CZ2001584A3 - Prevence tvorby hlenu v dýchacích cestách podáváním antagonistů EGF-R - Google Patents

Prevence tvorby hlenu v dýchacích cestách podáváním antagonistů EGF-R Download PDF

Info

Publication number
CZ2001584A3
CZ2001584A3 CZ2001584A CZ2001584A CZ2001584A3 CZ 2001584 A3 CZ2001584 A3 CZ 2001584A3 CZ 2001584 A CZ2001584 A CZ 2001584A CZ 2001584 A CZ2001584 A CZ 2001584A CZ 2001584 A3 CZ2001584 A3 CZ 2001584A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
egf
antagonist
cells
growth factor
epidermal growth
Prior art date
Application number
CZ2001584A
Other languages
English (en)
Inventor
Jay A. Nadel
Kiyoshi Takeyama
Original Assignee
The Regents Of The University Of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Regents Of The University Of California filed Critical The Regents Of The University Of California
Publication of CZ2001584A3 publication Critical patent/CZ2001584A3/cs

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/10—Expectorants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/12—Mucolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Prevence tvorby hlenu v dýchacích cestách podáváním antagonistů
EGF-R
Oblast techniky
Tento vynález se týká obecně oblasti léčení dýchacího systému. Přesněji se jedná o inhibici hypersekrece sliznice v plicích a v dýchacích cestách podáváním antagonistů EGF-R. Kromě toho se vynález také týká způsobů vývoje nebo potenciálně vhodných činidel schopných inhibovat sliznice v plicích.
sestavováním hypersekreci
Dosavadní stav techniky
V dýchacích cestách plicního systému slouží systém jako primární obranný mechanismus inhalovaných částeček nebo infekčních agens ven z dýchacích cest v plicích. Kromě cestách slouží k mukociliární k odstranění infekčních agens.
toho látky přítomné v tekutině v dýchacích omezení toxicity částeček a k inaktivaci Fyzikální mechanismus zachycování slouží k vypuzení sliznice z určitých částí dýchacích cest (viz např. „Foundations of Respirátory Care, Pierson a Kacmarek, eds. (1992) Churchill Livingstone lne. New Principles of Internal Medicine, Fauci et Edition, McGraw Hill,
New York,
New York).
York; „Harrison's al., eds. (1997) 14th
Řasinkový systém epiteliálnich buněk umístěných ve žlázách pod sliznicích. Řasinky jsou obklopeny vodnou vrstvou (periciliární tekutina) vylučovanou v dýchacím otvoru aktivním transportem chloridu a pasivním posunováním vody přes epitel. Řasinky jsou v kontaktu se sliznicí plovoucí na sestává z hltanu a řasinkových sérových a epiteliálnich buněk, sliznicových buněk této vodné vrstvě a cestou nepřímého pohonu způsobují , že se hlen posunuje směrem k hlasivkové štěrbině (viz Pierson a Kacmarek, shora a Fauci, et al., shora). Hlen je produkován pohárkovitými epitelovými buňkami a buňkami submukosálních žláz a je vylučován do vstupního otvoru průdušek po degranulaci.
Jelikož sliznice má obecně za úkol odstraňovat inhalované částečky nebo infekční agens, nadměrná sekrece hlenu v průduškách může způsobit progresivní potíže. V periferních průduškách dochází k tomu, že zachycování je neefektivní a nedochází k čištění od malých částeček. Dále vzhledem k tomu, že průdušinky mají malé rozměry, obsahují mnoho pohárkovitých buněk a jsou zejména vnímavé k zaplavení hlenem. Hypersekrece v průduškách působí v řadě jednotlivých případů; je pozorovatelná při mnoha dýchacích potížích , jako je např. chronická bronchitida, akutní astma, cystická fibróza a bronchiektáza.
Hypersekrece hlenu je hlavním příznakem u pacientů s chronickými potížemi při dýchání (COPD) a pomocí ní je definován stav (např. chronický zánět a produkce sputa). Bylo odhadnuto, že astma ovlivňuje nejméně 4 % populace Spojených států a způsobuje nejméně 2000 úmrtí ročně (Pierson a Kacmarek, shora). V průběhu akutní astmatické příhody se stěny průdušek obalí velkým objemem hlenu, ten roste a průměr průdušek se tím zmenšuje., což má vliv na obtíže při dýchání. Jako výsledek nadměrné sekrece při akutním astmatu dochází k rozsáhlému zaplavení hlenem a může způsobit ohrožení života a smrt.
Nadměrná sekrece také je důsledkem při cystické fibróze, která je jednou z nej obecnějšleh smrtelných, geneticky podmíněných nemocí na světě. Cystická fibróza je autosomální • · · · · · · · · · • · · · ♦ · · · · recesivní choroba, která způsobuje, že mukosální buňky průdušek se stávají nezodpovědné a nereaguji na cyklickou-AMP-závislou aktivaci proteinovou kinázou membrány kanálů chloridového iontu (Pierson a Kacmarek, shora a Fauci, et al.,) shora viz shora. Následná nerovnováha v elektrolytu snižuje hladinu hydratace průduškového hlenu, čímž se způsobí vysoká viskozita hlenu v plicích u individuálně probíhajících cystických fibróz. Nadměrná sekrece ztěžuje průchodnost vzduchu u jednotlivců v kombinaci s cystickou fibrózou, a dále omezuje funkci plic.
Další choroby ovlivněné hypersekrecí, jsou mimo jiné chronické plicní potíže (COPD). Oxidační stres hraje důležitou roli při patogenezi této choroby nazývané COPD. Cigaretový kouř, který generuje volné kyslíkové radikály, je považován za silnou příčinu v patogenezi této choroby. Neutrofily jsou často viditelné jako místa, kde dochází k zánětu při této chorobě a je zajímavé, že volné kyslíkové radikály jsou známy jako činidlo, které se uvolňuje v průběhu aktivace neutrofilů.
Při různých dýchacích chorobách bývá často za účelem dosažení umělého dýchání nutné pacienta mechanicky intubovat. Trubice se zavádí přes oropharanx a umisťuje se v průdušnici. Aby se zabránilo pronikání vzduchu kolem endotracheální trubice, roztahuje se kolem této trubičky balónek, což se provádí v nižší části průdušnice a může to způsobit poškození epitelu a metaplazii pohárkovitých buněk. Poranění epitelu vede k procesům, které jej mají vyléčit, což má za výsledek opět nadměrnou sekreci hlenu. Takováto dlouhá tracheálni intubace u pacientů může pak vést ke škodlivým jevům, projevujícím se v důsledku hypersekrece hlenu.
Jako výsledek vysokých množství hlenu v plicích pacientů, což se může projevovat při plicních chorobách s následkem hypersekrece, pozorujeme to, že se snižuje mukosální odstraňování nežádoucích částeček. Patologické agens jako jsou bakterie, např. pseudomonas aeruginosa, často vytvoří na sliznici kolonie, což má potom za následek časté infekce plic.
Klasické modality léčení jednotlivých pacientů ovlivněné a související s poškozením dýchacích cest nadměrnou sekrecí jsou např.: antibiotická terapie, bronchodilatační metody (např.
aplikace methylxantinů, sympatomimetik se silnými β2 adrenergickými anticholinergik) , kortokosteroidů, stimulačními vlastnostmi, aplikace inhalovaných použití systematických nebo primárně při astmatu, snaha o zkapalnění hlenu orálním podáváním expektorantů, např. guaifenesinu, a aerosolové podávání „mukolytických přípravků, např. vody, hypertonického roztoku chloridu sodného (viz Harrisonův roztok, uvedený shora). Novější terapie cystické fibrózy spočívá v podávání DN-ázy cílového, DNA obohaceného hlenu, nebo do sputa (Shak, (1990) Proč. Nati. Acad. (USA)87:9188-9192; Hubbard, R.C.
do et et al.
al.
(1991) N.Engl.J.Med. 326:812). Kromě toho fyzikální v úderech, vibracích a drenážování, hrudníku spočívá terapie což se často používá viskózního hlenu.
k dosažení odstranění nežádoucích částic .
Podobné dýchací potíže mohou také vznikat při a po transplantaci plic. Z tohoto důvodu se hledají efektivnější nebo alternativní terapie, které by mohly ovlivňování sekrece hlenu. Konkrétně existuje modality, která bude snižovat tvorbu sekrece cestách.
být použity pro potřeba specifické hlenu v dýchacích ·
• · 4444 • 4 44
444 4444 444
Relevantní literatura
Použiti EGF inhibitorů k blokování růstu rakovinných buněk je popsáno Levitskim (1994) Eur J Biochem. 226(1): 1-13; Powis (1994) Pharmac. Ther. 62:57-95; Kondapaka a Reddy (1996) Mol. Cell. Endocrin. 117:53-58.
Podstata vynálezu
Nadměrné vylučování hlenu v dýchacích cestách je nežádoucí příznak řady různých plicních chorob. Toto nadměrné vylučování má za následek degranulaci pohárkovitých buněk, jejichž proliferace je urychlována stimulací epidermálních receptorů růstového faktoru (EGF-R). Tento vynález řeší léčení nadměrného vylučování hlenu v plicích podáváním terapeutických množství EGF antagonistů, s výhodou inhibitorů kinázy. Tito antagonisté mohou být ve formě malých molekul, protilátek nebo částí protilátek, které se váží buď k EGF nebo k jeho receptoru. V jiném aspektu vynálezu se řeší způsoby rozhodování o potenciálních kandidátech na terapeuticky účinné látky, schopné inhibovat nadměrné vylučování hlenu, a to in vitro a in vivo způsoby.
Primárním předmětem vynálezu je poskytnout způsob léčení chorob plynoucích z nadměrného vylučování hlenu v plicích.
Jiným předmětem vynálezu je poskytnout farmaceutické prostředky, použitelné k léčení chorob, které pramení z nadměrného vylučování hlenu.
Ještě dalším předmětem vynálezu je poskytnout in vitro test pro screening nadějných kandidátských látek, které inhibují
• · · · 6 nadměrné vylučování hlenu, přičemž tento způsob zahrnuje následující stupně: (i) uvede se do kontaktu in vitro model proliferace pohárkovitých buněk s EGF nebo jeho funkčním ekvivalentem; (ii) následně se uvede do kontaktu tento in vitro model s látkou, která je kandidátem na užitečnou léčivou látku a (iii) posoudí se proliferace pohárkovitých buněk, přičemž proliferace pohárkovitých buněk je indikativní pro stupeň nadějnosti potenciálního terapeutického prostředku.
Jiným předmětem vynálezu je poskytnout in vivo test, kterým by bylo možné provádět screening látek, které jsou potenciálně možnými farmaceutickými účinnými látkami, inhibujicími nadměrné vylučování hlenu, přičemž tento způsob zahrnuje následující kroky: (i) vytvoří se zvířecí model choroby, při které dochází k nadměrné sekreci hlenu do plic indukcí EGF-R, např. pomocí faktoru alfa nádorové nekrózy (TNF-α); (ii) stimuluje se indukovaný EGF-R s působením jeho ligandu, např. transformací růstového faktoru alfa (TGF-α) nebo EGF, aby se produkovaly pohárkovité buňky produkující mucin; (iii) zkoumanou potenciálně účinnou látkou se šetří vznikající buňky a (iv) posoudí se stupeň proliferace pohárkovitých buněk nebo stupeň sekrece hlenu, přičemž inhibice proliferace pohárkovitých buněk nebo inhibice sekrece hlenu je indikativní pro stupeň účinnosti látky, jejíž terapeutická potenciální hodnota se posuzuje.
Dalším předmětem vynálezu je poskytnout testy in vivo a in vitro, pomocí kterých by se mohl provádět screening EGF-R antagonistů, inhibujících nadměrné vylučování hlenu.
Výhodou řešení podle vynálezu je, že poskytuje prostředky pro prevenci nadměrné tvorby hlenu v průduškách.
φφφφ·· φ · φ φφ φ • φφ φφφ φ φ φφφ φφφφ ··· φφ · <η Φ Φ· ΦΦΦΦΦΦΦ / Φ · φφφφ·· ···· φφφ φφφ φφ φφ φφφ
Znakem vynálezu je, že rozsah různých typů antagonistů se dá použit k tomu, aby se blokoval účinek EGF a/nebo TGF-α a jejich interakce s EQF-R.
Jedním z dalších aspektů vynálezu jsou prostředky na bázi EGF antagonistů pro snížení tvorby hlenu v dýchacích cestách pacienta, kterým je savec, výhodně člověk.
Jiným předmětem vynálezu je způsob podávání EGF antagonistů do plic za účelem snížení sekrece hlenu v dýchacích trubicích pacienta, kterým je savec, výhodně člověk.
Dalším předmětem vynálezu je poskytnout způsob léčení řady různých chorob, které mají příznak nadměrné tvorby hlenu v dýchacích cestách. Mezi tyto choroby patří, mimo jiné, chronická bronchitida, akutní astma, cystická fibróza, bronchiektáza, chronické potíže plicní, hypersekrece, která je důsledkem poškození epitelu jako je např. dráždění alergického charakteru nebo mechanického charakteru a hypersekrece hlenu v nose.
Tyto a další předměty, výhody a znaky vynálezu budou zcela jasné odborníkovi v oboru, až si přečte podrobnosti způsobu léčení a způsobu testů in vitro a in vivo, jak jsou ve větší míře popsány dále.
Stručný popis obrázků na přiložených výkresech
Obrázek 1A je western blot diagram EGF-R v buňkách NCI-H292 a v A431. Obrázek 1B představuje imunocytochemickou analýzu za přítomnosti anti-EGF-R protilátky v kulturách buněk NCI-H292.
Obrázek IC představuje Northern analýzu EGF-R v buňkách NCIH292.
Obrázek 2. Alcianová modř/PAS vybarvování buněk NCI-H292 za účelem identifikace glykoproteinů v hlenu.
Obrázek 3. Northern analýza exprese genu MUC5 v buňkách NCI-H292.
Obrázky 4A a 4B představují: imunohistochemickou analýzu EGF-R s protilátkou anti-EGF-R u krys bez patogenů. Obrázek 4A, krysy léčené podáním TNFa. Obrázek 4B krysy senzibilované ovalbuminem.
Obrázek 5 představuje graf znázorňující účinek inhibitoru EGF-R tyrosin kinázy (BIBX1522) na produkci pohárkovitých buněk (vyjádřená jako procenta vybarvené plochy epitelu průdušky, obsazená Alcianovou modří/PAS pozitivně vybarvených buněk) .
Podrobný popis výhodných provedeni vynálezu
Přípravky a způsoby jsou zde předkládány pro účely léčení nadměrného vylučování hlenu do dýchacích cest podáváním terapeutického množství EGF antagonistů, výhodně inhibitorů kinázy. Antagonisté mohou být ve formě malých molekul, protilátek nebo částí protilátek, které jsou schopny vázat buď EGF nebo jeho receptor. Při chorobách nadměrné sekrece hlenu v dýchacích cestách např. při chronické bronchitidě, bronchiektáze, cystické fibróze, akutním astmatu, COPD, atd. se zvyšuje rychlost syntézy hlenu v dýchacích cestách a projevuje t · · ·· · • · · • · ·· • · • · • · · · • · · ·· • · ·· • · ·· se „hypersekrece hlenu, cestách potíže, přičemž chorob smrt pacienta.
Vylučovaný hlen způsobuje v tento účinek může způsobit dýchacích u těchto
Je zde ukázáno několik případů poškození průdušky epidermálního indukci EGF-R které vyvolávají expresi receptoru faktoru u buněk epitelu průdušek. Po stimulaci EGF-R ligandově závislým projeví produkce hlenu proteinu. Je ukázáno, kinázy blokují tuto a ligandově mechanismem se zvýšení hladin EGF-R tyrosin proteinu.
a zánětu, růstového a následné nezávislým a zvýšení exprese genu a že selektivní inhibitory expresi mucinového genu
Aniž by tím byl vynález nějak omezen, bylo navrženo, evoluční sekvence pohárkovitých buněk může být založena že na expresi EGF-R. Stimulace TNFa indukuje intenzitu vybarvení EGF-R negranulovaných sekrečních buněk; jejich následná aktivace EGF-R ligandy způsobuje progresivní vybarvení mukózních glykokonjugátů v cytoplazmě a buňky se stávají „pohárkovými buňkami. Získaná data vyvolává selektivní diferenciaci Pohárkovité buňky jsou zjevně sekrečních buněk, které exprimují ligandy k produkci mucinů.
„předpohárkovými a potom naznačují, že aktivace EGF-R buněk, ale ne proliferaci. odvozeny od negranulovaných EGF-R a jsou stimulovány EGF-R
Kromě signálními spojení s průduškách, Prozánětlivé, stimulace cytokiny, může být EGF-R stimulován jinými mediátory. Tak např. dlouhodobé kouření cigaret ve progresivními patologickými změnami na periferních vyvolává hyperplazii pohárkovitých buněk, cytokinem aktivované neutrofily a cigaretový kouř jsou podle výsledku příčinou syntézy mucinů v buňkách lidského plicního epitelu, a to cestou ligandově-nezávislé aktivace ♦ · ··· · • · · · ίο ·*....
EGF-R, která má za následek uvedení do akce neutrofilů a cigaretového kouře jako regulátorů diferenciace epitelových buněk, které mají za následek abnormální indukci buněk produkujících mucin v dýchacích cestách. Neutrofily aktivované řadou stimulů včetně IL-8, N-formyl-methionylleucylfenylalaninu, TNF-α, cigaretový kouř nebo H2O2 pozitivně reguluje expresi mucinu v epitelových buňkách, což je syntéza, která je inhibována EGF-R inhibitory. Neutrofily jsou také schopné EGF-R ligandy, EGF a TGFa. Kromě toho epiteliálni buňky jsou zdrojem EGF-R ligandů.
Mechanické poškozeni epitelu dýchacích cest může také způsobit nadměrné vylučování hlenu a může být zodpovědné za zaplavení sliznice. Inhibitory EGF-R tyrosin kinázy slouží k prevenci nadměrného vylučování hlenu po intubaci do průdušnice.
Epiteliálni poškození se obvykle nachází u testů pacientů, kteří mají astma a poškození je vyšší v závislosti na závažnosti klinických příznaků. Poškození epitelu způsobené alergickou reakcí vyvolává aktivaci EGF-R, což má za následek abnormální produkci pohárkovitých buněk. EGF-R je implikován při epitelovém poškození, např. „změnách na průduškách, které se projevují při astmatu, operacích a uzavírání ran. Mechanické poškození epitelu a poranění epitelu při astmatu mohou zahrnovat jednoduché EGF-Rkaskády, které pak vedou k abnormálnímu růstu epitelových sekrečnich buněk.
Nadměrné vylučováni je také důležitou manifestací zánětlivých chorob nosu. Pokud jsou pohárkovité buňky nosu „napadeny indukcí degranulace pohárkovitých buněk při využití mechanismu závislého na neutrofilech, exprese EGF-R a mucinů je silně tímto pozitivně ovlivněna. Tyto události byly spojeny s degranulací pohárkovitých buněk.
Pokud došlo k zánětu, takováto stimulace neutrofilovou infiltrací degranulací pohárkovitých buněk a sekreci mucinů, způsobuje pozitivní regulaci a aktivaci EGF-R a opět se dále a dále dodává z epitelu dýchacích cest mucin.
Dříve než budou pospány způsoby léčení a složení přípravků, je třeba rozumět, že tento vynález se neomezuje na konkrétní způsoby a přípravky zde popsané, neboť může sám o sobě mít velmi mnoho variant, což je odborníkovi pochopitelné. Je také třeba rozumět, že terminologie se zde používá pouze pro účely popsání konkrétních provedení a není míněna jako omezující, neboť rozsah vynálezu je omezen pouze připojenými nároky.
Pokud není uvedeno jinak, všechny technické a vědecké termíny jsou zde používány ve stejném významu jako se jim obecně rozumí u odborníků, kteří jsou obeznámeni s tímto oborem, do kterého vynález náleží. Přestože mohou být veškeré způsoby a materiály, které jsou podobné nebo ekvivalentní těm, které jsou zde popsány, používány v praxi nebo při testování podle vynálezu, nyní budou popsány výhodné způsoby a výhodné materiály. Veškeré publikace, o kterých je zde zmínka, jsou začleněny formou odkazu do popisu, aby se dobře vysvětlilo a popsalo, o jaké způsoby a/nebo materiály jde ve spojení s těmito citovanými publikacemi.
Publikace, o kterých je zde řeč, jsou předkládány výhradně proto, že objasňují určité věci před datem podání této přihlášky. Neříká se tím nic takového, jako že by snad vynález nebyl nebo byl takovouto publikací.předem uveřejněn. Dále data ·· φφφφ φ · φφφφ « *φ φ · • · « · · φφφ · φ • · Φ····· ····♦· φφφ «φ ·« φφφ publikace, která jsou uvedena, mohou být odlišná od konkrétních publikací, která jsou uvedena a nezávisle potvrzena.
Definice důležitých pojmů
Výrazem „epidermální růstový faktor nebo „EGF je míněn protein nebo jeho část, který má biologickou účinnost charakterizovanou mitogenní aktivitou na epitelové buňky (např. Cohen (1986) Biosciences Reports 6(12):1017,- Aaronson, S.A., „Growth Factors and Cancer, Science (1991) 254:1146-1153). Příkladem je lidský epidermální růstový faktor, např. jak je
popsán v publikaci Urdea 80:7461-7465. et al. (1983) Proč. Nat. Acad. Sci.
Konkrétní zájem tohoto vynálezu pro tyto účely je o
mitogenní účinnost EGF na pohárkovité buňky. Také je tato
definice míněna tak, že zahrnuje všechny proteiny nebo jejich části, které jsou funkčními ekvivalenty EGF v termínech biologické reakce, vyvolané EGF.
Termínem „receptor epidermálního růstového faktoru nebo „EGF-R je míněn protein, jehož část je schopna vázat na EGF protein nebo na jeho část. Příkladem je receptor lidského epidermálního růstového faktoru (viz Ullrich et al. (1984) Nátuře 309:418-425; přístupové číslo genové banky NM-005228). S výhodou vazba EGF ligandu aktivuje EGF-R (např. jako výsledek aktivace intracelulární mitogenní signalizace, autofosforylace EGF-R). Odborník v oboru pochopí, že jiné ligandy, kromě EGF, se mohou vázat na EGF-R a aktivovat toto EGF-R. Příklady takových ligandů jsou, mimo jiné, TGF-α, betacelulin, amfiregulin, heparin, vázající EGF (ΗΒ-EGF) a neuregulin (také známý jako hergulin) (Strawn a Shawver (1998) Exp.-Opin. Invest. Drugs • *4 *'t · •» · 9 · · 44
4· to··# • to to toto· %
• ♦ · 4 to 9 4 >4 ·4 <♦ ··«
7(4)553-573, a „The Protein Kinase Facts Book: Protein Tyrosine Kinases (1995) Hardie, et al. (eds.), Academie Press, NY, NY).
Terminem „EGF-R antagonista je míněno jakékoliv činidlo, schopné přímo nebo nepřímo inhibovat účinek EGF-R, zejména účinek EGF-R na proliferaci pohárkových buněk nebo na nadměrnou sekreci hlenu pohárkovitými buňkami. EGF-R může být aktivováno ligandově závislým nebo ligandově nezávislým mechanismem, který může být výsledkem autofosforylace nebo transfosforylace. EGF-R antagonisté, o které se zajímá tento vynález, mohou inhibovat buď oba nebo jeden z těchto mechanismů. Tak např. vazba TNF-α na EGF-R je důsledkem ligandově závislé fosforylace, která může být blokována protilátkou, která se váže na EGF-R, čímž se předchází interakci EGF s ligandem, který by aktivoval EGF receptor. Příkladem takových protilátek jsou látky popsané v publikaci Goldstein et al. (1995) Clin. Cancer Res. 1:1311-1318; Lorimer et al. (1995) Clin. Cancer Res. 1:859-864; Schmidt a Wels (1996) Br. J. Cancer 74:853-862. Inhibitory tyrosin kinázy s malou molekulou jsou také účinné jako EGF-R antagonisté.
Alternativně, jak je ukázáno, tyto sloučeniny jako jsou volné kyslíkové radikály stimulují transfosforylaci EGF-R, což je důsledek ligandově nezávislé aktivace tohoto receptoru. Jiné prostředky k aktivaci EGF-R transfosforylaci jsou ultrafialové záření a osmotický stres, stimulace G-proteinem vázaného receptoru endotelinem-1, lysofosfatidová kyselina a trombin, m-1 muskarinový acetylcholinový receptor, a lidský růstový hormon. Antagonisté tohoto ligandově nezávislého mechanismu jsou antioxidanty jako je hyperoxid dismutázy, DMSO, DMTU, kyselina askorbová a pod.
* ··· • ·· · ···
Antagonistou EGF-R může být protilátka, která se váže na faktor, který stimuluje produkci EGF nebo EGF-R, čímž inhibuje urychleni proliferace pohárkovitých buněk působením EGF (to je inhibitor fosforylační kaskády, která fosforyluje EGF-R). Tak např. fúzní protein TGFa-Pseudomonáz exotoxin 40 je popsán v publikaci Arteaga et al. (1995) Cancer Res. 54:4703-4709.
Ve výhodném provedení je antagonistou EGF-R inhibitor aktivity tyrosin kinázy EGF-R, zejména inhibitory s malou molekulou mají selektivní účinek na EGF-R ve srovnání s jinými tyrosin kinázami, výhodné jsou malé molekuly, které blokují přírodní receptor EGF u savců, zejména u lidí, a mají molekulovou hmotnost menší než 1 kD.
Inhibitory EGF a EGF-R jsou, mimo jiné, inhibitory tyrosin kinázy jako jsou chinazoliny, jako je PD 153035, 4-(3chloranilin) chinazolin nebo CP-358,774, pyridopyrimidiny, pyrimidopyrimidiny, pyrolopyrimidiny jako je CGP 59326, CGP 60261 a CGP 62706, a pyrazolopyrimidiny (Shawn a Shawver, shora), 4-(fenylamino)-7H-pyrrolo[2,3-d] pyrimidiny (Traxler et al., (1996) J.Med.Chem 39:2285-2292), kurkumin (diferuloyl methan) (Laxmin arayana, et al., (1995), Carcinogen 16:17411745), 4,5-bis(4-fluoranilino)ftalimid (Buchdunger et al. (1995) Clin. Cancer Res. 1:813-821; Dinney et al. (1997) Clin. Cancer Res. 3:161-168); tyrfostiny obsahující nitrothiofenové skupiny (Brunton et al. (1996) Anti Cancer Drug Design 11:265-295); inhibitory protein kinázy ZD-1839 (AstraZeneca); CP-358774 (Pfizer, inc.); PD-0183805 (Warner-Lambert) nebo jako jsou látky popsané v mezinárodních patentových přihláškách W099/09016 (Američan Cyanamid); WO98/43960 (Američan Cyanamid); .WO97/38983 (Warener Labert); WO99/06378 (Warner Lambert); WO99/06396 (Warner Lambert); WO96/30347 (Pfizer, Inc.); WO96/33978 (Zeneca); WO96/33977 (Zeneca); a WO96/33980 (Zeneca); které jsou tu všechny vloženy do popisu formou odkazu nebo antisense molekuly.
