NO327000B1

NO327000B1 - Anvendelse av epidermal vekstfaktorreseptor (EGF-R) antagonister

Info

Publication number: NO327000B1
Application number: NO20010749A
Authority: NO
Inventors: Jay A Nadel; Kiyoshi Takeyama
Original assignee: Univ California
Priority date: 1998-08-18
Filing date: 2001-02-14
Publication date: 2009-03-30
Also published as: ID27345A; AU5676699A; HRP20010119B1; DE69939022D1; EA004316B1; HK1036219A1; JP2009221212A; IL140855A0; NO20010749L; CA2337422C; EP1119349B1; NZ509271A; US20080175797A1; CZ2001584A3; US6566324B2; EA200100136A1; US20030148990A1; KR20010085412A; MY126490A; AU760766B2

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av en epidermal vekstfaktorreseptor (EGF-R) antagonist for fremstilling av et preparat for behandling av en pulmonal sykdom. Nevnte pulmonal sykdom er valgt fra kronisk obstruktiv pulmonal sykdom, kronisk bronkitt, akutt astma, systisk fibrose og bronkiektasi og nevnte EGF-R antagonist er valgt fra en tyrosinkinaseinhibitor selektiv for EGF-R, et monoklonalt antistoff som spesifikt binder epidermal vekstfaktor (EGF), og et monoklonalt antistoff som spesifikt binder EGF-R.

I de ledende luftveier i åndedrettssystemet tjener det mukociliære system som primær forsvarsmekanisme for å bevege inhallerte partikler eller infektive midler ut av luftveiene i lungene. I tillegg tjener substanser til stede i luftveisfluidene til å begrense toksisite-ten av partiklene og å inaktivere infektive midler. Den fysiske mekanisme med hosting tjener til å støte ut mukus fra luftveispassasjene (se f.eks. "Foundations of Respiratory Care", Pierson og Kacmarek, red. (1992) Churchill Livingston Inc., New York, New York; "Harrison's Principles of Internal Medicine", Fauci et al., red. (1997) 14. utgave, McGraw Hill, New York, New York).

Det mukociliære system består av cilierte epitelale celler, epiteliale slimceller og serøse og mukøse celler lokalisert i submukosale kjerteler. Cilia er omgitt av et vannholdig lag (periciliært fluid) som utskilles i lumen av luftveispassasjen ved den aktive transport av klorid og den passive bevegelse av vann gjennom epiteliet. Cilia kommer i kontakt med mukus som flyter på dette vandige lag, og besørger via en ensrettet fremoverbevegelse bevegelse av mukus mot glottis (se Pierson og Kacmarek, supra og Fauci, et al, supra). Mukus produseres av de epiteliale slimceller og submukosale kjertelceller og utskilles i lumen av luftveien etter degranulasjon.

Mens mukus generelt letter bortskaffing av inhallerte partikler eller infektive midler, kan hypersekresjon av mukus i luftveiene bevirke progressiv luftveisobstruksjon. I perifere luftveier er hosting ineffektiv for bortskaffelse av sekresjoner. Videre er små luftveier inneholdende mange slimceller på grunn av deres små dimensjoner særlig utsatt for luftveisnlugging av mukus. Luftveishypersekresjon påvirker et stort antall individer; den sees i en rekke forskjellige pulmonale sykdommer, som kronisk bronkitt, akutt astma, systisk fibrose, og bronkiektasi.

Hypersekresjon av mukus er det vesentlige symptom i pasienter med kronisk obstruktiv pulmonal sykdom (COFobstruktivPD) og definerer tilstanden (dvs. kronisk hoste og spyttproduksjon). Denne tilstand alene påvirker 14 millioner amerikanere og kan bevirke progressiv invaliditet og død. Det er anslått at astma påvirker idet minste 4% av U.S.A. populasjonen og svarer for minst 2 000 dødsfall årlig (Pierson og Kucmarek, supra). Under et akutt astmaanfall, sveller bronkieveggene, mukusvolumet øker og den bronkiale glatte muskulatur trekker seg sammen og resulterer i luftveisinnsnevring. Som et resultat av hypersekresjon i akutt astma, kan utstragt mukusplugging være en vesentlig årsak til morbiditet og mortalitet.

Hypersekresjon har også vært implisert i cystisk fibrose, som er en av de mest vanlige fatale genetiske sykdommer i verden. Cystisk fibrose er en autosomal resessiv sykdom som bevirker at luftveis-mukosalcellen blir ikke-responsiv til cyklisk-AMP-avhengig proteinkinaseaktivering av membrankloridionekanalene (Pierson og Kacmarek, supra og Fauci, et al., supra). Den etterfølgende elektrolyttubalanse reduserer hydratiseringsni-vået i luftveismukus, og resulterer således i høyviskøst mukus i lungene i et individ som er angrepet med cystisk fibrose. Hypersekresjon tetter til luftpassasjene i individer med cystisk fibrose og nedsetter således ytterligere lungefunksjonen.

En ytterligere sykdom som innebærer hypersekresjon inkluderer kronisk obstruktiv lun-gelidelse (COPD). Oksidantstress spiller en viktig rolle ved patogenesen av COPD. Si-garettrøk, som genererer fri oksygenradikaler er sterkt implisert i patogenesen. Neutrofiler sees ofte ved setet for inflammasjon i COPD og det interessante er at fri oksygenradikaler er kjent å bli frigitt av neutrofiler under aktivering.

Mekanisk intubasjon er ofte nødvendig for å tilveiebringe assiserte ventilasjon til pasienter med forskjellige pulmonale sykdommer. Et rør innføres via orofaranx og anbring-es i trakea. For å hindre luftlekkasje omkring det endotrakeale rør pumpes en ballong opp omkring røret i det nedre trakea, noe som kan abradere epitelet og bevirke slimcellemetaplasi. Sårdannelse på epitelet fører til reparasjonsprosesser som kan resultere i rikelig mukussekresjon. Slik langvarig trakeaintubasjon i pasienter kan føre til skadelige virkninger på grunn av hypersekresjon.

Som et resultat av de høye nivåer av mukus i lungene på pasienter med hypersekretoriske pulmonale sykdommer reduseres mukosal bortskaffing. Patologiske midler som bakterier, f.eks. Pseudomonas aeruginosa, etablerer ofte kolonier i mukus, og resulterer ofte i lungeinfeksjon.

