PL200940B1 - Zastosowanie antagonisty receptora naskórkowego czynnika wzrostowego (EGF-R) i postać farmaceutyczna do leczenia nadmiernego wydzielania śluzu dróg oddechowych - Google Patents

Zastosowanie antagonisty receptora naskórkowego czynnika wzrostowego (EGF-R) i postać farmaceutyczna do leczenia nadmiernego wydzielania śluzu dróg oddechowych

Info

Publication number
PL200940B1
PL200940B1 PL351765A PL35176599A PL200940B1 PL 200940 B1 PL200940 B1 PL 200940B1 PL 351765 A PL351765 A PL 351765A PL 35176599 A PL35176599 A PL 35176599A PL 200940 B1 PL200940 B1 PL 200940B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
egf
cells
goblet
antagonist
mucus
Prior art date
Application number
PL351765A
Other languages
English (en)
Other versions
PL351765A1 (en
Inventor
Jay A. Nadel
Kiyoshi Takeyama
Original Assignee
Univ California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ California filed Critical Univ California
Publication of PL351765A1 publication Critical patent/PL351765A1/xx
Publication of PL200940B1 publication Critical patent/PL200940B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/10—Expectorants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/12—Mucolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Abstract

Wynalazek zapewnia zastosowanie antago- nisty receptora naskórkowego czynnika wzro- stowego (EGF-R) do wytwarzania leku, który pozwala na hamowanie nadmiernego wydziela- nia sluzu w p lucach. Wynalazek zapewnia tak- ze posta c farmaceutyczn a do leczenia nad- miernego wydzielania sluzu dróg oddechowych. Antagonista EGF-R mo ze by c w postaci ma lej cz asteczki organicznej, przeciwcia la lub cz esci przeciwcia la, która wi aze si e z lub blokuje re- ceptor EGF. Antagonist e EGF-R podaje si e przez iniekcj e w ilo sci wystarczaj acej do hamo- wania tworzenia si e komórek kubkowych w p lucnych drogach oddechowych. Degranula- cja komórek kubkowych, której wynikiem jest produkcja sluzu dróg oddechowych ulega w ten sposób zahamowaniu. PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy zastosowania antagonisty receptora naskórkowego czynnika wzrostowego (EGF-R) i postaci farmaceutycznej do leczenia nadmiernego wydzielania śluzu dróg oddechowych. Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy hamowania nadmiernego wydzielania śluzu w płucach i drogach oddechowych przez podawanie antagonisty EGF-R. Ponadto, wynalazek pozwala na opracowywanie i ocenianie potencjalnych czynników zdolnych do hamowania nadmiernego wydzielania śluzu w płucach.
W drogach układu oddechowego układ śluzowo-rzęskowy służy jako pierwszy mechanizm obronny do usuwania wdychanych cząstek lub czynników zakaźnych z dróg oddechowych w płucach. Ponadto, substancje obecne w płynach dróg oddechowych służą do ograniczania toksyczności cząstek i inaktywacji czynników zakaźnych. Fizyczny mechanizm kaszlu służy do wydalania śluzu z dróg oddechowych (patrz np. „Foundations of Respiratory Care, Pierson i Kacmarek, red. (1992) Churchill Livingstone Inc., Nowy Jork, Nowy Jork; „Harrison's Principles of Internal Medicine, Fauci i in., red. (1987), wydanie 14, McGraw Hill, Nowy Jork, Nowy Jork).
Układ śluzowo-rzęskowy składa się z nabłonkowych komórek rzęskowych, nabłonkowych komórek kubkowych oraz komórek surowiczych i śluzowych, zlokalizowanych w gruczołach podśluzówkowych. Rzęski otoczone są warstwą wodną (płynem okołorzęskowym), wydzielaną do światła dróg oddechowych przez transport aktywny chlorku i transport bierny wody poprzez nabłonek. Rzęski stykają się ze śluzem unoszącym się na tej warstwie wodnej i przez jednokierunkowy ruch napędzający zapewniają ruch śluzu w kierunku głośni (patrz Pierson i Kacmarek, supra oraz Fauci i in., supra. Śluz wytwarzają nabłonkowe komórki kubkowe i komórki gruczołów podśluzówkowych i wydzielają go do światła drogi oddechowej po degranulacji.
Podczas gdy śluz generalnie ułatwia oczyszczanie z wdychanych cząstek lub czynników zakaźnych, nadmierne wydzielanie śluzu w drogach oddechowych może powodować postępującą niedrożność dróg oddechowych. W obwodowych drogach oddechowych kaszel jest nieskuteczny w oczyszczaniu z produktów wydzielania. Ponadto, z powodu swoich mał ych rozmiarów, drobne drogi oddechowe, zawierające wiele komórek kubkowych, są szczególnie podatne na zatykanie przez śluz. Nadmierne wydzielanie w obrębie dróg oddechowych dotyczy znaczącej liczby osobników; obserwuje się je w szeregu chorobach płucnych, takich jak przewlekłe zapalenie oskrzeli, ostra astma, mukowiscydoza i rozstrzenie oskrzeli.
Nadmierne wydzielanie śluzu jest głównym objawem u pacjentów z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc (COPD) i definiuje stan chorobowy (tj. przewlekły kaszel i wytwarzanie plwociny). Tylko ten stan chorobowy dotyka 14 milionów Amerykanów i może powodować postępujące inwalidztwo i ś mierć . Oszacowano, ż e astma dotyka co najmniej 4% populacji Stanów Zjednoczonych Ameryki i odpowiada za co najmniej 2000 zgonów rocznie (Pierson i Kucmarek, supra). Podczas ostrego napadu astmy, ściany oskrzeli pęcznieją, wzrasta objętość śluzu i kurczą się mięśnie gładkie oskrzeli, czego skutkiem jest zwężenie dróg oddechowych. W wyniku nadmiernego wydzielania w ostrej astmie, główną przyczyną stanu chorobowego i umieralności może być rozległe zaczopowanie śluzem.
Nadmierne wydzielanie występuje w mukowiscydozie, która jest jedną z najpowszechniej występujących, śmiertelnych chorób genetycznych na świecie. Mukowiscydoza jest autosomalną chorobą recesywną, która powoduje, że komórki śluzowe dróg oddechowych stają się niezdolne do odpowiedzi na aktywację błonowych kanałów jonów chlorkowych przez zależną od cAMP kinazę białkową (Pierson i Kacmarek, supra i Fauci i in., supra). Występujące w wyniku niezrównoważenie elektrolitów obniża poziom uwodnienia śluzu dróg oddechowych, czego skutkiem jest wysoka lepkość śluzu w płucach osobnika dotkniętego mukowiscydozą. Nadmierne wydzielanie powoduje niedroż ność dróg oddechowych u osobników z mukowiscydozą, dalej upośledzając funkcję płuc.
Inną chorobą, w której występuje nadmierne wydzielanie, jest przewlekła obturacyjna choroba płuc (COPD). W patogenezie COPD ważną rolę odgrywa stres oksydacyjny. Dym papierosowy, który powoduje powstawanie wolnych rodników tlenowych, odgrywa znaczną rolę w patogenezie. W miejscu stanu zapalnego w COPD często obserwuje się granulocyty obojętnochłonne i, co interesujące, wiadomo, że granulocyty obojętnochłonne uwalniają wolne rodniki tlenowe podczas aktywacji.
Często u pacjentów z różnymi chorobami płucnymi konieczna jest mechaniczna intubacja w celu zapewnienia wspomaganej wentylacji. Rurkę wprowadza się poprzez część ustną gardła i umieszcza w tchawicy. Dla zapobiegania uchodzenia powietrza wokół rurki wewnątrztchawiczej, w dolnej tchawicy wokół rurki napompowuje się balonik, który może ocierać nabłonek i powodować metaplazję
PL 200 940 B1 komórek kubkowych. Zranienie nabłonka prowadzi do procesu gojenia, wynikiem którego może być obfite wydzielanie śluzu. Taka przedłużona intubacja dotchawicza u pacjentów może prowadzić do szkodliwych wpływów z powodu nadmiernego wydzielania.
W wyniku wysokich poziomów ś luzu w pł ucach pacjentów z chorobami pł ucnymi zwią zanymi z nadmiernym wydzielaniem, zmniejszone jest oczyszczanie za pośrednictwem śluzu. Czynniki patologiczne, takie jak bakterie, np. Pseudomonas aeruginosa, często rozwijają kolonie w śluzie, co prowadzi do częstych infekcji płuc.
Klasyczne wzorce leczenia osobników z nadmiernym wydzielaniem dróg oddechowych obejmują terapię antybiotykową, lekami rozszerzającymi oskrzela (np. metyloksantynami, lekami sympatykomimetycznymi o silnych właściwościach pobudzających receptory adrenergiczne β2, lekami antycholinergicznymi), stosowanie ogólnoustrojowo lub wziewnie kortykosteroidów, przede wszystkim w astmie, upłynnianie śluzu przez doustne podawanie środków wykrztuśnych, np. gwajafenazyny, oraz dostarczanie w aerozolu czynników „mukolitycznych, np. wody, hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej (patrz Harrison's, supra). Nową terapią w przypadku mukowiscydozy jest podawanie DNazy w celu działania na bogaty w DNA śluz lub plwocinę (Shak i in. (1990) Proc. Natl. Acad. (USA) 87: 9188-9192; Hubbard, R. C. i in., (1991) N. Engl. J. Med. 326: 812). Ponadto, można również stosować fizjoterapię klatki piersiowej, obejmującą opukiwanie, wibracje i drenaż, w celu ułatwiania oczyszczenia z lepkiego śluzu. Dla osób z poważnymi uszkodzeniami płuc, ostateczną możliwością może być przeszczep płuc. Dlatego też, potrzebna jest bardziej skuteczna lub alternatywna terapia skierowana wobec wydzielin śluzowych. Szczególnie, istnieje potrzeba specyficznego sposobu działania, który obniżać będzie tworzenie wydzielin śluzowych w drogach oddechowych.
