung hinzugefügt, um die Geneinführung zu beginnen. Anschließend wurde die Kultur in einem CO2-Inkubator für 48 Stunden durchgeführt.
  • 5) Arzneimittelbehandlung
  • 48 Stunden nach der Geneinführung wurde eine Arzneimittelbehandlung durchgeführt. Die Kulturlösung in den Vertiefungen wurde durch LHC-8 (welches kein Hydrokortison enthielt, hergestellt von Biofluid Corp.), welches HAST (300 mU/ml) oder TNF-α (hergestellt von R & D Corp.) (1 ng/ml) enthielt, ersetzt, und die Kultur wurde für 3 Stunden durchgeführt. Nachfolgend wurde die Kulturlösung entfernt, und die zurückgebliebenen Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen und anschließend für den Assay der Luciferaseaktivität bereitgestellt.
  • 6) Assay der Luciferaseaktivität
  • Die Luciferaseaktivität wurde mit Pica Gene Dual-Renilla reniformis (hergestellt von Toyo Ink Co.) untersucht. Die Zellen wurden mit HAST oder TNF-α für drei Stunden behandelt, der Entfernung der Kulturlösung unterzogen, einmal mit PBS gewaschen und anschließend mit 20 μl eines Zelllysemittels bei Raumtemperatur für 15 Minuten lysiert. Die Lösung mit den lysierten Zellen wurde mit einem 1,5 ml Mikroröhrchen gewonnen und anschließend bei 15.000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde als eine Probe gesammelt, und 20 μl der Probe wurden zu einer schwarzen 96-Vertiefungsplatte (hergestellt von Sumitomo Bakelite Co.) hinzugefügt. Zuerst wurden 100 μl Pica Gene lumineszentes Reagens II hinzugefügt, und die Lumineszenz aufgrund der Glühwürmchen-Luciferase wurde mit einem Luminometer (LUMINOUS CT-9000D (hergestellt von DIA-IATRON Corp.)) untersucht. Nachfolgend wurden 100 μl Renilla reniformis lumineszentes Reagens hinzugefügt, und die Lumineszenz aufgrund der Renilla reniformis-Luciferase wurde mit dem Luminometer (LUMINOUS CT-9000D (hergestellt von DIA-IATRON Corp.)) untersucht. Eine Korrektur, welche das Teilen der erhaltenen Glühwürmchen-Luciferaseaktivität durch die Renilla reniformis-Luciferaseaktivität umfasste, wurde durchgeführt, um die Reporteraktivität (relative Lichteinheit (R. L. U. für engl.: Relative Light Unit)) zu erhalten. Weiterhin wurde die Reporteraktivität in jeder Probe einer Datenanalyse als eine angestiegene Vergrößerung, basierend auf einem durchschnittlichen Wert in einer nichtstimulierten Gruppe, unterzogen. Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt. Aus den Ergebnissen wurde aufgeklärt, dass das HAST die Herstellung des IL-8 auf einer Transkriptionsebene fördert.
  • [Beispiel 9] Erhalt einer Maus-AST Gegenstück-cDNA
  • (1) Erhalt von Mäuseatemwegs-cDNA
  • Die Atemwege von Mäusen (C57 Black) wurden gesammelt und anschließend in 1 ml/Atemweg ISOGEN homogenisiert. Das erhaltene Homogenat wurde mit 0,2 ml Chloroform in einem Verwirbelungszustand gemischt, für 2 bis 3 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und anschließend bei 12.000 rpm bei 4°C für 10 Minuten zentrifugiert. Die obere Schicht wurde in ein neues Röhrchen überführt, mit 0,5 ml Isopropylalkohol gemischt und anschließend bei Raumtemperatur für 10 Minuten stehen gelassen. Das Gemisch wurde bei 15.000 rpm bei 4°C für 15 Minuten zentrifugiert, um die gesamte RNA zu präzipitieren. Das erhaltene Pellet wurde gut mit 1 ml 75% Ethanol gemischt und anschließend bei 10.000 rpm bei 4°C für 5 Minuten zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde mit Luft getrocknet, in DNase/RNase freiem Wasser gelöst und anschließend bei –80°C konserviert.
  • Die cDNA wurde mit Oligo (dT)12-18 und 2,5 μg der erhaltenen Gesamt-RNA, welche aus den Mäuseatemwegen stammte, durch die Verwendung des SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis Kits (hergestellt von GIBCO-BRL Corp.) gemäß einem beigefügten Protokoll synthetisiert.
  • (2) Erhalt eines AST-PCR-Fragments aus Mäuseatemwegs-cDNA
  • Ein Homologievergleich wurde zwischen den Basensequenzen von humanem AST und Maus-Hepsin durchgeführt, und ein vorwärts gerichteter Primer und ein rückwärts gerichteter Primer, welche jeweils durch SEQ ID NR: 17 und SEQ ID NR: 18 dargestellt sind, wurden hergestellt. Eine PCR-Reaktion wurde unter Verwendung der Primer und der cDNA, welche aus den Mäuseatemwegen stammte, als eine Matrize durch die Verwendung von TaKaRa TaqTM Polymerase (hergestellt von Takara Shuzo Co.) gemäß einem beigefügten Protokoll durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen. Folglich wurde eine amplifizierte Bande in der Nähe eines 450 bp-Ziels erkannt. Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden aus dem Agarosegel ausgeschnitten und anschließend in einen TA-Klonierungsvektor eingefügt. Escherichia coli wurde mit dem Vektor transformiert, um den Klon zu erhalten. Ein Plasmid wurde durch ein etabliertes Verfahren präpariert, und die Basensequenz des eingefügten DNA-Fragments wurde bestimmt. Folglich wurde aufgeklärt, dass nicht nur das Maus-Hepsin, sondern auch ein Gen, das die Homologie mit dem humanen AST aufwies, kloniert wurden.
  • (3) Erhalt einer vollständigen Maus-AST-cDNA durch 5'-RACE, 3'-RACE
  • Die Primer für eine 5'-RACE (schnelle Amplifizierung von cDNA-Enden) und eine 3'-RACE wurden auf Grundlage der in (2) erhaltenen Basenteilsequenz synthetisiert. Die Primersequenzen für die 1. RACE sind durch die SEQ ID NR: 19 und die SEQ ID NR: 20 dargestellt, und die Primersequenzen für die 2. RACE sind durch die SEQ ID NR: 21 und die SEQ ID NR: 22 dargestellt. Die 5'-RACE und die 31 RACE wurden auf den Sequenzen mit 15-Tage-Maus-Embryo Marathon-ReadyTM-cDNA (hergestellt von Clontech Corp., Swiss-Webster/NIH Embryo) durchgeführt. Eine PCR-Reaktion wurde mit dem Advantage 2 Polymerase Mix (hergestellt von Clontech Corp.) gemäß einem beigefügten Protokoll durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, und das durch die 5'-RACE amplifizierte, ungefähr 1,1 bp Fragment und das durch die 3'-RACE amplifizierte, ungefähr 0,6 kbp Fragment wurden so erhalten. Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden aus dem Agarosegel ausgeschnitten, in TA-Klonierungsvektoren eingefügt, welche verwendet wurden, um Escherichia coli zu transformieren, wodurch jeweils mehrere Klone der Transformanten erhalten wur den. Die Plasmide wurden aus den Tranformanten durch etablierte Verfahren präpariert, und anschließend wurden die Basensequenzen der eingefügten DNA-Fragmente bestimmt. Als Ergebnis wurde identifiziert, dass die Basensequenz, welche bei einer Sequenz beginnt, die mit der in (2) erhaltenen Basenteilsequenz übereinstimmt und eine Homologie mit dem humanen AST in der 5'-Richtung und in der 3'-Richtung aufweist, verlängert war. Die bestimmte Maus-AST-cDNA-Sequenz in genauer Länge und die Aminosäuresequenz sind in SEQ ID NR: 4 dargestellt.
  • Weiterhin, um zu bestätigen, ob Maus-AST, welches tatsächlich in einem Mäuseatemweg vorkommt, dieselbe Aminosäuresequenz aufweist oder nicht, wurden PCR-Primer (SEQ ID NR: 23 und SEQ ID NR: 24), welche die Außenseite eines Gens erkennen, welches die Aminosäure kodiert, synthetisiert. Advantage 2 Polymerase (hergestellt von Clontech Corp.) wurde verwendet, um die PCR-Reaktion mit einer Mäuseatemwegs-cDNA durchzuführen, und die Basensequenz des amplifizierten DNA-Fragments wurde bestimmt. Folglich wurde gefunden, dass die Aminosäuresequenz übereinstimmte, und das Klonieren der aus dem Atemweg stammenden Maus-AST-cDNA (SEQ ID NR: 6) wurde erfolgreich abgeschlossen.
  • (4) Vergleich der Homologie mit humanem AST
  • Das Ergebnis des Aminosäure-Homologievergleichs zwischen dem humanen AST und dem Maus-AST ist in 11 gezeigt. Der Homologievergleich wurde mit einer Gen analysierenden Software (Gene Works; Teijin System Technology Co.) durchgeführt. 66% der Aminosäuresequenzen stimmten vollständig miteinander überein.
  • [Beispiel 10] Erhalt einer Nagetier-AST Gegenstück-cDNA
  • (1) Synthese von Nagetieratemwegs-cDNA
  • Der Atemweg eines Hamsters oder eines Meerschweinchens wurde beprobt und anschließend in ungefähr 5 ml ISOGEN pro 0,5 Gramm Atemweg homogenisiert. Das erhaltene Homogenat wurde bei 3.000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert, und 1 ml des Überstands wurde gesammelt. Der Überstand wurde mit 0,2 ml Chloroform in einem Verwirbelungszustand gemischt, bei Raumtemperatur für 2 bis 3 Minuten stehen gelassen und anschließend bei 12.000 rpm bei 4°C für 10 Minuten zentrifugiert. Die obere Schicht wurde in ein neues Röhrchen übertragen, mit 0,5 ml Isopropylalkohol gemischt und anschließend bei Raumtemperatur für 10 Minuten stehen gelassen. Das Gemisch wurde bei 15.000 rpm bei 4°C für 15 Minuten zentrifugiert, um die Gesamt-RNA zu präzipitieren. Das erhaltene Pellet wurde gut mit 1 ml 75% Ethanol gemischt und anschließend bei 10.000 rpm bei 4°C für 5 Minuten zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde mit Luft getrocknet, in DNase und RNase freiem Wasser gelöst und anschließend bei –80°C konserviert.
  • Die cDNA wurde unter Verwendung von Oligo (dT)12-18 und 2,5 μg der erhaltenen Gesamt-RNA, welche aus den Atemwegen stammte, durch die Verwendung des SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis Kits (hergestellt von GIBCO-BRL Corp.) gemäß einem beigefügten Protokoll synthetisiert.
  • (2) Erhalt eines AST-PCR-Fragments aus cDNA
  • Ein Homologievergleich wurde zwischen den Basensequenzen von humanem AST und Mäuse-Hepsin durchgeführt, und ein vorwärts gerichteter Primer und ein rückwärts gerichteter Primer, welche jeweils durch SEQ ID NR: 17 und SEQ ID NR: 18 dargestellt sind, wurden hergestellt. Eine PCR-Reaktion wurde unter Verwendung der Primer und der cDNA, welche aus den Mäuseatemwegen stammte, als eine Matrize durch die Verwendung von TaKaRa TaqTM Polymerase (hergestellt von Takara Shuzo Co.) gemäß einem beigefügten Protokoll durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen. Folglich wurde eine amplifizierte Bande in der Nähe eines 450 bp-Ziels erkannt. Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden aus dem Agarosegel ausgeschnitten und anschließend in einen TA-Klonierungsvektor eingefügt. Escherichia coli wurde mit dem Vektor transformiert, um den Klon zu erhalten. Ein Plasmid wurde durch ein etabliertes Verfahren präpariert, und die Basensequenz des eingefügten DNA-Fragments wurde bestimmt. Folglich wurde aufgeklärt, dass ein Gen, das die Homologie mit dem humanen AST aufweist, kloniert wurde.
  • (3) Erhalt der vollständigen Nagetier-AST-cDNA durch eine 5'-RACE, 3'-RACE
  • Primer für eine 5'-RACE und eine 3'-RACE wurden auf Grundlage der in (2) erhaltenen Basenteilsequenz synthetisiert. Andererseits wurde die cDNA für die 5'-RACE und die 3'-RACE mit 1 μg der Gesamt-RNA, welche aus den Atemwegen gesammelt wurde, durch das Verwenden des SMART-RACE Kits (hergestellt von Clontech Corp.) synthetisiert. Die 5'-RACE und die 3'-RACE wurden durchgeführt. Eine PCR-Reaktion wurde mit Advantage 2 Polymerase Mix (hergestellt von Clontech Corp.) gemäß einem beigefügten Protokoll durchgeführt. Die durch die 5'-RACE und die 3'-RACE erhaltenen PCR-Produkte wurden einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen. Die hauptsächlich amplifizierten DNA-Fragmente wurden aus dem Agarosegel ausgeschnitten, in TA-Klonierungsvektoren eingefügt (hergestellt von Invitrogen Corp.), welche verwendet wurden, um Escherichia coli zu transformieren, wodurch jeweils mehrere Klone der Transformanten erhalten wurden. Die Plasmide wurden durch ein etabliertes Verfahren aus den Transformanten präpariert, und anschließend wurden die Basensequenzen der eingefügten DNA-Fragmente bestimmt. Als Ergebnis wurde identifiziert, dass die Basensequenz, welche bei einer Sequenz beginnt, die mit der in (2) erhaltenen Basenteilsequenz übereinstimmt und eine Homologie mit dem humanen AST in der 5'-Richtung und in der 3'-Richtung aufweist, verlängert wurde. Die bestimmte Nagetier-AST-cDNA-Sequenz in genauer Länge und die Aminosäuresequenz sind gezeigt. Das Meerschweinchen: SEQ ID NR: 36 und 37, der Hamster: SEQ ID NR: 38 und 39.