Klassiske behandlingsmåter for behandling av individer angrepet med luftveishypersekresjon inkluderer antibiotikaterapi, bronkodilatorere (f.eks. metylxantiner, sympato-mimetika med sterke p*2 adrenerge stimulerende egenskaper, anticholinergika), bruk av systemiske eller inhallerte kortikosteroider, primært ved astma, flytendegj ørende av mukus ved oral tilførsel av ekspektoranter, f.eks. guaifenesin, og aerosoltilførsel av "mukolyttiske" midler, f.eks. vann, hypertonisk saltløsning (se Harrison's supra). En nyere terapi for cystisk fibrose er tilførsel av DNAse målrettet til DNA-rikt mukus eller spytt (Shak, et al., 1990) Proe. Nati. Acad. (USA) 87:9188-9192; Hubbard, R.C., et al, ;(1991) N. Engl. J. Med. 326:812). I tillegg anvendes også brystkassefysisk terapi bestående av perkusjon, vibrasjon og drenering også for å lette bortskaffelse av viskøst mukus. Lungetransplantasjon kan være en endelig mulighet for individer med alvorlig pulmonal svikt. Mer effektiv eller alternativ terapi målrettet til de mukosale sekresjoner trenges derfor. Det er spesifikt et behov for en spesifikk modalitet som vil redusere dan-nelsen av mukussekresjoner i luftveiene. ;Relevant litteratur ;Bruken av EGF-inhibitorer for å blokkere veksten av cancerceller er oppsummert av Levitski (1994) Eur. J. Biochem. 226(1):1-13; Powis (1994) Pharmac. Ther. 62:57-95; Kondapaka og Reddy (1996) Mol. Cell. Endocrin. 117:53-58. ;Hypersekresjon av mukus i luftveiene er et ugunstig symptom på et antall forskjellige pulmonale sykdommer. Sekresjonen resulterer fra degranulasjonen av slimceller, idet deres formering fremmes ved stimulasjon av epidermale vekstfaktorreseptorer (EGF-R). ;W09719065 vedrører EGF-R antagonister som er selektive protein kinase inhibitorer av kinasene p56,ck, p59f<y>n, ZAP-70 og protein kinase C. ;WO9003374 omtaler inhibitorer av leukotrien biosyntese samt oksygenase inhibitorer. ;US5760041 beskriver EGF-R inhibitorer for anvendelse ved behandling av tumorer. ;Kumar et al. (1998) Cell Biol. Toxicol. 14:293-299 omtaler invitro effekter av AG1478, spesielt blokkering av mitogen aktivitet av et mitogen på celler i kultur. ;Den foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av en epidermal vekstfaktorreseptor (EGF-R) antagonist for fremstilling av et preparat for behandling av en pulmonal sykdom valgt fra kronisk obstruktiv pulmonal sykdom, kronisk bronkitt, akutt astma, systisk fibrose og bronkiektasi, hvori nevnte EGF-R antagonist er valgt fra en tyrosinkinaseinhibitor selektiv for EGF-R, et monoklonalt antistoff som spesifikt binder epidermal vekstfaktor (EGF), og et monoklonalt antistoff som spesifikt binder EGF-R. ;En fordel ved oppfinnelsen er at anvendelsen hindrer for sterk dannelse av mukus i pulmonale luftveier. Figur IA er en western blotting av EGF-R i NCI-H292- og i A431-celler. Figur IB er en immunocytokjemisk analyse med anti-EGF-R-antistoff i kulturer av NCI-H292-celler. ;Figur 1C er en Northern analyse av EGF-R i NCI-H292-celler. ;Figur 2 viser Alcianblått/PAS-farging av NCI-H292-celler for identifikasjon av slimstoffglykoproteiner. ;Figur 3 viser Northern analyse for MUC5-genekspresjon i NCI-H292-celler. ;Figur 4A og 4B viser immunohistokjemisk analyse av EGF-R med et anti-EGF-R-antistoff i patogenfrie rotter. Figur 4A viser TNF-a-behandlede rotter og figur 4B viser ovalbuminsensitiverte rotter. Figur 5 er en grafisk fremstilling av virkningen av EGF-R-tyrosinkinaseinhibitor (B1BX1522) på produksjon av slimceller (uttrykt som % av farget areal av luftveiepitel opptatt av Alcianblått/PAS-positive fargede celler). ;Antagonistene som anvendes i foreliggende oppfinnelse kan være i form av små molekyler, antistoffer, eller deler av antistoffer som binder til enten EGF eller dens reseptor. I luftveis-hypersekretoriske sykdommer, f.eks. kronisk bronkitt, bronkiektase, cystisk fibrose, akutt astma, COPD, etc, økes slimstoffsyntesen i luftveiene og mukus hypersekresjon opptrer. Det utskilte mukus resulterer i luftveisobstruksjon, en virkning som bevirker døden i disse sykdommer. ;Flere årsaker til luftveisskade og inflammasjon er vist heri som induserer ekspresjonen av den epidermale vekstfaktorreseptor i luftveis-epitelceller. Etter induksjon av EGF-R resulterer etterfølgende stimulering av EGF-R både ved ligandavhengige og liganduavhengige mekanismer i slimstoffproduksjon både ved genekspresjons- og proteinnivåer. Selektive inhibitorer av EGF-R tyrosinkinase påvises å blokkere denne slimstoffgen- og proteinekspresj on. ;Uten å begrense oppfinnelsen, tyder dette på at en evolusjonsmessig sekvens for slimcelleproduksjon kan være basert på ekspresjon av EGF-R. Stimulering med TNFa induserer intens EGF-R-farging (karakterisering) av ikke-granulerte sekretoriske celler; deres etterfølgende aktivering med EGF-R-ligander bevirker progressiv farging for mukø-se glykokonjugater i cytoplasmaet, og cellene blir "førslim"-celler og deretter "slim"-celler. Data antyder at EGF-R-aktivasjon fremmer selektiv celledifferensiering men ikke formering. Slimceller er åpenbart avledet fra ikke-granulerte sekretoriske celler som uttrykker EGF-R og stimuleres av EGF-R-ligander til å produsere slimstoffer (mukiner). ;I tillegg til stimulering ved cytokiner, kan EGF-R stimuleres ved hjelp av andre signallerende mediatorer. For eksempel er langvarig sigarettrøking assosiert med progressive patologiske endringer i de perifere luftveier, inklusive slimcellehyperplasi. Proinflammatoriske cytokinaktiverte neutrofiler og sigarettrøk er vist å bevirke slimstoffsyntese i humane bronkie-epitelceller via liganduavhengig aktivering av EGF-R, noe som impliserer rekrutterte neutrofiler og sigarettrør som regulatorer for epitelcelledifferensiering som resulterer i unormal induksjon av slimstoffproduserende celler i luftveier. Neutrofiler aktivert ved hjelp av en rekke forskjellige stimuli, inklusive IL-8, N-formyl-metionyl-leucyl-fenylalanin, TNF-oc, sigarettrøk eller H2O2 oppregulerer slimstoffekspresjon i epitelceller idet denne syntese inhiberes av EGF-R-inhibitorer. Neutrofiler er også i stand til produsere EGF-R-ligandene, TGF og TGF-a. I tillegg er epitelceller kilder for EGF-R-ligander. ;Mekanisk skade på luftveisepitel kan også bevirke hypersekresjon og være grunnen til mukøs tilstopping. Inhibitorer av EGF-R-tyrosinkinase tjener til å hindre mukøs hypersekresjon etter trakeaintubasjon. ;Epitelskade er et vanlig funn i undersøkelser av pasienter selv med mild astma, og ska-den er økende relatert til forverring av kliniske symptomer. Epitelskade frembragt ved den allergiske respons induserer EGF-R-aktivasjon som resulterer i unormal slimcelleproduksjon. EGF-R er implisert i epitelskade, f.eks. den "luftveis-remodellering" som opptrer i astma, reparasjon og sårlukking. Mekanisk epitelskade og epitelskade i astma kan involvere en lignende EGF-R-kaskade som resulterer i unormal vekst av epiteliale sekretoriske celler. ;Hypersekresjon er også en viktig manifestasjon på inflammatoriske sykdommer i nesen. Når nasale slimceller blir "eksponert" ved å indusere slimcelledegranulasjon ved bruk av en neutrofilavhengig mekanisme, blir ekspresjon av EGF-R og slimstoffer sterkt oppregulert. Disse fenomener ble assosiert med regranulasjon av slimcellene. Når inflammasjon, som f.eks. stimulasjon av neutrofil infiltrasjon, bevirker slimcelledegranulasjon og slimstoffsekresjon til oppregulering og aktivering av EGF-R re-supplere luftveisepitelet med slimstoffer. ;Før de foreliggende anvendelser beskrives, skal det forstås at denne oppfinnelse ikke er begrenset til spesielle anvendelser som er beskrevet i det disse selvfølgelig kan varieres. Det skal også forstås at terminologien anvendt heri er bare for det formål å beskrive spesielle utførelsesformer og skal ikke forstås som begrensende, ettersom rammen for den foreliggende oppfinnelse vil bli begrenset alene ved de etterfølgende patentkrav. ;Med mindre annet er angitt, har alle tekniske og vitenskapelige uttrykk anvendt heri den samme mening som vanlig forstått av den vanlige fagkyndige på det området hvorunder denne oppfinnelse henhører. ;Publikasjonene drøftet heri er bare anført for deres lære før inngivelsesdatoen for den foreliggende oppfinnelse. Ingen ting heri skal oppfattes som noen erkjennelse av at den foreliggende oppfinnelse ikke er berettiget til å forutgå slik publikasjon ut fra tidligere oppfinnelse. Videre, kan de anførte publikasjonsdatoer være forskjellig fra de aktuelle publikasjonsdatoer som kan trenges å bli bekreftet hver for seg. ;Med "epidermal vekstfaktor" eller "EGF" menes et protein eller del derav med biolo-gisk aktivitet karakterisert ved mitogenisk aktivitet på epitelceller (f.eks. Cohen (1986) Biosciences Reports 6(12): 1017; Aaronson, S.A., "Growth Factors and Cancer", Science (1991), 254:1146-1153). Et eksempel er den humane epidermale vekstfaktor, f.eks. som beskrevet av Urdea et al. (1983) Proe. Nat. Acad. Sei. 80:7461-7465. ;Av særlig interesse for den foreliggende oppfinnelses formål er den mitogeniske aktivitet av EGF på slimceller. Også proteiner eller deler derav som er den funksjonelle ekvivalent av EGF basert på den biologiske respons utløst av EGF er ment å være omfattet av denne definisjon. ;Med "epidermal vekstfaktorreseptor" eller "EGF-R" menes et protein eller del derav i stand til å binde EGF-protein eller en del derav. Et eksempel er den humane epidermale vekstfaktorrestor (se Ullrich et al., (1984) Nature 309:418-425; Genbank Accession Number NM_005228). Foretrukket aktiverer bindingen av EGF-liganden EGF-R (f.eks. resulterende i aktivasjon av intracellulær mitogenisk signallering, autofosforylasjon av EGF-R). En fagkyndig på området vil innse at andre ligander, i tillegg til EGF, kan binde til EGF-R og aktivere EGF-R. Eksempler på slike ligander inkluderer, men er ikke begrenset til TGF-a, betacellulin, amfiregulin, heparinbindende EGF (HB-EGF) og neuregulin (også kjent som hergulin) (Strawn og Shawver (1998) Exp.- Opin. Invest. Drugs. 7(4)553-573, og "The Protein Kinase Facts Book: Protein Tyrosine Kinases" ;(1995) Hardie et al., (red.), Academic Press, NY, NY). ;Med "EGF-R-antagonist" mens et hvilket som helst middel i stand til direkte eller indirekte å inhibere virkningen av EGF-R, særlig virkningen av EGF-R på slimcelleformering eller hypersekresjon av mukus av slimceller. EGF-R kan aktiveres ved ligandavhengige og liganduavhengige mekanismer, som resulterer i enten autofosforylasjon hhv. trans-fosforylasjon. EGF-R-antagonister av interesse kan inhibere enten den ene eller begge av disse mekanismer. For eksempel resulterer bindingen av TNF-a til EGF-R i en ligandavhengig fosforylasjon, som kan blokkeres av et antistoff som binder EGF-R, slik at interaksjonen av EGF med en ligand som ville aktivere EGF-reseptoren hindres. Eksempler på slike antistoffer er beskrevet av Goldstein et al., (1995) Clin. Cancer Res.. 1:1311-1318; Lorimer et al., (1995) Clin. Cancer Res. 1:859-864; Schmidt og Wels ;(1996) Br. J. Cancer 74:853-862. Tyrosinkinaseinhibitorer i form av små molekyler er også effektive som EGF-R-antagonister. ;Det vises alternativt at forbindelser som f.eks. fri oksygenradikaler stimulerer en trans-fosforylasjon av EGF-R som resulterer i liganduavhengig aktivasjon av reseptoren. Andre midler for aktivering av EGF-R ved transfosforylasjon inkluderer ultrafiolett og osmotisk påvirkning, stimulasjon av G-proteinkoblet reseptor ved endotelin-1, lysofos-fatidinsyre og trombin, ml muskarinisk acetylcholinreseptor, og humant veksthormon. Antagonister av denne liganduavhengige mekanisme inkluderer anti-oksidanter, som peroksiddisumatase, DMSO, DMTU, askorbinsyre og lignende. ;En EGF-R-antagonist kan være et antistoff som binder til en faktor som stimulerer EGF-produksjon eller EGF-R-produksjon og derved inhiberer fremming av slimcelleformering ved EGF (dvs. en inhibitor av fosforylasjonskaskaden som fosforylerer EGF-R). For eksempel, er et fusjonsprotein av TGFa-Pseudomonas eksotoksin 40 beskrevet av Areaga et al. (1995) Cancer Res. 54:4703-4709. ;I en foretrukket utførelsesform er EGF-R-antagonisten en inhibitor av tyrosinkinaseak-tiviteten av EGF-R, særlig inhibitorer med lite molekyl med selektiv innvirkning på EGF-R sammenlignet med andre tyrosinkinaser - foretrukket blokkerer små molekyler den naturlige EGF-reseptor i mammalia, foretrukket et menneske og har en molekylvekt på under 1 kD. ;Inhibitorer av EGF og EGF-R inkluderer, men er ikke begrenset til, tyrosinkinaseinhibitorer som kinazoliner, som PD 153035,4-(3-kloranilino)kinazolin, eller CP-358,774, pyridopyrimidiner, pyrimidopyrimidiner, pyrroliopyrimidiner, som CGP 59326, CGP 60261 og CGP 62706, og pyrazolopyrimidiner (Shawn og Shawver, supra), 4-(fenylamino)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidiner (Traxler et al., (1996), J. Med. Chem. 39:2285-2292), kurkumin (diferuloylmetan) (Laxmin arayana, et al., (1995), Carcinogen 16:1741-1745), 4,5-bis(4-fluoranilino)ftalimid (Buchdunger et al. (1995) Clin. Cancer Res. 1:813-821; Dinney et al. (1997) Clin. Cancer Res. 3:161-168); tyrfostiner inneholdende nitrotiofendeler (Brunton et al. (1996) Anti Cancer Drug Design 11:265-295); proteinkinaseinhibitorZD-1839 (AstraZeneca); CP-358774 (Pfizer, Inc.); PD-0183805 (Warner-Lambert); eller som beskrevet i internasjonal patentansøkning WO99/09016 (American Cyanamid); WO98/43960 (American Cyanamid); W097/38983 (Warner-Lambert); WO99/06378 (Warner-Lambert); WO99/06396 (Warner-Lambert); WO96/30347 (Pfizer, Inc.); W096/33978 (Zeneca);. W096/33977 (Zeneca); og WO96/33980 (Zeneca); eller antisensmolekyler. ;Med "inhibering" menes minsking, nøytralisering, svekking eller forhindring av forme-ringen av slimceller, degranulasjon av slimceller eller hypersekresjon av mukus av slimceller. ;Med betegnelsene "behandling", "behandle" og lignende anvendes heri for generelt å angi oppnåelse av en ønsket farmakologisk og/eller fysiologisk virkning. Virkningen kan være profylaktisk i betydningen av fullstendig eller delvis å forebygge en sykdom eller symptom derpå og/eller kan være terapeutisk i betydningen av en delvis eller fullstendig helbredelse av en sykdom og/eller skadelig virkning som skyldes sykdommen. "Behandling" som anvendt heri dekker en hvilken som helst behandling av en sykdom i mammalia, særlig et menneske, og inkluderer: (a) å forebygge sykdommen eller symptomet fra å opptre i et individ som kan være fordisponert for sykdommen eller symptomet men ennå ikke er blitt diagnostisert til å sykdommen eller symptomet; (b) inhibering av sykdommen eller symptomet, dvs. å stanse dens utvikling; eller (c) lindre sykdommen eller symptomet, dvs. å bevege regresjon av sykdommen eller symptomet. ;Mer spesifikt er "behandling" ment å angi tilveiebringelse av en terapeutisk påvisbar og gunstig virkning på en pasient som lider av en pulmonal sykdom som innebærer hypersekresjon av mukus. ;Enda mer spesifikt skal "behandling" angi forebygging, lindring og/eller inhibering av hypersekresjon av mukus med en forbindelse valgt fra gruppen bestående av EGF-R-antagonister valgt fra en tyrosinkinaseinhibitor selektiv for EGF-R, et monoklonalt antistoff som spesifikt binder epidermal vekstfaktor (EGF), og et monoklonalt antistoff som spesifikt binder EGF-R. En alternativ anvendelse kan omfatte forebygging av EGF-R-ekspresjon i luftveiene, slik at prosessen blokkeres i et tidligere trinn. For eksempel, kan reagenser som blokkerer binding av TNFcc til sin reseptor forebygge oppregulering av ;EGF-R. ;Behandling inkluderer forebygging eller inhibering av infeksjoner av patologiske midler bevirker av og/eller relatert til hypersekresjon av mukus. ;Med "antistoff menes et immunoglobulinprotein som er i stand til å binde et antigen. Antistoff som anvendt heri er ment å inkludere antistofrfagmenter, f.eks. F(ab')2, Fab', Fab, i stand til binding av antigenet eller antigenisk fragment av interesse. Foretrukket inhiberer bindingen av antistoffet til antigenet aktiviteten av EGF eller EGF-R. ;Betegnelsen "humanisert antistoff som anvendt heri for å beskrive fullstendige anti-stoffmolekyler, dvs. sammensatt av to fullstendige lette kjeder og to fullstendige tunge kjeder, så vel som antistoffer bestående bare av antistofrfagmenter, f.eks. Fab, Fab', F(ab')2 og Fv, hvori CDR er avledet fra en ikke-human kilde og den resterende del av Ig-molekylet eller fragment derav er avledet fra et humant antistoff, foretrukket fremstilt fra en nukleinsyresekvens som koder for et humant antistoff. ;Betegnelsene "humant antistoff og "humaniserf antistoff anvendes heri for å beskrive et antistoff hvori alle deler av antistoffmolekylet er avledet fra en nukleinsyresekvens som koder for et humant antistoff. Slike humane antistoffer er mest ønskelige for bruk ved antistoftferapier, etter som slike antistoffer ville utløse liten eller ingen immun-respons i den humane pasient. ;Betegnelsen "chimerisk antistoff anvendes heri for å beskrive et antistoffmolekyl så vel som antistofrfagmenter, som beskrevet i det foregående ved definisjonen av betegnelsen "humanisert antistoff. Betegnelsen "chimert antistoff omfatter humaniserte antistoffer. Chimeriske antistoff har minst en del av en tungkjede eller lettkjede amino-syresekvens avledet fra en første mammaliaspesies og en annen del av tungkjede eller lettkjede aminosyresekvensen avledet fra en annen, forskjellig mammaliaspesies. Foretrukket er den variable region avledet fra en ikke-human mammaliaspesies og den konstante region er avledet fra en human spesies. Spesifikt er det chimeriske antistoff foretrukket fremstilt fra en nukleotidsekvens fra et ikke-menneskelig mammalia som koder for en variabel region og en nukleotidsekvens fra en human mammalia som koder for en konstant region i et antistoff. ;Med uttrykket "binder spesifikt" menes høy begjærlighets- og/eller høy affinitetsbin-ding av et antistoff til et spesifikt polypeptid. Antistoffbinding til sin epitop på et spesifikt polypeptid er sterkere enn binding av det samme antistoff til en hvilken som helst annen epitop, særlig dem som kan være tilstede i molekyler i assosiasjon med eller i den samme prøve, som det spesifikke polypeptid av interesse. Antistoffer som binder spesifikt til et polypeptid av interesse kan være i stand til å binde andre polypeptider i et svakt, men likevel påvisbart miljø, f.eks. 10% eller mindre av bindingen vist til polypeptidet av interesse. Slik svak binding, eller bakgrunnsbinding, kan lett sjeldnes fra den spesifikke antistoffbinding til forbindelsen eller polypeptidet av interesse, f.eks. ved bruk av passende kontroller. ;Med "påvisbart merket antistoff', "påvisbart merket anti-EGF" eller "påvisbart merket anti-EGF-rfagment" menes et antistoff (eller antistoffragment som bibeholder bindings-spesifisitet) med en tilknyttet påvisbar merking. Den påvisbare merking er normalt tilknyttet ved kjemisk konjugasjon, men hvor merkingen er et polypeptid, bør den alternativt være tilknyttet ved hjelp av genteknologiske metoder. Metoder for fremstilling av påvisbart merkede proteiner er vel kjent på området. Påvisbare merkinger kan selekteres fra en rekke forskjellige slike merkinger kjent på området, men er vanlig radioisotoper, fluoroforer, enzymer, f.eks. pepperrotperoksidase, eller andre enheter eller forbindelser som enten emiterer et påvisbart signal (f.eks. radioaktivitet, fluorescens, farge), eller emiterer et påvisbart signal etter eksponering av merkingen overfor sitt substrat. Forskjellige påvisbare merking/substratpar (f.eks. pepperrotperoksidase/diaminobenzidin, avidin/streptavidin, luciferase/luciferin), metoder for merking av antistoffer, og metoder for bruk av merkede antistoffer for å påvise et antigen er vel kjent på området (f.eks. se Harlow og Lane, red., ( Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). ;TERAPEUTISKE ANVEDNELSER ;Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer anvendelse av en epidermal vekstfaktorreseptor (EGF-R) antagonist for fremstilling av et preparat for behandling av en pulmonal sykdom valgt fra kronisk obstruktiv pulmonal sykdom, kronisk bronkitt, akutt astma, systisk fibrose og bronkiektasi, hvori nevnte EGF-R antagonist er valgt fra en tyrosinkinaseinhibitor selektiv for EGF-R, et monoklonalt antistoff som spesifikt binder epidermal vekstfaktor (EGF), og et monoklonalt antistoff som spesifikt binder EGF-R. ;Antagonister som er direkte målrettet mot EGF eller EGF-R er foretrukket. En fagkyndig på området vil imidlertid innse at en hvilken som helst faktor eller celle involvert i den biologiske kaskade som resulterer i EGF-R-fremming av slimcelleformering kan være målet for inhibisjon, f.eks. TGF-a-antagonister. Uten å være bundet til noen teori, begynner en kaskade under en inflammatorisk respons når celler som f.eks. mastceller eller neutrofiler frigir TNF-a, som så fremmer EGF-R-ekspresjon. Stimulasjon av EGF-R, f.eks. ved sin ligand EGF, utløser i sin tur slimcelleformering. Hvilke som helst celler eller faktorer involvert i kaskaden, som f.eks. i TNF-a-trinnprosessen, kan således være målrettet for antagonistaktivitet. ;EGF-R-antagonisten som anvendes kan være i en hvilken som helst form. Som eksempel kan EGF-R-antagonisten være i form av et lite molekyl (dvs. antisenseoligonukleo-tid, tyrosinkinaseinhibitor, etc), antistoffer eller deler av antistoffer som binder til EGF, TGFa eller EGF-R. ;LITE MOLEKYL EGF-R-ANTAGONISTER ;Tyrosinkinaseinhibitorer som virker på EGF-reseptoren, og som er selektive for EGF-R, er kjent på området, og kan anvendes i de angjeldende metoder. Eksempler er beskrevet i det foregående, og av slike kan inkluderes BIBX1522 (Boehringer Ingelheim, Incø, Ingelheim, Tyskland); CGP59326B (Novartis Corporation, Basel, Sveits); 4-aminokinazolin EGF-R-inhibitorer (beskrevet i U.S. patent nr. 5,760,041); substituerte styrenforbindelser som kan oså være et naftalen, en indan eller et benzoksazin; inklusive nitril- og molonitrilforbindelser (beskrevet i U.S. patent nr. 5,217,999); inhibitorene beskrevet i U.S. patent nr. 5,773,476; potet-karboksypeptidaseinhibitor (PCI); en 39-aminosyres proteaseinhibitor med tre disulfidbroer, (Blanco-Aparicio et al. (1998) J. Biol. Chem. 273(20):12370-12377); bombesinantagonist RC-3095 (Szepeshazi et al. ;(1997) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94:1013-10918) etc. Andre tyrosinkinaseinhibitorer som kinazoliner, som f.eks. PD 153035,4-(3-kloranilino)kinazolin, eller CP-358,774, pyridopyrimidiner, pyrimidopyrimidiner, pyrrolopyirmidiner, som f.eks. CGP 59326, CGP 60261 og CGP 62706, og pyrazolopyrimidiner (Shawn og Sawver, supra), 4-(fenylamino)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidiner (Traxler et al., (1996) J. Med. Chem. 39:2285-2292), kurcumin (Korutla et al., (1994) Biochim. Biophys. Acta 1224:597-600); (Laxmin Arayana (1995); Carcinogen 16:1741-1745), etc. ;Foretrukne tyrosinkinaseinhibitorer er selektive for EGF-reseptor, dvs. at EGF-R inhiberes i en større grad enn andre celleoverflatereseptorer med tyrosinkinaseaktivitet. Se-lektivitet forsterkes ved hjelp av metodene med sammensetning og medikamenttilførsel, f.eks. hvor inhibitoren tilføres preferert til inflammerte luftveier, etc. ;Typiske doseringer for systemisk tilførsel er i området fra 0,1 ug til 100 mg pr. kg vekt individ pr. tilførsel. De fagkyndige på området vil lett innse at dosenivåer kan variere som en funksjon av den spesifikke forbindelse, alvorligheten av symptomene og indivi-dets mottagelighet for bivirkninger. Noen av de spesifikke forbindelser er mer potente enn andre. Foretrukne doseringer for en gitt forbindelse kan lett bestemmes av de fagkyndige på området ved hjelp av en rekke forskjellige metoder. En foretrukket metode er å måle den fysiologiske potens av en gitt forbindelse, f.eks. ved hjelp av di in vitro og in vivo tester som er beskrevet heri. ;ANTISTOFFER SOM EGF-R-ANTAGONISTER ;Antistoffer som EGF-R-antagonister er av særlig interesse (f.eks. Viloria et al., American Journal ofPathology 151:1523). Antistoffer til EGF eller EGF-R produseres ved immunisering av en xenogenisk immunokompetent mammaliavert, inklusive murine, rodentia, lagomorfa, ovine, porcine, bovine, etc. med EGF eller EGF-R eller deler derav. Foretrukket anvendes human EGF eller EGF-R eller deler derav som immunogenet. Valget av en spesiell vert er i første rekke et spørsmål om hensiktsmessighet. Immuni-sasjoner utføres i samsvar med konvensjonelle metoder, hvor immunogenet kan injiseres subkutant, intramuskulært, intraperitonealt, intravaskulært, etc. i vertsindividet. Normalt, anvends fra omtrent 1,0 mg/kg til omtrent 10 mg/kg EGF eller EGF-R intraperitonealt hver annen dag som et immunogen. Injeksjonene kan være med eller uten adjuvansmiddel, f.eks. komplett eller ufullstendig Freund's adjuvansmiddel, spekol, alum, etc. Etter fullføring av immunisasjonsprosessen, kan antiserumet høstes i samsvar med konvensjonelle metoder til å tilveiebringe polyklonale antisera spesifikke for EGF eller ;EGF-R. ;Enten monoklonale eller polyklonale antistoffer, foretrukket monoklonale antistoffer, fremstilles fra de immuniserte dyr. Polyklonale antisera kan høstes fra serum ved hjelp av konvensjonelle metoder fra dyrene etter fullføring av immunisasjonsprosessen. For produksjon av monoklonale antistoffer høstes lymfocytter fra passende lymfoid vev, f.eks. milt, ved tapping av lymfeknuter, etc. og fusjoneres med en passende fusjonse-ringspartner, vanlig en myelomlinje og frembringer en hybridom som utskiller et spesifikt monoklonalt antistoff. Screening av kloner av hybridomer for den antigeniske spesifisitet av interesse utføres i samsvar med konvensjonelle metoder. ;Av særlig interesse er antistoffer, foretrukket monoklonale antistoffer, som binder til EGF-R eller EGF slik at binding av EGF til EGF-R inhiberes, f.eks. et antistoff som spesifikt binder til det ekstracellulære domenet av EGF-R slik at binding til EGF hindres. Slike antistoffer kan fremstilles ved konvensjonell metodikk beskrevet i det foregående, eller kan fås i handelen. Eksempler på antistoffer som ville funksjonere som en EGF-antagonist inkluderer, men er ikke begrenset til, det nøytraliserende anti-EGF-R-monoklonale antistoff C225 (Kawamoto et al. (1983) Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA) 80:1337-1341; Petit et al. (1997) J. Path. 151:1523-153, fremstilt av ImClone Systems New York, NY) og anti-EGF-R-monoklonale antistoffEMD55900 (også benevnt Mab 425) (Merck, Darmstadt, Tyskland). ;Angjeldende antistoffer kan fremstilles som en enkelt kjede, i stedet for den vanlige multimere struktur. Enkle kjedeantistoffer er beskrevet i Jost et al. (1994) J. B. C. 269:26267-73, og andre. DNA-sekvenser som koder for den variable region i den tunge kjede og den variable region i den lette kjede ligeres til en spacer som koder for idet minste omtrent 4 aminosyrer i form av små nøytrale aminosyrer, inklusiv glycin og/eller serin. Proteinet som kodes for ved denne fusjon tillater sammensetning av en funksjo-nell variabel region som bibeholder spesifisiteten og affiniteten av det opprinnelige antistoff. ;Metoder for humanisering av antistoffer er kjent på området. Det humaniserte antistoff kan være produktet av et dyr med transgene humane immunoglobulinkonstante regiongener (se f.eks. Internasjonale patentansøkninger WO 90/10077 og WO 90/04036). Alternativt, kan antistoffet av interesse konstrueres ved hjelp av rekombinante DNA-metoder for å erstatte CH1, CH2, CH3, hengseldomener og/eller rammeverkrestene med den tilsvarende humane sekvens (se WO 92/02190). ;Anvendelse av lg cDNA for konstruksjon av chimeriske immunoglobulingener er også kjent på området (Liu et al. (1987) P. N. A. S. 84:3439 og (1997) J. Immunol. 