Przeglądu stosowania inhibitorów EGF do blokowania wzrostu komórek nowotworowych dokonali Levitski (1994) Eur. J. Blochem. 226 (1): 1-13; Powis (1994) Pharmac. Ther. 62: 57-95; Kondapaka i Reddy (1996) Mol. Cell. Endocrin. 117: 53-58.
Nadmierne wydzielanie śluzu w drogach oddechowych jest niepomyślnym objawem w licznych, różnych chorobach płucnych. Wydzielanie jest wynikiem degranulacji komórek kubkowych, których proliferację pobudza stymulacja receptorów naskórkowego czynnika wzrostowego (EGF-R).
Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania antagonisty receptora naskórkowego czynnika wzrostowego (EGF-R) do wytwarzania leku do leczenia nadmiernego wydzielania śluzu w płucach u pacjenta cierpiącego na nadmierne wydzielanie śluzu w drogach oddechowych podawanego w terapeutycznie skutecznej ilości, przy czym wspomniany antagonista EGF-R jest inhibitorem kinazy specyficznym wobec EGF-R.
W zastosowaniu według wynalazku antagonistę podaje się przez iniekcję.
Korzystnie antagonistę podaje się dożylnie z nośnikiem w postaci zwykłego roztworu soli.
Także korzystnie antagonistę podaje się przez inhalację. Antagonistę dostarcza się także w liposomach, które bardziej korzystnie są przestrzennie stabilizowane i podaje się je dożylnie.
Przedmiotem wynalazku jest także postać farmaceutyczna do leczenia nadmiernego wydzielania śluzu dróg oddechowych, charakteryzująca się tym, że zawiera: terapeutycznie skuteczną ilość antagonisty receptora naskórkowego czynnika wzrostowego (EGF-R) stanowiącą dawkę wystarczającą do zmniejszenia nadmiernego wydzielania śluzu dróg oddechowych; przy czym wspomnianym antagonistą EGF-R jest inhibitor kinazy specyficzny wobec EGF-R oraz odpowiedni do dostarczania przez inhalacje czynnik płynny.
W postaci farmaceutycznej według wynalazku antagonista wobec EGF-R jest opracowywany z nośnikiem płynnym i propelentem, lub także korzystnie antagonista wobec EGF-R jest sporządzany w roztworze wodnym lub etanolowym, bardziej korzystnie antagonista wobec EGF-R jest w postaci suchego proszku, lub też najbardziej korzystnie wspomniana postać jest przetwarzana w areozol.
Postać farmaceutyczna według wynalazku dodatkowo zawiera czynnik wybrany z grupy obejmującej czynniki mukolityczne, środki wykrztuśne i leki rozszerzające oskrzela.
Antagoniści mogą mieć postać małych cząsteczek, przeciwciał lub części przeciwciał, które wiążą albo EGF, albo jego receptor. W innym aspekcie wynalazku zapewnia się sposoby oszacowywania in vitro i in vivo siły terapeutycznej potencjalnych czynników do hamowania nadmiernego wydzielania śluzu.
Wynalazek został zilustrowany na rysunkach oznaczonych jako fig. A-fig. 5, na których:
Fig. 1A jest biotem typu Western EGF-R w komórkach NCI-H292 i A431. Figura 1B, immunocytochemiczna analiza z przeciwciałem skierowanym przeciw EGF-R w hodowlach komórek NCI-H292. Figura 1C, analiza typu Northern EGF-R w komórkach NCI-H292.
PL 200 940 B1
Fig. 2. Wybarwianie błękitem Alcian/PAS komórek NCI-H292 w celu identyfikacji glikoprotein mucyny.
Fig. 3. Analiza typu Northern ekspresji genu MUC5 w komórkach NCI-H292.
Fig. 4A i 4B. Immunohistochemiczna analiza EGF-R z przeciwciałem skierowanym przeciw
EGF-R u szczurów wolnych od patogenów. Figura 4A, szczury traktowane TNF-α. Figura 4B, szczury uczulane owoalbumin ą .
Fig. 5 jest wykresem przedstawiającym wpływ inhibitora kinazy tyrozynowej EGF-R (BIBX1522) na wytwarzanie komórek kubkowych (wyrażonym jako % wybarwionego obszaru w nabłonku dróg oddechowych zajętego przez komórki dodatnio wybarwione błękitem Alcian/PAS.
Antagoniści mogą mieć postać małych cząsteczek, przeciwciał lub części przeciwciał, które wiążą się z albo EGF, albo jego receptorem. W chorobach związanych z nadmiernym wydzielaniem dróg oddechowych, np. przewlekłym zapaleniu oskrzeli, rozstrzeniu oskrzelowym, mukowiscydozie, ostrej astmie, COPD itp., zwiększona jest synteza mucyny w drogach oddechowych i występuje nadmierne wydzielanie śluzu. Wynikiem wydzielanego śluzu jest niedrożność dróg oddechowych, efekt, który powoduje śmierć w tych chorobach.
W niniejszym opisie wykazano, że kilka przyczyn uszkodzenia dróg oddechowych indukuje ekspresję receptora naskórkowego czynnika wzrostowego w komórkach nabłonka dróg oddechowych. Po indukcji EGF-R, wynikiem późniejszej stymulacji EGF-R przez mechanizmy zarówno zależne, jak i niezależne od liganda, jest wytwarzanie mucyny na poziomie zarówno ekspresji genu, jak i białka. Wykazano, że selektywne inhibitory kinazy tyrozynowej EGF-R blokują ten gen mucyny i ekspresję białka.
Sekwencja ewolucyjna tworzenia się komórek kubkowych może opierać się na ekspresji EGF-R. Stymulacja przez TNF-α indukuje intensywne wybarwianie EGF-R nieziarnistych komórek wydzielniczych; ich późniejsza aktywacja przez ligandy EGF-R powoduje postępujące wybarwianie glikokoniugatów śluzu w cytoplazmie i komórki stają się komórkami „prekubkowymi, a następnie „kubkowymi. Dane sugerują, że aktywacja EGF-R pobudza selektywne różnicowanie komórek, ale nie proliferację. Komórki kubkowe najwidoczniej pochodzą od nie-ziarnistych komórek wydzielniczych, w których zachodzi ekspresja EGF-R i które stymulowane są przez ligandy EGF-R do wytwarzania mucyn.
Poza stymulacją przez cytokiny, EGF-R może być stymulowany przez inne pośredniki przekazywania sygnałów. Na przykład, przedłużone palenie papierosów związane jest z postępującymi patologicznymi zmianami w obwodowych drogach oddechowych, włącznie ze zwiększeniem liczby komórek kubkowych. Wykazano, że aktywowane przez stymulujące stan zapalny cytokiny granulocyty obojętnochłonne oraz dym papierosowy powodują syntezę mucyny w ludzkich oskrzelowych komórkach nabłonkowych poprzez niezależną od ligandów aktywację EGF-R, co sugeruje, że te zaktywowane granulocyty obojętnochłonne i dym papierosowy są regulatorami różnicowania komórek nabłonkowych, którego wynikiem jest nienormalna indukcja komórek wytwarzających mucynę w drogach oddechowych. Granulocyty obojętnochłonne aktywowane przez różnorodne bodźce, włącznie z IL-8, N-formylo-metionyloleucylofenyloalaniną, TNF-α, dym papierosowy lub H2O2, zwiększają ekspresję mucyny w komórkach nabłonkowych, którą to syntezę hamują inhibitory EGF-R. Granulocyty obojętnochłonne są również zdolne do wytwarzania ligandów EGF-R, EGF i TGFa. Ponadto, źródłem ligandów EGF-R są komórki nabłonkowe.
Mechaniczne uszkodzenie nabłonka dróg oddechowych również może powodować nadmierne wydzielanie, i jest odpowiedzialne za zatykanie przez śluz. Inhibitory kinazy tyrozynowej służą do zapobiegania nadmiernemu wydzielaniu śluzu po intubacji dotchawiczej.
Uszkodzenie nabłonka powszechnie stwierdza się w badaniach pacjentów, nawet z łagodną astmą, i uszkodzenie to progresywnie koreluje z pogarszaniem się objawów klinicznych. Uszkodzenia nabłonka powodowane przez odpowiedź alergiczną indukują aktywację EGF-R, czego wynikiem jest nienormalne tworzenie komórek kubkowych. EGF-R są zaangażowane w uszkodzeniach nabłonka, na przykład przy „przebudowie dróg oddechowych występującej w astmie, gojeniu i zamykaniu ran. Mechaniczne uszkodzenia nabłonka i uszkodzenia nabłonka w astmie mogą obejmować podobną kaskadę EGF-R, której wynikiem jest nienormalny wzrost nabłonkowych komórek wydzielniczych.
Nadmierne wydzielanie jest również ważnym przejawem zapalnych chorób nosa. Gdy komórki kubkowe nosa są „sprowokowane przez indukcję degranulacji komórek kubkowych z wykorzystaniem mechanizmu zależnego od granulocytów obojętnochłonnych, ekspresja EGF-R i mucyn jest silnie podwyższona. Przypadki te związane są z regranulacją komórek kubkowych. Podczas gdy stan zapalny, taki jak stymulacja naciekania granulocytów obojętnochłonnych, powoduje degranulację komóPL 200 940 B1 rek kubkowych i wydzielanie mucyn, podwyższona ekspresja i aktywacja EGF-R ponownie zaopatruje nabłonek dróg oddechowych w mucyny.