Termínem „inhibice se míní zmenšení, neutralizace, omezení nebo předcházení proliferace pohárkovitých buněk, degranulace pohárkovitých buněk nebo nadměrné vylučování hlenu pohárkovitými buňkami (hypersekrece).
Termínem „léčení nebo „ošetřování a pod., jak je zde používán, se myslí obecně získávání žádoucích farmakologických a/nebo fyziologických účinků. Účinek může být profylaktický v termínech kompletní nebo parciální prevence choroby nebo příznaku a/nebo může být terapeutický v termínech částečného nebo úplného vyléčení nemoci a/nebo nežádoucího účinku, který přísluší k dané léčené nemoci. „Léčení je zde používáno tak, že do něho patří veškeré ošetřování choroby u savců, zejména u lidí a zahrnuje:
(a) prevenci choroby nebo k příznaku, aby se neobjevoval u daného subjektu, který může být. predisponován k dané chorobě nebo danému příznaku, ale ještě u něj nebyla tato choroba ani tento příznak diagnostikovány;
(b) inhibici choroby nebo příznaku, tj. zastavení nebo zbrzdění jejich vývoje;
(c) zmírnění choroby nebo příznaku, tj. způsobení regrese choroby nebo příznaku. Vynález je zaměřen na léčeni pacientů s chorobami plic nebo dýchacích cest a je zejména zaměřen na léčení pacientů s nadměrným vylučováním hlenu, tj. na prevenci, inhibici nebo zmírnění nadměrného vylučování hlenu. V termínech léčení příznaků je vynález zaměřen na snížení množství hlenu nebo sputa v dýchacích inhibici infekce
9 9999 ·
• · · · patologickými organismy, cestách, zmírnění potíží a prevenci hypoxie v důsledku zacpání dýchacích cest.
V přesnějším významu je termín „léčení míněn tak, že se snaží poskytnout terapeuticky znatelný a výhodný účinek na pacienta, který trpí chorobou plic, která zahrnuje nadměrné vylučování hlenu.
Ještě přesněji je termín „léčení míněn jako prevence a zmírnění a/nebo inhibice nadměrného vylučování hlenu sloučeninou, vybranou ze souboru, do kterého patří EGF a/nebo EGF-R antagonisté jako jsou protilátky, inhibitory, proteinové tyrosin kinázy a antisense molekuly a pod. Alternativně může léčení zahrnovat prevenci EGF-R exprese v dýchacích cestách, čímž se blokuje rozvoj choroby v raném stádiu. Tak např. činidla, která blokují vazbu TNFa na její receptory, mohou preventivně pozitivně ovlivnit EGF-R.
Léčení zahrnuje prevenci nebo inhibici infekcí patologickými zárodky způsobenou a/nebo související s nadměrným vylučováním hlenu.
Termínem „protilátka se míní imunoglobullnový protein, který je schopen vázat se na antigen. Protilátka, jak je zde tento termín používán, zahrnuje fragmenty protilátek, např. F(ab')2, Fab’, Fab, schopné vázat antigen nebo antigenní fragment, o který je zájem. Výhodně vazba protilátky na antigen inhibuje aktivitu EGF nebo EGF-R.
• · ·
Terminem „humanizovaná protilátka, jak je zde používán, se míní popis kompletní molekuly protilátky, tj. složení dvou kompletních lehkých řetězců a dvou kompletních těžkých řetězců, stejně tak jako protilátek, sestávajících se pouze z fragmentů protilátek, tj. Fab, Fab', F(ab')2 a Fv, kde CDR jsou odvozeny od zdrojů jiných než je člověk a zbývající části Ig molekuly nebo jejího fragmentu jsou odvozeny od lidské protilátky, výhodně produkované ze sekvence nukleové kyseliny kódující lidskou protilátku.
Termíny „lidská protilátka a „humanizovaná protilátka, jak jsou zde používány, se myslí protilátka, jejíž veškeré části molekuly protilátky jsou odvozeny od sekvencí nukleových kyselin, kódujících lidskou protilátku. Takové lidské protilátky jsou nejvíce žádané pro použití jako pro terapie pomocí protilátek, neboť takové protilátky mohou mít malé nebo žádné imunitní odezvy u lidí jako pacientů.
Termínem „chimérní protilátka, jak je zde používán, se mini molekula protilátky, stejně jako fragment protilátky, jak je uvedeno shora v definicích termínu „humanizovaná protilátka. Termín „chimérická protilátka zahrnuje humanizované protilátky. Chimérické protilátky mají alespoň jednu část těžkého nebo lehkého řetězce aminokyselinové sekvence odvozenou od prvního savčího druhu a jinou část těžkého nebo lehkého řetězce aminokyselinové sekvence odvozenou od druhého, odlišného savčího druhu. Výhodně je variabilní region odvozen od jiného savčího druhu než je člověk a konstantní region je odvozen od člověka. Konkrétně je chimérická protilátka výhodně připravována z nukleotidové sekvence z jiného savce, než je člověk, kódující variabilní region a nukleotidové sekvence z člověka, kódující konstantní region protilátky.
Termínem „vázat se specificky je míněna vysoká schopnost se vázat a/nebo vysoká afinita vazby protilátky na specifický polypeptid. polypeptidu k jakémukoliv molekulách k jejímu epitopu na než vazba stejné zejména k těm, které mohou být nebo patří o který je na určitý vázat jiné např. 10 % Taková s předchozím polypeptid, specificky být schopny specifickém protilátky
Vazba protilátky je silnější jinému epitopu, přítomny v souvislosti stejnému vzorku jako je specifický zájem. Protilátky, které se váží polypeptid, o který je zájem, mohou polypeptidy ve slabé, ale ještě detekovatelné úrovni, nebo méně vazby ukazuje na polypeptid, o který je zájem, slabá vazba nebo vazba na pozadí je specifické protilátky na sloučeninu přímo zájem, např. použitím vhodných snadno odlišitelná od vazby nebo polypeptid, o který je kontrolních experimentů.
Termínem „detekovatelně značená protilátka, a termínem „detekovatelné značené anti-EGF nebo termínem „detekovatelně značený fragment anti-EGF je míněna protilátka (nebo fragment protilátky), jenž si ponechává svou specifičnost vazby, které mají připojeno detekovatelné značené. Detekovatelné značení je obvykle připojeno konjugovanou chemickou vazbou, ale pokud je značkou polypeptid, může být alternativně připojeno technickou genetického inženýrství. Metody přípravy detekovatelně značených proteinů jsou dostatečně v oboru známé. Detekovatelné značení mohou být volena z řady takových značení, známých v oboru, ale obvykle se jedná o radioizotopy, fluorescenční látky, enzymy, např. křenová peroxidáza nebo jiné skupiny nebo sloučeniny, které buď emitují detekovatelný signál (např. radioaktivitu, fluorescenci, barvu) nebo emitují detekovatelný signál po podrobení značky expozici ve vhodném substrátu. Různé detekovatelné kombinace značka/ substrát (např. křenová peroxidáza/diaminobenzidin, avidin/streptavidin, luciferáza/lucíferin), způsoby značení protilátek a způsoby použiti značených protilátek k detekci antigenu jsou dostatečně známé v oboru (např. viz Harlow a Lané, eds. (Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Způsoby léčení
Tento vynález také poskytuje způsoby léčení nadměrného vylučování hlenu v plicích podáváním terapeutických množství antagonistů EGF-R. Zde popsanými způsoby může být léčena jakákoliv choroba a zejména plicní choroba, pro kterou je charakteristické nadměrné vylučování hlenu nebo akumulace patologických množství hlenu. Příklady plicních chorob, při kterých dochází k nadměrnému vylučování hlenu, které mohou být tímto způsobem léčeny, jsou kromě jiných: chronická obstruktivní choroba plic, jako je chronická bronchitida, zánětlivé choroby jako je astma, bronchiectasis, pulmonární fibróza, COPD, choroby nasální hypersekrece, např. nosní alergie a další choroby související s nadměrným vylučováním hlenu. Genetické choroby jako je cystická fibróza, Kartagenerův syndrom, alfa-1antitrypsinová deficience, dědičné necysticko fibrotické zahuštění ve sliznicí nebo respiračním traktu patří do těchto léčitelných chorob také.
Antagonisté, které jsou přímo nasměrováni na EGF nebo EGF-R jsou výhodnější. Nicméně odborník v oboru pochopí, že jakýkoliv faktor nebo buňka umožňující biologickou kaskádu, která má za výsledek urychlení proliferace pohárkovitých buněk působením EGF-R může být zaměřena na inhibici, např. TGF-α antagonisté. Bez návaznosti na jakoukoliv teorii, kaskáda začíná v průběhu zánětlivé reakce, kdy buňky jako jsou buňky vylučující hlen nebo neutrofily uvolňují TNF-α, který pak vyvolává EGF-R expresi. Stimulace EGF-R např. ligandem EGF, na druhé straně urychluje proliferaci pohárkovitých buněk. Z toho plyne, že jakékoliv buňky nebo faktory, zahrnuté v kaskádě, jako je např. cesta TNFa, mohou být zaměřeny na antagonistickou aktivitu.
Antagonista EGF-R, podávaný při způsobu léčení podle vynálezu, může mít jakoukoliv formu. Formou příkladu lze uvést, že antagonistou EGF-R může být látka s malou molekulou (tj. antisense oligonukleotid, inhibitor tyrosin kinázy, atd.), protilátka nebo část protilátky, která se váže na EGF, TGF-a nebo EGF-R.
Antagonisté EGF-R s malou molekulou
Inhibitory tyrosin kinázy, které jsou selektivní pro EGF-R, v předmětných způsobech použít, může to být např. BIBX1522 Ingelheim, Germany); CGP59326B
Switzerland); 4-aminochinazolinové US patentu 5 760 041); také mohou být naftalény, které působí na EGF receptor a jsou v oboru známé a mohou se Příklady jsou popsány shora a (Boehringer Ingelheim, lne, (Novartis Corporation, Basel, inhibitory EGF-R (popsány v které nitrilů substituované styrenové sloučeniny, indan nebo benzoxazin; včetně a malononitrilových sloučenin (popsány v U.S. Patentu č.5 217
999); inhibitory popsané v americkém patentu č.5 773 476; inhibitor karboxypeptidázy z brambor (PCI) a 39-aminokyselinový inhibitor proteázy se třemi disulfidovými můstky, (viz BlancoApricio et al. (1998) J.Biol.Chem 273(20):12370-12377),antagonista bombesinu RC-3095 (Szepeshazi et al. (1997) Proč Nati Acad Sci U.S.A94:10913-10918) atd. Jiné inhibitory tyrosinkinázy včetně chinazolinu, jako je PD 153035, 4-(3·· ··»· · ·· ·· ·** ··♦··· «*·· ·«· ·· chloranilin)chinazolin, nebo CP-358 774, pyridopyrimidinu, pyrimidopyrimidinu, pyrolopyrimidinu, jako je CGP 59326, CGP 60261 a CGP 62706, a pyrazolopyrimidinu (Shawn a Shawver, shora.), 4-(fenylamino)-7H-pyrolo[2,3-d] pyrimidiny (Traxler et al. (1996) J. Med. Chem 39:2285-2292), kurkumin (Korutla et al. (1994) Biochim Biophys Acta 1224:597-600); viz též Laxmin Arayana et al.(1995), Carcinogen 16:1741-1745); atd.
Výhodné inhibitory tyrosin kinázy jsou selektivní pro EGF receptor, tj. EGF-R je inhibován ve větší míře než jiné receptory buněčného povrchu, které mají aktivitu tyrosin kinázy. Selektivně je podporován způsobem formulace a podávanou účinnou látkou, např. pokud inhibitor je přednostně podáván do zanícených průdušek, atd.
Obvyklé dávkování pro systémické podávání se pohybuje v rozsahu od 0,1 gg až do 100 miligramů na kilogram hmotnosti subjektu při jednom podání. Odborník v oboru snadno dávku stanoví a zjistí, že může být tato dávka proměnlivá v závislosti na konkrétní sloučenině, závažnosti příznaků a vnímavosti subjektu k vedlejším účinkům. Některé specifické sloučeniny jsou účinnější než jiné. Výhodné dávkováni pro určitou danou sloučeninu je snadno stanovitelné pro odborníka v oboru, a to řadou různých způsobů. Výhodnými způsoby jsou způsoby využívající měření fyziologické účinnosti dané sloučeniny, např. pomocí metod in vitro a in vivo, které jsou zde popsány.
Protilátky jako antagonisté EGF-R
Protilátky jako EGF-R antagonisté jsou mimořádně zajímavé (např. Viloria, et al., Američan Journal of Pathology 151:1523). Protilátky proti EGF nebo EGF-R jsou produkovány imunizací u
·· ···· * ··
• · * • · · • • • • ·
• ··· • 9 • • •
• · • · • • •
··· ·· ·· ··
xenogenního imunokompetentního savčího hostitele včetně mysovitých, hlodavců, králíků, ovcí, prasat, skotu atd., pomocí EÓF nebo EGF-R nebo jejich částí. Výhodně je používán jako imunogen lidský EGF nebo EGF-R nebo jejich část. Pro způsob je primární volba hostitele. Imunizace jsou prováděny obvyklými tečhnikami, přičemž imunogen může být injekčně vstříknut subkutánně, intrámuskulárně, intraperitoneálně, intravaskulárně, atd. do hostitelského zvířete. Normálně se používá jako imunogen asi 1,0 mg/kg až asi 10 mg/kg EGF nebo EGF-R intraperitoneálně, přičemž se takováto dávka podává každý další den. Injekce mohou být s nebo bez adjuvantů, např. může být použit kompletní nebo nekompletní Freundův adjuvant, specol. alum. atd. Po kompletaci imunizačního předpisu se může antisérum získat podle obvyklých návodů, čímž se získá polyklonální antisérum specifické pro EGF nebo EGF-R.
Buď monoklonální nebo polyklonální protilátky, výhodně monoklonální protilátky, se produkují z imunizovaných zvířat. Polyklonální antiséra mohou být získávána ze sér obvyklými metodami, přičemž se používá zvířat po ukončení imunizačního programu. Pro produkci monoklonálních protilátek se získávají lymfocyty z vhodných lymfatických tkání, např. sleziny, drenáží lymfatických cest atd., a jsou kombinovány s vhodným fúzním partnerem, obvykle s linií myelomu, produkující hybridom, který vylučuje specifickou monoklonální protilátku. Screening klonů hybridomů na antigenovou specifičnost, o kterou je zájem, potom přinese vhodný hybridom a provádí se obvyklými metodami.
Zájem je zejména o protilátky, výhodně monoklonální protilátky, které se váží na EGF-R nebo na EGF tak, že inhibují vazbu EGF na EGF-R, např. protilátky, které se specificky váží na extracelulární doménu EGF-R, čímž zabraňují vazbě EGF. Takové *4 ···« * 44·· • Β · Β 4 ΒΒ • ♦ · ··
♦ · · · Β Β ·«· 4Β ·· »4 4 protilátky mohou být vyrobeny běžnými metodami, které jsou popsány shora nebo jsou dokonce komerčně dostupné. Příklady protilátek, které by mohly mít takovou funkci, která splňuje požadavek na EGF antagonismus, jsou kromě jiných, neutralizující anti-EGF-R monoklonální protilátka C225 (Kawamoto et al. (1983) Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 80:1337-1341; Petit et al. (1997) J.Path. 151:1523-153, produkovaná firmou Im.Cloně Systems New York, NY) a anti-EGF-R monoklonální protilátka EMD55900 (také zvaná Mab 425), (Měrek, Darmstadt, Germany).
Předmětné protilátky se mohou vyrábět jako látky s jedním řetězcem, na rozdíl od normálních multimerních struktur. Protilátky s jedním řetězcem jsou popsány v publikaci Jost et al. (1994) J.B.C. 269:26267-73, a jiných. DNA sekvence, kódující různé regiony těžkého řetězce a různé regiony lehkého řetězce jsou ligovány na spacer, kódující alespoň asi 4 aminokyseliny malých neutrálních aminokyselin, včetně glycinu a/nebo šeřinu. Protein enkódovaný touto fúzí umožňuje sestavit funkčně proměnný region, který si zachovává specifičnost a afinitu původní protilátky.
Způsoby humanizace protilátek jsou v oboru známé. Humanizovaná protilátka může být produktem zvířete, které má geny transgenního lidského imunoglobulinového konstantního regionu (viz např. mezinárodní patentové přihlášky WO 90/10077 a WO 90/04036). Alternativně může být předmětná protilátka sestavena pomocí metod genetického inženýrství technikami rekombinační DNA, při kterých se nahradí CH1, CH2, CH3 za hlavní domény a/nebo rámcové zbytky příslušnými lidskými sekvencemi (viz WO 92/02190).
• ·
Použití Ig cDNA pro konstrukci chimérických imunoglobulinových genů je také známé v oboru viz publikaci (Liu et al. (1987) P.N.A.S. 84:3439 a (1987) J. Immunol. 139:3421). mRNA se izoluje z hybridomu nebo jiných buněk, produkujících protilátky a je používán k produkci cDNA. Tato cDNA, o jejíž výrobu jde, může být zesílena pomocí polymerázové řetězové reakce s použitím specifických primerů (US patenty 4 683 195 a
683 202) . Alternativně se vyrobí knihovna a provede se screening, aby se dosáhlo izolace sekvence, o kterou je zájem. DNA sekvence, kódující variabilní region protilátky, se pak fúzuje se sekvencí lidského konstantního regionu. Sekvence genu lidských konstantních regionů se dají nalézt v publikaci Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, publikace N.I.H. č. 91-3242. Geny lidského C regionu jsou snadno dostupné ze známých klonů. Chimérické, humanizované protilátky, se pak exprimují obvyklými metodami.
Fragmenty protilátek, jako je Fv, F(ab')2 a Fab mohou být připravovány štěpením intaktního proteinu, např. proteázou nebo chemickým způsobem. Alternativně je požadován zkrácený gen. Pro navržení takového genu se např., nějaký chimérický gen, kódující část F(ab')2 fragmentu zahrnující DNA sekvence enkódující CH1 doménu a hlavní region H řetězce, následovaný translací stop kodonu, což poskytne zkrácenou molekulu.
Jedinec, který má chorobu spočívající v nadměrném vylučování hlenu, může být nejprve léčen podáváním určitých množství EGF-R antagonisty v rozsahu asi 20 miligramů (mg) až asi 400 miligramů na kilogram hmotnosti pacienta dvakrát denně, např. formou inhalace.
·· ··
Antisense molekuly jako EGF-R antagonisté
V dalším provedení jsou předmětnými terapeutickými činidly antisense molekuly, specifické pro lidské sekvence kódující EGF nebo EGF-R. Podávaným terapeutickým prostředkem může být antisense oligonukleotid, zejména to mohou být syntetické oligonukleotidy, které mají chemické modifikace, odlišující je od přírodních nukleových kyselin, nebo nukleové kyseliny konstruované tak, že exprimují takovouto antisense molekulu jako RNA. Antisense sekvence je komplementární k mRNA cílových genů EGF nebo EGF-R, a inhibuje expresi cílových genových produktů (viz např. Nyce et al. (1997) Nátuře 385:720). Antisense molekuly inhibují genovou expresi snížením množství mRNA dostupného pro translaci formou aktivace RN-ázy H nebo stérickou zábranou. Může se podávat jedna antisense molekuly nebo jejich kombinace, přičemž kombinace může obsahovat více různých sekvencí od jednoho cílového genu nebo sekvence, které jsou komplementární několika různým genům.
Výhodným cílovým genem je EGF-R nebo EGF. Genová sekvence může být posouzena a porovnána s veřejně známými databázemi (lidský epidermální růstový faktor, přístupové číslo genové banky K01166; lidský mRNA pro prekursor receptorů epidermálního růstového faktoru, přístupové číslo genové banky X00588). Obecně bude antisense sekvence stejného druhu jako má zvířecí hostitel.
Antisense molekuly mohou být produkovány expresí celé sekvence cílového genu nebo její části ve vhodném vektoru, přičemž vektor se zavádí a exprimuje v cílených buňkách.
Transkripční iniciace bude orientována tak, že antisense kmen je produkován jako RNA molekula. Antisense RNA hybridizuje s endogenní sense kmenem mRNA, čímž blokuje expresi cílového ·· genu. Pro tento účel může být využit nativní transkripční iniciační region nebo exogenni transkripční iniciační region. Promotor může být zaveden rekombinačními metodami in vitro nebo jako výsledek homogenní integrace sekvence do chromozomu. Mnoho silných promotorů, které jsou aktivní ve svalových buňkách, je v oboru známo, jako příklad lze uvést β-aktinový promotor, SV40, časný a pozdní promotor, lidský cytomegalovirový promotor, retrovirové LTR, atd.
Transkripční vektory obecně mají obvyklá restrikční místa umístěná poblíž promotorové sekvence, aby se mohlo dosáhnout vložení potřebných sekvencí nukleové připraveny transkripční kazety, které kyseliny. Mohou být obsahují transkripční iniciační region, cílové geny nebo jej ich fragmenty a transkripční terminační region. Transkripční kazety mohou být zavedeny do řady vektorů, např, plasmidu; retroviru, např, lentivi.ru; adenovi.ru a pod,, přičemž vektory jsou schopné se dočasně nebo stabilně udržovat v buňkách, obvykle po dobu alespoň asi jeden den, méně obvykle po dobu několika dní
Alternativně je ve výhodném provedení antisense molekulou syntetický oligonukleotid. Antisense oligonukleotidy mají obecně od asi 7 do 500/ obvykle od asi 12 do 50 nukleotidů, méně obvykle od 20 do 35 nukleotidů, přičemž délka ovlivňuje účinnost inhibice, specifičnost včetně absence krosreaktivity a pod. Bylo zjištěno, že krátké oligonukleotidy, které mají od 7 do 8 bází délky, mohou být silnějšími a selektivnějšími inhibitory genové exprese (viz Wagner et al, (1996) Nátuře Biotechnology 14:840844) ,
Specifický region nebo regiony endogenního sense řetězce mRNA sekvence se volí tak, aby byl komplementární k antisense
• · sekvenci. Bylo ukázáno, že 5'region mRNA je zejména náchylný k antisense inhibici. Nicméně, současné důkazy naznačují, že analýza mRNA sekundární struktury může být důležitá pro přístup míst k inhibici. Selekce specifických sekvencí pro oligonukleotid může být použita jako empirická metoda, přičemž se několik sekvencí, které jsou potenciálními kandidáty, testuje na inhibici exprese cílového genu v in vitro nebo na zvířecím modelu. Kombinace sekvencí se také dá použít, přičemž několik regionů mRNA sekvence se v takovém případě volí pro antisense komplementaci.
Antisense oligonukleotidy se dají chemicky syntetizovat známými metodami (viz Wagner et al. (1993) viz shora a Miligan et al., viz shora). Výhodné oligonukleotidy jsou oproti nativní fosfodiesterové struktuře chemicky modifikovány, což se provádí za účelem zvýšení jejich intracelulární stability a afinity vazby. Řada takových modifikací byla popsána v literatuře, přičemž jednotlivé modifikace se liší chemickou strukturou skeletu, použitými cukry nebo heterocyklickými bázemi.
Oligonukleotidy mohou dále obsahovat zacílenou skupinu, která podporuje přijímání molekuly buňkami. Tato zacílená skupina je specificky vážící se molekula, např. protilátka nebo její fragment, která rozpoznává molekuly přítomné na povrchu buněk plicního epitelu, zejména epitelových buněk obsahujících EGR-F.
Bispecifické protilátky, chimérické protilátky a protilátky s jedním řetězcem jsou v oboru známé. Vhodně připravené protilátky jiného původu než lidského, se dají humanizovat řadou cest. Spojení mezi oligonukleotidem a zacílenou skupinou se může použít jako nejběžnější metoda, přičemž se takové spojení uskutečni např. disulfidovou, amidovou nebo thioéterovou vazbou, a to v závislosti na chemii oligonukleotidového skeletu. Výhodně se spojení uvnitř buňky štěpí a uvolní se oligonukleotid.
Oligonukleotidy se mohou napojovat na hydrofobní zbytky, např. cholesterol, aby se chránily před nukleázami a aby se zlepšil transport přes buněčné membrány. Alternativně se dá zvýšit transport do buňky konjugací na poly-L-lysin nebo jiné polyaminy. Další modifikací, která se dá provést, je přidání vmezeřující komponenty, jako je akridin, schopné vmezeření do cílové mRNA a schopné uskutečnit stabilizaci výsledného hybridu. Antisense oligonukleotidy mohou být transfektovány v kombinaci s enzymem (s enzymy), které degradují komplexy antisense-mRNA v buňce, např. RN-áza-H. Podobně se dá použít jakýkoliv protein nebo enzym, který je schopen přednostně degradovat nebo sekvestrovat duplex antisense-mRNA.
Jako alternativa k antisense inhibitorům se mohou použít k inhibici exprese genů katalytické sloučeniny na bázi nukleových kyselin, např. ribozomy, antisense konjugáty atd. Ribozomy se mohou syntetizovat in vitro a podávat pacientovi, nebo mohou být kódovány expresním vektorem, ze kterého se ribozom syntetizuje v cílové buňce (např. viz mezinárodní patentová přihláška WO 9523225 a Beigelman et al. (1995) Nucl. Acids Res 23:4434-42). Konjugáty antisense oligonukleotidů s kovovým komplexem, např. tetrapyridylměďnaný komplex, schopné zprostředkovat hydrolýzu mRNA jsou popsány v publikaci Bashkin et al. (1995) Appl. Biochem. Biotechnol. 54:43-56.
• ·
Farmaceutické prostředky
EGF-R antagonisté mohou být připravovány v roztoku nebo v jiných farmakologicky vhodných formách, které se dají použít k podávání pacientům, jako je např. liposomová suspenze. Vhodné protilátky nebo jiné formy anti-EGF se formulují pro podávání způsobem obvyklým pro přípravu takových materiálů. Obvyklé formulace jsou ty, které jsou uvedeny v publikaci Remington's Pharmaceutical Sciences, poslední edice, Mack Publishing Company, Easton, PA. Cesta, kterou se látka podává, se volí podle sloučeniny, která se má podávat, stavu pacienta a choroby, která se má léčit. Pokud dochází k nadměrnému vylučování hlenu, sloučenina se může podat různými cestami v závislosti na závažnosti choroby, např.
může stupeň nebezpečnosti situace vyžadovat intravaskulární podávání, akutní, ale život neohrožující situace může být řešena orálním podáváním látky, zatímco dlouhodobé léčení chronické choroby je účinné vhodné provádět formou aerosolu.
Pro terapeutické použití u nosních chorob a u chorob dýchacích cest se výhodně používá lokální podávání. Podávání účinné látky formou inhalace nebo dýchání aerosolu poskytuje vysoké koncentrace této látky ve srovnání s koncentracemi, které jsou adsorbovány systémicky. Alternativně může být antagonista EGF podáván injekcí, která může být intramuskulární, intravenózní, subkutánní nebo peritoneální, nejvýhodněji intravenózní a lokální. Nicméně jiné formy podávání se dají použít také a přitom se používají prostředky, které umožňují aby antagonista EGF-R vstoupil do systémického oběhu jako je cesta transmukosální nebo formulace transdermální, které se aplikují jako supositoria, kožní masti nebo nosní kapky. Jakákoliv vhodná
• · ···· • · · ♦ · · · formulace, která působí přenos antagonisty EGF-R do krevního řečiště nebo lokálně do plic se může v podstatě použít.