139:3521). rriRNA isoleres fra en hybridom eller annen celle som produserer antistoffer og anvendes for fremstilling av cDNA. cDNA av interesse kan forsterkes ved hjelp av polymerasekjedereaksjon ved bruk av spesifikke primere (U.S. patent nr. 4,683,195 og 4,683,202). Alternativt, kan det fremstilles og screenes et genbibliotek for å isolere sekvensen av interesse. DNA-sekvensen som koder for den variable region i antistoffet blir så fusjonert til humane konstante regionseksvenser. Sekvensene i humane konstante regiongener kan finnes i Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins ofImmunological Interests, N.I.H. publikasjon nr. 91-3242. Human C regiongener kan lett fås fra kjente kloner. Det chimeriske, humaniserte antistoff blir så uttrykt ved hjelp av konvensjonelle metoder. ;Antistoffragmenter, som Fv, F(ab')2, og Fab kan fremstilles ved spaltning av det intakte protein, f.eks. ved hjelp av protease eller kjemisk kutting. Alternativt, konstrueres et avkortet gen. For eksempel, ville et chimerisk gen som koder for en del av F(ab')2-fragmentet inkludere DNA-sekvenser som koder for CH1-domenet og hengselregionen av H-kjeden, etterfulgt av et translasjonalt stoppkodon til å gi det avkortede molekyl. ;Et individ med en hypersekretorisk mukussykdom kan initielt tilføres mengder av EGF-R-antagonister i området omtrent 200 milligram (mg) til omtrent 400 mg pr. kg vekt av pasienten to ganger daglig, f.eks. ved inhallasjon. ;ANTISENSEMOLEKYLER SOM EGF-R-ANTAGONISTER ;Ved en ytterligere utførelsesform er angjeldende terapeutiske midler antisensemolekyler spesifikke for humane sekvenser som koder for EGF eller EGF-R. Det tilførte terapeutiske middel kan være antisenseoligonukleotider, særlig syntetiske oligonukleotider med kjemiske modifikasjoner fra native nukleinsyrer, eller nukleinsyrekonstruksjoner som uttrykker slike antisensemolekyler som RNA. Antisensesekvensen er komplementær til mRNA i de målsøkte EGF eller EGF-R-gener og inhiberer ekspresjon av de målsøkte genprodukter (se f.eks. Nyce et al., (1997) Nature 385:720). Antisensemolekyler inhiberer genekspresjon ved å redusere mengden av mRNA som er tilgjengelig for translasjon, ved hjelp av aktivering av RN Ase H eller sterisk hindring. Et eller en kombinasjon av antisensemolekyler kan tilføres hvor en kombinasjon kan omfatte flere forskjellige sekvenser fra et enkelt målsøkt gen, eller sekvenser som komplementerer flere forskjellige gener. ;Et foretrukket målgen er EGF-R eller EGF. Gensekvensen er tilgjengelig gjennom offentlige databaser (human epidermal vekstfaktor, Genbank aksessjonsnr. KOI 166; human mRNA for forløper for epidermal vekstfaktorrestor, Genbank aksessjonsnr. X00588). Generelt vil antisensesekvensen ha den samme spesiesopprinnelse som dyre-verten. ;Antisensemolekyler kan fremstilles ved ekspresjon i hele eller en del av målgensekven-sen i en passende vektor, hvor vektoren innføres og uttrykkes i den målsøkte celle. Den transkripsjonene initiasjon vil være orientert slik at antisensetråden produseres som et RNA-molekyl. Antisense RNA-hybridene med den endogene sensetråd mRNA, og blokkerer derved ekspresjon av målgenet. Den native transkripsjonene initieringsregion, eller en eksogen transkripsjonen initieringsregion kan anvendes. Promoteren kan innfø-res ved hjelp av rekombinante metoder in vitro eller som resultatet av homolog integra-sjon av sekvensen inn i et kromosom. Mange sterke promotere som er aktive i muskel-celler er kjent på området, inklusive (3-aktinpromoteren, SV40 tidlige og sene promotere, human cytomegaloviruspromoter, retroviral LTR, etc. ;Transkripsjonsvektorer har generelt passende restriksjonsseter lokalisert nær promoter-sekvensen til å muliggjøre innsetting av nukleinsyresekvenser. Transkripsjonskassetter kan fremstilles omfattende en transkripsjons-initiasjonsregion, målgenet eller fragment derav, og en transkripsjonal terminasjonsregion. Transkripsjonskassettene kan innføres i en rekke forskjellige vektorer, f.eks. plasmid; retrovirus, f.eks. lentivirus; adenovirus; og lignende, hvor vektorene er i stand til forbigående eller varig å opprettholdes i cellene, vanlig i en periode på minst omtrent 1 dag, mer vanlig en periode på minst flere dager. ;Alternativt, i en foretrukket utførelsesform, er antisensemolekylet et syntetiske oligo-nukleotid. Antisenseoligonukleotider vil generelt ha fra omtrent 7 til 500, vanlig fra omtrent 12 til 50 nukleotider, mer vanlig fra omtrent 20 til 35 nukleotider, hvor lengden styres av effektiviteten for inhibisjon, spesifisitet, inklusiv fravær av kryssreaktivitet, og lignende. Det er funnet at korte oligonukleotider, med lengde 7 til 8 baser, kan være sterke og selektive inhibitorer for genekspresjon (se Wagner et al. (1996) Nature Bio-technology 14:840-844). ;En spesifikk region eller regioner av den endogene sensetråd mRNA-sekvens velges til å komplementeres av antisensesekvensen. Det er blitt vist at 5'-regionen av mRNA er særlig mottakelig for antisenseinhibisjon. Nylige tegn indikerer imidlertid at analyse av mRNA sekundær struktur kan være viktig ved tilgjengeligheten av seter for inhibisjon. Seleksjon av en spesifikk sekvens for oligonukleotidet kan anvende en empirisk metode, hvor flere kandidatsekvenser bedømmes for inhibering av ekspresjon av målgenet ved en in vitro eller dyremodell. En kombinasjon av sekvenser kan også anvendes, hvor flere regioner av mRNA-sekvensen selekteres for antisensekomplementasjon. ;Antisenseoligonukleotider kan syntetiseres kjemisk ved hjelp av metoder kjent på området (se Wagner et al. (1993) supra og Milligan et al., supra). Foretrukne oligonukleotider modifiseres kjemisk fra den native fosfodiesterstruktur, for å øke deres intracellulære stabilitet og bindingsaffinitet. Et antall slike modifikasjoner er beskrevet i litteratu-ren, som endrer kjemien av hovedkjeden, sukkerne eller de heterocykliske baser. ;Oligonukleotider kan ytterligere omfatte en målenhet som fremmer opptak av molekylet av cellene. Målenheten er spesifikke bindingsmolekyler, f.eks. et antistoff eller fragment derav som gjenkjenner molekyler tilstede på overflaten av lungeepitelceller, særlig epitelceller inneholdende EGF-R. ;Bispesifikke antistoffer, chimeriske antistoffer og enkeltkjedeantistoffer er kjent på området. Egnede fremstilte ikke-humane antistoffer kan humaniseres på forskjellige måter. Sammenknytning mellom oligonukleotidet og målenheten kan anvende en hvilken som helst konvensjonell metode, f.eks. ved hjelp av disulfid-, amid- eller tioeterbindinger, avhengig av kjemien av oligonukleotidhovedkjeden. Foretrukket vil bindingen spaltes inne i cellen for å frigi oligonukleotidet. ;Oligonukleotider kan konjugeres til hydrofobe rester, f.eks. kolesterol, for beskyttelse mot nukleaser og for å forbedre transport gjennom cellemembraner. Alternativt, kan også konjugasjon til poly-L-lysin eller andre polyaminer forbedre tilførsel til cellen. En ytterligere modifikasjon som kan foretas, er addisjonen av en interkalerende komponent, som akridin, i stand til interkalering i mål-mRNA og stabilisering av den resulterende hybrid. Antisenseoligonukleotider kan transfekteres i kombinasjon med et eller flere enzymer som vil nedbryte antisense-mRNA-komplekser i cellen, f.eks. RNase-H. Et hvilket som helst protein eller enzym som preferert kan nedbryte eller sekvestrere antisense-mRNA-duplekset kan anvendes på lignende måte. ;Som et alternativ til antisenseinhibitorer kan katalytiske nukleinsyreforbindelser, f.eks. ribozymer, antisensekonjugater, etc. anvendes for å inhibere genekspresjon. Ribozymer kan syntetiseres in vitro og tilføres pasienten, eller kan kodes på en ekspresjonsvektor, hvorfra ribozymet syntetiseres i målcellen (f.eks. se Internasjonal patentsøknad WO 9523225, og Beigelman et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:4434-42). Eksempler på oligonukleotider med katalytisk aktivitet er beskrevet i WO 9506764. Konjugater av antisenseoligonukleotider med et metallkompleks, f.eks. terpyridylCu(II), i stand til å virke til mRNA-hydrolyse er beskrevet i Bashkin et al, (1995) Appl. Biochem. Biotechnol. 54:43-56. ;FARMASØYTISKE PREPARATER ;EGF-R-antagonister kan tilveiebringes i oppløsning eller i en hvilken som helst annen farmakologisk egnet form for tilførsel, som f.eks. en liposomsuspensjon. De passende antistoffer eller annen form av anti-EGF sammensettes for tilførsel på en måte som er vanlig for tilførsel av slike materialer. Typiske preparater er dem som er angitt i Re-mington ' s Pharmaceutical Sciences, seneste utgave, Mack Publishing Company, Eas-ton, PA. Tilførselsmåten velges basert på den forbindelse som tilføres, pasientens tilstand og den sykdom som behandles. Hvor det er hypersekresjon av mukus, kan en forbindelse tilføres på forskjellige måter avhengig av alvorligheten av sykdommen, f.eks. nødsituasjoner kan kreve i.v. tilførsel, akutte men ikke livstruende situasjoner kan behandles oralt, mens kronisk behandling kan foretas ved hjelp av aerosol. ;For terapeutisk bruk ved nasale og luftveissykdommer foretrekkes lokal tilførsel. Tilfør-sel ved inhallasjon eller innblåsing av aerosoler gir høye nivåkonsentrasjoner av medikament sammenlignet med konsentrasjonen som absorberes systemisk. Alternativt, kan EGF-antagonisten tilføres ved injeksjon, inklusive intramuskulær, intravenøs (IV), sub-kutan eller peritoneal injeksjon, mest foretrukket IV og lokale injeksjoner. Andre tilfør-selsmåter kan imidlertid også anvendes forutsatt at midler er tilgjengelige til å tillate at EGF-R antagonisten kommer inn i den systemiske sirkulasjon, som f.eks. transmukosale eller transdermale preparater, som kan tilføres som stikkpiller, hudplastere eller intranasalt. Et hvilken som helst sammensetning som bevirker overføringen av EGF-R-antagonisten til blodstrømmen eller lokalt til lungene kan med fordel anvendes. ;For injeksjon, omfatter egnede sammensetninger generelt vandige oppløsninger eller suspensjoner ved bruk av fysiologisk saltløsning, Hank's oppløsning, eller andre buffere som eventuelt inkluderer stabiliseringsmidler eller andre mindre komponenter. Liposo-male preparater og andre former av mikroemulsjoner kan også anvendes. EGF-R-antagonisten kan også tilføres i frysetørket form og rekonstitueres for tilførsel. Transmukosale og transdermale tilførseler inkluderer generelt midler som letter passasjen gjennom den mukosale eller dermale barriere, som gallesyrer, salter, fusidinsyre og dens analoger, forskjellige detergenter og lignende. Oral tilførsel er også mulig, forutsatt at egnede enteriske belegg sammensettes slik at EGF-R-antagonisten kan overleve fordøy-elseskanalen. ;Arten av preparatet vil i noen utstrekning avhenge av arten av den valgte EGF-R-antagonist. En egnet sammensetning fremstilles ved bruk av kjente metoder og prinsip-per for sammensetning som er vel kjent for de fagkyndige på området. Prosentandelen av EGF-R-antagonister inneholdt i et spesielt farmasøytisk preparat vil også avhenge av arten av sammensetningen; prosentandelen av en EGF-R-antagonist som er et antistoff vil typisk variere over et stort område fra omtrent 1 vekt-% til omtrent 85 vekt-%. ;Det er mange tilførselsmetoder kjent på området for å forbedre opptaket av nukleinsyrer i celler. Brukbare tilførselssystemer inkluderer Sandai virus-liposomtilførselssystemer (Rapaport og Shai (1994) J. Biol. Chem. 269:15124-15131), kationsiek liposomer, po-lymere tilførselsceller eller matrikser, porøse balongkatetere (som omhandlet av Shi et al. (1994) Circulation 90:955-951; og Shi et al. (1994) Gene Therapy 1:408-414), retro-virusekspresjonsvektorer og lignende. ;Anvendelse av liposomer som en tilførselsbærer er en metode av interesse for bruk med EGF-R-antagonister. Liposomene fusjonerer med cellene i målsetet og avgir innholdet i lumen intracellulært. Liposomene opprettholdes i kontakt med cellene i tilstrekkelig tid for fusjon, ved bruk av forskjellige midler for å opprettholde kontakt, som isolasjon, bindingsmidler og lignende. Liposomer kan fremstilles med rensede proteiner eller peptider som bevirker fusjon av membraner, som Sendai-virus eller influensavirus, etc. Li-pidene kan være en hvilken som helst brukbar kombinasjon av kjente liposomdannende lipider, inklusive kationiske lipider, som fosfatidylcholin. Det tilbakeblivende lipid vil normalt være nøytrale lipider, som kolesterol, fosfatidylserin, fosfatidylglyserol og lignende. For fremstilling av liposomene, kan det anvendes prosedyren beskrevet av Kato et al. (1991)/. Biol. Chem. 266:3361. ;EGF-R-antagonisten kan innkapsles i sterisk stabiliserte "smug"-liposomer ("stealth"-liposomer), f.eks. pegylerte liposomer. Når slike liposomer injiseres i.v. forblir de i kretsløpet i lange perioder. Postkapillære venulære åpningsforbindelsessteder åpner seg under luftveisinflammasjon og tillater fluidakkumulasjon å lar molekyler, f.eks. komp-lement, kininogen, gå inn i vevene, og initierer inflammatoriske kaskader. Slik inflammasjon tillater at liposomer og deres innhold kan avsettes selektivt i det inflammerte vev (Zhang et al., (1998) Pharm. Res. 15:455-460). ;EGF-R-antagonister kan tilføres den angrepne pasient ved hjelp av et farmasøytisk til-førselssystem for inhallasjonstilførselsmåten. Forbindelsene kan sammensettes i en form egnet for tilførsel ved inhallasjon. Det farmasøytiske tilførselssystem er et system som er egnet for åndedrettsterapi ved topisk tilførsel av EGF-R-antagonister derav til muku-sale overflater i bronkiene. Et system som avhenger av energien i en komprimert gass for å drive ut EGF-R-antagonistene fra en beholder kan anvendes. En aerosol eller trykkbeholder kan anvendes for dette formål. ;Som anvendt heri anvendes betegnelsen "aerosol" i sin vanlige mening som henvisende til meget fine flytende eller faste partikler som bæres av en drivgass under trykk til et sete for terapeutisk anvendelse. Når en farmasøytisk aerosol anvendes ved denne oppfinnelse, inneholder aerosolen den terapeutisk aktive forbindelse, som kan være oppløst, oppslemmet eller emulgert i en blanding av en fluid bærer og et drivmiddel. Aerosolen kan være i form av en oppløsning, suspensjon, emulsjon, pulver, eller halvfast preparat. Aerosoler anvendt ved den foreliggende oppfinnelse er ment for tilførsel av fine, faste partikler eller som væsketåker via åndedrettskanalen i en pasient. Forskjellige typer av drivmidler kjent for den fagkyndige på området kan anvendes. Eksempler på egnede drivmidler inkluderer, men er ikke begrenset til, hydrokarboner eller annen passende gass. I tilfellet av en trykksatt aerosol kan doseringsenheten bestemmes ved å tilveiebringe en verdi for avgivelse av en målt mengde. ;Foreliggende oppfinnelse kan også utøves med en nebulisator (forstøver) som er et in-strument som genererer meget fine flytende partikler med hovedsakelig ensartet størrel-se i en gass. Foretrukket dispergeres en væske inneholdende EGF-R-antagonistene som dråper. De små dråper kan bæres av en luftstrøm gjennom et utløpsrør i nebulisatoren. Den resulterende tåke penetrerer inn i pasientens åndedrettskanal. ;En pulverblanding inneholdende EGF-R-antagonister eller analoger derav, med eller uten et smøremiddel, bærer, eller drivmiddel, kan tilføres mammalia som behøver terapi. Denne utførelsesform av oppfinnelsen kan utøves med en konvensjonell anordning for tilførsel av en pulverformet farmasøytisk blanding ved inhallasjon. For eksempel kan en pulverblanding av en forbindelse og en egnet pulverbase som laktose eller stivel-se tilveiebringes i enhetsdoseform i f.eks. kapsler eller patroner, f.eks. gelatin sådanne, eller blærepakninger, hvorfra pulveret kan tilføres ved hjelp av en inhallator. Kombinsjonsterapier kan anvendes for å behandle hypersekretorisk pulmonal sykdom. Spesielt kan EGF-R-antagonister kombineres med konvensjonell behandling for lindring av hypersekresjon, som bronkodilatorer, kortikosteroider, ekspektorantmidler, mu-kolytiske midler og lignende, for å lette mukociliær bortskaffelse. ;Avhengig av pasientens tilstand kan det være å foretrekke å tilføre en sammensetning ifølge den foreliggende oppfinnelse ved injeksjon (f.eks. intravenøs) eller ved inhallasjon. Pasienter som har store mengder mukus i lungene kan generelt ikke behandles initialt ved inhallasjon. Dette skyldes det faktum at pasientens lunger er tilstrekkelig tilstoppet slik at inhallering av en sammensetning bragt i aerosolform i lungene ikke behøver å være særlig effektiv. Etter behandling ved injeksjon eller alternativt, ved lang tids behandling eller ved situasjoner hvor pasientens lunger ikke er alvorlig tilstoppet, kan imidlertid tilførsel ved inhallasjon foretrekkes. Tilførsel ved inhallasjon foretrekkes på grunn av at mindre doser kan tilføres lokalt til de spesifikke celler som mest behøver behandling. Ved tilførsel av mindre doser kan eventuelle skadelige bivirkninger elimi-neres eller vesentlig reduseres. Ved tilførsel direkte til de celler som har mest behov behandling, vil virkningen av behandlingen oppnås hurtigere. ;Det er flere forskjellige typer av inhallasjonsmetodikker som kan anvendes i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse. Antagonister som anvendes ifølge den foreliggende oppfinnelse kan sammensettes i prinsipielt tre forskjellige typer av sammensetninger for inhallasjon. For det første kan antagonister som anvendes ifølge oppfinnelsen sammensettes med lavtkokende drivmidler. Slike sammensetninger tilføres generelt ved konvensjonelle inhallatorer med bestemt tilmålte doser (MDI). Konvensjonelle MDI kan imidlertid modifiseres slik at evnen til å oppnå gjentagbar dosering ved å anvende teknologi som måler det inspiratoriske volum og tilførselstakten for pasienten økes, som drøftet i U.S. patent nr. 5,404,871 og 5,542,410. ;Alternativt kan agonistene som anvendes ifølge den foreliggende oppfinnelse sammensettes i vandige eller etanoliske oppløsninger og tilføres ved hjelp av konvensjonelle ;nebulisatorer. Mer foretrukket blir imidlertid slike oppløsningssammensetninger bragt i aerosolform ved bruk av anordninger og systemer som f.eks. omhandlet i U.S. patent nr. 5,497,763; 5,544,646; 5,718,222 og 5,660,166. og U.S. patent nr. 5,740,794 utstedt 21. april 1998. ;Til sist, kan agonistforbindelser som anvendes ifølge den foreliggende oppfinnelse sammensettes til tørre pulversammensetninger. Slike sammensetninger kan tilføres ved enkel inhallasjon av den tørre pulversammensetning etter å ha skapt en aerosoltåke av pulveret. Teknologi for gjennomføring av dette er beskrevet i U.S. patentnr. 