DEFINICJE
Przez „naskórkowy czynnik wzrostowy lub „EGF rozumie się białko lub jego część wykazujące aktywność biologiczną charakteryzującą się mitogenną aktywnością wobec komórek nabłonkowych (np. Cohen (1986) Biosciences Reports 6 (12): 1017; Aaronson, S. A., „Growth Factors and Cancer,
Science (1991) 254: 1146-1153). Przykładem jest ludzki naskórkowy czynnik wzrostowy, na przykład opisany przez Urdea i in. (1983) Proc. Nat. Acad. Sci. 80: 7461-7465.
Przedmiotem szczególnego zainteresowania do celów niniejszego wynalazku jest mitogenna aktywność EGF wobec komórek kubkowych. W zamierzeniu definicja ta obejmuje również białka lub ich części, które są funkcjonalnie równoważne wobec EGF pod względem wywoływanej przez EGF odpowiedzi biologicznej.
Przez „receptor naskórkowego czynnika wzrostowego lub „EGF-R rozumie się białko lub jego część zdolne do wiązania białka EGF lub jego części. Przykładem jest ludzki receptor naskórkowego czynnika wzrostowego (patrz Ullrich i in. (1984) Nature 309: 418-425; numer dostępu Genbank NM_005228). Korzystnie, wiązanie liganda EGF aktywuje EGF-R (czego wynikiem jest np. aktywacja wewnątrzkomórkowego mitogennego szlaku przekazywania sygnałów, autofosforylacja EGF-R). Specjalista w tej dziedzinie będzie wiedzieć, że inne ligandy, poza EGF, mogą wiązać się z EGF-R i aktywować EGF-R. Przykłady takich ligandów obejmują, ale nie ograniczają się do TGF-α, betaceluliny, amfireguliny, wiążącego heparynę EGF (HB-EGF) i neureguliny (znanej również jako hergulina) (Strawn i Shawver (1998) Exp.-Opin. Invest Drugs 7 (4) 553-573 oraz „The Protein Kinase Facts Book: Protein Tyrosine Kinases: (1995) Hardie i in. (red.), Academic Press, NY, NY).
Przez „antagonistę EGF-R rozumie się jakikolwiek czynnik zdolny do bezpośredniego lub pośredniego hamowania wpływu EGF-R, szczególnie wpływu EGF-R na proliferację komórek kubkowych lub nadmierne wydzielanie śluzu przez komórki kubkowe. EGF-R może być aktywowany przez mechanizmy zależny od liganda i niezależny od liganda, czego wynikiem jest odpowiednio albo autofosforylacja, albo transfosforylacja. Będący przedmiotem zainteresowania antagoniści EGF-R mogą hamować jeden lub oba te mechanizmy. Na przykład, wynikiem wiązania TNF-α z EGF-R jest fosforylacja zależna od liganda, którą może blokować przeciwciało wiążące EGF-R, w ten sposób zapobiegając oddziaływaniu EGF z ligandem, który mógłby aktywować receptor EGF. Przykłady takich przeciwciał opisano w Goldstein i in. (1995) Clin. Cancer Res. 1: 1311-1318; Lorimer i in. (1995) Clin. Cancer Res. 1: 859-864; Schmidt i Wels (1996) Br. J. Cancer 74: 853-862. Jako antagoniści EGF-R skuteczne są również małe cząsteczki będące inhibitorami kinazy tyrozynowej.
Alternatywnie, wykazano, że takie związki, jak wolne rodniki tlenowe, stymulują transfosforylację EGF-R, czego wynikiem jest niezależna od liganda aktywacja receptora.
Inne sposoby aktywowania EGF-R przez transfosforylację obejmują światło ultrafioletowe lub stres osmotyczny, stymulację receptora sprzężonego z białkiem G przez endotelinę 1, kwas lizofosfatydowy i trombinę, muskarynowego receptora acetylocholiny ml i ludzki hormon wzrostu. Antagoniści tego mechanizmu niezależnego od liganda obejmują związki przeciwutleniające, takie jak dysmutaza ponadtlenkowa, DMSO, DMTU, kwas askorbinowy i podobne.
Antagonistą EGF-R może być przeciwciało, które wiąże się z czynnikiem stymulującym wytwarzanie EGF lub wytwarzanie EGF-R, hamując w ten sposób pobudzanie proliferacji komórek kubkowych przez EGF (tj. inhibitor kaskady fosforylacji, prowadzącej do fosforylacji EGF-R). Na przykład, Arteaga i in. (1995) Cancer Res. 54: 4703-4709, opisali białko fuzyjne TGFa-egzotoksyna 40 Pseudomonas.
W korzystnym rozwiązaniu, antagonistą EGF-R jest inhibitor aktywności kinazy tyrozynowej EGF-R, szczególnie inhibitory będące małymi cząsteczkami wykazujące selektywne działanie na EGF-R w porównaniu z innymi kinazami tyrozynowymi - korzystne małe cząsteczki blokują naturalny receptor EGF u ssaka, korzystnie człowieka, i posiadają masę cząsteczkową niższą niż 1 kD.
Inhibitory EGF i EGF-R obejmują, ale nie ograniczają się do inhibitorów kinazy tyrozynowej, takich jak chinazoliny, takie jak PD 153035, 4-(3-chloroanilino)chinazolina, lub CP-358 774, pirydopirymidyny, pirymidopirymidyny, pirolopirymidyny, takie jak CGP 59326, CGP 60261 i CGP 62706, oraz pirazolopirymidyny (Shawn i Shawver, supra), 4-(fenyloamino)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyny (Traxler i in., (1996) J. Med. Chem. 39: 2285-2292), kurkumina (diferuloilometan) (Laxmin arayana i in., (1995) Carcinogen 16: 1741-1745), 4,5-bis(4-fluoroanilino)ftalimid (Buchdunger i in. (1995) Clin. Cancer Res. 1: 813-821; Dinney i in. (1997) Clin. Cancer Res. 3: 161-168); tyrfostyny zawierające reszty nitrotiofe6
PL 200 940 B1 nowe (Brunton i in. (1996) AntiCancer Drug Design 11: 265-295); inhibitor kinaz białkowych ZD-1839 (AstraZeneca); CP-358774 (Pfizer, Inc.); PD-0183805 (Warner-Lambert) lub opisane w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym numer WO99/09016 (American Cyanamid); międzynarodowym zgłoszeniu patentowym numer WO98/43960 (American Cyanamid); międzynarodowym zgłoszeniu patentowym numer WO97/38983 (Warener Labert); międzynarodowym zgłoszeniu patentowym numer WO99/06378 (Warner Lambert); międzynarodowym zgłoszeniu patentowym numer WO99/06396 (Warner Lambert); międzynarodowym zgłoszeniu patentowym numer WO96/30347 (Pfizer, Inc.); międzynarodowym zgłoszeniu patentowym numer WO96/33978 (Zeneca); międzynarodowym zgłoszeniu patentowym numer W096/33977 (Zeneca) i międzynarodowym zgłoszeniu patentowym numer WO96/33980 (Zeneca), wszystkie włączone do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe; lub cząsteczki antysensowne.
Przez „hamowanie rozumie się zmniejszanie, neutralizację, osłabianie lub zapobieganie proliferacji komórek kubkowych, degranulacji komórek kubkowych lub nadmiernemu wydzielaniu śluzu przez komórki kubkowe.
Terminy „leczenie, „traktowanie i podobne stosuje się w niniejszym opisie w ogólnym znaczeniu otrzymywania pożądanego wpływu farmakologicznego i/lub fizjologicznego. Wpływ może być profilaktyczny, polegający na całkowitym lub częściowym zapobieganiu chorobie lub jej objawom i/lub może być terapeutyczny, polegający na częściowym lub całkowitym wyleczeniu choroby i/lub skutków ubocznych związanych z chorobą. „Leczenie w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie obejmuje jakiekolwiek traktowanie choroby u ssaka, szczególnie człowieka, i obejmuje:
(a) zapobieganie wystąpienia choroby lub objawu u osobnika, który może być predysponowany do choroby lub objawu, ale jeszcze nie rozpoznano ich u niego;
(b) hamowanie choroby lub objawu, tj. zatrzymanie ich rozwoju; lub (c) łagodzenia choroby lub objawu, tj. powodowanie ustępowania choroby lub objawu. Wynalazek jest ukierunkowany na leczenie pacjentów z chorobą płuc lub dróg oddechowych, a w szczególności jest ukierunkowany na leczenie nadmiernego wydzielania śluzu u pacjentów, tj. zapobieganiu, hamowaniu lub łagodzeniu nadmiernego wydzielania śluzu. Pod względem leczenia objawów, wynalazek jest ukierunkowany na obniżanie ilości śluzu lub plwociny w drogach oddechowych, hamowanie infekcji wywoływanych przez organizmy patogenne, łagodzenie kaszlu i zapobieganie niedotlenieniu w wyniku zatykania dróg oddechowych.
Bardziej szczegółowo, „leczenie w zamierzeniu oznacza zapewnianie terapeutycznie wykrywalnego i korzystnego wpływu na pacjenta cierpiącego na chorobę płucną, w której występuje nadmierne wydzielanie śluzu.
Jeszcze bardziej szczegółowo, „leczenie oznacza zapobieganie, łagodzenie i/lub hamowanie nadmiernego wydzielania śluzu związkiem wybranym z grupy składającej się z antagonistów EGF i/lub EGF-R, takich jak przeciwciała, inhibitory tyrozynowej kinazy białkowej i cząsteczki antysensowne oraz podobne. Alternatywne leczenie może obejmować zapobieganie ekspresji EGF-R w drogach oddechowych, w ten sposób blokując szlak na najwcześniejszym etapie. Na przykład, reagenty, które blokują wiązanie TNFa z jego receptorem, mogą zapobiegać podwyższonej ekspresji EGF-R.
Leczenie obejmuje zapobieganie lub hamowanie infekcji, wywoływanej przez czynniki patogenne, powodowanej przez i/lub związanej z nadmiernym wydzielaniem śluzu.
