KR100609646B1 - Ｅｇｆ-ｒ 길항물질의 투여에 의한 기도 점액생산의 방지 - Google Patents

Ｅｇｆ-ｒ 길항물질의 투여에 의한 기도 점액생산의 방지 Download PDF

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Abstract

폐내 점액의 과분비는 표피성장인자 (EGF-R) 길항물질의 투여에 의하여 저해된다. EGF-R 길항물질은, EGF 수용기에 결합하여 이를 차단하는 작은 유기분자, 항체, 또는 항체의 일부의 형태이다. EGF-R 길항물질은 폐 기도 (airways) 내 배상세포의 형성을 저해하기 충분한 양으로 주사함에 의하여 바람직하게 투여된다. 기도 점액 생산을 가져오는 배상세포의 탈과립은 그것에 의하여 저해된다. 배상세포 증식을 저해하는 후보 약제를 스크리닝하는 분석 또한 제공된다.
Figure 112001003507730-pct00004
기도 점액 과분비, 표피성장인자 수용체(EGF-R), 배상세포 증식 저해, EGF-R 길항물질

Description

ＥＧＦ-Ｒ 길항물질의 투여에 의한 기도 점액생산의 방지{PREVENTING AIRWAY MUCUS PRODUCTION BY ADMINISTRATION OF EGF-R ANTAGONISTS}
본 발명은 일반적으로 폐 치료의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 EGF-R 길항물질의 투여에 의한 폐 및 기도 내의 점액의 과분비의 저해에 관련된다. 게다가, 본 발명은 또한 허파 내의 점액 과분비 저해능을 지닌 후보 약제의 개발 또는 평가 방법에 관련된다.
호흡계의 전도 기도내에서, 점막섬모계는 흡입된 입자 또는 감염인자를 폐 기도 밖으로 운반하는 일차적 방어기작으로서 역할을 한다. 또한, 기도 장액에 존재하는 물질은 입자의 독성을 제한하고 감염인자를 불활성화하는 역할을 한다. 기침의 물리적 기작은 기도 통로로부터 점액을 배출하는 역할을 한다 (예를 들어, "Foundation of Respiratory Care" Pierson and Kacmarek, eds.(1992) Churchill Livingston Inc. New York;"Harrison's Principles of Internal Medicin", Fauci et al., eds.(1997) 14판,McGraw Hill, New York, New York 참조).
점막섬모계는 점막밑샘에 위치한 섬모성 상피세포, 상피 배상세포, 및 장액성 및 점액성 세포로 구성되어 있다. 섬모는, 기도통로의 관강으로 상피를 가로질러 염화물의 능동수송및 물의 수동적 운반에 의하여 분비되는 수성층 (섬모주위 체액)으로 둘러싸여 있다. 섬모는 수성층 상에 떠다니는 점액과 접촉하고, 일정방향 추진 동작에 의하여 성문 (聲門) 쪽으로의 점액의 이동을 제공한다 (Pierson and Kacmarek, 상기 및 Fauci, et al., 상기 참조). 점액은 상피 배상세포 및 점막밑샘세포에 의하여 생산되고 탈과립된 후 기도의 관강 내로 분비된다.
점액은 일반적으로 흡입된 입자 또는 감염인자의 제거를 촉진하지만, 점액의 과분비는 진행성 기도폐색증을 일으킨다. 말초 기도에서, 기침은 제거 분비에 효과가 없다. 더 나아가, 그 작은 크기 때문에, 많은 배상세포를 포함하는 작은 기도는 특히 점액에 의한 기도 폐색이 일어나기 쉽다. 기도 과분비는 상당수의 사람에게 영향을 준다; 만성 기관지염, 급성 천식, 낭성섬유증, 및 기관지확장증 같은 각종의 폐 질병에서 나타난다.
점액의 과분비는 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 환자의 주 증상이고 질병을 정의한다 (즉, 만성 기침 및 담 생성). 이 질병은 단독으로 1,400만 미국인에게 영향을 주고 진행성 폐질 및 사망을 일으킬 수 있다. 천식이 미국 인구의 적어도 4%에 영향을 미치고 매년 적어도 2000건 사망의 원인이 된다는 것이 입증되었다 (Pierson and Kucmarke, 상기). 급성 천식 발병 동안, 기관지벽은 부어오르고, 점액 부피는 증가하고, 그리고 기관지 민무늬근은 수축하여 기도는 좁아진다. 급성 천식에서 과분비의 결과로 광범위한 점액 폐쇄가 이병률 및 사망률의 주요 원인이 될 수 있다.
과분비는 또한 세계에서 가장 일반적인 치명적 유전병 중의 하나인 낭성섬유증과 관련된다. 낭성섬유증은 기도 점막세포가 막 염화물 이온 채널의 시클릭-AMP-의존 단백질 키나제 활성화에 반응하지 않게 하는 원인이 되는 상 (常) 염색체 열성 질병이다 (Pierson and Kacmarek, 상기 및 Fauci, et al., 상기). 이어지는 전해질 불균형은 기도 점액의 수화 수준을 감소시키고, 따라서 낭성섬유증을 앓는 사람의 허파 내 높은 점액 점도의 결과를 낳는다. 과분비는 사람의 공기 통로를 낭성 섬유로 폐쇄하고, 허파 기능을 더욱 손상시킨다.
과분비와 관련된 다른 질병은 만성 폐쇄성 허파 이상 (COPD)을 포함한다. 산화제 스트레스는 COPD의 발병에 중요한 역할을 한다. 산소 자유 라디칼을 생성하는 흡연은 발병에 강하게 관련된다. COPD의 염증 부위에서 호중구가 종종 보이는데, 흥미롭게도, 활성화 동안 산소 자유 라디칼이 호중구에 의하여 방출됨이 알려져 있다.
각종 폐질환 환자에게 보조적 통풍을 제공하기 위하여 기계적 삽관이 종종 필수적이다. 관이 구개인두를 통하여 삽입되고 기관에 위치된다. 기관내 튜브 주위의 공기의 누출을 막기 위하여 하기관 튜브 주위로 풍선이 팽창되는데, 이는 상피를 마멸시키고 배상세포 이형성의 원인이 된다. 상피의 손상은 수선 과정에 이르게 하는데, 이는 과다한 점액 분비를 유발할 수 있다. 이와 같은 환자의 장기간 삽관은 과분비에 의한 해로운 영향에 이르게 할 수 있다.
과분비 폐질환 환자의 높은 수준의 허파 점액의 결과로서, 점막 제거는 줄어든다. 박테리아, 예를 들면 Psedomonas aeruginosa, 같은 발병성 작용인자는 종종 점액내에, 잦은 허파 감염을 유발하는 콜로니를 형성한다.
기도 과분비를 앓는 환자 치료의 고전적 처방은 항체요법, 기관지확장제 (예를 들어, 메틸잔틴, 강한 β2 아드레날 자극성의 교감신경흥분약, 항콜린작용제), 주로 천식에서 전신적 또는 흡입된 코르티코스테로이드의 사용, 예를 들어 구아이페네신과 같은 거담제의 구강투여에 의한 점액 액화, 및 예를 들면 물,생리적 식염수와 같은 "점액용해" 약제 (Harrison's, 상기 참조)의 에어로졸 수송을 포함한다. 낭성섬유증의 더 새로운 치료법은 DNA-풍부 점액 또는 담을 표적으로 한 DNase 투여이다 (Shak, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. (USA)87: 9188-9192; Hubbard, R.C. et al., (1991) N. Engl. J. Med. 326:812). 또한, 타진, 진동, 및 배액을 포함하는 흉부물리요법은 또한 점성 점액 제거를 촉진하는데 사용된다. 허파이식은 중한 폐 장애에 대한 마지막 대안이다. 그러므로, 점막의 분비를 표적으로 하는 더욱 효과 있는 또는 대안적 요법이 요구된다. 구체적으로, 기관 점액 분비 형성을 감소시킬 특이적 처방에 대한 요구가 있다.
관계 문헌
암세포의 증식을 막기위한 EGF 저해제의 사용은 Levitski (1994) Eur. J. Biochem. 226(1): 1-13; Powis (1994) Pharmac. Ther. 62:57-95; Kondapaka 및 Reddy (1996) Mol. Cell. Endocrin. 117: 53-58에 정리되어있다.
발명의 개요
기관 점액 과분비는 다수의 다른 폐질환의 해로운 증상이다. 분비는, 그 증식이 표피 성장인자 수용체 (EGF-R)의 자극에 의하여 촉진되는, 배상세포의 탈과립에 기인한다. 본 발명은 폐 과분비를 치료학적 양의 EGF-R 길항물질, 바람직하게는 키나제 저해제를 투여함으로써 치료한다. 길항물질은 EGF-R 또는 그 수용체에 결합하는 작은 유기분자, 항체, 또는 항체의 일부 형태이다. 본 발명의 다른 측면은, 점액 과분비를 저해할 후보 약제의 치료학적 가능성의 전조가 되는, 시험관내 및 생체내 방법이 제공된다.
본 발명의 주 목적은 허파 점액 과분비와 관련된 질병을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 점액 과분비를 유발하는 질병의 치료에 유용한 제제을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 점액 과분비를 저해하는 후보 약제 스크리닝을 위한 시험관내 분석을 제공하는 것인데, 그 방법은 (i) 배상세포 증식의 시험관내 모델의 EGF 또는 그것의 기능적 균등물과의 접촉 단계; (ii) 이어지는 시험관내 모델의 후보약제와의 접촉 단계; 및 (iii) , 거기서 분배세포 증식 저해가 후보 약제의 치료학적 가능성을 나타내는, 분배세포의 증식 평가 단계와 관련이 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 점액 과분비를 저해하는 후보 약제의 스크리닝을 위한 생체내 분석법을 제공하는 것인데, 그 방법은 (i) EGF-R의 유도, 예를 들면 종양 증식 인자 알파 (TNF-α)를 통한 과분비 폐질환의 동물 모델을 만드는 단계; (ii) 뮤신 생산 배상세포를 생산하기 위하여, 그것의 리간드, 예를 들면 암화 증식 인자 알파 (TGF-α) 또는 EGF에 의하여 유도된 EGF-R을 자극하는 단계; (iii) 후보 약제의 처리 단계; 및 (iv) 그 배상세포 증식 또는 점액 분비의 저해가 후보 약제의 치료학적 가능성을 표시하는, 배상세포 증식 또는 점액 분비의 평가 단계와 관련이 있다.
본 발명의 더 나아간 목적은 점액의 과분비를 저해하는 EGF-R 길항물질의 스크리닝을 위한, 시험관내 및 생체내 분석법을 제공하는 것이다.
본 발명의 이점은 본 발명이 폐 기도에서 과도한 점액 생성을 방지할 수단을 제공한다는 것이다.
본 발명의 특징은 일정 범위의 다른 형태의 길항물질이, EGF 및/또는 TGF-α의 효과 및 그것들의 EGF-R과의 상호작용을 막는데 사용될 수 있다는 것이다.
본 발명의 한 측면은 포유류 환자의, 바람직하게는 인간 환자의 기도 내 점액 분비 생성을 감소시키기 위한 EGF 길항물질 제제이다.
본 발명의 다른 목적은 포유류 환자의, 바람직하게는 인간의 기도 점액 분비 감소를 위한 EGF 길항물질의 폐 송달 방법이다.
본 발명의 다른 목적은 기도 점액 분비 과다 생성의 증상을 지닌 일정 범위의 다른 질병들을 치료할 방법의 제공이다. 이러한 질병들은 만성 기관지염, 급성 천식, 낭성섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환, 알러지 자극 또는 기계적 마멸같은 상피 손상으로 인한 과분비, 및 코의 과분비를 포함하며, 이에 제한되지는 않는다.
더욱 충분히 하기된 바와 같은 치료법, 및 시험관내 및 생체내 분석의 상세한 설명을 읽으면, 본 발명의 이런 및 다른 목적, 이점, 및 특징은 당업계의 숙련된 자에게 명백하여질 것이다.
바람직한 실시예의 상세한 설명
치료에 적합한 양의 EGF 길항물질, 바람직하게는 키나제 저해제의 투여에 의한 기도 점액 과분비의 치료를 위하여, 구성과 방법이 제공된다. 길항물질은 EGF 또는 EGF의 수용체와 결합하는 작은 분자, 항체, 또는 항체의 일부 형태이다. 기도 과분비 질병, 예를 들어 만성 기관지염, 기관지확장, 낭성섬유증, 급성 천식, COPD 등에서, 기도내 뮤신 합성은 증가되고 점액 과분비가 발생한다. 분비된 점액은, 이런 질병들에서 사망의 원인이 되는 한 효과인, 기도폐쇄를 일으킨다.
기도 손상 및 염증의 여러 원인들은 기도 상피세포 내 표피성장인자 수용체의 발현을 유도하기 위하여 이 장소에 나타난다. EGF-R의 유도 후, 이어지는 리간드-의존 및 -비의존 기작에의한 EGF-R의 자극은 유전자 발현과 단백질 수준 양자에 있어서 뮤신 생산으로 귀착된다. EGF-R 티로신 키나제의 선택적 저해제는 이 뮤신 유전자와 단백질 발현을 막는 것으로 판명된다.
본 발명을 제한함 없이, 배상세포 생산의 진화적 서열은 EGF-R 발현에 기초를 두고 있음이 시사된다. TNFα자극은 무-과립 분비세포의 짙은 EGF-R 염색을 유도한다; 분비세포의 이어지는 EGF-R 리간드에 의한 활성화는 세포질 내 점액 당혼성물에 대한 점진적 염색을 유발한다, 그리고 세포는 "전-배상" 및 그 다음엔 "배상" 세포가 된다. 데이타는 EGF-R 활성화는 선택적 세포 분화를 촉진하지만 세포 증식은 촉진하지 않음을 시사한다. 배상세포는 명백하게 EGF-R을 발현하는 무-과립 분비 세포에서 유래되고 뮤신생산을 위하여 EGF-R 리간드에 의하여 자극된다.
시토키나제 자극 외에도, EGF-R은 다른 신호 매개체에 의하여 자극된다. 예를 들어, 지속적 흡연은 배상세포 과형성을 포함하는 말초 기도내 점진적 병리학적 변화와 관련된다. 전-염증 시토카인-활성화 호중구와 담배연기는 인간 기관지 상피에서 리간드-비의존성 EGF-R 활성화를 통하여 뮤신 합성을 유발하는 것으로 나타나는데, 이는 모집된 호중구와 담배 연기가 기도 뮤신-생산 세포의 비정상적 유도 를 야기하는 상피세포 분화의 조절자임을 암시한다. IL-8, N-포밀-메티오닐-류실-페닐알라닌, TNF-α, 담배연기 또는 H2O2를 포함하는 각종의 자극에 의하여 활성화된 호중구는 상피세포 내 뮤신 발현을 상향조절하는데, 그 합성은 EGF-R 저해제에 의하여 저해된다. 호중구는 또한 EGF-R 리간드, EGF 및 TGFα 생산능이 있다. 또한, 상피세포는 EGF-R 리간드의 공급원이다.
기도 상피의 기계적 손상은 또한 과분비를 유발할 수 있고, 점액전자의 원인이 될 수 있다. EGF-R 티로신 키나제의 저해제는 기관삽관 후 점액 과분비를 방지하는 역할을 한다.
상피 손상은 경증 천식의 환자 연구에서 조차 흔히 발견되고, 그리고 손상은 점증적으로 임상적 증상의 악화와 관련이 있다. 알러지 반응에 의하여 생성된 상피 손상은, 비정상적 배상세포 생산을 야기하는, EGF-R 활성화를 유도한다. EGF-R은, 예를 들면 천식에서 발생하는 "기도 저형성" 같은, 상피손상, 수선, 상처종결과 관련된다. 기계적 상피 손상 및 천식에서의 상피 상해는, 상피 분비세포의 비정상적 증식을 유발하는, 유사한 EGF-R 연쇄과정과 관련된다.
과분비는 또한 코의 염증성 질병의 중요한 징후이다. 코의 배상세포가 호중구-의존 기작을 사용한 배상세포 탈과립 유도에 의하여 "자극"될 때, EGF-R 및 뮤신의 발현은 강하게 상향조절된다. 이런 결과는 배상세포의 조절과 연결된다. 호중구 침윤의 자극과 같은 염증이 배상세포 탈과립 및 뮤신 분비를 유발한 때에, EGF-R 상향조절 및 활성화는 기도 상피에 뮤신을 재제공한다. 치료법 및 제제의 본 방 법이 기재되기 전에, 본 발명은 기재된 특정 방법 및 제제에 국한된 것이 아니고 당연히 변화가 있을 수 있음이 이해 되어야 할 것이다. 본 발명의 범위는 오직 첨부된 청구항에 의하여만 한정되므로, 여기에 사용된 용어는 오직 구체적 구체예를 기술할 목적으로 사용된 것이지 국한할 의도가 아님도 또한 이해되어야 할 것이다.
여기 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는, 다르게 정의되지 않았다면, 본 발명이 속하는 당업계 통상적 기술 중 하나에 의하여 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 지닌다. 방법 및 재료 중 여기에 기재된 방법 및 재료와 유사하거나 또는 등가인 어느 것이나 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료는 현재 기재된다. 여기에 언급된 모든 간행물은, 그 인용된 간행물과 관계있는 방법 및/또는 재료를 개시 및 기술한 참고문헌에 의하여, 여기에 포함된다.
여기에 논의된 간행물은 오직 본 출원의 출원일 이전의 개시를 위하여만 제공된다. 여기의 어느 것도, 본 발명이 선행 발명이라는 이유로 그런 간행물에 앞서는 권리가 부여되지 않음을 승인하는 것으로 해석되어서는 아니된다. 더 나아가, 제공된 간행일은, 독립적인 확인이 필요한 실제 간행일과 다를 수 있다.
정의
"표피 증식 인자" 또는 "EGF"에 의하여는, 상피세포 상의 분열유발 활성으로 특징 지워지는 생물학적 활성을 지니는 단백질 또는 단백질의 일부분을 의미한다(예를 들어, Cohen (1986) Biosciences Reports 6(12): 1017; Aaronson, S.A, "성장인자 및 암," Science (1991) 254: 1146-1153). 전형적 예는, 예를 들면 Urdea et al. (1983) Proc. Nat. Acad. Sci. 80: 7461-7465에 서술된, 인간 표피 성장인자이다.
본 발명의 목적에 대한 특별한 관심은 배상세포 상 EGF의 분열 유발 활성이다. EGF로써 끌어내어지는 생물학적 반응의 관점에서 EGF와 기능적 등가물인 단백질 또는 그 일부분은, 또한 본 정의에 의하여 포함되도록 의도되었다.
"표피성장인자 수용체" 또는 "EGF-R"에 의하여는, EGF단백질 또는 그 일부분에 결합능이 있는 단백질 또는 그 일부분을 의미한다. 전형적 예는 인간 표피성장인자 수용체이다 (Ullrich et al. (1984) Nature 309: 418-425; Genbank 접근 번호 NM_005228 참조). 바람직하게는, EGF 리간드의 결합은 EGF-R을 활성화한다 (예를 들면 세포내 분열유발 신호의 활성화 및 EGF-R의 자기인산화를 유발하여). 당업계 기술 중 하나는 EGF 외에 다른 리간드가 EGF-R에 결합하여 EGF-R을 활성화함을 인식할 것이다. 이런 리간드의 예는 TGF-α, 베타셀룰린, 암피레귤린, 헤파린-결합 EGF (HB-EGF) 및 뉴레귤린(헐귤린으로도 알려진)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다 (Strawn 및 Shawver (1998) Exp.-Opin Invest. Drugs 7(4) 553-573, 및 "Protein Kinase Fact Book: Protein Tyrosine Kinases" (1995) Hardie, et al.(eds), Academic Press, NY, NY).
"EGF-R 길항물질"에 의하여는, EGF-R의 효과, 특히 배상세포 증식 또는 매상세포에 의한 점액의 과분비에 미치는 EGF-R의 효과에 직접 또는 간접적 저해능이 있는 약제 중 어느 하나를 의미한다. EGF-R은 각각 자가인산화 또는 트랜스인산화를 유발하는 리간드-의존 및 리간드-비의존 기작을 통하여 활성화될 수 있다. 관심 있는 EGF-R 길항물질은 이 기작의 어느 하나 또는 양자모두를 저해할 수 있다. 예를 들어, TNF-α의 EGF-R로의 결합은, EGF-R를 결합하는 항체에 의하여 저지될 수 있는, 리간드-의존성 인산화를 유발하고, 그것에 의하여 EGF와 EGF 수용체를 활성화시킬 리간드와의 상호작용이 저지된다. 이런 항체의 예는 Goldstein et al. (1995) Clin. Cancer Res. 1: 1311-1318; Lorimer et al. (1995) Clin. Cancer Res. 1: 859-864; Schmitdt 및 Wels (1996) Br. J. Cancer 74:853-862에 기술되어 있다. 작은 분자 티로신 키나제 저해제는 또한 EGF-R 길항물질로 효과적이다.
대안으로, 산소 자유 라디칼같은 화합물이, 수용체의 리간드-비의존 활성화를 유발하는, EGF-R의 트랜스인산화를 자극함이 증명된다. 트랜스인산화에 의한 EGF-R 활성화의 다른 방법은 자외선 및 삼투 스트레스, 엔도테린-1, 리소포스파티드 산 및 트롬빈에 의한 G-단백질 공역-수용체의 자극, m1 뮤스카린 아세틸콜린 수용체, 및 인간 증식 호르몬을 포함한다. 본 리간드-비의존 기작의 길항물질은 수퍼옥시드 디스뮤타제, DMSO, DMTU,아스코르브산, 및 그 유사물질과 같은 항-산화제를 포함한다.
EGF-R 길항물질은, 그것에 의하여 EGF에 의한 배상세포 증식 촉진을 저해하는, EGF 생산 또는 EGF-R 생산을 자극하는 인자에 결합하는 항체이다 (즉, EGF-R 인산화 연쇄의 저해제). 예를 들어, TGF-α-Pseudomonas 외독소 40 융합단백질은 Arteaga et al. (1995) Cancer Res. 54: 4703-4709에 기술되어 있다.
바람직한 구체예에서, EGF-R 길항물질은 EGF-R의 티로신 키나제 활성 저해제, 특히 다른 티로신 키나제에 비하여 EGF-R에대한 선택적 활성을 지닌 소분자 저 해제이다 - 바람직한 소분자는 포유류, 바람직하게는 인간의 자연적 EGF 수용체를 차단하고 1kD이하의 분자량을 지닌다.