5,775,320 utstedt 7. juli 1998 og U.S. patent nr. 5,740,794 utstedt 21. april 1998. ;SCREENINGSANALYSER ;Kandidatmedikamenter ;Screeningsforsøk kan anvendes for å identifisere bioaktive kandidatmidler som er EGF-antagonister. Av særlig interesse er screeningsforsøk for midler som har en lav toksisitet for humane celler. En rekke forskjellige forsøk kan anvendes for dette formål, inklusive merkede in vtfro-protein-proteinbindende forsøk, elektroforetiske mobilitetsshiftforsøk, immunoforsøk for proteinbinding og lignende. Det rensede EGF eller EGF-R-protein kan også anvendes for bestemmelse av tredimensjonal krystallstruktur, som kan anvendes for modellering av intermolekylære interaksjoner, transporterfunksjon, etc. ;Betegnelsen "agent" som anvendt heri beskriver et hvilket som helst molekyl, f.eks. protein eller farmasøytikum, med evne til å endre eller inhibere den fysiologiske funksjon av EGF eller EGF-R. Generelt anvendes et flertall forsøksblandinger i parallell med forskjellige middelkonsentrasjoner for å oppnå en differensial respons til de forskjellige konsentrasjoner. Typisk tjener en av disse konsentrasjoner som en negativ kontroll, dvs. ved null konsentrasjon eller under påvisningsnivået. ;Kandidatmidler omfatter tallrike kjemiske klasser, selv om de typisk er organiske molekyler, foretrukket små organiske forbindelser med en molekylvekt på mer enn 50 og mindre enn omtrent 2 500 dalton. Kandidatmidler omfatter funksjonelle grupper nød-vendig for strukturell interaksjon med proteiner, særlig hydrogenbinding, og inkluderer typisk en amin-, karbonyl-, hydroksyl- eller karboksylgruppe, foretrukket minst to av de funksjonelle kjemiske grupper. Kandidatmidlene omfatter ofte cykliske hydrokarbon-eller heterocykliske strukturer og/eller aromatiske eller polyaromatiske strukturer substi-tuert med en eller flere av de ovennevnte funksjonelle grupper. Kandidatmidler finnes også blant biomolekyler inklusive peptider, sakkarider, fettsyrer, steroider, puriner, py-rimidiner, derivater, strukturelle analoger eller kombinasjoner derav. ;Kandidatmidler oppnås fra en rekke forskjellige kilder inklusive samlinger av syntetiske eller naturlige forbindelser. For eksempel er tallrike midler tilgjengelige for tilfeldig og styrt syntese av en rekke forskjellige organiske forbindelser og biomolekyler, inklusive ekspresjon av randomiserte (tilfeldig grupperte) oligonukleotider og oligopeptider. Alternativt, er samlinger av naturlige forbindelser i form av bakterier-, sopp-, plante- og dyreekstrakter tilgjengelige eller kan lett produseres. Ytterligere kan naturlige eller syntetisk fremstilte samlinger og forbindelser lett modifiseres ved hjelp av konvensjonelle kjemiske, fysiske og biokjemiske midler, og kan anvendes for å fremstille kombinato-riske samlinger. Kjente farmakologiske midler kan underkastes styrte eller tilfeldige kjemiske modifikasjoner, som f.eks. acylering, alkylering, forestring, amidifisering, etc., for å frembringe strukturanaloger. ;Hvor screeningsforsøket er et bindingsforsøk, kan et eller flere av molekylene forenes til en merking, hvor merkingen direkte eller indirekte kan gi et påvisbart signal. Forskjellige merkinger inkluderer radioisotoper, fluorescerende midler, kjemiluminisceren-de midler, enzymer, spesifikke bindingsmolekyler, partikler, f.eks. magnetiske partikler og lignende. Spesifikke bindingsmolekyler inkluderer par, som biotin og streptavidin, digoksin og antidigoksin, etc. For de spesifikke bindingselementer vil det komplemen-tære element normalt være merket med et molekyl som tilveiebringer påvisning, i samsvar med kjente prosedyrer. ;En rekke forskjellige andre reagenser kan inkluderes ved screeningforsøket. Disse inkluderer reagenser som salter, nøytrale proteiner, f.eks. albumin, detetergenter, etc. som anvendes for å lette optimal protein-proteinbinding og/eller redusere ikke-spesifikt eller bakgrunnsinteraksjoner. Reagenser som forbedrer effektiviteten av forsøket, som proteaseinhibitorer, nukleaseinhibitorer, antimikrobielle midler, etc. kan anvendes. Blan-dingen av komponenter tlsettes i en hvilken som helst rekkefølge som tilveiebringer den nødvendige binding. Inkubasjoner gjennomføres ved en hvilken som helst egnet temperatur, typisk mellom 4 og 40°C. Inkubasjonsperioder velges for optimal aktivitet, men kan også optimaliseres for å lette hurtig gjennomført screening. Typisk vil mellom 0,1 og 1 time være tilstrekkelig. ;Forbindelsene med den ønskede farmakologiske aktivitet kan tilføres i en fysiologisk tålbar bærer til en vert for behandling av hypersekretorisk sykdom i sammensetninger beskrevet heri. Avhengig av innføringsmåten kan forbindelsene sammensettes på en rekke forskjellige måter beskrevet heri. Konsentrasjonen av terapeutisk aktiv forbindelse i sammensetningen kan variere fra omtrent 0,1 til 100 vekt-%. ;Doserings- behandlingsregime ;Det passende dosenivå vil også variere avhengig av et antall faktorer inklusive karakte-ren av det individ som skal behandles, særlig arten av den hypersekretoriske tilstand som skal behandles og dens alvorlighet, arten av EFG-R-antagonistene anvendt som aktiv bestanddel, tilførselsmåten, sammensetningen og den behandlende leges bedøm-melse. For eksempel når antistoffer tilføres i seg selv som anti-EGF eller EGF-R i en injiserbar sammensetning vil doseringene være i området 20 mg/kg til omtrent 40 mg/kg i en enkel dosering. Gjentatt tilførsel i løpet av en periode av dager kan være nødvendig eller tilførsel ved hjelp av intravenøse midler kan være kontinuerlig. For kroniske betingelser kan tilførselen fortsettes i lengre periode etter behov. ;Effektiviteten av dose-behandlingsregimet vil bestemmes ved vurdering for forbedret lungefunksjon i pasienten. Denne bedømmelse kan inkludere viskoelastisitetsmålinger av spytt, forbedringer i pulmonal funksjon, inklusive forbedringer i tvungent eksplora-tiske volum av spytt og maksimal midt-ekspiratorisk strømningstakt. Det ovennevnte terapeutiske behandlingsregime kan gis i forbindelse med sammenfallende terapier som antibiotika, DNAse I eller andre vanlige terapier for behandling av hypersekretorisk pulmonal sykdom. Hvis antibiotika ko-tilføres som del av pasientens terapi, kan bakte-riell kvantitering etter terapien inkluderes for å vurdere effektiviteten av behandlingen ved nedsatt bakterievekst, som indikerer nedsatt viskositet av mukus eller spytt og økning av bortskaffelsen av mukus eller spytt fra lungen. ;Pulmonale funksjonstester, så vel som diagnostiske tester for det kliniske forløp av pulmonal hypersekretorisk sykdom, er kjent for de fagkyndige på området. Standard pulmonale funksjonstester inkluderer luftveismotstand (AR); tvungen vital kapasitet (FVC); tvungen ekspiratorisk volum i 1 sekund (FEV(l)); tvungen midtekspiratorisk strøm; og toppekspiratorisk strømningstakt (PEFR). Andre pulmonale funksjonstester inkluderer blodgassanalyse; responser for medisinering; eksponerings- og mosjonstes-ting; målinger av respiratorisk muskelstyrke; fibro-optisk luftveisundersøkelse; og lignende. Noen grunnleggende prosedyrer for å undersøke egenskapene av mukus inkluderer reologi, f.eks. med bruk av et magnetisk mikroreometer; klebeevne for å karakterisere tiltrekningskreftene mellom en klebende overflate og et klebemiddelsystem ved å måle kontaktvinkelen mellom en mukusdråpe og en overflate. Mukustransport ved hjelp av cilia kan undersøkes ved bruk av konvensjonelle metoder, så vel som direkte måling, dvs. in situ mukusbortskaffelse. Transepitelialpotensialforskjell, det netto resultat av aktiviteten av ionetransportsystemet i det pulmonale epitel, kan måles ved bruk av passende mikroelektroder. Kvantitative morfologimetoder kan anvendes for å karakterisere epiteloverflatetilstanden. ;Pasienten som behandles kan være en primat, som f.eks. et menneske, eller et hvilket som helst dyr som fremviser de beskrevne symptomer. Selv om anvendelsene ifølge oppfinnelsen er særlig tilpasset for fremstilling av et medikament for behandling av en human pasient er det forstått at oppfinnelsen også er anvendbar ved veterinær praksis. ;In vitro screeningsforsøk ;In vitro forsøk kan videre anvendes for å vurdere det terapeutiske potensialet av kandidatmidler for inhibering av slimcelleformering, dvs. om slike midler er aktive som en ;EGF-antagonist. Generelt, vil slike forsøk omfatte de følgende trinn: (i) en in vitro modell av slimcelleformering bringes i kontakt med EGF eller den funksjonelle ekvivalent derav; (ii) deretter bringes den in vitro modell i kontakt med et kandidatmiddel; og (iii) slimcelleformering bedømmes, hvori en inhibering av slimcelleformering indikerer kandidatmidlets terapeutiske potensiale. ;Forsøket gjennomføres foretrukket med to kontroller, hvor en andre cellegruppe ikke bringes i kontakt med noen forbindelse og en tredje cellegruppe bringes i kontakt med EGF, men ikke med kandidatmidlet. Sammenligninger gjøres så for å bestemme effek-tivitetsgraden av EGF og kandidatmidlet på cellene. ;En hvilken som helst in vitro modell av slimcelleformering kan anvendes. Som eksempel kan rotte-trakeaceller isoleres og opprettholdes i kultur som beskrevet i Guzman et al., (1995) 217:412-419. Kort sagt, blir rotte-trakeaceller platet ut på kollagengelbelagte semipermeable membraner, initielt dyrket neddykket i media, og deretter opprettholdt med en luft/væskegrenseflate. Eksempler på in vitro celler inkluderer primære humane bronkieceller (som kan fås fra Clonetics, San Diego); NCI-H292-celler (ATCC CRL-1848); og A431-celler (ATCC CRL-1555). ;Den nevnte in vitro kultur bringes i kontakt med EGF og med et kandidatmiddel. Kandidatmidlet kan bringes i kontakt med kulturen før eller samtidig med eller etter tilset-ningen av EGF avhengig av det sluttpunkt som skal bedømmes og arten av kandidatmidlet. De dyrkede celler bedømmes for inhibisjon av slimcelleformering i forhold til kontroller. ;En rekke forskjellige molekylære eller biokjemiske markører kan anvendes for å be-dømme slimcelleformering. Eksempler på molekylære biokjemiske markører som kan anvendes inkluderer, men er ikke begrenset til genekspresjon eller proteinekspresjon karakteristisk for slimceller. Visse slimstoffgener, f.eks. MUC5B (Desseyn et al, (1997) J. Biol. Chem. 272:3168-3178) uttrykkes i luftveiene, og har et genprodukt som er høyt representert i mukus. Ekspresjon av slimstoffgener tilveiebringer en egnet markør for å bestemme produksjon av mukus. ;Slimstoffgenekspresjon kan bedømmes ved hjelp av konvensjonell teknologi som f.eks. Northern blottinganalyse, polymerasekjedereaksjon (PCR), undersøkelse av slimstoff-genpromoteren, eller in situ analyse. Alternativt bedømmes slimstoffproteiner ved hjelp av konvensjonell metodikk, som f.eks. Western blottinganalyse, ELISA, immunokjemi og lignende, ved bruk av påvisbart merkede antistoffer. Morfologiske kriterier kan også anvendes for å bestemme nærvær eller fravær av slimceller i kulturen; som f.eks. farging for slimstoffer ved bruk av Alcian blått/PAS-farging (Lou et al. (1998) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157:1927-1934). Antistoffer til slimstoffer kan undersøkes ved bruk av ELISA-analyser. På grunn av at stimulering av EGF-R ved hjelp av en ligand, f.eks. EGF, TGF-a, vil indusere fosforylering av en spesifikk EGF-reseptorkinase og resultere i slimcelleproduksjon, kan EGF-R-fosforylasjon måles som en avspeiling av slimcelleinduksjon (Donato et al. (1984) J. Biol. Chem. 264:20474-20481). ;En minsking i molekylære eller biokjemiske markører assosiert med slimcelleformering indikerer det terapeutiske potensialet for antagonisten. ;In vivo modeller ;In vivo dyremodeller kan anvendes for å bedømme det terapeutiske potensialet for kandidatmidler til å inhibere slimcelleformering. Generelt omfatter analysen trinnene med: (i) etablering av en dyremodell for hypersekretorisk pulmonal sykdom ved å indusere EGF-R-ekspresjon; (ii) stimulering av indusert EGF-R til å produsere slimstoffproduserende slimceller; (iii) behandling med et kandidatmiddel; og (iv) bedømmelse av slimcelleformering eller mukussekresjon, hvori en inhibering av slimcelleformering eller mukussekresjon indikerer kandidatmidlets terapeutiske potensiale. ;En hvilken som helst in vivo modell for hypersekretorisk pulmonal sykdom kan anvendes. Som et eksempel anvendes en astmatisk musemodell, som beskrevet ei Temann et al. (1997) Am. J. Respir. Cell. Biol. 16:471-478, og som vist i eksemplene anført heri. Alternativt kan det anvendes en rottemodell, som beskrevet av Takeyama et al. (1998) Am. J. Physiol. Eksempler på andre dyremodeller som kan anvendes inkluderer, men er ikke begrenset til marsvin (en spesies som uttrykker slimceller konstitutivt) og rotter. ;Lungevevet eller trakeavevet ved dyremodellene kan bedømmes ved hjelp av de samme molekylære eller biokjemiske markører som beskrevet for in vitro modellen. En nedset-telse i slimcelleformeringen indikerer det terapeutiske potensialet for EGF-R-antagonisten. ;De følgende eksempler er anført for å gi de fagkyndige på området en fullstendig forkla-ring og beskrivelse av hvorledes den foreliggende oppfinnelse skal utøves og anvendes og skal ikke begrense rammen for det som anses som en oppfinnelse og heller ikke er de ment å representere at de følgende forsøk er alle eller de eneste forsøk som er utført. Anstrengelser har vært foretatt for å sikre nøyaktighet i forhold til de anvendte tallangi-velser (f.eks. mengder, temperatur, etc.) men noen forsøksfeil og avvikelser kan fore-komme. Med mindre annet er angitt, er deler vektdeler, molekylvekt er gjennomsnittlig molekylvekt, temperatur er grader Celsius og trykk er ved eller nær atmosfæretrykket. ;EKSPERIMENTELT ;Eksempel 1 ;EGF- systemet regulerer slimstoffproduksion i luftveier ;Slimcellehyperplasi forekommer ved forskjellige hypersekretoriske sykdommer i luftveier, men på grunn av at de underliggende mekanismer er ukjent, eksisterer ingen effektiv terapi. I friske luftveier er det få slimceller, men ved hypersekretoriske luftveissykdommer opptrer slimcellehyperplasi. En human bronkie (NCI-H292) cellelinje ble undersøkt. Disse celler uttrykker EGF-R konstitutivt; EGF-R-genekspresjon ble ytterligere stimulert ved tumornekrosefaktor alfa (TNFct). EGF-R-ligander økte syntesen av slimstoffer og denne virkning ble økt ved ko-inkubasjon med TNFa. ;Luftveisepitelceller fra patogenfrie rotter uttrykte lite EGF-R-protein, men intratrakeal instillasjon av TNFa (200 ng) induserte EGF-R i basale, forslimceller og slimceller, men ikke i cilierte celler; TNFa, EGF eller TNFa alene induserte ikke slimcelleproduksjon. Instillasjon av TNFa, etterfulgt av EGF-R-ligander resulterte imidlertid i et økt antall av slimceller og forslimceller og en slående økning i Alcian blått/PAS-positiv farging (som reflekterte mukøse glykokonjugater) og slimstoff MUC5-genekspresjon. I sensitiverte rotter resulterte ovalbumin i slimcelleproduksjon og EGF-R ekspresjon i luftveisepitel. I NCI-H292-celler, i rotter stimulert ved TNFa etterfulgt av EGF-R-ligander, og i astmamodellen i rotter, forhindret forbehandling med EGF-R tyrosinkinaseinhibitor (BIBX1522) slimcelleproduksjon i luftveiene. Disse funn viser en rolle for inhibitorer av EGF-R-kaskaden ved hypersekretoriske sykdommer i luftveier. ;METODER ;IN VITRO UNDERSØKELSER ;Cellekultur. En human pulmonal mukoepidermoid karsinomcellelinje, NCI-H292-celler, ble dyrket i RPMI1640 medium inneholdende 10% fetalt bovinserum, penicillin (10 U/ml), streptomycin (100 ug/ml) ved 37°C i en humidert 5% CO2 inkubator med vannkappe. Når de løp sammen ble cellene inkubert med EGF (rekombinant humant EGF, 25 ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA), TGFa (rekombinant humant TGFa, 25 ng/ml, Genzyme), TNFa (rekombinant human TNFa, 20 ng/ml, Genzyme), EGF (25 ng/ml) pluss TNFa (20 ng/ml) eller TGFa (25 ng/ml) pluss TNFa (20 ng/ml) i 12 timer, 24 timer eller 48 timer. Ved inhibisjonsundersøkelser med en EGF-R-tyrosinkinaseinhibitor, BIBX1522 (10 ug/ml, elskverdig levert av Boehringer Ingelheim Inc., Ingelheim, Tyskland), ble celler forbehandlet med BIBX 1522 30 minutter før tilsetning av vekstfaktorer. Etter inkubasjon, ble celler dyrket i T-75 flaske anvendt for total RNA-ekstraksjon eller proteinekstraksjon, og 8 kammers objektglass ble anvendt for Alcian blått/PAS-fargingen for å synliggjøre slimstoffer. ;Western blotting. Celler dyrket i T-75 flasker ble lysert og skrapt med PBS inneholdende 1% "Triton" X, 1% natriumdioksykolat og PMSF (10 mg/ml). Total mengde protein ble bedømt ved hjelp av BCA proteinanalysereagens (Pierce, Rockford, IL). Cellelysater ble kokt med "Tricine" prøvebuffer og 2% PME ved 95°C. Proteiner ble separert ved hjelp av SDS-PAGE i 8% akrylamidgeler. De resulterende geler ble ekvilibrert i overfø-ringsbufferen, 25 mM Tris-HCL, 192 mM glycin, 20% (volum/volum) metanol, pH 8,3. Proteinene ble så elektroforetisk overført til nitrocellulosemembraner. Membranene ble så inkubert i 1 time i 5% fettfri skummet melk i PBS inneholdende 0,05% "Tween" 20. Deretter ble membranene inkubert med monoklonalt muse anti-EGF-R-antistoff (1:100) ved 4°C over natten. Bundet antistoff ble synliggjort ved hjelp av standard protokoller for avidin-biotin-alkalisk fosfatasekompleksmetoden (ABC-sett, Vector Laboratories). Som en positiv kontroll for EGF-R, ble det anvendt cellelysater fra A431-celler (20). ;Immunocytokjemisk lokalisasjon av EGF- R i NCI- H292- celler. Celler dyrket på 8 kammers objektglass ble fiksert med 4% paraformaldehyd i 1 time. Molekylkarakterisering for EGF-R ble PBS inneholdende 0,05% "Tween" 20,2% normalt geiteserum og 2 mM levamisol anvendt som fortynningsmiddel for antistoffet. Seksjoner ble inkubert med muse monoklonalt antistoff til EGF-R (1:250) over natten ved 4°C og deretter vasket tre ganger med PBS for å fjerne overskytende primært antistoff. Celler ble så inkubert med biotinylert heste anti-muse-immunoglobulin (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ved 1:200 fortynning i 1 time ved romtemperatur. Bundet antistoff ble synliggjort ifølge standard protokoller for avidin-biotin-alkalisk fosfatasekompleksmetode (ABC-sett, Vector Laboratories, Burlingame, CA). ;Prober. EGF-R mRNA ekspesjon ble bestemt ved bruk av linearisert pTRI-EGF-R human probetemplat (Ambion, Austin, TX). Denne probe inneholder et 360 bp cDNA-fragment av det humane EGF-R-gen, som spenner over exoner 12-14. MUC5-genekspresjon ble bestemt ved bruk av human MUC5AC-probe, inneholdende et 298 bp cDNA-fragment av humant MUC5AC-gen (elskverdig tilveiebragt av Dr. Carol Bas-baum). ;Northern blotting. Total RNA ble ekstrahert fra NCI-H292-celler dyrket i en T-75 vevs-kulturflaske ved bruk av "Tri-Reagent" (Molecular Research Ctr., Cincinnati, OH) ved hver betingelse. Total RNA (10 ug) ble elektroforert på 1% agarose/formaldehydgel og overført til en nylonmembran (Amersham, Arlington Heights, IL) ved hjelp av kapil-lærblotting. Probene ble merket med <32>P ved bruk av Random Primed DNA-merkingssettet (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN). Blottinger ble forhybri-disert ved 42°C i 4 timer og deretter hybridisert ved 42°C i 16 timer med <32>P-merket spesifikk cDNA-probe. Hybridisasjonsoppløsningen inneholdt 250 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5% SDS, 1% BSA, 1% polyvinylpyrrolidon, 1% Ficoll og 0,5% natriumpyrofosfat. Etter hybridisering, ble membranene vasket to ganger med 2 x SSC med 0,1% SDS i 30 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av to vaskinger i 2 x SSC med 0,1% SDS i 30 minutter ved 50°C og en skylling i 0,1 x SSC med 0,1% SDS. Membraner ble påført røntgenfilm. ;IN VIVO UNDERSØKELSER ;Dyreforsøksprotokollen var godkjent av Committee on Animal Research, University of California, San Francisco. Spesifikt patogenfri hannrotter Fisher F344, som veide 230-250 g (Simonsen Laboratories, Gilroy, CA), ble opprettholdt i et temperaturstyrt (21°C) rom med standard laboratorieføde og fritt tilgjengelig vann. ;Friske rotter. Rotter ble bedøvet med metoheksital natrium (Brevital natrium, 50 mg/kg, i.p.; Eli Lilly & Co., Indianapolis, IN) og fikk puste spontant. For å bestemme om TNFa oppregulerer EGF-R i luftveier, ble TNFa (200 ng, 100 ul) instillert i trakea og dyrene ble bedøvet 24 timer senere. For å undersøke om EGF eller TGFa induserer slimceller i luftveisepitel, ble EGF (600 mg, 100 ul) eller TGFa (rotte syntetisk TGFa, 250 ng, 100 ul; Sigma, St. Louis, MI) innstillert inn i trakea enten alene eller 24 timer etter innstillasjonen av TNFa (200 ng, 100 ul) og dyrene ble bedøvet 48 timer senere. Ved hver undersøkelse ble steril PBS (100 ul) innstillert i trakea som kontroll. For å bekrefte om slimstoffproduksjon forekom via aktivasjon av EGF-R, ble virkningen av en EGF-R tyrosinkinaseinhibitor, BIBX1522 (dose anslått fra undersøkelser ved bruk av inhibitor for å hindre cancervekst) undersøkt. Rotter ble forbehandlet med BIBX1522 (3,10 eller 30 mg/kg, i.p.), 1 time før og 24 timer etter innstillasjon av TGFa. Trakea og lunger ble fjernet for undersøkelse 48 timer etter innstillasjonen av TGFa. ;Sensitiverte rotter ;Sensitivering. Rotter ble sensitivert på dager 0 og 10 med intraperitoneale injeksjoner av ovalbumin (10 mg, renhet V; Sigma, St. Louis, MO), kompleksdannet med 100 mg aluminiumhydroksid i 0,5 ml steril saltløsning. Rottene fikk så hvile i 10 dager. På dag 20, ble ovalbumin tilført direkte i trakea; dyrene ble eksponert med 100 ul 0,1% ovalbumin i saltløsning ved intratrakeal instillasjon tre ganger (dager 20, 22 og 24). Rotter ble eutanisert (avlivet under bedøvelse) enten uten eksponering (dag 20), eller 48 timer etter den tredje eksponering (dag 26). Denne prosedyre induserte slimcellemetaplasi. For å blokkere slimcellehyperplasien ble sensitiverte rotter forbehandlet med en EGF-R tyrosinkinaseinhibitor, BIBX1522. På dagene for ovalbumineksponering (dager 20,22 og 24) ble sensitiverte rotter forbehandlet med BIBX1522 (10 mg/kg, i.p., 1 time før eksponeringen) og deretter ble BIBX1522 også innstillert inn i trakea sammen med ovalbuminet (BIBX1522, IO"<5> M, 100 ul). BBX1522 ble også injiserte i.p. hver 24. time etter dagen før rottene ble avlivet. Etter at dyrene var avlivet, ble trakea fjernet 48 timer etter den tredje eksponering. ;Vevspreparering. Ved forut bestemte tider under bedøvelse, ble den systemiske sirkulasjon perfusert med 1% paraformaldehyd i DEPC-behandlet PBS ved et trykk på 120 mm Hg. Trakea ble så bedøvet og anbragt i 4% paraformaldehyd i 24 timer. Etter fiksering ble trakea og lunger innleiret i enten JP-4 pluss monomeroppløsning A for celleanalyse eller O.C.T.-forbindelse (Sakura Finetek U.S.A., Inc., Torrance, CA) for immu-nohistokjemi og in situ hybridisasjon. De innleirede vev ble kuttet som tverrsnitt (4 mm tykke) og anbragt på objektglass. ;Celleanalyse. Det totale antall epitelceller ble tellt ved telling av epitelcellekjerner over 2 mm av basal lamina ("basement membrane") med en oljeneddykningsobjektivlinse (x 1000 forstørres). Den lineære lengde av basal lamina under hver analysert region av epitel ble bestemt ved å spore konturen av det digitaliserte bildet av basal lamina. Etter instillasjon av stimuli dannes "utviklende" slimceller. Disse celler har Alcian blått/P AS-positive granuler, men størrelsen av granulene er liten og antallet cytoplasmiske granuler er få. Disse "utviklende" slimceller benevnes "for-slimceller", et trinn før celler blir fullt utviklede slimceller. Slimceller er høye, kubeformede, med fasong som fra drikke-beger til lav søyleform, med rikelige Alcian blått/PAS-fargede granuler som fyller det meste av cytoplasma mellom kjernen og den luminale overflate. For-slimceller er definert som celler med mindre mukuskarakteriserte arealer (< 1/3 høyde i epitel fra basalmembranen til luminal overflate) eller med sparsomme og svakt Alcian blått/P AS-fargede, små granuler. Cilierte celler gjenkjennes av deres cilierte kanter, svakt farget cytoplasma, og store runde kjerner. Ikke-granulerte sekretoriske celler har søyleform og strekker seg ut fra lumen til basal lamina. Cytoplasmaet farges lys rosa farge og et fåtall små PAS-positive og Alcian blått-negative granuler iakttas i cytoplasmaet. Basalceller er små flattrykte celler med en stor kjerne, lokalisert umiddelbart over basal lamina men når ikke luftveislumen. ;Kvantifisering av slimcelleproduksjon. Slimcelleproduksjon ble bestemt ved volumdensiteten av Alcian blått/P AS-fargede mukosubstanser på det mukosale overflateepitel ved bruk av et halv-automatisk avbildningssystem beskrevet på annet sted (Weber et al. ;(1984) Science 224:294-297). Det Alcian blått/PAS-positivt fargede areal og det totale epitelareal ble målt og uttrykte data som prosentandel av det totale areal farget med Alcian blått-PAS. Analysen ble gjennomført med det offentlige domene NIH Image Program (utviklet ved U.S. National Institute of Health og kan fås fra Internet ved hjelp av anonymt FTP fra zippy.nimh.gov eller på diskett fra National Technical Information Service, Springfield, VA, del nr. PB95-500195GEI). ;Immunohistokjemisk lokalisering av EGF- R i rotteepitel. Lokaliseringen av EGF-R ble undersøkt ved bruk av immunohistokjemisk immunomerking ("immunostaining") med et antistoff til EGF-R (Clabiochem, San Diego, CA) i frosne snitt av rottetrakea. Etter perfusjon med 1% paraformaldehyd i PBS, ble vev anbragt i 4% paraformaldehyd i PBS i 1 time og deretter fjernet i 30% sukrose for kryobeskyttelse over natten. Trakea ble innleiret i O.C.T. forbindelse (Sakura Finetek U.S.A., Inc., Torrance, CA) og frosset. Frosne snitt (5 um) ble kuttet og anbragt på objektivglass (Superfrost Plus, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Immunomerking ble gjennomført på tilsvarende måte som in vitro undersøkelsene. ;Probefremstilling. cDNA for rotte MUC5 ble elskverdig tilveiebragt av Dr. Carol Bas-baum. Et 320 bp cDNA-fragment av rotte MUC5 ble subklonet inn i Xba/HindIII-setet ;av transkripsjonsvektoren, pBluescript-SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA). For å fremstille RNA-prober for in situ hybridisering ble dette rekombinante plasmid inneholdende rotte MUC5 cDNA-fragmentet linearisert og transkribert in vitro med T7 eller T3 polymerase for å oppnå antisense hhv. senseprobe. Probene for in situ hybridisering ble generert i ;nærvær av [<35>S]UTP. Etter transkripsjon ble cDNA-templatet kuttet med DNase, og radiomerket RNA ble renset via en Sephadex G-25 Quick SpinTM kolonne (Boehringer Mannheim, Indianapolis, EN) og utfelt i en etanol/ammoniumacetatoppløsning. Før bruk ble RNA-prober vasket med 70% etanol og fortynnet med 10 mM DTT. ;In situ hybridisering. Frosne snitt (5 um) ble kuttet og anbragt på positivt ladede objektglass (Superfrost Plus, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Snitt kuttet i tett nærhet ble anvendt for hybridisering med sense- og antisenseprober. Vekselvise snitt ble anvendt for Alcian blått/PAS-farging. Prøver ble på nytt fiksert i 4% paraformaldehyd, rehydra-tisert i 0,5 x SSC, og deretter acetylert i trietanolamin med eddiksyreanhydrid. Hybridisering ble gjennomført ved 2500-3000 cpm/ul antisense- eller senseprobe i 50% deioni-sert formamid, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris, 5 mM EDTA, lx Denhardfs oppløsning, 20 mM ditiotreitol, 10% dekstransulfat, 0,5 mg/ml gjær tRNA, og 0,5 mg/ml ultralydbe-handlet laksesperma DNA ved 55°C over natten. Posthybridiseirngsbehandling bestå i vaskinger med 2 x SSC, 1 mM EDTA, 10 mM P-merkaptoetanol ved romtemperatur, inkubasjon med RNase-oppløsning (20 mg/ml) i 30 minutter ved romtemperatur og ytterligere vaskinger i 0,1 x SSC, 1 mM EDTA, 10 mM p-merkaptoetanol ved 55°C i 2 timer og deretter i 0,5 x SSC ved romtemperatur. Prøver ble dehydratisert, lufttørket og dekket med Kodak NBT kjernesporemulsjon (Eastman Kodak, Rochester, NY) for autoradiografi. Etter eksponering i 7 til 21 dager ved 4°C ble objektglassene fremkalt, fiksert og motfarget med hematoksylin (21). ;Statistikk. Alle data er uttrykt som middel ± standard feilmiddel. En veis analyse av va-rians ble anvendt for å bestemme statistisk signifikante forskjeller mellom grupper. Scheffe's F-test ble anvendt for å korrigere for multiple sammenligninger når statistiske