UA73722C2 - Treatment of mucus hypersecretion in lungs by administration of epidermal growth factor receptor (egf-r) antagonist and pharmaceutical formulation - Google Patents

Treatment of mucus hypersecretion in lungs by administration of epidermal growth factor receptor (egf-r) antagonist and pharmaceutical formulation Download PDF

Info

Publication number
UA73722C2
UA73722C2 UA2001021134A UA2001021134A UA73722C2 UA 73722 C2 UA73722 C2 UA 73722C2 UA 2001021134 A UA2001021134 A UA 2001021134A UA 2001021134 A UA2001021134 A UA 2001021134A UA 73722 C2 UA73722 C2 UA 73722C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
cells
ese
goblet
antagonist
esb
Prior art date
Application number
UA2001021134A
Other languages
English (en)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed filed Critical
Publication of UA73722C2 publication Critical patent/UA73722C2/uk

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/10—Expectorants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/12—Mucolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Опис винаходу
Цей винахід, в цілому, стосується лікування легень. Зокрема, цей винахід стосується інгібування 2 гіперсекреції слизу в легенях і дихальних шляхах за допомогою введення антагоніста рецепторів епідермального фактора росту (ЕСЕ-К). У доповнення до цього, цей винахід стосується також методів розробки або оцінки придатних засобів, здатних інгібувати гіперсекрецію слизу в легенях.
Війчастий епітелій у повітроносних шляхах дихальної системи виконує роль основного механізму захисту, який видаляє пилові частинки, які проникли разом з вдихуваним повітрям, або збудників заразних хвороб з 70 дихальних шляхів легень. Нарівні з цим речовини, присутні в рідинах дихальних шляхів, обмежують токсичність пилових частинок і інактивують збудників заразних хвороб. Фізичний механізм кашлю допомагає видаляти слиз з каналів дихальних шляхів |дивись, наприклад, "Боипдайопе ої Кегзрігагу Саге", під редакцією Пірсон (Ріегвоп) і Какмарек (Кастагек), (1992), компанія СВигсйй! І іміпудвіопе Іпс., Нью-Йорк, штат Нью-Йорк; "Нагтізоп'є Ргіпсіріез ої Іпіегпаї Меадісіпе", під редакцією Фосі (Райсі) і інших, (1997), 14-е видання, 72 компанія МсОгаму НІЇЇ, Нью-Йорк, штат Нью-Йоркі.
До складу війчастого епітелію входять війчасті епітеліальні клітини, епітеліальні келихоподібні клітини, а також серозні і мукоїдні клітини, які знаходяться в залозах, розташованих під слизовою оболонкою. Війки оточені водним шаром (перициліарна рідина), який виділяється в просвіт каналів дихальних шляхів внаслідок активного перенесення хлоридів і пасивного переміщення води через епітелій. Війки стикаються зі слизом, який плаває на поверхні зазначеного водного шару, і за допомогою однонаправленого руху забезпечують переміщення зазначеного слизу в напрямі голосової щілини (Пірсон (Ріеггоп) і Качмарек (КастагекК), дивись вище, і Фосі (Райсі) і інші, дивись вище). Слиз продукується епітеліальними келихоподібними клітинами і клітинами залоз, розташованих під слизовою оболонкою, і виділяється в просвіт дихальних шляхів після дегрануляції. с 29 Незважаючи на те, що слиз, як правило, полегшує виведення пилових частинок, які попали разом з Го) вдихуваним повітрям, або збудників заразних хвороб з дихальних шляхів, гіперсекреція слизу в дихальних шляхах може викликати прогресуючу обструкцію дихальних шляхів. У периферичних дихальних шляхах кашель є неефективним для видалення виділень. Крім того, дрібні дихальні шляхи, в яких знаходиться велика кількість келихоподібних клітин, внаслідок їхніх невеликих розмірів виявляються особливо вразливими при закупорці сч 30 дихальних шляхів слизом. На гіперсекрецію дихальних шляхів страждає велика кількість людей; зазначене с явище спостерігається при різних захворюваннях легень, таких як хронічний бронхіт, бронхіальна астма, муковісцидоз і бронхоектаз. в
Гіперсекреція слизу являє собою основний симптом у пацієнтів з хронічним обструктивним захворюванням со легень (СОРО) і визначає цей стан (тобто хронічний кашель і утворення мокротиння). Одним цим 3о захворюванням, яке викликає прогресуючу втрату працездатності і смерть, є ураженими 14 мільйонів в американців. За приблизними оцінками на астму хворіє як мінімум 495 населення США, що є причиною як мінімум 2000 смертних випадків щорічно (Пірсон (Ріеггоп) і Качмарек (Кастагек), дивись вище). При гострому астматичному нападі стінки бронхів набухають, об'єм слизу збільшується, гладкі м'язи бронхів скорочуються, « внаслідок чого відбувається звуження дихальних шляхів. Як наслідок гіперсекреції при гострому нападі астми, З 70 велика слизова пробка може бути основною причиною захворюваності і смертності. с Гіперсекреція причетна також до муковісцидозу, який являє собою одне з найбільш поширених в світі з» смертельних генетичних захворювань. Муковісцидоз являє собою аутосомне рецесивне захворювання, внаслідок якого клітини слизової дихальних шляхів стають нечутливими до цАМФ-залежної протеїнкіназної активації мембранних каналів іонів хлоридів (Пірсон (Ріеггоп) і Качмарек (Кастагек), дивись вище, і Фосі 45 (Рашйсі) і інші, дивись вище|. Подальше порушення водно-сольового балансу знижує рівень гідратації слизу 7 дихальних шляхів, наслідком чого є утворення надто в'язкого слизу в легенях людей, хворих на муковісцидоз. оз Гіперсекреція викликає обструкцію дихальних шляхів хворих на муковісцидоз, що ще більш погіршує функціонування легень. і До інших захворювань, які включають гіперсекрецію, відноситься хронічне обструктивне захворювання легень ка 20 (СОРО). Окислювальне (оксидантне) навантаження грає значну роль в патогенезі СОРО. Сигаретний дим, який спричиняє утворення вільних радикалів кисню, переважно мається на увазі в патогенезі. На місці запалення при із хронічному обструктивному захворюванні легень часто спостерігаються нейтрофіли, і, що представляє інтерес, відомо, що нейтрофіли в процесі активації виділяють вільні радикали кисню.
Механічна інтубація часто виявляється необхідною для забезпечення допоміжної вентиляції легень у пацієнтів з різними захворюваннями легень. Інтубаційна трубка вводиться через ротову частину глотки і
ГФ) вміщується в трахеї. Для запобігання витоку повітря по периметру інтубаційної трубки, навколо неї, в нижній частині трахеї, надувають балон, який може здирати епітелій і викликати метаплазію келихоподібних клітин. При о пораненнях епітелію відбуваються процеси репарації, які призводять до рясних слизових виділень. Тривала інтубація трахеї може викликати шкідливі явища, зумовлені гіперсекрецією. 60 Як наслідок високих рівнів слизу в легенях пацієнтів з гіперсекреторними легеневими захворюваннями знижується очищення (кліренс) слизової оболонки. Патологічні фактори, такі як бактерії, наприклад,
Рзейдотопаз аегидіпоза, часто утворюють колонії в слизі, наслідком чого є часті інфекційні хвороби легень.
Класичні способи лікування людей, уражених гіперсекрецією дихальних шляхів, включають антибіотикотерапію, застосування бронхолітичних засобів; (наприклад, метилксантинів, симпатоміметичних бо засобів з сильними В2 адренергічними стимулювальними властивостями, антихолінергічних засобів),
застосування системних або інгаляційних кортикостероїдів, головним чином при астмі, розрідження слизу за допомогою перорального введення відхаркувальних засобів, наприклад, гвайфенезину, і аерозольна доставка "муколітичних" засобів, наприклад, води, гіпертонічного фізіологічного розчину (Наггтізоп'5, дивись вище).
Більш новим способом лікування муковісцидозу є введення дезоксирибонуклеази для цілеспрямованого впливу на слиз або мокротиння з високим вмістом ДНК ІШек (5пак) і інші, (1990), Ргос. Май. Асай. (США) 87:9188-9192; Хаббард Р.К. (Ниррага К.С.) і інші, (1991), М. Епаі. У. Меда., 326:812)|. У доповнення до цього, способи фізіотерапевтичного впливу на грудну клітку, які полягають в постукуванні, вібрації і дренажі, також використовуються для полегшення очищення від в'язкого слизу. Кінцевим варіантом рішення для пацієнтів з /о важкими порушеннями функції легень може виявитися їх трансплантація. Таким чином, необхідні більш ефективні або альтернативні терапевтичні методи для цілеспрямованого впливу на слизові виділення.
Конкретно, необхідний специфічний спосіб лікування, який знижує утворення слизових виділень в дихальних шляхах.
Застосування інгібіторів епідермального фактора росту (ЕСЕ) для блокування росту ракових клітин /5 розглядають Левіцкий (ІГеміїзКі), Еицг. У. Віоспет.. 226 (1):1-13; Повіс (Роміз) (1994), РНаптас. ТнНег., 62:57-95; Кондапака (Копаарака) і Редді (Кеаау) (1996), Мої. СеїІ. Епадостіп., 117:53-58.
Гіперсекреція слизу в дихальних шляхах є несприятливим симптомом цілого ряду різних захворювань легень. Секреція є наслідком дегрануляції келихоподібних клітин, проліферація яких активізується стимулюванням рецепторів епідермального фактора росту (ЕСЕ-К). Відповідно до цього винаходу, лікування 2о легеневої гіперсекреції здійснюється за допомогою введення терапевтичних кількостей антагоністів епідермального фактора росту (ЕСЕ), в переважному варіанті інгібіторів кінази. Зазначені антагоністи можуть бути в формі невеликих молекул, антитіл або частин антитіл, які зв'язуються з ЕСЕ або його рецептором.
Відповідно до іншого аспекту цього винаходу, надаються іп мігго і іп мімо способи прогнозування терапевтичного потенціалу придатних засобів для інгібування гіперсекреції слизу. сч
Основною метою цього винаходу є надання способу лікування захворювань, які залучають до патологічного о процесу гіперсекрецію слизу в легенях.
Іншою метою цього винаходу є надання лікарських форм, придатних для лікування захворювань, наслідком яких є гіперсекреція слизу.
Ще однією метою цього винаходу є надання способу аналізу іп міго для обрання придатних засобів, які с зо інгібують гіперсекрецію слизу, де зазначений спосіб включає етапи (І) контактування моделі проліферації келихоподібних клітин іп мійго з епідермальним фактором росту або його функціональним еквівалентом; (ІІ) с подальшого контактування зазначеної моделі іп мйго з придатним засобом; і (ІП) оцінки проліферації М келихоподібних клітин, де інгібування проліферації келихоподібних клітин є показником терапевтичного потенціалу зазначеного придатного засобу. о
Іншою метою цього винаходу є надання способу аналізу іп мімо для обрання придатних засобів, які інгібують ї- гіперсекрецію слизу, де зазначений спосіб включає етапи (І) створення тваринної моделі гіперсекреторного легеневого захворювання за допомогою індукування ЕСЕ-К, наприклад, за допомогою альфа-фактора некротизації пухлинних клітин (ТМЕ-А); (ІІ) стимулювання зазначеного індукованого ЕСЕ-К за допомогою його ліганду, наприклад, трансформуючого альфа-фактора росту (ТОБ-А) або ЕСЕ, з метою продукування « келихоподібних клітин, які продукують муцин; (І) оброблення придатним засобом; і (ІМ) оцінювання з с проліферації келихоподібних клітин або виділення слизу, де інгібування проліферації келихоподібних клітин або виділення слизу є показником терапевтичного потенціалу зазначеного придатного засобу. ;» Ще однією метою цього винаходу є надання способів аналізу іп міо і іп мімо для обрання антагоністів
ЕСРЕ-ЕК, які інгібують гіперсекрецію слизу.
Перевага цього винаходу полягає в тому, що він надає засоби для запобігання надмірному утворенню слизу -І в легеневих дихальних шляхах.
Відрізняльна особливість цього винаходу полягає в тому, що цілий ряд антагоністів різного типу може о використовуватися для блокування ефектів ЕСЕ і/або ТОБ-а і їх взаємодії з ЕС К-К. -І Аспектом цього винаходу є отримання лікарських форм антагоністів ЕСЕ для зниження утворення слизу в дихальних шляхах пацієнта-ссавця, в переважному варіанті пацієнта, яким є людина. де Іншою метою цього винаходу є спосіб доставки антагоніста ЕСЕ в легені для зменшення слизових виділень в
Із дихальних шляхах пацієнта-ссавця, в переважному варіанті пацієнта, яким є людина.
Іншою метою цього винаходу є надання способу лікування ряду різних захворювань, симптомом яких є надмірне утворення слизових виділень в дихальних шляхах. До таких захворювань відносяться, хоч ними і не ов обмежуються, хронічний бронхіт, бронхіальна астма, муковісцидоз, бронхоектаз, хронічне обструктивне захворювання легень, гіперсекреція внаслідок пошкодження епітелію, такого як алергічне подразнення або
Ф) механічні подряпини, і назальна гіперсекреція. ка Ці ї інші цілі, переваги і відрізняльні особливості цього винаходу стануть очевидні фахівцям в цій галузі при читанні докладного опису способів лікування, а також способів аналізу іп міїго і іп мімо, яке подане далі. во На Фіг1А представлений аналіз ЕСБ-К в клітинах МСІ-Н292 і А431 методом вестерн-блотингу. На Фіг.18 представлені результати імуногістохімічних аналізів за допомогою анти-ЕСБ-К антитіла в культурах клітин
МСІ-Н292. На Фіг.1С представлений аналіз ЕСБЕ-К в клітинах МСІ-Н292 методом назерн-блотингу.
Фіг.2. Забарвлення клітин МСІ-Н292 алціаном блакитним/періодною кислотою-Шиффовою основою (АВ/РА5Б) для ідентифікування муцинових глікопротеїнів. 65 Фіг.3. Аналіз експресії МОС5 гена в клітинах МСІ-Н292 методом назерн-блотингу.
Фіг.АА і Фіг.48.. Імуногістохімічний аналіз ЕСЕ-К за допомогою анти-ЕСЕ-К антитіла у апатогенних пацюків.
Фіг.АА, пацюки, оброблені ТМЕ-А. Фіг.48,, пацюки, сенсибілізовані овальбуміном.
На Фіг.5 зображений графік, який представляє ефект інгібітору ЕСР-К тирозинкінази (ВІВХ 1522) на продукування келихоподібних клітин (виражений у вигляді процента забарвленої площі епітелію дихальних шляхів, зайнятої клітинами, позитивно пофарбованими алціаном блакитним/періодною кислотою Шиффовою основою (АВ/РАБ).
Надані композиції і способи лікування гіперсекреції слизу в дихальних шляхах за допомогою введення терапевтичних кількостей антагоністів ЕСЕ, в переважному варіанті інгібіторів кінази. Зазначені антагоністи можуть бути представлені в формі невеликих молекул, антитіл або фрагментів антитіл, які зв'язуються з ЕСЕ або 7/0 З його рецептором. При гіперсекреторних захворюваннях дихальних шляхів, наприклад, хронічному бронхіті, бронхоектазі, муковісцидозі, бронхіальній астмі, хронічному обструктивному захворюванні легень тощо, синтез муцину в дихальних шляхах є підвищеним і відбувається гіперсекреція слизу. Виділений слиз викликає обструкцію дихальних шляхів, яка є причиною смерті при цих захворюваннях.
Як показано в описі до цього винаходу, декілька причин пошкодження і запалення дихальних шляхів 7/5 індукують експресію рецептора епідермального фактора росту в клітинах епітелію дихальних шляхів. Після індукування ЕСЕ-К, результатом його подальшої стимуляції за допомогою як лігандзалежних, так і ліганднезалежних механізмів є продукування муцину як на рівні експресії гена, так і на рівні білка. Вибірні інгібітори ЕСБ-К тирозинкінази демонструють блокування зазначеної експресії муцинового гена і білка.
Без обмеження обсягу цього винаходу припущено, що в основі еволюційної послідовності продукування келихоподібних клітин лежить експресія ЕСЕР-К. Стимулювання за допомогою ТМЕ-А спричиняє інтенсивне
ЕСЕ-К забарвлення негранульованих секреторних клітин; їх подальша активація лігандами ЕСР-К спричиняє прогресуюче забарвлення слизових глікокон'югатів в цитоплазмі і зазначені клітини перетворюються спочатку в "клітини-попередники келихоподібних клітин", потім в "келихоподібні" клітини. Отримані дані дозволяють припустити, що активація ЕСЕ-К посилює вибірну диференціацію клітин, але не їх проліферацію. Келихоподібні сч об Клітини явно утворюються з негранульованих секреторних клітин, які експресують ЕСР-К і стимулюються лігандами ЕСЕ-К до продукування муцинів. і)
Крім стимулювання цитокінами, ЕСБЕ-К може стимулюватися іншими сигнальними медіаторами. Наприклад, тривале куріння сигарет зв'язують з прогресуючими патологічними змінами в периферичних дихальних шляхах, включаючи гіперплазію келихоподібних клітин. Показано, що передзапальні цитокінактивовані нейтрофіли і с зо сигаретний дим викликають синтез муцину в епітеліальних клітинах бронхів людини через посередництво ліганднезалежного активування ЕСЕ-К, що дозволяє припустити, що рекрутовані нейтрофіли і сигаретний дим є с регулювальниками диференціації епітеліальних клітин, наслідком чого є патологічне індукування М муцинпродукуючих клітин в дихальних шляхах. Нейтрофіли, активовані різними стимулами, в тому числі 1-8 (інтерлейкіном-8), М-форміл-метіоніл-лейцил-фенілаланіном, ТМЕ-А, сигаретним димом або НьО», активують ме) експресію муцину в епітеліальних клітинах, синтез якого інгібується інгібіторами ЕСБЕ-К. Нейтрофіли, крім ї- того, мають здатність продукувати ліганди ЕСБЕ-К, ЕСЕ і ТОБ-А. Нарівні з цим, епітеліальні клітини є джерелами лігандів ЕСБ-К.
Механічне пошкодження епітелію дихальних шляхів також може викликати гіперсекрецію і бути відповідальним за закупорку слизом. Інгібітори ЕСР-К тирозинкінази використовуються для запобігання « іперсекреції слизу після інтубації трахеї. з с Пошкодження епітелію є спільною характерною рисою при обстеженні пацієнтів навіть з легеими формами астми і зазначене пошкодження все в більшій мірі пов'язується з погіршенням клінічних симптомів. Пошкодження ;» епітелію, викликане алергічною реакцією, викликає активацію ЕСБЕ-К, наслідком якої є патологічне продукування келихоподібних клітин. ЕСР-К є причетним до пошкодження епітелію, наприклад, при "реструктуруванні дихальних шляхів", яке відбувається при астмі, репарації і загоєнні ран. Механічне пошкодження епітелію і -І пошкодження епітелію при астмі може залучати схожий ЕСРЕ-К каскад, наслідком якого є патологічний ріст секреторних клітин епітелію. о Гіперсекреція також є важливим виявом запальних захворювань носа. У разі "провокування" назальних -І келихоподібних клітин індукуванням дегрануляції келихоподібних клітин за допомогою нейтрофілзалежного 5р механізму, відбувається сильна активація експресії ЕСБ-К і муцинів. Ці події зв'язувалися з ; регрануляцією ю келихоподібних клітин. У випадку, коли запалення, таке як стимулювання інфільтрації нейтрофілів, викликає
Ге дегрануляцію келихоподібних клітин і секрецію муцину, епітелій дихальних шляхів повторно забезпечується; муцинами внаслідок позитивної регуляції і активації ЕСБ-К.
Перш ніж буде приведений опис способів лікування і лікарських форм, відповідних цьому винаходу, потрібно в розуміти, що цей винахід не обмежується конкретними описаними способами і лікарськими формами, оскільки такі можуть, природно, змінюватися. Потрібно розуміти також, що термінологія, яка застосовується в цьому (Ф, описі, використана з метою опису тільки конкретних варіантів здійснення цього винаходу, і не повинна ка розглядатися як обмежувальна, оскільки обсяг цього винаходу буде обмежуватися лише прикладеною формулою винаходу. во При відсутності інших визначень, всі технічні і наукові терміни, використані в цьому описі, мають те ж саме значення, яке традиційно мається на увазі середнім фахівцем в галузі, до якої відноситься цей винахід.
Незважаючи на те, що при практичному здійсненні або випробуванні цього винаходу можуть бути використані будь-які способи і матеріали, подібні або еквівалентні описаним тут, далі представлений опис переважних способів і матеріалів. Всі публікації, згадані в цьому описі, включені в нього як посилання для розкриття 65 суті і описання способів і/або матеріалів в зв'язку із зазначеними публікаціями.
Публікації, які обговорюються в цьому описі, надані виключно для розкриття їхньої суті перед датою подачі цієї заявки. У цьому описі ніщо не повинне розглядатися як визнання того, що цей винахід не правомочний датувати таку публікацію заднім числом внаслідок більш раннього винаходу. У доповнення до цього, приведені дати публікації можуть відрізнятися від фактичних дат публікації, які можуть потребувати незалежного підтвердження.
Зазначений термін "епідермальний фактор росту" або "ЕСЕ" означає білок або його частину, яка має біологічну активність, що характеризується мітогенним впливом на епітеліальні клітини (наприклад, Коуен (Сопеп) (1986), Віозсіепсез Керогіз 6 (12): 1017; Ааронсон С.А. (Аагопзоп 5.А.), "Сгомій Расіоге апа Сапсег",
Зсіепсе (1991) 254:1146-1153). Прикладом є людський епідермальний фактор росту, опис якого представлений, /о наприклад, Ердеа (Огаеа) і іншими (1983), Ргос. Маї. Асад. зсі. 80:7461-7465.
Особливий інтерес для цілей цього винаходу представляє мітогенна активність ЕСЕ відносно келихоподібних клітин. У приведене визначення включаються також білки або їхні фрагменти, які є функціональним еквівалентом
ЕСЕ з точки зору біологічної реакції, що викликається ЕОР.
Зазначений термін "рецептор епідермального фактора росту" або "ЕСБР-К" означає білок або його частину, /5 яка має здатність зв'язування білка ЕСЕ або його частини. Прикладом є рецептор людського епідермального фактора росту дивись, Ульріх (ШІІгіст) і інші, (1984), Майшге 309:418-425; номер доступу в Генбанку (Сепрапк
ММ 005228). У переважному варіанті зв'язування зазначеного ліганду ЕСЕ активує ЕСЕ-К (результатом чого є, наприклад, активація внутрішньоклітинної мітогенної індукції, аутофосфорилювання ЕСЕ-К). Фахівцеві в цій галузі зрозуміло, що інші ліганди, крім ЕСЕ, можуть зв'язуватися з ЕСЕ-К і активувати ЕСЕ-К. Приклади таких лігандів включають, однак, ними не обмежуються, ТОБ-А, бетацелюлін, амфірегулін, гепаринзв'язуючий ЕСЕ (НВ-ЕСРЕ) і нейрегулін (відомий також як гергулін) (Шон (Зпамжмп) і Шовер (Зпамумег), Ехр.-Оріп. Іпмеві. ЮОгидзв 7 (4) 553-573 і "Те Ргоївіп Кіпазе Расів ВооК: Ргоїеіп Тугозіпе Кіпазев" (1995), під редакцією Гарді (Нагаїєе) і інших, видавництво Асадептіс Ргевзв, Нью-Йорк, штат Нью-Йоркі.
Зазначений термін "антагоніст ЕСБ-К" означає будь-який засіб, здатний прямо або непрямо інгібувати ефект с ов ЕОЕ-К, зокрема, ефект ЕСР-К на 1 проліферацію келихоподібних клітин або гіперсекрецію слизу келихоподібними клітинами. ЕСЕ-К може бути активований Через посередництво лігандзалежних і і) ліганднезалежних механізмів, наслідком чого є аутофосфорилювання або перефосфорилювання, відповідно.
Антагоністи ЕСБЕ-К, які представляють інтерес, можуть інгібувати будь-який з або обидва ці механізми.
Наприклад, наслідком зв'язування ТМЕ-А з ЕСБ-К є лігандзалежне фосфорилювання, яке може бути блоковане с зо антитілом, яке зв'язує ЕСЕ-К, чим запобігається взаємодія ЕСЕ з лігандом, який міг би активувати зазначений рецептор ЕСЕ. Приклади таких антитіл приведені Гольдштейном (сСоїазівіп) і іншими (1995), Сіїп. Сапсег Кев. с 1:1311-1318; Лоримером (Гогітег) і іншими (1995), Сп. Сапсег Кев. 1:859-864; Шмідтом (Зсптій) і Уелсом Мк. (УУеів) (1996), Вт У. Сапсег 74:853-862. Невеликі молекули інгібіторів тирозинкінази також ефективні як антагоністи ЕСБ-К. о
Відповідно до альтернативного варіанту показано, що сполуки, такі як вільні радикали кисню, стимулюють ї- перефосфорилювання ЕСЕ-К, наслідком чого є ліганднезалежна активація зазначеного рецептора. Інші засоби активування ЕСР-К за допомогою перефосфорилювання включають ультрафіолетове і осмотичне навантаження, стимулювання рецептора, пов'язаного з С-білком, ендотеліном-1, лізофосфатидну кислоту і тромбін, т! мускариновий ацетилхоліновий рецептор і соматотропний гормон людини. Антагоністи цього « ліганднезалежного механізму включають антиоксиданти, такі як пероксид-дисмутаза, диметилсульфоксид в с (ОМ50), диметилсечовина (ОМТИ) аскорбінова кислота і подібні ним. . Антагоністом ЕСЕ-К може бути антитіло, яке зв'язується з фактором, який стимулює продукування ЕСЕ або и?» продукування ЕСЕ-К, тим самим інгібуючи стимулювання проліферації келихоподібних клітин ЕСЕ (наприклад, інгібітор каскаду фосфорилювання, який фосфорилює ЕСБ-К). Наприклад, гібридний білок ТОБ-А-екзотоксину
Рвемдотопаз 40, опис якого приведений Артега (Агіеада) і іншими (1995), Сапсег Кев. 54:4703-4709. -І У переважному варіанті здійснення зазначений антагоніст ЕСБР-К є інгібітором тирозинкіназної активності
ЕСЕ-К, зокрема, дрібномолекулярні інгібітори, які мають вибірну дію на ЕСБ-К, в порівнянні з іншими о тирозинкіназами - переважні дрібні молекули блокують природний рецептор ЕСЕ у ссавця, в переважному -І варіанті людини, і мають молекулярну масу менш ніж 1кДа.
До інгібіторів ЕСЕ і ЕСЕ-К відносяться, однак ними не обмежуються, інгібітори тирозинкінази, наприклад, де хіназоліни, такі як РО 153035, 4-(3-хлоранілін)хіназолін або СР-358774, піридопіримідини, піримідопіримідини,
Ге піролопіримідини, такі як СОР 59326, СОР 60261 і СОР 62706, і піразолопіримідини Шон (З5пам/п) і Шовер (Зпамумег), дивись вище, 4-(феніламіно)-7Н-піроло(2,3-4| піримідини |Гракслер (Тгахіег) і інші, (1996) )3.
Мед. Спет. 39:2285-2292), куркумін (диферулоїлметан) |Лаксмін араяна (Гахтіп агауапа) і інші, (1995), дв Сагсіподеп 16:1741-1745), 4,5-біс(4-фтораніліно)фталімід (Бахдангер (Виспацпдег) і інші, (1995), Сііп. Сапсег
Кевз. 1:813-821; Динні (Оіппеу) і інші, (1997), Сіпй. Сапсег Кев. 3:161-16); тирфостини, до складу яких
Ф) входять нітротіофенові складові, (Брайтон (Вгипіоп) і інші, (1996), Апії Сапсег ЮОгид ЮОевзідп 11:265-295); ка зазначений інгібітор протеїнкінази 7270-1839 (компанія Авіга/епеса); СР-358774 (компанія Ріїгег, Іпс.|,
РО-0183805 (компанія Уу/агпег-І атрегі); або описані в міжнародних заявках МУО99/09016 (компанія Атегісап бо Суапатіа); МУ/О98/43960 (компанія Атегісап Суапатіа); УУО97/38983 (компанія УМагтпег Гатрбегі; УУО99/06378 (компанія УУагпег Гатбрег); У/099/06396 (компанія УУагпег І атрег); УУО96/30347 (компанія Ріїгег, Іпс.);
МУО096/33978 (компанія 2епеса); МУО96/33977 (компанія 7епеса); і М/096/33980 (компанія 7епеса); всі включені в цей опис як посилання; або антисмислові молекули.
Зазначений термін "інгібування" означає зниження, нейтралізацію, ослаблення або запобігання проліферації 65 келихоподібних клітин або гіперсекреції слизу келихоподібними клітинами.
Зазначені терміни "лікування", "лікувати" тощо використовуються в цьому описі в загальному значенні досягнення необхідного фармакологічного і/або фізіологічного ефекту. Зазначений ефект може бути профілактичним з точки зору повного або часткового запобігання захворюванню або його симптому і/або може бути терапевтичним з точки зору часткового або повного лікування захворювання і/або несприятливого ефекту, пов'язаного із зазначеним захворюванням. Зазначений термін "лікування", використаний в цьому описі, і означає будь-яке лікування захворювання у ссавця, зокрема, людини, і включає: (а) запобігання виникненню захворювання або симптому у суб'єкта, який може бути сприйнятливий до даного захворювання або симптому, але який, однак, ще не був діагностований як такий, що має його; (Б) інгібування захворювання або симптому, тобто зупинку його розвитку; або 70 (с) полегшення захворювання або симптому, тобто спонукання зворотного і розвитку зазначеного захворювання або симптому. Цей винахід направлений на : лікування пацієнтів із захворюванням легень або дихальних шляхів і, зокрема, " спрямовано на лікування гіперсекреції слизу у пацієнтів, тобто запобігання, інгібування або полегшення процесу гіперсекреції слизу. З точки зору лікування , симптомів, цей винахід направлений на зниження вмісту слизу або мокротиння в дихальних шляхах, інгібування інфікування 75 патологічними мікроорганізмами, полегшення кашлю і запобігання гіпоксії внаслідок закупорки дихальних ; шляхам.
Більш конкретно, зазначений термін "лікування" означає надання такого, що піддається терапевтичному виявленню, і сприятливого ефекту пацієнтові, який страждає на захворювання легень, які включають гіперсекрецію слизу.
Ще більш конкретно, зазначений термін "лікування" означає запобігання, полегшення і/або інгібування гіперсекреції слизу за допомогою сполуки, обраної з групи, яка включає антагоністи ЕСЕ і/або ЕСБЕ-К, такі як антитіла, інгібітори протеїнтирозинкінази, антисмислові молекули тощо. Альтернативний спосіб лікування може включати запобігання експресії ЕСЕ-К в дихальних шляхах, блокуючи тим самим дихальні шляхи на більш ранній стадії. Наприклад, реактиви, які блокують зв'язування ТМЕ-А з його рецептором, можуть запобігати Га активуванню ЕСБ-К.
Лікування включає запобігання або інгібування інфекційних захворювань, зумовлених патологічними і9) агентами, викликаних і/або пов'язаних з гіперсекрецією слизу.
Зазначений термін "антитіло" означає імуноглобуліновий білок, здатний зв'язувати антиген. Термін "антитіло", використаний в цьому описі, означає фрагменти антитіла, наприклад, К(аб)2, Рар', Раб, здатні Ге зо зв'язувати зазначений антиген або фрагмент антигену, який представляє інтерес. У переважному варіанті зв'язування антитіла з антигеном інгібує активність ЕСЕ або ЕСБ-К. с
Зазначений термін "гуманізоване антитіло" використовується тут для опису повних молекул антитіла, тобто рч- таких, які складаються з двох повних легких ланцюгів і двох повних важких ланцюгів, а також антитіл, які включають лише фрагменти антитіл, наприклад, Раб Раб, К(ар)2 і Гм, де зазначені гіперваріабельні ділянки і. отримують з джерела, який не відноситься до людського роду, в той час як іншу частину зазначеної Ід молекули ча або її фрагмент отримують з людського антитіла, в переважному варіанті отриманому з послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує людське антитіло.
