JP2010065053A - Ｅｇｆ−ｒアンタゴニストの投与による気道粘液産生の防止方法 - Google Patents

Ｅｇｆ−ｒアンタゴニストの投与による気道粘液産生の防止方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2010065053A
JP2010065053A JP2009261019A JP2009261019A JP2010065053A JP 2010065053 A JP2010065053 A JP 2010065053A JP 2009261019 A JP2009261019 A JP 2009261019A JP 2009261019 A JP2009261019 A JP 2009261019A JP 2010065053 A JP2010065053 A JP 2010065053A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
egf
cells
antagonist
antibody
egfr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2009261019A
Other languages
English (en)
Inventor
Jay A Nadel
ジェイ エイ． ネイデル
Tadashi Takeyama
廉 武山
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Publication of JP2010065053A publication Critical patent/JP2010065053A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/12—Mucolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

【課題】気道における粘液の過剰分泌を阻害する方法、および気道における肺細胞過形成を低下させるための薬学的製剤の提供。
【解決手段】治療に有効な量の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）アンタゴニストを、気道肺細胞過形成による気道粘液過剰分泌に罹患した患者へ投与することを含む、個体の気道における肺細胞過形成を低下させる方法、および該アンタゴニストと薬学的に許容される担体とを含む、気道における肺細胞過形成を低下させるための薬学的製剤。該アンタゴニストとしては、ＥＧＦ−Ｒに選択的なキナーゼ阻害剤、上皮増殖因子と特異的に結合するモノクローナル抗体、抗酸化剤等であることが好ましい。
【選択図】図１７

