TWI250019B - Preventing airway mucus production by administration of EGF-R antagonists - Google Patents

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1250019 A7 B7 五、發明說明（4 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) J. Med. 326:8 1 2 )。此外，胸腔物理治療法還包括叩診、 振動及排水，亦用於促進黏性黏液的淸除率。肺臟移植則 爲肺部嚴重受損的最後選擇。因此，較有效的或替代的治 療法爲針對黏膜的分泌。明確的說，有須要能降低呼吸道 中黏液分泌形成的特定治療法。 相關的文獻 使用E G I F抑制劑阻擾癌症細胞生長，參見Levitski (1994) Eur J Biochem. 226 (1): 1-13 ; Powis (1994) Pharmac. Ther. 62:57-95 ; Kondapaka and Reddy ( 1 996)

Mol. Cell. Endocrin. 1 1 7:5 3 -5 8。 發明摘要 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 呼吸道中黏液過度分泌是許多不同肺部疾病之不良症 狀。分泌現象是高腳枉狀細胞去顆粒化的結果，經由刺激 表皮生長因子受體（E G F - R )可促進高腳枉狀細胞增 生。本發明對肺部過度分泌投用治療量的E G F拮抗劑， 較佳者爲磷激酶抑制劑。拮抗劑的形式可爲小分子、抗體 、或其抗體部分能結合至E G I F或其受體。本發明其他 特色中提供一種在離體及活體中預測有抑制黏液過度分泌 之治療潛力的候補藥劑的方法。 本發明主要的目的係提供一種治療肺部黏液過度分泌 之疾病的方法。 本發明的其他目的係提供一種用於治療黏液過度分泌 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250019 Α7 Β7 五、發明說明（5 ) 產生之疾病的調配物。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明之其他目的係提供一種於離體中篩選抑制黏液 過度分泌之ί丨矢補樂劑之測定方法，該方法包括以F之步馬聚 :(1 )離體中將高腳枉狀細胞增生之模式與E G F或其 功能相當的物質接觸；（ϋ )接著將離體中模式與候補藥 劑接觸，以及（iii )評估高腳枉狀細胞增生，其中對高腳 枉狀細胞增生之抑制即表示候補藥劑治療的功效。 本發明其他目的係提供於活體中篩選抑制黏液過度分 泌之候補藥劑之測定方法，該方法包括以下之步驟：（1 )誘導EGF — R，例如用腫瘤壞死因子—α (TNF -α )，以創造過度分泌的肺部疾病的動物模式；（ii )用 配基刺激引發的E G F - R，例如：轉形生長因子α ( T G F — α )或E G F ，以產生能產生黏蛋白的高腳枉狀 細胞，（Mi )用候補藥劑處理；以及（iy )評估高腳枉狀 細胞增生或黏液分泌，其中對高腳枉狀細胞增生或黏液分 泌之抑制即表示候補藥劑治療的功效。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明進一步的目的係提供一種於離體中及活體中鋪 選可抑制黏液過度分泌之E G F - R拮抗劑之測定方法。 本發明優點之一係提供一種預防肺部呼吸道黏液過度 形成的方法。 本發明之特色之一係使用不同類型之拮抗劑以阻擾 EGF及/或TGF — α及其與EGF — R交互作用之效 應。 本發明之特色之一爲一種降低哺乳動物病人（較佳者 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -8 - 1250019 A7 B7 五、發明說明（6 ) 爲人類病人）呼吸道黏液分泌形成之E G F拮抗劑調配物 0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明其他目的係提供一種在肺部傳遞E G F拮抗劑 的方法，以降低哺乳動物病人（較佳者爲人類病人）呼吸 道黏液分泌形成。 本發明其他目的係提供一種治療其症狀爲呼吸道過度 分泌黏液之不同疾病之方法。此類疾病包括（但非限於） :慢性支氣管炎、急性氣喘、囊狀纖維變性、支氣管擴張 症、慢性的堵塞性肺部疾病、起因於上皮損害過的過度分 泌，例如：過敏性的刺激或機械的磨耗、及鼻腔的過度分 泌。 熟悉此技藝的專業人士閱讀以下完整的詳細治療方法 ，以及於離體及活體中測定方法後即可發現此類及其他目 的、優點、及本發明之特色是顯而易見的。 圖形簡述 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 圖1A爲NC I— H292及A43 1細胞中EGF 一R之西方墨點分析。圖1B爲用抗一EGF—R抗體分 析N C I - Η 2 9 2培養細胞之免疫細胞化學。圖1 C爲 N C I - Η 2 9 2細胞E G F — R之北方分析。 圖2 . NC I - Η2 9 2細胞之亞西藍（Alcian blue ) / PAS染色以確認黏蛋白糖蛋白質。 圖3 · NCI— H292細胞中MUC5基因表現 之北方分析。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -9- 1250019 Α7 Β7 五、發明說明（7 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖4A及4B。無病源之老鼠中以抗一 EGF — R抗 體進行E G F - R之免疫組織化學分析。圖4 A爲 T N F α處理的老鼠。圖4 B爲卵白蛋白敏感的老鼠。 圖5是E G F - R酪胺酸磷激酶抑制劑（ Β I Β X 1 5 2 2 )對高腳枉狀細胞產生之效應（用呼吸 道上皮被亞西藍（Alcian blue ) / P A S正性染色細胞的 染色區域％加以表示）。 較佳具體實施例之詳細說明 一種投用治療量的E G F拮抗劑（較佳者爲磷激酶抑 制劑）治療呼吸道黏液過度分泌之組合物及方法。拮抗劑 可爲結合至E G F或其受體的小分子、抗體、或抗體部分 之形式。呼吸道過度分泌的疾病，例如：慢性支氣管炎、 支氣管擴張症、囊狀纖維變性、急性氣喘、C Ο P I D等 ，其呼吸道黏蛋白合成增加且黏液過度分泌。分泌黏液導 致呼吸道阻塞是此類疾病的致死原因。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 許多引起呼吸道損害及炎症的因素可引發呼吸道上皮 細胞的表皮生長因子受體的表現。誘發E G F - R後，經 配基依存的及非依存的機制刺激E G F - R可導致黏蛋白 基因表現及蛋白質之含量增加。E G F - R酪胺酸磷激酶 的選擇抑制劑可阻擾此黏蛋白基因及蛋白質表現。 一般而言，高腳枉狀細胞產生的演變順序和E G F -R之表現相關。經T N F α刺激後可增強非顆粒狀的分泌 細胞E G F — R之染色；經E G F — R配基活化後可引起 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250019 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（8 ) 細胞質黏液糖化結合物的染色持續增加，細胞先變成 '' 前 高腳枉狀〃再變成 ''高腳枉狀〃細胞。數據顯示活化 E G F - R可促進選擇細胞分化，而非增生。高腳枉狀細 胞係源自表現E G F - R的非顆粒狀分泌細胞，經E G F 一 R配基刺激可產生黏蛋白。 除了經細胞分裂素刺激之外，E G F - R可經其他信 號（例如：長期抽煙刺激）中介引起周邊呼吸道進行性的 病理改變，包括高腳枉狀細胞之細胞增殖。前發炎性的細 胞分裂素活化的嗜中性白血球以及抽煙可經配基依存的活 化E G F - R，引起人類支氣管上皮細胞黏蛋白的合成， 顯示被徵召之嗜中性白血球及抽煙爲上皮細胞分化之調控 者，能在呼吸道中異常的誘發產生黏蛋白之細胞。嗜中性 白血球可經各種刺激活化，包括：I L 一 8、N -甲醯基 一甲硫胺醯基一白胺醯基一苯基丙胺酸、TNF - α、抽 煙或Η 2 0 2向上調節上皮細胞黏蛋白（其合成可被E G F - R抑制劑加以抑制）的表現。嗜中性白血球亦能產生 E G F — R配基、E G F及T G F α。此外，上皮細胞亦 爲EGF-R配基之來源。 呼吸道上皮機械性損傷亦可引起過度分泌，並造成黏 液阻塞。E G F - R酪胺酸磷激酶抑制劑可在氣管插管後 預防黏液過度分泌。 上皮損害一般發生在輕度氣喘的病人身上，隨著臨床 症狀之惡化損害逐漸增強。由過敏性反應產生之上皮損害 會引發E G F - R活化，導致異常高腳枉狀細胞的產生。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----L----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 11 - 1250019 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（9) E G F — R涉及上皮損害，例如：氣喘時、'呼吸道重整" 、修補及傷癒。機械及氣喘造成的上皮損害涉及相似的 E G F - R串連反應，造成上皮分泌細胞的異常生長。 過度分泌亦是發炎性鼻病的重要表現形式。當鼻腔的 高腳枉狀細胞用嗜中性白血球依存的機制 ''挑戰〃而誘導 高腳枉狀細胞去顆粒化後，E G F - R及黏蛋白即表現強 烈的向上調節作用。引起高腳枉狀細胞重行造粒。當發炎 症（例如：刺激嗜中性白血球浸潤）引起高腳枉狀細胞去 顆粒化及黏蛋白分泌後，向上調節作用及E G F - R活化 作用可補充呼吸道上皮黏蛋白。 在描述本方法之治療及調配物之前，應了解本發明並 不限於描述的特定方法及調配物。亦應了解本文使用之名 稱係僅爲描述而非限制特定的具體實施例，本發明之範圍 僅受限於以下之申請專利範圍。 除非另行定義，所有在本發明中使用之技藝及科學名 稱均與一般熟悉此技藝的專業人士所熱知者相同。雖然任 何類似或相當本發明或測試之方法及材料均可使用，較佳 的方法及材料描述於下。所有本文提及揭示及描述方法及 /或材料之文獻全文在此倂入參考文獻。 本文討論之文獻僅因其係揭示於本申請案之前。並不 一定代表其核準公佈於本發明之前。此外，該文獻提供之 公佈日期可能與實際的公佈日期不同，須要另行察證。 疋我 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 丨·—-ί----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -12- 1250019 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（1〇) ''表皮生長因子〃或'' E G F 〃係指蛋白質或其部分 ’其特徵在於具有刺激上皮細胞進行細胞有絲分裂活性的 生物活性（例如，Cohen (1986) Biosciences Reports 6(12): 1017; Aaronson，S.A.，'、Growth Factors and Cancer，〃 Science ( 1 99 1 ) 254 1 1 46- 1 1 5 3 )。實施例爲人類表皮生長因 子，例如描述於 Urdea et al. (1983) Proc. Nat. Acad. Sci. 80:746 卜7465。 本發明的目的係關於E G F對高腳枉狀細胞刺激細胞 有絲分裂的活性。在此定義下亦包括具有E G F生物的反 應能進行E G F功能的的部分蛋白質。 ''表皮生長因子受體〃或'' E G F — R 〃指蛋白質部 分能結合E G F蛋白質或其部分的蛋白質。實施例爲人類 表皮生長因子受體（參見Ullnch et al. ( 1 984) Nature 309: 418-425 ;基因庫編號N M - 0 0 5 2 2 8 )。較佳之 E G F配基結合能活化E G F - R (例如造成細胞內刺激 細胞有絲分裂信號的活化、E G F - R自動磷酸化）。熟 悉此技藝的專業人士將認知除E G F之外其他配基亦可結 合至E G F - R並活化E G F - R。此類配基之實施例包 括（但非限於）T G F - α、/3動物纖維素、雙性調控素 (amphiregulin)、結合肝素之 EGF (HB — EGF)及 神經調控素（neuregulin，亦稱爲西調控素（hergulin))( Strawn and Shawver ( 1 998) Exp.-Opm. Invest. Drugs 7(4) 5 5 357 3、及、、The Protein Kinase Facts Book: Protein Tyrosine Kinases" (1995) Hardie, et al.(eds·)，Academic 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -13- I.---^----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250019 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（11)

Press，NY，NY )。 '' E G F - R拮抗劑〃指能直接的或間接的抑制 E G F - R效應的任何藥劑，尤其是能抑制E G F - R對 高腳枉狀細胞增生或高腳枉狀細胞黏液過度分泌的效應。 E G F - R可經配基依存的及配基非依存的機制活化，分 別造成自動磷酸化或反磷酸化。E G F - R拮抗劑可抑制 任一種或此二種機制。例如，T N F - α結合至E G F — R導致配基依存的磷酸化，其可被結合E G F - R之抗體 阻擾，因此可防止E G F與活化E G F受體配基之交互作 用。此類抗體之實施例描述於Goldstein et al.( 1 995) Clin. Cancer Res. 1: 1311-1318; Lorimer et al. ( 1 995) Clin. Cancer Res. 1:85 9- 864-, Schmidt and Weis ( 1 996) Br. J. Cance 74:85 3 -862。小分子酪胺酸磷激酶抑制劑亦爲有效的 E G F - R拮抗劑。 此外，據顯示化合物（例如氧自由基）可刺激E G F - R之經磷酸化，造成受體配基依存的活化。其他經磷酸 化活化E G F - R之方法包括紫外線及滲透的緊迫、經內 皮素（endothelin ) — 1刺激G -蛋白質耦合的受體、溶血 磷脂酸及凝血酶、m 1覃毒乙醯膽鹼受體、及人類生長荷 爾蒙。此類配基依存機制的拮坑劑包括抗氧化劑，例如： 超氧化物歧化酶、D M S 0、D Μ T U、抗壞血酸等。 E G F - R拮抗劑可爲結合至刺激E G F產生或 E G F - R產生之因子的抗體，因此抑制E G F對高腳枉 狀細胞增生之增進（即磷醯化E G F - R之磷酸化串聯反 1'—』----------------訂---------線· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 14- 1250019 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7_____ 五、發明說明（12) 應之抑制劑）。例如，T G F α —假單胞菌外毒素4 0之 融合蛋白質，描述於 Arteaga et al. ( 1 995) Cancer Res. 54: 4703-4709 。 在較佳的具體實施例中，E G F - R拮抗劑是E G F - R酪胺酸磷激酶活性的抑制劑，尤其是較之其他酪胺酸 磷激酶具有E G F - R選擇作用的小分子抑制劑-較佳的 小分子可阻擾哺乳類（較佳者爲人類）之E G F受體，其 分子量少於1 k D。 E G F及E G F - R抑制劑包括（但非限於）酪胺酸 磷激酶抑制劑，例如喹唑啉、例如：P D 1 5 3 0 3 5 、4 一（3 —氯苯胺基）喹唑啉、或CP — 358，774 、吡啶嘧啶、嘧錠嘧啶、吡咯基嘧啶，例如： CGP 59326 、CGP 6 0 261 及 C G P 6 2 7 〇 6、及11 比 口坐並嘧口定（Shawn and Shawver ，supra· ) 、4 一（苯基胺基）—7 Η —吡咯基〔2，3 — d〕喃D定（Traxler et al，（1996) J. Med. Chem 39:2285-2292 )、薑黃色素（二阿魏醯基甲院）（Laxmin arayana, et al.，（ 1 99 5 ), Carcinogen 1 6:1 74 1 - 1 745 ) 、4，5 —雙（ 4 —氟苯胺基）酞酼亞胺（Buchdungeretal.( 1 995)Clln· Cancer Res. l:813-821;Dinney et al. (1997) Clin. Cancer Res. 3:161-168 );胰主素（tyrphostin )含硝基噻吩部份（ Brunton et al. ( 1 996) Anti Cancer Drug Design 1 1:265 -295 );蛋白質磷激酶抑制劑 ZD- 1 8 3 9 (AstraZeneca); CP- 3 5 8 7 74 (Pfizer，inc·); PD-0183805 (Warner-Lambert);或描述於 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I-—』----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -15- 1250019 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（13)