Pro injekce, obsahují vhodné formulace, vodné roztoky nebo suspenze používající fyziologický slaný roztok, Hankův roztok nebo jiné pufry, které popřípadě obsahují stabilizační přísady nebo jiné minoritní komponenty. Liposomální přípravky a jiné formy mikroemulzí lze použít také. Antagonista EGF-R se může také dodávat v lyofilizované formě a pro podávání rekonstituovat. Transmukosální a transdermální podávání obecně vyžaduje prostředek, který umožní projít skrz sliznici nebo přes kožní bariéru jako je žluč, soli, fusidová kyselina a její analogy, různé detergenty a pod. Orální podávání je také možné, přičemž se používá různých povlaků, které se rozpouštějí ve střevech a umožňují, aby se antagonista EGF-R dostal nepoškozen do trávicího traktu.
Povaha prostředků závisí do určité míry na povaze zvoleného antagonisty EGF-R. Vhodná formulace se připraví pomocí známých technik a principů, které jsou pro přípravu farmaceutických prostředků v oboru dostatečně známy. Koncentrace antagonistů EGF-R, která je obsažena v konkrétním farmaceutickém prostředku, bude záviset na povaze formulace; koncentrace EGF-R antagonisty, který je protilátkou se bude obvykle pohybovat v širokém rozmezí od asi 1 % hmotnostního do asi 85 % hmotnostních.
Existuje mnoho způsobů, které jsou známy v oboru, používaných pro zlepšení a podporu přijímání nukleových kyselin buňkami. Použitelné systémy pro podávání nukleových kyselin jsou např. systémy Sendai virového liposomu (Rapaport a Shai (1994) J. Biol. Chem. 269:15124-15131), kationtových liposomů, polymerních podávačích gelů nebo matric, porézních balónkových
katetrů (jako jsou popsány v publikaci
Shi et al.
(1994)
Circulation 90:955-951;
and Shi et al.
(1994) Gene Therapy
1:408-414), retrovirové expresní vektory a pod.
Pro podávání EGF-R antagonistů je zajímavou metodou k podávání použití liposomů jako vehikula. Liposomů fúzuji s buňkami cílového místa a dodávají obsah lumenu do buňky. Liposomy jsou udržovány v kontaktu s buňkami po dobu nutnou pro fúzi, přičemž se používá různých prostředků k udržení kontaktu, jako je izolace, pojivá, a pod. Liposomy se dají připravit s čištěnými proteiny nebo peptidy, které zprostředkují fúzi membrány, jako je např. virus Sendai nebo virus chřipky, atd. Lipidy mohou být tvořeny jakoukoliv použitelnou kombinací známých liposomů tvořících lipidy, včetně kationtových lipidů jako je fosfatidylcholin. Zbývající lipid bude normální neutrální lipid, jako je cholesterol, fosfatidylserin, fosfatidylglycerin a pod. Pro přípravu liposomů je popsán postup v publikaci Kato et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:3361, který může být použit v tomto případě.
Ve výhodném provedení se EGF-R antagonista enkapsuluje ve stéricky stabilizovaných „stealth liposomech, např. pegylovaných liposomech. Když se takové liposomy vstříknou intravaskulárně, zůstávají v oběhu po dlouhou dobu. Štěrbiny v postkapilárním žilním spojení otevírají cestu k zánětu přes dýchací cesty a umožňují akumulaci tekutiny, což umožní molekulám, např. komplementárním, kininogenu, vstoupit do tkáně a iniciovat zánětlivé kaskády. Takové záněty umožňují liposomům a jejich obsahu, aby byly deponovány selektivně v zanícené tkáni (Zhang et al. (1998) Pharm Res 15:455-460).
•9 ···♦ · ·· ·Φ · ••4 ·· » « · » ·· • ··· · · · · · · • · · ··««·· · • ΟΏ · ······ • 999J9A· ··« ·· ·« ··«
EGF-R antagonisté se mohou podávat pacientovi pomocí farmaceutického dávkovacího systému pro inhalační cestu. Sloučeniny mohou být formulovány ve formě vhodné pro podávání inhalací. Farmaceutický podávači systém je jeden z těch, který je vhodný pro terapii respirační pomocí povrchového nanesení EGF-R antagonistů, na sliznici plic. Tento vynález může využít systém, který závisí na síle stlačeného plynu, který vypláchne EGF-R antagonisty z nádoby. Pro tento účel také lze využít aerosolové nebo tlakové balení.
Termín „aerosol, jak je zde užíván, má obvyklý význam a znamená velmi jemné částečky kapaliny nebo pevné látky, které jsou neseny hnacím plynem za tlaku směrem k místu terapeutické aplikace. Pokud se v tomto vynálezu používá aerosolu, obsahuje tento aerosol terapeuticky účinnou sloučeninu, která se může rozpustit, suspendovat nebo emulgovat ve směsi nosné tekutiny a hnacího plynu (propelentu). Aerosol může být ve formě roztoku, suspenze, emulze, prášku nebo ve formě polotuhého přípravku. Aerosoly, které se používají v tomto vynálezu, mají účel podat látku v tak jemném stavu, že pevné částečky nebo tekuté částečky se mohou dostat přes dýchací systém pacienta. V oboru jsou známy různé typy hnacích plynů, které mohou být pro tento účel použity. Mezi příklady vhodných hnacích plynů jsou, mimo jiné, uhlovodíky nebo jiný vhodný plyn. V případě tlakového aerosolu je jednotková dávka např. stanovena způsobem vytvoření zařízení, které umožňuje měřit množství a dávkovat jednotlivé várky.
Prostředky podle vynálezu a účinné látky se také mohou aplikovat a nést pomocí nebulizéru, což je zařízení, které vytváří v plynu velmi jemné částečky tekutiny, které mají v podstatě stejnou velikost. Výhodně se disperguje tekutina, obsahující EGF-R antagonisty jako kapičky. Malé kapičky se mohou • * ···♦ • · · «ti » · · t·· ·· ·« ««· uvést do nosiče, který může být momentálně dodaný vzduch, který je nese skrz trysky nebulizéru. Získaná mlha proniká do respiračního traktu pacienta.
Savci, který potřebuje takovou terapii, se dá také podávat práškový prostředek, obsahující antagonisty EGF-R nebo jejich analogy, a to s mazadlem nebo bez mazadla, nosičem nebo hnacím plynem. Takovéto provedení vynálezu se dá provést s obvyklým zařízením pro podávání práškových farmaceutických prostředků formou inhalace. Prášková směs účinné sloučeniny a vhodné práškové báze, jako je laktóza nebo škrob, může být také např. přítomna v jednotkové dávkové formě, která může být např. tobolka nebo kazeta např. z želatiny, nebo to může být blistr, a z těchto balení se pak může podávat pacientovi prostředek pomocí inhalačního zařízení.
Při léčení plicních chorob s nadměrnou sekrecí hlenu lze také použít kombinovanou terapii. Tak např. antagonisté EGF-R se mohou kombinovat s obvyklým léčením, které se používá pro zmírněni nadměrného vylučování hlenu, což může být podávání bronchiodilátorů, kortikosteroidů, expektorantů, mukolytických činidel a pod., aby se docílilo vyčištění řasinek od hlenu.
Podle stavu pacienta se také může výhodně podávat prostředek podle vynálezu formou injekcí (např. intravenózní) nebo formou inhalace. Pacienti, kteří mají velká množství hlenu v plicích, obecně nemohou být léčeni zprvu formou inhalace. Je to tím, že pacientovy plíce jsou příliš zatíženy a inhalace aerosolového prostředku do plic by nebyla příliš účinná. Nicméně, po aplikaci injekcí nebo alternativně pro dlouhodobé udržování zlepšeného stavu nebo v situacích, kdy pacientovy plíce nejsou ohroženy nebo nebezpečně zatíženy, je výhodné
• · · · · · • ♦ · • · · · • · .:.....· podávat účinnou látku podle vynálezu inhalaci. Podáváni účinné látky inhalaci je výhodné proto, že menší dávky se dají podat lokálně do specifických buněk, které jsou právě ty, které nejvíce potřebují léčení. Podáváním menších dávek se eliminují jakékoliv vedlejší účinky, nebo se tyto účinky podstatným způsobem zmenšují. Podáváním přímo do buněk, které nejvíce potřebují léčení, se léčebný efekt realizuje daleko rychleji.
Existuje několik typů inhalačních postupů, které se dají použít pro podávání prostředků a léčení podle vynálezu. Antagonisté podle vynálezu se mohou formulovat v zásadě v třech různých typech formulací pro inhalaci. První z nich se formuluje tak, že antagonisté podle vynálezu jsou kombinováni s hnacími plyny s nízkou teplotou varu. Takovéto formulace se obvykle podávají pomocí běžných inhalátorů, u kterých je možnost měření dodané dávky (MDI). Nicméně obvyklý MDI může být modifikován tak, že se zvýší schopnost získat opakované dávky použitím technologie zahrnující měření vdechnutého objemu a průtoku množství plynu do plic pacienta, což je dobře diskutováno v amerických patentech 5 404 871 a 5 542 410.
Alternativně mohou být agonisté podle vynálezu ve formulacích ve vodných nebo ethanolových roztocích a jejich podávání se může provádět běžnými nebulizéry. Nicméně, výhodnější je, když se takovéto formulace převádějí na aerosoly pomocí zařízení a systémů, jako jsou ty, které jsou popsány v amerických patentech 5 497 763; 5 544 646; 5 718 222 a 5 660 166.
A nakonec, agonistické sloučeniny podle vynálezu se mohou formulovat do suchých práškových prostředků. Takovéto prostředky se mohou podávat jednoduše inhalací suché práškové formulace po vytvoření aerosolové mlhy prášku. Technologie pro provádění
takového způsobu je popsána v americkém patentu 5 775 320, uděleného 7. července 1998 a v americkém patentu 5 7 40 7 94, uděleného 21. dubna 1998.
S přihlédnutím ke všem shora uvedeným patentům, přihlašovatelé zjistili, že tyto patenty citují i jiné publikace, týkající se zařízení pro intrapulmonární podávání účinných látek a takovéto publikace se mohou uvést také na podporu podpisu metodik, zařízení a prostředků, které mohou být použity v souvislosti s podáváním agonistů podle vynálezu. Dále všechny z těchto patentů jsou zde zahrnuty do popisu formou odkazu v celém jejich rozsahu pro účely popsání formulací, zařízení, balení a metodiky pro podávání prostředků obsahujících agonisty podle vynálezu.
Screeningové testy
Látky, které představují kandidáty použitelných účinných látek
Screeningové testy se mohou použít k identifikaci bioaktivních potenciálně účinných látek, které jsou antagonisty EGF. Zejména jsou zajímavé screeningové testy na prostředky, které mají nízkou toxicitu pro lidské buňky. Pro tento účel může být použito řady testů, včetně použití testů, které využívají vazbu značených in vitro protein-protein. Dále lze využít testy změny elektroforetické mobility, imunotesty na vázání proteinu a pod. Čištěný protein EGF nebo EGF-R se mohou také použít v testech na trojrozměrné krystalické struktury, což pak může být užitečné pro modelování intramolekulárních interakcí, transportních funkcí, atd.
Termín „činidlo, jak se zde používá, znamená jakoukoliv molekulu, např. protein nebo farmaceuticky účinnou látku, která má schopnost alterovat nebo inhibovat fyziologické funkce EGF nebo EGF-R. Obecně se provádějí paralelně řady testů směsi, při čemž se porovnávají různé koncentrace činidel, aby se získaly rozdílné odezvy při rozdílných koncentracích. Obvykle jedna z těchto koncentrací slouží jako negativní kontrola, např. nulová koncentrace nebo koncentrace pod hranicí detekovatelnosti.
Látky, které jsou potencionálně zbytečné, mohou spadat do řady chemických tříd, celkem obvykle jsou to organické molekuly, nej častěji malé molekuly organických sloučenin, které mají molekulovou hmotnost větší než 50 a menší než asi 2 500 daltonů. Potenciálně užitečná činidla mohou mít funkční skupiny, které jsou nutné pro strukturní interakci s proteiny, zejména vodíkové vazby, a obvykle obsahují v molekule alespoň jednu aminoskupinu, karbonylovou skupinu, hydroxylovou nebo karboxylovou skupinu, výhodně alespoň dvě z těchto funkčních chemických skupin. Potenciálně užitečná činidla často patří mezi cyklické uhlovodíky nebo mají heterocyklické struktury a/nebo aromatické nebo polyaromatické struktury, substituované jednou nebo více shora uvedenými skupinami. Potenciálně užitečná činidla se také nalézají mezi biologicky existujícími molekulami včetně peptidů, sacharidů, mastných kyselin, steroidů, purinů, pyrimidinů, derivátů, strukturních analogů nebo kombinací těchto sloučenin.
Potenciálně užitečná činidla se získávají z řady zdrojů, včetně knihoven nebo syntetických přírodních sloučenin. Tak např. řada prostředků je dostupná pro náhodnou a přímou syntézu velkého množství organických sloučenin a biomolekul, včetně exprese náhodně spojených oligonukleotidů a oligopeptidů. Alternativně se použijí knihovny přírodních sloučenin ve formě bakteriálních, houbových, rostlinných a zvířecích extraktů, které jsou dostupné nebo se dají snadno připravit. Dále přírodně nebo synteticky získané knihovny a sloučeniny se snadno dají modifikovat běžnými chemickými, fyzikálními a biochemickými prostředky, a mohou se k přípravě dalších knihoven, které jsou náhodnými a cílenými kombinacemi, také použít. Známá farmakologická činidla mohou být také podrobena přímé nebo náhodné chemické modifikaci, jako je acylace, alkylace, esterifikace, amidace, atd., čímž se získají strukturní analogy.
Pokud je screeningovým testem test na schopnost vazby, připojí se k jedné nebo více molekulám, např. vhodné značení, přičemž toto značení může být přímo nebo nepřímo detekovatelné pomocí nějakého signálu. Různé značení jsou radioizotopové, fluorescenční, chemiluminiscenční, enzymatické, mohou to být molekuly, které se specificky váží, částečky, např. magnetické částečky a pod. Molekuly schopné specifické vazby se vyskytují v párech, jako je biotin a streptavidin, digoxin a antídigoxin, atd. Pro členy, které jsou schopny specifické vazby, se normálně může komplementární člen označit molekulou, která zabezpečí detekci, což je možné provést známými postupy.
Při screeningových testech se také může uplatnit řada jiných reakčních činidel. Patří mezi ně činidla jako soli, neutrální proteiny, např. albumin, detergenty, atd., které se používají k dosažení optimální vazby protein-protein a/nebo ke snížení počtu nebo intenzity nespecifických interakcí nebo interakcí na pozadí. Mohou se také použít reakční činidla, která zlepšují účinnost testu, jako jsou inhibitory proteázy, inhibitory nukleázy, antimikrobiální činidla, atd. Směs sloučenin se přidá v jakémkoliv pořadí, které zajišťuje vazbu, potřebnou pro test. Inkubace se provádějí při jakékoliv vhodné teplotě, obvyklé mezi 4 a 40°C. Inkubační doba se volí tak, aby aktivita byla optimální, ale může se také optimalizovat za účelem dosažení rychlého výstupu z screeningového testu. Obvykle bývá dostatečná doba mezi 0,1 a 1 hodinou.
Sloučeniny, které mají žádanou farmakologickou účinnost, se mohou podávat ve fyziologicky přijatelném nosiči hostiteli za účelem léčení choroby, při které se projevuje nadměrné vylučování hlenu, ve formulacích, které jsou tu popsány. V závislosti na způsobu zavádění do organismu se mohou sloučeniny při těchto testech formulovat řadou způsobů, které jsou zde popsány. Koncentrace terapeuticky účinné sloučeniny ve formulacích se může měnit od asi 0,1 do 100 % hmotnostních.
Dávkovači režim
Vhodné úrovně dávek se také mění v závislosti na faktorech včetně povahy subjektu, který se má léčit, konkrétní povahy stavu nadměrného vylučování hlenu, který se má léčit a jeho závažnosti, povahy EFG-R antagonisty, který byl použit jako účinná přísada, způsobu podávání, složení konkrétního prostředku, který se podává a podle jiných známek závislých na posouzení odborného lékaře, který toto léčení provádí. Tak např., pokud se podávají protilátky jako takové, např. anti-EGF nebo EGF-R v injekčních formulacích, dávkování se bude pohybovat v rozmezí 20 mg/kg až asi 40 mg/kg u jednotlivé dávky. Může být požadováno opakované podávání v průběhu několika dnů nebo podávání intravenózními prostředky, které může být kontinuální. V případě chronických stavů může být v podávání pokračováno delší dobu, podle toho, jak je třeba.
Účinnost dávkovacího režimu se bude posuzovat podle zlepšení funkce plic u pacienta. Toto posouzení může zahrnovat měření viskoelasticity sputa, zlepšení u plicních funkcí, včetně • · «
• · ·
• · zlepšení v množství objemu vylučovaného sputa a maximální respirační průtok. Shora uvedený terapeutický režim může být poskytnut ve spojení dalšími terapiemi, jako je např. terapie antibiotiky, DN-ázou 1 nebo jinými současnými léčebnými postupy pro léčení chorob z nadměrné produkce hlenu v plicích. Pokud se současně podávají antibiotika jako část terapie pacienta, může následovat po terapii bakteriální test, pomocí kterého se posoudí účinnost na snížení růstu bakterií, což naznačuje snížení viskozity z hlenu nebo sputa a zvýšení čištění hlenu nebo sputa v plicích.
Testy plicní funkce, stejně jako diagnostické testy na klinický stav choroby z nadměrného vylučování hlenu, jsou odborníkům v oboru známé. Standardní testy plicní funkce zahrnují odpor dýchacích cest (AR); vitální kapacitu plic (FVC); respirační objem při intenzivním dýchání po dobu 1 sekundy (FEV(l)); průtok při silném výdechu; a nejvyšší výdechový průtok (PEFR). Jiné plicní testy zahrnují analýzu krevního plynu; odezvy na aplikaci farmaceutických prostředků; testování napadení a cvičení; měření tenze respiračniho svalu; zkoumání fibro-optických cest a pod. Některé základní postupy pro studium vlastností hlenu zahrnují rheologické testy, např. s použitím magnetického mikrorheometru; měření adhezivity pro stanovení síly přilnavosti mezi povrchem a adhesivním systémem měřením kontaktního úhlu mezi kapkou hlenu a povrchem. Běžnými technikami se také dá testovat transport hlenu s řasinkami, stejně jako se dá přímo měřit, tj. in šitu rychlost čištění hlenu. Potenciální transepitelové rozdíly a síťové výsledky aktivity iontově-transportního systému plicního epitelu, se dají měřit pomoci vhodných mikroelektrod. Pro charakterizaci stavu povrchu epitelu se dají použít kvantitativní morfologické metody.
Pacient, který se má léčit, může být primát jako je člověk nebo jakýkoliv jiný živočich, který má popsané příznaky. Přestože je způsob léčení podle vynálezu přizpůsoben zejména léčení lidí, je jasné, že se tento vynález dá aplikovat i na veterinární praxi.
Sceeningové testy in vitro
Podle dalšího provedení vynálezu se používají testy in vitro, aby se posoudila terapeutická účinnost potenciálně použitelného činidla ve smyslu inhibice proliferace pohárkovitých buněk, tj. zda tato činidla jsou aktivní jako EGF antagonisté. Obecně budou takovéto testy zahrnovat následující stupně: (i) uvede se in vitro do kontaktu model proliferace pohárkovitých buněk s EGF nebo jeho funkčním ekvivalentem; (ii) následně se uvede do kontaktu in vitro model s potenciálně účinným činidlem; a (iii) posoudí se proliferace pohárkovitých buněk, zda inhibice proliferace těchto buněk je indikativní u potenciálně použitelné testované látky
Tento test se výhodně provádí s dvěma kontrolami, přičemž druhá skupina buněk není uváděna do kontaktu s žádnou sloučeninou a třetí se uvádí do kontaktu s EGF, ale ne s testovanou potenciálně užitečnou sloučeninou. Srovnání se pak provádí tak, že se stanoví stupeň účinnosti podle účinnosti EGF.
Dá se použít jakýkoliv model proliferace pohárkovitých buněk in vitro. Formou příkladu lze uvést, že se dají izolovat tracheální buňky krys a udržovat v tkáňové kultuře, což je popsáno v publikaci Guzman et al. (1995) 217:412-419. Stručný popis tohoto testu je následující: tracheální buňky krys se pěstují na kolagenovém gelu, naneseném na semipermeabilních • * · · · · ♦ · · · • · ·· • · · • · •♦ •· •· • · membránách, zprvu se kultivují ponořené v kultivačním poté se udržují na rozhraní vzduch, kapalina. Příklady buněk, které se dají takto testovat in vitro jsou bronchiální buňky člověka (dostupné od Clonetics, San Diego); buňky NC1-H292 (ATCC (ATCC CRL-1555).
CRL-1848); a buňky A431
Tato kultura in roztoku a vitro se uvede do kontaktu s EGF a s testovaným činidlem.
kontaktu napřed s kulturou, souběžně nebo následně za EGF, podle výsledného účinku, který se povahy testovaného činidla. Kultivované
Testované činidlo se může uvést do přidání má posuzovat a podle buňky se posoudí na inhibicí proliferace pohárkovitých s kontrolami.
buněk ve srovnání
K posouzení proliferace pohárkovitých buněk se řada molekulárních nebo biochemických markérů, molekulových nebo biochemických markérů, jsou mimo jiné, pohárkovitých buněk. Určité al. (1997) J.Biol.Chem.
dá použít
Příklady které se mohou použít, genová exprese nebo exprese charakteristických geny mucinů, např. MUC5B (Desseyn et 272:3168-3178) v dýchacích cestách a mají v hlenu. Exprese mucinových pro stanovení produkce hlenu.
genetický produkt genů může sloužit jsou exprimovány vysoce zastoupený jako vhodný markér
Exprese mucinového hlenu se jako je northern blot analýza, (PCR), zkoumání promotoru analýzou. Alternativně se dá posoudit obvyklou technikou, reakce polymerázového mucinového hlenu nebo řetězce in šitu mucinové proteiny posuzují western blot, ELISA, imunochemie a známými pod., také nebo technikami jako je analýza přičemž se používají detekovatelně značené protilátky. Lze použít morfologická kritéria, čímž se stanoví přítomnost absence pohárkovitých buněk v kultuře; takové metody, jako je např. vybarvování mucinů, používají Alcianovou modř v kombinaci s vybarvováním PAS (Lou et al. (1998) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157:1927-1934). Protilátky proti mucinům mohou být testovány pomocí analýz ELISA. Vzhledem k tomu, že stimulace EGF-R ligandem, např. EGF, TGF-α, indukuje fosforylaci kinázy specifického EGF receptorů a má za následek produkci pohárkovitých buněk, fosforylace EGF-R se dá měřit jako odraz indukce pohárkovitých buněk (Donato et al. (1994) J. Biol. Chem. 264:20474-20481) .
Pokles množství molekulových nebo biochemických markérů spojený s proliferací pohárkovitých buněk je indikativní pro možnost potenciálního využití antagonisty, který je testován v terapii.
Modely in vivo
Podle ještě dalšího provedení podle vynálezu se používají k posouzení terapeutického potenciálu testovaných činidel inhibovat proliferací pohárkovitých buněk zvířecí modely in vivo. Obecně zahrnují takové testy následující stupně: (i) vytvoření zvířecího modelu choroby plic, při které dochází k nadměrnému vylučování hlenu indukcí exprese EGF-R; (ii) stimulace indukovaného EGF-R k produkci mucin produkujících pohárkovitých buněk; (iii) léčení testovaným činidlem; a (iv) posouzení proliferace pohárkovitých buněk nebo sekrece hlenu, při kterém je indikativní inhibice proliferace pohárkovitých buněk nebo inhibice vylučování hlenu pro terapeutickou hodnotu testovaného činidla.
Lze použit jakýkoliv model plicní choroby s nadměrným vylučováním hlenu in vivo. Jako příklad lze uvést příklad • · · · 4 · • 4 4 • ··· • ·
astmatické myši, jak je popsán v publikaci Temann et al. (1997) Tůn J. Respir. Cell. Biol. 16:471-478 a jak je ukázáno v příkladech, které jsou zde uvedeny. Alternativně se dá použít krysí model, jak je popsán v publikaci Takeyama et al. (1998) Am. J. Physiol. Příklady jiných zvířecích modelů, které se mohou také užít, aniž by se tím na tyto příklady omezoval, jsou morčata (druhy, které konstitutivné exprimují pohárkovité buňky) a krysy.
Plicní tkáň nebo tracheální tkáň zvířecích modelů se může posuzovat pomocí stejných molekulárních a biochemických markérů, které jsou popsány pro model in vitro. Snížení proliferace pohárkovitých buněk je indikativní pro potenciální terapeutickou hodnotu EGF-R antagonisty.
Aby se odborníkům v oboru poskytlo úplné podrobné vysvětlení a popis jak provést a použít tento vynález, jsou uvedeny následující experimenty, které však nejsou zamýšleny jako omezení rozsahu vynálezu a rozsahu toho, na co vynálezci přišli, neboť jde zde pouze o experimenty, které jsou reprezentativní. Byla maximální snaha zajistit přesnost použitých čísel (např. množství, teplot, atd.), ale mohlo také dojít k některým experimentálním chybám a odchylkám, se kterými je nutno počítat. Pokud není uvedeno jinak, díly jsou díly hmotnostní, molekulová hmotnost je střední molekulární hmotnost, teplota je ve stupních Celsia a tlak je atmosférický nebo je atmosférickému tlaku blízký.
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1
EGF systém reguluje produkci mucinů v dýchacích cestách
Hyperplazie pohárkovitých buněk se projevuje při řadě chorob průdušek, při kterých dochází k nadměrnému vylučování hlenu, ale vzhledem k tomu, že není známý mechanismus, který tento jev vyvolává, neexistuje účinná terapie. U zdravých průdušek je pohárkovitých buněk málo, ale při nadměrném vylučování hlenu při chorobném stavu se projevuje jejich hyperplazie. Byla studována linie lidských bronchiálních buněk (NHI-H292). Tyto buňky konstitutivně exprimují EGF-R; exprese genu EGF-R byla dále stimulována faktorem alfa (TNFa) nádorové nekrózy. EGF-R ligandy zvyšovaly syntézu mucinů, a tento efekt byl ještě zvýšen společnou inkubací s TNFa.
