MXPA03000253A - Prevencion de la produccion de mucosa en las vias respiratorias mediante la administracion de antagonistas egf-r. - Google Patents

Prevencion de la produccion de mucosa en las vias respiratorias mediante la administracion de antagonistas egf-r.

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Abstract

La hiperseccion de mucosa en los pulmones es inhibida mediante la administracion de un antagonista del receptor de factor de crecimiento de la epidermis (EGF-R). El antagonista de EGF-R puede ser en la forma de una molecula organica pequena, un anticuerpo, o porcion de un anticuerpo que se enlaza a, y bloquea el receptor de EGF. El antagonista de EGF-R es administrado de preferencia, por medio de la inyeccion de una cantidad suficiente para inhibir la formacion de celulas goblet en las vias respiratorias pulmonares. De este modo se inhibe la desgranulacion de las celulas goblet que es el resultado de la produccion de mucosa en las vias respiratorias. Tambien se proporcionan ensayos para seleccionar agentes candidatos que inhiben la proliferacion de celulas goblet.

Description

PREVENCIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE MUCOSA EN LAS VÍAS RESPIRATORIAS MEDIANTE LA ADMINISTRACIÓN DE ANTAGONISTAS EGF-R DERECHOS GUBERNAMENTALES El gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos en esta solicitud de conformidad con la Concesión HL-24136, otorgado por los Institutos Nacionales del Programa de Salud. Campo del Invento La presente invención se refiere de manera general al campo del tratamiento pulmonar. Más particularmente, la presente invención se refiere a la inhibición de hipersecreción de mucosa en los pulmones y vías respiratorias, mediante la administración de un antagonista EGF-R. Además, la presente invención también se refiere a métodos para el desarrollo o evaluación de agentes candidatos con la capacidad de inhibir la hipersecreción de mucosa en los pulmones. Antecedentes del Invento En los conductos respiratorios del sistema respiratorio, el sistema mucociliar sirve como el principal mecanismo de defensa para mover las partículas o agentes infecciosos inhalados fuera de las vías respiratorias en los pulmones. Además, las substancias presentes en los fluidos de las vías respiratorias sirven para limitar la toxicidad de las partículas y para desactivar los agentes no efectivos. El mecanismo físico de la tos, sirve para expulsar la mucosa de los pasajes de las vías respiratorias (ver por ejemplo la publicación de "Foundations of Respiratory Care," Pierson y Kacmarek, eds. (1992) Churchill Livingstone Inc. Nueva York, Nueva York; "Harrison's Principies of Internal Medicine", Fauci et al., eds. (1997) 14th Edition, McGraw Hill, Nueva York, Nueva York). El sistema mucociliar consiste de células epiteliales ciliadas, células goblet epiteliales y células serosas y mucosas localizadas en las glándulas submucosas. Los cilios están rodeados por una capa acuosa (fluido periciliar) segregada en el lumen del pasaje de las vías respiratorias mediante el transporte activo de cloruro y el movimiento pasivo de agua a través del epitelio. Los cilios hacen contacto con la mucosa que flota en ésta capa acuosa, y a través de un movimiento de propulsión unidireccional proporcionan el movimiento de la mucosa hacia el glotis (ver la publicación de Pierson y Kacmarek, supra y Fauci, et al., supra). La mucosa es producida por las células goblet epiteliales y las células de glándulas submucosas, y es segregada en el lumen de las vías respiratorias después de la granulación. Aunque la mucosa facilita generalmente el despeje de las partículas o agentes infecciosos inhalados, la hipersecreción de mucosa en las vías respiratorias puede causar una obstrucción progresiva de las mismas. En las vías respiratorias periféricas, la tos no es efectiva para despejar las secreciones. Además, debido a sus dimensiones pequeñas, las vías respiratorias pequeñas que contienen muchas células goblet son especialmente vulnerables al tapado de las mismas mediante la mucosa. La hipersecreción de las vías respiratorias afecta a un número substancial de individuos; se observa en una variedad de enfermedades pulmonares, tales como bronquitis crónica, asma aguda, fibrosis quística y bronquiectasias. La hipersecreción de la mucosa es el principal síntoma en pacientes con padecimiento pulmonar de obstrucción crónica (COPD) y define la condición (por ejemplo, tos crónica y producción de esputo). Esta condición sola, afecta a 14 millones de ciudadanos americanos y puede originar una discapacidad progresiva y la muerte. Se ha estimado que el asma afecta al menos al 4% de la población de los Estados Unidos y cuenta con al menos 2000 muertes anuales (Pierson y Kucmarek, supra). Durante un evento asmático agudo, se hinchan las paredes bronquiales, incrementa el volumen de la mucosa y se contrae el músculo liso bronquial, dando como resultado el estrechamiento de las vías respiratorias. Como resultado de la hipersecreción en el asma aguda, el tapado mediante la mucosa extensa puede ser una causa importante de morbididad y mortalidad. La hipersecreción ha estado implicada en fibrosis quística, el cual es uno de los padecimientos genéticos fatales más comunes en el mundo. La fibrosis quística es un padecimiento autosómico recesivo que origina que la célula mucosa de las vías respiratorias no responda a la activación de cinasa de proteína que depende de AMP cíclica de los canales de ión de cloruro de la membrana (Pierson y Kacmarek, supra y Fauci, et al., supra). El desequilibrio de electrolitos su bsecuente , reduce el nivel de h idratación de la mucosa de las vías respiratorias, dando como resultado de este modo una mucosa altamente viscosa en los pulmones de un i ndividuo q ue padece de fibrosis qu ística. La hipersecreción obstruye los pasajes de aire de individuos con fi brosis q u ística , comprometiendo además la función del pu l món . Otro padecimiento q ue involucra la hipersecreción incluye el padecimiento de pul món obstru ido crón ico (COPD). La tensión oxidante j uega un papel importante en la patogénesis de COPD. El humo del cigarro, el cual genera radicales l ibres de oxigeno, está implicado fuertemente en la patogénesis. Los neutrófilos con frecuencia se observan en el sitio de la inflamación en COP D , y de manera interesante, los radicales libres de oxígeno son conocidos por ser liberados med iante los neutrófi los du rante la activación . Con frecuencia es necesaria la entubación mecánica con el objeto de proporcionar ventilación asistida a los pacientes con diversos padecimientos pulmonares. Se introduce un tubo a través de la orofaringe y se coloca en la traquea. Para evitar la filtración de aire alrededor del tubo endotraqueal, se infla un balón alrededor del tu bo en la traquea inferior, lo cual puede desgastar el epitel io y causar la metaplasía de la célula goblet. Las heridas del epitelio conducen a procesos de reparación , que pueden dar como resultado una abundante secreción de mucosa. Tal entubación de traq uea prolongada en los pacientes, puede conducir a efectos perjudiciales debido a la hipersecreción .
Como resultado de los altos niveles de mucosa en los pacientes con padecimiento pulmonares de hipersecreción, se reduce el despeje de mucosa. Con frecuencia los agentes patológicos tales como bacterias, por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa, establecen colonias dentro de la mucosa, dando como resultado una infección frecuente del pulmón. Las modalidades clásicas para tratar individuos que padecen de hipersecreción de las vías respiratorias, incluyen terapia con antibióticos, broncodilatadores (por ejemplo, metilxantinas, simpatomimóticos con fuertes propiedades de estimulación adrenórgica ß2, anticolinórgicos), el uso de corticoesteróides sistémicos o inhalados, principalmente en asma, licuado de la mucosa mediante administración oral de expectorantes, por ejemplo, guaifenesina y el suministro en aerosol de agentes "mucolíticos" por ejemplo, agua, solución salina hipertónica (ver la publicación de Harrison's, supra). Una terapia más reciente para la fibrosis quistica, es la administración de ADNsa para dirigir la mucosa o esputo rico en ADN (Shak, et al. (1990) Proc. Nati. Acad. (EUA) 87:9188-9192; Hubbard, R.C. et al (1991) N. Engl. J. Med. 326:812). Además, también se utilizan las terapias físicas de pecho que consisten de percusión, vibración y drenaje para facilitar el despeje de la mucosa viscosa. El transplante de pulmón puede ser una opción final para aquellos con severos daños pulmonares. Por consiguiente, se necesita una terapia más eficaz o alternativa para dirigir las secreciones de la mucosa. De manera específica, existe la necesidad de una modalidad específica que reduzca la formación de secreciones mucosas en las vías respiratorias. Literatura Relevante. El uso de inhibidores EGF para bloquear el crecimiento de células cancerígenas, es revisado por Levitski (1994) Eur J Biochem. 226(1): 1-13; Powis (1994) Pharmac. Ther. 62:57-95; Kondapaka y Reddy (1996) Mol. Cell. Endocrin. 117:53-58. Sumario del Invento La hipersecreción de mucosa en vías respiratorias es un síntoma adverso de un número de diferentes padecimientos pulmonares. La secreción resulta de la desgranulación de células goblet, cuya proliferación es promovida por la estimulación de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R). La presente invención trata la hipersecreción pulmonar administrando cantidades terapéuticas de antagonistas EGF, preferentemente inhibidores de cinasa. Los antagonistas pueden estar en la forma de pequeñas moléculas, anticuerpos o parte de anticuerpos que enlazan ya sea al EGF o a su receptor. En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos in vitro e in vivo que predicen el potencial terapéutico de los agentes candidatos para inhibir la hipersecreción de la mucosa. Un objeto principal de la presente invención, es proporcionar un método para tratar enfermedades que comprenden hipersecreción de mucosa en los pulmones. Otro objeto de la presente invención es proporcionar formulaciones útiles en el tratamiento de enfermedades que dan como resultado la hipersecreción de mucosa. Aún otro objeto de la presente invención, es proporcionar un ensayo in vitro para la clasificación de agentes candidatos que inhiben la hipersecreción de mucosa, en donde el método comprende los pasos de (i) contactar un modelo in vitro de proliferación de células goblet con EGF o el equivalente funcional del mismo; (¡i) contactar en forma subsecuente el modelo in vitro con un agente candidato; y (iii) evaluar la proliferación de células goblet, en donde la inhibición de la proliferación de las células goblet es un indicador del potencial terapéutico del agente candidato. Otro objeto de la presente invención, es proporcionar un ensayo in vitro para la clasificación de agentes candidatos que inhiben la hipersecreción de mucosa, en donde el método comprende (i) crear un modelo animal de padecimiento pulmonar de hipersecreción induciendo EGF-R, por ejemplo, con factor-alfa de necrosis de tumor (TNF-a); (ii) estimular el EGF-R inducido con su ligando, por ejemplo, factor-alfa de crecimiento de transformación (TGF-a) ó EGF, para producir células goblet que producen mucina; (¡ii) tratar con un agente candidato; (iv) evaluar la proliferación de las células goblet o secreción de mucosa, en donde una inhibición de la proliferación de las células goblet o secreción de mucosa es una indicación del potencial terapéutico del agente candidato. Un objeto adicional de la presente invención, es proporcionar ensayos in vitro e in vivo para la clasificación de antagonistas EGF-R que inhiben la hipersecreción de mucosa. Una ventaja de la presente invención, es que proporciona un medio para evitar la formación excesiva de mucosa en las vías respiratorias pulmonares. Una característica de la presente invención, es que se puede utilizar un rango de diferentes tipos de antagonistas para bloquear los efectos de EGF y/o TGF-a y su interacción con EGF-R. Un aspecto de la presente invención, es formulaciones de antagonistas EGF para reducir la formación de secreción de mucosa en las vías respiratorias de un paciente mamífero, preferentemente un paciente humano. Otro objeto de la presente invención, es un método para la administración pulmonar de antagonistas EGF reduciendo las secreciones de mucosa en las vías respiratorias de un paciente mamífero, preferentemente un paciente humano. Otro objeto de la presente invención, es proporcionar un método para tratar un rango de diferentes enfermedades que tienen como síntoma la formación en exceso de secreciones de mucosa en las vías respiratorias. Estas enfermedades incluyen, sin limitación, bronquitis crónica, asma aguda, fibrosis quística, bronquiectasias, padecimiento de pulmón obstructivo crónico, hipersecreción que resulta del daño epitelial tal como estímulo alérgico o abrasiones mecánicas e hipersecreción nasal. Estos y otros objetos, ventajas y características de la presente invención, serán apreciados por los expertos en la técnica, al leer los detalles de los métodos de tratamiento, y los métodos de ensayo in vitro e in vivo, tal como se describen con mayor detalle más adelante. Breve Descripción de los Dibulos La figura 1A es un manchado Western de EGF-R en células NCI-H292 y en A431. La figura 1B, es un análisis inmunocitoqutmico con un anticuerpo anti-EGF-R en cultivos de células NCI-H292. La figura 1C, es un análisis Northern de EGF-R en células NCI-H292. Figura 2. Manchado azul Alcian/PAS de células NCI-H292 para la identificación de glucoproteínas de mucina. Figura 3, Análisis Northern de la expresión del gen MUC5 en células NCI-H292. Figuras 4A y 4B. Análisis inmunohistoquímico de EGF-R con un anticuerpo anti-EGF-R en ratas libres de patógenos. Figura 4A, ratas tratadas con TNFa. Figura 4B ratas sensibilizadas con ovalbúmina. La figura 5, es una gráfica que ilustra el efecto del inhibidor de cinasa de tirosina EGF-R (BIBX1522) en la producción de células goblet (expresada como el % de área teñida del epitelio de las vfas respiratorias ocupada por las células teñidas positivas -azul Alcian/PAS). La figura 6, es una gráfica de barras que ilustra la distribución de tejido de la inmunoreactividad EGFR en células saludables y células epiteliales asmáticas de las vías respiratorias. La figura 7, es una gráfica que ilustra la correlación entre la ¡nmunoreactividad de EGFR y la producción de MUC5AC en el epitelio de las vías respiratorias. La figura 8, es una gráfica que ilustra el efecto dependiente de la dosis de la instilación IL-13 en el porcentaje de área de teñido azul Alcian (AB)/PAS (figura 8A) y la expresión de la proteína MUC5AC (figura 8B) en las vias respiratorias de ratas. La figura 9, es una gráfica que ilustra la inhibición dependiente de la dosis del teñido inducido por 11-13 de glucoconjugados de mucosa con azul Alcian/PAS (figura 9A) y MUC5AC (figura 9B) mediante un inhibidor de cinasa de tirosina EGFR selectivo, BIBX 1522, en ratas. La figura 10, es una gráfica que ilustra el efecto de la instilación de IL-13 en el reclutamiento de leucocitos (figura 10A) y la tinción de azul Alcian (AB)/PAS (figura 10B) en el epitelio de las vías respiratorias de ratas. La figura 11 , es una autoradiografla que ilustra la fosforilación de tirosina de EGFR inducida por humo de cigarro y por TGFa. Los resultados son representativos de tres diferentes experimentos. Barra = 170 kD. La figura 12, es una gráfica de barras que ilustra el efecto de la incubación de una solución de cigarro con células NCI-H292, y los efectos de los inhibidores de cinasa de tirosina y de antioxidantes en la síntesis de proteína MUC5AC inducida por humo de cigarro. La figura13, es una gráfica de barras que ilustra el efecto de la inhalación de humo de cigarro en el porcentaje del área teñida con azul Alcian/PAS del epitelio de las vías respiratorias, y el efecto de un inhibidor de cinasa de tirosina EGFR en la respuesta de azul Alcian/PAS inducida por humo de cigarro y en ratas libres de patógenos. La figura 14, es una gráfica de barras que ilustra el efecto de la inhalación de humo de cigarro en la expresión de mARN de UC5AC en tejido traqueobronquial en ratas libres de patógenos, y el efecto de un inhibidor de cinasa de tirosina EGFR en la expresión de mARN UC5AC inducida por humo de cigarro. La figura 15, es una gráfica que ilustra el porcentaje de áreas teñidas con AB/PAS y MUC5AC en epitelio de control (columnas abiertas) y epitelio pólipo nasal (columnas cerradas). Los valores se expresan como % de áreas promedio + SEM ocupadas por células teñidas con AB/PAS y UC5AC. La figura 16, es una gráfica que ilustra la comparación de áreas teñidas con MUC5AC y EGFR en epitelio pseudoestratificado y hiperplástico en pólipos. Los resultados se expresan como % de áreas teñidas promedio ± SEM. La figura 17, es una gráfica que ilustra la desgranulación de células goblet en pólipos positivo-EGFR y negativo-EGFR. Descripción Detallada del Invento Se proporcionan composiciones y métodos para el tratamiento de hipersecreción de mucosa de las vías respiratorias mediante la administración de cantidades terapéuticas de antagonistas EGF, preferentemente inhibidores de cinasa. Los antagonistas pueden estar en la forma de moléculas pequeñas, anticuerpos o partes de anticuerpos que enlazan ya sea a EGF o a su receptor. En los padecimientos de hipersecreción de vías respiratorias, por ejemplo, bronquitis crónica, bronquiectasias, fibrosis quística, asma aguda, COPD, etc, se incrementa la síntesis de mucina en las vías respiratorias, y surge la hipersecreción de mucosa. La mucosa segregada da como resultado la obstrucción de las vías respiratorias, un efecto que origina la muerte en éstos padecimientos. En la presente invención se muestran varias causas de daño e inflamación a las vías respiratorias, que inducen a la expresión del receptor de factor de crecimiento epidérmico en las células epiteliales de las vías respiratorias. Después de la inducción de EGF-R, la estimulación subsecuente de EGF-R mediante mecanismos tanto dependientes como independientes del ligando, da como resultado la producción de mucina tanto en la expresión genética como en niveles de proteína. Los inhibidores selectivos de la cinasa de tirosina EGF-R demuestran bloquear esta expresión de gen de mucina y proteína. Sin pretender limitar la presente invención, se sugiere que una secuencia de evolución de células goblet puede estar basada en la expresión de EGF-R. La estimulación con TNFa induce al teñido EGF-R intenso de células de secreción no granuladas; su subsecuente activación mediante ligando EGF-R origina el teñido progresivo de glucoconjugados de mucosa en el citoplasma, y las células se vuelven "pre-goblet" y posteriormente células "goblet". Los datos sugieren que la activación de EGF-R promueve la diferenciación celular selectiva, pero no la proliferación. Las células goblet son derivadas aparentemente de células de secreción no granuladas que expresan EGF-R y son estimuladas mediante ligando EGF-R para producir mucinas. Además de la estimulación mediante citocinas, el EGF-R puede estimularse mediante otros transmisores de señalización. Por ejemplo, el fumar cigarros en forma prolongada se asocia con los cambios patológicos progresivos en las vías respiratorias periféricas, incluyendo la hiperplásia de las células goblet. Los neutrófilos activados por citocina pro-inflamatoria y el humo del cigarro, muestran originar la síntesis de mucina en células epiteliales bronquiales humanas a través de la activación independiente de ligando de EGF-R, implicando a los neutrófilos reclutados y al humo de cigarro como reguladores de la diferenciación de la célula epitelial que da como resultado una inducción anormal de las células que producen mucina en las vías respiratorias. Los neutrófilos activados mediante una variedad de estímulos, incluyendo IL-8, N-formil-metionil-leucil-fenilalanina, TNF-a, humo de cigarro o H202 activan la expresión de mucina en las células epiteliales, cuya síntesis se inhibe mediante los inhibidores EGF-R. Los neutrófilos también tienen la capacidad de producir los ligandos EGF-R, EGF y TGFa. Además, las células epiteliales son fuentes de ligandos EGF-R.
Las lesiones mecánicas al epitelio de las vías respiratorias también pueden originar una hipersecreción y ser la responsable del tapado de la mucosa. Los inhibidores de cinasa de tirosina EGF-R sirven para evitar la hipersecreción de mucosa después de la intubación traqueal. El daño epitelial es un descubrimiento común en estudios de pacientes incluso con asma leve, y el daño se relaciona de manera incrementada con el empeoramiento de los síntomas clínicos. El daño epitelial producido por la respuesta alérgica induce a la activación de EGF-R, lo cual da como resultado una producción anormal de células goblet. El EGF-R está implicado en el daño epitelial, por ejemplo la "remodelación de las vías respiratorias" que ocurre en el asma, la reparación y cierre de la herida. El daño epitelial mecánico y la lesión epitelial en el caso del asma, pueden involucrar una cascada EGF-R similar, que da como resultado el crecimiento anormal de las células de secreción epiteliales. La hipersecreción también es una manifestación importante de padecimientos inflamatorios de la nariz. Cuando las células goblet nasales son "estimuladas" induciendo una desgranulación de células goblet utilizando un mecanismo dependiente de neutrófilos, se activa fuertemente la expresión de EGF-R y mucinas. Estos casos estuvieron asociados con la regranulación de las células goblet. Cuando la inflamación, tal como una estimulación de infiltración de neutrófilos, origina la desgranulación de las células goblet y la secreción de mucina, la activación y generación de EGF-R abastecen nuevamente al epitelio de las vías respiratorias con mucinas. Antes de que se describan los métodos de tratamiento y formulaciones de la presente invención, debe quedar entendido que la misma no se limita a los métodos y formulaciones particulares aquí descritos, ya que por supuesto pueden variar. También debe quedar entendido que la terminología utilizada en la presente invención tiene el propósito de describir únicamente las modalidades particulares, y no pretende una limitación, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos aquí utilizados tienen el mismo significado que el conocido comúnmente por un experto en la técnica a la cual pertenece la presente invención. Aunque en la presente invención se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes para los descritos, en la práctica o para probar la misma, a continuación describen los métodos y materiales preferidos. Todas las publicaciones aquí mencionadas están incorporadas a la presente invención como referencia, para describir los métodos y/o materiales que están se relacionan con las publicaciones mencionadas. Las publicaciones aquí descritas se proporcionan únicamente por su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo que se encuentra en la presente invención, deberá ser interpretado como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a anteceder dicha publicación, en virtud de la invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes a las fechas de publicación reales, las cuales pueden necesitar confirmarse de manera independiente. DEFINICIONES Por "factor de crecimiento epidérmico" o "EGF" se entiende una protelna o parte de la misma que tiene actividad biológica caracterizada por una actividad mitogénica en células epiteliales (ver por ejemplo la publicación de Cohén (1986) Biosciences Reports 6 ( 12 ) : 1017 ; Aaronson, S.A. "Growth Factors and Cáncer," Science (1991) 254:1146-1153). Un ejemplo es el factor de crecimiento epidérmico humano, como el que describe por ejemplo Urdea et al. (1983) Proc. Nat Acad. Sci. 80:7461-7465. Es de particular interés para los propósitos de la presente invención, la actividad mitogénica de EGFA en células goblet. También se pretende que las proteínas o partes de las mismas que sean los equivalentes funcionales de EGF en términos de respuesta biológica producida por EGF, estén comprendidos en esta definición.
Por "receptor del factor de crecimiento epidérmico" o "EGF-R" se entiende una proteína o parte de la misma con la capacidad de enlazar una proteína EGF o una parte de la misma. Un ejemplo es el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (ver la publicación de Ullrich et al. (1984) Nature 309:418-425; Genbank accessión number NM 005228). Preferentemente, el enlace del ligando EGF activa el EGF-R (por ejemplo, que da como resultado la activación de la señalización mitogénica celular, autofosforilacíón de EGF-R). Un experto en la técnica apreciará que otros ligandos, además de EGF, pueden enlazar a EGF-R y activar el EGF-R. Los ejemplos de tales ligandos incluyen, pero no se limitan a TGF-a, betacelulina, amfiregulina, EGF enlazada por heparina (HB-EGF) y neuregulina (también conocida como ergulina) (Strawn y Shawver (1998) Exp.-Opin. Invest. Drugs 7 (4)553-573, y "The Protein Kinasa Facts Boc: Protein Tyrosine Kinases" (1995) Hardie, et al. (eds.), Academic Press, NY, NY). Por "antagonista EGF-R" se entiende cualquier agente con la capacidad de inhibir en forma directa o indirecta el efecto de EGF-R, o particularmente el efecto de EGF-R en la proliferación de células goblet o hipersecreción de mucosa mediante las células goblet. El EGF-R puede activarse a través de mecanismos dependientes e independientes del ligando, dando como resultado ya sea la autofosforilación o la trans-fosforilación, respectivamente. Los antagonistas EGF-R de interés, pueden inhibir cualesquiera o ambos de estos mecanismos. Por ejemplo, el enlace de TNF-a al EGF-R da como resultado una fosforilación dependiente del ligando, la cual puede ser bloqueada por un anticuerpo que enlaza a EGF-R, evitando de este modo la interacción de EGF con un ligando que podría activar el receptor EGF. Los ejemplos de tales anticuerpos son descritos por Goldstein et al. (1995) Clin. Cáncer Res. 1:1311-1318; Lorimer et al. (1995) Clin. Cáncer Res. 1:859-864; Schmidt y Wels (1996) Br. J. Cáncer 74:853-862. Los inhibidores de cinasa de tirosina de molécula pequeña también son efectivos como antagonistas EGF-R. Como alternativa, se muestra que los compuestos tales como radicales libres de oxígeno estimulan una trans-fosforilación del EGF-R, dando como resultado una activación independiente del ligando del receptor. Otros medios de activación de EGF-R mediante transfosforilación incluyen tensión ultravioleta y osmótica, estimulación de receptor acoplado por proteína-G mediante endotelina-1 , ácido lisofosfatídico y trombina, receptor de acetil colina muscarinicos m1, y hormona de crecimiento humano. Los antagonistas de este mecanismo independiente de ligando, incluyen antioxidantes, tales como dismutasa de super óxido, N-acetil-L-cisteína, DMSO, DMTU, ácido ascórbico y similares. La activación independiente de ligando EGF-R a través de la tensión oxidativa, da como resultado la activación de cinasa de proteína activada por mitogen (MEK), cinasa de proteína activada por mitogen p44/42 (p44/42ma k), que da como resultado la síntesis de mucina. Esta activación MEK se inhibe mediante el inhibidor MEK selectivo PD98059, asf como mediante oxidantes. Por lo tanto, los inhibidores MEK y antioxidantes están comprendidos por el término "antagonista EGFR". Además, las trayectorias de señalización dependientes de EGFR pueden ser activadas al momento de la estimulación de receptores acoplados por proteína-G (GPCR). La activación de ligando de proteínas G heterotrimóricas mediante la interacción con un GPCR, da como resultado una señal intracelular que induce la actividad extracelular de una metaloproteinasa de transmembrana. Esto conduce al procesamiento extracelular de un precursor de factor de crecimiento de transmembrana y la liberación del factor maduro el cual, directamente o a través de la matriz de proteoglicano, interactúa con el ectodominio de EGFR y activa la señal intracelular, Prenzel et al. (1999) Nature 402:884-888. Por lo tanto, el EGFR puede ser activado al momento de la liberación de un ligando EGFR enlazado por membrana mediante la acción de metaloproteinasa de transmembrana (MP). Por consiguiente, el término "antagonista EGFR" comprende además inhibidores de este proceso, incluyendo pero sin limitarse a inhibidores de metaloproteinasa. Un antagonista EGF-R puede ser un anticuerpo que enlaza a un factor que estimula la producción de EGF o EGF-R, inhibiendo de este modo la promoción de la proliferación de las células goblet mediante EGF (por ejemplo, un inhibidor de la cascada de fosforilación que fosforila a EGF-R). Por ejemplo, Arteaga et al (1995) Cáncer Res. 54:4703-4709. describe una proteína de fusión de exotoxina de Pseudomonas-TGFa 40. En una modalidad preferida, el antagonista EGF-R es un inhibidor de la actividad de cinasa de tirosina de EGF-R, particularmente inhibidores de molécula pequeña que tienen acción selectiva en EGF-R comparados con otras cinasas de tirosina -moléculas pequeñas preferidas que bloquean el receptor EGF natural en un mamífero, preferentemente en humano y tiene un peso molecular menor a 1 kD.
Los inhibidores de EGF y EGF-R incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de cinasa de tirosina tales como quinazolinas, tal como PD 153035, quinazolina 4-(3-cloroanilino) ó CP-358,774, piridopirimidinas, pirimidopirimidinas, pirrolopirimidinas, tal como CGP 59326, CGP 60261 y CGP 62706, y pirazolopirimidinas (Shawn y Shawver, supra), pirimidinas 4-(fenilamino)-7H-pirrolo[2,3-d] (Traxler et al., (1996) J. Med. Chem 39:2285-2292), curcumino (metano de diferuloilo) (Laxmin arayana, et al., (1995) Carcinogen 16:1741-1745), 4,5-bis (4-fluoroanilino)ftalimida (Buchdunger et al (1995) Clin. Cáncer Res. 1:813-821; Dinney et al (1997) Clin. Cáncer Res. 3:161-168); porciones de nitrotiofeno que contienen tirfostinas (Brunton et al. (1996) Anti Cáncer Druq Pesian 11:265-295); el inhibidor de cinasa de proteína ZD-1839 (AstraZeneca); CP-358774 (Pfizer, Inc.); PD-0183805 (Warner-Lambert);o tal como se describe en la solicitud de Patente Internacional número WO99/09016 (American Cyanamid), WO98/43960 (American Cyanamid); W097/38983 (Warner Labert); WO99/06378 (Warner Lambert); WO99/06396 (Warner Lambert); WO96/30347 (Pfizer, Inc.); W096/33978 (Zeneca); y WO96/33980) Zeneca; todas incorporadas como referencia a la presente invención; o moléculas de antisentido.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un antagonista EGFR, tal como se utiliza dentro del contexto de los métodos de tratamiento de la presente invención, es una cantidad de antagonista que es efectiva para inhibir un parámetro asociado con la activación de EGFR.