International patent application W099/09016 (American Cyanamid); W098/43960 (American Cyanamid); W097/38983 (Warener Labert); W099/06378 (Warner Lambert); W099/063 96 (Warner Lambert); W096/30347 (Pfizer, Inc.); W096/3 3978 (Zeneca); W096/33977 (Zeneca);及 WO96/3 3 9 80 (Zeneca)，全體在此并入參考文獻，或反股分 子。 ''抑制〃指降低、中和、或預防高腳枉狀細胞之增生 、高腳枉狀細胞去顆粒化或高腳枉狀細胞黏液之過度分泌 〇 ''治療〃、 ''治療方法〃等一般指得到須要的藥理及 /或生理效應。效應可爲預防性的完全或部分預防疾病或 其症狀及/或可治療部分或完整的疾病及/或歸因於疾病 的不良效應。、治療〃包括治療任何哺乳類（尤其是人類 )之疾病，包括： (a )預防易感受但尙未診斷出患有疾病或症狀之患 者產生此疾病或症狀； (b )抑制疾病或症狀，即制止其發生，或； (c )緩和疾病或症狀，即引起疾病或症狀之退化。 本發明係關於治療肺部或呼吸道疾病的病人，尤其是治療 黏液過度分泌的病人，即預防、抑制或緩和黏液過度分泌 。於治療症狀時，本發明係關於降低呼吸道黏液或多痰、 抑制病理生物體的感染、減輕咳嗽、以及預防由呼吸道阻 垂引起的組織缺氧。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公1 ) |„---U----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -16- 1250019 A7 B7 五、發明說明（14) Μ 0月確的目兌’ '、治療〃係對患有黏液過度分泌的肺部 疾病病人提供可偵測的有利治療效應。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 更明確的說’、、治療〃指用化合物預防、減輕、及/ 或抑制黏液過度分泌，其係選自E G F及/或E G F - R 括抗劑’例如：抗體、蛋白質酪胺酸磷激酶抑制劑及反股 分子等。其他的治療包括預防呼吸道中E G F - R表現， 阻擾早期之路徑。例如，阻擾T N F α結合至其受體之試 劑可預防E G F — R之向上調節。 治療包括預防或抑制病理及/或相關黏液過度分泌藥 劑的感染。 ''抗體"指能結合抗原之免疫球蛋白蛋白質。抗體包 括：抗體片段，例如：F ( a b / ) 2、F a b 一、F a b ，其能結合特定的抗原或免疫性的片段。較佳者，抗體結 合至抗原可抑制E G F或E G F - R之活性。 本文中 ''人類化的抗體〃係描述完整的抗體分子，即 包含兩個完整的輕鏈及兩個完整的重鏈，以及僅由抗體片 段組成的抗體，例如：F a、F a b >、F ( a b = ) 2、 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 及F v，其中C D R係源自非人類的來源，I g分子上其 他部分或其片段則是源自人類抗體，較佳者產生自人類抗 體之核酸序列編碼。 本文中 ''人類抗體〃及 ''人類化的抗體〃描述抗體分 子所有部分係源自人類抗體核酸序列編碼之抗體。此人類 抗體最適於用於抗體治療’此抗體對人類病人少有或無免 疫反應。 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250019 A7 B7 五、發明說明（15) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本文中 ''嵌合的抗體〃描述上述定義之、、人類化的抗 體〃的抗體分子及抗體片段。、、嵌合的抗體〃包含人類化 的抗體。嵌合的抗體中至少有一部分之重或輕鏈胺基酸序 列源自第一種哺乳動物’其他部分之重或輕鏈胺基酸序列 源自第二種不同之哺乳動物。較佳者，多變的區域係源自 非人類之哺乳動物，固定的區域係源自人類。明確的說， 嵌合的抗體較佳者係產生自非人類哺乳類編碼多變區域的 苷酸序列以及人類抗體編碼固定區域的核苷酸序列。 "專一地結合〃指抗體以高親合力及/或高親和性結 合至特定的多肽。抗體結合至其多肽特定的抗原決定部位 較之相同抗體對其他抗原決定部位之結合爲強，尤其是較 樣品中與特定的多肽同時存在之分子爲強。特定結合至多 肽的抗體亦可能可偵測的微弱之結合至其他多肽，例如 1 0 %或更少的結合至多肽。此微弱的結合，或背景結合 可與抗體專一的結合至化合物或多肽加以區別，例如使用 適當的對照組。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ''可偵測之經標記抗體〃，''可偵測之經標記抗-E G F 〃或 ''可偵測之經標記抗一 E G I F片段〃指抗體 (或具有結合專一性的抗體片段）上聯結可偵測的標記。 可偵測的標記一般經化學結合聯結，但當標記物是多肽時 ，可用基因工程的技藝聯結。產生可偵測地經標記之蛋白 質的方法是已知的技藝。可偵測的標記係僅能選自各種技 藝上已知的此類標記，但一般爲放射性同位素、螢光團、 酵素，例如：辣根過氧化酶，或其他部分或放射可偵測的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -18- 1250019 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（16) 信號（例如放射性活性、螢光、色彩）之化合物或標記暴 露至受質後放射可偵測的信號。各種可偵測的標記/受質 對（例如辣根過氧化酶/二胺基對二胺基聯苯、卵白素/ 抗生蛋白鏈菌素、螢光素酶/螢光素）、標記抗體之方法 、使用經標記之抗體偵測抗原之方法爲已知的技藝（例如 ，參見Had 〇 w and Lane, Eds. (Antibodies: A Laboratory Manual ( 1 9 8 8) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，NY ) o 治療的方法 本發明提供一種以投用治療量的E G F — R拮抗劑治 療肺部過度分泌的方法。任何疾病，尤其是其特徵在於病 理上黏液過度分泌或堆積黏液含量的肺部疾病均可用描述 於此之方法治療。可用此方法治療之肺部過度分泌疾病的 實施例包括（但非限於）：慢性的堵塞性肺部疾病，例如 :慢性支氣管炎、發炎性疾病，例如：氣喘、支氣管擴張 症、肺部纖維變性、C 0 P D、鼻腔的過度分泌的疾病， 例如：鼻腔過敏症、及其他過度分泌的疾病。遺傳疾病， 例如：囊狀纖維變性、卡氏（K a r t a g e n e r )症候群、α — 1 -抗胰蛋白酶缺乏症、家族性非囊狀纖維變性呼吸道黏液 濃縮等亦包括在內。 以直接作用於E G F或E G F — R上的拮抗劑較佳。 但是，熟悉此技藝的專業人士均認知任何涉及生物串聯反 應導致E G F - R促進高腳枉狀細胞增生的因子或細胞均 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） |_---^----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -19- 1250019 A7 B7 五、發明說明（17 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 可作爲抑制的目標’例如T G F - α捨抗劑。理論上不須 經過結合，在發炎性反應的串聯反應中細胞（例如肥大細 胞或嗜中性白血球）釋放T N F - α後可促進E G F - R 之表現。刺激E G F - R (例如經E G F配基）可激發高 腳枉狀細胞增生。因此任何涉及串聯反應（例如：T N F - α路徑）之細胞或因子’均爲拮抗劑活性之標的。 治療的方法中可用任何形式投用E G F — R拮抗劑。 實施例中E G F - R拮抗劑可爲小分子形式（即反股寡核 苷酸、酪胺酸磷激酶抑制劑等），結合至E G F、 TGFa或EGF-R之抗體或其部分。 小分子E G F - R拮抗劑 作用於E G F受體之酪胺酸磷激酶及選擇的作用於 E G F - R之抑制劑爲已知的技藝，可用於本方法。上述 之實施例包括 B I B X 1 5 2 2 ( Boehnnger Ingelheim，

Inc., Ingelheim, Germany); CGP59326B (Novartis Corporation，Basel, Switzerland ) ; 4 —胺基 奎 1:1坐啉 E G F 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 —R抑制劑（描述於U.S. Patent no· 5,760,04 1 );經取代 的苯乙烯化合物，亦可爲萘、氫茚或苯并鳄畊化合物；包 括腈及單腈化合物（描述於U.S. Patent n〇. 5,2 1 7,999 ); 揭示於U.S. Patent no. 5,773,476之抑制劑；馬鈴薯羧基胜 肽酶抑制劑（P C I )，爲3 9個胺基酸含三個雙硫橋之 蛋白酶抑制劑（Blanco-Apancio et al. (1998) J Biol Chem 273(20):1 2370- 1 2377 );旁北素（bombesin )拮抗劑 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -20- 1250019 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（18) R-C — 3095 ( Szepeshazi et al.( 1 997) Proc Natt Acad Sci U S A 94:1 09 1 3- 1 09 1 8 )等，其他酪胺酸磷激酶抑制劑 包括喹唑啉，例如：p D 1 5 3 0 3 5 ，4 — ( 3 —氯 苯胺基）喹唑啉、或C P — 3 5 8 ，7 7 4 、吼啶嘧啶、 嘧錠嘧啶、吡咯基嘧啶，例如：C G P 5 9 3 2 6、 CGP 6〇261&CGP 62706、及吡唑並嘧 症（Shawn and Shawver，supra.) 、4 —(苯胺基）—7 Η —吼略基〔2，3 — d〕Π密 d定（Traxler et al.(1996) J.

Med· Chem 39-.2285-2292 )、薑黃色素（Korutla et al.( 1994) Biochim Biophys Acta 1224i 597-600); (Laxmin arayana (1995)， Carcinogen 16:1741-1745 )等。 較佳的酪胺酸磷激酶抑制劑係選擇性抑制受體，即對 E G F - R之抑制大於細胞表面其他具有酪胺酸磷激酶活 性之受體。調配物及藥物傳遞（例如：抑制劑最好運送至 發炎的呼吸道）等方法可增強選擇性。 全身投藥的代表性劑量介於0 · 1 4 g至1 〇 〇毫克 / k g患者體重/投藥。熟悉此技藝之專家均知道此劑量 視特定化合物的功能、症狀嚴重性及患者對副作用之敏感 性而定。某些特定的化合物較其他者有效。給定之化合物 其較佳的劑量可由熟悉此技藝的專業人士經各種方法測定 ◦測定給定之化合物生理效能較佳的方法，例如離體中及 活體中測試描述於本文。 抗體作爲E G F - R拮抗劑 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----h----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -21 - 1250019 A7

五、發明說明（19 ) E G F — R拮抗劑以抗體爲佳（例如Vil〇na，et al，

American Journal of Pathology 1 5 1:1 523 )。E G F 或 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) E G F - R抗體之產生係將異種有免疫能力的哺乳動物寄 主，包括：鼠科的、嚙齒類動物、兔形目動物、綿羊、豬 、牛等接種E G F或E G F - R或其部分。較佳者爲人類 E G F或E G F - R或其部分作爲抗原。特定的寄主之選 擇以方便爲主。免疫可依據常見的技藝進行，將抗原經皮 下、肌肉內、腹腔內、血管內方式注入寄主動物。一般約 將1 · 0毫克/kg至約1〇毫克/kg之EGF或 E G F - R作爲抗原隔日進行腹腔內的注射。注射劑可含 或不含輔助劑，例如完整的或不完整的弗氏（Freund )輔 助劑、史必可（spec〇1 )、明礬等。免疫注射完成後，依 據常見的方法收集對E G F或E G F — R具有專一性的多 株抗血淸。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 抗體可爲單株的或多株的抗體，較佳者爲單株抗體， 其係產自免疫的動物。免疫注射完成後，多株的抗血淸可 用常見的方法自動物血淸中收集◦爲了產生單株的抗體， 可自適當的淋巴組織（例如脾臟、淋巴結等）收集淋巴球 ，與適當的融合細胞融合（通常爲骨髓癌細胞株）產生分 泌專一單株抗體之融合瘤。可依據常見的方法篩選具有特 定免疫專一性的融合瘤。 特定的抗體中較佳者爲單株的抗體’其可結合至 E G F — R或E G F以抑制E G F對E G F - R之結合， 例如專一的結合至E G F - R細胞外的結構區之抗體可預 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -22- 1250019 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（20) 防E G F之結合。此抗體可用上述常見方法製備，或商購 。具有E G F拮抗劑功能之抗體實施例包括（但非限於） :中和的抗—E G F — R單株抗體C 2 2 5 ( Kawamoto et al ( 1 9 8 3 ) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 8 0:1 3 37- 1 34 1;

Petit et al. ( 1 997) J. Path. 1 5 1:1 523- 1 53，產自 ImClone Systems New York，NY )及抗—E G F R 單株抗體 EMD5590 0 (亦稱爲 Mab 4 2 5 ) ， （ Merck,

Darmstadt, Germany ) o 除了 一般多體的構造之外，抗體亦可爲單鏈。單鏈抗 體描述於 JostEtal. ( 1 994) J.B.C. 269:26267-73 等。將編碼 重鏈的多變區域及輕鏈的多變區域之D N A序列用至少約 4個小的中性的胺基酸（包括甘胺酸及/或絲胺酸）的間 隔編碼連結。此融合之蛋白質編碼組成之功能的多變區域 仍保有原始抗體之專一性及親和性。 製作人類化抗體的方法是已知的技藝。人類化抗體可 爲引入人類免疫球蛋白固定的區域基因（參見例如： International Patent Applications W Ο 90/10 0 77 及W〇 9〇/ 0 4 0 3 6 )的動物之產物。此外，抗體 可爲重組D N A技藝用對應的人類序列（參見 W 0 92/02190)替代 CHI 、CH2 、CH3 、樞紐結構區、及/或架構殘基所構建之抗體。 使用I g c DNA構建嵌合的免疫球蛋白基因亦爲 已知的技藝（LiuEtal· ( 1 987) P.N.A.S. 84:343 9 以及（ 1 987) J. Immunol. 139:3521 ) 。111 — RNA係分離自融合瘤或其 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 丨，---^----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -23- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250019 A7 B7 五、發明說明（21) 他產生抗體之細胞並用於產生C D N A。C D N A可用聚 合酶連鎖反應經特定的引子放大（1^.?“61111108· 4,683,1 95及4,68 3,202 )。此外，可製作圖書館並篩選分離 須要的序列。然後編碼抗體多變區域的D N A序列可融合 至人類固定區域的序列。人類固定區域的基因序列可參見 Kabat et al (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, N.I.H. publication no. 91-3242。人類 C 區域基因 可輕易商購得之。嵌合的、人類化的抗體可用常見的方法 表現。 抗體片段，例如：F v、F ( a b二）2及F a b可切 除（例如經蛋白酶或化學的切除）完整的蛋白質後加以製 備。此外，可設計縮短的基因。例如，F ( a b二）2片段 部分嵌合的基因編碼可包括編碼C Η 1結構區及Η鏈樞紐 區域之D Ν Α序列，以及後續之轉譯終止密碼子以產生 縮短的分子。 患有黏液過度分泌疾病的病人起始時可投用之E G F 一 R拮抗劑含量介於約2 0毫克（毫克）至約4 0 0毫克 /公斤病人體重，兩次每日，例如經吸入方式。 反義分子作爲E G F — R拮抗劑 其他具體實施例中，治療劑可爲編碼E G F或E G F - R之人類序列的反股分子。投用之治療劑可爲反股寡核 苷酸，尤其是依據天然核酸經化學修飾後合成之寡核苷酸 ，或表現此反義分子（R N A )之核酸構建體。反股序列 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） i· U----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -24 - 1250019 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（22) 可互補至目標EGF或EGF - R基因之mRNA，並抑 制目標的基因產物之表現（參見例如Nyce et al. ( 1 997) Nature 3 85:720 )。反義分子可降低轉譯之mRNA量，活 化R N A酶Η或空間摭蔽以抑制基因表現。可投用一種或 反股分子之組合，組合物可由許多不同之序列單一目標的 基因，或序列組成，互補至許多不同之基因。 較佳的標的基因爲E G F — R或E G F ◦基因序列可 得自公開的數據庫（人類表皮生長因子，基因庫編號 η〇· KOI 1 6 6 ;人類表皮生長因子受體前驅物 mRNA，基因庫編號no· X 0 0 5 8 8 )。一般而言 ，反股序列之複製起點與動物寄主相同。 將目標細胞引入及表現適當的載體時，表現所有或部 分之目標基因序列可產生反義分子。在啓動定向轉錄後可 產生反股RNA分子。反義RNA可與內生性同義股 m R N A雜交，因而阻擾目標基因之表現。可使用天然的 轉錄起始區域，或外生性的轉錄起始區域。啓動子可用重 組方法於離體中引入，或用同源插入染色體序列。技藝上 已知許多肌肉細胞中活化的強啓動子，包括/3 —肌動蛋白 啓動子、S V 4 0早期及晚期啓動子、人類細胞巨大型病 毒啓動子、反轉錄病毒的L T R等。 轉錄載體在啓動子序列附近一般均帶有方便的限制位 點提供核酸序列之插入。轉錄卡匣之製備包括轉錄起始區 域、其目標基因或片段、及轉錄終止的區域。轉錄卡匣可 引入各種載體，例如：質體；反轉錄病毒，例如南提病毒 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -25- 1250019 A7 B7 五、發明說明（23) (lentivirus );腺病毒一 1等，該載體能瞬間的或穩定地 維持在細胞中，一般至少約一天，更常見者至少約數天。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 此外，較佳的具體實施例中反股分子是合成的寡核苷 酸。反義寡核苷酸一般約7至5 0 0，通常約1 2至5 0 個核苷酸，更常見者約2 0至3 5個核苷酸，其長度可控 制抑制效應，明確的說包括無交互反應性等。據發現短寡 核苷酸（7至8個鹼基長度）可爲基因表現之強烈的及選 擇的抑制劑（參見 W a g n e r e t a 1. ( 1 9 9 6) N a t u r e Biotechnology 14:840-844 ) o 特定的區域或內生性同義股m R N A序列區域可與反 股序列互補。據顯示m R N A之5 ’區域尤其是反股抑制 的易感區域。但是，最近分析m R N A二級構造的證據顯 示位點易接受性之抑制。用許多候選序列在離體中或動物 模式測定其對標的基因表現之抑制，發現選擇特定的寡核 苷酸序列是須要靠經驗的方法。亦可使用序列組合’選擇 許多區域之m R N A序列進行反股互補雜交。 反義寡核苷酸可用技藝上已知的方法化學地合成（參 見 Wagner et al. ( 1 993) supra.及 Milligan et al, supra.) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 。爲了增加其細胞內的穩定性及結合親和性，較佳的寡核 苷酸係自天然的磷酸二酯類構造進行化學地修飾。許多此 類之修飾可改變骨幹、糖或雜環基鹼基的化學性質己描述 於文獻。 寡核苷酸可額外地包含標定的部份以增進細胞對分子 之攝入。標定的部份可爲特定的結合分子，例如抗體或能 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 26- 1250019 A7 B7 五、發明說明（24) 確認肺部上皮細胞（尤其是含E G F - R的上皮細胞）的 抗體片段。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 專一的抗體、嵌合的抗體及單鏈抗體是已知的技藝。 可用方法各種適當地製備人類化的非人類抗體。聯結寡核 苷酸及標定的部份可用任何常見的方法，例如雙硫鍵、醯 胺或硫醚鍵，視寡核苷酸骨幹的化學性質而定。較佳者， 此聯結可在細胞內分解以釋出寡核苷酸。 寡核苷酸可聯結至疏水性的殘基，例如膽固醇，以避 免被核酸酶分解因而增進通過細胞膜之運送。此外，聯結 至聚- 1 -離胺酸或其他聚胺類亦可增進其對細胞之傳遞 。進一步的修飾可爲加入插入成分，例如吖碇，能插入至 目標m R N A並安定雜交結果。反義寡核苷酸可與能在細 胞內降解反股一 m R N A複合體之酵素（例如R N A酶一 Η )共同轉染。可使用任何能降解或摭蔽反股一 m R N A 雙體之蛋白質或酵素。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 除了反義抑制劑之外，亦可使用催化的核酸化合物， 例如：核糖酶、反義聯結物等以抑制基因表現。核糖酶可 於離體中合成並投用至病人，或可編碼於表現載體，於目 標細胞中合成核糖酶（例如參見International patent application W〇 9523225 ，及 Beige 1 man et al. (1995) Nucl.

