EA004316B1

EA004316B1 - Способ лечения гиперсекреции слизи

Info

Publication number: EA004316B1
Application number: EA200100136A
Authority: EA
Inventors: Джей А. Нейдел; Кийоси Такеяма
Original assignee: Дзе Реджентс Ов Дзе Юниверсити Ов Калифорния
Priority date: 1998-08-18
Filing date: 1999-08-17
Publication date: 2004-02-26
Also published as: RS50273B; CY1110370T1; CN1354657A; US20030148990A1; PT1119349E; SK2162001A3; AU760766B2; AU5676699A; US7358222B2; TWI250019B; NZ509271A; TR200100560T2; SK287805B6; UA73722C2; DE69939022D1; KR100609646B1; CA2337422A1; BR9912672A; NO327000B1; AR020220A1

Abstract

Гиперсекреция слизи в легких угнетается введением антагониста эпидермального фактора роста (EGF-R). Упомянутый антагонист EGF-R может быть в виде небольшой органической молекулы, антитела либо фрагмента антитела, который связывается с EGF-R и блокирует упомянутый рецептор. Антагонист EGF-R в предпочтительном варианте вводится посредством впрыскивания количества, достаточного для подавления образования бокаловидных клеток в дыхательных путях легких. Тем самым угнетается дегрануляция бокаловидных клеток, следствием которой является продуцирование слизи дыхательных путей. Предоставлены анализы для отбора подходящих средств, ингибирующих пролиферацию бокаловидных клеток.

Description

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение имеет, в общем, отношение к области лечения легких. В частности, настоящее изобретение относится к ингибированию гиперсекреции слизи в легких и дыхательных путях посредством введения антагониста рецепторов эпидермального фактора роста (ЕСР-К.). В дополнение к этому, настоящее изобретение относится также к методам разработки либо оценки подходящих средств, способных ингибировать гиперсекрецию слизи в легких.

Предпосылки создания изобретения

Реснитчатый эпителий в воздухоносных путях дыхательной системы выполняет роль основного механизма защиты, удаляющего пылевые частицы, проникшие вместе с вдыхаемым воздухом, либо возбудителей заразных болезней из дыхательных путей легких. Наряду с этим вещества, присутствующие в жидкостях дыхательных путей, ограничивают токсичность пылевых частиц и инактивируют возбудителей заразных болезней. Физический механизм кашля помогает удалять слизь из каналов дыхательных путей (см., например, РоиибаИоик о! КекрР га!огу Саге, под редакцией Пирсон (Р1ег8ои) и Какмарек (Кастагек), (1992), компания СйигсЫ11 ЬМидйоие 1ис., Нью-Йорк, штат НьюЙорк; Наткои'к Рг1ис1р1е8 о! 1и1егиа1 МеФсше, под редакцией Фоси (Раис1) и других, (1997), 14е издание, компания МсСгате НШ, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк).

В состав реснитчатого эпителия входят реснитчатые эпителиальные клетки, эпителиальные бокаловидные клетки, а также серозные и мукоидные клетки, находящиеся в железах, расположенных под слизистой оболочкой. Реснички окружены водным слоем (перицилиарная жидкость), выделяемым в просвет каналов дыхательных путей вследствие активного переноса хлоридов и пассивного перемещения воды через эпителий. Реснички соприкасаются со слизью, плавающей на поверхности упомянутого водного слоя, и посредством однонаправленного движения обеспечивают перемещение упомянутой слизи в направлении голосовой щели (Пирсон (Р1ег8ои) и Какмарек (Кастагек), см. выше, и Фоси (Раис1) и другие, смотри выше). Слизь продуцируется эпителиальными бокаловидными клетками и клетками желез, расположенных под слизистой оболочкой, и выделяется в просвет дыхательных путей после дегрануляции.

Несмотря на то, что слизь, как правило, облегчает выведение пылевых частиц, попавших вместе с вдыхаемым воздухом, либо возбудителей заразных болезней из дыхательных путей, гиперсекреция слизи в дыхательных путях может вызывать прогрессирующую обструкцию дыхательных путей. В периферических дыхательных путях кашель не эффективен для удаления выделений. Кроме того, мелкие дыхательные пути, в которых находится большое количество бокаловидных клеток, в силу их небольших размеров оказываются особо уязвимыми при закупорке дыхательных путей слизью. Гиперсекрецией дыхательных путей страдает большое количество людей; упомянутое явление наблюдается при различных заболеваниях легких, таких как хронический бронхит, бронхиальная астма, муковисцидоз и бронхоэктаз.

Гиперсекреция слизи представляет собой основной симптом у пациентов с хроническим обструктивным заболеванием легких (СОРЭ) и определяет это состояние (т.е. хронический кашель и образование мокроты). Одним этим заболеванием, вызывающим прогрессирующую потерю трудоспособности и смерть, поражено 14 миллионов американцев. По приблизительным оценкам астмой болеет как минимум 4% населения США, что является причиной как минимум 2000 смертных случаев ежегодно (Пирсон (Р1ег8ои) и Какмарек (Кастагек), смотри выше). При остром астматическом приступе стенки бронхов набухают, объем слизи увеличивается, гладкие мышцы бронхов сокращаются, вследствие чего происходит сужение дыхательных путей. Как следствие гиперсекреции при остром приступе астмы, обширная слизистая пробка может быть основной причиной заболеваемости и смертности.

Гиперсекреция причастна также к муковисцидозу, который представляет собой одно из наиболее распространенных смертельных генетических заболеваний в мире. Муковисцидоз представляет собой аутосомное рецессивное заболевание, вследствие которого клетки слизистой дыхательных путей становятся нечувствительными к цАМФ-зависимой протеинкиназной активации мембранных каналов ионов хлоридов (Пирсон (Р1ег8ои) и Какмарек (Кастагек), смотри выше, и Фоси (Раис1) и другие, см. выше). Последующее нарушение водно-солевого баланса снижает уровень гидратации слизи дыхательных путей, следствием чего является образование крайне вязкой слизи в легких людей, больных муковисцидозом. Гиперсекреция вызывает обструкцию дыхательных путей больных муковисцидозом, что еще более ухудшает функционирование легких.

К числу других заболеваний, включающих гиперсекрецию, относится хроническое обструктивное заболевание легких (СОРЭ). Окислительная (оксидантная) нагрузка играет значительную роль в патогенезе СОРЭ. Сигаретный дым, вызывающий образование свободных радикалов кислорода, преимущественно подразумевается в патогенезе. На месте воспаления при хроническом обструктивном заболевании легких часто наблюдаются нейтрофилы, и, что представляет интерес, известно, что нейтрофилы в процессе активации выделяют свободные радикалы кислорода.

Механическая интубация часто оказывается необходимой для обеспечения вспомогательной вентиляции легких у пациентов с различными заболеваниями легких. Интубационная трубка вводится через ротовую часть глотки и помещается в трахее. Для предотвращения утечки воздуха по периметру интубационной трубки, вокруг нее, в нижней части трахеи, надувают баллон, который может сдирать эпителий и вызывать метаплазию бокаловидных клеток. При ранениях эпителия происходят процессы репарации, которые приводят к обильным слизистым выделениям. Длительная интубация трахеи может вызвать вредные явления, обусловленные гиперсекрецией.

Как следствие высоких уровней слизи в легких пациентов с гиперсекреторными легочными заболеваниями снижается очистка (клиренс) слизистой оболочки. Патологические факторы, такие как бактерии, например, Ркеиботопак аегидшока, часто образуют колонии в слизи, следствием чего являются частые инфекционные болезни легких.

Классические способы лечения людей, пораженных гиперсекрецией дыхательных путей, включают антибиотикотерапию, применение бронхолитических средств (например, метилксантинов, симпатомиметических средств с сильными β2 адренергическими стимулирующими свойствами, антихолинергических средств), применение системных либо ингаляционных кортикостероидов, главным образом при астме, разжижение слизи посредством перорального введения отхаркивающих средств, например, гвайфенезина, и аэрозольная доставка муколитических средств, например, воды, гипертонического физиологического раствора (Наггйоп'к, смотри выше). Более новым способом лечения муковисцидоза является введение дезоксирибонуклеазы для целенаправленного воздействия на слизь или мокроту с высоким содержанием ДНК (Шек (8йак) и другие, (1990), Ргос. N11. Асаб. (США) 87:9188-9192; Хаббард Р.К. (НиЬЬагб КС.) и другие, (1991), N. Епд1. 1. Меб., 326:812). В дополнение к этому, способы физиотерапевтического воздействия на грудную клетку, заключающиеся в поколачивании, вибрации и дренаже, также используются для облегчения очистки от вязкой слизи. Конечным вариантом решения для пациентов с тяжелыми нарушениями функции легких может оказаться их трансплантация. Таким образом, необходимы более эффективные либо альтернативные терапевтические методы для целенаправленного воздействия на слизистые выделения. Конкретно, необходим специфический способ лечения, снижающий образование слизистых выделений в дыхательных путях.

Источники, относящиеся к данному вопросу

Применение ингибиторов эпидермального фактора роста (ЕСР) для блокирования роста раковых клеток рассматривают Левицкий (ЬеуЙ8к1), Еиг. 1. Вюсйет.. 226 (1): 1-13; Повис (Ро’Мк) (1994), Рйагтас. Тйег., 62:57-95; Кондапака (Копбарака) и Редди (Веабу) (1996), Мо1. Се11. Епбоспп., 117:53-58.

Краткое изложение сущности изобретения

Гиперсекреция слизи в дыхательных путях является неблагоприятным симптомом целого ряда различных заболеваний легких. Секреция является следствием дегрануляции бокаловидных клеток, пролиферация которых активизируется стимулированием рецепторов эпидермального фактора роста (ЕСР-В). В соответствии с настоящим изобретением, лечение легочной гиперсекреции осуществляется посредством введения терапевтических количеств антагонистов эпидермального фактора роста (ЕСР), в предпочтительном варианте ингибиторов киназы. Упомянутые антагонисты могут быть в форме небольших молекул, антител либо частей антител, которые связываются с ЕСР либо его рецептором. В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, предоставляются ш уйго и 1п у1уо способы прогнозирования терапевтического потенциала подходящих средств для подавления гиперсекреции слизи.

Основной целью настоящего изобретения является предоставление способа лечения заболеваний, вовлекающих в патологический процесс гиперсекрецию слизи в легких.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление лекарственных форм, пригодных для лечения заболеваний, следствием которых является гиперсекреция слизи.

Еще одной целью настоящего изобретения является предоставление способа анализа ш уйго для отбора подходящих средств, которые угнетают гиперсекрецию слизи, где упомянутый способ включает этапы (1) контактирования модели пролиферации бокаловидных клеток ш уйго с эпидермальным фактором роста либо его функциональным эквивалентом; (й) последующего контактирования упомянутой модели ш уйго с подходящим средством; и (ш) оценки пролиферации бокаловидных клеток, где угнетение пролиферации бокаловидных клеток является показателем терапевтического потенциала упомянутого подходящего средства.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление способа анализа ш у1уо для отбора подходящих средств, которые угнетают гиперсекрецию слизи, где упомянутый способ включает этапы (ί) создания животной модели гиперсекреторного легочного заболевания посредством индуцирования ЕСР-В, например, с помощью альфа-фактора некротизации опухолевых клеток (ΤΝΡ-α);

(ίί) стимулирования упомянутого индуцированного ЕСР-В с помощью его лиганда, например, трансформирующего альфа-фактора роста (ТСР-α) либо ЕСР, с целью продуцирова ния бокаловидных клеток, продуцирующих муцин;

(ш) обработки подходящим средством; и (ίν) оценки пролиферации бокаловидных клеток либо выделения слизи, где угнетение пролиферации бокаловидных клеток либо выделения слизи является показателем терапевтического потенциала упомянутого подходящего средства.

Еще одной целью настоящего изобретения является предоставление способов анализа ίη νίΐτο и ίη νίνο для отбора антагонистов ЕСЕ-К, которые угнетают гиперсекрецию слизи.

Преимущество настоящего изобретения заключается в том, что оно предоставляет средства для предотвращения чрезмерного образования слизи в легочных дыхательных путях.

Отличительная особенность настоящего изобретения заключается в том, что целый ряд антагонистов различного типа может использоваться для блокирования эффектов ЕСЕ и/или ТСЕ-α и их взаимодействия с ЕСК-К.

Аспектом настоящего изобретения является получение лекарственных форм антагонистов ЕСЕ для снижения образования слизи в дыхательных путях пациента-млекопитающего, в предпочтительном варианте пациента, которым является человек.

Другой целью настоящего изобретения является способ доставки антагониста ЕСЕ в легкие для уменьшения слизистых выделений в дыхательных путях пациента-млекопитающего, в предпочтительном варианте пациента, которым является человек.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление способа лечения ряда различных заболеваний, симптомом которых является чрезмерное образование слизистых выделений в дыхательных путях. К числу таких заболеваний относятся, хотя ими и не ограничиваются, хронический бронхит, бронхиальная астма, муковисцидоз, бронхоэктаз, хроническое обструктивное заболевание легких, гиперсекреция в результате повреждения эпителия, такого как аллергическое раздражение или механические царапины, и назальная гиперсекреция.

Эти и другие цели, преимущества и отличительные особенности настоящего изобретения станут очевидны специалистам в данной области при прочтении подробного описания способов лечения, а также способов анализа ίη νίΐτο и ίη νίνο, которое представлено далее.

Краткое описание рисунков

На фиг. 1А представлен анализ ЕСЕ-К в клетках ΝΟΙ-Η292 и А431 методом вестернблоттинга. На фиг. 1В представлены результаты иммуногистохимических анализов с помощью анти-ЕСЕ-К антитела в культурах клеток ΝΟΙΗ292. На фиг. 1С представлен анализ ЕСЕ-К в клетках ΝΟΙ-Η292 методом назерн-блоттинга.

Фиг. 2. Окрашивание клеток ΝΟΙ-Η292 алцианом голубым/периодной кислотой - Шиффо вым основанием (АВ/РЛ8) для идентифицирования муциновых гликопротеинов.

Фиг. 3. Анализ экспрессии МИС5 гена в клетках Νί.Ί-Η292 методом назерн-блоттинга.

Фиг. 4 А и фиг. 4В. Иммуногистохимический анализ ЕСЕ-К с помощью анти-ЕСЕ-К антитела у апатогенных крыс. Фиг. 4А, крысы, обработанные ΤΝΒ-α. Фиг. 4В, крысы, сенсибилизированные овальбумином.

На фиг. 5 изображен график, представляющий эффект ингибитора ЕСЕ-К тирозинкиназы (ΒΙΒΧ 1522) на продуцирование бокаловидных клеток (выраженный в виде процента окрашенной площади эпителия дыхательных путей, занятой клетками, позитивно окрашенными алцианом голубым/периодной кислотойШиффовым основанием (АВ/РА8).

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения

Предоставлены композиции и способы лечения гиперсекреции слизи в дыхательных путях посредством введения терапевтических количеств антагонистов ЕСЕ, в предпочтительном варианте ингибиторов киназы. Упомянутые антагонисты могут быть представлены в форме небольших молекул, антител либо фрагментов антител, которые связываются с ЕСЕ, либо с его рецептором. При гиперсекреторных заболеваниях дыхательных путей, например, хроническом бронхите, бронхоэктазе, муковисцидозе, бронхиальной астме, хроническом обструктивном заболевании легких и т.п., синтез муцина в дыхательных путях повышен и происходит гиперсекреция слизи. Выделенная слизь вызывает обструкцию дыхательных путей, что является причиной смерти при этих заболеваниях.

Как показано в описании к настоящему изобретению, несколько причин повреждения и воспаления дыхательных путей индуцируют экспрессию рецептора эпидермального фактора роста в клетках эпителия дыхательных путей. После индуцирования ЕСЕ-К, результатом его последующей стимуляции посредством как лигандзависимых, так и лиганднезависимых механизмов является продуцирование муцина как на уровне экспрессии гена, так и на уровне белка. Избирательные ингибиторы ЕСЕ-К тирозинкиназы демонстрируют блокирование упомянутой экспрессии муцинового гена и белка.

Без ограничения объема настоящего изобретения предполагается, что в основе эволюционной последовательности продуцирования бокаловидных клеток лежит экспрессия ЕСЕ-К. Стимулирование с помощью ΤΝΒ-α вызывает интенсивное ЕСЕ-К окрашивание негранулированных секреторных клеток; их последующая активация лигандами ЕСЕ-К вызывает прогрессирующее окрашивание гликоконъюгатов слизи в цитоплазме и упомянутые клетки превращаются вначале в клетки-предшественники бока ловидных клеток, затем в бокаловидные клетки. Полученные данные позволяют предположить, что активация ЕСЕ-К. усиливает избирательную дифференциацию клеток, но не их пролиферацию. Бокаловидные клетки явно образуются из негранулированных секреторных клеток, которые экспрессируют ЕСЕ-К и стимулируются лигандами ЕСЕ-К к продуцированию муцинов.

Наряду со стимулированием цитокинами, ЕСЕ-К может стимулироваться другими сигнальными медиаторами. Например, длительное курение сигарет связывают с прогрессирующими патологическими изменениями в периферических дыхательных путях, включая гиперплазию бокаловидных клеток. Показано, что предвоспалительные цитокинактивированные нейтрофилы и сигаретный дым вызывают синтез муцина в эпителиальных клетках бронхов человека через посредство лиганднезависимого активирования ЕСЕ-К, что позволяет предположить, что рекрутированные нейтрофилы и сигаретный дым являются регуляторами дифференциации эпителиальных клеток, следствием чего является патологическое индуцирование муцинпродуцирующих клеток в дыхательных путях. Нейтрофилы, активированные различными стимулами, в том числе 1Ь-8 (интерлейкином-8), Ν-формил-метионил-лейцил-фенилаланином, ΤΝΕ-α, сигаретным дымом либо Н₂О₂, активируют экспрессию муцина в эпителиальных клетках, синтез которого угнетается ингибиторами ЕСЕ-К. Нейтрофилы, кроме того, обладают способностью продуцировать лиганды ЕСЕК, ЕСЕ и ТСЕ-α. Наряду с этим, эпителиальные клетки являются источниками лигандов ЕСЕ-К.

Механическое повреждение эпителия дыхательных путей также может вызвать гиперсекрецию и быть ответственным за закупорку слизью. Ингибиторы ЕСЕ-К тирозинкиназы используются для предотвращения гиперсекреции слизи после интубации трахеи.

Повреждение эпителия является общей характерной чертой при обследовании пациентов даже с легкими формами астмы и упомянутое повреждение все в большей степени связывается с ухудшением клинических симптомов. Повреждение эпителия, вызванное аллергической реакцией, вызывает активацию ЕСЕ-К, следствием которой является патологическое продуцирование бокаловидных клеток. ЕСЕ-К причастен к повреждению эпителия, например, при реструктурировании дыхательных путей, происходящем при астме, репарации и заживлении ран. Механическое повреждение эпителия и повреждение эпителия при астме может вовлекать сходный ЕСЕ-К каскад, следствием которого является патологический рост секреторных клеток эпителия.

Гиперсекреция также является важным проявлением воспалительных заболеваний носа.

В случае провоцирования назальных бокаловидных клеток индуцированном дегрануляции бокаловидных клеток посредством нейтрофилзависимого механизма, происходит сильная активация экспрессии ЕСЕ-К и муцинов. Эти события связывались с регрануляцией бокаловидных клеток. В случае, когда воспаление, такое как стимулирование инфильтрации нейтрофилов, вызывает дегрануляцию бокаловидных клеток и секрецию муцина, эпителий дыхательных путей повторно снабжается муцинами вследствие позитивной регуляции и активации ЕСЕ-К.

Прежде чем будет приведено описание способов лечения и лекарственных форм, соответствующих настоящему изобретению, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными описанными способами и лекарственными формами, поскольку таковые могут, естественно, изменяться. Следует понимать также, что терминология, применяемая в настоящем описании, использована с целью описания только конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, и не должна рассматриваться в качестве ограничивающей, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничиваться лишь прилагаемой формулой изобретения.

При отсутствии иных определений, все технические и научные термины, использованные в данном описании, имеют то же самое значение, которое традиционно подразумевается средним специалистом в области, к которой относится настоящее изобретение. Несмотря на то, что при практическом осуществлении либо испытании настоящего изобретения могут быть использованы любые способы и материалы, подобные либо эквивалентные описанным здесь, далее представлено описание предпочтительных способов и материалов. Все публикации, упомянутые в настоящем описании, включены в него в качестве ссылки для раскрытия сущности и описания способов и/либо материалов в связи с упомянутыми публикациями.

Публикации, обсуждаемые в настоящем описании, предоставлены исключительно для раскрытия их сущности перед датой подачи настоящей заявки. В настоящем описании ничто не должно рассматриваться в качестве признания того, что настоящее изобретение не правомочно датировать такую публикацию задним числом в силу более раннего изобретения. В дополнение к этому, приведенные даты публикации могут отличаться от фактических дат публикации, которые могут нуждаться в независимом подтверждении.

Определения

Упомянутый термин эпидермальный фактор роста или ЕСЕ обозначает белок либо его часть, обладающую биологической активностью, характеризующейся митогенным воздействием на эпителиальные клетки (например, Коуэн (Сойеп) (1986), ВюкОепсек Керойк 6 (12):

1017; Ааронсон С.А. (Аагопкоп 8.А.), Сго\\111 Рас1огк апй Сапсег, 8с1епсе (1991) 254:11461153). Примером является человеческий эпидермальный фактор роста, описание которого представлено, например, Эрдеа (игйеа) и другими (1983), Ргос. Ыа1. Асай. 8сг 80:7461-7465.

Особый интерес для целей настоящего изобретения представляет митогенная активность БОР в отношении бокаловидных клеток. В приведенное определение включаются также белки либо их фрагменты, которые являются функциональным эквивалентом БОР с точки зрения биологической реакции, вызываемой БОР.

Упомянутый термин рецептор эпидермального фактора роста или БОР-К обозначает белок либо его часть, обладающую способностью связывания белка ЕОР либо его части. Примером является рецептор человеческого эпидермального фактора роста (см., Ульрих (Шпсй) и другие, (1984), Ыа1иге 309:418-425; номер доступа в Генбанке (ОепЬапк ΝΜ_005228). В предпочтительном варианте связывание упомянутого лиганда ЕОР активирует ЕОР-К (следствием чего является, например, активация внутриклеточной митогенной индукции, аутофосфорилирование ЕОР-К). Специалисту в данной области понятно, что другие лиганды, кроме ЕОР, могут связываться с ЕОР-К и активировать ЕОР-К. Примеры таких лигандов включают, однако, ими не ограничиваются, ТОР-α, бетацеллюлин, амфирегулин, гепаринсвязывающий ЕОР (НВ-ЕОР) и нейрегулин (известный также как гергулин) (Шон (8йа^п) и Шовер (8йа^уег), Ехр.-Орт. 1пуек1. Эгидк 7 (4) 553-573 и Тйе Рго1еш Капаке Рас1к Воок: Рго1ет Ту го к те Ктакек (1995), под редакцией Гарди (Нагй1е) и других, издательство Асайетю Ргекк, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк).

Упомянутый термин антагонист ЕОР-К обозначает любое средство, способное прямо либо косвенно ингибировать эффект ЕОР-К, в частности, эффект ЕОР-К на пролиферацию бокаловидных клеток либо гиперсекрецию слизи бокаловидными клетками. ЕОР-К может быть активирован через посредство лигандзависимых и лиганднезависимых механизмов, следствием чего является аутофосфорилирование либо перефосфорилирование, соответственно. Представляющие интерес антагонисты ЕОР-К могут ингибировать любой из или оба эти механизма. Например, следствием связывания ΤΝΒ-α с ЕОР-К является лигандзависимое фосфорилирование, которое может быть блокировано антителом, связывающим ЕОР-К, чем предотвращается взаимодействие ЕОР с лигандом, который мог бы активировать упомянутый рецептор ЕОР. Примеры таких антител приведены Гольдштейном (6о1Й81еш) и другими (1995), Сйп. Сапсег Кек. 1:1311-1318; Лоримером (Бопшег) и другими (1995), Сйп. Сапсег Кек.

1:859-864; Шмидтом (8сйт1й1) и Уэлсом (^е1к) (1996), Вг. 1. Сапсег 74:853-862. Небольшие молекулы ингибиторов тирозинкиназы также эффективны как антагонисты ЕОР-К.