Por "inhibir un parámetro asociado con activación EGFR" se entiende que se reduce, disminuye, neutraliza o evita la hiperplásia de la célula de mucosa; la proliferación de células goblet; diferenciación de células de las vías respiratorias epiteliales en células goblet, desgranulación de células goblet; o hipersecreción de mucosa mediante células goblet. Los términos "tratamiento", "tratar" y similares se utilizan en la presente invención para expresar de manera general que se obtiene un objeto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de evitar completa o parcialmente una enfermedad o síntoma del mismo y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. El término "tratamiento" tal como se utiliza en la presente invención, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente un humano, e incluye: (a) evitar que la enfermedad o síntoma ocurra en un sujeto que pueda estar predispuesto a la enfermedad o síntoma pero que aún no le ha sido diagnosticado: (b) inhibir la enfermedad o síntoma, por ejemplo, deteniendo su desarrollo; o (c) aliviar la enfermedad o síntoma, por ejemplo, originando una regresión de la enfermedad o síntoma. La presente invención está dirigida al tratamiento de pacientes con enfermedad pulmonar o de las vías respiratorias y está dirigida particularmente al tratamiento de pacientes con hipersecreción de mucosa, por ejemplo, al evitar, Inhibir o aliviar la hipersecreción de mucosa. En término de tratamiento de síntomas, la presente invención está dirigida a la disminución de mucosa o esputo en las vías respiratorias, inhibiendo la infección mediante organismos patológicos, aliviando la tos y evitando la hipoxia debido a la obstrucción de vías respiratorias. Más específicamente, el término "tratamiento" significa que se proporciona un efecto terapéuticamente detectable y benéfico en un paciente que padece de una enfermedad pulmonar que involucra hipersecreción de mucosa. Aún de manera más específica el término "tratamiento" debe significar que evita, alivia y/o inhibe la hipersecreción de mucosa con un compuesto seleccionado del grupo que consiste de antagonista EGF y EGF-R tales como anticuerpos, inhibidores de cinasa de tirosina de proteína y moléculas de antisentido; antioxidantes; inhibidores de cualquier factor en la cascada de EGFR, incluyendo pero sin limitarse a, inhibidores de MEK; inhibidores de metaloproteinasa; inhibidores de receptor acoplado por proteína G y similares. Un tratamiento alternativo puede comprender la prevención de la expresión EGF-R en las vías respiratorias, bloqueando de este modo la trayectoria en una etapa temprana. Por ejemplo, los reactivos que bloquean el enlace de TNFa a su receptor, pueden evitar la activación de EGF-R. El tratamiento incluye prevenir o evitar infecciones mediante agentes patológicos originados por y/o relacionados con hipersecreción de mucosa. Por el término "anticuerpo" se entiende una protetna de inmunoglobulina que tiene la capacidad de enlazar a un antígeno. El anticuerpo tal como se utiliza en la presente invención, significa que incluye fragmentos de anticuerpo, por ejemplo, F(ab')2, Fab' Fab, que tiene la capacidad de enlazar al antígeno o fragmento antigénico de interés. Preferentemente, el enlace del anticuerpo al antígeno inhibe la actividad de EGF ó EGF-R. El término "anticuerpo humanizado" que se utiliza en la presente invención, describe moléculas de anticuerpo completo, por ejemplo, compuestas de dos cadenas ligeras completas y dos cadenas pesadas completas así como anticuerpos que consisten únicamente de fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, Fab, Fab', F (ab')2, y Fv en donde los CDRs están derivados de una fuente no humana y la parte restante de la molécula Ig o fragmento de la misma, está derivada de un anticuerpo humano, producido preferentemente a partir de una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo humano. Los términos "anticuerpo humano" y "anticuerpo humanizado" tal como se utilizan en la presente invención, describen un anticuerpo en donde todas las partes de la molécula están derivadas de una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo humano. Tales anticuerpos humanos son los más deseables para utilizarse en terapias de anticuerpo, ya que tales anticuerpos pueden provocar una pequeña o ninguna respuesta inmune en el paciente humano. El término "anticuerpo quimérico" tal como se utiliza en la presente invención describe una molécula de anticuerpo, así como fragmentos de anticuerpo, tal como se describe en la definición del término "anticuerpo humanizado" El término "anticuerpo quimérico" comprende anticuerpos humanizados". Los anticuerpos quiméricos tienen al menos una parte de una secuencia de aminoácidos de cadena pesada o ligera derivada de una primera especie de mamífero y otra parte de la secuencia de aminoácido de cadena pesada o ligera derivada de una segunda y diferente especie de mamífero. Preferentemente, la región variable se deriva de una especie de mamífero no humano y la región constante es derivada de una especie humana. De manera específica, el anticuerpo quimérico se produce preferentemente a partir de una secuencia de nucleótidos procedente de un mamífero no humano que codifica una región variable de una secuencia de nucleótido procedente de un humano que codifica una región constante de un anticuerpo. Por "enlace de manera específica" se entiende un enlace de alta avidez y/o alta afinidad de un anticuerpo a un polipéptido específico. El enlace del anticuerpo a su epttope en un polipéptido especifico, es más fuerte que el enlace del mismo anticuerpo a cualquier otro epítope, particularmente aquellos que pueden presentarse en moléculas en asociación con, o en la misma muestra que, el polipéptido específico de interés. Los anticuerpos que enlazan específicamente a un polipéptido de interés pueden tener la capacidad de enlazar otros polipóptidos en un nivel débil, aunque detectable, por ejemplo 10% o menos del enlace mostrado al polipéptido de interés. Tal enlace débil, o enlace de soporte, es fácilmente discernible del enlace de anticuerpo específico para el compuesto o polipéptido de interés, por ejemplo, mediante el uso de controles adecuados. Por "anticuerpo marcado en forma detectable", "anti-EGF marcado en forma detectable" o "fragmento anti-EGF marcado en forma detectable", se entiende un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo que retiene la especificidad de enlace), que tiene una marca detectable adherida. La marca detectable está adherida normalmente mediante conjugación química, aunque cuando la marca es un polipéptido, podría ser adherido en forma alternativa mediante técnicas de construcción genética. Los métodos para producir proteínas marcadas en forma detectable son bien conocidos en la técnica. Las marcas detectables pueden ser seleccionadas de una variedad de marcas conocidas en la técnica, aunque normalmente son radioisótopos, fluoroforos, enzimas, por ejemplo peroxidasa de rábano u otras partes o compuestos que emiten ya sea una señal detectable (por ejemplo, radioactividad, fluorescencia, color) o una señal detectable después de la exposición de la marca a su substrato. Se conocen en la técnica (por ejemplo, ver la publicación de Harlow y Lañe, eds. (Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), varios pares de marca/substrato detectables (por ejemplo, peroxidasa de rábano/diaminobencidina, avidina/estreptavidina, luciferasa/luciferína), métodos para marcar anticuerpos y métodos para utilizar anticuerpos marcados para detectar un antígeno. MÉTODOS TERAPÉUTICOS La presente invención proporciona un método para tratar la hipersecreción pulmonar administrando cantidades terapéuticas de antagonistas EGF-R. En general, los métodos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista EGFR, a un individuo que padece de hipersecreción de mucosa en las vías respiratorias. En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para tratar la hipersecreción de mucosa en vías respiratorias de un individuo mediante células goblet que producen mucosa. En otras modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir la hiperplásia de células goblet en las vías respiratorias de un individuo. Cualquier enfermedad y particularmente cualquier enfermedad pulmonar caracterizada por hipersecreción de mucosa o acumulación de niveles patológicos de mucosa, pueden ser tratados a través de los métodos aquí descritos. Los ejemplos de enfermedades de hipersecreción pulmonar que pueden ser tratadas por éste método, incluyen pero no se limitan a, enfermedades de obstrucción de pulmón crónicas, tales como bronquitis crónica, enfermedades inflamatorias, tales como asma, bronquiectasias, fibrosis pulmonar, COPD, enfermedades de hipersecreción nasal, por ejemplo, alergias nasales, pólipos nasales; y otras enfermedades de hipersecreción.
También pretenden estar incluidas enfermedades genéticas tales como fibrosis quístíca, síndrome de Kartagener, deficiencia de alfa-1 -antitripsina, inspisación de fibrosis no qulstica familiar del tracto respiratorio. Se prefieren los antagonistas que dirigen directamente EGF ó EGF-R. Sin embargo, un experto en la técnica apreciará que cualquier factor o célula involucrada en la cascada biológica que dé como resultado la proliferación de células goblet que promueven EGF-R, se puede dirigir para la inhibición, por ejemplo, antagonistas TGF-a; inhibidores de cinasa de proteína activada por mitogen (MEK) cinasa de proteína activada por mitogen p44/42 (p44/42mapk); antioxidantes; inhibidores de metaloproteinasa, inhibidores de cinasa MAP; inhibidores de metaloproteinasas que transmiten la liberación del ligando EGFR enlazado por membrana; inhibidores de receptores acoplados por proteína-G; y similares. Sin estar limitados por la teoría, una cascada comienza durante una respuesta inflamatoria cuando las células, tales como mastocitos o neutrófilos liberan TNF- , lo cual posteriormente promueve la expresión de EGF-R. La estimulación de EGF-R, por ejemplo mediante su EGF ligando, dispara a su vez la proliferación de células goblet. Por lo tanto, cualesquiera células o factores involucrados en la cascada, tal como en la trayectoria TNF-a, se pueden dirigir para la actividad antagonista. El antagonista EGF-R administrado en el método terapéutico, puede ser de cualquier forma. A manera de ejemplo, el antagonista EGF-R puede estar en la fórmula de una molécula (por ejemplo, oligonucleótido de antisentido, inhibidor de cinasa de tirosina, etc), anticuerpos o parte de anticuerpos que enlazan a EGF, TGFa, ó EGF-R. Los antagonistas EGFR preferidos son selectivos, por ejemplo, inhiben su factor objetivo a un mayor grado que otros factores del mismo tipo. La selectividad puede ser aumentada a través de los métodos de formulación y suministro de fármacos, por ejemplo, cuando el inhibidor es suministrado preferentemente a vías respiratorias inflamadas, etc. ANTAGONISTAS EGF-R DE MOLÉCULA PEQUEÑA Inhibidores de cinasa de tirosina Los inhibidores de cinasa de tirosina que actúan en el receptor EGF, que son selectivos para el EGF-R, son conocidos en la técnica y se pueden utilizar en los métodos del tema. Los ejemplos se describen anteriormente, y de éstos se puede incluir BIBX 1522 (Boehringer Ingelheim, Inc., Ingelheim, Alemania); CGP59326B (Novartis Corporation, Basel, Suiza); AG1478 de tirfostina (Daub et al. (1997) E BO J. 167032-7044; inhibidores EGF-R de 4-aminoquinazolina (descritos en la Patente Norteamericana no. 5,760,041); compuestos de estireno substituido que también pueden ser un naftaleno, un indano o una benzoxazina; incluyendo compuestos de nitrilo y moloonnitrilo (descritos en la Patente Norteamericana No. 5,217,999); los inhibidores descritos en la Patente Norteamericana No. 5,773,476; inhibidor de carboxipeptidasa de papa (PCI), un inhibidor de proteasa de 39 aminoácidos con tres puentes de disulfuro (Blanco-Aparicio et al (1998) J Biol. Chem 273(20): 12370-12377); RC-3095 de antagonista de bombesina (Szepeshazi et al (1997) Proc Nati Acad Sci E U A 94:10913-10918) etc. Otros inhibidores de cinasa de tirosina incluyen quinazolinas, tal como PD 153035, 4-(3-cloroanilino)quinazolina, ó CP-358,774, piropirimidinas, pirimidopirimidinas, pirrolopirimidinas, tales como CGP 59326, CGP 60261 y CGP 62706, y pirazolopirimidinas (Shawn y Shawver, supra), 4-(fenilamino)-7H-p¡rrolo[2,3-d]p¡rimidinas (Traxler et al. (1996) J. Med. Chem 39:2285-2292), curcumino (Korutla et al. (1994) Biochim Biophys Acta 1224:597-600); (Laxmin arayana (1995), Carcinogen 16:1741-1745); etc. Los inhibidores de cinasa de tirosina preferidos son selectivos para el receptor EGF, por ejemplo, el EGF-R es inhibido hasta un grado mayor que otros receptores de superficie celular que tiene una actividad de cinasa de tirosina. La selectividad se aumenta a través de los métodos de formulación y suministro de fármacos, por ejemplo, cuando el inhibidor es suministrado preferentemente a vías respiratorias inflamadas, etc. Inhibidores de activación EGFR independiente de ligando Los antagonistas de mecanismos independientes de ligando incluyen antioxidantes, tales como dismutasa de super óxido, N-acetil-L-cisteína, DIVISO, DMTU, ácido ascórbico y similares. La activación independiente de ligando de EGFR a través de tensión oxidativa da como resultado la activación de la cinasa de proteína activada por mitogen (MEK) cinasa de proteína activada por mitogen p44/42 (p44/42mapk), que da como resultado la síntesis de mucina. Takeyama et al (2000) J. Immunol. 164:1546-1552. Esta activación MEK se inhibe a través del inhibidor MEK selectivo PD98059, así como mediante antioxidantes. Por lo tanto, se pueden utilizar los inhibidores MEK y antioxidantes en métodos terapéuticos de la presente invención. Los inhibidores MEK que se pueden utilizar en los métodos terapéuticos de la presente invención, incluyen cualquier inhibidor MEK conocido en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a, PD98059, U0126; y los inhibidores MEK descritos en los documentos WO 99/01421, WO 99/01426; WO 98/37881; WO 97/45412; y la Patente Norteamericana No. 5,525,625. Otros inhibidores de la cascada EGFR que se pueden utilizar en los métodos de la presente invención, incluyen inhibidores de cinasa MAP p38, incluyendo pero sin limitarse a SB203580 Inhibidores de metaloproteinasa Los inhibidores de metaloproteinasa se pueden utilizar en los métodos terapéuticos de la presente invención, particularmente inhibidores de metaloproteinasa que están involucrados en el procesamiento extracelular de un precursor de ligando EGFR de transmembrana, incluyendo pero sin limitarse a batimastato (BB-94) (Wojtowicz-Praga et al (1997) Invest. New Drugs 15:61-75) y cualesquiera de una amplia variedad de inhibidores de mataloproteinasa, incluyendo pero sin limitarse a los descritos en la publicación de Wojtowicz-Praga et al (1997); Brown (1999) APMIS 107:174-180; así como los descritos por ejemplo en el documento WO 200017162; la Patente Norteamericana No. 6,037,361; WO 200009485; WO 200006561; y WO 200006560. Si un inhibidor os efectivo para inhibir la activación de EGFR inhibiendo una metaloproteinasa que libera un precursor de ligando de EGFR de transmembrana, puede ser determinado fácilmente por los expertos en el arte. Como un ejemplo no limitativo, las células pueden ser contactadas con un estimulador del receptor acoplado a la proteína-G (GPCR), incluyendo pero sin limitarse a LPA (ácido lisofosfatídico), carbacol, trombina, bombesina, y andotelina; EGF; éster de forbol (por ejemplo, tetradecanoil-forbol-13-acetato, TPA); o ionomicina, en la presencia o ausencia de un inhibidor de metaloproteinasa, y la transactivación de EGFR medido tal como se describe en la publicación de Prenzel et al. (1999, supra) o en la sección de ejemplos. Como alternativa, se pueden llevar a cabo un ensayo enzimático de una metaloproteinasa, particularmente una metaloproteinasa sensible a batimastato. Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente, que además de los inhibidores específicos o selectivos de metaloproteinasa, se puede utilizar la inhibición de cualquier factor en esta cascada en los métodos terapéuticos de la presente invención, incluyendo pero sin limitarse a, inhibidores (por ejemplo antagonistas) de GPCR, particularmente antagonistas que inducen a producción de células goblet. Dosificación Las dosis típicas para la administración sistémica fluctúan de 0.1 µ9 a 100 miligramos por kg de peso del sujeto, por administración. Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que pueden variar los niveles de dosis como una función del compuesto específico, la severidad de los síntomas y la susceptibilidad del sujeto a los efectos secundarios. Algunos de los compuestos específicos son más potentes que otros. Las dosis preferidas para un compuesto determinado son fácilmente determinables por los expertos en la técnica a través de una variedad de medios. Un medio preferido es medir la potencia fisiológica de un compuesto determinado, por ejemplo con las pruebas ¡n vitro e in vivo descritas en la presente invención. ANTICUERPOS EN LA FORMA DE ANTAGONISTAS EGF-R Los anticuerpos de antagonistas EGF-R son de particular interés (por ejemplo, Viloria, et al., American Journal If Pathology 151:1523). Los anticuerpos para EGF ó EGF-R se producen inmunizando un huésped mamífero inmunocompetente xenogenóico, incluyendo múrido, roedores, lagomorfos, ovinos, porcinos, bovinos, etc. con EGF ó EGF-R o partes de los mismos. Preferentemente, el EGF ó EGF-R humanos o partes de los mismos se utilizan como el inmunogen. En la elección de un huésped particular interviene principalmente su conveniencia. Las inmunizaciones se llevan a cabo de acuerdo con técnicas convencionales, en donde se puede inyectar el inmunogen en forma subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intravascular, etc. en el animal huésped.
Normalmente, se utilizará desde aproximadamente 1.0 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg de EGF ó EGF-R en forma intraperitoneal todos los días en la forma de un inmunogen. Las inyecciones pueden ser con o sin adyuvante, por ejemplo adyuvante de Freund incompleto, specol. alum, etc. Después del término del programa de inmunización, se puede recolectar el antisuero de acuerdo con formas convencionales para proporcionar antisuero policlonal específico para EFG ó EFG-R. Cualesquiera anticuerpos monoclonaies o policlonales, preferentemente anticuerpos monoclonaies son producidos a partir del animal inmunizado. Se puede recolectar el antisuero policlonal del suero de los animales a través de métodos convencionales después del término del programa de inmunización. Para la producción de anticuerpos monoclonaies, se recolectan linfocitos del tejido linfoide adecuado, por ejemplo, baso, nodo linfático de drenaje, etc, y fusionarse con una parte de fusión adecuada, normalmente una línea de mieloma que produce un hibridoma que segrega un anticuerpo monoclonal específico. La clasificación de clones de hibridomas para la especificidad antigónica de interés se lleva a cabo de acuerdo con métodos convencionales. Son de particular interés, anticuerpos, preferentemente anticuerpos monoclonaies, que enlazan a EGF-R ó EGF para inhibir el enlace de EGF a EGF-R, por ejemplo, un anticuerpo que enlace específicamente al dominio extracelular de EGF-R, evitando de este modo el enlace de EGF. Tales anticuerpos pueden elaborarse a través de la metodología convencional descrita anteriormente, o están disponibles en el mercado. Los ejemplos de anticuerpos que podrían funcionar como un antagonista EGF-R, incluyen pero no se limitan a, el anticuerpo monoclonal anti-EGF-R de neutralización C225 (Kawamoto et al. (1983) Proc. Nati. Acad. Sci (EUA) 80:1337-1341; Petit et al (1997) J. Path. 151:1523-153, producida por ImClone Systems Nueva York, NY) y el anticuerpo monoclonal anti-EGF-R EMD55900 (también denominado Mab 425), (Merck, Darmstadt, Alemania). Los anticuerpos pueden ser producidos como una sola cadena, en lugar de la estructura multimérica normal. Los anticuerpos de una sola cadena se describen en la publicación de Jost et al. (1994) J.B.C. 269:26267-73, y otros. Las secuencias de ADN que codifican la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera son ligados a un espaciador que codifica al menos aproximadamente 4 aminoácidos de aminoácidos neutrales pequeños, incluyendo glicina y/o serina. La protelna codificada por esta fusión permite el ensamble de una región variable funcional que retiene la especificidad y afinidad del anticuerpo original. Los mótodos para humanizar anticuerpos son conocidos en la técnica. El anticuerpo humanizado puede ser el producto de un animal que tiene genes de región constante de inmunoglobulina humana transgónica (ver por ejemplo, las Solicitudes de Patente Internacional WO 90/10077 y WO 90/04036). Como alternativa, el anticuerpo de interés puede ser construido mediante técnicas de ADN recombinante para substituir el CH1, CH2, CH3, dominios de gozne y/o los residuos de estructura con la secuencia humana correspondiente (ver la publicación WO 92/02190). También se conoce en la técnica (Liu et al. (1987) P.N.A.S. 84:3439 y (1987) J. Inmunol. 139:3521) el uso del cADN Ig para la construcción del gen de inmunoglobulina quimérico. El mARN es aislado de un hibridoma u otra célula que produce el anticuerpo y se utiliza para producir el cADN. El cADN de interés puede ser amplificado a través de la reacción en cadena de polimerasa utilizando imprimadores específicos (Patentes Norteamericanas Nos. 4,683,195 y 4,683,202). De manera alternativa, se elabora una biblioteca y se clasifica para aislar la secuencia de interés. La secuencia de ADN que codifica la región variable del anticuerpo se fusiona posteriormente a las secuencias humana de región constante. Las secuencias humanas de genes de regiones constantes se pueden encontrar en la publicación de Kabat et al (1991) Sequences of Proteins of Inmunological Interest, N.I.H. Publicación no. 91-3242. Los genes de región humana C están disponibles fácilmente en clones conocidos. Posteriormente se expresa el anticuerpo humanizado quimérico a través de métodos convencionales. Los fragmentos de anticuerpo tales como Fv, F(ab')2 y Fab se pueden preparar mediante disociación de la proteína intacta, por ejemplo mediante disociación de proteasa o química. Como alternativa, se diseña un gen truncado. Por ejemplo, un gen quimérico que codifique una parte del fragmento (Fab')2, podría incluir secuencias de ADN que codifican el dominio CH1 y la región de gozne de la cadena H, seguida por un codón de retención de traducción para producir la molécula truncada. Un individuo que tiene una hipersecreción de mucosa, se le puede administrar en forma inicial cantidades de antagonista EGF-R en el rango de desde aproximadamente 20 miligramos (mg) hasta aproximadamente 400 mg por kilogramo de peso del paciente dos veces al día, por ejemplo, mediante inhalación. MOLÉCULAS ANTISENTIDO EN LA FORMA DE ANTAGONISTAS EGF-R En otra modalidad, los agentes terapéuticos de la presente invención son moléculas antisentido específicas para secuencias humanas que codifican para EGF ó EGF-R. El agente terapéutico administrado puede ser oligonucleótidos antisentido, particularmente oligonucleótidos sintéticos que tienen modificaciones químicas procedentes de ácidos nucleicos nativos o construcciones de ácido nucleico que expresan tales moléculas antisentido en la forma de ARN. La secuencia antisentido es complementaria con el mARN de los genes EGF ó EGF-R dirigidos, e inhibe la expresión de los productos del gen dirigido (ver por ejemplo la publicación de Nyce et al (1997) Nature 385:720). Las moléculas antisentido inhiben la expresión del gen produciendo la cantidad de mARN disponible para traducción, a través de la activación de ARNsa H o hidrancia esférica. Se puede administrar una o una combinación de moléculas antisentido cuando una combinación puede comprometer múltiples secuencias diferentes procedentes de un solo gen dirigido, o secuencias que complementan varios genes diferentes. Un gen objetivo preferido es EGF-R ó EGF. La secuencia de gen puede ser accesada a través de bases de datos publicas (factor de crecimiento epidérmico humano, número de acceso Genbank no. K01166; mARN humano para el precursor del receptor de factor de crecimiento epidérmico, número de acceso Genbank no. X00588). Generalmente, la secuencia antisentido tendrá las mismas especies de origen que el huésped animal. Las moléculas antisentido pueden ser producidas mediante la expresión de toda o una parte de la secuencia del gen objetivo en un vector adecuado, cuando el vector es introducido y expresado en las células dirigidas. La iniciación de transcripción será orientada de modo que el hilo de antisentido se produzca en al forma de una molécula de ARN. El ARN antisentido híbrida con el mARN de hilo de sentido endógeno, bloqueando de éste modo la expresión del gen dirigido. Se puede ampliar la región de iniciación de transcripción nativo o una región de iniciación de transcripción exógena. El promotor puede ser introducido a través de métodos recombinantes in vitro, o como el resultado de la integración homóloga de la secuencia en un cromosoma. Muchos promotores fuertes que están activos en células de músculo son conocidos en la técnica, incluyendo el promotor ß-actina, promotores tempranos y tardíos de SV40, y promotor de citomegalovirus humano, LTRs retrovirales, etc.
Generalmente los vectores de transcripción, tienen sitios de restricción convenientes localizados cerca de la secuencia promotora para proporcionar la inserción de secuencias de ácido nucleico. Las cintas de transcripción se pueden preparar comprendiendo una región de iniciación de transcripción, del gen objetivo o fragmento del mismo y una región de terminación de transcripción. Las cintas de transcripción pueden ser introducidas en una variedad de vectores, por ejemplo, plásmido; retrovirus, por ejemplo, lentivirus; adenovirus; y similares, cuando los vectores tienen la capacidad de mantenerse en las células en forma temporal o estable, normalmente durante un período de al menos aproximadamente un día, más normalmente durante un período de al menos aproximadamente varios días. Como alternativa, en una modalidad preferida, la molécula antisentido es un oligonucleótido antisentido. Los oligonucleótidos antisentido generalmente tendrán desde aproximadamente 7 hasta 500, normalmente desde aproximadamente 12 hasta 50 nucleótidos, más normalmente desde aproximadamente 20 hasta 35 nucleótidos, cuando la longitud está gobernada por la eficiencia de la inhibición, especificidad, incluyendo ausencia de actividad cruzada y similares. Se ha descubierto que los oligonucleótidos cortos, de desde 7 hasta 8 bases de longitud, pueden ser inhibidores fuertes y selectivos de la expresión del gen (ver Wagner et al. (1996) Nature Biotechnology 14:840-844).
Se elige una región o regiones específicas de la secuencia de mARN de hilo de sentido endógeno para ser complementada por la secuencia antisentido. Se ha mostrado que la región 5' de la región mARN es particularmente susceptible a la inhibición antisentido. Sin embargo, la evidencia reciente indica que puede ser importante el análisis de la estructura secundaria de mARN en la capacidad de acceso de los sitios de inhibición. La selección de una secuencia específica para el oligonucleótido, puede utilizar un método empírico, cuando se ensayan varias secuencias candidatas para la inhibición de expresión del gen objetivo en un modelo in vitro o animal. También se puede utilizar una combinación de secuencias, cuando diversas regiones de la secuencia de mARN son seleccionadas para el complemento de antisentido. Los oligonucleótidos antisentido pueden ser sintetizados en forma química a través de métodos conocidos en la técnica (ver la publicación de Wagner et al. (1993) supra y Milligan et al., supra). Los oligonucleótidos preferidos son modificados químicamente a partir de la estructura de fosfodiester nativo, con el objeto de incrementar su estabilidad intracelular y afinidad de enlace. En la literatura se ha descrito un número de modificaciones, las cuales alteran la química del esqueleto, azúcares o bases heterocíclicas. Los oligonucleótidos pueden comprender adicionalmente una parte de dirección que aumentan la captación de la molócula a través de las células. La parte de dirección es una molécula de enlace específico, por ejemplo un anticuerpo o fragmento del mismo que reconoce las moléculas presentes en la superficie de las células epiteliales del pulmón, particularmente células epiteliales que contienen EGF-R. Se conocen en la técnica anticuerpos biespeclficos, anticuerpos quiméricos y anticuerpos de cadena simple. Los anticuerpos no humanos preparados en forma adecuada se pueden humanizar en varias formas. El enlace entre el oligonucleótido y la parte de dirección puede utilizar cualquier método convencional, por ejemplo mediante enlaces de disulfuro, amida o tioéter, dependiendo de la química de la estructura del esqueleto del oligonucleótido. Preferentemente, el enlace será disasociado dentro de la célula para liberar el oligonucleótido. Los oligonucleótidos pueden ser conjugados a residuos hidrofóbicos, por ejemplo, colesterol, para protegerlos de las nucleasas y mejorar el transporte a través de las membranas celulares. Como alternativa, la conjugación a poli-L-lisina u otras poliaminas también puede aumentar el suministro a la célula. Una modificación adicional que puede realizarse es la adición de un componente de intercalado, tal como acridina, que tiene la capacidad de intercalarse en el mARN objetivo y estabilizar el híbrido resultante. Los oligonucleótidos antisentido pueden ser transfectados en combinación con una enzima (s) que degradará los complejos de mARN-antisentido en la célula, por ejemplo, RNasa-H. Cualquier proteína o enzima que degrade en forma preferencial o secuestre el dúplex de mARN-antisentido puede ser similarmente útil.