Description

政府の権利
米国政府は、国立衛生研究所プログラムにより授与された助成金HL-24136のため、本願における一定の権利を有しうる。
発明の分野
本発明は、一般的には肺治療の領域に関する。より具体的には、本発明は、EGF-Rアンタゴニストの投与による、肺及び気道における粘液の過剰分泌の阻害に関する。さらに、本発明は、肺における粘液の過剰分泌を阻害することができる候補薬剤の開発又は査定のための方法にも関する。
発明の背景
呼吸系の誘導気道においては、粘液線毛系が、吸入された粒子又は感染体を肺の気道の外へ移動させるための第一の防御メカニズムとして機能している。さらに、気道の体液中に存在する物質が、粒子の毒性を制限し、感染体を不活化するように機能する。咳の物理的メカニズムは、気道から粘液を排斥するように機能する（例えば、「呼吸系医療の基礎（Foundation of Respiratory Care）」,Pierson及びKacmarek編(1992)Churchill Livingstone Inc.,New York,New York:非特許文献１,「内科のハリソンの原理（Harrison's Principles of Internal Medicine）」,Fauciら編(1997)第14版,McGraw Hill,New York,New York:非特許文献２ 参照）。
粘液線毛系は、線毛上皮細胞、上皮杯細胞、並びに粘膜下腺中に位置している漿液細胞及び粘液細胞からなる。線毛は、上皮を介した塩化物の能動輸送及び水の受動的な移動により気道の内腔へ分泌された水性層（線毛周囲液）により囲まれている。線毛は、この水性層の上に浮遊している粘液と接触し、一方向の推進運動により粘液を声門へと移動させる（Pierson及びKacmarek（前記:非特許文献１）及びFauciら（前記:非特許文献２）を参照のこと）。粘液は、上皮杯細胞及び粘膜下腺細胞により産生され、脱顆粒後に気道の内腔へと分泌される。
粘液は、一般的に、吸入された粒子又は感染体のクリアランスを促すが、気道における粘液の過剰分泌は、進行性の気道閉塞を引き起こす場合がある。末梢気道においては、咳は分泌物の清掃に有効でない。さらに、多くの杯細胞を含有している小気道は、その小さい寸法のため、粘液による気道栓塞を特に起こしやすい。気道過剰分泌は、相当数の個体に影響を与えており、慢性気管支炎、急性喘息、嚢胞性繊維症、及び気管支拡張のような多様な肺疾患において見られる。
粘液の過剰分泌は、慢性閉塞性肺疾患（COPD）を有する患者における主要な症状であり、その状態（即ち、慢性的な咳及び痰の産生）を決定する。この状態は、単独で、1千4百万人の米国人に影響を与えており、進行性の疾病及び死亡を引き起こす場合がある。喘息は、米国人口の少なくとも4％に影響を与え、年間少なくとも2000例の死亡の原因となっていると推定されている（Pierson及びKucmarek（前記:非特許文献１））。急性喘息の発作中には、気管支壁が膨張し、粘液の量が増加し、気管支平滑筋が収縮し、それにより気道の狭窄が引き起こされる。急性喘息における過剰分泌の結果として、拡張的な粘液栓塞が、罹患率及び死亡率の主要な原因となりうる。
過剰分泌は、世界で最も一般的な致命的な遺伝病の一つである嚢胞性繊維症にも関与していることが示されている。嚢胞性繊維症は、サイクリックAMP依存性プロテインキナーゼによる膜塩化物イオンチャネルの活性化に対して気道粘液細胞が非応答性になる常染色体劣性疾患である（Pierson及びKacmarek（前記:非特許文献１）、及びFauciら（前記:非特許文献２））。嚢胞性繊維症に罹患した個体の肺においては、その後の電解質の不均衡により、気道粘液の水和レベルが減少し、それにより粘液が高度に粘稠となる。過剰分泌は、嚢胞性繊維症を有する個体の気道を閉塞し、さらに肺機能を損なわせる。
過剰分泌を含むその他の疾患には、慢性閉塞性肺疾患（COPD）が含まれる。COPDの病原においては、酸化ストレスが重要な役割を果たしている。酸素フリーラジカルを生成させるタバコ煙が、病原に強く関与していることが示されている。COPDにおいては炎症部位に好中球が観察されることが多く、興味深いことに、酸素フリーラジカルは、活性化の間に好中球により放出されることが知られている。
様々な肺疾患を有する患者に補助換気を提供するため、機械的な挿管が必要となることが多い。チューブを、口腔咽頭部から導入し、気管内に設置する。気管内チューブの周囲の空気の漏出を防止するため、気管下方においてチューブの周囲にバルーンを膨張させるが、それは、上皮を剥離させ杯細胞化生を引き起こす場合がある。上皮の創傷は、大量の粘液分泌を引き起こしうる修復過程へと至る。患者におけるそのような長期的な気管内挿管は、過剰分泌による有害な効果に至る場合もある。
過剰分泌性肺疾患を有する患者の肺においては、高レベルの粘液の結果として、粘液のクリアランスが減少する。細菌、例えば緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のような病原体が、しばしば粘液内にコロニーを確立し、高頻度で肺感染を引き起こす。
気道過剰分泌に罹患した個体を治療するための古典的な療法には、抗生物質療法、気管支拡張剤（例えば、メチルキサンチン類、強力なβ2アドレナリン刺激特性を有する交感神経作用薬、抗コリン作用薬）、主に喘息における全身投与又は吸入によるコルチコステロイドの使用、去痰薬、例えばグアイフェネシンの経口投与による粘液の液化、及び「粘液溶解」剤、例えば水、高張生理食塩水のエアロゾル送達が含まれる（Harrison's（前記:非特許文献２）を参照）。嚢胞性繊維症のためのより最近の療法は、DNAを多く含む粘液又は痰を標的とするDNAseの投与である（Shakら(1990)Proc.Natl.Acad.(USA)87:9188-9192:非特許文献３ ；Hubbard,R.C.ら(1991)N.Engl.J.Med.326:812:非特許文献４）。さらに、打診法、振とう法、及びドレナージからなる胸部物理療法も、粘稠な粘液のクリアランスを促すために使用されている。肺移植は重篤な肺障害を有する者のための最終的な選択となりうる。従って、粘液分泌を標的とする、より効率的な、又は代替的な療法が必要である。特に、気道における粘液分泌物の形成を減少させるであろう特別な療法が必要とされている。
関連文献
癌細胞の増殖を阻止するためのEGF阻害剤の使用は、レビツキ（Levitski）(1994)Eur J Biochem.226(1):1-13:非特許文献５ ；ポウィス（Powis）(1994)Pharmac.Ther.62:57-95:非特許文献６ ；コンダパカ（Kondapaka）とレディー（Reddy）(1996)Mol.Cell.Endocrin.117:53-58:非特許文献７に概説されている。
「呼吸系医療の基礎（Foundation of Respiratory Care）」,Pierson及びKacmarek編(1992)Churchill Livingstone Inc.,New York,New York 「内科のハリソンの原理（Harrison's Principles of Internal Medicine）」,Fauciら編(1997)第14版,McGraw Hill,New York,New York Shakら(1990)Proc.Natl.Acad.(USA)87:9188-9192 Hubbard,R.C.ら(1991)N.Engl.J.Med.326:812 レビツキ（Levitski）(1994)Eur J Biochem.226(1):1-13 ポウィス（Powis）(1994)Pharmac.Ther.62:57-95 コンダパカ（Kondapaka）とレディー（Reddy）(1996)Mol.Cell.Endocrin.117:53-58
気道における粘液の過剰分泌は、多数の異なる肺疾患の有害な症状である。分泌は、杯細胞の脱顆粒により引き起こされ、杯細胞の増殖は上皮増殖因子受容体（EGF-R）の刺激により促進される。本発明は、治療的な量のEGFアンタゴニスト、好ましくはキナーゼ阻害剤を投与することにより、肺過剰分泌を治療する。アンタゴニストは、EGF又はその受容体のいずれかと結合する、低分子、抗体、又は抗体の一部の形態でありうる。本発明のもう一つの面において、粘液の過剰分泌を阻害する候補薬剤の治療的可能性を予測するインビトロ及びインビボの方法が提供される。
本発明の第一の目的は、肺における粘液の過剰分泌を含む疾患を治療する方法を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、粘液の過剰分泌を引き起こす疾患の治療において有用な製剤を提供することである。
本発明のさらにもう一つの目的は、（i）杯細胞増殖のインビトロ・モデルを、EGF又はその機能的等価物と接触させる工程、（ii）続いて、インビトロ・モデルを候補薬剤と接触させる工程、及び（iii）杯細胞増殖を査定し、その際、杯細胞増殖の阻害をその候補薬剤の治療的可能性の指標とする工程を含む、粘液の過剰分泌を阻害する候補薬剤のスクリーニングのためのインビトロ・アッセイ法を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、（i）例えば腫瘍壊死因子−α（TNF-α）で、EGF-Rを誘導することにより、過剰分泌性肺疾患の動物モデルを作出すること、（ii）ムチン産生杯細胞が産生されるよう、リガンド、例えばトランスフォーミング増殖因子α（TGF-α）又はEGFで、誘導されたEGF-Rを刺激すること、（iii）候補薬剤で処理すること、及び（iv）杯細胞増殖又は粘液分泌を査定し、その際、杯細胞増殖又は粘液分泌の阻害を候補薬剤の治療的可能性の指標とすることを含む、粘液の過剰分泌を阻害する候補薬剤のスクリーニングのためのインビボ・アッセイ法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、粘液の過剰分泌を阻害するEGF-Rアンタゴニストのスクリーニングのためのインビトロ・アッセイ法及びインビボ・アッセイ法を提供することである。
本発明の利点は、肺気道における過剰な粘液形成を防止するための手段を提供する点である。
本発明の特徴は、ある範囲の異なる型のアンタゴニストが、EGF及び／又はTGF-αの効果、並びにそれらのEGF-Rとの相互作用を阻止するために使用されうるという点である。
本発明の一つの面は、哺乳動物患者、好ましくはヒト患者の気道における粘液分泌物の形成を減少させるためのEGFアンタゴニストの製剤である。
本発明のもう一つの目的は、哺乳動物患者、好ましくはヒト患者の気道における粘液分泌を減少させるためのEGFアンタゴニストの肺内送達の方法である。
本発明のもう一つの目的は、気道における過剰な粘液分泌物形成を症状として有する、ある範囲の異なる疾患を治療するための方法を提供することである。これらの疾患には、これらに限定はされないが、慢性気管支炎、急性喘息、嚢胞性繊維症、気管支拡張、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性刺激又は機械的剥離のような上皮の傷害に起因する過剰分泌、及び鼻の過剰分泌が含まれる。
本発明のこれら及びその他の目的、利点、及び特徴は、より完全に以下に記載される治療法、並びにインビトロ及びインビボのアッセイ法の詳細を参照することにより、当業者に明らかとなろう。
好ましい態様の詳細な説明
治療的な量のEGFアンタゴニスト、好ましくはキナーゼ阻害剤を投与することによる、気道粘液過剰分泌の治療のための組成物及び方法が提供される。アンタゴニストは、EGF又はその受容体のいずれかと結合する、低分子、抗体、又は抗体の一部の形態でありうる。気道過剰分泌性疾患、例えば慢性気管支炎、気管支拡張、嚢胞性繊維症、急性喘息、COPD等においては、気道におけるムチン合成が増加し、粘液過剰分泌が起こる。分泌された粘液は、気道の閉塞を引き起こし、この効果は、これらの疾患における死亡を引き起こす。
気道傷害及び炎症のいくつかの原因が、気道上皮細胞における上皮増殖因子受容体の発現を誘導することが、本明細書において示される。EGF-R誘導の後、その後のリガンド依存性及び非リガンド依存性の両方のメカニズムによるEGF-Rの刺激により、遺伝子発現レベル及びタンパク質レベルの両方においてムチン産生が引き起こされる。EGF-Rチロシンキナーゼの選択的阻害剤が、このムチンの遺伝子及びタンパク質の発現を阻止することが証明される。
本発明を制限するものではないが、杯細胞産生の展開の順序はEGF-Rの発現に基づくことが示唆される。TNFαによる刺激により、非顆粒形成分泌細胞の強いEGF-R染色が誘導され、それに続くEGF-Rリガンドによる活性化により、進行的に細胞質内の粘液糖質複合体に関する染色が引き起こされ、そして細胞は「前杯」細胞となり、次いで「杯」細胞となる。データは、EGF-R活性化が、選択的な細胞分化を促進し、増殖は促進しないことを示唆している。杯細胞は、EGF-Rを発現している非顆粒形成分泌細胞に由来しており、EGF-Rリガンドにより刺激されてムチンを産生すると考えられる。
EGF-Rは、サイトカインによる刺激に加え、その他のシグナル伝達メディエータによっても刺激されうる。例えば、長期にわたる喫煙は、杯細胞の過形成を含む、末梢気道における進行性の病理学的変化と関連している。炎症誘発性サイトカインにより活性化された好中球及びタバコ煙は、非リガンド依存性のEGF-Rの活性化を介して、ヒト気管支上皮細胞におけるムチン合成を引き起こすことが示され、このことは、動員された好中球及びタバコ煙が、気道におけるムチン産生細胞の異常な誘導を引き起こす上皮細胞分化の制御因子であることを意味している。IL-8、N-ホルミル-メチオニル-ロイシル-フェニルアラニン、TNF-α、タバコ煙、又はH2O2を含む多様な刺激により活性化された好中球は、上皮細胞におけるムチン発現を上方制御するが、その合成はEGF-R阻害剤により阻害される。好中球は、EGF-Rリガンド、EGF、及びTGFαを産生することもできる。さらに、上皮細胞はEGF-Rリガンドの起源である。
気道上皮に対する機械的損傷も、過剰分泌を引き起こし、粘液栓塞の原因となりうる。EGF-Rチロシンキナーゼの阻害剤は、気管内挿管後の粘液過剰分泌を防止するよう機能する。
上皮の傷害は、軽度の喘息の場合ですら、喘息を有する患者の研究における一般的な所見であり、傷害は臨床的症状の悪化と増加的に関係している。アレルギー応答により生じた上皮傷害は、EGF-R活性化を誘導し、それが異常な杯細胞産生を引き起こす。EGF-Rは、上皮傷害、例えば喘息において起こる「気道リモデリング」、修復、及び創傷閉鎖に関与していることが示されている。機械的な上皮傷害及び喘息における上皮損傷は、上皮分泌細胞の異常増殖を引き起こす、類似したEGF-Rカスケードを含んでいる可能性がある。
過剰分泌は、鼻の炎症性疾患の重要な徴候でもある。好中球依存性メカニズムを利用して杯細胞脱顆粒を誘導することにより鼻杯細胞を「攻撃」した場合、EGF-R及びムチンの発現が強く上方制御される。これらの現象は杯細胞の再顆粒形成と関連していた。好中球浸潤の刺激のような炎症により、杯細胞の脱顆粒及びムチン分泌が引き起こされると、EGF-Rの上方制御及び活性化により、気道上皮にムチンが再供給される。
本発明の治療法及び製剤を記載する前に、本発明が、記載された特定の方法及び製剤に限定されず、当然、様々に変化しうることを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるため、本明細書において使用された用語は、特定の態様を記載することのみを目的とするものであり、本発明を制限するものではないことも理解されたい。
特記しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載された方法及び材料と類似した、又は等価な任意の方法及び材料が、本発明の実施又は試行において使用されうるが、好ましい方法及び材料が本明細書に記載される。本明細書において言及された全ての出発物は、引用された出版物と共に、方法及び／又は材料を開示し記載するために、参照として本明細書に組み込まれる。
本明細書に記された出版物は、本願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書の記載は、先行特許のため本発明がそのような出版物に先行している資格を有しないことの承認として解釈されるべきではない。さらに、提供された出版物の日付は、実際の公開日と異なっている可能性があり、公開日は独立に確認される必要がある可能性がある。
定義
「上皮増殖因子」又は「EGF」とは、上皮細胞に対する分裂促進活性を特徴とする生物学的活性を有するタンパク質又はその一部を意味する（例えば、Cohen(1986)Biosciences Reports 6(12):1017；Aaronson,S.A.,「増殖因子と癌（Growth Factors and Cancer）」,Science(1991)254:1146-1153）。その例は、例えばアーディア（Urdea）ら(1983)Proc.Nat.Acad.Sci.80:7461-7465により記載されているようなヒト上皮増殖因子である。
本発明の目的のため特に重要であるのは、杯細胞に対するEGFの分裂促進活性である。EGFにより誘発される生物学的応答に関してEGFの機能的等価物であるタンパク質又はその一部も、この定義に包含されるものとする。
「上皮増殖因子受容体」又は「EGF-R」とは、EGFタンパク質又はその一部と結合することができるタンパク質又はその一部を意味する。その例は、ヒト上皮増殖因子受容体である（Ullrichら(1984)Nature 309:418-425参照；ゲンバンクアクセッション番号NM_005228）。好ましくは、EGFリガンドの結合により、EGF-Rが活性化される（例えば、細胞内分裂促進シグナル伝達の活性化、EGF-Rの自己リン酸化が引き起こされる）。当業者であれば、EGFに加え、その他のリガンドが、EGF-Rと結合し、EGF-Rを活性化しうることを認識するであろう。そのようなリガンドの例には、これらに限定はされないが、TGF-α、ベータセルリン（betacellulin）、アンフィレギュリン（amphiregulin）、ヘパリン結合性EGF（HB-EGF）、及びニューレグリン（neuregulin）（ヘルグリン（hergulin）としても知られる）（StrawnとShawver(1998)Exp.-Opin.Invest.Drugs 7(4)553-573及び「タンパク質キナーゼ因子ブック：タンパク質チロシンキナーゼ（The Protein Kinase Facts Book:Protein Tyrosine Kinases）」(1995)Hardiesら編,Academic Press,NY,NY）が含まれる。
「EGF-Rアンタゴニスト」とは、EGF-Rの効果、特に杯細胞増殖又は杯細胞による粘液過剰分泌に対するEGF-Rの効果を、直接的又は間接的に阻害することができる任意の薬剤を意味する。EGF-Rは、それぞれ自己リン酸化又はトランスリン酸化のいずれかを引き起こす、リガンド依存性メカニズム及び非リガンド依存性メカニズムによって活性化されうる。着目しているEGF-Rアンタゴニストは、これらのメカニズムのいずれか又は両方を阻害しうる。例えば、TNF-αとEGF-Rとの結合により、リガンド依存性リン酸化が引き起こされるが、それは、EGF-Rと結合し、それによりEGF受容体を活性するであろうEGFとリガンドとの相互作用を防止する抗体により阻止されうる。そのような抗体の例は、ゴールドステイン（Goldstein）ら(1995)Clin.Cancer Res.1:1311-1318；ロリマー（Lorimer）ら(1995)Clin.Cancer Res.1:859-864；シュミット（Schmidt）とウェルズ（Wels）(1996)Br.J.Cancer 74:853-862に記載されている。低分子チロシンキナーゼ阻害剤も、EGF-Rアンタゴニストとして有効である。
又は、酸素フリーラジカルのような化合物が、EGF-Rのトランスリン酸化を刺激し、非リガンド依存性の受容体の活性化を引き起こすことが示されている。トランスリン酸化によりEGF-Rを活性化するその他の手段には、紫外線及び浸透圧、エンドセリン-1、リゾホスファチジン酸、及びトロンビンによるGタンパク質共役型受容体の刺激、m1ムスカリン性アセチルコリン受容体、並びにヒト成長ホルモンが含まれる。この非リガンド依存性メカニズムのアンタゴニストには、スーパーオキシドジスムターゼ、N-アセチル-L-システイン、DMSO、DMTU、アスコルビン酸等のような抗酸化剤が含まれる。酸化ストレスを介した非リガンド依存性のEGFRの活性化は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（MEK）p44/42マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（p44/42mapk）の活性化をもたらし、ムチン合成をもたらす。このMEK活性化は、選択的MEK阻害剤PD98059、及び抗酸化剤によって阻害される。従って、「EGFRアンタゴニスト」という用語には、MEK阻害剤及び抗酸化剤も包含される。
さらに、EGFR依存性シグナル伝達経路は、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）の刺激によって活性化されうる。GPCRとの相互作用によるヘテロ三量体Gタンパク質のリガンドによる活性化は、膜貫通型メタロプロテイナーゼの細胞外活性を誘導する細胞内シグナルをもたらす。これは、膜貫通型増殖因子前駆体の細胞外プロセシング、及び、直接的に、又はプロテオグリカン・マトリックスを介してEGFRの外部ドメインと相互作用し、細胞内シグナルを活性化する成熟因子の放出をもたらす。プレンゼル（Prenzel）ら(1999)Nature 402:884-888。従って、EGFRは、膜貫通型メタロプロテイナーゼ（MP）の作用による膜結合型EGFRリガンドの放出によって活性化されうる。従って、「EGFRアンタゴニスト」という用語には、これに限定はされないが、特異的メタロプロテイナーゼ阻害剤を含む、この過程の阻害剤がさらに包含される。
EGF-Rアンタゴニストは、EGF産生又はEGF-R産生を刺激する因子と結合し、それによりEGFによる杯細胞増殖の促進を阻害する抗体（即ち、EGF-Rをリン酸化するリン酸化カスケードの阻害剤）であってもよい。例えば、TGFa-シュードモナス（Pseudomonas）外毒素40の融合タンパク質が、アーティーガ（Arteaga）ら(1995)Cancer Res.54:4703-4709により記載されている。
好ましい態様において、EGF-Rアンタゴニストは、EGF-Rのチロシンキナーゼ活性の阻害剤、特に他のチロシンキナーゼと比較してEGF-Rに選択的な作用を有する低分子阻害剤であり、好ましい低分子は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける天然のEGF受容体を阻止し、1kD未満の分子量を有する。
EGF及びEGF-Rの阻害剤には、これらに限定はされないが、キナゾリン類、例えばPD153035、4-（3-クロロアニリノ）キナゾリン、もしくはCP-358,774、ピリドピリミジン類、ピリミドピリミジン類、ピロロピリミジン類、例えばCGP59326、CGP60261、及びCGP62706、並びにピラゾロピリミジン類（ShawnとShawver（前記））、4-（フェニルアミノ）-7H-ピロロ［2,3-d］ピリミジン類（Traxlerら,(1996)J.Med.Chem 39:2285-2292）、クルクミン（ジフェルロイルメタン（diferuloyl methane））（Laxmin arayanaら,(1995),Carcinogen 16:1741-1745）、4,5-ビス（4-フルオロアニリノ）フタリミド（Buchdungerら(1995)Clin.Cancer Res.1:813-821、Dinneyら(1997)Clin.Cancer Res.3:161-168）、ニトロチオフェン部分を含有しているチルホスチン類（tyrphostins）（Bruntonら(1996)Anti Cancer Drug Design 11:265-295）、プロテインキナーゼ阻害剤ZD-1839（AstraZeneca）、CP-358774（Pfizer,inc.）、PD-0183805（Warner-Lambert）、もしくは国際公開公報99/09016（American Cyanamid）、国際公開公報98/43960（American Cyanamid）、国際公開公報97/38983（Warener Labert）、国際公開公報99/06378（Warener Lambert）、国際公開公報99/06396（Warener Lambert）、国際公開公報96/30347（Pfizer,inc.）、国際公開公報96/33978（Zeneca）、国際公開公報96/33977（Zeneca）、及び国際公開公報96/33980（Zeneca）（これらは全て参照として本明細書に組み込まれる）に記載されているようなもの、又はアンチセンス分子が含まれる。
治療法に関して本明細書において使用されるような、EGFRアンタゴニストの「治療に有効な量」とは、EGFR活性化と関連したパラメータの阻害において有効なアンタゴニストの量である。
「EGFR活性化と関連したパラメータの阻害」とは、粘液細胞過形成；杯細胞の増殖；上皮気道細胞の杯細胞への分化；杯細胞の脱顆粒；又は杯細胞による粘液の過剰分泌の低下、減少、中和、軽減、又は防止を意味する。
「治療」、「治療すること」等の用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを一般的に意味するために本明細書において使用される。その効果は、疾患もしくはその症状の完全もしくは部分的な防止に関する予防的なものであってもよいし、かつ／又は疾患及び／もしくは疾患に起因する有害な効果の部分的もしくは完全な治癒に関する治療的なものであってもよい。「治療」とは、本明細書において使用されるように、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、
（a）疾患又は症状の素因を有するが、未だその疾患を有するとは診断されていない対象において、疾患又は症状の発生を防止すること、
（b）疾患又は症状を阻害すること、即ちその進展を抑止すること、又は
（c）疾患又は症状を緩解させること、即ち疾患又は症状の後退を引き起こすこと
を含む。本発明は、肺又は気道の疾患を有する患者の治療に関し、特に、患者の粘液の過剰分泌の治療、即ち粘液の過剰分泌の防止、阻害、又は緩解に関する。症状の治療に関して、本発明は、気道における粘液又は痰の減少、病理学的生物による感染の阻害、咳の緩和、及び気道栓塞による低酸素症の防止に関する。
より具体的には、「治療」とは、粘液の過剰分泌を含む肺疾患に罹患した患者に対する、治療的に検出可能な有益な効果を提供することを意味するものとする。
さらに具体的には、「治療」とは、抗体、プロテインチロシンキナーゼ阻害剤、及びアンチセンス分子；抗酸化剤；これに限定はされないが、MEKの阻害剤を含む、EGFRカスケード中の任意の因子の阻害剤；メタロプロテイナーゼ阻害剤；Gタンパク質共役型受容体阻害剤等のようなEGFアンタゴニスト及び／又はEGF-Rアンタゴニストからなる群より選択される化合物による粘液の過剰分泌の防止、緩和、及び／又は阻害を意味するものとする。別の治療は、気道におけるEGF-R発現を防止し、それにより初期の段階で経路を阻止することを含みうる。例えば、TNFαとその受容体との結合を阻止する試薬は、EGF-Rの上方制御を防止しうる。
治療には、粘液の過剰分泌により引き起こされ、かつ／又は粘液の過剰分泌に関係している病原体による感染の防止又は阻害が含まれる。
「抗体」とは、抗原と結合することができる免疫グロブリン・タンパク質を意味する。抗体とは、本明細書において使用されるように、着目している抗原又は抗原性断片と結合することができる抗体断片、例えばF(ab')2、Fab'、Fabを含むことを意味する。好ましくは、抗体と抗原との結合は、EGF又はEGF-Rの活性を阻害する。
「ヒト化抗体」という用語は、CDRが非ヒト起源に由来しており、Ig分子又はその断片の残りの部分がヒト抗体に由来しており、好ましくはヒト抗体をコードする核酸配列から作製されている、完全な抗体分子、即ち2つの完全な軽鎖及び2つの完全な重鎖からなる抗体、並びに抗体断片、例えばFab、Fab'、F(ab')2、及びFvのみからなる抗体を記載するために、本明細書において使用される。
「ヒト抗体」及び「ヒト化抗体」という用語は、抗体分子の全部分がヒト抗体をコードする核酸配列に由来している抗体を記載するために、本明細書において使用される。そのようなヒト抗体は、ヒト患者において免疫応答をほとんど又は全く誘発しないため、抗体療法における使用にとって最も望ましい。
「キメラ抗体」という用語は、「ヒト化抗体」という用語の定義において既に記載されたような抗体分子及び抗体断片を記載するために、本明細書において使用される。「キメラ抗体」という用語は、ヒト化抗体を包含する。キメラ抗体は、第一の哺乳動物種に由来する重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列の一つの部分と、第二の異なる哺乳動物種に由来する重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列のもう一つの部分とを少なくとも有する。好ましくは、可変領域が非ヒト哺乳動物種に由来し、定常領域がヒト種に由来する。特に、キメラ抗体は、好ましくは、可変領域をコードする非ヒト哺乳動物由来のヌクレオチド配列と、抗体の定常領域をコードするヒト由来のヌクレオチド配列とから作製される。
「特異的に結合する」とは、抗体と特異的ポリペプチドとの高アビディティかつ／又は高親和性の結合を意味する。抗体と特異的ポリペプチド上のエピトープとの結合は、同抗体と、他の任意のエピトープ、特に着目している特異的ポリペプチドと関連した分子又は同一試料の中に存在しうるエピトープとの結合よりも強い。着目しているポリペプチドと特異的に結合する抗体は、他のポリペプチドと、弱いが検出可能なレベル、例えば着目しているポリペプチドに対して示された結合の10％以下のレベルで結合することができてもよい。そのような弱い結合、又はバックグラウンド結合は、例えば適切な対照を使用することにより、着目している化合物又はポリペプチドとの特異的抗体の結合と容易に区別することが可能である。
「検出可能に標識された抗体」、「検出可能に標識された抗EGF」、又は「検出可能に標識された抗EGF断片」とは、検出可能標識が付着している抗体（又は結合特異性を保持している抗体断片）を意味する。検出可能標識は、通常、化学的結合により付着しているが、又は、標識がポリペプチドである場合には、遺伝子組み換え技術により付着していてもよい。検出可能に標識されたタンパク質の作製のための方法は、当技術分野において周知である。検出可能標識は、当技術分野において既知の多様なそのような標識から選択されうるが、通常は、放射性同位体、フルオロフォア、酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、又は検出可能なシグナル（例えば、放射能、蛍光、色）を放出するか、もしくは標識のその基質への曝露後に検出可能なシグナルを放出するその他の部分もしくは化合物である。様々な検出可能標識／基質対（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ／ジアミノベンジジン、アビジン／ストレプトアビジン、ルシフェラーゼ／ルシフェリン）、抗体を標識するための方法、及び抗原を検出するため標識された抗体を使用するための方法が、当技術分野において周知である（例えば、Harlow及びLane編（「抗体：実験マニュアル（Antibodies:A Laboratory Manual）」(1988)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY）を参照のこと）。
治療法
本発明は、治療的な量のEGF-Rアンタゴニストを投与することにより、肺過剰分泌を治療する方法を提供する。一般に、その方法は、治療に有効な量のEGFRアンタゴニストを、気道粘液過剰分泌に罹患した個体へ投与することを含む。いくつかの態様において、本発明は、粘液産生杯細胞による個体の気道における粘液過剰分泌を治療する方法を提供する。他の態様において、本発明は、個体の気道における杯細胞過形成を低下させるための方法を提供する。粘液の過剰分泌又は病理学的レベルの粘液の蓄積を特徴とする任意の疾患、特に任意の肺疾患が、本明細書に記載の方法により治療されうる。この方法により治療されうる肺過剰分泌性疾患の例には、これらに限定はされないが、慢性気管支炎のような慢性閉塞性肺疾患、喘息のような炎症性疾患、気管支拡張、肺繊維症、COPD、鼻過剰分泌の疾患、例えば鼻アレルギー、鼻ポリープ、及びその他の過剰分泌性疾患が含まれる。嚢胞性繊維症のような遺伝病、カルタゲナー症候群、α1−アンチトリプシン欠損、家族性非嚢胞性繊維症、気道の粘液濃縮化も、同様に含まれるものとする。
EGF又はEGF-Rを直接的に標的とするアンタゴニストが好ましい。しかし、当業者であれば、例えばTGF-αアンタゴニスト；マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（MEK）p44/42マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（p44/42mapk）；抗酸化剤；メタロプロテイナーゼ阻害剤；MAPキナーゼの阻害剤；膜結合型EGFRリガンドの放出を媒介するメタロプロテイナーゼの阻害剤；Gタンパク質共役型受容体の阻害剤等のように、EGF-Rによる杯細胞増殖の促進を引き起こす生物学的カスケードに関与する任意の因子又は細胞が、阻害の標的となりうることを認識するであろう。理論に拘束されないが、カスケードは、炎症反応中、肥満細胞又は好中球のような細胞がTNF-αを放出し、次いでTNF-αがEGF-R発現を促進したときに開始する。次に、例えばそのリガンドEGFによるEGF-Rの刺激により、杯細胞増殖が誘発される。このように、TNF-α経路のようなカスケードに関与している任意の細胞又は因子が、アンタゴニスト活性の標的となりうる。
治療法において投与されるEGF-Rアンタゴニストは、任意の形態でありうる。例えば、EGF-Rアンタゴニストは、EGF、TGFα、又はEGF-Rと結合する、低分子（即ち、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、チロシンキナーゼ阻害剤等）、抗体、又は抗体の一部の形態でありうる。好ましいEGFRアンタゴニストは、選択的、即ち同一型の他の因子よりも大きい程度に標的因子を阻害するものである。選択性は、例えば阻害剤が炎症が生じている気道へ優先的に送達されるような、製剤化及び薬物送達の方法によって増強されうる。
低分子EGF-Rアンタゴニスト
チロシンキナーゼ阻害剤
EGF受容体に作用し、EGF-Rに選択的なチロシンキナーゼ阻害剤は、当技術分野において既知であり、本発明の方法において使用されうる。その例は、既に記載されており、BIBX1522（Boehringer Ingelheim Inc.,Ingelheim,Germanyより）、CGP59326B（Novartis Corporation,Basel,Switzerland）、チルホスチンAG1478（Daubら(1997)EMBO J.167032-7044）；4-アミノキナゾリンEGF-R阻害剤（米国特許第5,760,041号に記載）、ニトリル化合物及びモノニトリル化合物を含む、ナフタレン、インダン、もしくはベンゾキサジンであってもよい置換されたスチレン化合物（米国特許第5,217,999号に記載）、米国特許第5,773,476号に開示された阻害剤、ジャガイモ・カルボキシペプチダーゼ阻害剤（PCI）、3個のジスルフィド架橋を有する39アミノ酸プロテアーゼ阻害剤（Blanco-Aparicioら(1998)J Biol Chem 273(20):12370-12377）、ボンベシン・アンタゴニストRC-3095（Szepeshaziら(1997)Proc Natl Acad Sci U S A 94:10913-10918）等を含む。その他のチロシンキナーゼ阻害剤には、キナゾリン類、例えばPD153035、4-（3-クロロアニリノ）キナゾリン、もしくはCP-358,774、ピリドピリミジン類、ピリミドピリミジン類、ピロロピリミジン類、例えばCGP59326、CGP60261、及びCGP62706、並びにピラゾロピリミジン類（ShawnとShawver（前記））、4-（フェニルアミノ）-7H-ピロロ［2,3-d］ピリミジン類（Traxlerら,(1996)J.Med.Chem 39:2285-2292）、クルクミン（Korutlaら(1994)Biochim Biophys Acta 1224:597-600）；（Laxmin arayana(1995),Carcinogen 16:1741-1745）等が含まれる。
好ましいチロシンキナーゼ阻害剤は、EGF受容体に選択的なもの、即ち、EGF-Rが、チロシンキナーゼ活性を有するその他の細胞表面受容体よりも大きな程度で阻害されるようなものである。選択性は、例えば炎症が生じている気道へ阻害剤が優先的に送達されるような、製剤化及び薬物送達の方法により増強される。
非リガンド依存性EGFR活性化の阻害剤
非リガンド依存性メカニズムのアンタゴニストには、スーパーオキシドジスムターゼ、N-アセチル-L-システイン、DMSO、DMTU、アスコルビン酸等のような抗酸化剤が含まれる。酸化ストレスを介した非リガンド依存性のEGFR活性化は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（MEK）p44/42マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（p44/42mapk）の活性化をもたらし、ムチン合成をもたらす。タケヤマ（Takeyama）ら(2000)J.Immunol.164:1546-1552。このMEK活性化は、選択的MEK阻害剤PD98059、及び抗酸化剤によって阻害される。従って、MEK阻害剤及び抗酸化剤は、本発明の治療法において使用されうる。本発明の治療法において使用されうるMEK阻害剤には、これらに限定はされないが、PD98059；U0126；並びに国際公開公報99/01421；国際公開公報99/01426；国際公開公報98/37881；国際公開公報97/45412；及び米国特許第5,525,625号に記載されたMEK阻害剤を含む、当技術分野において既知の任意のMEK阻害剤が含まれる。本発明の方法において使用されうるEGFRカスケードのその他の阻害剤には、これに限定はされないが、SB203580を含む、p38 MAPキナーゼの阻害剤が含まれる。
メタロプロテイナーゼ阻害剤
メタロプロテイナーゼ阻害剤、特に、これに限定はされないが、バチマスタット（batimastat）（BB-94）（Wojtowicz-Pragaら(1997)Invest.New Drugs 15:61-75）を含む膜貫通型EGFRリガンド前駆体の細胞外プロセシングに関与しているメタロプロテイナーゼの阻害剤、及び、これらに限定はされないが、Wojtowicz-Pragaら(1997)；Brown(1999)APMIS 107:174-180に記載されているもの；並びに例えば国際公開公報200017162;米国特許第6,037,361号；国際公開公報200009485；国際公開公報200006561；及び国際公開公報200006560に記載されているものが、本発明の治療法において使用されうる。ある阻害剤が、膜貫通型EGFRリガンド前駆体を放出させるメタロプロテイナーゼを阻害することにより、EGFRの活性化の阻害において有効であるか否かは、当業者によって容易に決定されうる。一つの非制限的な例として、メタロプロテイナーゼ阻害剤の存在下又は非存在下で、細胞を、これらに限定はされないが、LPA（リゾホスファチジン酸）、カルバコール、トロンビン、ボンベシン、及びエンドセリンを含むGタンパク質共役型受容体（GPCR）の刺激剤；EGF；ホルボールエステル（例えば、テトラデカノイル-ホルボール-13-アセタート、TPA）；又はイオノマイシンと接触させ、Prenzelら(1999)（前記）又は実施例のセクションに記載されたようにしてEGFRのトランス活性化を測定することができる。又は、メタロプロテイナーゼ、特にバチマスタット感受性メタロプロテイナーゼの酵素アッセイ法を実施することができる。当業者は、メタロプロテイナーゼの特異的又は選択的な阻害剤に加え、これらに限定はされないが、GPCRの阻害剤（例えば、アンタゴニスト）、特に杯細胞産生を誘導するアンタゴニストを含む、このカスケード中の任意の因子の阻害が、本発明の治療法において使用されうることを容易に認識するであろう。
投薬量
全身投与のための典型的な投薬量は、1回の投与につき対象の体重1kg当たり0.1μgから100ミリグラムの範囲である。当業者であれば、用量レベルが、特定の化合物、症状の重度、及び対象の副作用への感受性の関数として変動しうることを容易に認識するであろう。化合物によって効力は異なる。特定の化合物の好ましい投薬量は、多様な手段によって当業者により容易に決定されうる。好ましい手段は、例えば本明細書に記載のインビトロ及びインビボの試験を用いて、特定の化合物の生理学的効力を測定することである。
EGF-Rアンタゴニストとしての抗体
EGF-Rアンタゴニストとしての抗体は、特に重要である（例えば、Viloriaら,American Journal of Pathology 151:1523）。EGF又はEGF-Rに対する抗体は、マウス、齧歯類、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ等を含む異種の免疫適格性哺乳動物宿主を、EGFもしくはEGF-R又はそれらの一部で免疫感作することにより作製される。好ましくは、ヒトのEGFもしくはEGF-R又はそれらの一部が、免疫原として使用される。特定の宿主の選択は、主に都合による。免疫原が、宿主動物の皮下、筋肉内、腹腔内、血管内等に注射されうる免疫感作は、従来の技術に従い実施される。通常、1日おきに腹腔内に約1.0〜約10mg/kgのEGF又はEGF-Rが、免疫原として使用されるであろう。注射は、アジュバント、例えば完全もしくは不完全フロイント・アジュバント、スペコール（specol）、ミョウバン等を用いてもよいし、又は用いなくてもよい。免疫感作スケジュールの完了後、EGF又はEGF-Rに特異的なポリクローナル抗血清を提供するため、従来の方式に従い、抗血清を収集することができる。
モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれか、好ましくはモノクローナル抗体が、免疫感作された動物から作製される。ポリクローナル抗血清は、免疫感作スケジュールの完了後、動物から、従来の方法に従い、血清から収集されうる。モノクローナル抗体の作製のためには、リンパ球を適切なリンパ組織、例えば脾臓、流入領域リンパ節等から収集し、適切な融合パートナー、通常は骨髄腫系と融合させ、特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製する。着目している抗原特異性に関するハイブリドーマのクローンのスクリーニングを、従来の方法に従い実施する。
特に重要であるのは、EGFとEGF-Rとの結合を阻害するためEGF-R又はEGFと結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体、例えばEGF-Rの細胞外ドメインと特異的に結合し、それによりEGFの結合を防止する抗体である。そのような抗体は、前記の従来の方法論により作成することができ、又は市販もされている。EGFアンタゴニストとして機能するであろう抗体の例には、これらに限定はされないが、中和抗EGF-Rモノクローナル抗体C225（Kawamotoら(1983)Proc.Nat'l.Acad.Sci.(USA)80:1337-1341；Petitら(1997)J.Path.151:1523-153、ImClone Systems New York,NYが製造）及び抗EGF-Rモノクローナル抗体EMD55900（Mab425とも呼ばれる）（Merck,Darmstadt,Germany）が含まれる。
本発明の抗体は、通常の多量体構造ではなく、単鎖として作製されてもよい。単鎖抗体は、Jostら(1994)J.B.C.269:26267-73等に記載されている。重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域をコードするDNA配列を、グリシン及び／又はセリンを含む小さい中性アミノ酸を少なくとも約4個コードするスペーサーとライゲートさせる。この融合体によりコードされるタンパク質は、元の抗体の特異性及び親和性を保持している機能的な可変領域の組み立てを可能にする。
抗体をヒト化する方法は、当分野において既知である。ヒト化抗体は、トランスジェニック・ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子を有する動物の産物でありうる（例えば、国際公開公報90/10077及び国際公開公報90/0403を参照のこと）。又は、着目している抗体は、CH1ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、ヒンジ・ドメイン、及び／又はフレームワークの残基を、対応するヒト配列と置換するため、組み換えDNA技術により操作されうる（国際公開公報92/02190を参照のこと）。
キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためのIg cDNAの使用も、当技術分野において既知である（Liuら(1987)P.N.A.S.84:8439及び(1987)J.Immunol.139:3521）。抗体を産生するハイブリドーマ又はその他の細胞からmRNAを単離し、cDNAを作製するために使用する。着目しているcDNAを、特異的なプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応により増幅することができる（米国特許第4,683,195号及び第4,683,202号）。又は、ライブラリーを作成し、着目している配列を単離するためスクリーニングする。次いで、抗体の可変領域をコードするDNA配列を、ヒト定常領域配列と融合させる。ヒト定常領域遺伝子の配列は、カバット（Kabat）ら(1991)「免疫学対象のタンパク質配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」、N.I.H.publication no.91-3242に見出すことができる。ヒトC領域遺伝子は、既知のクローンから容易に入手可能である。次いで、従来の方法によりキメラ・ヒト化抗体を発現させる。
Fv、F(ab')2、及びFabのような抗体断片は、例えばプロテアーゼ又は化学的分解による、完全なタンパク質の分解により調製されうる。又は、短縮された遺伝子が設計される。例えば、F(ab')2断片の一部をコードするキメラ遺伝子は、H鎖のCH1ドメイン及びヒンジ領域をコードするDNA配列の後ろに、短縮された分子を生成させるための翻訳終止コドンが続いたものを含む。
過剰分泌粘液性疾患を有する個体は、最初、例えば吸入により、1日に2回患者の体重1キログラム当たり約20ミリグラム（mg）から約400mgの範囲の量のEGF-Rアンタゴニストを投与されうる。
EGF-Rアンタゴニストとしてのアンチセンス分子
もう一つの態様において、本発明の治療剤は、EGF又はEGF-Rをコードするヒト配列に特異的なアンチセンス分子である。投与される治療剤は、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、特に天然型核酸からの化学的修飾を有する合成オリゴヌクレオチド、又はRNAのようなアンチセンス分子を発現する核酸構築物でありうる。アンチセンス配列は、標的のEGF遺伝子又はEGF-R遺伝子のmRNAと相補的であり、標的遺伝子産物の発現を阻害する（例えば、Nyceら(1997)Nature 385;720を参照のこと）。アンチセンス分子は、RNAseHの活性化又は立体障害を介して、翻訳に利用可能なmRNAの量を減少させることにより遺伝子発現を阻害する。一つのアンチセンス分子を投与してもよいし、又はアンチセンス分子の組み合わせを投与してもよく、組み合わせは、単一の標的遺伝子に由来する複数の異なる配列を含んでいてもよいし、もしくはいくつかの異なる遺伝子に相補的な配列を含んでいてもよい。
好ましい標的遺伝子は、EGF-R又はEGFである。遺伝子配列は、公共のデータベースから入手可能である（ヒト上皮増殖因子、ゲンバンクアクセッション番号K01166；上皮増殖因子受容体の前駆体のヒトmRNA、ゲンバンクアクセッション番号X00588）。一般的に、アンチセンス配列は、動物宿主と同一の起源種を有するであろう。
アンチセンス分子は、標的細胞に導入され発現される適切なベクターに含まれた標的遺伝子配列の全部又は一部の発現により作製されうる。転写開始は、アンチセンス鎖がRNA分子として産生されるよう方向付けられるであろう。アンチセンスRNAは内因性センス鎖mRNAとハイブリダイズし、それにより標的遺伝子の発現を阻止する。天然型の転写開始領域、又は外因性の転写開始領域が、使用されうる。プロモーターが、インビトロの組み換え法により、又は配列の染色体への相同的取り込みの結果として、導入されうる。β-アクチン・プロモーター、SV40初期プロモーター及び後期プロモーター、ヒト・サイトメガロウイルス・プロモーター、レトロウイルスLTR等を含む、筋細胞において活性を有する多くの強力なプロモーターが、当技術分野において既知である。
転写ベクターは、一般的に、核酸配列の挿入を提供するための、プロモーター配列の近傍に位置する便利な制限部位を有する。転写開始領域と、標的遺伝子又はその断片と、転写終結領域とを含む転写カセットが調製されうる。転写カセットは、通常少なくとも約1日にわたり、さらに通常は少なくとも約数日にわたり一時的又は安定的に細胞内に維持されうる多様なベクター、例えばプラスミド、レトロウイルス、例えばレンチウイルス、アデノウイルス等に導入されうる。
又は、好ましい態様において、アンチセンス分子は合成オリゴヌクレオチドである。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、一般的に約7から500ヌクレオチド、通常約12から50ヌクレオチド、さらに通常は約20から35ヌクレオチドであろうが、長さは、阻害の効率、交差反応性の欠如を含む特異性等により支配される。約7から8塩基長の短いオリゴヌクレオチドは、遺伝子発現の強力かつ選択的な阻害剤となりうることが見出されている（Wagnerら(1996)Nature Biotechnology 14:840-844を参照のこと）。
内因性センス鎖mRNA配列の1個またはそれ以上の特異的領域が、アンチセンス配列が相補的となるよう選択される。mRNAの5'領域はアンチセンス阻害に対して特に感受性が高いことが示されている。しかし、最近の証拠により、mRNAの二次構造の分析が、部位の阻害への到達可能性において重要であることが示されている。オリゴヌクレオチドの特異的配列の選択には、インビトロ又は動物モデルにおける標的遺伝子の発現の阻害に関して、いくつかの候補配列をアッセイする、経験的な方法を使用することができる。mRNA配列のいくつかの領域がアンチセンス相補のため選択された、配列の組み合わせを使用することもできる。
アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、当技術分野において既知の方法により化学的に合成されうる（Wagnerら(1993)（前記）及びMilliganら（前記）を参照のこと）。好ましいオリゴヌクレオチドは、細胞内安定性及び結合親和性を増加させるため、天然型のホスホジエステル構造から化学的に修飾されたものである。骨格、糖、又はヘテロ環式塩基の化学を改変する、そのような修飾は、文献に多数記載されている。
オリゴヌクレオチドは、細胞による分子の取り込みを増強するターゲティング部分をさらに含みうる。ターゲティング部分とは、特異的結合分子、例えば肺上皮細胞、特にEGF-Rを含有している上皮細胞の表面上に存在する分子を認識する抗体又はその断片である。
二重特異的抗体、キメラ抗体、及び単鎖抗体が、当技術分野において既知である。適当に調製された非ヒト抗体は、様々な方法でヒト化されうる。オリゴヌクレオチドとターゲティング部分との連結には、オリゴヌクレオチド骨格の化学に応じて、任意の従来の方法、例えばジスルフィド結合、アミド結合、又はチオエステル結合を使用することができる。好ましくは、連結は、オリゴヌクレオチドを遊離させるため、細胞内で分解されるであろう。
オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼから防御し、細胞膜を介した輸送を改善するため、疎水性残基、例えばコレステロールと結合していてもよい。又は、ポリ-L-リジン又はその他のポリアミンとの結合によっても、細胞への送達が増強されうる。行うことができるさらなる修飾は、標的mRNAへのインターカレーションを起こし、得られたハイブリッドを安定化することができる、アクリジンのようなインターカレーション成分の添加である。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、細胞内でアンチセンス-mRNA複合体を崩壊させるであろう（1個以上の）酵素、例えばRNase-Hと組み合わせてトランスフェクトされうる。アンチセンス-mRNA二重鎖を優先的に崩壊又は解離させうる任意のタンパク質又は酵素も、同様に有用でありうる。
アンチセンス阻害剤の代替物として、触媒性核酸化合物、例えばリボザイム、アンチセンス結合体等が、遺伝子発現を阻害するために使用されうる。リボザイムはインビトロで合成され、患者へ投与されてもよいし、又は標的細胞内でリボザイムが合成されるよう発現ベクター上にコードされてもよい（例えば、国際特許出願国際公開公報9523225、及びBeigelmanら(1995)Nucl.Acids Res 23:4434-42を参照のこと）。触媒活性を有するオリゴヌクレオチドの例は、国際公開公報9506764に記載されている。mRNA加水分解を媒介することができるアンチセンス・オリゴヌクレオチドと金属複合体、例えばテルピリジルCu(II)（terpyridylCu(II)）との結合体は、バシュキン（Bashkin）ら(1995)Appl Biochem Biotechnol 54:43-56に記載されている。
薬学的製剤
EGF-Rアンタゴニストは、溶液で、又はリポソーム懸濁液のようなその他の任意の薬理学的に適当な投与形態で提供されうる。適切な抗体又はその他の形態の抗EGFが、そのような材料の投与のための通例の様式で、投与のため製剤化されうる。典型的な製剤は、「レミントンの薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」、最新版、Mack Publishing Company、Easton、PAに提供されているものである。投与経路は、投与すべき化合物、治療を受ける患者及び疾患の状態に基づき選択されるであろう。粘液の過剰分泌が存在する場合、化合物は、疾患の重度に応じて異なる経路を介して投与されうる。例えば、緊急の状況は、i.v.投与を必要とするかもしれず、急性であるが生命に関わらない状況では、経口治療が可能であり、慢性治療はエアロゾルにより投与されうる。
鼻及び気道の疾患における治療的使用のためには、局所的送達が好ましい。吸入又はエアロゾル注入による送達は、全身投与により吸収される濃度と比較して高レベルの薬物濃度を提供する。又は、EGFアンタゴニストは、筋肉内注射、静脈内（IV）注射、皮下注射、又は腹腔内注射を含む注射により投与されてもよく、最も好ましくはIV注射及び局所注射により投与される。しかしながら、坐剤、皮膚貼付剤として、又は鼻腔内に適用されうる、経粘膜製剤又は経皮製剤のような、EGF-Rアンタゴニストが全身循環系に侵入することを許容するための手段が利用可能であれば、その他の投与様式も使用されうる。EGF-Rアンタゴニストを血流へ、又は局所的に肺へ移行させる任意の適当な製剤が、正しく使用されうる。
注射の場合、適当な製剤には、一般的に、安定剤もしくはその他の微量成分を場合により含んでいてもよい、生理食塩水、ハンクス溶液、又はその他の緩衝液を使用した水性の溶液又は懸濁液が含まれる。リポソーム調製物及びその他の微小乳濁液の形態を使用することもできる。EGF-Rアンタゴニストは、凍結乾燥形態で供給され、投与のため再生させられてもよい。経粘膜投与及び経皮投与は、一般的に、胆汁、塩、フシジン酸及びその類似体、様々な界面活性剤等のような粘膜又は皮膚の関門の通過を促す薬剤を含む。EGF-Rアンタゴニストが消化管において不活化されないようにするため、適当な腸溶性コーティングが製剤化されるのであれば、経口投与も可能である。
製剤の性質は、ある程度、選択されたEGF-Rアンタゴニストの性質に依存するであろう。適当な製剤は、当業者に周知の既知の技術及び製剤化の原理を使用して調製される。特定の薬学的組成物中に含まれるEGF-Rアンタゴニストの割合（％）も、製剤の性質に依存するであろう。抗体であるEGF-Rアンタゴニストの割合（％）は、典型的には、約1重量％から約85重量％までの広い範囲で変動するであろう。
細胞による核酸の取り込みを増強するための多くの送達法が、当分野において既知である。有用な送達系には、センダイウイルス−リポソーム送達系（RapaportとShai(1994)J.Biol.Chem.269:15124-15131）、陽イオン性リポソーム、ポリマー性送達ゲル又はマトリックス、多孔性バルーン・カテーテル（Shiら(1994)Circulation 90:955-951及びShiら(1994)Gene Therapy 1:408-414に開示されているようなもの）、レトロウイルス発現ベクター等が含まれる。
送達媒体としてのリポソームの使用は、EGF-Rアンタゴニストと共に使用するための一つの重要な方法である。リポソームは、標的部位の細胞と融合し、内腔の内容物を細胞内に送達する。リポソームの細胞との接触は、単離、結合剤等のような接触を維持するための様々な手段を使用して、融合のために十分な時間、維持される。リポソームは、センダイウイルス又はインフルエンザウイルス等のような膜の融合を媒介する精製されたタンパク質又はペプチドを用いて調製されうる。脂質は、ホスファチジルコリンのような陽イオン性脂質を含む既知のリポソーム形成脂質の任意の有用な組み合わせでありうる。残りの脂質は、通常、コレステロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール等のような中性脂質であろう。リポソームを調製するには、カトー（Kato）ら(1991)J.Biol.Chem.266:3361に記載された手法を使用することができる。
好ましい態様において、EGF-Rアンタゴニストは、立体的に安定化された「ステルス（stealth）」リポソーム、例えばPEG化リポソーム内に封入される。そのようなリポソームは、i.v.注射された場合、長期にわたり循環系に滞留する。気道の炎症中には、後毛細管細静脈ギャップ・ジャンクションが開口し、液体蓄積を可能にし、分子、例えば補体、キニノーゲンが組織へ侵入し炎症カスケードを開始させることを許容する。そのような炎症は、リポソーム及びその内容物が、炎症を起こした組織に選択的に沈積することを可能にする（Zhangら(1998)Pharm Res 15:455-460）。
EGF-Rアンタゴニストは、吸入経路用の薬学的送達系により、罹患した患者へ投与されうる。化合物は、吸入による投与に適した形態に製剤化されうる。薬学的送達系は、EGF-Rアンタゴニストの気管支粘膜への局所投与による呼吸器療法に適した系である。本発明は、容器からのEGF-Rアンタゴニストの押し出しを圧縮ガスの力に依存している系を使用することができる。エアロゾル又は加圧パッケージが、この目的のため使用されうる。
本明細書において使用されるように、「エアロゾル」という用語は、加圧されたプロペラント・ガスにより治療適用部位へと運搬される極めて微細な液体又は固体の粒子をさすものとして、従来の意味で使用される。薬学的エアロゾルを本発明において使用する場合、エアロゾルは、液体担体とプロペラントとの混合物の中に溶解、懸濁、又は乳濁させられうる治療的に活性な化合物を含有する。エアロゾルは、溶液、懸濁液、乳濁液、粉末、又は半固体の調製物の形態でありうる。本発明において使用されるエアロゾルは、患者の気道を介した、微細な固体粒子として、又は液体ミストとしての投与を目的とするものである。当業者に既知の様々な型のプロペラントが使用されうる。適当なプロペラントの例には、これらに限定はされないが、炭化水素又はその他の適当なガスが含まれる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、定量（metered amount）を送達するための値を提供することにより決定されうる。
ガス中に実質的に均一なサイズの極めて微細な液体粒子を生成させる装置である噴霧器を用いて、本発明を実施してもよい。好ましくは、EGF-Rアンタゴニストを含有している液体が、飛沫として分散させられる。小飛沫は、噴霧器の排出チューブから気流により運搬されうる。得られたミストは、患者の気道へと進入する。
滑沢剤、担体、又はプロペラントを含む、又は含まない、EGF-Rアンタゴニスト又はその類似体を含有している粉末組成物を、療法が必要な哺乳動物へ投与することができる。本発明のこの態様は、吸入により粉末薬学的組成物を投与するための従来の器具を用いて実施されうる。例えば、化合物と、ラクトース又はデンプンのような適当な粉末基剤との粉末混合物を、例えばカプセルもしくはカートリッジ、例えばゼラチン、又はブリスターパック中に単位投薬形態で提示することができ、粉末はそれらから吸入器の補助により投与されうる。
過剰分泌性肺疾患を治療するため、組み合わせ療法が使用されうる。特に、粘液線毛クリアランスを促すための気管支拡張剤、コルチコステロイド、去痰剤、粘液溶解剤等のような過剰分泌の緩和のための従来の治療と、EGF-Rアンタゴニストを組み合わせることができる。
患者の状態によっては、注射（例えば、静脈内）又は吸入により本発明の製剤を送達することが好ましい場合がある。肺に多量の粘液を有する患者は、一般的に、最初は吸入により治療され得ない。これは、肺へのエアロゾル化製剤の吸入が特に有効でない程に、患者の肺が閉塞しているという事実のためである。しかしながら、注射による治療の後、又は長期的な維持のため、又は患者の肺が重度に閉塞していない状況では、吸入による投与が好ましい。比較的少ない用量が、最も治療が必要な特定の細胞へ局所的に送達されうるため、吸入による投与は好ましい。比較的少ない用量を送達することにより、任意の有害な副作用が排除されるか、又は実質的に減少する。最も治療が必要な細胞へ直接的に送達することにより、より迅速に治療の効果が実現するであろう。
本発明に関して使用されうるいくつかの異なる型の吸入方法論が存在する。本発明のアンタゴニストは、基本的に3つの異なる型の吸入用製剤へと製剤化されうる。第一に、本発明のアンタゴニストは、低沸点プロペラントを用いて製剤化されうる。そのような製剤は、一般的に、従来の定量噴霧式吸入器（MDI）により投与されうる。しかし、米国特許第5,404,871号及び第5,542,410号に記されたような、患者の呼気量及び流速を測定する技術を利用することにより、反復可能な投薬を得る能力が増加するよう、従来のMDIを修飾してもよい。
又は、本発明のアンタゴニストは、水性溶液又はエタノール性溶液の中に製剤化され、従来の噴霧器により送達されうる。しかし、より好ましくは、そのような溶液製剤は、米国特許第5,497,763号、第5,544,646号、第5,718,222号、及び第5,660,166号に開示されたような器具及び系を使用してエアロゾル化される。
最後に、本発明のアンタゴニスト化合物は、乾燥粉末製剤へと製剤化されうる。そのような製剤は、粉末のエアロゾル・ミストを作出した後、乾燥粉末製剤を単純に吸入することにより投与されうる。そのような方法を実施するための技術は、1998年7月7日に発行された米国特許第5,775,320号及び1998年4月21日に発行された米国特許第5,740,794号に記載されている。
前掲の各特許に関して、本出願人らは、これらの特許が肺内薬物送達における他の出発物を引用していること、及び本発明のアンタゴニストの送達に関して使用されうる特定の方法論、器具、及び製剤に関してそのような出版物が参照されうることを指摘する。さらに、各特許は、本発明のアンタゴニスト製剤の製剤化、器具、パッケージング、及び送達方法論を開示する目的のため、参照として完全に本明細書に組み込まれる。
スクリーニング・アッセイ法
候補薬物
スクリーニング・アッセイ法は、EGFアンタゴニストである生理活性候補薬剤を同定するため使用されうる。特に重要であるのは、ヒト細胞に対して低い毒性を有する薬剤に関するスクリーニング・アッセイ法である。標識インビトロ・タンパク質−タンパク質結合アッセイ法、電気泳動移動度シフト・アッセイ法、酵素活性アッセイ法、タンパク質結合に関するイムノアッセイ法等を含む、極めて多様なアッセイ法が、この目的のため使用されうる。精製されたEGFタンパク質又はEGF-Rタンパク質を使用して三次元結晶構造を決定し、それを、分子間相互作用、トランスポーター機能等のモデリングに使用することもできる。
本明細書において使用されるように、「薬剤」という用語は、これらに限定はされないが、EGF又はEGFR受容体の機能の直接的な改変又は阻害；EGFRカスケード中の任意の因子の改変又は阻害；EGFRの活性化に関与している任意の因子の改変又は阻害；膜結合型EGFRリガンドの放出に関与している任意の因子の改変又は阻害を含む、EGF又はEGF-Rの生理学的機能の、直接的又は間接的な改変又は阻害の能力を有する任意の分子、例えばタンパク質又は医薬品を記述するものである。一般的に、様々な濃度に対するディファレンシャルな応答を得るため、異なる薬剤濃度を用いて複数のアッセイ混合物が並行に実行される。典型的には、これらの濃度のうちの一つは、陰性対照として、即ちゼロ濃度又は検出レベル未満で使用される。
候補薬剤には、多数の化学的クラスが包含されるが、典型的には、それらは有機分子であり、好ましくは50ダルトン超、約2,500ダルトン未満の分子量を有する小さい有機又は無機の化合物である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的にはアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基を少なくとも1個含み、好ましくは化学的官能基のうちの少なくとも2個を含む。候補薬剤は、しばしば、前記の官能基のうちの1個またはそれ以上で置換された、環式炭素もしくはヘテロ環式構造、及び／又は芳香族もしくは多重芳香族構造を含む。候補薬剤は、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造的類似体、又は組み合わせを含む生体分子の中にも見出される。
候補薬剤は、合成化合物又は天然化合物のライブラリーを含む極めて多様な起源から得られる。例えば、ランダム化されたオリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含む、極めて多様な有機化合物及び生体分子のランダム合成及び特異的合成のための多数の手段が利用可能である。又は、細菌、真菌、植物、及び動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが、入手可能であるか、又は容易に作製される。さらに、天然の又は合成により作製されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的手段、物理学的手段、及び生化学的手段により容易に修飾され、コンビナトリアル・ライブラリーを作製するため使用されうる。構造的類似体を作製するため、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等のような特異的又はランダムな化学的修飾を、既知の薬理学的薬剤に施すことができる。
スクリーニング・アッセイ法が結合アッセイ法である場合、検出可能シグナルを直接的又は間接的に提供することができる標識と、1個またはそれ以上の分子を結合させることができる。様々な標識には、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば磁性粒子等が含まれる。特異的結合分子には、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンとアンチジゴキシン等のような対が含まれる。特異的結合メンバーのため、通常、相補的なメンバーが、検出を提供する分子で既知の手法に従い標識されるであろう。
その他の多様な試薬が、スクリーニング・アッセイ法に含まれうる。これらには、最適なタンパク質−タンパク質結合を促し、かつ／又は非特異的なもしくはバックグラウンドの相互作用を減少させるため使用される、塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤等のような試薬が含まれる。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤等のようなアッセイ法の効率を改善する試薬が使用されうる。成分の混合物は、必要な結合を提供する任意の順序で添加されうる。インキュベーションは、任意の適当な温度、典型的には4〜40℃で実施される。インキュベーション時間は、活性が最適となるよう選択されるが、迅速なハイ・スループット・スクリーニングが促されるよう最適化されてもよい。典型的には、0.1〜1時間が十分であろう。
所望の薬理学的活性を有する化合物は、本明細書に記載の製剤として、過剰分泌性疾患の治療のため、生理学的に許容される担体に含まれて、宿主へ投与されうる。導入の様式に応じて、化合物は、本明細書に記載の多様な方式で製剤化されうる。製剤中の治療的活性を有する化合物の濃度は、約0.1〜100重量％で変動しうる。
投薬計画
適切な投薬レベルも、治療を受ける対象の性質、治療を受ける過剰分泌性状態の特定の性質及びその重度、活性要素として使用されるEFGRアンタゴニストの性質、投与の形式、製剤、及び実務者の判断を含む多数の要因に応じて変動するであろう。例えば、抗EGF又は抗EGF-Rのような抗体自体を注射可能製剤として投与する場合、投薬量は、1回の投薬につき20〜約40mg/kgまでの範囲であろう。数日にわたる反復投与が必要である場合もあるし、又は静脈内手段による投与は連続的なものであってもよい。慢性状態の場合、投与は必要に応じて比較的長期にわたり継続されうる。
投薬計画の効率は、患者における改善された肺機能を査定することにより決定されるであろう。この査定には、痰の粘弾性の測定、痰の努力呼気肺活量及び最大中期呼気流量（maximal midexpiratory flow rate）の改善を含む肺機能の改善が含まれうる。前述の治療計画は、抗生物質、DNAseI、又は過剰分泌性肺疾患の治療のためのその他の現行の療法のような補助療法と併せて与えられうる。抗生物質が患者の療法の一部として共投与される場合、粘液又は痰の粘性の減少、及び粘液又は痰の肺クリアランスの増加を示す、細菌増殖の減少による治療の効率を査定するため、療法後の細菌定量が含まれうる。
肺機能試験及び肺過剰分泌性疾患の臨床的進展の診断試験は、当業者に既知である。標準的な肺機能試験には、気道抵抗（AR）；努力肺活量（FVC）；1秒間努力呼気肺活量（FEV(1)）；努力中期呼気量（forced midexpiratory flow）；及び最大呼気流速（PEFR）が含まれる。その他の肺機能試験には、血液ガス分析；薬物療法に対する応答；チャレンジ・アンド・エクササイズ（challenge and exercise）試験；呼吸筋強度の測定；繊維光学的（fibro-optic）気道検査等が含まれる。粘液の特性を研究するためのいくつかの基本的な手法には、例えば磁気マイクロレオメーターを使用したレオロジー、粘液滴と表面との間の接触角を測定することにより接着表面と接着系との引力を特徴決定するための粘着力が含まれる。線毛による粘液輸送は、従来の技術、及び直接的な測定、即ちインサイチューの粘液クリアランスを使用して研究されうる。経上皮電位差、肺上皮のイオン輸送系の活性の正味の結果は、適切な微小電極を使用して測定されうる。定量的な形態学的方法が、上皮表面状態を特徴決定するために使用されうる。
治療を受ける患者は、ヒトのような霊長類であってもよいし、又は記載された症状を示すその他の任意の動物であってもよい。本発明の方法はヒト患者の治療に特に適合しているが、本発明が獣医実務にも適用可能であることが理解されよう。
インビトロ・スクリーニング・アッセイ法
本発明のもう一つの態様において、候補薬剤の杯細胞増殖阻害の治療的可能性を査定するため、即ちそのような薬剤がEGFアンタゴニストとしての活性を有するか否かを査定するため、インビトロ・アッセイ法が使用される。一般的に、そのようなアッセイ法は、（i）杯細胞増殖のインビトロ・モデルを、EGF又はその機能的等価物と接触させる工程；（ii）続いて、インビトロ・モデルを候補薬剤と接触させる工程；及び（iii）杯細胞増殖を査定し、その際、杯細胞増殖の阻害を候補薬剤の治療的可能性の指標とする工程を含む。
アッセイ法は、好ましくは、2つの対照を用いて実施される。ここで、第二の細胞群はいずれの化合物とも接触させず、第三の細胞群はEGFとは接触させるが、候補薬剤とは接触させない。次いで、EGF及び候補薬剤の細胞への効果の程度を決定するため、比較を行う。
任意の杯細胞増殖のインビトロ・モデルが使用されうる。例えば、ガズマン（Guzman）ら(1995)217:412-419に記載のようにして、ラット気管細胞を単離し培養物中で維持することができる。簡単に説明すると、ラット気管細胞をコラーゲン・ゲルでコーティングされた半透膜上に播き、まず培地中で液内培養し、続いて気体／液体界面で維持する。インビトロ細胞の例には、初代ヒト気管支細胞（Clontech,San Diegoより入手可能）；NCI-H292細胞（ATCC CRL-1848）；及びA431細胞（ATCC CRL-1555）が含まれる。
インビトロ培養物をEGF及び候補薬剤と接触させる。査定すべき終点及び候補薬剤の性質に応じて、EGFの添加の前に、同時に、又は後に、候補薬剤を培養物と接触させることができる。培養細胞を、対照と比した杯細胞増殖の阻害に関して査定する。
多様な分子マーカー又は生化学的マーカーが、杯細胞増殖を査定するため使用されうる。使用されうる分子マーカー又は生化学的マーカーの例には、これらに限定はされないが、杯細胞に特徴的な遺伝子発現又はタンパク質発現が含まれる。いくつかのムチン遺伝子、例えばMUC5B（Desseynら(1997)J.Biol.Chem.272:3168-3178）は気道に発現しており、その遺伝子産物は粘液中に高度に見られる。ムチン遺伝子の発現は、粘液の産生を決定するための適当なマーカーを提供する。
ムチン遺伝子発現は、ノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ムチン遺伝子プロモーターの調査、又はインサイチュー分析のような従来の技術により査定されうる。又は、ムチン・タンパク質が、検出可能に標識された抗体を使用して、ウェスタンブロット分析、ELISA、免疫化学等のような従来の方法により査定される。アルシアン青/PAS染色を使用したムチンの染色（Louら(1988)Am.J.Respir.Crit.Care Med.157:1927-1934）のような形態学的基準も、培養物中の杯細胞の存在又は欠如を決定するため使用されうる。ムチンに対する抗体は、ELISA法を使用して調査されうる。リガンド、例えばEGF、TGF-αによるEGF-Rの刺激は、特定のEGF受容体キナーゼのリン酸化を誘導し、杯細胞産生を引き起こすため、EGF-Rリン酸化は杯細胞誘導の反映として測定されうる（Donato et al(1984)J.Biol.Chem.264:20474-20481）。
肺細胞増殖に関連した分子マーカー又は生化学的マーカーの減少は、アンタゴニストの治療的可能性の指標となる。
インビボ・モデル
本発明のさらにもう一つの態様において、候補薬剤の杯細胞増殖阻害の治療的可能性を査定するため、インビボ動物モデルが使用される。一般的に、アッセイ法は、（i）EGF-R発現を誘導することにより過剰分泌性肺疾患の動物モデルを作出する工程；（ii）ムチン産生杯細胞を作製するため、誘導されたEGF-Rを刺激する工程；（iii）候補薬剤で処理する工程；及び（iv）杯細胞増殖又は粘液分泌を査定し、その際、肺細胞増殖又は粘液分泌の阻害を候補薬剤の治療的可能性の指標とする工程を含む。
任意の過剰分泌性肺疾患のインビボ・モデルが使用されうる。例えば、テマン（Temann）ら(1997)Am.J.Respir.Cell.Biol.16:471-478に記載され、本明細書に提供された実施例で示されているような喘息マウス・モデル。又は、タケヤマ（Takeyama）ら(1998)Am.J.Physiol.に記載されたようなラット・モデルが使用されうる。その他の使用されうる動物モデルの例には、これらに限定はされないが、モルモット（杯細胞を構成的に発現する種）及びラットが含まれる。
動物モデルの肺組織又は気管組織は、インビトロ・モデルに関して記載されたのと同様の分子マーカー及び生化学的マーカーにより査定されうる。杯細胞増殖の減少は、EGF-Rアンタゴニストの治療的可能性の指標となる。
以下の実施例は、当業者に本発明の作成法及び使用法の完全な開示及び説明を提供するために記載され、本発明者らが本発明であると見なすものの範囲を制限するためのものではないし、下記の実験が全て又は唯一の実施された実験であることを表すためのものでもない。使用された数字（例えば、量、温度等）に関しては正確さを保証するよう努力したが、いくつかの実験の誤差及び偏差は考えられる。特記しない限り、部分は重量部分であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。
図1Aは、NCI-H292細胞及びA431細胞におけるEGF-Rのウェスタンブロットである。図1Bは、NCI-H292細胞の培養物における抗EGF-R抗体を用いた免疫細胞化学的分析である。図1Cは、NCI-H292細胞におけるEGF-Rのノーザン分析である。 ムチン糖タンパク質の同定のためのNCI-H292細胞のアルシアン青/PAS染色。 NCI-H292細胞におけるMUC5遺伝子発現に関するノーザン分析。 病原体除去ラットにおける抗EGF-R抗体を用いたEGF-Rの免疫組織化学的分析。図4A、TNF-αで処理されたラット。図4B、オボアルブミンで感作されたラット。 杯細胞の産生に対するEGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤（BIBX1522）の効果を示すグラフ（アルシアン青/PAS陽性染色細胞が占める気道上皮の染色された面積の％として表されている）である。 健康気道上皮細胞及び喘息気道上皮細胞におけるEGFR免疫反応性の組織分布を示す棒グラフである。 気道上皮におけるEGFR免疫反応性とMUC5AC産生との相関を示すグラフである。 ラット気道におけるアルシアン青（AB）/PAS染色の面積（％）に対するIL-13注入の用量依存的な効果を示すグラフであり（図8A）、ラット気道におけるMUC5ACタンパク質発現の面積（％）に対するIL-13注入の用量依存的な効果を示すグラフである（図8B)。 ラットにおける、選択的EGFRチロシンキナーゼ阻害剤BIBX1522による、IL-13により誘導されるアルシアン青/PASによる粘液糖質複合体の染色の用量依存的な阻害を示すグラフであり（図9A)、ラットにおける、選択的EGFRチロシンキナーゼ阻害剤BIBX1522による、IL-13により誘導されるMUC5AC染色の用量依存的な阻害を示すグラフである（図9B)。 ラット気道上皮における白血球動員に対するIL-13注入の効果を示すグラフであり（図10A）、ラット気道上皮におけるアルシアン青（AB）/PAS染色に対するIL-13注入の効果を示すグラフである（図10B）。 タバコ煙及びTGFαにより誘導されるEGFRのチロシン・リン酸化を示すオートラジオグラフである。結果は、3つの異なる実験の代表である。バー＝170kD。 タバコ煙溶液のNCI-H292細胞とのインキュベーションの効果、並びにタバコ煙により誘導されるMUC5ACタンパク質合成に対する、チロシンキナーゼ阻害剤及び抗酸化剤の効果を示す棒グラフである。 病原体除去ラットにおける、気道上皮のアルシアン青/PAS染色面積の割合（％）に対するタバコ煙吸入の効果、及びタバコ煙により誘導されるアルシアン青/PAS応答に対するEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の効果を示す棒グラフである。 病原体除去ラットにおける、気管気管支組織におけるMUC5AC mRNA発現に対するタバコ煙吸入の効果、及びタバコ煙により誘導されるMUC5AC mRNA発現に対するEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の効果を示す棒グラフである。 対照上皮（白カラム）及び鼻ポリープ上皮（黒カラム）における上皮のAB/PAS染色面積及びMUC5AC染色面積の割合（％）を示すグラフである。値は、AB/PAS染色細胞及びMUC5AC染色細胞が占める面積（％）の平均±SEMとして表されている。 ポリープ内の偽重層上皮及び過形成上皮におけるMUC5AC染色面積及びEGFR染色面積の比較を示すグラフである。値は、染色面積（％）の平均±SEMとして表されている。 EGFR陽性ポリープ及びEGFR陰性ポリープにおける杯細胞脱顆粒を示すグラフである。
実験例
実施例1
EGF系は気道におけるムチン産生を制御する
杯細胞の過形成は、様々な気道の過剰分泌性疾患において起こるが、基本的なメカニズムが不明であるために、有効な療法が存在しない。健康な気道には杯細胞はほとんど存在しないが、過剰分泌性気道疾患においては杯細胞の過形成が起こる。ヒト気管支（NCI-H292）細胞系を研究した。これらの細胞は、EGF-Rを構成的に発現しており、EGF-R遺伝子発現は腫瘍壊死因子α（TNFα）によりさらに刺激された。EGF-Rリガンドはムチンの合成を増加させ、この効果はTNFαとの共インキュベーションにより増加した。
病原体除去ラットの気道上皮細胞は、EGF-Rタンパク質をほとんど発現していなかったが、TNFα（200ng）の気管内注入により、基底細胞、前杯細胞、及び杯細胞においてEGF-Rが誘導され、線毛細胞においては誘導されず、TNFα、EGF、又はTGFα単独では杯細胞産生が誘導されなかった。しかし、TNFαの後にEGF-Rリガンドを注入すると、杯細胞及び前杯細胞の数が増加し、アルシアン青/PAS陽性染色（粘液糖質複合体を反映する）及びムチンMUC5遺伝子発現が著しく増加した。感作されたラットにおいて、オボアルブミンは、気道上皮における杯細胞産生及びEGF-R発現を引き起こした。NCI-H292細胞、TNFαの後にEGF-Rリガンドで刺激されたラット、及びラット喘息モデルにおいては、EGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤（BIBX1522）での前処理により、気道における杯細胞産生が防止された。これらの所見より、気道の過剰分泌性疾患におけるEGF-Rカスケードの阻害剤の役割が証明される。
方法
インビトロ研究
細胞培養
ヒト肺粘膜性類表皮癌細胞系NCI-H292細胞を、加湿5％CO2水ジャケット付きインキュベーター内で、37℃で、10％ウシ胎児血清、ペニシリン（100U/ml）、ストレプトマイシン（100μg/ml）を含有するRPMI1640培地の中で増殖させた。コンフルエントになった時点で、EGF（組換えヒトEGF、25ng/ml、Genzyme,Cambridge,MA）、TGFα（組換えヒトTGFα、25ng/ml、Genzyme）、TNFα（組換えヒトTNFα、20ng/ml、Genzyme）、EGF（25ng/ml）＋TNFα（25ng/ml）、又はTGFα（25ng/ml）＋TNFα（20ng/ml）と共に、12時間、24時間、又は48時間、細胞をインキュベートした。EGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤BIBX1522（10μg/ml、Boehringer Ingelheim Inc.,Ingelheim,Germanyより譲り受けた）を用いた阻害実験においては、増殖因子を添加する30分前に、BIBX1522で細胞を前処理した。インキュベーション後、T-75フラスコ中で増殖させた細胞を、全RNA抽出又はタンパク質抽出のため使用し、8チャンバー・スライドを、ムチンを可視化するためのアルシアン青/PAS染色のため使用した。
ウェスタン・ブロッティング
T-75フラスコ中で増殖させた細胞を、溶解させ、1％トライトン（Triton) X、1％ジオキシコール酸ナトリウム、及びPMSF（10mg/ml）を含有するPBSで剥離した。総タンパク質量は、BCAタンパク質アッセイ試薬（Pierce,Rockford,IL）により推定した。細胞溶解物をトリシン試料緩衝液及び2％βMEと共に95℃に加熱した。8％アクリルアミド・ゲルにおけるSDS-PAGEにより、タンパク質を分離した。得られたゲルを転写緩衝液（25mM トリス-HCl、192mMグリシン、20容量％メタノール、pH8.3）中で平衡化した。次いで、タンパク質を電気泳動によりニトロセルロース膜に転写した。次いで、5％無脂肪スキムミルクを含む0.05％ツィーン（Tween）20含有PBSの中で、膜を1時間インキュベートした。次いで、膜をモノクローナル・マウス抗EGF-R抗体（1：100）と共に4℃で一晩インキュベートした。アビジン−ビオチン−アルカリホスファターゼ複合体法（ABCキット、Vector Laboratories）のための標準的なプロトコルに従い、結合した抗体を可視化した。EGF-Rの陽性対照として、A431細胞由来の細胞溶解物を使用した（20）。
NCI-H292細胞におけるEGF-Rの免疫細胞化学的局在部位決定
8チャンバー・スライド上で増殖させた細胞を、4％パラホルムアルデヒドで1時間固定した。EGF-Rに関して染色するため、0.05％ツィーン20、2％正常ヤギ血清、及び2mMレバミゾールを含有するPBSを、抗体の希釈剤として使用した。切片を、EGF-Rに対するマウス・モノクローナル抗体（1：250）と共に4℃で一晩インキュベートし、次いで過剰の一次抗体を除去するためPBSで3回洗浄した。次いで、細胞を、1：200希釈のビオチン化ウマ抗マウス免疫グロブリン（Vector Laboratories,Burlingame,CA）と共に室温で1時間インキュベートした。アビジン−ビオチン−アルカリホスファターゼ複合体法（ABCキット、Vector Laboratories,Burlingame,CA）のための標準的なプロトコルに従い、結合した抗体を可視化した。
プローブ
EGF-R mRNA発現は、直鎖化されたpTRI-EGF-R-ヒト・プローブ・テンプレート（Ambion,Austin,TX）を使用して決定した。このプローブは、エキソン12〜14に相当するヒトEGF-R遺伝子の360bpのcDNA断片を含有している。MUC5遺伝子発現は、ヒトMUC5AC遺伝子の298bpのcDNA断片を含有するヒトMUC5ACプローブ（Carol Basbaum博士より譲り受けた）を使用して決定した。
ノーザン・ブロッティング
各条件で、トリ・リージェント（Tri-Reagent）（Molecular Research Ctr,Cincinnati,OH）を使用して、T-75組織培養フラスコ中で増殖させたNCI-H292細胞から、全RNAを抽出した。全RNA（10μg）を1％アガロース／ホルムアルデヒド・ゲル上で電気泳動させ、キャピラリー・ブロッティングによりナイロン膜（Amersham,Arlington Heights,IL）へ転写した。プローブは、ランダム・プライムドDNA標識キット（Random Primed DNA labeling kit）（Boehringer Mannheim Corp.,Indianapolis,IN）を使用して32Pで標識した。ブロットに、42℃で4時間プレハイブリダイゼーションを施し、次いで42℃で16時間、32P標識特異的cDNAプローブをハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション溶液は、250mM トリス-HCl（pH7.5）、5％SDS、1％BSA、1％ポリビニル−ピロリドン、1％フィコール、及び0.5％ピロリン酸ナトリウムを含有していた。ハイブリダイゼーション後、膜を、室温で30分間、0.1％SDSを含む2×SSCで2回洗浄し、続いて50℃で30分間、0.1％SDSを含む2×SSCで2回洗浄し、0.1％SDSを含む0.1×SSCで1回濯いだ。膜をX線フィルムへ感光させた。
インビボ研究
実験的動物プロトコルは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の動物研究に関する委員会（the Committee on Animal Research,University of California San Francisco）により承認された。体重230〜250gの特定病原体除去雄F344フィッシャー（Fisher）ラット（Simonsen Laboratories,Gilroy,CA）を、温度調節された（21℃）部屋で維持し、標準的な実験用飼料及び水を自由に摂取させた。
健康ラット
メトヘキシタール・ナトリウム（Brevital sodium、50mg/kg、i.p.；Eli Lilly & Co.,Indianapolis,IN）でラットに麻酔をかけ、自発呼吸をさせた。TNFαが気道においてEGF-Rを上方制御するか否かを決定するため、TNFα（200ng、100μl）を気管内に注入し、24時間後に動物を安楽死させた。EGF又はTGFαが気道上皮において杯細胞を誘導するか否かを調査するため、EGF（600ng、100μl）又はTGFα（ラット合成TGFα、250ng、100μl；Sigma,St Louis,MI）を、単独で、又はTNFα（200ng、100μl）注入の24時間後に、気管内に注入し、48時間後に動物を安楽死させた。各研究において、無菌のPBS（100μl）を対照として気管内に注入した。ムチン産生がEGF-Rの活性化を介して起こるか否かを確認するため、本発明者らは、EGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤BIBX1522（阻害剤を使用した研究から、癌増殖を防止すると推定された用量）の効果を調査した。ラットを、TGFαの注入の1時間前及び24時間後に、BIBX1522（3mg/kg、10mg/kg、又は30mg/kg、i.p.）で前処理した。TGFαの注入の48時間後、調査のため気管及び肺を摘出した。
感作されたラット
感作
0日目及び10日目に、100mgの水酸化アルミニウムと複合体化されたオボアルブミン（10mg、等級V；Sigma,St Louis,MO）を含む無菌生理食塩水0.5mlの腹腔内注射により、ラットを感作した。次いで、ラットを10日間休息させた。20日目に、オボアルブミンを気管内に直接送達し、気管内注入により、3回（20日目、22日目、及び24日目）、0.1％オボアルブミンを含む生理食塩水100μlで動物をチャレンジした。チャレンジを受けていないラット（20日目）又は3回目のチャレンジから48時間後のラット（26日目）を安楽死させた。この手法により、杯細胞化生が誘導された。杯細胞の過形成を阻止するため、感作されたラットをEGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤BIBX1522で前処理した。オボアルブミン・チャレンジの日（20日目、22日目、及び24日目）、感作されたラットをBIBX1522（10mg/kg、i.p.、接種の1時間前）で前処理し、次いでオボアルブミンと共にBIBX1522も気管内に注入した（BIBX1522、10-5M、100μl）。ラットを安楽死させる前日まで、24時間毎にBIBX1522をi.p.注射した。動物を安楽死させた後、3回目のチャレンジから48時間後に気管を摘出した。