Przez „przeciwciało rozumie się białko immunoglobuliny, które jest zdolne do wiązania antygenu. Przeciwciało w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie rozumie się jako obejmujące fragmenty przeciwciał, np. F(ab')2, Fab', Fab, zdolne do wiązania będącego przedmiotem zainteresowania antygenu lub fragmentu antygenowego. Korzystnie, wiązanie przeciwciała z antygenem hamuje aktywność EGF lub EGF-R.
Termin „przeciwciało humanizowane stosuje się tu do opisu pełnych cząsteczek przeciwciał, tj. złożonych z dwóch pełnych łańcuchów lekkich i dwóch pełnych łańcuchów ciężkich, jak również przeciwciał składających się tylko z fragmentu przeciwciała, np. fab, Fab', F(ab')2 i Fv, w których CDR pochodzą ze źródła innego niż człowiek, a pozostała część cząsteczki Ig pochodzi z przeciwciała ludzkiego, korzystnie utworzonego z zastosowaniem sekwencji kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało ludzkie.
Terminy „przeciwciało ludzkie i „przeciwciało humanizowane stosuje się tu do opisu przeciwciała, którego wszystkie części cząsteczki przeciwciała pochodzą od sekwencji kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało ludzkie. Takie przeciwciała ludzkie są najbardziej pożądane do stosowania
PL 200 940 B1 w terapiach przeciwciałami, ponieważ takie przeciwciała powinny wywoływać niewielką lub nie wywoływać odpowiedzi immunologicznej u pacjenta będącego człowiekiem.
Termin „przeciwciało chimeryczne stosuje się tu do opisu cząsteczki przeciwciała, jak również fragmentów przeciwciała, jak opisano powyżej w definicji terminu „przeciwciało humanizowane. Termin „przeciwciało chimeryczne obejmuje przeciwciała humanizowane. Przeciwciała chimeryczne posiadają co najmniej jedną część sekwencji aminokwasowej łańcucha ciężkiego lub lekkiego pochodzącą z pierwszego gatunku ssaka i inną część sekwencji aminokwasowej łańcucha ciężkiego lub lekkiego pochodzącą z drugiego, innego gatunku ssaka. Korzystnie, region zmienny pochodzi z gatunku ssaka nie będącego człowiekiem, a region stały pochodzi z człowieka. W szczególności, przeciwciało chimeryczne wytwarza się z zastosowaniem sekwencji nukleotydowej z ssaka nie będącego człowiekiem, kodującej region zmienny, oraz sekwencji nukleotydowej człowieka, kodującej stały region przeciwciała.
Przez „wiąże się specyficznie rozumie się wiązanie o wysokiej zachłanności i wysokim powinowactwie przeciwciała z określonym polipeptydem. Wiązanie przeciwciała z jego epitopem na określonym polipeptydzie jest silniejsze, niż wiązanie tego samego przeciwciała z jakimkolwiek innym epitopem, szczególnie tym, który może być obecny w cząsteczkach razem z, lub w tej samej próbce, co określony polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania. Przeciwciała, które wiążą się specyficznie z polipeptydem bę d ą cym przedmiotem zainteresowania, mogą być zdolne do wią zania innych polipeptydów na słabym, jeszcze wykrywalnym poziomie, np. 10% lub mniej wiązania wykazywanego wobec polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania. Takie słabe wiązanie, lub wiązanie tła, jest łatwo odróżnialne od specyficznego wiązania przeciwciała ze związkiem lub polipeptydem będącym przedmiotem zainteresowania, np. przez zastosowanie odpowiednich kontroli.
Przez „wykrywalnie wyznakowane przeciwciało, „wykrywalnie wyznakowane przeciwciało skierowane przeciw EGF lub „wykrywalnie wyznakowany fragment przeciwciała skierowanego przeciw EGF rozumie się przeciwciało (bądź fragment przeciwciała, który zachowuje specyficzność wiązania), posiadające przyłączony wykrywalny znacznik. Wykrywalny znacznik normalnie przyłącza się przez koniugację chemiczną, ale jeśli znacznikiem jest polipeptyd, może zostać on alternatywnie przyłączony technikami inżynierii genetycznej. Metody wytwarzania wykrywalnie wyznakowanych białek są dobrze znane w nauce. Wykrywalne znaczniki można wybierać spośród szeregu takich znaczników znanych w nauce, ale zazwyczaj są nimi izotopy promieniotwórcze, fluorofory, enzymy, np. peroksydaza chrzanu, lub inne grupy lub związki, które albo emitują wykrywalny sygnał (np. promieniotwórczość, fluorescencja, barwa), albo emitują wykrywalny sygnał po ekspozycji znacznika na jego substrat. Różne pary wykrywalny znacznik/substrat (np. peroksydaza chrzanu/diaminobenzydyna, awidyna/streptawidyna, lucyferaza/lucyferyna), metody znakowania przeciwciał i metody stosowania wyznakowanych przeciwciał do wykrywania antygenu są dobrze znane w nauce (na przykład, patrz Harlow i Lane, red. (Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku można zapewnić leczenie nadmiernego wydzielania płucnego przez podawanie terapeutycznych ilości antagonistów EGF-R. Można w ten sposób leczyć każdą chorobę, a w szczególności chorobę płucną charakteryzującą się nadmiernym wydzielaniem śluzu lub akumulacją patologicznych poziomów śluzu. Przykłady chorób płucnych, w których występuje nadmierne wydzielanie i które można leczyć tym sposobem obejmują, ale nie ograniczają się do przewlekłych obturacyjnych chorób płuc, takich jak przewlekłe zapalenie oskrzeli, chorób zapalnych, takich jak astma, rozstrzenie oskrzeli, mukowiscydoza, COPD, choroby związane z nadmiernym wydzielaniem nosa, np. alergie nosowe, oraz inne choroby związane z nadmiernym wydzielaniem. W zamierzeniu włącza się również choroby genetyczne, takie jak mukowiscydoza, zespół Kartengenera, niedobór alfa-1-antytrypsyny, rodzinne nie-mukowiscydozowe zagęszczenie śluzu dróg oddechowych.
Korzystni są antagoniści, których bezpośrednim celem jest EGF lub EGF-R. Jednakże, specjalista w tej dziedzinie będzie wiedzieć, że celem dla hamowania może być jakikolwiek czynnik lub komórka, zaangażowane w kaskadzie biologicznej, której wynikiem jest pobudzana przez EGF-R proliferacja komórek kubkowych, np. antagoniści TGF-α. Kaskada biologiczna zaczyna się podczas odpowiedzi zapalnej, gdy takie komórki, jak komórki tuczne lub granulocyty obojętnochłonne uwalniają TNF -α, który następnie pobudza ekspresję EGF-R. Stymulacja EGF-R, np. przez jego ligand EGF, wyzwala z kolei proliferację komórek kubkowych. A zatem, celem aktywności antagonisty mogą być jakiekolwiek komórki lub czynniki uczestniczące w kaskadzie, takie jak ze szlaku TNF-α.
PL 200 940 B1
Podawany Antagonista EGF-R może mieć jakąkolwiek postać. Dla przykładu, antagonista
EGF-R może mieć postać małej cząsteczki (tj. oligonukleotydu antysensownego, inhibitora kinazy tyrozynowej itp.), przeciwciał lub części przeciwciał, które wiążą EGF, TGFa lub EGF-R.
NISKOCZĄSTECZKOWI ANTAGONIŚCI EGF-R
W nauce znane są inhibitory kinazy tyrozynowej, które działają na receptor EGF i które są selektywne wobec EGF-R, i można je stosować w podanych sposobach. Przykłady opisano powyżej i mogą one obejmować BIBX1522 (Boehringer Ingelheim, Inc., Ingelheim, Niemcy); CGP59326B (Novartis Corporation, Basel, Szwajcaria); 4-aminochinazolinowe inhibitory EGF (opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 760 041); podstawione związki styrenu, którymi mogą również być naftalen, indan lub benzoksazyna; związki nitrylu i molononitrylu (opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 217 999); inhibitory ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 773 476; inhibitor karboksypeptydazy z ziemniaka (PCI), 39-aminokwasowy inhibitor proteazy z trzema mostkami disiarczkowymi (Blanco-Aparicio i in. (1998) J. Biol. Chem. 273 (20): 12370-12377); antagonista bombezyny RC-3095 (Szepeshazi i in. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci USA 94: 10913-10918) itp. Inne inhibitory kinazy tyrozynowej obejmują chinazoliny, takie jak PD 153035, 4-(3-chloroanilino)chinazolina, lub CP-358 774, pirydopirymidyny, pirymidopirymidyny, pirolopirymidyny, takie jak CGP 59326, CGP 60261 i CGP 62706, oraz pirazolopirymidyny (Shawn i Shawver, supra), 4-(fenyloamino)-7H-pirolo[2,3-d]pirymidyny (Traxler i in. (1996) J. Med. Chem. 39: 2285-2292), kurkuminę (Korutla i in. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1224: 597-600); (Laxmin arayana i in., (1995) Carcinogen 16: 1741-1745) itp.
Korzystne inhibitory kinaz tyrozynowych są specyficzne wobec receptora EGF, tj. EGF-R hamowany jest w wyższym stopniu, niż inne receptory powierzchni komórkowych, posiadające aktywność kinazy tyrozynowej. Selektywność wzmacnia się przez sposoby dostarczania postaci farmaceutycznych i leków, np. kiedy inhibitor preferencyjnie dostarcza się do objętych stanem zapalnym dróg oddechowych itp.