Acids Res 23 -.4434-42 )。具催化活性之寡核苷酸的實施 例描述於W 0 9 5 0 6 7 6 4。與金屬複合體聯結之反 義寡核苷酸聯結物，例如三吡啶基C u ( I I )，能中介 mRN A 水解，描述於 Bashkin et al. (1995) Appl Biochem 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -27- 1250019 A7 B7 五、發明說明（25)

Biotechnol 54:43-56 〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 藥學配方 E G F - R拮抗劑可溶於溶液或任何其他醫藥學上適 合之形式進行投藥，例如：微脂粒懸浮液。適當的抗體或 其他的抗- E G F形式可依一般投藥此材料的方法調製後 進行投樂。代表性的調配物參見R e m i n g t ο η' s P h a r m a c e u t i c a 1 Sciences, latest Edition, Mack Publishing Company,

Easton, PA。投藥路徑的選擇視投用之化合物、病人及治 療之疾病狀況而定。當黏液過度分泌時，化合物可視疾病 之嚴重性而定經不同之路徑投用，例如在緊急時可經1 . v ·投藥，急性但非危急的狀況可以口服投用，慢性治療 方法可用氣溶膠投用。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 治療鼻腔及呼吸道疾病時以局部的傳遞方法較佳。與 全身吸收濃度相較之下吸入方式或以吹氣的氣溶膠傳遞時 可提供高濃度之藥物。此外，E G F拮抗劑可注射投用， 包括：肌肉內的、靜脈內的（I V )、皮下或腹膜注射， 最佳者爲I V及局部注射。但是，其他模示之投藥亦可提 供E G F - R拮抗劑進入全身循環，例如經黏膜的或經皮 調配物，其可利用栓劑、皮膚貼片、或內鼻腔藥劑投用。 任何適合之調配物其效應能移轉E G F - R拮抗劑經血液 液流或局部的方式至肺部者均可使用。 注射時，適合之調配物一般由水溶液或懸浮液組成， 使用生理食鹽水、HanLs溶液、或其他緩衝溶液可視須要 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -28- A7 1250019 _B7 _ 五、發明說明（26 ) 選擇的包括安定劑或其他次要成分。微脂粒的製劑及其他 形式之微乳狀液亦可使用。E G F - R拮抗劑亦可爲冷凍 乾燥的形式，並經重組後投藥。經黏膜的及經皮的投藥一 般包括增進通過黏膜或真皮的蔽障之藥劑，例如：膽酸、 鹽類、梭鏈孢酸及其類似物，各種兩性介面活性劑等。口 服投藥亦爲可行，與適合之腸內的包覆劑調製使E G F -R掊抗劑可通過消化道。 某些程度上調配物之性質視所選用之E G F - R拮抗 劑而定。適合之調配物係用已知的技藝製備，主要的調配 物爲熟悉此技藝的專業人士所熟知。特定的醫藥組合物中 含E G F - R拮抗劑之百分比亦視調配物之本性而定， E G F - R拮抗劑是抗體時其百分比介於約1 %之重量至 約8 5 %之重量。 許多傳遞方法是技藝上已知的方法，能提高細胞攝入 核酸。使用的傳遞系統包括：聖代（Sendai )病毒微脂粒 傳遞系統（Rapaport and Shai (1994) J. Biol. Chem. 269: 15124-15131 )、陽離子性微脂粒、聚合的傳遞凝膠或基質 、多孔的氣球導管（揭示於Shi et al. (1994) Circulation 90: 95 5 - 95 1;及 Shi et al. ( 1 994) Gene Therapy 1:408-4 1 4 )、反轉錄病毒表現載體等。使用.微脂粒作爲傳遞載劑是 使用E G F — R拮抗劑的方法之一。微脂粒與標定位點之 細胞融合並運送內含物至細胞內腔。微脂粒與細胞維持接 觸一段足夠的時間後可進行融合，可用各種方法維持接觸 ，例如：分離、黏結等。微脂粒可用與中介細胞膜融合的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1/---^----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 29 - 1250019 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（27) 純化蛋白質或肽類製備，例如聖代（Sendai )病毒或流行 性感冒病毒等。脂質可用已知能形成微脂粒的脂質組成， 包括：陽離子性脂質，例如磷脂醯基膽鹼。其餘的脂質一 般爲中性的脂質，例如：膽固醇、磷脂醯基絲胺酸、磷脂 醯基甘油等。製備微脂粒時，其方法描述於K a t q e t a 1. (1991) J· Biol. Chem. 266:3 36 1。 較佳的具體實施例中E G F - R拮抗劑係封包於空間 穩定的a隱祕〃微脂粒，例如：pegylated微脂粒。當此微 脂粒用i · v ·注射時其可在循環系統中保持相當長的時 間。在呼吸道發炎下，後微血管脈溝結合打開，使液體堆 積並使分子（例如補體、激肽原酶）進入組織啓動發炎性 的串聯反應。此炎症可使微脂粒及其內含物選擇性地沈澱 於發炎組織中（Zhang et al· ( 1 998) Pharm Res 1 5:455-460 )° E G F - R拮抗劑可經醫藥學的傳遞系統以吸入路徑 對相關病人投用。化合物可調製成適合吸入方式投藥之形 式。適合呼吸治療之醫藥學傳遞系統可在支氣管黏膜的襯 裏局部投用E G F - R拮抗劑。本發明可使用利用壓縮氣 體驅動E G F - R拮抗劑之容器系統。氣溶膠或加壓的包 裝可用於此一目的。 本文中 ''氣溶膠〃 一般係指推噴劑氣體在壓力下於治 療的位點推動之非常細之液體或固體微粒。當本發明使用 醫藥學的氣溶膠時，氣溶膠含有具治療性的活性化合物’ 可爲推噴劑推動之溶於、懸浮的、或乳化的液體混合物。 L---卜----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -30- 1250019 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（28) 氣溶膠可爲溶液、懸浮液、乳狀液、粉末、或半固體製備 物之形式◦本發明中所用之氣溶膠可經病人呼吸道投用細 粒、固體微粒或液體霧氣。爲熟悉此技藝的專業人士所熟 知的各種類形之推噴劑均可使用。適合之推噴劑的實施例 包括（但非限於）碳氫化合物或其他適合之氣體。加壓的 氣溶膠中’劑量單位可用運送値計量加以測定。 本發明亦可使用噴霧器，其係在相當均勻的氣體下產 生非常細之液體微粒的工具。較佳者，含E G F - R拮抗 劑液體可分散成液滴。小液滴可爲可經噴霧器出口管之空 氣攜帶。產生的霧氣可穿入病人的呼吸道。 含E G F - R拮抗劑或其類似物的粉末組合物可含或 不含潤滑劑、載體、或推噴劑，可投用至須要治療的哺乳 類。本發明之具體實施例可用常見的裝置經吸入方式投用 粉末醫藥組合物。例如，化合物之混合粉末及適合之粉末 (例如：乳糖或澱粉）可存在於單位劑量形式中（例如膠 囊狀）或彈射劑（例如··明膠）、或發泡包裝，在吸入器 協助下投用粉末。 組合治療可用於治療過度分泌的肺部疾病。尤其是 E G F - R拮抗劑可與常見的治療減輕過度分泌，例如： 支氣管擴張劑、皮質類固醇、袪痰劑、水解黏液的藥劑等 共同使用以增進黏液纖毛的淸除率。 視病人症狀而定，可用注射（例如靜脈內的）或吸入 方式傳遞本發明調配物。肺部有大量黏液之病患通常開始 時不能用吸入方式治療。因爲事實上’病人的肺部阻塞物 I.---^----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -31 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250019 A7 --- --B7_____ 五、發明說明（29 ) 足以阻塞吸入的氣溶膠調配物有效的進入肺部。但是，注 射治療後，或長期維持或治療後病人肺部的阻塞嚴重性下 降後’吸入方式的投藥較佳◦吸入方式投藥較佳的原因是 較小劑量可運送至須要治療的特定細胞。運送較小劑量可 排除或降低不良副作用。直接運送至須要治療的細胞，治 療效應亦更快。 本發明可用許多不同形式之吸入方法。基本上本發明 拮抗劑可調製爲三種不同形式之吸入式調配物。第一，本 發明拮抗劑可與低沸點推噴劑調製。此調配物一般用常見 的計量劑量吸入器（M D I > s )投用。但是，常見的 M D I > s可用測量病人吸氣的體積及流速之技藝加以修 飾以增加重覆給藥的能力，參見U.S. Patents 5，4 04,87 1及 5,542,410 。 此外，本發明促效劑可調製成水溶性或乙醇性溶液， 並用常見的噴霧器運送。但是，更佳者，此溶液調配物使 用氣溶膠化的裝置及系統，例如揭示於U. S . P a t e n t 5,497,763; 5,544,646; 5,718,222;及 5,660，166 。 最後，本發明促效劑化合物可調製成乾粉末調配物。 此調配物可創造成氣溶膠粉末噴霧後簡單的吸入乾粉末調 配物投用。此技藝描述於U.S. Patent 5,775,320公佈於July 7, 1 998 及 U.S. Patent 5,740,794 公佈於 Apnl 21，1 998。 除了上述之專利外，本申請者指出其他相關於肺部內 藥物傳遞之文獻及專利，亦可作爲特定的方法、裝置及調 配物傳遞本發明之促效劑。此外，揭示傳遞本發明促效劑 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） i ih 4------- 丨訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -32- 1250019 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（30) 之調配物、裝置、包裝及方法的各種專利，全文在此倂入 參考文獻。 篩選測定 候補藥品 篩選測定可用以確認具有E G F拮抗劑之生物活性的 候補藥劑。特定言之，係測定對人類細胞具有低毒性之藥 劑。可使用許多不同之測定，包括離體中經標記之蛋白質 -蛋白質結合測定、電泳的移動性測定、蛋白質結合免疫 測定等。純化的E G F或E G F — R蛋白質亦可用於三度 空間結晶構造測定，用以構建分子間交互作用、運送蛋白 質功能等之作用模式。 本文之 ''藥劑〃描述任何，例如蛋白質或醫藥學的分 子，其係能改變或抑制E G F或E G F - R之生理的功能 。一般而言，混合物係用不同之藥劑濃度進行多重測定得 到各種濃度下不同之反應。基本上以0濃度或偵測下限之 濃度作爲負對照組。 候補藥劑包括許多化學的種類，一般爲有機分子，較 佳者爲小的有機化合物，分子量大於5 0少於約 2，5 0 0道耳吞。候補藥劑含可與蛋白質交互作用（尤 其是氫鍵作用）之官能基，一般包括至少一個胺、簾基、 羥基或羧基，較佳者至少兩個化學官能基。候補藥劑通常 由環碳或雜環基的構造及/或芳香族的或經一種或多種上 述官能基取代的聚芳香族構造組成。候補藥劑亦可爲生物 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） -33- 丨· --------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250019 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（31) 分子，包括：肽類、醣類、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧陡 、衍生物、構造的類似物或其組合。 候補藥劑可得自各種來源，包括合成的圖書館或天然 化合物。例如許多方法可隨機及定位的合成各種有機化合 物及生物分子，包括：隨機化寡核苷酸及寡肽類之表現。 此外，細菌、真菌、植物及動物萃取液形成的天然化合物 圖書館亦可商購或輕易產生。此外，天然的或合成產生的 圖書館及化合物亦可用常見的化學的，物理及生化的方法 輕易的修飾，並可用於產生組合的圖書館。己知藥理性質 的藥劑可定位或隨機進行化學的修飾，例如：醯化反應、 烷化、酯化反應、醯胺化反應等，產生構造的類似物。 當篩選測定是結合測定時，一種或多種分子可結合至 標記，該標記可直接的或間接的提供可偵測的信號◦各種 標記包括放射性同位素、螢光劑、化學冷光劑、酵素、專 一的結合分子、微粒，例如有磁性的微粒等。專一的結合 分子包括生物配對，例如：生物素與抗生蛋白鏈菌素、地 高辛與抗地高辛等。在專一的結合時，互補的成員一般可 在分子上用己知的方法標記以提供偵測。 篩選測定時可包括各種其他試劑◦包括鹽類試劑、中 性的蛋白質，例如：白蛋白、兩性介面活性劑等以增進最 佳之蛋白質-蛋白質結合及/或降低非專一的或背景之交 互作用。改進測定效能之試劑，例如：蛋白酶抑制劑、核 酸酶抑制劑、抗-微生物的藥劑等亦可使用。混合物之成 分可依任何次序加入以提供須要之結合。反應可在適當的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1·---^---------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -34- 1250019 A7 B7 五、發明說明（32) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 溫度下進行，一般爲4至4 0 °C之間。可依最佳之活性選 擇反應期間，但亦可最佳化以增進篩選速度。一般在 0 . 1至1小時間就夠了。 須要的醫藥學活性之化合物可與生理上可接受的載體 製作成本文描述之調配物投用至寄主以治療過度分泌的疾 病。視引入的方法，化合物可用描述於此之各種方法調製 。調配物中活性化合物治療的濃度約0 · 1 - 1 0 0 %之 重量。 給藥療程 適當的劑量亦視多種因素而定，包括被治療的患者， 被治療的過度分泌的症狀之特性及其嚴重性，作爲 E F G R掊抗劑之活化成分的特性，投藥摸式，配方，及 醫師的判斷。例如，當抗體（例如抗一 E G F或E G F -R )之調配物注射投用時，單一劑量之劑量介於2 0毫克 / k g至約4 0毫克/ k g。數天期間之重覆投藥則須要 靜脈內的裝置連續投藥。慢性的症狀時，視須要投藥可持 續較長的時期。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 給藥療程的療效可評估病人肺功能之改善加以測定。 評估包括測量痰的黏性，肺部功能的改進，包栝增進橫隔 強迫的擴張體積及最大的中間呼氣流速。上述的治療療程 可與附屬的治療，例如：抗生素、D N A酶I或其他目前 治療過度分泌的肺部疾病的方法同時進行。若共同投用抗 生素治療病人，治療後評估治療效應時，細菌的定量觀赛 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -35- 1250019 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（33) 發現細菌的生長降低，代表黏液或多痰黏度降低以及黏液 或多痰肺部的淸除率增加。 測試肺部過度分泌的疾病之臨床進展之肺部功能測試 及診斷測試爲熟悉此技藝的專業人士所熟知。標準肺部的 功能測試，包括呼吸道阻力（A R );強迫的肺活量（ F V C );每秒強迫吐氣的體積（F E V ( 1 ));強迫 的中間呼氣流速；及尖峰呼氣的流速（P E F R )。其他 肺部的功能測試，包括：血液氣體分析；藥物反應·，刺激 及運動測試；測量呼吸肌肉強度；纖維光學的呼吸道檢視 等。某些硏究黏液性質的基本方法包括流變法，例如使用 有磁性的微血流計；黏著性，測量黏液滴及表面間之接觸 角度確認黏著劑表面及膠黏劑系統間之吸引力。可用常見 的技藝及直接測量（即原位黏液淸除率）纖毛對黏液的運 送。因爲經上皮的電位差，使肺部的上皮離子運送系統活 性的淨結果，可用適當的微電極測量◦定量的形態學方法 亦可用於確認上皮表面的症狀。 治療的病人可爲具有上述症狀之靈長類動物，例如人 類、或任何其他動物。本發明之方法尤適於治療人類病人 ，本發明亦可用於獸醫之治療用途。 離體中篩選測定 本發明其他具體實施例中，離體中測定係用於評估候 補藥劑抑制高腳枉狀細胞增生的治療潛力，即此藥劑是否 有E G F拮抗劑的活性。一般而言包含以下步驟：（i ) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I.--------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -36- 1250019 A7 B7 五、發明說明（34) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將高腳枉狀細胞增生之離體模式與E G F或其功能相當者 接觸；（ϋ )後續的將離體中模式與候補藥劑接觸；以及 (iii )評估高腳枉狀細胞之增生，其中對高腳枉狀細胞增 生之抑制即表示候補藥劑有治療的潛力。 較佳之測定用兩組對照組進行，第二組細胞不與任何 化合物接觸，第三組細胞與E G F接觸但不與候補藥劑接 觸。比較後測定E G F及候補藥劑對細胞之效應。 任何高腳枉狀細胞增生之離體中模式均可使用。實施 例中，老鼠氣管細胞可分離並維持在培養中如描述於 Guzman et al. ( 1 995 ) 2 1 7:4 1 2-4 1 9。簡言之，將老鼠氣管 細胞植入塗覆膠原蛋白凝膠的半滲透細胞膜，起始時浸入 培養液培養，接著維持在空氣/液體界面。離體中細胞實 施例包括初級人類支氣管的細胞（可商購自Clonetics，San Diego ) ;NCI— H192 細胞（ATCC C R L -1 848)— 1 及 A431 細胞（ATCC CRL 〜 1 5 5 5 )。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 離體中培養與E G F及候補藥劑接觸。視評估終點及 候補藥劑的特性而定，候補藥劑可與培養細胞在加入 E G F前、同時、或之接觸。評估相對於對照組，培養細 胞中高腳枉狀細胞之增生抑制。 各種分子或生化的標識可用於評估高腳枉狀細胞之增 生。分子或生化的標識的實施例包括（但非限於）：高腳 枉狀細胞特性之基因表現或蛋白質表現。某些黏蛋白基因 (例如在呼吸道中表現的M U C 5 B ( D e s s e y n e t a 1. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -37- 1250019 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明說明（35) (1 997 ) J. Biol. Chem. 27 2:3 1 68-3 1 7 8))能表現黏液中主要 的基因產物。黏蛋白基因之表現能提供適合之標識測定黏 液之產生。 黏蛋白基因表現可用常見的技藝評估，例如北方墨點 分析、聚合酶連鎖反應（P C R )、黏蛋白基因啓動子檢 視化、或原位分析◦此外黏蛋白蛋白質可用常見的方法用 可偵測之經標記抗體評估，例如：西方墨點分析、 E L I S A、免疫化學等。亦可用形態測定培養中是否有 高腳枉狀細胞存在；例如用亞西藍（A1 c i a n b 1 u e ) / P A S 染色黏蛋白（Lou et al. (1998) Am. J. Respir. Crit.