EGF 및 EGF-R의 저해제는, PD153035, 4-(3-클로로아닐리노)퀴나졸린, 또는 CP-358,774같은 퀴나졸린, 피리도피리미딘, 피리미도피리미딘, CGP 59326, CGP 60261 및 CGP 62706같은 피롤로피리미딘 및 피라졸로피리미딘 (Shawn 및 Shawver, 상기.)같은 티로신 키나제 저해제, 4-(페닐아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘 (Traxler et al., (1996) J. Med. Chem 39: 2285-2292) 쿨쿠민 (디페룰로일 메탄) (Laxmin arayana, et al. (1995), Carcinogen 16:1741-1745), 4,5-비스(4-프루오로아닐리노)프탈리미드 (Buchdunger et al. (1995) clin. Cancer Res. 1: 813-821; Dinney et al. (1997) Clin. Cancer Res. 3: 161-168); 니트로치오펜 부분을 포함한 티르포스틴(Brunton et al. (1996) Anti Cancer Drug Design 11: 265-295); 단백질 키나제 저해제 ZD-1839 (AstraZeneca); CP-358774 (Pfizer, inc.); PD-0183805 (Warner-Lambert); 또는 국제 특허 출원 WO99/09016 (American Cyanamid); WO98/ 43960 (American Cyanamid); WO97/ 38983 (Warener Labert); WO99/06378 (Warner Lambert); WO96/ 30347 (Zeneca); WO96/ 33977 (Zeneca); 및 WO96/ 33980 (Zeneca)에 기재된 바와 같이; 이 문서안에 참고문헌에 의하여 포함된 모든 것 또는 모든 안티센스 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"저해"에 의하여는 배상세포 증식, 배상세포 탈과립 또는 배상세포내 점액 과분비의 감소, 중화, 약화 또는 저지를 의미한다.
용어 "치료", "처치" 등은 여기에서 원하는 약학적 및/또는 생리적 효과의 획득을 일반적으로 의미하기 위하여 사용된다. 그 효과는, 완전하게 또는 부분적으로 그것의 질병 또는 증상을 막는 관점에서 예방학적이고/또는 질병의 부분적 또는 완전한 치료 및/또는 그 질병에 기여하는 반대 효과의 관점에서 치료학적이다. "치료"는 여기에 사용된 바와 같이 포유류, 특히 인간의 질병 치료 중 어느 하나를 망라하고, 그리고:
(a) 질병 또는 증상의 소인이 있으나 아직 그것을 지닌다고 진단되지 않은 피험자에게 질병 또는 증상이 발생하는 것의 예방;
(b) 질병 또는 증세의 저해, 즉 그것의 발달을 정지시킴;또는
(c) 질병 또는 증세의 완화, 즉 질병 또는 증세의 퇴행 유발을 포함한다. 본 발명은, 폐 또는 기도 질병 환자를 치료하는 방향으로 이끌어지고, 환자의 점액 과분비를 치료하는, 즉 점액 과분비의 예방, 저해, 또는 완화의 방향으로 부분적으로 이끌어진다. 증상 치료의 관점에서, 본 발명은 기도내 점액 또는 담을 감소시키고, 병원성 생물체의 감염을 저해하고, 기침을 완화시키고, 그리고 기도 폐쇄에 의한 저산소증을 막는 방향으로 이끌어진다.
더욱 구체적으로 "치료"는, 점액 과분비가 관련된 폐 질환을 앓는 환자에 대한, 치료학적으로 검출가능 및 유용한 효과의 제공을 의미하는 것으로 의도되었다.
더욱 더 구체적으로 "치료"는, 항체, 단백질 티로신 키나제 저해제 및 안티센스 분자 및 그 유사물과 같은 EGF 및/또는 EGF-R 길항물질로 구성된 군으로부터 선별된 화합물에 의한 점액 과분비의 예방, 완화, 및/또는 저해를 의미할 것이다. 대안적 치료는 기도에서 EGF-R 발현의 방지, 그것에 의한 더 앞선 단계 경로의 차 단을 포함한다. 예를 들어, TNF-α의 그 수용체에의 결합을 차단하는 약제는 EGF-R의 상향조절을 방지할 수 있다.
치료는 점액 과분비를 유발하고/또는 과분비와 관련 있는 병원성 약제에 의한 감염의 방지 또는 저해를 포함한다.
"항체"에 의하여는 항원 결합능이 있는 면역글로불린 단백질을 의미한다. 여기 사용된 바와 같이, 항체는 관심있는 항원 또는 항원 단편에 대한 결합능 있는 항체 단편, 예를 들면 F(ab')2, Fab', Fab,을 포함하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 항체의 항원에의 결합은 EGF 또는 EGF-R의 활성을 저해한다.
용어 "인간화된 항체"는 여기에서, 그 안에서 CDR은 비-인간 기원에서 유래하고 그것의 Ig분자 또는 단편 나머지 부분은 인간항체에서 유래한, 바람직하게는 인간 항체를 코드화하는 핵산 서열로부터 생산된, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv같이 항체 단편으로 구성된 항체 뿐만 아니라, 완전한 항체 분자, 즉 두 완전한 경쇄 및 두 완전한 중쇄로 구성된 분자를 기술하는 데에도 사용된다.
용어 "인간 항체" 및 "인간화된 항체"는 여기에서 그 항체의 항체 분자의 모든 부분이 인간 항체를 코드화하는 핵산 서열로부터 유래한 항체를 기술하는데 사용된다. 이런 인간 항체는 항체요법적 사용에 가장 바람직하다.
용어 "키메라 항체"는 여기에서, 용어 "인간화된 항체"의 정의에서 상기한 대로 항체 단편 뿐아니라 항체 분자를 기술하는데 사용된다. 용어 "키메라 항체"는 인간화된 항체를 포함한다. 키메라 항체는 적어도 하나의 첫번째 포유종 유래 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열 부분 및 또하나의 두번째 다른 포유종 유래 중쇄 또는 경 쇄 아미노산 서열 부분을 지닌다. 바람직하게는, 가변 영역은 비-인간 포유종에서 유래하고 불변영역은 인간종에서 유래한다. 구체적으로, 키메라 항체는 바람직하게는, 항체 가변영역을 코드화하는 비-인간 포유류 유래 뉴클레오티드 서열 및 항체 불변영역을 코드화하는 인간 유래 뉴클레오티드 서열로부터 생성된다.
"특이적으로 결합한다"는 것은 항체의, 특이적 폴리펩티드에 대한 높은 결합활성 및/또는 높은 친화력의 결합을 의미한다. 특이적 폴리펩티드 상의 에피토프에 대한 항체의 결합은 다른 어떤 에피토프, 특히 같이 결합된 분자내 존재하거나, 또는 관심 있는 특이적 폴리펩티드로서 같은 표본 내에 존재하는 에피토프에 대한 같은 항체의 결합보다 더 강하다. 관심있는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 폴리펩티드에 약하지만 탐지가능한, 예를 들어 관심있는 폴리펩티드에 대하여 나타나는 결합의 10%이하 수준으로 결합할 수 있다. 이런 약한 결합, 또는 백그라운드 결합은 예를 들어 적당한 대조군의 사용으로, 관심있는 화합물 또는 폴리펩티드에 대한 특이적 항체 결합과 쉽게 식별할 수 있다.
"검출가능하게 표지된 항체", "검출가능하게 표지된 항-EGF" 또는 "검출가능하게 표지된 항-EGF 단편"에 의하여는, 결합된 검출가능한 표지를 지니는 항체 (또는 결합 특이성을 지닌 항체 단편)를 의미한다. 검출가능한 표지는 보통으로는 화학적 융합에 의하여 결합되고, 표지가 폴리펩티드인 경우는 대안으로 유전공학 기술에 의하여 결합될 수 있다. 검출가능하게 표지된 단백질의 생산 방법은 당업계에서 주지이다.검출가능한 표지는 당업계에서 알려진 이런 각종 표지로부터 선택되지만, 보통 방사성동위원소, 형광단, 효소, 예를들어 고추냉이 페르옥시다아제, 또는 검출가능한 신호 (예를 들면, 방사능, 형광, 색)를 방출하거나 또는 기질에 표지 노출 후 검출 가능한 신호를 방출하는 다른 구성부분 또는 화합물이다. 각종 검출가능한 표지/기질 쌍(예를 들어 고추냉이 페르옥시다아제/디아미노벤지딘, 아비딘/스트렙토아비딘, 루시퍼라아제/루시페린), 항체 표지 방법, 및 항원을 검출하기 위한 표지된 항체의 사용 방법이 당업계에서 주지이다(예를 들어, Harlow 및 Lane, eds. Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 참조).
치료학적 방법
본 발명은 치료학적 양의 EGF-R 길항물질의 투여에 의한 폐 과분비 치료 방법을 제공한다. 점액 과분비 또는 점액의 병리적 수준의 축적으로 특징지워지는 질병, 특히 폐질환 중 어느 것은 여기에 기술된 방법에 의하여 치료될 수 있다. 본 방법에 의하여 치료될 수 있는 폐 과분비 질병의 예는 만성 기관지염같은 만성 폐쇄성 허파 질환, 천식같은 염증 질환, 기관지확장증, 폐 섬유증, COPD, 코의 과분비 질병, 예를 들면 코 알러지, 및 다른 과분비 질병을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 낭성섬유증, 칼타제넬 증후군, α-1-항트립신 결핍, 가족성 비-낭성섬유증, 호흡기 점액 농후같은 유전병 역시 포함되는 것으로 의도된다.
직접적으로 EGF 또는 EGF-R 을 표적으로 하는 길항물질은 바람직하다. 하지만, 당업계의 기술 중 하나는 배상세포 증식을 촉진하는 EGF-R 유발의 생물학적 연쇄와 관련된 약제 또는 세포,예를 들면 TGF-α가 저해의 표적이 될 수 있음을 인식할 것이다. 연쇄는, 마스터세포 또는 호중구 같은 세포가, 그다음 EGF-R 발현을 촉 진하는 TNF-α를 방출하는 염증 반응동안 시작된다. EGF-R의 자극, 예를 들면 리간드인 EGF에 의한 자극은 차례로 배상세포 증식을 촉발한다. 그러므로, TNF-α경로 같은 연쇄내 어떤 세포 또는 인자도 길항물질 활성의 표적이 된다.
투여될 EGF-R 길항물질은 어떤 형태일 수도 있다. 예로서, EGF-R 길항물질은 작은 분자 (즉, 안티센스 뉴클레오티드, 티로신 키나제 저해제, 기타등등), EGF, TGFα또는 EGF-R에 결합하는 항체 또는 항체 단편의 형태이다.
작은분자 EGF-R 길항물질
EGF 수용체에 작용하고, EGF-R에 선택적인 티로신 키나제 저해제는 당업계에서 알려져 있고, 부속된 방법에서 사용된다. 예는 상기되어 있고,그 중에는 BIBX1522 (Boehringer Ingelheim, Inc., Ingelheim, 독일); CGP59326B (Novartis Corporation, Basel, 스위스); 4-아미노퀴아졸린 EGF-R 저해제 (미국 특허 번호 5,760,041에 기재됨); 나프탈렌, 인단, 또는 벤족아진이 또한 될 수 있는 치환된 스티렌 화합물; 니트릴 또는 몰로노니트릴 화합물 (미국 특허 번호 5,217,999에 기재된)을 포함하는; 감자 카르복시펩티다아제 저해제 (PCI), 세개의 이황화 다리를 지닌 39-아미노산 프로테아제 저해제 (Blanco-Aparicio et al. (1998) J. Biol. Chem. 273 (20): 12370-12377); 봄베신 길항물질 RC-3095 (Szepeshazi et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94: 10913-10918) 등을 포함한다. 다른 티로신 키나제 저해제는 PD153035, 4-(3-클로로아닐리노) 퀴나졸린, 또는 CP-358,774같은 퀴나졸린, 피리도피리미딘, 피리미도피리미딘, CGP 59326, CGP 60261 및 CGP 62706같은 피롤로피리미딘, 및 피라졸로피리미딘 (Snawn 및 Shawver, 상기.), 4-(페닐아미노)-7H-피롤로[2,3-d] 피리미딘 (Traxler et al. (1996) J. Med. Chem. 39: 2285-2292), 쿠르쿠민 (Korutla et al. (1994) Biochim Biophys Acta 1224: 597-600); (Laxmin arayana (1995), Carcinogen 16: 1741-1745); 등을 포함한다.
바람직한 티로신 키나제 저해제는 EGF 수용체에 대하여 선택적이다, 즉 EGF-R은 티로신 키나제 활성을 지닌 다른 세포표면 수용체에 비하여 더 큰 정도로 저해된다. 선택성은, 저해제가 우선적으로 염증이 있는 기도로 송달되는 등의 예와 같이, 제제 및 약제 송달에 의하여 강화된다.
전신 투여를 위한 전형적 투여량은 투여당 수험자 ㎏ 무게당 0.1㎍ 내지 100㎎ 내에 배치된다. 숙련자는 투여량 수준이 특정 화합물, 증상의 심한정도 및 부작용에대한 수험자의 감수성에 대한 함수로서 변화될 수 있음을 즉시 이해할 것이다. 특정 화합물의 몇몇은 다른 것보다 더 강력하다. 주어진 화합물의 바람직한 투여량은 당업계 숙련자에 의하여 각종 방법에 의하여 즉시 결정될 수 있다. 바람직한 수단은 주어진 화합물의 생리적 효능을 측정하는, 예를 들어 여기에 기술된 대로 시험관내 또는 생체내에서 시험하는 것이다.
EGF-R 길항물질로서의 항체
EGF-R 길항물질로서의 항체는 특히 흥미롭다 (예를 들면 Viloria, et al., American Journal of Pathology 151: 1523). EGF 또는 EGF-R의 항체는, 마우스, 설치류, 토끼, 면양, 돼지, 소를 포함하는 이종 면역적격성 포유 숙주를 EGF 또는 EGF-R 또는 그 단편으로 면역처리하여 생산된다. 바람직하게는 인간 EGF 또는 EGF-R 또는 그 단편이 면역원으로 사용된다. 특정 숙주의 선택은 우선적으로 편리에 따 른다. 면역처리는, 면역원이 숙주 동물의 피하, 근육내, 복강내, 혈관내 등으로 주사되는 통상적 기술에 따라 수행된다. 일반적으로, 이틀에 한번 복강내로 약 1.0 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏ 의 EGF 또는 EGF-R이 면역원으로 사용될 것이다. 주사는 아쥬반트, 예를들어 완전 또는 불완전 Freund's 아쥬반트, 스페콜, 명반 등과 함께 또는 없이 이루어진다. 면역처리 일정이 완료된 후, EGF 또는 EGF-R에 대한 다클론성 항혈청을 제공하기 위하여 항혈청이 통상적 방법에 따라 수집된다.
단일클론 또는 다클론 항체는, 바람직하게는 단일클론항체는 면역처리된 동물로부터 생산된다. 다클론 항혈청은, 면역처리 일정이 완료된 후 통상적 방법으로 동물로부터 혈청으로 부터 수집된다. 단일클론항체 생산을 위하여, 림프구는 적당한 림프 조직, 예를 들면 비장, 배출 림프절, 등으로부터 수집되어, 특정 단일클론항체를 분비하는 혼성세포를 만들기 위하여 보통 골수종세포주인 적당한 융합짝과 함께 융합된다. 관심있는 항원 특이적 혼성세포의 스크리닝은 통상적 방법에 따라 수행된다.
특히 흥미 있는 항체는, EGF-R 또는 EGF에 결합하여 EGF의 EGF-R에의 결합을 저해하는, 예를 들어 EGF-R의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하여 EGF의 결합을 방해하는, 항체, 바람직하게는 단일클론항체이다. 이같은 항체는 상기된 통상적 방법학으로 만들어지거나, 또는 시중 구입 가능하다. EGF 길항물질로 기능하는 항체의 예는 중화 항-EGF-R 단일클론항체 C225 (Kawamoto et al. (1983) Proc. Nat'l. acad. Sci. (USA) 80: 1337-1341; Petit et al. (1997) J. Path. 151:1523-153, ImClone Systems New York, NY) 및 항-EGF-R 단일클론항체 EMD55900 (Mab55900라고 도 지칭), (Merck, Darmstadt, 독일)을 포함한다.
대상 항체는, 일반적 다량체 구조 대신 단일 사슬로 생산된다. 단일사슬 항체는 Jost et al. (1994) J. B. C. 269:26267-73, 및 그외에 기술되어 있다. 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 코드화하는 DNA 서열은, 적어도 4 아미노산의 중성 아미노산을 코드화하는 스페이서에 연결된다. 이 융합물에 의하여 코드화된 단백질은 원래 항체의 특이성 및 친화력을 보유하는 기능성 가변부위의 조립을 허용한다.
항체를 인간화하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 인간화된 항체는 형질전환 인간 면역글로불린 불변영역 유전자를 지닌 동물의 산물이다 (예를 들어, 국제 특허 출원 WO 90/ 10077 및 WO 90/ 04036 참조). 대안으로, 관심있는 항체는, CH1, CH2, CH3, 경첩 도메인, 및 또는 골격 잔기를 대응하는 인간 서열로 치환하기 위하여 재조합 DNA 기술로 조작될 수 있다 (WO 92/02190 참조).
키메라 면역그로불린 유전자 제작을 위한 Ig cDNA의 사용 또한 당업계에 알려져있다 (Lui et al. (1987) P.N.A.S. 84: 3439 및 (1987) J. Immunol. 139: 3521). mRNA는 항체를 생산하는 혼성세포 또는 다른 세포로부터 분리되고, cDNA를 생산하기 위하여 사용된다. 관심있는 cDNA는, 특정 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄반응으로 증폭될 수 있다 (U.S. 특허 번호 4,683,195 및 4,683,202). 대안으로, 관심있는 서열을 분리하기 위하여 라이브러리가 만들어지고 스크리닝된다. 항체의 가변영역을 서열화하는 DNA는 그 다음엔 인간 불변영역 서열과 융합된다. 인간 불변영역 유전자 서열은 Kanat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. 간행번호 91-3242 에서 발견할 수 있다. 인간 C 영역 유전자는 알려진 클론으로부터 즉시 사용 가능하다. 인간화된 키메라 항체는 그 다음엔 통상적 방법에 의하여 발현된다.
Fv, F(ab')2, 및 Fab같은 항체 단편은 온전한 단백질의 절단으로, 예를 들면 프로테아제 또는 화학적 절단으로 준비될 수 있다. 대안으로, 절단된 유전자를 디자인한다. 예를 들면, F(ab')2 단편의 일부를 코드화하는 유전자는, 절단된 분자를 생산할 번역 종결코드에 의하여 이어지는, CH1 도메인과 H사슬의 경첩 영역을 코드화하는 DNA 서열을 포함할 것이다.
과분비 점액 질병을 지닌 개체는 처음에는 매일 두번, 예를 들어 삼킴에 의하여, 환자 ㎏ 무게 당 20밀리그람 (㎎) 내지 400㎎ 범위 용량의 EGF-R 길항물질이 투여된다.
EGF-R 길항물질로서의 안티센스 분자.
다른 구체예에서, 대상 치료학적 약제는 EGF 또는 EGF-R을 코드화하는 인간 서열에 특이적인 안티센스 분자이다. 투여된 치료학적 인자는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 고유 핵산으로부터 화학적 변형을 지닌 합성 올리고뉴클레오티드, 또는 이런 안티-센스 분자를 RNA로서 발현하는 핵산 구성물이다. 안티센스 서열은 표적이 된 EGF 또는 EGF-R유전자의 mRNA에 상보적이고, 표적이 된 유전자 산물의 발현을 저해한다 (예를 들면 Nyce et al. (1997) Nature 385:720 참조). 안티센스 분자는, RNAse H 활성화 또는 입체장해를 통하여 번역될 수 있는 mRNA 양을 감소시켜 유전자 발현을 저해한다. 거기서 조합은, 단일 표적이 된 유전자 유래 다중적 다른 서열, 또는 몇몇 다른 유전자에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 분자 중 하나 또는 조합이 투여된다.
바람직한 표적 유전자는 EGF-R 또는 EGF이다. 유전자 서열은 공공 데이터베이스를 통하여 이용할 수 있다 (사람 표피 증식 인자, Genbank 등록번호 KO1166; 표피성장인자 수용체의 전구체 인간 mRNA, Genbank 등록번호 X00588). 일반적으로, 안티센스 서열은 동물 숙주와 같은 기원의 종류를 가질 것이다.
안티센스 분자는, 여기서 벡터는 표적이 된 세포에서 도입되고 발현되는, 적당한 벡터내 표적 유전자 서열의 모두 또는 일부분의 발현으로 생산된다. 전사 개시가 이같이 향할 것이고, 따라서 안티센스 사슬은 RNA 분자로 생산된다. 안티센스 RNA 분자는 내재성 센스 가닥 mRNA와, 그것에 의하여 표적 유전자의 발현이 차단되는, 혼성화가 이루어진다. 고유 전사 개시 영역, 또는 외재성 전사 개시 영역이 차용된다. 시험관내 재조합 방법으로, 또는 서열의 염색체내 상동적 삽입의 결과로 프로모터가 도입된다. β-액틴 프로모터, SV40초기 및 후기 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터, 래트로바이러스 LTR, 등등을 포함하는, 많은 근육 세포에서 활성이 있는 강한 프로모터가 당업계에서 알려져 있다.
전사벡터는 일반적으로 프로모터 서열 가까이 위치하는 핵산 서열 삽입을 제공하기 편리한 제한 부위를 지니고 있다. 전사 카세트는 전사 개시 영역, 표적 유전자 또는 그것의 단편, 및 전사 종결 영역을 포함하여 준비된다. 전사 카세트는, 일시적 또는 안정적으로, 통상적으로 적어도 약 1일, 더욱 통상적으로 적어도 약 며칠 동안 세포내에 유지되는 각종 벡터, 예를 들면 플라스미드; 레트로바이러스, 예를 들면 렌티바이러스; 아데노바이러스; 등에 도입된다.
대안으로, 바람직한 구체예에서, 안티센스 분자는 합성 올리고뉴클레오티드이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 여기서 길이는 저해 효율, 교차-활성의 부재를 포함하는 특이성, 및 이와같은 것에 좌우되는, 일반적으로 약 7 내지 500, 흔히 12 내지 50, 더욱 흔히 20 내지 35 뉴클레오티드이다. 7 내지 8 염기의 짧은 올리고뉴클레오티드도 강하고 선택적인 유전자발현 저해제가 될 수 있음이 판명되었다 (Wagner et al. (1996) Nature Biothechnology 14: 840-844 참조).