Typowe dawki do podawania ogólnoustrojowego pozostają w zakresie od 0,1 μg do 100 miligramów na kg wagi osobnika na jedno podanie. Dla specjalistów będzie zrozumiałe, że poziomy dawek można różnicować w zależności od określonego związku, ciężkości objawów i podatności osobnika na wpływy uboczne. Niektóre ze specyficznych związków są silniejsze od innych. Korzystne dawki danego związku są łatwe do określenia, przy wykorzystaniu różnych sposobów, przez specjalistów w tej dziedzinie. Korzystnym sposobem jest pomiar fizjologicznej siły działania danego związku, na przykład z zastosowaniem opisanych w niniejszym opisie testów in vitro i in vivo.
PRZECIWCIAŁA JAKO ANTAGONIŚCI EGF-R
Przeciwciała jako antagoniści EGF-R są przedmiotem szczególnego zainteresowania (np. Viloria i in., American Journal of Pathology 151: 1523). Przeciwciała skierowane przeciw EGF lub EGF-R wytwarza się przez immunizowanie EGF lub EGF-R, bądź ich częściami, ksenogennego, immunokompetentnego gospodarza będącego ssakiem, obejmującego myszy, gryzonie, zającowate, owce świnie, bydło itp. Korzystnie, jako immunogeny stosuje się ludzkie EGF lub EGF-R bądź ich części. Wybór określonego gospodarza zależy w pierwszym rzędzie od wygody. Immunizacje prowadzi się zgodnie z konwencjonalnymi technikami, zgodnie z którymi immunogen można zwierzęciu będącemu gospodarzem podawać podskórnie, domięśniowo, dootrzewnowo, donaczyniowo itp. Zazwyczaj jako immunogen stosować się będzie od około 1,0 mg/kg do około 10 mg/kg EGF lub EGF-R dootrzewnowo co drugi dzień. Iniekcje mogą być z lub bez adiuwanta, np. kompletnego lub niekompletnego adiuwanta Freunda, Specol, ałunu itp. Po zakończeniu harmonogramu immunizacji, anytysurowicę można zbierać zgodnie z konwencjalnymi sposobami w celu uzyskania poliklonalnych antysurowic specyficznych wobec EGF lub EGF-R.
Z immunizowanych zwierząt wytwarza się przeciwciała albo monoklonalne, albo poliklonalne, korzystnie przeciwciała monoklonalne. Antysurowice poliklonalne można zbierać z surowicy konwencjonalnymi sposobami od zwierząt po zakończeniu harmonogramu immunizacji. Do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych, z odpowiedniej tkanki limfatycznej, np. śledziony, drenażowanego węzła chłonnego itp. zbiera się limfocyty i poddaje je fuzji z odpowiednim partnerem fuzyjnym, zazwyczaj linią szpiczaka, tworząc hybrydomę wydzielającą specyficzne przeciwciało monoklonalne. Przeszukiwanie klonów hybrydom pod kątem będącej przedmiotem zainteresowania specyficzności antygenowej prowadzi się zgodnie z konwencjonalnymi sposobami.
Przedmiotem szczególnego zainteresowania są przeciwciała, korzystnie przeciwciała monoklonalne, które wiążą się z EGF-R lub EGF w taki sposób, że hamują wiązanie EGF z EGF-R, np. przePL 200 940 B1 ciwciała, które specyficznie wiążą się z zewnątrzkomórkową domeną EGF-R, w ten sposób zapobiegając wiązaniu EGF. Przeciwciała takie można przygotowywać stosując opisaną powyżej konwencjonalną metodologię, bądź są one dostępne komercjalnie. Przykłady przeciwciał, które mogą działać jako antagoniści EGF, obejmują, ale nie ograniczają się do neutralizującego przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciw EGF-R C225 (Kawamoto i in. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80: 1337-1341; petit i in. (1997) J. Path. 151: 1523-153, wytwarzane przez ImClone Systems, Nowy Jork, NY) oraz skierowanego przeciw EGF-R przeciwciała monoklonalnego EMD55900 (nazywanego również Mab 425 (Merck, Darmstadt, Niemcy).
Będące przedmiotem zainteresowania przeciwciała można wytwarzać jako przeciwciała jednołańcuchowe, zamiast posiadających normalną budowę multimeryczne. Przeciwciała jednołańcuchowe opisano w Jost i in. (1994) J. B. C. 269: 26267-73, i innych pracach. Sekwencje DNA kodujące region zmienny łańcucha ciężkiego i region zmienny łańcucha lekkiego liguje się z odstępnikiem kodującym co najmniej 4 aminokwasy, będące małymi aminokwasami obojętnymi, obejmującymi glicynę i/lub serynę. Białko kodowane przez tę fuzję umożliwia składanie funkcjonalnego regionu zmiennego, który zachowuje specyficzność i powinowactwo pierwotnego przeciwciała.
Metody humanizowania przeciwciał są znane w nauce. Humanizowane przeciwciało może być produktem pochodzącym ze zwierzęcia posiadającego transgeniczne geny regionu stałego immunoglobuliny ludzkiej (patrz, na przykład, międzynarodowe zgłoszenia patentowe o numerach WO 90/10077 i WO 90/04036. Alternatywnie, przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania można utworzyć technikami rekombinacji DNA, podstawiając domeny CH1, CH2, CH3 i zawiasową i/lub reszt zrębu odpowiadającą sekwencją ludzką (patrz międzynarodowe zgłoszenie patentowe numer WO 92/02190).
Stosowanie cDNA Ig do konstruowania genów chimerycznych immunoglobulin również jest znane w nauce (Liu i in. (1987) P.N.A.S. 84: 3439 oraz (1987) J. Immunol. 139: 3521). Z hybrydomy lub innej komórki wytwarzającej przeciwciało izoluje się mRNA i stosuje do utworzenia cDNA. cDNA będący przedmiotem zainteresowania można zamplifikować przez reakcję łańcuchową polimerazy stosując specyficzne startery (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 4 683 195 i 4 683 202). Alternatywnie, konstruuje się i przeszukuje bibliotekę w celu wyizolowania sekwencji będącej przedmiotem zainteresowania. Sekwencję DNA kodującą zmienny region przeciwciała poddaje się następnie fuzji z sekwencjami ludzkiego regionu stałego. Sekwencje genów ludzkich regionów stałych można znaleźć w Kabat i in. (1991) Seguences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. Publication no. 91-3242. Geny ludzkiego regionu C są łatwo dostępne ze znanych klonów. Ekspresję chimerycznego, humanizowanego przeciwciała prowadzi się następnie konwencjonalnymi metodami.
Fragmenty przeciwciał, takie jak Fv, F(ab')2 i Fab, można przygotowywać przez rozszczepienie nienaruszonego białka, np. proteazą lub przez rozszczepienie chemiczne. Alternatywnie, można zaprojektować skrócony gen. Na przykład, gen chimeryczny kodujący fragment F(ab')2 może obejmować sekwencje DNA kodujące domenę CH1 i region zawiasowy łańcucha H, po którym występuje kodon końca translacji dla otrzymania skróconej cząsteczki.
Osobnikowi cierpiącemu na chorobę, w której występuje nadmierne wydzielanie śluzu można początkowo podawać ilości antagonisty EGF-R w zakresie od około 20 miligramów (mg) do około 400 mg na kg wagi pacjenta dwa razy dziennie, np. przez inhalację.
CZĄSTECZKI ANTYSENSOWNE JAKO ANTAGONIŚCI EGF-R
W innym rozwiązaniu, będącymi przedmiotem zainteresowania czynnikami terapeutycznymi są cząsteczki antysensowne, specyficzne wobec ludzkich sekwencji kodujących EGF lub EGF-R. Podawanym czynnikiem terapeutycznym mogą być oligonukleotydy antysensowne, szczególnie oligonukleotydy syntetyczne posiadające modyfikacje chemiczne w stosunku do natywnych kwasów nukleinowych, bądź konstrukcje kwasów nukleinowych, z których zachodzi ekspresja takich cząsteczek antysensownych, jak RNA. Sekwencja antysensowna jest komplementarna do mRNA stanowiących cel genów EGF lub EGF-R, i hamuje ekspresję produktów tych genów (patrz np. Nyce i in. (1997) Nature 385: 385: 720). Cząsteczki antysensowne hamują ekspresję genu przez zmniejszanie ilości mRNA dostępnego do translacji, poprzez aktywację RNazy H lub zawadę przestrzenną. Można podawać jedną cząsteczkę antysensowną lub ich kombinację, przy czym kombinacja może zawierać wiele różnych sekwencji pochodzących z pojedynczego stanowiącego cel genu lub sekwencje, które są komplementarne do kilku różnych genów.
Korzystnym genem docelowym jest EGF-R lub EGF. Sekwencję genu można uzyskać w powszechnie dostępnej bazy danych (ludzki naskórkowy czynnik wzrostowy, numer dostępu Genbank
PL 200 940 B1
K01166; ludzki mRNA prekursora receptora naskórkowego czynnika wzrostowego, numer dostępu
Genbank X00588). Generalnie, sekwencja antysensowną będzie miała takie same pochodzenie gatunkowe, jak zwierzę będące gospodarzem.
Cząsteczki antysensowne można wytwarzać przez ekspresję całości lub części sekwencji genu docelowego w odpowiednim wektorze, gdzie wektor wprowadza się do komórek docelowych i ulega on w nich ekspresji. Inicjacja transkrypcji będzie zorientowana w taki sposób, że antysensowną nić wytwarzana jest jako cząsteczka RNA. Antysensowny RNA hybrydyzuje z endogenną sensowną nicią mRNA, w ten sposób blokując ekspresję genu docelowego. Można wykorzystać natywny region inicjacji transkrypcji lub egzogenny region inicjacji transkrypcji. Promotor można wprowadzić metodami rekombinacji in vitro, bądź w wyniku homologicznej integracji sekwencji do chromosomu. W nauce znanych jest wiele silnych promotorów, które są aktywne w komórkach mięśniowych, włącznie z promotorem aktyny β, wczesnym i późnym promotorami SV40, promotorem ludzkiego cytomegalowirusa, LTR retrowirusowymi itp.