signifikanser ble identifisert i variansanalysen. En mulighet på mindre enn 0,05 for null-hypotesen var akseptert som indikerende en statistisk signifikant forskjell. ;RESULTATER ;TNFa stimulerer produksjon av EGF- R i NCI- H292- celler. Først ble det bestemt hvor-vidt NCI-H292-celler uttrykker EGF-R konstitutivt. Western analyse av immunoblot-tinger identifiserte nærvær av EGF-R-protein i sammenløpende kulturer av NCI-H292-celler (Figur IA, til høyre). Celler ble undersøkt etter at de ble sammenløpende. Lysater ble elektroforert i 8% akrylamidgeler og blotting foretatt med anti-EGF-R-antistoff. Molekylvekter av markørproteiner er anført til høyre. En positiv kontroll for EGF-R var protein fra A431-celler (figur IA, til venstre) som uttrykker EGF-R konstitutivt (Weber et al., supra). Immunocytokjemiske undersøkelser med et anti-EGF-R-antistoff viste positiv farging, mest slående i delende celler (figur IB, immunocytokjemisk analyse med anti-EGF-R-antistoff i kulturer av NCI-H292-celler). Ved sammenløping ble positiv farging sett, sterkest i delende celler (pilene, høyre side). I fråvær av det primære antistoff, var farging fraværende (venstre side). Northern blotting viste at TNFa (20 ng/ml) oppregulerte EGF-R-genekspresjon, en virkning som var tilstede ved 12 timer og økte ved 24 timer (figur 1C, Northern analyse av EGF-R i NCI-H292-celler). Analyser ble gjennomført på total RNA ekstrahert fra sammenløpende kulturer inkubert med TNFa (20 ng/ul) i 12 eller 24 timer. RNA ble elektroforert på en formaldehyd-agarosegel, overført til en nylonmembran, og hybridisert med den P-merkede EGF-R cDNA-probe. Etter hybridisering, ble membranen vasket og autoradiografert. ;EGF- R- ligander stimulerer ekspresjon i mukøse glykokonjugater og MUC5-genekspresjon i NCI- H292- celler. EGF-R uttrykkes konstitutivt i NCI-H292-celler, så det ble foretatt bedømmelse av evnen av EGF-R-ligander (EGF, TGFa) til å indusere produksjonen av mukøse glykokonjugater (figur 2, øvre kolonne, Alcian blått/PAS-farging av NCI-H292-celler for identifikasjon av slimstoffglykoproteiner). Øvre kolonne er inkubasjon av celler uten inhibitor; lavere kolonne = inkubasjon i nærvær av EGF-R-tyrosinkinaseinhibitoren BIBX1522 (10 ug/ml). Når celler ble inkubert alene (kontroll), ble noe PAS-positiv farging iakttatt (piler, øvre kolonne); inkubasjon med TNFa (20 ng/ml) alene påvirket ikke fargingen; inkubasjon med EGF; (25 ng/ml) eller med TGFa (25 ng/ml) økte den PAS-positive farging (piler); inkubasjon med TNFa pluss TGFa økte markert farging (pil, øvre kolonne). ;Noen kontrollceller viste farging; inkubasjon med TNFa (20 ng/ml) alene påvirket ikke farging; inkubasjon med enten EGF eller TGFa (hver med 25 ng/ml) økte PAS-positiv farging (piler); inkubasjon med TNFa pluss TGFa økte fargingen mer enn med enten hver ligand alene. Således induserer EGF-R-ligander mukøse glykokonjugater i NCI-H292-celler. ;For å undersøke MUC5-genekspresjon, ble Northern blotting utført (figur 3). Total RNA (10 ug) ble ekstrahert fra cellene, elektroforert på en formaldehyd-agarosegel, overført til en nylonmembran og hybridisert med den <32>P-merkede MUC5 cDNA-proben. Etter hybridisering ble membranen vasket og autoradiografert. Kulturer ble oppnådd med medium alene (C), EGF eller TGFa (25 ng/ml), TNFa (20 ng/ml) eller kombinasjonen av TNFa pluss enten EGF eller TGFa i 12 timer (øvre kolonne) eller 24 timer (nedre kolonne) på MUC5-genekspresjon. Kulturer ble oppnådd også med TNFa pluss enten EGF eller TGFa etter forinkubasjon med EGF-R tyrosinkinaseinhibitor (BIBX1522; 10 ug/ml; nedre kolonne); idet inhibitoren hindret MUC5-genekspresjon. ;NCI-H292 celler viste noe ekspresjon i kontrolltilstanden (figur 3, nedre venstre kolonne); når cellene ble inkubert med EGF eller TGFa var MUC5-genekspresjon knapt synlig ved 12 timer men var klart uttrykt ved 24 timer. TNFa alene påvirket ikke MUC5-genekspresjon, men når TNFa ble tilsatt cellene inkubert med EGF-R-ligander, økte MUC5-genekspresjon markert over nivået bevirket ved EGF-R-liganden alene (figur 3). ;EGF- R tyrosinkinaseinhibitor ( BIBX1522) hindrer ekspresjon av mukøse glykokonjugater og av MUC5- genekspresjon i NCI- H292- celler. For å teste den hypotese at aktivering av EGF-R-reseptorer induserer MUC5-genekspresjon, ble celler inkubert med en EGF-R-tyrosinkinaseinhibitor BIBX1522. Når NCI-H292-celler ble forbehandlet med BIBX1522 (10 ug/ml) ble PAS-positiv farging inhibert i kontrolltilstanden, og den økte farging som forekom med EGF-R-ligandene var markert inhibert (figur 2, nedre kolonne). På Northern analyse ble MUC5-genekspresjon som var markert økt ved kombinasjonen av TNFa pluss EGF eller pluss TGFa fullstendig inhibert ved forinkubasjon med BIBX1522 (figur 3, nedre kolonne). Disse resultatene impliserer aktivering av EGF-R i induksjonen av slimstoffgen og mukøse glykoproteiner i NCI-H292-celler. ;TNFa stimulerer produksjon av EGF- R i rotter. Patogenfrie rotter (som har få luftveisepitel-slimceller konstitutivt) ble undersøkt, ved å begynne med rollen til TNFa. I kontrolltilstanden inneholdt trakeaepitel få EGF-R-positive celler (figur 4A, til venstre). Intratrakeal instillasjon av TNFa (200 ng) induserte imidlertid EGF-R-protein i forskjellige celletyper i trakeaepitelet (figur 4A, til høyre). EGF-R-positiv farging var tilstede i slimcellene (G), for-slimceller (P-G), ikke-granulerte sekretoriske celler (S) og basale celler (Ba), men ikke i cilierte celler. TNFa induserer således EGF-R-proteinproduksj on. ;Rollen til EGF- R- ligander i produksjon av mukøse glykokonjugater ogMUC5-genekspresjon i rotter. I kontrolltilstanden inneholdt trakeaepitel få slimceller og for-slimceller. Intratrakeal instillasjon av EGF-R-ligander, EGF (600 ng; ikke vist) eller TGFa (250 ng; tabell 1) alene hadde ingen virkning på epitelproduksjonen av mukøse glykokonjugater. Når TNFa (200 ng) ble tilført først, etterfulgt i Løpet av 24 timer av EGF eller TGFa (tabell 1) og dyrene ble avlivet 48 timer senere, var imidlertid Alcian blått/PAS-farging økt markert, og antallet av slimceller og for-slimceller var markert ;økt, uten en endring i det totale antall celler eller i antallet av cilierte cleler (tabell 1). In situ hybridisering for MUC5-genet viste ingen ekspresjon i kontrolldyr. Når TNFa, etterfulgt av EGF eller TGFa ble instillert intratrakealt, var ekspresjon av MUC5 synlig i epitelet. Induksjon av EGF-R alene eller stimulering med EGF-R-ligander alene var ;således utilstrekkelig til å indusere slimcellemetaplasi eller produksjon av mukøse glu-kokonjugater. Etter induksjonen av EGF-R ved hjelp av TNFa stimulerte imidlerte instillasjon av EGF-R-ligander slimcelleplasi markert. ;;Tabell 1. Virkning av mediatorer og av ovalbuminsensitivering på trakeale epitelceller i rotter. Celler ble analysert som beskrevet i avsnittet "Metoder"; fem rotter pr. gruppe. Karakterisering ble fremmet ved hjelp av Alcian blått(AB)/PAS-farging (som farger mukøse glykokonjugater). I tillegg til telling av cellene, ble prosent av totalt epitelareal opptatt av AB/P AS-farging beregning. Kontrolluftveier og luftveier stimulert ved hjelp av TGFa (250 ng) alene inneholdt få slimceller og for-slimceller; det var lite farging med AB/PAS. TNFa (200 ng), etterfulgt av TGFa, resulterte i økte antall av slimceller og for-slimceller og en økning av arealet opptatt av AB/P AS-fargede celler. Sensitivering av rotter med ovalbumin (OVA) intraperitonalt (ip) hadde ingen virkning på celle-fordeling eller på AB/P AS-farging, men når OVA ble tilført ip etterfulgt av intratrakeal (it) instillasjon av OVA ble det funnet en slående økning av antallet slimceller og for-slimceller og prosent areal opptatt av AB/P AS-farging. ;Ovalbuminsensitivering i rotter induserer EGF- R og slimcelleproduksjon. På grunn av at dødsfall grunnet akutt astma er rapportert å skyldes mukøs tilstopping av luftveier, ble en astmamodell frembragt i patogenfrie rotter. Injeksjoner av ovalbumin (10 mg, ip.) på dager 0 og 10 stimulerte ikke slimcellehyperplasi (tabell 1). Når dette imidlertid ble fulgt av tre intertrakeale (i.t.) instillasjoner av ovalbumin (0,1% i 100 ul) på dager 20, 22 og 24, og dyrene ble avlivet på dag 26, var antallet av slimceller og for-slimceller økt markert; antallet av cilierte og basalceller var uendret (tabell 1, høyre side). Immuno-histokjemiske undersøkelser med et anti-EGF-R-antistoff viste ingen farging i kon-trolltrakea. Dyrene sensitivert både i.p. og i.t. viste EGF-R-farging (farging 4B, venstre) selektivt i celler som farget positivt med AB/PAS (figur 4B, til høyre). Etter tre intratra-keale instillasjoner av ovalbumin (0,1%, 100 ml), ble EGF-R-immunoreaktivitet sterkt uttrykt i slimceller og forslimceller (nederst til venstre), de samme celler som farget positivt med Alcian blått/P AS (nederst til høyre). En ovalbuminmodell av astma viste således slimcelleformering i celler som produserte EGF-R. ;EGF- R- tyrosinkinaseinhibitor ( BIBX1522) forhindrer slimcelleproduksjon indusert ved instillasjon av TNFa pluss EGF- R- ligander og ved hjelp av ovalbuminsensitivering i rotter. På grunn av at BIBX1522 hindret slimstoffproduksjon i dyrkede celler, ble virkningen av denne inhibitor undersøkt i patogenfrie rotter. Alcian blått/P AS-farging som ble økt ved trakeal instillasjon av TNFa etterfulgt av EGF-R-liganden TGFa, ble inhibert på en doseavhengig måte ved forbehandling med BIBX1522 (3-30 mg/kg, i.p.; figur 5A). Trakeal instillasjon av TNFa (for å indusere EGF-R) etterfulgt av EGF-R-liganden TGFa, resulterte i slående slimcellemetaplasi. ;I rotter sensitivert med ovalbumin inhiberte forbehandling med BIBX1522 (10 mg/kg, i.p.) fullstendig produksjonen av slimceller (bedømt ved hjelp av Alcian blått/P AS-farging; figur 5B). Dyr som var tilført ovalbumin i.p. viste lite AB/PAS-positiv farging i bronkialt epitel. Dyrene som først var sensitivert med OVA i.p., etterfulgt av tre in-tratrakeale (i.t.) instillasjoner av OVA, viste en markert økning i AB/PAS-positiv farging. ;Disse undersøkelser indikerer at EGF-R, når den stimuleres av EGF-R-ligander, induserer slimcelleproduksjon in vitro og in vivo, virkninger som skyldes aktivering av EGF-R og som ble blokkert ved hjelp av en EGF-R-tyrosinkinaseinhibitor. I en ovalbuminmodell av astma var inhibitoren også effektiv til å hindre slimcelleproduksjon. ;I tillegg til å beskrive en mekanisme for induksjon av slimceller, antyder de foreliggende resultater en mulig sekvens for uviklingen av slimcelleproduksjon basert på ekspresjonen av EGF-R: Stimulering med TNFa induserte intens farging av ikke-granulerte sekretoriske celler; deres etterfølgende aktivering med EGF-R-ligander bevirket progressiv farging for mukøse glykokonjugater i cytoplasmaet, og cellene ble "for-slimceller" og deretter "slimceller". Instillasjon av TNFa etterfulgt av EGF-R-ligander induserte slimcelleproduksjon uten å endre det totale antall epitelceller, noe som antyder at EGF-R-aktiveiing fremmet selektiv celledifferensiering (ikke formering). Funnene antyder at slimceller er avledet fra ikke-granulerte sekretoriske celler som uttrykker EGF-R og stimuleres av EGF-R-ligander for å fremstille slimstoffer. ;I pasienter som dør av akutt astma, er slimcellehyperplasi og mukøs tilstopping viktige funn. I en murin astmamodell, opptrer sensitivering av luftveier etter gjentatt instillasjon av ovalbumin og resulterer i markert luftvei-slimcellehyperplasi. Det vises her at EGF-R, som ikke uttrykkes i et kontrolluftveisepitel, uttrykkes i senstiverte dyr. Celler som ble farget var for-slimceller og slimceller, som antydet at EGF-R var involvert i slimcelleproduksjon. Forbehandling med en EGF-R-reseptortyrosinkinaseinhibitor (BIBX1522) hindret luftveisslimcelleproduksjon og bekreftet rollen til EGF-R-akti vering i slimcelleproduksjon ved eksperimentell astma. ;De foreliggende resultater impliserer EGF-R-mønsteret ved slimcellehyperplasi. Tidligere studier har vist at forskjellige stimuli som ozon, svoveldioksid, virus, lipopolysak-karid, blodplateaktiverende faktor, og interleukin 4 oppregulerer slimstoffekspresjon og sekresjon. Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en mekanisme for å bedømme forholdet mellom disse inflammatoriske stimuli og EGF-R-systemet. ;Astma tjener som et eksempel på den terapeutiske strategi ifølge oppfinnelsen: Normalt humant luftveisepitel har et forhold på 3-10 cilierte celler for hver slimcelle. I astma, kan antallet slimceller være likt eller overstige antallet av cilierte celler; i pasienter som dør i status asthamaticus, er det en 30 gangers økning i det prosentvise areal som opptas av slimceller sammenlignet med antallet i pasienter som dør av ikke-astma-åndedrettssykdommer. Inhibisjon av produksjon av slimceller bør eliminere denne kilde til hypersekresjon. På grunn av at livssyklusen for slimceller er ukjent, kan ikke tidsfor-løpet for å løse slimcellehyperplasi med behandling forutsis med nøyaktighet. I fravær av ytterligere eksponering for allergen, løste slimcellehyperplasi i tidligere sensitiverte mus seg i løpet av 50 dager, sammen med andre manifestasjoner av allergisk inflammasjon. Inhibisjon av EGF-R-aktivering kan inhibere slimcellehyperplasi mye mer hurtig, avhengig av levetiden for slimceller. Mer nylig, er det rapportert høyselektive ATP-kompetitive tyrosinkinaseinhibitorer. EGF-R-tyrosinkinaseinhibitorer er vurdert for behandling av maligne forhold assosiert med ekspresjonen av EGF-R. ;Hypersekresjon er en vesentlig manifestasjon i mange kroniske inflammatoriske sykdommer i luftveiene. Hittil har det ikke vært noen effektiv terapi for å lindre symptomene og å bremse progressjonen av disse sykdommer. De foreliggende funn tilveiebringer en mekanisme og en strategi for terapi: ved å inhibere EGF-R-aktivering, hindres slimcelleproduksjon. Inhibitorer av EGF-R-aktivering er foreslått som terapi ved hypersekretoriske luftveissykdommer. ;Eksempel 2 ;Rollen til oksidativ stress ved produksjon av slimceller ;I mennesker er langvarig sigarettrøking foreslått å være assosiert med progressive patologiske endringer i de perifere luftveier inklusive slimcellehyperplasi. Likeledes, har forsøksmodeller med sigarettrøking i dyr vært vist å bevirke slimcellerhyperplasi i luftveier. Den mekanisme hvormed sigarettrøk kan indusere slimstoffsyntese er imidlertid ukjent. De følgende data viser at proinflammatoriske cytokinaktiverte neutrofiler og sigarettrøk bevirker slimstoffMUC5AC-syntese i humane bronkiale epitelceller via liganduavhengig aktivering av EGF-R. Disse resultater impliserer de foreslåtte neutrofiler og sigarettrøk som regulatorer for epitelcelledifferensiering som kan resultere i unormal induksjon av slimstoffproduserende celler i luftveier. ;Metoder ;Isolasjon av neutrofiler. Humane neutrofiler ble renset fra perifert blod oppnådd fra friske humane donorer. Neutrofil isolasjon ble utført ved hjelp av standardmetoder iføl-ge Ficoll-Hypaque-gradientseparasjon, dekstransedimentasjon, og hypotonisk lyse av erytrocytter. Celler var rutinemessig >95% levedyktige ved hjelp av trypan blåfar-geeksklusjon. For å hindre endoksinforurensning var alle oppløsninger ført gjennom et 0,1 nm filter. ;Cellekultur. NCI-H292-celler, en human pulmonal mukoepidermoid carcinomcellelinje, ble dyrket i RPMI1640 medium inneholdende 10% fetalt bovint serum, penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 ug/ml) og Hepes (25 mM) ved 37°C i en humidifisert 5% C02 inkubator med vannkappe. Enten 6-brønners dyrkningsplater eller 8-kammers objektglass ble anvendt for å dyrke cellene. Når de fløt sammen, ble cellene inkubert i 1 time med neutrofiler (IO<6> celler/ml) alene, TNFa alene (rekombinant human TNFa, 20 ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA), IL-8 (rekombinant human IL-8, IO"8 M, Genzyme) alene, fMLP (10"<8> M, Sigma, St. Louis, MO) alene, TNFa pluss neutrofiler, IL-8 pluss neutrofiler, fMLP pluss neutrofiler, hydrogenperoksid (H2O2,200 uM), sigarettrø-koppløsning eller TGFa (rekombinant humant TGFa, 0,1 til 25 ng/ml, Calbiochem, San Diego, CA). Disse celler ble så vasket og inkubert med friskt medium alene. Forsøk ble avsluttet ved forutbestemte tider (for mRNA, 6 timer og 12 timer; for protein, 24 timer). Som kontroller, ble celler inkubert med medium alene i de samme tidsperioder. I andre studier med neutrofiler ble TNFa valgt som en stimulus på grunn av at den hadde den kraftigste virkning på MUC5 AC-syntesen. NCI-H292-celler ble inkubert i 1 time med enten neutrofiler som var blitt inkubert med TNFa (20 ng/ml) i 1 time og deretter vasket med steril PBS for å unngå forurensning med supematanten (f.eks. molekyler frigitt fra neutrofiler), eller NCI-H292-cellene ble inkubert bare med supematanten. Ved inhibi-sjonsstudier med EGF-R-tyrosinkinaseinhibitorer, ble NCI-H292-celler forbehandlet med BIBX1522 (10 ng/ml, elskverdig tilveiebragt fra Boehringer Ingelheim, Inc., Ingelheim, Tyskland) eller tyrfostin AG1478 (10 ug/ml, Calbiochem) 30 minutter før tilsetning av en stimulus. Virkningene av en selektiv inhibitor på blodplateavledet vekstfaktorreseptor tyrosinkinase (tyrfostin AG1295,100 uM, Calbiochem) og en negativ kontroll for tyrfostiner (tyrfostin Al, 100 uM, Calbiochem) ble også undersøkt. I inhibi-sjonsstudier med blokkerende antistoffer til EGF-R-ligander ble supernatantene forbehandlet med anti-TGFa-antistoff (Calbiochem) eller anti-EGF-antistoff i 30 minutter og deretter tilsatt til NCI-H292-celler. Rollen til fri oksygenradikaler ble undersøkt ved bruk av midler for å fjerne fri oksygenradikaler, DMSO (1%, Sigma), l,3-dimetyl-2-tiourea (DMTU, 50 mM, Sigma) eller peroksiddismutase (SOD, 300 U/ml, Sigma). ;Fremstilling av sigarettrøkoppløsning. Forskningssigaretter (kode2Rl, fremstilt for University of Kentucky Tobacco and Health Research Foundation) ble anvendt ved un-dersøkelsen. Sigarettoppløsning ble fremstilt som tidligere beskrevet (Dusser et al. ;(1989) J. Clin. Invest. 84:900-906). Kort sagt, ble sigarettrør trukket inn i en polypropy-lensprøyte (35 ml) i en takt på et støt/minutt (10 ganger) og sakte boblet inn i 20 ml RPMI1640 inneholdende 50 mM Hepes buffer. Røkoppløsningen ble så titrert til pH 7 og anvendt med en gang etter fremstillingen. ;Visualisering av mukøse glykokonjugater og MUCSAC- protein i NCI- H292- celler. Ved slutten av forsøkene ble cellene dyrket på 8 kammers objektglass fiksert med 4% paraformaldehyd i 1 time og enten farget med Alcian blått/perjodsyre-Shiff (PAS) for å visualisere mukøse glykokonjugater, eller anvendt for immunocytokjemi av MUC5AC. For immunocytokjemi av MUC5AC, ble PBS-holdig 0,5% "Tween" 20, 2% normalt geiteserum og Levamisol (2 mM) anvendt som fortynningsmiddel for antistoffet. Celler ble inkubert med muse-mAB til MUC5AC (klon 45 Ml, 1:200, Neo Markers, Fremont, CA) i 1 time ved romtemperatur og deretter vasket 3 ganger med PBS for å fjerne over-skudd av primært antistoff. Celler ble så inkubert med biotinylert heste anti-muse IgG (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) ved 1:200 fortynning i 1 time ved romtemperatur. Bundet antistoff ble visualisert ifølge en standard protokoll for avidin-biotin-alkalisk fosfatase-kompleksmetode. ;In situ hybridisering for humant MUC5AC- gen. Et 298 bp cDNA-fragment av human MUCSACble innført i TA-kloningsvektor (Invitrogen, San Diego, CA). Fremstillingen av RNA-prober og in situ hybridisering ble gjennomført som beskrevet i det foregående. ;Immunoanalyse av MUCSAC- protein. MUC5AC-protein ble målt som beskrevet i det foregående. Kort sagt ble cellelysater fremstilt med PBS ved flere fortynninger, og 50 ul av hver prøve ble inkubert med bikarbonat-karbonatbuffer (50 ni) ved 40°C i en 96 brønns plate (Maxisorp Nunc, Fisher Scientific, Santa Clara, CA) inntil tørr overflate. Platene ble vasket tre ganger med PBS og blokkert med 2% BSA (fraksjon V, Sigma) i 1 time ved romtemperatur. Platene ble på nytt vasket tre ganger med PBS og så inkubert med 50 ul muse monoklonalt MUC5AC-antistoff (1:100) som var fortynnet med PBS inneholdende 0,5% "Tween" 20. Etter 1 time, ble brønnene vasket tre ganger med PBS og 100 ul pepperrotperoksidase-geit anti-muse IgG-konjugat (1:10 000, Sigma) ble ut-porsjonert i hver brønn. Etter 1 time ble platene vasket tre ganger med PBS. Fargereak-sjon ble fremkalt med TMB-peroksidaseoppløsning (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) og stanset med 2N H2SO4. Absorbans ble avlest ved 450 nm. ;Kvantitativ analyse av TGFa- protein. TGFa-protein ble målt ved bruk av et kommersi-elt tilgjengelig sett for ELISA (Sigma), ved å følge produsentens instruksjoner. Supernatant tatt etter inkubasjon av neutrofiler pluss TNFa (20 ng/ml) i 1 time ble blandet med lysebuffer PBS inneholdende 1% "Triton" X-100,1% natriumdeoksycholat og flere proteaseinhibitorer (Complete Mini, Boehringer, Mannheim, Tyskland) og deretter anvendt for å måle TGFa. ;ImmunoutfellingforEGF- R- protein og immunoblottingfor tyrosinfosforylering. Celler ble serumsultet i 24 timer og deretter stimulert med TGFa, H2O, eller supematanten fra aktiverte neutrofiler i 15 minutter. Etter stimulering ble celler lysert og inkubert i 30 minutter i en orbital ristemaskin ved 4°C. For å fjerne uoppløselig materiale, ble cellelysater sentrifugert ved 14 000 opm. i 5 minutter ved 4°C. Delmengder av supernatanter inneholdende like mengder protein ble immunoutfelt med et anti-EGF-reseptorantistoff (polyklonal, Ab4, Calbiochem) og 20 ul protein A-agarose (Santa Cruz) i 2 timer ved 4°C. Utfellinger ble vasket tre ganger med 0,5 ml lysebuffer, suspendert i SDS-prøvebuffer og kokt i 5 minutter. Proteiner ble separert ved hjelp av SDS-PAGE i 8,0% akrylamidgel. Den resulterende gelen ble ekvilibrert i overføringsbufferen: 25 mM Tris-HC1,192 mM glycin, 20% (volum/volum) metanol, pH 8,3. Proteinene ble så overført elektroforetisk på nitrocellulosemembraner (0,22 um), blokkert med 5% fettfri skummet melk i PBS inneholdende 0,05% 'Tween" 20 over natten og deretter inkubert med monoklonalt anti-fosfotyrosinantistoff (1:100, Santa Cruz) i 1 time. Bundet antistoff ble visualisert ifølge en standard protokoll for avidin-biotin-alkalisk fosfatasekompleksmetode (ABC kit, Vector Laboratories). ;Statistikk. Alle data er uttrykt som middel ± standardfeilmiddel - SFM. Enveis variansanalyse ble anvendt for å bestemme statiske signifikante forskjeller mellom grupper. Scheffe's F-test ble anvendt for å korrigere for multiple sammenligninger når statistiske signifikanser ble identifisert i variansanalysen. En sansynlighet på mindre enn 0,05 for null-hypotesen ble akseptert som indikasjon på en statistisk signifikant forskjell. ;Resultater ;Aktiverte neutrofiler bevirker slimstoffMUC5AC- syntese. Når neutrofiler pluss stimuli som aktiverer neutrofiler (IL-8, fMLP, TNFa) ble inkubert med NCI-H292-celler i 1 time, økte MUC5AC-proteinsyntesen signifikant i løpet av 24 timer, mens ikke-stimulerte neutrofiler (10<6>/ml), IL-8 alene eller fMLP alene ikke viste noen innvirkning på MUC5AC-syntesen; inkubasjon med TNFa alene bevirket en liten, ikke signifikant økning i MUC5 AC-syntesen. Når neutrofiler ble forinkubert i 1 time med TNFa, og deretter neutrofilene og deres supernatant ble separert, oppregulerte etterfølgende inkubasjon av supematanten i 1 time med NCI-H292-celler MUC5AC-genekspresjonen i løpet av 12 timer, og stimulerte farging med både Alcian blått/P AS og merking med et antistoff til MUC5AC-protein i løpet av 24 timer; hvilende NCI-H292-celler viste liten ekspresjon av MUC5AC-genet og små, flekkvis farging av både Alcian blått/P AS og MUC5AC-protein. MUC5AC-proteinsyntesen indusert av supematanten økte signifikant fra kontrollen; neutrofiler separert fra supematanten etter inkubasjon var uten virkning. Det ble konkludert at aktiverte neutrofiler hurtig utskiller et aktivt produksjon som bevirker MUC5 AC-syntesen. ;EGF- R- tyrosinkinaseinhibitorer hindrer MUC5AC- syntese indusert av supernatantfra aktiverte neutrofiler. På grunn av at EGF-R-ligander er kjent å bevirke MUC5 AC-syntese i NCI-H292-celler via aktivering av EGF-R-tyrosinkinase, ble rollen til EGF-R-aktivasjon i MUC5AC-syntese indusert av supematanten fra aktiverte neutrofiler under-søkt. Forbehandling av NCI-H292-celler med selektive EGF-R-tyrosinkinaseinhibitorer (BIBX1522, AG1478), forhindret den MUC5AC-proteinsyntese som vanlig ble indusert av supematanten fra aktiverte neutrofiler. En selektiv blodplateavledet vekstfaktorreseptorkinaseinhibitor (AG1295) og en negativ kontroll for tyrfostiner (Al) var uten virkning. Disse resultater impliserer aktivering av EGF-R-tyrosinkinase ved MUC5AC-syntese indusert av supematanten fra aktiverte neutrofiler. ;Rollen til EGF- R- ligander utskilt i supematanten fra aktiverte neutrofiler i MUC5AC-syntese. For å bestemme om aktivering av EGF-R-tyrosinkinase er avhengig av EGF-R-ligandene (EGF og TGFa), ble supematanten fra aktiverte neutrofiler forinkubert med nøytraliserende antistoffer til EGF-R-ligandene. Forbehandling av supematanten med enten anti-TGFa-antistoff eller anti-EGF-antistoff inhiberte ikke MUC5 AC-syntesen indusert ved supematenten fra aktiverte neutrofiler. Videre ble TGFa ikke påvist i supematenten. Således ble EGF-R-tyrosinfosforylering bevirket av supematanten fra aktiverte neutrofiler indusert ved hjelp av en mekanisme som er uavhengig av EGF-R-ligandene, EGF og TGFa. ;Sigarettrøk og fri oksygenradikaler bevirker MUC5AC- syntese. Sigarettrøk og fri oksygenradikaler, H2O2, oppregulert MUC5AC-genekspresjon i løpet av 12 timer, og likeledes TGFa. Tilsvarende økte alle stimuli MUC5AC-proteinsyntesen og mukøs glyko-konjugatproduksjon i løpet av 24 timer, idet dette er virkninger som opptrådte på en doseavhengig måte. Maksimum MUC5AC-syntese i respons til H2O2 var signifikant mindre nen responsen til TGFa. Forbehandling med AG1478 forhindret økningen i MUCSAC-proteinsyntesen indusert av alle stimuli, som indikerer at stimuli bevirker slimstoffsyntese ved aktivering av EGF-R-tyrosinkinase. MUC5AC-syntese ved super-natanten fra aktiverte neutrofiler, sigarettrøk og H2O2 ble signifikant inhibert ved forbehandling med fri radikalfjernende midler (DMSO og DMTU) og SOD, men MUC5AC-proteinsyntesen ved TGFa var upåvirket av DMSO eller SOD. ;Induksjon av tyrosinfosforylering av EGF- R ved supernatant av aktiverte neutrofiler og ved H2O2. Fordelingen av EGF-R-protein var tilsvarende i serumsultet kontroll og i alle stimulerte betingelser (supernatant av aktiverte neutrofiler, sigarettrøk, H2O2 eller TGFa). Total proteintyrosinfosforylering opptrådte i løpet av 15 minutter etter tilsetning av supematanten av aktiverte neutrofiler, sigarettrøk, H202 eller TGFa; den serumsulte-de kontroll viste ingen virkning. TGFa-indusert total proteintyrosinfosforylering var større enn virkningen av supematanten av aktiverte neutrofiler, sigarettrøk eller H2O2. For å bestemme om EGF-R var fosforylert, ble det utført immunoutfelling med anti-EGF-R-antistoff: supematanten av aktiverte neutrofiler, de oppløselige produkter fra sigarettrøk og H202 induserte alle EGF-R-spesifikk tyrosinfosforylering i løpet av 15 minutter, dette er en virkning som var lignende den virkning som bevirkes av TGFa. Forbehandling av NCI-H292-celler med AG1478 inhiberte EGF-R-tyrosinfosforylering ved alle stimuli. DMSO inhiberte supernatant-, sigarettrøk- og H202-indusert EGF-R-tyrosinfosforylering, men DMSO hadde ingen virkning på TGFa-indusert EGF-R-tyrosinfosforylering. ;De ovenstående resultater viser at neutrofilene bevirker slimstoff MUC5AC-syntese i NCI-H292-celler når de aktiveres med IL-8, fMLP eller TNFa. Videre, bevirket super-natanten som ble samlet 1 time etter inkubasjonen av neutrofiler med TNFa MUC5AC-syntese, en virkning som ble inhibert ved hjelp av selektive EGF-R-tyrosinkinaseinhibitorer. Inhibering av EGF-R-tyrosinkinase blokkerte fullstendig MUC5 AC-syntesen bevirket av supematanten av aktiverte neutrofiler; en ikke-EGF-R-tyrosinkinaseinhibitor, en selektiv blodplateavledet vekstfaktorreseptorkinaseinhibitor (AG1295) og en negativ kontroll for tyrfostiner (Al) var uten virkning, som impliserer EGF-R-tyrosinfosforylering som det signallerende mønster for MUC5 AC-syntese indusert ved supematanten av aktiverte neutrofiler. ;For ytterligere å analyse den mekanisme hvormed supernatanter av aktiverte neutrofiler induserer EGF-R-tyrosinfosforylering, ble både ligandavhengige og liganduavhengige EGF-R-mønstere undesøkt. Først, ble TGFa i supematanten av aktiverte neutrofiler målt og det ble funnet at supematanten ikke inneholdt målbare mengder av TGFa. Tidligere rapporter viste at neutrofiler bare inneholdt lave konsentrasjoner (2,5 pg/10<6> celler) av TGFa. Virkningen av supernatant fra aktiverte neutrofiler på MUC5AC-syntesen var like potent som virkningen av 1 ng TGFa, som var 400 ganger høyere enn den mengde TGFa som finnes i neutrofiler. For det andre, ble det utført blokkerende under-søkelser med nøytraliserende antistoffer av EGF-R-ligander: forbehandling med nøytra-liserende antistoffer til EGF og TGFa klarte ikke å inhibere MUC5 AC-syntesen bevirket av supematanten av aktiverte neutrofiler. Disse resultater antyder at neutrofil super-natantindusert MUC5AC-syntese ikke var forårsaket av sekresjon av EGF-R-ligander (TGFa og EGF) ved neutrofiler. Deretter ble det liganduavhengige mønster undersøkt: på grunn av at fri oksygenradikaler er kjent å frigis av neutrofiler under aktivering, og at de er kjent å bevirke transaktivering av EGF-R-tyrosinkinase i forskjellige, celler, ble det hypotetisert at frigivelse av fri oksygenradikaler av aktiverte neutrofiler bevirket EGF-R-tyrosinfosforylering og resulterende MUC5 AC-syntese i NCI-H292-celler. Midler for å fjerne fri radikaler (DMSO og DMTU) og SOD inhiberte MUC5AC-syntesen ved hjelp av supernatant av aktiverte neutrofiler. TNFa er rapportert å bevirke et oksidativt utbrudd i neutrofiler i suspensjon, med en maksimum respons i løpet av 1 time; de foreliggende resultater viser et lignende tidsforløp. ;I den foreliggende undersøkelse, bevirket eksogent H2O2, et hovedprodukt frigitt fra neutrofiler under oksidativt utbrudd, MUC5AC-syntese i NCI-H292-celler. Den mak-simale respons overfor H2O2 ved MUC5 AC-syntesen var imidlertid bare halvdelen av responsen til TGFa. Et lignende funn ved den foreliggende undersøkelse er det faktum at sigarettrøk alene bevirket MUC5 AC-syntese. Dette antyder at sigarettrøk kunne bevirke MUC5AC-syntese in vivo både ved direkte stimulering og ved indirekte stimulering bevirket ved tilveiebringelse av neutrofiler. De nøyaktige molekyler i sigarettrøk som bevirker MUC5 AC-syntese er fremdeles uklare. Sigarettrøk har vært vist å inne-holde mange produkter (f.eks. nikotin, tjære, akrolein og oksidanter). I de foreliggende forsøk, inhiberte DMSO og SOD delvis MUC5 AC-syntesen indusert av sigarettrøk. Oksidantstress kan således være en mekanisme som frembringer denne respons. Det faktum at sigarettrøkindusert MUC5AC-syntese var fullstendig blokkert av EGF-R-tyrosinkinaseinhibitorer indikerer at EGF-R-aktivering spiller en prinsipal rolle ved si-garettrøkindusert MUC5 AC-syntesen. ;I luftveissykdommer, er neutrofil luftveisinflammasjon et felles trekk og neutrofiler rekrutteres og aktiveres av cytokiner og av sigarettrøk. De foreliggende undersøkelser viser at rekrutterte neutrofiler og sigarettrøk også virker som regulatorer for epitelcelledifferensiering som resulterer i induksjon av slimstoffproduserende celler i luftveier. Mer viktig, vil inhibering av EGF-R-aktivering være nyttig som terapi ved hypersekretoriske luftveissykdommer. ;Eksempel 3 ;Skade på luftveisepitelet bevirker slimcellemetaplasi ;Det ble hypotetisert at agaroseplugger instillert i luftveier ville bero kronisk i bronkiene uten å tilstoppe dem, og at iboende plugger ville bevirke inflammasjon som resulterte i slimcellemetaplasi. Det er vist at agaroseplugger induserer markert lokal produksjon av slimceller, som vist ved hjelp av Alcian blått/PAS-positiv fargin og mucin MUC5AC-genekspresjon, assosiert med lokal rekruttering av inflammatoriske celler. Resultatene impliserer EGF-R-aktivering i pluggindusert slimcellemetaplasi. ;METODER ;Dyr. Protokollen for dyreforsøkene var godkjent av The Committee on Animal Research of the University of California, San Francisco. Spesifikke patogenfrie, F344 hannrotter (230 til 250 g kroppsvekt; Simonsen Lab., Gilroy, CA) ble anvendt. Rottene befant seg i patogenfri "BioClean" bur med miljømessig kontrollerte hetter med laminær strømning; dyrene hadde fri adgang til steril føde og vann. ;Medikamenter. Medikamenter fra de følgende kilder ble brukt: cyklofosfamid (Sigma, ;St. Louis, MO), metoheksitalnatrium (Brevital, Jones Medical Industries, Inc., St. Louis, MO), pentobarbitalnatrium (Nembutal, Abbot Lab., North Chicago, IL); BIBX1522, en selektiv inhibitor for EGF-R-tyrosinkinase (elskverdig tilveiebragt av Boehringer Ingelheim, Inc., Ingelheim, Tyskland) ble oppløst i den følgende oppløsning: 2 ml polyety-lenglykol 400 (Sigma, St. Louis, MO), 1 ml 0,1N HC1, og 3 ml 2% mannitoloppløsning i vann (pH 7,0). NPC 15669 (en inhibitor av leukocytmotilitet), ble elskverdig levert av Scios Nova, Inc., Moutain View, CA. ;Agaroseplugger. Agaroseplugger (0,7-0,8 mm diameter) ble fremstilt med 4% agarose type II medium EEO (Sigma, St. Louis, MO) i steril fosfatbufret saltløsning (PBS). For å synliggjøre agarosepluggene i vev ble 3% suspensjon Monastral blått B (Sigma, St. Louis, MO) tilsatt etter smelting av agarosen ved 50°C. ;Forsøksprotokoll. Patogenfrie rotter ble undersøkt, på grunn av de normalt har færre slimceller i luftveiene. Dyrene ble bedøvet med metoheksitalnatrium (Brevital, 25 mg/kg, i.p.). Trakea ble avdekket aseptisk med et midtlinjecervikalt innsnitt og agaroseplugger ble instillert i en bronkie via en "Angiocath" med størrelse 20 (Becton Dikin-son, Sandy, UT) forbundet til polyetylenslange (PE 90, indre diameter 0,86 mm og ytre diameter 1,27 mm, Clay Adams, Parsippany, NY) tredd inn i innsnittet i trakea. Poly-etylenslangen var bøyd i en 30° vinkel for å tillate selektiv instillasjon i den høyre bronkie. Etter instillasjon ble snittet lukket med en sutur. ;For å bedømme rollen av EGF-R på agarosepluggindusert slimcellemetaplasi ble dyrene behandlet med BIBX1522 (80 mg/kg, i.p.) 1 time før instillasjon av agarosepluggene og gjentatt daglig (40 mg/kg, i.p., bid). Dyrene ble avlivet 24,48 eller 72 timer etter instillasjon av agarosepluggene. ;For å bedømme rollen til TNFa i agarosepluggindusert slimcellemetaplasi ble dyrene behandlet med et TNFa nøytraliserende antistoff (Genzyme, Boston, MA). Den første behandling (100 ul i 0,2 ml saltløsning, i.p.) ble gitt 1 time før instillasjonen av agaroseplugger, og i.p. injeksjoner ble gjentatt daglig. I tillegg ble det infusert TNFa nøytra-liserede antistoff (10 (il/time) via en osmotisk minipumpe (Alzet 2ML1, Alza Corp., Palo Alto, CA) implantert subkutant. ;For å studere virkningen av neutrofiler på agarosepluggindusert slimcellemetaplasi ble rotter forbehandlet med cyklofosfamid (en inhibitor av benmargleukocytter) eller med en kombinasjon av cyklofosfatmid pluss NPC 15669. Cyklofosfamid (100 mg/kg, i.p.) ble tilført 5 dager før instillasjon av agaroseplugger og en andre injeksjon av cyklofosfatmid (50 mg/kg, i.p.) ble tilført 1 dag før instillasjon av pluggene. I studier med NPC 15669, ble medikamentet (10 mg/kg, i.p.) injisert 1 time før instillasjon av agaroseplugger og deretter daglig i 3 dager deretter. ;Alle medikamenter (BIBX1522, TNFa-nøytraliserende antistoff, cyklofosfamid og NPC 15669) ble tilført i.p. 1 time før instillasjon av agaroseplugger og doser ble gjentatt daglig i 3 dager. ;Vevpreparasjon. Ved forskjellige tidspunkter etter agaroseplugginstillasjon ble rotter bedøvet med natriumpentobarbital (65 mg/kg, i.p.), den systemiske sirkulasjonen ble ;perfusert med 1% paraformaldehyd i dietylpyrokarbonatbehandlet PBS ved et trykk på 120 mmHg. Den høyre lunge ble tatt ut og høyre kaudale lapp ble anvendt for histologi. For fryseseksjoner ble vev fjernet og anbragt i 4% paraformaldehyd i 1 time og deretter anbragt på nytt i 30% sukrose for kryobeskyttelse over natten. Vevene ble innleiret i ;O.C.T.-forbindelse (Sakura Finetek U.S.A., Inc., Torrance, CA). For metakrylatsnitt ble vevene anbragt i 4% paraformaldehyd i 24 timer og deretter dehydratisert med graderte konsentrasjoner av etanol og innleiret i metakrylat JB-4 (Polysciences, Inc., Warrington, PA). Vevsnitt (4 um tykke) ble farget med Alcian blått/P AS og motfarget med hematoksylin. ;Morfometrisk analyse av bronkialt epitel. Prosentandelen av Alcian blått/PAS-farget areal av mukøse glykokonjugater i epitelet ble bestemt ved bruk av et halvautomatisk bildeanalysesystem ifølge tidligere publiserte metoder. Arealet av epitel og Alcian blått/P AS-fargede mukøse konjugater inne i epitelet ble manuelt omskrevet og analysert ved bruk av NUH Image-programmet (utviklet ved The U.S. National Institute of Health og som kan fås fra Internet ved hjelp av anonym FTP eller fra en diskett fra The National Technical Information Service, Springfield, Virginia; delnr. PB95-500195GEI). Data er uttrykt som prosentandel av det totale epitelareal opptatt av Alcian blått/PAS-fargingen. For å evaluere mukussekresjon semikvantitativt, ble prosentandelen av lengden av epiteloverflate opptatt av Alcian blått/PAS-positiv farging bestemt ved å beregne den lengde som farget positivt som et forhold til den totale lengde. Prosentandelen av avdekket epitel ble bestemt ved å beregne forholdet mellom lengden av avdekket epitel til den totale epitellengde. ;Identifikasjon av celletyper i metakrylatsnitt og celleanalyse. Det totale antall epitelceller ble bestemt ved å telle epitelcellekjerner over 2 mm av basal lamina med en oljened-dykket objektivlinse (x1000 forstørring). Den lineære lengde av basal lamina under hver analysert region av epitel ble bestemt ved å trekke opp konturen av det digitalisert bildet av basal lamina. Epitelcellene ble identifisert som tidligere beskrevet. Kort sagt ble basalceller identifisert som små flattrykte celler med en stor kjerne, lokalisert umiddelbart over basal lamina, men som ikke nådde frem til luftveislumen. Cytoplasmaet ble mørk-farget og Alcian blå eller PAS-positive granuler var ikke tilstede. Cilierte celler ble igj enkj ent av deres cilierte kanter, lett farget cytoplasma, og store runde kjerner. Ikke-granulerte sekretoriske celler hadde søyleform og strakk seg fra det bronkiale lumen til basal lamina. Etter intrabronkial instillasjon av agaroseplugger ble det dannet "utviklende" slimceller (for-slimceller). Disse celler viste Alcian blått/P AS-positiv farging, granulene var små, og cellene var ikke pakket med granuler; de inneholdt mindre mukøs-fargede arealer (<l/3 høyde av epitel fra basalmembran til luminal overflate) eller spar-somt og lett Alcian blått/P AS-fargede små granuler. Celler av ubestemmelig type er definert som celleprofiler som mangler tilstrekkelige cytoplasmiske karakteristikker for riktig kategorisering. ;Immunohistokjemisk lokalisering av EGF- R. Nærværet av EGF-R ble bestemt ved immunohistokjemisk lokalisering, ved bruk av et monoklonalt muse antistoff til EGF-R (Calbiochem, San Diego, CA). Tidligere fremstilt 4 um frosne snitt ble etterfiksert med 4% paraformaldehyd, behandlet med 0,3% I^CVmetanol. Vevene ble inkubert med EGF-R-antistoff (1:250 fortynning). Biotinylert heste anti-muse IgG (1:200; Vector Lab., Burlingame, CA), etterfulgt av streptavidinperoksidasekompleks (ABC kit, Vector Lab., Burlingame, CA) ble anvendt for å visualisere antigen-antistoffkomplekser farget med 3,3'-diaminobenzidintetrahydroklorid (Sigma, St. Louis, MO). Negative kontroll-objektglass ble inkubert med enten det primære sekundære antistoff utelatt og erstattet med BPS. ;In situ hybridisering. [35S] -merkede riboprober ble generert fra et plasmid inneholdende et 320 bp cDNA-fragment av rotte MUC5AC elskverdig fremskaffet av Dr. Carol Bas-baum. Snitt ble hybridisert med [<35>S]-merkede RNA-probeer (2 500-3 000 cpm/ul hyb-ridiseringsbuffer) og vasket under strenge betingelser, inklusiv behandling med RNase A. Etter autoradiografi i 7-21 dager, ble den fotografiske emulsjon fremkalt og objektglassene ble farget med hematoksylin. ;Telling av neutrofiler i luftveisepitel. Evaluering av neutrofil innstrømning i bronkier ble utført ved farging av neutrofiler med 3,3'-diaminobenzidintetrahydroklorid, og antallet neutrofiler ble tellt i luftveislumen og i epitel; resultater ble uttrykt som antall fargede celler pr. mm lengde av basal lamina. ;Bronkoalveolar vasking ( BAL). For å bedømme differerende celletall i hver gruppe av ;dyr, ble lunger vasket fem ganger med 3 ml delmengder av sterilt PBS, vaskeløsningene ble slått sammen og volumet ble målt. Celler i BAL ble samlet ved rotering av vaskefluidet ved 1 000 opm. i 10 min. 10 ul av en cellesuspensjon ble så tellt med et hematocy-tometer for å bestemme celletallene i BAL-fluid. Differerende celletall ble oppnådd på cytoroterte preparater farget med Diff-Quik (American Scientific Products, McGaw Park, IL). Differerende celletall ble oppnådd ved prøvetagning av minst 200 celler på hvert cytorotert objektglass. ;Statistisk analyse. Data er uttrykt som middel ± standard middelfeil. For statistisk analyse, ble den toveis eller enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Student t-testen anvendt etter behov. En sansynlighet på mindre enn 0,05 ble betraktet som en statistisk signifikant forskjell. ;Resultater ;Virkning på luftveis- epitelstruktur: Slimcellemetaplasi. For å bestemme om agaroseplugger påvirker strukturen i luftveisepitel ble agaroseplugger instillert i høyre bronkie i 5 patogenfrie rotter. I kontrolldyr inneholdt bronkieepitelet få slimceller. Etter lokal instillasjon av agaroseplugger viste imidlertid Alcian blått/P AS-farging en tidsavhengig økning i slimcelleareal, som var påviselig så tidlig som 24 timer og var størst 72 timer etter instillasjon. Ved 24 timer produserte agaroseplugger signifikante økninger i antallet av for-slimceller og slimceller, og ved 48 timer ble det funnet mer fullt utviklede slimceller (tabell 1). Ved 72 timer økte agaroseplugger antallet av slimceller (P < 0,01); antallet av basalceller og cilierte celler var ikke endret (P > 0,05). Det totale antall epiteliale celler pr. mm basal lamina 72 timer etter instillasjon var litt, men ikke signifikant øket (P > 0,05, tabell 1); høyden av epitelet (målt fra basalmembran til luminal overflate av epitel) var økt fra 16,0 ± 1,2 um i kontrolluftveiene til 38,1 ± 9,1 um ved 72 timer etter instillasjon av plugger (n = 5, P < 0,01). ;I luftveislumen av kontrolldyrene var det ingen Alcian blått/P AS-farging. Inntil agarosepluggene ble det imidlertid sett positiv farging i lumen, som indikerte at sekresjon av mukøse glykokonjugater hadde forekommet. I luftveier med agaroseplugger økte farging tidsavhengig. Prosentandelen av den totale lengde av epitel okkupert av Alcian blått/P AS-positiv farging i luftveier inntil pluggene økte fra 0,1 ± 0,1% i kontrolldyr til 4,7 ± 1,4%, 13,3 ± 0,7% og til 19,1 ± 0,7% ved 24 timer, 48 timer og 72 timer (n = 5). Videre avdekket agarosepluggene epitelet i tilstoppede bronkier med 13,5 ± 2,3%, 6,9 ± 2,4%, og 5,1 ± 1,5% av det totale areal ved hhv. 24,48 og 72 timer, (n = 5). ;Virkning av agaroseplugger på slimstoffgenekspresjon. I kontrollrotter var det intet påvisbart signal med antisenseproben av MUC5AC i bronkier (n = 4 pr. gruppe). I bronkier hvor agaroseplugger var instillert, var det et signal for MUC5 AC som økte tidsavhengig fra 24 til 72 timer (n = 4). MUC5AC-genekspresjon ble funnet preferert i celler som farget positivt med Alcian blått/P AS. Ingen signaler ble påvist i andre celletyper (f.eks. glatt muskelvev, bindevev). Snitt undersøkt med MUC5 AC-senseprober viste ingen ekspresjon. ;Virkning av agaroseplugger på EGF- R- ekspresjon i luftsveisepitel. I kontrolldyr, viste immunomerking med et antistoff til EGF-R sparsom merking i epitel. Etter instillasjon av agaroseplugger viste imidlertid epitel inntil agarosepluggene EGF-R-positiv farging i celler som farget positivt med Alcian blått/P AS. Merkingsmønsteret for EGF-R var pa-rallelt til merkingen for MUC5AC og AB/PAS. For-slimceller, slimceller og ikke-granulerte sekretoriske celler var immunopositive for EGF-R. Cilierte celler viste ingen immunoreaktivitet. I luftveier som ikke var tilstoppet med agaroseplugger viste epitelet lite merking for EGF-R og viste seg lignende som for merking i kontrolldyr. ;Virkning av EGF- R- tyrosinkinaseinhibitor på slimcellemetaplasi og på slimst<q>ffge-nekspresjon. I de foreliggende undersøkelser resulterte instillasjon av agaroseplugger i ekspresjon av EGF-R i de celler som produserte slimstoffer. EGF-R er et medlem av klassen av tyrosinkinasereseptorer. Således, når EGF-R-ligander (EGF eller TGFa) binder til EGF-R, aktiveres således en spesifikk EGF-R-tyrosinkinases. Derfor, for å teste den hypotese at EGF-R-aktivering induserer ekspresjon av MUC5AC-genet og av mu-køse glykokonjugater etter instillasjon av agaroseplugger, ble en EGF-R-tyrosinkinaseinhibitor (BIBX1522) injiserte intraperitonealt i rotter. BIBX1522 inhiberte markert agarosepluggindusert Alcian blått/PAS-farget areal av epitel ved 24,48 og 72 timer. Den inhiberte også fullstendig ekspresjonen av MUC5AC-genet ved 72 timer etter plugginstillasjon. ;Virkning av TNFa- nøytraliserende antistoff på slimcellemetaplasi og på EGF- R-proteinekspresjon. Det ble hypotetisert at TNFa frigis under inflammasjonen bevirket av agaroseplugger. Virkningen av forbehandling av rotter med et TNFa-nøytraliserende antistoff på agarosepluggindusert slimcellemetaplasi ble derfor undersøkt: i dyr forbehandlet med det TNFa-nøytraliserede antistoff (n = 5), stimulerte agaroseplugger ikke lenger EGF-R-proteinekspresjon eller produksjon av Alcian blått/PAS-positivt fargede celler (slimceller). ;Inflammatoriske cellerekruttering av agaroseplugger. Det ble bemerket at agaroseplugger bevirker epitelskade og inflammatoriske celleinfiltrasjon. Forskjellige inflammatoriske celler kan produsere både TNFa-ligander og EGF-R-ligander. Både EGF-R og dets ligander er involvert i EGF-R-kaskaden som fører til slimcellemetaplasi. Rollen til leukocytter og makrofager ved agaroseplugginduserte virkninger ble evaluert på to måter. Først, ble cellene undersøkt i bronkoalveolar vaskefluid: I kontrollrotter var makrofager de overveiende celler som ble gjenvunnet (n = 5; figur 4, kontroll). Etter instillasjon av agaroseplugger, økte antallet av makrofager (P < 0,05), og signifikante antall av neutrofiler (P < 0,01) viste seg i vaskefluidet. Antallet av lymfocytter var uendret. ;Infiltrerende celler ble også evaluert i vevssnitt: luftveier uten agaroseplugger inneholdt få neutrofiler, men luftveier inneholdende plugger viste nærvær av neutrofiler, både i epitel og i lumen. Antallet av neutrofiler i luftveislumen var 0,2 ± 0,2,42,4 ±7,1,40,7 7,7 og 20,1 ± 7,2/mm basal lamina i kontrolluftveiene og hhv. ved 24,48 og 72 timer etter instillasjon av plugger (P < 0,05, n = 5). I tillegg, var antallet neutrofiler i luftveisepitel hhv. 1,3 ± 0,4,15,6 ± 2,6,14,9 ± 1,4 og 14,8 ± 2,6/mm basal lamina i kontroll og ved 24, 48 og 72 timer etter instillasjon av plugger, respektivt (P < 0,01, n = 5). ;Virkning av cyklofosfamid på neutrofilrekruttering, slimcellemetaplasi og EGF- R-proteinekspresjon. I cyklofosfamidbehandlede rotter ble blodneutrofiler deplettert (neut-rofiltallet i venøst blod etter cyklofosfamid, 1,8 ± 0,5%, n = 5) og pluggindusert neutrofil rekruttering i BAL var inhibert. Antallet av neutrofiler i luftveislumen (2,6 ± 0,3/mm basal lamina) og i epitel (0,8 ± 0,2/mm) minsket også signifikant ved 24 timer. Cyklofosfamid inhiberte også agarosepluggindusert slimcellemetaplasi og ekspresjonen av EGF-R-protein. Når leumedinet, NPC 15669 ble tilsatt til cyklofosfamidet, var inhibering av agarosepluggindusert slimcellemetaplasi lignende virkningen av cyklofosfamid alene. Disse resultater impliserer neutrofiler i pluggindusert slimcellemetaplasi. ;Drøftelse ;I en foreliggende undersøkelse, ble virkningen av instillasjon av agaroseplugger på slimcellemetaplasi i luftveiene i patogenfri rotter, som har meget få slimceller i kontrolltilstanden, undersøkt. Epitelceller i bronkier i kontrolldyr og bronkier uten agaroseplugger (kontrollunger) farget alle negativt med Alcian blått/P AS. Instillasjon av agaroseplugger resulterte i en dyr, tidsavhengig økning i slimcelleareal i bronkialt epitel inntil de instillerte plugger, som var påvisbare i løpet av 24 timer og var størst omtrent 72 timer etter instillasjon. Luftveiene inntil de pluggede luftveier viste også positivt med Alcian blått/P AS. Det totale celletall og antallet av basalceller og cilierte celler endret seg ikke, men antallet av slimceller økte, og antallet av ikke-granulerte sekretoriske celler minsket tidsavhengig etter agaroseplugginstillasjon (tabell 2). Disse resultater antyder at slimcellemetaplasien var resultatet av omdannelse av ikke-granulerte sekretoriske celler til slimceller. ;Celler ble analysert som beskrevet i "Metoder"; n = 5 i hver gruppe. Karakterisering ble lettet ved hjelp av Alcian blått/PAS-faring (som farger mukøse glykokonjugater). Kontrolluftveier inneholdt få for-slimceller og slimceller. Etter instillasjon av agaroseplugger, var det en tidsavhengig (24,48, 72 timer) økning i antallet av for-slimceller og slimceller og en minsking i antallet av ikke-granulerte sekretoriske celler sammenlignet med kontrolldyrene. ;<*> Data er midlere ± standardfeil-middel, antall celler/mm basal lamina.