Care Med. 157:1927-1934 )。抗黏蛋白抗體可用 E L I S A測定檢視。因爲配基（例如E G F、T G F -α )刺激E G F - R後引發特定的E G F受體磷激酶磷酸 化，導致高腳枉狀細胞產生，所以亦可測量E G F - R磷 酸化代表高腳枉狀細胞之誘發（Donato et al. ( 1 984) J. Biol. Chem. 264:20474-2048 1 )。 降低與高腳枉狀細胞增生相關分子的生化標識表示诘 抗劑有治療的潛力。 活體模式 本發明其他具體實施例中，活體中動物模式係用於評 估候補藥劑對抑制高腳枉狀細胞增生的治療潛力。一般而 言測定包含以下之步驟：（1 )誘導E G F - R表現創造 過度分泌的肺部疾病的動物模式；（ϋ )刺激引發的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -38- I"---l·---------------訂---------線· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250019 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（36) E G F - R產生黏蛋白以產生高腳枉狀細胞；（Mi )用候 補藥劑治療；以及（iv )評估高腳枉狀細胞增生或黏液分 泌，其中抑制高腳枉狀細胞增生或黏液分泌表示補藥藥劑 有治療的潛力。 任何過度分泌的肺部疾病活體中模式均可使用。氣喘 的老鼠模式實施例描述於Temann et al. ( 1 997) Am. J. Respir Cell. Biol. 1 6:47 1 -47 8 ，並示於本文之實施例。此 外，可用描述於 Takeyama et al. (1998) Am. J. Physiol 之 老鼠模式。其他動物模式之實施例均可使用包括（但非限 於）天竺鼠（組成的表現高腳枉狀細胞）及老鼠。動物模 式之肺組織或氣管組織可用描述於離體中模式之小分子及 生化的標識評估。降低高腳枉狀細胞增生表示E G F - R 拮抗劑之治療潛力。 以下實施例將對一般熟悉此技藝的專業人士提供製備 及使用本發明完整的揭示及描述，並非限制本發明之範圍 ’以下之實驗亦非代表所有可行之實驗。實驗之效應雖以 數目（例如：含量、溫度等）力求準確，但仍允許某些實 驗的誤差及變異。若非特則指明，份代表份之重量，分子 量爲平均分子量重量，溫度爲攝氏度，壓力爲大氣壓或近 似大氣壓。 實驗 實施例 1 E G F系統調控呼吸道黏蛋白之產生 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 丨 *---^----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -39- 1250019 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（37) 各種呼吸道過度分泌的疾病均有高腳枉狀細胞細胞增 殖的現象，但其機制因未明，故而尙無有效的治療方法。 在健康的呼吸道中高腳枉狀細胞數量很少，但過度分泌的 呼吸道疾病中高腳枉狀細胞有細胞增殖的現象發生。經硏 究人類支氣管的（N C I - Η 2 9 2 )細胞株後發現此類 細胞之組成有E G F - R表現；腫瘤壞死因子α ( TNFa)可進一步的刺激EGF — R基因表現。EGF - R配基可增加黏蛋白合成，此效應在與TN F α共同培 養下可更爲提高。 無病源老鼠之呼吸道上皮細胞不表現E G F - R蛋白 質，但氣管內滴注T N F α ( 2 0 0 n g )則可引發前高 腳枉狀，高腳枉狀細胞（而非有纖毛的細胞）的E G F -R基本表現量；僅以TNFa、EGF、或TGFa並無 法引發高腳枉狀細胞產生◦但是，在滴注T N F α及後續 的E G F - R配基下，結果會增加高腳枉狀及前高腳枉狀 細胞之數量及顯著的增加亞西藍（Alcian blue ) / P A S 正性染色（代表黏液糖化結合物）及黏蛋白M U C 5基因 表現。在致敏的老鼠中，卵白蛋白會引起高腳枉狀細胞產 生及呼吸道上皮表現EGF — R。老鼠經TNFa、 E G F - R配基刺激後以及氣喘模式老鼠中， N C I - Η 2 9 2細胞用E G F - R酪胺酸磷激酶抑制劑 (Β I Β X 1 5 2 2 )前處理可預防呼吸道產生高腳枉狀 細胞。此類發現顯示E G F - R串聯反應抑制劑在呼吸道 過度分泌的疾病中扮演的角色。 I --------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -40- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Π50019 A7 B7 五、發明說明（38) 方法 離體中之硏究 細胞培養。將人類肺部黏液表皮樣的癌細胞株（ N C I - Η 2 9 2細胞）生長於內含1 0 %胎牛血淸、青 黴素（100 U/毫升）、鏈黴素（100 1 tg/ 毫升）之 RPMI 1640 培養液 ’ 37°C、5%C〇2 濕化的水護套的培養箱。當細胞長滿後’將細胞與E G F (重組人類E GF，2 5 n g /毫升，G酵素，Cambridge， MA) 、TGFa (重組人類 TGFa，2 5ng /毫升 ，G 酵素）、TNFa (重組人類 TNFA’ 20ng/ 毫升，G酵素）、EGF(25ng/毫升）加TNFa (20ng /毫升）或 TGFa (25ng /毫升）力口 TNFa (2〇ng/毫升）反應12h、24h或 4 8 h。在E G F - R酪胺酸磷激酶抑制劑， BIBX1522 (l〇ug /毫升，來自 Boehringer I n g e 1 h e i m I n c.，I n g e 1 h e i m，G e r m a n y )的抑制硏究中將細胞 在加入生長因子前用B I BX1 5 2 2前處理3 0分鐘。 反應後，從生長於T 一 7 5燒瓶之細胞萃取總R N A或萃 取蛋白質，用8 -室之載玻片進行亞西藍（Alcian blue ) /PAS染色以觀察黏蛋白。 西方墨點分析。將生長於T - 7 5燒瓶之細胞水解， 用含1 % Triton X 、1%二氧基膽酸鈉及PMSF (1〇 毫克/毫升）之PBS刮下。蛋白質總量用BCA蛋白質 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 丨：—：----------------訂---------線· (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -41 - 1250019 A7 B7 五、發明說明（39) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 測定試劑（Pierce，R〇ckf〇rd，IL )評估。細胞水解液與麥 黃酮（Tncine )樣品緩衝溶液及2 % Ρ Μ E在9 5 °C下煮 沸。蛋白質用8%丙烯醯胺凝膠之SDS—PAGE分離 。產生的凝膠用轉移緩衝溶液：2 5 m Μ三羥甲基氨基甲 院一HC 1 、192 m Μ甘胺酸、2 0% (νο 1/ ν ο 1 )甲醇，ρ Η 8 · 3平衡。然後將蛋白質用電泳轉 移至硝化纖維素膜。此膜與含〇 · 〇 5 % Tween 20、5 % 脫脂牛奶之P B S反應1 h。然後將膜與單株的老鼠抗-E G F - R抗體（1 : 1 〇 〇 )在4 °C下反應過夜。結合 的抗體依據標準程序用卵白素-生物素-鹼性的磷酸酯酶 複合體方法（A B C組套，Vector Laboratories)顯現。 E G F - R之正性對照組爲A 4 3 1細胞之細胞水解液（ 2〇）° 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 N C I - Η 2 9 2細胞中E G F — R免疫細胞化學的 定位。將生長在8 -室之載玻片上之細胞用4 %三聚乙醛 固定lh。爲了染色EGF — R，用含〇 . 05% Tween 20、2%正常山羊血淸及2 111]\/1列瓦迷所（16¥3!1118〇16) 之P B S作爲抗體稀釋劑。切片與老鼠抗E G F — R單株 抗體（1 : 250)在4°C下反應過夜，然後用PBS淸 洗三次去除過量的一次抗體。然後將細胞與生物素化的馬 抗—老鼠免疫球蛋白（Vector Laboratories, Burlingame, CA ) ( 1 : 2 0 0稀釋）在室溫下反應1 h。結合的抗體

依據標準程序用卵白素-生物素-鹼性的磷酸酯酶複合體 方法（A B C 組套，Vector Laboratories，Burlingame，CA -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250019 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（4〇 ) )顯現。 探針。E G F - R m R N A表現係用線性化的 P TR I — e G F — R —人類探針模板（Ambion，Austin， TX )測定。探針含人類e G F — R基因3 6 0 b p cDNA片段，跨越表現序列12 - 14 〇MUC5基因 表現係用人類M U C 5 A C探針測定，含人類 MUC5AC 基因 298bp cDNA 片段（Dr. Carol B a s b a u m所提供）。

北方墨點分析。總R N A係用T r i 一試劑（. Molecular Research Ctr，Cincinnati,〇H )萃取自各條件下 生長於T 一 7 5組織培養燒瓶之N C I - Η 2 9 2細胞。 總R N A ( 1 〇 u g )在1 %瓊脂糖/甲醛凝膠下電泳並 用毛細管現象轉移至尼龍胞膜（Amersham，Arlington Heights, IL )。探針用隨機引子的D N A標記組套（ Boehringer Mannheim Corp.，Indianapo401is，IN )標記 32p。墨點在42°C下進行前雜交4h，然後用32P —標 記之特定的c D N A探針在4 2 °C下進行雜交1 6 h。雜 交溶液含2 5 OmM三羥甲基氨基甲烷一 HC 1 ( pH 7.5) 、5%SDS、1%BSA、1% 聚乙烯基—吡 咯烷酮、1 % F1C〇ll、及〇 . 5 %焦磷酸鈉。雜交後將膜用 含〇.1%SDS之2 X SSC在室溫下30分鐘淸 洗兩次，接著用含〇· 1%SDS之2 X SSC在 50°C下30分鐘淸洗兩次並用含〇 . 1%SDS之 〇·1 X S S C沖洗。將膜暴露至暴露至X -射線軟 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 丨j-------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -43- A7 1250019 B7_ 五、發明說明（41 ) 片。 活體中之硏究 實驗動物的方法經 Committee on Animal Research, University of California San Francisco 核準。將特定的無 病源雄性F344 Fisher老鼠，重約230 — 250克（ Simonsen Laboratories，Gilroy, CA )，維持在控制溫度的 (2 1 °C )房間並自由攝取標準實驗室食物及水。 健康的老鼠。將老鼠用巴比妥酸鈉（布比妥（B r e v i t a 1 )鈉，50 毫克/ kg，i . p · ; EliLilly&Co·，

Indianapolis, IN )麻醉並允許其自然的呼吸。爲了測定呼 吸道中TNFa是否向上調節EGF—R，將TNFa ( 2 0〇n g ，1 0〇U 1 )徐徐滴入氣管，2 4 h後將動 物安樂死。爲了檢視E GF或TG F a是否引發呼吸道上 皮之高腳枉狀細胞，將E G F ( 6 0 0 n g ，1〇〇u 1 )或TGFa (合成的老鼠TGFa，250ng， 1 0 0 u 1 ; S i g m a，S t L o u 1 s，ΜI )單獨的徐徐滴入氣管 或滴注TNFa (2〇〇ng ， l〇〇ul) 24h後滴 入氣管，將動物在4 8 h後安樂死。各硏究中，將滅菌之 P B S ( 1 〇 0 u 1 )徐徐滴入氣管作爲對照組。爲了證 實經活化E G F — R是否產生黏蛋白，檢視E G F — R酪 胺酸磷激酶抑制劑，B I B X 1 5 2 2 (劑量評估係用預 防癌症生長之抑制劑劑量）之效應。滴注T G F a前1 h 及24h後老鼠用BIBX1522 (3 、1〇或3〇毫 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 丨^— ^----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -44- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250019 A7 B7 五、發明說明（42) 克/kg，i · p ·)預處理〇TGFa滴注後48h移 除氣管及肺進行檢視。 致敏化老鼠 致敏作用。老鼠在第〇及1 〇天在腹腔內注射卵白蛋 白（1 〇毫克，grade V;Sigma，St. Louis，M〇’與 1 0 〇 毫克氫氧化銘之〇 · 5nil滅菌之生理食鹽水複合）。然 後休息1 0天。於2 0天’將卵白蛋白直接運送至氣管； 動物用氣管內的滴注接種1 〇 〇 U 1 0 · 1 %卵白蛋白 之生理食鹽水三次（20、22及24天）。將未接種的 老鼠安樂死（20天）’或在第三次接種後48 h安樂死 (2 6天）。此方法可引發的高腳枉狀細胞組織的變形。 爲了阻擾高腳枉狀細胞之細胞增殖，致敏的老鼠用E G F 一 R酪胺酸磷激酶抑制劑，B I B X 1 5 2 2前處理。在 卵白蛋白接種日（2 0、2 2及2 4天），致敏的老鼠用 BIBX1522 (10 毫克/kg，i · p ·，接種前 lh)前處理，然後每24h共同處理BIBX1522 與卵白蛋白（BIBX1522 ， 1〇—5M， l〇〇ul )。老鼠安樂死前每2 4 h亦經i · p .徐徐滴入 B I B X 1 5 2 2。第三次接種後4 8 h移除氣管，將動 物安樂死。 組織製備。在麻醉時期預選的時間，在全身的循環中 灌流1 %三聚乙醛之D E P C處理的P B S，壓力爲 1 2 OmmHg。然後移除氣管，置於4%三聚乙醛2 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 丨^----r---------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -45- 1250019 A7 B7 五、發明說明（43) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) h。固定後，將氣管及肺包埋於含單體之j b - 4溶液A 進行細胞分析或〇· C · T處理（Sakura Finetek U.S.A.， Inc·，Torrance，CA )進行免疫組織化學及原位雜交。將包 埋的組織橫切（4 m m厚）並置於載玻片上。 細胞分析。在2 m m之基底層間，用油浸接物鏡（ X 1 0 0 0放大）計數上皮細胞的細胞核計數上皮細胞的 總數。上皮各分析區域的基底層線性長度係追蹤基底層數 位化的影像外觀加以測定。滴注刺激後， > 發生〃高腳枉 狀細胞形式。此類細胞具有亞西藍（Aldan blue ) / 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 P A S -正性顆粒，但顆粒大小很小。細胞質的顆粒類量 少◦稱爲 ''發生中的〃高腳枉狀細胞''前高腳枉狀細胞〃 ，細胞變成成熟的高腳枉狀細胞前之階段。高腳枉狀細胞 爲高的、立方體的、高腳枉狀至低管柱的形狀，細胞核及 管腔的表面間之細胞質含大量的亞西藍（A1 c i a n b 1 u e ) / P A S染色的顆粒。前高腳枉狀細胞之定義爲較小黏液染 色面積的細胞（從細胞膜基底至管腔的表面< 1 / 3之上 皮高度）或亞西藍（Alcian blue ) / P A S之染色較少較 疏，顆粒小。纖毛的細胞之特徵爲具有纖毛的邊緣，輕微 染色的細胞質，大而圓的細胞核。非顆粒狀的分泌的細胞 爲管柱形，從內腔延伸至基底層。細胞質染上輕微的粉紅 色彩。細胞質內有少量之小的P A S -正性及亞西藍（ Alcian blue )負性顆粒。底層細胞爲小的扁平細胞，大細 胞核位於基底層上尙未到呼吸道內腔。 定量高腳枉狀細胞之產生。高腳枉狀細胞產生係用描 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -46- A7 1250019 B7 五、發明說明（44 ) 述於（Weber et al.( 1 984) Science 224:294-297 )之半自動 的影像系統測定上皮黏膜的表面亞西藍（Aldan blue ) / P A S染色的黏液物質體積密度。測量亞西藍（Ale 1 an blue ) / P A S -正性染色的面積及上皮的總面積，數據 用亞西藍（Ale 1 an blue ) - P A S染色總面積的百分比表 不。用公開之N I Η影像程式（爲U.S. National Institute of Health所發展並可用Internet以匿名之FTP下載自 zippynimh.gov 或從 National Technical Information Service, Spnngfield，VA，part number PB95-500 1 95GEI 得到程式的 磁碟片）進行分析。 老鼠上皮E G F - R免疫組織化學的定位。E G F — R定位係用免疫組織化學的染色以抗E G F - R抗體檢視 (CalBiochem，San Diego，CA )老鼠氣管冷凍切片。灌流 1 %三聚乙醛之P B S後，將組織置於4 %三聚乙醛之 PBS爲期lh，然後移至30%蔗糖冷凍保護過夜。將 氣管包埋在〇.C · T 化合物（Sakura Finetek U.S.A.，Inc ·，Torrance, CA )中並冷凍。進行冷凍切片（5 // m )並 將切片置於載玻片（Superfrost Plus, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA )。類似離體中的硏究進行免疫染色。 製備探針。老鼠M U C 5 c D N A來自Dr. Carol Basbaum。將3 2〇 b p之老鼠MUC5 cDNA片段 次選殖入轉錄載體 pBluescript-SK(-)(Stratagene，La Jolla， CA)之Xb a/H 1 n dm位點。爲了製備原位雜交之 R N A探針，將此含老鼠M U C 5 c D Ν Α片段之重組 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 丨.---^----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -47- 1250019 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（45 ) 質體線性化並在離體中用T 7或T 3聚合酶轉錄分別得到 反股或同義探針。在〔3 5 S〕U T P存在下產生原位雜交 探針◦轉錄後，c D N A模板用D N a s e水解，放射性 標記之 R N A 經 Sephadex G-25 Quick SpinTM 管柱（ Boehringer Mannheim, Indianapolis，IN )純化，於乙醇 / 乙酸錢溶液中沈澱。使用前，將R N A探針用7 〇 %乙醇 淸洗並稀釋於1 〇 m M D Τ Τ。 原位雜交。進行冷凍切片（5 g m )並置於正電價的 載玻片（Superfrost Plus，Fisher Scientific，Pittsburgh, PA ，）。接近近端的切片用來與同義及反股探針雜交。其他的 切片則用來進行亞西藍（Ale 1 an blue )/ P A S染色。將 檢體再固定於4 %三聚乙醛，再水合於0 · 5 X SSC，然後用乙酸酐在三乙醇胺中乙醯化。用2500 一300〇cpm/u1之反股或同義探針於50%去離 子的甲醯胺、0 · 3M NaC 1 、20mM三羥甲基氨 基甲烷、5mM EDTA、1 x Denhardt's 溶液、

2 0 m M二硫蘇糖醇、l 〇 %聚葡萄糖硫酸鹽、〇 · 5毫 克/毫升酵母菌t RNA、及0 · 5毫克/毫升超音波振 盪的鮭魚精子D N A中在5 5 °C下進行雜交過夜。雜交後 用 2 X SSC、lmM EDTA、l〇mM 〇一 氫硫基乙醇在室溫下持續的淸洗，與R N A酶溶液C 2 0 毫克/毫升）在室溫下反應30分鐘，用〇 · 1 X SSC、lmM EDTA、l〇mM 〇一氫硫基乙醇 在55°C下淸洗2h，然後在室溫下用0 · 5 X 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -48- I.——h---------------訂---------線· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250019 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（46) S S C淸洗◦檢體脫水，空氣—乾燥，覆上K 〇 d a k N B T核 子追蹤乳狀液（Eastman Kodak, Rochester，NY )進行放射 能照相。在4 °C下暴露7至2 1天，將載玻片顯影，固定 ，並計算蘇木紫的染色（21)。 統計。所有的數據用平均V S E Μ表示。使用變異之單 向分析測定組間之統計上地顯著的差異。當變異分析確認 統計的重要性後用許氏（Scheffe ) F測試校正多重之比較 。依據零（null )假設，或然率少於〇 . 〇 5則可接受的 視爲統計上地顯著的不同。 結果 T N F α刺激N C I — Η 2 9 2細胞產生E G F - R 。首先測定是否N C I - Η 2 9 2細胞組成的表現E G F 一 R，用免疫墨點西方分析確認EGF-R蛋白質出現在 長滿的N C I — Η 2 9 2培養細胞（圖1 A，右）。細胞 長滿後加以檢視。水解液於8 %丙烯醯胺凝膠中電泳，用 抗- E G F — R抗體進行墨點。標識蛋白質之分子量標示 如右。E G F — R蛋白質之正性對照組來自A 4 3 1細胞 (圖 1 A，左），組成的表現 E G F — R ( Weber et al， supra.)。用抗一 E G F - R抗體進行免疫細胞化學的硏窮 顯示正性的染色，大多於分裂中的細胞（圖1 B，用抗-E G F - R抗體對培養之N C I - Η 2 9 2細胞進行免疫 細胞化學的分析）。細胞長滿時，可看見正性染色’最強 烈者於分裂中的細胞（箭頭，右邊）。無一次抗體時’無 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I --------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -49- 1250019 A7 B7 五、發明說明（47) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 染色（左邊）◦北方墨點顯示TNFa (20ng/毫升 )向上調節E G F — R基因表現，於1 2 h後出現並於 2 4 h後更形增加（圖1 C，N C I - Η 2 9 2細胞 EGF-R之北方分析）。細胞與TNFa (20ng/ 毫升）反應1 2或2 4 h後，自長滿之培養細胞萃取總 R N A進行分析。R N A於甲醒一瓊脂糖凝膠中電泳，轉 移至尼龍膜，用32P —標記之EGF - R cDNA探針 雜交。雜交後，淸洗尼龍膜細並進行放射能照相。 E G F - R配基刺激黏液的糖化結合物表現及N C I —H2 9 2細胞中MUC 5基因之表現。EGF — R在 N C I - Η 2 9 2細胞中組成的表現，故評估E G F - R 配基（E G F，T G F α )引發黏液糖化結合物產生之能 力（圖2，上欄，N C I - Η 2 9 2細胞之亞西藍（