Como una alternativa para los inhibidores anti-sentido, se pueden utilizar compuestos de ácido nucléico catalítico, por ejemplo, ribozimas, conjugados anti-sentido para inhibir la expresión genética. Las ribozimas pueden ser sintetizadas in vitro y administradas al paciente, o pueden ser codificadas en un vector de expresión, del cual se sintetiza la ribozima en la célula dirigida (por ejemplo, ver la solicitud de Patente Internacional No. WO 9523225, y la publicación de Beigelman et al. (1995) Nucí. Acids Res 23:4434-42). Los ejemplos de oligonucleótidos con actividad catalítica se describen en la publicación WO 9506764. Los conjugados de oligonucleótidos antisentido con un complejo de metal, por ejemplo, terpiridilCu(ll), con la capacidad de transmitir hidrólisis de mARN se describen en la publicación de Bashkin et al. (1995) Appl Biochem Biotechnol 54:43-56. FORMULACIONES FARMACÉUTICAS Los antagonistas EGF-R pueden ser proporcionados en la solución o en cualquier otra forma farmacológicamente adecuada para administración, tal como suspensión de liposomas. Los anticuerpos adecuados u otra forma de anti-EGF son formulados para la administración en una forma acostumbrada para la administración de tales materiales. Las formulaciones típicas son aquellas proporcionadas en la publicación de Remington's Pharmaceutical Sciences, última edición, Mack Publishing Company Easton, PA. La ruta de administración será seleccionada con base en el compuesto que esté siendo administrado, el estado del paciente y la enfermedad que estén siendo tratados. Cuando existe una hipersecreción de mucosa, se puede administrar un compuesto a través de diferentes rutas dependiendo de la severidad de la enfermedad, por ejemplo, las situaciones de emergencia pueden requerir administración i.v., una situación aguda pero que no atente con la vida puede tratarse en forma oral, en tanto que el tratamiento crónico puede ser administrado mediante aerosol. Para uso terapéutico en enfermedades nasales y de las vías respiratorias, se prefiere la administración local. La administración mediante inhalación o aerosoles de insuflación proporcionan altas concentraciones de fármacos de alto nivel comparadas con la concentración absorbida en forma sistómica. Como alternativa, el antagonista EGF puede administrarse mediante inyección, incluyendo intramuscular, intravenosa (IV), subcutánea o inyección peritoneal, más preferentemente IV e inyecciones locales. Sin embargo, también se pueden utilizar otros modos de administración siempre que estén disponibles medios para permitir que el antagonista EGF-R entre a la circulación sistómica, tal como formulaciones transmucosas o transdérmicas que pueden ser aplicadas en la forma de supositorios, parches para la piel o en forma intranasal. Cualquier formulación adecuada que efectúe la transferencia del antagonista EGF-R a la corriente sanguínea o en forma local a los pulmones, se puede utilizar de manera adecuada. Para inyección, las formulaciones adecuadas comprenden de manera general soluciones o suspensiones acuosas que utilizan solución salina fisiológica, solución de Hank's u otros amortiguadores que incluyen opcionalmente agentes de estabilización u otros componentes menores. También se pueden utilizar preparaciones de liposomas y otras formas de microemulsiones. El antagonista EGF-R también puede ser administrado en forma liofilizada y reconstituido para la administración. Las administraciones transmucosas y transdórmicas incluyen generalmente agentes que facilitan el paso a través de la mucosa o la barrera dérmica, tal como bilis, sales, ácido fusídico y sus análogos, o varios detergentes y similares. También es posible la administración oral, siempre que los recubrimientos entéricos adecuados estén formulados para permitir que el antagonista EGF-R sobreviva el tracto digestivo. La naturaleza de la formulación dependerá hasta cierto punto de la naturaleza del antagonista EGF-R elegido. Se prepara una formulación adecuada utilizando técnicas y principios conocidos de formulación, bien conocidos para los expertos en la técnica. El porcentaje de antagonistas EGF-R contenido en una composición farmacéutica en particular, también dependerá de la naturaleza de la formulación; el porcentaje de un antagonista EGF-R que es un anticuerpo variará normalmente en un amplio rango desde aproximadamente 1% por peso hasta aproximadamente 85% por peso. Existen muchos métodos de administración conocidos en la técnica para aumentar la captación de ácidos nucléicos mediante células. Los sistemas de administración útiles incluyen sistemas de administración de liposomas-virus Sendai (Repaport and Shai (1994) J.Biol.Chem. 269:15124-15121), liposomas catiónicos, genes o matrices de administración polimérica, catéteres de balón poroso (tal como son descritos por Shi et al. (1994) Circulation 90:955-951; y Shi et al. (1994) Gene Therapy 1:408-414), vectores de expresión de retrovirus, y similares. El uso de liposomas como un vehículo de administración es un método de interés para utilizarse con antagonistas EGF-R. Los liposomas se funden con las células del sitio objetivo y se administran los contenidos del lumen en forma intracelular. Los liposomas se mantienen en contacto con las células durante suficiente tiempo para la fusión, utilizando varios medios para mantener contacto, tal como aislamiento, agentes de enlace y similares. Los liposomas pueden prepararse con proteínas o péptidos purificados que transmiten la fusión de membranas, tal como virus Sendai o virus influenza, etc. Los lípidos pueden ser cualquier combinación útil de llpidos que forman liposomas conocidos, incluyendo llpidos catiónicos, tales como fosfatidilcolina. El lípido restante normalmente será un llpido neutral, tal como colesterol, serina de fosfatidilo, glicerol de fosfatidilo y similares. Para preparar los liposomas, se puede utilizar el procedimiento descrito por Kato et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:3361 may be used. En una modalidad preferida, el antagonista EGF-R se encapsula en liposomas "invisibles" estéricamente estabilizados, por ejemplo, liposomas peguilados. Cuando tales liposomas se inyectan en forma intravenosa, permanecen en la circulación durante periodos largos. Las uniones de aberturas venéreas postcapilares se abren durante la inflamación de las vías respiratorias y permiten la acumulación de fluidos y moléculas, por ejemplo, complemento, cininogen, entran a los tejidos, e inician cascadas inflamatorias. Tal inflamación permite que los liposomas y sus contenidos sean depositados en forma selectiva en el tejido inflamado (Zhang et al. (1998) Pharm res 15:455-460). Los antagonistas EGF-R pueden ser administrados al paciente con el padecimiento, por medio de un sistema de administración de farmacéutico para la ruta de inhalación. Los compuestos pueden ser formulados en una forma adecuada para administración mediante inhalación. El sistema de administración farmacéutica es uno que es adecuado para terapia respiratoria mediante la administración tópica de antagonistas EGF-R de los mismos a los revestimientos de mucosa de los bronquios. La presente invención puede utilizar un sistema que depende del polvo y un gas comprimido para expulsar los antagonistas EGF-R de un contenedor. Para este propósito se puede emplear un aerosol o un paquete presurizado. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "aerosol" se utiliza en su sentido convencional refiriéndose a partículas líquidas o sólidas muy finas llevadas por un gas propulsor bajo presión hasta un sitio de aplicación terapéutica. Cuando se emplea un aerosol farmacéutico en la presente invención, el aerosol contiene el compuesto terapéuticamente activo, el cual puede ser disuelto, suspendido o emulsificado en una mezcla de un transportador de fluido y un propulsor. El aerosol puede estar en la forma de una solución, suspensión, emulsión, polvo o preparación semisólida. Los aerosoles empleados en la presente invención están proyectados para una administración en la forma de partículas sólidas, finas o como brumas líquidas a través del tracto respiratorio de un paciente. Se pueden utilizar varios tipos de propulsores conocidos para los expertos en la técnica. Los ejemplos de propulsores adecuados incluyen, pero no se limitan a, hidrocarburos u otro gas adecuado. En el caso del aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede ser determinada proporcionando un valor para suministrar una cantidad medida. La presente invención también se puede llevar a cabo con un nebulizador, el cual es un instrumento que genera partículas líquidas muy finas de tamaño substancialmente uniforme en un gas. Preferentemente, se dispersa en la forma de gotas un líquido que contiene los antagonistas EGF-R. Las gotas pequeñas pueden ser llevadas por una corriente de aire a través de un tubo de salida del nebulizador. La bruma resultante penetra en el tracto respiratorio del paciente. Se puede administrar a un mamífero que necesita de la terapia, una composición en polvo que contiene antagonistas EGF-R o análogos de los mismos, con o sin un lubricante, transportador o propulsor. Esta modalidad de la presente invención se puede llevar a cabo con un aparato convencional para administrar una composición farmacéutica en polvo mediante inhalación. Por ejemplo, se puede presentar una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada, tal como lactosa o almidón en una forma de dosificación por ejemplo en cápsulas o cartuchos, por ejemplo, gelatina, o paquetes de burbuja, de los cuales se puede administrar el polvo con la ayuda de un inhalador. Se pueden utilizar terapias de combinación para tratar la enfermedad pulmonar de hipersecreción. En particular, se pueden combinar antagonistas EGF- con tratamiento convencional para aliviar la hipersecreción, tal como broncodilatadores, corticosteroides, expectorantes, agentes mucollticos y similares para facilitar el despeje mucociliar. Dependiendo de la condición del paciente, puede ser preferible suministrar una formulación de la presente invención mediante inyección (por ejemplo intravenosa) o mediante inhalación. Los pacientes que tienen grandes cantidades de mucosa en los pulmones, en general no pueden ser tratados inicialmente mediante inhalación. Esto se debe al hecho de que los pulmones del paciente están lo suficientemente obstruidos como para que el inhalar la formulación en aerosol en los pulmones pueda ser un tratamiento particularmente efectivo. Sin embargo, después del tratamiento mediante inyección, o como alternativa, un mantenimiento a largo plazo o en situaciones en donde los pulmones del paciente no están obstruidos de manera severa, se prefiere la administración mediante inhalación. Se prefiere la administración mediante inhalación debido a que se pueden suministrar dosis más pequeñas en forma local a las células especificas que más necesitan del tratamiento. Al suministrar dosis más pequeñas, se eliminan o se reducen substancialmente cualesquiera efectos secundarios adversos. Al suministrar directamente a las células más necesitadas el tratamiento, su efecto se realizará en forma más rápida. Existen varios diferentes tipos de metodologías de inhalación, las cuales pueden ser empleadas en relación con la presente invención. Los antagonistas de la presente invención pueden estar formulados básicamente en tres diferentes tipos de formulaciones de inhalación. El primero, los antagonistas de la presente invención pueden ser formulados con propulsores de bajo punto de ebullición. Tales formulaciones generalmente se administran a través de inhaladores de dosis medida convencionales (MDI's). Sin embargo, tal como se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,404,871 y 5,542,410, los MDI's convencionales pueden ser modificados para incrementar la capacidad de obtener la dosificación repetible, utilizando tecnología que mide el volumen de inspiración y el rango de flujo del paciente. Como alternativa, los antagonistas de la presente invención pueden ser formulados en soluciones acuosas o etanólicas y administrados a través de nebulizadores convencionales. Sin embargo, de manera más preferente, tales formulaciones de solución son aerosolizadas utilizando aparatos y sistemas tales como los que se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,497,763; 5,544,646; 5,718,222; y 5,660,166. Por último, los compuestos antagonistas de la presente invención pueden ser formulados en formulaciones en polvo seco. Tales formulaciones pueden ser administradas inhalando simplemente la formulación en polvo seca después de crear una bruma en aerosol del polvo. En la Patente Norteamericana No. 5,775,320 presentada el 7 de Julio de 1998 y en la Patente Norteamericana No. 5,740,794 presentada el 21 de Abril de 1998 se describe la tecnología para llevar a cabo lo anterior. Con respecto a cada una de las patentes descritas anteriormente, los solicitantes señalan que estas patentes mencionan otras publicaciones con respecto a la administración de fármacos en forma intrapulmonar y tales publicaciones pueden ser referidas para metodologías, aparatos y formulaciones específicas que podrían utilizarse en relación con la administración de los antagonistas de la presente invención. Además, cada una de las patentes están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia, con propósitos de describir formulaciones, aparatos, empaque y metodología para administrar las formulaciones antagonistas de la presente invención. ENSAYOS DE CLASIFICACIÓN Fármacos candidatos Se pueden utilizar ensayos de clasificación para identificar agentes candidatos bioactivos que son antagonistas EGF. Son de particular interés los ensayos de clasificación para agentes que tienen una baja toxicidad para células humanas. Se pueden utilizar una amplia variedad de ensayos para este propósito, incluyendo el marcado in vitro del ensayo de enlace de proteína-proteína, ensayos de desplazamiento de movilidad elctroforótica, ensayos de actividad de enzima, inmunoensayos para enlace de proteína y similares. Tambión se puede utilizar la proteína EGF o EGF-R purificada, para la determinación de la estructura de cristal tridimensional, la cual se puede utilizar para modelar interacciones intermoleculares, función de transporte, etc. El término "agente", tal como se utiliza en la presente invención, describe cualquier molécula, por ejemplo proteína o farmacéutico, con la capacidad de alterar o inhibir, directa o indirectamente, la función fisiológica de EGF o EGF-R, incluyendo pero sin limitarse a, alterar o inhibir directamente la función del receptor EGF o EGF ; alterar o inhibir cualquier factor en la cascada EGFR; alterar o inhibir cualquier factor involucrado en la activación de EGFR; y alterar o inhibir cualquier factor involucrado en la liberación del ligando EGFR enlazado por membrana. Generalmente, corren en paralelo una pluralidad de mezclas del ensayo con diferentes concentración de agente, para obtener una respuesta diferencial a las diversas concentraciones. Normalmente, una de estas concentraciones sirve como un control negativo, por ejemplo, en una concentración cero o debajo del nivel de detección. Los agentes candidatos comprenden numerosas clases químicas, aunque normalmente son moléculas orgánicas, preferentemente compuestos orgánicos o inorgánicos pequeños que tienen un peso molecular de más de 50 y menos de aproximadamente 2,500 daltons. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente enlace de hidrógeno, e incluyen normalmente al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferentemente al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos comprenden con frecuencia estructuras de carbono cíclicas o hetrocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas, sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los agentes candidatos también se encuentran entre las biomoléculas incluyendo póptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Los agentes candidatos son obtenidos de una amplia variedad de fuentes incluyendo bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, están disponibles numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de una amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluyendo la expresión de oligonucleótidos y oligopéptidos aleatorizados. Como alternativa, las bibliotecas de compuestos naturales en la forma de extractos bacterianos, fúngicos, de plantas y animales están disponibles y son fácilmente producidos. Además, las librerías y compuestos naturales o producidos en forma sintética son fácilmente modificados a través de medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales, y se pueden utilizar para producir bibliotecas de combinación. Los agentes farmacológicos conocidos pueden estar sometidos a modificaciones químicas dirigidas o aleatorizadas, tales como acilación, alquilación, esterificación, amidificación, etc., para producir análogos estructurales. Cuando el ensayo de clasificación es un ensayo de enlace, se puede unir una o más de las moléculas a una marca, cuando la marca puede proporcionar en forma directa o indirecta una señal detectable. Varias marcas incluyen radioisótopos, fluorescentes, químioluminicentes, enzimas, moléculas de enlace específico, partículas, por ejemplo, partículas magnéticas y similares. Las moléculas de enlace específico incluyen pares, tales como biotina y estreptavidina, digoxina y antidigoxina, etc. Para los elementos de enlace específico, el elemento complementario podría ser normalmente marcado con una molécula que proporciona detección, de acuerdo con procedimientos conocidos. Una variedad de otros reactivos pueden ser inducidos en el ensayo de clasificación. Estos incluyen reactivos similares a sales, proteínas neutrales, por ejemplo, albúmina, detergente, etc., que se utilizan para facilitar el enlace óptimo proteína-proteína y/o reducir las interacciones no específicas o de soporte. Se pueden utilizar reactivos que mejoran la eficiencia del ensayo, tal como inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes antimicrobianos etc. La mezcla de componentes se agrega en cualquier orden que proporcione en enlace requerido. Las incubaciones se llevan a cabo a cualquier temperatura adecuada, normalmente entre 4 y 40°C. Los periodos de incubación son seleccionados para una actividad óptima, pero también pueden ser optimizados para facilitar una clasificación rápida de alto rendimiento. Normalmente será suficiente entre 0.1 y 1 hora. Los compuestos que tienen la actividad farmacológica deseada pueden ser administrados en un transportador fisiológicamente aceptable a un huésped para el tratamiento de enfermedades de hipersecreción en las formulaciones descritas en la presente invención. Dependiendo de la forma de introducción, los compuestos pueden ser formulados en una variedad de formas aquí descritas. La concentración del compuesto terapéuticamente activo en la formulación puede variar desde aproximadamente 0.1 hasta 100% por peso. Régimen de Dosificación El nivel de dosificación adecuado también variará dependiendo de un número de factores incluyendo la naturaleza del sujeto que será tratado, la naturaleza en particular de la condición de hipersecreción que será tratada y su severidad, la naturaleza del antagonista EFGR utilizado como ingrediente activo, el modo de administración, la formulación y el juicio del practicante. Por ejemplo, cuando se administra en los propios anticuerpos, tales como anti-EGF ó EGF-R en una formulación inyectable, las dosis fluctuarán de 20mg/kg hasta aproximadamente 40 mg/kg en una dosis simple. Se puede requerir la administración repetida durante u n periodo de d ías o puede ser continua la administración a través de medios intravenosos. Para condiciones crónicas , se puede contin uar la administración durante periodos largos según sea necesario. La eficacia del régimen de dosificación se determinará evaluando la función del pulmón mejorada en el paciente . Esta evaluación puede incluir med idas de viscoelasticidad de esputo, mejoras en la fu nción pulmonar, incluyendo mejoras en el volumen exploratorio forzado del esputo y un rango de flujo medio expiatorio máximo. El régimen terapéutico antes mencionado puede ser proporcionado junto con terapias de apoyo, tales como antibióticos, ADNsa I u otras terapias corrientes para el tratamiento de enfermedad pulmonar de h ipersecreción . Si los antibióticos son ad m in istrados en conjunto como parte de la terapia del paciente, se puede incl uir la cuantificación bacteriana después de la terapia para evaluar la eficacia del tratamiento mediante el creci miento bacteriano dismi nuido, que indica la viscosidad disminu ida de la mucosa o esputo y el incremento del despeje pulmonar de la mucosa o esputo. Las pruebas de fu nción pulmonar, asi como las pruebas de diagnóstico para la prog resión clín ica de la enfermedad de hipersecreción pul monar, son conocidas para los expertos en la técn ica . Las pruebas estándar de función pulmonar incluyen resistencia de las vías respiratorias (AR); capacidad vital forzada (FVC); vol umen espiratorio forzado en 1 segundo (FEV( 1 )); flujo medio espiratorio forzado; y rango de flujo espiratorio pico (PEFR). Otras pruebas de función pulmonar incluyen análisis de gas sanguíneo; respuestas a medicamentos; pruebas de estímulo y ejercicio; medidas de resistencia del músculo respiratorio; examen fibro-óptico de vías respiratorias; y similares. Algunos procedimientos básicos para estudiar las propiedades de la mucosa incluyen reologla, por ejemplo, con el uso de un microreometro magnético; capacidad de adhesión para caracterizar las fuerzas de atracción entre una superficie adherente y un sistema adhesivo midiendo el ángulo de contacto entre la gota de mucosa y una superficie. El transporte de mucosa mediante el cilio puede estudiarse utilizando técnicas convencionales, así como medición directa, por ejemplo, despeje de mucosa in situ. Se puede medir la diferencia potencial transepitelial, el resultado neto de la actividad del sistema de transporte de iones del epitelio pulmonar, utilizando microelectrodos adecuados. Se pueden utilizar métodos de morfología cuantitativa para caracterizar la condición de superficie epitelial. El paciente que será tratado puede ser un primate, tal como un humano, o cualquier otro animal que exhiba los síntomas descritos. Aunque el método de la presente invención está adaptado especialmente para el tratamiento de un paciente humano, quedará entendido que la misma es aplicable para la práctica veterinaria. Ensayo de Clasificación In Vitro En otra modalidad de la presente invención, se utilizan ensayos in vitro para evaluar el potencial terapéutico de los agentes candidatos para inhibir la proliferación de células goblet, por ejemplo, si tales agentes están activos como un antagonista EGF. Generalmente, tales ensayos comprenderán los siguientes pasos: (i) contactar un modelo in vitro de proliferación de células goblet con EGF o el equivalente funcional del mismo; (ii) contactar en forma subsecuente el modelo in vitro con un agente candidato; (iii) evaluar la proliferación de células goblet, en donde una inhibición de la proliferación de las células goblet indica el potencial terapéutico del agente candidato. El ensayo se lleva a cabo preferentemente con dos controles, en donde un segundo grupo no tiene contacto con cualquier compuesto y un tercero tiene contacto con EGF, aunque no el agente candidato. Las comparaciones se realizan después para determinar el grado de efecto de EGF y el agente candidato en la célula. Se puede utilizar cualquier modelo in vitro de proliferación de células goblet, A manera de ejemplo, se pueden aislar células de traquea de ratas y mantenerse en cultivo tal como se describe en la publicación de Guzman et al. (1995) 217:412-419. En síntesis, las células de traquea de rata se plaquean sobre membranas semipermeables recubiertas con gel de colágeno, inicialmente cultivadas sumergidas en el medio, y subsecuentemente mantenidas con una interface de aire/liquido. Los ejemplos de células in vitro incluyen células broqueales humanas primarias (disponibles en Clonetics, San Diego); células NCI-H292 (ATCC CRL-1848); y células A431 (ATCC CRL-1555). El cultivo in vitro se pone en contacto con EGF y con un agente candidato. El agente candidato puede ponerse en contacto con el cultivo antes, de manera concurrente o de manera subsecuente con la adición de EGF dependiendo del punto final que será evaluado y la naturaleza del agente candidato. Las células cultivadas son evaluadas en cuanto a inhibición de proliferación de células goblet con relación a los controles. Se puede utilizar una variedad de marcadores moleculares o bioquímicos para evaluar la proliferación de células goblet. Los ejemplos de marcadores moleculares o bioquímicos que se pueden utilizar, incluyen pero no se limitan a, expresión genética o expresión de proteína característica de células goblet. En las vías respiratorias se expresan ciertos genes de mucina, por ejemplo, MUC5B (Desseyn et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:3168-3178), y tienen un producto de gen representado en gran parte en la mucosa. La expresión de genes de mucina proporciona un marcado adecuado para la determinación de producción de mucosa. Se puede evaluar la expresión del gen de mucina a través de tecnología convencional, tal como análisis de manchado Northern, reacción en cadena de polimerasa (PCR), examen del promotor de gen de mucina, o análisis in situ. Como alternativa se evalúan las proteínas de mucina a través de metodología convencional, tal como análisis de manchado Western, ELISA, inmunoquímica y similares, utilizando anticuerpos marcados en forma detectable. También se pueden utilizar criterios morfológicos para determinar la presencia o ausencia de células goblet en el cultivo; tal como tinción de mucinas utilizando teñido con azul Alcian/PAS (Lou et al. (1998) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157:1927-1934). Se pueden examinar anticuerpos para mucinas utilizando ensayos ELISA. Debido a la estimulación de EGF-R mediante un ligando, por ejemplo, EGF, TGF-a, la inducción de la fosforilación de una cinasa receptora EGF específica y los resultados en la producción de células goblet, se pueden medir las fosforilaciones EGF-R como un reflejo de la inducción de células goblet (Donato et al. (1984) J. Biol. Chem. 264:20474-20481). Una disminución de los marcadores moleculares o bioquímicos asociados con la proliferación de células goblet indica el potencial terapéutico del antagonista. Modelos In Vivo En aún otra modalidad de la presente invención, se utilizan modelos animales in vivo para evaluar el potencial terapéutico de agentes candidatos para inhibir la proliferación de células goblet. Generalmente, el ensayo comprende los pasos de: (i) crear un modelo animal de enfermedad pulmonar de hipersecreción induciendo la expresión EGF-R; (ii) estimular el EGF-R inducido para producir células goblet que producen mucina; (iii) tratar con un agente candidato; (iv) evaluar la proliferación de células goblet o secreción de mucosa, en donde una inhibición de la proliferación de células goblet o secreción de mucosa indica el potencial terapéutico del agente candidato. Se puede utilizar cualquier modelo in vivo de enfermedad pulmonar de hipersecreción. A manera de ejemplo, en la publicación de Temann et al. (1997) Am. J. Respir. Cell. Biol. 16:471-478, se describe el modelo de ratón asmático y tal como se muestra en los ejemplos aquí proporcionados. Como alternativa, se puede utilizar un modelo de rata, tal como se describe en la publicación de Takeyama et al. (1998) Am. J. Physiol. Los ejemplos de otros modelos de animal que se pueden utilizar, incluyen pero no se limitan a, cerdos de Guinea (una especie que expresa células goblet en forma constitutiva) y ratas. El tejido de pulmón y tejido de traquea de los modelos de animal, pueden ser evaluados a través de los mismos marcadores moleculares y bioquímicos descritos para el modelo in vitro. Una disminución en la proliferación de células goblet indica el potencial terapéutico del antagonista EGF-R. Se establecen los siguientes ejemplos para proporcionar a los expertos en la técnica una descripción completa de cómo elaborar y utilizar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de los inventores con respecto a su invención ni pretenden representar que los experimentos que se encuentran más adelante son todos o los únicos experimentos llevados a cabo. Se han realizado esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) aunque se deben tomar en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes por peso, el peso molecular es un peso molecular promedio, la temperatura es en grados centígrados y la presión es una presión atmosférica o casi atmosférica. EXPERIMENTOS Ejemplo 1 El Sistema EGF Regula la Producción de Mucina en las Vías Respiratorias La hiperplasia de células goblet ocurre en varias enfermedades de hipersecreción de las vías respiratorias, debido a los mecanismos subyacentes no son conocidos, no existe una terapia efectiva. En vías respiratorias saludables, existen algunas células goblet, pero en enfermedades de vías respiratorias de hipersecreción, surge la hiperplasia de células goblet. Se estudió una línea celular bronquial humana (NCI-H292). Estas células expresan en forma constitutiva EGF-R; la expresión del gen EGF-R fue estimulada de manera adicional mediante factor alfa de necrosis de tumor (TNF ). Los ligandos de EGF-R incrementaron la síntesis de mucinas, y su efecto se incrementó mediante la co-incubación con TNFa. Las células epiteliales de las vías respiratorias de ratas libres de patógenos expresaron poca proteína EGF-R, aunque la instilación intratraqueal de TNFa (200ng) Indujo EGF-R en células básales, pregoblet y goblet, pero no en células ciliadas; TNFa, EGF, ó TNFa solos no indujeron a la producción de células goblet. Sin embargo, la instilación de TNFa, seguida de los ligandos EGF-R dio como resultado un número incrementado de células goblet y pregoblet y un sorprendente incremento en la tinción positiva de azul Alcian/PAS (glucoconjugados de mucosa de reflexión) y la expresión del gen MUC5 de mucina. En ratas sensibilizadas, la ovalbúmina dio como resultado la producción de células goblet y la expresión de EGF-R en epitelio de las vías respiratorias. En las células NCI-H292, en ratas estimuladas mediante TNFa seguido del ligando EGF-R, y en el modelo de asma en ratas, el tratamiento previo con el inhibidor de cinasa de tirosina EGF-R (BIBX1522) evitó la producción de células goblet en las vías respiratorias. Estos descubrimientos demuestran un papel para los inhibidores de la cascada EGF-R en enfermedades de hipersecreción de las vías respiratorias. MÉTODOS ESTUDIOS IN VITRO Cultivo celular. Se desarrolló una linea celular de carcinoma de mucoepidermoide pulmonar humana, NCI-H292 en un medio RPMI 1640 que contiene 10% de suero bovino fetal, penicilina(1 OOU/rnl), estreptomicina (100 g/ml) a una temperatura de 37°C en un incubador enchaquetado con agua C02 humidificada al 5%. Cuando fueron confluentes, las células fueron incubadas con EGF (EGF humano recombinante, 25ng/ml, Genzima, Cambridge, MA), TGFa (TGFa humano recombinante, 25ng/ml Genzima), TNFa (TNFa humano recombinante 20ng/ml Genzima), EGF (25ng/ml) además de TNFa (20ng/ml) ó TGFa (25ng/ml) además de TNFa (20ng/ml) durante 12 horas, 24 horas ó 48 horas. En estudios de inhibición con un inhibidor de cinasa de tirosina EGF-R, BIBX1522 (10 g/ml, proporcionado generosamente por Boehringer Ingelheim Inc., Ingelheim, Alemania), las células fueron tratadas previamente con BIBX1522, 30 minutos antes de la adición de factores de crecimiento. Después de la incubación, se utilizaron las células desarrolladas en un frasco T-75 para la extracción de ARN total o extracción de proteína, y se utilizaron 8 correderas de cámara para la tinción de azul Alcian/PAS para visualizar las mucinas. Manchado Western. Las células desarrolladas en los frascos T-75 fueron Usadas y raspadas con PBS que contiene Tritón X al 1%, dioxicolato de sodio al 1% y PMSF (10mg/ml). Se estimó la cantidad total de proteína mediante el reactivo de ensayo de protetna BCA (Pierce, Rockford, IL). Los Usados celulares fueron hervidos con un amortiguador de muestra de Tricina y ß?? al 2% a una temperatura de 95°C. las proteínas fueron separadas mediante SDS-PAGE en geles de acrilamida al 8%. Los geles resultantes fueron equilibrados en el amortiguador de transferencia; 25mM Tris-HCI, 192mM de glicina, metanol al 20% (vol/vol), pH8.3. Posteriormente las proteínas fueron transferidas en forma electroforótica para membranas de nitrocelulosa. Las membranas fueron incubadas posteriormente durante 1 hora en leche descremada libre de grasa al 5% en PBS que contiene Tween 20 al 0.05%. Posteriormente, las membranas fueron incubadas con anticuerpo anti-EGF-R de ratón monoclonal (1.100) a una temperatura de 4°C durante la noche. El anticuerpo enlazado se visualizó de acuerdo con protocolos estándar del método complejo de fosfatasa de avidina-biotina-alkalina (ABC kit, Vector Laboratories). Como un control positivo para EGF-R, se utilizaron lisatos celulares de A431 (20). Localización inmunocitoquímica de EGF-R en células NCI- H292. Las células desarrolladas en 8 correderas de cámara fueron fijadas con paraformaldehído al 4% durante 1 hora. Para teñir EGF-R, se utilizó PBS que contiene Tween 20 al 0.05%, suero de cabra normal al 2% y 2mM de levamisola como diluyente para el anticuerpo. Las secciones fueron incubadas con anticuerpo monoclonal de ratón para EGF-R (1:250) durante la noche a una temperatura de 4°C, y posteriormente se lavaron 3 veces con PBS para remover el anticuerpo primario en exceso. Posteriormente las células fueron incubadas con inmunoglobulina de antiratón de caballo biotinilado (Vector Laboratories, Burlingame, CA) a una dilución de 1:200 durante 1 hora a temperatura ambiente. Se visualizó el anticuerpo enlazado de acuerdo con los protocolos estándar del método de complejo de fosfatasa de abidina-butina-alkalino (ABC kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Muestras. Se determinó la expresión de mARN EGF-R utilizando la plantilla de muestra de pTRI-EGF-R-humano linealizada (Ambion, Austin, TX). Esta muestra contiene un fragmento de cADN de 360 pares base del gen EGF-R humano, cuyos exones se extienden de 12 a 14. Se determinó la expresión del gen MUC5 utilizando la muestra MUC5AC humana, que contiene un fragmento de cADN de 298 pares base del gen MUC5AC (proporcionado generosamente por el Dr. Carol Basbaum). Manchado Northern. Se extrajo el ARN total de células NCI-H292 desarrolladas en un frasco de cultivo celular T-75 utilizando Tri-Reactivo (moléculas Research Ctr, Cincinnati, OH) en cada condición. Se electroforó el ARN total (10µ9) en gel de agarosa/formaldehído en 1% y se transfirió a una membrana de nyln (Amsterdam, Arlington Heights, IL) mediante manchado capilar. Las muestras fueron marcadas con P32 utilizando el equipo de marcado de ADN Random Primed (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN). Las manchas fueron hibridadas previamente a una temperatura de 42°C durante 4 horas y posteriormente hibridadas a una temperatura de 42°C durante 16 horas con una muestra de cADN específica marcada con P32. La solución de hibridación contenía 250mM de Tris-HCI (pH7.5), SDS al 5%, BSA al 1%, polivinil-pirrolidona al 1%, Ficoll al 1% y pirofosfato de sodio al 0.5%. Después de la hibridación, las membranas fueron lavadas dos veces con 2 x SSC con SDS al 0.1% durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de dos lavados en 2 x SSC con SDS al 0.1% durante 30 minutos a una temperatura de 50°C y se enjuagaron en 0.1 x SSC con SDS al 0.1%. Las membranas fueron expuestas a una película de rayos X. ESTUDIOS IN VIVO El protocolo animal experimental fue aprobado por el Comité de Investigación Animal, de la Universidad de San Francisco California. Se mantuvieron en una habitación de temperatura controlada (21°C) con alimento de laboratorio estándar y agua disponible en forma libre, ratas macho libres de patógenos Fisher F344 específicas, que pesan de 230 a 250g (Simonsen Laboratories, Gilroy, CA),. Ratas saludables. Las ratas fueron anestesiadas con sodio de metohexital (sodio de Brevital, 50mg/kg, i.p.; Eli Lilly & Co., Indianapolis, IN) y se permitió que respiraran en forma espontánea. Para determinar si TNFa activa el EGF-R en las vías respiratorias, se instiló TNFa (200ng, 100µ?) en la traquea y los animales fueron eutanizados 24 horas después. Para examinar si EGF ó TGFa induce células goblet en el epitelio de las vías respiratorias, se instiló en la traquea ya sea sola, o 24 horas después de la instilación de TNFa (200ng, 10?µ?), EGF (600ng, 100µ?) ó TGFa (TGFa sintético de rata, 250ng, 1 ??µ?; Sigma, St Louis, MI) y los animales fueron eutanizados 48 horas después. En cada estudio, se instiló PBS estéril (1 ??µ?) en la traquea como control. Para confirmar si ocurrió la producción de mucina a través de la activación de EGF-R, examinamos el efecto de un inhibidor de cinasa de tirosina EGF-R, BIBX1522 (dosis estimada a partir de estudios que utilizan el inhibidor para evitar el crecimiento de cáncer). Las células fueron tratadas previamente con BIBX1522 (3,10 ó 30mg/kg, i.p.), 1 hora antes y 24 horas después de la instilación de TGFa. La traquea y los pulmones fueron removidos para examinarlos 48 horas después de la instilación de TGFa.