+ P < 0,05 sammenlignet med kontroll.

§ P < 0,01 sammenlignet med kontroll.

" Celler mangler tilstrekkelige cytoplasmiske karakteristikker for kategorisering.

Rotteluftveisslimceller er rapportert å uttrykke MUC5 AC-genet. I de foreliggende un-dersøkelser, uttrykte kontrollbronkier ikke MUC5 AC-genet, men luftveier tilstoppet med plugger eller inntil pluggene, som farget positivt med Alcian blått/P AS, uttrykte MUC5 AC-genet, som antyder at MUC5 AC-genet er involvert i agarosepluggindusert mukusproduksjon. Disse resultater indikerer at agaroseplugger induserer ekspresjonen av slimstoffgener og produksjonen av mukøse glykokonjugater i selekterte celler i rotte-luftveier.

Mekanismen for slimcellemetaplasi indusert ved agaroseplugger ble undersøkt. EGF-R blir normalt ikke uttrykt i luftveisepitel i patogenfrie rotter, men induseres av TNFa. I nærvær av EGF-R i epitel, resulterer instillasjon av EGF-R-ligander (EGF eller TGFa) i en økning i slimstoffgenet og proteinekspresjon. En selektiv inhibitor av EGF-R-tyrosinkinase (BIBX1522) inhiberer fullstendig disse responser, noe som impliserer EGF-R-signallering ved slimcellemetaplasi. Virkningen av BIBX1522 på agarosepluggindusert slimcellemetaplasi ble bestemt: BTJBX1522 inhiberte agarosepluggindusert produksjon av mukøse glykokonjugater og MUC5AC-genekspresjon. Disse resultater impliserer en EGF-R-kaskade i agarosepluggindusert slimcellemetaplasi.