Alcian blue ) / P A S染色以確認黏蛋白糖蛋白質）。上 欄=細胞在不含抑制劑下反應；下欄=在E G F - R酪胺 酸磷激酶抑制劑B I B X 1 5 2 2 ( 1 0 u g /毫升）存 在下反應。細胞單獨之反應（對照組）中，可見某些 P A S -正性染色（箭頭，上欄）；單獨與T N F α ( 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2〇ng/毫升）反應並不影響染色；與EGF; (25 ng/毫升）或TGFa (25ng/毫升）反應可增加 PAS-正性染色（箭頭）；與TNFα及TGFa反應 能顯著地增加染色（箭頭，上欄）° 某些對照組細胞顯示有染色；單獨與T N F α ( 2 0 ng/毫升）反應並不影響染色；與EGF或TGFa ( 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -50- 1250019 Α7 Β7 五、發明說明（48) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 各爲2 5 n g/毫升）反應可增加PAS —正性染色（箭 頭）；與TNFα及TGFa反應可增加染色（更大於各 單獨之配基）。因此，EGF - R配基可引發NC I -Η 2 9 2細胞中之黏液糖化結合物。 爲了檢視M U C 5基因表現，進行北方墨點分析（圖 3a)。將萃取自細胞之總R N A ( 1 〇 u g )於甲醛一 瓊脂糖凝膠中電泳，轉移至尼龍膜，用3 2 P -標記之 M U C 5 c D Ν Α探針雜交。雜交後，淸洗尼龍膜並進 行放射能照相。培養係於單獨培養液（C ) 、E G F或 TGFa (25ng/·升）、TNFa (2〇ng / 毫 升）、或組合TNFa及EGF或TGFa中進行12 ( 上欄）或2 4 h (下欄）以測定M U C 5基因表現。培養 亦可與TNF α及EGF或TGF α在EGF - R酪胺酸 磷激酶抑制劑（Β I Β X 1 5 2 2 1 - 1 0 u g / m 1 ，下欄）預反應後進行，以測定抑制劑預防M U C 5基因 之表現。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在對照組條件下，N C I - Η 2 9 2細胞顯示某些程 度之表覌（圖3 ，左下欄）；當細胞與E G F或T G F α 反應，1 2 h後M U C 5基因開始表現但2 4 h後表現則 非常明顯。單獨之T N F α不影響M U C 5基因表現，但 當TNF α加至細胞與EGF — R配基反應，MUC 5基 因表現顯著地增加（較之單獨之E G F - R配基引起之量 爲高）（圖3 )。 E G F - R酪胺酸磷激酶抑制劑（Β I Β X 1 5 2 2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -51 - 1250019 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明說明（49) )預防N C I — Η 2 9 2細胞中黏液糖化結合物之表現及 M U C 5基因之表現。爲了測試此假設，活化E G F - R 受體引發M U C 5基因表現，將細胞與E G F — R酪胺酸 磷激酶抑制劑Β I Β X 1 5 2 2反應。當N C I -Η292細胞用ΒΙΒΧ1522 (l〇ug/毫升）前 處理，在對照組條件下P A S -正性染色被抑制，E G F 一 R配基增加的染色被顯著地抑制（圖2，下欄）。於北 方分析中，組合TNF α及EGF或及TGF α之下 M U C 5基因表現顯著地增加完全地被Β I Β X 1 5 2 2 預處理所抑制（圖3，下欄）。此類結果意味著於N C I —Η 2 9 2細胞中活化E G F — R可誘發黏蛋白基因及黏 液糖蛋白質。 T N F α刺激老鼠產生E G F - R。用無病源之老鼠 (僅由少數之呼吸道上皮的高腳枉狀細胞組成）進行硏究 ，起始T N F α所扮演的角色。在對照組條件下，氣管上 皮含少量之E G F — R -正性細胞（圖4 A，左）。但是 ，氣管內的滴注TNFa (200ng)可引發氣管上皮 各種形式的細胞表現E G F — R蛋白質（圖4 A ’右）。 E G F - R -正性染色存在於高腳枉狀細胞（G )、前高 腳枉狀細胞（P - G )、非顆粒狀的分泌的細胞（S ) ' 及基底細胞（B a )，但不存在於纖毛細胞。因此’ TNFa引發EGF—R蛋白質產生。 老鼠E G F - R配基在產生黏液糖化結合物及 M U C 5基因表現上所扮演的角色。在對照組條件下’氣 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -52- 丨：—：----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250019 A7 _B7_ 五、發明說明（5〇) 管上皮含少量之高腳枉狀及前高腳枉狀細胞。氣管內滴注 EGF — R配基、EGF (600ng ;未示）或單獨之 T G F α ( 2 5 0 n g - 1表1 )對上皮產生黏液糖化結 合物則無效應。但是，當先投用T N F α ( 2 0 0 n g ) ，24h後投用EGF或TGFa (表1) ，48h後將 動物安樂死，亞西藍（Aid an blue ) / PAS染色顯著地 增加，高腳枉狀及前高腳枉狀細胞數量顯著地增加，細胞 總數或纖毛細胞的數目並不改變（表1 )。對照組動物原 位雜交顯示無M U C 5基因表現。當氣管內依序徐徐滴入 TNFa，接著滴入EGF或TGFa時，上皮有 MUC 5之表現。因此，單獨誘發EGF — R或EGF-R配基單獨之刺激不足以引發高腳枉狀細胞組織的變形或 產生黏液糖化結合物。但是，T N F a誘發E G F - R後 ，滴注E G F - R配基可顯著地刺激高腳枉狀細胞組織的 變形。 L——h---------------訂---------線· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -53- 1250019 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（51) 表1 氣管上皮之細胞分析 卵白蛋白致敏 細胞類型 對照組 TGF α TNF α/TGF a 僅爲i.p· i.p.+Lt. 高腳枉狀 2.8V0.7 5.8V1.2 28.8V3.4* 5.4V1.5 38.2V6.3* 前高腳枉狀 7.8V1.3 12.8V1.6 44.8V3.6* 13.8V1.4 36.0V6.3* 分泌的 82.0V2.0 72.2V4.0 40.8V2.4* 67.6V7.0 49.8V4.2 有纖毛的 49.6V2.0 54.6V23 53.2V1.8 56.4V3.8 52.4V7.1 基底的 57.8V2.6 56.8V2.3 43.0V3.5 60.2V3.4 59.8V2.9 中間型 1.4V0.5 2.0V0.4 0.8V0.4 1.4V0.2 2.6V0.5 總合 201.4V2.2 204.2V3.3 211.4V4.8 204.8V6.6 238.8V4.4* AB/PAS染色的面積％ 2.4V0.8 6.8V1.9 35.8V4.2* 7.8V2.9 38.7V6.2* 表1 · 中介物及卵白蛋白致敏對老鼠氣管上皮細胞的效 應。細胞的分析如方法中所描述；每組五隻老鼠。用亞西 藍（Alcianblue) (AB) / PAS染色（染黏液糖化結 合物）進行確認。此外，細胞計數係估算A B / P A S染 色佔上皮總面積的百分比。對照組呼吸道及單獨T G F α (2 5 0 n g )刺激之呼吸道含少量之高腳枉狀及前高腳 枉狀細胞；幾乎無AB/PAS染色。TNFa (200 n g )及後序之T G F α處理可增加高腳枉狀及前高腳枉 狀細胞數量及增加A B / P A S染色細胞的面積◦老鼠用 卵白蛋白（〇 V A )腹腔內注射（i p )致敏對細胞分佈 或AB/PAS染色並無效應，但i p投用〇VA，接著 氣管內的（1 t )滴注〇 V a，可增加高腳枉狀及前高腳 枉狀細胞及A B / P A S染色的面積。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ΙΪ---^----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -54 - 1250019 A7 B7 五、發明說明（52) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 老鼠卵白蛋白致敏引發E G F - R及高腳枉狀細胞產 生。因爲急性氣喘造成的死亡係由於呼吸道之黏液阻塞， 所以用無病源老鼠產生氣喘模式。於第〇及1 〇天注射卵 白蛋白（1 0毫克，i p )並未刺激高腳枉狀細胞之細胞 增殖（表1 )。但是，接著於第2 0、2 2、及2 4天三 次氣管內的（i · t ·)滴注卵白蛋白（0 · 1 %， 1 0 0 u 1 )，動物第2 6天安樂死，高腳枉狀及前高腳 枉狀細胞的數目則顯著地增加；纖毛及基底細胞的數目則 不變（表1 ，右邊）。用抗E G F - R抗體進行免疫組織 化學的硏究顯示對照組氣管並無染色。動物用i · p ·及 i . t ·致敏後顯示E G F — R染色（圖4 B，左）選擇 的及於A B / P A S正性染色的細胞（圖4 B，右）。氣 管滴注卵白蛋白（〇 · 1 %，1 0 0毫升）後，高腳枉狀 及前高腳枉狀細胞強烈的表現E G F - R之免疫反應性（ 下左），相同之細胞亦爲亞西藍（Alcian blue ) / P A S 正性的染色（下右）。因此，卵白蛋白之氣喘模式顯示在 產生E G F - R之細胞有高腳枉狀細胞之增生。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

E G F - R酪胺酸磷激酶抑制劑（B I B X 1 5 2 2 ) 能避免滴入TNF α與E GF - R配基以及卵白蛋白致敏 誘發的的老鼠產生高腳枉狀細胞。因爲Β I Β X 1 5 2 2 可預防培養的細胞產生黏蛋白，故用無病源之老鼠檢視此 抑制劑之效應。氣管滴注T N F〇L接著用E G F - R配 基T G F α處理可增加Alcian-blue / P A S染色， BIBX1522 (3 — 30 毫克/kg ’ iP ;圖 5A 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -55- 1250019 Α7 Β7 五、發明說明（53) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) )前處理可劑量依存的抑制此效應。氣管滴注T N F α ( 引發EGF — R)，接著用EGF — R配基TGFa處理 可，結果使高腳枉狀細胞組織的變形。 老鼠以卵白蛋白致敏後用B I BX1 5 2 2 ( 1 0毫 克/ k g，i p )前處理可完全抑制高腳枉狀細胞產生（ 用亞西藍（Alcian blue ) / PAS染色評估；圖5 B )。 動物用卵白蛋白i · P ·處理後支氣管的上皮僅顯示少量 之AB/PAS —正性染色。動物先用OVA i . p · 致敏，接著在氣管內的（1 . t ·)滴注〇V A三次，顯 示A B / P A S -正性染色顯著的增加。 此類硏究顯示當用E G F — R配基刺激E G F — R時 ’由於E G F — R之活化效應，離體中及活體中可引發高 腳枉狀細胞產生，而其可被E G F - R酪胺酸磷激酶抑制 劑阻擾。於卵白蛋白氣喘模式中，抑制劑亦有效的預防高 腳枉狀細胞產生。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 除了誘導高腳枉狀細胞的機制之外，本結果亦基於 E G F - R表現提供高腳枉狀細胞產生在演化上可能的序 列：T N F α刺激下引發非顆粒狀的分泌的細胞的強烈染 色；E G F - R配基後續的活化作用引起細胞質中黏液糖 化結合物持續性的染色，細胞變成 ''前高腳枉狀〃，然後 變成 ''高腳枉狀〃細胞。滴入T N F α後，接著滴入 E G F - R配基可引發的高腳枉狀細胞之產生而不改變上 皮細胞的總數，顯示E G F - R之活化可促進選擇的細胞 分化（而不是增生）。此結果顯示高腳枉狀細胞係源自表 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -56- 1250019 A7 B7 五、發明說明（54) 現E G F - R之非顆粒狀的分泌的細胞，經E G F - R配 基刺激產生黏蛋白。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在死於急性氣喘的病人中發現局腳枉狀細胞之細胞增 殖及黏液阻塞。在鼠科的氣喘模式中發現重覆滴注卵白蛋 白引起呼吸道致敏，造成呼吸道高腳枉狀細胞顯著的細胞 增殖◦不表現的於對照組呼吸道上皮之E G F - R，顯示 在致敏的動物中表現。該細胞經染色後呈現前高腳枉狀及 局腳枉狀，顯不E G F - R涉及局腳枉狀細胞之產生。 E G F - R受體酪胺酸磷激酶抑制劑（B I B X 1 5 2 2 )前處理可預防呼吸道高腳枉狀細胞產生，證實高腳枉狀 細胞中E G F - R活化在產生實驗的氣喘上扮演的角色。 本結果顯示E G F - R路徑涉及高腳枉狀細胞之細胞 增殖。前述之硏究顯示各種刺激，例如：臭氧、二氧化硫 、病毒、脂多醣類、血小板活化因子、及介白素一 4可向 上調節黏蛋白表現及分泌。本發明提供評估此類發炎性的 刺激與E G F — R系統間之關係的機制。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 氣喘爲本發明治療策略的實施例：正常人類呼吸道上 皮纖毛細胞對高腳枉狀細胞之比例爲3 — 1 0。氣喘時， 高腳枉狀細胞之數目等於或超過纖毛細胞；死於氣喘之病 人與死於非氣喘呼吸疾病之病人比較下，高腳枉狀細胞面 積百分比是增加3 0倍。除了產生高腳枉狀細胞之外，應 排除過度分泌之來源。因爲高腳枉狀細胞的生命期不詳， 治療後解析高腳枉狀細胞細胞增殖之時間點無法準確的預 測。若未進一步暴露至過敏原，前述致敏老鼠高腳枉狀細 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -57- 1250019 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（55) 胞細胞的增殖與其他過敏性炎症的表現形式可於五十天內 解析。抑制E G F - R活化，視高腳枉狀細胞的生命期而 定可更快的抑制高腳枉狀細胞之細胞增殖。最近，已有報 導指出高度選擇的A T P -競爭性酪胺酸磷激酶抑制劑。 E G F - R酪胺酸磷激酶抑制劑已被評估治療與E G F -R表現相關的惡性腫瘤。 過度分泌是許多呼吸道慢性發炎性疾病的主要表現形 式。目前無有效的治療以減輕此症狀及終止此類疾病之進 展。本發現提供機制及治療的策略：抑制E G F - R活化 ，預防高腳枉狀細胞之產生。以E G F - R活化抑制劑治 療過度分泌的呼吸道疾病。 實施例 2 氧化緊迫在高腳枉狀細胞產生上扮演的角色 人類中，長期抽煙與周邊呼吸道包括高腳枉狀細胞之 細胞增殖進行性的病理改變有關。類似的在動物抽煙的實 驗模式顯示在呼吸道引起高腳枉狀細胞之細胞增殖。但是 ，抽煙引發黏蛋白合成之機制則未明。以下數據顯示前發 炎性的細胞分裂素-活化的嗜中性白血球及抽煙會使人類 支氣管上皮細胞經配基依存的路徑活化E G F - R引起黏 蛋白M U C 5 A C之合成。此類結果顯示徵募嗜中性白血 球及抽煙是上皮細胞分化之調控者可在呼吸道異常的誘發 產生黏蛋白細胞之產生。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -58- A7 1250019 B7 五、發明說明（56) 方法 分離嗜中性白血球。人類嗜中性白血球可從健康的人 類供體周邊血液純化得之。分離嗜中性白血球可用標準技 藝進行：Fic〇H-Hypaque梯度分離、聚葡萄糖沈降、及低張 的水解紅血球。細胞經錐蟲藍染料排除染色後顯示> 9 5 %爲活細胞。爲了預防內毒素污染，所有溶液均通過 〇 . 1 u m濾膜過濾。 細胞培養◦將N C I — Η 2 9 2細胞，人類肺部黏液 表皮樣的癌細胞株，在3 7 °C下、濕化的5 % C〇2水護套 的培養箱內生長於內含1 〇 %胎牛血淸、青黴素（1 0 0 U /毫升）、鏈黴素（100ug /毫升）及Hepes ( 2 5 mM)之RPMI 1640培養液。使用6孔培養盤或 8室之載玻片培養細胞。當細胞長滿後，細胞與單獨之嗜 中性白血球（1 0 6細胞/毫升）、單獨之T N F C C (重 組人類 TNFCC，20ng /毫升，G 酵素，Cambridge， ΜΑ )、單獨之I L 一 8 (重組人類Γ L — 8，1 0 8 Μ ，G 酵素）、單獨之 f M L Ρ ( 1 〇 8 Μ，Sigma，St. Louis, MO ) 、TNFa加嗜中性白血球、IL — 8加嗜中 性白血球、f M L P加嗜中性白血球、過氧化氫（Η 2〇2 ，2 0 0 u Μ )、抽煙溶液或T G F α (重組人類 TGFa，〇 · 1 — 25ng / 毫升，CalBiochem，San

Diego, CA )反應1 h。然後淸洗細胞，與單獨之新鮮培養 液反應。在預選的時間終止反應（m R N A爲6 h及1 2 h，蛋白質爲2 4 h )。對照組中細胞與單獨之培養液反 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） _____ --------訂---------線 C請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -59- 1250019 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（57) 應相同之時間。其他硏究中選用嗜中性白血球、T N F α 作爲刺激物，因爲其對M U C 5 A C合成最具效應。將 NCI — 1 — 1292 細胞與預先用 TNFa (20ng /毫升）反應1 h之嗜中性白血球反應，然後用滅菌之 P B S淸洗以避免上淸液之污染（例如嗜中性白血球釋放 之分子），或將N C I - 1 一 1 2 9 2細胞與單獨之上淸 液反應。E G F - R酪胺酸磷激酶抑制劑之抑制反應中， NCI— H292 細胞用 BIBX1522 (10 lag/毫升，來自 B oehringer Ingelheim Inc., Ingelheim, Germany)或胰主素（tyrphostin) AG 1 4 7 8 ( 1 0 u M，CalBiochem )前處理3 0分鐘然後進行刺激作用。 亦檢視源自血小板的生長因子受體酪胺酸磷激酶選擇的抑 制劑（胰主素（tyrphostin) AG12 9 5，100uM， CalBiochem )，及胰主素（tyrphostin )(胰主素（ tyrphostin ) A 1 ，1 0 〇 u Μ，CalBiochem )負對照組之 效應。在抗E G F - R配基抗體阻擾之抑制硏究中，上淸 液用抗一 TG F α抗體（CalBiochem )或抗—E G F抗體 前處理3 0分鐘，然後加至N C I - Η 2 9 2細胞。檢視 所扮演的角色氧自由基係用氧自由基DMS〇（1%， Sigma )淸除劑、1 ，3 —二甲基—2 —硫脲（D Μ T U， 5 0 m Μ，Sigma )、或超氧化物歧化酶（S〇D，3 0〇 U / 毫升，Sigma )。 製備香煙溶液。硏究之香煙爲編碼2 R 1，來自 University of Kentucky Tobacco and Health Research 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -60- 1250019 A7 B7 五、發明說明（58) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Foundation。香煙溶液的製備描述於（Dusser et al. ( 1 9 89) J· Clin· Invest· 84:900 906 )。簡言之，將香煙通入聚丙 烯注射針筒（35毫升），速率爲1 puff/分鐘（ 1〇次）並緩1受的吹入2 0毫升含5 〇 m Μ H e p e s緩衝溶 液之R P Μ 1 1 6 4 0。然後將香煙溶液滴定至p η 7 · 4，製備後立即使用。 檢視N C I — Η 2 9 2細胞中黏液糖化結合物及 M U C 5 A C蛋白質。實驗結束後，將細胞生長在8 -室 之載玻片用4%三聚乙醛固定1 h，然後用亞西藍.（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Alcian blue ) /過碘酸—Schiff ( P A S )染色檢視黏液 糖化結合物，或用免疫細胞化學方法檢視]V[ U C 5 A C。 免疫細胞化學方法檢視M U C 5 A C時，用含〇 . 〇 5 % 丁\^61120，2%正常山羊血淸之？6 8及1^7311^〇1(2 m Μ )作爲抗體稀釋劑。將細胞與老鼠抗μ U C 5 A C mAb ( clone 45 Ml, 1:200, Neo Markers, Fremont, CA )在室温下反應1 h，然後用P B S淸洗三次去除過量的 一次抗體。然後細胞與生物素化的馬抗-老鼠I g G ( Vector Laboratories Inc., Burlingame, C A ) ， \ ： 2 0 0 倍稀釋，在室溫下反應1 h。結合的抗體依據標準方法用 卵白素生物素鹼性磷酸酯酶複合體方法顯現。 人類M U C 5 A C基因之原位雜交。將2 9 8 b p之 人類MUC 5AC cDNA片段插入TA選殖載體（ Invitrogen，San Diego, CA ) 。RNA探針製備之及原位雜 交依上述之方法進行。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -61 - 1250019 A7 ___B7__一 五、發明說明（59) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) MU C 5AC蛋白質之免疫測定。MUC 5 AC蛋白 質之測量依上述之方法進行。簡言之，用P B S將製備的 細胞水解液多重稀釋，5 0 u 1之各樣品與碳酸氫鹽-碳 酸鹽緩衝溶液（5 0 u 1 )在4 0 °C下於9 6孔微量滴定 盤（Maxisorp Nunc，Fisher Scientific, Santa Clara, CA )