組織の調製
麻酔中の予め選択された時点で、120mmHgの圧力で、1％パラホルムアルデヒドを含むDEPC処理PBSを、全身循環系に灌流した。次いで、気管を摘出し、4％パラホルムアルデヒド中に24時間置いた。固定後、気管及び肺を、細胞分析のためJB-4＋モノマー溶液Aに包埋するか、又は免疫組織化学及びインサイチュー・ハイブリダイゼーションのためO.C.T.化合物（Sakura Finetek U.S.A.,Inc.,Torrance,CA）に包埋した。包埋組織を、横断切片（厚さ4mm）として切断し、スライド上に置いた。
細胞分析
油浸対物レンズ（倍率1000倍）を用いて、2mmの基底層上の上皮細胞核を計数することにより、上皮細胞の総数を計数した。分析された上皮の各領域下の基底層の直線的な長さは、基底膜のディジタル化された画像の輪郭をトレースすることにより決定された。刺激の注入後、「発達中の」杯細胞が形成される。これらの細胞は、アルシアン青/PAS陽性顆粒を有するが、顆粒のサイズは小さく、細胞質顆粒の数は少ない。本発明者らは、これらの「発達中の」杯細胞を、細胞が成熟杯細胞になる前の段階である、「前杯細胞」と名付けた。杯細胞は、細長い立方体形、杯形〜低い円柱形であり、核と内腔表面との間の細胞質の大部分を、大量のアルシアン青/PAS染色顆粒が占めている。前杯細胞は、比較的小さい粘液染色面積（基底膜から内腔表面までの上皮の高さの1/3未満）を有するか、又は低密度の弱くアルシアン青/PAS染色される小さな顆粒を有する細胞と定義される。線毛細胞は、周縁部に線毛があること、細胞質が弱く染色されること、及び核が大きく丸いことにより認識される。非顆粒形成（non-granulated）分泌細胞は、円柱形であり、内腔から基底層にまで拡がっている。細胞質は薄桃色に染色され、数個の小さいPAS陽性アルシアン青陰性顆粒が細胞質に観察される。基底細胞は、基底膜の直ぐ上に位置するが、気道内腔にまでは及ばない、大きな核を有する小さい平板状の細胞である。
杯細胞産生の定量
杯細胞産生は、他に記載されている半自動イメージング・システム（Weberら(1984)Science 224:294-297）を使用して、粘膜表面上皮上のアルシアン青/PAS染色粘液物質の体積密度により決定した。本発明者らは、アルシアン青/PAS陽性染色面積及び総上皮面積を測定し、アルシアン青−PASにより染色された面積の総面積に対する割合（％）としてデータを表した。分析は、パブリック・ドメインNIHイメージ（Image）プログラム（米国国立衛生研究所で開発され、インターネットを介してzippy.nimh.govからアノニマスFTPで、又はNational Technical Information Service,Springfield,VA,part number PB95-500195GEIからフロッッピーディスクで入手可能である）を用いて実施した。
ラット上皮におけるEGF-Rの免疫組織化学的局在部位決定
EGF-Rの局在部位は、ラット気管の凍結切片において、EGF-Rに対する抗体（Calbiochem,San Diego,CA）を用いた免疫組織化学的染色を使用して調査した。1％パラホルムアルデヒドを含むPBSによる灌流の後、組織を4％パラホルムアルデヒドを含むPBSの中に1時間置き、次いで凍結保護のため30％ショ糖中に一晩取り出した。気管をO.C.T.化合物（Sakura Finetek U.S.A.,Inc.,Torrance,CA）に包埋し、凍結させた。凍結切片（5μm）を切断し、ガラス・スライド（Superfrost Plus,Fisher Scientific,Pittsburgh,PA）上に置いた。免疫染色はインビトロ研究と同様にして実施した。
プローブの調製
ラットMUC5のcDNAは、キャロル バスマウム（Carol Basbaum）博士より譲り受けた。ラットMUC5の320bpのcDNA断片を、転写ベクターpBluescript-SK(-)（Stratagene,La Jolla,CA）のXba/hindIII部位にサブクローニングした。インサイチュー・ハイブリダイゼーション用のRNAプローブを調製するため、このラットMUC5 cDNA断片を含有している組換えプラスミドを直鎖化し、アンチセンス・プローブ又はセンス・プローブを得るため、それぞれT7又はT3ポリメラーゼを用いてインビトロ転写した。インサイチュー・ハイブリダイゼーション用のプローブは、［35S］UTPの存在下で作製した。転写後、cDNA鋳型をDNaseで消化し、放射標識RNAをセファデックスG-25クイックスピン（Sephadex G-25 Quick Spin）（商標）カラム（Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN）により精製し、エタノール／酢酸アンモニウム溶液中で沈殿させた。使用前、RNAプローブを70％エタノールで洗浄し、10mM DTTで希釈した。
インサイチュー・ハイブリダイゼーション
凍結切片（5μm）を切断し、正の電荷を有するガラス・スライド（Superfrost Plus,Fisher Scientific,Pittsburgh,PA）の上に置いた。センス・プローブ及びアンチセンス・プローブを用いたハイブリダイゼーションのため、近位で切断された切片を使用した。代替的な切片を、アルシアン青/PAS染色のため使用した。標本を4％パラホルムアルデヒドで再固定し、0.5×SSC中で再水和させ、次いで無水酢酸を含むトリエタノールアミンの中でアセチル化した。ハイブリダイゼーションは、2500〜3000cpm/μlのアンチセンス・プローブ又はセンス・プローブを含む50％脱イオン化ホルムアミド、0.3M NaCl、20mM トリス、5mM EDTA、1×デンハルト溶液、20mMジチオスレイトール、10％デキストラン硫酸、0.5mg/ml酵母tRNA、及び0.5mg/mlの超音波処理サケ精子DNAを用いて、55℃で一晩実施した。ハイブリダイゼーション後の処理は、室温における2×SSC、1mM EDTA、10mMβ−メルカプトエタノールでの洗浄、室温における30分間のRNase溶液（20mg/ml）とのインキュベーション、さらに55℃における2時間の0.1×SSC、1mM EDTA、10mMβ−メルカプトエタノールでの洗浄、次いで室温における0.5×SSCでの洗浄からなっていた。標本を脱水和させ、空気乾燥させ、オートラジオグラフィーのため、コダックNBTヌクレア・トラック・エマルジョン（Kodak NBT nuclear track emulsion）（Eastman Kodak,Rochester,NY）でカバーした。4℃における7〜21日間の感光後、スライドを現像し、固定し、ヘマトキシリンで対比染色した（21）。
統計
全てのデータが、平均±SEMで表されている。群間の統計的有意差を決定するため、一元配置分散分析を使用した。分散分析において統計的有意性が同定された場合には、多重比較のためシェフェのF検定を使用した。帰無仮説の確率が0.05未満である場合に、統計的有意差ありと見なした。
結果
TNFαはNCI-H292細胞におけるEGF-Rの産生を刺激する
第一に、本発明者らは、NCI-H292細胞がEGF-Rを構成的に発現しているか否かを決定した。イムノブロットのウェスタン分析により、NCI-H292細胞のコンフルエント培養物中のEGF-Rタンパク質の存在が同定された（図1A、右）。コンフルエントになった後、細胞を調査した。溶解物を8％アクリルアミドゲル上で電気泳動させ、抗EGF-R抗体でブロットした。マーカー・タンパク質の分子量は右側に報告されている。EGF-Rの陽性対照は、EGF-Rを構成的に発現している（Weberら（前記））A431細胞に由来するタンパク質であった（図1A、左）。抗EGF-R抗体を用いた免疫細胞化学的研究により、陽性染色が明らかとなり、それは分裂中の細胞において最も著しかった（図1B、NCI-H292細胞の培養物における抗EGF-R抗体を用いた免疫細胞化学的分析）。コンフルエンス時、陽性染色が観察され、それは分裂中の細胞において最も強かった（矢印、右側）。一次抗体の非存在下では、染色は存在しなかった（左側）。ノーザン・ブロッティングにより、TNFα（20ng/ml）がEGF-R遺伝子発現を上方制御することが示され、その効果は12時間後に存在し、24時間後に増加した（図1C、NCI-H292細胞におけるEGF-Rのノーザン分析）。分析は、12時間又は24時間、TNFα（20ng/ml）と共にインキュベートされたコンフルエント培養物から抽出された全RNAに対して実施した。RNAをホルムアルデヒド−アガロース・ゲル上で電気泳動させ、ナイロン膜へ転写し、32P-標識EGF-R cDNAプローブをハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、膜を洗浄し、オートラジオグラフィーに供した。
EGF-RリガンドはNCI-H292細胞における粘液糖質複合体の発現及びMUC5遺伝子発現を刺激する
EGF-RはNCI-H292細胞において構成的に発現されているため、本発明者らは、EGF-Rリガンド（EGF、TGFα）の、粘液糖質複合体の産生を誘導する能力を査定した（図2、上カラム、ムチン糖タンパク質の同定のためのNCI-H292細胞のアルシアン青/PAS染色）。上カラム＝阻害剤の非存在下での細胞のインキュベーション；下カラム＝EGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤BIBX1522（10μg/ml）の存在下でのインキュベーション。細胞を単独でインキュベートした場合には（対照）、いくつかのPAS陽性染色が観察され（矢印、上カラム）；TNFα（20ng/ml）単独とのインキュベーションは染色に影響を与えず；EGF（25ng/ml）又はTGFα（25ng/ml）とのインキュベーションはPAS陽性染色を増加させ（矢印）、TNFα＋TGFαとのインキュベーションは染色を著しく増加させた（矢印、上カラム）。
いくつかの対照細胞は染色を示し；TNFα（20ng/ml）単独とのインキュベーションは染色に影響を与えず；EGF又はTGFα（それぞれ25ng/ml）のいずれかとのインキュベーションはPAS陽性染色を増加させ（矢印）；TNFα＋TGFαとのインキュベーションは、いずれかのリガンド単独の場合よりもはるかに多く染色を増加させた。このように、EGF-Rリガンドは、NCI-H292細胞において粘液糖質複合体を誘導する。
MUC5遺伝子発現を調査するため、ノーザン・ブロッティングを実施した（図3）。全RNA（10μg）を細胞から抽出し、ホルムアルデヒド−アガロースゲル上で電気泳動させ、ナイロン膜へ転写し、32P標識MUC5 cDNAプローブをハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、膜を洗浄し、オートラジオグラフィーに供した。MUC5遺伝子発現に関して、12時間（上カラム）又は24時間（下カラム）の、培地単独（C）、EGFもしくはTGFα（25ng/ml）、TNFα（20ng/ml）、又はTNFαとEGFもしくはTGFαのいずれかとの組み合わせを用いた培養物を得た。EGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤（BIBX1522；10μg/ml；下カラム）とのプレインキュベーション後、TNFαとEGF又はTGFaのいずれかとを用いた培養物も得た。阻害剤は、MUC5遺伝子発現を防止した。
NCI-H292細胞は、対照状態において、ある程度の発現を示し（図3、左下カラム）；細胞をEGF又はTGFαと共にインキュベートした場合、MUC5遺伝子発現は12時間後にはほとんど認められなかったが、24時間後には明確に発現した。TNFαは、単独では、MUC5遺伝子発現に影響を与えなかったが、EGF-Rリガンドと共にインキュベートされた細胞へTNFαを添加した場合には、MUC5遺伝子発現は、EGF-Rリガンド単独によって引き起こされたレベルよりも著しく高く増加した（図3）。
EGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤（BIBX1522）はNCI-H292細胞における粘液糖質複合体の発現及びMUC5遺伝子発現を防止する
EGF-R受容体の活性化がMUC5遺伝子発現を誘導するという仮説を検証するため、細胞をEGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤BIBX1522と共にインキュベートした。NCI-H292細胞をBIBX1522（10μg/ml）で前処理した場合、対照状態におけるPAS陽性染色が阻害され、EGF-Rリガンドにより起こる染色の増加が著しく阻害された（図2、下カラム）。ノーザン分析において、TNFαとEGF又はTGFαとの組み合わせにより著しく増加したMUC5遺伝子発現は、BIBX1522とのプレインキュベーションにより完全に阻害された（図3、下カラム）。これらの結果は、NCI-H292細胞におけるムチン遺伝子及び粘液糖タンパク質の誘導に、EGF-Rの活性化が関与していることを示している。
TNFαはラットにおけるEGF-R産生を刺激する
（構成的には気道上皮杯細胞をほとんど有しない）病原体除去ラットを、まずTNFαの役割に関して研究した。対照状態において、気管上皮はEGF-R陽性細胞をほとんど含有していなかった（図4A、左）。しかしながら、TNFα（200ng）の気管内注入により、気管上皮の様々な細胞型においてEGF-Rタンパク質が誘導された（図4A、右）。EGF-R陽性染色は、杯細胞（G）、前杯細胞（P-G）、非顆粒形成分泌細胞（S）、及び基底細胞（Ba）に存在したが、線毛細胞には存在しなかった。このように、TNFαは、EGF-Rタンパク質産生を誘導する。
ラットにおける粘液糖質複合体の産生及びMUC5遺伝子発現におけるEGF-Rリガンドの役割
対照状態において、気管上皮は杯細胞及び前杯細胞をほとんど含有していなかった。EGF-Rリガンド、EGF（600ng；示していない）又はTGFα（250ng；表1）単独の気管内注入は、上皮における粘液糖質複合体の産生に対する影響を有していなかった。しかしながら、まずTNFα（200ng）を与え、続いて24時間以内にEGF又はTGFαを与え（表1）、48時間後に動物を安楽死させた場合には、アルシアン青/PAS染色が著しく増加し、杯細胞及び前杯細胞の数が著しく増加したが、細胞の総数又は線毛細胞数は変化しなかった（表1）。MUC5遺伝子に関するインサイチュー・ハイブリダイゼーションにより、対照動物においては発現が示されなかった。TNFαに続いてEGF又はTGFαを気管内に注入した場合には、MUC5の発現が上皮において可視となった。このように、EGF-Rの誘導又はEGF-Rリガンドによる刺激は、単独では、杯細胞化生又は粘液糖質複合体の産生を誘導するのに不十分であった。しかしながら、TNFαによるEGF-Rの誘導後には、EGF-Rリガンドの注入により杯細胞化生が著しく刺激された。
〔表１〕 気管上皮における細胞分析
Figure 2010065053
ラットにおける気管上皮細胞に対するメディエータ及びオボアルブミン感作の効果。細胞は「方法」に記載のようにして分析された。各群5匹のラット。特徴決定は、（粘液糖質複合体を染色する）アルシアン青（AB）/PAS染色により補助された。細胞の計数に加え、総上皮面積のうちAB/PAS染色面積が占める割合（％）を計算した。対照気道、及びTGFα（250ng）単独で刺激された気道は、杯細胞及び前杯細胞をほとんど含有しておらず；AB/PASによる染色はほとんど存在しなかった。TNFα（200ng）に続いてTGFαで刺激することにより、杯細胞及び前杯細胞の数が増加し、AB/PAS染色細胞が占める面積が増加した。腹腔内（ip）のオボアルブミン（OVA）によるラットの感作は、細胞分布又はAB/PAS染色に対する効果を有していなかったが、OVAをipで与えた後、OVAを気管内（it）に注入した場合には、杯細胞及び前杯細胞、並びにAB/PAS染色が占める面積の割合（％）の著しい増加が見られた。
ラットにおけるオボアルブミン感作はEGF-R及び杯細胞産生を誘導する
急性喘息による死亡は、気道の粘液閉塞によることが報告されているため、病原体除去ラットにおいて喘息のモデルを作製した。0日目及び10日目にオボアルブミン（10mg、ip）を注射しても、杯細胞過形成は刺激されなかった（表1）。しかしながら、これに続いて、20日目、22日目、及び24日目にオボアルブミン（100μl中0.1％）を3回気管内（i.t.）注入し、26日目に動物を安楽死させた場合には、杯細胞及び前杯細胞が著しく増加し；線毛細胞及び基底細胞の数は不変であった（表1、右側）。抗EGF-R抗体を用いた免疫組織化学的研究は、対照気管において染色を示さなかった。i.p.及びi.t.の両方で感作された動物は、AB/PASで陽性染色された細胞（図4B、右）において選択的にEGF-R染色を示した（図4B、左）。オボアルブミン（0.1％、100ml）の3回の気管内注入の後、杯細胞及び前杯細胞においてEGF-R免疫反応性が強く発現され（左下）、同一細胞がアルシアン青/PASで陽性染色された（右下）。このように、オボアルブミン喘息モデルは、EGF-Rを産生する細胞において杯細胞増殖を示した。
EGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤（BIBX1522）は、ラットにおけるTNFα＋EGF-Rリガンドの注入及びオボアルブミン感作により誘導される杯細胞産生を防止する
BIBX1522は、培養細胞におけるムチン産生を防止したため、この阻害剤の効果を、病原体除去ラットにおいて調査した。TNFαに続いてEGF-RリガンドTGFαを気管内注入することにより増加したアルシアン青/PAS染色は、BIBX1522（3〜30mg/kg、ip；図5A）による前処理により用量依存的に阻害された。（EGF-Rを誘導するための）TNFαに続いてEGF-RリガンドTGFαを気管内注入することにより、著しい杯細胞化生が引き起こされた。
オボアルブミンで感作されたラットにおいては、BIBX1522（10mg/kg、ip）での前処理により、杯細胞の産生が完全に阻害された（アルシアン青/PAS染色により評価；図5B）。i.p.でのみオボアルブミンを与えられた動物は、気管支上皮におけるAB/PAS陽性染色をほとんど示さなかった。まずi.p.でOVA感作され、続いてOVAを3回気管内（i.t.）注入された動物は、AB/PAS陽性染色の顕著な増加を示した。
これらの研究は、EGF-Rが、EGF-Rリガンドにより刺激された場合、インビトロ及びインビボで杯細胞産生を誘導すること、その効果が、EGF-Rの活性化によるものであり、EGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤により阻止されたことを示している。オボアルブミン喘息モデルにおいても、阻害剤は杯細胞産生の防止において有効であった。
杯細胞誘導のメカニズムの記載に加え、当結果は、EGF-Rの発現に基づく杯細胞産生の展開に関する、可能性のある順序を示唆している。TNFαによる刺激により非顆粒形成分泌細胞の強い染色が誘導され；それに続くEGF-Rリガンドによる活性化により、進行的に細胞質内の粘液糖質複合体の染色が引き起こされ、細胞が「前杯細胞」となり、次いで「杯」細胞となった。TNFαの注入に続くEGF-Rリガンドの注入により、上皮細胞の総数は改変されることなく杯細胞産生が誘導され、このことから、EGF-R活性化により選択的な細胞分化（増殖ではない）が促進されたことが示唆される。その所見から、杯細胞が、EGF-Rを発現する非顆粒形成分泌細胞に由来しており、EGF-Rリガンドにより刺激されてムチンを産生することが示唆される。
急性喘息で死亡した患者において、杯細胞過形成及び粘液栓塞は重要な所見である。マウス喘息モデルにおいては、気道の感作が、オボアルブミンの反復注入の後に起こり、顕著な気道杯細胞の過形成を引き起こした。本発明者らは、対照気道上皮には発現していないEGF-Rが、感作された動物においては発現していることを示している。染色された細胞は前杯細胞及び杯細胞であり、このことから、EGF-Rが杯細胞産生に関与していることが示唆される。EGF-R受容体チロシンキナーゼ阻害剤（BIBX1522）による前処理により、気道杯細胞産生が防止されたが、このことは、実験的喘息における杯細胞産生におけるEGF-R活性化の役割を確証している。
当結果は、杯細胞過形成にEGF-R経路が関与していることを示している。オゾン、二酸化硫黄、ウイルス、リポ多糖、血小板活性化因子、及びインターロイキン-4のような様々な刺激が、ムチンの産生及び分泌を上方制御することが、以前の研究から示されている。本発明は、これらの炎症刺激とEGF-R系との関係を評価するためのメカニズムを提供する。
喘息は、本発明の治療戦略の一例として使用されている。正常ヒト気道上皮は、杯細胞1個に対し3〜10個という比率の線毛細胞を有する。喘息において、杯細胞の数は線毛細胞と等しいか、又はそれよりも多く；喘息発作重積状態で死亡する患者においては、喘息以外の呼吸器疾患で死亡する患者における数と比較して、杯細胞が占める面積の割合（％）が30倍増加している。杯細胞の産生の阻害は、この過剰分泌の起源を排除するはずである。杯細胞の生活環は不明であるため、治療による杯細胞過形成の消散の経過は正確には予測することができない。さらなるアレルゲンへの曝露が存在しない場合、以前に感作されたマウスにおける杯細胞過形成は、その他のアレルギー性炎症の兆候と共に50日以内に消散した。EGF-R活性化の阻害は、杯細胞の寿命によっては、はるかに迅速に杯細胞過形成を阻害する可能性がある。最近、高度に選択的なATP競合性チロシンキナーゼ阻害剤が報告された。EGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤は、EGF-R発現と関連した悪性疾患の治療のための評価を受けている途中である。
過剰分泌は、多くの慢性炎症性気道疾患における主要な兆候である。現在、これらの疾患の症状を緩解させ、進行を停止させるための有効な療法は存在しない。当所見は、EGF-R活性化を阻害することにより杯細胞産生が防止されるという、療法のためのメカニズム及び戦略を提供する。EGF-R活性化の阻害剤が、過剰分泌性気道疾患における療法として提唱される。
実施例2
杯細胞の産生における酸化ストレスの役割
ヒトにおいて、長期にわたる喫煙は、杯細胞過形成を含む末梢気道における進行性の病理学的変化と関連していることが示唆されている。同様に、動物における実験的な喫煙モデルは、気道における杯細胞過形成を引き起こすことが示されている。しかしながら、タバコ煙がムチン合成を誘導するメカニズムは不明である。以下のデータは、炎症誘発性サイトカインにより活性化された好中球及びタバコ煙が、非リガンド依存性のEGF-Rの活性化を介して、ヒト気管支上皮細胞におけるMUC5AC合成を引き起こすことを証明する。これらの結果は、動員された好中球及びタバコ煙が、気道におけるムチン産生細胞の異常な誘導を引き起こしうる、上皮細胞分化の制御因子であることを暗示する。
方法
好中球の単離
健康なヒト・ドナーから得られた末梢血よりヒト好中球を精製した。好中球の単離は、フィコール−ハイパック（Ficoll-Hypaque）勾配分離、デキストラン沈降、及び赤血球の低張溶解の標準的な技術により実施した。細胞は、通常、トリパンブルー色素排除によると95％超が生存していた。内毒素混入を防止するため、全ての溶液を、0.1μmフィルターに通した。
細胞培養
ヒト肺粘膜性類表皮癌細胞系NCI-H292細胞を、加湿5％CO2水ジャケット付きインキュベーター内で、37℃で、10％ウシ胎児血清、ペニシリン（100U/ml）、ストレプトマイシン（100μg/ml）、及びヘペス（25mM）を含有するRPMI1640培地の中で増殖させた。6穴培養プレート又は8チャンバー・スライドのいずれかを、細胞を培養するために使用した。コンフルエントになった時点で、細胞を、好中球単独（106細胞/ml）、TNFα単独（組換えヒトTNFα、20ng/ml、Genzyme,Cambridge,MA）、IL-8単独（組換えヒトIL-8、10−8M、Genzyme）、fMLP単独（10−8M、Sigma,St.Louis,MO）、TNFα＋好中球、IL-8＋好中球、fMLP＋好中球、過酸化水素（H2O2、200μM）、タバコ煙溶液、又はTGFα（組換えヒトTGFα、0.1〜25ng/ml、Calbiochem,San Diego,CA）と共に1時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、新鮮な培地単独と共にインキュベートした。予め選択された時点で実験を終了させた（mRNAについては6時間及び12時間；タンパク質については24時間）。対照として、同じ時間、培地単独と共に細胞をインキュベートした。好中球を用いた別の研究においては、TNFαがMUC5AC合成に対して最も強い効果を有していたため、TNFαを刺激として選択した。NCI-H292細胞を、TNFα（20ng/ml）と共に1時間インキュベートされた好中球と共に1時間インキュベートし、次いで上清（例えば、好中球から放出された分子）の混入を回避するため無菌PBSで洗浄するか、又はNCI-H292細胞を上清のみと共にインキュベートした。EGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤を用いた阻害研究においては、刺激を添加する30分前に、BIBX1522（10μg/ml、Boehringer Ingelheim Inc.,Ingelheim,Germanyより譲り受けた）又はチルホスチンAG1478（10μM、Calbiochem）でNCI-H292細胞を前処理した。血小板由来増殖因子受容体チロシンキナーゼの選択的阻害剤（チルホスチンAG1295、100μM、Calbiochem）、及びチルホスチンの陰性対照（チルホスチンA1、100μM、Calbiochem）の効果も調査した。EGF-Rリガンドに対する阻止抗体を用いた阻害研究においては、上清を抗TGFα抗体（Calbiochem）又は抗EGF抗体で30分間前処理し、次いでNCI-H292細胞へ添加した。酸素フリーラジカルの役割は、酸素フリーラジカルのスカベンジャーDMSO（1％、Sigma）、1,3-ジメチル-2-チオ尿素（DMTU、50mM、Sigma）、又はスーパーオキシドジスムターゼ（SOD、300U/ml、Sigma）を使用して調査した。
タバコ煙溶液の調製
研究用タバコ（コード2R1、University of Kentucky Tobacco and Health Research Foundationのため作製された）を研究に使用した。タバコ煙溶液は、以前に記載されたようにして調製された（Dusserら(1989)J.Clin.Invest.84:900-906）。簡単に説明すると、1分当たり1回の速度でタバコ煙をポリプロピレン製シリンジ（35ml）に吸引し（10回）、50mMヘペス緩衝液を含有する20mlのRPMI1640へと徐々に通した。次いで、煙溶液をpH7.4に滴定し、調製直後に使用した。
NCI-H292細胞における粘液糖質複合体及びMUC5ACタンパク質の可視化
実験の最後に、8チャンバー・スライドで増殖させた細胞を、4％パラホルムアルデヒドで1時間固定し、次いで粘液糖質複合体を可視化するためアルシアン青／過ヨウ素酸−シッフ（PAS）で染色するか、又はMUC5ACの免疫細胞化学のため使用した。MUC5ACの免疫細胞化学のため、0.05％ツィーン20、2％正常ヤギ血清、及びレバミゾール（2mM）を含有するPBSを、抗体の希釈剤として使用した。細胞をMUC5ACに対するマウスmAb（クローン45M1、1：200、Neo Markers,Fremont,CA）と共に室温で1時間インキュベートし、次いで過剰の一次抗体を除去するためPBSで3回洗浄した。次いで、細胞を1：200希釈のビオチン化ウマ抗マウスIgG（Vector Laboratories Inc.,Burlingame,CA）と共に室温で1時間インキュベートした。アビジン−ビオチン−アルカリホスファターゼ複合体法のための標準的なプロトコルに従い、結合した抗体を可視化した。
ヒトMUC5AC遺伝子に関するインサイチュー・ハイブリダイゼーション
ヒトMUC5ACの298bpのcDNA断片を、TAクローニング・ベクター（Invitrogen,San Diego,CA）に挿入した。RNAプローブの調製及びインサイチュー・ハイブリダイゼーションは、前記と同様にして実施した。
MUC5ACタンパク質のイムノアッセイ法
前記と同様にしてMUC5ACタンパク質を測定した。簡単に説明すると、複数の希釈率の細胞溶解物をPBSを用いて調製し、各試料50μlを96穴プレート（Maxisorp Nunc,Fisher Scientific,Santa Clara,CA）で重炭酸−炭酸緩衝液（50μl）と共に40℃で乾燥するまでインキュベートした。プレートをPBSで3回洗浄し、2％BSA（第V画分、Sigma）で室温で1時間ブロッキングした。プレートを再びPBSで3回洗浄し、次いで0.05％ツィーン20を含有するPBSで希釈されたマウス・モノクローナルMUC5AC抗体（1：100）50μlと共にインキュベートした。1時間後、ウェルをPBSで3回洗浄し、100μlの西洋ワサビペルオキシダーゼ−ヤギ抗マウスIgG結合体（1：10,000、Sigma）を各ウェルに分配した。1時間後、プレートをPBSで3回洗浄した。発色反応をTMBペルオキシダーゼ溶液（Kirkegaard & Perry Laboratories,Gaithersburg,MD）を用いて起こさせ、2N H2SO4で停止させた。450nmで吸光度を読み取った。
TGFαタンパク質の定量的分析
市販のELISAキット（Sigma）を使用して、製造業者の指示に従い、TGFαタンパク質を測定した。好中球＋TNFα（20ng/ml）の1時間のインキュベーションの後、採取された上清を、1％トライトン X-100、1％デオキシコール酸ナトリウム、及びいくつかのプロテアーゼ阻害剤（Complete Mini,Boehringer Mannheim,Germany）を含有する溶解緩衝液PBSと混合し、次いでTGFαを測定するために使用した。
EGF-Rタンパク質の免疫沈降及びチロシン・リン酸化に関するイムノブロッティング
細胞を無血清培地で24時間培養し、次いでTGFα、H2O2、又は活性化された好中球の上清で15分間刺激した。刺激後、細胞を溶解させ、回転式振とう器中で4℃で30分間インキュベートした。不溶性材料を除去するため、細胞溶解物を14,000rpmで4℃で5分間遠心分離した。等量のタンパク質を含有する上清の一部を、抗EGF受容体抗体（ポリクローナル、Ab4、Calbiochem）及び20μlのプロテインA−アガロース（Santa Cruz）を用いて4℃で2時間免疫沈降させた。沈降物を0.5mlの溶解緩衝液で3回洗浄し、SDS試料緩衝液に懸濁させ、5分間加熱した。タンパク質を8.0％アクリルアミドゲルでのSDS-PAGEにより分離した。得られたゲルを転写緩衝液（25mM トリス-HCl、192mMグリシン、20容量％メタノール、pH8.3）中で平衡化した。次いで、タンパク質をニトロセルロース膜（0.22μm）へ電気泳動により転写し、5％無脂肪スキムミルクを含む0.05％ツィーン20含有PBSで一晩ブロッキングし、次いでモノクローナル抗ホスホチロシン抗体（1：100、Santa Cruz）と共に1時間インキュベートした。アビジン−ビオチン−アルカリホスファターゼ複合体法のための標準的なプロトコル（ABC kit, Vector Laboratories）に従い、結合した抗体を可視化した。
統計
全てのデータが、平均±SEMで表されている。群間の統計的有意差を決定するため、一元配置分散分析を使用した。分散分析において統計的有意性が同定された場合には、多重比較のため、シェフェのF検定を使用した。帰無仮説の確率が0.05未満である場合、統計的有意差ありと見なした。
結果
活性化された好中球はムチンMUC5AC合成を引き起こす
好中球＋好中球を活性化する刺激（IL-8、fMLP、TNFα）を、NCI-H292細胞と共に1時間インキュベートした場合、MUC5ACタンパク質合成は24時間以内に有意に増加したが、未刺激好中球（106/ml）、IL-8単独、又はfMLP単独は、MUC5AC合成に対する効果を示さず；TNFα単独とのインキュベーションは小さな非有意なMUC5AC合成の増加を引き起こした。好中球をTNFαと共に1時間プレインキュベートし、次いで好中球とそれらの上清を分離した場合、それに続き上清をNCI-H292細胞と共に1時間インキュベートすることにより、12時間以内にMUC5AC遺伝子発現が上方制御され、アルシアン青/PAS及びMUC5ACタンパク質に対する抗体の両方による染色が24時間以内に刺激され；休止期NCI-H292細胞は、MUC5AC遺伝子発現をほとんど示さず、アルシアン青/PAS及びMUC5ACタンパク質の両方の染色を小さく断片的に示した。上清により誘導されたMUC5ACタンパク質合成は、対照より有意に増加しており、インキュベーション後に上清から分離された好中球には効果がなかった。活性化された好中球は、MUC5AC合成を引き起こす活性を有する産物を迅速に分泌するということが結論付けられた。
EGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤は活性化された好中球の上清により誘導されるMUC5AC合成を防止する
EGF-RリガンドはEGF-Rチロシンキナーゼの活性化を介してNCI-H292細胞におけるMUC5AC合成を引き起こすことが知られているため、活性化された好中球の上清により誘導されるMUC5AC合成におけるEGF-R活性化の役割を調査した。NCI-H292細胞を選択的EGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤（BIBX1522、AG1478）で前処理することにより、活性化された好中球の上清により通常は誘導されるMUC5ACタンパク質合成が防止された。選択的な血小板由来増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤（AG1295）及びチルホスチンの陰性対照（A1）には効果がなかった。これらの結果は、活性化された好中球の上清により誘導されるMUC5AC合成に、EGF-Rチロシンキナーゼの活性化が関与していることを示している。
MUC5AC合成における活性化された好中球の上清に分泌されるEGF-Rリガンドの役割
EGF-RチロシンキナーゼがEGF-Rリガンド（EGF及びTGFα）に対し依存性であるか否かを決定するため、本発明者らは、活性化された好中球の上清を、EGF-Rリガンドに対する中和抗体と共にプレインキュベートした。上清を抗TGFα抗体又は抗EGF抗体で前処理することにより、活性化された好中球の上清により誘導されるMUC5AC合成は阻害されなかった。さらに、上清中にTGFαは検出されなかった。従って、活性化された好中球の上清により引き起こされるEGF-Rチロシンのリン酸化は、EGF-RリガンドEGF及びTGFαとは無関係のメカニズムにより誘導された。
タバコ煙及び酸素フリーラジカルはMUC5AC合成を引き起こす
タバコ煙及び酸素フリーラジカルH2O2は、TGFαと同様に、12時間以内にMUC5AC遺伝子発現を上方制御した。同様に、全ての刺激がMUC5ACタンパク質合成及び粘液糖質複合体産生を24時間以内に増加させ、この効果は用量依存的に起こった。H2O2に応答して起こる最大のMUC5AC合成は、TGFαに対する応答よりも有意に少なかった。AG1478による前処理により、全ての刺激により誘導されるMUC5ACタンパク質合成の増加が防止され、このことから、刺激が、EGF-Rチロシンキナーゼの活性化によりムチン合成を引き起こすことが示された。活性化された好中球の上清、タバコ煙、及びH2O2によるMUC5AC合成は、フリーラジカル・スカベンジャー（DMSO及びDMTU）及びSODによる前処理により有意に阻害されたが、TGFαによるMUC5ACタンパク質合成はDMSO又はSODによる影響を受けなかった。
活性化された好中球の上清及びH2O2によるEGF-Rのチロシン・リン酸化の誘導
EGF-Rタンパク質の分布は、無血清培地で培養された対照、及び全ての刺激条件（活性化された好中球の上清、タバコ煙、H2O2、又はTGFα）で類似していた。全タンパク質チロシン・リン酸化は、活性化された好中球の上清、タバコ煙、H2O2、又はTGFαを添加してから15分以内に起こり；無血清培地で培養された対照は効果を示さなかった。TGFαにより誘導される全タンパク質チロシン・リン酸化は、活性化された好中球の上清、タバコ煙、又はH2O2の効果よりも大きかった。EGF-Rがリン酸化されたか否かを決定するため、抗EGF-R抗体による免疫沈降を実施した。活性化された好中球の上清、タバコ煙の可溶性産物、及びH2O2は全て、EGF-R特異的なチロシン・リン酸化を15分以内に誘導し、その効果はTGFαにより引き起こされた効果と類似していた。AG1478によるNCI-H292細胞の前処理により、全ての刺激によるEGF-Rチロシン・リン酸化が阻害された。DMSOは、上清、タバコ煙、及びH2O2により誘導されるEGF-Rチロシン・リン酸化を阻害したが、DMSOは、TGFαにより誘導されるEGF-Rチロシン・リン酸化に対する効果は有していなかった。
上記の結果は、好中球が、IL-8、fMLP、又はTNFαにより活性化されたとき、NCI-H292細胞におけるムチンMUC5AC合成を引き起こすことを示している。さらに、好中球とTNFαとのインキュベーションの1時間後に収集された上清は、MUC5AC合成を引き起こし、その効果は選択的EGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤により阻害された。EGF-Rチロシンキナーゼの阻害により、活性化された好中球の上清により引き起こされるMUC5AC合成は完全に阻止され；非EGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤である、選択的な血小板由来増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤（AG1295）及びチルホスチンの陰性対照（A1）には効果がなく、このことは、EGF-Rチロシン・リン酸化が、活性化された好中球の上清により誘導されるMUC5AC合成のシグナル伝達経路であることを暗示している。
活性化された好中球の上清がEGF-Rチロシン・リン酸化を誘導するメカニズムをさらに分析するため、リガンド依存性及び非リガンド依存性両方のEGF-R経路を調査した。第一に、活性化された好中球の上清の中のTGFαを測定し、上清が測定可能な量のTGFαを含有していないことを見出した。以前の報告より、好中球が低濃度（2.5pg/106細胞）のTGFαのみを含有していることが示されている。活性化された好中球の上清のMUC5AC合成に対する効果は、好中球中に見出されるTGFαの量よりも400倍多い1ngのTGFαの効果と同等の強さであった。第二に、本発明者らは、EGF-Rリガンドの中和抗体を用いた阻止研究を実施した。EGF及びTGFαに対する中和抗体による前処理により、活性化された好中球の上清により引き起こされるMUC5AC合成は阻害され得なかった。これらの結果より、好中球の上清により誘導されるMUC5AC合成が、好中球によるEGF-Rリガンド（TGFα及びEGF）の分泌によるのではないことが示唆される。次に、本発明者らは、非リガンド依存性経路を調査した。酸素フリーラジカルは活性化中の好中球により放出され、様々な細胞におけるEGF-Rチロシンキナーゼのトランス活性化を引き起こすことが知られているため、本発明者らは、活性化された好中球による酸素フリーラジカルの放出が、EGF-Rチロシン・リン酸化を引き起こし、NCI-H292細胞におけるMUC5AC合成を引き起こすのだという仮説を立てた。フリーラジカルのスカベンジャー（DMSO及びDMTU）及びSODにより、活性化された好中球の上清によるMUC5AC合成が阻害された。TNFαは、懸濁液中の好中球において酸化的破裂を引き起こし、その最大応答は1時間以内に起こることが報告されているが；本発明の結果は、同様の経過を示した。
H2O2は、酸化的破裂において好中球から放出される主要産物であるが、当研究において、外因性H2O2は、NCI-H292細胞におけるMUC5AC合成を引き起こした。しかしながら、MUC5AC合成におけるH2O2に対する最大応答は、TGFαに対する応答のわずか半分であった。当研究における重要な所見は、タバコ煙が単独でMUC5AC合成を引き起こしたという事実である。これは、タバコ煙が直接的な刺激及び好中球の動員により引き起こされる間接的な刺激の両方により、インビボでMUC5AC合成を引き起こしうることを示唆している。MUC5AC合成を引き起こすタバコ煙中の正確な分子は、未だ不明である。タバコ煙は、複数の産物（例えば、ニコチン、タール、アクロレイン、及び酸化剤）を含有していることが示されている。本発明者らの実験において、DMSO及びSODはタバコ煙により誘導されるMUC5AC合成を部分的に阻害した。従って、酸化ストレスは、この応答を起こさせる一つのメカニズムであるかもしれない。タバコ煙により誘導されるMUC5AC合成が、EGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤により完全に阻止されたという事実は、EGF-R活性化が、タバコ煙により誘導されるMUC5AC合成において主要な役割を果たしていることを示している。
気道疾患において、好中球性の気道炎症は一般的な特徴であり、好中球はサイトカイン及びタバコ煙により動員され活性化される。当研究は、動員された好中球及びタバコ煙が、気道におけるムチン産生細胞の誘導を引き起こす上皮細胞分化の制御因子としても作用することを示している。最も重要なこととして、EGF-R活性化の阻害は、過剰分泌性気道疾患における療法として有用であろう。
実施例3
気道上皮の創傷は杯細胞化生を引き起こす
気道に注入されたアガロース・プラグは、気管支を閉塞させることなく気管支内に慢性的に留まり、そして残留したプラグは、炎症を引き起こし、杯細胞化生をもたらすであろうという仮説を立てた。アガロース・プラグは、アルシアン青/PAS陽性染色及びムチンMUC5AC遺伝子発現により示されるような、炎症細胞の局所的な動員と関連した顕著な局所的な杯細胞産生を誘導することが示される。この結果は、プラグにより誘導される杯細胞化生にEGF-R活性化が関与していることを示している。
方法
動物
実験動物プロトコルは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の動物研究に関する委員会により承認された。特定病原体除去雄F344ラット（体重230〜250g；Simonsen Lab.,Gilroy,CA）を使用した。ラットは、環境的に調節された層流フードを有する病原体除去バイオクリーン（BioClean）ケージに収容し、無菌の飼料及び水を自由に摂取させた。
薬物
以下の供給元からの薬物を使用した。シクロホスファミド（Sigma,St Louis,MO）、メトヘキシタールナトリウム（Brevital、Jones Medical Industries,Inc.,St.Louis,MO）、ペントバルビタールナトリウム（Nembutal、Abbott Lab.,North Chicago,IL）；EGF-Rチロシンキナーゼの選択的阻害剤BIBX1522（Boehringer Ingelheim Inc.,Ingelheim,Germanyより譲り受けた）は、2mlのポリエチレングリコール400（Sigma,St Louis,MO）、1mlの0.1N HCl、及び3mlの2％マンニトール水溶液（pH7.0）に溶解させた。NPC15669（白血球運動の阻害剤）は、Scios Nova,Inc.,Mountain View,CAより譲り受けた。
アガロース・プラグ
アガロース・プラグ（直径0.7〜0.8mm）は、無菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の4％アガロースII型中EEO（Sigma,St Louis,MO）を用いて作成された。組織内のアガロース・プラグを可視化するため、50℃でアガロースを融解させた後、3％の懸濁モナストラル・ブルー（Monastral blue）B（Sigma,St Louis,MO）を添加した。
実験プロトコル
病原体除去ラットは、通常、気道に杯細胞をほとんど有していないため、本発明者らは、病原体除去ラットを研究した。メトヘキシタール・ナトリウム（Brevital、25mg/kg、i.p.）で動物に麻酔をかけた。正中頸部切開により気管を無菌的に露出させ、切開された気管に通されたポリエチレン・チューブ（PE90、内直径0.86mm、外直径1.27mm、Clay Adams,Parsippany,NY）と接続された20ゲージのアンジオカス（Angiocath）（Beckton Dikinson,Sandy,UT）を介して、アガロース・プラグを気管支内に注入した。右気管支に選択的に注入されるよう、ポリエチレン・チューブを30°の角度で湾曲させた。注入後、切開部を縫合により閉鎖した。
アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生に対するEGF-Rの役割を評価するため、アガロース・プラグの注入の1時間前に、動物をBIBX1522（80mg/kg、i.p.）で処理し、毎日繰り返した（40mg/kg、i.p.、1日2回）。アガロース・プラグの注入から24時間後、48時間後、又は72時間後に動物を安楽死させた。
アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生におけるTNFαの役割を評価するため、動物をTNFα中和抗体（Genzyme,Boston,MA）で処理した。最初の処理（0.2ml生理食塩水中100μl、i.p.）はアガロース・プラグの注入の1時間前に与え、毎日i.p.注射を繰り返した。さらに、皮下に移植された浸透圧ミニポンプ（Alzet 2ML1,Alza Corp.,Palo Alto,CA）を介して、TNFα中和抗体を点滴注入した（10μl/h）。
アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生に対する好中球の効果を研究するため、ラットを、シクロホスファミド（骨髄白血球の阻害剤）又はシクロホスファミド＋NPC15669の組み合わせで前処理した。シクロホスファミド（100mg/kg、i.p.）をアガロース・プラグ注入の5日前に与え、シクロホスファミド（50mg/kg、i.p.）の第二の注射をプラグ注入の1日前に与えた。NPC15669を用いた研究においては、薬物（10mg/kg、i.p.）をアガロース・プラグ注入の1時間前に注射し、次いで以後3日間毎日注射した。
全ての薬物（BIBX1522、TNFα中和抗体、シクロホスファミド、及びNPC15669）を、アガロース・プラグ注入の1時間前にi.p.で与え、3日間毎日投薬を繰り返した。
組織の調製
アガロース・プラグ注入後の様々な時点で、ペントバルビタール・ナトリウム（65mg/kg、i.p.）でラットに麻酔をかけ、全身循環系に120mmHgの圧力で1％パラホルムアルデヒドを含むジエチルピロカルボネート（diethyl pyrocarbonate）処理PBSを灌流した。右肺を摘出し、右尾状葉を組織学に使用した。凍結切片については、組織を摘出し、4％パラホルムアルデヒド中に1時間置き、次いで凍結保護のための30％ショ糖中に一晩移した。組織をO.C.T.化合物（Sakura Finetek U.S.A.,Inc.,Torrance,CA）に包埋した。メタクリレート切片については、組織を4％パラホルムアルデヒド中に24時間置き、次いで段階的な濃度のエタノールで脱水和させ、メタクリレートJB-4（Polysciences,Inc.,Warrington,PA）に包埋した。組織切片（厚さ4μm）を、アルシアン青/PASで染色し、ヘマトキシリンで対比染色した。
気管支上皮の形態計測的分析
以前に発表された方法に従い、半自動画像分析システムを使用して、上皮内の粘液糖質複合体のアルシアン青/PAS染色面積の割合（％）を決定した。上皮の面積及び上皮内のアルシアン青/PAS染色粘液糖質複合体の面積を、手動で画定し、NIHイメージ・プログラム（米国国立衛生研究所で開発され、インターネットからアノニマスFTPで、又はNational Technical Information Service,Springfield,VA,part number PB95-500195GEIからフロッッピーディスクで入手可能である）を使用して分析した。総上皮面積のうちアルシアン青/PAS染色が占める割合（％）としてデータを表した。粘液分泌を半定量的に評価するため、全長に対する比率として、陽性染色された長さを計算することにより、アルシアン青/PAS陽性染色が占める上皮表面の長さの割合（％）を決定した。全上皮長に対する剥皮上皮の長さの比率を計算することにより、剥皮上皮の割合（％）を決定した。
メタクリレート切片における細胞型の同定及び細胞分析
油浸対物レンズ（倍率1000倍）を用いて2mmの基底層上の上皮細胞核を計数することにより、上皮細胞の総数を計数した。分析された上皮の各領域の下の基底層の直線的な長さは、基底層のディジタル化された画像の輪郭をトレースすることにより決定した。上皮細胞は、以前に記載されたようにして同定した。簡単に説明すると、基底細胞は、基底膜の直ぐ上に位置するが、気道内腔にまでは及ばない、大きな核を有する小さな平板状の細胞として同定された。細胞質は、暗く染色され、アルシアン青又はPAS陽性顆粒は存在しなかった。線毛細胞は、周縁部に線毛を有すること、細胞質が弱く染色されること、及び核が大きく丸いことにより認識された。非顆粒形成分泌細胞は、円柱形であり、気管支内腔から基底層にまで拡がっていた。アガロース・プラグの気管支内注入後、「発達中の」杯細胞（前杯細胞）が形成された。これらの細胞は、アルシアン青/PAS陽性染色を示し、顆粒は小さく、細胞には顆粒が充満しておらず；小さな粘液染色面積（基底膜から内腔表面までの上皮の高さの1/3未満）を含有しているか、又は低密度の弱くアルシアン青/PAS染色される小さな顆粒を含有していた。未決定の型の細胞とは、妥当な分類のために十分な細胞質の特徴を欠いた細胞プロフィールと定義された。
EGF-Rの免疫組織化学的局在部位決定
EGF-Rに対するモノクローナル・マウス抗体（Calbiochem,San Diego,CA）を使用した免疫組織化学的局在部位決定によりEGF-Rの存在を決定した。先に調製された4μｍの凍結切片を、4％パラホルムアルデヒドで後固定し、0.3％H2O2／メタノールで処理した。組織をEGF-R抗体（1：250希釈）と共にインキュベートした。3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（Sigma,St Louis,MO）で染色された抗原−抗体複合体を可視化するため、ビオチン化ウマ抗マウスIgG（1：200；Vector Lab.,Burlingame,CA）を使用し、続いてストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（ABCキット、Vector Lab.,Burlingame,CA）を使用した。陰性対照スライドは、一次抗体又は二次抗体のいずれかを省略し、PBSと交換して、インキュベートした。
インサイチュー・ハイブリダイゼーション
キャロル バスマウム（Carol Basbaum）博士より譲り受けたラットMUC5ACの320bpのcDNA断片を含有するプラスミドから、［35S］標識リボプローブを作製した。切片に、［35S］標識RNAプローブ（2,500〜3,000cpm/μlハイブリダイゼーション緩衝液）をハイブリダイズさせ、RNaseA処理を含む高ストリンジェンシー条件下で洗浄した。7〜21日間のオートラジオグラフィー後、写真感光乳剤を現像し、スライドをヘマトキシリンで染色した。
気道上皮内の好中球の計数
気管支への好中球流入の評価を、3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドで好中球を染色することにより実施し、好中球の数を、気道内腔及び上皮において計数し；結果を基底層長1mm当たりの染色された細胞の数として表した。
気管支肺胞洗浄（BAL）
各動物群における種類別細胞数を査定するため、肺を各3mlの無菌PBSで5回洗浄し、洗浄液をプールし、容量を測定した。1,000rpmで10分間、洗浄液をスピンすることによりBAL中の細胞を収集した。次いで、BAL液中の細胞数を決定するため、血球計を用いて、10マイクロリットルの細胞懸濁液を計数した。ディフ−クイック（Diff-Quick）（American Scientific Products,McGraw Park,IL）で染色されたサイトスピン調製物に対して、種類別細胞計数を実施した。種類別細胞計数は、各サイトスピン・スライド上に少なくとも200個の細胞をサンプリングすることにより得られた。
統計分析
データは、平均±SEMで表されている。統計分析のため、適宜、二元配置又は一元配置の分散分析（ANOVA）を使用し、続いてスチューデントt検定を使用した。0.05未満の確率を、統計的有意差と見なした。
結果
気道上皮構造に対する効果：杯細胞化生
アガロース・プラグが気道上皮の構造に影響を与えるか否かを決定するため、アガロース・プラグを5匹の病原体除去ラットの右気管支内に注入した。対照動物においては、気管支上皮はほとんど杯細胞を含有していなかった。しかしながら、アガロース・プラグの局所注入後、アルシアン青/PAS染色により、杯細胞面積の時間依存的な増加が示され、それは注入から24時間後に早くも検出可能となり、72時間後に最大となった。24時間後に、アガロース・プラグは前杯細胞及び杯細胞の数を有意に増加させ、48時間後には、より多くの成熟杯細胞が見出された（表1）。72時間後、アガロース・プラグは杯細胞の数を増加させたが（P＜0.01）；基底細胞及び線毛細胞の数は変化しなかった（P＞0.05）。注入から72時間後の基底膜1mm当たりの上皮細胞の総数は、有意ではなかったが、わずかに増加し（P＞0.05、表1）；上皮の高さ（上皮の基底膜から内腔表面までを測定）は、対照気道における16.0±1.2μmから、プラグ注入から72時間後には38.1±9.1μmへと増加した（n=5、P＜0.01）。
対照動物の気道内腔には、アルシアン青/PAS染色が存在しなかった。しかしながら、アガロース・プラグと隣接した内腔には陽性染色が観察され、粘液糖質複合体の分泌が起こっていることが示された。アガロース・プラグを有する気道においては、染色は時間依存的に増加した。プラグと隣接した気道におけるアルシアン青/PAS陽性染色が占める上皮の全長に対する割合（％）は、対照動物における0.1±0.1％から、24時間後には4.7±1.4％、48時間後には13.3±0.7％、72時間後には19.1±0.7％へと増加した（n＝5）。さらに、アガロース・プラグは、プラグを有する気管支の上皮を、24時間後には13.5±2.3％、48時間後には6.9±2.4％、72時間後には5.1±1.5％剥皮した（n＝5）。
ムチン遺伝子発現に対するアガロース・プラグの効果
対照ラットの気管支には、MUC5ACのアンチセンス・プローブにより検出可能なシグナルは存在しなかった（1群当たりn＝4）。アガロース・プラグが注入された気管支においては、MUC5ACのシグナルが24時間から72時間にかけて時間依存的に増加した（n＝4）。MUC5AC遺伝子発現は、アルシアン青/PASで陽性染色された細胞に優先的に見出された。他の細胞型（例えば、平滑筋、結合組織）には、シグナルが検出されなかった。MUC5ACセンス・プローブを用いて調査された切片は、発現を示さなかった。
気道上皮におけるEGF-R発現に対するアガロース・プラグの効果
対照動物において、EGF-Rに対する抗体を用いた免疫染色は、上皮における低密度の染色を示した。しかしながら、アガロース・プラグの注入後、アガロース・プラグと隣接した上皮は、アルシアン青/PASで陽性染色された細胞におけるEGF-R陽性染色を示した。EGF-Rに関する染色パターンは、MUC5AC及びAB/PASに関する染色と平行していた。前杯細胞、杯細胞、及び非顆粒形成分泌細胞は、EGF-Rに関して免疫陽性であった。線毛細胞は免疫反応性を示さなかった。アガロース・プラグにより閉塞されていない気道においては、上皮はEGF-Rに関する染色をほとんど示さず、対照動物における染色と類似しているようであった。
杯細胞化生及びムチン遺伝子発現に対するEGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤の効果
本研究において、アガロース・プラグの注入は、ムチンを産生する細胞におけるEGF-Rの発現を引き起こした。EGF-Rは、チロシンキナーゼ受容体クラスのメンバーである。従って、EGF-Rリガンド（EGF又はTGFα）がEGF-Rと結合すると、特異的なEGF-Rチロシンキナーゼが活性化される。従って、EGF-R活性化が、アガロース・プラグの注入後のMUC5AC遺伝子及び粘液糖質複合体の発現を誘導するという仮説を検証するため、EGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤（BIBX1522）をラットに腹腔内注射した。BIBX1522は、24時間後、48時間後、及び72時間後にアガロース・プラグにより誘導される上皮のアルシアン青/PAS染色面積を顕著に阻害した。プラグ注入から72時間後、MUC5AC遺伝子の発現も完全に阻害された。
杯細胞化生及びEGF-Rタンパク質発現に対するTNFα中和抗体の効果
本発明者らは、アガロース・プラグにより引き起こされる炎症において、TNFαが放出されるという仮説を立てた。従って、本発明者らは、アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生に対する、TNFα中和抗体によるラットの前処理の効果を調査した。TNFα中和抗体で前処理された動物においては（n＝5）、アガロース・プラグは、EGF-Rタンパク質発現も、アルシアン青/PAS陽性染色（杯）細胞の産生も、もはや刺激しなかった。
アガロース・プラグによる炎症細胞動員
アガロース・プラグが上皮傷害及び炎症細胞浸潤を引き起こすことが認められた。様々な炎症細胞が、TNFα及びEGF-Rリガンドの両方を産生しうる。EGF-R及びそのリガンドの両方が、杯細胞化生へと至るEGF-Rカスケードに関与している。本発明者らは、アガロース・プラグにより誘導される効果における白血球及びマクロファージの役割を、二通りに評価した。第一に、本発明者らは、気管支肺胞洗浄において細胞を調査した。対照ラットにおいては、回収された細胞は主にマクロファージであった（n＝5；図4、対照）。アガロース・プラグの注入後、マクロファージの数は増加し（P＜0.05）、有意な数の好中球（P＜0.01）が洗浄液中に出現した。リンパ球の数は不変であった。
組織切片内の浸潤細胞も評価した。アガロース・プラグを有しない気道には、ほとんど好中球が含まれていなかったが、プラグを含有する気道は、上皮にも内腔にも好中球の存在を示した。対照気道、並びにプラグ注入から24時間後、48時間後、及び72時間後において、気道内腔の好中球の数は、それぞれ、基底層1mm当たり0.2±0.2、42.4±7.1、40.7±7.7、及び20.1±7.2であった（P＜0.05、n＝5）。さらに、対照、並びにプラグ注入から24時間後、48時間後、及び72時間後において、気道上皮の好中球の数は、それぞれ、基底層1mm当たり1.3±0.4、15.6±2.6、14.9±1.4、及び14.8±2.6であった（P＜0.01、n＝5）。
好中球動員、杯細胞化生、及びEGF-Rタンパク質発現に対するシクロホスファミドの効果
シクロホスファミドで処理されたラットにおいては、血中好中球が枯渇し（シクロホスファミド後の静脈血中の好中球数は1.8±0.5％、n＝5）、プラグにより誘導されるBALへの好中球動員が阻害された。気道内腔（基底層1mm当たり2.6±0.3）及び上皮（0.8±0.2/mm）における好中球の数も、24時間後に有意に減少した。シクロホスファミドは、アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生及びEGF-Rタンパク質発現も阻害した。ロイメジン（leumedin）、NPC15669をシクロホスファミドに添加した場合の、アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生の阻害は、シクロホスファミド単独の効果と類似していた。これらの結果は、プラグにより誘導される杯細胞化生に好中球が関与していることを示している。
考察
当研究において、本発明者らは、対照状態においては杯細胞をほとんど有していない病原体除去ラットの気道における、杯細胞化生に対するアガロース・プラグ注入の効果を調査した。対照動物の気管支及びアガロース・プラグを含まない気管支（対照肺）における上皮細胞は、アルシアン青/PASにより均一に陰性に染色された。アガロース・プラグの注入により、注入されたプラグと隣接した気管支上皮の杯細胞面積の明確な時間依存的な増加が引き起こされ、それは注入後24時間以内に検出可能となり、約72時間後に最大となった。プラグを有する気道と隣接した気道も、アルシアン青/PASで陽性に染色された。総細胞数、並びに基底細胞及び線毛細胞の数は変化しなかったが、杯細胞の数は増加し、非顆粒形成分泌細胞の数はアガロース・プラグ注入後に時間依存的に減少した（表2）。これらの結果より、杯細胞化生が非顆粒形成分泌細胞の杯細胞への変換の結果であったことが示唆される。
〔表２〕 病原体除去ラットにおける気管支上皮細胞の分布に対するアガロース・プラグの効果＊
Figure 2010065053
細胞は「方法」に記載のようにして分析した。各群n＝5。特徴決定は、（粘液糖質複合体を染色する）アルシアン青/PAS染色により補助された。対照気道は、前杯細胞及び杯細胞をほとんど含有していなかった。アガロース・プラグの注入後、対照動物と比較して、前杯細胞及び杯細胞の数は時間依存的（24時間後、48時間後、72時間後）に増加し、非顆粒形成分泌細胞の数は減少した。
＊ データは、基底層1mm当たりの細胞数の平均±SEである。
‡ 対照と比較してP＜0.05。
§ 対照と比較してP＜0.01。
‖ 細胞が分類のための十分な細胞質の特徴を欠いている。
ラット気道杯細胞は、MUC5AC遺伝子を発現することが報告されている。本研究においては、対照気管支は、MUC5AC遺伝子を発現していなかったが、アルシアン青/PASで陽性に染色された、プラグにより閉塞した気道又は栓と隣接した気道は、MUC5AC遺伝子を発現しており、このことから、MUC5AC遺伝子がアガロース・プラグにより誘導される粘液産生に関与していることが示唆された。これらの結果は、アガロース・プラグが、ラット気道中の選択された細胞において、ムチン遺伝子の発現及び粘液糖質複合体の産生を誘導することを示している。
アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生のメカニズムを調査した。EGF-Rは、病原体除去ラットの気道上皮に通常は発現していないが、TNFαにより誘導される。上皮にEGF-Rが存在する場合、EGF-Rリガンド（EGF又はTGFα）の注入により、ムチン遺伝子及びタンパク質発現の増加が引き起こされる。EGF-Rチロシンキナーゼの選択的阻害剤（BIBX1522）により、これらの応答が完全に阻害され、このことから、杯細胞化生にEGF-Rシグナル伝達が関与していることが示された。アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生に対するBIBX1522の効果を決定した。BIBX1522は、アガロース・プラグにより誘導される粘液糖質複合体の産生及びMUC5AC遺伝子発現を阻害した。これらの結果は、アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生にEGF-Rカスケードが関与していることを示している。
EGF-Rカスケードがアガロース・プラグによる杯細胞化生を引き起こすメカニズムを研究した。第一に、本発明者らは、気管支上皮におけるEGF-Rタンパク質の発現を研究した。対照気道はEGF-Rに関して均一に陰性に染色されたが、アガロース・プラグを含有する気道は、選択的な時間依存的なEGF-Rに関する陽性染色を示した。陽性染色された細胞には、非顆粒形成分泌細胞、前杯細胞、及び杯細胞が含まれていた。このように、アガロース・プラグはEGF-Rタンパク質発現を誘導した。TNFαに対する中和抗体で前処理されたラットは、アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生を示さず、このことから、アガロース・プラグにより誘導されるEGF-R発現にTNFαが関与していることが示された。
白血球産生を選択的に抑制する薬物であるシクロホスファミドは、アガロース・プラグ注入後の気道洗浄液及び気道上皮への好中球動員を防止し、アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生も防止した。マクロファージもアガロース・プラグの導入の後に増加したが、マクロファージ動員はシクロホスファミドにより阻害されなかった。これらの結果は、アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生に好中球が関与していることを示している。シクロホスファミドによりアガロース・プラグ後のEGF-Rタンパク質発現も減少したという事実は、好中球が、少なくとも部分的に、この炎症状態におけるEGF-R発現に寄与していることを示唆している。
好中球も、EGF-Rリガンド、EGF及びTGFαを産生しうる。さらに、上皮細胞はEGF-Rリガンドの起源であり、アガロース・プラグと隣接した上皮の著しい剥皮が存在した。従って、上皮は、TNFα及びEGF-Rリガンド両方の重要な潜在的な起源でありうる。
アガロース・プラグの有効な刺激は、呼吸中のプラグの移動と、それに続く上皮の剥皮と関連していると、合理的に推測できる。気道上皮に対する機械的な損傷は、過剰分泌を引き起こすことが報告されている。これらの以前の研究は、気道上皮に対する機械的外傷が過剰分泌に至るという仮説の信用性を高める。口蓋気管内挿管は、ウマにおいて多量の粘液分泌をもたらすことが報告されている。患者における慢性的な挿管は、粘液過剰分泌を引き起こし、粘液栓塞の原因となりうる。EGF-Rチロシンキナーゼの阻害剤は、気管内挿管後の粘液過剰分泌を防止するために役立つかもしれない。
上皮の傷害は、中程度の喘息の場合ですら、喘息患者の研究における共通の所見であり、傷害は臨床的な症状の悪化と増加的に関係している。アレルギー応答により生じた上皮の傷害は、異常な杯細胞産生をもたらすEGF-R活性化を誘導しうる。上記データは、特に杯細胞化生を含む異なる応答に、EGF-R活性化が関与していることを示している。機械的な上皮傷害及び喘息における上皮損傷には、上皮分泌細胞の異常な増殖をもたらす類似の（EGF-R）カスケードが関与している可能性がある。これは、致命的な急性喘息例において起こる過剰分泌に関するメカニズムを提供する。
実施例4
EGF受容体による杯細胞の再顆粒形成
ラット鼻気道上皮における杯細胞の脱顆粒が、fMLPの鼻腔内吸入により誘導された。fMLP（10-7M）の鼻腔内吸入から4時間後に、鼻中隔上皮において有意な脱顆粒が誘導された。杯細胞の再顆粒形成は、吸入の48時間後までに起こった。対照の状態において、MUC5ACタンパク質は杯細胞に発現していたが、EGF-Rタンパク質は発現していなかった。EGF-R及びMUC5ACムチンの遺伝子及びタンパク質は、いずれも、対照上皮には存在しないが、吸入から48時間後には有意に発現していた。EGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤BIBX1522による前処理により、fMLPにより誘導される杯細胞脱顆粒の後のムチンMUC5ACの遺伝子及びタンパク質の発現が阻害された。これらの結果は、EGF-Rの発現及び活性化が、ラット鼻上皮における杯細胞の再顆粒形成に関与していることを示している。
方法
動物
実験動物プロトコルは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の動物研究に関する委員会により承認された。特定病原体除去雄F344ラット（体重200〜230g；Simonsen Lab.,Gilroy,CA）を使用した。動物は、環境的に調節された層流フードを有する病原体除去バイオクリーン・ケージに収容し、無菌の飼料及び水を自由に摂取させた。
鼻組織の調製
吸入後の様々な時点において、ペントバルビタール・ナトリウム（65mg/kg、i.p.）でラットに麻酔をかけた。動物の心臓を露出させ、先端が鋭利でない針を左心室の心尖から上行大動脈へ挿入し、全身循環系に1％パラホルムアルデヒドを灌流した。右心房における切開により、固定液の出口を提供した。眼、下顎、皮膚、及び筋系を除去し、頭部を大容量の同固定液に24時間浸漬した。固定後、頭部をサージパス（Surgipath）（Decalcifier II,Surgical Medical Industries,Inc.,Richmond,IL）で4〜5日間脱灰し、リン酸緩衝生理食塩水で濯いだ。鼻腔を鼻口蓋の切歯乳頭のレベルで横に切片化した。前方組織塊を、グリコールメタクリレート（JB4 Plus,Polysciences,Inc.,Warrington,PA）又は凍結切片のためのOCT化合物（Sakura Finetek U.S.A.,Inc.,Torrance,CA）に包埋した。グリコールメタクリレート包埋された塊の腹側表面から厚さ5μmの切片を切断し、酸性及び中性の糖質複合体を証明するためアルシアン青（pH2.5）／過ヨウ素酸−シッフ（AB/PAS）で染色するか、又は上皮へ遊走した白血球を可視化するため3,3'-ジアミノベンジジン（Sigma chemical,St Louis,MO）で染色した。凍結包埋された塊の腹側表面から厚さ5μmの切片を切断し、AB/PASで染色するか、又はEGF-R及びMUC5ACの免疫染色のため使用した。
鼻上皮における好中球の計数
400倍という倍率で、3,3'-ジアミノベンジジンで染色された上皮層の高倍率視野において好中球を計数した。鼻中隔上皮内（基底膜から細胞先端部まで）の好中球の数を、基底層長1単位当たりの核プロフィールの数を計数することにより決定した。
杯細胞の脱顆粒及び再顆粒形成の定量
杯細胞の脱顆粒及び再顆粒形成を査定するため、本発明者らは、以前に発表された方法に従い、半自動イメージング・システムを使用して、粘膜表面上皮上のアルシアン青/PAS染色粘液物質の体積密度を測定した。本発明者らは、ビデオ・カメラ・コントロール・ユニット（DXC7550MD；Sony Corp.of America,Park Ridge,NJ）と接続されたアキシオプラン（Axioplan）顕微鏡（Zeiss,Inc.）を用いて、染色されたスライドを調査した。IMAXXビデオ・システム（PDI,Redmond,WA）を使用して、400倍の位相差レンズを用いて鼻上皮の像を高倍率視野で記録した。表層上皮分泌細胞の細胞内ムチンは、様々なサイズの楕円形の紫色顆粒として出現した。本発明者らは、アルシアン青/PAS陽性染色面積及び総上皮面積を測定し、総面積に対するアルシアン青/PAS面積の割合（％）としてデータを表した。分析は、パブリック・ドメインNIHイメージ・プログラムを使用して、マッキントッシュ9500/120コンピュータ（Apple Computer,Inc.,Cupertino,CA）上で実施した。
EGF-Rタンパク質及びMUC5ACタンパク質の免疫局在部位決定
パラホルムアルデヒドで固定された鼻組織からの組織切片を、内因性の過酸化物を阻止するため、3％H2O2／メタノールで処理し、1：100希釈のEGF-R（Calbiochem,San Diego,CA）又はMUC5AC（NeoMarkers Inc.,Fremont,CA）に対するマウス・モノクローナル抗体と共に1時間インキュベートした。免疫反応性のEGF-R又はMUC5ACを、色素原として3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドを使用して、ベクタステイン・エリート（Vectastain Elite）ABCキット（Vector Lab.,Inc.,Burlingame,CA）で可視化した。対照には、一次抗体又は二次抗体のPBSとの置換が含まれていた。
方法
本発明者らは、通常、鼻中隔上皮に多くの杯細胞を有しない病原体除去ラットを研究した。杯細胞脱顆粒及び好中球の鼻粘膜上皮への遊走に対するエアロゾル化fMLPの効果を決定するため、ペントバルビタール・ナトリウム（65mg/kg、i.p.）で動物に麻酔をかけ、N-ホルミル-メチオニル-ロイシル-フェニルアラニン（fMLP；10-5M、Sigma,St Louis,MO）を含む発熱性物質を含まない生理食塩水を、5分間エアロゾルにより鼻腔内に与えた。エアロゾル曝露は、0.3ml/分の速度でエアロゾル・ミストを発生する超音波噴霧器（PulmoSonic,DeVibiss Co.,Somerset,PA）を用いて、動物を換気することにより達成された。同様にして、対照動物には、生理食塩水エアロゾル単独を鼻腔内に与えた。
fMLPエアロゾルの吸入後の鼻杯細胞の再顆粒形成を研究するため、fMLPの鼻腔内送達から48時間後にラットを安楽死させた。
杯細胞再顆粒形成に対するEGF-Rチロシンキナーゼ活性化の効果を評価するため、fMLPの吸入の30分前に、EGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤（BIBX1522、15mg/kg、Boehringer Ingelheim Inc.,Ingelheim,Germanyより譲り受けた）で動物を腹腔内で前処理し、1日2回繰り返した。
統計
全てのデータが、平均±SEMとして表されている。各実験群について、一元配置ANOVA又はスチューデントt検定を使用した。0.05未満の確率を、統計的有意差と見なした。
結果
鼻上皮構造に対するfMLPによる杯細胞脱顆粒の効果 対照状態において、鼻中隔上皮は、AB/PAS染色杯細胞の有意な面積を含有していたが、内腔表面は染色されなかった。ムチンMUC5ACタンパク質に関する免疫染色は、AB/PAS染色の範囲と一致していたが、インサイチュー・ハイブリダイゼーションでは、MUC5AC遺伝子発現がほとんど又は全く示されなかった。EGF-Rタンパク質に関する免疫組織化学的染色は、陰性であった。これらの結果は、対照ラット鼻上皮が、ムチン遺伝子を発現することなく、MUC5ACタンパク質を含有している完全な杯細胞を含有していることを示している。内腔の染色の欠如は、ムチンの脱顆粒（分泌）が存在しなかったことを示唆している。
未刺激のラット鼻上皮は、ムチン・タンパク質を含有する「安定な」非脱顆粒杯細胞を含有している、という仮説を立てた。好中球化学誘引物質（例えば、fMLP）は、好中球を気道上皮へ動員し、そこで好中球がエラスターゼ依存的な過程を介してGC脱顆粒を引き起こすことが示されている。GC脱顆粒の効果を調査するため、好中球化学誘引物質fMLP（10-7M）のエアロゾルを5分間鼻腔内に送達した。fMLPの4時間後に安楽死させたラットにおいて、AB/PAS染色面積及びMUC5AC陽性免疫染色面積は著しく減少しており、鼻上皮への好中球動員が起こっていた。AB/PAS染色は鼻気道内腔表面において顕著であり、このことから、GC脱顆粒が起こったことが確認された。しかしながら、fMLPの4時間後、MUC5AC遺伝子発現は不変であった。
fMLPの48時間後に安楽死させたラットにおいては、EGF-R抗体による免疫組織化学的染色により、前杯細胞及び杯細胞においてEGF-Rが陽性に染色され、AB/PAS染色及びMUC5AC免疫陽性染色の面積は、対照状態において存在するレベルに戻り、このことから、鼻GCの再顆粒形成が起こったことが示された。この時点で、好中球動員はもはや存在せず；MUC5AC遺伝子発現はGCが占める範囲において可視であり、このことから、GC再顆粒形成がムチン遺伝子発現の増加と関連していることが示された。
杯細胞再顆粒形成におけるEGF-Rチロシンキナーゼ・リン酸化の役割
以前のラットにおける研究より、EGF受容体（EGF-R）の活性化が、ムチンの遺伝子及びタンパク質の発現に至ることが報告された。EGF-R活性化が、fMLP後のラット鼻GC再顆粒形成において役割を果たしているという仮説を検証するため、ラットを選択的EGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤BIBX1522で前処理した（n＝5）。fMLPのエアロゾル化は、鼻上皮への好中球動員及びGC脱顆粒を引き起こしたが、48時間後、AB/PAS染色及びMUC5AC免疫陽性染色の面積は減少したままであった。これらの結果は、fMLPによる脱顆粒の後の鼻GCムチン合成に、EGF-R活性化が関与していることを示している。
当研究において、本発明者らは、ラット鼻上皮におけるムチン産生の制御を調査した。対照上皮は、有意な数の杯細胞を含有しており、これらの細胞にはMUC5ACタンパク質が存在した。しかしながら、MUC5AC遺伝子発現は存在しなかった。MUC5ACムチン発現は、他の気道上皮細胞において、EGF-Rの発現及びそれらの活性化を介して起こることが報告されている。対照ラット鼻上皮細胞には、EGF-Rの遺伝子又はタンパク質の発現が見出されなかった。AB/PAS染色又はMUC5ACタンパク質は内腔に存在せず、このことから、有意な杯細胞脱顆粒（分泌）は起こっていなかったことが示唆された。EGF-Rは、「安定な」杯細胞においては下方制御されており、さらなるムチン合成を防止しているのかもしれない。従って、本発明者らは、杯細胞脱顆粒を誘導することにより鼻杯細胞を「攻撃」し、それに続く気道上皮構造の変化を調査した。
好中球化学誘引物質は、好中球と杯細胞との密接な接触を含む、好中球エラスターゼにより媒介される、モルモット及びヒトの気道における好中球依存性の杯細胞脱顆粒を引き起こす。鼻中隔に通常存在している杯細胞の脱顆粒を誘導するため、化学誘引物質fMLPを鼻腔内に吸入させた。fMLPにより鼻上皮に好中球が動員され、続いて杯細胞の脱顆粒が起こった。アルシアン青/PAS染色範囲は顕著に減少した。
次に、本発明者らは、fMLPにより誘導されるGC脱顆粒の後の、鼻上皮における後続現象を調査した。fMLPの4時間後、鼻GCの最大の脱顆粒が起こり、EGF-R及びMUC5ACの発現は存在しないままであった。しかしながら、fMLPの48時間後、EGF-Rは前杯細胞及び杯細胞において強く発現していた。MUC5AC遺伝子発現は、今や、上皮において強く発現しており、これらの現象は杯細胞の再顆粒形成（AB/PAS及びMUC5ACの染色の増加）と関連していた。実際、fMLPの48時間後には、杯細胞面積が対照状態と類似する程度にまで、再顆粒形成が起こった。これらの所見は、GC脱顆粒が、EGF-Rの発現及び活性化に至り、それによりムチンMUC5AC発現が誘導されることを示唆している。
GC再顆粒形成におけるEGF-Rチロシンキナーゼ活性化の役割を調査するため、本発明者らは、選択的EGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤BIBX1522で動物を前処理した。BIBX1522で前処理された動物において、fMLPは依然としてGC脱顆粒を引き起こした。しかしながら、BIBX1522による前処理は、GCの再顆粒形成及びMUC5ACタンパク質の発現を防止した。これらの結果は、GC脱顆粒後のムチンの再増殖にEGF-R活性化が関与していることを示している。病原体除去ラットにおいては、杯細胞は「不活型」（即ち、脱顆粒しない）であり、EGF-Rが下方制御されている。炎症（例えば、好中球浸潤の刺激）がGC脱顆粒及びムチン分泌を引き起こすと、EGF-Rの上方制御及び活性化が気道上皮にムチンを再供給する。本所見は、選択的EGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤が、鼻疾患における過剰分泌の防止において有用である可能性を示唆している。
実施例5
ヒト気管支におけるEGF-Rと杯細胞産生との関係
正常ヒト気道及び喘息気道におけるEGF-R発現を査定した。EGF-R及びMUC5AC（杯細胞ムチンのマーカーとして）の両方に関するインサイチュー・ハイブリダイゼーション及び免疫組織化学的分析を実施した。
方法
対象
11人の健康対象及び12人の喘息対象に由来する試料を分析した。以下の表3に要約されるように、肺活量測定、吸入メタコリンに対する気道の反応性、及び皮膚試験反応性によって、対象を特徴決定した。FEV1:1秒間努力呼気肺活量；FEV1 PC20：基線FEV1の20％の減少を引き起こすために必要なメタコリンの吸入誘発濃度。
〔表３〕
Figure 2010065053
健康対象は、気道閉塞又は再発性鼻炎の臨床歴を有しておらず、正常な肺機能検査結果を有していた。彼らは、皮膚アレルギーも有していなかった。喘息対象は、喘息に関する臨床的診断基準（American Thoracic Society(1987)Am.Rev.Respir.Dis.136:225-244）を満たし、吸入メタコリンに対する過敏性を示した。研究への参加前6週間以内に吸入又は経口でコルチコステロイドを摂取した対象はいなかった。喘息対象は、症状のコントロールのためにβ-アゴニストを断続的に使用していた。当時もしくは過去の喫煙歴、過去5年以内の気管内挿管歴、過去6週以内の気道感染、又は重度の心疾患もしくは神経学的疾患を有する者は、対象の中にいなかった。
気管支鏡は、口から導入し、右主気管支幹へと進めた。スパイク付き（spiked）窓付き（fenestrated）の生検用鉗子を使用して、上葉、中葉の分岐部、及び下葉の上方セグメントから生検試料を得た。生検標本を、4％パラホルムアルデヒドで1時間固定し、次いで凍結保護のため30％ショ糖中に一晩置いた。標本を、O.C.T.化合物又はグリコールメタクリレート（GMA）樹脂（Park Scientifice, Northampton, UK）に包埋し、厚さ3μmの切片として切断した。全ての切片を、アルシアン青/PASで染色し（杯細胞の可視化のため）、ヘマトキシリンで対比染色した（総細胞数の計数のため）。アルシアン青（1％）は、酢酸（3％）で希釈し、最終pHは2.5であった。
EGFR及びMUC5ACのインサイチュー・ハイブリダイゼーション
インサイチュー・ハイブリダイゼーションは、ヒトEGFR遺伝子の350bpのcDNA断片を含有しているヒトEGFRプローブ（pTRI-EGF-R-ヒト・プローブ・テンプレート、Ambion,Austin,TX）及びヒトMUC5AC遺伝子の298bpのcDNA断片を含有しているヒトMUC5ACプローブを使用して実施した。pBluescript II SK-ベクター（Stratagene,LaJolla,CA）を、EGFR断片のサブクローニングのために使用した。ハイブリダイゼーションは記載されたようにして実施した（Louら(1998)Am.J.Respir.Crit.Care Med.157:1927-1934）。簡単に説明すると、凍結切片（4μm）を切断し、正の電荷を有するガラス・スライド（Superfrost Plus,Fisher Sci,Pittsburgh,PA）の上に置いた。近位で切断された切片を、センス・プローブ及びアンチセンス・プローブを用いたハイブリダイゼーションに使用した。標本を、4％パラホルムアルデヒドで再固定し、0.5×SSC中で再水和させ、次いでトリエタノールアミン及び無水酢酸の中でアセチル化した。ハイブリダイゼーションは、アンチセンス・プローブ又はセンス・プローブ2500〜300cpm/μlを含む50％脱イオン化ホルムアミド、0.3M NaCl、20mMトリス、5mM EDTA、1×デンハルト溶液、20mMジチオスレイトール、10％デキストラン硫酸、0.5mg/ml酵母tRNA、及び0.5mg/ml超音波処理サケ精子DNAを用いて、58℃で、一晩、実施した。ハイブリダイゼーション後の処理は、2×SSC、1mM EDTA、10mM β-メルカプトエタノールでの室温での洗浄、室温での30分間のRNase溶液（20μg/ml）とのインキュベーション、さらに55℃で2時間の0.1×SSC、1mM EDTA、10mM β-メルカプトエタノールでの洗浄、次いで室温で20分間の0.5×SSCでの洗浄からなっていた。標本を、脱水和させ、空気乾燥させ、オートラジオグラフィーのためコダックNBTヌクレア・トラック・エマルジョン（Eastman Kodak,Rochester,NY）でカバーした。4℃で7〜21日間の感光の後、スライドを現像し、固定し、ヘマトキシリンで対比染色した。
EGFR及びMUC5ACの免疫組織化学的分析
免疫組織化学は、GMA包埋切片を使用して実施した。切片を、4％パラホルムアルデヒドで5分間再固定した。0.05％ツィーン20、2％正常ヤギ血清、及びレバミゾール（2mM）を含有しているPBSを、抗体の希釈剤として使用した。EGFRに対するマウス・モノクローナル抗体（1：40、Calbiochem,San Diego,CA）、又はMUC5ACに対するマウス・モノクローナル抗体（クローン45M1、1：100、NeoMarkers,Fremont,CA）と共に室温で一晩、切片をインキュベートし、次いで過剰の一次抗体を除去するためPBSで3回洗浄した。次いで、1：200希釈のビオチン化ウマ抗マウスIgG（Vector Laboratories）と共に室温で2時間、切片をインキュベートした。アビジン−ビオチン−アルカリホスファターゼ複合体法の標準的なプロトコルに従い、結合した抗体を可視化した。全ての免疫組織化学的染色に、一次抗体に曝さない対照切片、同一アイソタイプの無関係の抗体に置換するか、又は10倍過剰の免疫感作ペプチドと共に抗体をプレインキュベートする切片が含まれていた。EGFRの免疫染色には、染色パターンを確認し、ヒトEGFRのアミノ酸残基1005〜1016に相当するEGFRペプチド抗原（Calbiochem）を使用したクエンチング（quenching）を実施するため、EGFRに対するウサギ・ポリクローナル抗体（1：100、Calbiochem）も使用した。抗EGFR抗体については、EGFR過剰発現A431細胞系から調製された細胞溶解物と共に抗体をプレインキュベートすることにより、対照実験が実施された。
形態計測的分析
抗EGFR Ab又は抗MUC5AC Abで染色された生検切片から、400倍の倍率で、気道上皮の画像を6個捕捉した。他に記載されている半自動イメージング・システム（Takeyamaら(1998)Am.J.Physiol.275:L294-L302）を使用して、上皮粘膜表面上のMUC5AC免疫反応性の体積密度により、杯細胞面積を査定した。本発明者らは、陽性染色面積及び総上皮面積を測定し、陽性染色面積の割合（％）としてデータを表した。分析は、パブリック・ドメインNIH IMAGEプログラム（米国国立衛生研究所で開発され、zippy.nimh.govからアノニマスFTPにより、又はNational Technical Information Service,Springfield,VA,part number PB95-500195GEIからフロッッピーディスクで入手可能である）を用いて実施した。EGFR免疫反応性は、ステレオロジー・ツールボックス（Stereology Toolbox）（バージョン1.1、Morphometrix,Davis,CA）により分析した。気道上皮内のEGFR陽性細胞の数は、点及び線からなるサイクロイドを使用して、点計数により決定した。点計数は、対象のアイデンティティ及び疾患カテゴリを承知していない研究者が実施した。
統計分析
統計は、スタット・ビュー（StatView）4.01（Abacus concepts,Berkeley,CA）を使用して実施した。全てのデータが、平均±SEMで表されている。群間の統計的有意差を決定するため、マン・ホイトニー（Mann-Whitney）のU検定を使用し；変数間の相関を決定するため、ピアソン（Pearson's）の線形回帰分析及び一元配置分散分析を使用した。帰無仮説の確率が0.05未満である場合に、統計的有意差ありと見なした。
結果
EGFR mRNA
全ての喘息対象において、インサイチュー・ハイブリダイゼーションは、気道上皮におけるEGFR mRNAの発現を示したが、健康対象はEGFR mRNA発現をほとんど示さなかった。EGFRセンス・プローブは均一に陰性であった。
EGFRタンパク質
EGFR陽性細胞の総上皮細胞に対する割合（％）は、健康対象より喘息対象において大きかった（P＜0.05、図6、左カラム）。健康対象において、EGFR免疫反応性は、稀であり、ほぼ完全に杯細胞に限定されていた。喘息対象においては、EGFR免疫反応性は多様であり、EGFR免疫反応性が杯細胞にのみ観察される対象、及び内腔にも観察される対象がいた。EGFR免疫反応性が主に基底細胞に局在している対象もいた。基底細胞におけるEGFR免疫反応性の割合（％）は、健康対象よりも喘息対象の方が大きく；杯細胞においては、喘息対象よりも健康対象の方がEGFR免疫反応性の割合（％）が大きかった（図6）。粘液線が生検中に観察される場合もあった。腺中の粘液細胞はEGFR免疫反応性を示したが、漿液細胞は示さなかった。線毛細胞は、喘息対象においても健康対象においてもEGFR免疫反応性を示さなかった。一次抗体に曝さなかった切片、又は同一アイソタイプの無関係の抗体に置換した切片は陰性であり、過剰のEGFRタンパク質の抗体への予備吸着により、EGFR免疫反応性は消失した。
杯細胞及び基底細胞におけるEGFR免疫反応性の結果を、表4に要約する。
〔表４〕
Figure 2010065053
MUC5AC mRNA
喘息対象においては、杯細胞の分布と類似した断片的なパターンで気道上皮にMUC5AC mRNAが発現していた。健康対象由来の上皮は、杯細胞の分布域に位置しているMUC5AC mRNAの弱い発現のみを示した。MUC5ACセンス・プローブは均一に陰性であった。
MUC5ACとEGFRとの共局在
EGFR免疫反応性が杯細胞に観察された場合、MUC5AC及びEGFRの免疫反応性は、アルシアン青/PASで染色された杯細胞に共局在していた。
EGFR免疫反応性のMUC5ACとの相関
気道上皮細胞のEGFR免疫反応性は、全ての対象において、気道上皮におけるMUC5AC陽性染色面積との有意な正の相関を示した（n＝23、r＝0.725、P＜0.0001）（図7）。
実施例6
IL-13はEGFRを刺激し好中球を活性化することにより粘液産生を誘導する
病原体除去ラットにおいて、IL-13を注入することにより、IL-13により誘導される粘液産生に対するEGFR活性化の役割を調査し、IL-13により誘導される杯細胞（GC）増殖に対するEGFRチロシンキナーゼ阻害剤の効果を調査した。
方法
動物
体重220〜240gの特定病原体除去雄F344フィッシャー・ラットを、シモンセン・ラボラトリーズ（Simonsen Laboratories）（Gilroy,CA）より購入した。動物は、病原体除去室に収容し、実験用餌で維持し、飼料及び水を自由に摂取させた。カリフォルニア大学サンフランシスコ校の動物研究に関する委員会は、全ての手法を承認した。各群5匹の動物を研究した。
IL-13により誘導されるGC化生に対するEGFR活性化の選択的阻害剤の効果