  • [Beispiel 11] Erhalt einer Säuger-AST Gegenstück-cDNA
  • (1) Erhalt von Säugeratemwegs-cDNA
  • Der Atemweg von Kaninchen, Hund, Schwein, Rind oder Macaca irus wurde beprobt und anschließend in ungefähr 5 ml ISOGEN pro 0,5 g der Atemwege homogenisiert. Das erhaltene Homogenat wurde bei 3.000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert, und 1 ml des Überstands wurde gesammelt. Der Überstand wurde mit 0,2 ml Chloroform in einem Verwirbelungszustand gemischt, für 2 bis 3 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und anschließend bei 12.000 rpm bei 4°C für 10 Minuten zentrifugiert. Die obere Schicht wurde in ein neues Röhrchen übertragen, mit 0,5 ml Isopropylalkohol gemischt und anschließend bei Raumtemperatur für 10 Minuten stehen gelassen. Das Gemisch wurde bei 15.000 rpm bei 4°C für 15 Minuten zentrifugiert, um die Gesamt-RNA zu präzipitieren. Das erhaltene Pellet wurde gut mit 1 ml 75% Ethanol gemischt und anschließend bei 10.000 rpm bei 4°C für 5 Minuten zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde mit Luft getrocknet, in DNase und RNase freiem Wasser gelöst und anschließend bei –80°C konserviert.
  • Die cDNA wurde mit Oligo (dT)12-18 und 2,5 μg der erhaltenen Gesamt-RNA, welche aus den Atemwegen stammte, durch die Verwendung des SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis Kits (hergestellt von GIBCO-BRL Corp.) gemäß einem beigefügten Protokoll synthetisiert.
  • (2) Erhalt eines AST-PCR-Fragments aus Atemwegs-cDNA
  • Ein Homologievergleich wurde zwischen den Basensequenzen des humanem AST und des Nagetier-AST durchgeführt, und ein vorwärts gerichteter Primer, welcher durch ASTS652F (SEQ ID NR: 40) ASTS721F (SEQ ID NR: 41) dargestellt ist, und ein rückwärts gerichteter Primer, welcher durch ASTS1166 (SEQ ID NR: 42) und ASTS1211 (SEQ ID NR: 43) dargestellt ist, wurden hergestellt. Eine PCR-Reaktion wurde mit den Primern und der cDNA, welche aus den Säugeratemwegen stammte, als eine Matrize durch die Verwendung von Pyrobest DNA-Polymerase (hergestellt von Takara Shuzo Co.) gemäß einem beigefügten Protokoll durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen. Folglich wurde eine amplifizierte Bande von ungefähr 475 bp bis unge fähr 590 bp erkannt. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde aus dem Agarosegel ausgeschnitten und anschließend in einen TA-Klonierungsvektor eingefügt. Escherichia coli wurde mit dem Vektor transformiert, um den Klon zu erhalten. Ein Plasmid wurde durch ein etabliertes Verfahren präpariert, und die Basensequenz des eingefügten DNA-Fragments wurde bestimmt. Folglich wurde aufgeklärt, dass ein Genfragment, welches die Homologie mit dem humanen AST aufweist, kloniert wurde.
  • (3) Erhalt der vollständigen Säuger-AST-cDNA durch 5'-RACE, 3'-RACE
  • In Bezug auf das Kaninchen-AST wurden Primer für eine 5'-RACE und eine 3'-RACE auf Grundlage der in (2) erhaltenen Basenteilsequenz synthetisiert. Mit Bezug auf das Affen-, Hunde-, Schweine- oder Rinder-AST wurden SEQ ID NR: 40 für die 3'-RACE und SEQ ID NR: 43 für die 5'-RACE als Primersequenzen für die 1. RACE verwendet, und SEQ ID NR: 41 für die 3'-RACE und SEQ ID NR: 42 für die 5'-RACE wurden als Primersequenzen für die 2. RACE verwendet. Andererseits wurde die cDNA für die 5'-RACE und die 3'-RACE mit 1 μg der Gesamt-RNA, welche aus jedem Säugeratemweg gesammelt wurde, durch die Verwendung des SMART-RACE Kits (hergestellt von Clontech Corp.) synthetisiert. Die 5'-RACE und die 3'-RACE wurden durchgeführt. Eine PCR-Reaktion wurde mit dem Advantage 2 Polymerase Mix (hergestellt von Clontech Corp.) gemäß einem beigefügten Protokoll durchgeführt. Die durch die 5'-RACE und die 3'-RACE erhaltenen PCR-Produkte wurden einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen. Die hauptsächlich amplifizierten DNA-Fragmente wurden aus dem Agarosegel ausgeschnitten, in TA-Klonierungsvektoren (hergestellt von Invitrogen Corp.) eingefügt, welche verwendet wurden, um Escherichia coli zu transformieren, wodurch jeweils mehrere Klone der Transformanten erhalten wurden. Die Plasmide wurden aus den Transformanten durch ein etabliertes Verfahren präpariert, und anschließend wurden die Basensequenzen der eingefügten DNA-Fragmente bestimmt. Als Ergebnis wurde identifiziert, dass die Basensequenz, welche bei einer Sequenz beginnt, die mit der in (2) erhaltenen Basenteilsequenz übereinstimmt und eine Homologie mit dem humanen AST in der 5'-Richtung und in der 3'-Richtung aufweist, verlängert wurde. Jede bestimmte Säuger-AST-cDNA-Sequenz in genauer Länge und die Aminosäuresequenz sind gezeigt. Das Schwein: SEQ ID NR: 26 und 27, Affe: SEQ ID NR: 28 und 29, Hund: SEQ ID NR: 30 und 31, Rind: SEQ ID NR: 32 und 33, Kaninchen: SEQ ID NR: 34 und 35.
  • [Beispiel 12] Assay der enzymatischen Aktivitäten verschiedener Säuger-ASTs
  • (1) Herstellung von Plasmiden zum Exprimieren verschiedener Säuger-AST Tierzellen
  • Ein vorwärts gerichteter Primer und ein rückwärts gerichteter Primer wurden auf Grundlage von Gensequenzen hergestellt, welche den N-Terminus und den C-Terminus von jedem Säuger-AST kodieren, und eine cDNA, welche das vollständige AST kodiert, wurde durch eine PCR-Amplifikation unter Verwendung des vorwärts gerichteten Primers, des rückwärts gerichteten Primers, der Pyrobest DNA-Polymerase (hergestellt von Takara Shuzo Co.) und einer Atwemgs-cDNA als Matrize hergestellt. Andererseits wurden ein Produkt, welches durch Spalten von pcDNA3 (hergestellt von Invitrogen Corp.) mit den Restriktionsenzymen NruI und KpnI erhalten wurde, und die Promotordomäne von Elongationsfaktor-1α (EF-1α) aus dem Humangenom durch eine PCR unter Verwendung eines vorwärts gerichteten Primers: GACTTCGCGACGTGAGGCTCCGGTGCCCGTC und eines rückwärts gerichteten Primers: GACTGGTACCAAGCTTTTCACGACACCTGAAATGGAAG amplifiziert. Das amplifizierte Fragment wurde mit den Restrktionsenzymen NruI und KpnI gespalten und anschließend in dem oben beschriebenen Plasmidvektor eingefügt, um den pEF9-Expressionsvektor zu konstruieren, welcher den Promotor des humanen EF-1α aufweist. Das PCR-amplifizierte AST-Fragment wurde in eine Multi-Klonierungsstelle strangabwärts des humanen EF-1α-Promotors des oben beschriebenen pEF9-Expressionsvektors eingefügt, um jedes Tier-AST-Expressionsplasmid herzustellen. Die Basensequenzen wurden mit einem Sequenzierautomaten identifiziert.
  • (2) Überprüfung der enzymatischen Aktivität durch transiente Expression in kultivierten Tierzellen
  • Aus fötaler Niere stammende humane 293 EBNA-Zellen (Invitrogen Corp.) wurden in einer 10 cm Schale kultiviert, und die ungefähr 5,8 × 106 Zellen wurden mit 28 μg von jedem in (1) hergestellten Expressionsplamid in 56 μl LipofectAMINE 2000 (hergestellt von GibcoBRL Corp.) gemäß einem beigefügten Handbuch transfiziert. Drei Tage später wurden die Zellen lysiert und in 5 ml M-PER (hergestellt von PIERCE Corp.) wieder aufgenommen und anschließend mit 5 ml einer Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, 0,01% BSA, pH-Wert = 8,6) für den AST-Aktivitätsassay gemischt, um das Zelllysat zu ergeben. Das Zelllysat wurde weiterhin mit der Pufferlösung für den AST-Aktivitätsassay zehnfach verdünnt und anschließend für den Aktivitätsassay bereitgestellt. 40 μl der oben beschriebenen Assayprobe wurden mit 20 μl einer synthetischen Substratlösung (einer Lösung, welche durch 50-faches Verdünnen einer 10 mM Boc-Phe-Ser-Arg-MCA DMSO (Dimethylsulfoxid)-Lösung mit der Pufferlösung für den AST-Aktivitätsassay erhalten wurde) gemischt, und der Anstieg der Fluoreszenzintensität pro Minute wurde untersucht (Fluoreszenzwellenlänge: 460 nm, Anregungswellenlänge: 380 nm), um die enzymatische Aktivität zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt.
    Zelllysat Fluoreszenzintensitätsverhältnis (Mensch:100) Sup Fluoreszenzintensitätsverhältnis (Mensch:100)
    Mensch 100 100
    Affe 250 150
    Schwein 92
    Hund 40
    Rind 16
    Kaninchen 30
  • (3) Herstellung von rekombinantem Baculovirus zur Insektenzellen-Expression von Säuger-AST
  • Für das Mäuse-AST, Hunde-AST oder Affen-AST wurde das Bac-to-Bac-System (hergestellt von GIBCO-BRL Corp.) gemäß einem beigefügten Protokoll verwendet, um ein rekombinantes Bacmid für eine Insektenzellen-Expression herzustellen, und die Sf9-Zelllinie wurde mit dem rekombinanten Bacmid transfiziert, um das rekombinante Baculovirus zu erhalten.
  • (4) Massenexpression von Säuger-AST durch Insektenzellen-Expression und Enzym-Aktivitätsassay
  • Eine Insektenzelllinie Tn5 wurde als Massenkultur kultiviert und anschließend mit dem oben beschriebenen Baculovirus infiziert. Die infizierte Insektenzelllinie wurde für drei Tage kultiviert, um das rekombinante Säuger-AST zu exprimieren. Das exprimierte Zellpellet wurde denselben Vorgängen wie in Beispiel 1 unterzogen, um das gereinigte rekombinante Säuger-AST zu erhalten. Die Spaltungsaktivität des erhaltenen rekombinanten Säuger-AST wurde mit drei Sorten von Trypsinähnlichen synthetischen Substraten überprüft. Folglich wurde gefunden, dass das rekombinante Säuger-AST eine Aktivität ähnlich zu der von HAST aufwies, um die synthetischen Substrate: Boc-Phe-Ser-Arg-pNA, Boc-Ser-Glu-Gln-Arg-pNA und Boc-Ser-Lys-Gly-Arg-pNA zu spalten, und daher dieselbe Trypsin-ähnliche Aktivität, wie die des HAST aufwies.
  • [Beispiel 13] Analyse der Schleim-Glykoproteinsynthese durch Hinzufügen von AST
  • (1) Synthese von Schleim-Glykoprotein mit verschiedenen EGFR-Liganden
  • 1) Zellherstellung
  • NCI-H292-Zellen (humane mucoepidermoide Lungen-Tumorzelllinie, bezogen von ATCC) wurden in 10% FCS (fötales Kälberserum für engl.: Fötal Calf Serumenthaltendem RPMI-1640 (hergestellt von Gibco Corp.) suspendiert, auf einem Lab-Tek 8-Kammer-Objektträger (hergestellt von Nunc Corp.) in einer Dichte von 6,0 × 104 Zellen/cm2 ausgesät, für 72 Stunden kultiviert, dem Ersetzen der Kulturlösung durch RPMI-1640, welches 0,1% BSA enthielt, ausgesetzt und weiterhin für 24 Stunden kultiviert.
  • Arzneimittelbehandlung
  • 2) Arzneimittelbehandlung
  • Am Tag der Behandlung wurde die Kulturlösung jeder Vertiefung durch RPMI-1640 (welches 0,1% BSA enthielt), welches EGF (5 ng/ml, hergestellt von Becton Dickinson Corp.), HB-EGF (5 ng/ml, hergestellt von R&D Corp.), TGF-α (5 ng/ml, hergestellt von Peprotech Corp.) oder PBS enthielt, ersetzt, um die Behandlung zu beginnen. Anschließend wurden die Zellen bei 37°C für 24 Stunden inkubiert.
  • 3) AB-PAS (Alicanblau-Periodic Acid/Schiff)-Färbung
  • Nach der festgelegten 24 Stunden Behandlung wurde der Kulturüberstand entfernt. Der Rest wurde einmal mit PBS gewaschen, mit 4% Paraformaldehyd/PBS gemischt und anschließend bei Raumtemperatur für eine Stunde stehen gelassen, um die Zellen zu immobilisieren. Die immobilisierten Zellen wurden zweimal mit Milli Q-Wasser gewaschen und anschließend mit AB-PAS gefärbt. Die Färbung wurde gemäß einem Buch ("All of new dyeing methods", S. 136-150 (Iyaku Shuppansha)) durchgeführt. Nach dem Färben wurden die Zellen nacheinander in 70, 80 und 100% Ethanol für jeweils fünf Minuten eingetaucht, um das Wasser zu entfernen, in einen Aquatex (hergestellt von Merck Corp.) eingeschlossen und anschließend wurde das gefärbte Bild mit einem optischen Mikroskop beobachtet. Die Ergebnisse sind in 1 und 2 gezeigt. Aus den Ergebnissen wurde aufgeklärt, dass HAST, TGF-α, EGF und HB-EGF alle die Herstellung des Schleim-Glykoproteins förderten.