中反應，至乾燥爲止◦滴定盤用PB S淸洗三次，用2% B S A (溶析份V，Sigma )在室溫下阻擾1 h。滴定盤用 P B S淸洗三次，然後用含〇· 〇 5% Tween 20之P B S 稀釋的5 0 u 1老鼠單株M U C 5 A C抗體（1 : 1〇〇 )反應。1 h後各孔用P B S淸洗三次，加入1 0 0 u 1 辣根過氧化酶一山羊抗一老鼠I g G聯結物（ 1 : 10 ，〇〇〇，Sigma) 。lh後滴定盤用PBS淸洗 三次。用TMB過氧化酶溶液（Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD )展開色彩反應並用 2 N Η 2 S〇4終止反應。在4 5 0 n m下記讀。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 TGFa蛋白質的定量分析。TGFa蛋白質係用商 購之組套依廠商指示進行E L I S A ( Sigma )測量。嗜中 性白血球與T N F α ( 2 0 n g /毫升）反應後1 h將上 淸液與含1 % Triton X-100、1 %去氧基膽酸鈉及許多蛋 白酶抑制劑之水解緩衝溶液P B S (完整的Mini，

Boehringer Mannheim, Germany )混合並用於測量 T G F α 〇 E G F - R蛋白質之免疫沈澱及酪胺酸磷酸化之免疫 墨點。將細胞在無血淸下培養2 4 h，然後用T G F α、 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -62- 1250019 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（6〇) Η 2 0 2、或活化的嗜中性白血上淸液球刺激1 5分鐘。朿ij 激後，細胞在4 °C下圓形迥轉器中水解及反應3 0分鐘。 移除不溶的材料，細胞水解液在4 °C、1 4，0〇0 r p m下離心5分鐘。含等量蛋白質之上淸液用抗一 E GF受體抗體（多株的，Ab 4， CalBiochem )及2〇 U 1蛋白質A —瓊脂糖（Santa Cruz )在4 °C下免疫沈殿 2 h。沈澱用〇 · 5毫升水解緩衝溶液淸洗三次、懸浮於 S D S樣品緩衝溶液，沸騰5分鐘。蛋白質用803 — PAGE ’ 8 · 0%丙烯醯胺凝膠分離。產生的凝膠在轉 移緩衝溶液：2 5 m Μ三羥甲基氨基甲烷一 H C I 、 192mM甘胺酸，20% (ν〇 1/νο 1)甲醇， ρ Η 8 · 3中平衡。然後蛋白質電泳轉移至硝化纖維素細 胞月旲（〇.22pm)，用含 0 · 0 5% Tween20 ，5% 脫脂牛奶之P B S阻塞過夜，然後與單株的抗-磷酸酪胺 酸抗體（1 : 1 〇 〇，Santa Cruz )反應1 h。結合的抗 體依據標準方法用卵白素一生物素鹼性磷酸酯酶複合體方 法（A B C 組套，Vector Laboratories)顯現。 統計。所有的數據用平均土 S E Μ表示。用單向變方 分析測定群組間統計上地顯著差異。當變方分析確認統計 上差異後用Scheffe’s F測試校正多重的比較。依據零（ null )假設，或然率少於〇 · 〇 5則可接受的視爲統計上 地顯著的不同。 結果 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 丨：-------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -63- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250019 Δ7 Α7 Β7 五、發明說明（61) 引起黏蛋白M U C 5 A C合成之活化的嗜中性白血球 。當嗜中性白血球刺激後，活化的嗜中性白血球（I L -8、fMLP、TNFa)與 NCI— H292 細胞反應 lh，24h內MUC5AC蛋白質合成顯著的增加，然 而未經刺激的嗜中性白血球（1 〇 /毫升），單獨之I L 一 8或單獨之fMLP顯示無MU C 5AC合成效應；與 單獨之T N F α反應，引起小輻度，M U C 5 A C合成顯 著的增加。當嗜中性白血球與T N F α預反應1 h，然後 分離嗜中性白血球及其上淸液，後續的將上淸液與N C I 一 Η 2 9 2細胞反應1 h，1 2 h內會向上調節 MUC 5AC基因之表現，並在2 4 h內刺激亞西藍（ Alcnan blue ) / PAS及抗體對MUC 5AC蛋白質之染 色；靜止的N C I - Η 2 9 2細胞顯示無M U C 5 A C基 因表現，僅有小量點綴的亞西藍（Alcian blue ) / P A S 及MUC 5AC蛋白質之染色。上淸液引發的 M U C 5 A C蛋白質合成較對照組顯著的增加；反應後上 淸液中分離之嗜中性白血球則無效應。因此活化的嗜中性 白血球快速的分泌活化的產物，引起M U C 5 A C合成。 E G F - R酪胺酸磷激酶抑制劑預防活化的嗜中性白 血球上淸液誘發的MU C 5 A C合成。因爲E G F — R配 基可經活化E G F - R酪胺酸磷激酶引起N C I -Η 2 9 2細胞合成M U C 5 A C，所以檢視E G F — R活 化在活化的嗜中性白血球上淸液引發的M U C 5 A C合成 中所扮演的角色。將N C I — Η 2 9 2細胞選擇的用 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 丨：---I---------------訂---------線· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -64- A7 1250019 _B7___ 五、發明說明（62) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) E G F - R酪胺酸磷激酶抑制劑（B I B X 1 5 2 2 A G 1 4 7 8 )前處理，預防活化的嗜中性白血球上淸液 引發MU C 5 A C蛋白質的合成。選擇之源自血小板生長 因子受體磷激酶抑制劑（A G 1 2 9 5 )及胰主素（ tyrphostin )負對照組（A 1 )則無效應。此類結果意味著 活化的嗜中性白血球上淸液可活化E G F - R酪胺酸磷激 酶引發MUC5AC的合成。 活化的嗜中性白血球上淸液引起E G F - R配基分泌 對M U C 5 A C合成所扮演之角色。爲了測定活化E G F 一 R酪胺酸磷激酶是否與E G F - R配基（E G F及 T G F α )有關，將活化的嗜中性白血球上淸液與E G F 一 R配基之中和抗體反應。上淸液與抗一 TG F α抗體或 抗E G F抗體前處理不會抑制活化的嗜中性白血球上淸液 引發的MUC5AC合成。此外上淸液中無TGFa。因 此，活化的嗜中性白血球上淸液引起的E G F - R酪胺酸 磷酸化是與EGF — R配基、EGF及TGFa無關之引 發機制。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 抽煙及氧自由基引起MU C 5 A C合成。抽煙及氧自 由基（H2〇2)可在1 2h內向上調節MUC5AC之基 因表現，T G F α亦然。類似的所有刺激均可以劑量依存 的方式在2 4 h內增加MU C 5 A C蛋白質合成及黏液糖 化結合物之產生。H2〇2反應之最大的MU C 5 A C合成 顯著的少於T G F α之反應。A G 1 4 7 8前處理可預防 所有刺激引發的M U C 5 A C蛋白質合成之增加，顯示 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -65- A7 1250019 B7 五、發明說明（63) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) E G F - R酪胺酸磷激酶活化之刺激引起黏蛋白合成。活 化的嗜中性白血球上淸液、抽煙及Η 2 0 2引起的 M U C 5 A C合成顯著的被自由基淸除劑（D M S〇及 D Μ T U )及S〇D前處理所抑制，但T G F α引起之 MUC 5AC蛋白質合成則未受DMSO或SOD影響。 活化的嗜中性白血球上淸液及Η 2 0 2可誘發E G F — R之酪胺酸磷酸化。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在所有刺激的條件下（活化的嗜中性白血球上淸液、 抽煙、Η2〇2或TGFa) ，EGF — R蛋白質之分佈與 血淸飢餓的對照組相似。活化的嗜中性白血球上淸液、抽 煙、Η 2〇2或T G F α加入後1 5分鐘發生總蛋白質酪胺 酸磷酸化；血淸飢餓的對照組顯示無此效應。T G F α -引發的總蛋白質酪胺酸磷酸化大於活化的嗜中性白血球上 淸液、抽煙或Η 2〇2之效應。爲了測定E G F — R是否磷 醯化，用抗E G F - R抗體進行免疫沈殿。活化的嗜中性 白血球上淸液、抽煙之可溶解產物、及Η 2〇2均在1 5分 鐘內引發的E G F - R -特定的酪胺酸磷酸化，相似於 T G F α引起的效應◦ N C I — Η 2 9 2細胞用 A G 1 4 7 8前處理，可抑制所有刺激對E G F — R酪胺 酸之磷酸化。D M S〇可抑制上淸液、抽煙、及Η 2〇2〜 引發的E G F — R酪胺酸磷酸化，但D M S〇對T G F α 一引發的E G F - R酪胺酸磷酸化則無效應。 上述結果顯示嗜中性白血球在I L 一 8、f M L Ρ、 或T N F α活化下可引起N C I — Η 2 9 2細胞黏蛋白 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -66- 1250019 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（64) MU C 5 A C合成。此外，嗜中性白血球與T NF α反應 1 h後收集的上淸液可引起μ U C 5 A C合成，此效應被 選擇的E G F - R酪胺酸磷激酶抑制劑所抑制。抑制 E G F - R酪胺酸磷激酶完全地阻擾活化的嗜中性白血球 上淸液引起的M U C 5 A C合成；非E G F — R酪胺酸磷 激酶抑制劑，選擇的源自血小板的生長因子受體磷激酶抑 制劑（AG 1 2 9 5)及胰主素（tyrphostin) (A 1 )負 對照組，則無效應，意味著E G F - R酪胺酸磷酸化爲活 化的嗜中性白血球上淸液引發M U C 5 A C合成之信號路 徑。 進一步分析活化的嗜中性白血球上淸液引發E G F -R酪胺酸磷酸化之機制，檢視配基依存的及配基非依存的 E G F - R路徑。首先測量活化的嗜中性白血球上淸液中 之TGFa並發現上淸液不含可測量之TGFa。前述報 告顯示嗜中性白血球僅含低濃度（2 · 5 p g / 1 0 6細胞 )之T G F α。上淸液活化的嗜中性白血球對 MUC5AC合成之效應爲lng之TGFa ，爲嗜中性 白血球中TGFa之400倍。第二用EGF—R配基中 和抗體進行阻擾硏究：E G F中和抗體及T G F α前處理 無法抑制活化的嗜中性白血球上淸液引起的M U C 5 A C 合成◦此類結果顯示嗜中性白血球上淸液引發的 MU C 5 A C合成不是因爲嗜中性白血球分泌E G F - R 配基（T G F α及E G F ) ◦其次’檢視配基非依存的路 徑：因爲嗜中性白血球在活化時會釋放氧自由基，可引起 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -67- A7 1250019 B7 五、發明說明（65) 各種細胞E G F - R酪胺酸磷激酶經活化，假設N C I -Η 2 9 2細胞中活化的嗜中性白血球釋放氧自由基會引起 E GF - R酪胺酸磷酸化並產生的MUC 5Α C合成。淸 除自由基（D M S〇及D Μ T U )及S〇D可抑制活化的 嗜中性白血球上淸液引起的M U C 5 A C合成。報導指出 T N F α可引起嗜中性白血球懸浮液在1 h內大量釋出氧 化物：本結果有相似的時間流程。 本硏究中，外生性Η 2〇2 (嗜中性白血球在氧化下主 要的釋放產物）可引起N C I - Η 2 9 2細胞合成 MUC5AC。但是，Η2〇2對MUC5AC合成的最大 反應僅爲T G F α反應的一半。本硏究發現，單獨之抽煙 會引起M U C 5 A C合成。顯示抽煙能在活體中經直接刺 激及間接刺激徵募嗜中性白血球引起M U C 5 A C合成。 抽煙中引起M U C 5 A C合成的分子仍然未知。抽煙中含 多重產物（例如尼古丁、焦油、丙烯醛及氧化劑）。本實 驗中，D M S 0及S〇D部份抑制抽煙引發的 MU C 5 A C合成。因此，氧化劑緊迫是產生此反應的可 能機制。事實上，抽煙一引發的M U C 5 A C合成完全地 被E G F - R酪胺酸磷激酶抑制劑阻擾，顯示E G F - R 活化參與抽煙引發的M U C 5 A C合成。 呼吸道疾病中，嗜中性白血球性的呼吸道炎症是一般 的病徵，細胞分裂素及抽煙可徵募及活化嗜中性白血球。 本硏究顯示徵募嗜中性白血球及抽煙亦可調控上皮細胞分 化，在呼吸道誘發黏蛋白產生細胞產生。最重要的是，抑 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -68- 1250019 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（66) 制E G F - R之活化可用於治療過度分泌的呼吸道疾病。 實施例 3 傷害呼吸道上皮引起高腳枉狀細胞組織的變形 據假設，呼吸道徐徐滴入瓊脂糖堵塞物而不阻塞支氣 管，此堵塞物會引起炎症，造成高腳枉狀細胞組織的變形 。據顯示瓊脂糖堵塞物引發顯著的高腳枉狀細胞局部的產 生（亞西藍（Alcian blue ) / P A S正性染色及黏蛋白 M U C 5 A C基因表現），引起局部的徵募發炎性的細胞 。結果意味著E G F - R活化堵塞物引發的高腳枉狀細胞 組織的變形。 方法 動物。實驗的動物程序經C 〇 m m i 11 e e ο n A n i m a 1 Research of the University of California San Francisco 批 準。使用特定之無病源，雄性F 3 4 4老鼠（2 3 0至 2 5 〇 g 體重；Simonsen Lab., Gilroy, CA )。將老鼠置 於無病源（Bioclean )之籠中，無菌箱控制環境；動物可 自由攝食滅菌之食物及水。 樂品。使用樂品係來自以下來源：環憐釀胺（Sigma， St. Louis，M〇）、巴比妥酸納（Brevital, Jones Medical Industries, Inc., St. Louis, MO )、戊巴氏妥鈉（Nembutal ,Abbott Lab.，North Chicago，IL);將 BIBX1522 ，E G F — R酪胺酸磷激酶選擇的抑制劑（來自Boehnnger 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） ' ' 一 -69 - --------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250019 A7 B7 五、發明說明（67)

Ingelheim, Inc.，Ingelheim, Germany )，溶於以下溶液： 2毫升聚乙二醇4〇0 ( Sigma，St. Louis，M〇），1毫升

0 · IN HC 1 ，及3毫升2%甘露糖醇水溶液（pH 7.0) 。N P C 1 5 6 6 9 (白血球移動抑制劑）來 自 Scios Nova, Inc., Mountain View，CA 〇 瓊脂糖堵塞物。瓊脂糖堵塞物（0 · 7 - 0 . 8 m m 直徑）係溶於4 %瓊脂糖第二型培養液E E〇（Sigma, St· Loms，MO)之滅菌的磷酸鹽一緩衝的生理食鹽水（ P B S )。檢視組織中之瓊脂糖堵塞物時，在5 0 t下熔 解瓊脂糖後加入3 %懸浮之！^〇1^81^11311163(3丨£11^，31:· Louis, M〇）。 實驗方法。硏究使用無病源老鼠是因爲彼在呼吸道少 有高腳枉狀細胞。將動物用巴比妥酸鈉（Brevital，2 5毫 克/ k g，i · p .)麻醉。將暴露敗血氣的管從中線切 開，經 2 0 號 Angiocath ( Becton Dikinson，Sandy，UT ) 聯結至聚乙烯管（P E 9 0 ，內徑0 · 8 6 m m，外徑 1.27mm， Clay Adams，Parsippany，NY )穿入切入 的氣管徐徐滴入瓊脂糖堵塞物至支氣管。將聚乙烯管彎成 3 0度角以選擇的滴注入右支氣管。滴注後縫合切口。 爲了評估E G F - R對瓊脂糖堵塞物一引發的高腳枉 狀細胞組織的變形所扮演的角色，將動物在滴注瓊脂糖堵 塞物前lh用BIBX1522 (80毫克/kg，丄. Ρ·)處理，每日重覆（40毫克/kg， 1·ρ·， bid)。動物在滴注瓊脂糖堵塞物後2 4、4 8或7 2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -70- 1250019 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（68) h安樂死。 爲了評估T N F α在瓊脂糖堵塞物-引發的高腳枉狀 細胞組織的變形中所扮演的角色，將動物用T N F α中和 抗體（G酵素，Boston，ΜΑ )處理。滴注瓊脂糖堵塞物前 先進行處理（100u 1 ，0 · 2毫升生理食鹽水’ 1 · P ·)，每曰重覆1 · p ·注射。此外，將T N F α中和 抗體經滲透的微泵（Alzet 2ML1，Alza Corp.，Palo Alto， CA )灌入（1 〇 u 1 / h )植入皮下。 爲了硏究嗜中性白血球對瓊脂糖堵塞物一引發的高腳 枉狀細胞組織的變形之效應，老鼠用環磷醯胺（骨髓白血 球抑制劑）或環磷醯胺與N P C 1 5 6 6 9組合物前處 理。環磷醯胺（1 0 0毫克/ k g，i · p ·)在滴注瓊 脂糖堵塞物前5天投用，滴注堵塞物前1天再次注射投用 環磷醯胺（50毫克/kg，i · p ·)。使用NPC 15669時，藥物（1〇毫克/kg ，i · p ·)在滴 注瓊脂糖堵塞物前1 h投用，然後每日投用爲期3天。 所有藥物（BIBX1522，TNFa中和抗體、 環磷醯胺、及N P C 1 5 6 6 9 )係於滴注瓊脂糖堵塞 物前lh用1·p·投用，重覆每日劑量爲期3天。 組織製備。瓊脂糖堵塞物滴注後各種時間將老鼠用戊 巴氏妥鈉（65毫克/kg ，i · p ·)麻醉，在12〇 m m H g壓力下全身循環的灌流內含1 %三聚乙醛之二乙 基焦碳酸鹽處理的P B S。移除右肺，右尾葉用於組織切 片。冷凍切片時，移除組織並置於4 %三聚乙醛1 h，然 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 丨^-------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -71 - 1250019 A7 B7 五、發明說明（69) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 後以3 0 %蔗糖取代冷凍保護過夜。組織包埋於〇 · c · T ·化合物（Sakura Finetek U.S.A·，Inc·, Torrance，CA ) 。丙烯酸甲酯切片時將組織置於4 %三聚乙醛2 4 h，然 後用乙醇濃度梯度脫水，包埋於丙烯酸甲酯j B - 4 ( Polysciences，Inc·, Warrington，PA )。組織切片（4 u m 厚）用亞西藍（A1C1 an blue ) / PA S染色並用蘇木紫計 算染色的細胞。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 支氣管上皮的形態分析。上皮黏液糖化結合物亞西藍 (Alcian blue ) / P A S染色面積的百分比係用半自動的 影像分析系統依據發表的方法測定。將上皮面積及上皮亞 西藍（Alcian blue )/ P A S染色的黏液結合物用人工劃 定界限並用 N I Η 影像程式（U.S. National Institutes of health所開發，可用匿名的F T P自網路下載或自National Technical Information Service, Springfield, Virginia; part number PB95-500195GEI拿到磁片）分析。數據用亞西藍 (Aldan blue )/ P A S染色對上皮的總面積百分比加以 表示。爲了半定量的評估黏液分泌，測定亞西藍（A1 c 1 a η blue ) / P A S正性染色對上皮表面長度的百分比係計算 正性染色對總長度比例之長度。計算剝蝕的上皮對總上皮 長度的比例測定剝蝕上皮的百分比。 於丙烯酸甲酯切片及細胞分析確認細胞類型。上皮細 胞總數的測定係用油浸的接物鏡（放大1 0 0 0倍）計數 2 m m基底層之上皮細胞的細胞核。各上皮分析區域的基 底層線性長度用基底層數位化的影像測定。上皮細胞的確 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -72- 1250019 A7 B7 五、發明說明（70) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 認如前述。簡言之，基底細胞爲小的扁平之細胞’有大的 細胞核，位於基底層上方不到呼吸道內腔的地方。細胞質 的染色爲深色，無亞西藍（Alcian blue )或P A S -正性 顆粒。纖毛細胞具有纖毛的邊界，細胞質的染色爲淺色’ 有大及圓的細胞核。非顆粒狀的分泌的細胞爲管柱形，並 自支氣管的內腔延伸至基底層。內支氣管的滴注瓊脂糖堵 塞物後， ''發展〃形成高腳枉狀細胞（前高腳枉狀細胞） 。此類細胞顯示亞西藍（Alcian blue )/ P A S正性染色 ，顆粒小，但細胞中顆粒少；含較小的黏液染色的面積（ 上皮之高度小於從細胞膜底至管腔的表面之1 / 3 )或少 有及輕微之亞西藍（AlC1an blue ) / P A S染色、小顆粒 。未定形式之細胞其定義爲缺少足夠之細胞質特性作適當 分類的細胞表現形式。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 E G F - R之免疫組織化學定位。E G F - R測定係 用免疫組織化學的定位，使用單株的老鼠抗E G F - R抗 體（CalBiochem，San Diego, CA )。將前述製備的 4 u m 冷凍切片用4%三聚乙醛固定後，用0 · 3%H2〇2/甲 醇處理。組織與E G F - R抗體（1 : 2 5 0稀釋）反應 。依序用生物素化的馬抗老鼠I g G ( 1 : 2 0〇；