Wektory transkrypcyjne generalnie posiadają dogodne miejsca restrykcyjne zlokalizowane w pobliżu sekwencji promotora dla zapewniania wstawiania sekwencji kwasów nukleinowych. Można przygotowywać kasetki ekspresyjne zawierające region inicjacji transkrypcji, gen docelowy lub jego część, oraz region terminacji transkrypcji. Kasetki transkrypcyjne można wprowadzać do szeregu wektorów, np. plazmidu; retrowirusa, np. wirusa powolnego; adenowirusa i podobnych, gdzie wektory zdolne są do krótkotrwałego lub stabilnego utrzymywania w komórkach, zazwyczaj w ciągu okresu co najmniej około jednego dnia, lepiej w ciągu okresu co najmniej kilku dni.
Alternatywnie, w korzystnym rozwiązaniu, cząsteczką antysensowną jest syntetyczny oligonukleotyd. Antysensowne oligonukleotydy będą generalnie posiadać długość od około 7 do 500, zazwyczaj od około 12 do 50 nukleotydów, lepiej od około 20 do 35 nukleotydów, gdzie o długości decyduje skuteczność hamowania, specyficzność, włącznie z brakiem reaktywności krzyżowej, i podobne. Stwierdzono, że krótkie oligonukleotydy, o długości od 7 do 8 zasad, mogą być silnymi i specyficznymi inhibitorami ekspresji genów (patrz Wagner i in. (1996) Nature Biotechnology 14: 840-844).
Jako komplementarny do sekwencji antysensownej wybiera się określony region lub regiony sekwencji endogennej sensownej nici mRNA. Wykazano, że 5'-końcowy region mRNA jest szczególnie podatny na hamowanie przez sekwencję antysensowną. Jednakże, ostatnie dowody wskazują, że analiza struktury drugorzędowej mRNA może być ważna w określaniu dostępności miejsc do hamowania. Wybór określonych sekwencji dla oligonukleotydu może opierać się na metodzie empirycznej, gdzie kilka branych pod uwagę sekwencji oznacza się pod względem hamowania ekspresji genu docelowego w modelu zwierzęcym in vitro. Można również stosować kombinację sekwencji, kiedy do komplementacji sekwencją antysensowną wybiera się kilka regionów sekwencji mRNA.
Oligonukleotydy antysensowne można syntetyzować chemicznie metodami znanymi w nauce (patrz Wagner i in. (1993) supra oraz Milligan i in., supra). Korzystne oligonukleotydy modyfikuje się chemicznie w stosunku do ich natywnej struktury fosfodiestrowej w celu zwiększenia ich wewnątrzkomórkowej stabilności i powinowactwa wiązania. W literaturze opisano liczne takie modyfikacje, zmieniające skład chemiczny szkieletu, cukrów i zasad heterocyklicznych.
Oligonukleotydy mogą dodatkowo zawierać grupę kierującą, która wzmacnia pobieranie cząsteczki przez komórkę. Grupa kierująca jest cząsteczką wykazującą specyficzne wiązanie, np. przeciwciało lub jego fragment, która rozpoznaje cząsteczki obecne na powierzchni komórek nabłonkowych płuc, szczególnie komórek nabłonkowych zawierających EGF-R.
W nauce znane są przeciwciała bispecyficzne, przeciwciała chimeryczne i przeciwciała jednołańcuchowe. Odpowiednio przygotowane przeciwciała inne niż ludzkie można humanizować w różny sposób. W wiązaniu pomiędzy oligonukleotydem i grupą kierującą można wykorzystywać jakąkolwiek konwencjonalną metodę, na przykład może to być wiązanie disiarczkowe, amidowe lub tioeterowe, zależnie od składu chemicznego szkieletu oligonukleotydu. Korzystnie, wiązanie będzie rozszczepiane wewnątrz komórki z uwolnieniem oligonukleotydu.
Oligonukleotydy można koniugować z resztami hydrofobowymi, np. cholesterolem, w celu ochrony przed nukleazami i poprawy transportu przez błony komórkowe. Alternatywnie, koniugacja z poli-L-lizyną lub innymi poliaminami może również wzmacniać dostrczanie do komórki. Dalszą modyfikacją, której można dokonać, jest dodanie składnika interkalującego, takiego jak akrydyna, zdolnego do interkalacji do docelowego mRNA i stabilizacji uzyskiwanej w wyniku hybrydy. Transfekcji oligonukleotydów antysensownych można dokonywać w kombinacji z enzymem(ami), który będzie degradował kompleksy sekwencja antysensowna-mRNA w komórce, np. RNazą H. W podobny spoPL 200 940 B1 sób użyteczne może być jakiekolwiek białko lub enzym, które preferencyjnie degradują lub eliminują dupleks sekwencja antysensowna-mRNA.
Jako alternatywę inhibitorów antysensownych, do hamowania ekspresji genu można stosować związki będące katalitycznymi kwasami nukleinowymi, np. rybozymy, koniugaty antysensowne itp. Rybozymy można syntetyzować in vitro i podawać pacjentowi, lub mogą one być kodowane przez wektor ekspresyjny, z którego rybozym jest syntetyzowany w komórce będącej celem (na przykład, patrz międzynarodowe zgłoszenie patentowe numer WO 9523225, oraz Beigelman i in. (1995) Nucl. Acids Res. 23: 4434-42). Przykłady oligonukleotydów o aktywności katalitycznej opisano w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym numer WO 9506764. Koniugaty oligonukleotydów antysensownych z kompleksem metalu, np. terpyridyloCu(II), zdolnym do pośredniczenia w hydrolizie mRNA, opisano w Bashkin i in. (1995) Appl. Biochem. Biotechnol. 54: 43-56.
POSTACIE FARMACEUTYCZNE
Antagonistów EGF-R można dostarczać w roztworze lub innej farmakologicznie odpowiedniej postaci do podawania, takiej jak zawiesina liposomów. Odpowiednim przeciwciałom lub innemu czynnikowi skierowanemu przeciw EGF można nadawać postać farmaceutyczną do podawania w sposób zazwyczaj stosowany dla podawania takich materiałów. Typowymi postaciami farmaceutycznymi są te podane w Remington's Pharmaceutical Sciences, ostatnie wydanie. Mack Publishing Company, Easton, PA. Drogę podawania wybierać się będzie w oparciu o podawany związek, stan pacjenta i chorobę, która ma być leczona. Jeśli występuje nadmierne wydzielanie śluzu, związek można podawać różnymi drogami, zależnie od ciężkości choroby, np. sytuacje nagłe mogą wymagać podawania dożylnego, w sytuacjach ostrych, ale nie zagrażających życiu, można stosować leczenie doustne, podczas gdy w leczeniu przewlekłym można stosować aerozole.
Do terapeutycznego stosowania w chorobach nosa i dróg oddechowych, korzystne jest dostarczanie miejscowe. Dostarczanie przez inhalację lub aerozole do wdmuchiwania zapewnia wysoki poziom stężeń leku w porównaniu ze stężeniem uzyskanym w wyniku wchłaniania po podaniu ogólnoustrojowym. Alternatywnie, antagonistę EGF można podawać przez iniekcję, włącznie z iniekcją domięśniową, dożylną, podskórną lub dootrzewnową, najkorzystniej iniekcje dożylne i miejscowe. Jednakże, można stosować również inne sposoby podawania, pod warunkiem, że sposoby te umożliwiają wprowadzenie antagonisty EGF-R do krążenia ogolnoustrojowego, tak jak w przypadku przezśluzówkowych lub przezskórnych postaci farmaceutycznych, które można stosować jako czopki, plastry skórne lub donosowo. Właściwie można stosować jakąkolwiek odpowiednią postać farmaceutyczną, która zapewni dostarczenie antagonisty EGF-R do krwiobiegu lub miejscowo do płuc.
Postacie farmarmaceutyczne odpowiednie do iniekcji generalnie obejmują wodne roztwory lub zawiesiny, w których wykorzystuje się sól fizjologiczną, roztwór Hanka lub inne bufory, ewentualnie zawierające czynniki stabilizujące lub inne drugorzędne składniki. Można również stosować preparaty liposomowe i inne postacie mikroemulsji. Antagonistę EGF-R można również dostarczać w postaci zliofilizowanej i rekonstytuować do podawania. Postacie do podawania przezśluzówkowego i przezskórnego generalnie obejmują czynniki, które ułatwiają przechodzenie przez barierę śluzówki lub skóry, takie jak żółć, sole, kwas fusydowy i jego analogi, różne detergenty i podobne. Możliwe jest również podawanie doustne, pod warunkiem, że postać farmaceutyczną zaopatrzy się w odpowiednie otoczki dojelitowe umożliwiające antagoniście EGF-R przetrwanie w przewodzie pokarmowym.
Charakter postaci farmaceutycznej zależeć będzie w pewnym stopniu od charakteru wybranego antagonisty EGF-R. Odpowiednią postać przygotowuje się stosując znane techniki i zasady nadawania postaci, dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. Procent antagonisty EGF-R zawartego w określonej kompozycji farmaceutycznej zależeć będzie również od charakteru postaci, procent antagonisty EGF-R, którym jest przeciwciało będzie zazwyczaj zróżnicowany w szerokim zakresie, od około 1% wagowego do około 85% wagowych.
Istnieje wiele znanych w nauce metod dostarczania wzmacniających pobieranie kwasów nukleinowych przez komórki. Użyteczne układy dostarczające obejmują układy dostarczające wirus Sendai-liposomy (Rapaport i Shai (1994) J. Biol. Chem. 269: 15124-15131), liposomy kationowe, polimeryczne żele lub matryce dostarczające, cewniki z porowatymi balonikami (ujawnione przez Shai i in. (1994) Circulation 90: 955-951 oraz Shai i in. (1994) Gene Therapy 1: 408-414), retrowirusowe wektory ekspresyjne i podobne.