Зазначені терміни "людське антитіло" і "гуманізоване антитіло" використовуються тут для опису антитіла, « всі частини молекули якого отримані з послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує людське антитіло. Такі 70 людські антитіла є найбільш бажаними для використання в методах лікування антитілами, оскільки такі антитіла 8 с викликають незначну або взагалі не викликають імунної реакції у пацієнта-людини. ц Зазначений термін "хімерне антитіло" використовується тут для опису молекули антитіла, а також фрагментів "» антитіла, опис яких приведений раніше у визначенні зазначеного терміну "гуманізоване антитіло". Обсяг поняття зазначеного терміну "хімерне антитіло" включає гуманізовані антитіла. Хімерні антитіла мають як мінімум одну частину послідовності важкого або легкого ланцюга амінокислоти, отриманої від першого виду ссавців, і іншу -І частину послідовності важкого або легкого ланцюга амінокислоти, отриманої від другого, такого, що відрізняється, виду ссавців. У переважному варіанті змінну область отримують від виду ссавців, які не
Мамі відносяться до людини, в той час як постійну область отримують від людського виду. Зокрема, зазначене -І хімерне антитіло в переважному варіанті отримують з нуклеотидної послідовності від ссавця, який не
Відноситься до людського виду, який кодує змінну область, і нуклеотидної послідовності від людини, яка кодує ді постійну область антитіла.
Кз Зазначений вислів "специфічно зв'язується" означає високоавідне і/або високоафінне зв'язування антитіла зі специфічним поліпептидом. Зв'язування антитіла зі своїм епітопом на специфічному поліпептиді є більш сильним, ніж зв'язування того ж самого антитіла з будь-яким іншим епітопом, зокрема, з тими з них, які можуть бути представлені на молекулах, які знаходяться в зв'язку з або в тій же самій пробі, що і специфічний поліпептид, який представляє інтерес. Антитіла, які специфічно зв'язуються з поліпептидом, який представляє іФ) інтерес, можуть мати здібність до зв'язування з іншими поліпептидами на слабкому, однак такому, що піддається ко виявленню, рівні, наприклад, 1095 або менш від зв'язування, яке демонструється з зазначеним поліпептидом, що представляє інтерес. Таке слабке, або фонове, зв'язування легко відрізнити від специфічного зв'язування бо антитіла зі сполукою, яка представляє інтерес, або поліпептидом, наприклад, за допомогою відповідних контролів.
Зазначений вираз "мічене антитіло, яке піддається виявленню", "мічений анти-ЕСЕ, який піддається виявленню" або "мічений фрагмент анти-ЕСЕ, який піддається виявленню" означає антитіло (або фрагмент антитіла, який зберігає специфічність зв'язування), який має приєднану до нього мітку, яка піддається 65 виявленню. Зазначена мітка, яка піддається виявленню, приєднується, як правило, за допомогою хімічної кон'югації однак в тому випадку, коли зазначеною міткою є поліпептид, відповідно до альтернативного варіанту, він може приєднуватися методами генної інженерії. Способи отримання мічених білків, які піддаються виявленню, добре відомі в цій галузі. Мітки, які піддаються виявленню, можуть обиратися з різноманітних подібних міток, відомих в цій галузі, однак як зазначені мітки, які піддаються виявленню, використовуються, як правило, радіоактивні ізотопи, флуорофори, ферменти, наприклад, пероксидаза хріну, або інші складові або сполуки, які або випускають сигнал, що піддається виявленню, (наприклад, радіоактивність, флуоресценція, колір), або випускають сигнал, що піддається виявленню, після впливу на зазначену мітку її субстрату. У цій галузі добре відомі різні пари мітки, що піддається виявленню,/субстрату (наприклад, пероксидаза хріну/діамінобензидин, авідин/стрептавідин, люцифераза/люциферин), способи мічення антитіл і способи 7/0 використання мічених антитіл для виявлення антигену |дивись, наприклад, Апііродіег: А І арогаюгу МапциаїЇ, під редакцією Харлоу (Напом/) і Лейна (ІГапе), (1988), видавництво Со бргіпд Нагрог І арогаїогу Ргезв, Соїй
Зргіпа Нагрог, Нью-Йоркі.
Цей винахід надає спосіб лікування легеневої гіперсекреції за допомогою введення терапевтичних кількостей антагоністів ЕСЕ-К. Будь-яке захворювання і, зокрема, будь-яке захворювання легень, яке характеризуються 7/5 Піперсекрецією слизу або накопиченням патологічних рівнів слизу, може лікуватися за допомогою способів, опис яких тут надається. Прикладами легеневих гіперсекреторних захворювань, які можуть лікуватися цим способом, є, однак ними не обмежуються, хронічні обструктивні захворювання легень, такі як хронічний бронхіт, запальні захворювання, такі як астма, бронхоектаз, фіброз легень, хронічне обструктивне захворювання легень, захворювання назальної гіперсекреції, наприклад, назальні алергії, і інші гіперсекреторні захворювання. Сюди
Ж включаються і генетичні захворювання, такі як муковісцидоз, тріада Картагенера, альфа-1-антитрипсинова недостатність, сімейне ущільнення слизу в дихальних шляхах, яке не є муковісцидозом.
Перевага віддається антагоністам, безпосередньою мішенню для яких є ЕСЕ або ЕСЕ-К. Однак фахівцеві в цій галузі зрозуміло, що будь-який фактор або клітина, залучені до зазначеного біологічного каскаду, наслідком якого є активування проліферації келихоподібних клітин ЕСЕ-К, можуть виступати як мішені для сч інгібування, наприклад, антагоністи ТОБ-А. Не зв'язуючи себе теорією, автори винаходу вважають, що каскад починається під час запальної реакції, коли клітини, такі як гладкі клітини або нейтрофіли виділяють ТМР-А, (8) який в подальшому активує експресію ЕСЕР-К. Стимулювання ЕСЕ-К, наприклад, його лігандом ЕСЕ, в свою чергу запускає проліферацію келихоподібних клітин. Таким чином, будь-які клітини або фактори, залучені до зазначеного каскаду, наприклад, в каскад реакцій ТМЕ-А, можуть бути мішенню для активності антагоніста. с зо Зазначений антагоніст ЕСЕ-К, введений до зазначеного терапевтичного способу, може бути представлений в будь-якій формі. Наприклад, зазначений антагоніст ЕСБЕ-К може бути в формі невеликої молекули (наприклад, с антисмисловий олігонуклеотид, інгібітор тирозинкінази тощо), антитіла або частин антитіла, пов'язаного з ЕСЕ, М
ТОР-А або ЕСБ-К.
У цій галузі відомі інгібітори тирозинкінази, які впливають на рецептор ЕСЕ і відрізняються вибірністю у ме) відношенні ЕСБЕ-К, які можуть бути використані в представлених способах. Опис прикладів був приведений ї- раніше, і до них може бути віднесений ВІВХ 1522 |компанія Воепйгіпдег ІпдеІНеїт, Іпс., ІпдеІНеіт, Німеччина);
СОР 593268 (компанія Момапйіз Согрогайоп, Вазеї, Швейцарія); 4-амінохіназолінові інгібітори ЕСБЕ-К (описані в патенті США Мо 5,760,041); заміщені стирольні сполуки, які також можуть бути нафталіном, інданом або бензоксазином, включаючи нітрильні і молононітрильні сполуки (описані в патенті СІЛА Мо 5,217,9991; « інгібітори, розкриті в патенті СІЛА Мо 5,773,476; інгібітор картопляної карбоксипептидази (РСІ), інгібітор шщ с 39-амінокислотної протеази з трьома дисульфідними місточковими зв'язками |Бланко-Апарисіо (ВІіапсо-Арагісіо) і інші, (1988), 9. Віої. Спет. 273 (20): 12370-12377|; бобмезиновий антагоніст КО-3095 |Цепешазі (Згерезпа?і) і ;» інші, (1997), Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА, 94:10913-10918| тощо. До числа інших інгібіторів тирозинкінази відносяться хіназоліни, такі як РО 153035, 4-(3-хлоранілін)хіназолін або СР-358774, піридопіримідини, піримідопіримідини, піролопіримідини, такі як СОР 59326, СОР 60261 і СОР 62706, і піразолопіримідини Шон -І (Зпамжмп) і Шовер (5памжммег), дивись вище), 4-(феніламіно)-7Н-піроло|2,3-4| піримідини (Тракслер (Тгахіег) і інші, (1996), У. Мей. Спет. 39:2285-2292), куркумін (Корутла (КогаМа) і інші, Віоспіт. Віорпувз. Асіа о 1224:597-6001; |Лаксмін араяна (І ахтіп агауапа), (1995), Сагсіподеп 16:1741-1745); тощо. -І Переважні інгібітори тирозинкінази є вибірними відносно рецептора ЕСЕ, тобто зазначений ЕСБ-К 5ор пригнічується більше, ніж інші рецептори клітинної поверхні, які мають тирозинкіназну активність. Вибірність о посилюється способами отримання лікарських форм і доставки лікарського засобу, наприклад, коли зазначений
Ге інгібітор переважно доставляється в запалені дихальні шляхи, тощо.
Типові дози для системного введення коливаються від О0,їмкг до 100мг на кілограм маси суб'єкта на введення. Фахівцям в цій галузі зрозуміло, що величина дози може змінюватися в залежності від конкретної ов сполуки, важкості симптомів і сприйнятливості суб'єкта до побічних ефектів. Деякі з специфічних сполук є більш сильнодіючими, ніж інші. Переважні дози цієї сполуки легко визначаються фахівцями в цій галузі різними
Ф) способами. Переважним способом є визначення фізіологічної активності цієї сполуки, наприклад, за допомогою ка тестів іп міїгго і іп мімо, опис яких тут приводиться.
Антитіла як антагоністи ЕСЕ-К представляють собою особливий інтерес Інаприклад, Вілоріа (Мііогіа) і інші, бо Атегісап догипа! ої Раїпоіоду 151:1523). Антитіла до ЕСЕ або ЕСЕ-К продукуються за допомогою імунізації ксеногенного імунокомпетентного хазяїна-ссавця, в тому числі з сімейства мишачих, гризунів, зайцеподібних, овечих, свинячих, бичачих тощо, ЕСЕ, ЕСР-К або їхніми фрагментами. Як імуноген в переважному варіанті використовують ЕСЕ, ЕСБ-К або їхні фрагменти. Вибір конкретного хазяїна є, головним чином, питанням зручності. Імунізацію здійснюють відповідно до традиційних методів, де зазначений імуноген може вводитися 65 тварині-хазяїнові підшкірно, внутрішньом'язово, внутрішньоочеревинно, внутрішньосудинно тощо. Як правило, як імуноген через день внутрішньоочеревинно вводять від приблизно 1,0мг/кг до приблизно 1Омг/кг ЕСЕ або
ЕСЕ-К. Ін'єкції можуть проводитися з або без ад'юванта, наприклад, повного або неповного ад'юванта Фрейнда, спеколу, галуну тощо. Після завершення схеми імунізації, антисироватка може збиратися відповідно до традиційних способів з отриманням поліклональних антисироваток, специфічних для ЕСЕ або ЕСБ-К.
Від імунізованих тварин отримують моноклональні або поліклональні антитіла, в переважному варіанті моноклональні антитіла. Поліклональні антисироватки можуть збиратися з сироватки тварин традиційними способами після завершення схеми імунізації. Для отримання моноклональних антитіл лімфоцити збирають з відповідної лімфоїдної тканини, наприклад, селезінки, за допомогою дренування лімфатичних вузлів тощо, з подальшою гібридизацією з відповідним гібридизаційним партнером, як правило, лінією клітин мієломи, з 7/0 отриманням гібридоми, що секретує специфічне моноклональне антитіло. Відбір клонів гібридом за антигенною специфічністю, яка представляє інтерес, здійснюють відповідно до традиційних методів.
Особливий інтерес представляють антитіла, в переважному варіанті моноклональні антитіла, які зв'язуються з ЕСБ-К або ЕСЕ таким чином, щоб інгібувати зв'язування ЕСЕ з ЕСБ-К, наприклад, антитіло, яке специфічно зв'язується з позаклітинною областю ЕСБЕ-К, запобігаючи тим самим зв'язуванню ЕСЕ. Такі антитіла можуть бути /5 отримані за допомогою традиційних способів, опис яких був представлений перед тим, або вони є комерційно доступними. Прикладами антитіл, які могли б функціонувати як антагоністи ЕСЕ, є, однак, ними не обмежуються, моноклональне антитіло С225, яке нейтралізує анти-ЕСЕ-К, (Кавамото (Каматоїо) і інші, (1983), Ргос. Маї"7.
Асад. Зсі. (О5А), 80:1337-1341; Пті (Рейд) і інші, (1997), 9. Раїй., 151:1523-153, яке виробляється компанією ІтСіопе Зувіетв Мем мМогк, штат Нью-Йорк| і анти-ЕСЕ-К моноклональне антитіло ЕМО55900 (яке іменується також Маб 425), |компанія Мегск, Дармштадт, Німеччина).
Представлені антитіла можуть вироблятися з одним ланцюгом, замість нормальної мультимерної структури.
Одноланцюгові антитіла описуються Джостом (Чо5) і іншими, (1994), 9. В. С, 269:26267-73, і іншими.
Послідовності ДНК, які кодують змінну область важкого ланцюга і змінну область легкого ланцюга, лігуються спейсером, який кодує як мінімум біля 4 амінокислот з невеликих нейтральних амінокислот, включаючи гліцин сч ов Мабо серин. Білок, який кодується за допомогою зазначеного злиття, забезпечує можливість збирання функціонально змінної області, яка зберігає специфічність і афінність вихідного антитіла. і)
Способи гуманізації антитіл відомі в цій галузі. Гуманізоване антитіло може бути продуктом тварини, яка має гени константної області трансгенного людського імуноглобуліну (дивись, наприклад, міжнародні заявки УУО 90/10077 і МО 90/04036). Відповідно до альтернативного варіанту антитіло, яке представляє інтерес, може бути с зо отримане методами рекомбінантних ДНК для заміщення СНІ, СН2, СНЗ, шарнірних областей і/або залишків остову відповідною людською послідовністю (дивись У/О 92/02190). с
Використання Ід кКДНК для генно-інженерного конструювання хімерних імуноглобулінових генів також відоме в М цій галузі |/Лю (Гм) і інші, (1987), Р. М. А. 5., 84:3439 і (1987), 9. Іттипої, 139:3521|. мРНК виділяють з гібридоми або іншої клітини, яка продукує антитіло, і використовують для продукування кКДНК. Отримана кКДНК, ме) зв яка представляє інтерес, може ампліфікуватися за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з використанням ї- специфічних праймерів (патенти СІЛА Мо 4,683,195 і Мо 4,683,2021. Відповідно до альтернативного варіанту отримують бібліотеку, з якої відбирають послідовність, яка представляє інтерес. Після цього послідовність
ДНК, яка кодує змінну область зазначеного антитіла, зливається з людськими послідовностями, які кодують постійну область. Зазначені послідовності людських генів постійних областей можна знайти в роботі Кабат « (Караї) Її інших, (1991), Зедцепсев ої Ргоіеїпз ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, публікація Національного інституту з с здоров'я (М. І. НО) США Мо 91-3242. Людські гени постійної області легко доступні з відомих клонів. Після
Й цього хімерне гуманізоване антитіло експресують традиційними способами. и?» Фрагменти антитіл, наприклад, Ем, Е(аб)» Раб, можуть бути отримані за допомогою розщеплення інтактного білка, наприклад, за допомогою протеази або за допомогою хімічного розщеплення. Відповідно до альтернативного варіанту конструюється усічений ген. Наприклад, хімерний ген, який кодує частину фрагмента -І Кар)», повинен був би включати послідовності ДНК, які кодують область СНІ і шарнірну область важкого ланцюга, за якими слідує стоп-кодон трансляції, для отримання усіченої молекули. о Пацієнтові, який страждає на захворювання, пов'язані з гіперсекрецією слизу, можуть спочатку вводитися -І кількості антагоніста ЕСЕ-К в межах від приблизно 20 мг до приблизно 40Омг на 1 кілограм маси пацієнта двічі
В день, наприклад, за допомогою інгаляції. ю У іншому варіанті здійснення представленими терапевтичними засобами є антисмислові молекули,
Ге специфічні для людських послідовностей, які кодують ЕСЕ або ЕСБЕ-К. Терапевтичним засобом, який вводиться, можуть бути антисмислові олігонуклеотиди, зокрема, синтетичні олігонуклеотиди, отримані за допомогою хімічних модифікацій нативних нуклеїнових кислот, або генно-інженерні конструкції на основі нуклеїнових дв КИСЛОТ, які експресують такі антисмислові молекули, як РНК. Зазначена антисмислова послідовність є комплементарною до зазначеної мРНК таргетованих генів ЕСЕ або ЕСР-К і інгібує експресію продуктів
Ф) зазначеного таргетованого гена |дивись, наприклад, Найс (Мусе) і інші, (1997), Майиге, 385:720). Антисмислові ка молекули інгібують експресію гена за допомогою зменшення кількості мРНК, доступної для трансляції, шляхом активації рибонуклеази Н або стеричної невідповідності. Може вводитися одна антисмислова молекула або во комбінація антисмислових молекул, причому до складу зазначеної комбінації можуть входити численні різні послідовності одного таргетованого гена або послідовності, які доповнюють декілька різних генів.
Переважним геном-мішенню є ЕСЕ-К або ЕСЕ. Доступ до послідовності гена може забезпечуватися Через суспільні бази даних (людський епідермальний фактор росту, внесений в каталог Генбанка під Мо КО 1166; людська мРНК для попередника рецептора епідермального фактора росту, внесена в каталог Генбанка під Мо 65 ХО0588). Зазначена антисмислова послідовність, звичайно буде мати ті ж самі вихідні види, що і тварина-хазяїн.
Антисмислові молекули можуть бути отримані за допомогою експресії всієї або частини послідовності зазначеного гену-мішені у відповідному векторі, причому зазначений вектор вводять і експресують в зазначених таргетованих клітинах. Ініціація реплікації орієнтується таким чином, що зазначений антисмисловий ланцюжок продукується як молекула РНК. Отримана антисмислова РНК гібридизується з ендогенним смисловим ланцюгом мРНК, блокуючи тим самим експресію зазначеного таргетованого гена. Може бути використана нативна ініціююча область транскрипції або екзогенна ініціююча область транскрипції. Промотор може вводитися рекомбінантними методами іп міїго або внаслідок гомологічної інтеграції зазначеної послідовності в хромосому.
У цій галузі відомі численні сильні промотори, активні в м'язових клітинах, наприклад, промотор В-актина, ранні і пізні промотори ЗМ-40, промотор людського цитомегаловірусу, ретровірусні довгі кінцеві повтори тощо. 70 Вектори транскрипції мають, як правило, зручні сайти рестрикції, розташовані біля промоторної послідовності, для забезпечення вставки послідовностей нуклеїнових кислот. Можуть бути отримані транскрипційні кластери, які включають ініціюючу область транскрипції, ген-мішень або його фрагмент і термінуючу область транскрипції. Зазначені транскрипційні кластери можуть вводитися в різні вектори, наприклад, плазміду; ретровірус, наприклад, лентивірус; аденовірус тощо, причому зазначені вектори можуть зберігатися в клітинах періодично або постійно, як правило, протягом як мінімум приблизно одного дня, частіше протягом як мінімум приблизно декількох днів.
Альтернативно, в переважному варіанті здійснення, антисмислова молекула являє собою синтетичний олігонуклеотид. Антисмислові олігонуклеотиди включають, як правило, від приблизно 7 нуклеотидів до 500 нуклеотидів, звичайно від приблизно 12 нуклеотидів до 50 нуклеотидів, частіше від приблизно 20 нуклеотидів до
Зо нуклеотидів, причому довжина зумовлюється ефективністю інгібування, специфічністю, включаючи відсутність перехресної реактивності тощо. Було встановлено, що короткі олігонуклеотиди, від 7 основ до 8 основ довжиною, можуть бути сильними і вибірними інгібіторами експресії гена дивись, Вагнер (УУадпег) і інші, (1996), Макшге Віоїесппоіоду, 14:840-844|.
Специфічну область або області ендогенної послідовності смислового ланцюга мРНК обирають таким чином, сч щоб вони доповнювалися антисмисловою послідовністю. Було показано, що 5'-кінцева область мРНК відрізняється особливою сприйнятливістю до антисмислового інгібування. Недавно отримані дані свідчать, (8) однак, про те, що аналіз повторної структури МРНК може мати значення для доступності сайтів інгібування. При виборі специфічної послідовності для олігонуклеотиду можна користуватися емпіричним способом, коли декілька придатних послідовностей аналізуються на інгібування експресії гена-мішені на моделях іп мйго або на с зо тваринних моделях. Може використовуватися також комбінація послідовностей, де для антисмислової комплементарності може відбиратися кілька ділянок зазначеної послідовності мРНК. с
Антисмислові олігонуклеотиди можуть синтезуватися хімічним шляхом за допомогою способів, відомих в цій М галузі, |Вагнер (У/адпег) і інші, (1993), дивись вище, і Мілліган (Міїйїдап) і інші, дивись вище). Переважні олігонуклеотиди отримують за допомогою хімічної модифікації нативної фосфодіефірної структури для ме) підвищення їх внутрішньоклітинної стабільності і спорідненості до зв'язування. У літературі були описані ї- численні модифікації, які змінюють хімізм кістяка, цукру або гетероциклічних основ.
Олігонуклеотиди можуть додатково включати таргетуючу складову, яка посилює поглинання зазначеної молекули клітинами. Зазначена таргетуюча складова являє собою специфічні зв'язуючі молекули, наприклад, антитіло або його фрагмент, який розпізнає молекули, присутні на поверхні епітеліальних клітин легень, «
Зокрема, епітеліальних клітин, до складу яких входить ЕСБ-К. з с У цій галузі відомі біспецифічні антитіла, хімерні антитіла і одноланцюгові антитіла. Відповідним чином . отримані антитіла, які не відносяться до людського роду, можуть гуманізуватися різними шляхами. Сполучення а між олігонуклеотидом і таргетуючою складовою може здійснюватися будь-яким зручним способом, наприклад, за допомогою дисульфідних, амідних або тіоефірних зв'язків, в залежності від хімізму олігонуклеотидного кістяка.
У переважному варіанті зазначений зв'язок буде розщеплюватися всередині клітини для вивільнення -І олігонуклеотиду.
Олігонуклеотиди можуть кон'югуватися з гідрофобними залишками, наприклад, холестерином, для захисту о від нуклеаз і для поліпшення перенесення через клітинні мембрани. Як альтернатива кон'югування з -І полі-І -лізином або іншими поліамінами може також поліпшувати доставку в клітину. Додатковою модифікацією, яка може здійснюватися, є додавання інтеркаляційного компонента, такого як акридин, здатного уставлятися в ю МРНК-мішень і стабілізувати гібрид, який отримується в результаті. Антисмислові олігонуклеотиди можуть
Ге трансфікуватися в поєднанні з ферментом(-ами), які будуть руйнувати комплекси антисмислової мРНК в клітині, наприклад, з рибонуклеазою-Н. Подібним же чином може бути використаний будь-який білок або фермент, який може переважним чином розкладати або руйнувати зазначену дволанцюгову антисмислову МРНК.
Як альтернатива антисмисловим |інгібіторам, для інгібування експресії генів можуть використовуватися каталітичні сполуки нуклеїнових кислот, наприклад, рибозими, антисмислові кон'югати тощо. Рибозими можуть
Ф) синтезуватися іп міго і вводитися пацієнтові, або кодуватися на експресуючому векторі, з якого зазначений ка рибозим синтезується в клітині-мішені |дивись, наприклад, міжнародну заявку МУО 95/23225, і Бейгельман (Веїдеітап) і інші, (1955), МисіІ. Асідз Кев., 23:4434-42)1. Приклади олігонуклеотидів з каталітичною во активністю описані в МУО 95/06764. Кон'югати антисмислових олігонуклеотидів з металевим комплексом, наприклад, терпіридилСи(П), здатні бути посередниками у гідролізі МРНК, описані Башкіним (Вагпкіп) і іншими, (1995), Аррі. Віоспет. Віоїесппої, 54:43-56.
Антагоністи ЕСБ-К можуть надаватися для введення у вигляді розчину або в будь-якій іншій фармакологічно прийнятній формі, такій як ліпосомна суспензія. Відповідні антитіла або анти-ЕСЕ іншої форми включаються до 65 складу лікарської форми для введення способом, звичайним для введення таких матеріалів. До типових лікарських форм відносяться лікарські форми, приведені в довіднику Кетіпдіоп'є Рпаптасешііса! Зсіепсев,
останнє видання, Маск Рибіїзпіпд Сотрапу, Еазіоп, штат Пенсільванія. Шлях введення буде обиратися виходячи із сполуки, призначеної для введення, статусу пацієнта і захворювання, яке зазнає лікування. У разі гіперсекреції слизу сполука може вводитися різними шляхами, в залежності від важкості захворювання, наприклад, ургентні ситуації можуть вимагати внутрішньовенного введення, гострі, але не загрозливі для життя ситуації можуть вимагати перорального введення, в той час як у разі хронічного лікування сполука може вводитися в формі аерозолю.
Для терапевтичного застосування при назальних захворюваннях і захворюваннях дихальних шляхів перевага віддається місцевій доставці. Доставка за допомогою інгаляційних або інсуфляційних аерозолів забезпечує 7/0 Концентрації лікарського препарата високого рівня, в порівнянні з концентрацією, яка абсорбується системним шляхом. Як альтернатива антагоніст ЕСЕ може вводитися ін'єкційним шляхом, включаючи внутрішньом'язову, внутрішньовенну, підшкірну або очеревинну ін'єкцію, причому найбільша перевага віддається внутрішньовенним і місцевим ін'єкціям. Можуть, однак, використовуватися і інші шляхи введення, за умови доступності засобів, які забезпечують введення антагоніста ЕСБ-К в систему кровообігу, такі як черезслизові або черезшкірні 7/5 лікарські форми, які можуть застосовуватися у вигляді супозиторіїв, шкірних пластирів або інтраназально.
Відповідним чином може бути використана будь-яка придатна лікарська форма, яка забезпечує попадання антагоніста ЕСБ-К в систему кровообігу або локально в легені.
До числа лікарських форм, призначених для ін'єкцій, відносяться, як правило, водні розчини або суспензії, в яких використовується фізіологічний розчин, збалансований сольовий розчин Хенкса або інші буфери, до го складу яких факультативно включаються стабілізатори або інші другорядні компоненти. Можуть використовуватися також ліпосомні препарати і інші форми мікроемульсій. Антагоніст ЕСЕ-К може надаватися також в ліофілізованому вигляді або відновленим для введення. До складу лікарських форм для черезслизового або черезшкірного введення входять, як правило, агенти, які полегшують проходження через слизовий або шкірний бар'єр, такі як жовч, солі, фузидієва кислота і її аналоги, різні детергенти тощо. Можливе також сч пероральне введення, за умови включення до складу лікарської форми придатних ентеросолюбільних покриттів, які забезпечують можливість проходження антагоністом ЕСЕ-К травного тракту. і)
Природа лікарської форми буде в деякій мірі залежати від природи вибраного антагоніста ЕСЕ-К. Придатну лікарську форму отримують за допомогою відомих способів і принципів отримання лікарських форм, добре відомих фахівцям в цій галузі. Процентна кількість антагоніста ЕСЕ-К, включена до складу конкретного с зо фармацевтичного препарата, буде також залежати від природи лікарської форми; процентна кількість антагоніста ЕСБЕ-К, якою є антитіло, буде, як правило, коливатися в широких межах від приблизно 195 (мас.) до с приблизно 8595 (мас). М
У цій галузі відома велика кількість способів доставки, які забезпечують посилення поглинання нуклеїнових кислот клітинами. До числа придатних систем доставки відносяться системи доставки вірус Сендай-ліпосома о
І(Рапапорт (Карарог) і Шай (ЗП), (1994), 9. Віої. Спет., 269:15124-15131), катіонні ліпосоми, полімерні ї- доставочні гелі або матриці, пористі балонні катетери (розкриті Шай (ЗНї) і іншими, (1994), Сігсшайоп, 90:955-951; і Шай (5П1ї) і іншими, (1994), Сепе ТНегару, 1:408-414), вектори експресії на основі ретровірусів тощо.
Використання ліпосом як доставочного носія є способом, який представляє інтерес, для використання з антагоністами ЕСБ-К. Ліпосоми зливаються з клітинами сайта-мішені і доставляють вміст порожнини « Внутрішньоклітинно. Ліпосоми утримуються в контакті із зазначеними клітинами протягом періоду часу, з с достатнього для злиття, за допомогою різних засобів і способів збереження контакту, таких як виділення, зв'язуючі агенти тощо. Можна отримувати ліпосоми з очищеними білками або пептидами, які є посередниками в ;» злитті мембран, такими, наприклад, як вірус Сендай або вірус грипу, тощо. Як ліпіди можуть бути використані будь-які придатні комбінації відомих ліпідів, які створюють ліпосоми, в тому числі катіонні ліпіди, такі як фосфатидилхолін. Як ліпіди, що залишаються, за нормальних умов, можуть бути використані нейтральні ліпіди, -І такі як холестерин, фосфатидилсерин, фосфатидилгліцерин тощо. Для отримання ліпосом може використовуватися процедура, описана Като (Каїйос) і іншими, (1991), 9. ВіоЇ. Спет., 266:3361. о У переважному варіанті здійснення антагоніст ЕСЕ-К є інкапсулюваним в стерично стабілізовані "приховані" -І ліпосоми, наприклад, поліетиленгліколізовані ліпосоми. У разі внутрішньовенного уприскування таких ліпосом 5р Вони залишаються в системі кровообігу протягом тривалих періодів часу. При запаленні дихальних шляхів ю відкриваються місця з'єднань посткапілярних венул, що забезпечує можливість накопичення рідини і дозволяє
Ге молекулам, наприклад, комплементу, кініногену, проникати в тканини, ініцюючи запальні каскади. Таке запалення дозволяє ліпосомам і їхньому вмісту вибірково відкладатися в запалених тканинах |Жанг (7Напо) і інші, (1998), Рпагт. Кез., 15:455-460).
Антагоністи ЕСЕР-К можуть вводитися ураженому пацієнту за допомогою фармацевтичної системи доставки інгаляційним шляхом. Зазначені сполуки можуть включатися до складу лікарської форми, придатної для (Ф, введення за допомогою інгаляції. Зазначена фармацевтична система доставки відноситься до числа придатних ка для респіраторної терапії шляхом місцевого введення антагоністів ЕСБ-К на слизову вистілку бронхів. Цей винахід може використати систему, яка залежить від енергії стиснутого газу, для виштовхування антагоністів бо ЕеР-К з ємкості. З цією метою може використовуватися аерозольна упаковка або упаковка, яка знаходиться під підвищеним тиском.