특정 영역 또는 내재성 센스 사슬 mRNA 서열의 영역은 안티센스로 상보화되도록 선택된다. mRNA의 5'영역이 특히 안티센스 저해를 받기 쉬움이 판명되었다. 하지만, 최근 증거는 저해할 부위의 접근가능성에 mRNA의 2차구조 분석이 중요함을 나타낸다. 올리고뉴클레오티드를 위한 특정 서열의 선택은, 거기서 몇몇 후보 서열이 시험관내 또는 동물 모델에서 표적 유전자 발현의 저해에 대하여 분석되는, 실험 방법을 사용한다. 거기서 mRNA 서열의 몇몇 영역이 선택된, 서열의 조합은 안티센스 상보화에 사용될 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 당업계에서 알려진 방법으로 화학적으로 합성된다 (Wagner et al. (1993) 상기. 및 Milligan et al., 상기. 참조). 바람직한 올리고뉴클레오티드는, 세포내 안정성 및 결합 친화성을 증가시키기 위하여, 고유 포스포디에스테르 구조로부터 화학적으로 변형된다. 골격, 당, 또는 헤테로시클린 염기의 화학성을 바꾸는 많은 변형이 논문에 기술되어 있다.
올리고뉴클레오티드는 세포의 분자 섭취를 강화하는 표적 부분을 부가하여 포함한다. 표적 부분은 특이적 결합 분자, 예를 들어 허파 상피 세포의, 특히 EGF-R을 포함하는 상피세포의 표면상에 존재하는 분자를 인식하는 항체 또는 그 단편이다.
이특이적 항체, 키메라 항체 및 단일사슬 항체는 당업계에 알려져 있다. 적당하게 준비된 비-인간 항체는 각종 방법으로 인간화될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 및 표적 부분간 연결은, 올리고뉴클레오티드 골격의 화학성에 따라, 통상적 방법, 예를 들어 이황화, 아미드 또는 티오에테르 결합을 이용하는 방법 중 어느 하나를 사용한다. 바람직하게는, 연결은 올리고뉴클레오티드를 자유롭게하기 위하여 세포 내에서 절단된다.
올리고뉴클레오티드는, 뉴클레아제로부터 보호하고 세포막을 가로지른 수송을 개선하기 위하여 예를 들면 콜레스테롤같은 소수성 잔기와 접합된다. 대안으로, 폴리-L-리신 또는 다른 폴리아민에의 접합은 또한 세포로 송달을 강화시킨다. 수행될 수 있는 더 나아간 변형은, 표적 mRNA에 삽입하여 결과적 혼성물을 안정화할 수 있는 아크리딘같은 삽입제의 첨가이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 안티센스-mRNA 복합물을 분해할 효소, 예를들어 RNase-H와 조합하여 세포내로 형질전환된다. 안티센스-mRNA 복합물을 바람직하게 분해 또는 고립시킬 수 있는 어떤 단백질 또는 효소도 유사하게 유용하다.
안티-센스 저해제의 대안으로, 촉매성 핵산 화합물, 예를들어 리보자임, 안티-센스 접합체 등도 유전자 발현을 저해하는데 사용된다. 리보자임은 시험관내에서 합성되어 환자에게 투여되거나, 또는 그 발현벡터로부터 리보자임이 표적 세포 내에서 합성되는, 발현벡터에 코드화된다 (예를 들어, 국제특허출원 WO 9523225, 및 Beigelman et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23: 4434-42 참조). 촉매활성 있는 올리고뉴클레오티드의 예는 WO 9506764에 기술되어 있다. mRNA 혼성화를 매개할 수 있는, 안티-센스 올리고뉴클레오티드와 금속의 복합물 접합체, 예를 들어 테르피리딜Cu(II),는 Bashkin et al. (1995) Appl. Biochem. Biotechnol. 54: 43-56에 기술되어 있다.
약제학적 조제물
EGF-R 길항물질은 용액 또는 리포좀 혼탁액과 같이 약학적 투여에 적당한 다른 어떤 방법으로도 제공된다. 적당한 항체 또는 다른 형태의 항-EGF 는 통상적으로 이같은 물질 투여방법으로 투여하기 위하여 조제된다. 전형적 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판, Mack Publishing Company, Easton, PA에 제공된 제제이다. 투여의 경로는 투여되는 화합물, 환자의 상태 및 치료될 질병에 기초하여 선택된다. 점액 과분비가 있는 곳에, 질병의 중한 정도에 따라 서로 다른 경로로, 예를 들어 만성 치료는 에어로졸로 투여될 수 있지만, 응급상황에서는 i.v.가 요구되고, 급성이지만 생명에 지장이 없는 경우는 경구로 화합물이 투여된다.
코 및 기도 질병에서의 치료학적 사용을 위하여, 국소송달이 바람직하다. 흡입 또는 에어로졸 불어넣기에의한 송달은 전신으로 흡수되는 농도에 비하여 높은 수준의 약물 농도를 제공한다. 대안으로, EGF 길항물질은, 근육내, 정맥내(IV), 피하로 또는 복강내 주사, 바람직하게는 IV주사를 포함하는 주사 및 국지 주사에 의 하여 투여된다. 하지만, EGF-R 길항물질의 전신 순환계 진입을 허용하는 수단이 이용 가능하다면, 좌약, 피부첩부제, 또는 비내로 가하여질 수 있는 점막경유 또는 경피적 조제물 같은 다른 투여 방식 또한 사용된다. EGF-R 길항물질을 혈류로 또는 국지적으로 허파로 운반하는데 효과가 있는 적당한 조제물 중 어느 하나가 적합하게 사용될 수 있다.
주사를 위하여, 적당한 조제물은 일반적으로 생리적 식염, Hank's 용액, 또는 안정화 물질 또는 다른 미량성분을 선택적으로 포함한 다른 완충액을 사용한 수용액 또는 현탁액을 포함한다. 리포좀 제제 및 다른 형태의 마이크로에멀전 또한 사용될 수 있다. EGF-R 길항물질은 또한 동결건조된 형태로 제공되고 투여를 위하여 재구성된다. 점막 경유 및 경피적 투여는 일반적으로, 담즙, 염, 퓨시드 산 및 그 유사체, 각종 계면활성제 및 이와 같은, 점막 또는 피부장벽을 통한 통과를 용이하게 하는 약제를 포함한다. EGF-R 길항물질이 소화기관에서 살아남도록 허용하는 적당한 장내 코팅이 조제된다면 경구 투여 역시 가능하다.
조제물의 형태는 어느정도 선택된 EGF-R 길항물질의 형태에 의존한다. 적당한 조제물은 알려진 기술 및 당업계에 숙련자에게 주지의 조제물 원칙을 사용하여 준비된다. 특정 약제적 조성에 포함되는 EGF-R 길항물질의 백분율은 또한 조제물의 형태에 의존할 것이다; 항체인 EGF-R 길항물질의 백분율은 약 1 중량 % 내지 약 85 중량 %의 넓은 범위를 넘어 일반적으로 다양하다.
세포에 의한 핵산의 흡수를 증강시킬 많은 알려진 송달 방법이 당업계에 존재한다. 유용한 운반 시스템은 Sendai 바이러스-리포솜 운반 시스템 (Rapaport 및 Shai (1994) J. Bio.Chem. 269: 15124-15131), 양이온 리포솜, 중합체 운반 겔 또는 기질, 다공성 벌룬 카테테르 (Shi et al. (1994) Circulation 90: 955-951; 및 Shi et al. (1994) Gene Therapy 1:408-414 에 의하여 개시된 대로), 레트로바이러스 발현 벡터, 및 이와 유사한 것을 포함한다.
송달 매체로 리포솜의 사용은 EGF-R 길항물질과의 사용에서 흥미있는 한 방법이다. 리포솜은 표적 부위 세포와 융합하고 관강의 내용물을 세포내로 송달한다. 리포솜은, 분리, 결합인자, 및 이와 유사한 것 등과 같은 접촉 유지 수단을 사용하여 융합에 충분한 시간동안 세포와 접촉이 유지된다. 리포솜은, Sendi 바이러스나 인플루엔자 바이러스 등같이 막의 융합을 매개하는 정제된 단백질 또는 펩티드로 준비된다. 지질은, 포스파티딜콜린 같은 양이온 지질을 포함하는 알려진 리포솜 형성 지질의 유용한 조합 중 어느 하나이다. 나머지 지질은 정상적으로는, 콜레스테롤, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 및 이와 유사한 것 등같은 중성 지질일 것이다. 리포솜의 준비를 위하여, Kato et al. (1991) J. Bio. Chem. 266:3361에 의하여 기술된 절차가 사용된다.
바람직한 구체예에서, EGF-R 길항물질은 예를 들어 페지레이트된 리포솜같은 입체적으로 안정화된 "은밀" 리포솜 캡슐에 싸인다. 이같은 리포솜이 정맥내 주사되면, 순환내에 장기간 남아 있다. 기도염증 동안에 후모세관 정맥간극결합은 열려서 유체가 축적되는 것을 허용하고, 염증 연쇄를 개시하는 컴플리먼트, 키니노겐 같은 분자들이 조직으로 들어오는 것을 용인한다. 이런 염증은 리포솜 및 다른 내용물을 선택적으로 염증 조직 내에 퇴적되도록 한다 (Zhang et al. (1998) Pharm Res 15:455-460).
EGF-R 길항물질은 흡입 경로의 약제적 송달 시스템에 의하여, 질환중인 환자에게 투여된다. 화합물은 흡입 투여에 적당한 형태로 조제된다. 약제적 송달 시스템은 그것의 EGF-R 길항물질의 점막 라이닝에의 국소투여에 의한 호흡 요법에 적당한 것이다. 본 발명은, EGF-R 길항물질을 용기로부터 방출하는 압축 가스의 힘에 의존하는 시스템을 이용할 수 있다. 에어로졸 또는 압축화 패키지가 본 목적에 채용될 수 있다.
여기서 사용될 때, 용어 "에어로졸"은, 압력 하의 추진 기체에 의하여 요법 적용 부위로 송달되는 매우 미세한 액체 또는 고체 입자를 가리키는 통상적 의미로 사용된다. 약제적 에어로졸이 본 발명에서 채용될 때, 에어로졸은, 액체 송달체 및 추진체의 혼합액 내에서 용해되고, 혼탁되고, 또는 에멀젼화될 수 있는, 치료학적으로 활성있는 화합물을 내포한다. 에어로졸은 용액, 혼탁액, 에멀젼, 가루, 또는 반-고체 조제약 형태가 될 수 있다. 본 발명에서 채용한 에어로졸은 미세, 고체 입자 또는 액상 현탁액으로 환자 호흡기를 통하여 투여되도록 의도된다. 당업계에서 숙련자에게 알려진 각종 형태의 추진체가 이용될 수 있다. 알맞은 추진제의 예는 탄화수소 또는 다른 적당한 기체를 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 가압된 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계량된 양을 송달하는 값을 제공하여 결정된다.
본 발명은, 기체내에 실질적으로 균일한 크기의, 매우 미세한 액체 입자를 생성하는 기구인 분무기로 실시될 수 있다. 바람직하게는, EGF-R 길항물질을 내포하는 액체는 작은 방울로 분산된다. 작은 방울은 분무기 배출관을 통하여 기류에 의하여 송달될 수 있다. 결과적인 연무는 환자의 호흡관으로 침투한다.
윤활유, 송달체, 또는 추진제와 함께 또는 이들 없이, EGF-R 길항물질 또는 그 유사물질을 함유하는 분말조성물은 치료가 필요한 포유동물에게 투여될 수 있다. 본 발명의 본 구체예는 분말 약제적 조성물을 흡입에 의하여 투여하는 통상적 장치로 실시될 수 있다. 예를 들어, 화합물의 분말혼합물 및 락토스나 녹말같은 적당한 분말베이스는 단위투여량 형태로, 예를 들어 분말이 흡입기의 도움으로 그것으로 부터 투여될 수 있는 캡슐 또는 카트리지, 예를 들어 젤라틴, 또는 수포 팩으로 공급된다.
조합 요법이 과분비 폐질환의 치료에 사용된다. 특히, EGF-R 길항물질은, 점막섬모의 청소를 용이하게 하기 위하여, 기관지확장제, 코르티코스테로이드, 거담제, 점액 분해제 및 유사물질 등 같은 과분비 완화를 위한 통상적 치료와 조합된다.
환자의 상태에 따라, 본 발명의 조제물을 주사 (예를 들어 정맥내) 또는 흡입에 의하여 송달하는 것이 바람직하다. 많은 양의 점액이 허파에 있는 환자는 일반적으로 초기에는 흡입에 의하여 치료할 수 없다. 이것은 환자의 허파가 충분히 폐쇄되어 허파내로 에어로졸화된 조제의 흡입이 특히 효과적이지 않기 때문이다. 하지만, 주사 후 치료, 또는 대안으로 장기간 유지 또는 환자의 허파가 심하게 폐쇄되지 않은 경우, 흡입에 의한 투여가 바람직하다. 흡입에 의한 투여는 작은 용량이 치료가 가장 필요한 특정 세포에 국지적으로 송달될 수 있어 바람직하다. 적은 투여량 송달로, 불리한 부작용이 제거되거나 또는 충분히 감소된다. 치료가 가장 필요한 세포로 직접 송달함으로써, 치료의 효과는 더욱 빠르게 실현 될 것이다.
본 발명과 연관하여 채용될 수 있는 몇몇 다른 형의 흡입 방법학이 있다. 본 발명의 길항물질은 흡입을 위해 기본적으로 세가지 다른 형태의 조제물로 조제될 수 있다. 우선, 본 발명의 길항물질은 낮은 융점 추진제와 함께 조제될 수 있다. 이런 조제물은 일반적으로 종래의 미터 용량 흡입기 (MDI's)로 투여된다. 하지만, 종래의 MDI's는, U.S. 특허 5,404,871 및 5,542,410에 기재된 대로 환자의 흡기 부피 및 흐름 속도를 측정하는 기술을 이용하여, 반복되는 투약분배를 얻는 능력을 증가시키도록 변형될 수 있다.
대안으로, 본 발명의 길항물질은 수용액 또는 에탄올 용액으로 조제되고 통상적 분무기로 송달될 수 있다. 하지만, 더 바람직하게는, 이런 용액 조제물은 U.S. 특허 5,497,763; 5,544,646; 5,718,222; 및 5,660,166 안에 개시된 것같은 장치 및 시스템을 사용하여 에어로졸화된다.
최근, 본 발명의 길항 화합물은 건조 분말 형태로 조제될 수 있다. 이런 조제물은, 분말의 에어로졸 안개를 생성한 후 단순히 건조 분말 조제물을 흡입하여 투여될 수 있다. 이같은 실시 기술은 1998년 7월 7일 특허된 U.S. 특허 5,775,320 및 1998년 4월 21일 특허된 U.S. 특허 5,740,794 내에 기술되어 있다.
전기 열거된 특허 각각에 관하여서 출원인은 이들 특허가 폐내 약물 송달에 있어 다른 간행물을 인용함을 지적하며, 이런 간행물은 본 발명의 길항물질 송달과 관련하여 사용될 수 있는 특정 방법론, 장치 및 조제물에 참조될 수 있다. 더 나아가, 각각 특허는, 본 발명의 길항물질 조제물의 송달을 위한 조제법, 장치, 패키지 및 방법론을 개시하기 위하여, 전부 참고문헌으로서 여기 삽입되어 있다.
스크리닝 분석
후보 약물
스크리닝 분석은 EGF 길항물질인 생활성 후보 약제를 확인하는데 사용된다. 특히 관심있는 것은 인간 세포에 낮은 독성을 띠는 약제에 대한 스크리닝 분석이다. 표지된 시험관내 단백질-단백질 결합 분석, 전기영동 이동성 이동 분석, 단백질 결합의 면역분석, 및 이와 유사한 것 등을 포함하여, 폭넓은 각종의 분석이 이 목적을 위하여 사용된다. 정제된 EGF 또는 EGF-R 단백질이 또한, 분자내 상호작용, 수송체 기능 등의 모델링에 사용될 수 있는, 3차원 결정구조의 결정에 사용된다.
여기에서 사용된 용어 "약제"는 EGF 또는 EGF-R의 생리적 기능 변환 또는 저해능이 있는 분자, 예를 들면 단백질 또는 약제 중 어떤 것도 기술한다. 일반적으로, 여러 농도에서 미분적 반응을 얻기 위하여, 다른 약제 농도와 병행하여 복수의 분석 혼합물이 수행 되었다. 전형적으로, 이들 농도의 하나는 네거티브 대조군, 즉 농도 0 또는 검출 수준 이하, 역할을 한다.
후보 약제는, 전형적으로 유기 분자, 바람직하게는 분자량 50 내지 2,500 달톤의 작은 유기 화합물이지만, 수많은 화학물질 종류를 포함한다. 후보 약제는 단백질과 구조적 상호작용에, 특히 수소결합에 필수적 기능기를 포함하고 전형적으로 적어도 하나의 아민, 카르보닐, 히드록시 또는 카르복실기를, 바람직하게는 적어도 둘의 기능적 화학기를 포함한다. 후보 약제는 종종 하나 이상의 전기한 기능기로 치환된 환상 탄소 또는 헤테로환상 구조 및/또는 아로마틱 또는 폴리아로마틱 구조 를 포함한다. 후보 약제는 또한 펩티드, 당류, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 유도체, 이들의 구조적 유사체 또는 조합체를 포함하는 생물학적 분자 중에서 발견된다.
후보 약제는 합성 또는 자연적 화합물의 라이브러리를 포함하는 폭넓은 각종 기원으로부터 얻어진다. 예를 들어, 무작위화된 올리고뉴클레오티드 및 올리고 펩티드의 발현을 포함하는, 폭넓은 다양한 유기 화합물 및 생물학적 분자의 무작위 또는 의도적 합성을 위한 수많은 수단이 이용 가능하다. 대안으로, 박테리아, 균류, 식물 및 동물의 추출물 형태의 자연적 화합물의 라이브러리가 이용 가능하거나 또는 즉시 생산된다. 또한, 자연적 또는 합성적으로 생산된 라이브러리 및 화합물은, 통상적 화학적, 물리적, 생화학적 수단으로 즉시 변형되고, 조합적 라이브러리 생산을 위하여 사용된다. 알려진 약제적 인자는, 구조적 유사체 생산을 위하여 아실화, 알킬화, 에스테르화, 아미드화 등과 같은 의도적 또는 무작위 화학적 변형이 가해진다.
결합분석이 스크리닝 분석법인 경우, 하나 이상의 분자가, 직접 또는 간접으로 검출할 수 있는 신호를 제공할 수 있는 표지에 결합한다. 각종 표지는 방사성동위원소, 형광제, 화학발광제, 효소, 특정 결합 분자, 입자, 예를들어 자성 입자, 및 이와 유사한 물질들을 포함한다. 특정 결합 물질은, 바이오틴 및 스트렙트아비딘, 디곡신 및 안티디곡신 등과 같은 짝을 포함한다. 특이적 결합 구성원을 위하여, 상보적 구성원은 보통, 알려진 절차에 따라, 검출를 위하여 제공되는 분자로 표지된다.
각종 다른 시약들이 스크리닝 분석에 사용된다. 이들은, 최적 단백질-단백질 결합 촉진 및/또는 비-특이적 또는 배경 상호작용 감소에 사용하는 염, 중성 단백질, 예를 들어 알부민, 계면활성제 등 같은 시약을 포함한다. 프로테아제 저해제, 뉴클레아제 저해제, 항-미생물 약제 등과 같은 분석의 효과를 개선하는 시약이 사용된다. 구성물의 혼합이, 필수의 결합을 위하여 제공된 순서에 관계없이 첨가된다. 적당한 온도 중 어느 하나, 전형적으로 4 내지 40℃에서 항온방치가 수행된다. 항온방치 시간은 최적활성을 위하여 선별되지만 또한 빠른 고-효율 스크리닝을 용이하게 하기 위하여 최적화된다. 전형적으로 0.1 내지 1 시간이 충분할 것이다.
원하는 약학적 활성을 지니는 화합물은, 과분비 질환의 치료를 위하여 여기에 기술된 조제물로, 생물학적으로 허용되는 송달체로 숙주에게 투여된다. 도입의 성상에 따라, 화합물은 여기에 기술된 각종 방법으로 조제될 수 있다. 조제물에서 치료학적으로 활성 있는 화합물의 농도는 0.1 내지 100 중량 %로 다양하다.
투약량 섭생
적당한 투약량 수준 또한 치료대상의 특질, 치료될 과분비 상태의 특정 특질 및 그 심한 정도, 활성 성분으로 사용된 EGF-R 길항물질의 성질, 투약 방식, 조제물, 및 치료자의 판단을 포함하는 많은 요인에 따라 다양할 것이다. 예를 들어, 주사 조제물에서 항-EGF 또는 EGF-R 같은 항체가 그 자체로 투여되는 경우, 투여량은 1회 투여에 20㎎/㎏ 내지 40㎎/㎏이 될 것이다. 수일 기간 이상의 반복되는 투여가 요구되거나 또는 정맥내 방법에 의한 투여가 계속될 수도 있다. 만성 상태에 대하여는, 필요에 따라 투여는 더 오랜 기간동안 지속된다.
투약량 섭생의 효험은 환자의 개선된 폐 기능 평가에 의하여 측정될 것이다. 본 평가는 담의 점도유연성 측정, 강제 호기 담 부피 및 최대 중호기 유속의 개선을 포함하는 폐기능 개선을 포함한다. 전기한 치료학적 섭생은 항체, DNAse I 또는 과분비 폐질환의 치료를 위한 다른 현행 요법같은 인접한 요법과 결합하여 주어질 수 있다. 항생물질이 환자 치료의 부분으로서 보조-투여된다면, 요법에 따르는 세균 정량은, 점액 또는 담의 점성 감소 및 점액 또는 담의 폐 청소율 증가를 나타내는, 감소된 세균 성장에 의한 치료법의 효험 평가에 포함될 수 있다.