Epiteliální buňky dýchacích cest u krys bez patogenů exprimovaly malý EGF-R protein, ale intratracheální podání TNFa (200 ng) indukovalo EGF-R v základních, pre-pohárkovitých a pohárkovitých buňkách, ale ne v řasinkových buňkách; TNFa, EGF nebo TGFa samotné neindukuje produkci pohárkovitých buněk. Nicméně zavedení TNFa, následované ligandy EGF-R mělo za následek zvýšení počtu pohárkovitých a pre-pohárkovitých buněk a nárůst PAS-pozitivního vybarvení Alcianovou modří (což odráží glykokonjugáty hlenu) a exprese genu mucinů MUC5. U senzibilovaných krys měl ovalbumin za důsledek produkci pohárkovitých buněk a EGF-R expresi v epitelu dýchacích cest. Buňky NCI-H292 u krys stimulovaných TNFa s následujícím působením EGF-R ligandů a u modelu astmatu u krys zabraňovalo preventivní ošetření EGF-R tyrosin kinázy (BIBX1522) produkci pohárkovitých buněk v dýchacích cestách. Tato zjištění demonstrují funkci inhibitorů EGF-R kaskády pro choroby, při • ·
kterých dochází cestách. k nadměrnému vylučování hlenu v dýchacích
Použité metody
Studie in vitro
Buněčná kultura. Buněčná linie lidského plicního
mukoepidermoidního karcinomu, ECI-H292, byl kultivován v živném
prostředí RPMI 1640, obsahujícím 10 % fetálniho hovězího séra, penicilín (100 U/ml), streptomycin (100 pg/ml) při 37°C v prostředí zvlhčeného 5 % CO2 v inkubátoru s vodním pláštěm. Když kultury splynuly, byly buňky inkubovány s EGF (rekombinační lidský EGF, 25 ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA.) , TGFa (rekombinační lidský TGFoc, 25 ng/ml, Genzyme) , TNFa (rekombinační lidský TNFa, 20 ng/ml, Genzyme), EGF (25 ng/ml) plus TNFa (20 ng/ml) nebo TGFa (25 ng/ml) plus TNFa (20 ng/ml) podobu 12 hodin, 24 hodin nebo 48 hodin. Při testech inhibice působením inhibitoru EGF-R tyrosin kinázy bylo použito látky BIBX1522 (10 pg/ml, která je poskytována firmou Boehringer Ingelheim lne., Ingelheim, Germany), buňky byly předběžně ošetřeny BIBX1522 30 minut, a poté byly přidány růstové faktory. Po inkubaci byly buňky narostlé v baňkách T-75 použity pro totální extrakci RNA nebo proteinovou extrakci a pro vizualizaci mucinů pomocí Alcianové modři a vybarvení PAS byly použity 8 komorové filmy.
Western blotting. Buňky namnožené v baňkách T-75 byly rozloženy a jemně rozmělněny s PBS obsahující 1 % Tritonu X, 1 % dioxykolátu sodného a PMSF (10 mg/ml). Celkové množství proteinu bylo odhadnuto testem využívajícím BCA proteinové činidlo (Pierce, Rockford, IL) . Buněčné lyzáty byly vařeny tricinovým • · · · · ·
• · • · ·· vzorkovým pufrem a 2 % βΜΕ při 95°C. Proteiny byly odděleny pomocí SDS-PAGE do 8 % akrylamidových genů. Získané gely byly uvedeny do rovnováhy v přenosovém pufru: 25 mM Tris-HCl,192 mM glycine, 20 % (vol/vol) methanol, pH 8,3. Proteiny pak byly přeneseny elektroforeticky na nitrocelulózové membrány. Tyto membrány pak byly inkubovány po dobu 1 hodiny v 5 % tuku zbaveném odstředěném mléku v PBS s obsahem 0,05 % Tweenu 20. Pak byly membrány inkubovány v monoklonální myší protilátce antiEGF-R (1:100) při 4°C přes noc. Navázaná protilátka byla vizualizována podle standardních protokolů pro metodu avidin fosfatázového komplexu avidin-biotin-draslík (ABC kit, Vector Laboratories). Jako pozitivní kontrola pro EGF-R byly použity (20) buněčné lyzáty z buněk A431.
Imunocytochemická lokalizace EGF-R v buňkách NC1-H292. Buňky vyrostlé na 8 komorových filmech byly fixovány 4 % paraformaldehydem 1 hodinu. Pro vybarvení EGF-R byl použit jako ředidlo pro protilátku PBS obsahující 0,05 % Tweenu 20, 2 % normálního kozího séra a 2 mM levamisol. Oddíly byly inkubovány s myší monoklonální protilátkou proti EGF-R (1:250) přes noc při 4°C a pak promyty 3krát PBS, aby se odstranil přebytek primární protilátky. Buňky pak byly inkubovány s biotinylovaným koňským anti-myším imunoglobulinem (Vector Laboratories, Burlingame, CA) při zředění 1:200 po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Navázaná protilátka byla vizualizována podle standardních protokolů pro metodu využívající fosfatázový komplex avidinbiotin-alkalický kov (ABC kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA) .
Próby. Exprese EGF-R mRNA byla stanovována pomocí linearizované pTRI-EGF-R-lidské šablony sond (Ambion, Austin, TX) . Tyto sondy obsahují 360 bp cDNA fragment lidského EGF-R ·« • « • · ·· genu, který zasahuje rozpětí exonů 12-14. Exprese genu MUC5 byla stanovena pomocí sondy lidského MUC5AC, který obsahuje fragment lidského MUC5AC genu 298 bp cDNA (obecně je možné jej získat od doktora Carola Basbauma).
Northern blotting. Totální RNA byla extrahována z buněk NC1H292, vyrostlých v kultivačních baňkách T-75 ve všech případech s pomocí činidla Tri-Reagent (Molecular Research Ctr, Cincinnati, OH). Totální RNA (10 pg) byla podrobena elektroforéze na 1 % gelu agaróza/formaldehyd a přenesena na nylonovou membránu (Amersham, Arlington Heights, IL) kapilárním savým materiálem. Sondy byly značeny pomocí 32P značící soupravy Random Primed DNA (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN) . Nasáté skvrny byly prehybridizovány při 42°C po dobu 4 hodin a pak hybridizovány při 42°C 16 hodin pomocí specifické cDNA próby značené 32P. Hybridizační roztok obsahoval 250 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 % SDS, 1 % BSA, 1 % polyvinylpyrrolidon, 1 % Ficoll a 0,5 % pyrofosforečnan sodný. Po hybridizaci byla membrána dvakrát promyta SSC s použitím 0,1 % SDS po dobu 30 minut při pokojové teplotě, pak následovalo promytí ve dvakrát SSC pomocí 0,1 % SDS po dobu 30 minut při 50°C a opláchnutí v 0,1 krát SSC s použitím 0,1 % SDS. Membrány pak byly vystaveny filmu, citlivému na rentgenové paprsky.
Studie in vivo
Postup při provádění testů na zvířatech byl schválen Committee on Animal Research, University of California San Francisco. Pro testování byly použity speciální bezpatogenní krysí samci plemene F344 Fisher, vážící 230-250 g (Simonsen Laboratories, Gilroy, CA). Tyto krysy byly udržovány při • ·
•··4 ···
• · · · · • · · · •99 ·« · regulované teplotě (21°C) v místnosti se standardní laboratorní potravou a s libovolným přístupem k vodě.
Zdravé krysy. Krysy byly anestetizovány metohexitalem sodným (Brevital sodium, 50 mg/kg, i.p.; Eli Lilly & Co.; Indianapolis, IN), a byly ponechány spontánně dýchat. Aby se zjistilo, zda TNFa pozitivně reguluje EGF-R v dýchacích cestách, bylo TNFa (200 ng, 100 μΐ) umístěno do průdušnice a zvířata byla po 24 hodinách usmrcena. Aby se zjistilo, zda EGF nebo TGFa indukuje pohárkovité buňky v epitelu průdušnice, bylo umístěno EGF (600 ng, 100 μΐ) nebo TGFa (krysí syntetický TGFa, 250 ng, 100 μΐ; Sigma, St Louis, MI), a to buď samostatně nebo 24 hodin po umístění TNFa (200 ng, 100 μΐ) a zvířata byla po 48 hodinách utracena. V každém testu byl použit sterilní PBS (100 μΐ), který byl umístěn do průdušnice jako kontrola. Aby se potvrdila, že produkce mucinu byla důsledkem aktivace EGF-R, testovali jsme účinek EGF-R inhibitoru tyrosin kinázy, BIBX1522 (dávka byla odhadnuta z testů, ve kterých se používá inhibitor k prevenci růstu rakoviny). Krysy byly předběžně ošetřeny BIBX1522 (3, 10 nebo 30 mg/kg, i.p.) 1 hodinu a 24 hodin po umístění TGFa. Průdušnice a plíce byly vyjmuty pro testování 48 hodin po umístění TGFa.
Senzibilované krysy
Senzibilace. Krysy byly senzibilovány nultý a 10. den pomocí intraperitoneálních injekcí ovalbuminu (10 mg, čistota V; Sigma, St. Louis, MO), který byl uveden do komplexu přidáním 100 mg hydroxidu hlinitého v 0,5 ml sterilní solanky. Poté byly krysy ponechány 10 dní v klidu. Dvacátý den byl podán ovalbumin přímo do průdušnice. Zvířata byla podrobena dávce 100 μΐ 0,1 % • · ovalbuminu v solance intratracheálním podáním, a to celkem třikrát (20., 22. a 24. den). Krysy byly usmrceny, a to před podáváním (den 20) nebo 48 hodin po třetím podání (den 26) . Tento postup indukoval metaplazii pohárkovitých buněk. Aby se zablokovala hyperplazie pohárkovitých buněk, byly senzibilované krysy předběžně ošetřeny inhibitorem EGF-R tyrosin kinázy BIBX1522. V den podání ovalbuminu (dny 20, 22 a 24) byly senzibilované krysy před dávkou ošetřeny BIBX1522 (10 ml/kg, intraperitoneálně, 1 hodinu před podáním) a pak BIBX1522 byl také podán místně do průdušnice spolu s ovalbuminem (BIBX1522 10~5 M, 100 μΐ). BIBX1522 byl také podán injekčně intraperitoneálně, a to každých 24 hodin, až do dne, před kterým byly krysy usmrceny. Po usmrcení zvířat byla průdušnice vyjmuta 48 hodin po třetím ošetření.
Preparace tkáně. V předem zvolených dobách v průběhu anestézie byl do systémického oběhu vstříknut 1 % paraformaldehyd v DEPC-ošetřeném PBS při tlaku 120 mm Hg. Průdušnice pak byla vyjmuta a umístěna v 4 % paraformaldehydu po dobu 24 hodin. Po fixaci byly průdušnice a plíce uloženy buď v JB-4+ monomerním roztoku A pro analýzu buněk, nebo ve sloučenině O.C.T. (Sakura Finetek U.S.A., Inc., Torrance, CA) pro imunohistochemii pro hybridizaci in šitu. Z uložených tkání byly pak připraveny řezy, tlusté 4 mm, a tyto řezy byly umístěny na filmy.
Analýza buněk. Spočítali jsme celkový počet epiteliálních buněk, přičemž bylo použito metody, při které se počítají jádra epiteliálních buněk přes 2 mm základní vrstvy s použitím olejového imerzního objektivu (1000 krát zvětšení). Lineární délka základní vrstvy v každém analyzován regionu epitelu byla stanovena trasováním kontury digitalizovaného obrázku základní • 99·· •99 9 · ··· • 9 9 >··
9 » 9 9 9<
• 9 9 9 99 ··· 99 · *9 9 9 vrstvy. Po umístěni stimulantu je pozorovatelná forma pohárkovitých buněk, kterou lze označit jako „vyvíjející se. Tyto buňky se vybarvují jako PAS-pozitivní granule Alcianovou modří, ale velikost granulí je malá a počet cytoplasmatických granulí je také malý. Tyto „vyvíjející se pohárkovité buňky jsme nazvali „prepohárkovité buňky a považujeme je za stadium před tím, než se pohárkovité buňky stanou zralé. Pohárkovité buňky jsou vysoké, kostkovíté, pohárkovitého tvaru nízkého sloupce, přičemž jsou vyvolatelné jako PAS vybarvené granule Alcianovou modří, která vyplňuje většinu cytoplasmy mezi jádrem a luminálním povrchem. Prepohárkovité buňky jsou definovány jako buňky s menší plochou vybarveného objemu (méně než 1 třetina výšky epitelu od báze membrány k luminálnímu povrchu) nebo s částečně a světle Alcianovou modří vybarvenými PAS (malými granulemi). Buňky s řasinkami byly rozpoznány pomocí jejich řasinkového povrchu, světle vybarvené cytoplasmy a velkého kulatého jádra. Negranulované sekreční buňky jsou válcovité a zasahují od lumenu do bazální vrstvy. Vybarvení cytoplasmy je nahnědlé a také bylo u cytoplasmy pozorováno slabé PAS-pozitivní a Alcianová modř-negativní granule. Bazální buňky jsou malé ploché buňky s velkými jádry a jsou umístěny přímo nad základní vrstvou, ale nezasahují k lumenu průdušky.
Kvantitativní stanovení produkce pohárkovitých buněk. Produkce pohárkovitých buněk byla testována za pomoci objemové hustoty s použiti vybarvení mukosubstancí pomocí PAS-metody Alcianovou modří, vybarvování bylo testováno na povrchu epitelu s použitím semiautomatického zobrazovacího systému, který je popsán jinde (Webwr et al. (1984) Science 224:294-297). Měřili jsme plochu PAS-pozitivního vybarvení Alcianovou modří a celkovou plochu epitelu a data vyjádřená v procentech celkové vybarvené plochy byla potom dále zpracována. Analýza byla prováděna pomocí veřejně známého zobrazovacího programu NIH Image program (vyvinut v U.S. National Institute of Health dostupného na internetu pomocí anonymního FTP z zippy.nimh.gov nebo na disketě od National Technical Information Service, Springfield, VA, part number: PB95-500195GEI).
Imunohistochemická lokalizace EGF-R v krysím epitelu. Lokalizace EGF-R byla hledána pomocí imonohistochemického vybarvování s použitím protilátky proti EGF-R (Calbiochem, San Diego, CA) ve zmrazených částech krysí průdušnice. Po vymytí v 1 % paraformaldehydu v PBS byly tkáně umístěny v 4 % paraformaldehydu v PBS po dobu 1 hodiny a pak byly přemístěny do 30 % sacharózy, aby se zajistila kryoprotektivita přes noc. Průdušnice byly uloženy O.C.T. sloučenině (Sakura Finetek U.S.A., Inc. Torrance, CA) a zmrazený. Zmražené části (5 pm) byly nasekány a umístěny na skleněná sklíčka (Superfrost Plus, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Imunovybarvení bylo provedeno podobně jako při testech in vitro.
Příprava sondy. cDNA pro krysí MUC5 byl obecně získán od Dr. Carola Basbauma. cDNA fragment krysího MUC5, A 320 bp byl subklonován do Xba/hindlII místa transkripčního vektoru, pBluescript-SK(-)(Stratagene, La jolla, CA). Za účelem přípravy RNA sondy pro hybridizaci in šitu byl tento rekombinační plasmid, obsahující krysí MUC5 cDNA fragment linearizován a transkribován in vitro s T7 nebo T3 polymerázou, aby se získala antisense nebo sense próba. Tyto próby pro hybridizaci in šitu byly generovány za přítomnosti [35S]UTP. Po transkripci byla cDNA šablona digestována DN-ázou a radioaktivně značena RNA byla čištěna přes kolonu s náplní Sephadex G-25, typu Quick Spin TM Column (Boehringer Mannheim, Indianopoli, IN) a vysrážena • · z roztoku ethanol/octan amonný. Před použitím byly RNA próby promyty 70 % ethanolem a zředěny v 10 mM DTT.
Hybridizace in šitu. Byly nakrájeny zmražené sekce (5 pm) a tyto sekce byly umístěny na pozitivně nabitá skleněná sklíčka (Superfrost Plus, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA,). Sekce, které byly uříznuty ve velké blízkosti, byly použity pro hybridizaci se sense a antisense s próbami. Alternativní sekce byly použity pro vybarvení Alcianovou modří/PAS. Vzorky byly opět fixovány v 4 % paraformaldehydu, rehydratovány v 0,5 x SSC a pak acetylován v triethanolaminu pomocí acetanhydridu. Hybridizace byla prováděna pomocí 2500 - 3000 cpm/μΐ antisense nebo sense próby v 50 % deionizovaném formaldehydu, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris, 5 mM EDTA, lx Denhardtův roztok, 20 mM dithiothreitolu, 10 % síranu dextranu, 0,5 mg/ml kvasinkové tRNA a 0,5 mg/ml DNA lososího spermatu ošetřené ultrazvukem, což bylo provedeno při 55°C přes noc. Posthybridizační ošetření spočívalo z promytí v 2x SSC, 1 mM EDTA, 10 mM β-merkaptoethanolu při pokojové teplotě, dále z inkubace s RN-ázovým roztokem (20 mg/ml) po dobu 30 minut při pokojové teplotě a dalšího promytí v 0,1 x SSC, 1 mM EDTA, 10 mM β-merkaptoethanolu při 55°C po dobu 2 hodin a pak 0,5 x SSC při pokojové teplotě. Vzorky byly dehydratovány, sušeny na vzduchu a pokryty nukleární emulzí Kodak NBT (Eastman Kodak, Rochester, NY) pro autoradiografii. Po expozici po dobu 7 - 21 d při 4°C byly filmy vyvolány, ustáleny a vybarveny hematoxylínem (21).
Statistické zpracování získaných dat. Veškerá data jsou vyjádřena jako průměr ± střední odchylka. Při analýze nahodilých chyb byla použita jedna metoda, pomocí které byly statisticky zpracovány průkaznosti mezi jednotlivými skupinami. Pro • ♦ · · · ·
posouzeni statistické průkaznosti v případě více srovnávání byl použit Scheffeův F test. Pravděpodobnost menší než 0,05 pro nulovou hypotézu byla přijímána jako dostatečný důkaz statistické průkaznosti rozdílu.
Výsledky
TNFa stimuluje produkci EGF-R v NC1-H292 buňkách. Jako první jsme zkoumali, zda NC1-H292 buňky exprimuji EGF-R konstitutivně. Analýza imunity metodou western blot identifikovala přítomnost EGF-R proteinu v ovlivněných kulturách NC1-H292 buněk (obr. 1A, vpravo). Buňky byly testovány až poté, co došlo k jejich splynutí. Lyzáty byly podrobeny elektroforéze v 8 % akrylamidovém gelu a naneseny na savý materiál s antiEGF-R protilátkou. Molekulární hmotnosti markerových proteinů jsou uvedeny vpravo. Pozitivní kontrola pro EGF-R byl protein z buněk A431 (obrázek 1A, vlevo), které exprimuji EGF-R konstitutivně (Weber et al., supra.). Imunocytochemické testy s protilátkou anti-EGF-R lemovaly pozitivní vybarvení, které se nejvíce projevovalo v rozdělených buňkách (obr. IB, imunocytochemická analýza pomocí anti-EGF-R protilátky v kultuře NC1-H292 buněk). Na splynuté kultuře bylo vidět pozitivní vybarveni, nej ostřeji v rozdělených buňkách (šipky, pravá strana). Za nepřítomnosti primární protilátky vybarvení chybělo (levá strana). Northern blotting ukázal, že TNFa (20 ng/ml) pozitivně reguluje expresi genu EGF-R, a tento účinek byl přítomen 12 hodin a zvýšil se po dobu 24 hodin (obr. 1C, analýza Northern EGF-R v buňkách NCI-H292). Analýza byla prováděna s totální RNA extrahovanou ze splynutých kultur, inkubovaných s TNFa (20 ng/μΐ) po dobu 12 nebo 24 hodin. RNA byla podrobena elektroforéze na agarózovém gelu s formaldehydem, přenesena na nylonovou membránu a hybridizována s 32P-značenou EGF-R cDNA próbou. Po hybridizaci
byla membrána promyta a autoradiografována.
EGF-R ligandy stimulují expresi mukózních glykokonjugátů a expresi genu MUC5 v buňkách NCI-H292. EGF-R jsou exprimovány konstitutivně v buňkách NCI-H292, takže jsme posuzovali schopnost EGF-R ligandů (EGF, TGFa) vyvolat produkci mukózních glykokonjugátů (obr. 2, horní sloupec, vybarvení Alcianovou modří/PAS NCI-H292 buněk za účelem identifikace mucinových glykoproteinů). Horní sloupec = inkubace buněk bez inhibitorů; spodní sloupec - inkubace za přítomnosti inhibitoru BIBX1522 (10 μg/ml·) EGF-R tyrosin kinázy. Když byly buňky inkubována samotné (kontrola), bylo do určité míry pozorováno PAS-pozitivní vybarvení (šipky, horní sloupec); inkubace s TNFa (20 ng/ml) samotná neměla na vybarvení vliv; inkubace s EGF, (25 ng/ml) nebo s TGFa (25 ng/ml) zvyšovala PAS-pozitivní vybarvení (šipky); inkubace s TNFa plus TGFa zvyšovala vybarvení velmi výrazně (šipka, horní sloupec).
Některé kontrolní buňky vykazovaly vybarvení; inkubace s TNFa (20 ng/ml) samotným neměla na vybarvení vliv; inkubace s buď EGF nebo s TGFa (každý v koncentraci 25 ng/ml) zvyšovala PAS-pozitivní vybarvení (šipky); inkubace s TNFa plus TGFa zvyšovala vybarvení daleko více ve srovnání s ligandem samotným. Tudíž EGF-R ligandy vyvolávají v buňkách NCI-H292 tvorbu mukózních glykokonjugátů.
Pro zkoumání exprese genu MUC5 byl proveden Northern blotting (obr. 3). Totální RNA (10 μς) byla extrahována z buněk, podrobena elektroforéze na agarózovém gelu s formaldehydem,
přenesena na nylonovou membránu a hybridizována s 32P-značenou MUC5 cDNA probou. Po hybridizaci byla membrána promyta a autoradiografována. Byly získány kultury se samotným živným roztokem (C), s EGF nebo TGFa (25 ng/ml), s TNFa (20 ng/ml) nebo s kombinaci TNFa plus buď EGF nebo TGFa pro 12 (horní sloupec) nebo 24 hodin (dolní sloupec) a jejich vliv na expresi genu MUC5. Kultury byly také připraveny s TNFa plus buď EGF nebo TGFa po preinkubaci s inhibitorem EGF-R tyrosin kinázy (BIBX1522; ΙΟμ/ml; spodní sloupec); inhibitor zabraňoval expresi genu MUC5.
NCI-H292 buňky vykazovaly určitý stupeň exprese v kontrolním stavu (obr. 3, spodní levý sloupec); když byly buňky inkubovány s EGF nebo TGFa, byla exprese genu MUC5 v silné míře rozpoznána po 12 hodinách, ale byl ještě dostatečně jasně exprimován po 24 hodinách. TNFa samotný neovlivnil expresi genu MUC5, ale když byl TNFa přidán k buňkám inkubovaným s ligandy EGF-R, exprese genu MUC5 vzrostla výrazně nad hladinu, dosaženou EGF-R ligandem samotným (obr. 3).
Inhibitor EGF-R tyrosin kinázy (BIBX1522) zabraňuje expresi mukózních glykokonjugátů a expresi genu MUC5 v buňkách NCI-H292. Pro ověření hypotézy, že aktivace EGF-R receptoru vyvolává expresi genu MUC5 byly buňky inkubovány s inhibitorem EGF-R tyrosin kinázy (BIBX1522). Když byly buňky NCI-H292 předběžně ošetřeny BIBS1522 (10 μς/ηιΐ), bylo inhibováno PAS-pozitivní vybarvení v kontrolním stavu a zvýšené vybarvení se projevilo tehdy, kdy byly EGF-R ligandy silně inhibovány (obr. 2, spodní sloupec). Při analýze Northern byla exprese genu MUC5 výrazně zvýšena působením kombinace TNFa plus EGF nebo plus TGFa a zcela inhibována pomocí preinkubace s BIBX1522 (obr. 3, nižší sloupec). Z těchto výsledků plyne, že aktivace EGF-R způsobuje • · · · · ·
indukci mucinového genu a produkci mukózních glykoproteinů v buňkách NCI-H292.
TNFa stimuluje produkci EGF-R u krys. Krysy bez patogenů (které mají dědičně méně pohárkovitých buněk v epitelu dýchacích cest) byly použity nejprve k testování role TNFa. V kontrolním stavu obsahoval tracheální epitel málo EGF-R pozitivních buněk (obr.4A, vlevo). Nicméně intratracheální podání TNFa (200 ng) vyvolávalo tvorbu EGF-R proteinů u různých typů buněk v tracheálním epitelu (obr. 4A vpravo). EGF-R pozitivní vybarvení bylo přítomno u pohárkovitých buněk (G), prepohárkovitých buněk (P-G), negranulovaných sekrečních buněk (S) a bazálních buněk (Ba), ale ne u řasinkových buněk. Tudíž TNFa vyvolává produkci EGF-R proteinů.
Role EGF-R ligandů při produkci mukózních glykokonjugátů a expresi genu MUC5 u krys. V kontrolním stavu obsahoval tracheální epitel málo pohárkovitých a málo prepohárkovitých buněk. Intratracheální podání EGF-R ligandů, EGF (600 ng; není znázorněno) nebo TGFa (250 ng; tabulka 1) samotných nemělo žádný vliv na produkci mukózních glykokonjugátů epitelem. Nicméně pokud bylo TNFa (200 ng) podáno napřed, a poté po 24 hodinách bylo podáno EGF nebo TGFa (tabulka 1) a zvířata byla usmrcena o 48 hodin později, zvýšilo se PAS vybarvení Alcianovou modří velmi znatelně a počet pohárkovitých a prepohárkovitých buněk byl v obou případech znatelně vyšší, aniž by se při tom změnil celkový počet buněk nebo aniž by došlo ke změně počtu buněk opatřených řasinkami (tabulka 1) . In šitu hybridizace na gen MUC5 ukázala, že u kontrolních zvířat nedošlo k žádné expresi. Pokud byly intratracheálně podány TNFa a poté EGF nebo TGFa, byla v epitelu pozorována viditelná exprese genu MUC5Z toho vyplývá, že indukce EGF-R samotná nebo stimulace EGF-R ligandy samotná byla nedostatečná k vyvoláni metaplazie pohárkovitých buněk nebo k produkci mukózních glykokonjugátů. Nicméně po indukci EGF-R působením TNFa, stimulovalo podání EGF-R ligandů metaplazii pohárkovitých buněk velmi výrazně.
Tabulka 1 Analýza buněk v tracheálním epitelu
Typ buňky kontrola TGFa TNFa/TGFa pouze i.p. i.p. + i.t.
Pohárkovité 2,8 ± 0,7 5,8 + 1,2 28,8 ± 3,4* 5,4 ± 1,5 38,2 ± 6,3*
Prepohárkovité 7,8 ± 1,3 12,8 ± 1,6 44,8 ± 3,6* 13,8 ± 1,4 36,0 ± 6,3*
Sekreční 82, 0 ± 2, 0 72,2 ± 4,0 40,8 ± 2,4* 67,6 ± 7,0 49,8 ± 4,2
Řasinkové 49,6 ± 2,0 54,6 ± 2,3 53,2 ± 1,8 56,4 ± 3,8 52,4 ±7,1
Bazální 57,8 ± 2,6 56,8 ± 2,3 43,0 ± 3,5 60,2 ± 3,4 59,8 ± 2,9
Nerozpoznané 1,4 ± 0,5 2,0 ± 0,4 0, 8 ± 0,4 1,4 ± 0,2 2,6 ± 0,5
Celkem 201,4 ± 2,2 204,2 ± 3,3 211,4 ± 4,8 204,8 ± 6,6 238,8 ± 4,4*
% plochy vybarvené AB/PAS 2,4 ± 0,8 6, 8 ± 1,9 35,8 ± 4,2* 7,8 + 2,9 38,7 ± 6,2*
Tabulka 1. Tabulka znázorňuje vliv senzibilace mediátorů a ovalbuminu na tracheální epitelové buňky u krys. Buňky byly analyzovány metodou, jak je popsána v obecné části nazvané použité metody; byly testovány skupiny po 5 krysách. Rozlišení bylo prováděna PAS vybarvením Alcianovou modří (AB), (která vybarvuje mukózní glykokonjugáty). Kromě počítání buněk byla také stanovována procenta celkové plochy epitelu, vybarvená AB/PAS. Kontrolní tkáň dýchacích cest a stimulovaná tkáň dýchacích cest, přičemž ke stimulaci byly použity TGFa (250 ng) samotné, obsahovala málo pohárkovitých a málo prepohárkovitých buněk; u těchto případů docházelo k slabému vybarvení AB/PAS.