Ratas sensibilizadas Sensibilización. Las ratas fueron sensibilizadas en los días 0 y 10 con inyecciones intraperitonales de ovalbúmina (10mg, grado V; Sigma, St. Louis, MO), hechas complejo con 100mg de hidróxido de aluminio en 0.5ml de solución salina estéril. Posteriormente las ratas se dejaron descansar durante 10 días. En el día 20, se administró ovalbúmina directamente en la traquea; los animales fueron estimulados con 100 µ? de ovalbúmina al 0.1% en solución salina mediante instilación intratraqueal 3 veces (días 20, 22 y 24). Las ratas fueron eutanizadas ya sea sin estimulo (día 20), ó 48 horas después del tercer estímulo (día 26). Este procedimiento indujo la metaplasia de células goblet. Para bloquear la hiperplasia de células goblet, las ratas sensibilizadas fueron tratadas previamente con un inhibidor de cinasa de tirosina EGF-R, BIBX1522. En los días del estimulo con ovalbúmina (días 20, 22 y 24), las ratas sensibilizadas fueron tratadas previamente con BIBX1522 (10mg/kg, i.p., 1 hora antes del estímulo) y posteriormente BIBX1522 también se instiló en la traquea junto con ovalbúmina (BIBX1522, 10'5M, 100µ?). También se inyectó i.p. BIBX1522 cada 24 horas hasta un día antes de que las ratas fueran eutanizadas. Una vez que los animales fueron eutanizados, se removió la traquea 48 horas después del tercer estímulo. Preparación de tejido. En tiempos seleccionados previamente durante la anestesia, la circulación sistémica fue perfusionada con paraformaldehído al 1% en PBS tratado con DEPC a una presión de 120mmHg. Posteriormente, la traquea fue removida y colocada paraformaldehído al 4% durante 24 horas. Después de la fijación, la traquea y los pulmones fueron incrustados en cualquier JB-4 más solución de monómero A para el análisis celular o compuesto O.C.T. (Sakura Finetek EUA, Inc, Torrance, CA) para la inmunohistoquímica e hibridación in sito. Los tejidos incrustados fueron cortados como secciones transversales (4mm de espesor), y se colocaron en correderas. Análisis celular. Se contó el número total de células epiteliales, contando el núcleo celular epitelial a 2mm de la lámina basal con una lente objetivo de inmersión en aceite (magnificación 1000 x). La longitud lineal de la lámina basal bajo cada región analizada del epitelio, se determinó trazando el contorno de la imagen digitalizada de la lámina basal. Después de la instilación de estímulo, se formó el "desarrollo" de células goblet. Estas células tienen gránulos positivos de azul Alcian/PAS, aunque el tamaño de los gránulos es pequeño, y es poco el número de gránulos citoplásmicos. Denominamos este "desarrollo" de células goblet como "células pregoblet", una etapa antes de que las células se vuelvan células goblet maduras. Las células goblet son altas, de forma de cubo, con forma de globo a columna baja, con abundantes gránulos teñidos con azul Alcian/PAS que llenan la mayor parte del citoplasma entre el núcleo y la superficie luminal. Las células pregoblet se definen como células con áreas teñidas con mucosa más pequeña (<1/3 de altura del epitelio de la membrana de base a la superficie luminal) o con gránulos pequeños, teñidos ligeramente y en forma esparcida con azul Alcian/PAS. Las células ciliadas se reconocen por sus limites ciliados, citoplasma ligeramente teñido y núcleo redondo grande. Las células de segregación no granuladas son en forma de columna y se extienden desde el lumen hasta la lámina basal. El citoplasma ti ñe un color rosa claro, y se observan algunos gránulos positivos delgados PAS y negativos azul Alcian en el citoplasma. Las células básales son células pequeñas aplanadas con un núcleo grande, localizadas justo arriba de la lámina basal aunque no llegan al lumen de las vías respiratorias. Cuantificación de producción de células goblet. Se determinó la producción de células goblet a través de la densidad de volumen de las mucosubstancias teñidas con azul Alcian/PAS en el epitelio de la superficie de la mucosa, utilizando un sistema de generación de imagen semiautomático descrito en muchas partes (Weber et al. (1984) Science 224:294-297). Medimos el área teñida positiva con azul Alcian/PAS y el área epitelial total y se expresó la información como el porcentaje del área total teñida mediante azul Alcian/PAS. Se llevó a cabo el análisis con el programa de Imagen NIH del dominio público (desarrollado en el Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos de América y disponible en la Internet a través de FTP anónimo de zippy.nimh.gov o en el diskette del Servicio Nacional de Información Técnica, Springfield, VA. No. De parte PB95-500195GEI). Localización Inmunohistoquímica de EGF-R en epitelio de rata. Se revisó la localización de EGF-R, utilizando un manchado inmunohistoqulmico con un anticuerpo para EGF-R (Calbiochem, San Diego, CA) en secciones congeladas de traquea de rata. Después de la perfusión con 1% de paraformaldehído en PBS, se colocaron los tejidos en 4% de paraformaldehído en PBS durante 1 hora, y posteriormente se removieron en 30% de sacarosa para la crioprotección durante la noche. Se incrustaron las traqueas en el compuesto 0:C:T: (Sakura Finetek E.U.S, Inc., Torrance CA) y se congelaron. Se cortaron secciones congeladas (5µ??) y se colocaron en correderas de vidrio (Superfrost Plus, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Se llevó a cabo el inmunomanchado en forma similar a la de los estudios in vitro. Preparación de la Muestra. El cADN para MUC5 de rata fue proporcionado generosamente por la Dr. Carol Basbaum. Se subclonaron 320 pares base de fragmento de cADN en el sitio Xba/hind 111 del vector de transcripción, pBluescript-SK(-) (Stratagene, la Jolla, CA). Para preparar muestras de ARN para hibridación in situ, se linealizó este plásmido recombinante que contiene el fragmento de cADN MUC5 de rata y se transcribió in vitro con la polimerasa T7 ó T3 para obtener una muestra antisentido o sentido, respectivamente. Las muestras para la hibridación in situ, fueron generadas en la presencia de UTP[35S]. Después de la transcripción, la plantilla de cADN fue digerida con DNasa, y el ARN radiomarcado fue purificado a través de una Columna Sephadex G-25 Quick SpinTM (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) y precipitado en una solución de etanol/acetato de amonio. Antes de utilizarse, las muestras fueron lavadas con 70% de etanol y diluidas en 10 mM de DTT. Hibridación In Sito. Se cortaron secciones congeladas (5µ?t?) y se colocaron en correderas de vidrio cargadas en forma positiva (Superfrost Plus, Fisher Scientífic, Pittsburgh, PA). Las secciones cortadas en forma cercana se utilizaron para hibridación con pruebas sentido y antisentido. Se utilizaron secciones alternas para la tinción de azul Alcian/PAS. Los especímenes fueron fijados nuevamente en paraformaldehldo al 4%, rehidratados en 0.5 x SSC, y posteriormente acetilados en trietanolamina con anhídrido acético. Se llevó a cabo la hibridación con 2500-3000??p?/µ? de una muestra antisentido o sentido en formamida desionizada al 50%, 0.3 M NaCI, 20m Tris, 5mM EDTA, solución de Denhard's 1x, ditiotreitol 20mM, sulfato de dextrano al 10%, 0.5mg/ml de ADN de esperma de salmón sonicado a una temperatura de 55°C durante la noche. El tratamiento posthibridación consistió de lavados 2 x SSC, 1mM EDTA, 10mM de ß- mercaptoetanol a temperatura ambiente, incubación con solución de RNasa (20mg/ml) durante 30 minutos a temperatura ambiente y lavados adicionales en 0.1 x SSC, 1mM EDTA, 10mM de ß-mercaptoetanol a una temperatura de 55°C durante 2 horas y posteriormente en 0.5 x SSC a temperatura ambiente. Los especímenes fueron deshidratados, secados con aire y cubiertos con emulsión de rastreo nuclear NBT Kodak (Eastman Kodak, Rochester, NY) para la autoradiografía. Después de la exposición durante de 7 a 21 días a una temperatura de 4°C, las correderas fueron desarrolladas, fijadas y contrateñidas con hematoxilina (21). Estadísticas. Todos los datos se expresan como promedio ± SEM. Se utilizó análisis de variación de una dirección para determinar las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. Se utilizó la prueba F de Scheffe para corregir las múltiples comparaciones cuando se identificaron significancias estadísticas en el análisis de variación. Se aceptó una probabilidad menor a 0.5 para la hipótesis nula, como indicando una diferencia estadísticamente significativa. RESULTADOS Producción de estimulados TNFa de EGF-R en células NCI-H292. Se determinó primero si las células NCI-H292 expresan en forma constitutiva EGF-R. El análisis Western de inmunomanchados identificó la presencia de proteína EGF-R en cultivos confluentes de células NCI-H292 (figura 1A,lado derecho). Las células fueron examinadas después de volverse confluentes. Los lisados fueron electroforesados en geles de acrilamida al 8% y manchados con un anticuerpo anti-EGF-R. Los pesos moleculares de las proteínas marcadoras se reportan en el lado derecho. Un control positivo para EGF-R fue proteína procedente de células A431 (figura 1A, lado izquierdo), que expresa constitutivamente EGF-R (Weber et al., supra). Los estudios inmunocitoquímicos con un anticuerpo anti-EGF-R revelaron un teñido positivo, de manera más sorprendente en células de división (figura 1B, análisis inmunocitoquímico con anticuerpo anti-EGF-R en cultivos de células NCI-H292). En la confluencia, se observó tinción positiva, más fuertemente en células de divisiones (flechas, lado derecho). En la ausencia del anticuerpo primario, la tinción estuvo ausente (lado izquierdo). El manchado Northern demostró que TNFa (20ng/ml), activó la expresión del gen EGF-R, un efecto que estuvo presente en 12 horas y se incrementó en 24 horas (figura 1C, análisis Northern de EGF-R en células NCI-H292). El análisis se llevó a cabo en ARN total extractado de cultivos confluentes incubados con TNFa (20ng^l) durante 12 ó 24 horas. El ARN fue electroforesado en gel de formaldehldo-agarosa, transferido a una membrana de nylon e híbridado con la muestra de cADN EGF-R marcado P32. Después de la hibridación, se lavó la membrana y se autoradiografió. Expresión de estimulado de ligando EGF-R de glucoconjugados de mucosa y expresión de gen UC5 en células NCI-H292. Los EGF-R se expresan en forma constitutiva en células NCI-H292, de modo que se evaluó la capacidad de los ligandos EGF-R (EGF-R, TNFa) para inducir la producción de glucoconjugados de mucosa (figura 2, columna superior, tinción de azul Alcian/PAS de células NCI-H292 para la identificación de glucoproteínas de mucinas). Columna superior = incubación de células sin inhibidor; columna inferior = incubación en la presencia de inhibidor de cinasa de tirosina EGF-R BIBX1522 (10µg/ml). Cuando se incubaron las células solas (control), se observó una cierta tinción positiva-PAS (flechas, columna superior); la incubación con TNFa (20ng/ml) sola no afectó la tinción; la incubación con EGF; (25ng/ml) ó con TNFa (25ng/ml) incrementó la tinción positiva-PAS (flechas); la incubación con TNFa además de TGFa incrementó en forma marcada la tinción (flecha, columna superior). Algunas células de control mostraron tinción; la incubación con TNFa (20ng/ml) sola no afectó la tinción; la incubación ya sea con EGF o con TGFa cada una en 25ng/ml) incrementó la tinción positiva-PAS (flechas); la incubación con TNFa más TGFa incrementó la tinción mucho más que cualquier ligando solo. Por lo tanto, los ligandos de EGF-R inducen glucoconjugados de mucosa en células NCI-H292. Para examinar la expresión del gen MUC5, se llevó a cabo un manchado Northern (figura 3). Se extrajo el ARN total (10µ9) de las células, se electroforesó en un gel de formaldehído y una agarosa, se transfirió a una membrana de nilón y se hibridó con la muestra de cADN MUC5 marcada P32. Después de la hibridación, la membrana se lavó y autoradiografió. Se tuvieron cultivos con el medio solo (C), EGF ó TGFa (25ng/ml), TNFa (20ng/mlo ó la combinación de TNFa más cualesquiera de EGF ó TGFa durante 12 (columna superior) o 24 horas (columna inferior) en expresión de gen MUC5. Los cultivos también se obtuvieron con TNFa, además de ya sea EGF ó TGFa después de la preincubación con inhibidor de cinasa de tirosina EGF-R (BIBX1522, ??µ?/?t??; columna inferior); el inhibidor evitó la expresión del gen MUC5. Las células NCI-H292 mostraron alguna expresión en el estado de control (figura 3, columna izquierda inferior); cuando las células fueron incubadas con EGF TGFa, la expresión del gen MUC5 fue apenas reconocida en 12 horas, pero fue claramente expresada en 24 horas. El TNFa solo no afectó la expresión del gen MUC5, pero cuando el TNFa se agregó a las células incubadas con ligandos EGF-R, la expresión del gen MUC5 se incrementó en forma marcada arriba del nivel originado con el ligando EGF-R solo (figura 3). El inhibidor de cinasa de tirosina EGF-R (BIBX1522) evita la expresión de glucoconjugados de mucosa y de la expresión del gen MUC5 en células NCI-H292. Para probar la hipótesis de que la activación de los receptores EGF-R induce a la expresión del gen MUC5, las células fueron incubadas con un inhibidor de cinasa de tirosina EGF-R BIBX1522. Cuando las células NCI-H292 fueron tratadas previamente con BIBX1522 (1(^g/ml), se inhibió la tinción positiva-PAS en el estado de control y la tinción incrementada que ocurrió con los ligandos EGF-R se inhibió en forma marcada (figura 2, columna inferior). En el análisis Northern, se inhibió completamente la expresión del gen UC5 que se incrementó en forma marcada mediante la combinación de TNFa además de EGF ó además de TGFa, mediante la preincubación con BIBX1522 (figura 3, columna inferior). Estos resultados implican la activación de EGF-R en la inducción del gen de mucina y glucoproteinas de mucosa en células NCI-H292. Producción de estimulados TNFa de EGF-R en ratas. Se estudiaron ratas libres de patógeno (las cuales tienen constitutivamente pocas células goblet epiteliales), comenzando con el papel de TNFa. En el estado de control, el epitelio traqueal contuvo pocas células positivas EGF-R (figura 4A, lado izquierdo). Sin embargo, la instilación intratraqueal de TNFa (200ng) indujo la proteína EGF-R en varios tipos celulares en el epitelio traqueal (figura 4A, lado derecho). La tinción positiva EGF-R estuvo presente en las células goblet (G), células pregoblet (P-G), células de secreción no granuladas (S) y células básales (Ba), aunque no en células ciliadas. Por lo tanto, TNFa induce la protección de proteína EGF-R. Papel de los ligando EGF-R en la producción de glucoconjugados de mucosa y expresión del gen MUC5 en ratas. En el estado de control, el epitelio traqueal contuvo pocas células goblet y pregoblet. La instilación intratraqueal de los ligandos EGF-R, EGF (600ng¡ no mostrados) o TGFa (250ng; tabla 1) solos, no afectó la producción epitelial de glucoconjugados de mucosa. Sin embargo, cuando se proporcionó primero TNFa (200ng), seguido en 24 horas por EGF ó TGFa (tabla 1), y los animales fueron eutanizados 48 horas después, se incrementó en forma marcada la tinción de azul Alcian/PAS, y los números de células goblet y pregoblet se incrementaron en forma marcada, sin un cambio en el número total de células o en el número de células ciliadas (tabla 1). La hibridación in situ para el gen MUC5 no mostró expresión en animales de control. Cuando TNFa seguido de EGF ó TGFa, se instiló en forma intratraqueal, fue visible la expresión de MUC5 en el epitelio. Por lo tanto, la inducción de EGF-R solo o la estimulación mediante ligandos EGF-R solo fue suficiente para inducir la metaplasia de células goblet o la producción de glucoconjugados de mucosa. Sin embargo, después de la inducción de EGF-R mediante TNFo, fue marcada la instilación de metaplasia de células goblet estimulados por ligandos EGF-R.
Tabla 1 Análisis Celular en E itelio Traqueal Tabla 1. Efecto de transmisores y de sensibilización de ovalbúmina en células epiteliales de traquea en ratas. Las células fueron analizadas tal como se describió en la sección de métodos; cinco ratas por grupo. La caracterización estuvo auxiliada por la tinción azul Alcian (AB)/PAS (la cual tiñe glucoconjugados de mucosa). Además del conteo celular, se calculó el porcentaje de área epitelial total ocupada por la tinción AB/PAS. Las vías respiratorias de control y las vías respiratorias estimuladas por TGFa (250ng) solo contuvieron pocas células goblet y pregoblet; existió poca tinción con AB/PAS. TNFa (200ng), seguido de TGFa, dio como resultado números incrementados de células goblet y pregoblet y un incremento en el área ocupada por las células teñidas con AB/PAS. La sensibilización de las ratas con ovalbúmina (OVA) en forma intraperitoneal (ip), no tuvo efecto en la distribución celular o en la tinción AB/PAS, pero cuando se suministró OVA en forma ip seguido de instilación intratraqueal (it) de OVA, se encontró un sorprendente incremento en células goblet y pregoblet y el porcentaje de área ocupada por la tinción AB/PAS.
La sensibilización de ovalbúmina en ratas induce a la producción de EGF-R y células goblet. Ya que se reportó muerte por asma aguda debido a la obstrucción de mucosa de las vías respiratorias, se produjo un modelo de asma en ratas libres de patógeno. Las inyecciones de ovalbúmina (10mg, ip), en los días 0 y 10, no estimuló la hiperplasia de las células goblet (tabla 1). Sin embargo, cuando esto fue seguido por tres instilaciones intratraqueales (i.t.) de ovalbúmina (0.1% en 100 µ? ) en los días 20, 22 y 24, los animales fueron eutanizados en el día 26, los números de células goblet y pregoblet se incrementaron en forma marcada; los números de células ciliadas y básales no tuvieron cambio (tabla 1, lado derecho). Los estudios inmunohistoquímicos con un anticuerpo anti-EGF-R no mostraron tinción en traqueas de control. Los animales sensibilizados tanto con i.p. como i.t., mostraron tinción EGF-R (figura 4B, lado izquierdo) en forma selectiva en células que se tiñeron en forma positiva con AB/PAS (figura 4B, lado derecho). Después de tres instilaciones intratraqueales de ovalbúmina (0.1%, 100ml), se expresó fuertemente la inmunoreactividad de EGF-R en células goblet y pregoblet (lado izquierdo inferior), las mismas células que se tiñeron en forma positiva con azul Alcian/PAS (lado inferior). Por lo tanto, un modelo de asma de ovalbúmina mostró la proliferación de células goblet en células que produjeron EGF-R. El inhibidor de cinasa de tirosina EGF-R (BIBX1522) evita la producción de células goblet inducida por la instilación de ligandos TNFa más EGF-R y mediante la sensibilización de ovalbúmina en ratas. Debido a que BIBX1522 evitó la producción de mucinas en células cultivadas, se examinó el efecto de este inhibidor en ratas libres de patógeno. La tinción de azula Alcian/PAS que se incrementó mediante la instilación traqueal de TNFa, seguido de TGFa del ligando EGF-R, se inhibió en un modo dependiente de la dosis mediante el tratamiento previo con BIBX1522 (3-30mg/kg, i.p.; figura 5A). La instilación traqueal de TNFa (para inducir EGF-R), seguido del TGFa del ligando EGF-R, dio como resultado una sorprendente metaplasia de células goblet. En ratas sensibilizadas con ovalbúmina, el tratamiento previo con BIBX1522 (10mg/kg, i.p.) inhibió completamente la producción de células goblet (evaluado mediante tinción de azul Alcian/PAS; figura 5B). A los animales que se les proporcionó en forma i.p, ovalbúmina, mostraron únicamente poca tinción positiva AB/PAS en el epitelio bronquial. Los animales sensibilizados primero con OVA i.p., seguido de tres instilaciones intratraqueales (i.t.) de OVA, mostraron un marcado incremento en la tinción positiva AB/PAS. Estos estudios indican que EGF-R, cuando se estimula mediante ligandos EGF-R, induce a la producción de células goblet in vitro T in vivo, cuyos efectos se deben a la activación de EGF-R y los cuales fueron bloqueados por un inhibidor de cinasa de tirosina EGF-R. En un modelo de asma de ovalbúmina, el inhibidor también fue efectivo en la prevención de la producción de células goblet. Además de describir un mecanismo para inducir células goblet, estos resultados sugieren una posible secuencia para la evolución de la producción de células goblet con base en la expresión de EGF-R. El estimulo con TNFa, indujo a una tinción intensa de células de secreción no granuladas; la subsecuente activación mediante ligandos EGF-R causó la tinción progresiva de glucoconjugados de mucosa en el citoplasma , y las células se volvieron "pregoblet" y posteriormente en células "goblet". La instilación de TNFa seguido del ligando EGF-R, indujo a la producción de células goblet sin alterar el número total de células epiteliales, lo que sugiere que la activación de EGF-R promovió la diferenciación celular selectiva (sin proliferación). Los descubrimientos sugieren que las células goblet se dividen de las células de secreción no granuladas que expresan EGF-R y son estimuladas por los ligandos EGF-R para producir mucinas. En pacientes que murieron por asma aguda, la hiperplasia de células goblet y la obstrucción por mucosas son importantes descubrimientos. En un modelo de asma de múrido, la sensibilización de vías respiratorias ocurre después de la instilación repetida de ovalbúmina, dando como resultado una marcada hiperplasia de células goblet en las vías respiratorias. Se demostró que EGF-R, el cual no se expresó en el epitelio de las vías respiratorias de control, se expresa en animales sensibilizados. Las células que se tiñeron fueron pre-goblet y células goblet, sugiriendo que el EGF-R estaba involucrado en la producción de células goblet. El tratamiento previo con un inhibidor de cinasa de tirosina del receptor EGF-R (BIBX1522) evitó la producción de células goblet de las vías respiratorias, confirmando el rol de la activación de EGF-R en la producción de células goblet en asma experimental. Los resultados actuales implican la trayectoria de EGF-R en la hiperplasia de las células goblet. Los estudios anteriores han mostrado que diferentes estímulos, tales como el ozono, el dióxido de azufre, los víruses, los lipopolisacaridos, el factor de activación de plaquetas, y la interleucina-4, activan la expresión y secreción de mucina. La presente invención proporciona un mecanismo para evaluar la relación de estos estímulos inflamatorios y el sistema EGF-R. El asma sirve como un ejemplo de la estrategia terapéutica de la presente invención: El epitelio normal de las vías respiratorias humanas tiene una proporción de células ciliadas de 3 a 10 por cada célula goblet. En el asma, el número de células goblet puede ser igual o exceder el número de células ciliadas; en los pacientes quienes mueren en una condición asmática, existe un aumento de 30 veces en el área de porcentaje ocupado por las células goblet comparado con el número en los pacientes que mueren de enfermedades respiratorias diferentes al asma. La inhibición de la producción de las células goblet debe eliminar esta fuente de hipersecreción. Debido a que el ciclo de vida de las células goblet es desconocido, no se puede predecir con precisión el curso del tiempo de resolución de la hiperplasia de células goblet con el tratamiento. En ausencia de una exposición adicional al alérgeno, la hiperplasia de las células goblet en los ratones previamente sensibilizados se resolvió dentro de 50 días, junto con otras manifestaciones de inflamación alérgica . La inh ibición de la activación del eje EG F-R puede inhibir la hiperplasia de células goblet mucho más rápidamente, dependiendo del tiempo de vida de las células goblet. Recientemente, se han reportado in h ibidores de ci nasa de tirosina competitivos con ATP altamente selectivos. Los in h ibidores de cinasa de tirosina EG F-R están siendo eval uados para el tratamiento de padecimientos asociados con la expresión del EG F-R. La h i persecreción es una manifestación i mportante de muchas enfermedades i nflamatorias crónicas de las vías respi ratorias. Actualmente, no existe una terapia efectiva para aliviar los síntomas, y detener el prog reso de estas enfermedades. Los descu brimientos presentes proporcionan un mecanismo y una estrategia para la terapia: I nhibiendo la activación del EGF-R, se evita la producción de células goblet. Los inh ibidores de la activación del EG F-R se proponen como terapia en enfermedades hipersecretorias de las vías respiratorias. Ejemplo 2 Rol de la Tensión Oxidativa en la Prod ucción de Células Goblet En los humanos, se ha sugerido que fumar cigarrillos de manera prolongada puede estar asociado con los cambios patológicos prog resivos en las vías respi ratorias periféricas incluyendo la hiperplasia de células goblet. De un modo si mi lar, los modelos experimentales de fumado de cigarrillos en animales han mostrado causar la h i perplasia de cél ulas goblet en las vías respiratorias. Sin embargo, se desconoce el mecanismo por el cual el hecho de fumar cigarrillos puede inducir la síntesis de mucina. Los datos siguientes demuestran que los neutrófilos proinflamatorios activados por la citosina y el humo del cigarrillo ocasionan las síntesis de la mucina MUC5AC en las células epiteliales bronquiales humanas, por medio de la activación independiente delante del ligante del EGF-R. Estos resultados implican que los neutrófilos y el número de cigarrillo reclutado como reguladores de la diferenciación de la célula epitelial pueden dar como resultado una inducción anormal de las células que produce mucina en las vías respiratorias. Métodos Aislamiento de Neutrófilos. Se purificaron neutrógenos humanos provenientes de la sangre periférica obtenida de donadores humanos saludables. El aislamiento de neutrógenos se llevó a cabo por medio de técnicas estándar de una separación de gradiente Flcoll-Hypaque, sedimentación de dextrano, y lisis hipotónica de eritrocitos. Las células fueron rutinariamente viables >95% por la exclusión del tinte azul de tripano. Para evitar la contaminación de la endotoxina, todas las soluciones pasaron a través de un filtro de 0.1µ??. Cultivo Celular. Las células NCI-H292, una linea celular del carcinoma mucoepidermoide pulmonar humano, fueron cultivadas en un medio de RPMI 1640 con un contenido del 10% de suero fetal de bovino, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (???µ?/???) y Hepes (25m ) a una temperatura de 37°C, en un incubador recubierto con C02 agua humidificado al 5%. Se utilizaron para cultivar las células, ya sea placas de cultivo de 6 depósitos, o portaobjetos de 8 cámaras. Cuando fue confluente, las células fueron cultivadas durante 1 hora con los neutrófilos solos (células 106/ml), TNF solo (TNFa humano recombinante, 20ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA), IL-8 (IL-8 recombinante humano (10"e M, Genzyme) solo, fMLPMI O"8 Sigma, St Louis, MO) solo, TNFa más neutrófilos, IL8 más neutrófilos, fMLP más neutrófilos, peróxido de hidrógeno (H202, 200µ?) solución de humo de cigarrillo o TGFa (TGFa recombinante humano, 0.1 a 25ng/ml Calbiochem, San Diego, CA). Las células fueron lavadas después de incubadas en un medio fresco simple. Los experimentos se terminaron en los tiempos previamente seleccionados (para el mARN, 6 horas y 12 horas, para la proteína, 24 horas). Como controles, se incubaron células con el medio simple, por los mismos períodos de tiempo. En otros estudios con neutrófilos, se seleccionó el TNFa como un estímulo debido a que tenía el efecto más potente en la síntesis de la MUC5AC. Las células NCI-H292 fueron incubadas durante 1 hora, ya sea con neutrófilos que habían sido incubados con TNFa (20ng/ml) durante 1 hora y posteriormente con PBS estéril para evitar la contaminación con el sobrenadante (por ejemplo, moléculas liberadas de los neutrófilos), o las células NCI-HNCI-H292 fueron incubadas con el sobrenadante solamente. Los estudios de inhibición con inhibidores de cinasa de tirosina EGF-R, las células NCI-H292 fueron tratadas previamente con BIBX 1522 (??µ?/ml, proporcionado generosamente por Boehringer Ingelheim Inc., Ingelheim, Alemania), o tirfostina AG 1478 (10µ?, Calbiochem) 30 minutos antes de agregar un estimulo. También fueron examinados los efectos de un inhibidor selectivo de cinasa de tirosina del receptor del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (tirfostina AG1295, 100µ? Calbiochem), y un control negativo para la tirfostina (tirfostina A1 100µ , Carbiochem). En los estudios de inhibición con los anticuerpos de bloqueo para los ligantes EGF-R, los sobrenadantes fueron tratados previamente con un anticuerpo anti TGF (Calbiochem), o un anticuerpo anti EGF durante 30 minutos y luego agregados a las células NCI-H292. El estudio de los radicales libres de oxígeno fue examinado utilizando supresores de DIVISO de radical libre de oxígeno (1%, Sigma), 1,3-dimetil-2-tiourea (DMTU, 50mM, Sigma), o dismutasa de superóxido (SOD, 300 U/ml, Sigma). Preparación de la Solución de Humo de Cigarrillo. Se utilizaron en el estudio cigarrillos de investigación (código 2R1), producidos por la University of Kentucky Tobacco and Health Research Foundation), La solución de humo de cigarrillo fue preparada tal y como se describió anteriormente (Dusser et al. (1989) J. Clin. Invest. 84: páginas 900 a 906). Brevemente, el humo de cigarrillo fue extraído en una jeringa de polipropileno (35 mi) en un índice de una fumada/minuto (10 veces) y se hizo burbujear lentamente en 20 mi de RPMI1640 con un contenido de regulador Hepes 50 mM. La solución de humo entonces fue triturada a un pH de 7.4 y utilizada inmediatamente después de la preparación.