Зазначений термін "аерозоль", який застосовується в цьому описі, використовується в своєму традиційному значенні як такий, що позначає надто дрібні частки рідини або твердої речовини, переносимі газоподібним пропелентом до місця терапевтичного застосування. У разі використання в цьому винаході фармацевтичного 65 аерозолю, до складу зазначеного аерозолю входить терапевтично активна сполука, яка може розчинятися, суспендуватися або емульгуватися в суміші рідкого носія і пропелента. Зазначений аерозоль може бути в формі розчину, суспензії, емульсії, порошку або напівтвердого препарату. Аерозолі, які використовуються в цьому винаході, призначені для введення дрібних частинок твердої речовини або рідини у вигляді туману через дихальні шляхи пацієнта. Можуть використовуватися пропеленти різних типів, відомі фахівцеві в цій галузі.
Прикладами придатних пропелентів є, однак, ними не обмежуються, вуглеводні або інший придатний газ. У разі аерозолю, який знаходиться під підвищеним тиском, стандартна одиниця дозування може визначатися за допомогою надання об'єму для доставки певної кількості.
Цей винахід може здійснюватися також за допомогою розпилювача, який являє собою пристрій, який створює надзвичайно дрібні частки рідини по суті однорідної величини в газі. У переважному варіанті рідина, яка 7/0 Містить антагоністи ЕСЕ-К, є диспергованою у вигляді крапель. Дрібні краплі можуть винестися потоком повітря через вихідну трубку розпилювача. Утворений туман проникає в дихальні шляхи пацієнта.
Ссавцеві, який потребує лікування, може вводитися порошкова композиція, до складу якої входять антагоністи ЕСБ-К або їхні аналоги з/без пом'якшувального компонента, носія або пропелента. Цей варіант здійснення цього винаходу може бути реалізований за допомогою традиційного пристрою для введення 7/5 порошкової фармацевтичної композиції за допомогою інгаляції. Наприклад, порошкова суміш зазначеної сполуки і відповідної порошкової основи, такої як лактоза або крохмаль, може бути представлена в стандартній дозованій лікарській формі, наприклад, у вигляді капсул або патронів, наприклад, желатинових, або ж у вигляді витяжних прозорих упаковок, з яких зазначений порошок може вводитися за допомогою інгалятора.
Для лікування гіперсекреторного легеневого захворювання можуть використовуватися комбіновані 2о Терапевтичні методи. Зокрема, антагоністи ЕР-К можуть комбінуватися з традиційними лікарськими засобами для полегшення гіперсекреції, такими як бронхолітичні засоби, кортикостероїди, відхаркувальні засоби, муколітичні засоби тощо, для полегшення очищення війчастого епітелію.
У залежності від стану пацієнта перевага може віддаватися доставці лікарської форми, відповідної цьому винаходу, за допомогою уприскування (наприклад, внутрішньовенного) або за допомогою інгаляції. Пацієнти, які сч об мають в легенях великі кількості слизу, не можуть, в цілому, лікуватися спочатку за допомогою інгаляцій. Це о зумовлене тим, що легені пацієнта є закупореними до такої міри, що інгаляційна доставка аерозольованої лікарської форми може виявитися не особливо ефективною. Однак після лікування за допомогою ін'єкцій, або як альтернатива для тривалої підтримки, або в ситуаціях, коли легені пацієнта є не сильно закупореними, переважним може виявитися введення шляхом інгаляцій. Введення шляхом інгаляцій виявляється переважним, с зо тому що невеликі дози можуть доставлятися локально до конкретних клітин, які найбільше потребують лікування. Завдяки доставці малими дозами виключаються або істотно знижуються будь-які несприятливі побічні с ефекти. Завдяки доставці безпосередньо до клітин, які найбільше потребують лікування, ефект лікування буде М реалізований швидше.
Існує кілька способів інгаляції різних типів, які можуть використовуватися в зв'язку з цим винаходом. ме)
Антагоністи, відповідні цьому винаходу, можуть вводитися до складу інгаляційних лікарських форм в основному ї- трьох різних типів. По-перше, антагоністи, відповідні цьому винаходу, можуть вводитися до складу лікарських форм з пропелентами, які мають низьку температуру кипіння. Такі лікарські форми вводяться, як правило, за допомогою традиційних дозуючих інгаляторів (МО). Традиційні інгалятори, однак, можуть модифікуватися таким чином, щоб підвищити можливість отримання повторних доз за допомогою використання технології, яка « дозволяє вимірювати об'єм вдихуваного повітря і швидкість потоку повітря у пацієнта, як обговорюється в з с патентах США Мо 5,404,871 і Мо 5,542,410.
Й Як альтернатива агоністи, відповідні цьому винаходу, можуть вводитися до складу водних або етанолових и? розчинів і доставлятися за допомогою традиційних розпилювачів. У більш переважному варіанті, однак, подібні лікарські форми у вигляді розчинів є аерозольованими за допомогою пристроїв і систем, таких як були розкриті в патентах США Мо 5,497,763; Мо 5,544,646; Мо 5,718,222 і Мо 5,660,166. -І І, нарешті, сполуки-агоністи, відповідні цьому винаходу, можуть вводитися до складу сухих порошкових лікарських форм. Такі лікарські форми можуть вводитися простим інгалюванням зазначеної сухої порошкової о лікарської форми . після перетворення її в аерозольний порошковий туман. Опис технології здійснення -І зазначеного приведений в патенті США Мо 5,775,320, який був виданий 7 липня 1988р., і в патенті СІЛА Мо 5,740,794, який був виданий 21 квітня 1998р. о Відносно кожного з вищезазначених патентів, заявники вказують, що в цих патентах цитуються інші
Ге публікації, присвячені внутрішньолегеневій доставці лікарських препаратів, і до таких публікацій можна звертатися для з'ясування конкретної методики, пристроїв і лікарських форм, які могли б використовуватися в зв'язку з доставкою агоністів, відповідних цьому винаходу. У доповнення до цього, кожний із зазначених ов патентів включений в цей опис як посилання в повному обсязі з метою розкриття лікарських форм, пристроїв, упаковок і методів доставки агоністичних лікарських форм, відповідного цьому винаходу.
Ф) Відбірні аналізи можуть використовуватися для ідентифікування біоактивних придатних засобів, які є ка антагоністами ЕСЕ. Особливий інтерес відбірні аналізи представляють для засобів, які мають низьку токсичність для людських клітин. З цією метою можуть використовуватися численні різноманітні аналізи, включаючи аналізи бо п міо зв'язування мічених білків, аналізи по визначенню зміщення електрофоретичної рухливості, імунологічний аналізи зв'язування білків тощо. Очищений ЕСЕ і ЕСЕ-К білок може також використовуватися для визначення об'ємної кристалічної структури; ці дані можуть використовуватися для моделювання міжмолекулярних взаємодій, функцій переносника тощо.
Зазначений термін "засіб", використаний в цьому описі, означає будь-яку молекулу, наприклад, білкову або 65 фармацевтичного лікарського засобу, здатну змінювати або інгібувати фізіологічну функцію ЕСЕ або ЕСБ-К. В цілому, паралельному випробуванню з різними концентраціями засобу піддається велика кількість експериментальних сумішей для отримання диференційованої реакції на різні концентрації. Одна з цих концентрацій, як правило, використовується як негативний контроль, тобто при нульовій концентрації або нижче ніж рівень виявлення.
Придатні засоби представлені численними хімічними класами, хоч, як правило, це органічні молекули, в переважному варіанті невеликі органічні сполуки, які мають молекулярну масу більше за 50 дальтон і менш ніж приблизно 2500 дальтон. Придатні засоби включають функціональні групи, необхідні для структурної взаємодії з білками, зокрема, водневий зв'язок, і, як правило, включають як мінімум аміно-, карбонільну, гідроксильну або карбоксильну групу, в переважному варіанті як мінімум дві зазначені функціональні хімічні групи. До складу 7/0 придатних засобів часто входять циклічні вуглецеві або гетероциклічні структури і/або ароматичні або поліароматичні структури, заміщені однією або декількома вищезазначеними функціональними групами.
Придатними засобами можуть бути також біомолекули, в тому числі пептиди, сахариди, жирні кислоти, стероїди, пурини, піримідини, їхні похідні, структурні аналоги або комбінації.
Придатні засоби отримують з самих різноманітних джерел, в тому числі з бібліотек синтетичних або 7/5 природних сполук. Наприклад, є численні способи довільного або прямого синтезу різноманітних органічних сполук і біомолекул, включаючи експресію рандомізованих олігонуклеотидів і олігопептидів. Як альтернатива є доступними або легко виробленими бібліотеки природних сполук у вигляді екстрактів бактерійного, грибкового, рослинного або тваринного і походження. У доповнення до цього, бібліотеки і сполуки, отримані природним або синтетичним шляхом, легко модифікуються за допомогою традиційних хімічних, фізичних і біохімічних способів і 2о Можуть використовуватися для отримання комбінаторних бібліотек. Відомі фармакологічні засоби можуть піддаватися прямим або довільним хімічним модифікаціям, таких як ацилювання, алкілування, естерифікування, амідування тощо для отримання структурних аналогів.
У тому випадку, коли як відбірний аналіз використовується аналіз зв'язування, одна або декілька молекул можуть зв'язуватися з міткою, причому зазначена мітка може прямо або непрямо забезпечувати сигнал, який с ов Піддається виявленню. До численних існуючих міток відносяться радіоїзотопи флуоресцентні речовини, хемілюмінесцентні речовини, ферменти, специфічні зв'язуючі молекули, частинки, наприклад, магнітні частинки і) тощо. Специфічні зв'язуючі молекули являють собою пари, такі як біотин і стрептавідин, дигоксин антидигоксин тощо. У разі специфічних зв'язуючих членів, комплементарний член повинен, як правило, мітитися молекулою, яка забезпечує виявлення відповідно до відомих способів. с зо Відбірному аналізу може піддаватися велика кількість інших реагентів. До їх числа відносяться такі реагенти, як солі, нейтральні білки, наприклад, альбумін, детергенти тощо, які використовуються для с полегшення оптимального зв'язування білків і/або зниження обсягу неспецифічних або фонових взаємодій. М
Можуть використовуватися реактиви, які підвищують ефективність зазначеного аналізу, такі як інгібітори протеаз, інгібітори нуклеаз, протимікробні засоби тощо. Суміш компонентів додається в будь-якому порядку, ме) який забезпечує необхідне зв'язування. Інкубування здійснюють при будь-якій прийнятній температурі, як ча правило, в межах від 42С до 402. Тривалість інкубування підбирають для забезпечення оптимальної активності, однак її можна також оптимізувати для полегшення проведення прискореного високопродуктивного відбору.
Достатнім, як правило, виявляється проміжок часу від 0,1 год до 1 год.
Сполуки, які мають необхідну фармакологічну активність, можуть вводитися в фізіологічно прийнятному носії « 70 хазяїнові для лікування гіперсекреторного захворювання в лікарських формах, опис яких тут приводиться. У шщ с залежності від способу введення, зазначені сполуки можуть включатися до складу лікарських форм різними й способами, опис яких тут приводиться. Концентрація терапевтично активної сполуки в лікарській формі може и? коливатися від приблизно 0,195 (мас.) до 10095.
Відповідне дозування буде також змінюватися в залежності від ряду факторів, в тому числі від природи суб'єкта, який підлягає лікуванню, конкретної природи гіперсекреторного стану, який підлягає лікуванню, і -і його важкості, природи антагоніста ЕСЕ-К, який використовується як активний інгредієнт, способу введення, лікарської форми і рішення лікаря-куратора. Наприклад, у разі введення самих антитіл, таких як анти-ЕСЕ або о ЕСЕ-К, у вигляді лікарської форми для ін'єкцій, разові дози будуть складати в межах від 20мг/кг до приблизно -І 4Омг/кг. Може бути потрібне повторне введення протягом декількох днів або введення за допомогою 5р Внутрішньовенного вливання може бути безперервним. При хронічних станах введення може продовжуватися де протягом більш тривалих періодів часу, в залежності від потреби.
ГЯ6) Ефективність схеми прийому лікарського засобу буде визначатися за допомогою оцінювання поліпшення функціонування легень у пацієнта. Ця оцінка може включати визначення властивостей в'язкості і пружності мокротиння, поліпшення функціонування легень, включаючи підвищення об'єму форсованого виділення Мокротиння і максимальної середньої швидкості потоку видихуваного повітря. Зазначена лікувальна схема може бути здійснена в поєднанні з допоміжними методами лікування, такими як застосування антибіотиків, іФ) дезоксирибонуклеази І, або іншими терапевтичними методами, які використовуються в цей час для лікування ко гіперсекреторного легеневого захворювання. Якщо антибіотики вводяться одночасно як частина лікувальної схеми, кількісне визначення мікрофлори після завершення курсу лікування може використовуватися для оцінки бо його ефективності по зниженню бактеріального росту, яке свідчить про зниження в'язкості слизу або мокротиння і підвищенні виведення слизу або мокротиння з легень.
Досвідченим фахівцям в цій галузі відомі функціональні проби легень, а також діагностичні тести для визначення клінічного прогресування легеневого гіперсекреторного захворювання. Стандартні функціональні проби легень включають визначення опору дихальних шляхів (АК); форсованої життєвої місткості легень (ЕМС); бв5 індексу форсованого видиху в 1 с (РЕМ(І)); середньої форсованої швидкості потоку видихуваного повітря; і пікового значення швидкості потоку видихуваного повітря (РЕЕК). До числа інших функціональних проб легень відносяться: аналіз газу крові; реакції на лікарські засоби; провокаційна проба і навантажувальна проба (тест на переносимість фізичного навантаження); визначення сили дихальних м'язів; волоконно-оптичне дослідження дихальних шляхів тощо. Деякі основні процедури дослідження властивостей слизу включають визначення реологічних властивостей, наприклад, за допомогою магнітного мікрореометра; адгезивних властивостей для визначення сил тяжіння між липкою поверхнею і адгезивною системою шляхом вимірювання крайового кута між краплею слизу і поверхнею. Перенесення слизу війками може бути дослідженим за допомогою традиційних способів, а також шляхом безпосереднього вимірювання, наприклад, коефіцієнта очищення слизу іп зі. Різниця трансепітеліальних потенціалів, тобто сумарний результат активності системи перенесення іонів /о легеневим епітелієм, може вимірюватися за допомогою відповідних мікроелектродів. Для визначення стану поверхні епітелію можуть використовуватися кількісні морфологічні методи.
Пацієнтом, який підлягає лікуванню, може бути примат, такий як людина, або ж будь-яка інша тварина, яка демонструє описані симптоми. Незважаючи на те, що спосіб, відповідний цьому винаходу, є особливо пристосованим для лікування пацієнта-людини, потрібно розуміти, що цей винахід також придатний і у /5 Ветеринарії.
У іншому варіанті здійснення цього дослідження аналізи іп міго використовуються для оцінювання терапевтичного потенціалу придатних засобів по інгібуванню проліферації келихоподібних клітин, тобто чи активні такі засоби як антагоністи ЕСЕ. В цілому, такі аналізи будуть включати такі етапи: (І) контактування моделі проліферації келихоподібних клітин іп міо з ЕСЕ або його функціональним еквівалентом; (ІІ) подальше Контактування зазначеної моделі іп міго з придатним засобом; і (ІІ) оцінювання проліферації келихоподібних клітин, де інгібування проліферації келихоподібних клітин є показником терапевтичного потенціалу придатного засобу.
Зазначений аналіз в переважному варіанті здійснюється з двома контролями, де друга група клітин не контактує ні з якою сполукою, а третя контактує з ЕСЕ, але не контактує із зазначеним придатним засобом. с
Після цього проводиться порівняння з метою визначення міри впливу ЕСЕ і зазначеного придатного засобу на о клітини.
Може використовуватися будь-яка модель проліферації келихоподібних клітин іп міго . Як приклад, клітини трахеї щурів можуть виділятися і культивуватися відповідно до опису, приведеного Газманом (Сигтап) і іншими, (1995), 217:412-419. Коротко, клітини трахеї щурів висіваються на напівпроникні мембрани, покриті колагеновим с зо гелем; спочатку зазначені клітини культивуються із зануренням в живильне середовище, потім утримуються на поверхні розділу повітря/рідина. Прикладами клітин іп мійго є клітини бронхів зародка людини (доступні від с компанії Сіопеїіїсв, Зап Оіедо); клітини МСІ-Н292 (Американська колекція типових культур (АТСС СКІ -1848)|; і М клітини А431 (Американська колекція типових культур (АТОС СТІ -1555)).
Зазначена культура іп мійго контактує з ЕСЕ і з придатним засобом. Зазначений придатний засіб може ме)
Зв Контактувати з культурою перед, одночасно або після додавання ЕСЕ в залежності від кінцевої точки, яку мають ї- оцінювати, і природи зазначеного придатного засобу. Культивовані клітини оцінюють на інгібування проліферації келихоподібних клітин відносно контролів.
Для оцінки проліферації келихоподібних клітин можуть використовуватися різні молекулярні або біохімічні маркери. Прикладами молекулярних або біохімічних маркерів, які можуть використовуватися, є, однак, ними не « обмежуються, характеристики експресії генів або білків келихоподібних клітин. Певні муцинові гени, наприклад, пу с МИС5В |Дессин (Оеззеуп) і інші, (1997), У. Віої. Спет., 272:3168-3178| експресуються в дихальних шляхах і мають генний продукт, представлений в значних кількостях в слизові. Експресія муцинових генів забезпечує ;» придатний маркер для визначення продукування слизу.
Експресія муцинового гена може оцінюватися за допомогою традиційних методів, таких як метод назерн-блотингу, полімеразно-ланцюгова реакція (РОК), дослідження промотора муцинового гена або аналіз іп -І зіш. Відповідно до альтернативного варіанту муцинові білки оцінюються за допомогою традиційних методів, таких як метод вестерн-блотингу, твердофазний імуноферментний аналіз (ЕП ІЗА), імунохімічний метод тощо, і використовуючи мічені антитіла, які піддаються виявленню. Для визначення наявності або відсутності -І келихоподібних клітин в культурі можуть використовуватися також морфологічні критерії, такі як забарвлення на 5р МУцини за допомогою алціану блакитного/періодної Шиффової основи (АВ/РАЗ) |Лу (І оц) і інші, (1998), Ат. 9. ю Кезгріг. Стії. Саге Меад., 157:1927-1934). Антитіла до муцину можуть дослідитися за допомогою імуноферментного
Ге твердофазного аналізу (ЕГІЗБА). Оскільки стимулювання ЕСБ-К лігандом, наприклад, ЕСЕ, ТОР-А, індукує фосфорилювання специфічної кінази рецептора ЕСЕ і спричиняє продукування келихоподібних клітин, фосфорилювання ЕСБ-К може оцінюватися як відображення індукування келихоподібних клітин |Донато 5 (Бопайю) і інші, (1984), 9. Віої. Снет., 264-20474-204811.
Зниження молекулярних або біохімічних маркерів, пов'язане з проліферацією келихоподібних клітин, є (Ф, показником терапевтичного потенціалу антагоніста. ка Відповідно до ще одного варіанту здійснення цього винаходу, тваринні моделі іп мімо використовуються для оцінки терапевтичного потенціалу придатних засобів по інгібуванню проліферації келихоподібних клітин. В бо Чілому, такий аналіз включає такі етапи: (І) отримання тваринної моделі гіперсекреторного легеневого захворювання за допомогою індукування експресії ЕСБ-К; (ІІ) стимулювання індукованого ЕСБ-К до продукування келихоподібних клітин, які продукують муцин; (ІІ) оброблення придатним засобом; і (ІМ) оцінювання проліферації келихоподібних клітин або секреції слизу, де інгібування проліферації келихоподібних клітин або секреції слизу є показником терапевтичного потенціалу придатного засобу. 65 Може використовуватися будь-яка модель гіперсекреторного легеневого захворювання іп мімо. Як приклад може бути приведена астматична мишача модель, відповідна опису, приведеному Теманн (Тетапп) і іншими,
(1977), Ат. 9. Кегзріг. СеїЇ. Віої, 16:471-478, і показана в прикладах, приведених в цьому описі. Відповідно до альтернативного варіанту може бути використана пацюча модель, відповідна опису, приведеному Такеямою (Такеуата) і іншими, (1988), Ат. 9. РпузіоІ. Прикладами інших тваринних моделей, які можуть бути використані,
Є, однак, ними не обмежуються, морські свинки (види, конституціонально експресуючі келихоподібні клітини) і пацюки.
Тканина легень або тканина трахеї тваринних моделей може дослідитися за допомогою тих же самих молекулярних і біохімічних маркерів, опис яких був приведений для моделі іп міго. Зниження проліферації келихоподібних клітин є показником терапевтичного потенціалу зазначеного антагоніста ЕСБ-К. 70 Приведені далі приклади представлені для того, щоб забезпечити середнього фахівця в цій галузі повним розкриттям і описом того, як здійснити і використати цей винахід, і вони не призначені для обмеження обсягу того, що винахідники розглядають як свій винахід, вони також не служать свідченням того, що приведені експерименти є всіма або єдино проведеними. Були зроблені зусилля по забезпеченню точності використаних цифрових даних (наприклад, кількість, температура), однак, потрібно враховувати можливість деяких /5 експериментальних погрішностей і відхилень. Якщо не вказане інакше, частини є масовими частинами, молекулярна маса є зваженим середнім значенням молекулярної маси, температура приведена в градусах
Цельсия і тиск відповідає або є близьким до атмосферного.
Приклад 1 Система ЕСЕ регулює продукування муцину в дихальних шляхах
Гіперплазія келихоподібних клітин відбувається при різних гіперсекреторних захворюваннях дихальних шляхів, однак, оскільки невідомі механізми, які лежать в основі, не існує і ефективних способів лікування. У здорових дихальних шляхах спостерігається невелика кількість келихоподібних клітин, в той час як при гіперсекреторних захворюваннях дихальних шляхів відбувається гіперплазія келихоподібних клітин. Вивчали лінію бронхіальних клітин людини (МСІ-Н292). Ці клітини експресують ЕСЕ-К конституціонально; експресія гена
ЕСЕ-К була додатково стимульована альфа-фактором некротизації пухлинних клітин (ТМЕ-А). Ліганди ЕСБ-К сч гьв Підвищували синтез муцинів, і цей ефект посилювався при спільному інкубуванні з ТМЕ-А.
Епітеліальні клітини дихальних шляхів апатогенних пацюків експресували незначну кількість ЕСБЕ-К білка, і) однак інтратрахеальна інстиляція ТМЕ-а (200Онг) індукувала ЕСЕ-К в базальних клітинах, клітинах-попередниках келихоподібних клітин і келихоподібних клітинах, але не у війчастих епітеліальних клітинах; ТМЕ-А, ЕСЕ або
ТОР-А самостійно не індукували і продукування келихоподібних клітин. Однак інстиляція ТМЕ-А, з подальшим с зо введенням лігандів ЕСЕР-К, спричиняла підвищення кількості келихоподібних клітин і клітин-попередників келихоподібних клітин, вражаюче посилення позитивного забарвлення алціаном блакитним/періодною с
Шиффовою основою (АВ/РАФЗ) (відображення слизових глікокон'югатів) і експресії муцинового гена МОС5. У М сенсибілізованих пацюків наслідком введення овальбуміну було продукування келихоподібних клітин і експресія
ЕСОБ-К в епітелії дихальних шляхів. У клітинах МСІ-Н292, у пацюків, стимульованих ТМЕ-А з подальшим і) зв Ввведенням лігандів ЕСБ-К, і у астматичної пацючої моделі попередня обробка - інгібітором тирозинкінази ЕСБ-К ї- (ВІВХ 1522) запобігала продукування келихоподібних клітин в дихальних шляхах. Ці дані демонструють роль інгібіторів каскаду ЕСЕ-К при гіперсекреторних захворюваннях дихальних шляхів.
Культура клітин. Лінію клітин слизоутворюючого плоскоклітинного рака легень людини, МСІ-Н2г92, вирощували в живильному середовищі КРМІ 1640, яке містить 1095 сироватки зародка великої рогатої худоби, « пеніцилін (100Од/мл), стрептоміцин (100мкг/мл), при температурі 372С в 590 СО»-інкубаторі з водяною сорочкою. нт) с Після злиття клітини інкубували з ЕСЕ (рекомбінантний людський ЕСЕ, 25нг/мл, компанія Сепгуте, Сатьгідде, й штат Массачуссетс), ТОБ-А (рекомбінантний людський ТОБ-А, 25нг/мл, компанія Сепгуте), ТМЕ-А «» (рекомбінантний людський ТМЕ-А, 2Онг/мл, компанія Сепгуте), ЕСЕ (25нг/мл) плюс ТМЕ-А (2Онг/мл) або ТОБ-А (25нг/мл) плюс ТМЕ-А (2Онг/мл) протягом 12 год, 24год або 48год. При дослідженні інгібування інгібітором тирозинкінази ЕСР-К, ВІВХ 1522 (1Омкг/мл, люб'язно наданому компанією Военгіпдег ІпдеІНеїт Іпс., ІпдеІНеїт, -і Німеччина), клітини заздалегідь обробляли ВІВХ 1522 за ЗО0хв до додавання факторів росту. Після інкубування клітини, які вирощувалися в матраці Т-75, використали для повного екстрагування РНК або екстрагування білка, о і для візуалізації муцину за допомогою забарвлення АВ/РАЗ використали 8-камерне предметне скло. -І Вестерн-блотинг. Клітини, які вирощувалися в матрацах Т-75, лізували і зішкрібали в забуферений фосфатом фізіологічний розчин (РВ5), який містить 195 Тритону Х, 195 діоксиколату натрію і фенілметилсульфонілфторид де (РМ5Б) (10 мг/мл). Загальну кількість білка визначали за допомогою аналітичного білкового реактиву ВСА з (компанія Ріегсе, КосКіога, штат Іллінойс). Клітинні лізати кип'ятили з трициновим буфером для зразка і 290
В-меркаптоетанолу (ВМЕ) при температурі 959С. Білки відділлли за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію (5205-РАСЕ) в 895 акриламідних гелях. Отримані гелі врівноважували в гібридизаційному буфері: 25мММ Трис-буфер-НСІ, 192мМ гліцин, 2095 (в об'ємному відношенні) метанол, рН 8,3. Після цього отримані білки за допомогою електрофорезу переносили на о нітроцелюлозні мембрани. Після цього зазначені мембрани інкубували протягом 1 год в 595 знятому ко знежиреному молоці в РВ5, яке містить 0,059о Твій 20. Потім зазначені мембрани інкубували з моноклональним мишачим анти-ЕСБЕ-К антитілом (1:100) при температурі 42С протягом ночі. Візуалізацію зв'язаних антитіл бо здійснювали за стандартними протоколами методу з використанням комплексу авідин-біотин-лужна фосфатаза (набір АВС, компанія Месіог І арогайогіег). Як позитивний контроль для ЕСБ-К використали клітинні лізати клітин А431 (20).
Імуноцитохімічна локалізація ЕСР-К в клітинах МСІ-Н292. Клітини, вирощені на 8-камерному предметному склі, фіксували за допомогою 495 параформальдегіду протягом 1 год. При фарбуванні на ЕСБЕ-К, як розріджувач 65 для антитіла використали РВ5, який включав 0,0595 Твін 20, 295 нормальну козячу сироватку і 2ММ левамізол.
Гістологічні зрізи інкубували з мишачим моноклональним антитілом до ЕСБ-К (1:250) протягом ночі при температурі 42С, після чого тричі промивали РВ5 для видалення надлишку основного антитіла. Після цього клітини інкубували з біотинільованим конячим антимишачим імуноглобуліном |(компанія Месіог І арогайгієв,
Випіпдате, штат Каліфорнія в розведенні 1:200 протягом год при кімнатній температурі. Візуалізацію зв'язаних антитіл здійснювали за стандартними протоколами методу з використанням комплексу авідин-біотин-лужна фосфатаза Інабір АВС, компанія Месіог І арогайогіез, Вигіпдате, штат Каліфорнія).
Зонди. Експресію МРНК ЕСБ-К визначали за допомогою лінеаризованого рТКІ-ЕСЕ-К-МРНК-зонда людини (компанія Атбіоп, А!йвіїп, штат Техас). До складу цього зонда входить ЗбОп.н. фрагмент кКДНК людського гена
ЕСЕ-К, який стягує екзони 12-14. Експресію гена МОС5 визначали за допомогою людського зонда МОС5БАС, до 7/0 складу якого входить 298п.н. фрагмент КДНК людського гена МОС5БАС (люб'язно наданий доктором Карол
Басбаум (Саго! Вазрацйт)).
Назерн-блотинг. Загальну РНК екстрагували з клітин МСІ-Н292, вирощених в матраці Т-75 для культивування тканинних культур, за допомогою реактиву Тті-Кеадепі (компанія Моіесціаг Кезеагсп Сіг, СіпсіппаїйїіЇ, штат
Огайо) в будь-якому стані. Загальну РНК (1Омкг) піддавали електрофорезу на 195 агарозно/формальдегідному 75 Гелі і за допомогою гібридизації шляхом пасивної дифузії в капілярах переносили на нейлонову мембрану (компанія Атегейат, Агіпоюп Неїднів, штат Іллінойс). Отримані зонди мітили за допомогою ЗР, використовуючи набір Капдот Ргітей ОМА Іабеїїпо Кії (компанія Воейгіпдег Мапппеїт Согр., Іпаіапароїїз, штат Індіана). Блоти піддавали попередній гібридизації при температурі 422С протягом 4 год з подальшою гібридизацією при температурі 422С протягом 16бгод з ЗР-міченим специфічним кКДНК зондом. До складу гібридизаційного розчину входив 250мМ Трис-буфер НСТ1 (рН 7,5), 595 додецилсульфат натрію, 195 сироватковий альбумін великої рогатої худоби (ВЗА), 190 полівінілпіролідон, 195 фікол і 0,595 пірофосфат натрію. Після гібридизації зазначені мембрани двічі промивали 2х55С (цитрат Ма-Масі) з 0,195 додецилсульфату натрію протягом ЗОхв при кімнатній температурі, потім двічі промивали 2х552 (цитрат Ман-Масі) з 0,196 додецилсульфату натрію протягом ЗОхв при температурі 5092 і прополіскували ЇХЗ5С з 0,195 додецилсульфату натрію. Мембрани експонували на СМ рентгенівську плівку. о
Дослідження іп мімо. Протокол проведення експериментів на тваринах був схвалений Комітетом по проведенню досліджень на тваринах (Соттійее оп Апіта! Кезеагсп) Каліфорнійського університету,
Сан-Францисько. Спеціальних апатогенних пацюків-самців лінії Е344 Різвпег масою 230-250г (компанія бітопзеп
І арогаюгіез, Сігоу, штат Каліфорнія утримували в приміщенні з контрольованою температурою (21254) з с вільним доступом до стандартного лабораторного корму і води. с