    Kulturbedingungen AB-PAS Farbintensität
    PBS-Zugabe –
    EGF-Zugabe ++++++
    HB-EGF-Zugabe ++++++
    TGF-α-Zugabe ++++++
    Kulturbedingungen AB-PAS Farbintensität
    PBS-Zugabe –
    HAST-Zugabe ++++
    HB-EGF-Zugabe ++++++
    TGF-α-Zugabe ++++++
  • (2) Schleim-Glykoproteinsynthese aufgrund von HAST und Überprüfung der HAST-Aktivierung hemmenden Wirkung
  • 1) Zellherstellung
  • NCI-H292-Zellen (bezogen von ATCC) wurden in 10% FC enthaltendem RPMI-1640 (hergestellt von Gibo Corp.) suspendiert, auf einem Lab-Tek 8-Kammer-Objektträger (hergestellt von Nunc Corp.) in einer Dichte von 6,0 × 104 Zellen/cm2 ausgesät, für 72 Stunden kultiviert, dem Ersetzen der Kulturlösung durch RPMI-1640, welches 0,1% BSA enthielt, ausgesetzt und weiterhin für 24 Stunden kultiviert.
  • 2) Arzneimittelbehandlung
  • Am Tag der Behandlung wurde die Kulturlösung aus jeder Vertiefung durch RPMI-1640 (welches 0,1% BSA enthielt), welches nur PBS, PBS und Leupeptin (100 μM, hergestellt von SIGMA Corp.), nur HAST (300 mU/ml), HAST (300 mU/ml) und Leupeptin (100 μM) oder bei 99°C für 10 Minuten thermisch denaturiertes HAST enthielt, ersetzt.
  • 3) AB-PAS Färbung
  • Nach der festgelegten 24 Stunden Behandlung wurde der Kulturüberstand entfernt. Der Rest wurde einmal mit PBS gewaschen, mit 4% Paraformaldehyd/PBS gemischt und anschließend bei Raumtemperatur für eine Stunde stehen gelassen, um die Zellen zu immobilisieren. Die immobilisierten Zellen wurden zweimal mit Milli Q-Wasser gewaschen und anschließend mit AB-PAS gefärbt. Die Färbung wurde gemäß einem Buch ("All of new dyeing methods", S. 136-150 (Iyaku Shuppansha)) durchgeführt. Nach dem Färben wurden die Zellen nacheinander in 70, 80 und 100% Ethanol für jeweils fünf Minuten eingetaucht, um das Wasser zu entfernen, in einen Aquatex (hergestellt von Merck Corp.) eingeschlossen und anschließend wurde das gefärbte Bild mit einem optischen Mikroskop beobachtet.
  • Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen und 3 und 4 gezeigt. Aus den Ergebnissen wurde aufgeklärt, dass die durch HAST verursachte Förderung der Schleim-Glykoprotein-Herstellung durch hemmen der Aktivität von HAST mit dem Protease-Hemmstoff oder durch die thermische Behandlung kontrolliert werden konnte.
    Kulturbedingungen AB-PAS Farbintensität
    PBS-Zugabe –
    PBS/Leupeptin-Zugabe –
    HAST-Zugabe ++++++
    HAST/Leupeptin-Zugabe –
    Kulturbedingungen AB-PAS Farbintensität
    PBS-Zugabe –
    HAST-Zugabe ++++++
    Zugabe von thermisch denaturiertem HAST –
  • [Beispiel 14] Analyse der Muc5AC mRNA-Expressionsmenge aufgrund der Zugabe von AST durch ein Echtzeit-PCR-Verfahren
  • (1) Überprüfung der konzentrationsabhängigen Hemmung des Muc5AC-Herstellungsanstiegs des Hemmstoffes
  • 1) Zellen
  • NCI-H292-Zellen (bezogen von ATCC) wurden in 10% FCS enthaltendem RPMI-1640 (hergestellt von Gibco Corp.) suspendiert, auf eine 96-Vertiefungsplatte (hergestellt von Falcon Corp.) in einer Dichte von 6,0 × 104 Zellen/cm2 ausgesät, für 72 Stunden kultiviert, dem Ersetzen der Kulturlösung durch RPMI-1640, welches 0,1% BSA enthielt, ausgesetzt und weiterhin für 24 Stunden kultiviert.
  • 2) Arzneimittelbehandlung
  • Bevor es zu den Zellen hinzugefügt wurde, wurde das Leupeptin in verschiedenen Konzentrationen mit 300 mU/ml HAST für 30 Minuten auf Eis umgesetzt und weiterhin auf 37°C erhitzt. Anschließend wurde die Kulturlösung in den Vertiefungen vollständig durch das Kulturmedium ausgetauscht, welches das HAST oder Leupeptin enthielt, um die Behandlung zu beginnen, und die Behandlung wurde für 24 Stunden durchgeführt. HAST (300 mU/ml), welches thermisch bei 99°C für 10 Minuten behandelt wurde, als Kontrolle, nur EGF (1 ng/ml) und eine Kombination von EGF (5 ng/ml) mit Leupeptin (10–5 M) wurden auch ähnlich behandelt. Die Anzahl der Proben betrug 3.
  • 3) RNA-Extraktion
  • Die RNA wurde in jeder Vertiefung mit dem RNeasy Mini Kit und RNase freier DNase von QIAGEN Corp. extrahiert. 30 μl der RNA-Lösungen wurden jeweils erhalten.
  • 4) cDNA-Synthese
  • OmniScript-RT von QIAGEN Corp. wurde verwendet. Eine cDNA-Synthese-Reaktion wurde mit einem Zufallsprimer und 0,25 μg der RNA durchgeführt, um 20 μl der cDNA-Lösung zu erhalten. Ein Teil der cDNA-Lösung wurde mit Wasser 5-mal verdünnt, um eine Probe für einen TaqMan-Assay zu erhalten.
  • 5) TaqMan-Assay
  • Eine Probe der EGF-Behandlung wurde fortlaufend fünfmal verdünnt, um einen Standard herzustellen. PCR-Reaktionen wurden jeweils mit fünfmal verdünnter cDNA und dem Standard als Matrizen durchgeführt. Kommerziell verfügbare Primer und eine kommerziell verfügbare Sonde (hergestellt von ABI Corp.) wurden für β-Aktiv verwendet. Weiterhin wurden 5'-TCAACGGAGACTGCGAGTACAC-3' als ein vorwärts gerichteter Primer, 5'-TCTTGATGGCCTTGGAGCA-3' als ein rückwärts gerichteter Primer und 5'-ACTCCTTTCGTGTTGTCACCGAGAACGTC-3' als eine Sonde für Muc5AC verwendet. Die Primer und die Sonde wurden mit Primer Express Version 1.0 entworfen. Die Primer wurden in Auftrag gegeben und von Pharmacia Corp. synthetisiert. Die Sonde wurde auch in Auftrag gegeben und von ABI Corp. synthetisiert. Die PCR wurde mit TaqMan Universal PCR Mix (hergestellt von ABI Corp.) und GeneAmp 5700 gemäß einem Verfahrenshandbuch durchgeführt. Die Amplifikationsreaktion wurde bei 50°C für zwei Minuten, bei 95°C für 10 Minuten, weiterhin bei 95°C für 15 Sekunden und bei 60°C für eine Minute in insgesamt 40 Zyklen durchgeführt.
  • 6) Analyse
  • Sowohl für das Muc5AC als auch für das β-Aktin wurden die Expressionsmengen der Proben von den erhaltenen Ct-Werten relativ zu der Standardgeraden verglichen. Weiterhin wurden die Werte des Muc5AC durch die Werte des β-Aktiv geteilt, um die Werte zu korrigieren. Abschließend wurden die Werte der behandelten Proben durch den Durchschnittswert der unbehandelten Gruppe geteilt, um die Daten jeweils als die Anstiegsvergrößerung zu zeigen. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt.
  • Aus den Ergebnissen wurde gezeigt, dass die durch das HAST verursachte Förderung der Muc5AC-Genexpression durch Hemmen der Aktivität des HAST mit dem Protease-Hemmstoff oder durch die thermische Behandlung kontrolliert werden konnte.
  • (2) Überprüfung der Hemmung des Muc5AC-Herstellungsanstiegs durch einen Anti-EGF-R-Antikörper
  • 1) Zellen
  • NCI-H292-Zellen (bezogen von ATCC) wurden in 10% FCS enthaltendem RPMI-1640 (hergestellt von Gibco Corp.) suspendiert, auf eine 96-Vertiefungsplatte (hergestellt von Falcon Corp.) in einer Dichte von 6,0 × 104 Zellen/cm2 ausgesät, für 72 Stunden kultiviert, dem Ersetzen der Kulturlösung durch RPMI-1640, welches 0,1% BSA enthielt, ausgesetzt und weiterhin für 24 Stunden kultiviert.
  • 2) Arzneimittelbehandlung
    • ➀ Behandlung mit EGFR neutralisierendem Antikörper: das kultivierte Produkt wurde vorläufig mit einer Konzentration von 10 μg/ml eines EGFR-neutralisierenden Antikörpers (Klon LA1; hergestellt von Transduction Corp.) oder mit einer Konzentration von 10 μg/ml eines normalen Maus-IgG1 (hergestellt von R&D Corp.) bei 37°C für 30 Minuten behandelt, und das Kulturmedium wurde anschließend vollständig durch RPMI-1640 (welches 0,1% BSA enthielt) ausgetauscht, welches normalen Maus-IgG1 und HAST (300 mU/ml), den EGFR neutralisierenden Antikörper und HAST (300 mU/ml), normalen Maus-IgG1 und EGF (1 ng/ml) oder den EGFR neutralisierenden Antikörper und EGF (1 ng/ml) enthielt, um die Behandlung zu beginnen. Die Behandlung wurde weiterhin für 24 Stunden durchgeführt. Die Anzahl der Proben betrug 3.
    • ➁ Leupeptin-Behandlung: HAST (300 mU/ml) und EGF (1 ng/ml) wurden vorläufig mit Leupeptin (10–4 M) auf Eis für 30 Minuten behandelt, bei 37°C erhitzt und anschließend vollständig mit dem Kulturmedium in den Vertiefungen ausgetauscht, um die Behandlung zu beginnen. Die Behandlung wurde weiterhin für 24 Stunden durchgeführt. Die Anzahl der Proben betrug 3.
  • 3) RNA-Extraktion
  • Die RNA wurde in jeder Vertiefung mit dem RNeasy Mini Kit und RNase freier DNase von QIAGEN Corp. extrahiert. 30 μl der RNA-Lösungen wurden jeweils erhalten.
  • 4) cDNA-Synthese
  • OmniScript-RT von QIAGEN Corp. wurde verwendet. Eine cDNA-Synthese-Reaktion wurde mit einem Zufallsprimer und 0,25 μg der RNA durchgeführt, um 20 μl der cDNA-Lösung zu erhalten. Ein Teil der cDNA-Lösung wurde mit Wasser 5-mal verdünnt, um eine Probe für einen TaqMan-Assay zu erhalten.
  • 5) TaqMan-Assay
  • Eine Probe der EGF-Behandlung wurde fortlaufend fünfmal verdünnt, um einen Standard herzustellen. PCR-Reaktionen wurden jeweils mit fünfmal verdünnter cDNA und dem Standard als Matrizen durchgeführt. Kommerziell verfügbare Primer und eine kommerziell verfügbare Sonde (hergestellt von ABI Corp.) wurden für β-Aktin verwendet. Weiterhin wurden 5'-TCAACGGAGACTGCGAGTACAC-3' als ein vorwärts gerichteter Primer, 5'-TCTTGATGGCCTTGGAGCA-3' als ein rückwärts gerichteter Primer und 5'-ACTCCTTTCGTGTTGTCACCGAGAACGTC-3' als eine Sonde für Muc5AC verwendet. Die Primer und die Sonde wurden mit Primer Express Version 1.0 entworfen. Die Primer wurden in Auftrag gegeben und von Pharmacia Corp. synthetisiert. Die Sonde wurde auch in Auftrag gegeben und von ABI Corp. synthetisiert. Die PCR wurde mit TaqMan Universal PCR Mix (hergestellt von ABI Corp.) und GeneAmp 5700 gemäß einem Verfahrenshandbuch durchgeführt. Die Amplifikationsreaktion wurde bei 50°C für zwei Minuten, bei 95°C für 10 Minuten, weiterhin bei 95°C für 15 Sekunden und bei 60°C für eine Minute in insgesamt 40 Zyklen durchgeführt.
  • 6) Analyse
  • Sowohl für das Muc5AC, als auch für das β-Aktin wurden die Expressionsmengen der Proben von den erhaltenen Ct-Werten relativ zu der Standardgeraden verglichen. Weiterhin wurden die Werte des Muc5AC durch die Werte des β-Aktin geteilt, um die Werte zu korrigieren. Abschließend wurden die Werte der behandelten Proben durch den Durchschnittswert der unbehandelten Gruppe geteilt, um die Daten jeweils als die Anstiegsvergrößerung zu zeigen. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt.
  • Aus den Ergebnissen wurde gezeigt, dass die durch das HAST verursachte Förderung der Muc5AC-Genexpression durch Hemmen der Aktivität des HAST mit dem Protease-Hemmstoff oder durch die thermische Behandlung kontrolliert werden konnte. Weiterhin wurde gezeigt, dass das HAST die Muc5AC-Genexpression über den EGFR förderte.