В соответствии с альтернативным вариантом показано, что соединения, такие как свободные радикалы кислорода, стимулируют перефосфорилирование ЕОР-К, следствием чего является лиганднезависимая активация упомянутого рецептора. Другие средства активирования ЕОР-К посредством перефосфорилирования включают ультрафиолетовую и осмотическую нагрузку, стимулирование рецептора, связанного с О-белком, эндотелином-1, лизофосфатидную кислоту и тромбин, т1 мускариновый ацетилхолиновый рецептор и соматотропный гормон человека. Антагонисты этого лиганднезависимого механизма включают антиоксиданты, такие как пероскид-дисмутаза, диметилсульфоксид (ΌΜ8Ο), диметилмочевина (ΌΜΤυ) аскорбиновая кислота и подобные им.

Антагонистом ЕОР-К может быть антитело, которое связывается с фактором, стимулирующим продуцирование ЕОР либо продуцирование ЕОР-К, тем самым ингибируя стимулирование пролиферации бокаловидных клеток ЕОР (например, ингибитор каскада фосфорилирования, который фосфорилирует ЕОР-К). Например, гибридный белок ТОР-а-экзотоксина Ркеийотопак 40, описание которого приведено Артега (Айеада) и другими (1995), Сапсег Кек. 54:4703-4709.

В предпочтительном варианте осуществления упомянутый антагонист ЕОР-К является ингибитором тирозинкиназной активности ЕОРК, в частности, мелкомолекулярные ингибиторы, обладающие избирательным действием на ЕОР-К, по сравнению с другими тирозинкиназами - предпочтительные мелкие молекулы блокируют естественный рецептор ЕОР у млекопитающего, в предпочтительном варианте человека, и имеют молекулярную массу менее 1 кДа.

К ингибиторам ЕОР и ЕОР-К относятся, однако ими не ограничиваются, ингибиторы тирозинкиназы, например, хиназолины, такие как РЭ 153035, 4-(3-хлоранилин)хиназолин либо СР-358774, пиридопиримидины, пиримидопиримидины, пирролопиримидины, такие как СОР 59326, СОР 60261 и СОР 62706, и пиразолопиримидины (Шон (8йа^п) и Шовер (8йа^уег), см. выше), 4-(фениламино)-7Н-пирроло[2,3-й] пиримидины (Тракслер (Тгах1ег) и другие, (1996) 1. Мей. Сйет. 39:2285-2292), куркумин (диферулоилметан) (Лаксмин араяна (Бахтт агауапа) и другие, (1995), Сагсшодеп 16:17411745), 4,5-бис(4-фторанилино)фталимид (Бахдангер (Висййипдег) и другие, (1995), Сйп. Сапсег Кек. 1:813-821; Динни (Лтпеу) и другие, (1997), Сйп. Сапсег Кек. 3:161-168); тирфостины, в состав которых входят нитротиофеновые составляющие (Брайтон (Вгип1оп) и другие, (1996), Апй Сапсег Эгид Эекщп 11:26511

295); упомянутый ингибитор протеинкиназы ΖΌ-1839 (компания Л81га2еиеса); СР-358774 (компания ΡΓί/ег. 1пс.); ΡΌ-0183805 (компания ^агиег-ЬатЬеп); либо описанные в международных заявках \¥О 99/09016 (компания Лтепсаи Суапатй); \УО 98/43960 (компания Атенса п Суапапнй); XVО 97/38983 (компания ХУагпег ЬатЬей; XVО 99/06378 (компания ХУагпег ЬатЬей); XVО 99/06396 (компания ХУагпег ЬатЬей); XV О 96/30347 (компания РПхег. 1ис.); УО96/33978 (компания Ζеηеса); ХХ'О 96/33977 (компания Ζеηеса); и XVО 96/33980 (компания Ζеηеса); все включены в настоящее описание как ссылка; либо антисмысловые молекулы.

Упомянутый термин ингибирование означает снижение, нейтрализацию, ослабление либо предотвращение пролиферации бокаловидных клеток, дегрануляции бокаловидных клеток либо гиперсекреции слизи бокаловидными клетками.

Упомянутые термины лечение, лечить и т.п. используются в данном описании в общем значении достижения необходимого фармакологического и/или физиологического эффекта. Упомянутый эффект может быть профилактическим с точки зрения полного либо частичного предотвращения заболевания либо его симптома и/или может быть терапевтическим с точки зрения частичного либо полного излечения заболевания и/или неблагоприятного эффекта, связанного с упомянутым заболеванием. Упомянутый термин лечение, использованный в данном описании, обозначает любое лечение заболевания у млекопитающего, в частности, человека, и включает:

(a) предотвращение возникновения заболевания либо симптома у субъекта, который может быть предрасположен к данному заболеванию либо симптому, но который, однако, еще не был диагностирован как имеющий его;

(b) подавление заболевания либо симптома, т.е. остановку его развития; или (c) облегчение заболевания либо симптома, т.е. побуждение обратного развития упомянутого заболевания либо симптома. Настоящее изобретение направлено на лечение пациентов с заболеванием легких либо дыхательных путей и, в частности, направлено на лечение гиперсекреции слизи у пациентов, т.е. предотвращение, ингибирование либо облегчение процесса гиперсекреции слизи. С точки зрения лечения симптомов, настоящее изобретение направлено на снижение содержания слизи либо мокрот в дыхательных путях, подавление инфицирования патологическими микроорганизмами, облечение кашля и предотвращение гипоксии вследствие закупорки дыхательных путей.

Более конкретно, упомянутый термин лечение означает предоставление терапевтически обнаружимого и благоприятного эффекта пациенту, страдающему от заболевания легких, включающего гиперсекрецию слизи.

Еще более конкретно, упомянутый термин лечение обозначает предотвращение, облегчение и/или ингибирование гиперсекреции слизи с помощью соединения, выбранного из группы, включающей антагонисты ЕСЕ и/или ЕСЕ-К, такие как антитела, ингибиторы протеинтирозинкиназы, антисмысловые молекулы и т. п. Альтернативный способ лечения может включать предотвращение экспрессии ЕСЕ-К в дыхательных путях, блокируя тем самым дыхательные пути на более ранней стадии. Например, реактивы, блокирующие связывание ΤΝΕ-α с его рецептором, могут предотвращать активирование ЕСЕ-К.

Лечение включает предотвращение либо подавление инфекционных заболеваний, обусловленных патологическими агентами, вызванных и/или связанных с гиперсекрецией слизи.

Упомянутый термин антитело обозначает иммуноглобулиновый белок, способный связывать антиген. Термин антитело, использованный в настоящем описании, обозначает фрагменты антитела, например, Е(аЬ')₂, ЕаЬ', ЕаЬ, способные связывать упомянутый антиген либо представляющий интерес фрагмент антигена. В предпочтительном варианте связывание антитела с антигеном угнетает активность ЕСЕ либо ЕСЕ-К.

Упомянутый термин гуманизированное антитело используется здесь для описания полных молекул антитела, т.е. состоящих из двух полных легких цепей и двух полных тяжелых цепей, а также антител, включающих лишь фрагменты антител, например. ЕаЬ ЕаЬ', Е(аЬ')2 и Εν, где упомянутые гипервариабельные участки получают из источника, не относящегося к человеческому роду, в то время как остальную часть упомянутой 1д молекулы либо ее фрагмент получают из человеческого антитела, в предпочтительном варианте полученном из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческое антитело.

Упомянутые термины человеческое антитело и гуманизированное антитело используются здесь для описания антитела, все части молекулы которого получены из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческое антитело. Такие человеческие антитела являются наиболее желательными для использования в методах лечения антителами, поскольку такие антитела вызывают незначительную либо вообще не вызывают иммунной реакции у пациента-человека.

Упомянутый термин химерное антитело используется здесь для описания молекулы антитела, а также фрагментов антитела, описание которых приведено ранее в определении упомянутого термина гуманизированное антитело. Объем понятия упомянутого термина химерное антитело включает гуманизированные антитела. Химерные антитела имеют как минимум одну часть последовательности тяжелой или легкой цепи аминокислоты, полученной от первого вида млекопитающих, и другую часть последовательности тяжелой или легкой цепи аминокислоты, полученной от второго, отличающегося вида млекопитающих. В предпочтительном варианте переменную область получают от вида млекопитающих, не относящихся к человеку, в то время как постоянную область получают от человеческого вида. В частности, упомянутое химерное антитело в предпочтительном варианте получают из нуклеотидной последовательности от млекопитающего, не относящегося к человеческому виду, кодирующей переменную область, и нуклеотидной последовательности от человека, кодирующей постоянную область антитела.

Упомянутое выражение специфически связывается означает высокоавидное и/или высокоаффинное связывание антитела со специфическим полипептидом. Связывание антитела со своим эпитопом на специфическом полипептиде является более сильным, чем связывание того же самого антитела с любым другим эпитопом, в частности, с теми из них, которые могут быть представлены на молекулах, находящихся в связи с либо в той же самой пробе, что и представляющий интерес специфический полипептид. Антитела, которые специфически связываются с представляющим интерес полипептидом, могут обладать способностью к связыванию с другими полипептидами на слабом, однако поддающемся обнаружению уровне, например, 10% или менее от связывания, демонстрируемого с упомянутым представляющим интерес полипептидом. Такое слабое или фоновое связывание легко отличается от специфического связывания антитела с представляющим интерес соединением либо полипептидом, например, с помощью соответствующих контролей.

Упомянутое выражение поддающееся обнаружению меченое антитело, поддающийся обнаружению меченый анти-ЕСР либо поддающийся обнаружению меченый фрагмент анти-ЕСР означает антитело (либо фрагмент антитела, сохраняющий специфичность связывания), имеющее присоединенную к нему поддающуюся обнаружению метку. Упомянутая поддающаяся обнаружению метка присоединяется, как правило, посредством химической конъюгации, однако в том случае, когда упомянутой меткой является полипептид, в соответствии с альтернативным вариантом, он может присоединяться методами генной инженерии. Способы получения поддающихся обнаружению меченых белков хорошо известны в данной области. Поддающиеся обнаружению метки могут выбираться из разнообразных подобных меток, известных в данной области, однако в качестве упомянутых обнаружимых меток используются, как правило, радиоактивные изотопы, флуорофоры, ферменты, например, пероксидаза хрена, либо другие составляющие или соединения, которые либо испускают поддающийся обнаружению сигнал (например, радиоактивность, флуоресценция, цвет), либо испускают поддающийся обнаружению сигнал после воздействия на упомянутую метку ее субстрата. В данной области хорошо известны различные пары поддающейся обнаружению метки/субстрата (например, пероксидаза хрена/диаминобензидин, авидин/стрептавидин, люцифераза/ люциферин), способы мечения антител и способы использования меченых антител для обнаружения антигена (см., например, АпНЬоЛек: А ЬаЬога1огу Мапиа1, под редакцией Харлоу (Наг1ο\ν) и Лейна (Ьапе), (1988), издательство Со16 8рпп§ НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк, Со 16 8рпп§ НагЬог, Нью-Йорк).

Терапевтические методы

Настоящее изобретение предоставляет способ лечения легочной гиперсекреции посредством введения терапевтических количеств антагонистов ЕСР-В. Любое заболевание и, в частности, любое заболевание легких, характеризующееся гиперсекрецией слизи либо накоплением патологических уровней слизи, может лечиться с помощью способов, описание которых здесь предоставляется. Примерами легочных гиперсекреторных заболеваний, которые могут лечиться этим способом, являются, однако ими не ограничиваются, хронические обструктивные заболевания легких, такие как хронический бронхит, воспалительные заболевания, такие как астма, бронхоэктаз, фиброз легких, хроническое обструктивное заболевание легких, заболевания назальной гиперсекреции, например, назальные аллергии, и другие гиперсекреторные заболевания. Сюда же включаются и генетические заболевания, такие как муковисцидоз, триада Картагенера, альфа-1-антитрипсиновая недостаточность, семейное уплотнение слизи в дыхательных путях, не являющееся муковисцидозом.

Предпочтение отдается антагонистам, непосредственной мишенью для которых является ЕСР или ЕСР-В. Однако специалисту в данной области понятно, что любой фактор либо клетка, вовлеченные в упомянутый биологический каскад, следствием которого является активирование пролиферации бокаловидных клеток ЕСРВ, могут выступать в качестве мишеней для ингибирования, например антагонисты ТСР-α. Не связывая себя теорией, авторы изобретения полагают, что каскад начинается во время воспалительной реакции, когда клетки, такие как тучные клетки либо нейтрофилы выделяют ΤΝΡ-α, который в последующем активирует экспрессию ЕСР-В. Стимулирование ЕСР-В, например, его лигандом ЕСР, в свою очередь запускает пролиферацию бокаловидных клеток. Таким образом, любые клетки либо факторы, вовлеченные в упомянутый каскад, например, в кас кад реакций ΤΝΓ-α, могут явиться мишенью для активности антагониста.

Упомянутый антагонист ЕСР-К, введенный в упомянутый терапевтический способ, может быть представлен в любой форме. Например, упомянутый антагонист ЕСР-К может быть в форме небольшой молекулы (например, антисмысловой олигонуклеотид, ингибитор тирозинкиназы и т.п.), антитела либо части антитела, связанных с ЕСР, ТСР-α либо ЕСР-К.

Мелкомолекулярные антагонисты ЕСР-К

В данной области известны ингибиторы тирозинкиназы, воздействующие на рецептор ЕСР и отличающиеся избирательностью в отношении ЕСР-К, которые могут быть использованы в представленных способах. Описание примеров было приведено ранее, и к числу таковых может быть отнесен ΒΙΒΧ 1522 (компания Воейппдег ИщсШспп. 1пс., ИщсШспп. Германия); ССР 59326В (компания ΝονηιΌ Согрогайоп, Ва§е1, Швейцария); 4-аминохиназолиновые ингибиторы ЕСР-К (описаны в патенте США № 5,760,041); замещенные стирольные соединения, которые также могут быть нафталином, инданом либо бензоксазином, включая нитрильные и молононитрильные соединения (описаны в патенте США № 5,217,999); ингибиторы, раскрытые в патенте США № 5,773,476; ингибитор картофельной карбоксипептидазы (РС1), ингибитор 39-аминокислотной протеазы с тремя дисульфидными мостиковыми связями (БланкоАпарисио (В1апсо-Арапсю) и другие, (1988), 1. Вю1. Сйет. 273 (20): 12370-12377); бобмезиновый антагонист КС-3095 (Цепешази (8хере5Йах1) и другие, (1997), Ргос. №И. Асаб. 8сг И8А, 94:10913-10918) и т.д. К числу других ингибиторов тирозинкиназы относятся хиназолины, такие как ΡΌ 153035, 4-(3-хлоранилин)хиназолин либо СР-358774, пиридопиримидины, пиримидопиримидины, пирролопиримидины, такие как ССР 59326, ССР 60261 и ССР 62706, и пиразолопиримидины (Шон (8йаетп) и Шовер (8йа^ег), смотри выше), 4-(фениламино)-7Нпирроло[2,3-б] пиримидины (Тракслер (Тгах1ег) и другие, (1996), 1. Меб. Сйет. 39:2285-2292), куркумин (Корутла (Когиба) и другие, ВюсЫт. Вюрйук. Ас1а 1224:597-600); (Лаксмин араяна (Ъахтт агауапа), (1995), Сагсшодеп 16:17411745); и т.д.

Предпочтительные ингибиторы тирозинкиназы являются избирательными в отношении рецептора ЕСР, т.е. упомянутый ЕСР-К подавляется в большей степени, чем другие рецепторы клеточной поверхности, обладающие тирозинкиназной активностью. Избирательность усиливается способами получения лекарственных форм и доставки лекарственного средства, например, когда упомянутый ингибитор предпочтительно доставляется в воспаленные дыхательные пути, и т. д.

Типичные дозы для системного введения колеблются от 0,1 мкг до 100 мг на килограмм массы субъекта на введение. Специалистам в данной области понятно, что величина дозы может изменяться в зависимости от конкретного соединения, тяжести симптомов и восприимчивости субъекта к побочным эффектам. Некоторые из специфических соединений являются более сильнодействующими, чем другие. Предпочтительные дозы данного соединения легко определяются специалистами в данной области различными способами. Предпочтительным способом является определение физиологической активности данного соединения, например, с помощью тестов ш сбго и ш сАо, описание которых здесь приводится.

Антитела как антагонисты ЕСР-К

Антитела как антагонисты ЕСР-К представляют собой особый интерес (например, Вилориа (УПопа) и другие, Атепсап 1огцпа1 о! Ра1йо1оду 151:1523). Антитела к ЕСР либо ЕСРК продуцируются посредством иммунизации ксеногенного иммунокомпетентного хозяинамлекопитающего, в том числе из семейства мышиных, грызунов, зайцеобразных, овечьих, свиных, бычьих и т.д., ЕСР, ЕСР-К либо их фрагментами. В качестве иммуногена в предпочтительном варианте используют ЕСР, ЕСРК либо их фрагменты. Выбор конкретного хозяина является, главным образом, вопросом удобства. Иммунизацию осуществляют в соответствии с традиционными методами, где упомянутый иммуноген может вводиться животному-хозяину подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутрисосудисто и т.д. Как правило, в качестве иммуногена через день внутрибрюшинно вводят от приблизительно 1,0 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг ЕСР или ЕСР-К. Инъекции могут производиться с или без адъюванта, например, полного либо неполного адъюванта Фрейнда, спекола, квасцов и т.п. После завершения схемы иммунизации, антисыворотка может собираться в соответствии с традиционными способами с получением поликлональных антисывороток, специфичных для ЕСР или ЕСР-К.

От иммунизированных животных получают моноклональные либо поликлональные антитела, в предпочтительном варианте моноклональные антитела. Поликлональные антисыворотки могут собираться из сыворотки животных традиционными способами после завершения схемы иммунизации. Для получения моноклональных антител лимфоциты собирают из соответствующей лимфоидной ткани, например, селезенки, посредством дренирования лимфатических узлов и т.п., с последующей гибридизацией с соответствующим гибридизационным партнером, как правило, линией клеток миеломы, с получением гибридомы, секретирующей специфическое моноклональное антитело. Отбор клонов гибридом по представляющей инте рес антигенной специфичности осуществляют в соответствии с традиционными методами.

Особый интерес представляют антитела, в предпочтительном варианте моноклональные антитела, которые связываются с БОР-К либо БОР с тем, чтобы подавить связывание БОР с БОР-К, например, антитело, которое специфически связывается с внеклеточной областью ЕОР-К, предотвращая тем самым связывание ЕОР. Такие антитела могут быть получены с помощью традиционных способов, описание которых было представлено выше, либо они являются коммерчески доступными. Примерами антител, которые могли бы функционировать как антагонисты ЕОР, являются, однако, ими не ограничиваются, нейтрализующее анти-ЕОР-К моноклональное антитело С225 (Кавамото (Ка\\'ато1о) и другие, (1983), Ргос. ЫаИ Асаб. 8сР (И8А), 80:1337-1341: Пти (Реб!) и другие, (1997), 1. Ра!й., 151:1523-153, производимое компанией 1тС1опе 8ук!ет5 Ыете Уогк, штат Нью-Йорк) и анти-ЕОР-К моноклональное антитело ΕΜΌ55900 (именуемое также МаЬ 425), (компания Мегск, Дармштадт, Германия).

Представленные антитела могут производиться с одной цепью, вместо нормальной мультимерной структуры. Одноцепочечные антитела описываются Джостом (бок!) и другими, (1994), 1. В. С., 269:26267-73, и другими. Последовательности ДНК, кодирующие переменную область тяжелой цепи и переменную область легкой цепи, лигируются спейсером, кодирующим как минимум около 4 аминокислот из небольших нейтральных аминокислот, включая глицин и/или серин. Белок, кодируемый посредством упомянутого слияния, обеспечивает возможность сборки функционально переменной области, которая сохраняет специфичность и аффинность исходного антитела.

Способы гуманизации антител известны в этой области. Гуманизированное антитело может быть продуктом животного, имеющего гены константной области трансгенного человеческого иммуноглобулина (см., например, международные заявки \УО 90/10077 и \УО 90/04036). В соответствии с альтернативным вариантом представляющее интерес антитело может быть получено методами рекомбинантных ДНК для замещения СН1, СН2, СН3, шарнирных областей и/или остатков остова соответствующей человеческой последовательностью (смотри \УО 92/02190).

Использование 1д кДНК для генно-инженерного конструирования химерных иммуноглобулиновых генов также известно в данной области (Лю (Бш) и другие, (1987), Р. N. А. 8., 84:3439 и (1987), б. 1ттипо1., 139:3521). мРНК выделяют из гибридомы или другой клетки, продуцирующей антитело, и используют для продуцирования кДНК. Полученная представляющая интерес кДНК может амплифицироваться посредством полимеразно-цепьевой ре акции с использованием специфических праймеров (патенты США № 4,683,195 и № 4,683,202). В соответствии с альтернативным вариантом получают библиотеку, которую подвергают скринингу для выделения представляющей интерес последовательности. После этого последовательность ДНК, кодирующая переменную область упомянутого антитела, сливается с человеческими последовательностями, кодирующими постоянную область. Упомянутые последовательности человеческих генов постоянных областей можно найти в работе Кабат (КаЬа!) и других, (1991), 8ес.|иепсе5 о! Рго1еш8 о! 1ттипо1ощса1 1п!егек!, публикация Национального института здоровья (Ν.Ι.Η.) США № 91-3242. Человеческие гены постоянной области легко доступны из известных клонов. После этого химерное гуманизированное антитело экспрессируют традиционными способами.

Фрагменты антител, например, Ру, Р(аЬ')₂ и РаЬ, могут быть получены посредством расщепления интактного белка, например, с помощью протеазы либо посредством химического расщепления. В соответствии с альтернативным вариантом конструируется усеченный ген. Например, химерный ген, кодирующий часть фрагмента Р(аЬ')2, должен был бы включать последовательности ДНК, кодирующие область СН1 и шарнирную область тяжелой цепи, за которыми следует стоп-кодон трансляции, для получения усеченной молекулы.

Пациенту, страдающему заболеванием, связанным с гиперсекрецией слизи, могут вначале вводиться количества антагониста ЕОР-К в пределах от приблизительно 20 мг до приблизительно 400 мг на килограмм массы пациента дважды в день, например, посредством ингаляции.

Антисмысловые молекулы как антагонисты ЕСР-К

В другом варианте осуществления представленными терапевтическими средствами являются антисмысловые молекулы, специфические для человеческих последовательностей, кодирующих ЕОР или ЕОР-К. Вводимым терапевтическим средством могут быть антисмысловые олигонуклеотиды, в частности синтетические олигонуклеотиды, полученные посредством химических модификаций нативных нуклеиновых кислот, либо генно-инженерные конструкции на основе нуклеиновых кислот, которые экспрессируют такие антисмысловые молекулы, как РНК. Упомянутая антисмысловая последовательность является комплементарной к упомянутой мРНК таргетированных генов ЕОР или ЕОР-К и угнетает экспрессию продуктов упомянутого таргетированного гена (см., например, Найс ^усе) и другие, (1997), №Циге. 385:720). Антисмысловые молекулы ингибируют экспрессию гена посредством уменьшения количества мРНК, доступного для трансляции, путем активации рибонуклеазы Н либо стерического несоответствия. Может вводиться одна антисмысловая молекула либо комбинация антисмысловых молекул, причем в состав упомянутой комбинации могут входить многочисленные различные последовательности одного таргетированного гена либо последовательности, которые дополняют несколько различных генов.

Предпочтительным геном-мишенью является ЕСЕ-К или ЕСЕ. Доступ к последовательности гена может обеспечиваться через общественные базы данных (человеческий эпидермальный фактор роста, внесенный в каталог Генбанка под № К01166; человеческая мРНК для предшественника рецептора эпидермального фактора роста, внесенная в каталог Генбанка под № Х00588). Упомянутая антисмысловая последовательность обычно будет иметь те же самые исходные виды, что и животное-хозяин.

Антисмысловые молекулы могут быть получены посредством экспрессии всей либо части последовательности упомянутого генамишени в подходящем векторе, причем упомянутый вектор вводят и экспрессируют в упомянутых таргетированных клетках. Инициация репликации ориентируется таким образом, что упомянутая антисмысловая цепочка продуцируется как молекула РНК. Полученная антисмысловая РНК гибридизуется с эндогенной смысловой цепочкой мРНК, блокируя тем самым экспрессию упомянутого таргетированного гена. Может быть использована нативная инициирующая область транскрипции либо экзогенная инициирующая область транскрипции. Промотор может вводиться рекомбинантными методами ίη νίΐτο либо в результате гомологичной интеграции упомянутой последовательности в хромосому. В данной области известно множество сильных промоторов, активных в мышечных клетках, например, промотор β-актина, ранние и поздние промоторы 8У-40. промотор человеческого цитомегаловируса, ретровирусные длинные конечные повторы и т.п.