Visualización de Glucoconjugados Mucosos y Protelna MUC5AC en las Células NCI-H292. Al final de los experimentos, las células cultivadas en los portaobjetos de 8 cámaras fueron fijadas con 4% de paraformaldehído durante 1 hora y posteriormente, ya sea teñidas con Schiff-ácido peryódico/azul alciano (PAS) para visualizar los glucoconjugados de mucosa, o utilizados para la inmunocitoqutmica de la MUC5AC. Para la inmunocitoquímica del MUC5AC, se utilizó como diluyente para el anticuerpo PBS con un contenido de 0.05% de Tween 20, 2% de suero de cabra normal, y Levamisol (2mM). Las células fueron incubadas con mAb de ratón para MUC5AC (clon 45 M1, 1:200, Neo Markers, Fremont, CA), durante 1 hora a temperatura ambiente, y luego lavados 3 veces con PBS para remover el anticuerpo primario excedente. Posteriormente, las células fueron incubadas con IgG anti-ratón de caballo biotinilado (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA), en una dilución de 1:200 durante 1 hora a la temperatura ambiente. El anticuerpo enlazado fue visualizado de acuerdo con un protocolo estándar para el método de complejo de fosfatasa alcalina-biotina-avidina. Hibridación In Situ para el gen MUC5AC humano. El fragmento de cADN 298 bp de MUC5AC humano fue insertado en el vector de clonación TA (Invitrogen, San Diego, CA). La preparación de las muestras de ADN y la hibridación In situ fueron realizados, tal y como se describió anteriormente. Inmunoensayo de Proteína MUC5AC. La proteína UC5AC fue medida tal y como se describió anteriormente. Brevemente, los lisatos de células fueron preparados con PBS en diluciones múltiples, y se incubaron 50µ? de cada muestra con un regulador de carbonato-bicarbonato (50µ?) a una temperatura de 40°C, en una placa de 96 depósitos (Maxisorp Nunc, Fisher Scientific, Santa Clara, CA), hasta el secado. Las placas fueron lavadas tres veces con PBS, y bloqueadas con 2% de BSA (fracción V, Sigma) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas nuevamente, tres veces con PBS y luego incubadas con 50µ? de anticuerpo MUC5AC monoclonal de ratón (1:100), que fue diluido con PBS con un contenido de 0.05% de Tween 20. Después de 1 hora, los depósitos fueron lavados tres veces con PBS, y se suministró en cada depósito, un conjugado IgG anti-ratón-cabra de peroxidasa de rábano 100µ? (1:10000 Sigma). Después de 1 hora, las placas fueron lavadas tres veces con PBS. La reacción de color se desarrolló con una solución de peroxidasa TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD), y detenida con H2S04 2N. La absorbancia fue leída en 450 nm. Análisis Cuantitativo de la Proteína TGFa.. La proteína TGFa fue medida utilizando un equipo que se consigue en el mercado para el ensayo de ELISA (Sigma), siguiendo las instrucciones del fabricante. El sobrenadante tomado después de la incubación de los neutrófilos más el TNF (20 ng/ml) por 1 hora, fue mezclado con un regulador de lisis de PBS con un contenido del 1% de Tritón X-100, dioxicolato de sodio al 1%, y varios inhibidores de proteasa, (minicompleto, Boehringer annheim, Alemania), y luego utilizados para medir el TGFa. Inmunoprecipitación del la Proteína EGF-R, T Inmunotinción de Fosforilación de Tirosina. A las células se les eliminó el suero durante 24 horas, y luego fueron estimuladas con TGFa, H202, o el sobrenadante de los neutrófilos activados durante 15 minutos. Después del estimulo, las células fueron lisadas e incubadas durante 30 minutos en un agitador de órbita a una temperatura de 4°C. Para remover el material insoluble, los lisatos celulares fueron centrifugados a una velocidad de 14,000 rpm durante 5 minutos a una temperatura de 4°C. Se inmunoprecipitaron alícuotas del sobrenadante con contenido de cantidades iguales de proteína con un anticuerpo receptor anti-EGF (policlonal, Ab4, Calbiochem), y 20 µ? de A-agarosa de proteína (Santa Cruz) durante 2 horas a una temperatura de 4°C. Los precipitados fueron lavados tres veces con 0.5 mi de regulador de lisis, suspendidos en un regulador de la muestra SDS, y se hicieron hervir durante 5 minutos. Las proteínas fueron separadas por medio de SDS-PAGE en un gel de acrilamida al 8.0%. El gel resultante fue equilibrado en el regulador de transferencia: 25mM Tris-HCI, 192 mM glicina, 20% (volumen/volumen) metanol, pH 8.3. Entonces las proteínas fueron transferidas electroforéticamente a membranas de nitrocelulosa (0.22µ(t?), bloqueadas con leche desgrasada al 5% en PBS con un contenido de 0.05% de Tween 20 durante la noche y posteriormente incubadas con el anticuerpo anti-fosfotirosina monoclonal (1:100, Santa Cruz) durante 1 hora. El anticuerpo enlazado fue visualizado de acuerdo con un protocolo estándar para el método de complejo de fosfatasa alcalina-biotina-avidina (equipo ABC, Vector Laboratories).
Estadísticas. Todos los datos expresan como promedio ± SEM. Se utilizó el análisis de una vía de variación para determinar las diferencias estadísticamente importantes entre los grupos. Se utilizó la prueba F de Scheffe para corregir las comparaciones múltiples cuando las importancias estadísticas fueron identificadas en el análisis de variación. Se aceptó una probabilidad de menos de 0.05 de hipótesis nula indicando una diferencia estadísticamente importante. Resultados. Los Neutrófilos Activados Causan la Síntesis de ucina MUC5AC. Cuando los neutrófilos más el estimulo que activa los neutrófilos (IL-8, fMLP, TNFa) fueron incubados con células NCI-H292 durante 1 hora, la síntesis de la proteína MUC5AC aumento de manera importante en un período de 24 horas, mientras que los neutrófilos no asimilados (108/ml), el IL-8 solo o el fMLP solo no mostraron efecto en las síntesis de MUC5AC; la incubación con TNFa ocasionó un aumento insignificante pequeño en la síntesis del MUC5AC. Cuando los neutrófilos fueron incubados anticipadamente durante 1 hora con TNFa, y entonces los neutrófilos y sus sobrenadantes fueron separados, la incubación posterior del sobrenadante durante 1 hora con células NCI-H292, activaron la expresión del gen MUC5AC durante un período de 12 horas, y la tinción estimulada, tanto con PAS/azul alciano como con un anticuerpo para la proteína MUC5AC en un período de 24 horas; restando las células NCI-H292 que mostró poca expresión del gen MUC5AC, y una tinción de parches pequeña de ambos PAS/azul alciano y proteína MUC5AC. La síntesis de proteína UC5AC inducida mediante el sobrenadante aumentado de manera importante en comparación con el control; los neutrófilos separados del sobrenadante después de la incubación no tuvieron efecto. Se concluyó que los neutrógenos activados secretan rápidamente el producto activo, el cual ocasiona la síntesis del MUC5AC. Los inhibidores de Cinasa de Tirosina EGF-R Evitan la síntesis de MUC5AC Inducida por los Sobrenadantes de los Neutrófilos Activados. Debido a que se conoce que los ligantes de EGF-R ocasionan la síntesis de MUC5AC en las células NCI-H292 por medio de la activación de la cinasa de tirosina EGF-R, el rol de la activación de la EGF-R en la síntesis de MUC5AC inducida por el sobrenadante de células activadas también fue examinado. El tratamiento previo de las células NCI-H292 con inhibidores de cinasa de tirosina EGF-R selectivos (BIBX1522, AG1478), evitó la síntesis de la proteína MUC5AC que generalmente fue inducida por el sobrenadante de los neutrófilos activados. Un inhibidor selectivo de cinasa del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (AG1295), y un control negativo de tirfostina (A1), no tuvieron efecto. Estos resultados implican la activación de la cinasa de tirosina EGF- R en la síntesis de UC5AC inducida por el sobrenadante de los neutrófilos activados. Rol del ligante EGF-R secretado en el sobrenadante de los neutrófilos activados de la síntesis MUC5AC. Para determinar si la activación de la cinasa de tirosina EGF-R dependiente de los ligantes EGF-R (EGF y TGF ) se preincubaron en sobrenadante de neutrófilos activados con anticuerpos neutralizantes para el ligante EGF-R. El tratamiento previo del sobrenadante, ya sea con anticuerpo anti-TGFa o anticuerpo anti-EGF no inhibió la síntesis de UC5AC inducida por el sobrenadante de los neutrófilos activados. Además, no se detectó TGFa en el sobrenadante. Por lo tanto, la fosforilación de tirosina EGF-R ocasionada por el sobrenadante de los neutrófilos activados fue inducida por un mecanismo independiente de los ligantes EGF-R, EGF y TGFa. El Humo de Cigarrillo y los Radicales Libres de Oxígeno Ocasionan la síntesis de la MUC5AC. El humo de cigarrillo y el radical libre de oxigeno, H202, activó la expresión del gen MUC5AC en un período de 12 horas, como lo hizo el TGFa. De un modo similar, todos los estímulos aumentaron la síntesis de la proteína MUC5AC y la producción de glucoconjugados mucosos en un período de 24 horas, los efectos ocurrieron en una modalidad dependiente de la dosis. La síntesis máxima de UC5AC en respuesta al H202 fue significativamente menor que la respuesta al TGFa, el tratamiento previo con AG1478 evitó el aumento en la síntesis de proteína MUC5AC inducida por todos los estímulos, indicando que los estímulos ocasionan la síntesis de mucina mediante la activación de la cinasa de tirosina EGF-R. La síntesis de la MUC5AC por el sobrenadante de neutrófilos activados, el humo de cigarrillo y H202 fueron inhibidos de manera importante por el tratamiento previo de los supresores de radical libre (DMSO y DMTU) y SOD, pero la síntesis de la proteína MUC5AC por el TGFa, no fue afectada por el DMSO ó SOD. Inducción de la Fosforilación de Tirosina de EGF-R por el Sobrenadante de Neutrófilos Activados y por H202. La distribución de la proteína EGF-R fue similar en el control al que se le eliminó el suero y en todas las condiciones estimuladas (sobrenadante de neutrófilos activados, humo de cigarrillo, H202 ó TGFa). La fosforilación total de la tirosina de la proteína ocurrió en un período de 15 minutos posteriores a la adición del sobrenadante de los neutrófilos activados, el humo de cigarrillo, el H202 ó el TGFa; el control al que se le eliminó el suero no mostró efecto. La fosforilación total de la tirosina de la proteína inducida por TGFa fue mayor que el efecto del sobrenadante de los neutrófilos activados, el humo de cigarrillo o el H202- Para determinar si el EGF-R fue fosforilado, se llevó a cabo la inmunoprecipitación con un anticuerpo solubles del humo de cigarrillo, y el H202, todos indujeron la fosforilación de tirosina especifica de EGF-R en un período de 15 minutos, un efecto que fue similar al alcanzado por el TGFa, El tratamiento previo de las células NCI-H292 con AG1478 de la fosforilación inhibida de tirosina EGF-R para todos los estímulos. El sobrenadante inhibido por DMSO, humo de cigarrillo, y fosforilación de tirosina EGF-R por inducida por H202, pero el DMSO no tuvo efecto en la fosforilación de tirosina EGF-R inducida por TGFa. Los resultados anteriores muestran que los neutrófilos ocasionan la síntesis de mucina MUC5AC en las células NCI-H292 cuando son activadas con IL-8, fMLP ó TNFa. Además, el sobrenadante que fue recolectado 1 hora después de la incubación de los neutrófilos con TNFa ocasionó la síntesis de MUC5AC, un efecto que fue inhibido por los inhibidores selectivos de cinasa de tirosina EGF-R. La inhibición de la cinasa de tirosina EGF-R bloqueó completamente la síntesis de MUC5AC ocasionada por el sobrenadante de los neutrófilos activados; un inhibidor de cinasa de tirosina diferente al EGF-R, un inhibidor de cinasa del receptor selectivo de factor de crecimiento derivado de plaquetas (AG1295), y un control negativo para la tirfostina (A1), no tuvieron efecto, implicando la fosforilación de tirosina EGF-R como una trayectoria de señalización de la síntesis de MUC5AC, inducida por el sobrenadante de los neutrófilos activados. Para analizar de manera adicional el mecanismo por el cual, los sobrenadantes de los neutrófilos activados inducen la fosforilación de tirosina EGF-R, se examinaron tanto las trayectorias de EGF-R independientes del ligante, como la trayectorias dependientes del ligante. Primero, se midió el TGFa en el sobrenadante de los neutrófilos activados y se encontró que el sobrenadante no contenía cantidades mensurables de TGFa. Los reportes anteriores mostraron que los neutrófilos solamente contenían concentraciones bajas de TGFa (2.5 pg / células 10?). El efecto del sobrenadante de los neutrófilos activados en la síntesis de MUC5AC fue tan potente como el efecto de 1ng de TGFa, el cual fue 400 veces más alto que la cantidad de TGFa encontrada en los neutrófilos. Segundo, se realizaron estudios de bloqueo con anticuerpos neutralizantes de los ligantes EGF-R: El tratamiento previo de los anticuerpos neutralizantes al EGF y TGFa falló en la inhibición de la síntesis de la MUC5A causada por el sobrenadante de los neutrófilos activados. Estos resultados sugieren que la síntesis de la MUC5AC inducida por el sobrenadante de neutrófilos no fue debida a la secreción de ligantes EFG-R (TGFa y EGF) por los neutrófilos. Después, se examinó la trayectoria independiente del ligante: debido a que se sabe que los radicales libres de oxígeno son liberados por los neutrófilos durante la activación, y se sabe que causan la transactivación de la ciansa de tirosina EGF-R en diferentes células, se hipotetizó que la liberación de radicales libres de oxígeno por los neutrófilos activados ocasionó la fosforilación de tirosina EGF-R, y la síntesis de MUC5AC resultante en las células NCI-H292. Los supresores de radicales libres (DMSO y DMTU) y SOD inhibieron la síntesis de MUC5AC por el sobrenadante de los neutrófilos activados. Se reportó que el TNFa ocasionó un estallido oxidativo en los neutrófilos en suspensión, como una respuesta máxima de un período de 1 hora; los resultados actuales muestran un curso de tiempo similar.
En el estudio actual, el H202 exógeno, un producto principal liberado de los neutrófilos durante el estallido oxidativo, ocasionó la síntesis de la UC5AC en las células NCI-H292. Sin embargo, la respuesta máxima al H2O2 en la síntesis de MUC5AC solamente fue la mitad de la respuesta al TGFa. Un descubrimiento importante en el presente estudio es el hecho de que el humo de cigarrillo sólo causó la síntesis de MUC5AC. Esto sugiere que el humo de cigarrillo podría causar la síntesis de MUC5AC ¡n vivo, tanto a través del estímulo directo como a través del estimulo indirecto causado por el reclutamiento de neutrófilos. Las moléculas exactas en el humo de cigarrillos que causan la síntesis del MUC5AC todavía no está claro. El humo de cigarrillo ha mostrado tener productos múltiples (nicotina, alquitrán, acroleína y oxidantes). En otros experimentos, el DMSO y el SOD inhibieron parcialmente la síntesis de MUC5AC inducida por el humo de cigarrillo. Por lo tanto, la tensión de los oxidantes podría ser un mecanismo productor de esta respuesta. El hecho de que la síntesis de MUC5AC inducida por el humo del cigarrillo fue completamente bloqueada por los inhibidores de cinasa de tirosina EGF-R indica que la activación del EGF-R juega un rol principal en la síntesis de MUC5AC inducida por el humo de cigarrillo. En las enfermedades de las vías respiratorias, la inflamación neutrofílica de las vías respiratorias es una característica común, y los neutrófilos son reclutados y activados por las citosinas, y por el humo de cigarrillos. Los estudios actuales muestran que los neutrófilos y el humo de cigarrillo reclutados también actúan como reguladores de la diferenciación celular del epitelio que es el resultado de la inducción de las células que producen mucina en las vías respiratorias. Lo que es más importante, la inhibición de la activación EGF-R será útil como terapia en enfermedades hipersecretorias de las vías respiratorias. Ejemplo 3 Las Heridas del Epitelio de las Vías Respiratorias Ocasionan la Metaplasia de las Células Goblet Se hipotetizó que los tapones de agarosa instilados en las vías respiratorias se alojarían crónicamente en los bronquios y sin obstruirlos, y que los tapones residentes ocasionarían la inflamación dando como resultado la metaplasia de células goblet. Se ha mostrado que los tapones de agarosa inducen una producción local marcada de células goblet, tal y como lo muestra la tinción positiva PAS/azul alciano, y la expresión del gen mucina de MUC5AC, asociado con el reclutamiento local de células inflamatorias. Los resultados implican la activación del EGF-R en la metaplasia de células goblet inducida por el tapón. Métodos Animales. El protocolo experimental de animales fue aprobado por el Comité sobre Investigación en Animales de la Universidad de California, San Francisco. Se utilizaron ratas macho F344 libres de patógenos específicas (de 230 a 250 g de peso corporal; Símonsen Lab., Gilroy, CA). Las ratas fueron alojadas en jaulas BioClean libres de patógenos con campanas de flujo laminar controlado ambientalmente; y los animales tenían acceso libre al alimento y agua estéril. Fármacos. Se utilizaron fármacos de las siguientes fuentes: ciclofosfamida (Sigma, St. Louis, MO), sodio metohexital (Brevital, Jones Medical Industries, Inc., St. Louis MO), pentobarbital sódico (Nembutal, Abbott Lab., North Chicago, IL); BIBX1522, un inhibidor selectivo de cinasa de tirosina EGF-R (proporcionado generosamente por Boehringer Ingelheim, Inc., Ingelheim, Alemania), se disolvieron en la siguiente solución: 2ml de polietilónglicol 400 (Sigma, St. Louis, MO), 1ml de HCI 0.1 N, y 3 mi de solución de manitol al 2% en agua (pH 7.0). El NPC 15669 (un inhibidor de la movilidad de leucocitos) fue proporcionado bondadosamente por Scios Nova, Inc., Mountain View, CA. Tapones de agarosa. Se hicieron tapones de agarosa (con un diámetro de 0.7 a 0.8mm) con EEO medio del tipo II de agarosa al 4% (Sigma, ST. Louis, MO) en una solución salina regulada por fosfato estéril (PBS). Para visualizar los tapones de agarosa en el tejido, se agregaron después de la fusión de la agarosa a una temperatura de 50°C, azul B Monastral en suspensión al 3% (Sigma, St. Louis, MO). Protocolo de los experimentos. Se estudiaron ratas libres de patógenos, debido a que ellas generalmente tienen pocas células goblet en las vías respiratorias. Los animales fueron anestesiados con sodio de metohexital (Brevital, 25 mg/kg, i.p.) La traque fue expuesta asépticamente con una incisión cervical de línea media, y los tapones de agarosa fueron insertados dentro del bronquio por medio de un Angiocatéter de calibre 20 (Becton Dikinson, Sandy, UT) conectado a un entubado de polietileno (PE 90, diámetro interno, 0.86mm, y diámetro exterior 1.27 mm Clay Adams, Parsippany, NY), enroscados dentro de la traquea operada. El tubo de polietileno fue doblado en un ángulo de 30° para permitir la instilación selectiva dentro del bronquio derecho. Después de la instilación la incisión fue cerrada con una sutura. Con el objeto de evaluar el rol del EGF-R en la metaplasia de células goblet inducidas por el tapón de agarosa, los animales fueron tratados con BIBX1522 (80 mg/kg, i.p.) 1 hora antes de la instilación de los tapones de agarosa, y repetido diariamente (40 mg/kg, i.p, bid). Los animales fueron sacrificados, 24, 48 ó 72 horas después de la instilación de los tapones de agarosa. Para evaluar el rol de TNFa en la metaplasia de las células goblet inducidas por el tapón de agarosa, los animales fueron tratados con un anticuerpo neutralizante de TNFa (Genzyme, Boston, MA). El primer tratamiento (100 µ? en solución salina 0.2 mi, i.p.), se administró 1 hora antes de la instilación de los tapones de agarosa. Las inyecciones intraperitoneales se repitieron diariamente. Además, se infundió un anticuerpo neutralizante de TNFa (10 µ?/h) por medio de una minibomba osmótica (Alzet 2ML 1, Alza Copr., Palo Alto, CA) implantada subcutáneamente. Para estudiar el efecto de los neutrófilos en la metaplasia de células goblet inducida por el tapón de agarosa, las ratas fueron tratadas previamente con ciclofosfamida (un inhibidor de leucocitos de medula ósea), o con una combinación de ciclofosfamida más NPC15669. La ciclofosfamida (100 mg/kg, i.p.), fue administrada 5 días antes de la instilación de los tapones de agarosa, y se administró una segunda inyección de ciclofosfamida (50 mg/kg, i.p ), un día antes de la instilación de los tapones. En los estudios con NPC 15669, el fármaco (10 mg/kg, i.p.) fue inyectado 1 hora antes de la instilación de los tapones de agarosa, y luego diariamente durante los tres días siguientes. Todos los fármacos (BIBX1522, el anticuerpo neutralizante de TNFa, la ciclofosfamida, y el NPC 15669), fueron administrados i.p. 1 hora antes de la instilación de los tapones de agarosa, y la dosis se repitió diariamente durante 3 días. Preparación del tejido. En varias ocasiones después de la instilación del tapón de agarosa, las ratas fueron anestesiadas con pentobarbital sódico (65 mg/kg, i.p.), la circulación sistémica fue perfundida con paraformaldehído al 1% en PBS tratado con pirocarbonato dietilo a una presión de 120 mmHg. El pulmón derecho fue removido, y el glóbulo caudal derecho fue utilizado para la histología. En las secciones para ser congeladas, los tejidos fueron removidos y colocados en formaldehído al 4% durante 1 hora y posteriormente, se reemplazó por una sacarosa al 30% para la crioprotección durante la noche. Los tejidos fueron incrustados en los compuestos O.C.T. (Sakura Finetek U.S. A., Inc., Torrance, CA). Para las secciones de metacrilato, los tejidos fueron colocados en formaldehído al 4% durante 24 horas, y posteriormente deshidratados con concentraciones graduadas de etanol e incrustados en metacrilato JB-4 (Polysciences, Inc., Warrington, PA). Las secciones de tejidos (con un espesor de 4µ??) fueron teñidas con azul alciano/PAS y contrateñidas con hematoxilina. Análisis morfométrico del epitelio bronquial. El porcentaje del área teñida con azul alciano/PAS de los glucoconjugados mucosos del epitelio fue determinado utilizando un sistema de análisis de imagen semiautomático de acuerdo con los métodos publicados anteriormente. El área del epitelio y los conjugados de mucosa teñidos con azul alciano/PAS dentro del epitelio fueron circunscritos manualmente y analizados utilizando un programa de imagen NIH (desarrollado en Los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos, y disponibles en internet por FPT anónimos, y a partir de diskettes del National Technical Information Service, Springfield, Virginia; parte número PB95-500195GEI). Los datos son expresados como el porcentaje del área epitelial total ocupada por la tinción azul Alciano/PAS. Para evaluar semicuantitativamente la secreción mucosa, se determinó el porcentaje de la longitud de la superficie epitelial ocupada por la tinción de PAS-positivo/azul alciano calculando la longitud que se tiñó positivamente como una proporción de la longitud total. El porcentaje del epitelio desnudado fue determinado calculando la proporción de la longitud del epitelio desnudado con la longitud total del epitelio.
Identificación de tipo celular en secciones de metacrilato y análisis celular. El número total de células epiteliales fue determinado contando los núcleos de células epiteliales sobre 2 mm de lámina basal con lentes de objetivo de inmersión en aceite (magnificación x1000). Se determinó la longitud lineal de la lámina basal bajo cada región analizada del epitelio, rastreando el contorno de la imagen digitalizada de la lámina basal. Las células epiteliales fueron identificadas tal y como se describió anteriormente. Brevemente, las células básales fueron identificadas como células aplanadas con un núcleo grande, localizadas justamente arriba de la lámina basal pero que no alcanzaban el lumen respiratorio. El citoplasma teñido de manera obscura, y los gránulos de azul alciano y PAS positivo no estuvieron presentes. Las células ciliadas fueron reconocidas por sus bordes ciliados, un citoplasma ligeramente teñido, y un núcleo redondo grande. Las células secretorias no granuladas fueron de forma de columna y se extendieron desde el lumen bronquial hasta la lámina basal. Después de la instilación intrabronquial de los tapones de agarosa, se formó el "desarrollo" de las células goblet (células pre-goblet). Estas células mostraron una tinción de azul alciano/PAS positivo, los gránulos fueron pequeños, y las células no fueron empacadas con los gránulos; y contenían áreas teñidas de mucosa más pequeñas (<1/3 de la altura en el epitelio desde la base de la membrana a la superficie luminal) o escasamente y ligeramente teñidas con PAS/azul alciano, y pequeños gránulos. Las células de tiempo indeterminado son definidas como perfiles celulares que carecen de características citoplásmicas suficientes para una categorización apropiada. Localización Inmunohistoquímica de EGF-R. La presencia de EGF-R fue determinada por la localización inmunohistoquímica, utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón para EGF-R (Calbiochem, San Diego, CA). Secciones congeladas de 4 ?? anteriormente preparadas fueron post-fijadas con paraformaldehído al 4%, y tratadas con 0.3% de H202/metanol. Los tejidos fueron incubados con el anticuerpo EGF-R (dilución 1:250). El igG anti-ratón de caballo biotinilado (1:200; Vector Lab., Burlingame, CA), seguido por el complejo de estreptavidina-peroxidasa (ABC kit, Vector Lab., Burlingame, Ca). Fue utilizado para visualizar los complejos de antígenos-anticuerpo teñidos con tetraclorohidrato de 3,3'-diaminobencidina (Sigma, St. Louis, MO). Los portaobjetos de control negativo fueron incubados, ya sea con el anticuerpo primario o secundario omitido o reemplazado con PBS. Hibridación In Situ. Se generaron ribomuestras marcadas [35S] a partir de un plásmido con un contenido de un fragmento de cADN 320 bp o MUC5AC de rata proporcionado bondadosamente por el Dr. Carol Basbaum. Las secciones fueron hibridadas con muestras de ARN marcadas [36S] (2,500-3,000 cpm/µ? regulador de hibridación), y lavadas bajo condiciones severas, incluyendo un tratamiento con RNasa A. Después de la auto-radiografía durante 7 a 21 días, la emulsión fotográfica fue desarrollada, y las transparencias fueron teñidas con hematoxilina.
Conteo de neutrófilos en el epitelio de las vías respiratorias. La evaluación del influjo de neutrófilos en los bronquios fue realizada mediante la tinción de los neutrófilos con tetraclorhidrato de 3-3'diaminobencidina, y el número de neutrófilos fue contado en el lumen de las vías respiratorias y en el epitelio; los resultados se expresaron como el número de células teñidas por mm de la longitud de la lámina basal. Lavado bronquioalveolar (BAL). Para evaluar los conteos diferenciales de las células de cada grupo de animales, los pulmones fueron lavados cinco veces con alícuotas de 3 mi de PBS estéril, y los lavados fueron conjuntados y el volumen fue medido. Las células en el BAL fueron recolectadas por medio del movimiento circular del fluido del lavado a una velocidad 1,000 rpm durante 10 minutos. Entonces se contaron diez microlitros de una suspensión de células con un hematocitómetro para determinar el número de células en el fluido de BAL. Los conteos diferenciales de la célula se llevaron a cabo en preparaciones del citohilado, teñido con Diff-Quik (American Scientific Products, McGaw Park, IL). Los conteos diferenciales de células fueron obtenidos por medio del muestreo en al menos 200 células de cada portaobjetos de citohilado. Análisis estadístico. Los datos son expresados como promedios ± SE. Para el análisis estadístico, se utilizaron como apropiados el análisis de variación de dos vías o de una vía (ANOVA) seguido por la prueba t del Estudiante. Se consideró una diferencia estadística importante una probabilidad de menos de 0.05.