폐 과분비 질환의 임상적 진행 진단 시험법 뿐 아니라, 폐 기능 시험법은 당업계 숙련자에게 알려져 있다. 표준 폐기능 시험은 기도내성 (AR); 강제폐활량 (FVC); 1초당 강제호기부피 (FEV(1)); 강제중호기류; 및 최대호기유속 (PEFR)을 포함한다. 다른 폐기능 시험은 혈기체 분석; 투약 반응; 유발 및 운동 시험; 호흡기근력 시험; 섬유-광 기도 시험; 및 이와 유사한 것 등을 포함한다. 점액의 특질을 연구하는 몇몇 기초적 절차는, 예를 들어 자성극미 유동성측정계를 이용한, 유동성학; 점액적 및 표면간 접촉각의 측정을 통한, 고착표면 및 점착 시스템 간의 인력을 특징짓는 점착성을 포함한다. 섬모에 의한 점액 송달은, 직접 측정, 즉 원위치 점액 청소율 뿐아니라 통상적 기술을 사용하여 연구될 수 있다. 폐 상피 이온-송달 시스템 활동의 총 결과인 상피관통 전위차는 적당한 극미전극을 사용하여 측정될 수 있다. 정량적 형태학 방법은 상피 표면 상태를 특성결정하기 위하여 사용된다.
치료될 환자는, 인간 같은 영장류, 또는 기술된 증상을 나타내는 다른 동물 중 어느 하나가 될 수 있다. 본 발명의 방법은 특히 인간 환자의 치료를 위하여 적 합화되었으나, 본 발명은 또한 수의학적 실시에도 적용될 수 있음이 이해될 것이다.
시험관내 스크리닝 분석법
본 발명의 다른 구체예에서, 시험관내 분석은 후보 약제의 배상세포 증식 저해의 치료학적 가능성, 즉 그와 같은 약제가 EGF 길항물질로 활성이 있는지를 평가하는데 사용된다. 일반적으로, 이런 분석법은 하기한 (i) 배상세포 증식의 시험관내 모델이 EGF 또는 그것의 기능적 균등물과 접촉하는 단계; (ii) 이어지는 시험관내 모델이 후보 약제와 접촉하는 단계; (iii) 배상세포 증식의 저해가 후보 약제의 치료학적 가능성을 표시하는, 배상세포 증식의 평가단계를 포함할 것이다.
분석법은 두번째 세포군은 어느 화합물과도 접촉하지 않고 세번째는 EGF와는 접촉하지만 후보 약제와는 접촉하지 않는, 두가지 대조군과 함께 바람직하게 수행된다. 그 다음 EGF 및 후보 약제의 세포에 대한 효과의 정도를 측정하기 위하여, 비교가 행하여진다.
배상세포 증식의 시험관내 모델 중 어느 하나가 사용된다. 실시예에 의하여, 기관 세포는, Guzman et al. (1995) 217: 412-419에 기재된 대로 배양내에서 분리 되고 유지될 수 있다. 요약하면, 래트 기관 세포는, 초기에는 배지에서 액내배양되고, 이어 기체/액체 계면에서 유지되어, 콜라겐겔로 덮힌 반투막 상에 도말된다. 시험관내 세포의 예는 1차 인간 기관 세포 (Clonetics, San Diego로부터 이용가능); NCI-H292 세포 (ATCC CRL-1848); 및 A431 세포 (ATCC CRL-1555)를 포함한다.
시험관내 배양액은 EGF 및 후보 약제와 접촉한다. 후보 약제는, 평가되어야 할 종료점 및 후보 약제의 상태에 따라, EGF의 첨가 전, 첨가와 동시, 또는 첨가 후에 배양액과 접촉한다. 배양된 세포는 대조군에 대비한 배상세포 증식 저해에 대하여 평가된다.
각종 분자 또는 생화학적 마커가 배상세포 평가에 사용된다. 사용되는 분자 또는 생화학적 마커의 예는 배상세포의 유전자 발현 또는 단백질 발현 특징을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 어떤 뮤신 유전자, 예를 들어 MUC5B (Desseyn et al. (1997) J. Bio. Chem. 272: 3168-3178)는 기도에서 발현되고, 점액에서 높게 나타나는 유전자 산물을 가진다. 뮤신 유전자의 발현은 뮤신의 생산을 측정하는데 적당한 마커를 제공한다.
뮤신 유전자 발현은 노던블롯 분석, 중합효소연쇄반응, 뮤신 유전자 프로모터 조사, 또는 원위치 분석과 같은 통상적 기술에 의하여 평가된다. 대안으로 뮤신 단백질은, 검출 가능하게 표지된 항체를 사용한, 웨스턴블롯 분석, ELASA, 면역화학 등과 같은 통상적 방법론에 의하여 평가된다. Alcian blue/PAS 염색을 사용한 뮤신 염색법과 같은 (Lou et al. (1998) Am. J. Respir. Cirt. Care Med. 157: 1927-1934) 형태학적 기준 또한 배양액 내에 배상세포의 존재 여부를 측정하는데 사용된다. 뮤신에 대한 항체는 ELISA 분석으로 조사할 수 있다. 예를 들어 EGF, TGFα같은 리간드에 의한 EGF-R의 자극은 특정 EGF 수용체의 인산화를 유도하고 배상세포 생산을 유발한다. EGF-R 인산화는 배상세포 유도의 반향으로 측정될 수 있다 (Donato et al. (1984) J. Biol. Chem. 264: 20474-20481).
배상세포 증식과 연관된 분자학적 또는 생화학적 마커의 감소는 길항물질의 치료학적 가능성을 나타낸다.
생체내 모델
본 발명의 또 다른 구체예에서, 후보 약제의 배상세포 증식 저해의 치료학적 가능성을 평가하기 위하여 생체내 동물 모델이 사용된다. 일반적으로 분석법은: (i) EGF-R 발현 유도에 의하여 과분비 폐질환 동물 모델을 만드는 단계; (ii) 유도된 EGF-R을 배상세포를 생산하는 뮤신생산을 하도록 자극하는 단계; (iii) 후보 약제로 처리하는 단계; (iv) 그 배상세포 증식 또는 뮤신 분비의 저해가 후보 약제의 치료학적 가능성을 표시하는, 배상세포 증식 또는 뮤신 분비의 평가단계를 포함한다.
생체내 과분비 폐질환 모델 중 어느 하나도 사용될 수 있다. 예로서 Temann et al. (1997) Am. J. Respir. Cell. Biol. 16: 471-478에 기재된, 및 여기 제공된 실시예에 기재된 천식 마우스 모델이 있다. 대안으로, Takeyama et al. (1998) Am. J. Physiol.에 기술된 대로 래트 모델이 사용될 수 있다. 사용되는 다른 동물 모델의 예는 기니아 피그 (배상세포를 구성적으로 발현하는 종) 및 래트를 포함하나 이에 한정되지 아니한다.
동물 모델의 폐조직 또는 기관조직은 시험관내 모델에 대하여 기술된 분자학적 및 생화학적 마커와 같은 마커에 의하여 평가될 수 있다. 배상세포 증식의 감소는 EGF-R 길항물질의 치료학적 가능성을 나타낸다.
하기의 실시예는 당업계에서 통상적인 지식을 가진자에게 본 발명의 생산 및 이용의 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위하여 기재된 것이지, 발명자가 발명이라고 보는 범위를 제한하도록 의도된 것이 아니며 또한 하기의 실험이 실시된 실험의 전부 또는 유일한 실험임을 표현하도록 의도된 것이 아니다. 사용된 숫자 (예를 들어 분량, 온도 등)를 고려하여 정확성을 확인하기 위하여 노력이 가해졌으나, 몇몇 오차나 일탈은 고려되어야 한다. 지시되지 않은 경우, 비율은 무게당 비율이며, 분자량은 평균분자량이고, 온도는 섭씨온도이고, 압력은 공기압 또는 그 근처이다.
도 1A는 NCI-H292 및 A431 세포 내의 EGF-R의 웨스턴블롯이다. 도 1B는 NCI-H292 세포 배양 내 항-EGF-R 항체와의 면역세포화학적 분석이다. 도 1C는 NCI-H292세포 내 EGF-R의 노던블롯 분석이다.
도 2. 뮤신 당단백질의 동정을 위한 NCI-H292 세포의 Alcian blue/PAS 염색.
도 3.NCI-H292 세포 내 MUC5 유전자 발현에 대한 노던블롯 분석.
도 4A 및 4B. 무-병원균 래트 내에서 EGF-R의 항-EGF-R항체와의 면역조직화학적 분석. 도 4A, TNFα-처리 래트. 도 4B, 오브알부민-민감화 래트.
도 5는 EGF-R 티로신 키나제 저해제 (BIBX1522)의 배상세포 생성에 대한 효과를 도시한 그래프이다 (Alcian blue/PAS-파저티브 세포로 채워진 기도 상피의 염색된 %로 표현됨).
실시예1
EGF 시스템에 의한 기도내 뮤신 생산 조절
배상세포 과형성은 각종 기도 과분비 질병에서 발생하지만, 내재적 기작이 알려지지 않았기 때문에 효과적 치료법이 존재하지 않는다. 건강한 기도에서는, 배상세포는 거의 없지만, 과분비 기도 질환에서는, 배상세포 과형성이 발생한다. 인간 기관지 (NCI-H292) 세포주가 연구되었다. 본 세포는 EGF-R을 구성적으로 발현하고; EGF-R 유전자 발현은 더나아가 종양괴사인자 알파 (TNFα)에 의하여 자극된다. EGF-R 리간드는 뮤신의 합성을 증가시키고 이 효과는 TNFα와 보조-배양에 의하여 증가된다.
무-병원체 래트 기도 상피세포는 매우 소량의 EGF-R 단백질을 발현하지만, TNFα의 기관내 점적은 기부, 전-배상, 및 배상세포내에 EGF-R을 유도, 섬모세포에서는 유도하지 않았다; TNFα, EGF, 또는 TGFα단독으로는 배상세포 생산을 유도하지 않는다. 하지만, EGF-R 리간드에 의하여 이어지는 TNFα점적은 배상 및 전-배상세포 수 증가 및 Alcian blue/PAS-파저티브 염색 및 뮤신 MUC5 유전자 발현의 충격적 증가를 유발한다. 민감화된 래트에서, 오브알부민은 배상세포 생산 및 기도 상피내 EGF-R 발현을 유발한다. NCI-H292 세포에서, EGF-R 리간드에 의하여 이어지는 TNFα에 의하여 자극된 래트에서, 및 래트 천식 모델에서, EGF-R 티로신 키나제 저해제 (BIBX1522)의 전처리는 기도내 배상세포 증식을 방지한다. 본 발견은 기도 과분비 질환내 EGF-R 연쇄 저해제의 한 역할을 증명한다.
방법
시험관내 연구
세포 배양. 인간 폐 점액표피양 세포주, NCI-H292 세포는, 10% 태아소 혈청, 페니실린 (100 U/㎖), 스트렙토마이신 (100 ㎍/㎖)을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 37℃의 증기화된 5% CO2 물분사 항온기에서 성장되었다. 융합될 때, 세포는 EGF (재조합 인간 EGF, 25ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA), TGFα(재조합 인간 TGFα, 25ng/ml, Genzyme), TNFα(재조합 인간 TNFα, 20ng/ml, Genzyme), EGF (25ng/ml) + TNFα(20ng/ml) 또는 TGFα(25ng/ml) + TNFα(20ng/ml)과 함께 12h, 24h, Ehsms 48h동안 항온처리되었다. EGF-R 티로신 키나제 저해제, BIBX1522 (10㎍/㎖, Boehringer Ingelheim Inc., Ingelheim, Germany에 의하여 대규모 공급됨)를 사용한 저해 연구에서, 성장인자 첨가 30분전 세포는 BIBX1522로 전처리되었다. 항온처리후, T-75 플라스크에서 성장된 세포는 총 RNA 추출 또는 단백질 추출에 사용되고, 8-실 슬라이드가, 뮤신을 가시화하기 위한 Alcian blue/PAS-염색에 사용되었다.
웨스턴블롯. T-75 플라스크에서 성장한 세포는 1% TritonX, 1% 소듐 디옥시콜레이트 및 PMSF (10mg/ml)을 포함한 PBS로 용균되고 긁어내어졌다. 총단백질량은 BSA 단백질 분석 시약 (Pierce, Rockford, IL)으로 추산되었다. 세포용해물은 Tricine 표본 완충액 및 2% βME와 함께 95℃에서 끓여졌다. 단백질은 8% 아크릴아미드겔내 SDS-PAGE에서 분별되었다. 결과적 겔은 전달완충액: 25mM Tris-HCl, 192mM 글리신, 20% (부피/부피) 메탄올, pH 8.3 내에서 평형화된다. 단백질은 그 다음 전기영동으로 니트로셀루로스막에 전달되었다. 본 막은 그 다음 0.05% Tween20 포함 PBS내 5% 무지방 탈지유에서 1시간 동안 항온처리되었다. 그 다음 막 은 단일클론 마우스 항-EGF 항체 (1:100)로 4℃에서 하룻밤 항온처리되었다. 결합된 항체는 아비딘-비오틴-알칼리 포스파타제 복합체 방법 (ABC 키트, Vector Laboratories) 표준 절차에 따라 가시화되었다. EGF-R에 대한 파저티브 대조군으로, A431세포의 세포용해액이 사용되었다 (20).
NCI-H292 세포 EGF-R의 면역세포화학적 위치측정. 8-실 슬라이드상에 성장한 세포는 4% 파라폼알데히드로 1시간 동안 고정된다. EGF-R을 염색하기 위하여, 0.05% Tween20, 2% 정상 염소 혈청 및 2mM 레바미솔을 포함하는 PBS이 항체 희석 용매로 사용되었다. 절편은 EGF-R에 대한 마우스 단일클론항체 (1:250)와 함께 4℃에서 하룻밤 항온처리되었고, 여분의 1차항체 제거를 위하여 PBS로 세차례 세척하였다. 세포는 그다음 1:200희석의 비오틴화된 말 항-마우스 면역글로불린 (Vector Laboratories, Burlingame, CA)과 1시간동안 실온에서 항온처리되었다. 결합된 항체는 아비딘-비오틴-알칼린 탈인산화효소 복합체 방법 (ABC 키트, Vector Laboratories, Burlingame, CA) 표준 절차에 따라 가시화된다.
프로브. EGF-R mRNA 발현은 선형화된 pTRI-EGF-R-인간 프로브 주형 (Ambion, Austin, TX)을 사용하여 측정되었다. 본 프로브는, 엑손 12 내지 14에 위치한 인간 EGF-R 유전자 360 bp cDNA 단편을 포함한다. MUS5 유전자 발현은, 인간 MUS5AC 유전자 298bp cDNA 단편을 포함하는 인간 MUS5AC 프로브 (Dr. Carol Basbaum에 의하여 제공됨)를 사용하여 측정되었다.
노던블롯. 총 RNA는, 각 조건에서, Tri-Reagent (Molecular Research Ctr, Cincinnati, OH)를 사용하여 T-75 조직 배양 플라스크에서 성장한 NCI-H292 세포로부터 추출되었다. 총 RNA (10㎍)는 1% 아가로스/포름알데히드겔 상에서 전기영동된 후 모세관 블롯을 사용하여 나일론막으로 전달되었다. 프로브는 Random Primed DNA 표지 키트 (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IL)를 사용하여 32P로 표지되었다. 블롯은 42℃에서 4시간동안 전혼성화되었고 그다음 42℃에서 16시간 동안 32P-표지 특정 cDNA 프로브로 혼성화 되었다. 혼성화용액은 250mM Tris-HCl (pH 7.5), 5% SDS, 1% BSA, 1% 폴리비닐-피롤리돈, 1% 피콜, 및 0.5% 소듐 피로포스페이트를 포함하였다. 혼성화 후, 막은 0.1% SDS 포함 2 x SSC로 30분씩 실온에서 두차례 세척되었고 0.1% SDS 포함 2 x SSC에서 50℃, 30분 두차례 세척 및 0.1%SDS 포함 2 x SSC로 헹굼으로 이어졌다. 막은 X-선 필름에 노출되었다.
생체내 연구.
실험동물절차는 Committiee on Animal Research, University of California San Francisco에 의하여 승인되었다. 230-250g 특정 무-병원물질 수컷 F344 Fisher 래트 (Simosen Laboratories, Gilroy, CA)가 온도-조절 (21℃)실에서 표준 실험사료 및 물이 자유롭게 이용 가능하게 유지되었다.
건강한 래트. 래트는 메토헥시탈 소듐 (Brevital 소듐, 50mg/kg, i.p.; Eli Lilly & Co., Indianapolis, IN)로 마취되고 자발적 호흡이 이루어지도록 방치하였다. TNFα가 EGF-R을 상향조절하는지 측정하기 위하여, TNFα(200ng, 100㎕)가 기관에 점적되었고 동물은 24시간후 안락사되었다. EGF 또는 TGFα가 기도 상피에서 배상세포를 유도하는지 조사하기 위하여, EGF (600ng, 100㎕) 또는 TGFα(래트가 합성한 TGFα, 250ng, 100㎕; Sigma, St Louis, MI)가 단독 또는 TNFα(200ng, 100㎕)점적 24시간 후 기관에 점적되었고 동물은 48시간후 안락사되었다. 각 연구에서, 멸균 PBS (100㎕)가 대조군으로서 기관에 점적되었다. 점액 생산이 EGF-R 활성화를 통하여 일어나는지 확인하기 위하여, EGF-R 티로신 키나제 저해제 BIBX1522 의 영향을 조사하였다 (투여량은 본 저해제를 사용한 암 성장 방지 연구로부터 추산함). 래트는, TNFα점적 전 1시간 및 점적 후 24시간에, BIBX1522 (3,10 또는 30 mg/kg, i.p.)로 전처리되었다. 기관 및 폐는 조사를 위하여 TGFα점적후 48시간 후 제거되었다.
민감화된 래트
민감화. 래트는 제 0일 및 제 10일에, 0.5ml 멸균 식염수내 100mg 알루미늄 히드록시드와 복합체를 이룬 오브알부민 (10mg, V급; Sigma, St. Louis, MO) 복강내주사로 민감화되었다. 래트는 그 다음 10일간 휴식한다. 제 20일에, 오브알부민은 직접 기관으로 주입되었고; 동물은 식염수내 100㎕ 0.1% 오브알부민을 기관내로 세차례 (제 20일, 제 22일, 제 24일) 점적 처리되였다. 래트는 처리 없이 (제 20일) 또는 3회째 처리 24시간 후(제 26일)에 안락사되었다. 본 절차는 배상세포 이형성을 유도하였다. 배상세포 과형성을 막기 위하여, 민감화된 래트는 EGF-R 티로신 키나제 저해제인 BIBX1522로 전처리되었다. 오브알부민 처리일 (제 20, 22 및 24일)에, 민감화된 래트는 BIBX1522 (10mg/kg, i.p., 처리 1시간전)로 전처리되고 그 다음 BIBX1522 (BIBX1522, 10-5M, 100㎕) 또한 기관에 오브알부민과 함께 점적된 다. BIBX1522 또한 안락사 전까지 매 24시간마다 i.p.로 주사되었다. 동물이 안락사된 후, 기관은 3회째 처리 48시간후에 제거되었다.
조직 준비. 마취중 전선택 시간에, 전신 순환은 압력 120mmHg의 DEPC-처리 PBS내 1% 파라포름알데히드로 관류시켜졌다. 기관은 그 다음 제거되었고 4% 파라포름알데히드에서 24시간 놓여졌다. 고정 후, 기관 및 허파는 면역조직화학 및 원위치 혼성화를 위하여 JB-4 + 세포분석을 위한 단일체 용액 A 또는 O.C.T. 화합물 (Sakura Finetek U.S.A., Inc., Torrance, CA)에 채워졌다. 채워진 조직은 절편을 가로질러 잘리고 (4mm 두께) 슬라이드 위에 놓여졌다.
세포 분석. 기름담금 대물렌즈 (x 1000 배율)로 2mm 기부박막 너머 상피세포핵을 세어서 상피세포의 수를 측정하였다. 상피 각 분석 영역 아래 기부박막의 직선길이는 기부박막의 디지탈리스된 이미지의 윤곽을 추적하여 측정되었다. 자극의 점적후, "발생하는" 배상세포가 형성된다. 본 세포는 Alcian blue/PAS-파저티브 과립을 가지지만, 과립의 크기가 작고 세포질 과립의 수가 매우 적다. 우리는 본 "발생하는" 배상세포를 성숙 배상세포가 되기전의 세포 단계인, "전-배상세포"라고 부른다. 배상세포는, 핵 및 관강면 사이의 대분을 채우는 풍부한 Alcian blue/PAS-염색 과립을 가진 긴, 입방형, 배상 내지 낮은 원통형이다. 전-배상세포는 더 작은 점액-염색 영역 (< 상피내 기부에서 관강면까지 1/3 높이)을 가진 또는 빈약한 또는 옅은 Alcian blue/PAS-염색성에 작은 과립을 지닌 세포로 정의된다. 섬모성 세포는 그것의 섬모성 태두리, 옅게 염색된 세포질, 및 큰 둥근 핵에 의하여 인식된다. 무-과립 분비 세포는 원통형이고 관강에서부터 기부박막까지 연장되어있다. 세 포질은 밝은 분홍으로 염색되고 세포질에서 수개의 작은 PAS-파저티브 및 Alcian blue-네거티브 과립이 관찰된다. 기부 세포는, 기부박막 바로 위에 위치하지만 기도 관강에는 미치지 않는, 큰 과립을 가진 작은 납작한 세포이다.
배상세포 생산의 정량. 배상세포 생산은, 다른 곳에 기술된 반-자동 영상 시스템 (Weber et al. (1984) Science 224: 294-297)을 사용한 Alcian blue/PAS-염색된 점막표면 상피세포 점막물질의 부피밀도로 측정된다. 우리는 Alcian blue/PAS-파저티브 염색된 면적 및 총 상피면적을 측정하였고 데이터를 Alcian blue/PAS로 염색된 총면적의 백분율로 표현하였다. 본 분석은 공유 NIH 영상 프로그램 (U.S. National Institute of Health에서 개발되고 zippy.nimh.gov 유래 FTP에의하여 인터넷으로 또는 National Technical Information Service, Springfield, VA, 부분번호 PB95-500195GEI 유래 플로피 디스켓으로 이용가능 함)으로 수행되었다.