Působení TNFa (200 ng), následované působením TGFa mělo za následek zvýšení počtu pohárkovitých a prepohárkovitých buněk a zvětšení plochy zabrané vybarvenými buňkami metodou AB/PAS. Senzibilace krysím ovalbuminem (OVA) intraperitoneálně (ip) nemělo žádný vliv na rozdělení vybarvených a nevybarvených buněk, ale když bylo OVA podáno ip a následně it (intertracheálně) bylo opět podáno OVA, došlo ke zvýšení pohárkovitých a prepohárkovitých buněk a došlo i ke zvýšení procent plochy, která náležela vybarvení AB/PAS.
Senzibilace ovalbuminem vyvolává u krys produkci EGF-R a pohárkovitých buněk. Jelikož smrt v důsledku akutního astmatu je podle literárních údajů často přímo způsobena potížemi v dýchacích cestách z nadměrné produkce hlenu, byl použit model astmatu na krysách bez přítomnosti patogenů. Injekce ovalbuminu (10 mg, ip) ve dnech 0 a 10 nestimulovala hyperplazii pohárkovitých buněk (tabulka 1). Nicméně když byly tyto injekce následovány třemi intratracheálními (i.t.) aplikacemi ovalbuminu (0,1 % v 100 μΐ) ve dnech 20, 22 a 24 a zvířata byla usmrcena v den 26, počet pohárkovitých a prepohárkovitých buněk byl zvýšen výrazně; počet řasinkových a bazálních buněk byl nezměněn (tabulka 1, pravá strana). Imunohistochemické studie s protilátkou anti-EGF-R nevykazovaly žádné zbarvení u kontrolních vzorků průdušnic. Zvířata senzibilované jak i.p., tak i i.t. vykazovala EGF-R vybarvení (obr. 4B, vlevo), které bylo selektivní, pokud se buňky vybarvovaly pozitivně AB/PAS (obr. 4B, vpravo). Po 3 intratracheálních podáních ovalbuminu (0,1 %, 100 ml) byla EGF-R imunoreaktivita v pohárkovitých a prepohárkovitých buňkách exprimována velmi silně (dole vlevo), stejně jako docházelo u těchto buněk k pozitivnímu vybarvení Alcianovou modří/PAS (dole vpravo). Z toho vyplývá, že
·* ···» • · · • · ·«
Λ
99 99 9
999 9 ♦ «·· • * · · *· *·*··« ·
9 · · *· •99 * · ····* ovalbuminový model astmatu ukazuje proliferací pohárkovitých buněk v buňkách, které produkují EGF-R.
Inhibitor EGF-R tyrosin kinázy (BIBX1522) zabraňuje produkci pohárkovitých buněk u krys, indukovanou podáním TNFa plus EGF-R ligandů a senzibilací těchto krys ovalbuminem. Jelikož BIBX1522 zabraňuje produkci mucinů u buněčné kultury, účinek tohoto inhibitoru byl testován na bezpatogenních krysách. Vybarvení PAS/Alcianovou modří, které bylo zvýšené tracheálním podáním TNFa s následným podáním EGF-R ligandu TGNa, bylo inhibováno v míře závislé na dávce při předběžném ošetření BIBX1522 (3 - 30 ml/kg, i.p.; obr. 5A) . Tracheální podání TNFa (za účelem indukce EGF-R) následované podáním EGF-R ligandu TGFa, mělo za následek nápadnou metaplazii pohárkovitých buněk.
U krys senzibilovaných albuminem inhibovalo předběžné ošetření BIBX1522 (10 ml/kg, i.p.) produkci pohárkovitých buněk úplně (hodnocení podle PAS vybarvení Alcianovou modří; obr. 5B). Zvířata, kterým byl podán ovalbumin i.p., vykazovala pouze malé AB/PAS-pozitivní vybarvení bronchiálního epitelu. Zvířata nejprve senzibilovaná OVA i.p., s následnými třemi intratracheálními (i.t.) podáními OVA, vykazovala výrazné zvýšení AB/PAS-pozitiyního vybarvení.
Tyto studie naznačují, že EGF-R, pokud je stimulováno EGF-R ligandy, vyvolává produkci pohárkovitých buněk in vitro a in vivo, což je důsledkem aktivace EGF-R, a tento efekt může být blokován působením inhibitoru EGF-R tyrosinkinázy. U ovalbuminového modelu astmatu byl inhibitor také účinný a jeho použití vedlo k zabránění produkce pohárkovitých buněk.
K popisu mechanismu indukce pohárkovitých buněk je třeba dodat, že prezentované výsledky naznačují možnou sekvenci pro vývoj produkce pohárkovité buňky založený na expresi EGF-R: stimulace TNFa indukovalo intenzitu vybarvení negranulovaných sekrečních buněk; jejich následná aktivace působením EGF-R ligandů způsobila progresivní vybarvení mukózních glykokonjugátů v cytoplasmě a buňky se staly „předpohárkovitými a pak „pohárkovitými buňkami. Aplikace TNFa následovaná působením EGF-R ligandů vyvolávala produkci pohárkovitých buněk bez alterace celkového počtu epitelových buněk, což naznačuje, že EGF-R aktivace urychlovala selektivní buněčnou diferenciaci (ne proliferaci). Tato zjištění naznačují, že pohárkovité buňky jsou odvozeny z negranulovaných sekrečních buněk, které exprimují EGF-R a jsou stimulovány k produkci mucinů
EGF-R ligandy.
U pacientů, kteří zemřeli na akutní astma, jsou důležitá zjištění hyperplazie buněk a ucpání dýchacích cest hlenem. U myšího modelu astmatu se po opakovaném podání ovalbuminu objevuje senzibilace dýchacích cest, která vede k velmi výrazné hyperplazii pohárkovitých buněk v dýchacích cestách. Ukázali jsme, že dýchacích Vybarveny naznačuje,
EGF-R, cest, byly že které není exprimováno v kontrolním sensibilovaných pohárkovité na stimulaci je exprimováno v pre-pohárkovité a EGF-R se podílelo epitelu zvířatech.
buňky, což a produkci pohárkovitých buněk. Předběžné ošetření receptorů EGF-R tyrosin kinázy zabránilo produkci pohárkovitých buněk v dýchacích cestách, což potvrzuje roli EGF pro aktivaci produkce pohárkovitých buněk u experimentálního astmatu.
Přítomné výsledky naznačují, že hyperplazie pohárkovitých buněk vede přes EGF-R. Dosavadní studie ukázaly, že různé
Φ· ·*φ· · Φ· ·· * • » · φ» φ » · · · ·
ΦΦΦΦ · 9 Φ · · · · ♦ ♦ ···*· -1- ·ΦΦ· φφφ φφφ ·· ·♦ φφφ stimuly, jako je stimulace ozonem, oxidem siřičitým, viry, lipopolysacharidy, faktorem aktivace krevních destiček a interleukinem-4 ovlivňuje pozitivně expresi mucinů a jeho vylučování. Tento vynález poskytuje mechanismus ke zhodnocení příbuznosti těchto stimulů zánětů s EGF-R systémem.
Astma slouží jako příklad terapeutické strategie vynálezu: normální epitel lidské průdušky má na každou pohárkovitou buňku 3-10 buněk opatřených řasinkami. Při onemocnění astmatem může počet pohárkovitých buněk dosáhnout stejného množství nebo dokonce může překročit množství buněk, opatřených řasinkami; u pacientů, kteří zemřeli na status asthmaticus, se nalezlo zvýšení v procentech plochy, kterou zabíraly pohárkovité buňky ve srovnání s velikostí této plochy u pacientů, kteří zemřeli na neastmatická respirační onemocnění. Inhibice produkce pohárkovitých buněk by mohla eliminovat tento zdroj nadměrné sekrece. Vzhledem k tomu, že životní cyklus pohárkovitých buněk je neznámý, lze těžko předpovídat dobu odstranění hyperplazie pohárkovité buňky při léčení s dostatečnou přesností. Při nepřítomnosti dalších vlivů alergenů se hyperplazie pohárkovité buňky u senzibilované myši potlačí v průběhu 50 dní, přičemž bude potlačena spolu s jinými projevy alergického zánětu. Inhibice aktivace EGF-R může inhibovat hyperplazii pohárkovité buňky mnohem rychleji, v závislosti na době života těchto pohárkovitých buněk.V současné době byly publikovány selektivní ATP-kompetitivní inhibitory tyrosin kinázy. Inhibitory EGF-R tyrosin kinázy se musí zhodnotit po stránce lékařského použití pro léčení zhoubných chorob spojených s expresí EGF-R.
Hypersekrece je hlavním projevem u mnoha chronických zánětlivých chorob dýchacích cest. V současné době není účinná ·« ♦♦·· • · • · ··
99 999
999 9 · 999
9 9 9 99
9 9 9 9 9 9 9 99
9 9 9 9 9 99
999 ·99 999 99 99 999 terapie pro odstranění těchto příznaků a pro zastavení rozvoje těchto chorob. Současná zjištění poskytují mechanismus a strategii pro terapii: inhibicí EGF-R aktivace lze dosáhnout zabránění produkce pohárkovité buňky. Inhibitory EGF-R aktivace jsou navrženy jako léčiva pro choroby, při kterých dochází k nadměrné sekreci hlenu do dýchacích cest.
Příklad 2
Úloha oxidačního stresu při produkci pohárkovitých buněk
U lidí bylo navrženo, že příčinou progresivních patologických změn na periferních dýchacích cestách včetně hyperplazie pohárkovitých buněk je dlouhodobé kouření cigaret. V souladu s tím se ukázalo, že experimentální modely kouření cigaret u zvířat způsobily hyperplazii pohárkovitých buněk v dýchacích cestách. Nicméně mechanismus, jakým cigaretový kouř může vyvolat syntézu mucinů je dosud neznámý. Následující data ukazují, že pro zánětlivé cytokinově aktivované neutrofily a cigaretový kouř způsobují syntézu mucinů MUC5AC u buněk lidského plicního epitelu mechanismem ligandově nezávislé aktivace EGF-R. Tyto výsledky ukazují, že aktivované neutrofily a cigaretový kouř jako regulátory diferenciace epitelových buněk mohou mít za následek abnormální indukci buněk v dýchacích cestách, které produkují mucin.
Použité metody
Izolace neutrofilů. Lidské neutrofily byly čištěny z periferní krve, získané od zdravých lidí. Izolace neutrofilů byla prováděna standardními technikami (Ficoll-Hypaque) gradientovou separací, dextranovou sedimentací a hypotonickým • ·· φφ · φ φ φ φ · · φφ • φ · φφφ φ φ φ · φ φ · φφφ ·· *· φ·φ rozkladem erytrocytů. Buňky byly rutinně z více než 95% zviditelněny vybarvením trypanovou modři. Aby se předešlo kontaminací endotoxinem, všechny roztoky byly přečištěny přes filtr velikosti sporu 0,1 gm.
φφ φφφφ φ φ φφφφ
Φ φφφφ
Φ φφφ
Buněčná kultura. Buňky NCI-H292, což je buněčná linie lidského plicního mukoepidermoidního karcinomu, byly ponechány růst v živném roztoku RPMI 1640, který obsahoval 10 % fetálního hovězího sera, penicilín (100 U/ml), streptomycin (100 gg/ml) a Hepes (25 mM) při 37 °C ve zvlhčovaném inkubátoru s 5 % C02 s vodním pláštěm. Ke kultivaci buněk byly použity buď 6 jamkové kultivační destičky nebo 8 komorové filmy. Když vznikla spojitá kultura, buňky byly inkubovány po dobu 1 hodinu s neutrofily (106 buněk/ml) samotnými, s TNFa samotným (rekombinační lidský TNFa, 20 ng/ml, Genzyme, Cambridge, ΜΑ) , IL-8 (rekombinační lidský IL-8, 10“8 M, Genzyme) samotný, s fMLP (10~8 M, Sigma, St. Leuis, MO) samotným, s TNFa plus neutrofily, s IL-8 plus neutrofily, s fMLP plus neutrofily, s peroxidem vodíku (H202, 200 μΜ) , s roztokem cigaretového kouře nebo TGFa (rekombinační lidský TGFa, 0,1 - 25 ng/ml, Calbiochem, San Diego, CA). Buňky byly pak promyty a inkubovány se samotným čerstvým živným roztokem. Experimenty byly zakončeny v předem zvolených dobách (pro mRNA 6 hodin a 12 hodin; pro protein 24 hodin) . Jako kontroly byly buňky inkubovány se samotným živným roztokem po dobu stejných časových intervalů. Při dalších studiích s neutrofily byl zvolen TNFa jako stimulant, neboť měl největší účinnost při ovlivnění syntézy MUC5. HCI-H292 buňky byly inkubovány po dobu 1 hodiny buď s neutrofily, které byly inkubovány s TNFa (20 ng/ml) po dobu 1 hodiny a pak promyty sterilním PBS, aby se zbavily kontaminace supernatantem (např. molekuly uvolněné z neutrofilů), nebo byly buňky HCI-H292 •9 9999 9 ···· «9 9999 9·
999 9 9 ·9· inkubovány se samotným supernatantem. Při testech inhibice působením inhibitorů EGF-R tyrosin kinázy byly buňky HCI-H292 předběžně ošetřeny BIBX1522 (10 gg/ml, obecně poskytované firmou Boehringer Ingelheim lne., Ingelheim, Germany) nebo tyrfostinem AG1478 (10 μΜ, Calbiochem) 30 min. před přidáním stimulantu. Účinky selektivního inhibitoru receptoru tyrosin kinázy růstového faktoru odvozeného od krevních destiček (tyrfostin AG1295, 100 μΜ, Calbiochem), a negativní kontroly pro tyrfostiny (tyrphostin Al, 100 μΜ, Calbiochem) byly také předmětem zkoumání. Při testech inhibice s blokující protilátkou proti EGF-R ligandům byl supernatant předběžně ošetřen protilátkou anti-TGFa (Calbiochem) nebo anti-EGF protilátkou, po dobu 30 minut, a pak byl přidán k buňkám NCI-H292. Role volných kyslíkových radikálů byla zkoumána pomocí pohlcovačů volných kyslíkových radikálů, kterými byly DMSO (1 %, Sigma), 1,3dimethyl-2-thiomočoviny (DMTU, 50 mM, Sigma), nebo hydroperoxidů dismutázy (SOD, 300 U/ml, Sigma).
Příprava roztoku cigaretového kouře. V tomto testu byly použity pokusné cigarety (kód 2R1, vyráběné pro University of Kentucky Tobacco and Health Research Foundation). Roztok cigaretového kouře byl připraven podle již známého postupu, který je popsán v literatuře (Dusser et al. (1989) J.Clin. Invest.84:900-906). Stručně řečeno, cigaretový kouř byl odebrán do polypropylénové injekční stříkačky (35 ml) v množství 1 šluk za minutu (10 krát) a byl pomalu necháván bublat do 20 ml RPMI 1640, který obsahoval 50 mM Hepes pufru. Roztok kouře pak byl titrován na pH 7,4 a použit ihned po přípravě.
Vizualizace mukózních glykokonjugátů a proteinů MUC5AC v buňkách NCI-H292. Po skončení experimentů byly buňky, ·«··«· · · 44 ··· • 44 44 4 4 4 · ·· • ··· · · · 4 4 4
4 4 4444444
4 444444
4444 444 444 44 44♦·· namnožené v 8 komorových kultivačních filmech fixovány 4 % paraformaldehydem po dobu 1 hodiny a pak buď vybarveny Alcianovou modří/PAS, a tím byly mukózní glykokonjugáty vizualizovány nebo bylo použito imunocytochemie MUC5AC. Pro imonocytochemii MUC5AC byl použit jako rozpouštědlo pro protilátku normální kozí sérum a Levamisol (2 mM) obsahující PBS a 0,05 % Tweenu 20, v koncentraci 2 %. Buňky byly inkubovány s myším mAb na MUC5AC (klon 45 Ml, 1:200, Neo Markers, Fremont, CA) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a pak byly promyty 3x PBS, aby se odstranila přebytečná primární protilátka. Buňky pak byly inkubovány biotinylovaným koňským antimyším IgG (Vector Laboratories lne., Burlingame, CA) při zředění 1:200 po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Navázaná protilátka byla vizualizována podle standardního protokolu pro komplexní metodu využívající avidin-biotin-alkalickou fosfatázu.
In šitu hybridizace pro lidský MUC5AC. 298 bp cDNA fragment lidského MUC5AC byl vložen do TA klonovacího vektoru (Invitrogen, San Diego, CA). Příprava sond pro RNA a hybridizace in šitu byla prováděna podle postupu, popsaného shora.
Imunotest MUC5AC proteinu. MUC5AC protein byl kvantitativně stanoven, jak je popsáno shora. Stručně řečeno, buněčné lyzáty byly připraveny s PBS v různých ředidlech a 50 μΐ každého vzorku bylo inkubováno s pufrem hydrogenuhličitan-uhličitan (50 μΐ) při 40°C v 96-jamkových destičkách (Maxisorp Nunc, Fisher Scientific, Santa Clara, CA) , dokud nebyl suchý. Destičky byly 3x omyty PBS a blokovány s použitím 2 % BSA (frakce V, Sigma) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Destičky pak byly opět 3x promyty PBS a pak inkubovány s 50 μΐ myší monoklonální protilátky MUC5AC (1:100), která byla zředěná PBS, s obsahem ·« φφφφ · ·· ·· φ . φ φ φφφφ «φφ φ φφφ φφφ φ φ
0,05 % Tweenu 20. Po 1 hodině byly jamky 3x promyty PBS a do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ konjugátu křenová peroxidáza-kozi anti-myši IgG (1:10000, Sigma). Po 1 hodině byly destičky 3x omyty PBS. Barevná reakce byla vyvíjena pomocí TMB peroxidázového roztoku (Kirkegaard & Perry Laboratories, Baithersburg, MD) a zastavena působením 2N H2SO4. Absorbance byla měřena při 450 nm.
Kvantitativní analýza TGFa proteinu. Protein TGFa byl analyzován pomocí komerčně dostupného kitu pro ELISA (Sigma), přičemž se postupovalo podle instrukcí výrobce. Supernatant odebraný po inkubaci neutrofilů plus TNFa (20 ng/ml) byl po dobu 1 hodiny míchán s lyzním pufrem PBS obsahujícím 1 % Tritonu X100, 1 % deoxycholátu sodného a několik proteázových inhibitorů, (Complete Mini, Boehringer Mannheim, Germany), a pak byl použit ke stanovení TGFa.
Imunoprecipitace EGF-R proteinu a imunobloting pro stanovení fosforylace tyrosinu. Buňky byly ponechány bez séra po dobu 24 hodin a pak stimulovány TGFa, H2O2, nebo supernatantem aktivovaných neutrofilů po dobu 15 min. Po stimulaci byly buňky lyžovány a inkubovány 30 minut v třepačce při 4°C. Za účelem odstranění nerozpustného materiálu byly buněčné lyzáty odstředěny při 14 000 otáčkách za min. po dobu 5 minut při 4°C. Alikvotní díly supernatantů, obsahující ekvivalentní množství proteinů, byly podrobeny imunoprecipitaci s protilátkou anti-EGF receptoru (polyklonální, Ab4, Calbiochem) a bylo přidáno 20 μΐ A-agarózového proteinu (Santa Cruz) po dobu 2 hodin při 4°C. Sraženiny byly 3x promyty 0,5 ml lýzního pufru, rozmíchány ve vzorkovém pufru SDS a 5 minut povařeny. Proteiny byly odděleny pomocí SDS-PAGE v 8,0 % akrylamidovém gelu. Získaný gel byl ·* ··♦· • φ φφφφ φ φφ φφφφφφ · φ φ φφφφφφ φφφ «φφ φφφ «φ φφ φφφ vyrovnán v přenosovém pufru: 25 mM Tris-HCl, 192 mM glycine, 20 % (obj/obj) methanolu, pH = 8,3. Proteiny pak byly elektroforeticky naneseny na nitrocelulózové membrány (0,22 pm), blokovány pomocí 5 % mléka bez tuku v PBS s obsahem 0,05 % Tweenu 20 přes noc a pak inkubovány s monoklonální antifosfotyrosinovou protilátkou (1:100, Santa Cruz) po dobu 1 hodiny. Navázaná protilátka byla vizualizována pomocí standardního protokolu na avidin-biotin-alkalický fosfatázový komplex (ABC kit, Vector Laboratories).
Statistické zpracování. Veškerá data jsou vyjádřené jako průměr ± standardní odchylka. Pro výpočet statistické průkaznosti rozdílů mezi skupinami byla použita jednotná metoda. Pro zpracování případů, kdy jde o více srovnání současně, pokud byly vypočítávány hodnoty statistické průkaznosti při analýze náhodných odchylek, byl použit Scheffeův F test. Pravděpodobnost menší než 0,05 pro nulovou hypotézu byla akceptována jako indikativní pro statisticky průkazný rozdíl.
Výsledky.
Aktivované neutrofily vyvolávají syntézu mucinu MUC5AC. Pokud neutrofily plus stimulant, který neutrofily aktivuje (IL8, fMLP, TNFa) byly inkubovány s buňkami NCI-H292 po dobu 1 hodiny, pak syntéza proteinů MUC5AC signifikantně vzrostla v průběhu 24 hodin, zatímco nestimulované neutrofily (106/ml), IL8 samotné nebo fMLP samotné nevykazovaly žádný vliv na syntézu MUC5AC; inkubace s TNFa samotným způsobila malý, neprůkazný nárůst syntézy MUC5AC. Když byly neutrofily předem inkubovány po dobu 1 hodin s TNFa a pak byly neutrofily a jejich supernatant rozděleny, na inkubace supernatantu po dobu 1 hodiny s buňkami <······ · ·· ·· « φ φ φφ · φ φ φ e
NCI-H292 pozitivně regulovala expresi genu MUC5AC v průběhu 12 hodin a stimulovala vybarvení PAS pomocí Alcianové modři a s protilátkou proti proteinu MUC5AC v průběhu 24 hodin; samotné buňky HCI-H292 vykazovaly malou expresi genu MUC5AC a malé nevýrazné vybarvení PAS Alcianovou modří a MUC5AC proteinu. Syntéza proteinu MUC5AC, vyvolaná supernatantem byla oproti kontrole signifikantně vyšší; neutrofily oddělené od supernatantu po inkubaci byly bez efektu. Z toho bylo vyvozeno, že aktivované neutrofily velmi rychle vylučuji nějaký aktivní produkt, který způsobuje syntézu MUC5AC.
Inhibitory EGF-R tyrosin kinázy zabraňují syntéze MUC5AC, indukované v supernatantem aktivovaných neutrofilů.Vzhledem k tomu, že je známo, že ligandy EGF-R způsobují syntézu MUC5AC v buňkách HCI-H292, a to cestou aktivace EGF-R tyrosin kinázy, byla zkoumána role aktivace EGF-R při syntéze MUC5AC vyvolané supernatantem aktivovaných neutrofilů. Předběžné ošetření buněk NCI-H292 selektivními inhibitory EGF-R tyrosin kinázy (BIBX1522, AG1478) zabraňovalo syntéze proteinu MUC5AC, která byla obvykle vyvolána supernatantem aktivovaných neutrofilů. Selektivní inhibitor kinázového receptoru odvozeného růstového faktoru krevních destiček (AG1295) a negativní kontrola pro tyrfostiny (Al) byly bez efektu. Tyto výsledku naznačují, že dochází k aktivaci EGF-R tyrosin kinázy při syntéze MUC5AC vlivem supernatantu aktivovaných neutrofilů.
Role ligandu EGF-R vylučovaných v supernatantu aktivovaných neutrofilů při syntéze MUC5AC. Za účelem zjištění, zda aktivace EGF-R tyrosin kinázy je závislá na ligandech EGF-R (EGF a TGFa), jsme předem inkubovali supernatant aktivovaných neutrofilů s ligandy neutralizačních protilátek vůči EGF-R. Předběžné ošetřeni supernatantu buď anti-TGFa protilátkou nebo anti-EGF •w ·#·· • · • ···
protilátkou neinhibovalo syntézu MUC5AC vyvolanou supernatantem aktivovaných neutrofilů. Dále v supernatantu nebyl zjištěn TGFa. Z toho vyplývá, že EGF-R tyrosinová fosforylace způsobená supernatantem aktivovaných neutrofilů byla vyvolána mechanismem nezávislým na EGF-R ligandech, EGF a TGFa.
Cigaretový kouř a volné kyslíkové radikály způsobují syntézu MUC5AC.
Cigaretový kouř a volné kyslíkové radikály,
H2O2, pozitivně regulovaly expresi genu MUC5AC v průběhu 12 hodin, stejně jako to způsobovalo TGFa. Obdobně, všechny stimulanty zvyšovaly syntézu MUC5AC proteinu a produkci mukózních glykokonjugátů v průběhu 24 hodin, přičemž tento efekt závisel na podané dávce. Maximum syntézy MUC5AC v závislosti na
H2O2 bylo signifikantně vyšší než maximum stejné křivky pro TGFa. Předběžné ošetření AG1478 zabraňovalo zvyšování syntézy proteinu MUC5AC, vyvolané veškerými stimulanty, což naznačuje, že stimulanty způsobují syntézu mucinů cestou aktivace EGF-R tyrosin kinázy. Syntéza MUC5AC supernatantem aktivovaných neutrofilů, cigaretovým kouřem a H202 byly signifikantně inhibovány při předběžném ošetření pohlcovači volných radikálů (DMSO a DMTU) a SOD, ale na syntézu proteinu MUC5AC působením TGFa neměly DMSO nebo SOD vliv.
Vyvolání tyrosinové fosforylace EGF-R působením supernatantu aktivovaných neutrofilů a působením H2O2. Distribuce EGF-R proteinu byla podobná u kontroly bez séra a u všech stimulovaných podmínek (supernatant aktivovaných neutrofilů, cigaretový kouře, H2O2 nebo TGFa). Celkový stupeň tyrosinové fosforylace se projevil v průběhu 15 minut po podání supernatantu aktivovaných neutrofilů, cigaretového kouře, H202 nebo TGFa; kontrola bez séra nevykazovala žádný efekt. Celková
·« «·* * '9·
< · · ·· ♦ • · ··
• · »9 • · • • • •
• · • · • • • •
·· ·· · ·
tyrosinová fosforylace proteinů vliv supernatantu aktivovaných nebo H2O2. Aby se stanovilo, provedena imunoprecipitace supernatant aktivovaných z cigaretového kouře a tyrosinovou fosforylaci zda vyvolaná TGFa byla větší, než neutrofilů, cigaretového kouře
EGF-R byly fosforylovány, byla pomocí anti-EGF-R protilátky: neutrofilů, rozpustné produkty H2O2 všechny vyvolávají EGF-R-specifickou v průběhu 15 minut, což je efekt, který byl podobný efektu, ošetřeni buněk vyvolanému působením TGFa.