Здорові пацюки. Пацюків анестезували метогекситалом натрію (бревітал натрію, 5БОмг/кг, внутрішньоочеревинно; компанія Еїї Шу «Со., Іпаіапароїїв, штат Індіана) при спонтанному диханні. Для - визначення, чи активує ТМЕ-а ЕСБ-К в дихальних шляхах, ТМЕ-а (200Онг, 100мкл) вводили малими дозами в со трахею і тварин забивали через 24 год. Для перевірки, чи індукувалися келихоподібні клітини в епітелії дихальних шляхів за допомогою ЕСЕ або ТМЕ-А, ЕСЕ (600 нг, 100 мкг) або ТОБ-А (синтетичний пацючий ТОБ-А, ї- 250 нг, 100 мкл; компанія Зідта, 51. І оці, штат Міссурі) вводили малими дозами в трахею самостійно або через 24 год після введення ТМЕ-А (20Онг, 100мкл) малими дозами, і тварин забивали через 48 год. При проведенні кожного експеримент в трахею як контроль малими дозами вводили стерильний РВ5 (100 мкг). Для « підтвердження того, що продукування муцину було викликане активацією ЕСЕ-К, нами був перевірений вплив інгібітору тирозинкінази ЕСЕ-К, ВІВХ 1522 (доза визначалася за результатами досліджень з використанням но) с зазначеного інгібітору для запобігання зростання ракової пухлини). Пацюків заздалегідь обробляли ВІВХ 1522 "» (Змг/кг, 1Омг/кг або ЗОмг/кг, внутрішньоочеревинно) за год до і через24 год після введення ТОРЕ-А. Трахеї і " легені видаляли для перевірки через 48год після введення ТОБ-А.
Сенсибілізация. Пацюків сенсибілізували на О день і 10 день за допомогою внутрішньоочеревинного уприскування овальбуміну (10мг, М клас чистоти, компанія Зідта, 5. Гоців, штат Міссурі) в комплексі зі 100мг це. гідроксиду алюмінію в О,5мл стерильного фізіологічного розчину. Після цього пацюки знаходилися у спокої г) протягом 10 днів. На 20 день овальбумін вводили безпосередньо в трахею; тварин тричі (20 день, 22 день і 24 день) провокували (інтратрахеальна інстиляція) 10О0мкл 0,196 розчину овальбуміну в фізіологічному розчині. це. Пацюків забивали або без постановки провокаційної проби (20 день), або через 48 год після постановки третьої ко 20 провокаційної проби (26 день). Наслідком цієї процедури з'явилася метаплазія келихоподібних клітин. Для блокування гіперплазії келихоподібних клітин, сенсибілізованих пацюків заздалегідь обробляли інгібітором їз тирозинкінази ЕСЕ-К, ВІВХ 1522. У дні овальбумінової провокаційної проби (20 день, 22 день і 24 день) сенсибілізованих пацюків заздалегідь обробляли ВІВХ 1522 (1Омг/кг, внутрішньоочеревинно, за год до постановки провокаційної проби), після чого ВІВХ 1522 знову вводили малими дозами в трахею разом з 22 овальбуміном (ВІВХ 1522, 10-5 М, 100мкл). Крім того, ВІВХ 1522 впорскували пацюкам внутрішньоочеревинно
Ф! через кожні 24год до дня забою тварин. Після того як тварини були забиті, трахеї видаляли через 48год після третьої провокаційної проби. о Підготовка тканин. У заздалегідь визначені моменти часу в процесі анестезування здійснювали перфузію системи кровообігу 1956 розчином параформальдегіду в РВ5, обробленому діетилпірокарбонатом (ОЕРС) при 60 тискові 120мм рт.ст. Після цього трахею видаляли і витримували в 495 розчині параформальдегіду протягом 24год. Після завершення фіксування трахеї і легені заливали 8-4 плюс мономерним розчином А для аналізу клітин або складом О.С.Т. (компанія Закига РіпеФек Ш.5.А., Іпс., Тоггапсе, штат Каліфорнія| для проведення імуногістохімічних досліджень і для гібридизації іп зйи. З залитих тканин отримували поперечні гістологічні зрізи (товщиною 4мм) і вміщували їх на предметне скло. бо Аналіз клітин. Ми робили підрахунок загальної кількості епітеліальних клітин шляхом підрахунку ядер епітеліальних клітин на 2мм власної пластинки слизової оболонки за допомогою імерсійних об'єктивів (1000х збільшення). Лінійну довжину власної пластинки слизової оболонки під кожною ділянкою епітелію, яка піддавалася аналізу, визначали за допомогою запису контура оцифрованого зображення власної пластинки слизової оболонки. Після інстиляції стимулювальних агентів виникають келихоподібні "клітини, що проявляються". Ці клітини мають АВ/РАЗ-позитивні гранули, однак розмір гранул невеликий і кількість цитоплазматичних гранул незначне. Ми називаємо ці келихоподібні "клітини, які проявляються" "клітинами-попередниками келихоподібних клітин", ця стадія передує перетворенню зазначених клітин в зрілі келихоподібні клітини. Келихоподібні клітини високі, кубоїдні мають форму від келихоподібної до 7/0 низькостовпчастої і включають велику кількість АВ/РА5-пофарбованих гранул, що заповнюють велику частину цитоплазми між ядром і поверхнею порожнини. Клітини-попередники келихоподібних клітин визначаються як клітини з меншою площею пофарбованого слизу (« 1/3 висоти в епітелії від базальної мембрани до поверхні просвіту) або з розсіяними і злегка АВ/РА5З-пофарбований гранулами невеликого розміру. Війчасті епітеліальні клітини розпізнаються по їхніх війчастих краях, злегка пофарбованій цитоплазмі і великим круглим ядрам. 7/5 Негранульовані секреторні клітини мають стовпчасту форму і протягаються від просвіту до власної пластинки слизової оболонки. Цитоплазма фарбується в ясно-рожевий колір і в ній спостерігається декілька крихітних
РАЗ-позитивних і АВ-негативних гранул. Базальні клітини являють собою невеликі сплощені клітини з великими ядрами, розташовані безпосередньо над власною пластинкою слизової оболонки, але так, що не досягають просвіту дихальних шляхів.
Кількісне визначення продукованих келихоподібних клітин. Продукування келихоподібних клітин визначали по об'ємній щільності пофарбованих алціаном блакитним/РА5З слизових субстанцій на слизовій поверхні епітелію, використовуючи напівавтоматичну систему відображення, опис якої був приведений в літературних джерелах
ІВебер (Ухебег) і інші, (1984), Зсіепсе, 224:294-297)|. Ми вимірювали площу, позитивно пофарбовану алціаном блакитним/РАЗ, і загальну площу епітелію, і виражали отримані дані у вигляді відсотка від загальної площі, сч забарвленої алціаном блакитним/РА5. Аналіз проводили за допомогою програми Ітаде Національного інституту здоров'я, яка знаходиться в державній власності США (розробленої в Національному інституті здоров'я США і і) загальнодоступної з мережі Інтернет за протоколом ЕТР за адресою 7ірру.піти.доу. або на гнучкому диску від компанії Майопаї! Тесппіса! Іптогтайоп Зегмісе, Зргіпоїеїд, штат Віргінія, шифр компонента РВ95-5001950ЕЇ1).
Імуногістохімічна локалізація ЕСБ-К в епітелії пацюків. Локалізацію ЕСБЕ-К перевіряли за допомогою с
Зо імуногістохімічного забарвлення антитілом до ЕСЕ-К |компанія СаІріоспет, Зап Оіведо, штат Каліфорнія) на заморожених гістологічних зрізах трахеї пацюків. Після перфузії 195 розчином параформальдегіду в РВ5, с тканини витримували в 495 розчині параформальдегіду в РВЗ протягом год, після чого вміщували в 3095 розчин р сахарози для кріозахисту протягом ночі. Трахеї заливали складом О.С.Т. (компанія ЗзакКига РіпеФек О.5.А., Іпс.,
Тотапсе, штат Каліфорнія) і заморожували. Заморожені гістологічні зрізи (б5мкм) розрізали і вміщували на ме)
Зв скляне предметне скло (компанія Зирептгові Рів, Рівпег сіепійіс, Рійеригуй, штат Пенсільванія). ї-
Імунологічне забарвлення здійснювали так само, як і при проведенні досліджень іп міїго.
Отримання зондів. КДНК для МОС5 пацюків була люб'язно надана доктором Карол Басбаум (Саго! Вазраийт). 320п.н. фрагмент КДНК МОС5 пацюків субклонували в сайті Хбра/піпа!!! зазначеного транскрипційного вектора, рВіпезстірі-ЗК(-) (компанія Зігаїадепе, Іа доПа, штат Каліфорнія). Для отримання РНК-зондів для гібридизації « п вйи цю рекомбінантну плазміду, до складу якої входив фрагмент КДНК МОС5 пацюків, переводили в лінійну пу) с форму і транскрибували іп міїго з Т7 або ТЗ полімеразою для отримання антисмислового або смислового зонда, ц відповідно. Зазначені зонди для гібридизації іп віш отримували в присутності І8)0ТР (уридин-5'-трифосфат). "» Після транскрибування кКДНК матрицю розщеплювали за допомогою дезоксирибонуклеази, мічену радіоактивним ізотопом РНК очищали на колонці Зерпадех 5-25 Оціск ЗріпТМ (компанія Военйгіпдег МаппПеїт, Іпаіапароїз, штат Індіана) і осаджували в розчині етанолу/ацетату амонію. Перед використанням РНК-зонди промивали 7090 -І етанолом і розбавляли в 10мММ ОТТ (дитіотреїтол).
Гібридизація іп зйи. Заморожені гістологічні зрізи (ЗХмкм) розрізали і вміщували на позитивно заряджене о скляне предметне скло (компанія Зирепгові Рів, Різпег Зсіепійіс, Рійеригуй, штат Пенсільванія). -І Гістологічні зрізи, нарізані в безпосередній взаємній близькості, використовували для гібридизації зі смисловими і антисмисловими зондами. Гістологічні зрізи, що чергуються, використовувалися для забарвлення о алціаном блакитним/РА5. Зразки повторно фіксували в 495 розчині параформальдегіду, регідратували в
Кз 0,5х555, після чого ацетилювали в триетаноламіні за допомогою оцтового ангідриду. Гібридизацію здійснювали з 2500-3000імп/мкл антисмислового або смислового зонда в суміші, яка включала 5095 розчин деіонізованого формаміду, 0,3М Масі, 20МмМ Трисбуфера, 5мМ етилендіамінтрифтороцтової кислоти (ЕОТА), Тхрозчин Денхардта, 20мММ дитіотреїтолу, 10956 розчин сульфату декстрану, О,5мг/мл дріжджової тРНК і 0О,5мг/мл оброблених ультразвуком ДНК молок лососевих при температурі 559С протягом ночі. Постгібридизаційна
ІФ) обробка включала промивки 2х55С, 1мММ етилендіамінтрифтороцтової кислоти, 10ММ В-меркаптоетанолу при ко кімнатній температурі, інкубування з розчином рибонуклеази (2Омг/мл) протягом ЗОхв при кімнатній температурі, і додаткові промивки в 0,1х55С, 1мММ етилендіамінтрифтороцтової кислоти, 10ММ В-меркаптоетанолу при 60 температурі 552С протягом 2год, потім в 0,5х55С при кімнатній температурі. Зразки дегідратували, сушили на повітрі і покривали ядерною фотоемульсією Кодак МВТ (компанія Еавітап Кодак, Коспевівг, штат Нью-Йорк) для авторадіографії. Після експонування протягом 7-21 днів при температурі 4 «С слайди проявляли, закріпляли і піддавали контрастному фарбуванню гематоксиліном (21).
Статистика. Всі дані виражені у вигляді середнього значення нсередня квадратична помилка середнього. Для 65 визначення статистично значущих різниць між групами вдавалися до однофакторного дисперсійного аналізу.
Після визначення статистичної значущості в дисперсійному аналізі, для коректування на множинність порівнянь використали Е-критерій Шеффа (Зспепе). Імовірність менш ніж 0,05 для основної гіпотези приймалася як свідчення статистично значущої різниці.
Результати.
ТМЕ-А стимулює продукування ЕСК-К в клітинах МСІ-Н292. Спочатку ми визначили, чи експресують клітини
МСІ-Н292 ЕСБ-К конституціонально. Аналіз імуноблотів методом вестерн-блотингу дозволив визначити присутність ЕСЕ-К білка в культурах клітин МСІ-Н292, які злилися, (Фіг. ТА, праворуч). Клітини перевірялися після початку злиття. Лізати піддавалися електрофорезу в 895 акриламідних гелях і блотували анти-ЕСБ-К антитілом. Молекулярні маси маркерних білків приведена з правого боку. Як позитивний контроль ЕСБ-К 7/0 використали білок клітин А431 (Фіг. 1А, зліва), який експресує ЕСБ-К конституціонально (Вебер (УМебег) і інші, дивись вище). Імуноцитохімічні дослідження з анти-ЕСЕ-К антитілом виявили позитивне забарвлення, що було надто несподівано у клітин, які діляться (Фіг. ЇВ, Імуноцитохімічний аналіз культур клітин МСІ-Н292 за допомогою анти-ЕСБЕ-К антитіла). При злитті спостерігалося позитивне забарвлення, найбільш сильно виражене у клітин, які діляться (стрілки, права сторона). При відсутності головного антитіла забарвлення було 7/5 Відсутнім (ліва сторона). Назерн-блотинг показав, що ТМЕ-А (20 нг/мл) активував експресію гена ЕСЕ-К, ефект, який був присутнім в 12год і зростав в 24год (Фіг1С, Назерн-блотинг ЕСБ-К в клітинах МСІ-Н292). Аналізу піддавали загальну РНК, екстраговану з культур, які злилися, інкубованих з ТМЕ-А (2Онг/мкл) протягом 12год або 24год. Отриману РНК піддавали електрофорезу на формальдегід-агарозному гелі, переносили на найлонову мембрану і гібридизували з З"Р-міченим ЕСБЕ-В. кКДНК-зондом. Після гібридизації зазначену мембрану промивали 2о і авторадіографували.
Ліганди ЕСР-К стимулюють експресію слизових глікокон'югатів і експресію гена МИОС5 в клітинах
МСІ-Н292. ЕСБ-К експресуються в клітинах МСІ-Н292 конституціонально, тому ми оцінювали здатність лігандів
ЕСЕ-К (ЕСЕ, ТОБ-А) індукувати продукування слизових глікокон'югатів (Фіг.2, верхня колонка, забарвлення клітин МСІ-Н292 алціаном блакитним/РАЗ для ідентифікації муцинових глікопротеїнів). Верхня Га Колонка:інкубування клітин без інгібітору; нижня колонка:інкубування в присутності інгібітору тирозинкінази
ЕСЕ-К ВІВХ 1522 (10мкг/мл). У випадку, коли клітини інкубувались самостійно (контроль), спостерігалося певне і9)
РА5-позитивне забарвлення (стрілки, верхня колонка); інкубування тільки з ТМЕ-А (2Онг/мл) не впливало на забарвлення; інкубування з ЕСЕ (25нг/мл) або з ТОБ-А (25нг/мл) посилювало РА5-позитивне забарвлення (стрілки); інкубування з ТМЕ-А плюс ТОРБ-А значно посилювало забарвлення (стрілка, верхня колонка). Ге
Спостерігалося забарвлення деяких контрольних клітин; інкубування тільки з ТМЕ-А (2Онг/мл) не впливало на забарвлення; інкубування з ЕСЕ або з ТОБР-А (кожного по 25нг/мл) посилювало РА5-позитивне забарвлення с (стрілки); інкубування з ТМЕ-А плюс ТОБЕ-А посилювало забарвлення в значно більшій мірі, ніж кожним з лігандів рч- поодинці. Таким чином, ліганди ЕСЕБ-К індукують слизові глікокон'югати в клітинах МСІ-Н292.
Для перевірки експресії гена МОС5 здійснювали назерн-блотинг (Фіг.3). Загальну РНК (1Омкг) екстрагували о із зазначених клітин, піддавали електрофорезу на формальдегід-агарозному гелі, переносили на найлонову мембрану і гібридизували з ЗгР-міченим МОС5 кКДНК-зондом. Після гібридизації зазначену мембрану промивали і авторадіографували. Культури були отримані тільки з живильним середовищем (С); визначали вплив ЕСЕ або
ТОР-А (25нг/мл), ТМЕ-А (2Онг/мл) або комбінації ТМЕ- А плюс ЕСЕ або ТОБЕ- А протягом 12 год (верхня колонка) « або 24год (нижня колонка) на експресію гена МОС5. Були також отримані культури з ТМЕ-А плюс ЕСЕ або ТОБ-А після попереднього інкубування з інгібітором тирозинкінази ЕСБ-К (ВІВХ 1522; 10 мкг/мл; нижня колонка); - с зазначений інгібітор запобігав експресії гена МОС5. а Клітини МСІ-Н292 продемонстрували деяку експресію в контрольному стані (Фіг.3, нижня ліва колонка); у "» випадку, коли зазначені клітини інкубувались з ЕСЕ або ТОР-А, експресія гена МОС5 ледве розпізнавалася в 12год, однак була чітко виражена в 24год. ТМЕ-А самостійно не впливав на експресію гена МОС5, однак, при додаванні ТМЕ-А до клітин, які інкубувалися з лігандами ЕСЕ-К, експресія гена МОС5 явно посилилася, -і перевищивши рівень, який викликався тільки лігандом ЕСБ-К (Фіг.3). с Інгібітор тирозинкінази ЕСБ-К (ВІВХ 1522) запобігає експресії слизових глікокон'югатів і експресії гена
МИиИС5 в клітинах МСІ-Н292. Для перевірки гіпотези, суть якої полягала в тому, що активація рецепторів ЕСБ-К -і індукує експресію гена МИС5, клітини інкубували з інгібітором тирозинкінази ЕСЕ-К ВІВХ 1522. У разі т 50 попередньої обробки клітин МСІ-Н292 ВІВХ 1522 (10мкг/мл), РА5б-позитивне забарвлення інгібувалось в контрольному стані, а підвищене забарвлення, яке відбувалося з лігандами ЕСЕ-К, інгібувалося значною мірою що) (Фіг.2, нижня колонка). У випадку назерн-блотингу експресія гена МОС5, яка була значно підвищена комбінацією
ТМЕ-а плюс ЕСЕ або плюс ТОР-А, повністю інгібувалася у разі попереднього інкубування з ВІВХ 1522 (Фіг.З, нижня колонка). Ці результати свідчать про причетність активації ЕСЕБ-К до індукції муцинового гена і слизових глікопротеїнів в клітинах МСІ-Н292.
ТМЕ-А стимулює продукування ЕСБ-К у пацюків. Дослідженню піддавали апатогенних пацюків (які о конституціонально мали незначну кількість келихоподібних клітин в епітелії дихальних шляхів), починаючи з іме) ролі ТМЕ-А. У контрольному стані епітелій трахей мав незначну кількість ЕСЕ-К-позитивних клітин (Фіг.4А, зліва). Однак інтратрахеальна інстиляція ТМЕ-А (200нг) індукувала ЕСЕ-К білок у клітин різних типів в 60 епітелії трахей (Фіг.АА, праворуч). ЕСЕ-К-позитивне забарвлення спостерігалося у келихоподібних клітин (5), клітин-попередників келихоподібних клітин (Р-5), негранульованих секреторних клітин (5) і у базальних клітин (Ва), однак був відсутній у війчастих епітеліальних клітин. Таким чином, ТМЕ-А індукує продукування ЕСЕ-К білка.
Роль лігандів ЕСР-К в продукуванні слизових глікокон'югатів і експресії гена МИОС5 у пацюків. У 65 контрольному стані в епітелії трахеї знаходилася незначна : кількість келихоподібних клітин і клітин-попередників келихоподібних клітин. Інтратрахеальна інстиляція лігандів ЕСЕ-К, ЕСЕ (бООнг; не показане) або тільки ТОБ-А (25О0нг; Таблиця 1), не впливала на продукування епітелієм слизових глікокон'югатів. Однак в тому випадку, коли першим вводився ТМЕ-А (20Онг), з наступним введенням через 24год ЕСЕ або ТОБ-А (Таблиця 1), і тварин забивали через 48год, забарвлення алціаном блакитним/РАЗ значно посилювалося і кількість келихоподібних клітин і клітин- попередників келихоподібних клітин значно зростала без зміни загальної кількості клітин або кількості війчастих епітеліальних клітин (Таблиця 1). При гібридизації іп зйи експресії гена МОС5 у контрольних тварин не спостерігалося. При інтратрахеальній інстиляції ТМЕ-А з подальшим введенням ЕСЕ або ТОБ-А в епітелії спостерігалася експресія
МИС. Таким чином, тільки індукування ЕСБ-К або тільки стимуляція лігандами ЕСЕ-К була недостатньою для 70 індукування метаплазії келихоподібних клітин або для продукування слизових глікокон'югатів. Однак після індукування ЕСБ-К за допомогою ТМЕ- А, інстиляція лігандів ЕСЕ-К викликала істотну стимуляцію метаплазії келихоподібних клітин. й /ЛОБ-А |внутрішньо-очеревинно
Клітини-попередники келихоподібних 7,8--1,3 /12,8--1,6|44,8--3,6" 13,8--1,4 36,0--6,37 доз пою Та ВАННЮ ВМ ; клІТИНИ 2 о 2,2 3,3 с
Таблиця 1. Вплив медіаторів і сенсибілізації овальбуміном на епітеліальні с клітини трахеї у пацюків. Клітини аналізували, як описано в розділі Методи; п'ять пацюків на групу. При визначенні властивостей вдавалися до забарвлення алціаном блакитним (АВУРАБЗ (останнє поєднання ї- забарвлює слизові глікокон'югати). У доповнення до підрахунку клітин, визначали процент АВ/РА5З-забарвленої с площі від загальної площі епітелію. У контрольних дихальних шляхах і дихальних шляхах, стимульованих тільки
Зо ТОБ-А (250нг), знаходилася невелика кількість келихоподібних клітин і клітин-попередників келихоподібних в. клітин; спостерігалося незначне забарвлення АВ/РАБ5. Результатом введення ТМЕ-А (200нг) з подальшим введенням ТОРБ-А з'явилася підвищена кількість келихоподібних клітин і клітин-попередників келихоподібних клітин, а також збільшення площі, зайнятої АВ/РАБЗ-забарвленими клітинами. Сенсибілізація пацюків « овальбуміном (ОМА) внутрішньоочеревинно (ір) не впливала ні на розподіл клітин, ні на АВ/РА5З-забарвлення, однак, в тому випадку, коли спочатку ОМА вводили внутрішньоочеревинно, а потім здійснювали інтратрахеальну З с інстиляцію, спостерігалося вельми інтенсивне зростання кількості келихоподібних клітин і клітин-попередників "» келихоподібних клітин, а також різке збільшення АВ/РА5-забарвленої площі (905). " Сенсибилизация пацюків овальбуміном індукує ЕСЕ-К і продукування келихоподібних клітин. Оскільки, як повідомляється, смерть від гострого астматичного нападу наступає внаслідок закупорки дихальних шляхів слизом, модель астми відтворили на апатогенних пацюках. Ін'єкції овальбуміну (10мг, внутрішньоочеревинно) на ш- О день і ТОдень не стимулювали гіперплазії келихоподібних клітин (Таблиця 1). Однак у випадку, коли за цим
Га слідували три інтратрахеальні інстиляції овальбуміну (0,195 в 10Омкл) на 20 день, 22 день і 24 день і тварин забивали на 26 день, кількість келихоподібних клітин і клітин-попередників келихоподібних клітин була значно
Ш- збільшена; кількість війчастих епітеліальних клітин і базальних клітин залишилася незмінною (Таблиця 1, права ко 20 сторона). Імуногістохімічні дослідження з анти-ЕСЕ-К антитілом продемонстрували відсутність забарвлення в контрольних трахеях. У тварин, сенсибілізованих як внутрішньоочеревинно, так і інтратрахеально, г» спостерігалося вибіркове забарвлення ЕСЕ-К (Фіг.4В8, зліва) в клітинах, які позитивно забарвлювалися АВ/РА5 (Фіг.48,, праворуч). Після трьох інтратрахеальних інстиляцій овальбуміну (0,195, 100мл) імунореактивність ЕСБ-К була сильно вираженою у келихоподібних клітин і у клітин-попередників келихоподібних клітин (внизу зліва), 22 тобто у тих же самих клітин, які позитивно забарвлювалися алціаном блакитним/РАЗ (внизу праворуч). Таким
ГФ) чином, овальбумінова модель астми продемонструвала проліферацію келихоподібних клітин в клітинах, які продукували ЕСБ-К. де Інгібітор тирозинкінази ЕСБ-К (ВІВХ1522) запобігає продукування келихоподібних клітин, індукованого інстиляцією ТМЕ-А плюс ліганди ЕСБ-К і сенсибілізацією овальбуміном у пацюків. Оскільки ВІВХ 1522 запобігав 60 продукування муцину культивованими клітинами, вплив цього інгібітору досліджували на апатогенних пацюках.
Забарвлення алціаном блакитним/РА5, яке посилювалося інтратрахеальною інстиляцією ТМЕ-А з подальшим введенням ліганду ЕСР-К ТОБ-А, інгібувалося дозозалежним чином у разі попередньої обробки ВІВХ 1522 (3-ЗОмг/кг, внутрішньоочеревинно; Фіг.5А). Наслідком інтратрахеальної інстиляції ТМЕ-А (для індукування
ЕСЕ-К) і подальшого введення ліганду ЕСЕ-К ТОР-А з'явилася вельми інтенсивна металлазія келихоподібних бо клітин.
У пацюків, сенсибілізованих овальбуміном, попередня обробка ВІВХ 1522 (1Омг/кг, внутрішньоочеревинно) повністю інгібувала продукування келихоподібних клітин (оцінювалося по забарвленню алціаном блакитним/РАБ5; Фіг.58). У тварин, яким овальбумін вводили внутрішньоочеревинно, спостерігалося незначне
АВ/РА5З-позитивне забарвлення бронхіального епітелію. У тварин, спочатку сенсибілізованих ОМА внутрішньоочеревинно, з трьома подальшими інтратрахеальними інстиляціями ОМА, спостерігалося явно виражене посилення АВ/РАз-позитивного забарвлення.
Результати цих досліджень показують, що ЕСБЕ-К, будучи стимульованим лігандами ЕСБ-К, індукує продукування келихоподібних клітин іп міо і іп мімо. виконуване завдяки активації ЕСЕ-К, яке блокувалося 70 інгібітором тирозинкінази ЕСР-К. На овальбуміновій моделі астми зазначений інгібітор також ефективно запобігав продукування келихоподібних клітин.
Нарівні з описом механізму індукування келихоподібних клітин, отримані результати дозволяють запропонувати можливу послідовність розвитку продукування келихоподібних клітин, виходячи з експресії
ЕСЕ-К: Стимуляція ТМЕ-А спричиняє інтенсивне забарвлення негранульованих секреторних клітин; їх подальша /5 активація лігандами ЕСР-К спричиняє прогресуюче забарвлення слизових глікокон'югатів в цитоплазмі і зазначені клітини перетворюються в "клітини-попередники келихоподібних клітин", а потім в "келихоподібні клітини". Інстиляція ТМЕ-а з подальшим введенням лігандів ЕСЕ-К індукує продукування келихоподібних клітин, не змінюючи загальної кількості епітеліальних клітин, що дозволяє припустити, що активація ЕСЕ-К стимулювала вибірну диференціацію клітин (не проліферацію). Отримані дані дозволяють зробити припущення, що келихоподібні клітини утворюються з негранульованих секреторних клітин, які експресують ЕСЕ-К і стимулюються лігандами ЕСЕ-К до продукування муцину.
У пацієнтів, які померли від гострого астматичного нападу, важливими показниками є гіперплазія келихоподібних клітин і закупорка слизом. У пацючій моделі астми сенсибілізація дихальних шляхів відбувається після повторної інстиляції овальбуміну, наслідком чого є явно виражена гіперплазія келихоподібних клітин сч об дихальних шляхів. Ми показали, що ЕСБЕ-К, який не експресується в епітелії дихальних шляхів контрольних тварин, експресується у сенсибілізованих тварин. Клітини, які забарвлювалися, були клітинами-попередниками і) келихоподібних клітин і келихоподібними клітинами, що дозволяє припустити, що ЕСЕ-К був залучений до продукування келихоподібних клітин. Попереднє оброблення інгібітором тирозинкінази ЕСР-К (ВІВХ 1522) запобігало продукування келихоподібних клітин в дихальних шляхах, підтверджуючи роль активації ЕСБЕ-К в с зо продукуванні келихоподібних клітин при експериментальній астмі.
Отримані результати вказують на причетність каскаду реакцій ЕСБЕ-К до гіперплазії келихоподібних клітин. с
Результати раніше проведених досліджень показали, що різні стимулювальні агенти, наприклад, озон, діоксид М сірки, віруси, ліпополісахариди, фактор активації тромбоцитів і інтерлейкін-4, активують експресію і секрецію муцину. Цей винахід надає механізм оцінювання взаємозв'язку цих запальних стимулювальних агентів і системи ме) з5 ЕСЕ-В. ча
Астма використовується як приклад терапевтичної стратегії, відповідної цьому винаходу: в нормальному епітелії людських дихальних шляхів на кожну келихоподібну клітину доводиться 3-10 війчастих епітеліальних клітин. При астмі кількість келихоподібних клітин може дорівнівати або перевершувати кількість війчастих епітеліальних клітин; у пацієнтів, які померли в зіай5 азіптаїйсив, спостерігалося ЗО-кратне збільшення площі « (95), зайнятої келихоподібними клітинами, в порівнянні з відповідним показником у пацієнтів, які померли від з с неастматичних респіраторних захворювань. Інгібування продукування келихоподібних клітин повинно ліквідувати це джерело гіперсекреції. Оскільки життєвий цикл келихоподібних клітин невідомий, час усунення гіперплазії ;» келихоподібних клітин за допомогою лікування точно спрогнозований бути не може. При відсутності додаткового впливу алергену, гіперплазія келихоподібних клітин у раніше сенсибілізованих мишей усувалася протягом п'яти днів, нарівні з іншими проявами алергічного запалення. Інгібування активації ЕСБ-К може інгібувати -І гіперплазію келихоподібних клітин набагато швидше, в залежності від тривалості життя келихоподібних клітин.
Нещодавно повідомили об високовибірних АТФ-конкурентних інгібіторах тирозинкінази. Інгібітори тирозинкінази о ЕСЕ-К оцінювалися для лікування злоякісних пухлин, пов'язаних з експресією ЕСБ-К. -І Гіперсекреція є основним симптомом багатьох хронічних запальних захворювань дихальних шляхів. У цей час не існує ефективних лікарських засобів для полегшення симптомів і припинення прогресування цих ю захворювань. Отримані дані надають механізм і стратегію лікування: продукування келихоподібних клітин
Ге запобігається за допомогою інгібування активації ЕСБ-К. Інгібітори активації ЕСР-К пропонуються як лікарський засіб при гіперсекреторних захворюваннях дихальних шляхів.
Приклад 2. Роль оксидаційного стресу в продукуванні келихоподібних клітин 5Б Як вважають, тривале куріння сигарет у людей пов'язане з прогресуючими патологічними змінами периферичних дихальних шляхів, включаючи гіперплазію келихоподібних клітин. Подібним же чином, як було
Ф) показано, експериментальні моделі куріння сигарет викликають у тварин гіперплазію келихоподібних клітин в ка дихальних шляхах. Однак механізм, за допомогою якого сигаретний дим може індукувати синтез муцину, є невідомим. Приведені далі дані демонструють, що передзапальні цитокінактивовані нейтрофіли і сигаретний дим бо Викликають синтез муцину МОСЗАС в епітеліальних клітинах бронхів людини через посередництво ліганднезалежного активування ЕСБЕ-К. Ці результати мають на увазі рекрутовані нейтрофіли і сигаретний дим як регулювальників диференціації епітеліальних клітин, наслідком якої може бути патологічна індукція муцинпродукуючих клітин в дихальних шляхах.
Методи. 65 Виділення нейтрофілів. Нейтрофіли людини очищали з периферичної крові, отриманої від здорових донорів-людей. Виділення нейтрофілів здійснювали у відповідності зі стандартним методом відділення градієнтом фікол-хайпак, осадженням декстраном і гіпотонічним лізисом еритроцитів. За результатами виключаючого забарвлення трипановим синім 29595 клітин були, як правило, життєздатні. Для запобігання забрудненню ендотоксином всі розчини пропускали через 0,1мкм фільтр.
Культура клітин. Клітини МСІ-Н292 (лінія клітин легеневого слизоутворюючого плоскоклітинного раку людини) вирощували в живильному середовищі КРМІ 1640, яке включає 1095 сироватки ембріону великої рогатої худоби, пеніцилін (100Од/мл), стрептоміцин (1О0Омкг/мл) і Гепес-буфер (25мММ), при температурі 372С в 595
СО.-інкубаторі з водяною сорочкою. Для культивування клітин використали б-луночні культуральні планшети або 8-камерне предметне скло. При досягненні стадії злиття клітини інкубували протягом 1 год тільки з 7/0 нейтрофілами (106 клітин/мл), тільки з ТМЕ-А (рекомбінантний людський ТМЕ-А, 20 нг/мл, компанія Сепгуте,
Сатргідде, штат Меріленд), тільки з 1ІІ-8 (рекомбінантний людський ІІ -8, 10-8 М, компанія Сепгуте), тільки з
МІ Р (1029М, компанія Зідта, 51. І оців, штат Міссурі), з ТМЕ-А плюс нейтрофіли, І/-8 плюс нейтрофіли, МІ Р плюс нейтрофіли, пероксидом водню (Нь2О»о, 200мкм), розчином сигаретного диму або ТОБ-А (рекомбінантний людський ТОР-А, 0,1-25нг/мл, компанія СаІріоспет, Зап Оіедо, штат Каліфорнія). Після цього зазначені клітини 75 промивали і інкубували тільки зі свіжим живильним середовищем. Експерименти були завершені в заздалегідь визначений час (для мРНК, бгод і 12год; для білка, 24год). Як контроль клітини інкубували тільки з живильним середовищем протягом таких же періодів часу. При проведенні інших досліджень з нейтрофілами ТМЕ-А був обраний як стимулювальний агент, оскільки він має найбільш могутній вплив на синтез МОС5БАС. Клітини