Векторы транскрипции имеют, как правило, удобные сайты рестрикции, расположенные возле промоторной последовательности, для обеспечения вставки последовательностей нуклеиновых кислот. Могут быть получены транскрипционные кластеры, включающие инициирующую область транскрипции, ген-мишень либо его фрагмент и терминирующую область транскрипции. Упомянутые транскрипционные кластеры могут вводиться в различные векторы, например, плазмиду; ретровирус, например, лентивирус; аденовирус и т.п., причем упомянутые векторы могут сохраняться в клетках периодически либо постоянно, как правило, в течение как минимум приблизительно одного дня, чаще в течение как минимум приблизительно нескольких дней.

В качестве альтернативы в предпочтительном варианте осуществления антисмысловая молекула представляет собой синтетический олигонуклеотид. Антисмысловые олигонуклеотиды включают, как правило, от приблизительно 7 нуклеотидов до 500 нуклеотидов, обычно от приблизительно 12 нуклеотидов до 50 нуклеотидов, чаще от приблизительно 20 нуклеотидов до 35 нуклеотидов, причем длина обусловливается эффективностью ингибирования, специфичностью, включая отсутствие перекрестной реактивности и т.п. Было установлено, что короткие олигонуклеотиды, от 7 оснований до 8 оснований длиной, могут быть сильными и избирательными ингибиторами экспрессии гена (см., Вагнер (^адпет) и другие, (1996), №1игс Вю!есйпо1о§у, 14:840-844).

Специфическую область либо области эндогенной последовательности смысловой цепочки мРНК выбирают таким образом, чтобы они дополнялись антисмысловой последовательностью. Было показано, что 5'-конечная область мРНК отличается особой восприимчивостью к антисмысловому ингибированию. Недавно полученные данные свидетельствуют, однако, о том, что анализ вторичной структуры мРНК может иметь значение для доступности сайтов ингибирования. При выборе специфической последовательности для олигонуклеотида можно пользоваться эмпирическим способом, когда несколько подходящих последовательностей анализируются на ингибирование экспрессии гена-мишени на моделях ίη νίΐτο либо на животных моделях. Может использоваться также комбинация последовательностей, где для антисмысловой комплементарности может отбираться несколько участков упомянутой последовательности мРНК.

Антисмысловые олигонуклеотиды могут синтезироваться химическим путем с помощью способов, известных в данной области, (Вагнер (^адпет) и другие, (1993), см. выше, и Миллиган (МйБдап) и другие, смотри выше). Предпочтительные олигонуклеотиды получают посредством химической модификации нативной фосфодиэфирной структуры для повышения их внутриклеточной стабильности и сродства к связыванию. В литературе был описан ряд таких модификаций, которые изменяют химизм остова, сахаров либо гетероциклических оснований.

Олигонуклеотиды могут дополнительно включать таргетирующую составляющую, которая усиливает поглощение упомянутой молекулы клетками. Упомянутая таргетирующая составляющая представляет собой специфические связывающие молекулы, например, антитело либо его фрагмент, который распознает молекулы, присутствующие на поверхности эпителиальных клеток легких, в частности, эпителиальных клеток, в состав которых входит ЕСЕ-К.

В данной области известны биспецифические антитела, химерные антитела и одноцепочечные антитела. Соответствующим образом полученные антитела, не относящиеся к человеческому роду, могут гуманизироваться различными путями. Соединение между олигонуклеотидом и таргетирующей составляющей может осуществляться любым удобным способом, например, с помощью дисульфидных, амидных либо тиоэфирных связей, в зависимости от химизма олигонуклеотидного остова. В предпочтительном варианте упомянутая связь будет расщепляться внутри клетки для высвобождения олигонуклеотида.

Олигонуклеотиды могут конъюгироваться с гидрофобными остатками, например, холестерином, для защиты от нуклеаз и для улучшения переноса через клеточные мембраны. В качестве альтернативы конъюгирование с поли-Ь-лизином либо другими полиаминами может также улучшать доставку в клетку. Дополнительной модификацией, которая может осуществляться, является добавление интеркаляционного компонента, такого как акридин, способный внедряться в мРНК-мишень и стабилизировать получаемый в результате гибрид. Антисмысловые олигонуклеотиды могут трансфицироваться в сочетании с ферментом(-ами), которые будут разрушать комплексы антисмысловой мРНК в клетке, например, с рибонуклеазой-Н. Подобным же образом может быть использован любой белок либо фермент, который может предпочтительным образом разлагать либо разрушать упомянутую двухцепочечную антисмысловую мРНК.

В качестве альтернативы антисмысловым ингибиторам, для ингибирования экспрессии генов могут использоваться каталитические соединения нуклеиновых кислот, например, рибозимы, антисмысловые конъюгаты и т.п. Рибозимы могут синтезироваться ίη νίίτο и вводиться пациенту, либо кодироваться на экспрессирующем векторе, из которого упомянутый рибозим синтезируется в клетке-мишени (см., например, международную заявку XVО 95/23225, и Бейгельман (Всщс1шап) и другие, (1955), Νιιοί. Асίάκ Век., 23:4434-42). Примеры олигонуклеотидов с каталитической активностью описаны в νθ 95/06764. Конъюгаты антисмысловых олигонуклеотидов с металлическим комплексом, например, терпиридилСи(11), способные опосредовать гидролиз мРНК, описаны Башкиным (Вакйкш) и другими, (1995), Арр1. Вюсйет. Вю1есЬпо1., 54:43-56.

Фармацевтические лекарственные формы

Антагонисты ЕСЕ-В могут предоставляться для введения в виде раствора либо в любой другой фармакологически приемлемой форме, такой как липосомная суспензия. Соответствующие антитела либо анти-ЕСЕ иной формы включаются в состав лекарственной формы для введения способом, обычным для введения таких материалов. К типичным лекарственным формам относятся лекарственные формы, приведенные в справочнике Вет1пд1оп'к Рйагта сеи11са1 8с1епсек, последнее издание, Маск РиЬБкЫпд Сотрапу, Еак1оп, штат Пенсильвания. Путь введения будет выбираться исходя из соединения, предназначенного для введения, статуса пациента и заболевания, которое подвергается лечению. В случае гиперсекреции слизи соединение может вводиться различными путями, в зависимости от тяжести заболевания, например, ургентные ситуации могут потребовать внутривенного введения, острые, но не представляющие опасности для жизни ситуации могут потребовать перорального введения, в то время как в случае хронического лечения соединение может вводиться в форме аэрозоля.

Для терапевтического применения при назальных заболеваниях и заболеваниях дыхательных путей предпочтение отдается местной доставке. Доставка посредством ингаляционных либо инсуффляционных аэрозолей обеспечивает концентрации лекарственного препарата высокого уровня, по сравнению с концентрацией, абсорбируемой системным путем. В качестве альтернативы антагонист ЕСЕ может вводиться инъекционным путем, включая внутримышечную, внутривенную, подкожную либо брюшинную инъекцию, причем наибольшее предпочтение отдается внутривенным и местным инъекциям. Могут, однако, использоваться и другие пути введения, при условии доступности средств, обеспечивающих введение антагониста ЕСЕ-В в систему кровообращения, такие как чресслизистые либо чрескожные лекарственные формы, которые могут применяться в виде суппозиториев, кожных пластырей либо интраназально. Соответствующим образом может быть использована любая подходящая лекарственная форма, которая обеспечивает попадание антагониста ЕСЕ-В в систему кровообращения либо локально в легкие.

К числу лекарственных форм, предназначенных для инъекций, относятся, как правило, водные растворы либо суспензии, в которых используется физиологический раствор, сбалансированный солевой раствор Хенкса или другие буферы, в состав которых факультативно включаются стабилизаторы либо другие второстепенные компоненты. Могут использоваться также липосомные препараты и другие формы микроэмульсий. Антагонист ЕСЕ-В может предоставляться также в лиофилизированном виде либо восстановленным для введения. В состав лекарственных форм для чресслизистого либо чрескожного введения входят, как правило, агенты, облегчающие прохождение через слизистый либо кожный барьер, такие как желчь, соли, фузидиевая кислота и ее аналоги, различные детергенты и т. п. Возможно также пероральное введение, при условии включения в состав лекарственной формы подходящих энеросолюбильных покрытий, обеспечивающих возможность прохождения антагонистом ЕСЕ-В пищеварительного тракта.

Природа лекарственной формы будет в некоторой степени зависеть от природы выбранного антагониста ЕСР-В. Подходящую лекарственную форму получают с помощью известных способов и принципов получения лекарственных форм, хорошо известных специалистам в данной области. Процентное количество антагониста ЕСР-В, включенное в состав конкретного фармацевтического препарата, будет также зависеть от природы лекарственной формы; процентное количество антагониста ЕСР-К, которым является антитело, будет, как правило, колебаться в широких пределах от приблизительно 1% (мас.) до приблизительно 85% (мас.).

В данной области известно большое количество способов доставки, обеспечивающих усиления поглощения нуклеиновых кислот клетками. К числу пригодных систем доставки относятся системы доставки вирус Сендайлипосома (Рапапорт (Варарой) и Шай (8Ы), (1994), 1. Бю1. Сйеш., 269:15124-15131), катионные липосомы, полимерные доставочные гели либо матрицы, пористые баллонные катетеры (раскрытые Шай (§Ы) и другими, (1994), Спеи1аОоп. 90:955-951: и Шай (§Ы) и другими, (1994), Сепе Тйегару, 1:408-414), векторы экспрессии на основе ретровирусов и т.п.

Использование липосом в качестве доставочного носителя является представляющим интерес способом для использования с антагонистами ЕСР-В. Липосомы сливаются с клетками сайта-мишени и доставляют содержимое полости внутриклеточно. Липосомы удерживаются в контакте с упомянутыми клетками в течение периода времени, достаточного для слияния, с помощью различных средств и способов сохранения контакта, таких как выделение, связывающие агенты и т.п. Можно получать липосомы с очищенными белками либо пептидами, которые опосредуют слияние мембран, такими, например, как вирус Сендай либо вирус гриппа, и т. п. В качестве липидов могут быть использованы любые пригодные комбинации известных образующих липосомы липидов, в том числе катионные липиды, такие как фосфатидилхолин. В качестве остающегося липида, при нормальных условиях, могут быть использованы нейтральные липиды, такие как холестерин, фосфатидилсерин, фосфатидилглицерин и т.п. Для получения липосом может использоваться процедура, описанная Като (Ка1о) и другими, (1991), 1. Бю1. Сйеш., 266:3361.

В предпочтительном варианте осуществления антагонист ЕСР-К капсулируется в стерически стабилизированные скрытые липосомы, например, полиэтиленгликолизированные липосомы. В случае внутривенного впрыскивания таких липосом они остаются в системе кровообращения в течение длительных периодов времени. При воспалении дыхательных путей открываются места соединений посткапиллярных венул, что обеспечивает возможность накопления жидкости и позволяет молекулам, например, комплемента, кининогена, проникать в ткани, инициируя воспалительные каскады. Такое воспаление позволяет липосомам и их содержимому избирательно откладываться в воспаленных тканях (Жанг (Ζ1ι;·ιη§) и другие, (1998), Рйагш. Век., 15:455-460).

Антагонисты ЕСР-В могут вводиться пораженному пациенту с помощью фармацевтической системы доставки ингаляционным путем. Упомянутые соединения могут включаться в состав лекарственной формы, пригодной для введения посредством ингаляции. Упомянутая фармацевтическая система доставки относится к числу пригодных для респираторной терапии путем местного введения антагонистов ЕСР-В на слизистую выстилку бронхов. Это изобретение может использовать систему, зависящую от энергии сжатого газа, для выталкивания антагонистов ЕСР-В из емкости. С этой целью может использоваться аэрозольная упаковка либо упаковка, находящаяся под повышенным давлением.

Упомянутый термин аэрозоль, применяемый в настоящем описании, используется в своем традиционном смысле как обозначающий крайне мелкие частицы жидкости либо твердого вещества, переносимые газообразным пропеллентом к месту терапевтического применения. В случае использования в этом изобретении фармацевтического аэрозоля, в состав упомянутого аэрозоля входит терапевтически активное соединение, которое может растворяться, суспендироваться либо эмульгироваться в смеси жидкого носителя и пропеллента. Упомянутый аэрозоль может быть в форме раствора, суспензии, эмульсии, порошка либо полутвердого препарата. Аэрозоли, используемые в настоящем изобретении, предназначены для введения мелких частиц твердого вещества либо жидкости в виде тумана через дыхательные пути пациента. Могут использоваться пропелленты различных типов, известные специалисту в данной области. Примерами подходящих пропеллентов являются, однако, ими не ограничиваются, углеводороды либо другой пригодный газ. В случае аэрозоля, находящегося под повышенным давлением, стандартная дозировочная единица может определяться посредством предоставления объема для доставки определенного количества.

Настоящее изобретение может осуществляться также с помощью распылителя, представляющего собой устройство, образующее чрезвычайно мелкие частицы жидкости по существу однородной величины в газе. В предпочтительном варианте жидкость, содержащая антагонисты ЕСР-В, диспергируется в виде капель. Мелкие капли могут выноситься потоком воздуха через выходную трубку распылителя. Образующийся туман проникает в дыхательные пути пациента.

Млекопитающему, нуждающемуся в лечении, может вводиться порошковая композиция, в состав которой входят антагонисты ЕСЕ-К либо их аналоги с/без смягчающего компонента, носителя либо пропеллента. Этот вариант осуществления настоящего изобретения может быть реализован с помощью традиционного устройства для введения порошковой фармацевтической композиции посредством ингаляции. Например, порошковая смесь упомянутого соединения и соответствующей порошковой основы, такой как лактоза либо крахмал, может быть представлена в стандартной дозированной лекарственной форме, например, в виде капсул либо патронов, например, желатиновых, или же в виде вытяжных прозрачных упаковок, из которых упомянутый порошок может вводиться с помощью ингалятора.

Для лечения гиперсекреторного легочного заболевания могут использоваться комбинированные терапевтические методы. В частности, антагонисты ЕСЕ-К могут комбинироваться с традиционными лекарственными средствами для облегчения гиперсекреции, такими как бронхолитические средства, кортикостероиды, отхаркивающие средства, муколитические средства и т. п., для облегчения очистки реснитчатого эпителия.

В зависимости от состояния пациента предпочтение может отдаваться доставке лекарственной формы, соответствующей настоящему изобретению, посредством впрыскивания (например, внутривенного) либо посредством ингаляции. Пациенты, имеющие в легких большие количества слизи, не могут, в общем, лечиться вначале посредством ингаляций. Это обусловлено тем, что легкие пациента закупорены в такой степени, что ингаляционная доставка аэрозолированной лекарственной формы может оказаться не особо эффективной. Однако после лечения посредством инъекций, либо в качестве альтернативы для длительного поддержания, или в ситуациях, когда легкие пациента сильно не закупорены, предпочтительным может оказаться введение путем ингаляций. Введение путем ингаляций оказывается предпочтительным, потому что небольшие дозы могут доставляться локально к конкретным клеткам, которые испытывают наибольшую необходимость в лечении. Благодаря доставке малыми дозами исключаются либо существенно снижаются любые неблагоприятные побочные эффекты. Благодаря доставке непосредственно к клеткам, которые испытывают наибольшую потребность в лечении, эффект лечения будет реализован быстрее.

Существует несколько способов ингаляции различных типов, которые могут использоваться в связи с настоящим изобретением. Антагонисты, соответствующие настоящему изобретению, могут вводиться в состав ингаляционных лекарственных форм в основном трех различных типов. Во-первых, антагонисты, соответст вующие настоящему изобретению, могут вводиться в состав лекарственных форм с пропеллентами, имеющими низкую температуру кипения. Такие лекарственные формы вводятся, как правило, с помощью традиционных дозирующих ингаляторов (ΜΌΙ). Традиционные ингаляторы, однако, могут модифицироваться таким образом, чтобы повысить возможность получения повторных доз посредством использования технологии, которая позволяет измерять объем вдыхаемого воздуха и скорость потока воздуха у пациента, как обсуждается в патентах США № 5,404,871 и № 5,542,410.

В качестве альтернативы агонисты, соответствующие настоящему изобретению, могут вводиться в состав водных либо этаноловых растворов и доставляться с помощью традиционных распылителей. В более предпочтительном варианте, однако, подобные лекарственные формы в виде растворов аэрозолируются с помощью устройств и систем, таких как были раскрыты в патентах США № 5,497,763; № 5,544,646; № 5,718,222 и № 5,660,166.

И, наконец, соединения-агонисты, соответствующие настоящему изобретению, могут вводиться в состав сухих порошковых лекарственных форм. Такие лекарственные формы могут вводиться простым ингалированием упомянутой сухой порошковой лекарственной формы после превращения ее в аэрозольный порошковый туман. Описание технологии осуществления упомянутого приведено в патенте США № 5,775,320, который был выдан 7 июля 1988 г., и в патенте США № 5,740,794, который был выдан 21 апреля 1998 г.

В отношении каждого из вышеупомянутых патентов, заявители указывают, что в этих патентах цитируются другие публикации, посвященные внутрилегочной доставке лекарственных препаратов, и к подобным публикациям можно обращаться для выяснения конкретной методики, устройств и лекарственных форм, которые могли бы использоваться в связи с доставкой агонистов, соответствующих настоящему изобретению. В дополнение к этому, каждый из упомянутых патентов включен в настоящее описание как ссылка в полном объеме с целью раскрытия лекарственных форм, устройств, упаковок и методов доставки агонистических лекарственных форм, соответствующих настоящему изобретению.

Отборочные анализы

Подходящие лекарственные средства

Отборочные анализы могут использоваться для идентифицирования биоактивных подходящих средств, являющихся антагонистами ЕСЕ. Особый интерес отборочные анализы представляют для средств, имеющих низкую токсичность для человеческих клеток. С этой целью могут использоваться многочисленные разнообразные анализы, включая анализы ίη νίίτο связывания меченых белков, анализы по определению смещения электрофоретической подвижности, иммунологические анализы связывания белков и т.п. Очищенный ЕСЕ и ЕСЕ-К белок может также использоваться для определения объемной кристаллической структуры; эти данные могут использоваться для моделирования межмолекулярных взаимодействий, функций переносчика и т. п.

Упомянутый термин средство, использованный в этом описании, означает любую молекулу, например, белковую либо фармацевтического лекарственного средства, способную изменять либо угнетать физиологическую функцию ЕСЕ либо ЕСЕ-К. В общем, параллельному испытанию с различными концентрациями средства подвергается большое количество экспериментальных смесей для получения дифференцированной реакции на различные концентрации. Одна из этих концентраций, как правило, используется в качестве отрицательного контроля, т. е. при нулевой концентрации либо ниже уровня обнаружения.

Подходящие средства представлены многочисленными химическими классами, хотя, как правило, это органические молекулы, в предпочтительном варианте небольшие органические соединения, имеющие молекулярную массу более 50 Да и менее приблизительно 2500 Да. Подходящие средства включают функциональные группы, необходимые для структурного взаимодействия с белками, в частности, водородную связь, и, как правило, включают как минимум амино-, карбонильную, гидроксильную либо карбоксильную группу, в предпочтительном варианте как минимум две упомянутые функциональные химические группы. В состав подходящих средств часто входят циклические углеродные либо гетероциклические структуры и/или ароматические либо полиароматические структуры, замещенные одной либо несколькими вышеупомянутыми функциональными группами. Подходящими средствами могут быть также биомолекулы, в том числе пептиды, сахариды, жирные кислоты, стероиды, пурины, пиримидины, их производные, структурные аналоги либо комбинации.

Подходящие средства получают из самых разнообразных источников, в том числе из библиотек синтетических либо природных соединений. Например, имеются многочисленные способы произвольного либо прямого синтеза разнообразных органических соединений и биомолекул, включая экспрессию рандомизированных олигонуклеотидов и олигопептидов. В качестве альтернативы являются доступными либо легко получаются библиотеки природных соединений в виде экстрактов бактериального, грибкового, растительного либо животного происхождения. В дополнение к этому, библиотеки и соединения, полученные естественным либо синтетическим путем, легко модифицируются с помощью традиционных химических, физических и биохимических способов и могут использоваться для получения комбинаторных библиотек. Известные фармакологические средства могут подвергаться прямым либо произвольным химическим модификациям, таким как ацилирование, алкилирование, эстерификация, амидирование и т. п. для получения структурных аналогов.

В том случае, когда в качестве отборочного анализа используется анализ связывания, одна либо несколько молекул могут соединяться с меткой, причем упомянутая метка может прямо либо косвенно обеспечивать поддающийся обнаружению сигнал. К многочисленным существующим меткам относятся радиоизотопы, флуоресцирующие вещества, хемилюминесцирующие вещества, ферменты, специфические связывающие молекулы, частицы, например, магнитные частицы и т.п. Специфические связывающие молекулы представляют собой пары, такие как биотин и стрептавидин, дигоксин и антидигоксин и т.п. В случае специфических связывающих членов, комплементарный член должен, как правило, метиться молекулой, обеспечивающей обнаружение в соответствии с известными способами.

Отборочному анализу может подвергаться большое количество других реагентов. К их числу относятся такие реагенты, как соли, нейтральные белки, например, альбумин, детергенты и т. д., которые используются для облегчения оптимального связывания белков и/или снижения объема неспецифических либо фоновых взаимодействий. Могут использоваться реактивы, повышающие эффективность упомянутого анализа, такие как ингибиторы протеаз, ингибиторы нуклеаз, противомикробные средства и т.д. Смесь компонентов добавляется в любом порядке, обеспечивающем необходимое связывание. Инкубирование осуществляют при любой приемлемой температуре, как правило, в пределах от 4 до 40°С. Продолжительность инкубирования подбирают для обеспечения оптимальной активности, однако, ее можно также оптимизировать для облегчения проведения ускоренного высокопроизводительного отбора. Достаточным, как правило, оказывается промежуток времени от 0,1 до 1 ч.

Соединения, имеющие необходимую фармакологическую активность, могут вводиться в физиологически приемлемом носителе хозяину для лечения гиперсекреторного заболевания в лекарственных формах, описание которых здесь приводится. В зависимости от способа введения, упомянутые соединения могут включаться в состав лекарственных форм различными способами, описание которых здесь приводится. Концентрация терапевтически активного соединения в лекарственной форме может колебаться от приблизительно 0,1 до 100 мас.%.

Схема приема лекарственного средства

Соответствующая дозировка будет также изменяться в зависимости от ряда факторов, в том числе от природы субъекта, подлежащего лечению, конкретной природы гиперсекреторного состояния, подлежащего лечению, и его тяжести, природы антагониста ЕСР-Я, используемого в качестве активного ингредиента, способа введения, лекарственной формы и решения лечащего врача. Например, в случае введения самих антител, таких как анти-ЕСР либо ЕСР-Я, в виде лекарственной формы для инъекций, разовые дозы будут составлять в пределах от 20 до приблизительно 40 мг/кг. Может потребоваться повторное введение в течение нескольких дней либо введение посредством внутривенного вливания может быть непрерывным. При хронических состояниях введение может продолжаться в течение более длительных периодов времени, в зависимости от потребности.

Эффективность схемы приема лекарственного средства будет определяться посредством оценки улучшения функционирования легких у пациента. Эта оценка может включать определение упруговязкостных свойств мокроты, улучшения функционирования легких, включая повышение объема форсированного выделения мокрот и максимальной средней скорости выдыхаемого потока воздуха. Упомянутая лечебная схема может быть осуществлена в сочетании со вспомогательными методами лечения, такими как применение антибиотиков, дезоксирибонуклеазы I, или другими терапевтическими методами, используемыми в настоящее время для лечения гиперсекреторного легочного заболевания. Если антибиотики вводятся одновременно как часть лечебной схемы, количественное определение микрофлоры после завершения курса лечения может использоваться для оценки его эффективности по снижению бактериального роста, свидетельствующего о снижении вязкости слизи либо мокроты и повышении выведения слизи или мокроты из легких.