Resultados Efecto en la estructura epitelial de las vías respiratorias: Metaplasia de células Goblet. Para determinar si los tapones de agarosa afectaron la estructura del epitelio de las vías respiratorias, los tapones de agarosa fueron instilados dentro del bronquio derecho en 5 ratas libres de patógenos. En los animales de control, el epitelio bronquial contenía pocas células goblet. Sin embargo, después de la instilación local de los tapones de agarosa, la tinción de PAS/azul alciano mostró un aumento dependiente del tiempo en el área de las células goblet, el cual fue detectable tan pronto como a las 24 horas, y fue mayor 72 horas después de la instilación. A las 24 horas, los tapones de agarosa produjeron aumentos importantes en el número de células pre-goblet y goblet, y a las 48 horas, se encontraron células goblet más maduras (Tabla 1). A las 72 horas, los tapones de agarosa aumentaron el número de células goblet (P < 0.01); el número de células básales y ciliadas no cambió (P > 0.05). El número total de células epiteliales por mm de lámina basal 72 horas después de la instilación fue aumentado ligeramente pero no de manera importante (P > 0.05, Tabla 1); la altura del epitelio (medida desde la membrana de la base a la superficie luminal del epitelio) aumentó de 16.0 ± 1.2 µ?? en las vías respiratorias de control al 38.1 ± 9.1 µ? a las 72 horas posteriores a la instilación de los tapones (n = 5, P < 0.01). En el lumen de las vías respiratorias de los animales de control, no existió tinción de azul alciano/PAS. Sin embargo, adyacente a los tapones de agarosa, se vio una tinción positiva en el lumen, indicando que había ocurrido una secreción de glucoconjugados de mucosa. En las vías respiratorias con tapones de agarosa, la tinción aumentó dependiendo del tiempo. El porcentaje de la longitud total del epitelio ocupado por la tinción PAS-positiva/azul alciano en las vías respiratorias adyacentes a los tapones aumentó de 0.1 ± 0.1% en los animales de control a 4.7 ± 1.4%, 13.3 ± 0.7%, y a 19.1 ± 0.7% las 24 horas, 48 horas y 72 horas (n = 5). Además, los tapones de agarosa desnudaron el epitelio de los bronquios taponados por 13.5 ± 2.3%, 6.9 ± 2.4%, y 5.1 ± 1.5% del área total a las 24, 48, y 72 horas, respectivamente (n = 5). Efecto de los tapones de agarosa en la expresión del gen mucina. En las ratas de control, no existe una señal detectable con la muestra antisentido del MUC5AC en los bronquios (n = 4 por grupo). En los bronquios en donde fueron instilados los tapones de agarosa, existió una señal para la MUC5AC que aumentó dependiendo del tiempo de 24 a 72 horas (n = 4). La expresión del gen UC5AC se encontró preferentemente en las células que se tiñeron positivamente con PAS/azul alciano. No se detectaron señales en otros tipos celulares (por ejemplo, el músculo liso, y el tejido conectivo). Las secciones examinadas con la muestra MUC5AC sentido, no mostraron expresión. Efecto de los tapones de agarosa en la expresión del EGF-R en el epitelio de las vías respiratorias. En los animales de control, la inmunotinción con un anticuerpo del EGF-R mostró una tinción escasa en el epitelio. Sin embargo, después de la instilación de tapones de agarosa, el epitelio adyacente a los tapones de agarosa mostró una tinción EGF-R positiva en las células que se tiñeron positivamente con PAS/azul alciano. El patrón de tinción para el EGF-R fue paralelo a la tinción para el MUC5AC y el AB/PAS. Las células pre-goblet, goblet y secretorias no granuladas, fueron inmunopositivas para el EGF-R. Las células ciliadas no mostraron inmunoreactividad. En las vías respiratorias no obstruidas por los tapones de agarosa, el epitelio mostró poca tinción para el EGF-R, y pareció similar a la tinción en los animales de control. Efecto del inhibidor de cinasa de tirosina EGF-R en la metaplasia de célula goblet y en la expresión del gen mucina. En los estudios actuales, la instilación de la tapones de agarosa dio como resultado la expresión del EGF-R en las células que producen mucinas. El EGF-R es un miembro de la clase de receptores de cinasa de tirosina. Por lo tanto, cuando los ligantes de EGF-R (EGF ó TGF ), se enlazaron al EGF-R, y se activó una cinasa de tirosina EGF-R específica. Por lo tanto, para probar la hipótesis de que la activación del EGF-R induce a la expresión del gen MUC5Ac y los glucoconjugados de mucosa después de la instilación de los tapones de agarosa, un inhibidor de cinasa de tirosina EGF-R (BIBX1522) fue inyectado intraperitonealmente en las ratas. El BIBX1522 inhibió de manera marcada el área teñida con PAS/ azul alciano inducida por los tapones de agarosa del epitelio a las 24, 48 y 72 horas. También se inhibió completamente la expresión del gen UC5AC a las 72 horas posteriores a la instilación del tapón. Efecto del anticuerpo neutralizante del TNF en la metaplasia de células goblet, y en la expresión de la proteína EGF-R. Nosotros hipotetizamos que el TNFa es liberado durante la inflamación causada por los tapones de agarosa. Por lo tanto, se examinaron los efectos del tratamiento previo de las ratas con un anticuerpo neutralizante del TNFa en la metaplasia de la célula goblet inducida por los tapones de agarosa: En los animales tratados previamente con el anticuerpo neutralizante de TNFa (n = 5), los tapones de agarosa ya no estimularon la expresión de la proteína EGF-R o la producción de células (goblet) teñidas positivamente con PAS/azul alciano. Reclutamiento de células inflamatorias por medio de los tapones de agarosa. Se observó que los tapones de agarosa causan daño en el epitelio y la infiltración de células inflamatorias. Varias células inflamatorias pueden producir, tanto los ligantes TNFa como EGF-R. Tanto el EGF-R como sus ligantes están involucrados en la cascada de EGF-R que conduce a la metaplasia de células goblet. Se evaluaron los roles de los leucocitos y los macrófagos en los efectos inducidos por el tapón de agarosa de dos maneras. Primero, se examinaron las células en el lavado bronquioalveolar: En las ratas de control, los macrófagos fueron las células predominantes recuperadas (n = 5; figura 4, Control). Después de la instilación de los tapones de agarosa, el número de macrófagos aumentó (P < 0.05), y aparecieron en el líquido de lavado, números importantes de neutrófilos (P < 0.01). El número de linfocitos no cambió. También se evaluaron las células de infiltración en las secciones del tejido: las vías respiratorias sin tapones de agarosa contenían pocos neutrófilos, pero las vías respiratorias que contenían tapones mostraron la presencia de neutrófilos, tanto en el epitelio como en el lumen. El número de neutrófilos en el lumen de las vías respiratorias fue de 0.2 ± 0.2, 42.4 ± 7.1, 40.7 ± 7.7, y 20.1 ± 7.2/mm de la lámina basal en las vías respiratorias de control y en las 24, 48, y 72 horas posteriores a la instilación de los tapones, respectivamente (P < 0.05, n = 5). Además, el número de neutrófilos en el epitelio de las vías respiratorias fue de 1.3 ± 0.4, 15.6 ± 2.6, 14.9 ± 1.4, y 14.8 ± 2.6/mm de la lámina basal en el control, y a las 24, 48, y 72 horas posteriores de los tapones respectivamente (P < 0.01 , n = 5). Efecto de la ciclofosfamida en el reclutamiento de neutrófilos, metaplasia de células goblet, y expresión de la proteína EGF-R. En las ratas tratadas con ciclofosfamida, los neutrófilos sanguíneos fueron agotados (conteo de neutrófilos en la sangre venosa después de la ciclofosfamida, 1.8 ± 0.5%, n = 5), y el reclutamiento de neutrófilos inducido por el tapón en el BAL fue inhibido. El número de neutrófilos en el lumen de las vías respiratorias (2.6 ± 0.3/mm de la lámina basal) y en el epitelio (0.8 ± 0.2/mm) también disminuyó de manera importante a las 24 horas. La ciclofosfamida también inhibió la metaplasia de células goblet inducida por el tapón de agarosa y la expresión de la protelna EGF-R. Cuando se agregó leumedina, NPC 15669 a la ciclofosfamida, la inhibición de la metaplasia de células goblet inducidas por el tapón de agarosa fue similar al efecto de la ciclofosfamida sola. Estos resultados implican neutrófilos en la metaplasia de las células goblet inducida por el tapón. Explicación En el estudio presente, se examinaron los efectos de la instilación de tapones de agarosa en la metaplasia de células goblet en las vías respiratorias de ratas libres de patógenos, las cuales tienen muy pocas células goblet en su condición de control. Las células del epitelio en los bronquios de los animales de control y los bronquios sin tapones de agarosa (pulmones de control) se tiñeron negativamente de manera uniforme con PAS/azul alciano. La instilación de los tapones de agarosa dio como resultado un aumento profundo dependiente del tiempo en el área de células goblet del epitelio bronquial adyacente a los tapones instilados, el cual fue detectable dentro de las 24 horas y fue mayor en aproximadamente 72 horas posteriores a la instilación. Las vías respiratorias adyacentes a las vías respiratorias taponadas también se tiñeron positivamente con PAS/azul alciano. El número total de células y el número de células básales y ciliadas no cambió, pero el número de células goblet aumentó y el número de células secretorias no granuladas disminuyó dependiendo del tiempo después de la instilación de tapones de agarosa (Tabla 2). Estos resultados sugieren que la metaplasia de células goblet fue el resultado de la conversión de las células secretorias no granuladas en células goblet. Tabla 2 Efecto de los tapones de agarosa en la distribución de las células del epitelio bronquial en ratas libres de patógenos *.
Las células fueron analizadas tal y como se describe en los Métodos; n = 5 en cada grupo. La caracterización fue auxiliada por la tinción de PAS/azul alciano (el cual tiñe los glucoconjugados de mucosas). Las vías respiratorias de control contenían pocas células pre-goblet y células goblet. Después de la instilación de los tapones de agarosa, hubo un aumento dependiente del tiempo (24, 48, 72 horas) en el número de células pre-goblet y goblet y una disminución en el número de células secretorias no granuladas comparadas con los animales de control. * Los datos son promedios ± SE, números de células/mm de lámina basal. i P < 0.05 comparados con el control.
P < 0.01 comparados con el control. ' Las células carecen de características citoplásmicas suficientes para la categorización. Se ha reportado que las células goblet en las vías respiratorias de las ratas expresan el gen MUC5AC. En los estudios presentes, los bronquios de control no expresaron el gen MUC5AC, pero las vías respiratorias obstruidas por los tapones o adyacentes a los tapones, las cuales se tiñeron positivamente con PAS/azul alciano, expresaron el gen MUC5AC, sugiriendo que el gen MUC5AC está involucrado en la producción de mucosa inducida por el tapón de agarosa. Estos resultados indican que los tapones de agarosa inducen la expresión de los genes mucina y la producción de glucoconjugados de mucosa en las células seleccionadas de las vías respiratorias de las ratas. El mecanismo de metaplasia de las células goblet inducido por los tapones de agarosa fue examinado. El EGF-R no es expresado normalmente en el epitelio de las vías respiratorias de las ratas libres de patógenos, pero es inducido por el TNFa. En la presencia de EGF-R en el epitelio, la instilación de ligantes de EGF-R (EGF ó TGFoc) da como resultado un aumento en el gen mucina y la expresión de la proteína. Un inhibidor selectivo de la cinasa de tirosina EGF-R (B1BX1522) inhibe completamente estas respuestas, implicando la señalización EGF-R en la metaplasia de células goblet. El efecto del BIBX1522 en la metaplasia de células goblet inducida por tapones de agarosa fue determinado: el BIBX1522 inhibió la producción de glucoconjugados de mucosa inducida por los tapones de agarosa y la expresión del gen MUC5AC. Estos resultados implican una cascada de EGF-R en la metaplasia de células goblet inducida por el tapón de agarosa. También fueron estudiados los mecanismos por medio de los cuales la cascada de EGF-R causa la metaplasia de las células goblet con los tapones de agarosa. Primero, se estudió la expresión de la proteína EGF-R en el epitelio bronquial. Las vías respiratorias de control teñidas negativamente de manera uniforme para el EGF-R, pero las vías respiratorias que contienen los tapones de agarosa mostraron una tinción positiva para el EGF-R dependiente del tiempo selectiva. Las células teñidas positivamente incluyeron células secretorias no granuladas pre-goblet, y goblet. Por lo tanto, la expresión de la proteína EGF-R inducida por los tapones de agarosa. Las ratas que fueron tratadas previamente con un anticuerpo neutralizante para el TNFa no desarrollaron la metaplasia de células goblet inducida por el tapón de agarosa implicando el TNFa en la expresión EGF-R inducida por el tapón de agarosa. La ciclofosfamida, un fármaco que deprime de manera selectiva la producción de leucocitos, evitó el reclutamiento de neutrófilos en el fluido de lavado de las vías respiratorias y dentro del epitelio de las vías respiratorias después de la instilación de los tapones de agarosa y también previno la metaplasia de las células goblet inducidas por el tapón de agarosa. También se aumentaron los macrófagos después de la introducción de los tapones de agarosa, pero la ciclofosfamida no exhibió el reclutamiento de macrófagos.
Estos resultados implican neutrófilos en la metaplasia de células goblet inducida por tapones de agarosa. El hecho de que la ciclofosfamida también disminuyó la expresión de la proteína EG F-R después de los tapones de agarosa sug iere q ue los neutrófilos contri buyen , al menos en parte, a la expresión del EGF-R en esta condición inflamatoria . Los neutrófilos también tienen la capacidad de producir ligantes EG F-R, EGF y TGFa. Además, las células del epitelio son fuentes de los ligantes EG F-R, y hu bo un desn udamiento golpeado del epitelio adyacente a los tapones de agarosa. Por lo tanto, el epitelio podría ser una fuente potencial i mportante, tanto de los ligantes TN Fa como del EGF-R. Se supone razonablemente, que el estímulo efectivo de los tapones de agarosa está relacionado con el movimiento de los tapones durante la respiración , con la abrasión subsecuente del epitelio. La lesión mecán ica al epitelio de las vías respiratorias ha sido reportada como causante de la hipersecreción . Estos estudios anteriores le dan credibilidad a la hipótesis de que el trauma mecánico al epitelio de las vías respi ratorias conduce a la hipersecreción . Se reporta que la intubación orotraqueal da como resultado u na secreción de mucosa abundante en los caballos. La intubación crónica en los pacientes podría causar la hipersecreción de mucosa y podría ser responsable del taponado por mucosa. Los i n hibidores de la cinasa de tirosina EGF-R podrían servir para evitar la hipersecreción de mucosa, después de la intubación traq ueal .
El daño del epitelio es un descubrimiento común en los estudios de pacientes aún con asma media, y el daño está relacionado de manera creciente con el agravamiento de los síntomas clínicos. El daño del epitelio producido por respuestas alérgicas puede inducir a la activación del EGF-R, lo cual da como resultado una producción anormal de células goblet. Los datos presentados anteriormente implican la activación del EGF-R en una respuesta diferente, específicamente comprendiendo la metaplasia de células goblet. El daño mecánico al epitelio, y la lesión al epitelio en el asma puede comprender una cascada similar (EGF-R) que da como resultado la proliferación anormal de células secretorias epiteliales. Esto proporciona un mecanismo para la hipersecreción que ocurre en casos fatales de asma aguda. Ejemplo 4 Reqranulación de células goblet por medio de los Receptores de EGF La desgranulación de las células goblet en el epitelio respiratorio nasal de las ratas fue inducido por medio de la inhalación intranasal de fMLP. La desgranulación importante fue inducida en el epitelio septal nasal 4 horas después de la inhalación intranasal de fMLP (10"7M). La regranulación de las células goblet ocurrió a las 48 horas posteriores a la inhalación. En la condición de control, la proteína MUC5AC fue expresada en las células goblet, pero la proteína EGF-R no fue expresada. Tanto el gen EGF-R como el MUC5AC mucina y la proteína estuvieron ausentes en el epitelio de control, pero fueron expresados de manera importante 48 horas después de la inhalación. El tratamiento previo con un inhibidor de cinasa de tirosina EGF-R, BIBX1522, inhibió el gen UC5AC mucina y la expresión de la proteína después de la desgranulación de las células goblet inducida por fMLP. Estos resultados indican que la expresión del EGF-R y la activación están comprendidos en la regranulación de las células goblet en el epitelio nasal de las ratas. MÉTODOS Animales. El protocolo experimental de animales fue aprobado por el Comité de Investigación en Animales de la Universidad de California, San Francisco. Se utilizaron ratas machos F344 libres de patógenos especificas (de 200 a 230 gramos de peso corporal; Simonsen Lab, Gilroy, CA). Los animales fueron alojados en jaulas BioClean libres de patógenos con campanas de flujo laminar controladas ambientalmente; y los animales tuvieron acceso libre al alimento y agua estéril. Preparación del Tejido Nasal. En diferentes momentos posteriores a la inhalación, las ratas fueron anestesiadas con pentobarbital sódico (65 mg/kg, i.p.). El corazón del animal fue expuesto, una aguja con una punta roma fue insertada desde el vórtice del ventrículo izquierdo dentro de la aorta ascendente, y la circulación sistómica fue perfundída con 1% de paraformaldehído. Una incisión en el atrio derecho proporcionó una salida para el fijador. Los ojos, mandíbulas inferiores, la piel y la musculatura fueron removidos, y la cabeza fue sumergida en un volumen grande del mismo fijador durante 24 horas. Después de la fijación , la cabeza fue descalcificada con Surgipath (Decalcifier I I , Surgical Medical I nd ustries, I nc. , Richmond , IL) durante un período de 4 a 5 días, y enjuagados en una solución sali na regu lada por fosfato. La cavidad nasal fue seccionada transversalmente en el nivel de la papila incisiva del paladar nasal . El bloque del tejido frontal fue incrustado en metacrilato de glicol (JB 4 Plus, Polysciences, I nc. , Warrington , PA), o en un compuesto OCT (Saku ra Finetek, E. U .A. , Inc. , Torrance , CA) para las secciones congeladas . Se cortaron secciones de un espesor de cinco µ?? de la superficie anterior de los bloques i ncrustados en metacrilato de glicol y fueron teñidos después, ya sea con azul alciano (pH 2.5)/o ácido Schiff peryódico (AB/PAS) para demostrar el ácido y los glucoconjugados neutrales, o 3,3'-diaminobencidina (Sigma Chemical , St. Louis, MO) para visualizar los leucocitos que hablan emigrado en el epitel io . Se cortaron secciones con un espesor de ci nco µ?t? de las su perficies anteriores de los bloques incrustados congelados y fueron teñidos con AB/PAS o usados para la inmunotinción de EGF-R y MUC5AC . Conteo de Neutrófilos en el Epitelio Nasal . Los neutrófilos fueron contados en campos de alta potencia de la capa epitelial teñida con 3 ,3'-d iami nobencidi na en una magnificación x400. El número de neutrófilos dentro del epitelio nasal sepal (desde la membrana de la base a los ápices celulares) fue determinado mediante el conteo del número de perfiles nucleares por unidad de la longitud de la lámina basal.
Cuantificación de la Desgranulación y Regranulación de Células Goblet. Para evaluar la desgranulación y regranulación de células goblet, se midió la densidad del volumen de las mucosubstancias teñidas con PAS/azul alciano en el epitelio de la superficie de la mucosa utilizando un sistema de elaboración de imagen semiautomático de acuerdo con un método publicado anteriormente. Se examinaron las tiras de tinción con un microscopio Axioplan (Zeiss, Inc.), el cual fue conectado a una unidad de control de cámara de video (DXC7550 D; Sony Corp. of America, Park Ridge, NJ). Las imágenes del epitelio nasal fueron grabadas en campos de alta potencia con un lente de contraste de fase en x400, utilizando un Sistema de Video IMAXX (PDI, Redmond, WA). La mucina intracelular en las células secretorias superficiales del epitelio parecen tener forma ovalada, gránulos morados, de tamaños variables. Se midieron las áreas teñidas con PAS-positivo/azul alciano y el área total del epitelio, y se expresaron los datos como el porcentaje del área PAS/azul alciano al área total. El análisis se llevó a cabo en una computadora Macintosh 9500/120 (Apple Computer, Inc., Cupertino, CA), utilizando un programa de elaboración de imagen NIH del dominio público. Inmunolocalización de EGF-R y proteína MUC5AC. Las secciones congeladas del tejido nasal fijado con paraformaldehído fueron tratadas con H202 al 3%/metanol para bloquear el peróxido endógeno y fueron incubadas con un anticuerpo monoclonal de ratón para EGF-R (Calbiochem, San Diego, CA), o MUC5AC (NeoMarkers Inc., Fremont, CA) durante 1 hora en una dilución de 1:100. El EGF-R inmunorreactivo o el MUC5AC fue visualizado con un equipo Vectastain Elite ABC un equipo (Vector Lab., Inc., Burlingame, CA) utilizando tetraclorhidrato de 3,3-diaminobencidina como cromogen. Los controles incluyeron la substitución de anticuerpo primario y secundario con PBS. Métodos. Se estudiaron ratas libres de patógenos, las cuales normalmente tienen muchas células goblet en el epitelio nasal septal. Para determinar el efecto del fMLP aerosolizado en la desgranulación de las células goblet y en la migración de neutrófilos en el epitelio de la mucosa nasal, los animales fueron anestesiados con pentobarbital sódico (65 mg/kg, i.p.), y recibieron N-formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP; 10"6 M, Sigma, St. Louis, MO) en solución salina libre de pirógenos intranasalmente por medio de aerosol durante 5 minutos. La exposición al aerosol fue realizada por medio de la ventilación de los animales con un nebulizador ultrasónico (PulmoSonic, DeVilbiss Co., Somerset, PA) que generó un rocfo de aerosol en un rango de 0.3 ml/min. De un modo similar, a los animales de control se les administró aerosol de solución salina simple intranasalmente. Para estudiar la regranulación de las células goblet nasales después de la inhalación del aerosol fMLP, las ratas fueron sacrificadas 48 horas después de la administración intranasal del fMLP.
Con el objeto de evaluar el efecto de la activación de la cinasa de tirosina EGF-R en la regranulación de las células goblet, los animales fueron tratados previamente intraperitonealmente con un inhibidor de cinasa de tirosina EGF-R (BIBX1522, 15 mg/kg, proporcionado generosamente por Boehringer Ingelheim Inc., Ingelheim, Alemania), 30 minutos después de la inhalación de fMLP y se repitió dos veces al día. Estadísticas. Todos los datos están reportados como un promedio ± SEM. Se utilizaron el estudio ANOVA de una vía o la prueba t del Estudiante para cada grupo experimental. Una probabilidad menor del 0.05, se consideró como una diferencia estadística importante, Resultados Efecto de la desgranulación de célula goblet por medio del fMLP en la estructura del epitelio nasal. En la condición de control, el epitelio septai nasal contenía un área importante de células goblet teñidas con AB/PAS, pero la superficie luminal no estaba teñida. La inmunotinción para la proteína MUC5AC mucina correspondió al área de tinción AB/PAS, pero la hibridación in situ mostró poco o ninguna expresión del gen MUC5AC. La tinción inmunohistoquímica para la protelna EGF-R fue negativa. Estos resultados indican que el epitelio nasal de la rata de control contiene células goblet intactas que contienen proteína MUC5AC en ausencia de la expresión del gen de mucina. La ausencia de la tinción luminal sugiere que no estuvo presente la desgranulación (secreción) de mucina.
Se hipotetizó que el epitelio nasal de ratas no estimulado contiene células goblet no desgranuladoras "estables" que contienen proteínas mucina . Se ha mostrado que los quimioatrayentes de neutrófilos (por ejemplo, fM LP) recl uían neutrófilos en el epitelio de las vías respiratorias en donde ocasionan la desgranulación de las células goblet por medio de un proceso dependiente de la elastasa. Para exami nar el efecto de la desgranulación de las células goblet, se administró intranasal mente d u rante 5 minutos u n aerosol del quimioatrayente de neutrófilos, fMLP ( 1 0"7M). En las ratas eutanizadas 4 horas después de la administración del fM LP, el área teñida con AB/PAS y el área inmunoteñida de M UCSAC-positivo disminuyeron de una manera marcada el reclutamiento de neutrófilos que ocurrió en el epitelio nasal . La tinción AB/PAS fue prominente en la superficie l u minal de las vías respiratorias nasales , confirmando que la desgranulación de las células goblet había tenido lugar. A las 4 horas posteriores de la admin istración del fMLP, sin embargo, la expresión del gen M UC5AC no había cambiado. En las ratas eutanizadas 48 horas después de la administración del fMLP , la tinción ¡nmunohistoq u ímica, con u n anticuerpo de EGF-R tifió positivamente el EGF-R en las células pre-goblet y goblet en las áreas de la tinción de AB/PAS y MUC5AC i nmunopositiva regresó al nivel presente en el estado de control , indicando que había ocurrido la reg ranulación de las células goblet nasales. En este momento, ya no estuvo presente el reclutamiento de neutrófilos , la expresión del gen MU C5AC fue visible en el área ocupada por las células goblet, indicando que la regranulación de las células goblet estaba asociada con la expresión aumentada del gen mucina. Rol de la fosforilación de la cinasa tirosina EGF-R en la regranulación de células goblet. Estudios anteriores en las ratas reportaron que la activación de los receptores EGF (EGF-R) conduce a la expresión del gen mucina y la proteína. Para probar la hipótesis de que la activación del EGF-R juega un rol en la regranulación de las células goblet nasales de las ratas después de la administración del fMLP, las ratas fueron tratadas previamente (n = 5) con el inhibidor de cinasa tirosina EGF-R selectivo, BIBX1522; la aerosolización del fMLP ocasionó el reclutamiento de neutrófilos en el epitelio nasal y la desgranulación de las células goblet, pero 48 horas después, permanecieron disminuidas las áreas de tinción AB/PAS y tinción MUC5AC inmunopositiva. Estos resultados implican la activación de EGF-R en las síntesis de mucina en las células goblet nasales después de la desgranulación por medio del fMLP. En el estudio actual, examinamos la regulación de la producción de mucina en el epitelio nasal de las ratas. El epitelio de control contenía un número importante de células goblet, y la proteína MUC5AC estaba presente en estas células. Sin embargo, la expresión del gen MUC5AC estuvo ausente. La expresión de MUC5AC de mucina se reporta que ocurre en otras células del epitelio de las vías respiratorias por medio de la expresión del EGF-R y su activación. En las células del epitelio nasal de las ratas de control, no encontrarnos expresión del gen EGF-R o la proteína . No hubo tinción luminal para AB/PAS o la protelna M UC5AC, sugiriendo que no había tenido l ugar una desgranulación importante de las células goblet (secreción ). El EG F-R podría ser desactivado en las cél ulas goblet "estable", evitando una síntesis adicional de mucina. Por lo tanto, se "desafiaron" las células goblet nasales induciendo la desg ranulación de células goblet y examinamos los cambios posteriores en la estructura del epitelio de las vías respiratorias. Los q uimioatrayentes de neutrófilos causaron la desg ranulación de las células goblet dependientes de los neutrófi los en los conejillos de indias, y en las vías respiratorias humanas portada por la elastasa de neutrófi los, comprendiendo el contacto cercano entre los neutrófilos y las células goblet. Para induci r la desg ranulación de las células goblet normal mente presentes en el septo nasal, el quimioatrayente fMLP fue inhalado intranasalmente. El fMLP reclutó neutrófilos en el epitelio nasal , seg uidos por la desg ranulación de las células goblet; el área teñida con azul alciano/PAS dismi nuyó de una manera notable . Posteriormente, se exami naron los eventos subsecuentes en el epitelio nasal después de la desgran ulación de las células goblet inducida por el fMLP. 4 horas posteriores a la administración del fMLP, cuando había ocurrido la desgranulación máxima de las célu las goblet nasales, el EGF-R y la expresión MUC5AC permanecieron ausentes. Si n embargo, 48 después de la admi nistración del fM LP , el EGF-R se había expresado fuertemente en las células pregoblet y goblet. Ahora la expresión del gen UC5AC era expresada fuertemente en el epitelio, y estos eventos fueron asociados con la regranulación de las células goblet (tinción aumentada AB/PAS y UC5AC). De hecho, 48 horas después de la administración del fMLP, había ocurrido la regranulación hasta el punto en que el área de células goblet era similar al estado de control. Estos descubrimientos sugieren que la desgranulación de las células goblet conduce a la expresión y activación del EGF-R, induciendo de este modo la expresión del UC5AC mucina. Para examinar el rol de la activación de la cinasa de tirosina EGF-R en la regranulación de células goblet, se trataron previamente los animales con un inhibidor de cinasa de tirosina EGF-R selectivo, BIBX1522. En los animales tratados previamente con BIBX1522, el fMLP todavía causó la desgranulación de las células goblet. Sin embargo, el tratamiento previo con BIBX1522 previno la regranulacíón de las células goblet y su expresión de la proteína MUC5AC. Estos resultados implican la activación del EGF-R en la nueva proliferación de mucinas después de la desgranulación de las células goblet. En las ratas libres de patógenos, las células goblet están "inactivas" (por ejemplo, sin desgranulación) y ©I EGF-R está desactivado. Cuando la inflamación (por ejemplo, el estimulo de infiltración de neutrófilos) causa la desgranulación de las células goblet y la secreción de mucina, se vuelve a presentar la activación del EGF-R en los suministros del epitelio de las vías respiratorias con mucinas. Los descubrimientos presentes sugieren que los inhibidores de cinasa de tirosina en EGF-R selectivos pueden ser útiles para prevenir la hipersecreción en la enfermedad nasal. Ejemplo 5 Relación del EGF-R con la Producción de Células Goblet en los Bronquios Humanos La expresión del EGF-R fue evaluada en las vías respiratorias normales humanas, y en vías respiratorias asmáticas. Se realizó la hibridación in situ, y el análisis inmunohistoquímico, tanto para el EGF-R, como para el UC5AC (como un marcador de la mucina de células goblet). MÉTODOS Sujetos Se analizaron muestras de once sujetos saludables y doce sujetos asmáticos. Los sujetos fueron caracterizados por medio de espirometría, reactividad de las vías respiratorias a la metacolina inhalada, y la reactividad de la prueba de la piel, tal y como se resume en la Tabla 3 siguiente. FEV1: volumen expirado forzado en un segundo; FEV1 PC2o: concentración provocadora de metacolina requerida para ocasionar un 20% de disminución en la línea de base del FEV1. Tabla 3 Características Sujetos saludables (n-11) Sujetos asmáticos (n-12) Edad promedio (arios) 28 33 Rango de edad (anos) 24-44 26-37 Genero (masculino/femenino) 2/9 8/4 FEV1 (% predicción) ± SE 104 ± 7.1 84.2 ±50 FEV1 PC20 (mg/ml)±SE >15 ) 0.72 ±0.2 Los sujetos saludables no tenían historia clínica de obstrucción de las vías respiratorias o rinitis perennial, y tenían resultados de prueba de función pulmonar normal. Ellos tampoco tenían alergias de la piel. Los sujetos asmáticos cumplieron con los criterios del diagnóstico clínico para el asma (American Thoracic Society (1987) Am. Rev. Respir. Dis. 136: páginas 225 a 244), y mostraron hiperreactividad a la metacolina inhalada, Ninguno de los sujetos había tomado corticoesteroides inhalados u orales en las seis semanas anteriores a su enrolamiento en el estudio. Los sujetos asmáticos utilizaron agonistas-ß intermitentemente para el control de los síntomas. Entre los sujetos, no había fumadores actuales o anteriores, no había historial de entubación endotraqueal en los últimos 5 años, infección del aparato respiratorio en las pasadas 6 semanas, o enfermedad cardiaca o neurológica importante. Se introdujo un broncoscopio por medio de la boca, y se avanzó al bronquio del tallo principal derecho. Se obtuvieron biopsias de las bifurcaciones del lóbulo superior, el lóbulo medio y el segmento superior del lóbulo inferior, utilizando unas pinzas con puntas fenestradas para biopsia. Las muestras de la biopsia fueron fijadas con 4% de paraformaldehído durante 1 hora y luego colocadas en sacarosa el 30% durante la noche para la crioprotección. Las muestras fueron incrustadas con un compuesto O.C.T., o glicolmetacrilato (GMA) (Park Scientifice, Northampton, RU) y se cortaron en secciones con un grueso de 3 µ?t?. Todas las secciones fueron teñidas con azul alciano/PAS (para visualizar las células goblet) y contrateñidas con hematoxilina (para contar el número total de células). El azul alciano (1%) fue diluido con ácido acético (3%), y con un pH final de 2.5. Hibridación in situ de EGFR y UC5AC. Se llevó a cabo la hibridación in situ, utilizando una muestra de EGFR humano la cual contenia un fragmento de cADN 350-bp del gen EGFR humano (plantilla de muestra pTRI-EGF-R-humano, Ambion, Austin, TX) y una muestra de MUC5AC humano, la cual contenia un fragmento de cADN 298-bp del gen UC5AC humano. Se utilizó un vector pBludscript II SK (Stratagene, LaJolla, CA) para la subclonación del fragmento del EGFR. La hibridación se llevó a cabo tal y como se describió. Lou et al. (1998) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157: páginas 1927 a 1934. Brevemente, se cortaron las secciones congeladas (4 µ?t?) y se colocaron en portaobjetos de vidrio cargados positivamente (Superfrost Plus, Fisher Sci, Pittsburgh, PA). Se utilizaron las secciones cortadas en una proximidad cercana para la hibridación con muestras sentido y antisentido. Las muestras se volvieron a fijar en 4% de paraformaldehído, se rehidrataron en 0.5 x SSC, y luego se acetilaron en trietanolamina y anhídrido acético. La hibridación se llevó a cabo con 2500-3000 cpm/µ? de la muestra antisentido o sentido en formamida desionizada al 50%, NaCI 0.3 M, 20 mM de Tris, 5 mM de EDTA, y una solución de Denhardt, 1x, 20 mM de ditiotreítol, sulfato de dextrano al 10%, tARN de levadura 0.5 mg/ml, y 0.5 mg/ml de ADN de esperma de salmón sonicada a una temperatura de 58°C durante toda la noche. El tratamiento posterior a la hibridación consistió de lavados con 2 x SSC, 1 mM de EDTA, 10 mM de ß-mercaptoetanol a temperatura ambiente, incubación con una solución RNasa (20 µ9/p??) durante 30 minutos a temperatura ambiente, y lavados adicionales en 0.1 x SSC, 1 mM de EDTA, 10 mM de ß-mercaptoetanol a una temperatura de 55°C durante 2 horas y posteriormente en 0.5 x SSC a temperatura ambiente durante 20 minutos. Las muestras se deshidrataron, se secaron al aire y se cubrieron con una emulsión de tracto nuclear NBT de Kodak (Eastman Kodak, Rochester, NY) para la auto-radiografía. Después de una exposición de 7 a 21 días a una temperatura de 4°C, se desarrollaron las transparencias, se fijaron y se contratiñeron con hematoxilina. Análisis inmunohistoquímico de EGFR y MUC5AC. Se llevó a cabo la inmunohistoquímica utilizando secciones GMA incrustadas. Las secciones se volvieron a fijar con 4% de paraformaldehldo durante 5 minutos. Se utilizó PBS con un contenido de 0.05% de Tween 20, 2% de suero de cabra normal y Levamisol (2 mM), como diluyentes para los anticuerpos. Las secciones fueron incubadas con anticuerpo monoclonal de ratón para EGFR (1: 40, Calbiochem, San Diego, CA) o anticuerpo monoclonal de ratón para MUC5AC (clon 45 M1, 1:100, NeoMarkers, Fremont, CA) durante la noche a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con PBS para remover el anticuerpo primario excedente. Las secciones fueron incubadas entonces con IgG anti-ratón de caballo biotinilado (Vector Laboratories) en una dilución de 1:200 durante 2 horas a temperatura ambiente. El anticuerpo enlazado fue visualizado de acuerdo con protocolos estándar para el método de complejo de fosfatasa alcalina-biotina-avidina. Toda la tinción inmunohistoqufmica incluyó secciones de control no expuestas al anticuerpo primario, con la substitución de un anticuerpo no relacionado del mismo isotipo o pre-incubación del anticuerpo con un excedente de 10 dobleces de peptido inmunizante. Para la inmunotinción del EGFR también se utilizó un anticuerpo policlonal de conejo al EGFR (1:100, Calbiochem), para confirmar el patrón de tinción, y para llevar a cabo la extinción utilizando el antígeno del péptido EGFR, el cual corresponde a los residuos de aminoácidos del 1005 al 1016 del EGFR humano (Calbiochem). Para el anticuerpo anti-EGFR, se llevaron a cabo experimentos de control por medio de la incubación previa del anticuerpo con lisatos de células preparados de la línea celular A431 que sobre-expresa el EGFR. Análisis morfométrico. Se capturaron aleatoriamente seis imágenes del epitelio de las vías respiratorias de las secciones de biopsia que se tiñeron con anti-EGFR Ab, o con anti-MUC5AC Ab en una magnificación x 400. El área de células goblet fue evaluada por medio de la densidad de volumen de la inmunorreactividad del MUC5AC en la superficie de la mucosa del epitelio, utilizando un sistema de elaboración de imagen semiautomático que se describe en alguna parte. Takeyama et al. (1998) Am. J. Physiol. 275: páginas L294 a L302. Se midió el área teñida positivamente, y el área total del epitelio, y se expresaron los datos como el porcentaje de las áreas teñidas positivamente. El análisis se llevó a cabo con el programa NIH IMAGE del dominio público (desarrollado en el Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos, y disponible por medio del FTP anónimo de zippy.nimh.gov, o en un diskette del National Technical Information Service, Springfield, VA, parte número PB95-500195GEI). La inmunorreactividad de EGFR fue analizada por la caja de herramientas por medio del Stereology Toolbox (versión 1.1, Morphometrix, Davis, CA). El número de las células EGFR-positivas en el epitelio de las vías respiratorias fue determinado por medio del conteo del punto, utilizando un cicloide que consiste de puntos y líneas. El conteo de puntos se llevó a cabo por un investigador ciego a la identidad y categoría de la enfermedad de los sujetos. Análisis estadístico. Las estadísticas se realizaron utilizando el programa StatView 4.01 (Abacus Concepts, Berkeley, CA). Todos los datos son expresados como el promedio ± SE . Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para determinar las diferencias estadísticamente importantes entre los grupos; se utilizaron el análisis de regresión lineal de Pearson y el análisis de variación de una vía para determinar una correlación entre las variables. Se aceptó una probabilidad menor de 0.05 para la hipótesis nula, como que indica una diferencia estadísticamente importante.