МСІ-Н292 інкубували протягом 1 год або з нейтрофілами, які інкубували з ТМЕ-А (2Онг/мл) протягом 1 год, після чого промивали стерильним РВ5, щоб уникнути забруднення супернатантом (наприклад, молекулами, які були виділені нейтрофілами), або тільки з супернатантом. При проведенні досліджень інгібування інгібіторами тирозинкінази ЕСБ-К, клітини МСІ-Н292 заздалегідь обробляли ВІВХ 1522 (1Омкг/мл, люб'язно наданим компанією Воепйгіпдег ІпдеІйеійт Іпс., ІпдеІйеійт, Німеччина) або тирфостином Ас1478 (1Омкм, компанія
СаїІріоспет) за ЗОхв до додавання стимулювального агента. Досліджували також вплив вибірного інгібітору Ге тирозинкінази отриманого з тромбоцитів рецептора соматотропіну (тирфостин АС1295, 100мкм, компанія о
СаїІріоспет) і негативний контроль для виявлення тирфостинів (тирфостин Ат, 100мкм, компанія СаІБіоспет).
При проведенні досліджень інгібування блокуючими антитілами до лігандів ЕСЕ-К, супернатанти заздалегідь обробляли анти-ТОБР-А антитілом (компанія СаІріоспет) або анти-ЕСЕ антитілом протягом ЗОхв, після чого додавали клітини МСІ-Н292. Роль вільних радикалів кисню досліджували за допомогою акцепторів вільних СМ радикалів кисню ЮМ5О (195, компанія Зідта), 1,3-диметил-2-тіосечовини (ОМТИ, 5ОММ, компанія Зідта) або пероксид-дисмутази (500, З0б0Од/мл, компанія Зідта). с
Отримання розчину сигаретного диму. При проведенні цього дослідження використали експериментальні - сигарети (код 2К1, виготовлені для університету штату Кентуккі компанією Торассо апа Неаїйїй Кезеагсп
Еошпааїйоп). Розчин сигаретного диму отримували відповідно до представленого раніше опису ІДассер (Юиззег) і о інші, (1989), 9. Сііп. Іпмевзі.,, 84:900-906|Ї. Коротко, сигаретний дим втягували в поліпропіленовий шприц їч- (ЗбБмл) з швидкістю 1 клуб тютюнового диму/хв (10 разів) і повільно барботували в 20мл середовища КРМІ 1640, яке включає 50ММ Гепес-буфер. Після цього отриманий розчин диму титрували до рН 7,4 і використовували відразу ж після отримання. «
Візуалізація слизових глікокон'югатів і МОС5БАС білка в клітинах МСІ-Н292. У кінці експериментів, клітини, 70 вирощені на 8-камерному предметному склі, фіксували за допомогою 495 параформальдегіду протягом 1 год, - с після чого або забарвлювали алціаном блакитним/періодною Шиффовою основою (РАБ) для візуалізації ц слизових глікокон'югатів, або використали для імуноцитохімічних досліджень МОС5БАС. Для імуноцитохімічних "» досліджень МОС5АС як розріджувач для антитіла використали РВ5, який містить 0,0595 Твій 20, 2956 нормальну козячу сироватку і левамізол (2мММ). Клітини інкубували з мишачим моноклональним антитілом до МОС5БАС (клон 45 МІ, 1:200, компанія Мео МагкКегв, Егетопі, штат Каліфорнія) протягом год при кімнатній температурі, після - І чого тричі промивали РВЗ для видалення надлишку основного антитіла. Після цього клітини інкубували з біотинільованим кінським антимишачим Ідс |компанія Месіог І арогайогіез Іпс., Вигіпдате, штат Каліфорнія) в о розведенні 1:200 протягом 1 год при кімнатній температурі. Візуалізацію пов'язаного антитіла здійснювали за -І стандартним протоколом для методу з використанням комплексу авідин-біотин-лужна фосфатаза.
Гібридизація іп зйш для отримання людського гена МОС5БАС. 298 п.н. фрагмент кКДНК людського МОС5БАС о вставляли в клонуючий вектор ТА компанія Іпийгодеп, Зап Оіедо, штат Каліфорнія). Отримання РНК-зондів і до) гібридизацію іп зйи здійснювали відповідно до опису, який був приведений раніше.
Імунологічний аналіз МОС5АС бнька. Кількість МОС5АС білка визначали, як описувалося раніше. Коротко, клітинні лізати отримували з РВЗ у вигляді кратного розведення і 5Омкл кожного зразка інкубували з бікарбонат-карбонатним буфером (5Омкл) при температурі 40а9С в 9б-луночному планшеті |Махізогр Мипс, о компанія Різпег Зсіепійіс, Запіа Сіага, штат Каліфорнія до висихання. Планшети тричі промивали РВ:5 і блокували 295 ВЗА (фракція М, компанія Зідта) протягом 1год при кімнатній температурі. Після цього планшети іме) знову тричі промивали РВ5, після чого інкубували з ХоОмкл мишачого моноклонального МОС5АС антитіла (1:100), яке було розбавлене РВ5, який включав 0,0595 Твін 20. Через 1год лунки тричі промивали РВ5 і в кожну з них 60 вносили кон'югат пероксидази хріну-козячого антимишачого дос (1:10000, компанія 5ідта). Через 1год планшети тричі промивали РВ5. Кольорову реакцію виявляли за допомогою розчину пероксидази ТМВ (компанія
Кігєккедаага «Регту І арогайгіев, Сайпегериго, штат Меріленд| і зупиняли за допомогою 2М Н25О4. Оптичну густину визначали при 45Онм.
Кількісний аналіз ТОвР-а білка. Кількість ТОЕ-А білка визначали за допомогою комерційно доступного набору 65 для проведення твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІЗА) (компанія Зідта) відповідно до інструкцій виготівника. Супернатант, отриманий після інкубування нейтрофілів плюс ТМЕ-А (2Онг/мл) протягом год,
змішували з лізисним буфером РВ5, який містив 195 Тритон Х-100, 195 деоксихолату натрію і декілька інгібіторів протеаз, (Сотрієїе Міпі, компанія Воепгіпдег Маппіеїт, Німеччина), після чого використовували для визначення кількості ТОБ-А.
Імунопреципітація для отримання ЕСРБ-К білка і імуноблотинг для фосфорилювання тирозину. Клітини вирощували на мінімальному середовищі протягом 24 год, після чого стимулювали ТОБ-А, Н 505 або супернатантом активованих нейтрофілів протягом 15хв. Після стимулювання клітини лізували і інкубували протягом ЗОхв в ротаційному шейкері при температурі 49С. Для видалення нерозчинного матеріалу клітинні лізати центрифугували при 14000об/хв протягом 5 хв при температурі 42С. Аліквоти супернатантів, які містять 70 рівні кількості білка, імунопреципітували з анти-ЕСОБ-К антитілом (поліклональне, АБ4, компанія СаІріоспет) і 20мкл білка А-агарози (Запіа Сги7) протягом 2 год при температурі 42С. Преципітати тричі промивали 0О,б5мл лізисного буферу, суспендували в буфері для зразка з додецилсульфатом натрію (505) і кип'ятили протягом 5хв. Білки відділялли 5О5-РАСЕ в 8,095 акриламідному гелі. Отриманий гель врівноважували в гібридизаційному буфері: 25мММ трис-С1, 192мМ гліцин, 2095 (в об'ємному відношенні) метанол, рН 8,3. Після цього білки 75 переносили за допомогою електрофорезу на нітроцелюлозні мембрани (0,22мкм), блокували 595 знятим знежиреним молоком в РВ5, який містив 0,0595 Твін 20, протягом ночі, після чого інкубували з моноклональним антифосфотирозиновим антитілом (1:100, Запіа Стги) протягом год. Візуалізацію зв'язаного антитіла здійснювали за стандартним протоколом для методу з використанням комплексу авідин-біотин-лужна фосфатаза (АВС Кії, компанія Месіог І арогайогіев).
Статистика. Всі дані виражені у вигляді середнього значення «середня квадратична помилка середнього. Для визначення статистично значущих різниць між групами, вдавалися до однофакторного дисперсійного аналізу.
Після визначення статистичної значущості в дисперсійному аналізі, для коректування на множинність порівнянь використали Е-критерій Шеффа (Зспепе). Імовірність менш ніж 0,05 для основної гіпотези приймалася як свідчення статистично значущої різниці. Ге
Результати. Активовані нейтрофіли викликають синтез муцину геном МОС5БАС. Коли нейтрофіли плюс (5) стимулювальні агенти, які активують нейтрофіли (ІІ -8, "МІ Р, ТМЕ-А), інкубували з клітинами МСІ-Н292 протягом 1год, синтез більа МОС5АС значно зростав протягом 24год, в той час як нестимульовані нейтрофіли (10 б/мл), тільки І/-8 або тільки МІ Р не впливали на синтез МОС5БАС; інкубування тільки з ТМЕ-А викликало незначне, неістотне збільшення синтезу МОС5БАС. У випадку, коли нейтрофіли заздалегідь інкубували протягом 1год з с ТМЕ-А, після чого зазначені нейтрофіли і їхній супернатант відділяли, подальше інкубування зазначеного с супернатанта протягом їгод з клітинами МСІ-Н292 активувало експресію гена МОСБАС в межах 12год і стимулювало забарвлення як за допомогою алціану блакитного/РА5З, так і за допомогою антитіла до МОС5АС в. білка в межах 24год; клітини, які покояться МСІ-Н292 демонстрували незначну експресію гену МОС5АС і со незначне, плямисте забарвлення як алціаном блакитним/РА5, так і білюм МИОС5БАС. Синтез біль»а МОС5БАС, індукований зазначеним супернатантом, значно зростав в порівнянні з контролем; нейтрофіли, відділені від в. зазначеного супернатанта після інкубування, ніякого впливу не виявляли. Прийшли до висновку, що активовані нейтрофіли швидко секретують активний продукт, який викликає синтез МОС5АС.
Інгібітори тирозинкінази ЕСБ-К запобігають синтезу МОС5БАС, індукованому супернатантом активованих « нейтрофілів. Оскільки, як відомо, ліганди ЕСЕ-К викликають синтез МОС5БАС в клітинах МСІ-Н292 за допомогою активування тирозинкінази ЕСБЕ-К, досліджували роль активації ЕСБ-К в синтезі МОС5БАС, індукованому З с зазначеним супернатантом активованих нейтрофілів. Попередня обробка клітин МСІ-Н292 вибірними "» інгібіторами тирозинкінази ЕСЕ-К (ВІВХ 1522, АбС1478) запобігала синтезу білла МОС5БАС, який, звичайно, " індукувався зазначеним супернатантом активованих нейтрофілів. Вибірний інгібітор кінази рецептора отриманого з тромбоцитів соматотропіну (АС 1295) і негативний контроль тирфостинів (Ат) впливу не виявляли.
Ці результати мають на увазі активацію тирозинкінази ЕСЕ-К в синтезі МОС5БАС, індукованому зазначеним і супернатантом активованих нейтрофілів. с Роль лігандів ЕСЕ-К, секретованих в супернатант активованих нейтрофілів при синтезі МОС5АС. Для визначення, чи залежить активація тирозинкінази ЕСБ-К від лігандів ЕСР-К(ЕСЕ і ТОБ-А), ми попередньо і інкубували зазначений супернатант активованих нейтрофілів з нейтралізуючими антитілами до лігандів ЕСБ-К.
Ге 50 Попередня обробка зазначеного супернатанта анти-ТОБ-А антитілом або анти-ЕСЕ антитілом не інгібувала синтезу МОС5АС, індукованого зазначеним супернатантом активованих нейтрофілів. Більш того ТОБ-А не був о) виявлений в зазначеному супернатанті. Таким чином, фосфорилювання тирозину ЕСЕ-К, викликане зазначеним супернатантом активованих нейтрофілів, було індуковано механізмом, який не залежить від зазначених лігандів
ЕСЕ-К, ЕСЕ і ТОБ-А. 22 Сигаретний дим і вільні радикали кисню викликають синтез МОС5БАС. Сигаретний дим і вільний радикал
ГФ! кисню, Н2О2, активують експресію гена МОС5АС в межах 12 год, так само, як це робить і ТОБ-А. Подібним же чином, все стимулювальні агенти посилювали синтез білюка МОС5АС і продукування слизового глікокон'югату в ко межах 24 год; ці впливи мали змінний за часом характер. Максимальний синтез МОС5АС у відповідь на вплив
НььО» був значно меншим, ніж реакція на ТОР-А. Попередня обробка за допомогою АС 1478 запобігала 60 посиленню синтезу білюьа МОС5БАС, індукованого всіма стимулювальними агентами, вказуючи на те, що всі зазначені стимулювальні агенти викликають синтез муцину за допомогою активації тирозинкінази ЕСБЕ-К. Синтез
МИС5БАС, який викликався супернатантом активованих нейтрофілів, сигаретним димом і Н 5250», значно інгібувався попереднім обробленням акцепторами вільних радикалів (0ОМ5О і ОМТ) і БОБ, в той час як ОМ5О і
ОО не впливали на синтез білка МОС5АС, зумовлений ТОБ-А. 65 Індукування фосфорилювання тирозину ТОБ-К супернатантом активованих нейтрофілів і Н?2О2. Розподіл білка ЕСЕ-К був однаковим у контролю, вирощеного на мінімальному середовищі, і при всіх стимульованих умовах (супернатант активованих нейтрофілів, сигаретний дим, Н»О»о або ТОБ-А). Фосфорилювання загального білка тирозину відбувалося в межах 15хв після додавання супернатанта активованих нейтрофілів, сигаретного диму, НО» або ТОБ-А; у контролю, вирощеного на мінімальному середовищі, ефекту не спостерігалося. ТОБ-А -індуковане фосфорилювання загального білка тирозину було більшим, ніж ефект супернатанта активованих нейтрофілів, сигаретного диму або НьО». Для визначення того, чи фосфорилювався ЕСБЕ-К, здійснювали імунопреципітацію з анти-ЕСБ-К антитілом. Всі фактори, зазначений супернатант активованих нейтрофілів, розчинні продукти сигаретного диму і НО», індукували ЕСЕ-К-специфічне фосфорилювання тирозину в межах 15хв; цей ефект був подібний ефекту, викликаному ТОБ-А. Попереднє оброблення клітин МСІ-Н292 за 7/0 допомогою АС 1478 інгібувало фосфорилювання тирозину ЕСЕ-К всіма стимулювальними агентами. ОМБО інгібував фосфорилювання тирозину ЕСЕ-К, індуковане супернатантом, сигаретним димом і Н 20», однак, не надавав впливу на фосфорилювання тирозину ЕСЕ-К, індуковане ТОРЕ- А.
Вищенаведені результати показують, що нейтрофіли викликають синтез муцину МОСБ5БАС в клітинах
МСІ-Н292, коли вони активуються ІІ -8, МІ Р або ТМЕ-А. Однак зазначений супернатант, який збирали через 1год 7/5 Після інкубування нейтрофілів з ТМЕ-А, викликав синтез МОС5АС, тобто ефект, який інгібувався вибірними інгібіторами тирозинкінази ЕСБЕ-К. Інгібування тирозинкінази ЕСЕ-К повністю блокувало синтез МОС5АС, викликаний зазначеним супернатантом активованих нейтрофілів; інгібітор тирозинкінази не-ЕСЕ-К, вибірний інгібітор кінази рецептора соматотропіну, отриманого з тромбоцитів, (АС 1295) і негативний контроль тирфостинів (Ат), не виявляли впливу, що має на увазі фосфорилювання тирозину ЕСЕБЕ-К як сигнальний шлях синтезу МОСЗАС, індукованого зазначеним супернатантом активованих нейтрофілів.
Для додаткового аналізу механізму, за допомогою якого супернатанти активованих нейтрофілів індукують фосфорилювання тирозину ЕСЕ-К, були досліджені як лігандзалежні, так і ліганднезалежні шляхи перетворень
ЕСЕР-К. По-перше, ми визначили кількість ТОБ-А в зазначеному супернатанті активованих нейтрофілів і встановили, що зазначений супернатант не містить кількостей ТОР-А, які піддаються вимірюванню. У попередніх сч ов повідомленнях було показано, що нейтрофіли містили лише низькі концентрації (2,5пг/10 6) ТОБ-А. Ефект супернатанта активованих нейтрофілів на синтез МОС5БАС був так же сильним, як і ефект 1 нг ТОБ-А, якого було і9) в 400 раз більше від кількості ТОБ-А, виявленої в нейтрофілах. По-друге, ми провели дослідження по блокуванню нейтралізуючими антитілами лігандів ЕСЕ-К: попередня обробка нейтралізуючими антитілами до
ЕСЕ ї ТОБ-А не інгібувала синтез МОС5АС, викликаний зазначеним супернатантом активованих нейтрофілів. Ці с зо результати дозволяють припустити, що синтез МОС5БАС, індукований супернатантом нейтрофілів, не був викликаний секрецією лігандів ЕСБ-К (ТОг-а і ЕСЕ) нейтрофілами. Далі, ми досліджували ліганд-незалежний с шлях: оскільки вільні радикали кисню, як відомо, виділяються нейтрофілами під час активації, і вони, як рч- відомо, викликають трансактивацію тирозинкінази ЕСРЕ-К в різних клітинах, ми припустили, що виділення вільних радикалів кисню активованими нейтрофілами викликає фосфорилювання тирозину ЕСЕ-К і подальший синтез о МИиСБАС в клітинах МСІ-Н292. Акцептор вільних радикалів (0ОМ5О і ЮОМТИ) і ОО інгібували синтез МОСБАС, р. зумовлений зазначеним супернатантом активованих нейтрофілів. Повідомляють, що ТМЕ-а викликає оксидаційний "вибух" в суспензії нейтрофілів з максимальною реакцією в межах 1 год; представлені результати демонструють такий же розвиток у часі. «
У цьому дослідженні екзогенний НьО»о, основний продукт, який виділяється з нейтрофілів під час "оксидаційного" вибуху, викликає синтез МОС5БАС в клітинах МСІ-Н292. Однак максимальна реакція на НО при ей с синтезі МОС5БАС становила лише половину реакції на ТОБ-А. Значним відкриттям в цьому дослідженні є той ц факт, що сигаретний дим самостійно викликає синтез МОС5БАС. Це дозволяє припустити, що сигаретний дим "» може викликати синтез МОСБАС іп мімо як через посередництво прямого стимулювання, так і через посередництво непрямого стимулювання, викликаного рекрутингом нейтрофілів. Точні молекули сигаретного 775 диму, які викликають синтез МОС5БАС, всі ще не встановлені. Показано, що сигаретний дим включає численні -І продукти (наприклад, нікотин, смолу, акролеїн і оксиданти). У наших експериментах ЮОМ5БО і 500 частково інгібували синтез МОС5АС, індукований сигаретним димом. Таким чином, оксидантний стрес може бути одним з о механізмів, які викликають цю реакцію. Той факт, що синтез МОС5АС, індукований сигаретним димом, повністю -І блокувався інгібіторами тирозинкінази ЕСЕ-К, вказує на те, що активація ЕСЕ-К грає основну роль в синтезі МИиС5АС, індукованому сигаретним димом. о При захворюваннях дихальних шляхів нейтрофільне запалення дихальних шляхів є звичайним симптомом;
Кз нейтрофіли рекрутуються і активуються цитокінами і сигаретним димом. Результати цих досліджень показують, що рекрутовані нейтрофіли і сигаретний дим також діють як регулювальники диференціації епітеліальних клітин, наслідком чого є індукція муцин-продукуючих клітин в дихальних шляхах. Найбільш важливим представляється те, що інгібування активації ЕСЕ-К годитиметься як лікарський засіб при гіперсекреторних захворюваннях дихальних шляхів. іФ) Приклад 3. Поранення епітелію дихальних шляхів викликає метаплазію келихоподібних клітин. ко Припустили, що агарозні пробки, введені в дихальні шляхи, будуть постійно знаходитися в бронхах, не закупорюючи їх, і що постійні пробки спричинять запалення, наслідком якого з'явиться метаплазія бор Келихоподібних клітин. Показано, що агарозні пробки індукують явно виражене місцеве продукування келихоподібних клітин, яке демонструється позитивним забарвленням алціаном блакитним/РАЗ і експресією муцинового гена МОС5БАС, пов'язаною з місцевим рекрутингом клітин зони запалення. Цей результат має на увазі активацію ЕСЕ-К в індукованій пробками метаплазії келихоподібних клітин.
Методи. 65 Тварини. Протокол проведення експериментів на тваринах був схвалений Комітетом по проведенню досліджень на тваринах (Соттіцее оп Апіта! Кезеагсі) Каліфорнійського університету, Сан-Францисько. Були використані спеціальні апатогенні пацюки-самці лінії Е344 (маса 230-250 г; компанія Зітопвеп І арогаюгіев,
Сігоу, штат Каліфорнія). Пацюків утримували в апатогенних клітинах Віо Сіеап з ізольованими від навколишнього середовища витяжними ковпаками, які забезпечують подачу ламінарного потоку повітря; тварини
Мали вільний доступ до стерильного корму і води.
Лікарські препарати. Були використані лікарські препарати з таких джерел: циклофосфамід (компанія Зідта,
ЗІ. Гоців, штат Міссурі), метогекситал натрію (бревітал, компанія Ддопез Меаійса! Іпдизігіев, Іпс., 95. Гоців, штат Міссурі), пентобарбітал натрію І(нембутал, компанія Аррой Іар., Могій СпВпісадо, штат Іллінойс|; ВІВХ 1522, вибірний інгібітор тирозинкінази ЕСЕ-К (люб'язно наданий компанією Воейгіпдег ІпдеїІНеїт, Іпс., 7/0 ІпдеїІНеіт, Німеччина), був розчинений в такому розчині: 2мл поліетиленгліколю 400 (компанія бідта, 51. І оців, штат Міссурі), 1 мл ОМ НС ї З мл 295 розчину манітолу у воді (рН 7,0). МРС 15669 (інгібітор рухливості лейкоцитів) був люб'язно наданий компанією Зсіоз Мома, Іпс., Мошпіаіп Міем/, штат Каліфорнія.
Агарозні пробки. Агарозні пробки (діаметром 0,7-О0,8мм) виготовляли з 4905 агарозного живильного середовища ЕЕО типу ІІ (компанія Зідта, 5. І оціз, штат Міссурі в стерильному забуференому фосфатом 7/5 фізіологічному розчині (РВЗ). Для візуалізації зазначених агарозних пробок в тканині, після розплавлення агарози при температурі 509С до неї додавали 3956 суспензію барвника монастралу блакитного В Ікомпанія зЗідта, 951. І оців, штат Міссурі.
Протокол експериментів. Дослідження проводилися нами на апатогенних пацюках, оскільки в їхніх дихальних шляхах, як правило, знаходиться невелика кількість келихоподібних клітин. Тварин анестезували го Мметогекситалом натрію (бревітал, 25 мг/кг, внутрішньоочеревинно). Трахею асептично оголяли розрізом по середній лінії і агарозні пробки вводили в бронхи за допомогою голки Апдіосаїй Мо20 (компанія Весіоп Рікіпзоп,
Запау, штат Юту), приєднаної до поліетиленової трубки (РЕ 90, внутрішній діаметр О,8бмм і зовнішній діаметр 1,27мм, компанія Сіау Адатв, Рагвіррапу, штат Нью-Йорк), введеної в розрізану трахею. Поліетиленову трубку згинали під кутом 302 для вибірного введення до відповідного бронху. Після введення пробок на розріз с накладали шов.
Для оцінки ролі ЕСБ-К в метаплазії келихоподібних клітин, індукованої агарозними пробками, тварин і) обробляли ВІВХ 1522 (8Омг/кг, внутрішньоочеревинно) за їгод до введення зазначених агарозних пробок, і зазначене оброблення повторювали щодня (40 мг/кг, внутрішньоочеревинно, два рази на день). Тварин забивали Через 24 год, 48 год або 72 год після введення зазначених агарозних пробок. сі
Для оцінки ролі ТМЕ- А в метаплазії келихоподібних клітин, індукованої агарозними пробками, тварин обробляли ТМЕ-А нейтралізуючим антитілом (компанія Сепгуте, Вовіоп, штат Масачусетс). Перше оброблення с (100 мкл в 0,2 мл фізіологічного розчину, внутрішньоочеревинно) проводили за 1 год до введення агарозних ч- пробок, і внутрішньоочеревинні ін'єкції повторювалися щодня. У доповнення до цього ТМЕ-А нейтралізуюче антитіло вливали (10 мкл/ч) за допомогою осмотичного мінінасоса (АІгеї 2МІ1, компанія АїІга Согр., Раїо АЮ, о штат Каліфорнія), імплантованого під шкіру. ч-
Для оцінювання впливу нейтрофілів на метаплазію келихоподібних клітин, індукованої агарозними пробками, пацюків заздалегідь обробляли циклофосфамідом (інгібітор лейкоцитів кісткового мозку) або комбінацією циклофосфаміду плюс МРС 15669. Циклофосфамід (10Омг/кг, внутрішньоочеревинно) вводили за 5 днів до « введення агарозних пробок, і другу ін'єкцію циклофосфаміду (5Омг/кг, внутрішньоочеревинно) проводили за 1 день до введення пробок. У процесі досліджень з МРС 15669, зазначений лікарський засіб (1Омг/кг, - с внутрішньоочеревинно) впорскували за 1год до введення агарозних пробок, потім щодня протягом З подальших ц днів. "» Всі лікарські препарати (ВІВХ 1522, ТМЕ-А нейтралізуюче антитіло, циклофосфамід і МРС 15669) вводили внутрішньоочеревинно за 1 год до введення агарозних пробок, і дози повторно вводили щодня протягом З днів.
Отримання тканин. Через різні проміжки часу після введення агарозних пробок, пацюків анестезували -І пентобарбіталом натрію (65 мг/кг, внутрішньоочеревинно) і здійснювали перфузію системи кровообігу розчином 196 параформальдегіду в РВ5, обробленому діетилпірокарбонатом, при тиску 120мм рт.ст. Праву легеню о видаляли і праву каудальну частку використовували для гістологічних досліджень. Для отримання заморожених -І зрізів тканини видаляли і вміщували в 495 параформальдегід на 1год з подальшим розміщенням в 30905 сахарозі для кріозахисту протягом ночі. Зазначені тканини заливали складом О.С.Т. (компанія заКига РіпеФек О.5.А., о Іпс., Тотпапсе, штат Каліфорнія)|. Для отримання метилакрилатних зрізів зазначені тканини вміщували в 4905
ІЗ параформальдегід на 24 год, після чого дегідратували градуйованими концентраціями етанолу і заливали метакрилатом У8-4 І(компанія Роїузсіепсев, Іпс., ММагіпдіоп, штат Пенсільванія|. Тканинні зрізи (товщиною 4мкм) забарвлювали алціаном блакитним/РАФЗ і контрастно забарвлювали гематоксиліном.
Морфометричний аналіз бронхіального епітелію. Процент забарвленої алціаном блакитним/РА5 площі слизових глікокон'югатів в епітелії визначали за допомогою напівавтоматичної системи аналізування зображень о відповідно до раніше опублікованих методів. Площа епітелію і забарвлені алціаном блакитним/РА5 слизові ко кон'югати в межах епітелію окреслювали вручну і аналізували за допомогою програми Ітаде Національного інституту здоров'я, яка знаходиться в державній власності СІЛА (розробленої в Національному інституті 6о здоров'я США і загальнодоступної з мережі Інтернет за протоколом ЕТР або на гнучкому дискові від компанії
Майопа! Тесппіса! Іптогтайоп бегмісе, Зргіпоуйеїд, штат Віргінія, шифр компонента РВО5-50019505ЕЇ). Дані виражені у вигляді процента від загальної площі епітелію, зайнятої барвником алціаном блакитним/РА5. Для напівкількісної оцінки секреції слизу, процент довжини поверхні епітелію, позитивно забарвленої алціаном блакитним/РА5З, визначали шляхом співвіднесення позитивно забарвленої довжини із загальною довжиною. 65 Процент оголеного епітелію визначали за допомогою обчислення відношення довжини оголеного епітелію до загальної довжини епітелію.
Ідентифікація клітинних типів в метакрилатних зрізах і аналіз клітин. Загальну кількість епітеліальних клітин визначали шляхом підрахування ядер епітеліальних клітин на 2мм власної пластинки слизової оболонки за допомогою імерсійних об'єктивів (1000х збільшення). Лінійну довжину власної пластинки слизової оболонки під
Кожною ділянкою епітелію, яка піддавалася аналізу, визначали за допомогою запису контура оцифрованого зображення власної пластинки слизової оболонки. Епітеліальні клітини ідентифікувалися, як описувалося раніше. Коротко, базальні клітини ідентифікувалися як невеликі сплощені клітини з великими ядрами, розташовані безпосередньо над власною пластинкою слизової оболонки, але такі, що не досягають просвіту дихальних шляхів. Цитоплазма забарвлювалася в темний колір, алціан блакитний- або РАЗ-позитивні гранули 70 був відсутніми. Війчасті епітеліальні клітини розпізнавалися по їхніх війчастих краях, трохи забарвленій цитоплазмі і великим круглим ядрам. Негранульовані секреторні клітини мали стовпчасту форму і протягалися від просвіту бронхів до власної пластинки слизової оболонки. Після інтрабронхіальної інстиляції агарозних пробок виникали келихоподібні "клітини, які проявляються" (клітини-попередники келихоподібних клітин). Ці клітини мали алціан блакитний/РАв-позитивне забарвлення, гранули були невеликими і самі клітини не були забиті гранулами; вони включали невеликі ділянки, забарвлені слизом ( «1/3 висоти в епітелії від базальної мембрани до поверхні просвіту), або розсіяно і злегка пофарбовані алціаном блакитним/РАЗ гранули невеликого розміру. Клітини невизначеного типу визначаються як профілі клітин, що не мають достатніх цитоплазматичних характеристик для віднесення до відповідної категорії.
Імуногістохімічна локалізація ЕСБЕ-К. Присутність ЕСБ-К визначали за допомогою |імуногістохімічної локалізації, використовуючи моноклональне мишаче антитіло до ЕСЕ-К (компанія СаІріоспет, Зап Оіедо, штат
Каліфорнія). Заздалегідь отримані 4мкм заморожені гістологічні зрізи постфіксували 495 параформальдегідом, оброблялися 0,395 сумішшю Н »О5/метанолу. Тканини інкубували з ЕСБ-К антитілом (розведення 1:250).
Біотинільований кінський антимишачий ІдС (1:200; компанія Месіог І ар., Вигіпдате, штат Каліфорнія), з подальшою обробкою комплексом стрептавідин-пероксидаза (АВС Кії, компанія Месіог І ар., Випіпдате, штат сч ов Каліфорнія), використали для візуалізації комплексів антиген-антитіло, забарвлених 3,3'-діамінобензидину тетрагідрохлоридом (компанія Зідта, 5. І оці, штат Міссурі). Негативне контрольне предметне скло інкубували і) з виключенням основного або другорядного антитіла, заміненого РВ5.
Гібридизація іп зйши. (551-мічені рибозонди отримували з плазміди, яка включає 320п.н. фрагмент КДдНК пацючого МОС5БАС, люб'язно наданої доктором Карол Басбаум (Саго! Вазрацшт). Гістологічні зрізи гібридизували су зо з (355|-міченими РНК-зондами (2500-300б0имп/мкл гібридизаційного буфера) і промивали з дотриманням жорстких умов, які включають оброблення рибонуклеазою А. Після авторадіографування протягом 7-21 днів, см фотоемульсію проявляли і отримане предметне скло фарбовували гематоксиліном. -
Підраховування нейтрофілів в епітелії дихальних шляхів. Оцінювання притоку нейтрофілів в бронхи проводили шляхом забарвлення нейтрофілів 3,3'--діамінобензидину тетрагідрохлоридом з підраховуванням о
Кількості нейтрофілів в просвіті і в епітелії дихальних шляхів; результати виражали у вигляді кількості ї- забарвлених клітин на міліметр довжини власної пластинки слизової оболонки.
Бронхоальвеолярний лаваж (ВА). Для визначення лейкоцитарної формули в кожній групі тварин легені промивали п'ять разів Змл аліквотами стерильного РВ5, змиви об'єднували і визначали об'єм. Клітини в ВАГ. « збирали за допомогою центрифугування промивної рідини при 1000об/хв протягом 10 хв. Після цього за допомогою гемоцитометра підраховували 1Омкл клітинної суспензії для визначення кількості клітин в промивній - с рідині. Лейкоцитарну формулу визначали на цитоцентрифугових препаратах, забарвлених барвником ОШ-ОціК а (компанія Атегісап Зсіепійіс Ргодисів, МесСам/ Рагк, штат Іллінойс|. Лейкоцитарну формулу визначали шляхом "» відбору як мінімум 200 клітин на кожному цитоцентрифуговому склі.
Статистичний аналіз. Дані представлені у вигляді середнього значення (середня квадратична помилка середнього. Для статистичного аналізу як придатний був використаний двофакторний або однофакторний -і дисперсійний аналіз (АМОМА) з подальшим застосуванням і-критерію Стьюдента. Імовірність менш ніж 0,05 була о визнана статистично значущою різницею.