  • (3) Vergleich mit Trypsin, Esterase, Tryptase
  • 1) Zellen
  • NCI-H292-Zellen (bezogen von ATCC) wurden in 10% FCS enthaltendem RPMI-1640 (hergestellt von Gibco Corp.) suspendiert, auf eine 96-Vertiefungsplatte (hergestellt von Falcon Corp.) in einer Dichte von 6,0 × 104 Zellen/cm2 ausgesät, für 72 Stunden kultiviert, dem Ersetzen der Kulturlösung durch RPMI-1640, welches 0,1% BSA enthielt, ausgesetzt und weiterhin für 24 Stunden kultiviert.
  • 2) Arzneimittelbehandlung
  • Am Tag der Behandlung wurde die Kulturlösung in jeder Vertiefung durch RPMI-1640 (welches 0,1% BSA enthielt), welches HAST (0,3 mU/ml), Esterase (0,1, 1, 10 U/ml), Trypsin (0,1, 1, 10 U/ml) und Tryptase (0,1, 1, 10 U/ml) enthielt, ersetzt, und die Behandlung wurde für 24 Stunden durchgeführt.
  • 3) RNA-Extraktion
  • Die RNA wurde in jeder Vertiefung mit dem RNeasy Mini Kit und RNase freier DNase von QIAGEN Corp. extrahiert. 30 μl der RNA-Lösungen wurden jeweils erhalten.
  • 4) cDNA-Synthese
  • OmniScript-RT von QIAGEN Corp. wurde verwendet. Eine cDNA-Synthese-Reaktion wurde mit einem Zufallsprimer und 0,25 μg der RNA durchgeführt, um 20 μl der cDNA-Lösung zu erhalten. Ein Teil der cDNA-Lösung wurde mit Wasser 5-mal verdünnt, um eine Probe für einen TaqMan-Assay zu erhalten.
  • 5) TaqMan-Assay
  • Eine Probe der EGF-Behandlung wurde fortlaufend fünfmal verdünnt, um einen Standard herzustellen. PCR-Reaktionen wurden jeweils mit fünfmal verdünnter cDNA und dem Standard als Matrizen durchgeführt. Kommerziell verfügbare Primer und eine kommerziell verfügbare Sonde (hergestellt von ABI Corp.) wurden für β-Aktin verwendet. Weiterhin wurden 5'-TCAACGGAGACTGCGAGTACAC-3' als ein vorwärts gerichteter Primer, 5'-TCTTGATGGCCTTGGAGCA-3' als ein rückwärts gerichteter Primer und 5'-ACTCCTTTCGTGTTGTCACCGAGAACGTC-3' als eine Sonde für Muc5AC verwendet. Die Primer und die Sonde wurden mit Primer Express Version 1.0 entworfen. Die Primer wurden in Auftrag gegeben und von Pharmacia Corp. synthetisiert. Die Sonde wurde auch in Auftrag gegeben und von ABI Corp. synthetisiert. Die PCR wurde mit TaqMan Universal PCR Mix (hergestellt von ABI Corp.) und GeneAmp 5700 gemäß einem Verfahrenshandbuch durchgeführt. Die Amplifikationsreaktion wurde bei 50°C für zwei Minuten, bei 95°C für 10 Minuten, weiterhin bei 95°C für 15 Sekunden und bei 60°C für eine Minute in insgesamt 40 Zyklen durchgeführt.
  • 6) Analyse
  • Sowohl für das Muc5AC, als auch für das β-Aktin wurden die Expressionsmengen der Proben von den erhaltenen Ct-Werten relativ zu der Standardgeraden verglichen. Weiterhin wurden die Werte des Muc5AC durch die Werte des β-Aktin geteilt, um die Werte zu korrigieren. Abschließend wurden die Werte der behandelten Proben durch den Durchschnittswert der unbehandelten Gruppe geteilt, um die Daten jeweils als die Anstiegsvergrößerung zu zeigen. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt.
  • Aus den Ergebnissen wurde gefunden, dass die Muc5AC-Genexpression durch einen Mechanismus gefördert wurde, welchen das Trypsin, die Tryptase und die Esterase nicht aufwiesen.
  • [Beispiel 15] Spaltung von EGF-L (EGF und HB-EGF) an der Oberfläche der Zellmembran mit HAST
  • (1) Spaltung von EGF und HB-EGF-Antigen an der Oberfläche der H292-Zellemembran mit HAST
  • 1) Zellen
  • NCI-H292-Zellen (bezogen von ATCC) wurden in einer 10 cm Schale in 10% FCS enthaltendem RPMI-1640 kultiviert, bis sie einen konfluenten Zustand erreichten, dem Ersetzen des Kulturmediums durch RPMI-1640, welches 0,1% BSA enthielt, ausgesetzt und weiterhin für 24 Stunden kultiviert. Die kultivierten Zellen wurden mit PBS gewaschen, behandelt und in PBS, welches 5 mM EDTA enthielt, bei 37°C für 5 Minuten aufgeschwemmt und anschließend in 0,1% BSA enthaltendem RPMI-1640 in einer Dichte von 1,0 × 107 Zellen/ml suspendiert.
  • 2) Arzneimittelbehandlung
  • Die oben beschriebene Zellsuspension und 0,1% BSA enthaltendes RPMI-1640, welches HAST in einer zweifachen Konzentration (600 mU/ml) enthielt, wurden miteinander in jeweils äquivalenten Mengen gemischt und miteinander bei 37°C für 30 Minuten umgesetzt (Zellendkonzentration: 5,0 × 106 Zellen/ml, HAST-Endkonzentration: 300 mU/ml). Die Reaktionslösung wurde mit eisgekühltem 1% FCS enthaltendem PBS in einem 5-fachen Volumen der Reaktionslösung gemischt, um die Reaktion abzustoppen, und die behandelte Lösung wurde anschließend für eine Oberflächenantigen-Analyse bereitgestellt.
  • 3) Oberflächenantigen-Analyse
  • Die Zellen, welche den festgesetzten Behandlungen ausgesetzt waren, wurden in 1% FCS enthaltendem PBS in einer Dichte von 1,0 × 10 Zellen/ml suspendiert. 100 μl der hergestellten Zellsuspension wurden mit einem ersten Antigen (EGF-Hintergrundfärbung: 1 μg normaler Maus-IgG1 (hergestellt von R&D Corp.), EGF-Färbung: 1 μg eines monoklonalen Anti-EGF Maus-Antikörpers (hergestellt von R&D Corp.), HB-EGF Hintergrundfärbung: frei von primärem Antigen, HB-EGF-Färbung: 2 μg eines polyklonalen Anti-HB-EGF Ziegen-Antikörpers (hergestellt von R&D Corp.)) gemischt und auf Eis für 30 Minuten umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde einmal mit 5 ml 1% FCS enthaltendem PBS gewaschen, mit 2 μg eines zweiten Antigens (EGF-Hintergrundfärbung und EGF-Färbung: FITC konjugiertes F(ab')2-Fragment gegen Mäuse-IgG (hergestellt von Dako Corp.), HB-EGF-Hintergrundfärbung und HB-EGF-Färbung: Schwein Anti-Ziege Ig's Fluorescein-Konjugat (hergestellt von KPL Corp.)) gemischt und anschließend auf Eis für 30 Minuten umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde einmal mit 5 ml 1% FCS enthaltendem PBS gewaschen und anschließend mit Cell Fix (hergestellt von Becton Dickinson Corp.) gemischt, um die Zellen zu immobilisieren. Die Expression des Oberflächenantigens wurde mit FACS Calibur (hergestellt von Becton Dickinson Corp.) untersucht und mit Cell Quest (hergestellt von Becton Dickinson Corp.) analysiert. Durchschnittliche Fluoreszenzintensitäten werden in der folgenden Tabelle als Indikatoren der Expressionsintensitäten gezeigt.
  • Aus den Ergebnissen wurde gefunden, dass das HAST proEGF und proHB-EGF auf den Oberflächen der Zellmembranen spaltete.
  • Die Änderungen der EGF-, HB-EGF-Expressionsintensitäten auf der Oberfläche der Zellmembranen durch die HAST-Behandlung
    Hintergrund PBS HAST
    EGF 4,62 7,26 4,88
    HB-EGF 4,5 8,72 6,94
  • (2) Untersuchung der AST-Aktivität hemmenden Wirkung
  • 1) Zellen
  • NCI-H292-Zellen (bezogen von ATCC) wurden in einer 10 cm Schale in 10% FCS enthaltendem RPMI-1640 kultiviert, bis sie einen konfluenten Zustand erreichten, dem Ersetzen des Kulturmediums durch RPMI-1640, welches 0,1% BSA enthielt, ausgesetzt und weiterhin für 24 Stunden kultiviert. Die kultivierten Zellen wurden mit PBS gewaschen, behandelt und in PBS, welches 5 mM EDTA enthielt, bei 37°C für 5 Minuten aufgeschwemmt und anschließend in 0,1% BSA enthaltendem RPMI-1640 in einer Dichte von 1,0 × 107 Zellen/ml suspendiert.
  • 2) Arzneimittelbehandlung
  • HAST (600 mU/ml) wurde mit Leupeptin (10 μM) oder BB1101 (5 μM) in 0,1% BSA enthaltendem RPMI-1640 auf Eis für 30 Minuten umgesetzt, und die Reakti onslösung wurde mit der äquivalenten Menge einer Zellsuspension gemischt, welche vorläufig mit Leupeptin (10 μM) oder 881101 (5 μM) bei 37°C für 30 Minuten behandelt wurde und weiterhin bei 37°C für 30 Minuten behandelt (HAST- Endkonzentration: 300 mU/ml, Leupeptin-Endkonzentration: 10 μM, BB1101-Endkonzentration: 5 μM, Zell-Endkonzentration: 5,0 × 106 Zellen/ml). Die Reaktionslösung wurde. mit eisgekühltem 1% FCS enthaltendem PBS in einer 5-fachen Menge der Reaktionslösung gemischt, um die Reaktion abzustoppen und anschließend für die Oberflächenantigen-Analyse bereitgestellt.
  • 3) Oberflächenantigen-Analyse
  • Die Zellen, welche den festgesetzten Behandlungen ausgesetzt waren, wurden in 1% FCS enthaltendem PBS in einer Dichte von 1,0 × 10 Zellen/ml suspendiert. 100 μl der hergestellten Zellsuspension wurde mit einem erste Antigen (EGF-Hintergrundfärbung: 1 μg normaler Maus-IgG1 (hergestellt von R&D Corp.), EGF-Färbung: 1 μg eines monoklonalen Anti-EGF Maus-Antikörpers (hergestellt von R&D Corp.), HB-EGF Hintergrundfärbung: frei von primärem Antigen, HB-EGF-Färbung: 2 μg eines polyklonalen Anti-HB-EGF Ziegen-Antikörpers (hergestellt von R&D Corp.)) gemischt und auf Eis für 30 Minuten umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde einmal mit 5 ml 1% FCS enthaltendem PBS gewaschen, mit 2 μg eines zweiten Antigens (EGF-Hintergrundfärbung und EGF-Färbung: PerCP konjugiertes F(ab')2-Fragment gegen Mäuse-IgG (hergestellt von Becton Dickinson Corp.), oder Schwein Anti-Ziege Ig's Fluorescein-Konjugat) gemischt und anschließend auf Eis für 30 Minuten umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde einmal mit 5 ml 1% FCS enthaltendem PBS gewaschen und anschließend mit Cell Fix (hergestellt von Becton Dickinson Corp.) gemischt, um die Zellen zu immobilisieren. Die Expression des Oberflächenantigens wurde mit FACS Calibur (hergestellt von Becton Dickinson Corp.) untersucht und mit Cell Quest (hergestellt von Becton Dickinson Corp.) analysiert. Durchschnittliche Fluoreszenzintensitäten werden in der folgenden Tabelle als Indikatoren der Expressionsintensitäten gezeigt.
  • Aus den Ergebnissen wurde gefunden, dass die HAST verursachte Spaltung von proEGF und proHB-EGF auf der Oberfläche der Zellmembranen durch Hemmen der Aktivität des HAST mit dem Protease-Hemmstoff gehemmt wurde.
  • Die Änderungen der EGF-, HB-EGF-Expressionsintensitäten auf der Oberfläche der Zellmembranen durch die HAST-Behandlung
    Hintergrund PBS HAST HAST + Leupeptin HAST + BB01
    EGF 8,44 10,79 8,33 10,18 7,49
    HB-EGF 5,58 8,61 6,26 7,3 6,65
  • (3) Überprüfung der EGF-L (humaner HB-EGF)-Exzision aufgrund von HAST
  • 1) Herstellung von einem humanen HB-EGF Expressionsplasmid für Tierzellen
  • Eine cDNA wurde mit dem SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis Kit (hergestellt von GIBCO-BRL Corp.) unter Verwendung von 2,5 μg humaner Atemwegs-PolyA+RNA (hergestellt von Clontech Corp.) und Oligo (dT)12-18 gemäß einem beigefügten Protokoll synthetisiert. Ein cDNA-Fragment, welches eine Juxtamembran-Domäne enthaltende Domäne kodiert, wurde aus dem Signalpeptid des N-Terminus des humanen HB-EGF mit der hergestellten humanen Atemwegs-cDNA als Matrize durch eine Amplifikation unter Verwendung von PyorobestPCR (hergestellt von Takara Shuzo Co.) erhalten. Andererseits wurde humane alkalische Plazenta-Phosphatase-cDNA aus dem pSEAO2-Kontrollvektor (hergestellt von Clontech Corp.) durch eine Amplifikation mit der PyorobestPCR erhalten.
  • Ein DNA-Fragment: HBEGF (ΔTM)-ALP (SEQ ID NR: 44), welches durch Hinzufügen humaner alkalischer Planzenta-Phosphatase zu dem C-Terminus der Juxtamembran-Domäne erhalten wurde, wurde durch Ligieren eines DNA-Fragments, welches eine Domäne kodiert, die eine Juxtamembran-Domäne von dem Signalpeptid des N-Terminus des humanen HB-EGF enthielt, an ein DNA-Fragment, welches humane alkalische Plazenta-Phosphatase kodiert, durch ein PCR-Verfahren hergestellt.