RESULTADOS mARN de EGFR. En todos los sujetos asmáticos, la hibridación ¡n situ mostró la expresión del mARN de EGFR en el epitelio de las vías respiratorias, mientras que en los sujetos saludables se mostró poca expresión del mARN de EGFR. La muestra del EGFR sentido fue negativa uniformemente. Proteína EGFR. El porcentaje de células del epitelio totales que fueron EGFR positivas fue mayor en los asmáticos que en los sujetos saludables (P < 0.05, figura 6, columnas izquierdas). En los sujetos saludables, la inmunorreactividad al EGFR fue rara y estuvo casi limitada completamente a las células goblet. En los sujetos asmáticos, la inmunorreactividad al EGFR varió: En algunos sujetos, se observó inmunorreactividad al EGFR solamente en las células goblet, y también fue observada en el lumen. En otros, la inmunorreactividad al EGFR fue localizada principalmente en las células básales. El porcentaje de inmunorreactividad de EGFR en las células básales fue mayor en los asmáticos que en los sujetos saludables; en las células goblet; el porcentaje de inmunorreactividad de EGFR fue mayor en los sujetos saludables que en los asmáticos (figura 6). Ocasionalmente, se observaron glándulas de mucosa en las biopsias. Las células de mucosa, pero no serosa, en las glándulas mostraron inmunorreactividad EGFR. Las células ciliadas no mostraron inmunorreactividad EGFR ni en los asmáticos ni en los sujetos saludables. Las secciones no expuestas al anticuerpo pri mario o con la substitución de u n anticuerpo no relacionado del mismo isotipo fueron negativas , la inmunorreactividad del EG FR fue disminuida mediante la pre-adsorción del anticuerpo con una proteína EG FR excedente. Los resultados de la inmunorreactividad al EGFR en las células goblet y básales se resumen en la Tabla 4. Tabla 4 mARN de MUC5AC. En los sujetos asmáticos, el mARN del MUC5AC fue expresado en el epitelio de las vías respiratorias en un patrón parchado similar a la distribución de células goblet. El epitelio de los sujetos saludables mostró solamente una expresión débil del mARN del MUC5AC, la cual fue localizada en la distribución de células goblet. La muestra de MUC5AC sentido fue negativa uniformemente. Co-localización de MUC5AC y EGFR. La inmunorreactividad de MUC5AC y EGFR fue co-localizada en las células goblet que fueron teñidas con azul alciano/PAS, cuando fue observada la inmunorreactividad de las células goblet al EGFR. Correlación de la inmunorreactividad al EGFR con MUC5AC. La inmunorreactividad al EGFR de las células del epitelio de las vías respiratorias mostraron una correlación positiva importante con el área de tinción MUC5AC positiva en el epitelio de las vías respiratorias entre todos los sujetos (n = 23, r = 0.725, P < 0.0001) (figura 7). Ejemplo 6 El IL-13 induce a la producción de mucosa mediante el estímulo y del EGFR y los neutrófilos de activación Se examinó el rol de la activación de EGFR en la producción de mucosa inducida por IL-13 que fue examinada instilando IL-13 en ratas libres de patógenos, y el efecto de los inhibidores de cinasa de tirosina EGFR en el crecimiento de células goblet (CG) inducido por IL-13.
MÉTODOS Animales Se compraron en Simonsen Laboratories (Gilroy, CA) ratas F344 Fisher machos libres de patógenos especificas con un peso de 220 a 240 g. Los animales fueron alojados en alojamientos libres de patógenos y mantenidos en el comedero del laboratorio para el acceso libre a los alimentos y el agua. El Comité de Investigación en Animales, Universidad de California, San Francisco, probó todos los procedimientos. Se estudiaron cinco animales de cada grupo. Efecto del inhibidor selectivo de la activación de EGFR en la metaplasia de células goblet inducida por IL-13. Primero se realizaron estudios en ratas in vivo, y mostraron que el IL-13 induce a la metaplasia de células goblet en el epitelio traqueal de las ratas. Los animales fueron anestesiados con pentobarbital [Nembutal sódico, 50 mg/kg, intraperitonealmente (ip), Abbott Laboratories, North Chicago, IL] y se permitió que respiraran espontáneamente. El vehículo (solución salina regulada por fosfato; PBS) o el IL-13 fue instilado intratraquealmente por medio de un catéter Angiocath calibre 20 (Beckton Dickinson, Sandy, UT) a través de la boca, mientras que el área de la laringe fue visualizada utilizando un iluminador de alta densidad (FiberLite; Dolan Jenner Industries, Inc., Lawrence, MA). Los tejidos carinales fueron examinados 48 horas después de la instilación de IL-13. Se instilaron varias concentraciones de IL-13 (IL-13 múrido recombinante; 5, 50, 100, y 500 ng/rata, R&D systems, Minneapolis, MN) dentro de la traquea en 200 µ? de PBS. El PBS estéril (200 µ?) fue instilado en la traquea de los ratones de control. Para el examen de la relación entre la metaplasia de células goblet inducida por IL-13 y la activación de EGFR, los animales fueron tratados previamente un día antes de la instilación del IL-13, y diariamente después de la instilación con un inhibidor de cinasa de tirosina EGFR selectivo (BIBX 1522; 1 a 30 mg/kg/día,ip; Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Alemania). Los animales fueron eutanizados 48 horas después de la instilación de IL-13. Rol de reclutamiento de leucocitos en la metaplasia de células goblet inducida por IL-13. En estudios preliminares, notamos que el IL-13 ocasiona el reclutamiento de leucocitos en las vías respiratorias se hipotetizo que el reclutamiento de leucocitos es el resultado del quimioatrayente inducido por IL-13 liberado del epitelio, y que este reclutamiento está comprendido en la cascada de EGFR inducida por IL-13 que conduce a la metaplasia de células goblet. Los grupos de animales fueron eutanizados a las 4, 8, 16, 24, y 48 horas posteriores a la instilación del IL-13 (500 ng), y se contaron los leucocitos en el tejido de las vías respiratorias. Para la evaluación del rol de los leucocitos en la metaplasia de células goblet inducida por IL-13, las ratas fueron tratadas previamente con un inhibidor de leucocitos en la médula ósea [ciclofosfamida (17); Sigma Chemical Co., St Louis, O] o con un anticuerpo de bloqueo a la interleucina-8 (IL-8Ab; anticuerpo IL-8 anti-humano conejo; Biosource, Camarillo, CA). La ciclofosfamida (100 mg/kg, ip) fue administrada 5 días antes de la instilación de una sola dosis con I L- 13 de (500 ng), y una segunda inyección de ciclofosfamida (50 mg/kg, ip) fue administrada 1 día antes de la instilación del IL-13. En otras series de estudios, se instilaron intratraquealmente el IL-8 Ab (10 µg/rata) junto con IL-13; y se repitió la instilación del anticuerpo de bloqueo IL-8 anti-humano en intervalos de 12 horas hasta que los animales fueron eutanizados. Preparación del tejido. Los animales fueron eutanizados con una dosis letal de pentobarbital (Nembutal sódico, 200 mg/kg, ip, Abbott Laboratories, North Chicago, IL), y la circulación sistémica fue perfundida con paraformaldehído al 1% en Dietilpirocarbonato (DEPC, Sigma Chemical Co., St Louis, MO) via del PBS tratados del ventrículo izquierdo. Para las secciones congeladas, se removieron los tejidos carinales, colocados en 4% de paraformaldehído durante la noche, y luego se colocaron en sacarosa al 30% para la crioprotección. Los tejidos fueron incrustados en temperatura de corte óptima (OCT, Sakura Finetek U.S. A., Inc., Torrance, CA). Para las secciones de plástico o parafina, los tejidos fueron colocados en 4% de paraformaldehído durante la noche, deshidratados con etanol, e incrustados en una solución JB-4 más monómero A (Polysciences, Inc., Warrington, PA) o en parafina. Los tejidos incrustados fueron cortados como secciones transversales con un grueso de 4 µ?t? y colocados en portaobjetos de vidrio.
Cuantificación de la metaplasia de células goblet. En todos los estudios, la carina fue examinada para obtener un muestreado consistente. Se midió las áreas AB/PAS positivas y el área del epitelio total, y se expresaron los resultados como el porcentaje del área AB/PAS al área epitelial total. Los análisis se llevaron a cabo con el programa NIH IMAGE del dominio público (desarrollado en los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos y disponible del FTP anónimo del zippy.nimh.gov. o el diskette del National Technical Information Service, Springfield, VA, parte número PB95-500195GEI). Tinción inmunohistoquímica para MUC5AC, proteína EGFR, TNF-a e IL-8 en el epitelio carinal de ratas. Se utilizó una sección de regulador de fosfato con un contenido de 0.05% de Tween 20, y 2% de suero normal de cabra como diluyente para los anticuerpos después de la peroxidasa endógena de bloqueo con 0.3% de H202 en metanol. Las secciones fueron incubadas con mAb de ratón para EGFR (1:250, Calbiochem, San Diego, CA), para UC5AC (clon 45 1, 1:500, New Markers, Fremont, CA), o un anticuerpo de conejo para TNFa (1:1000, Genzyme, Cambridge, A) durante toda la noche a una temperatura de 4°C y fueron lavados con PBS para remover el anticuerpo primario excedente. Para la localización inmunohistoquímica de una substancia similar al IL-8, se utilizó un anticuerpo IL-8 anti-humano de ratón (1.20; Biosource, Camarillo, CA). Entonces las secciones fueron incubadas con IgG anti-ratón de caballo bíotiniladas (Vector Laboratories, Burlingame, CA) en una dilución de 1:200 durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos enlazados fueron visualizados de acuerdo con protocolos estándar para el método de complejo de peroxidasa-biotina-avidina. La medición de la protelna MUC5AC también utilizó el mismo método utilizado para la medición cuantitativa de la metaplasia de células goblet en el epitelio. Evaluación de leucocitos en el tejido de las vías respiratorias. Los animales fueron eutanizados 4, 8, 16, 24, y 48 horas después de la instilación de IL-13 (500 ng), y los leucocitos fueron contados en el tejido de las vías respiratorias. Para evaluar el reclutamiento de neutrófilos, se tiñeron las secciones con 3,3'-diaminobencidina, para los neutrófilos y luego se contratiñeron con azul toluidina. Los neutrófilos vistos como células citoplásmicas de azul peroxidasa-positivas fueron contados en seis campos consecutivos de alta potencia del epitelio (a partir de la membrana de la base a los ápices de la célula) en la carina. Para evaluar el reclutamiento de eosinófilos, se tiñeron las secciones con un reactivo de Luna. Aislamiento y quimiotáctismo de neutrófilos humanos. Los neutrófilos humanos fueron purificados de la sal periférica obtenida de donadores saludables. El aislamiento de neutrófilos se llevó a cabo por técnicas estándar de separación de gradiente Ficoll-Hypaque, sedimentación de dextrano, y lisis hipotónica de eritrocitos. Las células fueron rutinariamente >95% viables por exclusión del tinte de azul tripano. Para evitar la contaminación por endotoxina, todas las soluciones fueron pasadas a través de un filtro de 0.1 µ??. La actividad quimiotáctica fue evaluada en una cámara de microquimiotáctismo de 48 depósitos (Neuroprobe, Cabin John, MD), utilizando la técnica de conducción del frente. La migración fue medida como el movimiento neto de neutrófilos (µ??) a través de un filtro de nitrocelulosa (tamaño del poro, 3 µ??) después de 25 minutos a una temperatura de 37°C. El efecto del IL-13 (IL-13 humano recombinante 10"10, 10"9, y 5 X 10"9 M; R&D systems, Minneapolis, MN) es expresado como la distancia viajada, comparada con la migración aleatoria de los neutrófilos incubados con RPMI 1640. Análisis de los datos Todos los datos son expresados como el promedio ± SEM. El análisis estadístico realizado con el ANOVA de una vía fue utilizado para determinar las diferencias estadísticamente importantes entre los grupos. Se utilizó la prueba F de Scheffe para corregir las comparaciones múltiples cuando fueron identificadas importancias estadísticas en el estudio ANOVA. Se aceptó Una probabilidad menor de 0.05 como indicadora de una diferencia estadísticamente importante. RESULTADOS Efecto de la lnterleucina-13 en la metaplasia de células goblet. Para confirmar que el IL-13 induce a la producción de mucina, el IL-13 (5, 50, 100, y 500 ng/rata) fue instilado en la traquea, y los tejidos fueron examinados 48 horas después. En las ratas de control, el epitelio de las vías respiratorias contenia solamente AB/PAS y tinción MUC5AC escasa (figura 8). El IL-13 aumentó la tinción AB/PAS y MUC5AC dependiente de la dosis (figura 8). Estos resultados implican que el IL-13 induce la metaplasia de células goblet y la producción de MUC5AC mucina en el epitelio de las vías respiratorias de las ratas. Efecto de un inhibidor selectivo de activación de EGFR en la metaplasia de células goblet inducida por IL-13. Para examinar la relación entre la metaplasia de células goblet inducida por IL-13 y la activación de EGFR, los animales fueron tratados previamente con un inhibidor de cinasa de tirosina EGFR selectivo (BIBX 1522, 1 -30mg/kg/día). Las ratas de control mostraron poca expresión del EGFR en el epitelio de las vías respiratorias, pero la instilación de IL-13 aumentó la expresión de EGFR. El tratamiento previo con un inhibidor de cinasa de tirosina EGFR selectivo BIBX 1522, evitó la tinción de AB/PAS y MUC5AC inducida por IL-13 dependiente de la dosis y completamente (figura 9). Estos descubrimientos implican la activación de EGFR en la producción mucina inducida por IL-13. Expresión del TNFa en los tejidos de las vías respiratorias de ratas. Se examinó el efecto de la instilación del IL-13 en la expresión de TNFa: En las ratas de control, la tinción con el anticuerpo TNFa fue mínima. La instilación de IL-13 indujo la expresión de TNFa, principalmente en los neutrófilos de infiltración. El tratamiento previo con ciclofosfamida evitó la expresión de TNFa inducida por IL-13.
El efecto de IL-13 en el reclutamiento de leucocitos y la producción mucina. El epitelio de las vías respiratorias de las ratas de control contenía pocos leucocitos, pero la instilación de IL-13 en las vías respiratorias causó un reclutamiento de leucocitos dependiente del tiempo (figura 10A), la cual comenzó después de aproximadamente 8 horas y la cual fue máxima dentro de las 24 horas. El tratamiento previo con ciclofosfamida, un fármaco que suprime leucocitos en la médula ósea, inhibió el reclutamiento de leucocitos en las vías respiratorias (figura 10A), y evitó la producción de mucina inducida por IL-13 (figura 10B). Para examinar el efecto del IL-13 en el quimiotactismo de neutrófilos in vitro, se estudió, con neutrófilos humanos. El IL-13 disminuyó el movimiento de neutrófilos dependiente de la dosis en una concentración de 5 X 10"9 M, y el IL-13 causó la disminución al 50.6 ± 3.4% de los valores de control. Debido a que el IL-13 no causó la quimiotactismo de los neutrófilos, se hipotótizo que el IL-13 estimula la producción del quimioatrayente de neutrófilos en el epitelio. En los animales de control, el epitelio de las vías respiratorias no se tiñó con el quimioatrayente y similar al IL-8, pero la instilación de IL-13 dio como resultado una tinción positiva con un anticuerpo IL-8 antihumano. El tratamiento previo con un anticuerpo bloqueador de IL-8 inhibió el reclutamiento de leucocitos inducido por IL-13 y la producción de mucina (figura 10). Estos descubrimientos indican que el IL-13 induce el quimioatrayente similar al IL-8 del epitelio de las vías respiratorias el cual ocasiona el reclutamiento de neutrófilos. Ejemplo 7 La activación del EGFR promueve las síntesis de mucina inducida por humo de cigarrillo. Tal y como se describió en el ejemplo 2, los neutrófilos activados por citocina pro-inflamatoria y el humo de cigarrillo causan la síntesis del UC5AC mucina en las células del epitelio bronquial humano in vitro, por medio de la activación dependiente del ligante de EGFR. Este fenómeno fue examinado adicionalmente en estudios in vivo llevados a cabo en ratas y humanos. MÉTODOS Estudios In Vitro. Preparación de Solución de Humo de Cigarrillo La solución de humo de cigarrillo fue preparada tal y como se describió en el Ejemplo 2. Cultivo Celular. Se cultivaron células NCI-H292, una línea celular del carcinoma de la mucoepidermoide pulmonar humano, en un medio de RPMI 1640 con un contenido del 10% de suero fetal de bovino, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 9/?t??) y Hepes (25 mM) a una temperatura de 37°C en un incubador cubierto con C02 agua al 5% humidificado. Se utilizaron para cultivar las células ya sea placas de cultivo de 6 depósitos, o portaobjetos de 8 cámaras. Cuando fue confluente, las células fueron incubadas durante 1 hora con una solución de humo de cigarrillo. Posteriormente las células fueron lavadas e incubadas con un medio fresco simple. Los experimentos fueron terminados en los tiempos previamente seleccionados (para el mARN, 6 horas y 12 horas; para la protelna, 24 horas). Como controles, las células fueron incubadas con el medio simple por el mismo período de tiempo. En los estudios de inhibición con inhibidores de cinasa de tirosina EGFR, las células NCI-H292 fueron tratadas previamente con BIBX1522 (10 µ?/?t??, proporcionado generosamente por Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim, Alemania), o ti rfosti na AG1478 (10 µ?, de Calbiochem) 30 minutos antes de administrar la solución de humo de cigarrillo. Los efectos del inhibidor selectivo de la cinasa de tirosina del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (tirfostina AG1295, 100 µ , de Calbiochem), y un control negativo para tirfostinas (tirfostina A1, 100 µ?, de Calbiochem) también fueron examinados. El rol de las especies de oxígeno reactivas fue examinado utilizando un supresor de radicales libres de oxígeno DMSO (1%, Sigma), o dismutasa de superóxido (SOD, 300 U/mi, Sigma). Inmunotinción de EGFR Activado. A las células se les suprimió el suero durante 24 horas, y luego fueron estimuladas con solución de humo de cigarrillo o con TGFa durante 15 minutos. Después del estímulo, las células fueron lisadas con regulador de lisis (fosfato de sodio 20 mM, pH 7.8, 150 mM NaCI, 5 mM EDTA, 50 mM HEPES, 1% Triton-X100, 50 mM NaF, ortovanadato sódico 1 mM, 5 mM de PMSF, y 10 µg ml de cada uno de leupeptina y aprotinina) y fueron incubadas durante 30 minutos a una temperatura de 4°C. Para remover los materiales insolubles, los lisatos de células fueron centrifugados a una velocidad de 14,000 rpm durante 15 minutos a una temperatura de 4°C. Se suspendieron alícuotas de sobrenadantes que contenían cantidades iguales de proteína en un regulador de muestra SDS, y se hicieron hervir durante 5 minutos. Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE en gel de acrilamida del 4 al 15%. El gel resultante fue equilibrado en el regulador de transferencia: 25 mM de HCI-Tris, 192 mM de glicina, metanol al 20% (vol/vol), pH 8.3. Entonces las proteínas fueron transferidas electroforéticamente a membranas de nitrocelulosa, las cuales fueron incubadas con leche desgrasada al 5% en PBS con un contenido de 0.05% de Tween 20 durante 1 hora y luego incubadas con un mAb EGFR específico anti-fosfo (2 µg/ml, de Calbiochem) durante la noche. El Ab enlazado fue visualizado de acuerdo con un protocolo estándar para el método de complejo de fosfatasa alcalina-biotina-avidina (ABC Kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Hibridación In Situ de mARN de EGFR y mARN de UC5AC. La hibridación in situ fue realizada utilizando una muestra de EGFR humano, la cual contenía un fragmento de cADN 350-bp del gen EGFR humano (plantilla de muestra pTRI-EGFR-humano, Ambion, Austin, TX) y una muestra de MUC5AC humano, la cual contenía un fragmento de cADN 298-bp del gen MUC5AC humano. El cADN 350 bp de EGFR humano fue subclonado en un vector pBluescript II SK en los sitios Kpn I, y EcoR I. Este pBluescript fue utilizado para generar las muestras de EGFR humano antisentido y sentido. La hibridación se llevó a cabo tal y como describió anteriormente. Lou et al. (1998) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157: páginas 1927 a 1934. Brevemente, las células cultivadas en los portaobjetos de 8 cámaras fueron fijadas en 4% de paraformaldehído, rehidratadas en 0.5 x SSC, y luego acetiladas en trietanolamina y anhídrido acético. La hibridación se llevó a cabo con 2500 a 4000 cpm/µ? de muestra antisentido o sentido en formamida desionizada al 50%, NaCI 0.3 M, 20 mM de Tris, 5 mM de EDTA, solución de Denhardt's 1x, 20 mM de ditiotreitol, sulfato de dextrano al 10%, 0.5 mg/ml de tARN de levadura, y 0.5 mg/ml de ADN de esperma de salmón sonicada a una temperatura de 58°C durante la noche. El tratamiento posterior a la hibridación consistió de lavados con 2 x SSC, 1 mM de EDTA, 10 mM de ß-mercaptoetanol a temperatura ambiente, incubación con solución de Rnasa (20 µ9/???) durante 30 minutos a temperatura ambiente, y lavados adicionales en 0.1 x SSC, 1 mM de EDTA, 10 mM de ß-mercaptoetanol a una temperatura de 55°C durante 2 horas y luego en 0.5 x SSC a temperatura ambiente durante 20 minutos. Las muestras fueron deshidratadas, secadas al aire y cubiertas con una emulsión de tracto nuclear Kodak NBT (Eastman Kodak, Rochester, NY) para la auto-radiografla. Después de una exposición de 7 a 21 dias a una temperatura de 4°C, las transparencias fueron desarrolladas, fijadas y contrateñidas con hematoxilina.
Inmunoensayo de la Proteína MUC5AC. La proteína MUC5AC fue medida tal y como se describió anteriormente. Takeyama et al., (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 96: páginas 3081 a 3086. Brevemente, los lisatos de células fueron preparados con PBS en diluciones múltiples, y 50 µ? de cada muestra fue incubado con un regulador de carbonato-bicarbonato (50 µ?) a una temperatura de 40°C en una placa de 96 depósitos (Maxisorp Nunc, Fisher Scientific, Santa Clara, CA), hasta el secado. Las placas fueron lavadas tres veces con PBS y bloqueadas con albúmina de suero bovino al 2%, fracción V (Sigma) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas nuevamente tres veces con PBS y luego incubadas con 50 µ? de mAb de MUC5AC (1:100) que fue diluido con PBS con un contenido del 0.05% de Tween 20. Después de 1 hora, los depósitos fueron lavados tres veces con PBS, y se abastecieron en cada depósito 100 µ? de conjugado IgG anti-ratón cabra peroxidasa de rábano (1:10,000). Después de 1 hora las placas fueron lavadas tres veces con PBS. La reacción de color fue desarrollada con 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TNB) y solución de peroxidasa (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) y detenida con H2S0 2N. La absorbancia fue leída en 450 nm. Estudios In Vivo. Fármacos El BIBX1522 (3 6 9 mg) fue disuelto en 0.6 mi de cloroformo con un contenido de solutol al 25% (p/v). Esta solución fue evaporada hasta el secado. El residuo se volvió a disolver en 0.3 mi de metanol y una vez más se evaporó hasta el secado. Esta preparación del material fue guardada a una temperatura de 4°C durante 5 días. La solución para la instilación intratraqueal se preparó fresca cada día mediante la disolución de la preparación del material en 3 mi de solución salina previamente calentada (40°C) para lograr una concentración final de 0.1 y 0.3%, respectivamente. Inducción de etaplasia de Células Goblet por Exposición a Humo de Cigarrillo. Se utilizaron para el estudio ratas macho Sprague Dawley con un peso de 250 a 300 gramos. Los animales fueron alojados en un cuarto con temperatura y humedad controladas, y tenían libre acceso al agua y un alimento estándar de laboratorio. Los animales fueron asignados aleatoriamente al grupo de control de no fumadores y al grupo de control expuestos al humo, y los grupos de tratamiento. Las ratas del grupo de fumadores fueron expuestas a 8 cigarrillos regulares sin filtro (1.2 mg. nicotina, 12 mg. condensado) por día durante 5 días, utilizando un aparato fumador con cámaras adaptadas para ratas. Inhibición de la Metaplasia de Células Goblet Inducida por Humo de Cigarrillo por el Inhibidor de Cinasa EGFR BIBX 1522. Para evaluar el efecto del inhibidor de cinasa EGFR en la metaplasia de células goblet y producción de mucosa, los animales fueron tratados una vez diariamente con vehículo o con BIBX 1522 en dosis de 1 ó 3 mg/kg intratraquealmente 1 hora antes de la exposición al humo del cigarrillo. El tratamiento de los animales con vehículo o BIBX 1522 inició en el día 1, y continuó durante 5 días durante la exposición al humo del cigarrillo. La instilación intratraqueal en un volumen de 1 ml/kg fue realizada bajo una anestesia de isoflurano Aislamiento y Cuantificación del ARN. Ocho horas después de la última exposición al humo del cigarrillo, los animales fueron eutanizados con pentobarbital sódico. Se removieron la traquea y el tallo principal derecho del bronquio y se procesaron para el aislamiento total del ARN, utilizando un equipo Qiagen RNeasy de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La cuantificación del ARN, fue empleada la tecnología de PCR de tiempo real (TaqMan-PCR, Sistema de Detección de Secuencia, ABI Prism 7700, Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, California). La tecnología ha sido descrita detalladamente en otras publicaciones. Fink et al. (1998) Nature Med. 4: paginas 1329 a 1333. Brevemente, durante los ciclos PCR, el nucleótido marcado 5' fluorescente es liberado de la muestra por medio de la actividad de la exonucleasa de la TaqPolimerasa; la emisión de fluorescencia es detectada por medio del láser, y durante los ciclos sucesivos de PCR un aumento en la fluorescencia arriba del fondo es medido y documentado. La señal es normalizada en relación con una señal de referencia interna, y el programa (software), establece los ciclos de umbral (Ct) cuando la diferencia con la señal de referencia es mayor de 1 0 veces de la desviación estándar. El valor Ct es utilizado para la cuantificación del número de entrada objetivo. Los cebadores y las muestras para el MUC5AC de rata fueron diseñados utilizando el programa PrimerExpress™1 .0 proporcionado por Perkin El mer. Se utilizaron las siguientes secuencias para la cuantificación del M UC5AC rata : cebador delantero 5'-TGG GAA CCA TCA TCT ACA ACC A-3' , cebador i nverso 5'-TCC TGA CTA ACC CCT TTG ACC A-3', y muestra de hibridación marcada con tinte reportador FAM : 5'-CCT TGA CGG CCA CTG TTA CTA TGC GAT GT-3'. Los cebadores y las muestras para el ARN del ribosoma fueron comprados en Biosystems Deutschland GmbH (Reactivos de Control de ARN de ribosoma [TaqMan® (muestra VI C™), Patente Norteamericana No. 4308329] , Se real izaron el RT-PCR y el PCR TaqMan en un RT-PCR de un paso utilizando los reactivos de núcleo TaqMan®EZ RT-PCR (Parte No. N808-0236); cebador delantero 50nM , cebador inverso 300n M , muestra 100n M , acetato de manganeso 2.5 m M ; ARN total aproximado 5 a 1 0 ng; enzimas, regu lador de reacción , y nucleótidos de acuerdo con el protocolo del fabricante (equipo TaqMan® EZ RT-PCR, The Perkin-Elmer Corporation , P/N 402877 Rev. A, 1 996). Ciclos 10' 50°C¡ 30' 60°C; 5' 95°C; 40x 20" 94 "C; 1 ' 59°C. Para expresar la cuantificación del mARN el gen objetivo fue normalizado pri mero al ARN del ribosoma como estándar interno. Los datos fueron expresados entonces como la cantidad relativa del UC5AC comparado con el tejido de control estándar. Preparación del Tej ido y Cuantificación de la Prod ucción de Células Goblet Se disectaron los pulmones, y se fijaron en formalina reg ulada al 7% y fueron i ncrustados en parafina . El bronquio del tal lo pri ncipal izquierdo fue utilizado para la tinción inmunohistoquímica. Se cortaron secciones del pulmón para inclu ir la longitud total de las vías respiratorias principales intrapulmonares, y fueron teñ idas secuencialmente con hematoxilina y oesina , o con PAS/azul alciano para evaluar el área del epitelio total , y el área teñida para los glucoconjugados de mucosa i ntracelular, respectivamente. La producción de células Goblet fue determinada por la densidad de volumen de los glucoconj ugados de mucosa teñidos con PAS/azul alciano en la superficie de la mucosa del epitelio util izando un sistema de análisis de i magen (S I S , Muenster, Alemania). El área teñida de PAS-positivo/azu l alciano y el área del epitelio total fue medida por una longitud de 2 mm de la lámina basal. Los datos están expresados como el porcentaje del área total teñida por el PAS/azu l alciano. Estud ios en Humanos Sujetos El protocolo para estudios en humanos fue aprobado por el Comité para I nvestigación H umana en la U niversidad de Californ ia , San Francisco. Las muestras del epitelio del bronquio humano en cuatro sujetos, quienes cubrían los criterios de diagnóstico clínico para el COPD (American Thoracic Society (1987) Am. Rev. Respir. Dis. 136: páginas 225 a 243) fueron obtenidos al momento de la cirugía. No había historia de entubación endotraqueal dentro de los últimos 5 años, y tampoco historia de enfermedades cardiacas o neurológicas importantes. Preparación del Tejido Los especímenes quirúrgicos fueron fijados con 4% de paraformaldehído durante 1 hora y luego colocados en sacarosa al 30% para la crioprotección durante la noche. Los especímenes fueron incrustados en un compuesto O.C.T., y cortados en secciones con un espesor de 4 µ??. Análisis Inmunohistoquímico de EGFR. Se llevó a cabo la inmunohistoquímica utilizando las secciones congeladas. Las secciones se volvieron a fijar en 4% de paraformaldehído durante 5 minutos. Se utilizaron diluyentes para los anticuerpos PBS con un contenido del 0.05% de Tween 20, 2% de suero normal de cabra, y levamisol (2 mM). Las secciones fueron incubadas en anticuerpo monoclonal de ratón para EGFR (1:200, Calbiochem, San Diego, CA) durante 2 horas a temperatura ambiente, y luego se lavaron 3 veces con PBS para remover el anticuerpo primario excedente. Las secciones entonces fueron incubadas en IgG anti-ratón de caballo biotinilado (Vector Laboratories) en una dilución de 1:200 durante 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo enlazado fue visualizado de acuerdo con los protocolos estándar para el método del complejo de fosfatasa alcalina-biotina-avidina. Todas las tinciones inmunohistoquímicas incluyeron secciones de control no expuestas al anticuerpo primario, con la substitución de un anticuerpo no relacionado del mismo isotipo, o preincubación del anticuerpo con un excedente de 10 dobleces del póptido inmunizante. También se utilizó un anticuerpo policlonal de conejo para EGFR (1200, Calbiochem) para confirmar el patrón de tinción, y para realizar la extinción utilizando el antígeno del péptido EGFR, el cual corresponde a los residuos de aminoácidos del 1005 al 1016 del EGFR humano (Calbiochem). Estadísticas Todos los datos se expresan como promedio ± SEM. Se utilizó el análisis de variación de una vía para determinar las diferencias estadísticas importantes entre los grupos. Se utilizó la prueba F de Scheffe para corregir las comparaciones múltiples cuando las importancias estadísticas fueron identificadas en el análisis de variación. Se aceptó una probabilidad de menos de 0.05 para la hipótesis nula, como que indicaba una diferencia estadísticamente importante. RESULTADOS A. Estudios In Vitro de Células NCI-H292. El humo de cigarrillo activa la expresión del mARN de EGFR. En la condición de control, las células NCI-H292 expresaron el mARN de EGFR constitutivamente. La adición de solución de humo de cigarrillo a las células activó la expresión del mARN de EGFR en un período de 6 horas, un efecto que fue aumentado a las 12 horas. El TNFa (utilizado como control) también aumentó la expresión de mARN de EGFR. La muestra sentido de EGFR no mostró expresión. El Humo del Cigarrillo Activa la Fosforilación de Tirosina EGFR. Se examinaron los efectos de la solución de humo de cigarrillo en activación de la cinasa de tirosina EGFR: Como control positivo, se utilizó el ligante EGFR, TGFalfa, el cual aumentó la fosforilación de tirosina específica de EGFR en las células NCI-H292 (figura 11). De un modo similar, la solución de humo de cigarrillo aumentó la fosforilación de tirosina específica de EGFR, pero en un grado menor (figura 11). El tratamiento previo de las células NCI-H292 con BIBX 1522 inhibió la fosforilación de tirosina EGFR inducida por la solución de humo de cigarrillo y por el EGFa. (figura 11). El Humo del Cigarrillo Aumenta la Expresión del UC5AC Las células NCI-H292 en reposo mostraron poca expresión del mARN de MUC5AC en las 12 horas, la adición a las células de la solución del humo del cigarrillo activó la expresión de mARN del MUC5AC dentro de 6 horas, un efecto que fue aumentado a las 12 horas. El TGFalfa (utilizado como control), también aumentó la expresión del mARN del MUC5AC. La muestra sentido de MUC5AC no mostró expresión. De un modo similar, la solución de humo de cigarrillo aumentó la síntesis de la proteína UC5AC dentro de 24 horas, un efecto que ocurrió de un modo dependiente de la dosis (figura 12).