Результати. -і Вплив на структуру епітелію дихальних шляхів: метаплазія келихоподібних клітин. Для визначення, чи т 50 впливають агарозні пробки на структуру епітелію дихальних шляхів, агарозні пробки вводили в праві бронхи 5 апатогенних пацюків. У бронхіальному епітелії контрольних тварин знаходилася невелика кількість що) келихоподібних клітин. Однак після місцевого введення агарозних пробок, забарвлення алціаном блакитним/РА5 показало змінюване з часом збільшення площі келихоподібних клітин, яке було можливо виявити вже у 24год і було найбільшим через 72год після введення агарозних пробок. Через 24год агарозні пробки спричинили значне збільшення кількості клітин-попередників келихоподібних клітин і келихоподібних клітин, і Через 48год виявлялося більше зрілих келихоподібних клітин (Таблиця 1). Через 72год агарозні пробки збільшили кількість
ІФ) келихоподібних клітин (Р«0,01); кількість базальних і війчастих клітин залишилася незмінною (Р»20,05). Загальна іме) кількість епітеліальних клітин на мм власної пластинки слизової оболонки через 72год після введення агарозних пробок було злегка, але незначно підвищене (Р»О0,05, Таблиця 1); висота епітелію (виміряна від базальної 60 мембрани до поверхні епітелію в просвіті) збільшилася від 16,0 мкм.--1,2 мкм в контрольних дихальних шляхах до 38,1мкм--9,1мкм через 72год після введення пробок (п-5, Р.«0,01).
У просвіті дихальних шляхів контрольних тварин не спостерігалося забарвлення алціаном блакитним/РАЗ.
Однак в безпосередній близькості від агарозних пробок в просвіті спостерігалося забарвлення, яке свідчить про секрецію слизових глікокон'югатів, яка мала місце. У дихальних шляхах з агарозними пробками збільшення 65 забарвленої площі носило змінний за часом характер. Процент загальної довжини епітелію, позитивно забарвленої алціаном блакитним/РА5, в дихальних шляхах в безпосередній близькості від пробок, збільшився від 0,190--0,190 у контрольних тварин до 4,790-1,495, 13,390-0,790 і 19,190-0,790 через 24год, 48год і 72 год (п-5). Більш того агарозні пробки оголили епітелій закупорених бронхів на 13,595--2,3905, 6,990--2,490 і 5,195--1,590 від загальної площі через 24год, 48год і 72год, відповідно (п-5).
Вплив агарозних пробок на експресію муцинового гена. У бронхах контрольних пацюків не спостерігалося сигналу, який піддається виявленню, з анти смисловим зондом МОС5БАС (п-4 на групу). У бронхах, в які були вставлені пробки, спостерігався сигнал для МОС5БАС, який зростав в залежності від часу від 24год до 72год (п-4). Експресія гена МОС5БАС виявлялася, головним чином, в клітинах, які мали позитивне забарвлення алціаном блакитним/РА5. У клітинах інших типів (наприклад, гладких м'язах, з'єднувальній тканині) сигнали не 70 виявлялися. Зрізи, перевірені смисловим зондом МОС5АС, експресії не показали.
Вплив агарозних пробок на експресію ЕСЕ-К в епітелії дихальних шляхів. У епітелії контрольних тварин, при імунному фарбуванні антитілом до ЕСЕ-К, спостерігалося слабке забарвлення. Однак після введення агарозних пробок ЕСЕ-К-позитивне забарвлення продемонстрував епітелій, який знаходиться в безпосередній близькості від агарозних пробок, клітини якого позитивно забарвилися алціаном блакитним/РА5. Картина 75 забарвлення для ЕСЕ-К нагадувала забарвлення для МОС5БАС і АВ/РА5. Клітини-попередники келихоподібних клітин, келихоподібні клітини і негранульовані секреторні клітини були імунопозитивні на ЕСБЕ-К. У війчастих клітин імунореактивність була відсутньою. У дихальних шляхах, не закупорених агарозними пробками, епітелій демонстрував незначне забарвлення для ЕСРЕ-К і воно було подібним до забарвлення у контрольних тварин.
Вплив інгібітору тирозинкінази ЕСЕ-К на метаплазію келихоподібних клітин і на експресію муцинового гена. У цих дослідженнях наслідком введення агарозних пробок з'явилася експресія ЕСБЕ-К в клітинах, які продукують муцин. ЕСЕ-К є членом класу рецепторів тирозинкінази. Таким чином, коли ліганди ЕСЕ-К (ЕСЕ або ТОБ-А) зв'язуються з ЕСБЕ-К, активізується особлива тирозинкіназа ЕСЕ-К. Тому для перевірки гіпотези, суть якої полягає в тому, що активація ЕСЕ-К індукує експресію гена МОС5АС і слизових глікокон'югатів після інстиляції агарозних пробок, пацюкам внутрішньоочеревинно впорскували інгібітор тирозинкінази ЕСЕ-К (ВІВХ 1522). ВІВХ сч 1522 помітно скорочував індуковану агарозними пробками забарвлену алціаном блакитним/РАЗ площа епітелію через 24год, 48год і 72год. Він також повністю інгібував експресію гена МОС5БАС через 72год після введення о пробок.
Вплив ТМЕ-А нейтралізуючого антитіла на метаплазію келихоподібних клітин і на експресію ЕСБЕ-К білка. Ми припустили, що ТМЕ-А виділяється в процесі запалення, викликаного агарозними пробками. Тому ми сі досліджували вплив попереднього оброблення пацюків ТМЕ-а нейтралізуючим антитілом на метаплазію келихоподібних клітин, індуковану агарозними пробками: у тварин, заздалегідь оброблених ТМЕ-А с нейтралізуючим антитілом (п-5), агарозні пробки більш не стимулювали експресію ЕСБР-К білка або |- продукування (келихоподібних) клітин, позитивно забарвлених алціаном блакитним/РА5.
Рекрутинг клітин зони запалення агарозними пробками. Було помічено, що агарозні пробки викликають о пошкодження епітелію і інфільтрацію клітин зони запалення. Різні клітини зони запалення можуть продукувати ч- ліганди як ТМЕ-А, так і ЕСБ-К. Як ЕСБ-К, так і його ліганди залучені до каскаду ЕСБЕ-К, який веде до метаплазії келихоподібних клітин. Ми оцінювали роль лейкоцитів і макрофагів в ефектах, індукованих агарозними пробками, двома способами. По-перше, ми досліджували клітини в бронхоальвеолярному лаважі: у « контрольних пацюків переважаючими виділеними клітинами були макрофаги (п-5; Фіг.4, контроль). Після введення агарозних пробок кількість макрофагів збільшилася (Р «0,05) і в промивній рідині з'явилося значна - с кількість нейтрофілів (Р«0,01). Кількість лімфоцитів залишилася незмінною. ц У гістологічних зрізах оцінювалися також інфільтраційні клітини: в дихальних шляхах без агарозних пробок "» була невелика кількість нейтрофілів, в той час як в дихальних шляхах з пробками нейтрофіли були присутні як в епітелії, так і в просвіті. Кількість нейтрофілів в просвіті дихальних шляхів становила 0,2-0,2/мм, 42,4--7 1/мм, 40,7-7,7/мм і 20,14-7,2/мм власної пластинки слизової оболонки в контрольних дихальних шляхах і через 24год, - і 48год і 72год після введення пробок, відповідно (Р «0,05, п-5). У доповнення до цього, кількість нейтрофілів в сю епітелії дихальних шляхів становила 1,3 --0,4/мм, 15,6--2,6/мм, 14,9-1,4/мм і 14,8-2,6/мм власних пластинок слизової оболонки в контрольних дихальних шляхах і через 24год, 48год і 72год після введення пробок, -і відповідно (Р«0,01, п-5). з 20 Вплив циклофосфаміду на рекрутмент нейтрофілів, метаплазію келихоподібних клітин і експресію ЕСБ-К білка. У пацюків, оброблених циклофосфамідом, знижувалася кількість нейтрофілів в крові (кількість нейтрофілів кі» у венозній крові після циклофосфаміду, 1,895 -0,595, п-5) і інгібувався індукований пробками рекрутмент нейтрофілів в ВАГ. Кількість нейтрофілів в просвіті дихальних шляхів (2,64-0,3/мм власної пластинки слизової оболонки) і в епітелії (0,8--0,2/мм) також значно знизилася через 24год. Циклофосфамід також інгібував індуковану агарозними пробками метаплазію келихоподібних клітин і експресію ЕСБ-Е. білка. Після того як до
ГФ) циклофосфаміду був доданий леймедин, МРС 15669, інгібування індукованої агарозними пробками метаплазії келихоподібних клітин стало подібним впливу тільки циклофосфаміду. Ці результати мають на увазі участь ді нейтрофілів в індукованій пробками метаплазії келихоподібних клітин.
Обговорення. 60 У даному дослідженні ми розглянули вплив введення агарозних пробок на метаплазію келихоподібних клітин в дихальних шляхах апатогенних пацюків, які в контрольному стані, мають надто незначну кількість келихоподібних клітин. Епітеліальні клітини бронхів контрольних тварин і бронхів без агарозних пробок (контрольні легені) забарвлювалися алціаном блакитним/РА5 однорідно негативно. Наслідком введення агарозних пробок з'явилося глибоке, змінюване з часом збільшення площі келихоподібних клітин в бо бронхіальному епітелії в безпосередній близькості від введених пробок, яке стало піддаватися виявленню в межах 24год і досягло максимального рівня через приблизно 72год після введення. Дихальні шляхи, прилеглі до закупорених дихальних шляхів, також позитивно забарвлювалися алціаном блакитним/РАЗ. Загальна кількість клітин і кількість основних і ввійчастих епітеліальних клітин не змінилася, однак зросла кількість келихоподібних клітин і після введення агарозних пробок змінно за часом знизилася кількість негранульованих секреторних клітин (Таблиця 2). Ці результати дозволяють зробити припущення про те, що метаплазія келихоподібних клітин була результатом перетворення негранульованих секреторних клітин в келихоподібні клітини. » ів
Клітини аналізували, як описано в розділі Методи; п-5 в кожній групі. При визначенні властивостей додатково вдавалися до забарвлення алціаном блакитним/РАЗ (останнє поєднання забарвлює слизові глікокон'югати). У дихальних шляхах контрольних тварин знаходилася незначна кількість клітин-попередників келихоподібних клітин і келихоподібних клітин. Після введення агарозних пробок спостерігалося змінюване з с часом (24год, 48год, 72год) збільшення кількості клітин-попередників келихоподібних клітин і келихоподібних о клітин і зниження кількості негранульованих секреторних клітин, в порівнянні з контрольними тваринами. " Дані представлені у вигляді середнього значеннянсередня квадратична помилка, кількість клітин/мм власної пластинки слизової оболонки. ж Р«еО0,05 в порівнянні з контролем. с 5 Ре0,01 в порівнянні з контролем. сч
ІЇ Цитоплазматичних характеристик недостатньо для віднесення клітини до певної категорії.
Повідомляють, що келихоподібні клітини дихальних шляхів пацюків експресують ген МОСБАС. У цих в. дослідженнях контрольні бронхи не експресували ген МОС5БАС, однак дихальні шляхи, закупорені пробками або со прилеглі до зазначених пробок, які позитивно забарвлювалися алціаном блакитним/РА5, експресували ген
МИСБАС, що дозволяє припустити, що ген МИОСБАС є залученим в індуковане агарозними пробками в. продукування слизу. Ці результати вказують на те, що агарозні пробки індукують експресію муцинових генів і продукування слизових глікокон'югатів в певних клітинах дихальних шляхів пацюків.
Досліджували механізм метаплазії келихоподібних клітин, індукованої агарозними пробками. ЕСБЕ-К, в нормі, « не експресується в епітелії дихальних шляхів апатогенних пацюків, але індукується ТМЕ-А. У присутності ЕСБ-К в епітелії, результатом інстиляції лігандів ЕСБЕ-К (ЕСЕ і ТОБ-А) було посилення експресії муцинового гена і З с білка. Вибірний інгібітор тирозинкінази ЕСБ-К (ВІВХ 1522) повністю інгібує ці реакції, що має на увазі "» передачу сигналу ЕСР-К при метаплазії келихоподібних клітин. Визначали вплив ВІВХ 1522 на індуковану " агарозними пробками метаплазію келихоподібних клітин: ВІВХ 1522 інгібував індуковане агарозними пробками продукування слизових глікокон'югатів і експресію гена МОС5БАС. Цими результатами мається на увазі каскад ЕСБ-К в індукованій агарозними пробками метаплазії келихоподібних клітин. - Вивчали механізми, за допомогою яких зазначений каскад ЕСЕ-К викликає метаплазію келихоподібних клітин с агарозними пробками. По-перше, ми досліджували експресію ЕСЕ-К білка в бронхіальному епітелії. Контрольні дихальні шляхи забарвлювалися однорідно негативно на ЕСЕ-К, однак дихальні шляхи, в яких знаходилися і агарозні пробки, демонстрували вибірково змінюване з часом позитивне забарвлення на ЕСБ-К. До числа
Ге 50 позитивно пофарбованих клітин відносилися негранульовані секреторні клітини, клітини-попередники келихоподібних клітин і келихоподібні клітини. Таким чином, агарозні пробки індукували експресію ЕСБ-К білка. о) У пацюків, заздалегідь оброблених нейтралізуючим антитілом до ТМЕ-А, не розвивалася індукована агарозними пробками метаплазія келихоподібних клітин, що має на увазі участь ТМЕ-А в індукованій агарозними пробками експресії ЕСБ-К.
Циклофосфамід, лікарський препарат, який вибірково депресує продукування лейкоцитів, запобігав
ГФ! рекрутмент нейтрофілів в промивну рідину дихальних шляхів і в епітелій дихальних шляхів після введення агарозних пробок і, крім того, запобігав індуковану агарозними пробками метаплазію келихоподібних клітин. о Після введення агарозних пробок збільшувалася також кількість макрофагів, однак циклофосфамід не інгібував рекрутмент макрофагов. Ці результати дозволяють припустити участь нейтрофілів в індукованій агарозними 60 пробками метаплазії келихоподібних клітин. Той факт, що циклофосфамід також знижував експресію ЕСБ-К білка після введення агарозних пробок, дозволяє припустити, що нейтрофіли приймають, принаймні частково, участь в експресії ЕСБЕ-К при запальному стані.
Нейтрофіли здатні також продукувати ліганди ЕСБЕ-К, ЕСЕ і ТОБ-А. Крім того, епітеліальні клітини є джерелами лігандів ЕСЕ-К і в безпосередній близькості від агарозних пробок спостерігалося гідне здивування бо оголення епітелію. Таким чином, епітелій може бути важливим потенційним джерелом як ТМР-А, так і лігандів
ЕСБ-К.
Розумно припустити, що ефективний стимулювальний агент агарозної пробки пов'язаний з переміщенням пробок в процесі дихання з подальшим здиранням епітелію. Повідомляли, що механічне пошкодження епітелію дихальних шляхів викликає гіперсекрецію. Результати зазначених попередніх досліджень служать підтвердженням гіпотези, суть якої полягає в тому, що наслідком механічної травми епітелію дихальних шляхів є гіперсекреція. Повідомляють, що наслідком інтубації трахеї у коней є рясне виділення слизу. Хронічна інтубація у пацієнтів може викликати гіперсекрецію слизу і нести відповідальність за закупорку слизом.
Інгібітори тирозинкінази ЕСЕ-К могли б використовуватися для запобігання гіперсекреції слизу після інтубації трахеї. 70 Пошкодження епітелію є звичайним симптомом при дослідженнях пацієнтів навіть зі слабкими формами астми, і це пошкодження в зростаючій мірі зв'язується з погіршенням клінічних симптомів. Пошкодження епітелію, викликане алергічною реакцією, може індукувати активацію ЕСБЕ-К, наслідком якої є патологічне продукування келихоподібних клітин. Раніше представлені дані дозволяють припустити, що активація ЕСЕ-К являє собою іншу реакцію, яка безпосередньо залучає метаплазію келихоподібних клітин. Механічне /5 пошкодження епітелію і пошкодження епітелію при астмі можуть залучати однаковий (ЕСБ-К) каскад, наслідком якого є патологічний ріст секреторних клітин епітелію. Це надає механізм гіперсекреції, який відбувається у разі гострих астматичних нападів зі смертельним кінцем.
Приклад 4. Регрануляція келихоподібних клітин рецепторами ЕСЕ
Дегрануляція келихоподібних клітин в назальному респіраторному епітелії пацюків індукувалася інтраназальною інгаляцією ЯМІ-Р. (М-форміл-метіоніл-лейцил-фенілаланін). Значна дегрануляція індукувалася в назальному септальному епітелії через 4 год після інтраназальної інгаляції МІ Р(10-7М).
Регрануляція келихоподібних клітин мала місце через 48 год після інгаляції. У контрольному стані келихоподібні клітини експресували МОС5БАС білок, але не експресували ЕСЕ-К білок. Обидва ЕСЕ-К і МОС5АС муциновий ген і білок були відсутніми в контрольному епітелії, але експресувалися на значному рівні через 48 су год після інгаляції. Попереднє оброблення інгібітором тирозинкінази ЕСБ-К, ВІВХ 1522, інгібувало експресію муцинового МОС5АС гена і білка після дегрануляції келихоподібних клітин, індукованої МІ Р. Ці результати і9) вказують на те, що експресія і активація ЕСЕ-К залучені в регрануляцію келихоподібних клітин в назальному епітелії пацюків.
Методи. Ге
Тварини. Протокол проведення експериментів на тваринах був схвалений Комітетом по проведенню досліджень на тваринах (Соттіцее оп Апіта! Кезеагсі) Каліфорнійського університету, Сан-Францисько. Були с використані спеціальні апатогенні щури-самці лінії Е344 (маса 200-230г; компанія Зітопзеп Іарогаюгіев, рч-
Сіїгоу, штат Каліфорнія). Пацюків утримували в апатогенних клітинах ВіосСіеап з ізольованими від навколишнього середовища витяжними ковпаками, які забезпечують подачу ламінарного потоку повітря; тварини мали вільний о доступ до стерильного корму і води. ча
Отримання назальніх тканин. Через різні проміжки часу після інгаляції пацюків анестезували пентобарбіталом натрію (б5мг/кг, внутрішньоочеревинно). Серце тварини оголяли, тупокінцеву голку вводили через верхівку лівого шлуночка у висхідну аорту і проводили перфузію системи кровообігу 190 « параформальдегідом. Розріз в правому передсерді забезпечував впускний отвір для фіксатора. Очі, нижні щелепи, шкуру і мускулатуру видаляли, голову занурювали на 24год у великий об'єм того ж самого фіксатора. -- с Після завершення фіксування голову декальцинували за допомогою препарата Зигдіра(й (Декальцинатор І, ц компанія ЗигдісаІ! Меадіса! Іпдизігіев, Іпс., Кісптопа, штат Іллінойс) протягом 4-5 днів і прополіскували в "» забуференому фосфатом фізрозчині. Носову порожнину розтинали в поперечному напрямі на рівні різцового сосочка піднебіння. Фронтальний тканинний блок заливали глікольметакрилатом |В 4 Рів, компанія Роїувсіепсев, Іпс., ММагіпдіоп, штат Пенсільванія або складом ОСТ (компанія Закига Ріпесек, О.5.А., Іпс., -І Тотапсе, штат Каліфорнія для отримання заморожених зрізів. З передньої поверхні глікольметакрилатних блоків отримували зрізи товщиною БбБмкм, які забарвлювали або алціаном блакитним (рН 2,5)/періодною о кислотой-Шиффовою основою (АВ/РА5Б) для демонстрації кислих і нейтральних глікокон'югатів, або -І 3,3'-дідамшобензидином (компанія Зідта СНетіса!ї, 5. Іоціз, штат Міссурі| для візуалізації лейкоцитів, які Мігрували в епітелій. З передньої поверхні залитих і заморожених блоків отримували зрізи товщиною 5мкм, які ді забарвлювали АВ/РА5 або використали для імунного забарвлення ЕСБ-К і МОС5АС.
Кз Підрахунок нейтрофілів в назальном епітелії. Нейтрофіли підраховували за допомогою мікроскопа з великим збільшенням на полях епітеліального шару, забарвленого 3,3'-діамінобензидином при збільшенні 400х. Кількість нейтрофілів в назальному септальному епітелії (від базальної мембрани до верхівок клітин) визначали шляхом Ппідраховування кількості ядерних профілів на одиницю довжини власної пластинки слизової оболонки.
Кількісне визначення дегрануляції і регрануляции келихоподібних клітин. Для оцінки дегрануляції і
Ф, регрануляції келихоподібних клітин, ми вимірювали об'ємну густину забарвлених алціаном блакитним/РА5 ко слизових субстанцій на слизовій поверхні епітелію за допомогою напівавтоматичної системи відображення відповідно до раніше опублікованого методу. Забарвлені покривні стекла досліджувалися нами за допомогою бо мікроскопа Ахіоріап (компанія 7еїв5, Іпс.!, пов'язаного з блоком управління, оснащеним відеокамерою
ІОХС755ОМО); компанія Зопу Согр. ої Атегіса, Рагк Кідде, штат Нью-Джерсі). Зображення назального епітелію реєструвалися на фазоконтрастному мікроскопі з великим збільшенням (400х) за допомогою відеосистеми
ІМАХХ (компанія РОЇ, Кедтопа, штат Вашингтон). Внутрішньоклітинний муцин в поверхневих епітеліальних секреторних клітинах мав вигляд овальних гранул пурпурного кольору різних розмірів. Ми виміряли площу, 65 позитивно забарвлену алціаном блакитним/РАЗ, і загальну площу епітелію. Отримані дані були виражені у вигляді процентного співвідношення площі, забарвленої алціаном блакитним/РАЗ, до загальної площі. Аналіз проводився на комп'ютері Масіпіозпй 9500/120 (компанія Арріе Сотрцїег, Іпс., Сирепіпо, штат Каліфорнія) за допомогою програми Ітаде Національного інституту здоров'я, яка знаходиться в державній власності США.
Імунолокалізація ЕСЕ-К і МТОСБ5БАС білка. Заморожені зрізи фіксованих параформальдегідом назальних тпканин обробляли 395 НгОг/метанолом для блокування ендогенного пероксиду і інкубували з мишачим моноклональним антитілом до ЕСЕ-К (комп. СаІрбіоспет, Зап Оіведо, штат Каліфорнія) або МОС5АС (компанія
МеоМагкегз Іпс., Егетопі, штат Каліфорнія) протягом год з розведенням 1:100. Візуалізацію імунореактивного
ЕСБР-К або МОСБ5БАС здійснювали за допомогою набору Весіавзіаіп ЕІШе АВС Кі Ікомп. Месіог Іаб., Іпс.,
Випіпдате, штат Каліфорнія), використовуючи 3,3'-діамінобензидину тетрагідрохлорид як хромоген. Контролі 7/0 Включали заміщення основного або повторного антитіла РВ5.
Методи. Нами вивчалися апатогенні пацюки, в носовому септальному епітелії яких, як правило, є велика кількість келихоподібних клітин. Для визначення впливу аерозольованого ЇМІ Р на дегрануляцію келихоподібних клітин і на міграцію нейтрофілів в епітелій назальної слизової, тварин анестезували пентобарбіталом натрію (бо5мг/кг, внутрішньоочеревинно) і інтраназально протягом хв у вигляді аерозолю вводили розчин 75. М-форміл-метіоніл-лейцил-фенілаланіну (МІР, 105 М, компанія бЗідта, З. Іоців, штат Міссурі! в апірогенному фізрозчині. Введення аерозолю завершили вентилюванням легень тварин за допомогою ультразвукового розпилювача |Ри!тозопіс, компанія Оеміїрізз Со., Зотегвеї, штат Пенсільванія), який створює аерозольний туман зі швидкістю О,Змл/хв. Таким же чином контрольним тваринам інтраназально вводили тільки аерозоль в фізрозчині.
Для дослідження регрануляції назальних келихоподібних клітин після інгаляції МІ Р аерозолю, пацюків забивали Через 48 год після інтраназального введення МІ Р.
Для оцінювання впливу активації тирозинкінази ЕСЕ-К на регрануляцію келихоподібних клітин, тварин піддавали попередній обробці (внутрішньоочеревинно) інгібітором тирозинкінази ЕСБ-К (ВІВХ 1522, 15 мг/кг, люб'язно наданим компанією Воепйгіпдег Іпдеїйеїйт Іпс., ІпдеІйеійт, Німеччина) за ЗОхв до інгаляції МІР з Га повторенням двічі на день.
Статистика. Всі дані виражені у вигляді середнього значення нсередня квадратична помилка середнього. Для і) кожної експериментальної групи використали однофакторний дисперсійний аналіз або і-критерій Стьюдента.
Імовірність менш ніж 0,05 розглядалася як свідчення статистично значущої різниці.
Результати. Ге
Вплив дегрануляції келихоподібних клітин МІР на структуру назального епітелію. У контрольному стані, назальний септальний епітелій мав значну площу АВ/РА5З-забарвлених келихоподібних клітин, однак, поверхня с просвіту залишалася незабарвленою. Імунне забарвлення на муциновий МОС5БАС білок відповідало площі рч-
АВ/РА5З-забарвлення, однак, гібридизація іп зйш продемонструвала незначну або повну відсутність експресії гена МОС5АС. Імуногістохімічне забарвлення на ЕСБЕ-К білок було негативним. Ці результати вказують на те, що о в назальному епітелії контрольних пацюків містяться інтактні келихоподібні клітини, які включають МОС5АС - білок за відсутності експресії муцинового гена. Відсутність забарвлення просвіту дозволяє припустити відсутність дегрануляції (секреції) муцинів.
Була висунена гіпотеза, суть якої полягала в тому, що в назальному епітелії нестимульованих пацюків « знаходяться "стабільні" недегранульовані келихоподібні клітини, які містять муцинові білки. Було показано, що 70 нейтрофільний хемоатрактант (наприклад, ЯМІ Р) рекрутує нейтрофіли в епітелії дихальних шляхів, де вони - с викликають дегрануляцію келихоподібних клітин за допомогою еластазазалежного процесу. Для дослідження ц впливу дегрануляції келихоподібних клітин інтраназально протягом бхв вводили аерозоль нейтрофільного "» хемоатрактанта, ЯМІР (1077 М). У пацюків, забитих через 4 год після ЇМІР, значно поменшала
АВ/РА5-забарвлена площа, плоца МОС5АС-позитивного імунного забарвлення і стався рекрутинг нейтрофілів в назальний епітелій. Було сильно виражене АВ/РА5-забарвлення поверхні просвіту назальних дихальних шляхів, -| що служило підтвердженням дегрануляції келихоподібних клітин, яка відбулася. Однак через 4год після МІ Р с експресія гена МОС5АС залишалася незмінною.
У пацюків, забитих через 48год після ЯМІ Р, при імуногістохімічному фарбуванні антитілом до ЕСБ-К -і спостерігалося позитивне забарвлення на ЕСЕ-К у клітин-попередників келихоподібних клітин і келихоподібних т 50 клітин, в той час як площа АВ/РА5- і МОС5БАС-імунопозитивного забарвлення повернулася до рівня, який спостерігався в контрольному стані, свідчачи про регрануляцію назальних келихоподібних клітин, яка відбулася. що) У цей час рекрутинг нейтрофілів більш не спостерігався; експресія гена МОС5БАС спостерігалася на ділянці, зайнятій келихоподібними клітинами, що свідчило про те, що регрануляція келихоподібних клітин була пов'язана з підвищеною експресією муцинового гена.
Роль фосфорилювання тирозинкінази ЕСЕБ-К в регрануляції келихоподібних клітин. У попередніх дослідженнях на пацюках повідомлялося, що наслідком активації ЕсСЕ-рецепторів (ЕСБЕ-К) є експресія о муцинового гена і білка. Для перевірки гіпотези про те, що активація ЕСЕ-К грає роль в регрануляції назальних іме) келихоподібних клітин пацюків після ЯМІ Р, пацюків заздалегідь обробляли (п-5) вибірним інгібітором тирозинкінази ЕСЕ-К, ВІВХ 1522; аерозолювання ЇМІ Р викликало рекрутинг нейтрофілів в назальний епітелій і 60 дегрануляцію келихоподібних клітин, однак через 48год площі АВ/РАЗ-забарвлення і МиС5АСсС-імунопозитивного забарвлення залишалися незмінними. Ці результати мають на увазі участь активації ЕСРЕ-К в синтезі муцину назальними келихоподібними клітинами після дегрануляції МІ Р.
У цьому дослідженні ми вивчали регуляцію продукування муцину в назальному епітелії пацюків. У контрольному епітелії знаходилася значна кількість келихоподібних клітин і в цих клітинах був присутнім 65 МИиС5АС білок. Експресія гена МОС5БАС, однак, була відсутня. Повідомлялося, що експресія муцину МОС5АС в інших епітеліальних клітинах дихальних шляхів відбувалася через посередництво експресії ЕСБ-К і їх активації.
У клітинах назального епітелію контрольних пацюків ми не виявили експресії ні гена ЕСБЕ-К, ні білка.
Забарвлення просвіту АВ/РА5 на МОС5БАС білок не спостерігалося, що дозволяє припустити, що значної дегрануляції (секреції) келихоподібних клітин не відбувалося. ЕСР-К міг супресуватися в "стабільних" келихоподібних клітинах, що запобігало подальшому синтезу муцину. У зв'язку з цим ми "провокували" назальні келихоподібні клітини за допомогою індукування дегрануляції келихоподібних клітин і досліджували подальші зміни в структурі епітелію дихальних шляхів.
Нейтрофільні хемоатрактанти викликають нейтрофілзалежну дегрануляцію келихоподібних клітин в дихальних шляхах морської свинки і людини, опосередковану еластазою нейтрофілів, забезпечуючи тісний 7/0 Контакт між нейтрофілами і келихоподібними клітинами. Для індукування дегрануляції келихоподібних клітин, звичайно присутніх в назальній перегородці, хемоатрактант, МІ Р, інгалювали інтраназально. МІ Р рекрутував нейтрофіли в назальний епітелій з подальшою дегрануляцією келихоподібних клітин; істотно скорочувалася площа, забарвлена алціаном блакитним/РАЗ.
Далі, ми досліджували подальші події в назальному епітелії після МІ Р-індукованої дегрануляції келихоподібних клітин. Через 4год після ЯМІР, коли сталася максимальна дегрануляція назальних келихоподібних клітин, експресії ЕСБЕ-К і МОС5АС не спостерігалося. Однак через 48год після введення ЇМІ Р почалася інтенсивна експресія ЕСБЕ-К в клітинах-попередниках келихоподібних клітин і келихоподібних клітинах.
До цього моменту ген МОС5БАС інтенсивно експресувався в епітелії і ці події були пов'язані з регрануляцією келихоподібних клітин (посилене забарвлення АВ/РАЗ і МОС5АС). Фактично, через 48 год після введення МІ Р, 2о регрануляція досягла такого рівня, що площа, зайнята келихоподібними клітинами, знаходилася в стані, який нагадував контрольне. Ці дані дозволяють припустити, що дегрануляція келихоподібних клітин веде до експресії і активації ЕСЕ-К, індукуючи тим самим експресію муцину МОС5БАС.
Для дослідження ролі активації тирозинкінази ЕСЕ-К в регрануляції келихоподібних клітин, ми заздалегідь обробляли тварин вибірним інгібітором тирозин кінази ЕСЕ-К, ВІВХ 1522. У тварин, заздалегідь оброблених ВІВХ с дв 1522, ЇМІР як ії раніше викликав дегрануляцію келихоподібних клітин. Однак попередня обробка ВІВХ 1522 запобігала регрануляцію келихоподібних клітин і їх експресію МОС5БАС білка. Ці результати мають на увазі і) участь активації ЕСЕ-К в повторному збільшенні кількості муцинів після дегрануляції келихоподібних клітин.
Келихоподібні клітини у апатогенних пацюків "неактивні" (тобто не дегранулюються) і ЕСЕ-К супресовані. У випадку, коли запалення (наприклад, стимулювання інфільтрації нейтрофілів) викликає дегрануляцію с зо келихоподібних клітин і секрецію муцину, позитивна регуляція і активація ЕСБ-К забезпечує повторне постачання муцинів в епітелій дихальних шляхів. Дані, отримані при проведенні цих досліджень, дозволяють с припустити, що вибірні інгібітори тирозинкінази ЕСЕ-К можуть використовуватися для запобігання гіперсекреції М при назальних захворюваннях.
У той час як цей винахід було описано з посиланням на специфічні варіанти його здійснення, фахівцям в цій ме) галузі потрібно розуміти, що можуть робитися різні зміни і еквівалентні моменти можуть замінятися без ї- відступу від істинного духа і обсягу цього винаходу. У доповнення до цього, багато які модифікації можуть здійснюватися для пристосування конкретної ситуації, матеріалу, композиції речовини, процесу, етапу або етапів процесу до цілей, духу і обсягу цього винаходу. Мається на увазі, що всі подібні модифікації входять в обсяг прикладеної формули винаходу. « - с