NCI-H292 pomocí AG1478 inhibovalo fosforylaci EGF-R všemi
Předběžné supernatantem-, cigaretovým tyrosinovou fosforylaci EGF-R, stimulanty. DMSO kouřem-, a H2O2~ tyrosinovou inhibovalo indukovanou ale DMSO nemělo žádný vliv na
TGFa-indukovanou tyrosinovou fosforylaci EGF-R.
Shora uvedené výsledky ukazují, že neutrofily vyvolávají syntézu mucinu MUC5AC u buněk NCI-H292, jsou-li aktivovány IL-8, fMLP nebo TNFa. Kromě toho supernatant, který byl odebrán 1 hodinu po inkubaci neutrofilů s TNFa způsoboval syntézu MUC5AC, což je efekt, který byl inhibován selektivními inhibitory EGF-R tyrosin kinázy. Inhibice EGF-R tyrosinkinázy kompletně blokovala syntézu MUC5AC, způsobenou supernatantem aktivovaných neutrofilů; inhibitor non-EGF-R tyrosin kinázy, selektivní kinázový inhibitor receptorú růstového faktoru odvozeného od krevních destiček (AG1295) a negativní kontrola na tyrfostiny (Al) byly bez efektu, což naznačuje, že tyrosinová fosforylace EGF-R, jak naznačovala cesta syntézy MUC5AC, je vyvolána supernatantem aktivovaných neutrofilů.
Aby se dále prozkoumal mechanismus, kterým supernatanty aktivovaných neutrofilů vyvolávají tyrosinovou fosforylaci
EGF-R, byly zkoumání jak ligandově závislé, tak i ligandově nezávislé cesty EGF-R. První z těchto cest jsme měřili TGFa v supernatantu aktivovaných neutrofilů, a zjistili jsme, že supernatant neobsahuje měřitelná množství TGFa. Podle dříve uvedených informací jsou neutrofily přítomny pouze v nízkých koncentracích (2,5 pg/106 buněk) TGFa. Účinek supernatantu aktivovaných neutrofilů na syntézu MUC5AC byl tak silný, jako vliv 1 ng TGFa, což je 400x vyšší účinek, než je účinek množství TGFa vázaného v neutrofilech. Za druhé jsme provedli blokační testy s neutralizací protilátek EGF-R ligandu: předběžné ošetření neutralizujícími protilátkami vůči EGF a TGFa nedokázalo inhibovat syntézu MUC5AC, způsobenou supernatantem z aktivovaných neutrofilů. Tyto výsledky naznačují, že syntéza MUC5AC, vyvolaná neutrofilovým supernatantem nebyla způsobena v důsledku vylučování EGF-R ligandu (TGFa a EGF) neutrofily. Jako další jsme zkoumali cestu ligandově-nezávislou: vzhledem k tomu, že je známo, že volné kyslíkové radikály se uvolňují v průběhu aktivace neutrofilů a že je známo, že v různých buňkách způsobují transaktivaci EGF-R tyrosin kinázy, vznesli jsme hypotézu, že uvolňování volných kyslíkových radikálů aktivací neutrofilů způsobilo tyrosinovou fosforylaci EGF-R a to mělo za následek syntézu MUC5AC v buňkách NCI-H292. Pohlcovače volných radikálů (DMSO a DMTU) a SOD inhibovaly syntézu MUC5AC vyvolanou supernatantem aktivovaných neutrofilů. 0 TNFa se uvádí, že vyvolává u neutrofilů suspenzi oxidační šok spojený s roztržením, přičemž maximální odezva je v průběhu 1 hodiny; tyto výsledky ukazují, že probíhá děj v podobném čase.
V tomto testu vyvolával peroxid vodíku v buňkách NCL-H292 syntézu MUC5AC, přičemž tento exogenní H2O2 je hlavní produkt, uvolňovaný z neutrofilů v průběhu oxidačního šoku. Nicméně,
• · · · · · ♦ · · • · · ·
7.?:.
maximální odezva na H2O2 po stránce syntézy MUC5AC byla pouze poloviční ve srovnání s odezvou na TGFa. Signifikantním zjištěním u tohoto testu je, že fakticky cigaretový kouře samotný vyvolává syntézu MUC5AC. To naznačuje, že by mohl cigaretový kouř způsobovat syntézu MUC5AC in vivo, a to jak cestou přímé stimulace, tak i nepřímou stimulací, způsobenou naverbováním neutrofilů. Přesná podoba molekul, které v cigaretovém kouři způsobují syntézu MUC5AC, je dosud nejasná. Bylo ukázáno, že cigaretový kouř obsahuje řadu produktů (např. nikotin, dehet, akrolein a oxidační činidla). Při našich experimentech DMSO a SOD částečně inhibovaly syntézu MUC5AC, vyvolanou cigaretovým kouřem. Z toho plyne, že oxidační stres by mohl být jedním z mechanismů, který vyvolává tuto odezvu. Skutečnost, že cigaretovým kouřem vyvolaná syntéza MUC5AC byla kompletně blokovaná inhibitory EGF-R tyrosin kinázy naznačuje, že aktivace EGF-R hraje základní roli v syntéze MUC5AC vyvolané cigaretovým kouřem.
V dýchacích cestách je velmi častým příznakem zánět neutrofilních průdušnic a neutrofily jsou verbovány a aktivovány cytokiny a cigaretovým kouřem. Současné studie ukazují, že verbované neutrofily a cigaretový kouř také působí jako regulátory diferenciace epitelových buněk, která má za následek indukci buněk produkujících mucin v dýchacích cestách. Nejdůležitější je, že inhibice aktivace EGF-R bude použitelná pro léčení chorob dýchacích cest, při kterých dochází k nadměrnému vylučování hlenu.
Příklad 3
Poraněni epitelu dýchacích cest způsobuje metaplazii pohárkovitých buněk.
·· ···· · ·· ·· ··· · · · · · • · · · · · · ·
7®* · ······ '·<·· ··· ··· ·· ·· ··· ·
Byla vznesena hypotéza, že agarózové zátky, vyskytující se v dýchacích cestách by mohly v bronchách chronicky existovat bez jejich rušení a proto rezidentní zátky by mohly způsobovat záněty, což by pak mělo za následek metaplazii pohárkovitých buněk. Bylo prokázáno, že agarózové zátky indukují značnou lokální produkci pohárkovitých buněk, jak je ukázáno na vybarvení Alcianovou modří/PAS, které je pozitivní a na genové expresi mucinu MUC5AC, spojené s lokálním verbováním zánětlivých buněk. Tyto výsledky naznačují, že při zátkou indukované metaplazii pohárkovitých buněk dochází k aktivaci EGF-R.
Použité metody
Zvířata. Experimentální postup byl schválen Committee on Animal Research of the University of California San Francisco. Bylo použito specifické bezpatogenní plemeno krys F344, a to samců (tělesná hmotnost 230 až 250 g; Simonsen Lab., Gilroy, CA) . Krysy byly umístěny v klecích BioClean bez přítomnosti patogenů s kontrolovaným laminárním přívodem vzduchu. Krysy měly volný přístup k sterilní potravě a k vodě.
Použité účinné látky. Účinné látky byly použity z následujících zdrojů: cyklofosfamid (Sigma, St. Louis, MO), methohexital sodný (Brevital, Jones Medical Industries, lne., St. Louis, MO) , pentobarbital sodný (Nembutal, Abbott Lab., North Chicago, IL); BIBX1522, selektivní inhibitor EGF-R tyrosin kinázy (obecně dostupný u firmy Boehringer Ingelheim, lne., Ingelheim, Germany), přičemž látky byly rozpouštěny v následujícím roztoku: 2 ml polyethylénglykolu 400 (Sigma, St. Louis, MO) , 1 ml 0,1 N HCI, a 3 ml 2% roztoku manitolu ve vodě ···«·· · ♦ · ·· ··· · · · · · · · (pH 7,0). Inhibitor motility leukocytů (NPC 15669) byl poskytnut s laskavým svolením firmy Scios Nova, lne., Mountain View, CA.
Agarózové zátky. Agarózové zátky (0,7 až 0,8 mm v průměru) byly připraveny v prostředí EEO (Sigma,St. Louis, MO) s použitím 4% agarózy typu II, ve sterilní fosfátem pufrované solance (PBS). Aby se agarózové zátky tkáně vizualizovaly, byl přidán po roztavení agarózy při 50°C přípravek tvořený 3% suspenzí barviva Monastral blue B (Sigma, St. Louis, MO).
Postup při experimentech. Studovali jsme bezpatogenní krysy, neboť tyto krysy mají normálně v dýchacích cestách malé množství pohárkovitých buněk. Zvířata byla uspána pomocí natrium metohexitalu (Brevital, 25 mg/kg, i.p.). Trachea byla asepticky odhalena střední cervikální incisí a agarózové zátky byly umístěny do cesty průdušky pomocí jehly 20 gauge Angiocath (Becton Dikinson, Sandy, UT) napojené na polyetylénovou trubku (PE 90, vnitřní světlost 0,86 mm a vnější průměr 1,27 mm, Clay Adams, Parsippany, NY) , přičemž tyto trubice byly do naříznuté průdušnice vsunuty. Polyetylénová trubice byla upevněna v úhlu 30°, aby bylo možné selektivně umístit požadované množství do pravé průdušky. Po umístění byl řez uzavřen šitím.
Aby se mohla zhodnotit úloha EGF-R při metaplazii vyvolané agarózovými zátkami, byla zvířatům podána dávka BIBX1522 (80 mg/kg, intraperitoneálně), a to 1 hodinu před umístěním agarózových zátek a opakovaně denně (40 mg/kg i.p. bíd). Zvířata byla uspána 24, 48 nebo 72 hodin po umístění agarózových zátek.
Aby se mohla zhodnotit úloha TNFa při metaplazii pohárkovitých buněk vyvolané agarózovými zátkami, byla zvířatům podána TNFa neutralizační protilátka (Genzyme, Boston, MA).
ΦΦ ···« φ « • ΦΦΦ
• φφ φφ · φφ · φ φ φ «φ φ φ · φ φ φ «φφφφ· · • φ φ · φ · φφφ «φ φφ «φφ
První podání (100 μΐ ν 0,2 ml solanky, i.p.) byla podána 1 hodinu před umístěním agarózových zátek a i.p. injekce byly opakovány denně. Kromě toho byla podána TNFa neutralizační protilátka (10 μΙ/h) pomocí infuze přes osmotické miničerpadlo (Alzet 2ML1, Alza Corp., Palo Alto, CA) implatované subkutánně.
Studie vlivu neutrofilů na metaplazii pohárkovitých buněk vyvolanou agarózovými zátkami byla provedena tak, že krysy byly předem ošetřeny cyklofosfamidem (inhibitor leukocytů kostní dřeně) nebo s kombinací cyklofosfamidu plus NPC 15669. Před umístěním agarózových zátek byl podán cyklofosfamid (100 mg/kg, i.p.) a druhá injekce cyklofosfamidu (50 mg/kg, i.p.) byla podána jeden den před umístěním zátek. Při testech s NPC 15669 byla účinná látka (10 mg/kg, i.p.) podána injekčně 1 hodinu před umístěním agarózových zátek a pak denně po dobu 3 dnů, které následovaly.
Veškeré účinné látky (BIBX1522, TNFa neutralizační protilátka, cyklofosfamid a NPC 15669) byly podávány 1 hodinu před umístěním agarózových zátek a dávkování bylo opakováno denně po tři dny.
Příprava tkání. V různých dobách po umístění agarózové zátky byly krysy uspány pomocí natriumpentobarbitalu (65 mg/kg, i.p.) byla provedena perfuse krevního oběhu pomocí 1% paraformaldehydu v dietylpyrokarbonátem ošetřeném PBS při tlaku 120 mm Hg. Pravá plíce byla vyjmuta a pravý kaudální lalok byl použit pro histologické vyšetření. Aby se získaly zmrazené řezy, byly tkáně vyjmuty a umístěny v 4% paraformaldehydu na dobu 1 hodiny a pak přemístěny do 30% sacharózy pro kryoprotekci přes noc. Tkáně byly uloženy v sloučenině OCT (Sakura Finetek U.S.A.,
0· 41H • ··» • ·· ·· ·· · · · · · • * · · · lne., Torrance, CA). Pro metakrylátové řezy byly tkáně umístěny v 4% roztoku paraformaldehydu po dobu 24 hodin a pak vysušeny s pomocí ethanolu o vysokých koncentracích a uloženy v metakrylátu JB-4 (Polysciences, lne., Warrington, PA). Řezy tkání (tloušťka 4 pm) byly vybarvovány pomocí metody PAS Alcianovou modří a kontrastně vybarvovány hematoxylinem.
Morfometrická analýza bronchiálního epitelu. Procenta plochy, vybarvené metodou PAS Alcianovou modří, odpovídající mukózním glykokonjugátům v epitelu, byla stanovena pomocí poloautomatické analýzy obrázku, což je metoda, která již byla dříve publikována. Plocha epitelu a Alcianovou modří/PAS metodou vybarvených mukózních konjugátů uvnitř epitelu byla ručně obtažena a analyzována pomocí programu NIH Image (vyvinutého v U.S. National Institutes of health přístupný na internetu přes anonymní FTP nebo z diskety od National Technical Information Service, Springfield, Virginia; part number PB95-500195GEI). Data jsou vyjádřena jako procenta celkové plochy epitelu, obsazená Alcianovou modří, při PAS vybarvení. Aby se zhodnotila sekrece hlenu semikvantitativně, byla použita procenta délky povrchu epitelu, obsazená při PAS-pozitivním vybarvení Alcianovou modří výpočtem délky, která je vybarvená pozitivně jako poměr k celkové délce. Procenta denudovaného epitelu byla vyjádřena spočítáním poměru délky denudovaného epitelu k celkové délce epitelu.
Identifikace buněčných typů v metakrylátových řezech a analýza buněk. Celkový počet epitelových buněk byl stanoven počítáním jader epitelových buněk nad 2 mm základní délky s olejovým inverzním objektivem (zvětšení krát 1000). Lineární délka základního plátku pod každým analyzovaným regionem epitelu byla stanovena trasováním kontury digitalizovaného obrázku
ΦΦ ΦΦΦΦ · 99 »9 9 • Φ . ·Φ · » Λ 9 ΦΦ φφφφ φφφ φ φ · • · · · φ · φ φ · φ • φ ······ φφφ φφφ φφφ φφ φφ φφφ základního lístku. Epitelové buňky byly identifikovány způsobem, který byl popsán shora. Stručně řečeno, bazální buňky byly identifikovány jako malé sploštělé buňky s velkými jádry, umístěné těsně nad základním lístkem, ale ne zasahující lumen dýchací cesty. Cytoplasma byla vybarvena temně a granule, vybarvené Alcianovou modří nebo PAS-pozitivně nebyly přítomny. Buňky nesoucí řasinky byly rozpoznány pomocí řasinkových ploch, lehce vybarvené cytoplasmy a velkých kulatých jader. Negranulované sekreční buňky měly válcovitý tvar a zasahovaly od lumenu bronchy k základní vrstvě. Po umístění agarózových zátek do bronche se vytvořily „vyvíjející se pohárkovité buňky (prepohárkovité buňky). Tyto buňky vykazovaly pozitivní PAS vybarvení Alcianovou modří, granule byly malé a buňky nebyly sbaleny granulemi; obsahovaly malé mukózně vybarvené plochy (<l/3 výšky epitelu od základní membrány k luminálnímu povrchu) nebo neúplně lehce vybarvené Alcianovou modří/PAS, malé granule. Buňky typu nedeterminovaných byly definovány jako buněčné profily, kterým chybí dostatečný cytoplasmatický charakter pro vhodnou kategorizaci.
Imunohistochemická lokalizace EGF-R. Přítomný EGF-R byly determinovány imunohistochemickou lokalizací, přičemž se používala monoklonální myší protilátka proti EGF-R (Calbiochem, San Diego, CA) . Předběžně byly připraveny 4 pm zmražené řezy, které byly pak fixovány 4% formaldehydem, bylo na ně potom působeno 0,3% H202/methanolem. Tyto tkáně byly inkubovány s EGF-R protilátkou (zředění 1:250). K vizualizaci komplexu antigen - protilátka, vybarvených 3,3'-diaminobenzidin tetrachloridem (Sigma, St. Louis, MO) byly použity biotinylované koňské anti-myší IgG (1:200; Vector Lab., Burlingame, CA) a následně streptavidin-peroxidázový komplex (ABC kit, Vector Lab., Burlingame, CA). Filmy, které představovaly negativní ···· · ·· ·· • · ···· · · · kontrolu, byly inkubovány vynecháním primární nebo sekundární protilátky a jejím nahrazením PBS.
Hybridizace in sítu. [35S]-značené ribopróby byly generovány z plasmidů, obsahujících 320 bp cDNA fragment krysího MUC5AC, což bylo laskavě poskytnuto panem Dr. Carolem Basbaumem. Řezy byly hybridizovány s těmito [35S]-značenými RNA próbami (2500— 3000 cpm/μΐ hybridizačního pufru) a promyty za přesně stanovených podmínek, mezi které patřilo působení RN-ázou A. Po autoradiografii po dobu 7-21 dní byly fotografické emulze vyvolány a filmy byly vybarveny hematoxylinem.
Počítání neutrofilů v epitelu dýchacích cest. Zhodnocení nárůstu neutrofilů v bronchách bylo provedeno vybarvením neutrofilů pomocí 3,3'diaminobenzidintetrahydrochloridu a počet neutrofilů byl počítán v lumenu průdušky a v epitelu. Výsledky byly vyjádřeny jako počet vybarvených buněk na mm délky základní vrstvy.
Bronchoalveolární výplach (BAL). Aby se mohly spočítat diferenciální buňky v každé skupině zvířat, byly plíce podrobeny 5 minutovému výplachu působením 3 ml alikvotů sterilního PBS, oplachy byly spojeny a byl změřen jejich objem. Buňky v BAL byly odděleny odstředěním výplachové tekutiny při 1000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut. Poté bylo 10 μΐ buněčné suspenze počítáno pomoci hematocytometru, aby se stanovil počet buněk v BAL tekutině. Počítání diferenciálních buněk bylo prováděno na cytospanových přípravcích, vybarvených pomocí Diff-Quik (Američan Scientific Products, McGaw Park, IL) . Počet diferenciálních buněk byl získán ze vzorků nejméně 200 buněk na každém cytospanovém filmu.
Statistické zpracování. Data jsou vyjádřena jako průměr ± střední odchylka. Pro statistický rozbor byla použita buď cesta dvoucestné nebo jednocestné analýzy variance (ANOVA) s následujícím Studentovým t-testem, který byl použit podle potřeby. Pravděpodobnost menší než 0,05 byla považována za statisticky průkazný rozdíl.
Výsledky.
Vliv metaplazie pohárkovitých buněk na strukturu epitelu. Aby se stanovilo, zda agarózové zátky mají vliv na strukturu epitelu dýchacích cest, byly umístěny agarózové zátky do pravé průdušky u 5 bezpatogenních krys. U kontrolních zvířat obsahoval bronchiální epitel málo pohárkovitých buněk. Nicméně po lokálním umístění agarózových zátek, ukázalo metodou PAS, že v závislosti na čase což byl rozdíl detekovaný již největší 72 docházelo vybarvení Alcianovou modří buněk, a byl zátek pohárkovitých a nalezeno více :
roste plocha pohárkovitých 24 hodin po umístění zátek hodin po umístění zátek. 24 hodin po umístění zvyšování počtu prea po 48 hodinách bylo buněk (Tab. 1). Po 72 k signifikantnímu pohárkovitých buněk zralých pohárkovitých hodinách zvýšily agarózové zátky počet pohárkovitých buněk (P <
0,01); počet bazálních a řasinkových buněk byl nezměněn (P >
0,05). Celkový počet epitelových buněk na mm základní vrstvy 72 hodin po umístěni agarózových zátek byl mírně, ale neprůkazné zvýšený (P > 0,05, tab.l); výška epitelu (měřeno od základní membrány k luminálnímu povrchu epitelu) byl zvýšený z 16,0 ± 1,2 pm u kontrolních průdušek na 38,1 ± 9,1 pm po 72 hodinách u průdušek, do kterých byly umístěny zátky (n = 5, P < 0,01).
k žádnému
V lumenu dýchacích cest u kontrolních PAS vybarvení Alcianovou modři, k agarózovým vybarvení, zvířat nedošlo přiléhaly pozitivní k vylučování mukózních s agarovými zátkami bylo Procenta celkové délky vybarvením Alcianovou modří v dýchacích cestách, zátkám, bylo . i které indikovalo,
Nicméně pokud v lumenu pozorováno docházelo že zde glykokonjugátů. zvýšeni epitelu, cestách
V dýchacích vybarvení závislé obsazeného PAS-pozitivním přiléhajících na čase.
těsně k zátkám, vzrostly z 0,1 ± 0,1 % u kontrolních zvířat na
4,7 ± 1,4 %, 13,3 ± 0,7 % a na 19,1 ± 0,7 % po 24 hodinách, 48 hodinách a 7 2 hodinách (n = 5) . Kromě toho způsobily agarózové zátky denudaci epitelu zacpaného bronchu o 13,5 ± 2,3 %, 6,9 ±
2,4 % a 5,1 ± 1,5 % celkové plochy po 24, 48 a 72 hodinách (n = 5) .
Vliv agarózových zátek na expresi mucinového genu. U kontrolních krys nebyl pozorován žádný detekovatelný signál s pomocí antisense próby na MUC5AC v průdušce (n = 4 na každou skupinu). V průdušce, kde byly umístěny agarózové zátky, byl signál pro MUC5AC zvýšený, a to v závislosti na čase od 24 do 72 hodin (n = 4). Exprese genu MUC5AC byla zjištěna zejména u buněk, které se vybarvily pozitivně Alcianovou modří/PAS. Žádný signál nebyl detekován u jiných buněčných typů (např. hladkého svalstva, spojovacích tkání). Sekce, testované pomoci MUC5AC sense sond nevykazovaly žádnou expresi tohoto genu.
Vliv agarózových zátek na expresi EGF-R v epitelu dýchacích cest. U kontrolních zvířat došlo k imunovybarvení protilátkou proti EGF-R, které bylo nepříliš silné v epitelu. Nicméně po umístění agarózových zátek vykazoval epitel, přiléhající k agarózovým zátkám, EGF-R pozitivní vybarvení u buněk, které se •44444 · ♦ ··· • 4 4 4 · · · ♦· ···· · · · 4· pozitivně vybarvují Alcianovou modří/PAS metodou. Vybarvovací obrázek pro EGF-R byl podobný při vybarvení pro MUC5AC a AB/PAS. Prepohárkovité, pohárkovité a negranulární sekvenční buňky byly imunopozitivní pro EGF-R. Řasinkové buňky nevykazovaly žádnou imunoreaktivitu. V dýchacích cestách, které nebyly zatěžovány agarózovými zátkami vykázal epitel malé vybarvení na EGF-R a vypadal podobně jako u kontrolních zvířat.
Vliv inhibitoru EGF-R tyrosin kinázy na metaplazii pohárkovitých buněk a na expresi mucinového genu. V těchto studiích se zkoumal výsledek zavedení agarózových zátek, kterým byla exprese EGF-R v buňkách, které produkují Lučiny. EGF-R je člen třídy tyrosinkinázových receptoru. Z těchto důvodů platí, že pokud se EGF-R ligandy (EGF nebo TGFa) váží na EGF-R, je aktivována specifická EGF-R tyrosin kináza. Aby tudíž mohla být ověřena hypotéza, že aktivace EGF-R vyvolává expresi MUC5AC genu a mukózních glykokonjugátů, a to po zavedení agarózových zátek, byl krysám injekčně podán intraperitoneálně inhibitor EGF-R tyrosin kinázy (BIBX1522). Tento BIBX1522 velmi zřetelně inhiboval oblast, vybarvenou Alcianovou modří/PAS na epitelu po indukci agarózovou zátkou, a to po 24, 48 a 72 hodinách. Také byla úplně inhibována exprese MUC5AC genu, a to 72 hodin po zavedení zátky.
Vliv TNFa neutralizační protilátky na metaplazii pohárkovitých buněk a na expresi EGF-R proteinu. Vznesli jsme hypotézu, že TNFa je uvolňován v průběhu zánětu, způsobeného agarózovými zátkami. Z toho důvodu jsme testovali vliv předběžného ošetření krys TNFa neutralizační protilátkou na metaplazii pohárkovitých buněk indukovanou agarózovou zátkou: u zvířat předem ošetřených TNFa neutralizační protilátkou (n = 5), ·· · ·♦· · ·· • · · · · · · agarózové zátky již dále nestimulovaly expresi EGF-R proteinu nebo produkci pozitivně vybarvených Alcianovou modří/PAS (pohárkovitých) buněk.
Verbováni zánětlivých buněk působením agarózových zátek. Bylo zaznamenáno, že agarózové zátky působí poškození epitelu a infiltraci zánětlivých buněk. Různé zánětlivé buňky mohou produkovat jak TNFa, tak i EGF-R ligandy. Oba tedy EGF-R a tyto ligandy jsou zahrnuty v EGF-R kaskádě, která vede k metaplazii pohárkovitých buněk. Vyhodnotili jsme roli leukocytů a makrofágů agarózovými zátkami indukované efekty dvěma způsoby. Za prvé jsme zkoumali buňky v bronchoalveolárním kanálu: u kontrolních krys byly makrofágy nejvíce verbovány (n = 5; obr. 4, kontrola). Po umístění agarózové zátky počet makrofágů vzrostl (P < 0,05), a v kanálkové tekutině se objevil signifikantní počet neutrofilů (P < 0,01). Počet lymfocytů zůstal nezměněn.
Infiltrace buněk byla také hodnocena na tkáňových řezech: průdušková tkáň bez agarózových zátek obsahovala málo neutrofilů, ale pokud obsahovaly průdušky zátky, byla zjištěna přítomnost neutrofilů, a to jak v epitelu, tak i v lumenu. Počet neutrofilů v lumenu průdušky byl 0,2 ± 0,2; 42,4 ± 7,1; 40,7 ±
7,7 a 20,1 ± 7,2/mm základní vrstvy v kontrolních průduškách a v 24, 48 a 72 hodině po umístění zátek (P < 0,05; n = 5). Kromě toho, počet neutrofilů v epitelu průdušek byl 1,3 ± 0,4; 15,6 ± 2,6; 14,9 ± 1,4 a 14,8 ± 2,6/mm základní vrstvy u kontroly a 24, 48 a 72 hodinu po umístění zátek (P < 0,01; n = 5).