Los Inhibidores de Cinasa de Tirosina EGFR Previenen el Gen UC5AC, y la Expresión de la Proteína en las Células NCIH292. Para probar si el gen MUC5AC inducido por el humo de cigarrillo, y la expresión de proteína ocurrió debido a la activación del EGFR, las células fueron incubadas con diferentes inhibidores de cinasa de tirosina. El tratamiento previo de las células con inhibidores de cinasa de tirosina EGFR selectivos (BIBX 1522, AG1478) previno la expresión del mARN de UC5AC y la síntesis de la proteína UC5AC inducida por la solución de humo de cigarrillos (figura 12). Un inhibidor de cinasa de tirosina selectivo del factor de crecimiento derivado de plaquetas (AG1295), y un control negativo para la tirfostina (Al) no tuvieron efecto (figura 12). Además, la síntesis de MUC5AC inducida por el humo de cigarrillo fue inhibida de manera importante por el tratamiento previo con un supresor de radical libre (D SO), y por SOD. Estos resultados indican que la activación de la cinasa de tirosina EGF-R induce el gen MUC5AC y la expresión de la proteína en las células NCIH292, y que el esfuerzo oxidativo inducido por el humo de cigarrillo está involucrado, por lo menos en parte, en la producción de MUC5AC inducida por el humo de cigarrillo. B. Estudios In Vivo en Ratas El Humo de Cigarrillo Aumenta la Producción de Células Goblet en las Ratas libres de Patógenos. En los animales de control, el epitelio de las vías respiratorias contenía pocas células goblet (figura 13). La inhalación de humo de cigarrillo (8 cigarrillos por día durante 5 días) dio como resultado un aumento marcado de la tinción de PAS/azul alciano (figura 13). La inhalación de humo de cigarrillo también aumentó la expresión del gen MUC5AC mucina (figura 14). El Inhibidor de Cinasa de Tirosina EGFR (BIBX 1552) evita la producción de células Goblet Inducidas por Humo de Cigarrillo en las Ratas libres de Patógenos. Cuando las ratas fueron tratadas con BIBX1522 durante el fumado de cigarrillos, el aumento de la tinción PAS/azul alciano fue inhibido dependiendo de la dosis, y completamente (figura 13), el BIBX 1522 también previno la expresión inducida por el humo del cigarrillo de la expresión del gen MUC5AC (figura 14). C. Estudios en Pacientes Humanos con COPD. Inmunorreactividad del EGFR es Localizada en las Células Goblet de las Vías Respiratorias, y en las Glándulas de Submucosa en Pacientes con COPD. La inmunorreactividad de EGFR fue observada en las células goblet, y las glándulas de mucosa en donde fue positiva la tinción PAS/azul alciano, y la tinción EGFR también fue observada en el lumen de las vías respiratorias. Las secciones no expuestas al anticuerpo primario o con substitución de un anticuerpo no relacionado del mismo isotipo fueron negativas, y la inmunorreactividad del EGFR fue disminuida por medio de la adsorción previa del anticuerpo con la proteína EGFR.
Ejemplo 8 Relación de la expresión EGF para hiperplasia de célula qoblet en pólipos nasales La poliposis nasal es una enfermedad inflamatoria crónica común de las vías respiratorias superiores que afecta al ser humano y la calidad de vida de los individuos afectados. La probabilidad de que el EGFR podría estar involucrado en la hipersecreción de mucosa y la hiperplasia de las células de mucosa en los pólipos nasales humanos fue examinada. El gen UC5AC y la expresión de la proteina fueron examinadas en el epitelio del pólipo nasal, y en el epitelio nasal normal de los turbinatos inferiores. Utilizando la hibridación in situ y la tinción inmunoquímica, se analizaron el mARN de EGFR y la expresión de la proteína, y su relación con la hiperplasia de la célula de la mucosa. Además, se examinaron la presencia y localización del TNF-alfa en la expresión del EGFR, asi como la presencia de neutrófilos en los pólipos nasales. MÉTODOS Materiales Se obtuvieron muestras nasales de pacientes que sufren procedimientos quirúrgicos. Se muestrearon ocho pólipos nasales en pacientes cuyos pólipos fueron removidos durante la etmoidectomfa, y seis biopsias fueron obtenidas de los turbinatos inferiores removidos durante la turbinectomia en individuos roncadores (grupo de control)- Las muestras del tejido nasal fueron fijadas inmediatamente en formaldehído, e incrustadas en parafina para los estudios morfológicos. Ninguno de los pacientes con pólipos nasales tenia fibrosis quística, o discinesia ciliar primaria. A los sujetos se les requirió detener la terapia de los pólipos (por ejemplo, glucocorticoides y antibióticos) un mes antes de la cirugía. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes, y el permiso del Comité de Ética del Hospital Henri ondor (CCPPRB, Creteil, Francia). Evaluación morfológica estándar Se obtuvieron secciones de parafina de 5 µ??, se desparafinaron, y se tiñeron con un Equipo de Tinción Diff-Quik (Baxter Healthcare Corporation, Miami, FL), para los estudios histológicos, con Azul alciano (AB)/PAS para los glucoconjugados de glucosa. Localización inmunohistoquímica de UC5AC y EGFR en las muestras nasales Las secciones de parafina de 5 µ?t? preparadas anteriormente fueron desparafinadas, rehidratadas, fijadas posteriormente con 4% paraformaldehído y tratadas con H202 al 0.3% en alcohol metílico. Se utilizó un diluyente para los anticuerpos PBS con un contenido del 0.05% de Tween 20, 2% de suero normal de cabra. Las secciones de los tejidos fueron incubadas con un anticuerpo monoclonal para el EGFR (dilución, 1:200) (Calbiochem, La Jolla, CA) o para un anticuerpo monoclonal para el MUC5AC (dilución, 1:2500) (clon 45 m1, Neomarkers, Fremont, CA) a temperatura ambiente durante 2 horas. Posteriormente, las secciones fueron incubadas con anticuerpo anti-ratón de caballo biotinilada (dilución, 1:250) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) a temperatura ambiente durante 1 hora. Los anticuerpos enlazados fueron visualizados de acuerdo con protocolos estándar para el método de complejo de Peroxidasa-Biotina-Avidina (Equipo Elite ABC, Vector Laboratories). Las secciones de tejido fueron contrateñidas con hematoxilina. Las preparaciones para el tejido de los pólipos y la mucosa nasal del turbinato inferior fueron realizadas de manera concomitante. Se utilizó la omisión del anticuerpo primario como el control negativo. Cuantificación de áreas teñidas de AB/PAS-, MUC5AC y EGFR La cuantificación de la tinción AB/PAS y de la inmunorreactividad del UC5AC y el EGFR fueron evaluadas utilizando un sistema de elaboración de imagen semiautomático, tal como se describe en otra parte por Lou et al. (1998) Am J. Respir. Crit. Care ed. 157: páginas 1927 a 1934. Se registraron imágenes del epitelio de las muestras nasales de diez campos de alta potencia con lentes de contraste de fase en x400. Se midieron las áreas teñidas de AB/PAS-, MUC5AC- y EGFR y el área del epitelio total, y se expresaron los datos como el porcentaje del área total teñida por AB/PAS por un anticuerpo para MUC5AC, o por un anticuerpo para el EGFR. Los análisis se llevaron a cabo con el programa de elaboración de imagen NIH del dominio público (desarrollado en el U.S. National Instituto of Health y disponible por el FTP anónimo del zippy.nimh.gov o del diskette del National Technical Information Service, Springfield, VA, parte número PB95-500195GEI).
Primero se examinó el porcentaje de áreas teñidas para el AB/PAS y el UC5AC, comparando el control y el epitelio del pólipo. En las muestras de control, el epitelio fue pseudoestratifícado de manera uniforme, de manera que el muestreado fue directo. Sin embargo, el epitelio de la superficie de los pólipos nasales se presentaron subtipos morfológicos variables: (a) epitelio pseudoestratifícado normal (compuesto de células ciliadas, células goblet y una sola capa de células básales); (b) epitelio hiperplástico consistente de células ciliadas, células básales y goblet, (con un contenido mayor de tres capas celulares, ya sea de células básales, de células de mucosa o ambas); (c) la metaplasia escamosa no fue observada en nuestras muestras. El mezclado tuvo que considerar esta heterogeneidad. Primero, los portaobjetos teñidos fueron examinados bajo una magnificación baja para determinar las áreas de epitelio pseudoestratifícado e hiperplástico en cada pólipo. Existieron diferencias grandes entre las diferentes muestras: el epitelio pseudoestratifícado ocupó un promedio del 25% (rango, 14 a 56%), y el epitelio hiperplástico ocupó un promedio del 75% (rango 44 a 100%) en el epitelio intacto del pólipo. Para examinar el porcentaje de áreas teñidas en los pólipos, se obtuvieron imágenes de áreas representativas (10 campos de alta potencia) en proporción con el porcentaje del epitelio pseudoestratifícado e hiperplástico de cada pólipo. Debido a que se encontró que las células goblet estaban más concentradas en las áreas del epitelio hiperplástico que en las pseudoestratificadas, se comparó la expresión de la proteína EGFR en las dos áreas . En estos estud ios, se obtuvieron imágenes de diez campos de alta potencia de los dos tipos de epitelio teñ ido para la proteína MUC5AC y las secciones adyacentes teñidas para la proteína EG F R, y las áreas fueron comparadas. Debido a que solamente la mitad de las muestras de pól ipos expresadas en el EG FR, se determi nó una relación entre el EG FR y la ti nción M UC5AC en los pólipos, examinando diez ca mpos de alta potencia de las muestras adyacentes teñidas. Expresión del EGFR y el gen M UC5AC en el tejido nasal La expresión del gen EG FR fue evaluada por medio de la hibridación in situ utilizando ribomuestras marcadas 35S. Un fragmento 350bp fue aislado de la planti l la Ptri-EG FR humana (Ambion, Austin , Texas) y se subclonaron en los sitios Kpnl y EcoRI del vector Bluescript I I SK (Stratagene, La Jolla , CA). Para prepara la muestra de ARN para la hibridación in situ, este plásmido recombinante contenía un fragmento de cADN de EGFR humano que fue linearizado y transcrito In vitro con la polimerasa T7 ó T3 para obtener las muestras antisentido y sentido . Las muestras para la h ibridación in situ fueron generadas en la presencia de trifosfato de azufre-35-uridina ([35S]UTP). Para el M UC5AC, se generaron ribomuestras de los plásmidos con contenido humano. El aislamiento de las muestras y la hibridación in situ fueron realizadas tal y como se describió anteriormente. Lou et al . (1 998) Am . J . Respi r. Crit. Care Med. 157: páginas 1 927 a 1 934).
Localización inmunohistoquímica de TNF-a, en pólipos nasales Se tiñeron las muestras de pólipos con un anticuerpo antihumano de conejo policlonal para TNF-a . (dilución 1:1000) (Genzyme Corp., Cambridge, MA). La cuantificación de la protelna TNF-a. fue realizada examinando diez campos consecutivos de alta potencia (x400), cinco en el área subepitelial, y cinco en el área estromal, tal y como se describió anteriormente. Finotto et al. (1994) J. Immunol. 153: páginas 2278 a 2289. Los valores reportados son expresados como células positivas por campo. Bajo estas condiciones, un campo representa un área de 0.25 mm2. Tinción inmunohistoquímica para neutrófilos Se utilizaron dos anticuerpos para identificar los neutrófilos en las muestras de los tejidos: debido a que la elastasa de neutrófilos es un componente principal de los neutrófilos humanos, se utilizó anticuerpo de ratón monoclonal para la elastasa de neutrófilo humano (HNE) (dilución 1:5000) (DAKI Corp., Carpintería, CA). Además, debido a que la elastasa de neutrófilos puede estar presente en cantidades más pequeñas en las células diferentes a los neutrófilos, también se utilizó un anticuerpo monoclonal para el CD-16+ (dilución 1:500) (BioSource International, Camarillo, CA), el cual se enlaza con una afinidad inferior al receptor Fe (FcyRII) presente en la superficie celular de los neutrófilos, y el cual se ha mostrado anteriormente que distingue los neutrófilos (CD-16 + ) de los eosinófilos (CD-16-)(10). Para las técnicas de tinción ver los párrafos que describen la tinción de MUC5AC y EGF .
Los neutrófilos reclutados tuvieron dos efectos en las células goblet. El primero, la elastasa de neutrófilo es un secretador potente de las células goblet de las vías respiratorias. Takeyama et al. (1998) Am. J. Physiol. 275: páginas L294 a L302. Segundo la desgranulación de las células goblet ocasionan la expresión del EGFR (Lee et al. (2000) Am. J. Respir Crit. Care Med) y los neutrófilos ocasionan la activación del EGFR. Takeyama et al. (2000) J. Immunol. 164: páginas 1546 a 1552. Por lo tanto, contamos la elastasa de neutrofilo y las células teñidas CD16 en el epitelio de los pólipos nasales, y comparamos las muestras EGFR positivas y EGFR negativas. Para cada muestra, se obtuvieron imágenes de diez campos de alta potencia consecutivos (x400), y se contaron las teñidas positivamente. Los resultados se expresan como el número de célula /campos teñidos positivamente. Bajo estas condiciones, un campo representa un área de 0.25 mm2. Análisis Estadístico Los datos obtenidos de las mediciones de las áreas teñidas por AB-PAS-,MUC5AC- y EGFR y las células TNF-q.HNE- y CD16 teñidas utilizando una prueba U Mann-Whitney no paramétrica. Se aceptó una probabilidad de <0.05 para una hipótesis nula indicando una diferencia estadística importante. RESULTADOS Glucoconjugados de mucosa y MUC5AC de mucina en el epitelio normal y el pólipo nasal.
La tinción con AB/PAS y la inmunotinción para el MUC5AC de mucina fueron positivas, tanto en el epitelio nasal normal como en el pólipo. Las áreas del epitelio ocupadas por la tinción AB/PAS y UC5AC no fueron diferentes entre ellas, en los sujetos de control, ni en los sujetos con pólipos (P=0.91 y P = 0.10, respectivamente) (figura 15). Sin embargo, el porcentaje promedio de áreas teñidas fue significativamente más grande en los pólipos en el epitelio de control (cada comparación, P<0.01). Inmunorreactividad de EGFR y la expresión del gen en el epitelio nasal (a) Inmunorreactividad del EGFR En el epitelio normal, en donde fue escasa la tinción AB/PAS y MUC5AC, la inmunorreactividad de EGFR fue débil y localizada para algunas células goblet, y células secretorias no granuladas en cuatro sujetos; en los otros dos sujetos, el tejido no se tiñó con el anticuerpo para EGFR. En estas dos muestras, la tinción AB/PAS y MUC5AC también fue escasa. En los pólipos, cuatro de las ocho muestras teñidas positivamente con el anticuerpo de EGFR, los cuatro pólipos restantes, no fueron teñidos con el anticuerpo de EGFR. El epitelio de cuatro pólipos teñidos positivamente con el EGFR, el porcentaje de área promedio de tinción positiva de EGFR fue mayor que en el epitelio de los cuatro sujetos de control, los cuales tenían tinción de EGFR (44.07±5.95% vs 19.55±1.44%: P = 0.02). En contraste, al controlar el epitelio (ver lo anterior) en los pólipos, la tinción de EGFR fue mucho más intensa y estaba concentrada en las células básales; algunas células secretoria no granuladas y las células goblet teñidas también positivamente, Las células ciliadas no estaban teñidas en ambos los controles y los pólipos. (b) mARN de EGFR El epitelio de los cuatro sujetos de control que mostraron una inmunorreactividad para EGFR también mostraron la expresión del gen EGFR, como lo demuestra la hibridación in situ. En estas muestras, la señal de mARN de EGFR fue débil y estaba localizada en el área basal del epitelio. En las dos muestras de control en donde estaba ausente la tinción de EGFR, el mARN de EGFR también estaba ausente. En los pólipos, la hibridación in situ para el mARN de EGFR se mostró en la expresión fuerte en el área basal del epitelio en las cuatro muestras que fueron positivas para la inmunotinción de EGFR en el epitelio basal. Hubo poca expresión del gen EGFR en los cuatro pólipos que no mostraron inmunotinción para el gen EGFR; en estos especímenes, la señal no fue localizada en la porción basal del epitelio, sino se encontró en su mayor parte en algunas células alargadas que parecían ser células secretorias no granuladas. La muestra de sentido no mostró señal ni en pólipos ni en los controles. Inmunolocalización de TNF- o en especímenes nasales Debido a que TNF-a. induce la expresión del EGFR en las líneas de células del epitelio humano in vitro, y en el epitelio de la traquea en las ratas in vivo, se tiñeron especímenes nasales con un anticuerpo policlonal para TNF-a En las muestras de control, no existió inmunorreactividad para el TNF-a . mientras que todas las muestras de los pólipos mostraron inmunorreactividad para el TNF-a. Sin embargo, los pólipos teñidos positivamente para EGFR contenían más células TNF-a. teñidas que los pólipos no teñidos para EGFR (19.55±1.13 vs 9.02±41 célulcas/campos; P = 0.02, n=4). La tinción fue concentrada en las células inflamatorias en la capa subepitelial, y en la capa estromal profunda. Basados en su apariencia morfológica, la mayor parte de estas células fueron eosinófilos con un núcleo bi-lobulado característico. Sin embargo, algunas células mononucleares y neutrófilos también se tiñeron positivamente. Una muestra expresó inmunorreactividad para el TNF-a. en el epitelio, en su mayor parte en las células básales. Relación de la expresión de EGFR para el MUC5AC mucina (a) Comparación del epitelio pseudoestratificado e hiperplástico en los pólipos. En las muestras de control, el epitelio fue pseudoestratificado de manera uniforme. Sin embargo, en los pólipos, el epitelio de la superficie estaba compuesto de epitelio pseudoestratificado, y el criterio hiperplastico. Debido a que se descubrieron que las áreas del epitelio hiperplástico contenía un porcentaje de área epitelial significativamente mayor con la tinción positiva AB/PAS y MUC5AC que las áreas pseudoestratificadas. Se llegó a la hipótesis que el EGFR podría ser expresado más fuertemente en las áreas del epitelio hiperplástico que en las áreas del epitelio pseudoestratificado. Se descubrió que en el epitelio de los pólipos EGFR positivos, el epitelio hiperplástico el cual contenía un área mayor de tinción para MUC5AC (figura 16A), también contienen un área mayor de tinción EGFR- positiva que el epitelio pseudoestratificado (figura 16B). (b) Relación entre la positividad EGFR, y el gen MUC5AC mucina y la expresión de la protelna. Debido a que la activación del EGFR se ha mostrado que causa la expresión mucina en el epitelio de las vías respiratorias, se examinó la relación entre la positividad EGFR, y la expresión mucina en el epitelio. Primero, estos estudios mostraron que las muestras que expresaron EGFR también mostraron la expresión del gen MUC5AC mucina. Después examinamos la relación entre la positividad EGFR en el epitelio y la tinción de la proteína UC5AC. Sorprendentemente, el grupo teñido de EGFR tuvo un área teñida inferior de UC5AC que el grupo de pólipos que no tenían inmunorreactividad EGFR (figura 17A). En los pólipos teñidos positivamente con EGFR las células goblet fueron menores y hubo áreas más grandes teñidas para MUC5AC en el lumen, sugiriendo la desgranulación activa de las células goblet mientras que en los pólipos que no mostraron inmunorreactividad para EGFR, las células goblet parecieron ser más grandes y mostraron una evidencia mínima de tinción de MUC5AC en el lumen. Infiltración de neutrófilos en el epitelio del pólipo Debido a que la elastasa de neutrófilo ha sido im plicada en la desgran ulación de células goblet, para evaluar la hipótesis de que el EGFR no era expresado más fuertemente en los tejidos en donde ocurrió la desgranulación de las células goblet, examinamos la local ización de los neutrófilos en las muestras de los pólipos por medio de la tinción de las muestras con anticuerpos para elastasa y para CD1 6. Se descubrió que el número de neutrófilos en el epitelio había au mentado en las muestras EGFR positivas comparadas con las muestras q ue no se tiñeron para EGFR (fig ura 1 7B ) . Aunque la presente i nvención ha sido descrita con referencia a las modalidades específicas de las mismas, aquellos expertos en la técnica deberán entender que se le pueden hacer varios cambios y que se pueden substituir por varios equivalentes si n salirse del espíritu y alcance reales de la invención . Además, se pueden hacer muchas modificaciones para adaptarla a u na situación particular, material, composición de materias, procesos, pasos de procesos para el objetivo espíritu y alcance de la presente i nvención. Todas dichas modificaciones se pretende que están i ncluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (26)

  1. REIVINDICACIONES 1.- Un método para reducir la hiperplasia de células goblet en las vías respiratorias de un individuo, el cual comprende: la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un receptor del factor de crecimiento de la epidermis (EGF-R) antagonista para un paciente que sufre de una hipersecreción de mucosa de las vías respiratorias debido a la hiperplasia de células goblet.
  2. 2.- El método tal y como se describe en la reivindicación 1, en donde el antagonista de EGF-R es un inhibidor de cinasa selectivo para EGF-R.
  3. 3.- El método tal y como se describe en la reivindicación 2, en donde el antagonista es BIBX1522.
  4. 4.- El método tal y como se describe en la reivindicación 1, en donde el antagonista es un anticuerpo.
  5. 5.- El método tal y como se describe en la reivindicación 4, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que enlaza específicamente el factor de crecimiento de la epidermis (EGFR).
  6. 6.- El método tal y como se describe en la reivindicación 4, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que se enlaza específicamente con el receptor de factor de crecimiento de epidermis (EGF-R).
  7. 7. - El método tal y como se describe en la reivindicación 1, en donde el antagonista inhibe la liberación de un ligante EGF-R transmembrana.
  8. 8. - El método tal y como se describe en la reivindicación 7, en donde el antagonista en un inhibidor selectivo de un metal o proteína que es portadora de la liberación del ligante EGF-R transmembrana.
  9. 9. - El método tal y como se describe en la reivindicación 8, en donde el antagonista es un antagonista del receptor acoplado de proteína G que induce la producción de células goblet.
  10. 10. - El método tal y como se describe en la reivindicación 1, en donde el antagonista inhibe la transfosforilación del EGF-R.
  11. 11. - El método tal y como se describe en la reivindicación 8, en donde el antagonista es un antioxidante.
  12. 12.- El método tal y como se describe en la reivindicación 1, en donde el antagonista es administrado por medio de una inyección.
  13. 13.- El método tal y como se describe en la reivindicación 12, en donde el antagonista es administrado intravenosamente con un vehículo en la forma de una solución salina normal.
  14. 14.- El método tal y como se describe en la reivindicación 1, en donde el antagonista es administrado por medio de inhalación.
  15. 15.- El método tal y como se describe en la reivindicación 1, en donde el antagonista es administrado por medio de administración en liposoma.
  16. 16. - El método tal y como se describe en la reivindicación 15, en donde el liposoma es estabilizado estóricamente y administrado intravenosamente.
  17. 17. - Una formulación farmacéutica para la reducción de la hiperplastia de células goblet en las células respiratorias, la cual comprende: una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista del receptor de factor de crecimiento de epidermis (EGF-R) en una dosis suficiente para reducir la hiperplasia de células goblet en las vías respiratorias; y y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  18. 18. - La formulación tal y como se describe en la reivindicación 17, en donde el antagonista de EGF-R es un inhibidor de cinasa selectivo para EGF-R.
  19. 19.- La formulación tal y como se describe en la reivindicación 18, en donde el antagonista de EGF-R inhibe la transfosforilación del EGF-R.
  20. 20.- La formulación tal y como se describe en la reivindicación 19, en donde el antagonista es un antioxidante.
  21. 21.- La formulación tal y como se describe en la reivindicación 17, en donde el antagonista es un anticuerpo.
  22. 22.- La formulación tal y como se describe en la reivindicación 21, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que se enlaza específicamente con el factor de crecimiento de epidermis (EGF).
  23. 23.- La formulación tal y como se describe en la reivindicación 21, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que se enlaza específicamente el receptor de factor de crecimiento de epidermis (EGF-R).
  24. 24.- La formulación tal y como se describe en la reivindicación 17, en donde el antagonista inhibe la liberación de un ligante EGF-R transmembrana.
  25. 25. - La formulación tal y como se describe en la reivindicación 24, en donde el antagonista es un inhibidor selectivo de una metaloproteinasa que porta la liberación del ligante EGF-R transmembrana.
  26. 26. - Un método para el tratamiento de los pólipos nasales, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista del receptor de un factor de crecimiento de epidermis (EGF-R) a un paciente que sufre de pólipos nasales. RES U M EN La hipersección de mucosa en los pulmones es inhibida mediante la admi nistración de un antagonista del receptor de factor de crecimiento de la epidermis (EG F-R). El antagonista de EGF-R puede ser en la forma de una molécula orgánica peq ueña, un anticuerpo , o porción de un anticuerpo que se en laza a , y bloquea el receptor de EGF. El antagonista de EGF-R es administrado de preferencia, por medio de la inyección de una cantidad suficiente para i nhibir la formación de células gobiet en las vías respiratorias pu lmonares. De este modo se i nhibe la desg ran ulación de las cél ulas gobiet que es el resultado de la producción de mucosa en las vías respiratorias. También se proporcionan ensayos para seleccionar agentes candidatos que inhiben la proliferación de células gobiet.
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