  • Ein humanes HBEGF exprimierendes Plasmid: pEF9-HBEGF (ΔTM)-ALP wurde durch Einfügen des oben beschriebenen HBEGF in die multiple Klonierungsstelle des in Beispiel 12 (1) hergestellten pEF9-Vektors hergestellt.
  • 2) Expression von HBEGF in kultivierten humanen Zellen
  • Die 293EBNA-Zelllinie wurde in einer Dichte von 9 × 106 Zellen/10 cm Schale ausgesät, über Nacht kultiviert und anschließend mit dem in 1) hergestellten humanen HBEGF exprimierenden Plasmid: pEF9-HBEGF (ΔTM)-ALP transfiziert. 12 μg des pEF9-HBEGF (ΔTM)-ALP wurden einer Lipofektion mit 75 μl Lipofectamin 2000 (hergestellt von GIBCO-BRL) unterzogen. Die Lipofektion wurde gemäß einem beigefügten Handbuch durchgeführt. 72 Stunden später wurden die Zellen mit einer Pipette abgelöst und anschließend bei 3000 rpm bei 4°C für fünf Minuten zentrifugiert. Das Lysat wurde in 12 ml M-PER (hergestellt von PIERCE Corp.) gelöst, einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter einer nicht reduzierenden Bedingung ausgesetzt und anschließend auf eine Nitrozellulosemembran (hergestellt von BIO-RAD Corp.) geblottet.
  • Das auf die Nitrozellulosemembran geblottete Produkt wurde mit 3% BSA enthaltendem PBS bei 4°C über Nacht behandelt und anschließend mit dem Antihumanes HB-EGF-Antikörper (hergestellt von GENZYME Corp., ein Antikörper, der eine EGFR-Bindungsstelle erkennt), der mit 1% BSA enthaltendem PBS in einer Konzentration von 1 μg/ml verdünnt war, bei Raumtemperatur für 1 Stunde umgesetzt. Die Nitrozellulosemembran wurde mit 0,05% Tween 20 enthaltendem PBS dreimal gewaschen und anschließend mit Schwein Anti-Ziege Ig's-ALP-Antikörper (hergestellt von BIOSOURCE Corp.), der mit 1% BSA enthaltendem PBS in einer Konzentration von 1 μg/ml verdünnt war, bei Raumtemperatur für eine Stunde umgesetzt. Die Nitrozellulosemembran wurde mit 0,05% Tween 20 enthaltendem PBS dreimal gewaschen, weiterhin einmal mit TBS gewaschen und anschließend mit NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid)/BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat-p-toluidinsalz, hergestellt von PIERCE Corp.) bei Raumtemperatur für fünf Minuten umgesetzt, um die Farbe zu entwickeln
  • 3) Aktivität der Spaltung von HBEGF (ΔTM)-ALP aufgrund von HAST
  • 100 μl des Lysats, das mit dem M-PER gelöst wurde, wurde mit 10 μl eines rekombinanten HAST (1,56 U/ml) gemischt und bei 37°C über Nacht inkubiert. Die Probe wurde einer Western-Blot-Behandlung unterzogen, ähnlich wie oben beschrieben. Folglich wurden die folgenden Tatsachen in der Probe mit zugegebenem HAST identifiziert. Ein Bande, welche Reaktivität mit dem Anti-humanes HB-EGF-Antikörper (einem Antikörper, der eine EGFR-Bindungsstelle erkennt) zeigte, wurde zu einem niedrigen Molekulargewicht verschoben. Eine reife Form, welche die EGF-Domäne des HB-EGF aufwies, wurde herausgeschnitten. Die Bande wurde zu einer Position von ungefähr 12 kD verschoben.
  • [Beispie 16] Analyse der Tyrosinphosphorylierung von EGFR aufgrund von HAST
  • 1) Zellen
  • NCI-H292-Zellen (bezogen von ATCC) wurden in 10% FCS enthaltendem RPMI-1640 (hergestellt von Gibco Corp.) suspendiert und anschließend auf eine 12-Vertiefungsplatte (hergestellt von Falcon Corp.) in einer Dichte von 6,0 × 104 Zellen/cm2 ausgesät. Die Zellen wurden für 72 Stunden kultiviert, dem Ersetzen des Kulturmediums durch 0,1% BSA enthaltendem RPMI-1640 ausgesetzt und weiterhin für 24 Stunden kultiviert.
  • 2) Arzneimittelbehandlung
  • Am Tag der Behandlung wurde die Kulturlösung der Vertiefungen durch RPMI-1640 (welches 0,1% BSA enthielt), welches HAST (0,3 U/ml), EGF (1 μg/ml) ent hielt, ersetzt, und die Behandlungen wurden für jeweils 30, 60, 120, 180, 240 Minuten durchgeführt.
  • 3) Herstellung des Zelllysats
  • Die Zellen, die mit dem HAST oder dem EGF für die festgesetzte Zeit behandelt wurden, wurden zweimal mit eisgekühltem PBS gewaschen, mit 500 μl einer eisgekühlten Lyse-Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100 (Sigma), 150 mM NaCl, 10% Glycerin, 1% Protease-Hemmstoffcocktail (Sigma), 1% Phosphatase-Hemmstoffcocktail (Sigma)) gemischt, für 15 Minuten auf Eis stehen gelassen und anschließend in ein Mikroröhrchen gebracht. Das gewonnene Produkt im Mikroröhrchen wurde bei 15.000 rpm bei 4°C für 10 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wurde als eine Probe gewonnen. Die Proteinkonzentration der Probe wurde mit einem BioRad Protein-Assay (hergestellt von Bio Rad Corp.) untersucht und angemessen mit der Lyse-Pufferlösung verdünnt, sodass die Proteinkonzentrationen in allen Proben 1,48 mg/ml betrugen. Nachfolgend wurden 406 μl der verdünnten Lösung für die folgende Immunpräzipitation verwendet.
  • 4) Immunpräzipitation
  • Das oben beschriebene hergestellte Zelllysat (1,48 mg/ml, 406 μl) wurde mit 8 μl Agarose konjugiertem Maus-IgG1 (hergestellt von Santa Cruz Corp.) und 20 μl Protein G Plus Agarose (hergestellt von Oncogene Corp.) gemischt, vorsichtig bei 4°C für zwei Stunden gerührt und anschließend bei 3.000 rpm bei 4°C für eine Minute zentrifugiert. Der Überstand wurde gewonnen, mit 4 μg eines Anti-EGFR-Antikörpers (Clon LA1, hergestellt von Transduction Corp.) gemischt, vorsichtig bei 4°C für eine Stunde gerührt, weiterhin mit 20 μl Protein G Plus Agarose (hergestellt von Oncogene Corp.) gemischt, vorsichtig bei 4°C über Nacht gerührt und anschließend bei 3000 rpm bei 4°C für eine Minute zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt wurde, wurden die Präzipitate mit 1 ml einer eisgekühlten Waschpufferlösung (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 100 mM NaCl, 0,05% Tween- 20 (BiodRad)) viermal gewaschen, weiterhin einmal mit einer Wasch-Pufferlösung, welche kein Tween-20 enthielt, gewaschen und anschließend bei 3000 rpm bei 4°C für eine Minute zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und die Präzipitate wurden mit 25 μl einer SDS-Probenpufferlösung (125 mM Tris-HCl, pH-Wert 6,8 4% SDS, 10% Glycerin, 0,04% Bromphenolblau, 4% 2-Mercaptoethanol) gemischt, bei 99°C für fünf Minuten erhitzt und anschließend bei 3.000 rpm bei Raumtemperatur für eine Minute zentrifugiert. Der Überstand wurde gewonnen und als Probe für eine Western-Blot-Behandlung verwendet.
  • 5) Western-Blot
  • Die durch die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennten Proteine wurden auf eine Nylonmembran (Immobilon PVDF Membran, hergestellt von Millipore Corp.) durch einen Halbtrocken-Transfer (hergestellt von Ato Corp.) übertragen. Die übertragenen Proteine wurden in einer Blot-Pufferlösung (1% BSA (hergestellt von Boehringer Mannheim GmbH) enthaltenden Waschpufferlösung) bei 4°C über Nacht geblottet. Nachfolgend wurden die geblotteten Proteine mit einem HRP-Anti-Phosphotyrosin-Antikörper, der mit einer Blockierungs-Pufferlösung 2500-fach verdünnt war, bei Raumtemperatur für eine Stunde umgesetzt. Die Membran wurde mit einer Waschpufferlösung sechsmal gewaschen und anschließend der Entwicklung der Farbe ausgesetzt.
  • 6) Farbentwicklung, -nachweis
  • Es wurde ECLplus (hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech Corp.) verwendet. Nachdem sie gewaschen war, wurde die Membran für fünf Minuten in eine ECL Farb-Entwicklungslösung eingetaucht, der Entfernung der überschüssigen Farb-Entwicklungslösung von der Membran ausgesetzt, in Saran-Folie eingeschlossen, für 2 bis 5 Minuten einem Röntgenfilm ausgesetzt, entwickelt und anschließend der Analyse der Banden der Tyrosin-phosphorylierten Proteine ausgesetzt.
  • 7) Resondierung
  • Nachdem sie dem Röntgenfilm ausgesetzt war, wurde die Membran mit einer Waschpufferlösung für fünf Minuten dreimal gewaschen. Die Membran wurde in Restore-Reagens (hergestellt von PIERCE Corp.) bei 37°C für 15 Minuten geschüttelt, um den Antikörper zu entfernen. Die Membran wurde mit einer Waschpufferlösung für fünf Minuten dreimal gewaschen, der Entwicklung der Farbe durch das oben beschriebene Verfahren mit ECLplus ausgesetzt und anschließend für 10 Minuten einem Röntgenfilm ausgesetzt. Nachdem festgestellt wurde, dass keine Bande auf dem entwickelten Röntgenfilm zurückblieb, wurde die Membran mit einer Waschpufferlösung für fünf Minuten dreimal gewaschen, weiterhin in eine Blockierungs-Pufferlösung eingetaucht und bei 4°C über Nacht stehen gelassen, um zu blockieren. Das blockierte Produkt wurde anschließend mit einem Anti-EGFR-Antikörper (Klon 13, hergestellt von Transduction Corp.), der mit einer Blockierungs-Pufferlösung in einer Konzentration von 0,1 μg/ml verdünnt war, bei Raumtemperatur für eine Stunde umgesetzt. Das Produkt wurde mit einer Waschpufferlösung sechsmal gewaschen, anschließend mit einem HRP markierten Anti-Maus-IgG-Antikörper (hergestellt von Amersham Corp.), der mit einer Blockierungs-Pufferlösung 6000-fach vedünnt war, bei Raumtemperatur für eine Stunde umgesetzt, mit einer Waschpufferlösung sechsmal gewaschen und anschließend der Farbentwicklung unter Verwendung von ECLplus durch das oben beschriebene Verfahren ausgesetzt. Die Farbe entwickelnde Bande von EGFR wurde nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt.
  • So wurde aufgeklärt, dass HAST EGFR durch die Förderung der Tyrosin-Phosphorylierung von EGFR aktivierte.
  • [Beispiel 17] Erhalt von polyklonalem Anti-AST-Antikörper
  • (1) Erhalt von Anti-Peptid-Antikörper
  • Ein 20 Einheiten-Peptid (SEQ ID NR: 25), welches von Isoleucin an der 187. Position des humanen AST bis zu einer Einheit an der 205. Position reichte und ein Cystein am N-Terminus aufwies, wurde chemisch mit einem Peptid-Syntheseautomaten (Applied Biosystems Modell 431A) synthetisiert. Das synthetisierte Peptid wurde in einer 10 mM Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,5) gelöst (10 mg/ml) und anschließend mit 10 mg Maleimid aktiviertem Hämocyanin (hergestellt von Boehringer Mannheim Biochemica Corp.) bei 25°C für zwei Stunden inkubiert. Die Reaktionslösung wurde mit einer 10 mM Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,5) dialysiert. Das Hämocyanin gebundene Peptid wurde einem Kaninchen subkutan verabreicht (0,5 mg/Verabreichung). Die Verabreichung wurde sechsmal in zweiwöchigen Intervallen wiederholt. Das Gesamtblut wurde gesammelt, und das Serum wurde hergestellt. Das Serum wurde mit einer Sepharose-4B-Säule (hergestellt von Pharmacia Corp.) gereinigt, um den polyklonalen Anti-AST-Antikörper (Anti-N19-PAb) zu erhalten.
  • (2) Erhalt eines anti-rekombinantes AST-Antikörpers
  • Das rekombinante AST (40 μg/Verabreichung), welches in Beispiel 1 hergestellt wurde, und vollständiges Freund-Adjuvans (hergestellt von BACTO Corp., 1:1) wurden subkutan einem Kaninchen in zweiwöchigen Intervallen verabreicht. Nachdem die Behandlung viermal durchgeführt wurde, wurde das Gesamtblut gesammelt, um ein Antiserum zu erhalten. Das IgG wurde aus dem Serum mit einer Protein A-Sepharose 4B-Säule (hergestellt von Pharmacia Corp.) gemäß einem gängigen Verfahren gereinigt, um den polyklonalen Anti-AST-Antikörper (Anti-rAST PAb) zu erhalten.