まず、ラットにおいてインビボ研究を実施したところ、IL-13がラット気管上皮においてGC化生を誘導することが示された。ペントバルビタール［ネンブタール・ナトリウム（Nembutal sodium）、50mg/kg、腹腔内（ip）、Abbott Laboratories,North Chicago,IL］で動物に麻酔をかけ、自発呼吸をさせた。媒体（リン酸緩衝生理食塩溶液；PBS）又はIL-13を、口から20ゲージのアンジオカス・カテーテル（Beckton Dickinson,Sandy,UT）により気管支内に注入しながら、高輝度照明器（FiberLite；Dolan Jenner Industries,Inc.,Lawrence,MA）を使用して喉頭範囲を可視化した。IL-13の注入から48時間後、竜骨組織を調査した。様々な濃度のIL-13（組換えマウスIL-13；5ng/匹、50ng/匹、100ng/匹、及び500ng/匹、R & D systems,Minneapolis,MN）を含む200μlのPBSを、気管内に注入した。無菌PBS（200μl）を、対照として気管内に注入した。
IL-13により誘導されるGC化生と、EGFR活性化との関係の調査のため、IL-13注入の1日前、及び翌日に、選択的EGFRチロシンキナーゼ阻害剤（BIBX1522；1〜30mg/kg/日、ip；Boehringer Ingelheim,Ingelheim,Germany）で動物を処理した。IL-13の注入から48時間後、動物を安楽死させた。
IL-13により誘導される杯細胞化生における白血球動員の役割
予備研究において、本発明者らは、IL-13が気道への白血球動員を引き起こすことを認めた。本発明者らは、白血球動員が、IL-13によって誘導される上皮からの化学誘引物質の放出によって起こり、この動員が、GC化生へと至るIL-13により誘導されるEGFRカスケードに関与しているとの仮説を立てた。動物群を、IL-13（500ng）の注入から4時間後、8時間後、16時間後、24時間後、及び48時間後に安楽死させ、気道組織内の白血球を計数した。
IL-13により誘導されるGC化生における白血球の役割の評価のため、骨髄内の白血球の阻害剤［シクロホスファミド（17）；Sigma chemical Co.,St Louis,MO］、又はインターロイキン-8に対する阻止抗体（IL-8Ab；ウサギ抗ヒトIL-8抗体；Biosource,Camarillo,CA）でラットを前処理した。IL-13（500ng）の単一用量の注入の5日前にシクロホスファミド（100mg/kg、ip）を与え、IL-13注入の1日前に2回目のシクロホスファミド注射（50mg/kg、ip）を与えた。もう一つの研究系列において、本発明者らは、IL-13と共にIL-8 Ab（10μg/匹）を注入し、抗ヒトIL-8阻止抗体の注入を、12時間間隔で、動物が安楽死するまで繰り返した。
組織の調製
致死量のペントバルビタール［ネンブタール・ナトリウム、200mg/kg、ip、Abbott Laboratories,North Chicago,IL］で動物を安楽死させ、全身循環系に、1％パラホルムアルデヒドを含むジエチルピロカルボネート（Diethylpyrocarbonate）（DEPC、Sigma chemical Co.,St Louis,MO）で処理したPBSを、左心室から灌流した。凍結切片については、竜骨組織を摘出し、4％パラホルムアルデヒド中に一晩置き、次いで凍結保護のため30％ショ糖中に置いた。組織をオプティマル・カッティング・テンパラチャー（optimal cutting temperature）（OCT、Sakura Finetek U.S.A.,Inc.,Torrance,CA）化合物に包埋した。プラスチック切片又はパラフィン切片については、組織を4％パラホルムアルデヒド中に一晩置き、エタノールで脱水和させ、JB-4プラス・モノマー溶液A（Polysciences,Inc.,Warrington,PA）又はパラフィンに包埋した。包埋組織を厚さ4μmの横断切片として切断し、ガラス・スライド上に置いた。
GC化生の定量
全ての研究において、一定のサンプリングを得るため、竜骨を調査した。本発明者らは、AB/PAS陽性面積及び総上皮面積を測定し、総上皮面積に対するAB/PAS面積の割合（％）として結果を表した。分析は、パブリック・ドメインNIH IMAGEプログラム（米国国立衛生研究所で開発され、zippy.nimh.govからアノニマスFTPにより、又はNational Technical Information Service,Springfield,VA,part number PB95-500195GEIからフロッッピーディスクで入手可能である）を用いて実施した。
ラット竜骨上皮におけるMUC5AC、EGFRタンパク質、TNF-α、及びIL-8に関する免疫組織化学的染色
0.3％H2O2を含むメタノールにより内因性ペルオキシダーゼを阻止した後、0.05％ツィーン20及び2％正常ヤギ血清を含有しているリン酸緩衝溶液を、抗体の希釈剤として使用した。EGFRに対するマウスmAb（1：250、Calbiochem,San Diego,CA）、MUC5ACに対するマウスmAb（クローン45M1、1：500、New Markers,Fremont,CA）、又はTNF-αに対するウサギ抗体（1：1000、Genzyme,Cambridge,MA）と共に4℃で一晩、切片をインキュベートし、過剰の一次抗体を除去するためPBSで洗浄した。IL-8様物質の免疫組織化学的局在部位決定のため、本発明者らは、マウス抗ヒトIL-8抗体（1：20；Biosource,Camarillo,CA）を使用した。次いで、1：200希釈のビオチン化ウマ抗マウスIgG（Vector Laboratories,Burlingame,CA）と共に室温で1時間、切片をインキュベートした。アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体法のための標準的なプロトコルに従い、結合した抗体を可視化した。MUC5ACタンパク質の測定にも、上皮におけるGC化生の定量的測定のために使用したのと同一の方法を使用した。
気道組織における白血球の評価
IL-13（500ng）の注入から4時間後、8時間後、16時間後、24時間後、及び48時間後、動物を安楽死させ、気道組織内の白血球を計数した。好中球の動員を評価するため、本発明者らは、好中球のための3,3'-ジアミノベンジジンで切片を染色し、次いでトルイジンブルーで対比染色した。ペルオキシダーゼ陽性の青色細胞質の細胞として見られる好中球を、胸骨内の上皮（基底膜から細胞先端部まで）の6個の連続する高倍率視野で計数した。好塩基球の動員を評価するため、本発明者らは、ルナ（Luna）試薬で切片を染色した。
ヒト好中球の単離及び走化性
健康ドナーから得られた末梢血よりヒト好中球を精製した。好中球単離は、フィコール・ハイパック勾配分離、デキストラン沈降、及び赤血球の低張溶解の標準的な技術により実施した。細胞は、通常、トリパンブルー色素排除によると95％超が生存していた。内毒素の混入を防止するため、全ての溶液を0.1μmフィルターに通した。走化活性は、リーディング・フロント（leading front）技術を利用して、48穴マイクロケモスタシス・チャンバー（48-well microchemotaxis chamber）（Neuroprobe,Cabin John,MD）において査定した。遊走は、37℃で25分後のニトロセルロース・フィルター（孔径3μm）を介した好中球の正味の移動（μm）として測定した。IL-13（10-10、10-9、5×10-9M；組換えヒトIL-13；R & D systems,Minneapolis,MN）の効果は、移動距離として表され、RPMI1640と共にインキュベートされた好中球のランダムな遊走と比較される。
データ分析
全てのデータが、平均±SEMで表されている。群間の統計的有意差を決定するため、一元配置分散分析（ANOVA）を用いて統計分析を実施した。ANOVAにおいて統計的有意性が同定された場合には、多重比較のためシェフェのF検定を使用した。0.05未満の確率を、統計的有意差ありと見なした。
結果
杯細胞化生に対するインターロイキン-13の効果
IL-13がムチン産生を誘導することを確認するため、IL-13（5ng/匹、50ng/匹、100ng/匹、及び500ng/匹）を気管内に注入し、48時間後に組織を調査した。対照ラットにおいて、気道上皮は、散在するAB/PAS染色及びMUC5AC染色のみを含有していた（図8）。IL-13は、用量依存的にAB/PAS染色及びMUC5AC染色を増加させた（図8）。これらの結果は、IL-13が、ラット気道上皮において、GC化生及びMUC5ACムチン産生を誘導することを暗示している。
IL-13により誘導される杯細胞化生に対するEGFR活性化の選択的阻害剤の効果
IL-13により誘導されるGC化生と、EGFR活性化との関係を調査するため、選択的EGFRチロシンキナーゼ阻害剤（BIBX1522；1〜30mg/kg/日）で前処理した。対照ラットは、気道上皮にEGFR発現をほとんど示さなかったが、IL-13注入によりEGFR発現が増加した。選択的EGFRチロシンキナーゼ阻害剤BIBX1522による前処理によって、IL-13により誘導されるAB/PAS染色及びMUC5AC染色は、用量依存的に、かつ完全に防止された（図9）。これらの所見は、IL-13により誘導されるムチン産生にEGFR活性化が関与していることを示している。
ラット気道組織におけるTNFαの発現
本発明者らは、TNFα発現に対するIL-13注入の効果を調査した。対照ラットにおいて、TNFα抗体による染色は最小であった。IL-13注入によって、主に浸潤好中球において、TNFα発現が誘導された。シクロホスファミドによる前処理によって、IL-13により誘導されるTNFα発現は防止された。
白血球動員及びムチン産生に対するIL-13の効果
対照ラットの気道上皮はほとんど白血球を含有していなかったが、気道へのIL-13注入により、時間依存的な白血球動員が引き起こされ（図10A）、それはおよそ8時間後に開始し、24時間以内に最大となった。骨髄内の白血球を抑制する薬物シクロホスファミドによる前処理により、気道への白血球動員は阻害され（図10A）、IL-13により誘導されるムチン産生が防止された（図10B）。
インビトロの好中球走化性に対するIL-13の効果を調査するため、本発明者らは、ヒト好中球を用いて研究した。IL-13は、用量依存的に好中球の移動を減少させ、5×10-9Mという濃度で、対照値の50.6±3.4％への減少を引き起こした。
IL-13は好中球走化性を引き起こさなかったため、本発明者らは、IL-13が、上皮において好中球化学誘引物質の産生を刺激するとの仮説を立てた。対照動物において、気道上皮はIL-8様化学遊走物質に関して染色されなかったが、IL-13注入により、抗ヒトIL-8抗体による陽性染色がもたらされた。IL-8阻止抗体による前処理により、IL-13により誘導される白血球動員及びムチン産生は阻害された（図10）。これらの所見は、IL-13が、気道上皮のIL-8様化学誘引物質を誘導し、それが好中球動員を引き起こすことを示している。
実施例7
EGFRの活性化はタバコ煙により誘導されるムチン産生を促進する
実施例2に記載のように、炎症誘発性サイトカインにより活性化された好中球及びタバコ煙は、リガンド依存性のEGFRの活性化を介して、インビトロでヒト気管支上皮細胞におけるムチンMUC5AC合成を引き起こす。この現象を、ラット及びヒトにおいて実施されたインビボ研究によりさらに調査した。
方法
インビトロ研究
タバコ煙溶液の調製
タバコ煙溶液は、実施例2に記載のようにして調製した。
細胞培養
ヒト肺粘膜性類表皮癌細胞系NCI-H292細胞を、加湿5％CO2水ジャケット付きインキュベーター内で、37℃で、10％ウシ胎児血清、ペニシリン（100U/ml）、ストレプトマイシン（100μg/ml）、及びヘペス（25mM）を含有しているRPMI1640培地の中で増殖させた。6穴培養プレート又は8チャンバー・スライドのいずれかを、細胞を培養するために使用した。コンフルエントになった時点で、細胞をタバコ煙溶液と共に1時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、新鮮な培地単独と共にインキュベートした。予め選択された時点で実験を終了させた（mRNAについては6時間及び12時間；タンパク質については24時間）。対照として、同じ時間、培地単独と共に細胞をインキュベートした。EGF-Rチロシンキナーゼ阻害剤を用いた阻害研究においては、タバコ煙溶液を送達する30分前に、BIBX1522（10μg/ml、Boehringer Ingelheim Pharma KG,Ingelheim,Germanyより譲り受けた）又はチルホスチンAG1478（10μM、Calbiochem）でNCI-H292細胞を前処理した。血小板由来増殖因子受容体チロシンキナーゼの選択的阻害剤（チルホスチンAG1295、100μM、Calbiochem）、及びチルホスチンの陰性対照（チルホスチンA1、100μM、Calbiochem）の効果も調査した。活性酸素の役割は、酸素フリーラジカルのスカベンジャーDMSO（1％、Sigma）又はスーパーオキシドジスムターゼ（SOD、300U/ml、Sigma）を使用して調査した。
活性化されたEGFRに関するイムノブロッティング
細胞を無血清培地で24時間培養し、次いでタバコ煙溶液又はTGFαで15分間刺激した。刺激後、溶解緩衝液（20mMリン酸ナトリウム、pH7.8、150mM NaCl、5mM EDTA、50mM HEPES、1％トライトン-X100、50mM NaF、1mMオルトバナジン酸ナトリウム、5mM PMSF、並びに各10μg/mlのロイペプチン及びアプロチニン）により細胞を溶解させ、4℃で30分間インキュベートした。不溶性材料を除去するため、細胞溶解物を14,000rpmで4℃で5分間遠心分離した。等量のタンパク質を含有する上清の一部を、SDS試料緩衝液に懸濁させ、5分間加熱した。タンパク質を4〜15％アクリルアミドゲルでのSDS-PAGEにより分離した。得られたゲルを転写緩衝液（25mM トリス-HCl、192mMグリシン、20容量％メタノール、pH8.3）中で平衡化した。次いで、タンパク質をニトロセルロース膜へ電気泳動により転写し、それを、5％無脂肪スキムミルクを含む0.05％ツィーン20含有PBSと共に1時間インキュベートし、次いで抗ホスホ特異的EGFR mAb（2μg/ml、Calbiochem）と共に一晩インキュベートした。アビジン−ビオチン−アルカリホスファターゼ複合体法（ABCキット、Vector Laboratories,Burlingame,CA）のための標準的なプロトコルに従い、結合したAbを可視化した。
EGFR mRNA及びMUC5AC mRNAのインサイチュー・ハイブリダイゼーション
インサイチュー・ハイブリダイゼーションは、ヒトEGFR遺伝子の350bpのcDNA断片を含有しているヒトEGFRプローブ（pTRI-EGF-R-ヒト・プローブ・テンプレート、Ambion,Austin,TX）及びヒトMUC5AC遺伝子の298bpのcDNA断片を含有しているヒトMUC5ACプローブを使用して実施した。350bpのcDNAヒトEGFRを、pBluescript II SK-ベクターのKpnI部位及びEcoRI部位へサブクローニングした。このpBluescriptを、ヒトEGFRのアンチセンス・プローブ及びセンス・プローブを作製するために使用した。ハイブリダイゼーションは、以前に記載されたようにして実施した（Louら(1998)Am.J.Respir.Crit.Care Med.157:1927-1934）。簡単に説明すると、8チャンバー・スライド上で増殖させた細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定し、0.5×SSC中で再水和させ、次いでトリエタノールアミン及び無水酢酸の中でアセチル化した。ハイブリダイゼーションは、アンチセンス・プローブ又はセンス・プローブ2500〜4000cpm/μlを含む50％脱イオン化ホルムアミド、0.3M NaCl、20mMトリス、5mM EDTA、1×デンハルト溶液、20mMジチオスレイトール、10％デキストラン硫酸、0.5mg/ml酵母tRNA、及び0.5mg/ml超音波処理サケ精子DNAを用いて、58℃で、一晩、実施した。ハイブリダイゼーション後の処理は、2×SSC、1mM EDTA、10mM β-メルカプトエタノールでの室温での洗浄、室温での30分間のRNase溶液（20μg/ml）とのインキュベーション、さらに55℃で2時間の0.1×SSC、1mM EDTA、10mM β-メルカプトエタノールでの洗浄、次いで室温で20分間の0.5×SSCでの洗浄からなっていた。標本を、脱水和させ、空気乾燥させ、オートラジオグラフィーのためコダックNBTヌクレア・トラック・エマルジョン（Eastman Kodak,Rochester,NY）でカバーした。4℃で7〜21日間の感光の後、スライドを現像し、固定し、ヘマトキシリンで対比染色した。
MUC5ACタンパク質のイムノアッセイ法
以前に記載されたようにして、MUC5ACタンパク質を測定した（Takeyamaら(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:3081-3086）。簡単に説明すると、複数の希釈率の細胞溶解物をPBSを用いて調製し、各試料50μlを96穴プレート（Maxisorp Nunc,Fisher Scientific,Santa Clara,CA）内で重炭酸−炭酸緩衝液（50μl）と共に40℃で乾燥するまでインキュベートした。プレートをPBSで3回洗浄し、2％ウシ血清アルブミン第V画分（Sigma）で室温で1時間ブロッキングした。プレートを再びPBSで3回洗浄し、次いで0.05％ツィーン20を含有するPBSで希釈されたMUC5AC mAb（1：100）50μlと共にインキュベートした。1時間後、ウェルをPBSで3回洗浄し、100μlの西洋ワサビペルオキシダーゼ−ヤギ抗マウスIgG複合体（1：10,000）を各ウェルに分配した。1時間後、プレートをPBSで3回洗浄した。発色反応を3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）ペルオキシダーゼ溶液（Kirkegaard & Perry Laboratories,Gaithersburg,MD）を用いて起こさせ、2N H2SO4で停止させた。450nmで吸光度を読み取った。
インビボ研究
薬物
BIBX1522（3mg又は9mg）を、25％（w/v）ソルトール（solutol）を含有するクロロホルム0.6mlに溶解させた。この溶液を乾燥するまで蒸発させた。残さをメタノール0.3mlに再溶解させ、再び乾燥するまで蒸発させた。このストック調製物を4℃で5日間保存した。気管内注入のための溶液は、最終濃度がそれぞれ0.1％及び0.3％となるよう、予め加温された3mlの生理食塩水（40℃）にストック調製物を溶解させることにより、当日、新鮮に調製した。
タバコ煙曝露による杯細胞化生の誘導
体重250〜300gの雄スプレーグ・ドーリー（Sprague Dawley）ラットを研究に使用した。動物は温度及び湿度がコントロールされた部屋に収容し、水及び標準的な実験用飼料を自由に摂取させた。動物を、煙処理しない対照群、又は煙曝露する対照群及び処理群へとランダムに振り分けた。煙処理群のラットは、ラットに適合したチャンバーを有する煙処理装置を使用して、5日間、1日に8回、定期的に、ノンフィルター（non-filter）タバコ（ニコチン1.2mg、濃縮物12mg）に曝した。
タバコ煙により誘導される杯細胞化生のEGFRキナーゼ阻害剤BIBX1522による阻害
杯細胞化生及び粘液産生に対するEGFRキナーゼ阻害剤の効果を評価するため、タバコ煙曝露の1時間前に、媒体又は1mg/kgもしくは3mg/kgの用量のBIBX1522で、1日1回、動物を気管内処理した。媒体又はBIBX1522による動物の処理は、1日目に開始し、タバコ煙曝露中5日間継続した。1ml/kgの容量の気管内注入を、イソフルラン麻酔下で実施した。
RNAの単離及び定量
最後のタバコ煙曝露から8時間後、ペントバルビタール・ナトリウムで動物を安楽死させた。気管及び右主気管支幹を摘出し、製造業者の指示に従いキアゲンRNイージー（Qiagen Rneasy）キットを使用して全RNA単離のため加工した。RNA定量には、リアルタイムPCR技術（Taqman-PCR,ABI Prism7700 Sequence Detection System,Perkin Elmer Applied Biosystems,Foster City,California）を利用した。この技術は、他に詳細に記載されている（Finkら(1998)Nature Med.4:1329-1333）。簡単に説明すると、PCRサイクル中、5'蛍光標識ヌクレオチドが、タックポリメラーゼ（TaqPolymerase）のエキソヌクレアーゼ活性によりプローブから放出され；蛍光の放出がレーザーにより検出され、PCRサイクルが進行するにつれ、バックグラウンドを超えて増加する蛍光が測定され記録される。シグナルが内部参照シグナルに対し規準化され、参照シグナルとの差が標準偏差の10倍を超える閾値サイクル（Ct）をソフトウェアが設定する。Ct値が、入力標的数の定量のため使用される。
ラットMUC5AC用のプライマー及びプローブは、パーキンエルマー（Perkin Elmer）より提供されたプライマーエクスプレス（PrimerExpress）（商標）1.0プログラムを使用して設計した。以下の配列を、ラットMUC5ACの定量のため使用した。順方向プライマー
Figure 2010065053
逆方向プライマー
Figure 2010065053
及びFAMレポーター色素標識ハイブリダイゼーション・プローブ
Figure 2010065053
リボソームRNA用のプライマー及びプローブは、バイオシステムズ ドイツランド GmbH（Biosystems Deutschland GmbH）［TaqMan（登録商標）Ribosomal RNA Control Reagents（VIC（商標）プローブ）、米国特許第4308329号］。RT-PCR及びタックマン（TaqMan）PCRは、製造業者の指示に従い（TaqMan（登録商標）EZ RT-PCRキット、The Perkin-Elmer Corporation,P/N 402877 Rev.A,1996）、TaqMan（登録商標）EZ RT-PCRコア・リージェント（Core Reagents）（Part No. N808-0236）；順方向プライマー50nM、逆方向プライマー300nM、プローブ100nM、酢酸マンガン2.5mM；全RNAおよそ5〜10ng；酵素、反応緩衝液、及びヌクレオチドを使用したワンステップRT-PCRで実施した。サイクル：10'50℃；30'60℃；5'95℃；40×20"94℃、1'59℃。mRNA発現を定量するため、標的遺伝子を、まず、内部標準としてのリボソームRNAに対し規準化した。次いで、標準対照組織と比較したMUC5ACの相対量としてデータを表した。
組織の調製及び杯細胞産生の定量
肺を切除し、7％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。左主気管支幹を、免疫組織化学染色のため使用した。胚切片を、主な肺内気道全長が含まれるよう切断し、総上皮面積、及び細胞内粘液糖複合体に関し染色される面積を評価するため、それぞれヘマトキシリン及びエオシン、又はアルシアン青／PASで連続的に染色した。杯細胞産生は、画像分析システム（SIS,Muenster,Germany）を使用して上皮粘膜表面上のアルシアン青／PAS染色粘液糖複合体の体積密度により決定した。アルシアン青/PAS陽性染色面積及び総上皮面積を、2mmの長さの基底層において測定した。総面積に対するアルシアン青/PAS染色面積の割合（％）として、データを表した。
ヒトにおける研究
対象
ヒト研究のプロトコルは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校のヒト研究に関する委員会（the Committee on Human Research,University of California San Francisco）により承認された。COPDの臨床的診断基準（American Thoracic Society(1987)Am.Rev.Respir.Dis.136:225-243）を満たした対象4人のヒト気管支上皮の試料を、手術時に得た。過去5年以内の気管内挿管歴、及び重度の心疾患もしくは神経学的疾患の経歴はなかった。
組織の調製
外科標本を4％パラホルムアルデヒドで1時間固定し、次いで凍結保護のため30％ショ糖中に一晩置いた。標本をO.C.T.化合物に包埋し、厚さ4μmの切片として切断した。
EGFRの免疫組織化学的分析
免疫組織化学は、凍結切片を使用して実施した。切片を4％パラホルムアルデヒドで5分間再固定した。0.05％ツィーン20、2％正常ヤギ血清、及びレバミゾール（2mM）を含有しているPBSを、抗体の希釈剤として使用した。EGFRに対するマウス・モノクローナル抗体（1：200、Calbiochem,San Diego,CA）と共に室温で2時間、切片をインキュベートし、次いで過剰の一次抗体を除去するためPBSで3回洗浄した。次いで、1：200希釈のビオチン化ウマ抗マウスIgG（Vector Laboratories）と共に室温で1時間、切片をインキュベートした。アビジン−ビオチン−アルカリホスファターゼ複合体法のための標準的なプロトコルに従い、結合した抗体を可視化した。全ての免疫組織化学染色に、一次抗体に曝さない対照切片、同一アイソタイプの無関係の抗体に置換するか、又は10倍過剰の免疫感作ペプチドと共に抗体をプレインキュベートする切片が含まれていた。染色パターンを確認し、ヒトEGFRのアミノ酸残基1005〜1016に相当するEGFRペプチド抗原（Calbiochem）を使用したクエンチングを実施するため、EGFRに対するウサギ・ポリクローナル抗体（1：100、Calbiochem）も使用した。
統計
全てのデータが、平均±SEMで表されている。群間の統計的有意差を決定するため、一元配置分散分析を使用した。分散分析において統計的有意性が同定された場合には、多重比較のためシェフェのF検定を使用した。帰無仮説の確率が0.05未満である場合、統計的有意差ありと見なした。
結果
A. NCI-H292細胞におけるインビトロ研究
タバコ煙はEGFR mRNA発現を上方制御する
対照条件において、NCI-H292細胞は、EGFR mRNAを構成的な発現していた。細胞へのタバコ煙溶液の添加により、6時間以内にEGFR mRNA発現が上方制御され、その効果は12時間後に増加した。TNFa（対照として使用）も、EGFR mRNA発現を増加させた。EGFRのセンス・プローブは、発現を示さなかった。
タバコ煙はEGFRチロシン・リン酸化を活性化する
本発明者らは、EGFRチロシンキナーゼの活性化に対するタバコ煙溶液の効果を調査した。陽性対照として、本発明者らは、NCI-H292細胞におけるEGFR特異的チロシン・リン酸化を増加させるEGFRリガンド、TGFαを使用した（図11）。同様に、タバコ煙溶液は、EGFR特異的チロシン・リン酸化を増加させたが、その程度は低かった（図11）。BIBX1522によるNCI-H292細胞の前処理により、タバコ煙溶液及びTGFαにより誘導されるEGFRチロシン・リン酸化が阻害された（図11）。
タバコ煙はMUC5AC発現を増加させる
休止期NCI-H292細胞は、12時間後、MUC5AC mRNAの発現をほとんど示さなかった。細胞へのタバコ煙溶液の添加により、6時間以内にMUC5AC mRNA発現が上方制御され、その効果は12時間後に増加した。TNFα（対照として使用）も、MUC5AC mRNA発現を増加させた。MUC5ACのセンス・プローブは、発現を示さなかった。同様に、タバコ煙は、MUC5ACタンパク質合成を24時間以内に増加させ、その効果は用量依存的に起こった（図12）。
EGFRチロシンキナーゼ阻害剤はNCIH292細胞におけるMUC5ACの遺伝子及びタンパク質の発現を防止する
タバコ煙によって誘導されるMUC5ACの遺伝子及びタンパク質の発現が、EGFRの活性化により起こったのか否かを試験するため、細胞を様々なチロシンキナーゼ阻害剤と共にインキュベートした。選択的EGFRチロシンキナーゼ阻害剤（BIBX1522、AG1478）による細胞の前処理は、タバコ煙溶液によって誘導されるMUC5AC mRNA発現及びMUC5ACタンパク質合成を防止した（図12）。血小板由来増殖因子の選択的チロシンキナーゼ阻害剤（AG1295）及びチルホスフィンの陰性対照（AI）には効果がなかった（図12）。さらに、タバコ煙によって誘導されるMUC5AC合成は、フリーラジカル・スカベンジャー（DMSO）による前処理、及びSODによって有意に阻害された。これらの結果は、EGF-Rチロシンキナーゼの活性化が、NCIH292細胞におけるMUC5ACの遺伝子及びタンパク質の発現を誘導すること、タバコ煙によって誘導されるMUC5AC産生に、タバコ煙によって誘導される酸化ストレスが、少なくとも一部は関与していることを示している。
B. ラットにおけるインビボ研究
タバコ煙は病原体除去ラットにおける杯細胞産生を増加させる
対照動物において、気道上皮はほとんど杯細胞を含有していなかった（図13）。タバコ煙の吸入（1日8本5日間）によって、アルシアン青/PAS染色は著しく増加した（図13）。タバコ煙の吸入によって、MUC5ACムチン遺伝子発現も増加した（図14）。
EGFRチロシンキナーゼ阻害剤（BIBX1522）は病原体除去ラットにおけるタバコ煙によって誘導される杯細胞産生を防止する
タバコ煙処理中、ラットをBIBX1522で処理した場合、アルシアン青/PAS染色の増加が、用量依存的かつ完全に阻害された（図13）。BIBX1522により、タバコ煙によって誘導されるMUC5AC遺伝子発現の発現も防止された（図14）。
C. COPDを有する患者におけるヒト研究
COPDを有する患者においてEGFR免疫反応性は気道杯細胞及び粘膜下腺に位置している
EGFR免疫反応性は、アルシアン青/PAS染色が陽性であった杯細胞及び粘液腺に観察され、EGFR染色は、気道内腔にも観察された。一次抗体に曝していない切片、又は同一アイソタイプの無関係の抗体に置換した切片は陰性であり、過剰のEGFRタンパク質による抗体の予備吸着により、EGFR免疫反応性は消滅した。
実施例8
鼻ポリープにおけるEGFR発現と杯細胞化生との関係
鼻ポリポーシスは、罹患した個体の福祉及び生活の質に影響を与える、一般的な慢性炎症性上気道疾患である。EGFRがヒト鼻ポリープにおける粘液過剰分泌及び粘液細胞過形成に関与している可能性を、調査した。鼻ポリープ上皮及び下鼻甲介の正常鼻上皮において、MUC5ACの遺伝子及びタンパク質の発現を、調査した。インサイチュー・ハイブリダイゼーション及び免疫化学的染色を使用して、EGFRのmRNA及びタンパク質の発現、並びにそれらと粘液細胞過形成との関係を分析した。さらに、鼻ポリープにおける、EGFR発現におけるTNF-αの存在及び位置、並びに好中球の存在を調査した。
方法
材料
外科的手技を受けている患者から鼻標本を得た。篩骨蜂巣開放術中にポリープが摘出された患者において8個の鼻ポリープが採取され、いびき患者における鼻甲介切除中に除去された下鼻甲介から6個の鼻生検試料が得られた（対照群）。鼻組織試料を直ちにホルムアルデヒドで固定し、形態学的研究のためパラフィン包埋した。鼻ポリポーシスを有する患者は、いずれも、嚢胞性繊維症又は原発性線毛機能不全（primary ciliary dyskinesia）を有していなかった。対象には、手術の1ヶ月前にポリポーシスの療法（即ち、グルココルチコイド及び抗生物質）を中止するよう要請した。全ての患者からインフォームド・コンセントが得られ、アンリ・モンドール病院（Hopital Henri Mondor）（CCPPRB,Creteil,France）の倫理委員会（Ethics Committee）より承認が得られた。
標準的な形態学的評価
5μmのパラフィン切片を得、脱パラフィン処理し、組織学的研究のためのディフ・クイック・ステイン・セット（Diff-Quik Stain Set）（Baxter Healthcare Corporation,Miami,FL）、及び粘液糖質複合体のためのアルシアン青（AB）/PASで染色した。
鼻標本におけるMUC5AC及びEGFRの免疫組織化学的局在部位決定
先に調製された5μmのパラフィン切片を脱パラフィン処理し、再水和させ、4％パラホルムアルデヒドで後固定し、0.3％H2O2を含むメチルアルコールで処理した。0.05％ツィーン20、2％正常ヤギ血清を含有しているPBSを、抗体の希釈剤として使用した。EGFRに対するモノクローナル抗体（1：200希釈）（Calbiochem,La Jolla,CA）又はMUC5ACに対するモノクローナル抗体（1：500希釈）（クローン45M1、Neomarkers,Fremont,CA）と共に室温で2時間、組織切片をインキュベートした。次いで、ビオチン化ウマ抗マウス抗体（1：250希釈）（Vector laboratories,Burlingame,CA）と共に室温で1時間、切片をインキュベートした。アビジン−ビオチン−アルカリホスファターゼ複合体法（Elite ABCキット、Vector Laboratories）のための標準的なプロトコルに従い、結合した抗体を可視化した。組織切片をヘマトキシリンで対比染色した。ポリープ及び下鼻甲介からの鼻粘膜の組織調製は、同時に実施した。一次抗体の省略を、陰性対照として使用した。
AB/PAS、MUC5AC、及びEGFRに関して染色された面積の定量
AB/PAS染色、並びにMUC5AC及びEGFRの免疫反応性の定量は、他に記載されているような半自動イメージング・システム（Louら(1998)Am.J.Respir.Crit.Care Med.157:1927-1934）を使用して査定した。鼻標本の上皮の画像は、400倍の位相差レンズを用いて10個の高倍率視野から記録した。本発明者らは、AB/PAS、MUC5AC、及びEGFRに関して染色された面積、並びに総上皮面積を測定し、AB/PAS、MUC5ACに対する抗体、又はEGFRに対する抗体により染色された面積の、総面積に対する割合（％）としてデータを表した。分析は、パブリック・ドメインNIHイメージプログラム（米国国立衛生研究所で開発され、zippy.nimh.govからアノニマスFTPにより、又はNational Technical Information Service,Springfield,VA,part number PB95-500195GEIからフロッッピーディスクで入手可能である）を用いて実施した。
まず、AB/PAS及びMUC5ACに関して染色された面積（％）を調査し、対照上皮とポリープ上皮とを比較した。対照標本においては、上皮が均一に偽重層しており、試料採取は簡単であった。しかしながら、鼻ポリープの表面上皮は、様々な形態学的サブタイプを示した。（a）正常な偽重層上皮（線毛細胞、杯細胞、及び基底細胞の単層から構成）；（b）線毛細胞、基底細胞、及び杯細胞からなる過形成上皮（3個超の細胞層、基底細胞、粘液細胞のいずれか、又は両方を含有）；（c）扁平上皮化生は当標本中には観察されなかった。試料採取では、その不均一性を考慮しなければならない。まず、各ポリープにおける偽重層上皮及び過形成上皮の面積を決定するため、染色されたスライドを低倍率で調査した。標本によって大きな差違が存在し：平均すると、偽重層上皮は、完全ポリープ上皮の25％（範囲14〜56％）を占め、過形成上皮は75％（範囲44〜100％）を占めていた。ポリープ中の染色面積（％）を調査するため、本発明者らは、各ポリープ中の偽重層上皮及び過形成上皮の割合（％）と比例する代表的な区域（10個の高倍率視野）の画像を得た。
偽重層上皮の区域よりも過形成上皮の区域の方が、杯細胞の濃度が高いことが見出されたため、本発明者らは、2つの区域におけるEGFRタンパク質発現を比較した。これらの研究において、MUC5ACタンパク質に関して染色された2つの型の上皮、及びEGFRタンパク質に関して染色された隣接切片の10個の高倍率視野の画像を得、面積を比較した。ポリープ標本の半分のみがEGFRを発現していたため、本発明者らは、隣接する染色標本の10個の高倍率視野を調査して、ポリープにおけるEGFR染色とMUC5AC染色との関係を決定した。
鼻組織におけるEGFR遺伝子及びMUC5AC遺伝子の発現
EGFR遺伝子発現を、35S標識リボプローブを使用したインサイチュー・ハイブリダイゼーションにより査定した。350bp断片をpTRI-EGFRヒト・テンプレート（Ambion,Austin,Texas）より単離し、Bluescript II SK-ベクター（Stratagene,La Jolla,CA）のKpnI部位及びEcoRI部位へとサブクローニングした。インサイチュー・ハイブリダイゼーション用のRNAプローブを調製するため、このヒトEGFR cDNA断片を含有している組換えプラスミドを直鎖化し、アンチセンス・プローブ及びセンス・プローブを得るため、T7又はT3ポリメラーゼによりインビトロ転写した。インサイチュー・ハイブリダイゼーション用のプローブは、硫黄35-ウリジン三リン酸（[35S]UTP）の存在下で作製した。MUC5ACについては、ヒトを含有しているプラスミドからリポプローブを作製した。プローブ単離及びインサイチュー・ハイブリダイゼーションは、以前に記載されたようにして実施した（Louら(1998)Am.J.Respir.Crit.Care Med.157:1927-1934）。
鼻ポリープにおけるTNF-αの免疫組織化学的局在部位決定
本発明者らは、TNF-αに対するポリクローナル・ウサギ抗ヒト抗体（1：1000希釈）（Genzyme Corp.,Cambridge,MA）によりポリープ標本を染色した。TNF-αタンパク質の定量は、以前に記載されたようにして（Finottoら(1994)J.Immunol.153:2278-2289）、10個の連続する高倍率視野（400倍）（5個は上皮下区域、5個は間質区域）を調査することにより実施した。報告された値は、1視野当たりの陽性細胞として表されている。これらの条件下で、1個の視野は0.25mm2の面積を表す。
好中球に関する免疫組織化学的染色
本発明者らは、組織標本中の好中球を同定するため、2個の抗体を使用した。好中球エラスターゼはヒト好中球の主要な成分であるため、本発明者らは、ヒト好中球エラスターゼ（HNE）に対するモノクローナル・マウス抗体（1：5000希釈）（DAKO Corp.,Carpinteria,CA）を使用した。さらに、好中球エラスターゼは、好中球以外の細胞に比較的少ない量で存在している可能性があるため、本発明者らは、好中球細胞表面上に存在する低親和性Fc受容体（FcγRIII）と結合し、好中球（CD-16+）を好塩基球（CD-16-）と区別することが以前に示されているCD-16に対するモノクローナル抗体（1：500希釈）（BioSource International,Camarillo,CA）（10）も使用した。MUC5ACとEGFR染色の説明の段落を参照のこと。
動員された好中球は、杯細胞に対する2つの効果を有する。第一に、好中球エラスターゼは気道杯細胞の強力な分泌促進物質である（Takeyamaら(1998)Am.J.Physiol.275:L294-L302）。第二に、杯細胞脱顆粒は、EGFR発現を引き起こし（Leeら (2000)Am.J.Respir.Crit.Care Med）、好中球はEGFR活性化を引き起こす（Takeyamaら(2000)J.Immunol.164:1546-1552）。従って、本発明者らは、鼻ポリープの上皮において好中球エラスターゼ及びCD16に関して染色された細胞を計数し、EGFR陽性標本とEGFR陰性標本とを比較した。各標本について、10個の連続する高倍率視野（400倍）を得、陽性染色細胞を計数した。結果は、陽性染色細胞数／視野として表されている。これらの条件下で、1個の視野は0.25mm2の面積を表す。
統計分析
AB-PAS、MUC5AC、及びEGFRに関して染色された面積、並びにTNF-α、HNE、及びCD16に関して染色された細胞の測定から得られたデータは、ノンパラメトリックなマン・ホイトニーのU検定を使用して比較した。帰無仮説の確率が0.05未満である場合、統計的有意差ありと見なした。
結果
正常鼻上皮及びポリープ鼻上皮における粘液糖質複合体及びムチンMUC5AC
AB/PASによる染色、及びムチンMUC5ACに関する免疫染色は、正常鼻上皮及びポリープ鼻上皮の両方において陽性であった。AB/PAS染色及びMUC5AC染色が占める上皮の面積は、対照対象においても、ポリープを有する対象においても、相互に異なっていなかった（それぞれ、P＝0.91及びP＝0.10）（図15）。しかしながら、平均染色面積（％）は対照上皮よりもポリープの方が有意に大きかった（各比較、P＜0.01）。
鼻上皮におけるEGFR免疫反応性及び遺伝子発現
（a）EGFR免疫反応性
4人の対照においては、AB/PAS染色及びMUC5AC染色が低密度であった正常上皮において、EGFR免疫反応性は弱く、いくつかの杯細胞及び無脱顆粒分泌細胞に局在しており；他の2人の対象においては、組織はEGFR抗体で染色されなかった。これらの2つの標本においても、AB/PAS染色及びMUC5AC染色は低密度であった。
ポリープにおいては、8個の標本のうち4個が、EGFR抗体で陽性に染色され；残りの4個のポリープはEGFR抗体で染色されなかった。4個のEGFR陽性染色ポリープの上皮においては、EGFR陽性染色の平均面積（％）が、EGFR染色を有していた4人の対照対象の上皮よりも大きかった（44.07±5.95％対19.55±1.44％；P＝0.02）。対照上皮（前記参照）とは対照的に、ポリープにおいては、EGFR染色が、はるかに強く、基底細胞に集中しており；いくつかの非顆粒形成分泌細胞及び杯細胞も陽性に染色された。線毛細胞は、対照においてもポリープにおいても染色されなかった。
（b）EGFR mRNA
EGFR免疫反応性を示した4人の対照対象の上皮は、インサイチュー・ハイブリダイゼーションにより証明されるようにEGFR遺伝子発現も示した。これらの標本において、EGFR mRNAのシグナルは弱く、上皮の基底区域に位置していた。EGFR染色が存在しなかった2個の対照標本においては、EGFR mRNAも存在しなかった。ポリープにおいては、EGFR mRNAに関するインサイチュー・ハイブリダイゼーションによって、基底上皮においてEGFR免疫反応性が陽性であった4個の標本において、上皮の基底区域における強い発現が示された。EGFR免疫反応性を示さなかった4個のポリープには、EGFR遺伝子発現がほとんど存在せず；これらの標本において、シグナルは上皮の基底部分には位置しておらず、非顆粒形成分泌細胞と見られるいくつかの細長い細胞に主として見られた。センス・プローブは、ポリープにおいても対照においてもシグナルを示さなかった。
鼻標本におけるTNF-α免疫局在部位決定
TNF-αはインビトロのヒト上皮細胞系、及びインビボのラット気管上皮においてEGFR発現を誘導するため、本発明者らは、TNF-αに対するポリクローナル抗体で鼻標本を染色した。対照標本にはTNF-α免疫反応性が存在しなかったが、ポリープ標本は全てTNF-α免疫反応性を示した。しかしながら、EGFR陽性染色ポリープは、非EGFR染色ポリープよりも多くのTNF-α染色細胞を含有していた（19.55±1.13対9.02±.41個／視野；P＝0.02、n＝4）。染色は、上皮下層及び深部間質層の炎症細胞に集中していた。形態学的形状に基づき、これらの細胞の大部分が、特徴的な2分葉核を有する好塩基球であった。しかしながら、いくつかの単核細胞及び好中球も陽性に染色された。1個の標本は、上皮、主に基底細胞にTNF-α免疫反応性を発現した。
EGFR発現とムチンMUC5ACとの関係
（a）ポリープにおける偽重層上皮と過形成上皮との比較
対照標本において、上皮は均一に偽重層していた。しかしながら、ポリープにおいては、表面上皮が偽重層上皮と過形成上皮とから構成されていた。過形成上皮の区域は、偽重層区域よりも有意に大きい、AB/PAS及びMUC5ACに関して陽性染色される上皮面積（％）を含有していることが見出したため、本発明者らは、EGFRが、過形成上皮の区域において偽重層上皮の区域よりも強く発現しているとの仮説を立てた。本発明者らは、EGFR陽性ポリープの上皮において、偽重層上皮（図16B）よりも大きいMUC5AC染色面積を含有していた過形成上皮（図16A）が、大きいEGFR陽性染色面積も含有していることを見出した。
（b）EGFR陽性とムチンMUC5ACの遺伝子及びタンパク質の発現との関係
EGFR活性化は、気道上皮においてムチン発現を引き起こすことが示されているため、本発明者らは、上皮におけるEGFR陽性とムチン発現との関係を調査した。まず、これらの研究は、EGFRを発現している標本が、ムチンMUC5AC遺伝子発現も示すことを示した。次に、本発明者らは、上皮におけるEGFR陽性と、MUC5ACタンパク質染色との関係を調査した。驚くべきことに、EGFRで染色された群は、EGFR免疫反応性を有していないポリープ群よりも低いMUC5AC染色面積を有していた（図17A）。しかしながら、EGFR陽性染色ポリープにおいて、杯細胞は比較的小さく、内腔に大きいMUC5AC染色面積が存在し、このことから、活発な杯細胞脱顆粒が示されたが、EGFR免疫反応性を示さなかったポリープにおいては、杯細胞は比較的大きく、内腔にMUC5AC染色の最小の証拠を示した。
ポリープ上皮における好中球浸潤
好中球エラスターゼは杯細胞脱顆粒に関与していることが示されているため、EGFRが、杯細胞脱顆粒が起こった組織に、より強く発現しているという仮説を査定するため、本発明者らは、エラスターゼ及びCD16に対する抗体により標本を染色することにより、ポリープ標本における好中球の位置を調査した。本発明者らは、上皮内の好中球の数が、EGFRに関して染色されなかった標本と比較して、EGFR陽性標本において増加していることを見出した（図17B）。
本発明の特定の態様を参照して本発明を説明してきたが、本発明の本旨及び範囲から逸脱することなく様々な変化を作成し、等価物を置換することが可能であることを、当業者は理解されたい。さらに、特定の情況、材料、物質の組成、過程、（1個またはそれ以上の）工程を適合化するため、本発明の目的、本旨、及び範囲に対して多くの修飾を行うことが可能である。そのような修飾は全て、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。