Опытным специалистам в данной области известны функциональные пробы легких, а также диагностические тесты для определения клинического прогрессирования легочного гиперсекреторного заболевания. Стандартные функциональные пробы легких включают определение сопротивления дыхательных путей (АЯ); форсированной жизненной емкости легких (РУС); индекса форсированного выдоха в 1 с (РЕУ(1)); средней форсированной скорости потока выдыхаемого воздуха; и пикового значения скорости потока выдыхаемого воздуха (РЕРЯ). К числу других функциональных проб легких относятся: анализ газа крови; реакции на лекарственные средства; провокационная проба и нагрузочная проба (тест на переносимость физической нагрузки); определение силы дыхательных мышц; волоконно-оптическое исследование дыхательных путей и т. п. Некоторые основные процедуры исследования свойств слизи включают определение реологических свойств, например, с помощью магнитного микрореометра; адгезивных свойств для определения сил притяжения между липкой поверхностью и адгезивной системой путем измерения краевого угла между каплей слизи и поверхностью. Перенос слизи ресничками может исследоваться с помощью традиционных способов, а также путем непосредственного измерения, например, коэффициента очищения слизи ίη δίΐιι. Разность трансэпителиальных потенциалов, т.е. суммарный результат активности системы переноса ионов легочным эпителием, может измеряться с помощью соответствующих микроэлектродов. Для определения состояния поверхности эпителия могут использоваться количественные морфологические методы.

Пациентом, подлежащим лечению, может быть примат, такой как человек, или же любое другое животное, демонстрирующее описанные симптомы. Несмотря на то, что способ, соответствующий настоящему изобретению, в особой степени приспособлен для лечения пациентачеловека, следует понимать, что настоящее изобретение также применимо и в ветеринарии.

Отборочные анализы ΐη νΐίΐΌ

В другом варианте осуществления настоящего исследования анализы ίη νίίτο используются для оценки терапевтического потенциала подходящих средств по угнетению пролиферации бокаловидных клеток, т. е. активны ли такие средства как антагонисты ЕСР. В общем, такие анализы будут включать следующие этапы: (1) контактирование модели пролиферации бокаловидных клеток ίη νίίτο с ЕСР либо его функциональным эквивалентом; (ίί) последующее контактирование упомянутой модели ίη νίίτο с подходящим средством; и (ш) оценка пролиферации бокаловидных клеток, где угнетение пролиферации бокаловидных клеток является показателем терапевтического потенциала подходящего средства.

Упомянутый анализ в предпочтительном варианте осуществляется с двумя контролями, где вторая группа клеток не контактирует ни с каким соединением, а третья контактирует с ЕСР, но не контактирует с упомянутым подходящим средством. После этого производится сравнение с целью определения степени воздействия ЕСР и упомянутого подходящего средства на клетки.

Может использоваться любая модель пролиферации бокаловидных клеток ίη νίίτο. В качестве примера, клетки трахеи крыс могут выделяться и культивироваться в соответствии с описанием, приведенным Газманом (Сихтаи) и другими, (1995), 217:412-419. Вкратце, клетки трахеи крыс высеваются на полупроницаемые мембраны, покрытые коллагеновым гелем; вначале упомянутые клетки культивируются с погружением в питательную среду, затем удерживаются на поверхности раздела воздух/жид кость. Примерами клеток ίη νίΐτο являются клетки бронхов зародыша человека (доступные от компании С1опеОс8, 8;·ιη Ωίοβο): клетки N01Н292 (Американская коллекция типовых культур (АТСС СКЬ-1848)); и клетки А431 (Американская коллекция типовых культур (АТСС СКЬ-1555)).

Упомянутая культура ίη νίίτο контактирует с ЕСЕ и с подходящим средством. Упомянутое подходящее средство может контактировать с культурой перед, одновременно либо после добавления ЕСЕ в зависимости от конечной точки, подлежащей оценке, и природы упомянутого подходящего средства. Культивируемые клетки оцениваются на угнетение пролиферации бокаловидных клеток относительно контролей.

Для оценки пролиферации бокаловидных клеток могут использоваться различные молекулярные либо биохимические маркеры. Примерами молекулярных либо биохимических маркеров, которые могут использоваться, являются, однако, ими не ограничиваются, характеристики экспрессии генов либо белков бокаловидных клеток. Некоторые муциновые гены, например, МиС5В (Дессин (Ле^еум) и другие, (1997), 1. Вю1. Сйет., 272:3168-3178) экспрессируются в дыхательных путях и имеют генный продукт, представленный в значительных количествах в слизи. Экспрессия муциновых генов обеспечивает подходящий маркер для определения продуцирования слизистого секрета.

Экспрессия муцинового гена может оцениваться с помощью традиционных методов, таких как метод назерн-блоттинга, полимеразно-цепьевая реакция (РСК.), исследование промотора муцинового гена либо анализ ίη δίΐιι. В соответствии с альтернативным вариантом муциновые белки оцениваются с помощью традиционных методов, таких как метод вестернблоттинга, твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А), иммунохимический метод и т.п., используя поддающиеся обнаружению меченные антитела. Для определения наличия либо отсутствия бокаловидных клеток в культуре могут использоваться также морфологические критерии, такие как окрашивание на муцины с помощью алциана голубого/периодной кислоты-Шиффова основания (АВ/РА8) (Лу (Ьои) и другие, (1998), Ат. 1. Кекрш СгЦ. Саге Меб.. 157:1927-1934). Антитела к муцину могут исследоваться с помощью иммуноферментного твердофазного анализа (ЕЬ18А). Поскольку стимулирование ЕСЕ-К лигандом, например, ЕСЕ, ТСЕ-α, индуцирует фосфорилирование специфической киназы рецептора ЕСЕ и вызывает продуцирование бокаловидных клеток, фосфорилирование ЕСЕ-К может оцениваться как отражение индуцирования бокаловидных клеток (Донато (ΌοηαΙο) и другие, (1984), 1. Вю1. Сйет., 264-20474-20481).

Снижение молекулярных или биохимических маркеров, связанное с пролиферацией бо каловидных клеток, является показателем терапевтического потенциала антагониста.

Модели ΐη νΐνθ

В соответствии с еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения, животные модели ίη νίνο используются для оценки терапевтического потенциала подходящих средств по угнетению пролиферации бокаловидных клеток. В общем, такой анализ включает следующие этапы:

(ί) получение животной модели гиперсекреторного легочного заболевания посредством индуцирования экспрессии ЕСЕ-К;

(ίί) стимулирование индуцированного ЕСЕ-К к продуцированию бокаловидных клеток, продуцирующих муцин;

(ш) обработка подходящим средством; и (ίν) оценка пролиферации бокаловидных клеток либо секреции слизи, где угнетение пролиферации бокаловидных клеток либо секреции слизи является показателем терапевтического потенциала подходящего средства.

Может использоваться любая модель гиперсекреторного легочного заболевания ίη νίνο. В качестве примера может быть приведена астматическая мышиная модель, соответствующая описанию, приведенному Теманн (Тетаηη) и другими, (1977), Ат. 1. Ке§р1г. Се11. Вю1., 16:471-478, и показанная в примерах, приведенных в настоящем описании. В соответствии с альтернативным вариантом может быть использована крысиная модель, соответствующая описанию, приведенному Такеямой (Такеуата) и другими, (1988), Ат. 1. РЬ.у8ю1. Примерами других животных моделей, которые могут быть использованы, являются, однако, ими не ограничиваются, морские свинки (виды, конституционально экспрессирующие бокаловидные клетки) и крысы.

Ткань легких либо ткань трахеи животных моделей может исследоваться с помощью тех же самых молекулярных и биохимических маркеров, описание которых было приведено для модели ίη νίΐτο. Снижение пролиферации бокаловидных клеток является показателем терапевтического потенциала упомянутого антагониста ЕСЕ-К.

Приведенные далее примеры представлены для того, чтобы снабдить среднего специалиста в данной области полным раскрытием и описанием того, как осуществить и использовать настоящее изобретение, и они не предназначены для ограничения объема того, что изобретатели рассматривают как свое изобретение, они также не служат свидетельством того, что приведенные эксперименты являются всеми либо единственно проведенными. Были предприняты усилия по обеспечению точности использованных цифровых данных (например, количество, температура), однако, следует учитывать возможность некоторых экспериментальных погрешностей и отклонений. При от сутствии иных указаний части являются массовыми частями, молекулярная масса является взвешенным средним значением молекулярной массы, температура приведена в градусах Цельсия и давление соответствует либо является близким к атмосферному.

Экспериментальная часть

Пример 1. Система ЕСР регулирует продуцирование муцина в дыхательных путях.

Гиперплазия бокаловидных клеток происходит при различных гиперсекреторных заболеваниях дыхательных путей, однако, поскольку неизвестны лежащие в основе механизмы, не существует и эффективных способов лечения. В здоровых дыхательных путях наблюдается небольшое количество бокаловидных клеток, в то время как при гиперсекреторных заболеваниях дыхательных путей происходит гиперплазия бокаловидных клеток. Изучали линию бронхиальных клеток человека (ΝΟΓΗ292). Эти клетки экспрессируют ЕСР-К конституционально; экспрессия гена ЕСР-К была дополнительно стимулирована альфа-фактором некротизации опухолевых клеток (ΤΝΒ-α). Лиганды ЕСР-К повышали синтез муцинов, и этот эффект усиливался при совместном инкубировании с ΤΝΕ-α.

Эпителиальные клетки дыхательных путей апатогенных крыс экспрессировали незначительное количество ЕСР-К белка, однако интратрахеальная инстилляция ΤΝΓ-α (200 нг) индуцировала ЕСР-К в базальных клетках, клетках-предшественниках бокаловидных клеток и бокаловидных клетках, но не в реснитчатых эпителиальных клетках; ΤΝΓ-α, ЕСР либо ТСР-α самостоятельно не индуцировали продуцирования бокаловидных клеток. Однако инстилляция ΤΝΓ-α, с последующим введением лигандов ЕСР-К, вызывала повышение числа бокаловидных клеток и клеток-предшественников бокаловидных клеток, поразительное усиление позитивного окрашивания алцианом голубым/периодной кислотой-Шиффовым основанием (АВ/РА8) (отражавшее гликоконъюгаты слизи) и экспрессии муцинового гена МИС5. У сенсибилизированных крыс следствием введения овальбумина являлось продуцирование бокаловидных клеток и экспрессия ЕСР-К в эпителии дыхательных путей. В клетках ΝΟН292, у крыс, стимулированных ΤΝΒ-α с последующим введением лигандов ЕСР-К, и у астматической крысиной модели предварительная обработка ингибитором тирозинкиназы ЕСР-К (ΒΙΒΧ 1522) предотвращала продуцирование бокаловидных клеток в дыхательных путях. Эти данные демонстрируют роль ингибиторов каскада ЕСР-К при гиперсекреторных заболеваниях дыхательных путей.

Методы исследования ш νίΐΐΌ

Культура клеток. Линию клеток слизеобразующего плоскоклеточного рака легких чело века, ΝΟ-Η292, выращивали в питательной среде КРМ1 1640, содержащей 10% сыворотки зародыша крупного рогатого скота, пенициллин (100 Ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), при температуре 37°С в 5% СО₂-инкубаторе с водяной рубашкой. После слияния клетки инкубировали с ЕСР (рекомбинантный человеческий ЕСР, 25 нг/мл, компания Сеи/уше, СатЬгИде, штат Массачуссетс), ΤΟ^α. (рекомбинантный человеческий ΤСΓ-α, 25 нг/мл, компания Сеи/уте), ΤΝ^α (рекомбинантный человеческий ΤΝΒ-α, 20 нг/мл, компания Сеи/уте), ЕСР (25 нг/мл) плюс ΤΝΒ-α (20 нг/мл) либо ТСР-α (25 нг/мл) плюс ΤΝΒ-α (20 нг/мл) в течение 12 ч, 24 ч либо 48 ч. При исследовании ингибирования ингибитором тирозинкиназы ЕСР-К, ΒΙΒΧ 1522 (10 мкг/мл, любезно предоставленным компанией ВоеНгищег 1идеШе1т 1ис., 1идеШе1т, Германия), клетки предварительно обрабатывали ΒΙΒΧ 1522 за 30 мин до добавления факторов роста. После инкубирования клетки, которые выращивались в матрасе Т-75, использовали для полного экстрагирования РНК либо экстрагирования белка, и для визуализации муцина посредством окрашивания ΑΒ/РАЗ использовали 8-камерные предметные стекла.

Вестерн-блоттинг. Клетки, выращивавшиеся в матрасах Т-75, лизировали и соскребали в забуференный фосфатом физиологический раствор (ΓΒ8), содержащий 1% Тритона X, 1% диоксиколата натрия и фенилметилсульфонилфторид (РМ8Р) (10 мг/мл). Общее количество белка определяли с помощью аналитического белкового реактива ВСА (компания Р1егсе, КоскГогб, штат Иллинойс). Клеточные лизаты кипятили с трициновым буфером для образца и 2% β-меркаптоэтанола фМЕ) при температуре 95°С. Белки отделяли посредством электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (8Э8-РАСЕ) в 8% акриламидных гелях. Полученные гели уравновешивали в гибридизационном буфере: 25 мМ Трис-буфер-НС1, 192 мМ глицин, 20% (в объемном отношении) метанол, рН 8,3. После этого полученные белки посредством электрофореза переносили на нитроцеллюлозные мембраны. После этого упомянутые мембраны инкубировали в течение 1 ч в 5% снятом обезжиренном молоке в РΒ8, содержащем 0,05% Твин 20. Затем упомянутые мембраны инкубировали с моноклональным мышиным анти-ЕСР-К антителом (1:100) при температуре 4°С в течение ночи. Визуализацию связанных антител осуществляли по стандартным протоколам метода с использованием комплекса авидин-биотин-щелочная фосфатаза (набор АВС, компания УесЮг ЬаЬогаЮпек). В качестве позитивного контроля для ЕСР-К использовали клеточные лизаты клеток А431 (20).

Иммуноцитохимическая локализация ЕСРК в клетках Νί.Ί-Η292. Клетки, выращенные на

8-камерных предметных стеклах, фиксировали с помощью 4% параформальдегида в течение 1 ч. При окрашивании на ЕСЕ-К, в качестве разбавителя для антитела использовали РВ8, который включал 0,05% Твин 20, 2% нормальную козью сыворотку и 2 мМ левамизол. Гистологические срезы инкубировали с мышиным моноклональным антителом к ЕСЕ-К (1:250) в течение ночи при температуре 4°С, после чего трижды промывали РВ8 для удаления излишка основного антитела. После этого клетки инкубировали с биотинилированным лошадиным антимышиным иммуноглобулином (компания νοοΙοΓ ЬаЬога1опе5, Виг1шдате, штат Калифорния) в разведении 1:200 в течение 1 ч при комнатной температуре. Визуализацию связанных антител осуществляли по стандартным протоколам метода с использованием комплекса авидин-биотинщелочная фосфатаза (набор АВС, компания νοοΙοΓ ЬаЬога1опе8, Виг1тдате, штат Калифорния).

Зонды. Экспрессию мРНК ЕСЕ-К определяли с помощью линеаризованного рТКГЕСЕК-мРНК-зонда человека (компания Λιηόίοη, Λιΐδΐίη, штат Техас). В состав этого зонда входит 360 п.н. фрагмент кДНК человеческого гена ЕСЕ-К, который стягивает экзоны 12-14. Экспрессию гена МИС5 определяли с помощью человеческого зонда МИС5АС, в состав которого входит 298 п. н. фрагмент кДНК человеческого гена МИС5АС (любезно предоставленный доктором Карол Басбаум (Саго1 ВакЬаит)).

Назерн-блоттинг. Общую РНК экстрагировали из клеток ΝΟΙ-Η292, выращенных в матрасе Т-75 для культивирования тканевых культур, с помощью реактива Тп-КеадегИ (компания Мо1еси1аг КекеагсЬ СТг, ΟίηοίηηηΐΓ штат Огайо) в любом состоянии. Общую РНК (10 мкг) подвергали электрофорезу на 1% агарозно/формальдегидном геле и посредством гибридизации путем пассивной диффузии в капиллярах переносили на нейлоновую мембрану (компания АтегхНат, Л^1^пдιοп ^ίβΙιΚ штат Иллинойс). Полученные зонды метили с помощью ³²Р, используя набор Капάοт Рптеб ЭХА 1аЬе1тд кН (компания Воейгтдег МамиНет! С о гр., Ιηά.ίηηηρο1ί8, штат Индиана). Блоты подвергали предварительной гибридизации при температуре 42°С в течение 4ч с последующей гибридизацией при температуре 42°С в течение 16 ч с ³²Р-меченым специфическим кДНК зондом. В состав гибридизационного раствора входил 250 мМ Трис-буфер-НС1 (рН 7,5), 5% додецилсульфат натрия, 1% сывороточный альбумин крупного рогатого скота (В8А), 1% поливинилпирролидон, 1% фиколл и 0,5% пирофосфат натрия. После гибридизации упомянутые мембраны дважды промывали 2х88С (цитрат Ν;·ι+Ν;·ιΟ.Ί) с 0,1% додецилсульфата натрия в течение 30 мин при комнатной температуре, затем дважды промывали 2х88С (цитрат №+№С1) с 0,1% додецилсульфата натрия в течение 30 мин при температуре 50°С и прополаскивали 1х88С с 0,1% додецилсульфата натрия. Мембраны экспонировали на рентгеновскую пленку.

Исследования ίη νίνο

Протокол проведения экспериментов на животных был одобрен Комитетом по проведению исследований на животных (СотпиНее οη Ашта1 КехеагсН) Калифорнийского университета, Сан-Франциско. Специальных апатогенных крыс-самцов линии Е344 ЕЪНег массой 230-250 г (компания 8ίιηοη^η ЬаЬогаФпек, СПгоу, штат Калифорния) содержали в помещении с контролируемой температурой (21°С) со свободным доступом к стандартному лабораторному корму и воде.

Здоровые крысы. Крыс анестезировали метогекситалом натрия (бревитал натрия, 50 мг/кг, внутрибрюшинно; компания Е11 Ы11у&Со., Ιηάί;·ιη;·ιρο1ί5, штат Индиана) при спонтанном дыхании. Для определения, активирует ли ΤΝΡ-α ЕСЕ-К в дыхательных путях, ΤΝΡ-α (200 нг, 100 мкл) вводили малыми дозами в трахею и животных забивали через 24 ч. Для проверки, индуцировались ли бокаловидные клетки в эпителии дыхательных путей с помощью ЕСЕ либо ΤΝΓ-α, ЕСЕ (600 нг, 100 мкг) либо ТСЕ-α (синтетический крысиный ТСЕ-α, 250 нг, 100 мкл; компания 8|дта, 8ΐ. Ьошк, штат Миссури) вводили малыми дозами в трахею самостоятельно либо через 24 ч после введения ΤΝΡ-α (200 нг, 100 мкл) малыми дозами, и животных забивали через 48 ч. При проведении каждого эксперимента в трахею в качестве контроля малыми дозами вводили стерильный РВ8 (100 мкг). Для подтверждения того, что продуцирование муцина было вызвано активацией ЕСЕ-К, нами было проверено воздействие ингибитора тирозинкиназы ЕСЕ-К, ВШХ 1522 (доза определялась по результатам исследований с использованием упомянутого ингибитора для предотвращения роста раковой опухоли). Крыс предварительно обрабатывали ВШХ 1522 (3 мг/кг, 10 мг/кг либо 30 мг/кг, внутрибрюшинно) за 1 ч до и через 24 ч после введения ТСЕ-α. Трахеи и легкие удаляли для проверки через 48 ч после введения ТСЕ-α.

Сенсибилизированные крысы

Сенсибилизация. Крыс сенсибилизировали на 0 день и 10 день посредством внутрибрюшинного впрыскивания овальбумина (10мг, ν класс чистоты, компания 81дта, 8ΐ. Ьошк, штат Миссури) в комплексе со 100 мг гидроксида алюминия в 0,5 мл стерильного физиологического раствора. После этого крысы находились в покое в течение 10 дней. На 20 день овальбумин вводили непосредственно в трахею; животных трижды (20 день, 22 день и 24 день) провоцировали (интратрахеальная инстилляция) 100 мкл 0,1% раствора овальбумина в физиологическом растворе. Крыс забивали либо без постановки провокационной пробы (20 день), либо через 48 ч после постановки третьей провокационной пробы (26 день). Следствием этой процедуры явилась метаплазия бокаловидных клеток. Для блокирования гиперплазии бокаловидных клеток, сенсибилизированных крыс предварительно обрабатывали ингибитором тирозинкиназы ЕСР-В, В1ВХ 1522. В дни овальбуминовой провокационной пробы (20 день, 22 день и 24 день) сенсибилизированных крыс предварительно обрабатывали В1ВХ 1522 (10 мг/кг, внутрибрюшинно, за 1 ч до постановки провокационной пробы), после чего В1ВХ 1522 вновь вводили малыми дозами в трахею вместе с овальбумином (В1ВХ 1522, 10^-5М, 100 мкл). Кроме того, В1ВХ 1522 впрыскивали крысам внутрибрюшинно через каждые 24 ч до дня забоя животных. После того как животные были забиты, трахеи удаляли через 48 ч после третьей провокационной пробы.

Подготовка тканей. В предварительно определенные моменты времени в процессе анестезирования осуществляли перфузию системы кровообращения 1% раствором параформальдегида в РВ8, обработанном диэтилпирокарбонатом (ПЕРС) при давлении 120 мм рт.ст. После этого трахею удаляли и выдерживали в 4% растворе параформальдегида в течение 24 ч. После завершения фиксирования трахеи и легкие заливали 1В-4 плюс мономерный раствор А для анализа клеток либо составом О.С.Т. (компания 8акига Рше1ек И.8.А., 1пс., Тоггапсе, штат Калифорния) для проведения иммуногистохимических исследований и для гибридизации ш δίΐιι. Из залитых тканей получали поперечные гистологические срезы (толщиной 4 мм) и помещали их на предметные стекла.

Анализ клеток. Мы производили подсчет общего количества эпителиальных клеток путем подсчета ядер эпителиальных клеток на 2 мм собственной пластинки слизистой оболочки с помощью иммерсионных объективов (1000х увеличение). Линейную длину собственной пластинки слизистой оболочки под каждым участком эпителия, подвергавшимся анализу, определяли посредством записи контура оцифрованного изображения собственной пластинки слизистой оболочки. После инстилляции стимулирующих агентов возникают проявляющиеся бокаловидные клетки. Эти клетки имеют АВ/РА8-позитивные гранулы, однако размер гранул небольшой и количество цитоплазматических гранул незначительно. Мы называем эти проявляющиеся бокаловидные клетки клетками-предшественниками бокаловидных клеток, эта стадия предшествует превращению упомянутых клеток в зрелые бокаловидные клетки. Бокаловидные клетки высокие, кубоидные, имеют форму от бокаловидной до низкостолбчатой и включают большое количество АВ/РА8-окрашенных гранул, заполняющих большую часть цитоплазмы между ядром и поверхностью полости. Клетки-предшественники бокаловидных клеток определяются как клетки с меньшей площадью окрашенной слизи (<1/3 высоты в эпителии от базальной мембраны до поверхности просвета) либо с рассеянными и слегка АВ/РА8-окрашенными гранулами небольшого размера. Реснитчатые эпителиальные клетки распознаются по их реснитчатым краям, слегка окрашенной цитоплазме и большим круглым ядрам. Негранулированные секреторные клетки имеют столбчатую форму и протягиваются от просвета до собственной пластинки слизистой оболочки. Цитоплазма окрашивается в светло-розовый цвет и в ней наблюдается несколько крошечных РА8-позитивных и АВнегативных гранул. Базальные клетки представляют собой небольшие уплощенные клетки с крупными ядрами, расположенные непосредственно над собственной пластинкой слизистой оболочки, но не достигающие просвета дыхательных путей.

Количественное определение продуцируемых бокаловидных клеток. Продуцирование бокаловидных клеток определяли по объемной плотности окрашенных алцианом голубым/РА8 слизистых субстанций на слизистой поверхности эпителия, используя полуавтоматическую систему отображения, описание которой было приведено в литературных источниках (Вебер (^еЬег) и другие, (1984), 8аепсе, 224:294-297). Мы измеряли площадь, позитивно окрашенную алцианом голубым/РА8, и общую площадь эпителия, и выражали полученные данные в виде процента от общей площади, окрашенной алцианом голубым/РА8. Анализ производили с помощью находящейся в государственной собственности программы 1таде Национального института здоровья США (разработанной в Национальном институте здоровья США и общедоступной из сети Интернет по протоколу РТР по адресу /|рру.шт11.доу. либо на гибком диске от компании №-11юпа1 Тес1нпса1 1пГогтайоп 8егу1се, 8рппдПе1б. штат Вирджиния, шифр компонента РВ95-500195СЕ1).