래트 상피 EGF-R의 면역조직화학적 위치측정. EGF-R의 위치측정은, EGF-R에 대한 항체 (Calbiochem, San Diego, CA)로 동결 래트 기관 절편내 면역조직화학적 염색을 사용하여 조사되었다. PBS내 1% 파라포름알데히드로의 관류후, 조직은 PBS내 4% 파라포름알데히드에 1시간 동안 놓아지고 그다음 동결보존을 위하여 하룻밤 동안 30% 수크로스로 옮겨졌다. 기관은 O.C.T.화합물 (Sakura Finetek U.S.A., Inc., Torrance, CA)에 잠기고 동결되었다. 동결 절편 (5㎛)은 잘라지고 유리 슬라이드 (Superfront Plus, Fisher Scientific Pittsburgh, PA)에 놓였다. 면역염색은 시험관내 연구와 유사하게 수행되었다.
프로브 준비. 래트 MUC5 cDNA는 Carol Basbaum 박사에 의하여 관대하게 제공 되었다. 래트 MUC5의 A 320 bp cDNA 단편은 전사벡터 pBluescript-SK(-) (Stragene, La Jolla, CA)의 Xba/HindIII 부위로 서브클론되었다. 원위치 혼성화를 위한 RNA 프로브를 준비하기 위하여, 래트 MUC5 cDNA 단편을 포함하는 본 재조합 플라스미드는 선형화되었고, 안티센스 또는 센스 프로브를 얻기위하여 각각 T7 또는 T3 중합효소와 함께 시험관내 전사되었다. 원위치 혼성화를 위한 프로브는 [35S]UTP 존재 하에서 생성되었다. 전사후, cDNA 주형은 DNase로 분해되었고, 방사성표지된 RNA가 Sephadex G-25 Quick SpinTM Column (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)을 통하여 정제되었고, 에탄올/암모늄아세테이트 용액 내에서 침강되었다. 사용 전, RNA 프로브는 70% 에탄올로 세척되고, 10mM DTT에 희석되었다.
원위치 혼성화. 동결 절편 (5㎛)은 잘려지고 파저티브 대전된 유리 슬라이드 (Superfront Plus, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) 위에 놓였다. 가깝게 근접하여 잘린 절편은 센스 또는 안티센스 프로브와 함께 혼성화에 사용되었다. 격절편들이 Alcian blue/PAS 염색에 사용되었다. 표본은 4% 파라포름알데히드 내에서 재고정되었고, 0.5 x SSC 내에서 재수화되었고, 그 다음 트리에탄올아민 내에서 아세트화되었다. 혼성화는, 50% 탈이온화 포름알데히드, 0.3 M NaCl, 20mM Tris, 5mM EDTA, 1 x Denhardt's 용액, 20mM 디티오트레이톨, 10% 덱스트란 설페이트, 0.5mg/ml 효모 tRNA, 및 0.5mg/ml 초음파처리 연어 스펌 DNA 내의 2500-3000cpm/㎕의 안티센스 또는 센스 프로브로 55℃ 하룻밤 동안 수행되었다. 후혼성화 처리는 2 x SSC, 1mM EDTA, 10mM β-멀켑토에탄올로 실온에서 세척, RNase 용액 (20mg/ml)으 로 30분간 실온 항온처리 및 0.1 x SSC, 1mM EDTA, 10mM β-멀켑토에탄올에서 55℃ 두시간 및 실온 0.5 x SSC에서의 더 나아간 세척으로 구성되었다. 자동방사선사진을 위하여 표본은 탈수화되고, 공기-건조되고, 그리고 Kodak NBT 핵 궤도 에멀젼 (Eastman Kodak, Rochester, NY)으로 덮였다. 4℃에서 7 내지 21 시간 노출 후, 슬라이드는 현상, 고정, 및 헤마토옥실린 (21)으로 역염색되었다.
통계. 모든 데이터는 평균 ±SEM 으로 표시된다. 군간에 통계적인 심한 오차를 측정하기 위하여 분산의 일방 분석이 사용되었다. 통계적 중요성이 분산 분석에서 동정될때, 보정을 위하여 다중 비교에대한 Scheffe's F 시험이 사용되었다. 잘못된 가정에 대하여 통계적으로 중요한 오차로 0.05 미만의 확률이 허용되었다.
결과
TNFα는 NCI-H292 세포내 EGF-R 생산을 자극한다. 첫째로 우리는 NCI-H292 세포가 EGF-R을 구성적으로 발현하는지 여부를 알아내었다. 면역블롯의 웨스턴 분석은 NCI-H292 세포 밀집 배양내 EGF-R 단백질의 존재를 동정하였다 (도 1A, 오른쪽). 세포는 밀집된 후 조사되었다. 용해물은 8% 아크릴아미드겔상에서 전기영동되고 항-EGF-R 항체로 블롯되었다. 마커 단백질의 분자량은 오른쪽에 보고된다. EGF-R의 파저티브 대조군은, 구성적으로 EGF-R을 발현하는 (Weber et al., 상기.) A431 세포 유래 단백질 (도 1A, 왼쪽)이었다. 항-EGF-R 항체를 이용한 면역세포화학 연구는, 분열중 세포에서 가장 강하게, 파저티브 염색을 나타내었다 (도 1B, NCI-H292세포 배양내 항-EGF-R 항체를 사용한 면역세포화학적 분석). 밀집된 때, 분열 중 세포에서 가장 강하게 (화살표, 오른쪽), 파저티브 염색이 보였다. 1차 항체가 없는 경우, 염색은 되지 않았다(왼쪽). 노던블롯은 TNFα(20ng/ml)에 의한, 제 12시간에서 존재하였고 제 24시간에서 증가된 효과인, EGF-R 유전자 발현 상향조절을 나타내었다 (도 1C, NCI-H292 세포내 EGF-R 노던블롯 분석). 분석은, TNFα(20ng/ml)와 함께 12 또는 24시간 항온처리된 밀집배양으로부터 추출된 총 RNA에 대하여 수행되었다. RNA는 포름알데히드-아가로스겔 상에서 전기영동되었고 나일론막으로 전달되었고, 32P-표지 EGF-R cDNA 프로브와 혼성화되었다. 혼성화 후에, 막은 세척되고 자동방사선사진이 수행되었다.
EGF-R 리간드는 NCI-H292 세포 점액 복합당질 및 MUC5 유전자 발현을 자극한다. NCI-H292 세포에서 EGF-R은 구성적으로 발현되므로 우리는 EGF-R 리간드 (EGF,TGFα)의 점액 복합당질 생산 유도능을 평가하였다 (도 2, 윗단, 뮤신 당단백질 동정을 위한 NCI-H292 세포의 Alcian blue/PAS 염색). 윗단 = 세포를 저해제 부존재하에 항온처리; 아랫단 = EGF-R 티로신 키나제 저해제 BIBX1522 (10㎍/ml)존재하에 항온처리. 세포가 단독으로 항온처리된 때 (대조군), 약간의 PAS-파저티브 염색이 나타나고 (화살표, 윗단); TNFα(20ng/ml)와 함께 항온처리는 효과를 보이지 않았고; EGF (25ng/ml) 또는 TGFα(25ng/ml)와 함께 항온처리는 PAS-파저티브 염색을 증가시켰다 (화살표); TNFα+ TGFα와 항온처리는 염색을 현저하게 증가시켰다 (화살표, 윗단).
약간의 대조군 세포는 염색을 나타내었다; TNFα단독과 항온처리는 염색에 영향이 없었고; EGF 또는 TGFα(각각 25ng/ml에서)와 함께 항온처리는 PAS-파저티 브 염색을 증가시켰다 (화살표); TFα+ TGFα와 함께 항온처리는 각각의 리간드 단독보다 훨씬 더 많이 염색을 증가시켰다. 그러므로, NCI-H292 세포에서 EGF-R 리간드는 점액 복합당질을 유도한다.
MUC5 유전자 발현을 조사하기 위하여, 노던블롯이 수행되었다 (도 3). 세포로부터 총 RNA (10㎍)가 추출되었고, 포름알데히드-아가로스겔 상에 전기영동되었고, 나일론막에 전달되었고, 32P-표지된 MUC5 cDNA 프로브로 혼성화되었다. 혼성화 후, 막은 세척되고 자동방사선사진이 수행되었다. 배양액은 배지 단독 (C), EGF 또는 TGFα(25ng/ml), TNFα(20ng/ml), 또는 TNFα+ EGF 또는 TGFα의 조합과 함께 MUC5유전자 발현에 대하여 제 12시간 (윗단) 또는 제 24시간 (아랫단)에서 얻어졌다. 배양액은 또한 EGF-R 티로신 키나제 저해제 (BIBX1522; 10㎍/ml; 아랫단)로 전항온처리한 후 TNFα+ EGF 또는 TGFα와 함께 얻어졌다; 본 저해제는 MUC5 유전자 발현을 저해한다.
NCI-H292 세포는 대조 상태에서 약간의 발현을 나타내었다 (도 3, 아래 왼쪽 단); 세포가 EGF 또는 TGFα와 항온처리되었을 때, MUC5 유전자는 제 12시간에서는 거의 인식되지 않았으나 제 24시간에서는 분명하게 발현되었다. TNFα단독은 MUC5 유전자 발현에 영향이 없었으나, TNFα가, EGF-R 리간드와 항온처리된 세포에 첨가되었을 때, MUC5 유전자 발현 수준은 EGF-R 리간드 단독에 의한 수준보다 현저하게 높게 증가되었다 (도 3).
EGF-R 티로신 키나제 저해제 (BIBX1522)는 점액 복합당질 발현 및 MUC5 유 전자 발현을 방해한다. EGF-R 수용체의 활성화가 MUC5 유전자의 발현을 유도한다는 가설을 시험하기 위하여, 세포는 EGF-R 티로신 키나제 저해제 BIBX1522와 항온처리되었다. NCI-H292 세포가 BIBX1522 (10㎍/ml)로 전처리되었을 때, PAS-파저티브 염색은 대조 상태에서 저해되었고, 그리고 EGF-R 리간드에 의하여 발생된 증가된 염색은 현저하게 저해되었다 (도 2, 아랫단). 노던블롯 분석에서, TNFα+ EGF 또는 +TGFα 조합에 의하여 현저히 증가되었던 MUC5 유전자 발현은 BIBX1522 전항온처리에 의하여 완전히 저해되었다 (도 3, 아랫단). 본 결과는 EGF-R 활성화가 NCI-H292 세포내 뮤신 유전자 및 점액 당단백질 유도와 관련됨을 나타낸다.
TNFα는 래트에서 EGF-R 생산을 자극한다. TNFα의 역할로 시작하여, (구성적인 기도상피 배상세포가 거의 없는) 무-병원물질 래트가 연구되었다. 대조 상태에서, 기관 상피는 EGF-R-파저티브 세포를 거의 포함하지 않았다 (도 4A, 왼쪽). 하지만, TNFα(200ng) 기관내 점적은, 기관내 각종 세포형에서 EGF-R 단백질을 유도하였다 (도 4A, 오른쪽). EGF-R-파저티브 염색은 배상세포 (G), 전-배상세포 (P-G), 무-과립 분비세포 (S), 및 기부세포 (Ba) 내에 존재하였으나 섬모세포에는 존재하지 않았다. 그러므로, TNFα는 EGF-R 단백질 생산을 유도한다.
래트 점액 복합당질 생산 및 MUC5 유전자 발현에서 EGF-R 리간드의 역할. 대조 상태에서, 기관 상피는 배상 및 전-배상세포를 거의 포함하지 아니한다. 기관내 EGF-R 리간드, EGF (600ng; 나타나지 않음) 또는 TGFα(250ng; 표 1) 단독 점적은 상피 점액 복합당질 생산에 영향이 없었다. 하지만, 24시간내 EGF 또는 TGFα에 의하여 이어지는, TNFα(200ng)이 먼저 주어지고 동물이 48시간후 안락사되면, Alcian blue/PAS 염색이 현저히 증가되었고, 그리고 세포 총수 또는 섬모세포의 수의 변화없이, 배상세포 및 전-배상세포의 수가 현저히 증가하였다 (표 1). MUC5 유전자에 대한 원위치 혼성화는 대조군 동물에서 발현 없음을 나타낸다. EGF 또는 TGFα로 이어지는 TNFα가 기관내 점적되었을 때, 상피에서 MUC5 발현을 볼 수 있었다. 그러므로, EGF-R 단독의 유도 또는 EGF-R 리간드 단독에 의한 자극은 배상세포 이형성 또는 점액 복합당질 생산에 불충분하였다. 하지만, TNFα에 의한 EGF-R 유도 후에는, EGF-R 리간드 점적은 배상세포 이형성을 현저히 자극하였다.
Figure 112001003507730-pct00003
표 1. 래트 기관 상피 세포상 매개체 및 오브알부민 민감화의 효과. 세포는 방법에 기술된대로 분석되었다; 한 군당 다섯 래트. (점액 복합당질을 염색하는) Alcian blue/PAS 염색에 의하여 특징화가 보조되었다. 세포수 측정에 부가하여, AB/PAS- 염색에 의하여 채워진 총 상피 면적 백분율이 측정되었다. 대조 기도 및 TGFα(250ng) 단독에 의하여 자극된 기도는 배상 및 전-배상세포를 거의 포함하지 않았다; AB/PAS로 거의 염색되지 않았다. TGFα에 의하여 이어지는 TNFα(200ng)은 배상 및 전-배상세포 수의 증가 및 AB/PAS-염색된 세포에 의하여 채워진 면적의 증가를 유발하였다. 오브알부민 (OVA) 복강내 (ip) 주사에 의한 래트의 민감화는 세포 분포 또는 AB/PAS 염색에 효과가 없었으나, OVA 기관내 (it) 점적에 의하여 이어지는 OVA가 ip로 주어지면, 배상 및 전-배상세포 및 AB/PAS 염색에 의하여 채워진 면적 백분율의 충격적 증가가 발견되었다.
래트 오브알부민 민감화는 EGF-R 및 배상세포 생산을 유도한다. 급성천식에 의한 사망이 기도 점액폐색 때문임이 보고되기 때문에, 천식의 모델이 무-병원성물질 래트에서 생산되었다. 제 0일 및 제10일의 오브알부민 주사 (10mg, ip)는 배상세포 이형성을 자극하지 않았다. 하지만, 이것이 제 20, 22 및 24일 세차례 기관내 오브알부민 점적으로 이어지고, 동물을 제 26일에 안락사시키면, 배상 및 전-배상세포의 수가 현저하게 증가했다; 섬모 및 기부세포의 수는 변화되지 않았다 (표 1). 항-EGF-R 항체를 이용한 면역조직화학적 연구는 대조군 기관내 염색이 일어나지 않음을 나타내었다. i.p. 및 i.t. 양자로 민감화된 동물은 AB/PAS로 파저티브 염색된 세포에서 선택적으로 EGF-R 염색을 나타내었다 (도 4B, 오른쪽). 세차례의 기관내 오브알부민 (0.1%, 100ml) 점적 후에, EGF-R 면역활성이, Alcian blue/PAS로 파저티브 염색되는 세포 (아래 오른쪽)와 동일한 세포인, 배상 및 전-배상세포 (아래 왼쪽)에서 강하게 발현되었다. 따라서, 천식의 오브알부민 모델은 EGF-R을 생산하는 세포에서 배상세포 증식을 나타내었다.
EGF-R 티로신 키나제 저해제 (BIBX1522)는, TNFα+ EGF-R 리간드 점적으로 그리고 래트내 오브알부민 민감화로 유도되는 배상세포 생산을 방해한다. BIBX1522가 배양세포내 뮤신 생산을 방해하기 때문에, 본 저해제의 효과가 무-병원물질 래트에서 조사되었다. EGF-R 리간드 TGFα로 이어지는 TNFα기관 점적으로 증가되는 Alcian-blue/PAS 염색은 BIBX1522 전처리에 의하여 투여량-의존 양식으로 저해되었다 (3 내지 30mg/ml, ip; 도 5A). EGF-R 리간드 TGFα로 이어지는 (EGF-R 유도를 유한) TNFα점적은 놀랄만한 배상세포 이형성을 유발한다.
오브알부민으로 민감화된 래트에서, BIBX1522 (10mg/kg, ip) 전처리는 배상세포 생산을 완전히 저해한다 (Alcian blue/PAS 염색으로 평가됨; 도 5B). 오브알부민이 ip로 주어진 동물은 기관지 표면에서 오직 극소량의 AB/PAS-파저티브 염색을 나타냈다. 먼저 OVA ip로 민감화되고, 세차례 OVA 기관내 (i.t.) 점적이 이어진 동물은 AB/PAS-파저티브 염색의 현저한 증가를 보였다.
본 연구는 EGF-R이, EGF-R 리간드에 의하여 자극된 때, EGF-R 활성화에 의한 효과 및 EGF-R 티로신 키나제 저해제에 의하여 방해되는 효과인 시험관내 및 생체내에서 배상세포 생산을 유도한다는 것을 암시한다. 천식 오브알부민 모델에서, 저해제는 또한 배상세포 생산 저해에 효과적이다.
배상세포 유도 기작을 기술하는것 외에, 본 결과는, EGF-R 발현에 기초하여 배상세포 생산의 가능한 진화 단계: TNFα에 의한 자극은 무-과립 분비세포의 짙은 염색을 유도하였고; 이어지는 EGF-R 리간드에 의한 활성화는 세포질내 점액 복합당질의 점진적 염색을 유발하였고 그리고 세포는 "전-배상" 및 그 다음 "배상"세포가 되었음을 시사한다. EGF-R 리간드로 이어지는 TNFα점적은, 상피세포 총 수의 변화없이 배상세포 생산을 유도하였는데, 이는 EGF-R 활성화가 선택적 세포 (증식이 아닌) 분화를 용이하게 하였다는 것을 시사한다. 본 발견은 배상세포가, EGF-R을 발현하는 무-과립화된 분비세포로부터 유래하였고 뮤신을 생산하기 위하여 EGF-R 리간드에 의하여 자극됨을 시사한다.
급성천식으로 사망한 환자에서, 배상세포 과분비 및 점액 폐색은 중요한 발견이다. 마우스 천식 모델에서, 기도 민감화는 오브알부민 반복 점적으로 발생하여, 현저한 기도 배상세포 과분비를 유발한다. 우리는 대조군 기도 상피에서 발현되지 않는 EGF-R이, 민감화된 동물에서 발현됨을 증명한다. 염색된 세포는 전-배상 및 배상세포이고 이는 EGF-R이 배상세포 생산에 관련됨을 시사한다. 상피 천식 배상세포 생산에서 EGF-R 활성화의 역할을 확인할 수 있도록, EGF-R 수용체 티로신 키나제 저해제 (BIBX1522)로의 전처리는 기도 배상세포 생산을 방해한다.
본 결과는 EGF-R 경로가 배상세포 과형성에 관련됨을 나타낸다. 선행 연구는 오존, 이산화황, 바이러스, 다당지질, 혈소판활성화인자, 및 인터루킨-4 같은 각종 자극이 뮤신 발현 및 분비를 상향-조절함을 증명하였다. 본 발명은 이런 면역자극 및 EGF-R 시스템간 관계를 평가하기 위한 기작을 제공한다.
천식은 본 발명의 치료학적 전략의 예 역할을 한다: 정상적 인간 기도 상피는 각 배상세포당 3 내지 10 비율의 섬모세포를 가진다. 천식에서는, 배상세포 수 가 섬모세포와 같거나 또는 그 이상이 될 수 있다; 천식지속상태 환자에서는, 비-천식 호흡성 질환으로 사망한 환자에서의 수와 비교하여, 배상세포로 채워진 면적 백분율 30-배 증가를 보인다. 배상세포 생산 저해는 이런 과분비 원인을 제거할 것이다. 배상세포의 생주기가 알려져 있지 않아서, 배상세포 과형성 소산의 시간적 추이는 정확하게 예견할 수 없다. 알러지원에 더 나아간 노출 없이, 선행적으로 민감화된 마우스에서 배상세포 과형성은, 다른 알러지 염증의 징후와 함께, 50일 이내에 소산된다. EGF-R 활성화 저해는, 배상세포 생주기에 따라, 배상세포 과형성을 더욱 빨리 저해한다. 최근에는, 강한 선별성 ATP-경쟁성 티로신 키나제 저해제가 보고되었다. EGF-R 티로신 키나제 저해제는 EGF-R 발현과 연관된 악성질병 치료로서 평가되고 있다.
많은 기도 만성 염증 질병에서 과분비는 주요 징후이다. 현재, 증상을 완화시키고 본 질병의 진행을 막을 효과적 요법이 없다. 본 발견은 치료를 위한 기작 및 전략을 제공한다: EGF-R 활성화의 저해를 통하여 배상세포 생산이 방지된다. EGF-R 활성화 저해가 과분비 기도 질환에서 치료법으로서 제안된다.
실시예2
배상세포 생산에서 산화적 스트레스의 역할
인간에서, 지속적 흡연 배상세포 과형성을 포함하는 말초 기도내 진행적 병리학적 변화와 연관됨이 시사되었다. 이와같이, 동물 흡연의 실험 모델은 기도 배상세포 과형성을 유발함이 나타났다. 하지만, 흡연에 의한 뮤신 합성 유도 기작은 알려져 있지 않다. 하기의 데이터는 후염증 시토카인-활성화 호중구 및 담배연기 가, 리간드-의존 EGF-R 활성화를 통하여 인간 기관지 상피 세포내 뮤신 MUC5AC 합성을 유발한다는 것을 증명한다. 이런 결과는 모집된 호중구 및 담배연기가, 기도내 비정상적 뮤신-생산 세포 유도를 유발하는 상피세포 분화의 조절자로서 관련됨을 나타낸다.
방법
호중구의 분리. 인간 호중구는 건강한 인간 기증자 유래 말초혈액으로부터 정제되었다. 호중구 분리는 Ficoll-Hypaque 구배 분리, 덱스트란 침강, 및 적혈구 저장 용균의 표준 기술에 의하여 수행되었다. 트리판블루 염색 배제에 의하면 세포는 일상적으로 >95% 생존하였다. 내독소 오염을 방지하기 위하여, 모든 용액은 0.1㎛ 여과지를 통과시켰다.