  • [Beispiel 18] Herstellung eines monoklonalen Anti-AST-Antikörpers
  • (1) Immunisierung einer Maus mit rekombinantem AST
  • Das in Beispiel 1 hergestellte rekombinante AST und vollständiges Freund-Adjuvans (hergestellt von BACTO Corp., 1:1) wurden intraperitoneal (10 bis 20 μg/Verabreichung/Kopf) in eine Balb/c-Maus (7 Wochen alt, männlich) in zwei wöchigen Intervallen verabreicht. Nachdem die Behandlung viermal durchgeführt wurde, wurde die fünfte Verabreichung durch intravenöses Verabreichen von 50 μg einer rekombinanten AST-Lösung, welche drei Tage vor dem Tag der Zellfusion verabreicht wurde, durchgeführt. Das Blut wurde aus der Schwanzvene der Maus gesammelt, bei 37°C für 30 Minuten inkubiert und anschließend bei 3000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert, um das Serum zu gewinnen. Der Anti-AST-Antikörper-Titer in dem Serum wurde durch einen ELISA untersucht.
  • Nachfolgend wird das Verfahren beschrieben werden.
  • 50 μl des rekombinanten AST, welches mit 0,05 M Na2CO3-Pufferlösung (pH-Wert 10,5) in einer Konzentration von 1 μg/ml verdünnt war, wurden zu einer 96-Loch ELISA-Platte (Falcon 3912, Becton Dickinson Corp.) hinzugefügt und bei 4°C über Nacht umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde mit PBS, welches 0,05% Tween 20 enthielt, dreimal gewaschen und anschließend mit PBS, welches 3% bovines Serumalbumin (BSA) enthielt, bei Raumtemperatur für eine Stunde behandelt. Das behandelte Produkt wurde mit PBS, welches 0,05% Tween 20 enthielt, dreimal gewaschen, mit 50 μl einer Probe gemischt und bei Raumtemperatur für eine Stunde umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde mit PBS, welches 0,05% Tween 20 enthielt, dreimal gewaschen, mit 50 μl eines an alkalische Phosphatase gebundenen Ziege Anti-Maus IgG-Antikörpers (ZYMED Corp.), der mit 3% BSA enthaltendem PBS 1000-fach verdünnt war, gemischt und bei Raumtemperatur für eine Stunde umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde mit PBS, welches 0,05% Tween 20 enthielt, dreimal gewaschen, mit PNPP (p-Nitrophenylphosphat, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) bei Raumtemperatur für eine Stunde umgesetzt und anschließend dem Assay der Absorption bei 405 nm ausgesetzt.
  • (2) Herstellung eines Hybridoms durch Zellfusion
  • Eine Maus wurde kurz vor der Zellfusion getötet, und die Milzzellen der getöteten Maus wurden in PBS homogenisiert. Die Reste wurden mit einem Nylonnetz abfilt riert und anschließend einmal einer Zentrifugen-Waschbehandlung unter Verwendung von PBS ausgesetzt. Die erhaltenen Milzzellen wurden mit Maus-Myelomzellen (P3X63Ag8U. 1) gemäß einem gängigen Verfahren (Kohler, Milstein; Nature, 256, 495 bis 497, 1975) fusioniert.
  • Es wurden nämlich 5 × 10 Milzzellen und 5 × 106 Maus-Myelomzellen P3 × 63 Ag8U. 1(P3U1) mit RPMI-1640 Kulturmedium gewaschen und anschließend bei 1.500 rpm für fünf Minuten zentrifugiert, um das Zellpellet zu erhalten. 1 ml des Zellpellets wurde schrittweise mit einer 35% Polyethylenglykol-Lösung (5,75 ml RPMI-1640 Kulturmedium + 3,5 ml Polyethylenglykol + 0,75 ml Dimethylsulfoxid) für zwei Minuten gemischt, um die Zellen vorsichtig aufzuschwemmen. Das Gemisch wurde schrittweise mit 1 ml RPMI-1640 Kulturmedium für zwei Minuten gemischt und weiterhin mit 2 ml RPMI-1640 Kulturmedium für zwei Minuten. Das Gemisch wurde schrittweise mit 4 ml GIT-HAT Kulturmedium (GIT Kulturmedium, das 95 μM Hypoxanthin, 0,4 μM Aminopterin, 1,6 μM Thymidin und 5% FCS enthielt) für zwei Minuten gemischt, weiterhin mit 8 ml GIT-HAT Kulturmedium für zwei Minuten gemischt und anschließend bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Das inkubierte Produkt wurde in einer 96-Vertiefungsflachbodenplatte verteilt, wobei in jeder Vertiefung ungefähr 104 peritoneale Mäuse-Exsudatzellen ausgesät wurden, und anschließend in der Anwesenheit von 5% CO2 bei 37°C kultiviert.
  • Eine Woche später wurde das Kulturprodukt dem Austausch der Hälfte des Kulturmediums durch GIT-HT Kulturmedium (einem Kulturmedium, welches durch Entfernen von Aminopterin aus dem GIT-HAT Kulturmedium erhalten wurde) ausgesetzt und weiterhin in der Anwesenheit von 5% CO2 bei 37°C für ungefähr eine Woche kultiviert, um mehrere Hybridomkolonien pro Vertiefung zu erhalten.
  • (3) Screenen des Hybridoms
  • Zwei Wochen später wurde das Screenen des Hybridoms mit einer Platte, die mit dem rekombinanten AST beschichtet war, durchgeführt. Die 50 mM Na2CO3-Pufferlösung (1 μg/ml, pH-Wert 10,5) des rekombinanten AST wurde in einer 96- Vertiefungsplatte (Falcon Corp., hergestellt aus PVC) mit einem Volumen von 50 μl pro Vertiefung verteilt und anschließend bei 4°C über Nacht stehen gelassen. Das Produkt wurde gewaschen und anschließend mit 200 μl/Vertiefung 3% BSA/PBS bei 37°C für eine Stunde blockiert. Das Produkt wurde wiederum gewaschen, mit 50 μl/Vertiefung des Kulturüberstands gemischt, für eine Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen und anschließend mit 0,05% Tween/PBS dreimal gewaschen.
  • Nachfolgend wurde das Produkt mit 50 μl/Vertiefung Ziege Anti-Maus-IgG-alkalische Phosphatase-Konjugat (Tago Corp.), welches mit PBS, das 3% BSA und 0,2% Magermilch enthielt, 2000-fach verdünnt, bei Raumtemperatur für eine Stunde stehen gelassen, wiederum gewaschen, mit 100 μl/Vertiefung der 1 mg/ml-Lösung Dinatrium-p-Nitrophenylphosphat (Wako Pure Chemical Industries), das in einer 1 M Diethanolamin-Pufferlösung (pH-Wert 9,8), welche 0,25 mM Magnesiumchlorid enthielt, gelöst wurde, gemischt und bei Raumtemperatur für 30 Minuten umgesetzt. Die Absorption des Produkts bei 405 nm wurde mit einem ELISA-Lesegerät (Vmax, Molecular Device Corp.) für 96-Vertiefungsplatten untersucht, und das Hybridom, welches den an das rekombinante AST gebundenen monoklonalen Antikörper sezernierte, wurde ausgewält.
  • (4) Klonieren des Hybridoms
  • Das ausgewählte Hybridom wurde zweimal durch ein limitiertes Verdünnungsverfahren kloniert, um das Hybridom zu etablieren. Konkret wurden die peritonealen Mäuse-Exsudatzellen, die in HT-Kulturmedium in einer Dichte von 106 Zellen/ml hergestellt wurden, jeweils in Vertiefungen verteilt, und die in HT-Kulturmedium mit einer Rate von 0,5 Zellen/Vertiefung suspendierten Hybridomzellen wurden in die Vertiefungen gesät und anschließend in der Anwesenheit von 5% CO2 bei 37°C für zwei Wochen kultiviert. Der Kulturüberstand wurde durch das oben beschriebene ELISA-Verfahren gescreent, und eine einzelne Kolonie wurde ausgewählt, um die Zellen zu etablieren.
  • (5) Kultur des Hybridoms und Reinigung des Antikörpers
  • Sechs Klone von zwanzig Anti-AST-Antikörper herstellenden Hybridomklonen, die durch die oben beschriebenen Vorgänge erhalten wurden, wurden an ein eRDF-Kulturmedium (Gibco BRL Corp.), welches ein serumfreies Kulturmedium darstellt, das Insulin, Transferrin, Ethanolamin und Selenit enthält, angepasst und darin kultiviert. Der Kulturüberstand wurde gewonnen. Der Antikörper im Überstand wurde mit einer Protein G-Säule durch ein gängiges Verfahren gereinigt.
  • (6) Subtypisierung des monoklonalen AST-Antikörpers
  • Sechs gereinigte monoklonale Anti-AST-Antikörperklone, die durch die Vorgänge in (5) erhalten wurden, wurden mit IsoStrip (ein Isotypisierungs-Kit für monoklonale Maus-Antikörper, Boehringer Corp.) gemäß einem Protokoll subtypisiert. Folglich wurde gefunden, dass drei Klone und zwei Klone jeweils IgG1 und IgM darstellten.
  • [Beispiel 19] Western-Blot mit Anti-AST-Antikörper
  • Ein rekombinantes AST oder natürliches AST wurde durch eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter einer reduzierenden Bedingung fraktioniert und anschließend einem Western-Blot auf einer Nitrozellulosemembran (BIO-RAD Corp.) unterzogen. Das Produkt wurde mit 3% BSA enthaltendem PBS bei Raumtemperatur über Nacht behandelt und anschließend mit dem Anti-AST-Antikörper, der in Beispiel 17, 18 erhalten wurde und mit dem 3% BSA enthaltendem PBS in einer Dichte von 10 μg/ml verdünnt war, bei Raumtemperatur für eine Stunde umgesetzt. Die Nitrozellulosemembran wurde mit 1% BSA enthaltendem PBS sechsmal gewaschen und anschließend mit Ziege Anti-Mensch-IgG-Antikörper (TAGO Corp.), der an alkalische Phosphatase gebunden war und mit 3% BSA enthaltendem PBS in einer Dichte von 25 μg/ml verdünnt war, bei Raumtemperatur für eine Stunde umgesetzt. Die Nitrozellulosemembran wurde mit 1% BSA enthaltendem PBS sechsmal gewaschen und anschließend mit NBT/BCIP (PIERCE Corp.) bei Raumtemperatur für 10 Minuten umgesetzt, um die Farbe zu entwickeln.
  • Dadurch wurde gezeigt, dass die Anti-AST-Antikörper jeweils an das rekombinante AST gebunden waren. In der Reaktivität des Western-Blots, war die Reaktivität von Anti-N19-PAb unter den polyklonalen Antikörpern hoch, und die Reaktivität von Anti-rAST-PAb war niedrig. Weiterhin wies der Anti-rAST-PAb keine Kreuzreaktivität mit aus Mastzellen stammender/m Tryptase und Trypsin auf. Normales Kaninchen IgG wurde als Negativkontrolle verwendet.
  • [Beispiel 20] Überprüfung der AST hemmenden Aktivität
  • (1) Verfahren zum Untersuchen der AST-Aktivität
  • Die Definitionen des Untersuchungsverfahrens und der Aktivitätseinheit sind wie im oben beschriebenen Beispiel 2 gezeigt wurde.
  • (2) Überprüfung der AST hemmenden Aktivität des Anti-AST-Antikörpers
  • 0,5 ml einer 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH-Wert 8,6), die 2 ng/ml des rekombinanten AST enthielt, und 0,01% BSA wurden mit 50 μl einer Anti-AST-Antikörper enthaltenden Lösung gemischt und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Das Inkubationsprodukt wurde mit 0,5 ml einer 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH-Wert 8,6), die 200 μM eines Trypsin-Synthesesubstrats: Boc-Phe-Ser-Arg-MCA enthielt, gemischt und bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Das Produkt wurde mit 1 ml 30% Essigsäure gemischt. Die Menge des hergestellten AMC wurde durch eine Fluorometrie (Fluoreszenzlicht: 460 nm und Anregungslicht: 380 nm) untersucht, und die Fähigkeit des Anti-AST-Antikörpers zur Hemmung der enzymatischen Aktivität wurde überprüft. Die Ergebnisse sind in 15 gezeigt.
  • Für den monoklonalen Anti-AST-Antikörper, der durch Immunisieren des im Beispiel erhaltenen rekombinanten AST (Insektenzellen-Baculovirussystem) erhalten wurde, wurde eine aktivitätshemmende Wirkung von 27% bei einer Konzentration von 236 μg/ml festgestellt.
  • (3) Überprüfung der AST hemmenden Aktivität einer Verbindung
  • 0,05 ml einer 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH-Wert 8,6), die 2 ng/ml des rekombinanten AST und 0,01% Tween 20 enthielt, wurden mit 2 μl einer DMSO-Lösung gemischt, die Nafamostatmesylat oder Gabexatmesylat als Zielverbindung der Überprüfung in verschiedenen Konzentrationen enthielt und mit 0,05 ml einer 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH-Wert 8,6), die 30 μM eines Trypsin-Synthesesubstrats: Boc-Phe-Ser-Arg-MCA enthielt, und bei 24°C für 6 Minuten inkubiert. Die Mengen des hergestellten AMC wurden durch eine Fluorometrie (Fluoreszenzlicht: 460 nm, Anregungslicht: 380 nm) mit dem Zeitverlauf untersucht, und die Fähigkeit der Verbindung zur Hemmung der enzymatischen Aktivität wurde überprüft. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle als IC 50 (molare Konzentration, welche die hemmende Aktivität von 50% aufweist) gezeigt.
    Verbindungsname IC 50/(μM)
    Nafamostatmesylat 0,23
    Gabexatmesylat 0,14
  • [Beispiel 21] Konstruktion eines AST-Assaysystems
  • (1) Konstruktion eines Sandwich-ELISA-Systems mit polyklonalem Antikörper
  • Die folgenden Vorgänge unter Verwendung des in Beispiel 17 erhaltenen polyklonalen Anti-AST-Antikörpers (anti-rASTPAb) wurden durchgeführt, um das Sandwich-ELISA-System zu konstruieren.