Vliv cyklofosfamidu na verbováni neutrofilů, metaplazii pohárkovitých buněk a expresi proteinu EGF-R. U krys, kterým byl podáván cyklofosfamid, bylo sníženo množství neutrofilů v krvi ··«*·· · ·· *· • « · ·· ♦ · · • · ·· · · · · • · ······ ······· ··♦ «· ·· ··· (počet neutrofilů byl počítán v krvi z tepen po podání cyklofosfamidu, 1,8 ± 0,5 %, n = 5) a verbování neutrofilů, vyvolané zátkou v BAL bylo inhibováno. Počet neutrofilů v 1uměnu průdušky (2,6 ± 0,3/mm základní vrstvy) a v epitelu (0,8 ± 0,2/mm) se také signifikantně snížil za 24 hodin. Cyklofosfamid také inhiboval metaplazii pohárkovitých buněk indukovanou agarózovou zátkou a expresi EGF-R proteinu. Když byl k cyklofosfamidu přidán leumedin (NPC 15669), byla inhibice metaplazie pohárkovitých buněk vyvolaná agarózovou zátkou podobná jako při účinku cyklofosfamidu samotného. Tyto výsledky
ukazují funkci neutrofilů indukované zátkami. při metaplazii pohárkovitých buněk
Diskuse
V této studii, která byla předložena, byl zkoumán vliv
vložení agarózových zátek do dýchacích cest na metaplazii
pohárkovitých buněk u krys bez patogenů, které měly velmi málo
pohárkovitých buněk v kontrolním stavu. Buňky epitelu v průduškách u kontrolních zvířat a průduškách bez agarózových zátek (kontrolní plíce) se vybarvovaly stejně negativně, působením metody PAS Alcianovou modří. Umístění agarózových zátek mělo za následek velmi silný, časově závislý, růst plochy pohárkovitých buněk bronchiálního epitelu, který přiléhal k umístěným zátkám, přičemž tento efekt byl zjistitelný v průběhu 24 hodin a byl největší zhruba 72 hodin po umístění zátek. Dýchací cesty přiléhající k uzátkovaným dýchacím cestám také nesly pozitivní vybarvení metodou PAS Alcianovou modří. Celkový počet buněk a počet bazálních a řasinkových buněk se nezměnil, ale počet pohárkovitých buněk vzrostl a počet negranulovaných sekrečních buněk klesl v závislosti na čase, který uběhl po umístění agarózové zátky (tab. 2) . Tyto výsledky
444444
4 44
4 44 .·: ·
94«4
4 4 44
4 44
4 44
44 444 naznačuji, že metaplazie pohárkovitých přeměny negranulovaných sekrečnich buněk buněk byla důsledkem na pohárkovité buňky.
Tabulka 2
Účinek agarózových zátek na distribuci bronchiálních epitelových buněk u krys bez patogenů*
Typ buňky Kontrola 24 hod. 48 hod. 72 hod.
Pohárkovité 0,0 ± 0,0 13,1 ±5,6 25,7 ± 15,0 51,5 ±9,0
Prepohárkovité 0,0 ± 0,0 32,8 ± 2,9 25,7 ± 15,0 51,5 ±9,0
SekreČní 43,5 ± 3,0 24,4 ± 3,3 18,4 ±3,7 8,9 ± 2,3
Řasinkové 98,5 ± 4,0 83,8 ± 7,9 81,6 ±5,0 84,0 ±3,9
Bazální 18,4 ±5,7 10,6 ± 0,8 11,6 ± 1,7 11,0 ±2,3
Nezjištěnét 1,3 ± 0,5 1,4 ±0,8 1,1 ±0,1 0,6 ±0,4
Celkem 161 ±7,2 166,1 ± 6,1 175,5 ± 6,2 180,9 ±7,5
Buňky byly analyzovány metodou, popsanou v příslušné stati popisu nazvané Použité metody; n = 5 v každé skupině. Charakterizace byla provedena metodou PAS vybarvení Alcianovou modří (tato metoda vybarvuje mukózní glykokonjugáty). Kontrolní dýchací cesty obsahovaly malé množství prepohárkovitých a pohárkovitých buněk. Po umístěni agarózových zátek byl růst počtu prepohárkovitých a pohárkovitých buněk a snížení počtu negranulovaných sekrečnich buněk ve srovnání s kontrolními zvířaty časově závislý (24, 48, 72 hodin).
*Data jsou uvedena ve formě průměr ± střední odchylka, je uveden počet buněk/mm v bazální vrstvě.
+ P < 0,05 ve srovnání s kontrolou § P < 0,01 ve srovnání s kontrolou
Buňky nemají dostatek cytoplasmatických znaků, aby byly zařazeny.
» ·· 9«t · · ·· » · * ·· · k ·« · · « 9 99 ♦ 9 9 9 9*9999
9 9 9 9 9 99
9999 999 999 *9 99999
O pohárkovitých buňkách průdušek u krys není známo, že by exprimovaly gen MUC5AC. V předkládaných studiích kontrolní průdušky neexprimují gen MUC5AC, ale dýchací cesty zatížené zátkami nebo přiléhající k zátkám, které byly vybarveny pozitivně metodou PAS Alcianovou modří, exprimovaly gen MUC5AC, což naznačuje, že gen MUC5AC je zahrnut v mechanismu produkce hlenu při indukci agarózovými zátkami. Tyto výsledky naznačují, že agarózové zátky indukují expresi mucinových genů a produkci mukózních glykokonjugátů, což se děje ve speciálních buňkách v dýchacích cestách u krys.
Předmětem zkoumání byl mechanismus metaplazie pohárkovitých buněk, indukované agarózovými zátkami. EGF-R nejsou normálně exprimovány v epitelu průdušek u bezpatogenních krys, ale tato exprese je indukována TNFa. Za přítomnosti EGF-R v epitelu působí přidání EGF-R ligandů (EGF nebo TGFa) tak, že dochází k růstu exprese mucinového genu a proteinu. Selektivní inhibitor EGF-R tyrosin kinázy (BIBX1522) tyto odezvy úplně inhibuje, čímž se může ovlivnit signalizace EGF-R při mechanismu metaplazie pohárkovitých buněk. Vliv BIBX1522 na metaplazii buněk vyvolanou agarózovými zátkami byl následující: BIBX1522 inhibovalo produkci mukózních glykokonjugátů vyvolanou agarózovými zátkami a expresi genu MUC5AC. Tyto výsledky prokazují EGF-R kaskádu při metaplazii pohárkovitých buněk vyvolané agarózovými zátkami.
Dále byl studován mechanismus, kterým EGF-R kaskáda způsobuje metaplazii pohárkovitých buněk indukovanou agarózovými zátkami. Za prvé jsme studovali expresi EGF-R proteinu v bronchiálním epitelu. Kontrolní dýchací cesty se vybarvily stejně negativně jako na EGF-R, ale dýchací cesty obsahující agarózové zátky vykázaly selektivní, časově závislé, pozitivní vybarvení na EGF-R. Pozitivně vybarvené buňky byly jak , ·· ·
•..... ·1 · · · · ·· • · · I * · · · · ···· -Z···· · ’··* ·:· negranulované sekrečni, tak prepohárkovité a pohárkovité buňky. Z toho plyne, že agarózové zátky vyvolávají expresi EGF-R proteinu. Krysy, které byly předběžně ošetřeny neutralizační protilátkou vůči TNFa, neměly vyvinutou metaplazii pohárkovitých buněk indukovanou agarózovými zátkami, což dokazuje, že TNFa se uplatňuje při EGF-R expresi vyvolané agarózovými zátkami.
Cyklofosfamid, což je látka, která selektivně zmenšuje produkci leukocytů, zabraňoval verbování neutrofilů do kanálku pro tekutiny v dýchacích cestách a do epitelu dýchacích cest, ke kterému dochází po umístění agarózových zátek, a tedy zabraňoval metaplazii pohárkovitých buněk, vyvolané agarózovými zátkami. Po zavedení agarózových zátek také vzrostl počet makrofágů, ale cyklofosfamid verbování makrofágů neinhiboval. Tyto výsledky dokládají funkce neutrofilů při metaplazii pohárkovitých buněk indukované agarózovými zátkami. Fakt, že cyklofosfamid také snižoval expresi EGF-R proteinu po umístění agarózových zátek naznačuje, že neutrofily přispívají, alespoň z části, vyvolání EGF-R exprese ve stavu zánětu.
Neutrofily jsou také schopny produkovat EGF-R ligandy, tedy EGF a TGFa. Kromě toho epitelové buňky jsou zdrojem EGF-R ligandu a došlo k denudaci epitelu, přiléhajícího k agarózovým zátkám. Z toho plyne, že epitel by mohl být důležitý jako potenciální zdroj jak TNFa, tak EGF-R ligandu.
Lze předpokládat, že účinný stimul agarózové zátky je spojen s posunutím zátek v průběhu procesu vysouvání, který má za následek epitelovou abrazi. Mechanické poškození epitelu dýchacích cest bývá podle literatury příčinou nadměrného vylučování hlenu. Tyto předchozí studie vedly k hypotéze, že ·» mechanické trauma epitelu dýchacích cest vede k hypersekreci. Je uváděno, že orotracheální intubace vede u koní k nadměrnému hlenění. Chronická intubace u pacientů by mohla způsobit hypersekreci hlenu a mohla by být odpovědná za ucpávání dýchacích cest hlenem. Inhibitory EGF-R tyrosin kinázy by mohly sloužit k zabránění této hypersekrece hlenu po tracheální intubaci.
Poškození epitelu je nalézáno obecně při testech pacientů, kteří mají třeba i slabé astma, a toto poškození je ve velké míře spojeno se zhoršováním klinických příznaků. Epiteliální poškození způsobené alergickou odpovědí, může indukovat EGF-R aktivaci, což vede k abnormální produkci pohárkovitých buněk. Shora uváděná data prokazují aktivaci EGF-R při různých odpovědích specificky kde je zahrnuta metaplazie pohárkovitých buněk. Mechanické poškození epitelu a poranění epitelu při astmatu může být součástí podobné EGF-R kaskády, jejíž výsledkem je abnormální růst epitelových sekrečních buněk. Toto poskytuje náhled na mechanismus hypersekrece, který se projevuje ve fatálních případech akutního astmatu.
Příklad 4
Regranulace pohárkovitých buněk působením EGF-receptorů
Degranulace pohárkovitých buněk u epitelu nosního respiračního systému u krys byla vyvolána intranasální inhalací fMLP. Signifikantní degranulace byla indukována v nasálním septálním epitelu 4 hodiny po intranasální inhalaci fMLP(10~7M).
Regranulace pohárkovitých buněk se projevovala 48 hodin po inhalaci. V kontrolním stavu byl v pohárkovitých buňkách • * exprimován protein MUC5AC, ale protein EGF-R exprimován nebyl. Jak EGF-R, tak i MUC5AC mucinový gen a protein nebyly přítomny v kontrolním epitelu, ale byly exprimovány signifikantně 48 hodin po inhalaci. Předběžné ošetření inhibitorem EGF-R tyrosin kinázy, BIBX1522, inhibovalo gen MUC5AC a expresi proteinu následující po degranulaci pohárkovitých buněk vyvolané fMLP. Tyto výsledky naznačují, že exprese EGF-R a aktivace tohoto receptorů jsou součástí regranulace pohárkovitých buněk nosního epitelu u krys.
Použité metody
Zvířata. Postup při experimentech se zvířaty byl schválen Committee on Animal Research of the University of California San Francisco. K testům byly použity samci specifického bezpatogenního plemene F344 krys (tělesná hmotnost 200 až 230 g, Simonsen Lab, Gilroy, CA) . Tato zvířata byla chována v bezpatogenních klecích BioClean s kontrolovaným laminárním průtokem prostředí, přičemž měla zvířata volný přístup k sterilní potravě a vodě.
Příprava preparátů z nosní tkáně. V různých časech po inhalaci byly krysy anestetizovány pomocí natrium pentobarbitalu (65 mg/kg, i.p.). Srdce zvířete bylo vystaveno a tupá jehla byla vsunuta od apexu levé tělní dutiny do vzestupné části aorty a krevní oběh byl prosycen 1% paraformaldehydem. Incise pravé komory poskytla výstup pro fixaci. Byly odstraněny oči, spodní čelist, kůže a svalová tkáň a hlava byla ponořena do velkého objemu stejného fixativu na 24 hodin. Po fixaci byla hlava dekalcifikována pomocí činidla Surgipath (Decalcifier II, Surgical Medical Industries, lne., Richmond, IL) na dobu 4-5 dnů a opláchnuta fosfátem v pufrované solance. Nosní dutina byla « ·
Φ e* · · · · • · · • · · · φ · • · ···· ··· nařezána transversálně v úrovni incisivní papily nosní palaty. Frontální blok tkáně byl uložen v glykolmetakrylátu (JB 4 Plus, Polysciences, Inc., Warrington, PA) nebo ve sloučenině OCT (Sakura Finetek, U.S.A., Inc., Torrance, CA) ve formě zmražených řezů. Pět pm tlusté řezy byly nasekány z anteriorního povrchu bloků, uložených v glykolmetakrylátu a vybarveny buď Alcianovou modří (pH 2,5)/periodická kyselina Schiff (AB/PAS), aby se mohla prokázat přítomnost kyselých a neutrálních glykokonjugátů nebo 3, 3'-diaminobenzidinem (Sigma chemical, St. Louis, MO), aby se mohly vizualizovat leukocyty, které měly migrovat do epitelu. Pět pm tlusté řezy byly nařezány z anteriorního povrchu bloků uložených a zmrazených a byly vybarveny metodou AB/PAS nebo použity pro imunovybarvení EGF-R a MUC5AC.
Počítání neutrofilů v nosním epitelu. Neutrofily byly počítány ve vysoce silných oblastech epitelových vrstev vybarvených 3,3'-diaminobenzidinem při zvětšení x400. Počet neutrofilů v nosním septálním epitelu (od základní membrány k buněčným apexům) byly stanoveny počítáním počtu jaderných tvarů na jednotku délky základní vrstvy.
Kvantifikace degranulace a regranulace pohárkovitých buněk. Pro posouzení degranulace a regranulace pohárkovitých buněk jsme měřili objemovou hustotu vybarvených ploch (Alcianová modř/PAS) mukosubstancí na povrchu epitelu sliznice s použitím semiautomatického zobrazovacího systému podle metody, která byla již dříve publikována. Zkoumali jsme vybarvené filmy pomocí mikroskopu Axioplan (Zeiss, Inc.), který byl napojen na videokamerovou kontrolní jednotku (DXC7550MD; Sony Corp. of America, Park Ridge, NJ) . Obrazy nosního epitelu byly zaznamenávány v místech s velkou intenzitou pomocí fázové kontrastní čočky při zvětšení x400, přičemž byl použit videosystém IMAXX Video Systém (PDI, Redmond, WA) . Intracelulární mucin se v povrchových epitelových sekrečních buňkách se jevil jako oválné purpurové granule různých velikostí. Měřili jsme plochu pozitivně vybarvenou metodou PAS
Alcianovou modří a celkovou plochu epitelu a vyjádřili jsme tato místa vybarvená celkové plochy.
Alcianovou modří metodou PAS v procentech
Rozbor byl proveden na počítači Macintosh
9500/120 (Apple Computer,
Cupertino, CA), s použitím publikovaného programu NIH Image.
Imunolokalizace EGF-R a MUC5AC proteinu. Zmrazené řezy z fixované nosní tkáně paraformaldehydem byly podrobeny působení 3% H202 v methanolu, aby se blokoval endogenní peroxid a byly inkubovány s myší monoklonální protilátkou proti EGF-R (Calbiochem, San Diego, CA), nebo MUC5AC (NeoMarkers Inc., Frement, CA) po dobu 1 hodiny při zředění 1:100. Imunoreaktivní EGF-R nebo MUC5AC byly vizualizovány pomocí kitu Vectastain Elitě ABC kit (Vector Lab., Inc., Burlingame, CA) s použitím 3,3'-diaminobenzidin tetrahydrochloridu jako chromogenu. V kontrolních experimentech byla primární nebo sekundární protilátka nahrazena PBS.
Použité metody.
K testům byly použity bezpatogenní krysy, které mají normálně mnoho pohárkovitých buněk v nasálním septálním epitelu. Pro stanovení vlivu aerosolově rozprášeného fMLP na degranulaci pohárkovitých buněk a na migraci neutrofilů v epitelu nosní sliznice byla zvířata anestetizována natrium pentobarbitalem (65 mg/kg, i.p.) a byl jim podán N-formylmethionylleucylfenylalamin (fMLP; 10“5 M, Sigma, St. Louis, MO) v bezpyrogenové solance intranasálně formou aerosolu, což bylo aplikováno po dobu 5 « · • · ♦ · ·
minut. Aerosolová expozice byla dosažena napojením zvířat na ultrazvukový nebulizér (PulmoSonic, DeVilbiss Co., Somerset, PA), který vytvářel aerosol rychlostí 0,3 ml/min. Podobně byla kontrolní zvířata podrobena intranasálnímu působení aerosolu samotné solanky.
Pro testování regranulace nosních pohárkovitých buněk po inhalaci aerosolu fMLP byly krysy usmrceny 48 hodin po intranasálním podávání fMLP. Za účelem zhodnocení vlivu aktivace EGF-R tyrosin kinázy na regranulaci pohárkovitých buněk byla zvířata předběžně ošetřena intraperitoneálně inhibitorem EGF-R tyrosin kinázy (BIBX1522, 15 mg/kg, který lze obecně získat od Boehringer Ingelheim lne., Ingelheim, Germany) 30 minut před inhalací fMLP a toto ošetření bylo dvakrát denně opakováno.
Statistika. Veškerá data byla vyjádřena jako průměr ± směrodatná odchylka. Pro zpracování každé experimentální skupiny byla použita jednocestná metoda ANOVA nebo Studentův t test. Pravděpodobnost menší než 0,05 byla shledána jako důkaz statistické průkaznosti rozdílu.
Výsledky
Vliv degranulace pohárkovitých buněk působením fMLP na nosní epitelovou strukturu. Ve výchozím kontrolním stavu obsahoval nosní septální epitel signifikantní plochu AB/PAS vybarvitelných pohárkovitých buněk, ale luminální povrch byl nevybarven. Imunovybarveni mucinového MUC5AC proteinu bylo v souladu s plochou AB/PAS vybarvení, ale in sítu hybridizace vykázala malou nebo žádnou expresi genu MUC5AC. Imunohistochemické vybarvení na EGF-R protein bylo negativní. Tyto výsledky naznačují, že nosní epitel kontrolních krys « · · obsahuje intaktní pohárkovité buňky, obsahující protein MUC5AC za nepřítomnosti exprese mucinového genu. Nepřítomnost vybarvení v luminální tkáni naznačuje, že k degranulaci (sekreci) mucinů nedošlo.
Byla vznesena hypotéza, že nestimulovaný nosní epitel krys obsahuje „stabilní, nedegranulované pohárkovité buňky, obsahující mucinové proteiny. Chemoatraktant neutrofilů (např. fMLP) se ukázal být činidlem, verbující neutrofily do epitelu dýchacích cest, přičemž ty tam způsobovaly GC degranulaci cestou elastázově-závislého procesu. Aby se mohl zkoumat vliv GC degranulace, byl internasálně 5 minut podáván chemoatraktant neutrofilů, fMLP (10_7M). U krys usmrcených 4 hodiny po aplikaci fMLP byla AB/PAS-vybarvená plocha a plocha MUC5AC pozitivně imunovybarvená zřetelně menší a verbování neutrofilů do nosního epitelu se zřejmě projevilo. AB/PAS vybarvení bylo hlavním faktorem, který měl vliv na luminální povrch nosních dýchacích cest, což potvrzovalo, že GC degranulace se také uplatnila. 4 hodiny po aplikaci fMLP nicméně, byla exprese genu MUC5AC nezměněna.
U krys usmrcených 48 hodin po podání fMLP se imunohistochemické vybarvení s EGF-R protilátkou pozitivně na EGF-R v prepohárkovitých a pohárkovitých buňkách na ploše AB/PAS a MUC5AC imunopozitivní vybarvení navrátily k původním hladinám, na kterých byly v kontrolním stavu, což naznačuje, že se projevila nasální GC regranulace. V tomto časovém odstupu již nebylo přítomno verbování neutrofilů, exprese genu MUC5AC byla viditelná na ploše obsazené GC, což dále naznačuje GC regranulace byla spojena se zvýšenou expresí mucinového genu.
♦ · ·
Úloha fosforylace EGF-R tyrosin kinázy při regranulaci pohárkovitých buněk. Předchozí studie u krys potvrdila, že aktivace EGF receptoru (EGF-R) vedla k expresi mucinového genu a proteinu. Aby se mohla otestovat hypotéza, že aktivace EGF-R hraje roli při regranulaci nosního GC u krys po aplikaci fMLP, byly krysy předběžně ošetřeny (n = 5) selektivním inhibitorem EGF-R tyrosin kinázy, BIBX1522, poté byly podrobeny působní aerosolu fMLP, který působí verbování neutrofilů do nosního epitelu a GC degranulaci, ale 48 hodin po této aplikaci zůstaly plochy vybarvené AB/PAS a MUC5AC imunopozitivně snížené. Tento výsledek potvrzuje EGF-R aktivaci při syntéze nasálního GC mucinu, která následuje po degranulaci působením fMLP.
V této studii jsme zkoumali regulaci produkce mucinů v krysím nosním epitelu. Kontrolní epitel obsahoval signifikantní počet pohárkovitých buněk a v těchto buňkách byl přítomen protein MUC5AC. Nicméně k expresi genu MUC5AC nedocházelo. Exprese MUC5AC mucinu se podle dosavadních údajů projevuje v jiných buňkách epitelu dýchacích cest mechanismem exprese EGF-R a jejich aktivací. U buněk nosního epitelu kontrolních krys jsme zjistili, že k žádné expresi EGF-R genu nebo proteinu nedochází. Nedošlo k žádnému luminálnímu vybarvení AB/PAS nebo MUC5AC proteinu, což naznačuje, že se signifikatní degranulace (sekrece) pohárkovitých buněk neprojevila. EGF-R může být negativně ovlivněno ve „stabilních pohárkovitých buňkách tím, že se předejde syntéze dalšího mucinu. Z těchto důvodů jsme provedli imunologický test nasálních pohárkovitých buněk indukcí degranulace pohárkovitých buněk a zkoumali jsme následné změny ve struktuře epitelu dýchacích cest.
Chemoatraktanty neutrofilů způsobily neutrofilově-závislou degranulaci pohárkovitých buněk u morčat a v lidských dýchacích • · cestách, zprostředkovanou elastázou neutrofilů, která vyplývala z blízkého kontaktu mezi neutrofily a prepohárkovitými buňkami. K indukci degranulace normálně přítomných pohárkovitých buněk v nosním septu byl inhalován fMLP, chemoatraktant, a to intranasálně. fMLP verboval neutrofily v nosním epitelu, po čemž následovala degranulace pohárkovitých buněk; plocha vybarvená metodou PAS Alcianovou modří se snížila velmi znatelně.
Jako další jsme zkoumali následné jevy v nasálním epitelu po fMLP indukované GC degranulací. 4 hodiny po fMLP, když se projevovala maximální degranulace nasálního GC, nebyla stále přítomna exprese EGF-R a MUC5AC. Nicméně, 48 hodin po fMLP, ostře stoupla exprese EGF-R v prepohárkovitých a pohárkovitých buňkách. Exprese MUC5AC genu byla také velmi silná v tomto čase v epitelu, a tyto jevy byly spojeny s regranulací pohárkovitých buněk (zvýšené AB/PAS a MUC5AC vybarvení). Fakticky se 48 hodin po aplikaci fMLP projevila regranulace na stupeň, který byl podobný kontrolnímu stavu po stránce plochy pohárkovitých buněk. Tato zjištění naznačují, že GC degranulace vede k expresi a aktivaci EGF-R, což má za následek indukci exprese mucinu MUC5AC.
Aby se zjistila role aktivace EGF-R tyrosin kinázy při GC degranulací, předběžně jsme ošetřili zvířata selektivním inhibitorem EGF-R tyrosin kinázy, BIBX1522. U zvířat předběžně ošetřených BIBX1522 způsobovalo v fMLP ještě GC degranulací. Nicméně předběžné ošetření BIBX1522 zabraňovalo regranulací GC a jejich expresi proteinu MUC5AC. Tyto výsledky prokazuji EGF-R aktivaci při obnově růstu mladiny mucinů po GC degranulací. U bezpatogenních krys jsou pohárkovité buňky „inaktivní tj. nedegranulující. A EGF-R jsou ovlivňovány negativně. Když dojde k zánětu (např. stimulací infiltrace neutrofilů) dojde k GC
9« ···♦ degranulaci a sekreci mucinů, k pozitivní regulací a aktivaci EGF-R a k další dodávce mucinů epitelem dýchacích cest. Tato zjištění naznačují, že selektivní EGF-R tyrosin kinázové inhibitory mohou být užitečné při prevenci nadměrného vylučování hlenu při nosních chorobách.
Přestože byl tento vynález popsán s odkazem na konkrétní provedení, mělo by být zřejmé, že odborník v oboru může provést nej různější úpravy a ekvivalentní změny, kde obmění různé části bez toho, aby se odchýlil od skutečné podstaty a od rozsahu vynálezu. Kromě toho mohou být uskutečněny různé modifikace, aby se řešení přizpůsobilo konkrétní situaci, materiálním, látkovým a procesním podmínkám, aby se upravil některý stupeň procesu, za účelem dosažení daného cíle, přičemž nejde o odchýlení od podstaty a rozsahu tohoto vynálezu. Veškeré takovéto modifikace a úpravy jsou součástí jeho rozsahu, který je definován připojenými patentovými nároky.

Claims (27)

  1. NÁROKY
    1. Použiti antagonisty receptorů epidermálního růstového faktoru (EGF-R) k výrobě farmaceutického prostředku pro léčení nadměrného vylučování hlenu v plicích.
  2. 2. Použití antagonisty receptorů epidermálního růstového faktoru (EGF-R) k výrobě farmaceutického prostředku pro léčeni nadměrného vylučování hlenu v plicích podle nároku 1, kde uvedeným EGF-R antagonistou je kinázový inhibitor, selektivní pro EGF-R.
  3. 3. Použití antagonisty receptorů epidermálního růstového faktoru (EGF-R) k výrobě farmaceutického prostředku pro léčení nadměrného vylučování hlenu v plicích podle nároku 2, kde uvedeným EGF-R antagonistou je BIBX1522.
  4. 4. Použití antagonisty receptorů epidermálního růstového faktoru (EGF-R) k výrobě farmaceutického prostředku pro léčení nadměrného vylučování hlenu v plicích podle nároku 1, kde uvedeným EGF-R antagonistou je protilátka.
  5. 5. Použití antagonisty receptorů epidermálního růstového faktoru (EGF-R) k výrobě farmaceutického prostředku pro léčení nadměrného vylučování hlenu v plicích podle nároku 4, kde uvedeným EGF-R antagonistou je monoklonální protilátka, která specificky váže epidermální růstový faktor (EGF).
  6. 6. Použití antagonisty receptorů epidermálního růstového faktoru (EGF-R) k výrobě farmaceutického prostředku pro léčení nadměrného vylučování hlenu v plicích podle nároku 4, kde uvedeným EGF-R antagonistou je monoklonální protilátka, která ·« «>
    • · · · • · · * · · · * · · • ···· specificky váže receptor epidermálniho růstového faktoru (EGFR) .