Иммуногистохимическая локализация ЕСР-В в эпителии крыс. Локализацию ЕСР-В проверяли посредством иммуногистохимического окрашивания антителом к ЕСР-В (компания Са1Ьюсйет, 8ап П1едо, штат Калифорния) на замороженных гистологических срезах трахеи крыс. После перфузии 1% раствором параформальдегида в РВ8, ткани выдерживали в 4% растворе параформальдегида в РВ8 в течение 1 ч, после чего помещали в 30% раствор сахарозы для криозащиты в течение ночи. Трахеи заливали составом О.С.Т. (компания 8акцга Ппе1ек И.8.А., 1пс., Тоггапсе, штат Калифорния) и замораживали. Замороженные гистологические срезы (5 мкм) разрезали и помещали на стеклянные предметные стекла (компания 8ирегГго§1 Р1ц§, РШег 8аеп1Шс, РШьЬигдЦ штат Пенсильвания). Иммунологическое окрашивание осуществляли так же, как и при проведении исследований ш νΐΐΐΌ.

Получение зондов. кДНК для МИС5 крыс была щедро предоставлена доктором Карол Басбаум (Саго1 ВакЬаит). 320 п.н. фрагмент кДНК МИС5 крыс субклонировали в сайте ХЬа/ΙιίηάΙΙΙ упомянутого транскрипционного вектора, рВ1ие8Спр1-§К(-) (компания 81га1адепе, Ьа Ло11а. штат Калифорния). Для получения РНК-зондов для гибридизации ίη δίΐιι эту рекомбинантную плазмиду, в состав которой входил фрагмент кДНК МиС5 крыс, переводили в линейную форму и транскрибировали ίη νίΐΐΌ с Т7 либо Т3 полимеразой для получения антисмыслового либо смыслового зонда, соответственно. Упомянутые зонды для гибридизации ίη δίΐιι получали в присутствии [³⁵8]ИТР (уридин-5'трифосфат). После транскрибирования кДНК матрицу расщепляли с помощью дезоксирибонуклеазы, меченую радиоактивным изотопом РНК очищали на колонке 8ерйабех С-25 Ошск 8ршТМ (компания Воейппдег Маппйепп, Ιηάίηπаройк, штат Индиана) и осаждали в растворе этанола/ацетата аммония. Перед использованием РНК-зонды промывали 70% этанолом и разбавляли в 10 мМ ΌΤΤ (дитиотреитол).

Гибридизация ш δίΐιι. Замороженные гистологические срезы (5 мкм) разрезали и помещали на положительно заряженные стеклянные предметные стекла (компания ЗирегГгоЧ Р1н5. Р18Йег 8с1еп11Г1с, РййЬигдй, штат Пенсильвания). Гистологические срезы, нарезанные в непосредственной взаимной близости, использовали для гибридизации со смысловыми и антисмысловыми зондами. Чередующиеся гистологические срезы использовались для окрашивания алцианом голубым/РА8. Образцы повторно фиксировали в 4% растворе параформальдегида, регидратировали в 0,5х88С, после чего ацетилировали в триэтаноламине с помощью уксусного ангидрида. Гибридизацию осуществляли с 25003000 имп/мкл антисмыслового либо смыслового зонда в смеси, включавшей 50% раствор деионизированного формамида, 0,3М №С1, 20 мМ Трис-буфера, 5 мМ этилендиаминтрифторуксусной кислоты (ЕИТА), 1храствор Денхардта, 20 мМ дитиотреитола, 10% раствор сульфата декстрана, 0,5 мг/мл дрожжевой тРНК и 0,5 мг/мл обработанной ультразвуком ДНК молок лососевых при температуре 55°С в течение ночи. Постгибридизационная обработка включала промывки 2х88С, 1 мМ этилендиаминтрифторуксусной кислоты, 10 мМ β-меркаптоэтанола при комнатной температуре, инкубирование с раствором рибонуклеазы (20 мг/мл) в течение 30 мин при комнатной температуре, и дополнительные промывки в 0,1х88С, 1 мМ этилендиаминтрифторуксусной кислоты, 10 мМ βмеркаптоэтанола при температуре 55°С в течение 2 ч, затем в 0,5х88С при комнатной температуре. Образцы дегидратировали, сушили на воздухе и покрывали ядерной фотоэмульсией Кобак №Т (компания Еак!тап Кобак, Восйейег, штат Нью-Йорк) для авторадиографии. После экспонирования в течение 7-21 дня при температуре 4°С слайды проявляли, закрепляли и подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином (21).

Статистика. Все данные выражены в виде среднего значения±средняя квадратическая ошибка среднего. Для определения статистически значимых различий между группами прибегали к однофакторному дисперсионному анализу. После определения статистической значимости в дисперсионном анализе, для корректирования на множественность сравнений использовали Р-критерий Шеффа (8сйеГГе). Вероятность менее 0,05 для основной гипотезы принималась как свидетельство статистически значимого различия.

Результаты

Т№-а стимулирует продуцирование ЕСВВ в клетках N0-4292. Вначале мы определили, экспрессируют ли клетки ΝΟ-Β292 ЕСР-В конституционально. Анализ иммуноблотов методом вестерн-блоттинга позволил определить присутствие ЕСР-В белка в слившихся культурах клеток ΝΟ-Β292 (фиг. 1А, справа). Клетки проверялись после начала слияния. Лизаты подвергались электрофорезу в 8% акриламидных гелях и блотировались анти-ЕСР-В антителом. Молекулярные массы маркерных белков приведены с правой стороны. В качестве положительного контроля ЕСР-В использовали белок клеток А431 (фиг. 1А, слева), который экспрессирует ЕСР-В конституционально (Вебер (^еЬег) и другие, см. выше). Иммуноцитохимические исследования с анти-ЕСР-В антителом выявили позитивное окрашивание, что было крайне неожиданно у делящихся клеток (фиг. 1В, Иммуноцитохимический анализ культур клеток ΝΓΊН292 с помощью анти-ЕСР-В антитела). При слиянии наблюдалось позитивное окрашивание, наиболее сильно выраженное у делящихся клеток (стрелки, правая сторона). При отсутствии главного антитела окрашивание отсутствовало (левая сторона). Назерн-блоттинг показал, что Т№-а (20 нг/мл) активировал экспрессию гена ЕСР-В, эффект, который присутствовал в 12 ч и возрастал к 24 ч (фиг. 1С, Назерн-блоттинг ЕСР-В в клетках ΝΟ-Β292). Анализу подвергали общую РНК, экстрагированную из слившихся культур, инкубированных с ΊΝΓ-α (20 нг/мкл) в течение 12 ч либо 24 ч. Полученную РНК подвергали электрофорезу на формальдегид-агарозном геле, переносили на найлоновую мембрану и гибридизовали с ³²Р-меченым ЕСРВ кДНК-зондом. После гибридизации упомянутую мембрану промывали и авторадиографировали.

Лиганды ЕСР-В стимулируют экспрессию слизистых гликоконъюгатов и экспрессию гена

МиС5 в клетках Νί.Ί-Η292. ЕСЕ-К экспрессируются в клетках N0-4292 конституционально, поэтому мы оценивали способность лигандов ЕСЕ-К (ЕСЕ, ТСЕ-α) индуцировать продуцирование слизистых гликоконъюгатов (Фиг. 2, верхняя колонка, окрашивание клеток ΝΟ-Η292 алцианом голубым/ΡΑδ для идентификации муциновых гликопротеинов). Верхняя колонка=инкубирование клеток без ингибитора; нижняя колонка=инкубирование в присутствии ингибитора тирозинкиназы ЕСЕ-К В1ВХ 1522 (10 мкг/мл). В случае, когда клетки инкубировались самостоятельно (контроль), наблюдалось некоторое ΡΑδ-позитивное окрашивание (стрелки, верхняя колонка); инкубирование только с ΤNΕα (20 нг/мл) не влияло на окрашивание; инкубирование с ЕСЕ (25 нг/мл) либо с ТСЕ-α (25 нг/мл) усиливало ΡΑδ-позитивное окрашивание (стрелки); инкубирование с Τ№·α плюс ТСЕ-α значительно усиливало окрашивание (стрелка, верхняя колонка).

Наблюдалось окрашивание некоторых контрольных клеток; инкубирование только с ΤΝΡ-α (20 нг/мл) не влияло на окрашивание; инкубирование с ЕСЕ либо с ТСЕ-α (каждого по 25 нг/мл) усиливало ΡΑδ-позитивное окрашивание (стрелки); инкубирование с ТОТ-α плюс ТСЕ-α усиливало окрашивание в значительно большей степени, чем самостоятельно с любым из лигандов. Таким образом, лиганды ЕСЕ-К индуцируют слизистые гликоконъюгаты в клетках ΝΟ-Η292.

Для проверки экспрессии гена МИС5 осуществляли назерн-блоттинг (фиг. 3). Общую РНК (10 мкг) экстрагировали из упомянутых клеток, подвергали электрофорезу на формальдегид-агарозном геле, переносили на найлоновую мембрану и гибридизовали с ³²Р-меченым МиС5 кДНК-зондом. После гибридизации упомянутую мембрану промывали и авторадиографировали. Культуры были получены только с питательной средой (С); определяли воздействие ЕСЕ или ТСЕ-α (25 нг/мл), Т№-ц (20 нг/мл) либо комбинации ТКР-'7. плюс ЕСЕ либо ТСЕ-α в течение 12 ч (верхняя колонка) либо 24 ч (нижняя колонка) на экспрессию гена МИС5. Были также получены культуры с ТОТ-α плюс ЕСЕ или ТСЕ-α после предварительного инкубирования с ингибитором тирозинкиназы ЕСЕК (В1ВХ 1522; 10 мкг/мл; нижняя колонка); упомянутый ингибитор предотвращал экспрессию гена МИС5.

Клетки ΝΟ-Η292 продемонстрировали некоторую степень экспрессии в контрольном состоянии (фиг. 3, нижняя левая колонка); в случае, когда упомянутые клетки инкубировались с ЕСЕ либо ТСЕ-α, экспрессия гена МИС5 едва распознавалась в 12 ч, однако была четко выражена в 24 ч. ТОТ-α самостоятельно не влиял на экспрессию гена МИС5, однако, при добавлении ТКР-'7. к клеткам, инкубировавшимся с лиган дами ЕСЕ-К, экспрессия гена МИС5 явно усилилась, превысив уровень, вызывавшийся только лигандом ЕСЕ-К (фиг. 3).

Ингибитор тирозинкиназы ЕСЕ-К (В1ВХ 1522) предотвращает экспрессию гликоконъюгатов слизистого секрета и экспрессию гена МИС5 в клетках ΝΟ-Η292. Для проверки гипотезы, суть которой заключалась в том, что активация рецепторов ЕСЕ-К индуцирует экспрессию гена МИС5, клетки инкубировали с ингибитором тирозинкиназы ЕСЕ-К В1ВХ 1522. В случае предварительной обработки клеток ΝΟΙΗ292 В1ВХ 1522 (10 мкг/мл), ΡΑδ-позитивное окрашивание ингибировалось в контрольном состоянии, а повышенное окрашивание, происходившее с лигандами ЕСЕ-К, угнеталось в значительной степени (фиг. 2, нижняя колонка). В случае назерн-блоттинга экспрессия гена МИС5, которая была значительно повышена комбинацией ТОТ-α плюс ЕСЕ либо плюс ТСЕα, полностью угнеталась в случае предварительного инкубирования с В1ВХ 1522 (фиг. 3, нижняя колонка). Эти результаты свидетельствуют о причастности активации ЕСЕ-К к индукции муцинового гена и слизистых гликопротеинов в клетках Νί.Ί-Η292.

ТКР-'7. стимулирует продуцирование ЕСЕК у крыс. Исследованию подвергали апатогенных крыс (которые конституционально имели незначительное количество бокаловидных клеток в эпителии дыхательных путей), начиная с роли ΤNΕ-α. В контрольном состоянии эпителий трахей имел незначительное количество ЕСЕ-К-положительных клеток (фиг. 4 А, слева). Однако интратрахеальная инстилляция ΤNΕ-α (200 нг) индуцировала ЕСЕ-К белок у клеток различных типов в эпителии трахей (фиг. 4А, справа). ЕСЕ-К-позитивное окрашивание наблюдалось у бокаловидных клеток (С), клетокпредшественников бокаловидных клеток (Ρ-С), негранулированных секреторных клеток (8) и у базальных клеток (Ва), однако отсутствовало у реснитчатых эпителиальных клеток. Таким образом, ΤNΕ-α индуцирует продуцирование ЕСЕК белка.

Роль лигандов ЕСЕ-К в продуцировании слизистых гликоконъюгатов и экспрессии гена МИС5 у крыс. В контрольном состоянии в эпителии трахеи находилось незначительное количество бокаловидных клеток и клетокпредшественников бокаловидных клеток. Интратрахеальная инстилляция лигандов ЕСЕ-К, ЕСЕ (600 нг; не показано) либо только ТСЕ-α (250 нг; табл. 1), не влияла на продуцирование эпителием слизистых гликоконъюгатов. Однако в том случае, когда первым вводился ТКР-г/. (200 нг), с последовавшим через 24 ч введением ЕСЕ или ТСЕ-α (табл. 1), и животных забивали через 48 ч, окрашивание алцианом голубым/ ΡΑ8 значительно усиливалось и количество бокаловидных клеток и клеток-предшественников бокаловидных клеток значительно возрастало без изменения общего количества клеток либо количества реснитчатых эпителиальных клеток (табл. 1). При гибридизации ίη δίΐιι экспрессии гена МиС5 у контрольных животных не наблюдалось. При интратрахеальной инстилляции ΤΝΕ-α с последующим введением ЕСЕ или ТСЕ-α в эпителии наблюдалась экспрессия МиС5. Таким образом, только индуцирование

ЕСЕ-К либо только стимуляция лигандами ЕСЕК была недостаточной для индуцирования метаплазии бокаловидных клеток либо для продуцирования слизистых гликоконъюгатов. Однако после индуцирования ЕСЕ-К с помощью Τ№-α, инстилляция лигандов ЕСЕ-К вызвала существенную стимуляцию метаплазии бокаловидных клеток.

Таблица 1. Анализ клеток эпителия трахеи

Сенсибилизация овальбумином
Тип клеток	контроль	ТСЕ-α	ΤΝΡ-α/ ТСЕ-α	только внутрибрюшинно	внутрибрюшинно +интратрахеально
Бокаловидные клетки	2,8±0,7	5,8±1,2	28,8±3,4	5,4±1,5	38,2±6,3*
Клетки-предшественники бокаловидных клеток	7,8±1,3	12,8±1,6	44,8±3,6*	13,8±1,4	36,0±6,3*
Секреторные клетки	82,0±2,0	72,2±4,0	40,8±2,4*	67,6±7,0	49,8±4,2
Реснитчатые эпителиальные клетки	49,6±2,0	54,6±2,3	53,2±1,8	56,4±3,8	52,4±7,1
Базальные клетки	57,8±2,6	56,8±2,3	43,0±3,5	60,2±3,4	59,8±2,9
Неопределенного типа	1,4±0,5	2,0±0,4	0,8±0,4	1,4±0,2	2,6±0,5
Итого	201,4±2,2	204,2±3,3	211,4±4,8	204,8±6,6	238,8±4,4*
% АВ/РА8-окрашенной площади	2,4±0,8	6,8±1,9	35,8±4,2*	7,8±2,9	38,7±6,2*

Таблица 1. Влияние медиаторов и сенсибилизации овальбумином на эпителиальные клетки трахеи у крыс. Клетки анализировали, как описано в разделе Методы; пять крыс на группу. При определении свойств прибегали к окрашиванию алцианом голубым (АВ)/РА8 (последнее сочетание окрашивает слизистые гликоконъюгаты). В дополнение к подсчету клеток, определяли процент АВ/РА8-окрашенной площади от общей площади эпителия. В контрольных дыхательных путях и дыхательных путях, стимулированных только ТСЕ-α (250 нг), находилось небольшое количество бокаловидных клеток и клеток-предшественников бокаловидных клеток; наблюдалось незначительное окрашивание АВ/РА8. Результатом введения ΤΝΡ-α (200 нг) с последующим введением ТСЕ-α явилось повышенное количество бокаловидных клеток и клеток-предшественников бокаловидных клеток, а также увеличение площади, занятой АВ/РА§-окрашенными клетками. Сенсибилизация крыс овальбумином (ОУА) внутрибрюшинно (ίρ) не влияла ни на распределение клеток, ни на АВ/РА8-окрашивание, однако, в том случае, когда вначале ОУА вводили внутрибрюшинно, а затем осуществляли интратрахеальную инстилляцию, наблюдалось весьма интенсивное возрастание числа бокаловидных клеток и клеток-предшественников бокаловидных клеток, а также резкое увеличение АВ/РА8окрашенной площади (%).

Сенсибилизация крыс овальбумином индуцирует ЕСЕ-К и продуцирование бокаловидных клеток. Поскольку, как сообщается, смерть от острого астматического приступа наступает вследствие закупорки дыхательных путей слизью, модель астмы воспроизвели на апатогенных крысах. Инъекции овальбумина (10 мг, внутрибрюшинно) на 0 день и 10 день не стимулировали гиперплазии бокаловидных клеток (табл. 1). Однако в случае, когда за этим следовали три интратрахеальные инстилляции овальбумина (0,1% в 100 мкл) на 20 день, 22 день и 24 день и животных забивали на 26 день, количество бокаловидных клеток и клеток-предшественников бокаловидных клеток было значительно увеличено; количество реснитчатых эпителиальных клеток и базальных клеток осталось неизменным (табл. 1, правая сторона). Иммуногистохимические исследования с антиЕСЕ-К антителом продемонстрировали отсутствие окрашивания в контрольных трахеях. У животных, сенсибилизированных как внутрибрюшинно, так и интратрахеально, наблюдалось избирательное окрашивание ЕСЕ-К (фиг. 4В, слева) в клетках, которые положительно окрашивались АВ/РА8 (фиг. 4В, справа). После трех интратрахеальных инстилляций овальбумина (0,1%, 100 мл) иммунореактивность ЕСЕ-К была сильно выраженной у бокаловидных клеток и у клеток-предшественников бокаловидных клеток (внизу слева), т.е. у тех же самых клеток, которые положительно окрашивались алцианом голубым/РА8 (внизу справа). Таким образом, овальбуминовая модель астмы продемонстрировала пролиферацию бокаловидных клеток в клетках, которые продуцировали ЕСЕ-К.

Ингибитор тирозинкиназы ЕСЕ-К (В1ВХ 1522) предотвращает продуцирование бокаловидных клеток, индуцированное инстилляцией

ΤΝΕ-α плюс лиганды ЕСЕ-К и сенсибилизацией овальбумином у крыс. Поскольку ΒΙΒΧ 1522 предотвращал продуцирование муцина культивированными клетками, влияние этого ингибитора исследовали на апатогенных крысах. Окрашивание алцианом голубым/РА8, усиливавшееся интратрахеальной инстилляцией ΤΝΕ-α с последующим введением лиганда ЕСЕ-К ТСЕα, угнеталось дозозависимым образом в случае предварительной обработки ΒΙΒΧ 1522 (3-30 мг/кг, внутрибрюшинно; фиг. 5А). Следствием интратрахеальной инстилляции ТК’Е-а (для индуцирования ЕСЕ-К) и последующего введения лиганда ЕСЕ-К ТСЕ-α явилась весьма интенсивная метаплазия бокаловидных клеток.

У крыс, сенсибилизированных овальбумином, предварительная обработка ΒΙΒΧ 1522 (10 мг/кг, внутрибрюшинно) полностью подавляла продуцирование бокаловидных клеток (оценивалось по окраске алцианом голубым/РА8; фиг. 5В). У животных, которым овальбумин вводили внутрибрюшинно, наблюдалось незначительное ΑΒ/ΡΑδ-позитивное окрашивание бронхиального эпителия. У животных, вначале сенсибилизированных ОУА внутрибрюшинно, с тремя последующими интратрахеальными инстилляциями ОУА, наблюдалось явно выраженное усиление ΑΒ/ΡΑδ-положительного окрашивания.

Результаты этих исследований показывают, что ЕСЕ-К, будучи стимулированным лигандами ЕСЕ-К, индуцирует продуцирование бокаловидных клеток ш νίίτο и ш νίνο. т.е. оказывает воздействие, обусловленное активацией ЕСЕ-К, которое блокировалось ингибитором тирозинкиназы ЕСЕ-К. На овальбуминовой модели астмы упомянутый ингибитор также эффективно предотвращал продуцирование бокаловидных клеток.

Наряду с описанием механизма индуцирования бокаловидных клеток, полученные результаты позволяют предположить возможную последовательность развития продуцирования бокаловидных клеток, исходя из экспрессии ЕСЕ-К:

Стимуляция Τ№-α вызывает интенсивное окрашивание негранулированных секреторных клеток; их последующая активация лигандами ЕСЕ-К вызывает прогрессирующее окрашивание слизистых гликоконъюгатов в цитоплазме и упомянутые клетки превращаются в клеткипредшественники бокаловидных клеток, а затем в бокаловидные клетки. Инстилляция Τ№-α с последующим введением лигандов ЕСЕ-К индуцирует продуцирование бокаловидных клеток, не изменяя общего количества эпителиальных клеток, что позволяет предположить, что активация ЕСЕ-К стимулировала избирательную дифференциацию клеток (не пролиферацию). Полученные данные позволяют сделать предположение, что бокаловидные клетки образуются из негранулированных сек реторных клеток, которые экспрессируют ЕСЕК и стимулируются лигандами ЕСЕ-К к продуцированию муцина.

У пациентов, умерших от острого астматического приступа, важными показателями являются гиперплазия бокаловидных клеток и закупорка слизистым секретом. В крысиной модели астмы сенсибилизация дыхательных путей происходит после повторной инстилляции овальбумина, следствием чего является явно выраженная гиперплазия бокаловидных клеток дыхательных путей. Мы показали, что ЕСЕК, который не экспрессируется в эпителии дыхательных путей контрольных животных, экспрессируется у сенсибилизированных животных. Клетки, которые окрашивались, были клетками-предшественниками бокаловидных клеток и бокаловидными клетками, что позволяет предположить, что ЕСЕ-К был вовлечен в продуцирование бокаловидных клеток. Предварительная обработка ингибитором тирозинкиназы ЕСЕ-К (ΒΙΒΧ 1522) предотвращала продуцирование бокаловидных клеток в дыхательных путях, подтверждая роль активации ЕСЕ-К в продуцировании бокаловидных клеток при экспериментальной астме.

Полученные результаты указывают на причастность каскада реакций ЕСЕ-К к гиперплазии бокаловидных клеток. Результаты ранее проведенных исследований показали, что различные стимулирующие агенты, например, озон, диоксид серы, вирусы, липополисахариды, фактор активации тромбоцитов и интерлейкин4, активируют экспрессию и секрецию муцина. Настоящее изобретение предоставляет механизм оценки взаимосвязи этих воспалительных стимулирующих агентов и системы ЕСЕ-К.

Астма используется в качестве примера терапевтической стратегии, соответствующей настоящему изобретению: в нормальном эпителии человеческих дыхательных путей на каждую бокаловидную клетку приходится 3-10 реснитчатых эпителиальных клеток. При астме количество бокаловидных клеток может быть равным либо превосходить количество реснитчатых эпителиальных клеток; у пациентов, умерших в 51;Щ15 айНтаНси^ наблюдалось 30кратное увеличение площади (%), занятой бокаловидными клетками, по сравнению с соответствующим показателем у пациентов, умерших от неастматических респираторных заболеваний. Угнетение продуцирования бокаловидных клеток должно ликвидировать этот источник гиперсекреции. Поскольку жизненный цикл бокаловидных клеток неизвестен, время устранения гиперплазии бокаловидных клеток посредством лечения точно спрогнозировано быть не может. При отсутствии дополнительного воздействия аллергена, гиперплазия бокаловидных клеток у ранее сенсибилизированных мышей устранялась в течение пяти дней, наряду с другими проявлениями аллергического воспа ления. Ингибирование активации ЕОР-К может ингибировать гиперплазию бокаловидных клеток намного быстрее, в зависимости от продолжительности жизни бокаловидных клеток. Недавно сообщили о высокоизбирательных АТФконкурентных ингибиторах тирозинкиназы. Ингибиторы тирозинкиназы ЕОР-К оценивались для лечения злокачественных опухолей, связанных с экспрессией ЕОР-К.