세포 배양. NCI-H292 세포는 10% 태아소 혈청, 페니실린 (100U/ml), 스트렙토마이신 (100㎍/ml) 및 Hepes (25mM)를 포함하는 RPMI 1640 배지로 37℃의 가습된 5% CO2 물자켓 항온기에서 성장시켰다. 세포 배양에는 6-샘 배양판 또는 8-실 슬라이드가 사용되었다. 밀집되어 자랄 때, 세포는, 호중구 (106 세포/ml) 단독, TNFα(재조합 인간 TNFα, 20ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA)단독, IL-8 (재조합 인간 IL-8, 10-8M, Genzyme) 단독, fMLP (10-8M, Sigma, St. Louis, MO) 단독, TNFα+ 호중구, IL-8 + 호중구, fMLP + 호중구, 과산화수소 (H2O2, 200uM) 담배연기용액 또는 TGFα(재조합 인간 TGFα, 0.1 내지 25 ng/ml, Calbiochem, San Diego, CA)와 함께 1시간 동안 항온처리되었다. 세포는 그 다음 세척되고 배지 단독과 함께 항온처리되었다. 실험은 전선택된 시간에 (mRNA에 대하여는 6시간, 12시간; 단백질에 대하여는 24시간) 종료되었다. 대조군으로서, 세포는 배지 단독으로, 같은 기간동안 항온처리되었다. 호중구를 사용한 다른 연구에서, MUC5AC 합성에 가장 강력한 효과를 지니므로, TNFα가 자극제로 선택되었다. NCI-H292 세포는, TNFα(20ng/ml)와 1시간동안 항온처리되고 그 다음 상층액 오염 (예를 들어, 호중구로부터 나온 분자)을 피하기 위하여 멸균 PBS로 세척된 호중구, 또는 상층액 단독과 항온처리되었던 NCI-H292세포와 함께 1시간 동안 항온처리되었다. EGF-R 티로신 키나제 저해제를 사용한 저해 연구에서, NCI-H292 세포는 BIBX1522 (10㎍/ml, Boehringer Ingelheim Inc., Ingelheim, Germany에 의하여 관대하게 제공된) 또는 트립신 AG1478 (10uM, Calbiochem)으로 자극을 첨가하기 30분전에 전처리되었다. 선별된 혈소판-유래 성장인자 수용체 티로신 키나제 저해제 (티르포스틴 AG1295, 100uM, Calbiochem) 및 티르포스틴의 네거티브 대조군 (티르포스틴 A1, 100uM, Calbiochem)의 영향 또한 조사되었다. EGF-R에 대한 차단 항체를 사용한 저해 실험에서, 상층액은 항-TNFα항체 (Calbiochem) 또는 항-EGF 항체로 30분간 전처리되었고 그 다음 NCI-H292 세포에 첨가되었다. 산소 자유라디칼의 역할은 산소 자유라디칼 탐식자인 DMSO (1%, Sigma), 1,3-디메틸-2-티오유레아 (DMTU, 50mM, Sigma), 또는 수퍼옥사이드 디스뮤타제 (SOD, 300U/ml, Sigma)를 사용하여 조사되었다.
담배연기용액의 준비. 본 연구에는 연구용 담배 (code2R1, University of Kentucky Tobacco and Health Research Foundation을 위하여 생산된)가 사용되었 다. 담배연기용액은 전기된 대로 (Dusser et al. (1989) J. Clin. Invest. 84: 900-906) 준비되었다. 요약하면, 담배연기는 폴리프로필렌 주사기 (35ml) 안으로 한 번 분 연기/분의 속도로 (10번) 품어져서 천천히 50mM Hepes 완충액을 포함하는 20ml RPMI1640 내로 넘쳐 들어가게 하였다. 연기용액은 그다음 pH 7.4로 적정되었고 준비후 즉시 사용되었다.
NCI-H292 세포내 점액 복합당질 및 MUC5AC 단백질의 가시화. 실험의 마지막에, 8-실 슬라이드에서 성장한 세포는 4% 파라포름알데히드로 1시간동안 고정되었고, 그 다음 점액 복합당질을 가시화하기 위하여 Alcian blue/periodic acid-Schiff (PAS)로 염색되거나 또는 MUC5AC 면역세포화학을 위하여 사용되었다. MUC5AC 면역세포화학을 위하여, 0.05% Tween20, 2% 정상 염소혈청 및 Levamisol (2mM)을 포함하는 PBS가 항체희석액으로 사용되었다. 세포는 MUC5AC에 대한 마우스 mAb (클론 45M1, 1:200, Neo Markers, Fremont, CA)로 실온에서 1시간 동안 항온처리되었고, 그다음 여분의 1차항체를 제거하기 위하여 세차례 PBS로 세척되었다. 세포는 그 다음 비오틴결합 말 항-마우스 IgG (Vector Laboratory Inc., Bulingame, CA) 1:200 희석비로 실온에서 1시간 항온처리되었다. 결합된 항체는 아비딘-비오틴-알칼린 인산화효소 복합체의 표준 절차에 따라 가시화되었다.
인간 MUC5AC 유전자의 원위치 혼성화. 인간 MUC5AC의 298bp cDNA 단편은 TA 클로닝벡터 (Invitroen, San Diego, CA)에 삽입되었다. RNA의 준비 및 원위치 혼성화는 전기한대로 수행하였다.
MUC5AC 단백질의 면역분석. MUC5AC 단백질은 전기한대로 측정되었다. 요약하 면, 세포용해물은 PBS 이용 다중희석에서 준비되었고, 각 표본 50㎕는 중탄산-탄산 완충액 (50㎕)과 40℃, 96-샘 평판 (Maxixorp Nunc, Fisher Scientific, Santa Clara, CA)에서 건조될 때까지 항온처리되었다. 평판은 다시 PBS로 세차례 세척되었고 2% BSA (fractionV, Sigma)로 1시간동안 실온에서 차단되었다. 평판은 다시 PBS로 세차례 세척되었고 그 다음 0.05% Tween20을 포함하는 PBS로 희석된 50㎕ 마우스 단일클론 MUC5AC 항체 (1:100)로 항온처리되었다. 1시간후, 평판은 PBS로 세차례 세척되고, 그리고 100㎕ 고추냉이 페르옥시다제-염소 항-마우스 IgG 혼성체 (1:10,000, Sigma)가 각 샘 안으로 분배되었다. 1시간후, 평판은 세차례 세척되었다. 정색반응이 TMB 페르옥시다제 용액 (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)으로 현상되었고 2N H2SO4로 정지되었다. 흡광도는 450nm에서 측정되었다.
TGFα단백질의 정량 분석. TGFα단백질은 시중구입 가능한 ELISA 키트 (Sigma)를 사용하여, 제조자의 지시에 따라 측정되었다. 1시간동안 호중구 + TNFα(20ng/ml)과 항온처리한 후 취하여진 상층액은, 1% Triton X-100, 1% 소듐 디옥시콜레이트 및 몇몇 프로테아제 저해제를 포함하는 PBS 용균 완충액과 혼합되었고, 그 다음 TGFα측정에 사용되었다.
EGF-R 단백질에 대한 면역침강 및 티로신 인산화에 대한 면역블롯팅. 세포는 24시간 혈청-결핍되었고, 그 다음 TGFα, H2O2 또는 활성화된 호중구 상층액으로 15분간 자극되었다. 자극후, 세포는 용균되고 그리고 30분간 4℃ 궤도 쉐이커에서 항온처리되었다. 불용성 물질을 제거하기 위하여, 세포용해물은 14,000rpm에서 4℃ 5분간 원심분리된다. 균등한 단백질양을 포함하는 상층액 일정분량은 항-EGF 수용체 항체 (폴리클론, Ab4, Calbiochem) 및 20㎕ 단백질A-아가로스 (Santa Cruz)로 4℃에서 2시간동안 면역침강된다. 침강물은 세차례 0.5ml 용균 완충액으로 세척되었고, SDS 표본 완충액에 풀어넣고, 그리고 5분간 끓였다. 단백질은 8% 아크릴아미드겔내 SDS-PAGE에 의하여 분리되었다. 결과적 겔은 전달 완충액: 25mM Tris-HCl, 192mM 글리신, 20% (부피/부피) 메탄올, pH 8.3에서 평형화 되었다. 단백질은 그 다음 전기영동으로 니트로셀루로스막 (0.22㎛)에 전달되었고, 0.05% Tween20을 포함하는 PBS내 5% 무지방 탈지유로 하룻밤 차단되었고, 그 다음 단일클론 항-포스포티로신 항체 (1:100, Santa Cruz)와 1시간 항온처리되었다. 결합된 항체는 아비딘-비오틴-알칼린 포스파타제 복합체 방법 (ABC 키트, Vector Laboratories)에 대한 표준 절차에 따라 가시화되었다.
통계. 모든 데이터는 평균 ±SEM 으로 표시된다. 군간에 통계적인 심한 오차를 측정하기 위하여 분산의 일방 분석이 사용되었다. 통계적 중요성이 분산 분석에서 동정될 때, 보정을 위하여 다중 비교에 대한 Scheffe's F 시험이 사용되었다. 잘못된 가정에 대하여 통계적으로 중요한 오차로 0.05 미만의 확률이 허용되었다.
결과
활성화된 호중구가 뮤신 MUC5AC 합성을 유발한다. 호중구 + 호중구를 활성화하는 자극 (IL-8, fMLP, TNFα)이 NCI-H292 세포와 1시간 항온처리 되었을 때 MUC5AC 단백질 합성은 24 시간내에 현저히 증가되었지만, 무-자극 호중구 (106/ml), IL-8 단독, 또는 fMLP 단독은 MUC5AC 단백질 합성에 영향이 없었고; TNFα단독과 항온처리에서는 작고 현저하지 않은 MUC5AC 단백질 증가를 유발하였다. 호중구가 TNFα 로 1시간동안 전항온처리되고, 그 다음 호중구 및 그 상층액이 분리되었을 때, 이어지는 상층액의 NCI-H292 세포와의 1시간 항온처리는 12시간 이내에 MUC5AC 유전자 발현을 상향조절하였고, 24시간 이내에 Alcian blue/PAS 및 MUC5AC 단백질에 대한 항체에 의한 염색이 자극되었다; 결과적 NCI-H292 세포는 MUC5AC 유전자 발현을 거의 나타내지 않았고, Alcian blue/PAS 및 MUC5AC 단백질 양자의 작고 간헐적인 염색을 나타냈다. 상층액에 의하여 유도되는 MUC5AC 단백질 합성은 대조군으로부터 현저하게 증가되었다; 항온처리 후 상층액으로부터 분리된 호중구는 아무런 효과가 없었다. 활성화된 호중구는, MUC5AC 합성을 유발하는, 활성 산물을 빠르게 분비한다고 결론내렸다.
EGF-R 티로신 키나제 저해제는 활성화된 호중구 상층액에 의하여 유도된 MUC5AC 합성을 방해한다. EGF-R 리간드는 NCI-H292 세포에서 EGF-R 티로신 키나제 활성화를 통하여 MUC5AC 합성을 유발하는 것으로 알려져있기 때문에, 활성화된 호중구 상층액으로 유도된 MUC5AC 합성에서 EGF-R의 역할이 조사되었다. NCI-H292 세포의, 선택된 EGF-R 티로신 키나제 저해제 (BIBX1522, AG1478)로의 전처리는, 통상 활성화된 호중구 상층액으로 유도되는, MUC5AC 단백질 합성을 방해한다. 선택된 혈소판-유래 성장인자 수용체 키나제 저해제 (AG1295) 및 티르포스틴에 대한 네거티 브 대조군 (A1)은 효과가 없었다. 본 결과는, EGF-R 티로신 키나제 활성화가, 활성화된 호중구 상층액으로 유도된 MUC5AC 합성에 관련됨을 나타낸다.
MUC5AC 합성에서 활성화된 호중구 상층액에서 분비되는 EGF-R 리간드의 역할. EGF-R 티로신 키나제 활성화가 EGF-R 리간드 (EGF 및 TGFα)에 의존하는지 여부를 결정하기 위하여, 활성화된 호중구 상층액을 EGF-R 리간드에 대한 중화 항체로 전항온처리 하였다. 상층액의 항-TGFα항체 또는 항-EGF 항체로의 전항온처리는, 활성화된 호중구 상층액으로 유도된 MUC5AC 합성을 저해하지 않았다. 더 나아가, TGFα는 상층액에서 검출되지 않았다. 그러므로, 활성화된 호중구 상층액으로 유발된 EGF-R 티로신 인산화는 EGF-R 리간드, EGF 및 TGFα와 독립적 기작으로 유도되었다.
담배연기 및 산소 자유라디칼이 MUC5AC 합성을 유발한다. 담배연기 및 산소 자유라디칼, H2O2는 TGFα가 그랬던 것 처럼 12시간 이내에 MUC5AC 유전자 발현을 상향-조절하였다. 마찬가지로, 모든 자극은 24시간이내에, 투여량-의존 양식으로 발생된 효과로서, MUC5AC 단백질 합성 및 점액 복합당질 합성을 증가시켰다. H2O2에 반응한 최대 MUC5AC 합성은 TGFα에 반응한 경우보다 현저하게 적다. AG1478로의 전처리는, 모든 자극으로 유도된 MUC5AC 단백질 합성을 방해했는데, 이는 자극이 EGF-R 티로신 키나제 활성화에 의한 뮤신 합성을 유발함을 나타낸다. 활성화된 호중구 상층액, 담배연기 및 H2O2에 의한 MUC5AC 합성은 자유라디칼 보족제 (DMSO 및 DMTU) 및 SOD로의 전처리에 의하여 현저하게 저해되었으나, TGFα에 의한 MUC5AC 단백질 합성은 DMSO 또는 SOD에 의하여 영향받지 아니하였다.
활성화된 호중구 상층액 및 H 2 O 2 에 의한 EGF-R 티로신 인산화 유도. EGF-R의 분포는 혈청-결핍 대조군 및 모든 자극 조건 (활성화된 호중구 상층액, 담배연기, H2O2 또는 TGFα)에서와 유사하였다. 총 단백질 티로신 인산화는 활성화된 호중구 상층액, 담배연기, H2O2 또는 TGFα 첨가 후 15분 이내에 발생하였다; 헐청-결핍 대조군은 효과를 나타내지 않았다. TGFα의 인산화 여부를 결정하기 위하여, 항-EGF-R 항체에 의한 면역침강이 수행되었다: 활성화된 호중구 상층액, 담배연기의 가용성 산물, 및 H2O2 모두, TGFα에 의하여 유발되는 것과 유사한 효과로, 15분 이내에 EGF-R-특이적 티로신 인산화를 유도하였다. NCI-H292 세포의 AG1478 전처리는 모든 자극에 의한 EGF-R 티로신 인산화를 저해하였다. DMSO는 상층액-, 담배연기-, 및 H2O2-유도된 EGF-R 티로신 인산화를 저해하였으나, DMSO는 TGFα-유도된 EGF-R 티로신 인산화에는 효과가 없었다.
상기 결과는, 세포가 IL-8, fMLP, 또는 TGFα로 활성화될 때, NCI-H292 세포에서 호중구가 뮤신 MUC5AC 합성을 유발함을 나타낸다. 더우기, 호중구를 TGFα와 항온처리후 1시간에 수집한 상층액은, 선별된 EGF-R 티로신 키나제 저해제에 의하여 저해되는 효과인 MUC5AC 합성을 유발하였다. EGF-R 티로신 키나제 저해는, 활성화된 호중구 상층액으로 유발된 MUC5AC 합성을 완전히 차단하였다; 비-EGF-R 티로신 키나제 저해제, 선택적 혈소판-유래 성장인자 수용체 키나제 저해제 (AG1295) 및 티르포스틴에 대한 네거티브 대조군 (A1)은 효과가 없었는데, 이는 EGF-R 티로신 인산화가 활성화된 호중구 상층액으로 유도된 MUC5AC 합성 신호 경로임을 암시한다.
활성화된 호중구 상층액이 EGF-R 티로신 인산화를 유도하는 기작을 더 나아가 분석하기 위하여, 리간드-의존 및 리간드-비의존 EGF-R 양자 경로가 조사되었다. 첫째로, 우리는 활성화된 호중구 상층액내 TGFα를 측정하였고 상층액은 측정할 수 있는 양의 TGFα를 포함하지 않음을 발견하였다. 선행된 보고는 호중구는 오직 낮은 농도 (2.5pg/106세포)의 TGFα만을 포함함을 증명하였다. 활성화된 호중구 유래 상층액의 MUC5AC 합성에의 영향은, 호중구에서 발견되는 양보다 400배 많은 양인 1ng TGFα와 같은 정도로 강력하였다. 두째로, 우리는 EGF-R 리간드 중화 항체를 이용한 차단 실험을 수행하였다: EGF 및 TGFα중화항체로 전처리는, 활성화된 호중구 상층액으로 유발된 MUC5AC 합성 저해에 실패하였다. 이 결과는 호중구 상층액-유도 MUC5AC 합성은 호중구에 의한 EGF-R 리간드 (TGFα및 EGF)의 분비 때문이 아님을 시사한다. 그 다음, 우리는 리간드-비의존 경로를 조사하였다: 활성화 동안 산소 자유라디칼이 호중구에의하여 방출됨 및 이들이 각종 세포에서 EGF-R 티로신 키나제 트랜스활성화를 유도함이 알려져 있으므로, 우리는 활성화된 호중구에 의한 산소 자유라디칼의 방출이 NCI-H292 세포에서 EGF-R 티로신 인산화 및 결과적 MUC5AC 합성을 유발한다고 가정하였다. 자유라디칼의 보족제(DMSO 및 DMUT) 및 SOD는 활성화된 호중구 상층액에 의한 MUC5AC 합성을 저해하였다. TNFα는 호중구 현 탁액에서, 1시간이내에 최대반응을 나타내는, 산화적 폭발을 유발하는 것으로 보고되었다; 본 결과도 유사한 시간 경과를 나타낸다.
본 연구에서, 산화적 폭발 동안 호중구에서 방출되는 주요 산물인, 외재성 H2O2는 NCI-H292 세포에서 MUC5AC 합성을 유발하였다. 그러나, MUC5AC 합성에서 H2 O2에 대한 최대 반응은 TGFα에 대한 반응의 오직 절반이었다. 본 연구의 중대한 발견은 담배연기 단독으로도 MUC5AC 합성을 유발하였다는 사실이다. 이는 담배연기가 생체내에서 직접자극 간접자극 양자를 통하여, 호중구 모집에 의한 MUC5AC 합성을 유발할 수 있음을 시사한다. MUC5AC 합성을 유발하는 담배 연기내 정확한 분자는 아직 분명하지 않다. 담배연기는 다중 산물 (예를 들어, 니코틴, 타르, 에크롤레인 및 강산화성물질)을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 본 실험에서, DMSO 및 SOD는 담배연기로 유도된 MUC5AC 합성을 부분적으로 저해하였다. 따라서, 강산화성물질 스트레스는 본 반응을 생산하는 한 기작일 수 있다. 담배연기-유도 MUC5AC 합성이 EGF-R 티로신 키나제 저해제에 의하여 완전히 차단된다는 사실은 EGF-R 활성화가 담배연기-유도 MUC5AC 합성에 중요한 역할을 함을 암시한다.
기도 질환에서, 호중구성 기도 염증은 흔한 증상이고, 호중구는 시토카인 및 담배연기에 의하여 모집되고 그리고 활성화된다. 본 연구는 모집된 호중구 및 담배연기는 또한, 기도 뮤신-생산 세포의 유도를 유발하는 상피세포 분화의 조절자로서 역할을 함을 나타낸다. 가장 중요하게는, EGF-R 활성화의 저해는 과분비 기도 질환에서 치료법으로 유용할 것이다.
실시예3
기도 상피 상처는 배상세포 이형성을 유발한다
기도내로 점적된 아가로스마개는 기관지를 폐쇄하지는 않고 장기간 기관지에 박힐 것이고, 머물러있는 마개는 염증을 일으켜 배상세포 이형성을 유발할 것으로 가설이 세워졌다. 국소 염증세포 모집과 연관되어, Alcian blue/PAS-파저티브 염색 및 뮤신 MUC5AC 유전자 발현으로 나타나듯, 아가로스마개가 현저한 국지적 배상세포 생산을 유도함이 증명된다. 본 결과는 EGF-R 활성화가 마개-유도 배상세포 이형성에 관련됨을 나타낸다.
방법
동물. 실험동물 절차는 Committee on Animal Research of the University of California San Francisco에 의하여 승인되었다. 특정 무-병원물질, 수컷 F344 래트 (230 내지 250g 몸무게; Simonsen Lab., Gilroy, CA)가 사용되었다. 래트는 환경적으로 조적되는 박판 흐름 후드가 있는 무-병원물질 BioClean 우리에 수용되었다; 동물은 멸균 사료 및 물에 자유롭게 접근하도록 하였다.
약물. 하기의 기원에서 유래한 약물이 사용되었다: 시클로포스파미드 (Sigma, St. Louis, MO), 메토헥시탈 소듐 (Brevital, Jones Medica Industries, Inc., St. Louis, MO), 펜토바비탈 소듐 (Nembutal, Abbott Lab., North Chicago, IL); EGF-R 티로신 키나제의 선택적 저해제 (Boehringer Ingelheim, Inc., Ingelheim, Germany에 의하여 관대하게 제공됨)인 BIBX1522는 하기의 용액: 2ml 폴리에틸렌글리콜 400 (Sigma, St. Louis, MO), 1ml 0.1N HCl, 및 3ml 2% 만니톨 수 용액 (pH 7.0)에 용해되었다. NPC 15669 (백혈구 운동성 저해제)는 Scios Nova. Inc., Mountain View, CA에 의하여 친절하게 제공되었다.
아가로스마개. 아가로스마개 (직경 0.7 내지 0.8 mm)는 멸균 포스페이트-완충액 식염수 (PBS)내 4% 아가로스 타입II 기질 EEO (Sigma, St. Louis, MO)로 제작되었다. 조직내 아가로스마개를 가시화하기 위하여, 아가로스을 50℃에서 녹인후 3% 현탁 Monastral blue B (Sigam, St. Louis, MO)가 첨가되었다.
실험 절차. 우리는, 일반적으로 기도 배상세포가 거의 없는 무-병원물질 래트를 연구하였다. 동물은 메토헥시탈 (Brevital, 25mg/kg, i.p.)로 마취되었다. 기관은 중선 경관 절개로 무균적으로 노출되었고, 아가로스마개는, 절개된 기관내로 관통된 폴리에틸렌 관 (PE 90, 내경 0.86mm 및 외경 1.27mm, Clay Adams, Parsippany, NY)에 연결된 20 게이지 Angiocath (Becton Dikinson, Sandy,UT)를 통하여 기관지내로 점적되었다. 폴리에틸렌관은 오른쪽 기관지로의 선택적 점적을 허용하기 위하여 30°구부러졌다. 점적후, 절개는 봉합으로 닫혀졌다.
아가로스마개-유도 배상세포 이형성에 대한 EGF-R의 역할을 평가하기 위하여, 동물은, 헌천마개 점적 1시간전에 BIBX1522 (80mg/kg, i.p.)로 처리되었고 매일 반복되었다 (40mg/kg, i.p.,bid). 동물은 아가로스마개 점적후 24, 48 또는 72시간에 안락사되었다.