Stosowanie liposomów jako nośników dostarczających jest jedną z metod będących przedmiotem zainteresowania przy stosowaniu z antagonistami EGF-R. Liposomy ulegają fuzji z komórkami w miejscu docelowym i dostarczają zawartość światła do wnętrza komórki. Liposomy utrzymuje się
PL 200 940 B1 w styczności z komórkami w ciągu czasu wystarczającego do zajścia fuzji, stosując różne sposoby do utrzymywania styczności, takie jak izolowanie, czynniki wiążące i podobne. Liposomy można przygotowywać z oczyszczonych białek lub peptydow, które pośredniczą w fuzji błon, takich jak wirusa Sendai lub wirusa grypy itp. Lipidami może być jakakolwiek użyteczna kombinacja znanych lipidów tworzących liposomy, obejmujących lipidy kationowe, takie jak fosfatydylocholina. Pozostałymi lipidami będą zazwyczaj lipidy obojętne, takie jak cholesterol, fosfatydyloseryna, fosfatydyloglicerol i podobne. Do przygotowywania liposomów można stosować procedurę opisaną przez Kato i in. (1991) J. Biol. Chem. 266: 3361.
W korzystnym rozwiązaniu antagonistę EGF-R zamyka się w przestrzennie stabilizowanych „ukrytych liposomach, np. liposomach z glikolem polioksyetylenowym. Gdy takie liposomy wstrzykuje się dożylnie, pozostają one w krążeniu w ciągu długich okresów. Pokapilarne żylne połączenia szczelinowe ulegają otwarciu podczas stanu zapalnego dróg oddechowych i umożliwiają akumulację płynu oraz pozwalają na wnikanie do tkanek cząsteczek, np. dopełniacza, kininogenu, inicjujących kaskady stanu zapalnego. Taki stan zapalny umożliwia selektywne odkładanie liposomów i ich zawartości w tkance objętej stanem zapalnym (Zhang i in. (1998) Pharm. Res. 15: 455-460).
Antagonistów EGF-R można podawać choremu pacjentowi za pomocą farmaceutycznego układu dostarczającego do podawania drogą wziewną. Związkom można nadawać postać odpowiednią do podawania wziewnego. Farmaceutyczny układ dostarczający jest układem, który jest odpowiedni do leczenia układu oddechowego przez miejscowe podawanie antagonistów EGF-R do śluzówki wyścielającej oskrzela. W wynalazku tym można wykorzystywać układ, który zależy od siły sprężonego gazu do wyrzucania antagonistów EGF-R z pojemnika. Do tego celu można wykorzystywać aerozol lub opakowanie ciśnieniowe. W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, termin „aerozol stosuje się w jego konwencjonalnym znaczeniu jako odnoszący się do bardzo drobnych cząstek płynu lub ciała stałego niesionych przez gazowy propelent pod ciśnieniem do miejsca terapeutycznego stosowania. Jeśli w wynalazku tym wykorzystuje się aerozol farmaceutyczny, to aerozol zawiera związek aktywny terapeutycznie, który może być rozpuszczony, zawieszony lub zemulgowany w mieszaninie płynnego nośnika i propelentu. Aerozol może mieć postać roztworu, zawiesiny, emulsji lub preparatu półstałego. Aerozole wykorzystywane w niniejszym wynalazku przeznaczone są do podawania w postaci bardzo drobnych stałych cząstek lub w postaci płynnych mgieł do układu oddechowego pacjenta. Można wykorzystywać różne rodzaje propelentów znanych specjaliście w tej dziedzinie. Przykłady odpowiednich propelentów obejmują, ale nie ograniczają się do węglowodorów lub innego odpowiedniego gazu. W przypadku aerozoli ciśnieniowych, jednostkę dawkowania można określić przez zapewnienie wartości do dostarczania odmierzonej ilości.
Niniejszy wynalazek można również realizować stosując rozpylacz, będący urządzeniem, który tworzy bardzo drobne cząstki płynu o zasadniczo jednolitej wielkości w gazie. Korzystnie, płyn zawierający antagonistów EGF-R jest rozpraszany w postaci kropelek. Małe kropelki mogą być przenoszone przez strumień powietrza poprzez wylot rurki rozpylacza. Uzyskiwana w wyniku mgła przenika do układu oddechowego pacjenta.
Ssakowi potrzebującemu takiej terapii można podawać kompozycję proszkową zawierającą antagonistów EGF-R lub ich analogi, z lub bez środka poślizgowego, nośnika lub propelentu. To rozwiązanie wynalazku można zrealizować stosując konwencjonalne urządzenie do podawania proszkowej kompozycji farmaceutycznej przez inhalację. Na przykład, mieszaninę związku w postaci proszku i odpowiednie podłoże proszkowe, takie jak laktoza lub skrobia, można umieścić w postaci do jednostkowego dawkowania, na przykład, kapsułce lub naboju, np. żelatynowych, lub pakowanych w blistry, z których proszek można podawać za pomocą inhalatora.
Do leczenia choroby płucnej, w której występuje nadmierne wydzielanie można stosować terapie łączone. W szczególności, antagonistów EGF-R można łączyć z konwencjonalnymi lekami łagodzącymi nadmierne wydzielanie, takimi jak leki rozszerzające oskrzela, kortykosteroidy, środki wykrztuśne, czynniki mukolityczne i podobne, dla ułatwienia oczyszczania przez układ śluzowo-rzęskowy.
Zależnie od stanu pacjenta, korzystne może być podawanie postaci farmaceutycznej według niniejszego wynalazku przez iniekcje (np. dożylne) lub przez inhalacje. Pacjentów, którzy posiadają duże ilości śluzu w płucach, nie można, zasadniczo, początkowo leczyć przez inhalacje. Dzieje się tak dlatego, że płuca pacjenta są zbyt zatkane, aby postać aerozolu do inhalacji mogła skutecznie docierać do płuc. Jednakże, po leczeniu przez iniekcje lub, alternatywnie, przy długoterminowym utrzymywaniu terapii lub w sytuacjach, w których płuca pacjenta nie są w znacznym stopniu zatkane, korzystPL 200 940 B1 ne jest podawanie przez inhalacje. Podawanie przez inhalacje jest korzystne, ponieważ mniejsze dawki można dostarczać miejscowo do określonych komórek, które najbardziej wymagają leczenia.
Dzięki podawaniu mniejszych dawek eliminuje się, lub zasadniczo zmniejsza, wszystkie wpływy uboczne. Dzięki podawaniu bezpośrednio do komórek, które najbardziej wymagają leczenia, wpływ leczenia będzie szybszy.
Istnieje kilka rodzajów metodologii inhalacji, które można wykorzystywać w związku z niniejszym wynalazkiem. Antagonistom według niniejszego wynalazku można nadawać zasadniczo trzy różne rodzaje postaci do inhalacji. Po pierwsze, antagonistom według niniejszego wynalazku można nadawać postać z propelentami o niskiej temperaturze wrzenia. Takie postacie generalnie podaje się przez konwecjonalne inhalatory odmierzające dawkę (MDI). Jednakże, konwencjonalne MDI można modyfikować w taki sposób, aby zwiększyć zdolność uzyskiwania powtarzalnego dawkowania przez wykorzystanie technologii, w której mierzy się objętość wdechową i szybkość przepływu u pacjenta, jak dyskutowano w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 5 404 871 i 5 542 410.
Alternatywnie, agonistom według niniejszego wynalazku można nadawać postać roztworów wodnych lub alkoholowych i podawanych przez konwencjonalne rozpylacze. Jednakże, korzystniej, takim roztworom nadaje się postać aerozoli stosując takie urządzenia i układy, jak ujawnione w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 5 497 763, 5 544 646, 5 718 222 i 5 660 166.
Wreszcie, związkom agonistów według niniejszego wynalazku można nadawać postać suchych proszków. Takie postacie można podawać przez zwykłą inhalację suchego proszku po utworzeniu aerozolowej mgły proszku. Technologię przeprowadzenia tego opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 775 320, wydanym 7 lipca 1998 r., oraz w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 740 794, wydanym 21 kwietnia 1998 r.
Odnosząc się do każdego z podanych powyżej opisów patentowych, zgłaszający zwraca uwagę, że te opisy patentowe cytują inne publikacje dotyczące dopłucnego dostarczania leków i takie publikacje mogą odwoływać się do specyficznych metodologii, urządzeń i postaci farmaceutycznych, które można stosować w związku z dostarczaniem agonistów według niniejszego wynalazku. Ponadto, każdy z opisów patentowych w całości włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy w celu ujawnienia postaci farmaceutycznych, urządzeń, opakowań i metodologii postaci do dostarczania agonistów według niniejszego wynalazku.
OZNACZENIA PRZESZUKIWANIA
Potencjalne leki
Oznaczenia przeszukiwania można stosować do identyfikacji aktywnych biologicznie czynników, które są antagonistami EGF. Przedmiotem szczególnego zainteresowania są oznaczenia przeszukiwania pod kątem czynników, które wykazują niską toksyczność wobec komórek ludzkich. Do tego celu można stosować szeroki zakres różnych oznaczeń, obejmujących oznaczenia wiązania wyznakowane białko-białko in vitro, oznaczenia zmiany ruchliwości elektroforetycznej, immunologiczne oznaczenia wiązania białka i podobne. Oczyszczone białko EGF lub EGF-R można również stosować do określania przestrzennej struktury krystalicznej, którą można wykorzystywać do modelowania oddziaływań międzycząsteczkowych, funkcji transportujących itp.