Гиперсекреция является основным симптомом многих хронических воспалительных заболеваний дыхательных путей. В настоящее время не существует эффективных лекарственных средств для облегчения симптомов и приостановки прогрессирования этих заболеваний. Полученные данные предоставляют механизм и стратегию лечения: продуцирование бокаловидных клеток предотвращается посредством ингибирования активации ЕОР-К.

Ингибиторы активации ЕОР-К предлагаются в качестве лекарственного средства при гиперсекреторных заболеваниях дыхательных путей.

Пример 2. Роль оксидационного стресса в продуцировании бокаловидных клеток.

Как полагают, длительное курение сигарет у людей связано с прогрессирующими патологическими изменениями периферических дыхательных путей, включая гиперплазию бокаловидных клеток. Подобным же образом, как было показано, экспериментальные модели курения сигарет вызывают у животных гиперплазию бокаловидных клеток в дыхательных путях. Однако механизм, посредством которого сигаретный дым может индуцировать синтез муцина, неизвестен. Приведенные далее данные демонстрируют, что предвоспалительные цитокинактивированные нейтрофилы и сигаретный дым вызывают синтез муцина МИС5АС в эпителиальных клетках бронхов человека через посредство лиганднезависимого активирования ЕОР-К. Эти результаты подразумевают рекрутированные нейтрофилы и сигаретный дым как регуляторы дифференциации эпителиальных клеток, следствием которой может быть патологическая индукция муцинпродуцирующих клеток в дыхательных путях.

Методы

Выделение нейтрофилов. Нейтрофилы человека очищали из периферической крови, полученной от здоровых доноров-людей. Выделение нейтрофилов осуществляли в соответствии со стандартным методом отделения градиентом фиколл-хайпак, осаждением декстраном и гипотоническим лизисом эритроцитов. >95% клеток, по результатам исключающего окрашивания трипановым синим, были, как правило, жизнеспособны. Для предотвращения загрязнения эндотоксином все растворы пропускали через 0,1 мкм фильтр.

Культура клеток. Клетки ΝΟ-Η292 (линия клеток легочного слизеобразующего плоскоклеточного рака человека) выращивали в питательной среде КРМ1 1640, включающей 10% сыворотки зародыша крупного рогатого скота, пенициллин (100 Ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и Гепес-буфер (25 мМ), при температуре 37°С в 5% СО2-инкубаторе с водяной рубашкой. Для культивирования клеток использовали 6-луночные культуральные планшеты либо 8-камерные предметные стекла. При достижении стадии слияния клетки инкубировали в течение 1 ч только с нейтрофилами (10⁶ клеток/мл), только с ΤΝΒ-α (рекомбинантный человеческий ΤΝΒ-α, 20 нг/мл, компания Сепхуте. СатЬпбде. штат Мериленд), только с 1Ь-8 (рекомбинантный человеческий 1Ь-8, 10^-8 М, компания Сепхуте), только с 1МЬР (10^-8 М, компания 81дта, 8ΐ. Ьошк, штат Миссури), с ΤΝΕ-α плюс нейтрофилы, 1Ь-8 плюс нейтрофилы, 1МЬР плюс нейтрофилы, пероксидом водорода (Н₂О₂, 200 мкМ), раствором сигаретного дыма либо ТОР-α (рекомбинантный человеческий ТОР-α, 0,1-25 нг/мл, компания Са1ЫосНет, 8ап О|едо, штат Калифорния). После этого упомянутые клетки промывали и инкубировали только со свежей питательной средой. Эксперименты были завершены в заранее определенное время (для мРНК, 6 ч и 12ч; для белка, 24 ч). В качестве контроля клетки инкубировали только с питательной средой в течение таких же периодов времени. При проведении других исследований с нейтрофилами ΤΝΓ-α был выбран в качестве стимулирующего агента, поскольку он обладает наиболее мощным воздействием на синтез МИС5АС. Клетки ΝΟΙ-Η292 инкубировали в течение 1 ч либо с нейтрофилами, которые инкубировали с ΤΝΓ-α (20 нг/мл) в течение 1 ч, после чего промывали стерильным РВ8 во избежание загрязнения супернатантом (например, молекулами, которые были выделены нейтрофилами), либо только с супернатантом. При проведении исследований ингибирования ингибиторами тирозинкиназы ЕОР-К, клетки ΝΟΙΗ292 предварительно обрабатывали В1ВХ 1522 (10 мкг/мл, любезно предоставленным компанией ВоеЬппдег 1пде1Ге1т 1пс., 1пде1Ге1т, Германия) либо тирфостином АО1478 (10 мкМ, компания Са1ЬюсГет) за 30 мин до добавления стимулирующего агента. Исследовали также влияние избирательного ингибитора тирозинкиназы полученного из тромбоцитов рецептора соматотропина (тирфостин АО1295, 100 мкМ, компания Са1ЬюсГет) и отрицательный контроль для выявления тирфостинов (тирфостин А1, 100 мкМ, компания Са1ЬюсГет). При проведении исследований ингибирования блокирующими антителами к лигандам ЕОР-К, супернатанты предварительно обрабатывали антиТСР-α антителом (компания Са1ЬюсГет) либо анти-ЕОР антителом в течение 30 мин, после чего добавляли клетки ΝΟ-Η292. Роль свободных радикалов кислорода исследовали с помо щью акцепторов свободных радикалов кислорода ΌΜ8Θ (1%, компания 81дта), 1,3-диметил-2тиомочевины (ΌΜΤϋ, 50 мМ, компания §1§та) либо пероксид-дисмутазы (8ΘΌ, 300 Ед/мл, компания 81§та).

Получение раствора сигаретного дыма. При проведении этого исследования использовали экспериментальные сигареты (код 2К1, изготовлены для университета штата Кентукки компанией ТоЬассо апй НеаПП КекеагсЬ Еоипйаΐίοη). Раствор сигаретного дыма получали в соответствии с представленным ранее описанием (Дассер (Оиккег) и другие, (1989), 1. С1ш. [пускТ, 84:900-906). Вкратце, сигаретный дым втягивали в полипропиленовый шприц (35 мл) со скоростью 1 клуб табачного дыма/мин (10 раз) и медленно барботировали в 20 мл среды КРМ1 1640, включающей 50 мМ Гепес-буфер.

После этого полученный раствор дыма титровали до рН 7,4 и использовали сразу же после получения.

Визуализация слизистых гликоконъюгатов и МИС5ЛС белка в клетках ЫС1-Н292. В конце экспериментов, клетки, выращенные на 8камерных предметных стеклах, фиксировали с помощью 4% параформальдегида в течение 1 ч, после чего либо окрашивали алцианом голубым/периодной кислотой-Шиффовым основанием (РА8) для визуализации слизистых гликоконъюгатов, либо использовали для иммуноцитохимических исследований МИС5АС. Для иммуноцитохимических исследований МИС5АС в качестве разбавителя для антитела использовали РВ8, содержащий 0,05% Твин 20, 2% нормальную козью сыворотку и левамизол (2 мМ). Клетки инкубировали с мышиным моноклональным антителом к МИС5АС (клон 45 М1, 1:200, компания №о Магкегк, ЕгетоШ, штат Калифорния) в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего трижды промывали РВ8 для удаления излишка основного антитела. После этого клетки инкубировали с биотинилированным лошадиным антимышиным 1дС (компания УесЮг ЬаЬога1ог1ек 1пс., ВшИпдате, штат Калифорния) в разведении 1:200 в течение 1 ч при комнатной температуре. Визуализацию связанного антитела осуществляли по стандартному протоколу для метода с использованием комплекса авидин-биотин-щелочная фосфатаза.

Гибридизация ш κίΐιι для получения человеческого гена МИС5АС. 298 п.н. фрагмент кДНК человеческого МИС5АС вставляли в клонирующий вектор ТА (компания [тЦгодеп, 8ап П1едо, штат Калифорния). Получение РНКзондов и гибридизацию ш κίΐι,ι осуществляли в соответствии с описанием, которое было приведено ранее.

Иммунологический анализ МИС5АС белка. Количество МИС5АС белка определяли, как описывалось ранее. Вкратце, клеточные лизаты получали с РВ8 в виде кратных разведений и 50 мкл каждого образца инкубировали с бикарбо нат-карбонатным буфером (50 мкл) при температуре 40°С в 96-луночном планшете (Мах1когр Ыцпс, компания Е1кЬег 8с1епййс, 8ап1а С1ага, штат Калифорния) до высыхания. Планшеты трижды промывали РВ8 и блокировали 2% В8А (фракция V, компания 8щта) в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого планшеты вновь трижды промывали РВ8, после чего инкубировали с 50 мкл мышиного моноклонального МИС5АС антитела (1:100), которое было разбавлено РВ8, включающим 0,05% Твин 20. Через 1 ч лунки трижды промывали РВ8 и в каждую из них вносили конъюгат пероксидазы хрена-козьего антимышиного 1дС (1:10000, компания 8щта). Через 1 ч планшеты трижды промывали РВ8. Цветную реакцию проявляли с помощью раствора пероксидазы ТМВ (компания Кпкедаагй&Реггу ЬаЬога1ог1ек, СайЬегкЬигд, штат Мериленд) и останавливали с помощью 2Ν Н₂8О₄. Оптическую плотность определяли при 450 нм.

Количественный анализ ТСЕ-α белка. Количество ТСЕ-α белка определяли с помощью коммерчески доступного набора для проведения твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А) (компания 8Цта) согласно инструкциям изготовителя. Супернатант, полученный после инкубирования нейтрофилов плюс ΤΝΕ-α (20 нг/мл) в течение 1 ч, смешивали с лизисным буфером РВ8, содержащим 1% Тритон Х-100, 1% деоксихолата натрия и несколько ингибиторов протеаз, (Сотр1е1е М1ш, компания ВоеЬппдег МаппНе1т, Германия), после чего использования для определения количества ТСЕ-α.

Иммунопреципитация для получения ЕСЕК белка и иммуноблоттинг для фосфорилирования тирозина. Клетки выращивали на минимальной среде в течение 24 ч, после чего стимулировали ТСЕ-α, Н₂О₂ или супернатантом активированных нейтрофилов в течение 15 мин. После стимулирования клетки лизировали и инкубировали в течение 30 мин в ротационном шейкере при температуре 4°С. Для удаления нерастворимого материала клеточные лизаты центрифугировали при 14000 об./мин в течение 5 мин при температуре 4°С. Аликвоты супернатантов, содержащие равные количества белка, иммунопреципитировали с анти-ЕСЕ-К антителом (поликлональное, АЬ4, компания Са1ЬюсПет) и 20 мкл белка А-агарозы (8аШа Сгих) в течение 2 ч при температуре 4°С. Преципитаты трижды промывали 0,5 мл лизисного буфера, суспендировали в буфере для образца с додецилсульфатом натрия (8Ό8) и кипятили в течение 5 мин. Белки отделяли δΌδ-РАСЕ в 8,0% акриламидном геле. Полученный гель уравновешивали в гибридизационном буфере: 25 мМ трис-С1, 192 мМ глицин, 20% (в объемном отношении) метанол, рН 8,3. После этого белки переносили посредством электрофореза на нитроцеллюлозные мембраны (0,22 мкм), блокиро вали 5% снятым обезжиренным молоком в РВБ, содержащем 0,05% Твин 20, в течение ночи, после чего инкубировали с моноклональным антифосфотирозиновым антителом (1:100, Бап!а ί'πιζ) в течение 1 ч. Визуализацию связанного антитела осуществляли по стандартному протоколу для метода с использованием комплекса авидин-биотин-щелочная фосфатаза (АВС кН, компания УееЮг ЬаЬога&пек).

Статистика. Все данные выражены в виде среднего значения±средняя квадратическая ошибка среднего. Для определения статистически значимых различий между группами, прибегали к однофакторному дисперсионному анализу. После определения статистической значимости в дисперсионном анализе, для корректирования на множественность сравнений использовали Р-критерий Шеффа (8сНеГГе). Вероятность менее 0,05 для основной гипотезы принималась как свидетельство статистически значимого различия.

Результаты

Активированные нейтрофилы вызывают синтез муцина геном МиС5АС. Когда нейтрофилы плюс стимулирующие агенты, которые активируют нейтрофилы (1Ь-8, ГМЬР, ΤΝΒ-α), инкубировали с клетками Νί.Ί-Η292 в течение 1 ч, синтез белка МИС5АС значительно возрастал в течение 24 ч, в то время как нестимулированные нейтрофилы (10⁶/мл), только 1Ь-8 либо только ГМЬР не оказывали воздействия на синтез МиС5АС; инкубирование только с ΤΝΒ-α вызывало незначительно, несущественное увеличение синтеза МИС5АС. В случае, когда нейтрофилы предварительно инкубировали в течение 1 ч с ΤΝΕ-α, после чего упомянутые нейтрофилы и их супернатант отделяли, последующее инкубирование упомянутого супернатанта в течение 1 ч с клетками Νί.Ί-Η292 активировало экспрессию гена МИС5АС в пределах 12 ч и стимулировало окрашивание как с помощью алциана голубого/РАБ, так и с помощью антитела к МИС5АС белку в пределах 24 ч; покоящиеся клетки Νί.Ί-Η292 демонстрировали незначительную экспрессию гена МИС5АС и незначительное, пятнистое окрашивание как алцианом голубым/РАБ, так и белком МИС5АС. Синтез белка МИС5АС, индуцированный упомянутым супернатантом, значительно возрастал по сравнению с контролем; нейтрофилы, отделенные от упомянутого супернатанта после инкубирования, никакого воздействия не оказывали. Пришли к выводу, что активированные нейтрофилы быстро секретируют активный продукт, который вызывает синтез МИС5АС.

Ингибиторы тирозинкиназы ЕСР-В предотвращают синтез МИС5АС, индуцированный супернатантом активированных нейтрофилов. Поскольку, как известно, лиганды ЕСР-В вызывают синтез МИС5АС в клетках Νί’Ι-Η292 посредством активирования тирозинкиназы ЕСР

В, исследовали роль активации ЕСР-В в синтезе МиС5АС, индуцированном упомянутым супернатантом активированных нейтрофилов. Предварительная обработка клеток Νί’Ι-Η292 избирательными ингибиторами тирозинкиназы ЕСРВ (ΒΙΒΧ 1522, АС1478) предотвращала синтез белка МиС5АС, который, обычно, индуцировался упомянутым супернатантом активированных нейтрофилов. Избирательный ингибитор киназы рецептора полученного из тромбоцитов соматотропина (АС 1295) и отрицательный контроль тирфостинов (А1) воздействия не оказывали. Эти результаты подразумевают активацию тирозинкиназы ЕСР-В в синтезе МИС5АС, индуцированном упомянутым супернатантом активированных нейтрофилов.

Роль лигандов ЕСР-В, секретированных в супернатант активированных нейтрофилов при синтезе МИС5АС. Для определения, зависит ли активация тирозинкиназы ЕСР-В от лигандов ЕСР-В(ЕСР и ТСР-α), мы прединкубировали упомянутый супернатант активированных нейтрофилов с нейтрализующими антителами к лигандам ЕСР-В. Предварительная обработка упомянутого супернатанта анти-ТСР-α антителом либо анти-ЕСР антителом не ингибировала синтеза МИС5АС, индуцированного упомянутым супернатантом активированных нейтрофилов. Более того, ТСР-α не был обнаружен в упомянутом супернатанте. Таким образом, фосфорилирование тирозина ЕСР-В, вызванное упомянутым супернатантом активированных нейтрофилов, было индуцировано механизмом, не зависящим от упомянутых лигандов ЕСР-В, ЕСР и ТСР-α.

Сигаретный дым и свободные радикалы кислорода вызывают синтез МИС5АС. Сигаретный дым и свободный радикал кислорода, Н₂О₂, активируют экспрессию гена МИС5АС в пределах 12 ч, так же, как это делает и ТСР-α. Подобным же образом, все стимулирующие агенты усиливали синтез белка МИС5АС и продуцирование гликоконъюгата слизистого секрета в пределах 24 ч; эти воздействия имели переменный по времени характер. Максимальный синтез МиС5АС в ответ на воздействие Н₂О₂был значительно меньшим, чем реакция на ТСР -α. Предварительная обработка с помощью АС 1478 предотвращала усиление синтеза белка МиС5АС, индуцированного всеми стимулирующими агентами, указывая на то, что все упомянутые стимулирующие агенты вызывают синтез муцина посредством активации тирозинкиназы ЕСР-В. Синтез МИС5АС, вызывавшийся супернатантом активированных нейтрофилов, сигаретным дымом и Н₂О₂, значительно ингибировался предварительной обработкой акцепторами свободных радикалов (ΌΜ8Θ и ЭМТЫ) и 8ΘΌ, в то время как ΌΜ8Θ и 8ΘΌ не оказывали воздействия на синтез белка МиС5АС, обусловленный ТСР-α.

Индуцирование фосфорилирования тирозина ТСЕ-В супернатантом активированных нейтрофилов и Н2О2. Распределение белка ЕСЕВ было одинаковым у контроля, выращенного на минимальной среде, и при всех стимулированных условиях (супернатант активированных нейтрофилов, сигаретный дым, Н2О2 или ТСЕα). Фосфорилирование общего белка тирозина происходило в пределах 15 мин после добавления супернатанта активированных нейтрофилов, сигаретного дыма, Н₂О₂ либо ТСЕ-α; у контроля, выращенного на минимальной среде, эффекта не наблюдалось. ТСЕ-а-индуцированное фосфорилирование общего белка тирозина было большим, чем эффект супернатанта активированных нейтрофилов, сигаретного дыма или Н2О2. Для определения того, фосфорилировался ли ЕСЕ-В, осуществляли иммунопреципитацию с анти-ЕСЕ-В антителом. Все факторы, упомянутый супернатант активированных нейтрофилов, растворимые продукты сигаретного дыма и Н₂О₂, индуцировали ЕСЕ-В-специфическое фосфорилирование тирозина в пределах 15 мин; этот эффект был подобен эффекту, вызванному ТСЕ -а. Предварительная обработка клеток Νί'ΊН292 с помощью АС 1478 ингибировала фосфорилирование тирозина ЕСЕ-В всеми стимулирующими агентами. ΌΜ80 ингибировал фосфорилирование тирозина ЕСЕ-В, индуцированное супернатантом, сигаретным дымом и Н2О2, однако, не оказывал воздействия на фосфорилирование тирозина ЕСЕ-В, индуцированное ТСЕ-а.

Вышеприведенные результаты показывают, что нейтрофилы вызывают синтез муцина МИС5АС в клетках Νί.Ί-Η292. когда они активируются 1Ь-8, 1МЬР либо ΤΝΕ-α. Более того, упомянутый супернатант, который собирали через 1 ч после инкубирования нейтрофилов с ΤΝΕ-α, вызывал синтез МИС5АС, т.е. эффект, который ингибировался избирательными ингибиторами тирозинкиназы ЕСЕ-В. Ингибирование тирозинкиназы ЕСЕ-В полностью блокировало синтез МИС5АС, вызванный упомянутым супернатантом активированных нейтрофилов; ингибитор тирозинкиназы не-ЕСЕ-В, избирательный ингибитор киназы рецептора соматотропина, полученного из тромбоцитов, (АС 1295) и отрицательный контроль тирфостинов (А1), не оказывали воздействия, что подразумевает фосфорилирование тирозина ЕСЕ-В как сигнальный путь синтеза МИС5АС, индуцированного упомянутым супернатантом активированных нейтрофилов.

Для дополнительного анализа механизма, посредством которого супернатанты активированных нейтрофилов индуцируют фосфорилирование тирозина ЕСЕ-В, были исследованы как лигандзависимые, так и лиганднезависимые пути превращений ЕСЕ-В. Во-первых, мы определили количество ТСЕ-α в упомянутом супер натанте активированных нейтрофилов и установили, что упомянутый супернатант не содержит измеримых количеств ТСЕ-α. В предшествующих сообщениях было показано, что нейтрофилы содержали лишь низкие концентрации (2,5 пг/10⁶) ТСЕ -α. Эффект супернатанта активированных нейтрофилов на синтез МИС5АС был столь же сильным, как и эффект 1 нг ТСЕ-α, которого было в 400 раз больше количества ТСЕ-α, обнаруженного в нейтрофилах. Вовторых, мы провели исследования по блокировке нейтрализующими антителами лигандов ЕСЕ-В: предварительная обработка нейтрализующими антителами к ЕСЕ и ТСЕ-α не ингибировала синтез МИС5АС, вызванный упомянутым супернатантом активированных нейтрофилов. Эти результаты позволяют предположить, что синтез МИС5АС, индуцированный супернатантом нейтрофилов, не был вызван секрецией лигандов ЕСЕ-В (ТСЕ-α и ЕСЕ) нейтрофилами. Далее, мы исследовали лиганднезависимый путь: поскольку свободные радикалы кислорода, как известно, выделяются нейтрофилами во время активации, и они, как известно, вызывают трансактивацию тирозинкиназы ЕСЕ-В в различных клетках, мы предположили, что выделение свободных радикалов кислорода активированными нейтрофилами вызывает фосфорилирование тирозина ЕСЕ-В и последующий синтез МИС5АС в клетках N01Н292. Акцепторы свободных радикалов (ИМ80 и ИМТИ) и 80Ό ингибировали синтез МИС5АС, обусловленный упомянутым супернатантом активированных нейтрофилов. Сообщают, что ТДО-ц вызывает оксидационный взрыв в суспензии нейтрофилов с максимальной реакцией в пределах 1 ч; представленные результаты демонстрируют подобное же развитие во времени.

В настоящем исследовании экзогенный Н2О2, основной продукт, выделяемый из нейтрофилов во время оксидационного взрыва, вызывает синтез МИС5АС в клетках ΝΟ-Η292. Однако максимальная реакция на Н2О2 при синтезе МИС5АС составляла лишь половину реакции на ТСЕ-α. Значительным открытием в настоящем исследовании является тот факт, что сигаретный дым самостоятельно вызывает синтез МИС5АС. Это позволяет предположить, что сигаретный дым может вызвать синтез МИС5АС ш νίνο как через посредство прямого стимулирования, так и через посредство косвенного стимулирования, вызванного рекрутингом нейтрофилов. Точные молекулы сигаретного дыма, вызывающие синтез МИС5АС, все еще не установлены. Показано, что сигаретный дым включает многочисленные продукты (например, никотин, смолу, акролеин и оксиданты). В наших экспериментах ИМ80 и 80Ό частично ингибировали синтез МИС5АС, индуцированный сигаретным дымом. Таким образом, оксидант ный стресс может быть одним из механизмов, вызывающих эту реакцию. Тот факт, что синтез МИС5АС, индуцированный сигаретным дымом, полностью блокировался ингибиторами тирозинкиназы ЕСР-К, указывает на то, что активация ЕСР-К играет основную роль в синтезе МПС5АС, индуцированном сигаретным дымом.

При заболеваниях дыхательных путей нейтрофильное воспаление дыхательных путей является обычным симптомом; нейтрофилы рекрутируются и активируются цитокинами и сигаретным дымом. Результаты настоящих исследований показывают, что рекрутированные нейтрофилы и сигаретный дым также действуют как регуляторы дифференциации эпителиальных клеток, следствием чего является индукция муцин-продуцирующих клеток в дыхательных путях. Наиболее важным представляется то, что ингибирование активации ЕСР-К будет пригодным в качестве лекарственного средства при гиперсекреторных заболеваниях дыхательных путей.

Пример 3.

Ранение эпителия дыхательных путей вызывает метаплазию бокаловидных клеток.

Предположили, что агарозные пробки, введенные в дыхательные пути, будут постоянно находиться в бронхах, не закупоривая их, и что постоянные пробки вызовут воспаление, следствием которого явится метаплазия бокаловидных клеток. Показано, что агарозные пробки индуцируют явно выраженное местное продуцирование бокаловидных клеток, что демонстрируется положительным окрашиванием алцианом голубым/РА8 и экспрессией муцинового гена МИС5АС, связанной с местным рекрутингом клеток зоны воспаления. Этот результат подразумевает активацию ЕСР-К в индуцированной пробками метаплазии бокаловидных клеток.