  • 1) Herstellung von Meerrettichperoxidase (HRP für engl.: horse radish peroxidase) markiertem Antikörper
  • ➀ Herstellung von Antikörper-(F(ab')2)
  • 1 ml der 2,0 mg/ml PBS-Lösung eines Antikörpers (IgG) wurde mit 100 μl einer 1 M Acetat-Pufferlösung (pH-Wert 4,2) und 20 μl derselben Pufferlösung, die 40 μg Pepsin enthielt, gemischt und bei 37°C für vier Stunden umgesetzt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, wurde die Reaktionslösung einer Trennbehandlung unter Verwendung einer PBS äquilibrierten Sephadex G25-Säule (0 2 cm × 45 cm) unterzogen, um das Antikörper-(F(ab')2) zu sammeln.
  • ➁ HRP-Markierung des Antikörper-(F(ab')2)
  • 2 ml einer Lösung (pH-Wert 7,4) aus 1 mg/ml des Antikörper-(F(ab')2), 0,01 M Phosphat und 0,15 M NaCl wurden mit 50 μl der Dimethylformamid-Lösung (10 mg/ml) aus N-(m-Maleimidbenzoesäure)-N-succinimidester (MBS) gemischt und bei 25°C für 30 Minuten umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde anschließend einer Gelfiltrations-Behandlung unter Verwendung einer mit Sephadex G-25 gefüllten Säule in einer 0,1 M Phosphat-Pufferlösung (pH-Wert 6,0) ausgesetzt, um den maleimidisierten Antikörper von dem nicht umgesetzten MBS zu trennen.
  • Andererseits wurden 2 ml einer 0,1 M Phosphat-Pufferlösung (pH-Wert 6,5), die 10 mg/ml HRP enthielt, mit 120 μl einer Dimethylformamid-Lösung, die 60 mg/ml S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid enthielt, gemischt und bei 25°C für zwei Stunden umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde mit 800 μl einer 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH-Wert 7,0), 160 μl 0,1 M EDTA und 1,6 ml 1 M Hydroxylamin gemischt und bei 0°C für 4 Minuten umgesetzt. Nachfolgend wurde die Reaktionslösung in einen Kollodiumbeutel gefüllt und anschließend mit einer 0,1 M Phosphat-Pufferlösung (pH-Wert 6,0) und einer 5 mM EDTA enthaltenden Lösung bei 4°C für drei Tage dialysiert, um die thiolysierte HRP zu erhalten.
  • Nachfolgend wurden 2 mg des maleimidisierten Antikörpers mit 4 mg der thiolysierten HRP gemischt, und das Gemisch wurde mit einem Kollodiumbeutel unter Kühlen mit Eis konzentriert, bis es eine Proteinkonzentration von 4 bis 10 mg/ml ergab und anschließend bei 15 bis 20°C über Nacht stehen gelassen. Die Lösung wurde einer Gelfiltration unter Verwendung einer Säule, die mit Ultragel AcA44 (hergestellt von Pharmacia LKB Corp.) gefüllt war, ausgesetzt, um den HRP markierten Anti-AST-(F(ab')2)-Antikörper zu erhalten.
  • 2) Herstellung einer Antikörper immobilisierten Platte
  • Eine 96-Vertiefungsplatte (hergestellt von Sumitomo Bakelite Co., MS-3796F/Carboplate) wurde gut gewaschen, in der 20 μg/ml PBS-Lösung eines Antikörpers bei 4°C für einen ganzen Tag und eine Nacht stehen gelassen, mit PBS gewaschen und anschließend in der 1% PBS-Lösung aus bovinem Serumalbumin (BSA) bei 4°C für einen ganzen Tag und eine Nacht stehen gelassen, um die Beschichtungs-Nachbehandlung durchzuführen, wodurch die Antikörper immobilisierte Platte erhalten wurde.
  • 3) Konstruktion des Assaysystems
  • 100 μl einer 1% BSA-0,1% Magermilch enthaltenden 10 mM PBS (pH-Wert 7,2)-Lösung (verdünnte Probenlösung), die ein gereinigtes rekombinantes AST (Standardsubstanz) in einer Konzentration von 0 bis 1.600 ng/ml enthielt, wurden zu der in 2) hergestellten mit Anti-AST-Antikörper IgG immobilisierten Platte hinzugefügt und anschließend bei 25°C für vier Stunden inkubiert. Nachfolgend wurde die Platte mit 0,05% Tween 20 enthaltendem 10 mM PBS (pH-Wert 7,2) gewaschen. 100 μl der 1% BSA enthaltenden 10 mM (pH-Wert 7,2) 100-fach verdünnten Lösung des in 1) hergestellten HRP markierten Anti-AST-(F(ab')2)-Antikörpers (500 μg/ml) wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt und bei 25°C für zwei Stunden inkubiert. Die Lösungen in jeder Vertiefung wurden durch Absaugen der Vertiefungen entfernt und anschließend mit 0,05% Tween 20 enthaltendem 10 mM PBS (pH-Wert 7,2) gewaschen. 100 μl einer 0,1 M Phosphat-/Zitrat-Pufferlösung (pH-Wert 4,3), die 0,02% 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidinhydrochlorid und 2,5 mM Wasserstoffperoxid enthielt, wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt und bei 25°C für 30 Minuten umgesetzt. 100 μl einer 0,5 M wässrigen Schwefelsäurelösung wurden zu jeder Vertiefung als Reaktionsstopper hinzugefügt, um die Enzymreaktion abzustoppen. Die Absorptionsintensität der Lösung wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm mit einem Spektralfotometer untersucht, und die untersuchten Absorptionsintensitäten wurden als Antwort auf die Konzentrationen der Standardsubstanz von 0 bis 1.600 ng/ml aufgetragen. Die Ergebnisse sind in 16 gezeigt.
  • 4) Nachweis von AST in intravitalen Bestandteilen
  • ➀ Nachweis von AST im Speichel
  • AST in menschlichem Speichel wurde mit dem Assaysystem aus 3) untersucht. Der von einem Menschen gesammelte Speichel wurde bei 15.000 rpm für 15 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wurde als Assayprobe verwendet. Sechs Proben wurden in einem unverdünnten, flüssigen Zustand oder in einem Zustand untersucht, der mit einer 1% BSA-0,1% Magermilch enthaltenden 10 mM PBS (pH-Wert 7,2)-Lösung (Proben-Verdünnungslösung) sechszehnmal verdünnt war. Da die untersuchten Werte der drei Proben niedrig waren, wurden die Werte der unverdünnten Lösungen übernommen, und für die anderen drei Proben wurden die Werte der 16-fach verdünnten Lösungen als die AST-Konzentrationen der Speichelproben übernommen. Die Assayergebnisse sind zusammen mit den AST-Aktivitäten (Trypsinsubstrat abbauende Aktivitäten) in den Proben in der folgenden Tabelle gezeigt.
    AST (ng/ml)
    Speichelproben ELISA AST-Aktivitätsumsetzung*
    KM 123 1616 3333
    KY 123 24 120
    KT 123 22 518
    HO 123 720 1772
    KY 112 25 208
    HO 112 784 2349
    • * Trypsin-ähnliche Enzymaktivität der rekombinanten HAT-Umsetzung
  • ➁ Nachweis von AST in Sputum
  • Sputum wurde von einem Patienten mit chronischer Atemwegsentzündung gesammelt, mit einem neunfachen Volumen physiologischer Salzlösung verdünnt, homogenisiert und anschließend bei 10.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde als Assayprobe verwendet. Die Probe wurde zwanzigmal verdünnt und untersucht. Die Ergebnisse sind in 17 gezeigt. Es wurde gefunden, dass die Assaywerte von eitrigen Sputa niedriger lagen als jene von schleimigen Sputa.
  • Hier wurden die schleimigen Schleim, eitrigen Sputa aus den folgenden Patienten gesammelt.
    • CB: chronische Bronchitis
    • SecCB: sekundäre Bronchitis
    • BA: Bronchialasthma
    • BE: Bronchiektase
    • DPB: diffuse Panbronchiolitis
  • Weiterhin wurden die eitrigen Sputa von den folgenden Patienten gesammelt.
    • BE: Bronchiektase
    • DPB: diffuse Panbronchiolitis
  • (2) Konstruktion eines Sandwich-ELISA-Systems mit monoklonalem Antikörper und polyklonalem Antikörper
  • 1) Überprüfung der antigenen Reaktivität der flüssigen Phase von jedem monoklonalen Anti-AST-Antikörper
  • Die Überprüfung einer Bindungseigenschaft an das rekombinante AST in einer flüssigen Phase wurde in Bezug auf drei Formen monoklonaler Anti-AST-Antikörper durchgeführt, welche durch eine Subtypisierung dem IgG1-Typ angehörten.
  • 50 μl/Vertiefung einer PBS-Lösung (1 und 5 μg/ml) von jedem monoklonalen Anti-AST-Antikörper wurden zu einer 96-Vertiefungsplatte hinzugefügt und bei 4°C über Nacht stehen gelassen, um den Antikörper zu immobilisieren. 100 μl einer 1% BSA-0,1% Magermilch enthaltenden 10 mM PBS (pH-Wert 7,2)-Lösung (Proben-Verdünnungslösung), die das gereinigte rekombinante AST (Standardsubstanz) in einem Bereich von 0 bis 300 ng/ml enthielt, wurden zu der hergestellten mit monoklonalem Anti-AST-Antikörper immobilisierten Platte hinzugefügt und anschließend bei 25°C für vier Stunden inkubiert. Nachfolgend wurde die Platte mit 0,05% Tween 20 enthaltendem 10 mM PBS (pH-Wert 7,2) gewaschen, 100 μl einer Lösung, die durch Verdünnen des in (1) 1) hergestellten HRP markierten Antikörpers (500 μg/ml) mit 1% BSA enthaltendem 10 mM PBS (pH-Wert 7,2) 100-fach erzeugt wurde, wurde zu jeder Vertiefung hinzugefügt und anschließend bei 25°C für zwei Stunden inkubiert. Anschließend wurde die Lösung aus jeder Vertiefung abgesaugt, und die Vertiefung wurde mit 0,05% Tween 20 enthaltendem 10 mM PBS (pH-Wert 7,2) gewaschen. 100 μl einer 0,1 M Phosphat-/Zitrat-Pufferlösung (pH-Wert 4,3), die 0,02% 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidinhydrochlorid und 2,5 mM Wasserstoffperoxid enthielt, wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Reaktion wurde bei 25°C für 30 Minuten durchgeführt, und 100 μl einer 0,5 M wässrigen Schwefelsäurelösung wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt, um die enzymatische Reaktion abzustoppen. Nachfolgend wurde die Absorptionsintensität der Lösung bei einer Wellenlänge von 450 nm mit einem Spektralfotometer untersucht. Die untersuchten Absorptionsintensitäten wurden als Antwort auf die Standardsubstanzkonzentrationen von 0 bis 300 ng/ml aufgetragen. Die Ergebnisse sind in 18 gezeigt.
  • 2) Konstruktion eines Assaysystems
  • ➀ Herstellung von biotinyliertem Antikörper
  • Die Biotinylierung von IgG wurde mit dem monoklonalen #B3 Anti-AST-Antikörper mit der höchsten antigenen Reaktivität in der flüssigen Phase in den Überprüfungsergebnissen aus 1) und mit dem in Beispiel 17 erhaltenen polyklonalen Anti-AST-Antikörper (Anti-rAST PAb) durchgeführt.
  • 1 ml einer 1 bis 3 mg/ml IgG/PBS(–)-Lösung wurde mit dem äquivalenten Volumen 0,2 M NaHCO3 (pH-Wert 8,0) gemischt, weiterhin mit 10 mM eines Biotinylierungs-Reagens mit einer 100-fachen molaren Konzentration gemischt und anschließend bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Als Biotinylierungs-Reagens wurde NHS-LC-Biotin (hergestellt von PIERCE Corp., #21335), welches in Dimethylformamid mit einer Konzentration von 10 mM gelöst war, verwendet. Die Reaktionslösung wurde mit einer zehntel Menge von 1 M Monoethanolamin gemischt und weiterhin bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Die Reaktionslösung wurde mit PBS(–) auf 2,5 ml verdünnt und anschließend auf eine G-25 Gelfiltrationssäule gebracht, um das PBS(–) abfließen zu lassen, wodurch das biotinylierte IgG gewonnen wurde. Das gewonnene biotinylierte IgG wurde mit BSA in einer Endkonzentration von 3% gemischt, weiterhin mit NaN3 mit einer Endkonzentration von 0,1% gemischt und anschließend gelagert.
  • ➁ Herstellung einer immobilisierten Antikörper-Platte
  • Eine 96-Vertiefungsplatte (hergestellt von Sumitomo Bakelite Co., MS-3796F/Carboplate) wurde gut gewaschen, 100 μl der 20 μg/ml PBS-Lösung eines Antikörpers (#B3 und Anti-rAST PAb) wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt und bei 4°C für einen ganzen Tag und eine Nacht stehen gelassen. Die behandelte Platte wurde mit PBS-0,05% Tween 20 gewaschen, dem Hinzufügen von 380 μl einer 1% bovines Serumalbumin-PBS-Lösung zu jeder Vertiefung ausgesetzt und anschließend bei 4°C für einen ganzen Tag und eine Nacht stehen gelassen, um die Vertiefungen nachzubehandeln, wodurch die Antikörper immobilisierte Platte erhalten wurde.