Vector Lab·, Burlingame, CA )，抗生蛋白鏈菌素一過氧化 酶複合體（A B C 組套，Vector Lab·，Burlingame，CA ) 以3，3 / -二胺基對二胺基聯苯四氫氯化物（Sigma，St. L o u 1 s, Μ〇）呈現抗原-抗體複合體的染色。負對照組載 玻片之反應中刪除一次或二次抗體並用P B S取代。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -73- 1250019 A7 B7 五、發明說明（71) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 原位雜交。〔S〕一標記之核酸探針產生自含3 2〇 bp cDNA片段之老鼠MUC5AC質體，來自 Dr. Carol Basbaum。切片與〔3 5 S〕—標記之 R N A 探針 (2 ， 5〇〇一3 ，〇〇〇c p m / 1 d雜交緩衝溶液） 雜交並在迫切的條件下（包括用R N A酶A處理）淸洗。 放射性照相7 - 2 1天後，將攝影用的乳狀液顯影，載玻 片用蘇木紫染色。 計數呼吸道上皮嗜中性白血球。評估嗜中性白血球流 入支氣管係用嗜中性白血球與3 - 3 / —二胺基對二胺基 聯苯四氫氯化物染色，計數呼吸道內腔上皮中嗜中性白血 球的數目；結果用染色的細胞數目/ m m之基底層長度表 不 ° 氣管肺泡洗濯（B A L )。爲了評估各組動物分化之 細胞數目，將肺用3毫升滅菌之P B S洗濯五次，收集洗 濯液，測量細胞體。洗濯液體在1 ，0 0 〇 r p m下離心 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 0分鐘收集B A L。然後用血球計數器計數1 0微升之 細胞懸浮液，測定B A L液體中之細胞數目。計算分化之 細胞數目係用Diff-Quik染色的細胞沈降（cytospun )製劑 (American Scientific Products，McGaw Park，IL )進行。 計算分化之細胞時各細胞沈降（c y t ◦ s p u η )載玻片至少抹 樣2 0 0個細胞。 統計分析。數據用平均+ S E表示。統計分析時，雙 向或單向變方分析（AN OVA)後可適當的用學生t測 試。或然率少於0 · 0 5視爲統計上顯著的不同。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -74- 1250019 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（72) 結果 高腳枉狀細胞組織的變形對呼吸道上皮構造的效應。 爲了測定瓊脂糖堵塞物是否影響呼吸道上皮構造，將瓊脂 糖堵塞物徐徐滴入無病源老鼠之右支氣管。對照組動物中 ’支氣管的上皮含較少的高腳枉狀細胞。但是，局部的滴 注瓊脂糖堵塞物後，亞西藍（Alcian blue ) / P A S染色 顯示高腳枉狀細胞面積隨時間依存的增加，最早在2 4 h 可偵測到在滴注後7 2 h效應最大。瓊脂糖堵塞物處理 2 4 h後，顯著的增加前高腳枉狀及高腳枉狀細胞數目， 4 8 h時發現更多的成熟的高腳枉狀細胞（表1 )。瓊脂 糖堵塞物處理7 2 h後，高腳枉狀細胞數目增加（P < 0.01);基底及纖毛細胞之數目不變（P > 0 · 0 5 )。滴注7 2 h後，上皮細胞的總數/ m m之基底層稍微 但不顯著的增加（P > 0 · 0 5，表1 );滴注堵塞物 7 2 h後，上皮高度（從細胞膜底部至管腔的上皮表面） 自對照組呼吸道的1 6 ·〇± 1 · 2 u m增加至3 8 · 1 土 9.1um(n = 5，P<〇.〇l)。 對照組動物之呼吸道內腔無亞西藍（Alcian blue ) / P A S染色。但是，瓊脂糖堵塞物相鄰的內腔有正性染色 ，顯示有糖化結合物黏液之分泌。瓊脂糖堵塞物處理之呼 吸道，染色隨時間依存的增加。堵塞物相鄰的呼吸道上皮 亞西藍（Alcian blue )/ P A S正性染色總長度百分比分 別從對照組動物之0 · 1 土 0 · 1 %增加至4 · 7 土 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -75- 1250019 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（73) 1 ·4%、 13 · 3 土 〇·7%、 19 · 1 土 0.7%( 4h、48h、&72h，n=5)。此外，瓊脂糖堵塞 物堵塞的支氣管，剝蝕的上皮分別爲總面積之1 3 . 5 土 2·3%、6·9±2·4%、及 5·1±1·5%( 24、48、及7211，11==5)。 瓊脂糖堵塞物對黏蛋白基因表現之效應◦對照組老鼠 中，支氣管中無M U C 5 A C反股探針可偵測的信號（各 組η = 4 )。支氣管徐徐滴入瓊脂糖堵塞物後， MU C 5AC信號時間依存的由2 4至7 2 h ( η = 4) 漸漸增加。M U C 5 A C基因表現發生在亞西藍（Alcian blue ) / P A S正性染色之細胞。其他細胞（例如：平滑 肌、結締組織）無信號之存在。切片用M U C 5 A C同義 探針檢視顯示無表現。 瓊脂糖堵塞物對呼吸道上皮E G F - R表現之效應。 對照組動物中，用抗E G F - R抗體免疫染色顯示上皮少 有染色。但是，滴注瓊脂糖堵塞物後，瓊脂糖堵塞物相鄰 的上皮亞西藍（Alcian blue ) / P A S正性染色之細胞顯 示EGF - R之正性染色。EGF - R之染色類形與 MUC 5AC及AB/PAS染色相同。前高腳枉狀，高 腳枉狀，及非顆粒狀的分泌的細胞爲E G F - R免疫正性 染色。纖毛細胞顯示無免疫反應性。未經瓊脂糖堵塞物堵 塞的呼吸道，上皮顯示少有E G F - R染色並與對照組動 物呈現相似的染色。 E G F - R酪胺酸磷激酶抑制劑對高腳枉狀細胞組織 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -76- 1250019 Α7 Β7 五、發明說明（74) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 的變形及黏蛋白基因表現效應。本硏究中，滴注瓊脂糖堵 塞物使細胞表現E G F - R產生黏蛋白。E G F — R是酪 胺酸磷激酶受體之一員。因此，當E G F — R配基（ E G F或T G F α )結合至E G F — R時，活化特定的 E G F - R酪胺酸磷激酶。因此，爲了測試瓊脂糖堵塞物 滴注後E G F - R活化引發M U C 5 A C基因表現及黏液 糖化結合物的假設，將E G F - R酪胺酸磷激酶抑制劑（ B I B X 1 5 2 2 )注入老鼠的腹腔內。 B I B X 1 5 2 2顯著地在2 4、4 8及7 2 h抑制瓊脂 糖堵塞物一引發的亞西藍（Ale 1 an blue )/ P A S染色的 上皮面積。在堵塞物滴注後7 2 h亦完全地抑制 MUC5AC基因之表現。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 T N F α中和抗體對腳枉狀細胞組織的變形及E G F - R蛋白質表現之效應。假設T N F α在瓊脂糖堵塞物引 起炎症期間釋放。因此，檢視抗T N F α中和抗體前處理 之老鼠對瓊脂糖堵塞物引發的高腳枉狀細胞組織的變形之 效應··將動物用抗T N F α中和抗體前處理（η二5 )， 瓊脂糖堵塞物不再刺激E G F - R蛋白質表現或產生亞西 藍（Alcian blue ) / P A S之正性染色（高腳枉狀）細胞 〇 瓊脂糖堵塞物可徵募發炎的細胞。瓊脂糖堵塞物可引 起上皮的損害及發炎性的細胞浸潤。T N F α及E G F -R配基可產生各種發炎性的細胞。E G F - R及其配基涉 及E G F - R之串聯反應並導至高腳枉狀細胞組織的變形 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -77- 1250019 A7 B7 五、發明說明（75) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 。評估瓊脂糖堵塞物對白血球及巨噬細胞引發的效應有兩 種方法。第一檢視氣管肺泡洗濯之細胞：對照組老鼠中’ 巨噬細胞是主要的細胞（η = 5 ;圖4，對照組）。滴注 瓊脂糖堵塞物後，巨噬細胞數目增加（Ρ < 0 · 0 5 ) ’ 洗濯液體有顯著數目之嗜中性白血球（Ρ < 0 · 0 1 )。 淋巴球數目不變。 評估組織切片中之浸潤細胞：無瓊脂糖堵塞物之呼吸 道含少量之嗜中性白血球，但呼吸道含堵塞物時顯示上皮 及內腔均有嗜中性白血球之存在。呼吸道內腔之嗜中性白 血球數目分別爲〇· 2 土 0 · 2 、42 · 4±7 . 1 、 4〇· 7±7 · 7 、及2〇· 1±7 · 2/mm之基底層 (對照組、滴注堵塞物後2 4、4 8、及7 2 h，P < 0 · 0 5，η二5 )。此外，呼吸道上皮之嗜中性白血球 數目分別爲 1 · 3 土 0 · 4、1 5 · 6 土 2 · 6、 1 4 · 9 土 1 · 4 、及 1 4 · 8±2 . 6/mm 之基底層 (對照組、滴注堵塞物後2 4、4 8、及7 2 h，P < 〇· 0 1，η = 5 )。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 環磷醯胺對嗜中性白血球之徵募、高腳枉狀細胞組織 的變形、及E G F - R蛋白質表現之效應。於環磷醯胺處 理的老鼠中，去除血液之嗜中性白血球（環磷醯胺處理後 靜脈的血液中嗜中性白血球數爲1 · 8 ± 0 · 5 %，η = 5 )，堵塞物引發的嗜中性白血球徵募在B A L中受到抑 制。呼吸道內腔（2 · 6±0 · 3/mm之基底層）及上 皮（〇 · 8 ± 0 · 2 / m m )之嗜中性白血球數目在2 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -78- 1250019 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（76) h後亦顯著的降低。環磷醯胺亦可抑制瓊脂糖堵塞物-引 發的高腳枉狀細胞組織的變形及E G F - R蛋白質之表現 。將魯密定（leumedin ) 、NPC 15669加至環磷 醯胺，抑制瓊脂糖堵塞物引發的高腳枉狀細胞組織的變形 與單獨之環磷醯胺處理有相似的效應◦此類結果意味著嗜 中性白血球參與堵塞物-引發的高腳枉狀細胞組織的變形 〇 討論 本硏究中，檢視滴注瓊脂糖堵塞物對無病源老鼠呼吸 道高腳枉狀紐胞組織的變形之效應，在對照組條件下少有 高腳枉狀細胞。對照組動物支氣管上皮細胞及支氣管在無 瓊脂糖堵塞物（對照組肺）其亞西藍（Aleman blue ) / P A S染色爲一致的負性。滴入瓊脂糖堵塞物後大大的、 時間依存的增加徐徐滴入堵塞物之相鄰的支氣管上皮的高 腳枉狀細胞面積，2 4 h內即可偵測到而滴注後大約7 2 h效果最大。相鄰堵塞物的呼吸道亦爲亞西藍（Alcian blue )/ P A S之正性染色。瓊脂糖堵塞物滴注後總細胞 數及基底及纖毛細胞數則不變，但高腳枉狀細胞數增加， 非顆粒狀的分泌的細胞數時間依存的降低（表2 )。此類 結果顯示高腳枉狀細胞組織的變形是非顆粒狀的分泌的細 胞轉變成高腳枉狀細胞的結果。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -79- 1250019 發 五 匕 應 效 的 佈 分 朐 細 h 答一| 2 古 表本 ϋ I Λ 4 VI/ 7Jlir 7 山 ( Λ明 一一 說 W 明 Ϊ 細胞形式 例對in册們 對照組 鄕毋、入不、 24h 48h 72h 高腳枉狀 0.0 + 0.0 13.1 + 5.6 25.7 ± 15.0 51.5 士 9.0— 前高腳枉狀 0.0 + 〇.〇 132.8 + 2.91 25.7 ± 15.01 51.5 士 9.0 分泌的 43.5+3.0 24.4+3.3 18.4 ± 3.7 8.9 ± 2.3 有纖毛的 98.5+4.0 83.8 士 7.9 8 1.6 士 5.0 84.0 土 3.9 基底的 18.4 + 5.7 10.6 土 〇·8 11.6 土 1.7 11.0 土 2.3 中間型 1.3 + 0.5 1.4 土 0.8 1 · 1 ± 0.1 0.6 ± 0.4 總數 161 + 7.2 166.1 土 6.1 175.5 ± 6.2 180.9 ± 7.5 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 細胞的分析如方法中所描述；各組之n = 5。用亞西藍（ Alcnan blue )/ P A S染色（染黏液糖化結合物）特徵化 。對照組呼吸道含少量之前高腳枉狀及高腳枉狀細胞。較 之對照組動物，滴注瓊脂糖堵塞物後，隨時間依存的（2 4、4 8、7 2 h )增加前高腳枉狀及高腳枉狀細胞的數 目，並降低非顆粒狀的分泌細胞的數目。 * 數據爲平均土 S E，細胞數/m m基底層。 與對照組比較P < 0 · 〇 5。 § 與對照組比較P < 0 · 0 1 。 II細胞無足量之細胞質特性以分類。 老鼠呼吸道高腳枉狀細胞可表現M U C 5 A C基因。 本硏究中，對照組支氣管並不表現M U C 5 A C基因，但 堵塞物或相鄰的堵塞物堵塞呼吸道後可有亞西藍（Alcian 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -80- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250019 Δ7 Α7 Β7 五、發明說明（78) blue ) / PAS正性之染色，表現MUC 5AC基因，顯 示M U C 5 A C基因涉及瓊脂糖堵塞物引發的黏液產生。 此結果顯示瓊脂糖堵塞物引發老鼠呼吸道選擇的細胞黏蛋 白基因表現及黏液糖化結合物之產生。 檢視瓊脂糖堵塞物引發高腳枉狀細胞組織的變形的機 制。在無病源之老鼠的呼吸道上皮並不表現E G F - R， 但TNF α則可引發EGF - R的表現。上皮在EGF -R存在下，滴注EGF - R配基（EGF或TGFa) 可導致黏蛋白基因及蛋白質表現之增加。EGF — R酪胺 酸磷激酶（B I B X 1 5 2 2 )選擇的抑制劑完全地抑制 此類反應，意味著E G F - R之信號促使高腳枉狀細胞組 織的變形。測定B I B X 1 5 2 2對瓊脂糖堵塞物一引發 的高腳枉狀細胞組織變形的效應：B I B X 1 5 2 2抑制 瓊脂糖堵塞物引發黏液糖化結合物及M U C 5 A C基因表 現的產生。此類結果意味著E G F - R串聯反應參與瓊脂 糖堵塞物引發的高腳枉狀細胞組織的變形。 爲了硏究瓊脂糖堵塞物在E G F - R串聯反應引起高 腳枉狀細胞組織的變形的機制。首先硏究E G F — R蛋白 質在支氣管上皮之表現。對照組呼吸道的E G F — R染色 爲一致的負性，但含瓊脂糖堵塞物之呼吸道則顯示選擇的 、時間依存的E G F - R正性染色。正性染色的細胞包括 非顆粒狀的分泌的、前高腳枉狀、及高腳枉狀細胞。因此 ，瓊脂糖堵塞物可引發E G F - R蛋白質表現。將老鼠用 抗T N F α之中和抗體前處理，並不會發展出瓊脂糖堵塞 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -81 - 1250019 A7 B7 五、發明說明（79) 物引發的高腳枉狀細胞組織的變形，意味著T N F α參與 瓊脂糖堵塞物引發的E .G F - R表現。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 環磷醯胺，選擇地減少白血球產生之藥物，可預防嗜 中性白血球徵募至呼吸道洗濯液體及滴注瓊脂糖堵塞物後 進入呼吸道上皮並可預防瓊脂糖堵塞物引發的高腳枉狀細 胞組織的變形。引入瓊脂糖堵塞物亦可增加巨噬細胞，但 環磷醯胺並不抑制巨噬細胞之徵募。此類結果意味著嗜中 性白血球參與瓊脂糖堵塞物引發的高腳枉狀細胞組織的變 形。事實上，環磷醯胺亦降低瓊脂糖堵塞物處理後E G F 一 R蛋白質表現，顯示嗜中性白血球在發炎性症狀中作用 ，至少一部份，係表現E G F — R。 嗜中性白血球亦能產生EGF-R配基、EGF及 T G F α。此外，上皮細胞爲E G F — R配基之來源，瓊 脂糖堵塞物可剝離相鄰的上皮細胞。因此，上皮爲 TNF α及E GF — R配基可能之重要的來源。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 吾人可合理的假設，瓊脂糖堵塞物能在呼吸時有效的 刺激堵塞物相關的移動，後續的發生上皮磨耗。呼吸道上 皮機械的損傷可引起過度分泌。依據前述的硏究結果可假 設呼吸道上皮機械的外傷可導至過度分泌。馬之〇 r ◦氣 管插管可產生大量的黏液分泌。病人慢性的插管可引起黏 液過度分泌並塞至黏液阻塞◦ E G F - R酪胺酸磷激酶抑 制劑可預防氣管插管後之黏液過度分泌。 即使是輕微氣喘的病人上皮的損害是共同的現象，其 損害隨臨床症狀之惡化而增強。過敏性的反應產生之上皮 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -82- 1250019 A7 B7 五、發明說明（8〇) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 的損害可引發E G F - R活化，導致異常的高腳枉狀細胞 之產生。上述之數據意味著不同之反應可活化E G F - R ，尤其包括高腳枉狀細胞組織的變形。機械的上皮的損害 及氣喘之上皮損傷亦包括相似的（E G F — R )串聯反應 ，造成上皮分泌細胞的異常生長◦此提供急性氣喘時過度 分泌之致死機制。 實施例 4 E G F -受體引起之高腳枉狀細胞再造粒作用 鼻腔內吸入f M L P引發老鼠的鼻腔呼吸上皮的高腳 枉狀細胞再造粒作用。鼻腔內吸入f M L Ρ ( 1 0 — 7 Μ ) 後4 h鼻腔的隔膜上皮顯著的引發去顆粒化。吸入後4 8 h，高腳枉狀細胞發生再造粒作用。對照組中，高腳枉狀 細胞表現M U C 5 A C蛋白質，但未表現E G F — R蛋白 質。EGF — R及MUC5AC黏蛋白基因及蛋白質均未 出現在對照組上皮，但均在吸入後4 8 h顯著的表現。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 E G F - R酪胺酸磷激酶抑制劑（B I B X 1 5 2 2 )前 處理，在f M L P -引發的高腳枉狀細胞去顆粒化後抑制 黏蛋白MU C 5 A C基因及蛋白質表現。此結果顯示 E G F - R表現示活化涉及老鼠鼻腔的上皮高腳枉狀細胞 之再造粒作用。 方法 動物。實驗動物操作步驟由Committee on Animal 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -83- 1250019 A7 B7 五、發明說明（81)