  7. 7. Použití antagonisty receptorů epidermálniho růstového faktoru (EGF-R) k výrobě farmaceutického prostředku pro léčení nadměrného vylučování hlenu v plicích podle nároku 1, kde uvedeným EGF-R antagonistou je antisense molekula specifická pro sekvenci, kódující protein, vybraný ze skupiny, sestávající z EGF a EGF-R.
  8. 8. Použití antagonisty receptorů epidermálniho růstového faktoru (EGF-R) k výrobě farmaceutického prostředku pro léčení nadměrného vylučování hlenu v plicích podle nároku 1, kde antagonista inhibuje transfosforylaci EGF-R.
  9. 9. Použití antagonisty receptorů epidermálniho růstového faktoru (EGF-R) k výrobě farmaceutického prostředku pro léčení nadměrného vylučování hlenu v plicích podle nároku 8, kde uvedeným antagonistou je antioxidant.
  10. 10. Použití antagonisty receptorů epidermálniho růstového faktoru (EGF-R) k výrobě farmaceutického prostředku pro léčení nadměrného vylučování hlenu v plicích podle nároku 1, kde prostředek je pro injekce.
  11. 11. Použití antagonisty receptorů epidermálniho růstového faktoru (EGF-R) k výrobě farmaceutického prostředku pro léčení nadměrného vylučování hlenu v plicích podle nároku 10, kde prostředek je pro intravenózní podávání a antagonista se používá spolu s vehikulem ve formě fyziologického slaného roztoku.
    ♦ ♦♦ • · 9 ·· • 9 • * • r 9 9 • • 9 · * • ·· ♦ · • · • • • • • · · 9 9 ·♦·· • · • 9 * • · 9 9 • • 9 • « · · 99 *
  12. 12. Použiti antagonisty receptorů epidermálniho růstového faktoru (EGF-R) k výrobě farmaceutického prostředku pro léčení nadměrného vylučování hlenu v plicích podle nároku 1, kde prostředek je určen pro inhalací.
  13. 13. Použití antagonisty receptorů epidermálniho růstového faktoru (EGF-R) k výrobě farmaceutického prostředku pro léčeni nadměrného vylučování hlenu v plicích podle nároku 1, kde prostředek obsahuje liposom.
  14. 14. Použití antagonisty receptorů epidermálniho růstového faktoru (EGF-R) k výrobě farmaceutického prostředku pro léčení nadměrného vylučování hlenu v plicích podle nároku 13, kde použitý liposom je sféricky stabilizován a prostředek je pro intravenózní podávání.
  15. 15. Způsob in vitro screeningu potenciálně účinných látek, při kterém:
    (i) se uvádí in vitro model proliferace pohárkovitých buněk do kontaktu s EGF nebo s jeho funkčním ekvivalentem;
    (ii) následně se uvádí do kontaktu zmíněný in vitro model s látkou, která je potenciálně účinnou látkou; a (iii) posuzuje se proliferace pohárkovitých buněk;
    přičemž zmenšení proliferace je indikativní pro terapeutickou účinnost testované látky.
    • ·♦ ·· 4 44 ·· • · · · 4 4#««·
    4 4 44 «444 4«4
    44 444 4 444« 4 · 44
    4*4 44 4444 ♦ 4*44 · * 4 «44444
  16. 16. In vitro model podle nároku 14, kde in vitro modely jsou buňky plicního epitelu.
  17. 17. In vitro způsob screeningu potenciálně účinných látek, při kterém se:
    (i) vytvoří zvířecí model plicní choroby při které dochází k nadměrnému vylučování hlenu použitím EGF-R;
    (ii) indukovaný EGF-R se stimuluje ligandem, aby se produkovaly pohárkovité buňky, produkující mucin;
    (iii) model se ošetří testovanou potenciálně účinnou látku;
    a (iv) posoudí se proliferace pohárkovitých buněk nebo sekrece hlenu;
    přičemž inhibice proliferace nebo inhibice produkce hlenu jsou indikativní pro nadějnou terapeutickou účinnost testované látky.
  18. 18. In vitro způsob podle nároku 17, kde zvíře, použité pro vytvoření modelu je vybráno ze skupiny sestávající z myši, krysy, králíka nebo morčete.
  19. 19. Způsob podle nároku 17, kde modelem je model astmatu.
  20. 20. Farmaceutický prostředek k léčení nadměrného vylučování hlenu v dýchacích cestách, obsahující terapeuticky účinné množství antagonisty receptoru epidermálního růstového faktoru (EGF-R) v dávce, dostatečné ke snížení nadměrného vylučování hlenu v dýchacích cestách a farmaceuticky přijatelný nosič.
    100
    • φφ • · Φ φφ ΦΦ • · Φ • Φ Φ Φ Φ φ · * ΦΦΦ • • • · Φ Φ • • φ Φ Φ • • ΦΦΦΦ Φ · Φ Φ t · φ • • Φ Φ Φ Φ • Φ · ♦♦ • · Φ ΦΦ • ΦΦΦ
  21. 21. Prostředek podle nároku 20, kde uvedeným antagonistou EGF-R je inhibitor kinázy selektivní pro EGF-R.
  22. 22. Prostředek podle nároku 20, kde uvedený antagonista EGF-R inhibuje transfosforylaci EGF-R.
  23. 23. Prostředek podle nároku je antioxidant.
  24. 24. Prostředek podle nároku protilátka.
  25. 25. Prostředek podle nároku
    22, kde uvedeným antagonistou
    20, kde antagonistou je
    24, kde protilátkou je monoklonální protilátka, která specificky váže epidermální růstový faktor (EGF).
  26. 26. Prostředek podle nároku 24, kde protilátkou je monoklonální protilátka, která specificky váže epidermální růstový faktor receptor (EGF-R).
  27. 27. Prostředek podle nároku 20, kde antagonistou je antisense molekula specifická pro sekvenci, kódující protein, vybraný ze skupiny, sestávající z EGF a EGF-R.
CZ2001584A 1998-08-18 1999-08-17 Prevence tvorby hlenu v dýchacích cestách podáváním antagonistů EGF-R CZ2001584A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US9702398P 1998-08-18 1998-08-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ2001584A3 true CZ2001584A3 (cs) 2002-06-12

Family

ID=22260380

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2001584A CZ2001584A3 (cs) 1998-08-18 1999-08-17 Prevence tvorby hlenu v dýchacích cestách podáváním antagonistů EGF-R

Country Status (35)

Country Link
US (6) US6270747B1 (cs)
EP (2) EP1970058A1 (cs)
JP (2) JP2002539072A (cs)
KR (1) KR100609646B1 (cs)
CN (1) CN1184961C (cs)
AR (1) AR020220A1 (cs)
AT (1) ATE399541T1 (cs)
AU (1) AU760766B2 (cs)
BR (1) BR9912672A (cs)
CA (1) CA2337422C (cs)
CO (1) CO5130028A1 (cs)
CY (1) CY1110370T1 (cs)
CZ (1) CZ2001584A3 (cs)
DE (1) DE69939022D1 (cs)
DK (1) DK1119349T3 (cs)
EA (1) EA004316B1 (cs)
EE (1) EE200100097A (cs)
ES (1) ES2310047T3 (cs)
HR (1) HRP20010119B1 (cs)
HU (1) HUP0103894A3 (cs)
ID (1) ID27345A (cs)
IL (2) IL140855A0 (cs)
MY (1) MY126490A (cs)
NO (1) NO327000B1 (cs)
NZ (1) NZ509271A (cs)
PH (2) PH12010000216A1 (cs)
PL (1) PL200940B1 (cs)
PT (1) PT1119349E (cs)
RS (1) RS50273B (cs)
SI (1) SI1119349T1 (cs)
SK (1) SK287805B6 (cs)
TR (1) TR200100560T2 (cs)
TW (1) TWI250019B (cs)
UA (1) UA73722C2 (cs)
WO (1) WO2000010588A2 (cs)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6846799B1 (en) * 1998-08-18 2005-01-25 The Regents Of The University Of California Preventing airway mucus production by administration of EGF-R antagonists
BR9912672A (pt) 1998-08-18 2002-06-11 Univ California Prevenção de produção de muco no trato respiratório por administração de antagonistas de egf-r
US7354894B2 (en) 1998-08-18 2008-04-08 The Regents Of The University Of California Preventing airway mucus production by administration of EGF-R antagonists
US20030149113A1 (en) * 2001-10-12 2003-08-07 Caplan Michael J. Conductance of improperly folded proteins through the secretory pathway and related methods for treating disease
US20030236300A1 (en) * 1999-10-27 2003-12-25 Yale University Conductance of improperly folded proteins through the secretory pathway and related methods for treating disease
WO2002094318A1 (en) * 2001-05-18 2002-11-28 University Of Southern California Vector for targeted delivery to cells
US6818446B2 (en) 2001-11-21 2004-11-16 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for the analysis of mucin gene expression and identification of drugs having the ability to inhibit mucin gene expression
DE10204462A1 (de) * 2002-02-05 2003-08-07 Boehringer Ingelheim Pharma Verwendung von Tyrosinkinase-Inhibitoren zur Behandlung inflammatorischer Prozesse
US6924285B2 (en) * 2002-03-30 2005-08-02 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Bicyclic heterocyclic compounds, pharmaceutical compositions containing these compounds, their use and process for preparing them
US7105576B2 (en) * 2002-04-24 2006-09-12 Research Development Foundation Synergistic effects of nuclear transcription factor NF-κB inhibitors and anti-neoplastic agents
AU2003253681B2 (en) * 2002-06-24 2008-05-01 Research Development Foundation Treatment of human multiple myeloma by Curcumin
EP1587482A4 (en) * 2003-01-31 2010-08-25 Technion Res & Dev Foundation INFLAMMATORY COMPOSITIONS AND ITS USES
US7195899B1 (en) * 2003-03-14 2007-03-27 Florida State University Research Foundation, Inc. Cell-based biosensor for harmful airborne agents
CA2536738A1 (en) * 2003-08-26 2005-03-10 Research Development Foundation Aerosol delivery of curcumin
CA2536380A1 (en) 2003-08-26 2005-02-26 Research Development Foundation Osteoclastogenesis inhibitors and uses thereof
US20060115523A1 (en) * 2004-12-01 2006-06-01 Konduri Kameswari S Sterically stabilized liposome and triamcinolone composition for treating the respiratory tract of a mammal
US11324698B2 (en) 2003-08-28 2022-05-10 Vgsk Technologies, Inc. Sterically stabilized carrier for aerosol therapeutics, compositions and methods for treating the respiratory tract of a mammal
US8846079B1 (en) 2004-12-01 2014-09-30 Vgsk Technologies, Inc. Sterically stabilized carrier for aerosol therapeutics, compositions and methods for treating the respiratory tract of a mammal
US20050096332A1 (en) * 2003-10-30 2005-05-05 Boehringer Ingelheim International Gmbh Use of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of inflammatory processes
DE60334645D1 (de) 2003-11-07 2010-12-02 Ablynx Nv Camelidae schwere ketten antikörper vhhs gegen epidermalen wachstumfaktor rezeptor (egfr) und ihre verwendung
US8134010B2 (en) * 2004-05-05 2012-03-13 Renopharm Ltd. Thiazole-based nitric oxide donors having aryl substituent(s) and uses thereof
WO2005105765A1 (en) * 2004-05-05 2005-11-10 Renopharm Ltd. Nitric oxide donors and uses thereof
US7968575B2 (en) * 2004-05-05 2011-06-28 Renopharm Ltd. Nitric oxide donors and uses thereof
US7498445B2 (en) * 2004-05-05 2009-03-03 Renopharm Ltd. Thiazole-based nitric oxide donors capable of releasing two or more nitric oxide molecules and uses thereof
US6998028B1 (en) * 2004-09-24 2006-02-14 Superpower, Inc. Methods for forming superconducting conductors
US7915223B2 (en) * 2004-09-27 2011-03-29 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antimicrobial agents
US7504381B2 (en) * 2004-09-27 2009-03-17 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antimicrobial agents
JP4690158B2 (ja) * 2004-09-28 2011-06-01 スギ生物科学研究所株式会社 薬効評価用動物、薬効評価用動物の慢性閉塞性肺疾患発症方法及びその動物を用いた薬効評価方法
WO2006035706A1 (ja) * 2004-09-28 2006-04-06 Dainippon Ink And Chemicals, Inc. 薬効評価用動物、薬効評価用動物の慢性閉塞性肺疾患発症方法及びその動物を用いた薬効評価方法
EP1933624A4 (en) * 2005-10-11 2009-09-16 Univ Washington COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING RESPIRATORY TRACT HYPERSECRETION
EP1921070A1 (de) * 2006-11-10 2008-05-14 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Bicyclische Heterocyclen, diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel, deren Verwendung und Verfahren zu ihrer Herstelllung
AU2008212999A1 (en) * 2007-02-06 2008-08-14 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bicyclic heterocycles, drugs containing said compounds, use thereof, and method for production thereof
WO2008124496A1 (en) * 2007-04-03 2008-10-16 Parion Sciences, Inc. Method of treating acid-sensing ion channel mediated pain, cough, and central nervous system disorders
EP2152289A1 (en) * 2007-04-30 2010-02-17 Technion Research & Development Foundation Ltd. Novel antimicrobial agents
WO2008132738A2 (en) * 2007-04-30 2008-11-06 Technion Research & Development Foundation Ltd. Anticancerous polymeric agents
CA2711582A1 (en) * 2008-02-07 2009-08-13 Boehringer Ingelheim International Gmbh Spirocyclic heterocycles, formulations containing said compounds, use thereof and processes for the preparation thereof
EP2313397B1 (de) * 2008-08-08 2016-04-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Cyclohexyloxy-substituierte heterocyclen, diese verbindungen enthaltende arzneimittel, deren verwendung und verfahren zu ihrer herstellung
US8112365B2 (en) * 2008-12-19 2012-02-07 Foster Scott C System and method for online employment recruiting and evaluation
WO2010085665A2 (en) 2009-01-23 2010-07-29 Cedars-Sinai Medical Center Targeted delivery system
US9095606B1 (en) 2010-11-13 2015-08-04 Sirbal Ltd. Molecular and herbal combinations for treating psoriasis
US8541382B2 (en) 2010-11-13 2013-09-24 Sirbal Ltd. Cardiac glycoside analogs in combination with emodin for cancer therapy
US9066974B1 (en) 2010-11-13 2015-06-30 Sirbal Ltd. Molecular and herbal combinations for treating psoriasis
US8597695B1 (en) 2010-11-13 2013-12-03 Sirbal Ltd. Herbal combinations for treatment of a skin condition
WO2012096866A2 (en) * 2011-01-10 2012-07-19 Inverseon, Inc. Use of beta-adrenergic inverse agonists for smoking cessation
US20170049835A1 (en) 2015-07-29 2017-02-23 Sirbal Ltd. Herbal Combinations For Treating Scalp Conditions
BR112015002004A2 (pt) 2012-08-03 2017-07-04 Cedars Sinai Medical Center isolamento de mutantes melhoradores de tráfego de proteínas transportadoras de medicamentos
JP6799201B2 (ja) 2013-07-31 2020-12-16 アヴァリン ファーマ インク． エアロゾルチロシンキナーゼ阻害剤の化合物、及びその使用
EP3498288A1 (en) 2013-12-02 2019-06-19 Sirbal Ltd. Herbal combinations for treatment of a skin condition
CN108289845A (zh) 2015-09-14 2018-07-17 维吉思康科技公司 皮下、舌下和口服治疗用空间稳定载体、用于治疗哺乳动物的组合物和方法
WO2022235907A1 (en) 2021-05-05 2022-11-10 Vgsk Technologies, Inc. Liposome-encapsulated corticosteriods inhibit sars-cov-2 replication and reduces lung inflammation

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2932481A (en) * 1954-06-15 1960-04-12 Breer Bipod camera support
GB1242211A (en) * 1967-08-08 1971-08-11 Fisons Pharmaceuticals Ltd Pharmaceutical composition
FR2502627A1 (fr) * 1981-02-02 1982-10-01 Refarmed Sa Derives thioliques de l'erythromycine a activite therapeutique, procede de preparation et produits pharmaceutiques dans lesquels ils apparaissent
IT1173549B (it) * 1984-04-02 1987-06-24 Corvi Camillo Spa Estere dell'acido teofillin-7-acetico con il d,l-trans-sobrerolo avente attivita' mucosecretolitica-fluidificante e antibroncospastica, procedimento per la sua preparazione e sue composizioni farmaceutiche
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4904786A (en) * 1986-01-27 1990-02-27 American Home Products Corporation Quinoline compounds as antiallergic and antiinflammatory agents
US5089516A (en) * 1987-03-11 1992-02-18 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha 1-phenyl-3,5-pyrazolidinedione hydroxystyrene compounds which have tyrosine kinase inhibiting activity
US5217999A (en) 1987-12-24 1993-06-08 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Styryl compounds which inhibit EGF receptor protein tyrosine kinase
WO1990003374A1 (en) * 1988-09-28 1990-04-05 The Upjohn Company 1,4-dihydrothionapthoquinone and heterocyclic congeners which inhibit lipoxygenase enzymes
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
GB8904009D0 (en) 1989-02-22 1989-04-05 Celltech Ltd Vector
US5362755A (en) * 1990-01-05 1994-11-08 Sepracor, Inc. Method for treating asthma using optically pure (R)-albuterol
US5302606A (en) * 1990-04-16 1994-04-12 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Styryl-substituted pyridyl compounds which inhibit EGF receptor tyrosine kinase
US5165424A (en) 1990-08-09 1992-11-24 Silverman Harvey N Method and system for whitening teeth
US5404871A (en) 1991-03-05 1995-04-11 Aradigm Delivery of aerosol medications for inspiration
EP1362868A3 (en) * 1991-03-06 2004-02-11 MERCK PATENT GmbH Humanized and chimeric monoclonal antibodies that bind epidermal growth factor receptor (EGF-R)
US5116616A (en) * 1991-04-29 1992-05-26 Bio-Technology General Corp. Use of intratracheal administration of SOD to protect humans from lung injury due to hyperoxia and hyperventilation
DE4117078A1 (de) 1991-05-25 1992-11-26 Boehringer Ingelheim Kg Verfahren zur herstellung therapeutisch anwendbarer aerosole
CA2444415A1 (en) 1991-07-02 1993-01-21 Nektar Therapeutics Method and device for delivering aerosolized medicaments
PT100905A (pt) * 1991-09-30 1994-02-28 Eisai Co Ltd Compostos heterociclicos azotados biciclicos contendo aneis de benzeno, ciclo-hexano ou piridina e de pirimidina, piridina ou imidazol substituidos e composicoes farmaceuticas que os contem
DE4310051A1 (de) 1992-04-11 1993-10-14 Byk Gulden Lomberg Chem Fab Weitere Verwendung substituierter Pyridazine
US5785049A (en) 1994-09-21 1998-07-28 Inhale Therapeutic Systems Method and apparatus for dispersion of dry powder medicaments
JP2801085B2 (ja) * 1992-09-11 1998-09-21 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン ヒト細胞を植えた気道上の異種移植片を有する非ヒト動物
IL108367A0 (en) * 1993-01-27 1994-04-12 Hektoen Inst For Medical Resea Antisense polynzcleotide inhibition of human growth factor-sensitive cancer cells
US5497763A (en) 1993-05-21 1996-03-12 Aradigm Corporation Disposable package for intrapulmonary delivery of aerosolized formulations
US5886026A (en) * 1993-07-19 1999-03-23 Angiotech Pharmaceuticals Inc. Anti-angiogenic compositions and methods of use
GB9314893D0 (en) 1993-07-19 1993-09-01 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
GB9314884D0 (en) 1993-07-19 1993-09-01 Zeneca Ltd Tricyclic derivatives
WO1995006764A2 (en) 1993-09-03 1995-03-09 Vpi Holdings Ltd. Oligonucleotides with rna cleavage activity
JP3436311B2 (ja) * 1993-09-13 2003-08-11 メルク フロスト カナダ アンド カンパニー 粘液分泌性上皮細胞の化生変化を測定する方法
CA2261433A1 (en) * 1993-12-09 1995-06-10 Belinda Sanchez Ramirez Composition comprising autologous epidermal growth factor
WO1995023225A2 (en) 1994-02-23 1995-08-31 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for inhibiting the expression of disease related genes
WO1995024190A2 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Sugen, Inc. Receptor tyrosine kinase inhibitors for inhibiting cell proliferative disorders and compositions thereof
US20030114379A1 (en) * 1994-03-08 2003-06-19 Human Genome Sciences, Inc. Methods of treating or preventing cell, tissue, and organ damage using human myeloid progenitor inhibitory factor-1 (MPIF-1)
GB9510757D0 (en) * 1994-09-19 1995-07-19 Wellcome Found Therapeuticaly active compounds
ATE205483T1 (de) 1995-03-30 2001-09-15 Pfizer Chinazolinderivate
US5932574A (en) 1995-04-27 1999-08-03 Zeneca Limited Quinazoline derivatives
GB9508565D0 (en) 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quiazoline derivative
GB9508538D0 (en) 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
US5747498A (en) * 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
GB9523675D0 (en) * 1995-11-20 1996-01-24 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
US5760041A (en) 1996-02-05 1998-06-02 American Cyanamid Company 4-aminoquinazoline EGFR Inhibitors
NZ332119A (en) * 1996-04-12 2001-08-31 Warner Lambert Co Quinazoline compounds which are irreversible inhibitors of tyrosine kinases
CA2261872C (en) * 1996-07-29 2004-06-15 Thomas P. Kennedy Methods of treating asthma with o-desulfated heparin
SE9603725D0 (sv) 1996-10-11 1996-10-11 Astra Ab New teatment
UA73073C2 (uk) 1997-04-03 2005-06-15 Уайт Холдінгз Корпорейшн Заміщені 3-ціанохіноліни, спосіб їх одержання та фармацевтична композиція
ZA986729B (en) 1997-07-29 1999-02-02 Warner Lambert Co Irreversible inhibitors of tyrosine kinases
ZA986732B (en) 1997-07-29 1999-02-02 Warner Lambert Co Irreversible inhibitiors of tyrosine kinases
TW436485B (en) 1997-08-01 2001-05-28 American Cyanamid Co Substituted quinazoline derivatives
US6251912B1 (en) * 1997-08-01 2001-06-26 American Cyanamid Company Substituted quinazoline derivatives
CA2314980A1 (en) 1997-12-19 1999-07-01 Smithkline Beecham Corporation Compounds of heteroaryl substituted imidazole, their pharmaceutical compositions and uses
CA2322311C (en) * 1998-03-04 2009-10-13 Bristol-Myers Squibb Company Heterocyclo-substituted imidazopyrazine protein tyrosine kinase inhibitors
US5968748A (en) * 1998-03-26 1999-10-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of human HER-2 expression
BR9912672A (pt) 1998-08-18 2002-06-11 Univ California Prevenção de produção de muco no trato respiratório por administração de antagonistas de egf-r
US6297258B1 (en) * 1998-09-29 2001-10-02 American Cyanamid Company Substituted 3-cyanoquinolines
US6288082B1 (en) * 1998-09-29 2001-09-11 American Cyanamid Company Substituted 3-cyanoquinolines
TR200102505T2 (tr) 1999-02-27 2003-01-21 Boehringer Ingelheim Pharma Kg 4-amino-kinazolin ve kinolin türevleri.
KR100681724B1 (ko) * 1999-10-19 2007-02-28 머크 앤드 캄파니 인코포레이티드 티로신 키나제 억제제 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
US6627634B2 (en) 2000-04-08 2003-09-30 Boehringer Ingelheim Pharma Kg Bicyclic heterocycles, pharmaceutical compositions containing them, their use, and processes for preparing them
AU6383101A (en) 2000-04-08 2001-10-23 Boehringer Ingelheim Pharma Kg Bicyclic heterocylces, medicaments containing said compounds, the use thereof and method for producing them

Also Published As

Publication number Publication date
AR020220A1 (es) 2002-05-02
KR100609646B1 (ko) 2006-08-04
HK1036219A1 (en) 2001-12-28
PT1119349E (pt) 2008-10-14
BR9912672A (pt) 2002-06-11
US20030148990A1 (en) 2003-08-07
US6270747B1 (en) 2001-08-07
US20010041178A1 (en) 2001-11-15
PL200940B1 (pl) 2009-02-27
CA2337422A1 (en) 2000-03-02
HUP0103894A2 (hu) 2002-04-29
US20010036919A1 (en) 2001-11-01
CN1354657A (zh) 2002-06-19
YU13201A (sh) 2005-07-19
JP2009221212A (ja) 2009-10-01
EP1119349A2 (en) 2001-08-01
EA004316B1 (ru) 2004-02-26
US6551989B2 (en) 2003-04-22
TR200100560T2 (tr) 2002-05-21
SK2162001A3 (en) 2002-08-06
IL140855A0 (en) 2002-02-10
ES2310047T3 (es) 2008-12-16
HRP20010119A2 (en) 2002-02-28
KR20010085412A (ko) 2001-09-07
ID27345A (id) 2001-04-05
HUP0103894A3 (en) 2003-07-28
WO2000010588A9 (en) 2000-08-10
AU5676699A (en) 2000-03-14
ATE399541T1 (de) 2008-07-15
EP1970058A1 (en) 2008-09-17
SI1119349T1 (sl) 2008-12-31
WO2000010588A2 (en) 2000-03-02
RS50273B (sr) 2009-07-15
AU760766B2 (en) 2003-05-22
US7358222B2 (en) 2008-04-15
US20080175797A1 (en) 2008-07-24
NO20010749L (no) 2001-04-17
NO20010749D0 (no) 2001-02-14
NO327000B1 (no) 2009-03-30
CA2337422C (en) 2010-11-02
CY1110370T1 (el) 2015-04-29
PH12010000215A1 (en) 2015-07-27
WO2000010588A3 (en) 2001-05-25
EE200100097A (et) 2002-06-17
PL351765A1 (en) 2003-06-16
SK287805B6 (sk) 2011-10-04
HRP20010119B1 (hr) 2008-05-31
UA73722C2 (en) 2005-09-15
DK1119349T3 (da) 2008-10-13
US8071074B2 (en) 2011-12-06
MY126490A (en) 2006-10-31
IL140855A (en) 2011-02-28
US8048844B1 (en) 2011-11-01
CO5130028A1 (es) 2002-02-27
CN1184961C (zh) 2005-01-19
DE69939022D1 (de) 2008-08-14
EA200100136A1 (ru) 2001-10-22
JP2002539072A (ja) 2002-11-19
PH12010000216A1 (en) 2015-07-27
US6566324B2 (en) 2003-05-20
EP1119349B1 (en) 2008-07-02
TWI250019B (en) 2006-03-01
NZ509271A (en) 2003-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ2001584A3 (cs) Prevence tvorby hlenu v dýchacích cestách podáváním antagonistů EGF-R
US7700547B2 (en) Preventing airway mucus production by administration of EGF-R antagonists
JP2010065053A (ja) Ｅｇｆ−ｒアンタゴニストの投与による気道粘液産生の防止方法
HK1036219B (en) Epidermal growth factor receptor antagonists for treating hypersecretion of mucus in the lungs
HK1121413A (en) Epidermal growth factor receptor antagonists for treating hypersecretion of mucus in the lungs
BG105158A (bg) Предотвратяване образуването на слузести покрития(мускус) върху летателни писти с прилагане на противодействащо средство egf-r
MXPA01001755A (en) Preventing airway mucus production by administration of egf-r antagonists