아가로스마개-유도 배상세포 이형성에 대한 TNFα의 역할을 평가하기 위하여, 동물은 TNFα중화 항체 (Genzyme, Boston, MA)로 처리되었다. 제 1회 처리 (0.2ml 식염수내 100㎕, i.p.)는 아가로스마개 점적 1시간 전에 주어졌고 i.p. 주사는 매일 반복되었다. TNFα중화 항체는 피하로 이식된 삼투 미니펌프 (Alzet 2ML1, Alza Corp., Palo Alto, CA)를 통하여 불어 넣어졌다 (10㎕/시간).
아가로스마개-유도 배상세포 이형성에 대한 호중구의 영향을 연구하기 위하여,래트는 시클로포스파미드 (골수 백혈구 저해제) 또는 시클로포스파미드 + NPC 15669 조합으로 전처리되었다. 시클로포스파미드 (100mg/kg, i.p.)는 아가로스마개 점적 5일전에 주어졌고, 시클로포스파미드 (50 mg/kg, i.p.) 2회째 주사는 마개 점적 1일전에 주어졌다. NPC 15669를 사용한 연구에서, 본 약물 (10mg/kg, i.p.)은 아가로스마개 점적 1시간 전에 주사되었고, 그때부터 3일간 매일 주사되었다.
모든 약물 (BIBX1522, TNFα중화 항체, 시클로포스파미드, 및 NPC 15669)은 아가로스마개 점적 1시간전 i.p.로 주어졌고, 투약량은 3일간 매일 반복되었다.
조직 준비. 아가로스마개 점적후 다양한 시간대에, 래트는 소듐 펜토바비탈 (65mg/kg, i.p.)로 마취되었고, 전신순환은 디에틸 피로칼보네이트-처리 PBS내 1% 파라포름알데히드로 120mmHg 압력으로 관류되었다. 오른쪽 허파가 제거되고 4% 파라포름알데히드에 1시간동안 놓여지고 그리고 동결보존을 위하여 30% 수크로스로 교체되었다. 조직은 O.C.T. 화합물 (Sakura Finetek U.S.A., Inc., Torrance, CA)에 감싸졌다. 메타크릴레이트 절편을 위하여, 조직은 4% 파라포름알데히드에 24시간동안 놓여졌고 그 다음 에탄올 농도경사로 탈수 되었고 메타크릴레이트 JB-4 (Polysciences, Inc., Warrington, PA)에 둘러싸여졌다. 조직절편 (4㎛ 두께)은 Alcian blue/PAS로 염색되었고 헤마톡실린으로 역염색되었다.
기관지 상피의 형태측정적 분석. 상피내 점액 복합당질의 Alcian blue/PAS- 염색된 면적의 백분율은, 선행되어 간행된 방법에 따라 반-자동화 영상분석 시스템을 사용하여 결정되었다. 상피 내의 상피 및 Alcian blue/PAS-염색된 점액 접합체의 면적은 수동으로 측정되고 NIH 영상 프로그램 (U.S. National Institute of Health에서 개발되고 zippy.nimh.gov 유래 FTP에의하여 인터넷으로 또는 National Technical Information Service, Springfield, VA, 부분번호 PB95-500195GEI 유래 플로피 디스켓으로 이용가능 함)을 사용하여 분석되었다. 데이터는 Alcian blue/PAS 염색으로 채워진 총 상피 면적의 백분율로 표현되었다. 점액분비를 반-정량적으로 평가하기 위하여, 총길이에 대한 비율로서 파저티브 염색된 길이측정에 의하여, Alcian blue/PAS-파저티브 염색으로 채워진 상피 표면의 길이의 백분율이 결정되었다. 벗겨진 상피의 백분율은, 총 상피길이에 대한 벗겨진 표피 길이의 비율 측정으로 결정되었다.
메타크릴레이트 절편에서 세포형의 동정 및 세포 분석. 기름담금 대물렌즈 (x 1000 배율)로 2mm 기부박막 너머 상피세포핵을 세어서 상피세포의 수를 측정하였다. 상피 각 분석 영역 아래 기부박막의 직선길이는 기부박막의 디지탈리스된 이미지의 윤곽을 추적하여 측정되었다. 상피세포는 전기된대로 동정되었다. 요약하면, 기부세포는 큰 핵의 납작한 세포로서, 기부박판 바로 위에 위치하지만 기도 관강에는 미치지 않는 것으로 동정되었다. 세포질은 짙게 염색되고, Alcian blue 또는 PAS-파저티브 과립은 존재하지 않는다. 섬모성 세포는 그것의 섬모성 태두리, 옅게 염색된 세포질, 및 큰 둥근 핵에 의하여 인식된다. 무-과립 분비 세포는 원통형이고 관강에서부터 기부박막까지 연장되어있다. 기관내 아가로스마개 점적후, "발생하는" 배상세포 (전-배상세포)가 형성되었다. 이들 세포는 Alcian blue/PAS-파저티브 염색을 나타내었고, 과립은 작고, 세포는 과립으로 채워지지 않았다; 이들 세포는 작은 점액-염색된 면적 (기부막부터 관강면까지의 상피 높이의 1/3 이하) 또는 드물게 및 옅게 Alcian blue/PAS-염색된 작은 과립을 포함하였다. 결정되지 않은 세포형은, 적당한 분류를 위한 충분한 세포질 특질을 결여한 세포 윤곽으로 정의되었다.
면역조직화학적 EGF-R 위치측정. EGF-R의 존재는, EGF-R에 대한 단일클론 마우스 항체 (Calbiochem, San Diego, CA)를 사용하여, 면역조직화학적 위치결정으로 결정된다. 미리 준비된 4㎛ 동결 절편이 4% 파라포름알데히드로 후-고정되었고, 0.3% H2O2/메탄올로 처리되었다. 본 조직은 EGF-R 항체 (1:250 희석)와 항온처리되었다. 스트렙토아비딘-페르옥시다제 복합체로 이어지는,비오틴결합 말 항-마우스 IgG (1:200; Vector Lab., Burlingame, CA)가, 3,3'-디아미노벤지딘 테트라히드로클로라이드 (Sigma, St. Louis, MO)로 염색된 항원-항체 복합체를 가시화하기 위하여 사용되었다. 네거티브 대조군 슬라이드는 1차 또는 2차 항체가 빠지고 PBS로 대체되어 항온처리되었다.
원위치 혼성화. [35S]-표지된 리보프로브는 CArol Basbaum 박사에 의하여 친절하게 제공된 래트 MUC5AC 320bp cDNA 단편을 포함하는 플라스미드로부터 생성되었다. 절편은 [35S]-표지 RNA 프로브 (2,500 내지 3,000 cpm/㎕ 혼성화 완충액)로 혼성화되었고, RNase A 처리를 포함하는 긴축조건 하에서 세척되었다. 7내지 21일 자동방사선사진 후, 사진 에멀젼은 현상되고, 슬라이드는 헤마톡실린으로 염색되었다.
기도 상피 내 호중구 측정. 기관지내로의 호중구 유입의 평가는 호중구를 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드로 수행되었고, 많은 호중구는 기도 관강 및 상피에서 측정되었다; 결과는 기부박막 길이 mm 당 염색된 세포 수로 표현되었다.
기관지폐포성 세정 (BAL). 각 동물 군에서 미분적 세포계산을 평가하기 위하여, 허파가 5차례 3ml일정분량 멸균 PBS로 세정되었고, 세정물은 합하여져 부피가 계산되었다. BAL 내 세포는 세정액의 1,000rpm, 10분간 원심분리로 수집되었다. 10㎕ 세포 혼탁액은 그 다음 BAL 용액내 세포수를 결정하기 위하여 헤마토사이토미터로 계산되었다. 미분적 세포 계산은 Diff-Quik (American Scientific Products, McGaw Park, IL)으로 염색된 세포스펀 준비상에서 수행되었다. 미분적 세포계산은 각 세포스펀 슬라이드상에서 적어도 200 세포 표본추출에 의하여 얻어진다.
통계적 분석. 모든 데이터는 평균 ±SE 으로 표시된다. 통계적 분석을 위하여, Student t 검사로 이어지는 분산의 양방 또는 일방 분석 (ANOVA)이 적당하게 사용되었다. 0.05 미만의 확률이 통계적으로 중요한 오차로 간주되었다.
결과
기도 상피구조에 대한 영향. 아가로스마개가 기도 상피구조에 영항을 미치는지 결정하기 위하여, 아가로스마개가, 5 무-병원물질 래트의 오른쪽 기관지 내로 점적되었다. 대조군 동물에서, 기관지 상피는 배상세포를 거의 포함하지 않았다. 그러나, 국소 아가로스마개 점적후, Alcian blue/PAS 염색은, 점적 후 제 24시간에서부터 검출가능하고 제 72 시간에서 최대인, 시간-의존 배상세포 면적의 증가를 나타내었다. 제 24시간에서, 아가로스마개는 현저한 전-배상 및 배상세포 수 증가를 생산하였고, 제 48시간에는 더 많은 성숙 배상세포가 발견되었다 (표 1). 제 72시간에서, 아가로스마개는 배상세포 수를 증가시켰다 (P<0.01); 기부 및 섬모세포 수는 변화하지 않았다 (P>0.05). 점적 72시간 후 mm 기부박막 당 상피세포 총 수는 약간, 그러나 현저하지 않게 증가되었다 (P>0.05, 표 1); (상피의 기부막부터 관강면까지 측정된) 상피의 높이는, 대조군 기도 16.0 ±1.2㎛로 부터 마개 점적후 제 72시간에 38.1 ±9.1㎛까지 증가되었다 (n = 5, P<0.01).
대조군 동물 기도 관강에서, Alcian blue/PAS 염색은 없었다. 그러나, 아가로스마개에 인접하여 관강내 파저티브 염색이 나타났는데, 이는 점액 복합당질 분비가 일어났음을 가리킨다. 아가로스마개가 있는 기도내, 시간-의존적으로 염색이 증가되었다. 마개 인접 기도내 Alcian blue/ PAS-파저티브 염색으로 채워진 상피 총길이 백분율은, 대조군 동물의 0.1 ±0.1% 에서 제 24시간, 48시간, 및 72시간의 4.7 ±1.4%, 13.3 ±0.7%, 및 19.1 ±0.7% (n = 5)로 증가하였다. 더 나아가, 아가로스마개는 마개된 기관지 상피를 각각 제 24시간, 48시간, 및 72시간에, 총면적의 13.5 ±2.3%, 6.9 ±2.4%, 및 5.1 ±1.5% 만큼 벗겼다.
뮤신 유전자 발현에 대한 아가로스마개의 영향. 대조군 래트에서, 기관지내 MUC5AC의 암티센스 프로브로 검출할 수 있는 신호가 없었다 (군 당 n =4). 아가로스마개가 점적된 기관지내에서, 제 24부터 72 시간까지 시간-의존적으로 증가된 MUC5AC에 대한 신호가 있었다 (n = 4). MUC5AC 유전자 발현은 바람직하게 Alcian blue/PAS로 파저티브 염색된 세포내에서 발견되었다. 다른 세포형 (예를 들어, 민무늬근, 연결조직)에서는 신호가 검출되지 않았다. MUC5AC 센스 프로브로 조사된 절편은 발현을 나타내지 않았다.
기도 상피내 EGF-R 발현에 대한 아가로스마개의 영향. 대조군 동물에서, EGF-R에 대한 항체로의 면역염색은 상피에서 드문 염색을 나타냈다. 그러나, 아가로스마개 점적후, 아가로스마개인접 상피는, Alcian blue/PAS로 파저티브염색된 세포내에서 EGF-R-파저티브 염색을 나타냈다. EGF-R에 대한 염색 패턴은 MUC5AC 및 AB/PAS에 대한 염색과 대응하였다. 전-배상, 배상, 및 무-과립 분비세포는 EGF-R에 대하여 면역파저티브이다. 섬모세포는 면역활성을 나타내지 않았다. 아가로스으로 폐쇄되지 않은 기도에서, 상피는 EGF-R에대한 염색을 거의 나타내지 않았고 대조군 동물의 염색과 유사하게 나타났다.
배상세포 이형성 및 뮤신 유전자 발현에 대한 EGF-R 티로신 키나제 저해제의 영향. 본 연구에서, 아가로스마개 점적은, 뮤신을 생산하는 세포내 EGF-R 발현을 유발하였다. EGF-R은 티로신 키나제 수용체 부류의 일원이다. 따라서, EGF-R 리간드 (EGF 또는 TNFα)가 EGF-R에 결합되면, 특이적 EGF-R 티로신 키나제가 활성화된다. 그러므로, EGF-R 활성화가 아가로스마개 점적 후 MUC5AC 유전자 및 점액 복합당질 발현을 유도한다는 가설을 검증하기 위하여, EGF-R 티로신 키나제 저해제 (BIBX1522)가 래트 복강내로 주사되었다. BIBX1522는, 제 24, 48, 및72 시간에서 상피 아가로스마개-유도 Alcian blue/PAS-염색 면적을 현저하게 저해하였다. 마개 점적후 72시간에서 MUC5AC 유전자 발현 또한 완전히 저해되었다.
배상세포 이형성 및 EGF-R 단백질 발현에 대한 TNFα중화 항체의 영향. 우리는 아가로스마개 유래 염증 중 TNFα가 방출된다는 가설을 세웠다. 그러므로, 우리는 래트에의 TNFα중화 항체로 전처리가 아가로스마개-유도 배상세포 이형성에 끼치는 영향을 시험하였다: TNFα중화 항체로 전처리된 동물에서 (n = 5), 아가로스마개는 더이상 EGF-R 단백질 발현 또는 Alcian blue/PAS-파저티브 염색 (배상)세포 생산을 자극하지 않았다.
아가로스마개에 의한 염증세포 모집. 아가로스마개가 상피 손상 및 염증 세포 침윤을 유발한다는 것이 관찰되었다. 각종 감염세포는 TNFα및 EGF-R 리간드 양자를 생산할 수 있다. EGF-R 및 그 리간드 양자는, 배상세포 이형성을 이끄는 EGF-R 연쇄에 관련된다. 우리는 아가로스마개-유도 효과에서 백혈구 및 마크로파지의 역할을 두 방법으로 평가하였다. 첫째로, 우리는 기관지폐포성 세정내 세포를 시험하였다: 대조군 래트에서, 마크로파지는 회수된 우점 세포였다 (n = 5; 도.4, 대조군). 아가로스 점적 후, 마크로파지 수는 증가하였고 (P<0.05), 그리고 상당수의 호중구 (P<0.01)가 세척액에 나타났다. 림프구의 수는 변화하지 않았다.
침윤 세포 또한 조직절편에서 평가되었다: 아가로스마개 없는 기도는 호중구가 거의 없으나, 마개를 포함하는 기도는 상피 및 관강 양자에 호중구의 존재를 나타냈다. 기도 관강내 호중구 수는 대조군 및 마개 점적후 24시간, 48시간, 72시간에서 각각 0.2 ±0.2, 42.4 ±7.1, 40.7 ±7.7, 및 20.1 ±7.2/기부 박판 mm 였다 (P<0.05, n = 5). 또한, 기도 상피내 호중구 수는 대조군 및 마개 점적후 24시간, 48시간, 72시간에서 각각 1.3 ±0.4, 15.6 ±2.6, 14.9 ±1.4, 및 14.8 ±2.6/기부 박판 mm 였다 (P<0.01, n = 5).
호중구 모집, 배상세포 이형성, 및 EGF-R 단백질 발현에 대한 시클로포스파미드의 영향. 시클로포스파미드-처리 래트에서, 혈중 호중구는 격감되었고 (시클로포스파미드 처리 후 정맥내 호중구 수, 1.8 ±0.5%, n = 5), BAL 내 마개-유도 호중구 수집은 저해되었다. 기도 관강 내 호중구 수 (2.6 ±0.3/ 기부 박판 mm) 및 상피 내 호중구 수 (0.8 ±0.2/ 기부 박판 mm) 또한 제 24시간에서 현저히 감소하였다. 시클로포스파미드 또한 아가로스마개-유도 배상세포 이형성 및 EGF-R 단백질 발현을 저해하였다. 류메딘인 NPC 15669가 시클로포스파미드에 첨가되었을 때, 아가로스마개-유도 배상세포 이형성의 제해는 시클로포스파미드 단독의 효과와 유사하였다. 이 결과는 호중구가 마개-유도 배상세포 이형성에 관련됨을 나타낸다.
해설
본 연구에서, 우리는 대조군 상태에서는 배상세포가 거의 없는 무-병원물질 래트 배상세포 이형성에 대한 아가로스마개 점적의 영향을 시험하였다. 대조군 동물 기관지 및 아가로스마개 없는 기관지(대조군 폐) 내 상피세포는 Alcian blue/PAS로 일정하게 네거티브 염색되었다. 아가로스마개 점적은, 점적 마개 인접 기관지 상피의 배상세포 면적의 심한 시간-의존적 증가를 유발하는데, 이는 점적 후 24시간 이내에 검출 가능하고 점적 72시간 이후에 최대가 되었다. 막힌 기도에 인접한 기도 또한 Alcian blue/PAS로 파저티브 염색되었다. 총 세포수 및 기부 및 섬모세포 수는 변화하지 않았으나, 배상세포 수는 증가하였으며, 무-과립 분비세포 수는 아가로스마개 점적 후 시간-의존적으로 감소하였다 (표 2). 이 결과는 배상세포 이형성이 무-과립 분비세포가 배상세포로 전환한 결과임을 시사한다.
Figure 112001003507730-pct00002
세포는 방법에 기재된 대로 분석되었다; 각 군에서 n = 5. 특징화는 (점액 복합당질을 염색하는) Alican blue/PAS 염색에 의하여 보강되었다. 대조군 기도는 전-배상 및 배상세포를 거의 포함하지 않는다. 아가로스마개 점적후, 대조군 동물에 비하여, 시간-의존적 (24, 48, 72시간) 전-배상 및 배상세포 수 증가 및 무-과립 분비세포 수 감소가 있었다.
*데이터는 평균 ±SE, 세포수/기부박막 mm.
‡대조군에 비하여 P < 0.05
§대조군에 비하여 P < 0.01
∥분류를 위한 충분한 세포질 특질을 결여한 세포
래트 기도 배상세포는 MUC5AC 유전자를 발현하는 것으로 보고된다. 본 연구에서, 대조군 기관지는 MUC5AC 유전자를 발현하지 않았으나, 마개로 폐쇄되거나 또는 마개에 인접한 기도는 MUC5AC 유전자를 발현하였고 이는 MUC5AC 유전자가 아가로스마개 -유도 점액 생산과 관련됨을 시사한다. 이 결과는 아가로스마개가 래트 기도내 선별된 세포 내 뮤신 유전자 발현 및 점액 복합당질의 생산을 유도함을 나타낸다.
아가로스마개로 유도된 배상세포 이형성 기작이 시험되었다. EGF-R은 원래 무-병원물질 래트 기도 상피에서 발견되지 않으나, TGFα에 의하여 유도된다. 상피내 EGF-R 존재시, EGF-R 리간드 (EGF 또는 TGFα)점적은 뮤신 유전자 및 단백질 발현의 증가를 유발한다. 선택적 EGF-R 티로신 키나제 저해제 (BIBX1522)는 이런 반응을 완전히 저해하는데, 이는 EGF-R 신호체계가 배상세포 이형성에 관련됨을 나타낸다. 아가로스마개-유도 배상세포 이형성에 대한 BIBX1522의 영향이 측정되었다: BIBX1522는 아가로스마개-유도 점액 복합당질 생산 및 MUC5AC 유전자 발현을 저해하였다. 본 결과는 EGF-R 연쇄반응이 아가로스마개-유도 배상세포 이형성에 관련됨을 나타낸다.
아가로스마개로 배상세포 이형성을 유발하는 EGF-R 연쇄반응 기작이 연구되었다. 첫째로, 우리는 기관지 상피에서 EGF-R 단백질 발현을 연구하였다. 대조군 기도는 EGF-R에 대하여 네거티브으로 균일하게 염색되었으나, 아가로스마개를 포함하는 기도는 EGF-R에 대하여 선택적, 시간-의존적 파저티브염색을 나타내었다. 파저티브으로 염색된 세포는 무-과립 분비, 전-배상 및 배상세포를 포함한다. 따라서, 아가로스마개는 EGF-R 단백질 발현을 유도하였다. TNFα에 대한 중화항체로 전처리된 래트는 아가로스마개-유도 배상세포 이형성을 발전시키지 않았는데, 이는 TNFα가 아가로스마개-유도 EGF-R 발현에 관련됨을 나타낸다.
백혈구 생산을 선택적으로 저하시키는 약물인 시클로포스파미드는 아가로스마개 점적후 기도세정장액 및 기도 상피 내로의 호중구 모집을 방해하였고, 또한 아가로스마개-유도 배상세포 이형성을 방해하였다. 마크로파지 또한 아가로스마개 도입후 증가하였지만, 시클로포스파미드는 마크로파지 모집을 저해하지 않았다. 본 결과는 호중구가 아가로스마개-유도 배상세포 이형성과 관련됨을 나타낸다. 시클로포스파미드 또한 아가로스마개 후 EGF-R 단백질 발현을 감소시켰다는 사실은 최소한 부분적으로는, 호중구가 본 염증조건에서 EGF-R 발현에 기여한다는 것을 시사한다.
호중구는 또한 EGF-R 리간드인 EGF 및 TGFα생산능이 있다. 게다가, 상피세포는 EGF-R 리간드의 공급원이고, 아가로스마개 인접 상피의 현저한 벗겨짐이 있었다. 따라서 상피는 TNFα및 EGF-R 리간드 양자의 중요한 잠재적 공급원이 될 수 있다.
아가로스마개의 효과적 자극은 이어지는 상피 마멸과 함께, 호흡하는 동안 마개의 움직임과 관련된다는 것이 합리적으로 가정된다. 기도 상피의 기계적 손상은 과분비를 유발한다고 보고되어왔다. 이런 선행 연구는 기도 상피에 대한 기계적 외상이 과분비를 유발한다는 가설에 신뢰를 준다. 경구기관내삽관은 말에서 과다한 점액 분비를 유발한다고 보고되어 왔다. 환자에 대한 지속적 삽관은 점액 과분비를 유발할 수 있고 점액전자의 원인이 될 수 있다. EGF-R 티로신 키나제 저해제는 기관내삽관 후 점액 과분비 방지 역할을 할 수 있다.