  • ➂ Konstruktion des Assaysystems
  • 50 μl einer 1% BSA-0,1% Magermilch enthaltenden 10 mM PBS (pH-Wert 7,2)-Lösung (Proben-Verdünnungslösung), die das gereinigte rekombinante AST (Standardsubstanz) in einem Bereich von 0 bis 400 nm/ml enthielt und 50 μl einer 1% BSA-0,1% Magermilch enthaltenden 10 mM PBS (pH-Wert 7,2)-Lösung, die das in ➀ hergestellte biotinylierte IgG enthielt, wurden zu der in ➁ hergestellten mit Anti-AST-IgG immobilsierten Platte hinzugefügt und anschließend bei 4°C über Nacht stehen gelassen. Die Platte wurde gewaschen, dem Hinzufügen von 100 μl/Vertiefung einer 1% BSA-0,1% Magermilch enthaltenden 10 mM PBS (pH-Wert 7,2)-Lösung, die durch 10.000-faches Verdünnen Streptavidin markierter Peroxidase (hergestellt von TAGO Corp. #SNN1004) erhalten wurde, zu jeder Vertiefung ausgesetzt, bei 25°C für eine Stunde inkubiert, dem Entfernen der Lösung in jeder Vertiefung durch Absaugen ausgesetzt, mit 0,05% Tween 20 enthaltendem 10 mM PBS (pH-Wert 7,2) gewaschen und weiterhin dem Hinzufügen von 100 μl einer 0,1 M Phosphat-/Zitrat-Pufferlösung (pH-Wert 4,3), die 0,02% 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidinhydrochlorid und 2,5 mM Wasserstoffperoxid enthielt, zu jeder Vertiefung ausgesetzt. Die Reaktion wurde bei 25°C für 15 Minuten durchgeführt, und 100 μl einer 0,5 M wässrigen Schwefelsäurelösung wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt, um die enzymatische Reaktion abzustoppen. Nachfolgend wurde die Absorptionsintensität der Lösung bei einer Wellenlänge von 450 nm mit einem Spektralfotometer untersucht. Die untersuchten Absorptionsintensitäten wurden als Antwort auf die Standardsubstanz-Konzentrationen von 0 bis 200 ng/ml aufgetragen. Die Ergebnisse sind in 19 gezeigt.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Das AST mit der Struktur, in welcher die gesamte Propeptideinheit oder ein Teil davon mit der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit über die Disulfidbindung verbunden ist, ist oben offenbart. Das AST mit der Struktur kann verwendet werden, um ein Hemmstoff-Screeningsystem unter Verwendung der PAR-Aktivierung, der Schleimbildungsförderung, der Aktivierung des EGFR-Signaltransduktionssystems oder der intrazellulären Calciumeinstrom-Förderungs-Aktivität als Indikator zu konstruieren, und so einen Hemmstoff zu screenen, wobei ein AST-Hemmstoff und ein hemmendes Polypeptid (einschließlich hemmenden Antikörpern) erhalten wird. Es kann erwartet werden, dass der so erhaltene AST-Hemmstoff, der Hemmstoff der AST-PAR-Aktivierung, der Hemmstoff der AST-Schleimbildungförderung, der Hemmstoff der EGFR-Signaltransduktionssystem-Aktivierungs oder der Hemmstoff der intrazellulären Calciumeinstrom-Förderung als ein therapeutisches Arzneimittel verwendet wird, um eine physiologische Wirkung, wie im weiten Sinne Atemwegs-Entzündungswirkungen, eine Schleimsekretion-Förderungswirkung, eine Atemwegs-Umbildungswirkung, eine mukoziliäre Eigenabwehrsystem-Wirkung, eine Koagulations-Fibrinogenolyse-System-Wirkung, eine Zellproliferationswirkung, eine Krebsproliferations- oder Metastase-Wirkung oder eine Anti-Virusinfektions-Wirkung, zu kontrollieren oder zu modifizieren, um eine Erkrankungskrise zu verhindern oder den Zustand der Erkrankung zu verbessern und zu behandeln.
  • Zusätzlich kann auf der Grundlage der Sequenz des Tier-AST, wie des Mäuse-AST, festgestellt werden, in welchem Krankheitszustand des Modelltiers und zu welcher Zeit das AST am Zustand einer Erkrankung beteiligt ist, durch Untersuchen oder Kontrollieren der Proteinexpression oder Genexpression des Tier-AST. Weiterhin können die therapeutischen Wirkungen des AST-Hemmstoffs und des hemmenden Proteins, welche durch die erfindungsgemäße Verwendung ausgewählt werden, festgestellt werden, und die klinischen Dosen des AST-Hemmstoffs oder des hemmenden Polypeptids können auch abgeschätzt werden.
  • Weiterhin können die Expressionsstellen von Geweben durch Immunhistochemie unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers oder eines polyklonalen Antikörpers nachgewiesen werden.
  • Weiterhin ermöglicht das Enzym-Immunassaysystem, diagnostische Reagens oder diagnostische Kit, welches einen solchen monoklonalen Antikörpers oder po lyklonalen Antikörper verwendet, die Untersuchung der Konzentration des AST in Speichel, Sputum, Serum oder desgleichen und ist daher zum Verstehen und Diagnostizieren des Zustands einer Erkrankung mit AST-Beteiligung geeignet.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (11)

  1. Verfahren zum Screenen für ein(e) zur Hemmung von AST befähigte(s) Verbindung oder Polypeptid, durch Mischen: (i) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzyms mit einer Struktur, in welcher eine Propeptideinheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-170 bis Arg an der 186. Position der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, mit einer Trypsin-ähnlichen Proteineinheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von Ile an der 187. Position bis ILe an der 418. Position der in SEQ ID NR.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsinähnlichen Proteineinheit der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz gebildet ist, oder (ii) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Säugerenzyms, welches ein Teil eines Gegenstück-Säugerproteins ist, welches 66% oder mehr Homologie mit dem in SEQ ID NR.: 1 dargestellten atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzym aufweist, und eine Struktur aufweist, in welcher eine der Propeptideinheit entsprechende Einheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-170 bis Arg an der 186. Position mit einer der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit entsprechenden Einheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von Ile an der 187. Position bis Ile an der 418. Position, über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit gebildet ist, oder (iii) einer das Enzym exprimierenden Zelle, oder (iv) eines das Enzym exprimierenden Gewebes, der Verbindung oder des Polypeptids, welche(s) untersucht werden soll, und weiter einer PAR-exprimierenden Zelle, und dann das Verwenden der PAR-Aktivierung als Indikator.
  2. Nachweisverfahren nach Anspruch 1, wobei der Protease-aktivierte Rezeptor PAR2 ist.
  3. Verfahren zum Screenen für ein(e) zur Hemmung von AST befähigte(s) Verbindung oder Polypeptid, durch Mischen: (i) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzyms mit einer Struktur, in welcher eine Propeptideinheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-170 bis Arg an der 186. Position der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, mit einer Trypsin-ähnlichen Proteineinheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von ILe an der 187. Position bis Ile an der 418. Position der in SEQ ID NR.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsinähnlichen Proteineinheit der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz gebildet ist, oder (ii) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Säugerenzyms, welches ein Teil eines Gegenstück-Säugerproteins ist, welches 66% oder mehr Homologie mit dem in SEQ ID NR.: 1 dargestellten atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzym aufweist, und eine Struktur aufweist, in welcher eine der Propeptideinheit entsprechende Einheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-170 bis Arg an der 186. Position mit einer der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit entsprechenden Einheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von ILe an der 187. Position bis Ile an der 418. Position, über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit gebildet ist, oder (iii) einer das Enzym exprimierenden Zelle, oder (iv) eines das Enzym exprimierenden Gewebes, der Verbindung oder des Polypeptids, welche(s) untersucht werden soll, und weiter einer Zelle mit einer intrazellulären Calciumeinströmbefähigung, und dann das Verwenden des intrazellulären Calciumeinstroms als Indikator.
  4. Verfahren zum Screenen für ein(e) zur Hemmung von AST befähigtes) Verbindung oder Polypeptid, durch Mischen: (i) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzyms mit einer Struktur, in welcher eine Propeptideinheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-170 bis Arg an der 186. Position der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, mit einer Trypsin-ähnlichen Proteineinheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von Ile an der 187. Position bis Ile an der 418. Position der in SEQ ID NR.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsinähnlichen Proteineinheit der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz gebildet ist, oder (ii) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Säugerenzyms, welches ein Teil eines Gegenstück-Säugerproteins ist, welches 66% oder mehr Homologie mit dem in SEQ ID NR.: 1 dargestellten atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzym aufweist, und eine Struktur aufweist, in welcher eine der Propeptideinheit entsprechende Einheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-170 bis Arg an der 186. Position mit einer der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit entsprechenden Einheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von Ile an der 187. Position bis Ile an der 418. Position, über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit gebildet ist, oder (iii) einer das Enzym exprimierenden Zelle, oder (iv) eines das Enzym exprimierenden Gewebes, der Verbindung oder des Polypeptids, welche(s) untersucht werden soll, und weiter einer Zelle mit einer Schleimbildungsfähigkeit, und dann das Verwenden des Sekretionsprodukts als Indikator.
  5. Nachweisverfahren nach Anspruch 4, wobei ein Verfahren zum Untersuchen der Schleimbildungsfähigkeit ein AB-PAS Anfärbeverfahren ist.
  6. Nachweisverfahren nach Anspruch 4, wobei der Indikator der Schleimbildungsfähigkeit die Menge von exprimiertem Muc5AC ist.
  7. Nachweisverfahren nach Anspruch 4, wobei der Indikator der Schleimbildungsfähigkeit die Menge von freigesetztem oder hergestellten EGF, HB-EGF, TGF-α, Amphiregulin oder Betacellulin ist.
  8. Nachweisverfahren nach Anspruch 4, wobei der Indikator der Schleimbildungsfähigkeit die Aktivierung eines EGF-R Signaltransduktionswegs ist.
  9. Verfahren zum Screenen für ein(e) zur Hemmung von EGF, HB-EGF, TGF-α, Amphiregulin oder Betacellulin befähigtes) Verbindung oder Polypeptid, durch Mischen: (i) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzyms mit einer Struktur, in welcher eine Propeptideinheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-170 bis Arg an der 186. Position der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, mit einer Trypsin-ähnlichen Proteineinheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von Ile an der 187. Position bis Ile an der 418. Position der in SEQ ID NR.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsin ähnlichen Proteineinheit der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz gebildet ist, oder (ii) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Säugerenzyms, welches ein Teil eines Gegenstück-Säugerproteins ist, welches 66% oder mehr Homologie mit dem in SEQ ID NR.: 1 dargestellten atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzym aufweist, und eine Struktur aufweist, in welcher eine der Propeptideinheit entsprechende Einheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-170 bis Arg an der 186. Position mit einer der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit entsprechenden Einheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von Ile an der 187. Position bis Ile an der 418. Position über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit gebildet ist, oder (iii) einer das Enzym exprimierenden Zelle, oder (iv) eines das Enzym exprimierenden Gewebes, der Verbindung oder des Polypeptids, welche(s) untersucht werden soll, und weiter einer Zelle mit EGF, HB-EGF, TGF-α, Amphiregulin oder Betacellulin, und dann das Verwenden der Freisetzungsmenge von EGF, HB-EGF, TGF-α, Amphiregulin oder Betacellulin als Indikator.
  10. Verfahren zum Screenen für ein(e) zur Hemmung von AST befähigtes) Verbindung oder Polypeptid, durch Mischen: (i) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzyms mit einer Struktur, in welcher eine Propeptideinheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-170 bis Arg an der 186. Position der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, mit einer Trypsin-ähnlichen Proteineinheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von Ile an der 187. Position bis Ile an der 418. Position der in SEQ ID NR.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsin ähnlichen Proteineinheit der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz gebildet ist, oder (ii) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Säugerenzyms, welches ein Teil eines Gegenstück-Säugerproteins ist, welches 66% oder mehr Homologie mit dem in SEQ ID NR.: 1 dargestellten atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzym aufweist, und eine Struktur aufweist, in welcher eine der Propeptideinheit entsprechende Einheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-170 bis Arg an der 186. Position mit einer der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit entsprechenden Einheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von Ile an der 187. Position bis Ile an der 418. Position über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit gebildet ist, oder (iii) einer das Enzym exprimierenden Zelle, oder (iv) eines das Enzym exprimierenden Gewebes, der Verbindung oder des Polypeptids, welche(s) untersucht werden soll, und weiter einer Zelle mit einem EGFR-Signaltransduktionsweg, und dann das Verwenden der Aktivierung des EGFR-Signaltransduktionsweges als Indikator.
  11. Verfahren zum Screenen für ein(e) zur Hemmung von AST befähigte(s) Verbindung oder Polypeptid, durch Mischen: (i) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzyms mit einer Struktur, in welcher eine Propeptideinheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-170 bis Arg an der 186. Position der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, mit einer Trypsin-ähnlichen Proteineinheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von Ile an der 187. Position bis Ile an der 418. Position der in SEQ ID NR.: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsinähnlichen Proteineinheit der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Aminosäure sequenz gebildet ist, oder (ii) eines atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Säugerenzyms, welches ein Teil eines Gegenstück-Säugerproteins ist, welches 66% oder mehr Homologie mit dem in SEQ ID NR.: 1 dargestellten atemwegsspezifischen Trypsin-ähnlichen Enzym aufweist, und eine Struktur aufweist, in welcher eine der Propeptideinheit entsprechende Einheit, bestehend aus der Aminosäuresequenz von einer der Positionen 145-170 bis Arg an der 186. Position mit einer der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit entsprechenden Einheit, bestehend aus einer Sequenz von 232 Aminosäuren von Ile an der 187. Position bis Ile an der 418. Position über eine Disulfidbindung verbunden ist, wobei die Disulfidbindung zwischen dem Cysteinrest an Position 173 der Propeptideinheit und dem Cysteinrest an Position 292 der Trypsin-ähnlichen Proteineinheit gebildet ist, oder (iii) einer das Enzym exprimierenden Zelle, oder (iv) eines das Enzym exprimierenden Gewebes, der Verbindung oder des Polypeptids, welche(s) untersucht werden soll, und weiter einer Zelle und das Verwenden der Freisetzungsmenge oder Expressionsmenge von IL-8 oder der Transkriptionsaktivität des IL-8-Promotors als Indikator.
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