Методы

Животные. Протокол проведения экспериментов на животных был одобрен Комитетом по проведению исследований на животных (Сотт111ее оп Ашта1 КекеагсЕ) Калифорнийского университета, Сан-Франциско. Были использованы специальные апатогенные крысы-самцы линии Р344 (масса 230-250 г; компания 81топкеп ЬаЬога1ог1е8, СПгоу, штат Калифорния). Крыс содержали в апатогенных клетках В1оС1еап с изолированными от окружающей среды вытяжными колпаками, обеспечивающими подачу ламинарного потока воздуха; животные имели свободный доступ к стерильному корму и воде.

Лекарственные препараты. Были использованы лекарственные препараты из следующих источников: циклофосфамид (компания 81дта, 81. Ьошк, штат Миссури), метогекситал натрия (бревитал, компания 1опе§ Меб1са1 1пби51пе5, 1пс., 81. Ьошк, штат Миссури), пентобарбитал натрия (нембутал, компания АЬЬо11 ЬаЬ., №г111

СЫсадо, штат Иллинойс); В1ВХ 1522, избирательный ингибитор тирозинкиназы ЕСР-К (щедро предоставленный компанией Воейппдег 1пдеШе1т, 1пс., 1пдеШе1т, Германия), был растворен в следующем растворе: 2 мл полиэтиленгликоля 400 (компания 81дта, 81. Ьошк, штат Миссури), 1 мл 0,1Ν НС1 и 3 мл 2% раствора маннитола в воде (рН 7,0). ΝΚ' 15669 (ингибитор подвижности лейкоцитов) был любезно предоставлен компанией 8сю5 Nονа, 1пс., Моип1аш У|е\у, штат Калифорния.

Агарозные пробки. Агарозные пробки (диаметром 0,7-0,8 мм) изготовляли из 4% агарозной питательной среды ЕЕО типа II (компания 81дта, 81. Ьошк, штат Миссури) в стерильном забуференном фосфатом физиологическом растворе (РВ8). Для визуализации упомянутых агарозных пробок в ткани, после расплавления агарозы при температуре 50°С к ней добавляли 3% суспензию красителя монастрала голубого В (компания 81дта, 81. Ьошк, штат Миссури).

Протокол экспериментов. Исследования проводились нами на апатогенных крысах, поскольку в их дыхательных путях, как правило, находится небольшое количество бокаловидных клеток. Животных анестезировали метогекситалом натрия (бревитал, 25 мг/кг, внутрибрюшинно). Трахею асептически обнажали разрезом по средней линии и агарозные пробки вводили в бронхи с помощью иглы АпдюсаШ № 20 (компания Вес1оп П1кш8оп, 8апбу, штат Юта), присоединенной к полиэтиленовой трубке (РЕ 90, внутренний диаметр 0,86 мм и наружный диаметр 1,27 мм, компания С1ау Абатк, Рагыррапу, штат Нью-Йорк), введенной в разрезанную трахею. Полиэтиленовую трубку изгибали под углом 30° для избирательного введения в соответствующий бронх. После введения пробок на разрез накладывали шов.

Для оценки роли ЕСР-К в метаплазии бокаловидных клеток, индуцированной агарозными пробками, животных обрабатывали В1ВХ 1522 (80 мг/кг, внутрибрюшинно) за 1 ч до введения упомянутых агарозных пробок, и упомянутую обработку повторяли ежедневно (40 мг/кг, внутрибрюшинно, два раза в день). Животных забивали через 24, 48 или 72 ч после введения упомянутых агарозных пробок.

Для оценки роли ΤΝΕ-α в метаплазии бокаловидных клеток, индуцированной агарозными пробками, животных обрабатывали ΤΝΕ-α нейтрализующим антителом (компания Сепхуте, Вок1оп, штат Массачуссетс). Первую обработку (100 мкл в 0,2 мл физиологического раствора, внутрибрюшинно) производили за 1 ч до введения агарозных пробок, и внутрибрюшинные инъекции повторялись ежедневно. В дополнение к этому ΤΝΕ-α нейтрализующее антитело вливали (10 мкл/ч) с помощью осмотического мининасоса (А1хе1 2МЬ1, компания

Ака Согр., Ра1о А11о. штат Калифорния), имплантированного под кожу.

Для оценки влияния нейтрофилов на метаплазию бокаловидных клеток, индуцированную агарозными пробками, крыс предварительно обрабатывали циклофосфамидом (ингибитор лейкоцитов костного мозга) либо комбинацией циклофосфамида плюс ДОС 15669. Циклофосфамид (100 мг/кг, внутрибрюшинно) вводили за 5 дней до введения агарозных пробок, и вторую инъекцию циклофосфамида (50 мг/кг, внутрибрюшинно) производили за 1 день до введения пробок. В процессе исследований с ДОС 15669, упомянутое лекарственное средство (10 мг/кг, внутрибрюшинно) впрыскивали за 1 ч до введения агарозных пробок, затем ежедневно в течение 3 последующих дней.

Все лекарственные препараты (В1ВХ 1522, ТДО-а нейтрализующее антитело, циклофосфамид и NРС 15669) вводили внутрибрюшинно за 1 час до введения агарозных пробок, и дозы повторно вводили ежедневно в течение 3 дней.

Получение тканей. Через различные промежутки времени после введения агарозных пробок, крыс анестезировали пентобарбиталом натрия (65 мг/кг, внутрибрюшинно) и осуществляли перфузию системы кровообращения раствором 1% параформальдегида в РВ8, обработанном диэтилпирокарбонатом, при давлении 120 мм рт.ст. Правое легкое удаляли и правую каудальную долю использовали для гистологических исследований. Для получения замороженных срезов ткани удаляли и помещали в 4% параформальдегид на 1 ч с последующим помещением в 30% сахарозу для криозащиты в течение ночи. Упомянутые ткани заливали составом О.С.Т. (компания 8акига Ппе1ек и.8.А., 1пс., Тоггапсе, штат Калифорния). Для получения метилакрилатных срезов упомянутые ткани помещали в 4% параформальдегид на 24 ч, после чего дегидратировали градуированными концентрациями этанола и заливали метакрилатом ДБ-4 (компания Ро1укс1епсек, 1пс., ХУагппд1оп, штат Пенсильвания). Тканевые срезы (толщиной 4 мкм) окрашивали алцианом голубым/ РА8 и контрастно окрашивали гематоксилином.

Морфометрический анализ бронхиального эпителия. Процент окрашенной алцианом голубым/РА8 площади слизистых гликоконъюгатов в эпителии определяли с помощью полуавтоматической системы анализирования изображений в соответствии с ранее опубликованными методами. Площадь эпителия и окрашенных алцианом голубым/РА8 конъюгатов слизистого секрета в пределах эпителия очерчивали вручную и анализировали с помощью находящейся в государственной собственности программы 1таде Национального института здоровья США (разработанной в Национальном институте здоровья США и общедоступной из сети Интернет по протоколу РТР либо на гибком диске от компании №1Нопа1 Тес11шса1 1пГогтаНоп 8егу1се, 8ргшдГ1е1й, штат Вирджиния, шифр компонента РВ95-500195ОЕ1). Данные выражены в виде процента от общей площади эпителия, занятой красителем алцианом голубым/РА8. Для полуколичественной оценки секреции слизистого секрета, процент длины поверхности эпителия, позитивно окрашенной алцианом голубым/РА8, определяли путем соотнесения позитивно окрашенной длины с общей длиной. Процент оголенного эпителия определяли посредством вычисления отношения длины оголенного эпителия к общей длине эпителия.

Идентификация клеточных типов в метакрилатных срезах и анализ клеток. Общее количество эпителиальных клеток определяли путем подсчета ядер эпителиальных клеток на 2 мм собственной пластинки слизистой оболочки с помощью иммерсионных объективов (1000х увеличение). Линейную длину собственной пластинки слизистой оболочки под каждым участком эпителия, подвергавшимся анализу, определяли посредством записи контура оцифрованного изображения собственной пластинки слизистой оболочки. Эпителиальные клетки идентифицировались, как описывалось ранее. Вкратце, базальные клетки идентифицировались как небольшие уплощенные клетки с крупными ядрами, расположенные непосредственно над собственной пластинкой слизистой оболочки, но не достигающие просвета дыхательных путей. Цитоплазма окрашивалась в темный цвет, алциан голубой- либо РА8-положительные гранулы отсутствовали. Реснитчатые эпителиальные клетки распознавались по их реснитчатым краям, слегка окрашенной цитоплазме и большим круглым ядрам. Негранулированные секреторные клетки имели столбчатую форму и протягивались от просвета бронхов до собственной пластинки слизистой оболочки. После интрабронхиальной инстилляции агарозных пробок возникали проявляющиеся бокаловидные клетки (клетки-предшественники бокаловидных клеток). Эти клетки имели алциан голубой/РА8позитивную окраску, гранулы были небольшими и сами клетки не были забиты гранулами; они включали небольшие участки, окрашенные слизью (<1/3 высоты в эпителии от базальной мембраны до поверхности просвета), либо рассеянно и слегка окрашенные алцианом голубым/РА8 гранулы небольшого размера. Клетки неопределенного типа определяются как профили клеток, не имеющие достаточных цитоплазматических характеристик для отнесения к соответствующей категории.

Иммуногистохимическая локализация ЕОР-К. Присутствие ЕОР-К определяли посредством иммуногистохимической локализации, используя моноклональное мышиное антитело к ЕОР-К (компания Са1Ьюс11ет, 8ап П1едо, штат Калифорния). Предварительно полученные 4 мкм замороженные гистологические срезы постфиксировались 4% параформальдегидом, обрабатывались 0,3% смесью Н₂О₂/метанола. Ткани инкубировали с ЕСР-Я антителом (разведение 1:250). Биотинилированный лошадиный антимышиный 1дС (1:200; компания УесЮг ЬаЬ., Виг1шдате, штат Калифорния), с последующей обработкой комплексом стрептавидинпероксидаза (АВС ΚίΙ, компания УсеЮг ЬаЬ., Виг1шдате, штат Калифорния), использовали для визуализации комплексов антиген-антитело, окрашенных 3,3'-диаминобензидина тетрагидрохлоридом (компания 81дта, 8ί. Ροιιίδ, штат Миссури). Негативные контрольные предметные стекла инкубировали с исключением основного либо второстепенного антитела, замененного РВ8.

Гибридизация ίη δίΐιι. [³⁵8]-меченые рибозонды получали из плазмиды, включающей 320 п.н. фрагмент кДНК крысиного МИС5АС, любезно предоставленного доктором Карол Басбаум (Саго1 ВакЬаит). Гистологические срезы гибридизовали с [³⁵8]-мечеными РНК-зондами (2500-3000 имп/мкл гибридизационного буфера) и промывали с соблюдением жестких условий, включающих обработку рибонуклеазой А. После авторадиографирования в течение 7-21 дней, фотоэмульсию проявляли и полученные предметные стекла окрашивали гематоксилином.

Подсчет нейтрофилов в эпителии дыхательных путей. Оценку притока нейтрофилов в бронхи производили путем окрашивания нейтрофилов 3,3'-диаминобензидина тетрагидрохлоридом с подсчетом количества нейтрофилов в просвете и в эпителии дыхательных путей; результаты выражали в виде количества окрашенных клеток на миллиметр длины собственной пластинки слизистой оболочки.

Бронхоальвеолярный лаваж (ВАЬ). Для определения лейкоцитарной формулы в каждой группе животных легкие промывали пять раз 3 мл аликвотами стерильного РВ8, смывы объединяли и определяли объем. Клетки в ВАЬ собирали посредством центрифугирования промывной жидкости при 1000 об/мин в течение 10 мин. После этого с помощью гемоцитометра просчитывали десять микролитров клеточной суспензии для определения количества клеток в промывной жидкости. Лейкоцитарную формулу определяли на цитоцентрифужных препаратах, окрашенных красителем ΩίΓΓ-ΟυίΚ (компания Атенсам ЗЛениНс РгобиеК МсСате Рагк, штат Иллинойс). Лейкоцитарную формулу определяли путем отбора как минимум 200 клеток на каждом цитоцентрифужном стекле.

Статистический анализ. Данные представлены в виде среднего значения ±средняя квадратическая ошибка среднего. Для статистического анализа как подходящий был использован двухфакторный либо однофакторный дисперсионный анализ (АИОУА) с последующим применением ί-критерия Стьюдента. Вероятность ме нее 0,05 была сочтена статистически значимым различием.

Результаты

Влияние на структуру эпителия дыхательных путей: Метаплазия бокаловидных клеток. Для определения, влияют ли агарозные пробки на структуру эпителия дыхательных путей, агарозные пробки вводили в правые бронхи 5 апатогенных крыс. В бронхиальном эпителии контрольных животных находилось небольшое количество бокаловидных клеток. Однако после местного введения агарозных пробок, окрашивание алцианом голубым/РА8 показало изменяющееся со временем увеличение площади бокаловидных клеток, которая обнаруживалась уже к 24 ч и была наибольшей через 72 ч после введения агарозных пробок. Через 24 ч агарозные пробки вызвали значительное увеличение числа клеток-предшественников бокаловидных клеток и бокаловидных клеток, и через 48 ч обнаруживалось больше зрелых бокаловидных клеток (табл. 1). Через 72 ч агарозные пробки увеличили количество бокаловидных клеток (Р<0,01); количество базальных и реснитчатых клеток осталось неизменным (Р>0,05). Общее число эпителиальных клеток на мм собственной пластинки слизистой оболочки через 72 ч после введения агарозных пробок было слегка, но незначительно повышено (Р>0,05, табл. 1); высота эпителия (измеренная от базальной мембраны до поверхности эпителия в просвете) увеличилась от 16,0±1,2 мкм в контрольных дыхательных путях до 38,1±9,1 мкм через 72 ч после введения пробок (η=5, Р<0,01).

В просвете дыхательных путей контрольных животных не наблюдалось окрашивания алцианом голубым/РА8. Однако в непосредственной близости от агарозных пробок в просвете наблюдалось окрашивание, свидетельствующее о имевшей место секреции гликоконъюгатов слизи. В дыхательных путях с агарозными пробками увеличение окрашенной площади носило переменный по времени характер. Процент общей длины эпителия, позитивно окрашеной алцианом голубым/РА8 в дыхательных путях в непосредственной близости от пробок, увеличился от 0,1±0,1% у контрольных животных до 4,7±1,4%, 13,3±0,7% и 19,1±0,7% через 24 ч, 48 ч и 72 ч (η=5). Более того, агарозные пробки оголили эпителий закупоренных бронхов на 13,5±2,3%, 6,9±2,4% и 5,1±1,5% от общей площади через 24 ч, 48 ч и 72 ч, соответственно (η=5).

Влияние агарозных пробок на экспрессию муцинового гена. В бронхах контрольных крыс не наблюдалось обнаружимого сигнала с антисмысловым зондом МИС5АС (η=4 на группу). В бронхах, в которые были вставлены пробки, наблюдался сигнал для МИС5АС, который возрастал в зависимости от времени от 24 до 72 ч (η=4). Экспрессия гена МИС5АС обнаруживалась, главным образом, в клетках, которые име ли положительную окраску алцианом голубым/ РАБ. В клетках других типов (например, гладких мышцах, соединительной ткани) сигналы не обнаруживались. Срезы, проверенные смысловым зондом МИС5АС, экспрессии не показали.

Влияние агарозных пробок на экспрессию ЕСР-К в эпителии дыхательных путей. В эпителии контрольных животных, при иммунном окрашивании антителом к ЕСР-К, наблюдалось слабое окрашивание. Однако после введения агарозных пробок ЕСР-К-позитивное окрашивание продемонстрировал находящийся в непосредственной близости от агарозных пробок эпителий, клетки которого позитивно окрасились алцианом голубым/РАБ. Картина окрашивания для ЕСР-К напоминала окрашивание для МИС5АС и ΑΒ/РΑБ. Клетки-предшественники бокаловидных клеток, бокаловидные клетки и негранулированные секреторные клетки были иммунопозитивны на ЕСР-К. У реснитчатых клеток иммунореактивность отсутствовала. В дыхательных путях, не закупоренных агарозными пробками, эпителий демонстрировал незначительное окрашивание для ЕСР-К и оно было подобным окрашиванию у контрольных животных.

Влияние ингибитора тирозинкиназы ЕСРК на метаплазию бокаловидных клеток и на экспрессию муцинового гена. В настоящих исследованиях следствием введения агарозных пробок явилась экспрессия ЕСР-К в клетках, продуцирующих муцин. ЕСР-К является членом класса рецепторов тирозинкиназы. Таким образом, когда лиганды ЕСР-К (ЕСР либо ТСР-α) связываются с ЕСР-К, активизируется особая тирозинкиназа ЕСР-К. Поэтому для проверки гипотезы, суть которой заключается в том, что активация ЕСР-К индуцирует экспрессию гена МИС5АС и гликоконъюгатов слизистого секрета после инстилляции агарозных пробок, крысам внутрибрюшинно впрыскивали ингибитор тирозинкиназы ЕСР-К (ΒΙΒΧ 1522). ΒΙΒΧ 1522 заметно сокращал индуцированную агарозными пробками окрашенную алцианом голубым/РАБ площадь эпителия через 24, 48 и 72 ч. Он также полностью ингибировал экспрессию гена МИС5АС через 72 ч после введения пробок.

Влияние ΤΝΡ-α нейтрализующего антитела на метаплазию бокаловидных клеток и на экспрессию ЕСР-К белка. Мы предположили, что ΤΝΡ-α выделяется в процессе воспаления, вызванного агарозными пробками. Поэтому мы исследовали воздействие предварительной обработки крыс ΤNΡ-α нейтрализующим антителом на метаплазию бокаловидных клеток, индуцированную агарозными пробками: у животных, предварительно обработанных ΤΝΗ-α нейтрализующим антителом (и=5), агарозные пробки более не стимулировали экспрессию ЕСР-К белка либо продуцирование (бокаловидных) клеток, позитивно окрашенных алцианом голубым/РАБ.

Рекрутинг клеток зоны воспаления агарозными пробками. Было замечено, что агарозные пробки вызывают повреждение эпителия и инфильтрацию клеток зоны воспаления. Различные клетки зоны воспаления могут продуцировать лиганды как ΤΝΗ-α, так и ЕСР-К. Как ЕСРК, так и его лиганды вовлечены в каскад ЕСР-К, который ведет к метаплазии бокаловидных клеток. Мы оценивали роль лейкоцитов и макрофагов в эффектах, индуцированных агарозными пробками, двумя способами. Во-первых, мы исследовали клетки в бронхоальвеолярном лаваже: у контрольных крыс преобладающими выделенными клетками были макрофаги (и=5; фиг. 4, контроль). После введения агарозных пробок количество макрофагов увеличилось (Р<0,05) и в промывной жидкости появилось значительное количество нейтрофилов (Р<0,01). Количество лимфоцитов осталось неизменным.

В гистологических срезах оценивались также инфильтрационные клетки: в дыхательных путях без агарозных пробок имелось небольшое количество нейтрофилов, в то время как в дыхательных путях с пробками нейтрофилы присутствовали как в эпителии, так и в просвете. Количество нейтрофилов в просвете дыхательных путей составляло 0,2±0,2/мм, 42,4±7,1/мм, 40,7±7,7/мм и 20,1±7,2/мм собственной пластинки слизистой оболочки в контрольных дыхательных путях и через 24, 48 и 72 ч после введения пробок, соответственно (Р<0,05, и=5). В дополнение к этому, количество нейтрофилов в эпителии дыхательных путей составляло 1,3±0,4/мм, 15,6±2,6/мм, 14,9±1,4/мм и 14,8±2,6/мм собственной пластинки слизистой оболочки в контрольных дыхательных путях и через 24, 48 и 72 ч после введения пробок, соответственно (Р<0,01, и=5).

Влияние циклофосфамида на рекрутмент нейтрофилов, метаплазию бокаловидных клеток и экспрессию ЕСР-К белка. У крыс, обработанных циклофосфамидом, снижалось количество нейтрофилов в крови (количество нейтрофилов в венозной крови после циклофосфамида, 1,8±0,5%, и=5) и ингибировался индуцированный пробками рекрутмент нейтрофилов в ΒΑ^. Количество нейтрофилов в просвете дыхательных путей (2,6±0,3/мм собственной пластинки слизистой оболочки) и в эпителии (0,8±0,2/мм) также значительно снизилось через 24 ч. Циклофосфамид также ингибировал индуцированную агарозными пробками метаплазию бокаловидных клеток и экспрессию ЕСР-К белка. После того как к циклофосфамиду был добавлен леймедин, №С 15669, ингибирование индуцированной агарозными пробками метаплазии бокаловидных клеток стало подобным воздействию только циклофосфамида. Эти результаты подразумевают участие нейтрофилов в индуци рованной пробками метаплазии бокаловидных клеток.

Обсуждение

В данном исследовании мы рассмотрели влияние введения агарозных пробок на метаплазию бокаловидных клеток в дыхательных путях апатогенных крыс, которые, в контрольном состоянии, имеют крайне незначительное количество бокаловидных клеток. Эпителиальные клетки бронхов контрольных животных и бронхов без агарозных пробок (контрольные легкие) окрашивались алцианом голубым/РА8 однородно отрицательно. Следствием введения агарозных пробок явилось глубокое, изменяющееся со временем увеличение площади бокаловидных клеток в бронхиальном эпителии в непосредственной близости от введенных пробок, которое стало обнаружимым в пределах 24 ч и достигло максимального уровня через приблизительно 72 ч после введения. Дыхательные пути, прилегающие к закупоренным дыхательным путям, также положительно окрашивались алцианом голубым/РА8. Общее количество клеток и количество основных и реснитчатых эпителиальных клеток не изменилось, однако возросло число бокаловидных клеток и после введения агарозных пробок переменно по времени снизилось количество негранулированных секреторных клеток (табл. 2). Эти результаты позволяют сделать предположение о том, что метаплазия бокаловидных клеток была результатом превращения негранулированных секреторных клеток в бокаловидные клетки.

Таблица 2. Влияние агарозных пробок на распределение бронхиальных эпителиальных клеток у апатогенных крыс*

Тип клеток	Контроль	24ч	48ч	72ч
Бокаловидные клетки	0,0±0,0	13,1±5,6	25,7±15,0	51,5±9,0
Клетки-предшественники бокаловидных клеток	0,0±0,0	32,8±2,9	25,7±15,0	51,5±9,0
Секреторные клетки	43,5±3,0	24,4±3,3	18,4±3,7	8,9±2,3
Реснитчатые эпителиальные клетки	98,5±4,0	83,8±7,9	81,6±5,0	84,0±3,9
Базальные клетки	18,4±5,7	10,6±0,8	11,6±1,7	11,0±2,3
Неопределенного типа ψ	1,3±0,5	1,4±0,8	1,1±0,1	0,6±0,4
Итого	161±7,2	166,1±6,1	175,5±6,2	180,9±7,5

Клетки анализировали, как описано в разделе Методы; η=5 в каждой группе. При определении свойств дополнительно прибегали к окрашиванию алцианом голубым/РА8 (последнее сочетание окрашивает слизистые гликоконъюгаты). В дыхательных путях контрольных животных находилось незначительное количество клеток-предшественников бокаловидных клеток и бокаловидных клеток. После введения агарозных пробок наблюдалось изменяющееся со временем (24, 48, 72 ч) увеличение количества клеток-предшественников бокаловидных клеток и бокаловидных клеток и снижение количества негранулированных секреторных клеток, по сравнению с контрольными животными.

* Данные представлены в виде среднего значения±средняя квадратичная ошибка, количество клеток/мм собственной пластинки слизистой оболочки.

фР<0,05 по сравнению с контролем. § Р<0,01 по сравнению с контролем.

I I Цитоплазматических характеристик недостаточно для отнесения клетки к определенной категории.

Сообщают, что бокаловидные клетки дыхательных путей крыс экспрессируют ген МиС5АС. В настоящих исследованиях контрольные бронхи не экспрессировали ген МиС5АС, однако дыхательные пути, закупоренные пробками либо прилегающие к упомянутым пробкам, позитивно окрашивавшиеся алцианом голубым/РА8, экспрессировали ген МиС5АС, что позволяет предположить, что ген МиС5АС вовлечен в индуцированное агарозными пробками продуцирование слизи. Эти результаты указывают на то, что агарозные пробки индуцируют экспрессию муциновых генов и продуцирование слизистых гликоконъюгатов в определенных клетках дыхательных путей крыс.