Claims (26)

  1. 治療に有効な量の上皮増殖因子受容体（EGF-R）アンタゴニストを、気道杯細胞過形成による気道粘液過剰分泌に罹患した患者へ投与することを含む、個体の気道における杯細胞過形成を低下させる方法。
  2. EGF-RアンタゴニストがEGF-Rに選択的なキナーゼ阻害剤である、請求項1の方法。
  3. アンタゴニストがBIBX1522である、請求項2の方法。
  4. アンタゴニストが抗体である、請求項1の方法。
  5. 抗体が上皮増殖因子（EGF）と特異的に結合するモノクローナル抗体である、請求項4の方法。
  6. 抗体が上皮増殖因子受容体（EGF-R）と特異的に結合するモノクローナル抗体である、請求項4の方法。
  7. アンタゴニストが膜貫通型EGF-Rリガンドの放出を阻害するものである、請求項1の方法。
  8. アンタゴニストが膜貫通型EGF-Rリガンドの放出を媒介するメタロプロテイナーゼの選択的阻害剤である、請求項7の方法。
  9. アンタゴニストが杯細胞産生を誘導するGタンパク質共役型受容体アンタゴニストである、請求項8の方法。
  10. アンタゴニストがEGF-Rのトランスリン酸化を阻害するものである、請求項1の方法。
  11. アンタゴニストが抗酸化剤である、請求項8の方法。
  12. アンタゴニストが注射により投与される、請求項1の方法。
  13. アンタゴニストが、通常の生理食塩溶液の形態で担体と共に静脈内に投与される、請求項12の方法。
  14. アンタゴニストが吸入により投与される、請求項1の方法。
  15. アンタゴニストがリポソーム送達により投与される、請求項1の方法。
  16. リポソームが立体的に安定化され静脈内に投与される、請求項15の方法。
  17. 気道における杯細胞過形成を低下させるのに十分な用量の、治療に有効な量の上皮増殖因子受容体（EGF-R）アンタゴニストと、薬学的に許容される担体とを含む、気道における杯細胞過形成を低下させるための薬学的製剤。
  18. EGF-RアンタゴニストがEGF-Rに選択的なキナーゼ阻害剤である、請求項17の製剤。
  19. EGF-RアンタゴニストがEGF-Rのトランスリン酸化を阻害するものである、請求項18の製剤。
  20. アンタゴニストが抗酸化剤である、請求項19の製剤。
  21. アンタゴニストが抗体である、請求項17の製剤。
  22. 抗体が上皮増殖因子（EGF）と特異的に結合するモノクローナル抗体である、請求項21の製剤。
  23. 抗体が上皮増殖因子受容体（EGF-R）と特異的に結合するモノクローナル抗体である、請求項21の製剤。
  24. アンタゴニストが膜貫通型EGF-Rリガンドの放出を阻害するものである、請求項17の製剤。
  25. アンタゴニストが膜貫通型EGF-Rリガンドの放出を媒介するメタロプロテイナーゼの選択的阻害剤である、請求項24の製剤。
  26. 治療に有効な量の上皮増殖因子受容体（EGF-R）アンタゴニストを、鼻ポリープに罹患した患者へ投与することを含む、鼻ポリープを治療する方法。
JP2009261019A 2000-07-14 2009-11-16 Ｅｇｆ−ｒアンタゴニストの投与による気道粘液産生の防止方法 Withdrawn JP2010065053A (ja)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/616,223 US6846799B1 (en) 1998-08-18 2000-07-14 Preventing airway mucus production by administration of EGF-R antagonists