상피 손상은 경미한 천식환자 연구에서 조차 흔히 발견되고, 본 손상은 점증 적으로 임상적 증상악화와 관련된다. 알러지 반응에 의하여 생산된 상피손상은 EGF-R 활성화를 유도하는데, 이는 비정상적 배상세포 생산을 유발한다. 상기 데이터는 EGF-R 활성화가, 구체적으로 배상세포 이형성과 관련된 다른 반응과 관련됨을 나타낸다. 기계적 상피손상 및 외상의 상피상해는 유사한 (EGF-R) 연쇄반응과 관련되어, 상피 분비세포의 비정상적 성장을 유발한다. 이는 급성천식의 치명적 사례에서 발생하는 과분비 기작을 제공한다.
실시예4
EGF-수용체에 의한 배상세포 조절
래트 비호흡기 상피내 배상세포의 탈과립은 비내 fMLP 흡입에 의하여 유도되었다. 비내 fMLP (10-7M) 흡입 4시간 후, 비중격상피내에 현저한 탈과립이 유도되었다. 배상세포 재과립화는 흡입 48시간 이내에 발생하였다. 대조군 상태에서, MUC5AC 단백질이 배상세포에서 발현되었으나, EGF-R 단백질은 발현되지 않았다. EGF-R 및 MUC5AC 뮤신 양자의 유전자 및 단백질은 대조군 상피세포에 존재하지 않았지만, 흡입 48시간 후에는 현저하게 발현되었다. EGF-R 티로신 키나제 저해제인 BIBX1522로의 전처리는, fMLP-유도 배상세포 탈과립을 따르는 뮤신 MUC5AC 유전자 및 단백질 발현을 저해하였다. 본 결과는 EGF-R 발현 및 활성화가 래트 상피내 배상세포 재과립화와 관련됨을 나타낸다.
방법
동물. 실험용 동물 절차는 Committee on Animal Research of the University of California San Francisco에 의하여 승인되었다. 특정 무-병원물질 수컷 F344 래트 (체중 200 내지 230g; Simonsen Lab, Gilroy, CA)가 사용되었다. 동물은 환경적으로 조적되는 박판 흐름 후드가 있는 무-병원물질 BioClean 우리에 수용되었다; 동물은 멸균 사료 및 물에 자유롭게 접근하도록 하였다.
비조직 준비. 흡입후 다양한 시간 후, 래트는 펜토바비탈소듐 (65mg/kg, i.p.)로 마취되었다. 동물의 심장이 노출되고, 둔단침이 좌심실축으로부터 상행대동맥내로 삽입되었고, 전신순환은 1% 파라포름알데히드로 관류되었다. 좌심방 절개는 고정액 유출구를 제공하였다. 눈, 하악, 피부, 및 근육계가 제거되었고, 머리는 큰 부피의 동일 고정액에 24시간 동안 담겨졌다. 고정후, 머리는 Surgipath (DecalcifierII, Surgical Medical Industries, Inc., Richmond, IL)로 4 내지 5일동안 석회제거되고, 포스페이트-완충 식염수로 헹궈졌다. 비강은 비구개의 절치유두 수준에서 횡단절개되었다. 전두조직블록은 동결절편을 위하여 글리콜 메타크릴레이트 (JB 4 Plus, Polysciences, Inc., Warrington, PA), 또는 OCT 화합물 (Sakura Finetek, U.S.A., Inc., Torrance, CA)에 파묻혀졌다. 5㎛-두께 절편은 글리콜 메타크릴레이트-에 파묻힌 블록 전면으로부터 절단되었고 산성 및 중성 복합당질을 나타내기 위하여 Alcian blue (pH 2.5)/periodic acid-Schiff (AB/PAS)로, 또는 상피세포내로 이동한 백혈구를 가시화하기 위하여 3,3'-디아미노벤지딘 (Sigma chemical, St. Louis, MO)으로 염색되었다. 5㎛-두께 절편은 동결된-파묻힌 블록 전면으로부터 절단되었고, AB/PAS로 염색되었거나 또는 EGF-R 및 MUC5AC 의 면역염색을 위하여 사용되었다.
비상피내 호중구 측정. 호중구는 x400 배율에서 3,3'-디아미노벤지딘으로 염색된 상피층의 고력장내에서 측정되었다. 비중격상피내 (기부막부터 세포정점까지) 호중구 수는 단위 기부 박판 길이당 핵 외곽윤각 수를 세어 결정하였다.
배상세포 탈과립 및 재과립화의 정량화. 배상세포의 탈과립 및 재과립을 평가하기 위하여, 우리는 반자동 이미지시스템을 사용하여 선행하여 간행된 방법에 따라, 점막표면상피 위의 Alcian blue/PAS-염색된 점막물질의 부피밀도를 측정하였다. 우리는, 비디오 사진기 조절 유니트 (DXC7550MD; Sony Corp. of America, Park Ridge, NJ)와 연결된, Axioplan 현미경 (Zeiss, Inc.)을 사용하여 염색된 슬라이드를 시험하였다. 비상피의 영상은, IMAXX Video System을 사용하여 x400에서 위상차렌즈로 고력장에 기록되었다. 표면상피 분비세포내 세포내 뮤신은 타원형, 다양한 크기의 자주빛과립 형태로 나타난다. 우리는 Alcian blue/PAS-파저티브-염색된 면적 및 총 상피면적을 측정하였고 데이터를 총 면적에 대한 Alcian blue/PAS 면적의 백분율로 나타냈다. 분석은, 공유영역 NIH 영상 프로그램을 사용하여 Macintoxh 9500/120 컴퓨터 (Apple Computer, Inc., Cupertino, CA) 상에서 수행되었다.
EGF-R 및 MUC5AC의 면역위치측정. 파라포름알데히드-고정된 비조직 유래 동결단편은 내재성 페르옥시드를 차단하기 위하여 3% H2O2/메탄올로 처리되었고 EGF-R 또는 MUC5AC에 대한 마우스 단일클론 항체 (각각 Calbiochem, San Diego, CA 및 NeoMarkers Inc., Fremont, CA)와 함께 희석비 1:100으로 1시간 항온처리되었다. 면역활성 EGF-R 또는 MUC5AC는 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드를 색소생산물질로 사용하여, Vectastain Elite ABC 키트 (Vector Lab., Inc., Burlingame, CA)로 가시화되었다. 대조군은 PBS와 함께 1차 및 2차 항체의 치환을 포함한다.
방법. 우리는, 정상적으로는 많은 배상세포를 비중격상피내에 가지는, 무-병원물질 래트를 연구하였다. 에어로졸화된 fMLP의 배상세포 탈과립 및 비점막상피내로의 호중구 이동에 대한 영향을 결정하기 위하여, 동물은 소듐펜토바비탈 (65mg/kg, i.p.)로 마취되었고, 동물은 무-염증원 식염수내 N-포르밀-메티닐-류실-페닐알라닌 (fMLP; 10-5M, Sigma, St. Louis, MO)을 비내로 에어로졸에 의하여 5분간 수용하였다. 에어로졸 노출은 동물을, 0.3ml/분 속도로 에어로졸 연무를 생성하는 초음파 분무기 (PulmoSonic, DeVilbiss Co., Somerset, PA)로 환기하여 성취되었다. 유사하게, 대조군 동물은 에어로졸 단독이 비내로 주어졌다.
fMLP 에어로졸 흡입후 배상세포의 재과립화를 연구하기 위하여, 래트는 fMLP비내송달 후 48시간에 안락사되었다.
배상세포 재-과립화에 대한 EGF-R 티로신 키나제 활성화의 영향을 평가하기 위하여, 동물은 fMLP흡입 30분전에 복강내 EGF-R 티로신 키나제 저해제 (BIBX1522, 15mg/kg, Boehringer Ingelheim Inc., Ingelheim, Germany에 의하여 관대하게 제공됨)로 전처리되었고 하루 두번 반복되었다.
통계. 모든 데이터는 평균 ±SEM으로 표시된다. 각 실험군에 대하여, 일방 ANOVA 또는 Student t 검사가 사용되었다. 0.05 미만의 확률이 통계적으로 중요한 오차로 간주되었다.
결과
fMLP에 의한 배상세포 탈과립의 비상피구조에 대한 영향. 대조군 상태에서, 비중격상피는 현저한 면적의 AB/PAS-염색된 배상세포를 포함하였으나, 관강면은 염색되지 않았다. 뮤신 MUC5AC 단백질에 대한 면역염색은 AB/PAS염색된 범위와 대응되었으나, 원위치 혼성화는 MUC5AC 유전자 발현이 거의 없거나 또는 전혀 없게 나타났다. EGF-R에 대한 면역조직화학적 염색은 네거티브이었다. 본 결과는 대조군 래트 비상피는, 뮤신 유전자 발현 없이, MUC5AC 단백질을 포함하는 완전한 배상세포를 포함함을 나타낸다. 관강 염색의 부재는 뮤신의 탈과립(분비)이 존재하지 않음을 시사한다. 비-자극된 래트 비상피는 뮤신 단백질을 포함한 "안정된", 비-탈과립 배상세포를 포함한다고 가정되었다. 호중구 화학유인물질 (예를 들어, fMLP)는, 그곳에서 호중구가 엘라스타아제-의존 공정에 의하여 GC 탈과립을 유발하는 기도 상피내로 호중구를 모집한다고 증명되었다. GC 탈과립의 영향을 시험하기 위하여, 호중구 화학유인물질인 fMLP (10-7M) 에어로졸이 비내로 5분간 송달되었다. fMLP 처리 4시간후 마취된 래트에서, AB/PAS-염색된 면적 및 MUC5AC-파저티브 면역염색 면적은 두드러지게 줄어들었고 비상피내로의 호중구 모집이 유발되었다. AB/PAS 염색은 비기도 관강면 상에서 두드러졌는데, 이는 GC 탈과립이 발생하였음을 확인시킨다. 하지만, fMLP 처리 4시간후 MUC5AC 유전자 발현은 변화하지 않았다.
fMLP 처리 48시간후 안락사된 래트에서, EGF-R 항체에 의한 면역조직화학적 염색은 전-배상 및 배상세포에서 EGF-R에 대하여 파저티브으로 염색시켰고 AB/PAS- 및 MUC5AC-면역파저티브 염색은 대조군 상태에서 나타난 수준으로 돌아왔는데, 이는 비 GC의 재과립화가 일어났음을 나타낸다. 이때, 호중구 모집은 더이상 존재하지 않았다; GC로 채워진 범위내 MUC5AC 유전자 발현이 가시적이었는데, 이는 GC 재과립화가 증가된 뮤신 유전자 발현과 연결되어 있음을 나타낸다.
배상세포 재과립화에서 EGF-R 티로신 키나제 포스포릴화의 역할. 래트에서의 선행 연구는 EGF-수용체 (EGF-R)의 활성화는 뮤신 유전자 및 단백질 발현으로 이어짐을 보고하였다. EGF-R 활성화가 fMLP 후 래트 비 GC 재과립화에서 중요한 역할을 한다는 가설을 시험하기 위하여, 래트는 (n = 5) 선택적 EGF-R 티로신 키나제 저해제인 BIBX1522로 전처리되었다; fMLP의 에어로졸화는 비상피내로 호중구 모집 및 GC 탈과립을 유발하였으나, 48시간 후에는 AB/PAS 염색 및 MUC5AC-면역파저티브 염색은 감소세로 유지되었다. 본 결과는 EGF-R 활성화가 fMLP에 의한 탈과립에 이어지는 코의 GC 뮤신 합성과 관련됨을 나타낸다.
본 연구에서, 우리는 래트 비상피에서 뮤신 생산의 조절을 시험하였다. 대조군 상피는 상당수의 배상세포를 포함하였고, MUC5AC 단백질이 이들 세포내에 존재하였다. 그러나, MUC5AC 유전자 발현은 없었다. MUC5AC 뮤신 발현은 EGF-R 발현 및 그 활성화를 통하여 다른 기도상피세포에서 발생한다고 보고 된다. 대조군 래트 비상피세포에서, 우리는 EGF-R 유전자 또는 단백질 발현을 발견하지 못하였다. AB/PAS 또는 MUC5AC 단백질에 대한 관강염색은 없었는데, 이는 현저한 배상세포 탈과립 (분비)가 일어나지 않았음을 시사한다. EGF-R은 "안정한" 배상세포에서 하향- 조절되어 더 나아간 뮤신 합성을 방지하였다. 따라서, 우리는 비 배상세포를 배상세포 탈과립 유도에 의하여 "시험하여 보았고", 우리는 이어진 기도 상피구조의 변화를 조사하였다.
호중구 화학유인물질은 기니아피그 및 인간 기도에서, 호중구 엘라스타제로 매개되며, 호중구와 배상세포간 가까운 접촉과 관련되는 호중구-의존 배상세포 탈과립을 유발한다. 비중격에 정상적으로 존재하는 배상세포의 탈과립을 유도하기 위하여, 화학유인물질인 fMLP가 비내로 흡입되었다. fMLP는 비상피내로 호중구를 모집하였고 배상세포 탈과립이 이어졌다; Alcian blue/PAS-염색된 면적은 현저하게 줄었다.
다음, 우리는 fMLP-유도 GC 탈과립 후 이어진 비상피내 결과를 조사하였다. 코의 GC 탈과립이 최대로 일어난 fMLP 4시간후에, EGF-R 및 MUC5AC 발현은 존재하지 않은채로 유지되었다. 그러나, fMLP 48시간 후, EGF-R은 전배상 및 배상세포에서 강하게 발현되었다. MUC5AC 유전자 발현은 이제 상피내에서 강하게 발현되었고, 본 결과는 배상세포의 재과립화 (증가된 AB/PAS 및 MUC5AC 염색)와 연결되었다. 실제로, fMLP 48시간후 배상세포 재과립화는 배상세포면적이 대조군 상태와 유사한 시점에 발생하였다. 본 발견은 GC 탈과립이 EGF-R의 발현 및 활성화로 이끌고, 따라서 뮤신 MUC5AC 발현을 유도함을 시사한다.
GC 재과립화에서 EGF-R 티로신 키나제 활성화의 역할을 조사하기 위하여, 우리는 동물을 선택적 EGF-R 티로신 키나제 저해제인 BIBX1522로 전처리하였다. BIBX1522로 전처리된 동물에서, fMLP는 여전히 GC 탈과립을 유발하였다. 그러나, BIBX1522로의 전처리는 GC 재과립화 및 GC의 MUC5AC 단백질 발현을 방지하였다. 본 결과는 EGF-R 활성화가 GC 탈과립후 뮤신의 재-성장과 관련됨을 나타낸다. 무-병원물질 래트에서 배상세포는 "비활성" (즉, 탈과립되지 않은)이고 EGF-R 은 하향-조절된다. 염증 (예를 들어, 호중구 침윤의 자극)이 GC 탈과립 및 뮤신 분비를 유발한 때, EGF-R 상향-조절 및 활성화는 기도상피에 뮤신을 재-공급한다. 본 발견은 선택적 EGF-R 티로신 키나제 저해제가 코의 질병에서 과분비 방지에 유용함을 시사한다.
본 발명은 그것의 구체예에 대한 참고문헌과 함께 기재되었지만, 본 발명의 요지 및 범위에서 벗어나지 않고 당업계 숙련자에 의하여 다양한 변화가 이루어지고 균등물이 치환될 수 있음이 이해되어야 한다. 게다가, 특정 조건, 재료, 물질의 조성, 공정, 공정단계 또는 단계들에 적용하기 위하여 본 발명의 목적, 요지 및 범위에 많은 변형이 이루어진다. 이런 모든 변형은 여기 첨부된 청구항의 범위내에 속하려는 의도이다.

Claims (28)

  1. (i) 배상세포 증식의 시험관내 모델을 표피 성장인자 (EGF) 또는 그것의 기능적 균등물에 접촉시키는 단계;
    (ii) 이어서, 시험관내 모델을 후보 약제와 접촉시키는 단계; 및
    (iii) 배상세포 증식을 평가하는 단계를 포함하며,
    배상세포 증식의 감소가 약제의 치료학적 가능성의 표시인, 후보 약제를 스크리닝하는 시험관내 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 시험관내 모델은 폐 표피세포인 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  3. 기도 점액 과분비를 감소시키기 충분한 투여량의, 치료학적 유효량의 표피 성장인자 수용체 (EGF-R) 길항물질; 및 약제학적으로 허용되는 송달체를 포함하며, 상기 표피 성장인자 수용체 (EGF-R) 길항물질은 퀴나졸린, 피리도피리미딘, 피리미도피리미딘, 피롤로피리미딘, 피라졸로피리미딘, 쿨쿠민, 티르포스틴, 단백질 키나제 저해제, 표피 성장인자 (EGF)에 특이적으로 결합하는 항체, 표피 성장인자 수용체 (EGF-R)에 특이적으로 결합하는 항체, 표피 성장인자 (EGF)를 암호화하는 서열에 특이적인 안티센스 분자, 표피 성장인자 수용체 (EGF-R)를 암호화하는 서열에 특이적인 안티센스 분자, 및 표피 성장인자 수용체 (EGF-R)의 트랜스인산화를 저해하는 화합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 기도 점액 과분비의 치료를 위한 약제학적 조제물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 표피 성장인자 수용체 (EGF-R) 길항물질은 표피 성장인자 수용체 (EGF-R)에 대하여 선택적인 티로신 키나제 저해제인 것을 특징으로 하는 조제물.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 표피 성장인자 수용체 (EGF-R) 길항물질은 표피 성장인자 수용체 (EGF-R)의 트랜스인산화를 저해하는 것을 특징으로 하는 조제물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 길항물질은 산화방지제인 것을 특징으로 하는 조제물.
  7. 제 3 항에 있어서, 길항물질은 항체인 것을 특징으로 하는 조제물.
  8. 제 7 항에 있어서, 항체는 표피성장인자 (EGF)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 조제물.
  9. 제 7 항에 있어서, 항체는 표피성장인자 수용체 (EGF-R)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 조제물.
  10. 제 3 항에 있어서, 길항물질은, 표피 성장인자 (EGF) 및 표피 성장인자 수용체 (EGF-R)로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 서열에 특이적인 안티센스 분자인 것을 특징으로 하는 조제물.
  11. 기도 점액 과분비를 감소시키기 충분한 양의, 치료학적 유효량의 표피 성장인자 수용체 (EGF-R) 길항물질; 및 흡입에 의한 송달에 적합한 유동성 조제물을 포함하며, 상기 표피 성장인자 수용체 (EGF-R) 길항물질은 퀴나졸린, 피리도피리미딘, 피리미도피리미딘, 피롤로피리미딘, 피라졸로피리미딘, 쿨쿠민, 티르포스틴, 단백질 키나제 저해제로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 기도 점액 과분비의 치료를 위한 약제학적 조제물.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 표피 성장인자 수용체 (EGF-R) 길항물질은 액체 송달체 및 추진제와 함께 조제되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조제물.
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 표피 성장인자 수용체 (EGF-R) 길항물질은 수용액 또는 에탄올 용액으로 조제되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조제물.
  14. 제 11 항에 있어서, 상기 표피 성장인자 수용체 (EGF-R) 길항물질은 건조 분말 조제물 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조제물.
  15. 제 12 항에 있어서, 상기 조제물은 에어로졸을 형성하도록 에어로졸화되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조제물.
  16. 제 11 항에 있어서, 기관지확장제, 코르티코스테로이드, 거담제, 점액 분해제로 구성되는 군으로부터 선택된 제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조제물.
  17. 제 11 항에 있어서, 상기 표피 성장인자 수용체 (EGF-R) 길항물질은 티로신 키나제 저해제인 것을 특징으로 하는 약제학적 조제물.
  18. 기도 점액 과분비 치료에 사용하기 위한 패키지로서, 용기와 그 안에 있는 약제학적으로 활성인 표피 성장인자 수용체 (EGF-R) 길항물질을 포함하는 유동성 조제물을 포함하며, 상기 표피 성장인자 수용체 (EGF-R) 길항물질은 퀴나졸린, 피리도피리미딘, 피리미도피리미딘, 피롤로피리미딘, 피라졸로피리미딘, 쿨쿠민, 티르포스틴, 단백질 키나제 저해제로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 기도 점액 과분비 치료에 사용하기 위한 패키지.
  19. 제 18 항에 있어서, 패키지는 미터 용량 흡입기이고, 표피 성장인자 수용체 (EGF-R) 길항물질은 추진제와 함께 조제되는 것을 특징으로 하는 패키지.
  20. 제 18 항에 있어서, 조제물이 에어로졸화될 때 약 0.5 내지 12 미크론의 직경을 갖는 입자가 생성되는 것을 특징으로 하는 패키지.
  21. 제 18 항에 있어서, 패키지는 건조 분말 흡입기이고, 표피 성장인자 수용체 (EGF-R) 길항물질은 건조 분말 조제물로 조제되는 것을 특징으로 하는 패키지.
  22. 제 18 항에 있어서, 패키지는 분무기이고, 표피 성장인자 수용체 (EGF-R) 길항물질은 수용액 또는 에탄올 용액인 것을 특징으로 하는 패키지.
  23. 제 18 항에 있어서, 기관지확장제, 코르티코스테로이드, 거담제, 점액 분해제로 구성되는 군으로부터 선택된 제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 패키지.
  24. 제 18 항에 있어서, 상기 표피 성장인자 수용체 (EGF-R) 길항물질은 티로신 키나제 저해제인 것을 특징으로 하는 패키지.
  25. 퀴나졸린, 피리도피리미딘, 피리미도피리미딘, 피롤로피리미딘, 피라졸로피리미딘, 쿨쿠민, 티르포스틴, 단백질 키나제 저해제로부터 선택된 약제학적으로 활성인 표피 성장인자 수용체 (EGF-R) 길항물질을 포함하는 에어로졸.
  26. 제 25 항에 있어서, 표피 성장인자 수용체 (EGF-R) 길항물질이 약 0.25 미크론 내지 약 12 미크론 범위의 직경을 갖는 에어로졸화된 입자내에 함유되는 것을 특징으로 하는 에어로졸.
  27. 제 25 항에 있어서, 기관지확장제, 코르티코스테로이드, 거담제, 점액 분해제로 구성되는 군으로부터 선택된 제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 에어로졸.
  28. 제 25 항에 있어서, 상기 표피 성장인자 수용체 (EGF-R) 길항물질은 티로신 키나제 저해제인 것을 특징으로 하는 에어로졸.
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