Claims (20)

Формула винаходу з
1. Спосіб лікування гіперсекреції слизу в легенях, який включає введення терапевтично ефективної кількості антагоніста рецептора епідермального фактора росту (ЕСЕ-К), що зв'язується з ЕСБЕ-К, пацієнту, що - страждає на гіперсекрецію слизу в дихальних шляхах.
2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що згаданим антагоністом ЕСР-К є інгібітор тирозинкінази, о селективний щодо ЕСБ-К. -І
3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що згаданим антагоністом є антитіло.
4. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що згаданим антитілом є моноклональне антитіло, що специфічно їмо) зв'язує рецептор фактора епідермального росту (ЕСБ-К). ГЕ
5. Спосіб за п.1, який відрізняється тим, що згаданий антагоніст інгібує перефосфорилювання ЕСБ-К.
6. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що згаданим антагоністом є антиоксидант.
7. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що згаданий антагоніст вводять за допомогою вприскування.
8. Спосіб за п. 7, який відрізняється тим, що згаданий антагоніст вводять інтравенозно з носієм у формі нормального фізіологічного розчину. (Ф;
9. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що згаданий антагоніст вводять за допомогою інгаляції. ГІ
10. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що згаданий антагоніст вводять за допомогою ліпосоми.
11. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що згадана ліпосома є стерично стабілізованою і вводиться во інтравенозно.
12. Спосіб /л и//о скринінгу засобів, що мають бути випробувані, для виявлення антагоністів ЕСЕ-К, що інгібують гіперсекрецію слизу, для використання у способі за п.1, який включає: () введення моделі /л и//со проліферації келихоподібних клітин у контакт з ЕСЕ або його функціональним еквівалентом; в5 (ї) згодом, введення згаданої моделі /л у///о в контакт із випробуваним засобом; і (ії) оцінювання проліферації келихоподібних клітин;
причому зниження проліферації келихоподібних клітин свідчить про терапевтичний потенціал даного засобу.
13. Спосіб за п. 12, який відрізняється тим, що згаданими моделями /л п/о є епітеліальні клітини легень.
14. Спосіб /л у/ио скринінгу засобів, що мають бути випробувані, для виявлення антагоністів ЕСБЕ-К, що інгібують гіперсекрецію слизу, для використання у способі за п.1, який включає: () одержання тваринної моделі гіперсекреторного легеневого захворювання за допомогою індукування ЕСБ-Б; (ї) стимулювання індукованого ЕСЕ-К лігандом для продукування келихоподібних клітин, що продукують муцин; 70 (ії) обробку випробуваним засобом; і (м) оцінювання проліферації келихоподібних клітин або секреції слизу; причому інгібування проліферації келихоподібних клітин або секреції слизу свідчить про терапевтичний потенціал даного випробуваного засобу.
15. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що тварину, використану в згаданій моделі /л у/ис, вибрано з /5 Групи, яка включає мишу, пацюка, кролика і морську свинку.
16. Спосіб іп мімо за п. 14, який відрізняється тим, що згаданою моделлю /л у/ио є модель астми.
17. Фармацевтична композиція для лікування гіперсекреції слизу у дихальних шляхах, яка містить терапевтично ефективну кількість антагоніста рецептора епідермального фактора росту (ЕСЕБЕ-К) у кількості, достатній для зниження гіперсекреції слизу у дихальних шляхах, і текучу композицію, придатну для здійснення доставляння за допомогою інгаляції, причому згаданим антагоністом ЕСР-К є інгібітор тирозинкінази.
18. Фармацевтична композиція за п. 17, яка містить, додатково до антагоніста ЕСБЕ-К, рідкий носій і пропелент.
19. Фармацевтична композиція за п. 17, в якій антагоніст ЕСР-К міститься у водному або етанольному розчині. сч
20. Фармацевтична композиція за п. 17, в якій антагоніст ЕСР-К входить до складу сухої порошкової композиції. і) с с у (зе) і -
- . и? -і (95) -і іме) Ко) іме) 60 б5
UA2001021134A 1998-08-18 1999-08-17 Treatment of mucus hypersecretion in lungs by administration of epidermal growth factor receptor (egf-r) antagonist and pharmaceutical formulation UA73722C2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US9702398P 1998-08-18 1998-08-18
PCT/US1999/018696 WO2000010588A2 (en) 1998-08-18 1999-08-17 Epidermal growth factor receptor antagonists for treating hypersecretion of mucus in the lungs