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2002511774A Division JP2004503599A (ja) 2000-07-14 2001-07-11 Ｅｇｆ−ｒアンタゴニストの投与による気道粘液産生の防止方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2010065053A true JP2010065053A (ja) 2010-03-25

Family

ID=24468521

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2002511774A Withdrawn JP2004503599A (ja) 2000-07-14 2001-07-11 Ｅｇｆ−ｒアンタゴニストの投与による気道粘液産生の防止方法
JP2009261019A Withdrawn JP2010065053A (ja) 2000-07-14 2009-11-16 Ｅｇｆ−ｒアンタゴニストの投与による気道粘液産生の防止方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2002511774A Withdrawn JP2004503599A (ja) 2000-07-14 2001-07-11 Ｅｇｆ−ｒアンタゴニストの投与による気道粘液産生の防止方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US6846799B1 (ja)
EP (1) EP1303301B1 (ja)
JP (2) JP2004503599A (ja)
AU (1) AU2001276889A1 (ja)
CA (1) CA2415325C (ja)
MX (1) MXPA03000253A (ja)
WO (1) WO2002005842A2 (ja)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7354894B2 (en) * 1998-08-18 2008-04-08 The Regents Of The University Of California Preventing airway mucus production by administration of EGF-R antagonists
US6924285B2 (en) * 2002-03-30 2005-08-02 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Bicyclic heterocyclic compounds, pharmaceutical compositions containing these compounds, their use and process for preparing them
WO2007040188A1 (ja) * 2005-10-03 2007-04-12 Sankyo Company, Limited 杯細胞過形成抑制のための医薬組成物
EP1933624A4 (en) * 2005-10-11 2009-09-16 Univ Washington COMPOSITIONS AND METHOD FOR THE TREATMENT OF HYPERSEKRETION OF RESPIRATORY WAYS
EP1921070A1 (de) * 2006-11-10 2008-05-14 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Bicyclische Heterocyclen, diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel, deren Verwendung und Verfahren zu ihrer Herstelllung
EA200901041A1 (ru) * 2007-02-06 2010-02-26 Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Бициклические гетероциклы, содержащие эти соединения лекарственные средства, их применение и способ их получения
KR20100046215A (ko) * 2007-08-24 2010-05-06 노파르티스 아게 호흡기 장애의 치료를 위한 ｎｒｇ1의 조정자
WO2009098061A1 (de) * 2008-02-07 2009-08-13 Boehringer Ingelheim International Gmbh Spirocyclische heterocyclen, diese verbindungen enthaltende arzneimittel, deren verwendung und verfahren zu ihrer herstellung
CA2733153C (en) * 2008-08-08 2016-11-08 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cyclohexyloxy substituted heterocycles, pharmaceutical compositions containing these compounds and processes for preparing them
EP2475360A1 (en) * 2009-09-12 2012-07-18 Reckitt Benckiser LLC Use of guaifenesin for inhibiting mucin secretion
AU2012205791B2 (en) 2011-01-10 2016-11-03 Invion, Ltd. Use of beta-adrenergic inverse agonists for smoking cessation
JP6996781B1 (ja) * 2020-10-05 2022-01-17 株式会社常光 陰イオン選択性電極用応答膜の製造方法及び陰イオン選択性電極用応答膜
CN115792229A (zh) * 2022-01-28 2023-03-14 华中科技大学同济医学院附属同济医院 鼻分泌物中tPA在制备鼻息肉及其预后检测剂中的应用

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4310051A1 (de) * 1992-04-11 1993-10-14 Byk Gulden Lomberg Chem Fab Weitere Verwendung substituierter Pyridazine
MY119161A (en) 1994-04-18 2005-04-30 Novartis Ag Delta-amino-gamma-hydroxy-omega-aryl-alkanoic acid amides with enzyme especially renin inhibiting activities
US5525625A (en) 1995-01-24 1996-06-11 Warner-Lambert Company 2-(2-Amino-3-methoxyphenyl)-4-oxo-4H-[1]benzopyran for treating proliferative disorders
GB9523675D0 (en) 1995-11-20 1996-01-24 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
WO1997045412A1 (en) 1996-05-30 1997-12-04 Merck & Co., Inc. A method of treating cancer
SE9603725D0 (sv) * 1996-10-11 1996-10-11 Astra Ab New teatment
US6251943B1 (en) 1997-02-28 2001-06-26 Warner-Lambert Company Method of treating or preventing septic shock by administering a MEK inhibitor
ATE277895T1 (de) 1997-07-01 2004-10-15 Warner Lambert Co 4-brom or 4-iod-phenylamino- benzhydroxamsäurederivate und ihre anwendung als mek-inhibitoren
KR20010014360A (ko) 1997-07-01 2001-02-26 로즈 암스트롱, 크리스틴 에이. 트러트웨인 2-(4-브로모 또는 4-요오도 페닐아미노)벤조산 유도체 및ｍｅｋ 억제제로서의 그의 용도
AU1924699A (en) 1997-12-19 1999-07-12 Smithkline Beecham Corporation Compounds of heteroaryl substituted imidazole, their pharmaceutical compositionsand uses
US6037361A (en) 1998-03-09 2000-03-14 Warner-Lambert Company Fluorinated butyric acids and their derivatives as inhibitors of matrix metalloproteinases
HUP0102714A3 (en) 1998-07-30 2003-01-28 Warner Lambert Co Tricyclic sulfonamid derivatives as inhibitors of matrix metalloproteinases and medicaments containing the same
AU4229499A (en) 1998-07-30 2000-02-21 Warner-Lambert Company Tricyclic heteroaromatics and their derivatives as inhibitors of matrix metalloproteinases
UA59453C2 (uk) 1998-08-12 2003-09-15 Пфайзер Продактс Інк. Похідні гідроксипіпеколат гідроксамової кислоти як інгібітори матричних металопротеїназ
EE200100097A (et) 1998-08-18 2002-06-17 The Regents Of The University Of California Hingamisteede lima tootmise tõkestamine EGF-R antagonistide manustamise teel
WO2000017162A1 (fr) 1998-09-21 2000-03-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Nouveaux derives de thiol, leur procede de production et leur utilisation
ID29800A (id) * 1999-02-27 2001-10-11 Boehringer Ingelheim Pharma Turunan-turunan 4-amino-kinazolin dan kinolin yang mempunyai efek inhibitor pada transduksi signal yang dimediasi oleh tirosin kinase
EP1226136B1 (en) * 1999-10-19 2004-12-29 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
CA2415325A1 (en) 2002-01-24
EP1303301A2 (en) 2003-04-23
MXPA03000253A (es) 2005-04-19
JP2004503599A (ja) 2004-02-05
WO2002005842A3 (en) 2003-01-03
US6846799B1 (en) 2005-01-25
AU2001276889A1 (en) 2002-01-30
EP1303301B1 (en) 2014-02-12
WO2002005842A2 (en) 2002-01-24
CA2415325C (en) 2013-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8071074B2 (en) Preventing airway mucus production by administration of EGF-R antagonists
US7700547B2 (en) Preventing airway mucus production by administration of EGF-R antagonists
JP2010065053A (ja) Ｅｇｆ−ｒアンタゴニストの投与による気道粘液産生の防止方法
MXPA01001755A (en) Preventing airway mucus production by administration of egf-r antagonists
BG105158A (bg) Предотвратяване образуването на слузести покрития(мускус) върху летателни писти с прилагане на противодействащо средство egf-r

Legal Events

Date Code Title Description
A072 Dismissal of procedure [no reply to invitation to correct request for examination]

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A073

Effective date: 20110509

A300 Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300

Effective date: 20110510