De mekanismer hvorved EGF-R-kaskade bevirker slimcellemetaplasi med agaroseplugger ble undersøkt. Først ble ekspresjonen av EGF-R-protein i bronkialepitel studert. Kontrolluftveier farget alle negativt for EGF-R, men luftveier inneholdede agaroseplugger viste selektiv, tidsavhengig positiv farging for EGF-R. Positivt fargede celler inkluderte ikke-granulerte sekretoriske celler, forslimceller og slimceller. Således induserte agaroseplugger EGF-R-proteinekspresjon. Rotter som var forbehandlet med et nøytrali-serende antistoff til TNFa utviklet ikke agarosepluggindusert slimcellemetaplasi, som impliserte TNFa i agarosepluggindusert EGF-R-ekspresjon.

Cyklofosfamid, et medikament som selektivt undertrykker leukocytproduksjon, forhindret neutrofil rekruttering i luftveisvaskefluid og inn i luftveisepitel etter instillasjonen av agaroseplugger og hindret også agarosepluggindusert slimcellemetaplasi. Makrofager var også økt etter innføringen av agaroseplugger, men cyklofosfamid inhiberte ikke makrofagrekruttering. Disse resultater impliserer neutrofiler i agarosepluggindusert slimcellemetaplasi. Det faktum at cyklofosfamid også nedsatte EGF-R-proteinekspresjon etter agaroseplugging, antydet at neutrofiler bidrar idet minste delvis til EGF-R-ekspresj onen i denne inflammatoriske tilstand.

Neutrofiler er også i stand til å produsere EGF-R-ligandene, EGF og TGFa. I tillegg er epitelceller kilder for EGF-R-ligander, og det var en slående avdekking av epitel inntil agarosepluggene. Epitelet kunne således være en viktig potensiell kilde for både TNFa-ligander og EGF-R-ligander.

Det er rimelig å anta at den effektive stimulus av agarosepluggen er relatert til bevegel-sen av pluggene under pusting, med etterfølgende epitelabrasjon. Mekanisk skade på luftveisepitel er blitt rapportert å bevirke hypersekresjon. Disse tidligere undersøkelser gir tiltro til den hypotese at mekaniske traumer på luftveisepitelet fører til hypersekresjon. Orotrakeal intubasjon er rapportert å resultere i rikelig mukussekresjon i hes-ter. Kronisk intubasjon i pasienter kunne bevirke mukøs hypersekresjon og kunne være årsak til mukøs tilstopping. Inhibitorer av EGF-R-tyrosinkinase kunne tjene til å hindre mukøs hypersekresjon etter trakeal intubasjon.

Epitelskade er et vanlig funn i undersøkelser av pasienter med selv mild astma, og ska-den er økende relatert til forværring av de kliniske symptomer. Epitelskade produsert ved den allergiske respons kan indusere EGF-R-aktivering, som resulterer i unormal slimcelleproduksjon. Data presentert i det foregående, impliserer EGF-R-aktivering i en forskjellig respons, spesifikt involverende slimcellemetaplasi. Mekanisk epitelskade og epitelskade i astma kan involvere en lignende (EGF-R) kaskade, som resulterer i unormal vekst av epiteliale sekretoriske celler. Dette tilveiebringer en mekanisme for den hypersekresjon som opptrer i fatale tilfeller av akutt astma.

Eksempel 4

Regranulering av slimceller ved hjelp av EGF- reseptorer

Degranulering av slimceller i rotte nasal respiratorisk epitel ble indusert ved intranasal inhallasjon av fMLP. Signifikant degranulering ble indusert i det nasale septale epitel 4 timer etter intranasal inhallasjon av fMLP (IO"<7> M). Slimcelleregranulering opptrådte ved 48 timer etter inhallasjon. I kontrolltilstanden ble MUC5AC-protein uttrykt i slimcellene, men EGF-R-protein ble ikke uttrykt. Både EGF-R og MUC5 AC-slimstoffgen og protein var fraværende i kontrollepitel men var uttrykt signifikant 48 timer etter inhallasjon. Forbehandling med en EGF-R-tyrosinkinaseinhibitor, BIBX1522, inhiberte slimstoff MUC5AC-gen og proteinekspresjon etter fMLP-indusert slimcelledegranulering. Disse resultater indikerer at EGF-R-ekspresjon og aktivering er involvert ved regranulering av slimceller i rotte nasal epitel.

METODER

Dyr. Dyreforsøksprotokollen var godkjent av The Committee on Animal Research of the University of California, San Francisco. Spesifikke patogenfrie hannrotter F344 (200 til 230 g kroppsvekt; Simonsen Lab, Gilroy, CA) ble anvendt. Dyrene ble holdt i patogenfri "BioClean"-bur med miljømessig kontrollerte avtrekkshetter med laminær strømning; dyrene hadde fri adgang til steril føde og vann.

Nasal vevpreparering. Ved forskjellige tidspunkter etter inhallasjon ble rotter bedøvet med pentobarbital natrium (65 mg/kg, i.p.). Hjertet av dyrene ble eksponert, en butten-det nål ble stukket inn fra toppen av den venstre ventrikkel inn i den stigende aorta, og den systemiske sirkulasjon ble perfusert med 1% paraformaldehyd. Et innsnitt i høyre atrium ga et utløp for fikseringsmidlet. Øynene, underkjever, hud og muskulatur ble fjernet og hodet ble neddykket i et stort volum av det samme fikseringsmiddel i 24 timer. Etter fiksering, ble hodet dekalsifisert med "Surgipath" (Decalcifier II, Surgical Medical Industries, Inc., Richmond, IL) i 4 til 5 dager og renset i fosfatbufret saltløs-ning. Nesehulen ble kuttet på tvers i nivå med den incisive papill på den nasale gane. Den frontale vevblokk ble innleiret i glykolmetakrylat (JB 4 Plus, Polyscience, Inc., Warrington, PA) eller i OCT compound (Sakura Finetek, U.S.A., Inc., Torrance, CA) for fryste seksjoner. 5 um tykke seksjoner ble kuttet fra forsiden av glykolmetakryla-tinnleirede blokker og farget enten med Alcian blått (pH 2,5)/perjodsyre-Schiff (AB/PAS) for å vise sure og nøytrale glykokonjugater, eller 3,3'-diaminobenzidin (Sigma Chemical, St. Louis, MO) for å visualisere leukocytter som hadde migrert inn i epitelet. 5 um tykke seksjoner ble kuttet fra forsiden av fryseinnleirede blokker og farget med AB/PAS eller anvendt for immunomerking av EGF-R og MUC5AC.

Telling av neutrofiler i nasalt epitel. Neutrofiler ble tellt i kraftig forstørrede arealer av epitellaget farget med 3,3'-diaminobenzidin ved forstørrelse x400. Antallet av neutrofiler inne i det nasale sepale epitel (fra basalmembranen til celletoppene) ble bestemt ved telling av antallet nukleærprofiler pr. enhet basal laminalengde.

Kvantifisering av slimcelledegranulering og regranulering. For å bedømme slimcelledegranulering og regranulering ble volumdensiteten av Alcian blått/P AS-fargede mukosubstanser på det mukosale overflateepitel målt ved bruk av et semiautomatisk avbil-dingssystem ifølge en tidligere publisert metode. De fargede objektglass ble undersøkt med et Axioplan "mikroskop" (Zeiss, Inc.), som var forbundet til en videokamerakont-rollenhet (DXC7550MD: Sony Corp. of America, Park Ridge, NJ). Bilder av nasalt epitel ble tatt opp i kraftige felt med en fasekontrastlinse ved X400, ved bruk av et IMAXX videosystem (PDI, Redmond, WA). Det intracellulære slimstoff i overflateepitelsekreto-riske celler viste seg som ovalformede, purpurfargede granuler av forskjellige størrelser. Det Alcian blått/PAS-positivt fargede areal og totalt epitelareal ble målt og data ble uttrykt som prosentandel av Alcian blått/PAS-areal i forhold til totalt areal. Analysen ble utført på en Macintosh 9500/120 regnemaskin (Apple Computer, Inc., Cupertino, CA), ved bruk av det offisielt tilgjengelige NEH Image-program.

Immunolokalisering av EGF- R og MUC5AC- protein. Fryste snitt fra de paraformalde-hydfikserte nasalvev ble behandlet med 3% H202/metanol for å blokkere endogent per-oksid og ble inkubert med et muse monoklonalt antistoff til EGF-R (Calbiochem, San Diego, CA), eller MUC5AC (NeoMarkers Inc., Fremont, CA) i 1 time ved en fortynning på 1:100. hnmunoreaktivt EGF-R eller MUC5AC ble visualisert ved hjelp av "Vectastain Elite ABC"-settet (Vector Lab., Inc., Burlingame, CA) ved bruk av 3,3'-diaminobenzidin tetrahydroklorid som et kromogen. Kontroller inkluderte erstatning av primært eller sekundært antistoff med PBS.

Metoder. Patogenfrie rotter, som normalt har mange slimceller i det nasale septale epitel ble undersøkt. For å bestemme virkningen av aerosolisert fMLP på slimcelledegranulering og på neutrofil vandring inn i nasalt mukosaepitel ble dyrene bedøvet med natriumpentobarbital (65 mg/kg, i.p.) og de mottok N-formyl-metionyl-leucyl-fenylalanin (fMLP; IO"<5> M, Sigma, St. Louis, MO) i pyrogenfri saltløsning intranasalt ved hjelp av aerosol i 5 minutter. Aerosoleksponering ble fullført ved å ventillere dyrene med en ultralyd-nebulisator (PulmoSonic, DeVilbiss Co., Somerset, PA) som genererte en aerosoltåke i en takt på 0,3 ml/min. Tilsvarende ble kontrolldyr tilført saltløsningsaerosol alene intranasalt.

For å studere regranulering av nasale slimceller etter inhallasjon av fMLP-aerosol, ble rottene avlivet 48 timer etter intranasal tilførsel av fMLP.

For å bedømme virkningen av EGF-R-tyrosinkinaseaktivering på slimcelleregranulering ble dyrene forbehandlet intraperitonealt med en EGF-R-tyrosinkinaseinhibitor (BIBX1522,15 mg/kg, elskverdig gitt av Boehringer Ingelheim Inc., Ingelheim, Tyskland) 30 minutter før inhallasjonen av fMLP og dette ble gjentatt to ganger daglig.

Statistikk. Alle data er uttrykt som middelverdi ± standardfeilmiddel. En veis ANOVA eller Student t-test ble anvendt for hver forsøksgruppe. En sansynlighet på mindre enn 0,05 ble betraktet som en statistisk signifikant forskjell.

RESULTATER

Virkning av slimcelledegranulering ved fMLP på nasal epitelstruktur. I kontrolltilstanden inneholdt det nasale septale epitel et signifikant areal av AB/P AS-fargede slimceller, men luminaloverflaten var ufarget. Immunofarging for slimstoff MUC5AC-protein tilsvarte arealet av AB/P AS-farging, men in situ hybridisering viste liten eller ingen MUC5AC-genekspresjon. Immunohistokjemisk farging for EGF-R-protein var negativ. Disse resultater indikerer at kontrollrotte nasalt epitel inneholder intakte slimceller inneholdende MUC5AC-protein i fravær av ekspresjon av slimstoffgenet. Fraværet av luminal farging antyder at degranulering (sekresjon) av slimstoffer ikke foregikk.

Det ble hypotetisk antatt at ikke-stimulert rottenasalt epitel inneholder "stabile", ikke-degranulerende slimceller inneholdende slimstoffproteiner. Neutrofile kjemoattraktantmidler (f.eks. fMLP) er vist å rekruttere neutrofiler inn i luftveisepitelet, hvor de bevirker GC-degranulering via en elastaseavhengig prosess. For å undersøke virkningen av GC-degranulering, ble en aerosol av det neutrofile kjemoattraktive middel, fMLP (IO"<7 >M) tilført intranasalt i 5 minutter. I rotter avlivet 4 timer etter fMLP, var det AB/P AS-fargede areal og arealet av MUC5 AC-positiv immunofarging markert nedsatt og neutrofilrekruttering inn i det nasale epitel forekom. AB/P AS-farging var fremtredende i den nasale luftveisluminale overflate, som bekreftet at GC-degranulering hadde funnet sted. Ved 4 timer etter fMLP, var imidlertid MUC5AC-genekspresjonen uendret.

I rotter avlivet 48 timer etter fMLP, med immunohistokjemisk merking med et EGF-R-antistoff positivt farget for EGF-R i for-slimcleler og slimceller returnerte arealet av

AB/PAS- og MUC5AC-immunpositiv farging til nivået tilstede i kontrolltilstanden, noe som indikerte at regranulering av nasal GC hadde skjedd. Ved dette tidspunkt, var neutrofil rekruttering ikke lenger tilstede; MUC5AC-genekspresjon var synlig i arealet opptatt av GC, noe som indikerte at GC-regranulering var assosiert med økt slimstoffgenekspresjon.

Rollen av EGF- R- tyrosinkinasefosforylering i slimcelleregranulering. Tidligere studier i rotter rapporterte at aktivering av EGF-reseptor (EGF-R) fører til slimstoffgenekspresjon og proteinekspresjon. For å teste den hypotese at EGF-R-aktivering spiller en rolle i rottenasal GC-regranulering etter fMLP, ble rotter forbehandlet (n = 5) med den selektive EGF-R-tyrosinkinaseinhibitor, BJJBX1522; aerosolisering av fMLP bevirket neutrofil rektruttering inn i det nasale epitel og GC-degranulering, men 48 timer senere forble arealene av AB/P AS-farging og MUC5 AC-immunopositiv farging redu-sert. Disse resultater impliserer EGF-R-aktivering i nasal GC-slimstoffsyntese etter degranulering ved fMLP.

I den foreliggende undersøkelse, ble reguleringen av slimstoffproduksjon i rottenasalt epitel undersøkt. Kontrollepitel inneholdt et signifikant antall slimceller, og MUCSAC-protein var tilstede i disse celler. MUC5AC-genekspresjon var imidlertid fraværende. MUC5AC-slimstoffekspresjon er rapportert å skje i andre luftveisepitelceller via ekspresjonen av EGF-R og deres aktivering. I kontrollrottenasale epitelceller ble det ikke funnet noe EGF-R-genekspresjon eller proteinekspresjon. Det var ingen luminal farging for AB/PAS eller MUC5AC-protein, som antyder at signifikant slimcelledegranulering (sekresjon) ikke fant sted. EGF-R kan nedreguleres i "stabile" slimceller som hindrer virdere slimstoffsyntese. Derfor ble de nasale slimceller "eksponert" ved å indusere slimcelledegranulering og de etterfølgende endringer i luftveisepitelstrukturen ble un-dersøkt.

Neutrofile kjemoattraktantmidler bevirker neutrofilavhengig slimcelledegranulering i marsvinluftveier og humane luftveier mediert ved hjelp av neutrofil elastase, som invol-verer nær kontakt mellom neutrofiler og slimceller. For å indusere degranuleringen av normalt tilstedeværende slimceller i det nasale septum ble kjemoattraktantmidlet, fMLP, inhallert intranasalt. fMLP rekrutterte neutrofiler i det nasale epitel, etterfulgt av degranulering av slimcellene; Alcian blått/PAS-farget areal minsket markert.

Deretter ble de etterfølgende prosesser i det nasale epitel etter fMLP-indusert GC-degranulering undersøkt. Ved 4 timer etter fMLP, når maksimal degranulering av nasal GC forekom, forble EGF-R- og MUC5AC-ekspresjon fraværende. 48 timer etter fMLP var imidlertid EGF-R sterkt uttrykt i for-slimceller og slimceller. MUC5 AC-genekspresjon var nå sterkt uttrykt i epitelet, og disse prosesser var assosiert med regranulering av slimcellene (økt AB/PAS og MUC5AC-farging). 48 timer etter fMLP hadde faktisk regranulering foregått til det punkt at slimcellearealet var lignende kontrolltilstanden. Disse funn antyder at GC-degranulering fører til ekspresjon og aktivering av EGF-R som således induserer slimstoff MUCSAC-ekspresjon.

For å undersøke rollen av EGF-R-tyrosinkinaseaktivering i GC-regranulering, ble dyr forbehandlet med en selektiv EGF-R-tyrosinkinaseinhibitor, BIBX1522.1 dyr forbehandlet med BIBX1522 bevirket fMLP fremdeles GC-degranulering. Forbehandling med BIBX1522 forhindret imidlertid regranuleringen av GC og deres ekspresjon av MUC5 AC-protein. Disse resultater impliserer EGF-R-aktivering i den fornyede vekst av slimstoffer etter GC-degranulering. I patogenfrie rotter er slimceller "inaktive" (dvs. ikke degranulerende) og EGF-R er nedregulert. Når inflammasjon (f.eks. stimulering av neutrofil infiltrasjon) bevirker GC-degranulering og slimstoffsekresjon, vil oppregulering og aktivering av EGF-R på nytt supplere luftveisepitelet med slimstoffer. De foreliggende funn antyder at selektive EGF-R-tyrosinkinaseinhibitorer kan være nyttige ved forebygging av hypersekresjon i nasal sykdom.

Mens den foreliggende oppfinnelse er blitt beskrevet med henvisning til dens spesifikke utførelsesformer, skal det være klart for de fagkyndige på området at forskjellige endringer kan foretas og ekvivalenter kan erstattes uten å gå utenfor den reelle ide og rammen for oppfinnelsen. I tillegg kan mange modifikasjoner foretas for å tilpasses en spesiell situasjon, materiale, stoffblanding, fremgangsmåte, et eller flere fremgangsmåte-trinn, til formålet, ideen og rammen for den foreliggende oppfinnelse. Alle sike modifikasjoner er ment å være innenfor rammen for de etterfølgende patentkrav.

Claims

1. Anvendelse av en epidermal vekstfaktorreseptor (EGF-R) antagonist for fremstilling av et preparat for behandling av en pulmonal sykdom valgt fra kronisk obstruktiv pulmonal sykdom, kronisk bronkitt, akutt astma, systisk fibrose og bronkiektasi, hvori nevnte EGF-R antagonist er valgt fra en tyrosinkinaseinhibitor selektiv for EGF-R, et monoklonalt antistoff som spesifikt binder epidermal vekstfaktor (EGF), og et monoklonalt antistoff som spesifikt binder EGF-R.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvori nevnte EGF-R-antagonist er en tyrosinkinaseinhibitor som er selektiv for EGF-R.

3. Anvendelse ifølge krav 1, hvori EGFR antagonisten er et monoklonalt antistoff som spesifikt binder EGF.

4. Anvendelse ifølge krav 1, hvori EGFR antagonisten er et monoklonalt antistoff som spesifikt binder EGF-R.

5. Anvendelse ifølge krav 1, hvori antagonisten er formulert på en slik måte at den er egnet for tilførsel ved injeksjon.

6. Anvendelse ifølge krav 5, hvori antagonisten er formulert på en slik måte at den er egnet for intravenøs tilførsel med en bærer i form av en normal saltløsning.

7. Anvendelse ifølge krav 1, hvori antagonisten er formulert på en slik måte at den er egnet for tilførsel ved inhalering.

8. Anvendelse ifølge krav 1, hvori antagonisten er formulert på en slik måte at den er egnet for tilførsel ved liposom avlevering.

9. Anvendelse ifølge krav 8, hvori nevnte liposom er sterisk stabilisert og formulert på en slik måte at den er egnet for intravenøs tilførsel.

10. Anvendelse ifølge krav 1, hvori nevnte EGF-R antagonist er valgt blant CP-358,774, CGP 59326, CGP 60261, CGP 62706, ZD-1839, PD-0183805 og PD-153035.

11. Anvendelse ifølge krav 10, hvori nevnte EGF-R antagonist er ZD-1839.