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA73722C2 true UA73722C2 (en) 2005-09-15

Family

ID=22260380

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA2001021134A UA73722C2 (en) 1998-08-18 1999-08-17 Treatment of mucus hypersecretion in lungs by administration of epidermal growth factor receptor (egf-r) antagonist and pharmaceutical formulation

Country Status (36)

Country Link
US (6) US6270747B1 (uk)
EP (2) EP1119349B1 (uk)
JP (2) JP2002539072A (uk)
KR (1) KR100609646B1 (uk)
CN (1) CN1184961C (uk)
AR (1) AR020220A1 (uk)
AT (1) ATE399541T1 (uk)
AU (1) AU760766B2 (uk)
BR (1) BR9912672A (uk)
CA (1) CA2337422C (uk)
CO (1) CO5130028A1 (uk)
CY (1) CY1110370T1 (uk)
CZ (1) CZ2001584A3 (uk)
DE (1) DE69939022D1 (uk)
DK (1) DK1119349T3 (uk)
EA (1) EA004316B1 (uk)
EE (1) EE200100097A (uk)
ES (1) ES2310047T3 (uk)
HK (1) HK1036219A1 (uk)
HR (1) HRP20010119B1 (uk)
HU (1) HUP0103894A3 (uk)
ID (1) ID27345A (uk)
IL (2) IL140855A0 (uk)
MY (1) MY126490A (uk)
NO (1) NO327000B1 (uk)
NZ (1) NZ509271A (uk)
PH (2) PH12010000215A1 (uk)
PL (1) PL200940B1 (uk)
PT (1) PT1119349E (uk)
RS (1) RS50273B (uk)
SI (1) SI1119349T1 (uk)
SK (1) SK287805B6 (uk)
TR (1) TR200100560T2 (uk)
TW (1) TWI250019B (uk)
UA (1) UA73722C2 (uk)
WO (1) WO2000010588A2 (uk)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6846799B1 (en) * 1998-08-18 2005-01-25 The Regents Of The University Of California Preventing airway mucus production by administration of EGF-R antagonists
US7354894B2 (en) 1998-08-18 2008-04-08 The Regents Of The University Of California Preventing airway mucus production by administration of EGF-R antagonists
EE200100097A (et) 1998-08-18 2002-06-17 The Regents Of The University Of California Hingamisteede lima tootmise tõkestamine EGF-R antagonistide manustamise teel
US20030149113A1 (en) * 2001-10-12 2003-08-07 Caplan Michael J. Conductance of improperly folded proteins through the secretory pathway and related methods for treating disease
US20030236300A1 (en) * 1999-10-27 2003-12-25 Yale University Conductance of improperly folded proteins through the secretory pathway and related methods for treating disease
WO2002094318A1 (en) * 2001-05-18 2002-11-28 University Of Southern California Vector for targeted delivery to cells
US6818446B2 (en) 2001-11-21 2004-11-16 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for the analysis of mucin gene expression and identification of drugs having the ability to inhibit mucin gene expression
DE10204462A1 (de) * 2002-02-05 2003-08-07 Boehringer Ingelheim Pharma Verwendung von Tyrosinkinase-Inhibitoren zur Behandlung inflammatorischer Prozesse
US6924285B2 (en) * 2002-03-30 2005-08-02 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Bicyclic heterocyclic compounds, pharmaceutical compositions containing these compounds, their use and process for preparing them
CA2483340A1 (en) * 2002-04-24 2003-11-06 Research Development Foundation Synergistic effects of nuclear transcription factor nf-.kappa.b inhibitors and anti-neoplastic agents
EP1523318A4 (en) * 2002-06-24 2007-07-04 Res Dev Foundation TREATMENT OF HUMAN MULTIPLE MYELOMA BY CURCUMIN
US20060241130A1 (en) * 2003-01-31 2006-10-26 Ehud Keinan Anti-inflammatory compositions and uses thereof
US7195899B1 (en) * 2003-03-14 2007-03-27 Florida State University Research Foundation, Inc. Cell-based biosensor for harmful airborne agents
EP1658061A2 (en) * 2003-08-26 2006-05-24 Research Development Foundation Aerosol delivery of curcumin
EP1694335A4 (en) 2003-08-26 2008-12-31 Res Dev Foundation OSTEOCLASTOGENESIS HEMMER AND ITS USES
US20060115523A1 (en) * 2004-12-01 2006-06-01 Konduri Kameswari S Sterically stabilized liposome and triamcinolone composition for treating the respiratory tract of a mammal
US11324698B2 (en) 2003-08-28 2022-05-10 Vgsk Technologies, Inc. Sterically stabilized carrier for aerosol therapeutics, compositions and methods for treating the respiratory tract of a mammal
US8846079B1 (en) 2004-12-01 2014-09-30 Vgsk Technologies, Inc. Sterically stabilized carrier for aerosol therapeutics, compositions and methods for treating the respiratory tract of a mammal
US20050096332A1 (en) * 2003-10-30 2005-05-05 Boehringer Ingelheim International Gmbh Use of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of inflammatory processes
ATE485307T1 (de) 2003-11-07 2010-11-15 Ablynx Nv Camelidae schwere ketten antikörper vhhs gegen epidermalen wachstumfaktor rezeptor (egfr) und ihre verwendung
US7968575B2 (en) * 2004-05-05 2011-06-28 Renopharm Ltd. Nitric oxide donors and uses thereof
US7498445B2 (en) * 2004-05-05 2009-03-03 Renopharm Ltd. Thiazole-based nitric oxide donors capable of releasing two or more nitric oxide molecules and uses thereof
EP1753734A1 (en) * 2004-05-05 2007-02-21 Renopharm Ltd. Nitric oxide donors and uses thereof
US8134010B2 (en) * 2004-05-05 2012-03-13 Renopharm Ltd. Thiazole-based nitric oxide donors having aryl substituent(s) and uses thereof
US6998028B1 (en) * 2004-09-24 2006-02-14 Superpower, Inc. Methods for forming superconducting conductors
AU2005288519A1 (en) * 2004-09-27 2006-04-06 Technion Research & Development Foundation Ltd. Fatty acid modified polylysines as antimicrobial agents
US7915223B2 (en) * 2004-09-27 2011-03-29 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antimicrobial agents
WO2006035706A1 (ja) * 2004-09-28 2006-04-06 Dainippon Ink And Chemicals, Inc. 薬効評価用動物、薬効評価用動物の慢性閉塞性肺疾患発症方法及びその動物を用いた薬効評価方法
JP4690158B2 (ja) * 2004-09-28 2011-06-01 スギ生物科学研究所株式会社 薬効評価用動物、薬効評価用動物の慢性閉塞性肺疾患発症方法及びその動物を用いた薬効評価方法
EP1933624A4 (en) * 2005-10-11 2009-09-16 Univ Washington COMPOSITIONS AND METHOD FOR THE TREATMENT OF HYPERSEKRETION OF RESPIRATORY WAYS
EP1921070A1 (de) * 2006-11-10 2008-05-14 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Bicyclische Heterocyclen, diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel, deren Verwendung und Verfahren zu ihrer Herstelllung
EA200901041A1 (ru) * 2007-02-06 2010-02-26 Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Бициклические гетероциклы, содержащие эти соединения лекарственные средства, их применение и способ их получения
US20080293740A1 (en) * 2007-04-03 2008-11-27 Parion Sciences, Inc. Method of treating acid-sensing ion channel mediated pain, cough suppression, and central nervous system disorders
WO2008132737A1 (en) * 2007-04-30 2008-11-06 Technion Research & Development Foundation Ltd. Novel antimicrobial agents
WO2008132738A2 (en) * 2007-04-30 2008-11-06 Technion Research & Development Foundation Ltd. Anticancerous polymeric agents
WO2009098061A1 (de) * 2008-02-07 2009-08-13 Boehringer Ingelheim International Gmbh Spirocyclische heterocyclen, diese verbindungen enthaltende arzneimittel, deren verwendung und verfahren zu ihrer herstellung
CA2733153C (en) * 2008-08-08 2016-11-08 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cyclohexyloxy substituted heterocycles, pharmaceutical compositions containing these compounds and processes for preparing them
US8112365B2 (en) * 2008-12-19 2012-02-07 Foster Scott C System and method for online employment recruiting and evaluation
WO2010085665A2 (en) 2009-01-23 2010-07-29 Cedars-Sinai Medical Center Targeted delivery system
US8541382B2 (en) 2010-11-13 2013-09-24 Sirbal Ltd. Cardiac glycoside analogs in combination with emodin for cancer therapy
US8734859B1 (en) 2010-11-13 2014-05-27 Sirbal Ltd. Molecular combinations for cancer or other disease treatment
US9066974B1 (en) 2010-11-13 2015-06-30 Sirbal Ltd. Molecular and herbal combinations for treating psoriasis
US9095606B1 (en) 2010-11-13 2015-08-04 Sirbal Ltd. Molecular and herbal combinations for treating psoriasis
AU2012205791B2 (en) * 2011-01-10 2016-11-03 Invion, Ltd. Use of beta-adrenergic inverse agonists for smoking cessation
ES2703052T3 (es) 2012-08-03 2019-03-06 Cedars Sinai Medical Center Aislamiento de mutantes potenciadores del tráfico de proteína de entrega de fármacos
EP3027026A4 (en) 2013-07-31 2017-05-03 Windward Pharma, Inc. Aerosol tyrosine kinase inhibitor compounds and uses thereof
WO2015082950A1 (en) 2013-12-02 2015-06-11 Sirbal Ltd. Herbal combinations for treatment of a skin condition
EP3328498B1 (en) 2015-07-29 2021-05-05 Sirbal Ltd. Medical kit comprising herbal combinations for treating psoriasis

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2932481A (en) * 1954-06-15 1960-04-12 Breer Bipod camera support
GB1242211A (en) * 1967-08-08 1971-08-11 Fisons Pharmaceuticals Ltd Pharmaceutical composition
FR2502627A1 (fr) * 1981-02-02 1982-10-01 Refarmed Sa Derives thioliques de l'erythromycine a activite therapeutique, procede de preparation et produits pharmaceutiques dans lesquels ils apparaissent
IT1173549B (it) * 1984-04-02 1987-06-24 Corvi Camillo Spa Estere dell'acido teofillin-7-acetico con il d,l-trans-sobrerolo avente attivita' mucosecretolitica-fluidificante e antibroncospastica, procedimento per la sua preparazione e sue composizioni farmaceutiche
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4904786A (en) * 1986-01-27 1990-02-27 American Home Products Corporation Quinoline compounds as antiallergic and antiinflammatory agents
US5089516A (en) * 1987-03-11 1992-02-18 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha 1-phenyl-3,5-pyrazolidinedione hydroxystyrene compounds which have tyrosine kinase inhibiting activity
US5217999A (en) 1987-12-24 1993-06-08 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Styryl compounds which inhibit EGF receptor protein tyrosine kinase
AU4203789A (en) * 1988-09-28 1990-04-18 Upjohn Company, The 1,4-dihydrothionapthoquinone and heterocyclic congeners which inhibit lipoxygenase enzymes
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
GB8904009D0 (en) 1989-02-22 1989-04-05 Celltech Ltd Vector
US5362755A (en) * 1990-01-05 1994-11-08 Sepracor, Inc. Method for treating asthma using optically pure (R)-albuterol
US5302606A (en) * 1990-04-16 1994-04-12 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Styryl-substituted pyridyl compounds which inhibit EGF receptor tyrosine kinase
US5165424A (en) 1990-08-09 1992-11-24 Silverman Harvey N Method and system for whitening teeth
US5404871A (en) 1991-03-05 1995-04-11 Aradigm Delivery of aerosol medications for inspiration
CA2082160C (en) * 1991-03-06 2003-05-06 Mary M. Bendig Humanised and chimeric monoclonal antibodies
US5116616A (en) * 1991-04-29 1992-05-26 Bio-Technology General Corp. Use of intratracheal administration of SOD to protect humans from lung injury due to hyperoxia and hyperventilation
DE4117078A1 (de) * 1991-05-25 1992-11-26 Boehringer Ingelheim Kg Verfahren zur herstellung therapeutisch anwendbarer aerosole
ES2284226T3 (es) 1991-07-02 2007-11-01 Nektar Therapeutics Dispositivo para proporcionar medicamentos en aerosol.
PT100905A (pt) * 1991-09-30 1994-02-28 Eisai Co Ltd Compostos heterociclicos azotados biciclicos contendo aneis de benzeno, ciclo-hexano ou piridina e de pirimidina, piridina ou imidazol substituidos e composicoes farmaceuticas que os contem
DE4310051A1 (de) 1992-04-11 1993-10-14 Byk Gulden Lomberg Chem Fab Weitere Verwendung substituierter Pyridazine
US5785049A (en) 1994-09-21 1998-07-28 Inhale Therapeutic Systems Method and apparatus for dispersion of dry powder medicaments
EP0659046A1 (en) * 1992-09-11 1995-06-28 The Regents of The University of Michigan Non-human animal with xenograft of on airway populated by human cells
IL108367A0 (en) * 1993-01-27 1994-04-12 Hektoen Inst For Medical Resea Antisense polynzcleotide inhibition of human growth factor-sensitive cancer cells
US5497763A (en) 1993-05-21 1996-03-12 Aradigm Corporation Disposable package for intrapulmonary delivery of aerosolized formulations
GB9314884D0 (en) 1993-07-19 1993-09-01 Zeneca Ltd Tricyclic derivatives
GB9314893D0 (en) 1993-07-19 1993-09-01 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
US5716981A (en) * 1993-07-19 1998-02-10 Angiogenesis Technologies, Inc. Anti-angiogenic compositions and methods of use
WO1995006764A2 (en) 1993-09-03 1995-03-09 Vpi Holdings Ltd. Oligonucleotides with rna cleavage activity
DK0719412T3 (da) * 1993-09-13 1999-07-19 Merck Frosst Canada Inc Fremgangsmåde til måling af metaplastiske ændringer i slimsecernerende epithelceller
CA2261433A1 (en) * 1993-12-09 1995-06-10 Belinda Sanchez Ramirez Composition comprising autologous epidermal growth factor
AU706417B2 (en) 1994-02-23 1998-06-17 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for inhibiting the expression of disease related genes
WO1995024190A2 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Sugen, Inc. Receptor tyrosine kinase inhibitors for inhibiting cell proliferative disorders and compositions thereof
US20030114379A1 (en) * 1994-03-08 2003-06-19 Human Genome Sciences, Inc. Methods of treating or preventing cell, tissue, and organ damage using human myeloid progenitor inhibitory factor-1 (MPIF-1)
GB9510757D0 (en) * 1994-09-19 1995-07-19 Wellcome Found Therapeuticaly active compounds
DK0817775T3 (da) 1995-03-30 2001-11-19 Pfizer Quinazolinderivater
GB9508565D0 (en) 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quiazoline derivative
GB9508538D0 (en) 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
US5932574A (en) 1995-04-27 1999-08-03 Zeneca Limited Quinazoline derivatives
US5747498A (en) * 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
GB9523675D0 (en) * 1995-11-20 1996-01-24 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
US5760041A (en) 1996-02-05 1998-06-02 American Cyanamid Company 4-aminoquinazoline EGFR Inhibitors
SI0892789T2 (sl) * 1996-04-12 2010-03-31 Warner Lambert Co Ireverzibilni inhibitorji tirozin kinaz
AU727352B2 (en) * 1996-07-29 2000-12-14 Paringenix, Inc. Methods of treating asthma with o-desulfated heparin
SE9603725D0 (sv) 1996-10-11 1996-10-11 Astra Ab New teatment
UA73073C2 (uk) 1997-04-03 2005-06-15 Уайт Холдінгз Корпорейшн Заміщені 3-ціанохіноліни, спосіб їх одержання та фармацевтична композиція
ZA986732B (en) 1997-07-29 1999-02-02 Warner Lambert Co Irreversible inhibitiors of tyrosine kinases
ZA986729B (en) 1997-07-29 1999-02-02 Warner Lambert Co Irreversible inhibitors of tyrosine kinases
TW436485B (en) 1997-08-01 2001-05-28 American Cyanamid Co Substituted quinazoline derivatives
US6251912B1 (en) * 1997-08-01 2001-06-26 American Cyanamid Company Substituted quinazoline derivatives
AU1924699A (en) 1997-12-19 1999-07-12 Smithkline Beecham Corporation Compounds of heteroaryl substituted imidazole, their pharmaceutical compositionsand uses
DE69940808D1 (de) * 1998-03-04 2009-06-10 Bristol Myers Squibb Co Heterocyclen substituierte imidazopyrazine als protein- tyrosin-kinase-inhibitoren
US5968748A (en) * 1998-03-26 1999-10-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of human HER-2 expression
EE200100097A (et) 1998-08-18 2002-06-17 The Regents Of The University Of California Hingamisteede lima tootmise tõkestamine EGF-R antagonistide manustamise teel
US6297258B1 (en) * 1998-09-29 2001-10-02 American Cyanamid Company Substituted 3-cyanoquinolines
US6288082B1 (en) * 1998-09-29 2001-09-11 American Cyanamid Company Substituted 3-cyanoquinolines
ID29800A (id) 1999-02-27 2001-10-11 Boehringer Ingelheim Pharma Turunan-turunan 4-amino-kinazolin dan kinolin yang mempunyai efek inhibitor pada transduksi signal yang dimediasi oleh tirosin kinase
EP1226136B1 (en) * 1999-10-19 2004-12-29 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
CA2403152C (en) 2000-04-08 2008-10-28 Boehringer Ingelheim Pharma Kg Bicyclic heterocycles, pharmaceutical compositions containing these compounds, their use and processes for preparing them
US6627634B2 (en) * 2000-04-08 2003-09-30 Boehringer Ingelheim Pharma Kg Bicyclic heterocycles, pharmaceutical compositions containing them, their use, and processes for preparing them

Also Published As

Publication number Publication date
ID27345A (id) 2001-04-05
AU5676699A (en) 2000-03-14
HRP20010119B1 (en) 2008-05-31
DE69939022D1 (de) 2008-08-14
EA004316B1 (ru) 2004-02-26
HK1036219A1 (en) 2001-12-28
JP2009221212A (ja) 2009-10-01
IL140855A0 (en) 2002-02-10
NO20010749L (no) 2001-04-17
CA2337422C (en) 2010-11-02
EP1119349B1 (en) 2008-07-02
NZ509271A (en) 2003-10-31
US20080175797A1 (en) 2008-07-24
CZ2001584A3 (cs) 2002-06-12
US6566324B2 (en) 2003-05-20
EA200100136A1 (ru) 2001-10-22
US20030148990A1 (en) 2003-08-07
KR20010085412A (ko) 2001-09-07
MY126490A (en) 2006-10-31
AU760766B2 (en) 2003-05-22
RS50273B (sr) 2009-07-15
SK2162001A3 (en) 2002-08-06
CA2337422A1 (en) 2000-03-02
WO2000010588A9 (en) 2000-08-10
SK287805B6 (sk) 2011-10-04
PL200940B1 (pl) 2009-02-27
DK1119349T3 (da) 2008-10-13
CY1110370T1 (el) 2015-04-29
HUP0103894A3 (en) 2003-07-28
YU13201A (sh) 2005-07-19
US20010036919A1 (en) 2001-11-01
AR020220A1 (es) 2002-05-02
TWI250019B (en) 2006-03-01
PL351765A1 (en) 2003-06-16
JP2002539072A (ja) 2002-11-19
ES2310047T3 (es) 2008-12-16
PH12010000216A1 (en) 2015-07-27
IL140855A (en) 2011-02-28
NO20010749D0 (no) 2001-02-14
US6551989B2 (en) 2003-04-22
CN1184961C (zh) 2005-01-19
EP1119349A2 (en) 2001-08-01
WO2000010588A3 (en) 2001-05-25
PT1119349E (pt) 2008-10-14
US8071074B2 (en) 2011-12-06
US8048844B1 (en) 2011-11-01
CO5130028A1 (es) 2002-02-27
TR200100560T2 (tr) 2002-05-21
US20010041178A1 (en) 2001-11-15
CN1354657A (zh) 2002-06-19
SI1119349T1 (sl) 2008-12-31
WO2000010588A2 (en) 2000-03-02
EP1970058A1 (en) 2008-09-17
HRP20010119A2 (en) 2002-02-28
US7358222B2 (en) 2008-04-15
PH12010000215A1 (en) 2015-07-27
KR100609646B1 (ko) 2006-08-04
HUP0103894A2 (hu) 2002-04-29
EE200100097A (et) 2002-06-17
ATE399541T1 (de) 2008-07-15
NO327000B1 (no) 2009-03-30
BR9912672A (pt) 2002-06-11
US6270747B1 (en) 2001-08-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA73722C2 (en) Treatment of mucus hypersecretion in lungs by administration of epidermal growth factor receptor (egf-r) antagonist and pharmaceutical formulation
US7700547B2 (en) Preventing airway mucus production by administration of EGF-R antagonists
JP2010065053A (ja) Ｅｇｆ−ｒアンタゴニストの投与による気道粘液産生の防止方法
MXPA01001755A (en) Preventing airway mucus production by administration of egf-r antagonists
BG105158A (bg) Предотвратяване образуването на слузести покрития(мускус) върху летателни писти с прилагане на противодействащо средство egf-r