Исследовали механизм метаплазии бокаловидных клеток, индуцированной агарозными пробками. ЕСЕ-К, в норме, не экспрессируется в эпителии дыхательных путей апатогенных крыс, но индуцируется ТNЕ-α. В присутствии ЕСЕ-К в эпителии, результатом инстилляции лигандов ЕСЕ-К (ЕСЕ и ТСЕ-α) являлось усиление экспрессии муцинового гена и белка. Избирательный ингибитор тирозинкиназы ЕСЕ-К (В1ВХ 1522) полностью ингибирует эти реакции, что подразумевает передачу сигнала ЕСЕ-К при метаплазии бокаловидных клеток. Определяли влияние В1ВХ 1522 на индуцированную агарозными пробками метаплазию бокаловидных клеток: В1ВХ 1522 ингибировал индуцированное агарозными пробками продуцирование слизистых гликоконъюгатов и экспрессию гена МиС5АС. Этими результатами подразумевается каскад ЕСЕ-К в индуцированной агарозными пробками метаплазии бокаловидных клеток.

Изучали механизмы, посредством которых упомянутый каскад ЕСЕ-К вызывает метаплазию бокаловидных клеток агарозными пробка ми. Во-первых, мы исследовали экспрессию ЕСЕ-К белка в бронхиальном эпителии. Контрольные дыхательные пути окрашивались однородно негативно на ЕСЕ-К, однако, дыхательные пути, в которых находились агарозные пробки, демонстрировали избирательно изменяющееся со временем позитивное окрашивание на ЕСЕ-К. К числу позитивно окрашенных клеток относились негранулированные секреторные клетки, клетки-предшественники бокаловидных клеток и бокаловидные клетки. Таким образом, агарозные пробки индуцировали экспрессию ЕСЕ-К белка. У крыс, предварительно обработанных нейтрализующим антителом к ΤΝΕ-α, не развивалась индуцированная агарозными пробками метаплазия бокаловидных клеток, что подразумевает участие З^Е-а в индуцированной агарозными пробками экспрессии ЕСЕ-К.

Циклофосфамид, лекарственный препарат, избирательно депрессирующий продуцирование лейкоцитов, предотвращал рекрутмент нейтрофилов в промывную жидкость дыхательных путей и в эпителий дыхательных путей после введения агарозных пробок и, кроме того, предотвращал индуцированную агарозными пробками метаплазию бокаловидных клеток. После введения агарозных пробок увеличивалось также количество макрофагов, однако циклофосфамид не ингибировал рекрутмент макрофагов. Эти результаты позволяют предположить участие нейтрофилов в индуцированной агарозными пробками метаплазии бокаловидных клеток. Тот факт, что циклофосфамид также снижал экспрессию ЕСЕ-К белка после введения агарозных пробок, позволяет предположить, что нейтрофилы принимают, по крайней мере частичное, участие в экспрессии ЕСЕ-К при воспалительном состоянии.

Нейтрофилы способны также продуцировать лиганды ЕСЕ-К, ЕСЕ и ТСЕ-α. Кроме того, эпителиальные клетки являются источниками лигандов ЕСЕ-К и в непосредственной близости от агарозных пробок наблюдалось вызывающее удивление обнажение эпителия. Таким образом, эпителий может быть важным потенциальным источником как ΤNΕ-α, так и лигандов ЕСЕ-К.

Разумно предположить, что эффективный стимулирующий агент агарозной пробки связан с перемещением пробок в процессе дыхания с последующим сдиранием эпителия. Сообщали, что механическое повреждение эпителия дыхательных путей вызывает гиперсекрецию. Результаты упомянутых предшествующих исследований служат подтверждением гипотезы, суть которой заключается в том, что следствием механической травмы эпителия дыхательных путей является гиперсекреция. Сообщают, что следствием интубации трахеи у лошадей является обильное выделение слизи. Хроническая интубация у пациентов может вызывать гипер секрецию слизи и нести ответственность за закупорку слизью. Ингибиторы тирозинкиназы ЕСЕ-К могли бы использоваться для предотвращения гиперсекреции слизи после интубации трахеи.

Повреждение эпителия является обычным симптомом при исследованиях пациентов даже со слабыми формами астмы, и это повреждение в возрастающей степени связывается с ухудшением клинических симптомов. Повреждение эпителия, вызванное аллергической реакцией, может индуцировать активацию ЕСЕ-К, следствием которой является патологическое продуцирование бокаловидных клеток. Ранее представленные данные позволяют предположить, что активация ЕСЕ-К представляет собой иную реакцию, непосредственно вовлекающую метаплазию бокаловидых клеток. Механическое повреждение эпителия и повреждение эпителия при астме могут вовлекать одинаковый (ЕСЕ-К) каскад, следствием которого является патологический рост секреторных клеток эпителия. Это предоставляет механизм гиперсекреции, происходящей в случае острых астматических приступов со смертельным исходом.

Пример 4. Регрануляция бокаловидных клеток рецепторами ЕСЕ.

Дегрануляция бокаловидных клеток в назальном респираторном эпителии крыс индуцировалась интраназальной ингаляцией ГМЬР (Νформил-метионил-лейцил-фенилаланин). Значительная дегрануляция индуцировалась в назальном септальном эпителии через 4 ч после интраназальной ингаляции ГМЬР(10^-7 М). Регрануляция бокаловидных клеток имела место через 48 ч после ингаляции. В контрольном состоянии бокаловидные клетки экспрессировали МИС5АС белок, но не экспрессировали ЕСЕ-К белок. Оба ЕСЕ-К и МИС5АС муциновый ген и белок отсутствовали в контрольном эпителии, но экспрессировались на значительном уровне через 48 ч после ингаляции. Предварительная обработка ингибитором тирозинкиназы ЕСЕ-К, ΒΙΒΧ 1522, ингибировала экспрессию муцинового МИС5АС гена и белка после дегрануляции бокаловидных клеток, индуцированной ГМЬР. Эти результаты указывают на то, что экспрессия и активация ЕСЕ-К вовлечены в регрануляцию бокаловидных клеток в назальном эпителии крыс.

Методы

Животные. Протокол проведения экспериментов на животных был одобрен Комитетом по проведению исследований на животных (СоттШее ои Атта1 КекеагсЕ) Калифорнийского университета, Сан-Франциско. Были использованы специальные апатогенные крысы-самцы линии Е344 (масса 200-230 г; компания 5>ί топке п ЬаЬогаФпек, Сйгоу, штат Калифорния). Крыс содержали в апатогенных клетках ΒίοС1еаи с изолированными от окружающей среды вытяжными колпаками, обеспечивающими по дачу ламинарного потока воздуха; животные имели свободный доступ к стерильному корму и воде.

Получение назальных тканей. Через различные промежутки времени после ингаляции крыс анестезировали пентобарбиталом натрия (65 мг/кг, внутрибрюшинно). Сердце животного обнажали, тупоконечную иглу вводили через верхушку левого желудочка в восходящую аорту и проводили перфузию системы кровообращения 1% параформальдегидом. Разрез в правом предсердии обеспечивал впускное отверстие для фиксатора. Глаза, нижние челюсти, шкуру и мускулатуру удаляли, голову погружали на 24 ч в большой объем того же самого фиксатора. После завершения фиксирования голову декальцинировали с помощью препарата 8игд1ра111 (Декальцинатор II, компания 8шд1са1 Меб1са1 Шбийпек, 1пс., ШсЬтопб, штат Иллинойс) в течение 4-5 дней и прополаскивали в забуференном фосфатом физрастворе. Носовую полость рассекали в поперечном направлении на уровне резцового сосочка неба. Фронтальный тканевый блок заливали гликольметакрилатом О В 4 Р1и8, компания Ро1у8с1епсе8, 1пс., \Уагнпд1оп, штат Пенсильвания) либо составом ОСТ (компания 8акига Рше!ек, И.8.А., 1пс., штат Калифорния) для получения замороженных срезов. С передней поверхности гликольметакрилатных блоков получали срезы толщиной 5 мкм, которые окрашивали либо алцианом голубым (рН 2,5)/периодной кислотойШиффовым основанием (АВ/РА8) для демонстрации кислых и нейтральных гликоконъюгатов, либо 3,3'-диаминобензидином (компания 81дта Сбет1са1, 8ΐ. Ьошк, штат Миссури) для визуализации лейкоцитов, мигрировавших в эпителий. С передней поверхности залитых и замороженных блоков получали срезы толщиной 5 мкм, которые окрашивали АВ/РА8 либо использовали для иммунного окрашивания ЕОР-К и МИС5АС.

Подсчет нейтрофилов в назальном эпителии. Нейтрофилы подсчитывали с помощью микроскопа с большим увеличением на полях эпителиального слоя, окрашенного 3,3'-диаминобензидином при увеличении 400х. Количество нейтрофилов в назальном септальном эпителии (от базальной мембраны до верхушек клеток) определяли путем подсчета количества ядерных профилей на единицу длины собственной пластинки слизистой оболочки.

Количественное определение дегрануляции и регрануляции бокаловидных клеток. Для оценки дегрануляции и регрануляции бокаловидных клеток, мы измеряли объемную плотность окрашенных алцианом голубым/РА8 слизистых субстанций на слизистой поверхности эпителия с помощью полуавтоматической системы отображения в соответствии с ранее опубликованным методом. Окрашенные покровные стекла исследовались нами с помощью микро скопа Ахюр1аи (компания 2е188, 1пс.), связанного с блоком управления, снабженным видеокамерой (ОХС7550МО; компания 8опу Согр. о! Атенса, Рагк К1бде, штат Нью-Джерси). Изображения назального эпителия регистрировались на фазоконтрастном микроскопе с большим увеличением (400х) с помощью видеосистемы 1МАХХ (компания РЭ1, Кебтопб, штат Вашингтон). Внутриклеточный муцин в поверхностных эпителиальных секреторных клетках имел вид овальных гранул пурпурного цвета различных размеров. Мы измерили площадь, позитивно окрашенную алцианом голубым/РА8, и общую площадь эпителия. Полученные данные были выражены в виде процентного соотношения площади, окрашенной алцианом голубым/РА8, к общей площади. Анализ производился на компьютере Маст!о§Ь 9500/120 (компания Арр1е Сотри!ег, 1пс., Сирейто, штат Калифорния) с помощью находящейся в государственной собственности программы 1таде Национального института здоровья США.

Иммунолокализация ЕОР-К и МИС5АС белка. Замороженные срезы фиксированных параформальдегидом назальных тканей обрабатывали 3% Н₂О₂/метанолом для блокирования эндогенного пероксида и инкубировали с мышиным моноклональным антителом к ЕОР-К (комп. Са1Ыосбет, 8ап О|едо, штат Калифорния) либо МИС5АС (компания №оМагкег§ 1пс., Ргетоп!, штат Калифорния) в течение 1ч с разведением 1:100. Визуализацию иммунореактивного ЕОР-К или МИС5АС осуществляли с помощью набора Вес1а51ат ЕШе АВС кб (комп. УесЮг ЬаЬ., 1пс., Вшбтдате, штат Калифорния), используя 3,3'-диаминобензидина тетрагидрохлорид в качестве хромогена. Контроли включали замещение основного либо вторичного антитела РВ8.

Методы. Нами изучались апатогенные крысы, в носовом септальном эпителии которых, как правило, имеется большое количество бокаловидных клеток. Для определения влияния аэрозолированного !МЬР на дегрануляцию бокаловидных клеток и на миграцию нейтрофилов в эпителий назальной слизистой, животных анестезировали пентобарбиталом натрия (65 мг/кг, внутрибрюшинно) и интраназально в течение 5 мин в виде аэрозоля вводили раствор Ν-формилметионил-лейцил-фенилаланина (!МЬР, 10^-5 М, компания 81дта, 8ΐ. Ьошк, штат Миссури) в апирогенном физрастворе. Введение аэрозоля завершили вентилированием легких животных с помощью ультразвукового распылителя (Ри1то8ошс, компания ОеУйЬйк Со., 8отег§е!, штат Пенсильвания), образующего аэрозольный туман со скоростью 0,3 мл/мин. Подобным же образом контрольным животным интраназально вводили только аэрозоль в физрастворе.

Для исследования регрануляции назальных бокаловидных клеток после ингаляции !МЬР аэрозоля, крыс забивали через 48 ч после интраназального введения ГМЬР.

Для оценки влияния активации тирозинкиназы ЕСР-В на регрануляцию бокаловидных клеток, животных подвергали предварительной обработке (внутрибрюшинно) ингибитором тирозинкиназы ЕСР-В (В1ВХ 1522, 15 мг/кг, любезно предоставленным компанией ВоеЬппдег 1пде111ейп 1пс., 1пдеШе1т, Германия) за 30 мин до ингаляции ГМЬР с повторением дважды в день.

Статистика. Все данные выражены в виде среднего значения±средняя квадратическая ошибка среднего. Для каждой экспериментальной группы использовали однофакторный дисперсионный анализ либо ΐ-критерий Стьюдента. Вероятность менее 0,05 рассматривалась как свидетельство статистически значимого различия.

Результаты

Влияние дегрануляции бокаловидных клеток ГМЬР на структуру назального эпителия. В контрольном состоянии, назальный септальный эпителий имел значительную площадь АВ/РА8окрашенных бокаловидных клеток, однако, поверхность просвета оставалась неокрашенной. Иммунное окрашивание на муциновый МИС5АС белок соответствовало площади АВ/ РА8-окрашивания, однако, гибридизация 1п 5Йи продемонстрировала незначительную либо полное отсутствие экспрессии гена МИС5АС. Иммуногистохимическое окрашивание на ЕСР-В белок было негативным. Эти результаты указывают на то, что в назальном эпителии контрольных крыс содержатся интактные бокаловидные клетки, включающие МИС5АС белок при отсутствии экспрессии муцинового гена. Отсутствие окрашивания просвета позволяет предположить отсутствие дегрануляции (секреции) муцинов.

Была выдвинута гипотеза, суть которой заключалась в том, что в назальном эпителии нестимулированных крыс находятся стабильные недегранулированные бокаловидные клетки, содержащие муциновые белки. Было показано, что нейтрофильный хемоатрактант (например, ГМЬР) рекрутирует нейтрофилы в эпителии дыхательных путей, где они вызывают дегрануляцию бокаловидных клеток посредством эластазазависимого процесса. Для исследования влияния дегрануляции бокаловидных клеток интраназально в течение 5 мин вводили аэрозоль нейтрофильного хемоатрактанта, ГМЬР (10^-7 М). У крыс, забитых через 4 ч после ГМЬР, значительно уменьшилась АВ/РА8-окрашенная площадь, площадь МИС5АС-позитивной иммунной окраски и произошел рекрутинг нейтрофилов в назальный эпителий. Была сильно выражена АВ/РА8-окраска поверхности просвета назальных дыхательных путей, что служило подтверждением произошедшей дегрануляции бокаловидных клеток. Однако через 4 ч после ГМЬР экспрессия гена МИС5АС оставалась неизменной.

У крыс, забитых через 48 ч после ГМЬР, при иммуногистохимическом окрашивании антителом к ЕСР-В наблюдалась позитивная окраска на ЕСР-В у клеток-предшественников бокаловидных клеток и бокаловидных клеток, в то время как площадь АВ/РА8- и МИС5АСиммунопозитивной окраски вернулась к уровню, наблюдавшемуся в контрольном состоянии, свидетельствуя о произошедшей регрануляции назальных бокаловидных клеток. В это время рекрутинг нейтрофилов более не наблюдался; экспрессия гена МИС5АС наблюдалась на участке, занятом бокаловидными клетками, что свидетельствовало о том, что регрануляция бокаловидных клеток была связана с повышенной экспрессией муцинового гена.

Роль фосфорилирования тирозинкиназы ЕСР-В в регрануляции бокаловидных клеток. В предшествующих исследованиях на крысах сообщалось, что следствием активации ЕСРрецепторов (ЕСР-В) является экспрессия муцинового гена и белка. Для проверки гипотезы о том, что активация ЕСР-В играет роль в регрануляции назальных бокаловидных клеток крыс после ГМЬР, крыс предварительно обрабатывали (п=5) избирательным ингибитором тирозинкиназы ЕСР-В, В1ВХ 1522; аэрозолирование ГМЬР вызывало рекрутинг нейтрофилов в назальный эпителий и дегрануляцию бокаловидных клеток, однако, через 48 ч площади АВ/РА8-окраски и МИС5АС-иммунопозитивной окраски оставались неизменными. Эти результаты подразумевают участие активации ЕСР-В в синтезе муцина назальными бокаловидными клетками после дегрануляции ГМЬР.

В настоящем исследовании мы изучали регуляцию продуцирования муцина в назальном эпителии крыс. В контрольном эпителии находилось значительное количество бокаловидных клеток и в этих клетках присутствовал МИС5АС белок. Экспрессия гена МИС5АС, однако, отсутствовала. Сообщалось, что экспрессия муцина МИС5АС в других эпителиальных клетках дыхательных путей происходила через посредство экспрессии ЕСР-В и их активации. В клетках назального эпителия контрольных крыс мы не обнаружили экспрессии ни гена ЕСР-В, ни белка. Окрашивания просвета АВ/РА8 на МИС5АС белок не наблюдалось, что позволяет предположить, что значительной дегрануляции (секреции) бокаловидных клеток не происходило. ЕСР-В мог супрессироваться в стабильных бокаловидных клетках, что предотвращало дальнейший синтез муцина. В связи с этим мы провоцировали назальные бокаловидные клетки посредством индуцирования дегрануляции бокаловидных клеток и исследовали последующие изменения в структуре эпителия дыхательных путей.

Нейтрофильные хемоатрактанты вызывают нейтрофилзависимую дегрануляцию бокаловидных клеток в дыхательных путях морской свинки и человека, опосредованную эластазой нейтрофилов, обеспечивая тесный контакт между нейтрофилами и бокаловидными клетками. Для индуцирования дегрануляции бокаловидных клеток, обычно присутствующих в назальной перегородке, хемоатрактант, ίМ^Ρ, ингалировали интраназально. ГМЬ-Ρ рекрутировал нейтрофилы в назальный эпителий с последующей дегрануляцией бокаловидных клеток; существенно сокращалась площадь, окрашенная алцианом голубым/ΡΑδ.

Далее, мы исследовали последующие события в назальном эпителии после ГМР-Ρиндуцированной дегрануляции бокаловидных клеток. Через 4 ч после ГМк-Ρ. когда произошла максимальная дегрануляция назальных бокаловидных клеток, экспрессии ЕСЕ-К и МυС5ΑС не наблюдалось. Однако через 48 ч после введения ГМЬ-Ρ началась интенсивная экспрессия ЕСЕ-К в клетках-предшественниках бокаловидных клеток и бокаловидных клетках. К этому моменту ген МυС5ΑС интенсивно экспрессировался в эпителии и эти события были связаны с регрануляцией бокаловидных клеток (усиленное окрашивание ЛВ/ΡΑΞ и МυС5ΑС). Фактически, через 48 ч после введения ГМЕВ, регрануляция достигла такого уровня, что площадь, занятая бокаловидными клетками, находилась в состоянии, напоминавшем контрольное. Эти данные позволяют предположить, что дегрануляция бокаловидных клеток ведет к экспрессии и активации ЕСЕ-К, индуцируя тем самым экспрессию муцина МυС5ΑС.

Для исследования роли активации тирозинкиназы ЕСЕ-К в регрануляции бокаловидных клеток, мы предварительно обрабатывали животных избирательным ингибитором тирозин киназы ЕСЕ-К, В1ВХ 1522. У животных, предварительно обработанных В1ВХ 1522, ГМЬ-Ρ попрежнему вызывал дегрануляцию бокаловидных клеток. Однако предварительная обработка В1ВХ 1522 предотвращала регрануляцию бокаловидных клеток и их экспрессию МυС5ΑС белка. Эти результаты подразумевают участие активации ЕСЕ-К в повторном увеличении количества муцинов после дегрануляции бокаловидных клеток. Бокаловидные клетки у апатогенных крыс неактивны (т.е. не дегранулируются) и ЕСЕ-К супрессированы. В случае, когда воспаление (например, стимулирование инфильтрации нейтрофилов) вызывает дегрануляцию бокаловидных клеток и секрецию муцина, позитивная регуляция и активация ЕСЕ-К обеспечивает повторную поставку муцинов в эпителий дыхательных путей. Данные, полученные при проведении настоящих исследований, позволяют предположить, что избирательные ингибиторы тирозинкиназы ЕСЕ-К могут исполь зоваться для предотвращения гиперсекреции при назальных заболеваниях.

В то время как настоящее изобретение было описано со ссылкой на специфические варианты его осуществления, специалистам в данной области следует понимать, что могут производиться различные изменения и эквивалентные моменты могут замещаться без отступления от истинного духа и объема настоящего изобретения. В дополнение к этому многие модификации могут осуществляться для приспособления конкретной ситуации, материала, композиции вещества, процесса, этапа либо этапов процесса к целям, духу и объему настоящего изобретения. Предполагается, что все подобные модификации входят в объем пунктов прилагаемой формулы изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ лечения гиперсекреции слизи в легких, включающий введение терапевтически эффективного количества антагониста рецептора эпидермального фактора роста (ЕСЕ-К), который связывается с ЕСЕ-К, пациенту, страдающему от гиперсекреции слизи в дыхательных путях.
2. Способ по п.1, где упомянутым антагонистом ЕСЕ-К является ингибитор киназы, селективный в отношении ЕСЕ-К.
3. Способ по п.1, где упомянутым антагонистом является антитело.
4. Способ по п.3, где упомянутым антителом является моноклональное антитело, специфически связывающее рецептор фактора эпидермального роста (ЕСЕ-К).
5. Способ по п.1, где упомянутый антагонист ингибирует перефосфорилирование ЕСЕ-К.
6. Способ по п.5, где упомянутым антагонистом является антиоксидант.
7. Способ по п.1, где упомянутый антагонист вводят посредством впрыскивания.
8. Способ по п.7, где упомянутый антагонист вводят интравенозно с носителем в форме нормального физиологического раствора.
9. Способ по п.1, где упомянутый антагонист вводят посредством ингаляции.
10. Способ по п.1, где упомянутый антагонист вводят с помощью липосом.
11. Способ по п.1, где упомянутая липосома стерически стабилизирована и вводится интравенозно.
12. Способ ίη νίΐτο скрининга испытываемых средств для выявления антагонистов ЕСЕК, ингибирующих гиперсекрецию слизи, включающий (ί) введение модели ίη νίΐτο пролиферации бокаловидных клеток в контакт с ЕСЕ либо его функциональным эквивалентом;

(ίί) последующее введение упомянутой модели ίη νίΐΓΟ в контакт с испытываемым средством и (ίίί) оценку пролиферации бокаловидных клеток;

где снижение пролиферации бокаловидных клеток свидетельствует о терапевтическом потенциале данного средства.
13. Способ по п.12, где упомянутыми моделями ш ν 11 го являются эпителиальные клетки легких.
14. Способ 1п νί\Ό скрининга испытываемых средств для выявления антагонистов ЕСРВ, ингибирующих гиперсекрецию слизи, включающий (ί) получение животной модели гиперсекреторного легочного заболевания посредством включения ЕСР-В;

(ίί) стимулирование индуцированного ЕСР-В лигандом для продуцирования бокаловидных клеток, продуцирующих муцин;

(ίίί) обработку испытываемым средством и (ίν) оценку пролиферации бокаловидных клеток либо секреции слизи;

где ингибирование пролиферации бокаловидных клеток либо секреции слизи свидетельствует о терапевтическом потенциале данного испытываемого средства.

Фиг. 1
15. Способ по п.14, где животное, использованное в упомянутой модели ш νί\Ό, выбирают из группы, включающей мышь, крысу, кролика и морскую свинку.
16. Способ по п.14, где упомянутой моделью 1п νί\Ό является модель астмы.
17. Фармацевтическая композиция для лечения гиперсекреции слизи в дыхательных путях, содержащая терапевтически эффективное количество антагониста рецептора эпидермального фактора роста (ЕСР-В) в количестве, достаточном для снижения гиперсекреции слизи в дыхательных путях, и текучую композицию, пригодную для осуществления доставки путем ингаляции, причем упомянутым антагонистом ЕСР-В является ингибитор тирозинкиназы.
18. Фармацевтическая композиция по п.17, в состав которой вместе с антагонистом ЕСР-В входят жидкий носитель и пропеллент.
19. Фармацевтическая композиция по п.17, в которой антагонист ЕСР-В содержится в водном или этанольном растворе.
20. Фармацевтическая композиция по п.17, в которой антагонист ЕСР-В входит в состав сухой порошковой композиции.

ΒΙΒΧ1522