Research of the University of California San Francisco 提 供。使用無特定病源的雄性F 3 4 4老鼠（2 0 0至 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 2 3 0 克體重；Simonsen Lab，Gikoy，CA )。將動物餵養 在無病源之無菌箱控制環境下的淸潔籠中；動物可自由攝 食滅菌之食物與水。 鼻腔組織製備物。吸入後各時間點，老鼠用戊巴氏妥 鈉（6 5毫克/ k g，1 · p ·)麻醉。暴露動物心臟， 從左心室頂端插入鈍端的注射針至上升主動脈，用1 %三 聚乙醛作全身的循環灌流。在右心房剪開開口作爲固定液 之出口。移除眼睛、下顎，皮膚、及肌肉組織，將頭部浸 入大量體積之相同固定液2 4 h。固定後，頭部用 Surgipath ( Decalcifier 11, Surgical Medical Industries, 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Inc.，Richmond，IL )脫鈣4 — 5天後用磷酸鹽緩衝的生理 食鹽水沖洗。橫切切開鼻腔至鼻腔板乳突。將前面的組織 塊包埋在乙二醇丙烯酸甲酯（JB 4 Plus, Polysciences，Inc .,Warrington, PA )，或〇 C T 化合物（S akura Finetek， U.S.A·，Inc.，Torrance, CA )後進行冷凍切片。從乙二醇丙 烯酸甲酯包埋塊的前表面切出5 u m厚的切片，用亞西藍 (Alcian blue ) ( ρ Η 2 · 5 ) / 過碘酸—Schiff ( A B / P A S )染色呈現酸性及中性的糖化結合物，或3， 3 —二胺基對二胺基聯苯（Sigma chemical, St. Louis, M〇）以觀察遷移至上皮之白血球。從冷凍包埋塊的前表面 切出5 um厚的切片，用AB/PAS染色或用EGF -R及MU C 5 A C進行免疫染色。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -84- 1250019 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（82) 計數鼻腔上皮之嗜中性白血球。嗜中性白血球之計數 係將上皮層用3 ，3 > -二胺基對二胺基聯苯染色在放大 倍數X 4 0 0之高視野下計數。鼻腔的橫隔上皮（從基底 膜至細胞頂端）之嗜中性白血球的數目係以測定每基底層 長度單之細胞核的數目加以表示。 定量高腳枉狀細胞之去造粒及再造粒作用。爲了評估 高腳枉狀細胞去顆粒化及再造粒作用，係用半自動的影像 系統依據已發表之方法測量黏膜表面上皮亞西藍（Alcnan blue ) / P A S染色的黏液物質之體積密度。用Axioplan 顯微鏡（Zeiss, Inc.)並聯結至錄影照相機控制單位（ DXC7 5 5 0MD; Sony Corp. of America, Park Ridge，NJ )檢 視染色的載玻片。鼻腔上皮的影像用高視野之相位差鏡頭 之 I M A X X 錄影 System ( PDI，Redmond，WA )在 x 4 ◦ 0倍下記錄。表面上皮的分泌細胞，細胞內的黏蛋 白呈現橢圓形的、紫色顆粒之各種大小。測量亞西藍（ Alcian blue ) / P A S正性染色的面積及上皮的總面積， 數據用亞西藍（Alcian blue ) / P A S面積比上總面積之 百分比表示。用Macintosh 9500/120電腦（

Apple Computer, Inc.，Cupertino, CA )，以公開之 N I Η 影像程式加以分析。 EGF—R及MUC5AC蛋白質之免疫定位。將三 聚乙醛固定的鼻腔的組織之冷凍切片用3 % Η 2〇2 /甲 醇處理以阻擾內生性過氧化物並與1 : 1 0 0稀釋之老鼠 抗 E G F — R ( CalBiochem，San Diego, CA)，或 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -85- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250019 A7 _____B7 _ 五、發明說明（83) MU C 5 A C ( NeoMarkers Inc·，Fremont, CA )單株抗體 反應1 h〇EGF R或MUC5AC的免疫反應性用 Vectastain Elite ABC 組套（Vector Lab·，Inc·, Burlingame， C A )以3，3 -二胺基對二胺基聯苯四氫氯化物作爲發 色劑顯現。對照組包括用P B S取代一次或二次抗體。 方法。無病源老鼠鼻腔的隔膜上皮有許多高腳枉狀細 胞。爲了測定氣溶膠化的f M L P對高腳枉狀細胞去顆粒 化及嗜中性白血球遷移至鼻腔的黏膜上皮之效應，將動物 用鈉戊巴氏妥（65毫克/kg，i · ρ ·)麻醉，並在 鼻腔內的投用內含N—甲醯基一甲硫胺醯基一白胺醯基一 苯基丙胺酸（f M L P ; 1 〇 5 Μ，Sigma，St. Louis， M〇）之無熱原生理食鹽水氣溶膠5分鐘。氣溶膠暴露係用 超音波的噴霧器（PulmoSonic，DeVilbiss Co·, Somerset， PA )產生噴霧之速率爲0 · 3毫升/分鐘之氣溶膠並使動 物吸入。相似的，對照組動物僅在鼻腔內投用生理食鹽水 氣溶膠。 爲了硏究吸入f M L P氣溶膠後鼻腔的高腳枉狀細胞 再造粒作用，將老鼠在鼻腔內傳遞f M L Ρ後4 8 h安樂 死。 爲了評估E G F - R酪胺酸磷激酶活化高腳枉狀細胞 再造粒之效應，將動物在吸入f M L P前3 0分鐘在腹腔 內用E G F — R酪胺酸磷激酶抑制劑（Β I Β X 1 5 2 2 ，1 5 毫克/ k g，由 Boehnnger Ingelheim Inc·，

Ingelheim，Germany提供）進行則處理’每天重覆兩次。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -86- 1250019 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（84) 統計。所有的數據用平均土 s E Μ表示。各實驗的組 別用單向A Ν〇V Α或學生t測試分析。或然率少於 0 · 0 5代表統計上顯著的不同。 結果 f M L P對鼻腔的上皮的構造高腳枉狀細胞去顆粒化 之效應。在對照組條件下，鼻腔的隔膜上皮含顯著的A Β / P A S染色的高腳枉狀細胞區域，但管腔的表面則未染 色。黏蛋白MUC5AC蛋白質免疫染色代表AB/PA S染色區域，但原位雜交顯示少有或無MU C 5 A C基因 表現。無E G F - R蛋白質之免疫組織化學的染色。此結 果藏不對照組老鼠鼻腔的上皮含完整的局腳枉狀細胞內含 MU C 5 A C蛋白質，但無黏蛋白基因之表現。管腔無法 染色顯示黏蛋白去顆粒化（分泌）並不存在。 據假設，未經刺激的老鼠鼻腔的上皮含 '"穩定的〃， 含黏蛋白蛋白質未顆粒化的高腳枉狀細胞。嗜中性白血球 化學引誘劑（例如ί M L P )已顯示能徵募嗜中性白血球 進入呼吸道上皮，經胰肽酶依存的方法引起G C去顆粒化 。爲了檢視G C去顆粒化之效應，使用氣溶膠鼻腔內的運 送嗜中性白血球化學吸引劑，f M L Ρ ( 1 0 7 Μ )，5

分鐘。fMLP處理後4h將老鼠安樂死，AB/PAS -染色的面積及MU C 5 A C -正性免疫染色的面積顯著 地降低，並發生嗜中性白血球徵募入鼻腔的上皮。鼻腔的 呼吸道管腔的表面AB/PAS染色非常明顯，證實GC 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） IK-------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -87- 1250019 A7 B7 五、發明說明（85) 去顆粒化已發生。但是f M L P處理後4 h， MU C 5 A C基因表現並未改變。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) F M L P處理後4 8 h將老鼠安樂死，將前高腳枉狀 及高腳枉狀細胞用E G F - R正性染色抗體進行免疫組織 化學的染色，AB/PAS及MUC 5AC免疫正性染色 回復在對照組條件下之面積，顯示已發生鼻腔G C的再造 粒。此時，嗜中性白血球之徵募不復存在；於G C地區表 現MUC 5AC基因，顯示GC再造粒與黏蛋白基因表現 增加有關。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 高腳枉狀細胞再造粒中E G F - R酪胺酸磷激酶磷酸 化作用扮演之角色。前述老鼠的硏究中顯示E G F -受體 (EGF—R)活化導至黏蛋白基因及蛋白質表現。爲了 測試此一假設，即f M L P處理後E G F - R活化對老鼠 鼻腔的G C再造粒扮演重要之角色，將老鼠用選擇的 E G F - R酪胺酸磷激酶抑制劑，Β I Β X 1 5 2 2前處 理（η = 5 );氣溶膠化之f M L Ρ引起嗜中性白血球徵 募至鼻腔的上皮並發生G C去顆粒化，但4 8 h後A Β/ P A S染色及M U C 5 A C —免疫正性染色面積仍低。此 類結果意味著f M L P去顆粒化後E G F - R活化鼻腔的 G C黏蛋白之合成。 本硏究中，檢視老鼠鼻腔的上皮黏蛋白產生之調節。 對照組上皮含顯著數量之高腳枉狀細胞’ Μ U C 5 A C蛋 白質在在於此類細胞中。但是，M U C 5 A C基因則無表 現。經E G F — R表現及其活化後M U C 5 A C黏蛋白表 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 88 - A7 1250019 B7 五、發明說明（86) 現於其他呼吸道上皮細胞。對照組老鼠鼻腔的上皮細胞中 發現無E G F — R基因或蛋白質表現。管腔無A B/ PA S或MUC 5AC蛋白質的染色，顯示顯著的高腳枉 狀細胞去顆粒化（分泌）並未發生。在 > 穩定的〃高腳枉 狀細胞中E G F — R可能向下調控以預防進一步之黏蛋白 合成。因此，誘導高腳枉狀細胞去顆粒化a接種〃鼻腔的 高腳枉狀細胞，檢視呼吸道上皮的構造後續的改變。 天竺鼠及人類呼吸道中，嗜中性白血球化學引誘劑經 嗜中性白血球胰肽酶中介引起嗜中性白血球與高腳枉狀細 胞之緊密接觸，引起嗜中性白血球依存的高腳枉狀細胞去 顆粒化。爲了引發鼻腔的隔膜中正常的高腳枉狀細胞去顆 粒化，鼻腔內吸入化學引誘劑，f M L P。F M L P在鼻 腔的上皮徵募嗜中性白血球，接著將高腳枉狀細胞去顆粒 化；亞西藍（Alcian blue ) / P A S染色的面積顯著地降 低。 接著檢視f M L P -引發的G C去顆粒化後鼻腔上皮 的後續發展。F M L Ρ處理後4 h，鼻腔的G C發生最大 的去顆粒化，E G F — R及M U C 5 A C仍未表現。但是 ，f M L P處理後4 8 h，E G F — R在目丨j局腳枉狀及局 腳枉狀細胞強烈的表現。M U C 5 A C基因在上皮強烈的 表現，此類現象與高腳枉狀細胞再造粒相關聯（增加A B /PAS及MUC5AC染色）。事實上，fMLP處理 後4 8 h，再造粒發生時，高腳枉狀細胞地區和對照組狀 況相似。此類發現顯示G C去顆粒化導至E G F - R表現 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） — l·---^---------------訂---------線 Φ· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -89- 1250019 Α7 Β7 五、發明說明（87) 及活化，因此誘導黏蛋白YUC 5AC表現。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲了檢視G C再造粒時E G F - R酪胺酸磷激酶活化 所扮演的角色，將動物用選擇的E G F - R酪胺酸磷激酶 抑制劑，B I B X 1 5 2 2進行前處理。用 8 16又1 5 2 2前處理之動物中，丨減1^?仍可引起 G C去顆粒化。但是’ B I B X 1 5 2 2前處理可預防 GC再造粒及其MUC 5AC蛋白質之表現。此類結果意 味者G C去顆松化後E G F - R活化黏蛋白之再長。於無 病源老鼠高腳枉狀細胞中 ''去活化〃（即無題粒化）及 E G F - R均被向下調控。當炎症（例如嗜中性白血球浸 潤刺激）引起G C去顆粒化及黏蛋白分泌，向上調節及 E G F - R活化可再度補充呼吸道上皮黏蛋白。本發現顯 示選擇的E G F - R酪胺酸磷激酶抑制劑可用於預防鼻腔 疾病的度分泌。 當本發明描述其特定的具體實施例時，熟悉此技藝的 專業人士當能對本發明作出各種改變及取代， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 發明之範圍。此外，在特定的情形、材料、物質之組合物 、方法、處理步驟或步驟上亦可作作出許多修飾，而不月兌 離本發明之目的、精髓及範圍。所有此類之修飾均屬於以 下之申請專利範圍之內。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） •90-

Claims (1)

1. A8 B8 C8 D8 1250019 A、申請專利範圍 附件2A : 第88 1 14306號專利申請案 中文申.請專利範圍替換本 民國94年11月17日修正 1 · 一種活體外篩選候選表皮生長因子受體（E GF -R )拮抗劑之方法，其包含： (i)令高腳枉狀細胞分化之活體外肺上皮細胞模式與 選自E G F、 丁 G F α、/3 —動物纖維素、雙性調控素（ amphuegulin )、結合肝素之E G F或神經調控素（ neuregulin)之試劑相接觸； (Π )隨後令該肺上皮細胞與候選拮抗劑相接觸；及 (iii )評估高腳枉狀細胞之分化； 其中降低高腳枉狀細胞之分化係表示該拮抗劑之治療功 效。 2 · —種活體內篩選候選表皮生長因子受體（E GF-R )拮抗劑之方法，其包含： (i )藉由利用T N F — α誘導E G F — R表現以創造 過度分泌之肺部疾病的動物模式； (ϋ )利用配位體刺激所誘導之E G F - R以產生生成 黏蛋白之高腳枉狀細胞； (iii )利用候選拮抗劑進行處理；及 (iv )評估高腳枉狀細胞之分化或黏液之分泌； 其中抑制高腳枉狀細胞之分化或黏液之分泌係表示候選 拮抗劑之治療功效。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS.) A4規格（2】0X29<7公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、tT 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250019 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 3 ·如申請專利範圍第2項之活體內方法，其中該活體 内模式所使用之動物係選自小鼠、大鼠、兔子或天竺鼠。 4 ·如申請專利範圍第2項之活體內方法，其中該活體 內模式係氣喘模式。 5 . —種治療呼吸道黏液過度分泌之醫藥組成物，其包 含： 治療上有效量之表皮生長因子受體（E G F〜R)拮抗 劑’該量係足以減少呼吸道黏液之過度分泌，其中該 E G F - R拮抗劑係對E g F - R具選擇性之酪胺酸激酶抑 制劑；及 適於吸入投遞之調製劑。 6 ·如申g靑專利範圍第5項之醫藥組成物，其中藉由流 體載體和推進劑調製該E G F - R拮抗劑。 7 ·如申請專利範圍第5項之醫藥組成物，其中該 E G F - R拮抗劑係調製於水溶液或乙醇溶液中。 8 ·如申請專利範圍第5項之醫藥組成物，其中該 E G F - R拮抗劑係於乾粉末調製劑中。 9 .如申請專利範圍第6項之醫藥組成物，其中該調製 劑係經霧化以生成氣溶膠。 1 0 ·如申請專利範圍第5或9項之醫藥組成物，其中 該E G F - R拮抗劑係喹唑啉化合物。 1 1 _ 一種用於治療呼吸道黏液過度分泌之藥包，其包 含一個容器’該容器含有適於吸入投遞之調製劑，該調製劑 包含具有醫藥活性之表皮生長因子受體（E G F - R )拮抗 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 豢 經濟部智慧財產局員Η消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ABCD 1250019 夂、申請專利範圍 劑，其中該E G F - R拮抗劑係對e G F - R具選擇性之酷 胺酸激酶抑制劑。 1 2 .如申請專利範圍第1 1項之藥包，其中該藥包係 計量劑量吸入器’且該E G F - R拮抗劑係經推進劑調製。 1 3 ·如申請專利範圍第1 2項之藥包，其中當該調製 劑經霧化後’產生直徑約0 · 5至1 2微米之顆粒。 1 4 ·如申請專利範圍第1 1項之藥包，其中該藥包係 乾粉末吸入器，且係於乾粉末調製劑中調製該E G F - R捨 抗劑。 . 1 5 .如申請專利範圍第1 1項之藥包，其中該藥包係 霧化器，且該E G F - R拮抗劑係於水溶液或乙醇溶液中。 1 6 ·如申請專利範圍第1 1項之藥包，其中該e G F - R拮抗劑係嗤唑啉化合物。 1 7 ·如申請專利範圍第9項之醫藥組成物，其中該 E G F - R拮抗劑係包含於霧化顆粒中，該顆粒之直徑係介 於約0 . 2 5至約1 2微米。 謇！ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） - 3 -