Termin „czynnik w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie opisuje jakąkolwiek cząsteczkę, np. białko lub środek farmaceutyczny, o zdolności zmieniania lub hamowania fizjologicznej funkcji EGF lub EGF-R. Generalnie, równolegle stosuje się wiele mieszanin oznaczenia o różnych stężeniach czynnika w celu uzyskania różnicowej odpowiedzi na różne stężenia. Zazwyczaj jedno z tych stężeń służy jako kontrola ujemna, tj. stężenie równe zero lub niższe od poziomu detekcji.
Potencjalne czynniki obejmują liczne klasy chemiczne, chociaż zazwyczaj są one cząsteczkami organicznymi, korzystnie niskocząsteczkowymi związkami organicznymi posiadającymi masy cząsteczkowe powyżej 50, a poniżej około 2 500 daltonów. Potencjalne czynniki posiadają grupy funkcyjne konieczne do strukturalnych oddziaływań z białkami, szczególnie wiązań wodorowych, i zazwyczaj obejmują co najmniej grupę aminową, karbonylową, hydroksylową lub karboksylową, korzystnie co najmniej dwie z funkcyjnych grup chemicznych. Potencjalne czynniki często obejmują cykliczne związki węgla lub struktury heterocykliczne i/lub struktury aromatyczne bądź poliaromatyczne podstawione jedną lub więcej z powyższych grup funkcyjnych. Potencjalne czynniki występują również wśród cząsteczek biologicznych, obejmujących peptydy, sacharydy, kwasy tłuszczowe, steroidy, puryny, pirymidyny, ich pochodne, analogi strukturalne lub kombinacje.
Potencjalne czynniki otrzymuje się z szerokiego zakresu różnych źródeł, włącznie z bibliotekami związków syntetycznych lub naturalnych. Na przykład, dostępne są liczne sposoby losowej lub ukie14
PL 200 940 B1 runkowanej syntezy różnorodnych związków organicznych lub cząsteczek biologicznych, włącznie z ekspresją losowych oligonukleotydów lub oligopeptydów. Alternatywnie, dostępne są lub łatwe do utworzenia biblioteki związków naturalnych w postaci ekstraktów bakteryjnych, grzybowych, roślinnych i zwierzęcych. Ponadto, biblioteki naturalne lub utworzone syntetycznie łatwo jest modyfikować konwencjonalnymi sposobami chemicznymi, fizycznymi lub biochemicznymi, i można je stosować do tworzenia bibliotek kombinatorycznych. Znane czynniki farmakologiczne można poddawać ukierunkowanym lub losowym modyfikacjom chemicznym, takim jak acylacja, alkilacja, estryfikacja, amdyfikacja itp. w celu utworzenia analogów strukturalnych.
Jeśli oznaczeniem przeszukiwania jest oznaczenie wiązania, jedną lub więcej z cząsteczek można połączyć ze znacznikiem, gdzie znacznik może bezpośrednio lub pośrednio zapewniać wykrywalny sygnał. Różne znaczniki obejmują izotopy promieniotwórcze, substancje fluoryzujące, substancje chemiluminescencyjne, enzymy, specyficznie wiążące cząsteczki, cząstki, np. cząstki magnetyczne, i podobne. Cząsteczki specyficznie wiążące obejmują pary, takie jak biotyna i streptawidyna, digoksyna i przeciwciało skierowane przeciw digoksynie itp. W składnikach tworzących specyficzne wiązania, komplementarny składnik będzie zazwyczaj wyznakowany cząsteczką, która zapewnia wykrywanie, zgodnie ze znanymi procedurami.
Do oznaczenia przeszukiwania mogą zostać włączone różnorodne inne odczynniki. Obejmują one takie odczynniki, jak sole, obojętne białka, np. albuminę, środki powierzchniowo czynne, itp., które stosuje się dla ułatwienia optymalnego wiązania białek i/lub obniżania oddziaływań niespecyficznych lub tła. Można stosować odczynniki, które poprawiają wydajność oznaczenia, takie jak inhibitory proteaz, inhibitory nukleaz, czynniki przeciwdrobnoustrojowe itp. Składniki mieszaniny dodaje się w dowolnej kolejności, która zapewnia żądane wiązanie. Inkubacje prowadzi się w jakiejkolwiek odpowiedniej temperaturze, zazwyczaj pomiędzy 4 a 40°C. Okresy inkubacji wybiera się pod kątem optymalnej aktywności, ale można je również optymalizować pod kątem ułatwiania szybkiego oznaczenia o wysokiej wydajności. Zazwyczaj wystarczający będzie okres pomiędzy 0,1 a 1 godziną.
Związki posiadające pożądaną aktywność farmakologiczną można podawać w fizjologicznie dopuszczalnym nośniku gospodarzowi w celu leczenia choroby związanej z nadmiernym wydzielaniem, w postaciach farmaceutycznych opisanych w niniejszym opisie. Zależnie od sposobu wprowadzania, związkom można nadawać różne postacie stosując opisane w niniejszym opisie sposoby. Stężenie związku aktywnego terapeutycznie w postaci farmaceutycznej może być zróżnicowane od około 0,1-100% wagowych.
Tryb dawkowania
Odpowiedni poziom dawkowania będzie również różny, zależnie od licznych czynników, obejmujących określonego osobnika, który ma być leczony, charakteru określonego stanu związanego z nadmiernym wydzielaniem jaki ma być leczony oraz jego ciężkości, charakteru antagonisty EGFR stosowanego jako składnik aktywny, sposobu podawania, postaci farmaceutycznej oraz opinii lekarza. Na przykład, jeśli podaje się same przeciwciała, takie jak przeciwciała skierowane przeciw EGF lub EGF-R, w postaciach do iniekcji, dawki pozostawać będą w zakresie od 20 mg/kg do około 40 mg/kg na pojedynczą dawkę. Może być wymagane powtarzane podawanie w ciągu okresu kilku dni, bądź podawanie dożylne może być ciągłe. W przypadku stanów przewlekłych, podawanie można kontynuować w ciągu dłuższych okresów, jak jest to konieczne.
Skuteczność trybu dawkowania będzie się określać na podstawie oceny poprawy czynnościowej płuc u pacjenta. Ocena ta może obejmować pomiary lepkosprężystości plwociny, poprawy parametrów czynnościowych płuc, włącznie z poprawą pod względem maksymalnej objętości wykrztuszanej plwociny oraz maksymalnego przepływu w środkowej części wydechu. Wymieniony powyżej tryb terapeutyczny można stosować łącznie z terapiami pomocniczymi, takimi jak stosowanie antybiotyków, DNAzy I lub z innymi aktualnie stosowanymi w leczeniu choroby płucnej związanej z nadmiernym wydzielaniem terapiami. Jeśli jako część terapii pacjenta podaje się jednocześnie antybiotyki, to można włączyć ilościowe określanie bakterii po terapii do oceny skuteczności leczenia na podstawie obniżonego wzrostu bakteryjnego, wskazującego na obniżoną lepkość śluzu lub plwociny i zwiększania oczyszczania płuc ze śluzu lub plwociny.
Czynnościowe testy płucne, jak również testy diagnostyczne do oceny klinicznego postępu leczenia choroby płucnej związanej z nadmiernym wydzielaniem, znane są osobom będącym specjalistami w tej dziedzinie. Standardowe testy czynnościowe płuc obejmują opór dróg oddechowych (AR); maksymalną pojemność życiową (FCV); natężoną objętość wydechową w ciągu 1 sekundy (FEV(1)); przepływ w środku natężonego wydechu oraz przepływ na szczycie wydechu (PEFR). Inne testy funkPL 200 940 B1 cjonowania płuc obejmują analizę gazów krwi, odpowiedzi na leki, testy prowokacji oraz wysiłkowe, pomiary siły mięśni oddechowych, światłowodowe badanie dróg oddechowych i podobne. Niektóre podstawowe procedury do badania właściwości śluzu obejmują reologię, np. z zastosowaniem mikroreometru magnetycznego; adhezyjność w celu scharakteryzowania sił przylegania pomiędzy powierzchnią adhezyjną a przyczepnym układem przez pomiar kąta kontaktu pomiędzy kroplą śluzu a powierzchnią. Transport śluzu przez rzęski można badać stosując konwencjonalne techniki, jak również bezpośredni pomiar, tj. oczyszczanie przez śluz in situ. Różnicę potencjałów po obu stronach nabłonka, wypadkowy wynik aktywności układu transportu jonów nabłonka płuc, można mierzyć stosując odpowiednie mikroelektrody. Ilościowe metody morfologiczne można stosować do charakteryzowania stanu powierzchni nabłonka.
Leczonym pacjentem może być naczelny, taki jak człowiek, lub jakiekolwiek inne zwierzę wykazujące opisane objawy. Chociaż sposób według wynalazku jest szczególnie dostosowany do leczenia pacjenta będącego człowiekiem, będzie zrozumiałe, że wynalazek można również stosować w praktyce weterynaryjnej.
Oznaczenie przeszukiwania in vitro
W innym rozwiązaniu wynalazku, stosuje się oznaczenia in vitro do oceny siły terapeutycznej potencjalnych czynników do hamowania proliferacji komórek kubkowych, tj. czy takie czynniki są aktywne jako antagoniści EGF. Generalnie, oznaczenia takie obejmować będą następujące etapy (i) zetknięcia modelu in vitro proliferacji komórek kubkowych z EGF lub jego funkcjonalnym równoważnikiem; następnie zetknięcie modelu in vitro z potencjalnym czynnikiem, oraz (iii) oceniania proliferacji komórek kubkowych, gdzie hamowanie proliferacji komórek kubkowych wskazuje na siłę terapeutyczną potencjalnego czynnika.
Oznaczenie korzystnie przeprowadza się z dwiema kontrolami, gdzie drugiej grupy komórek nie kontaktuje się z jakimkolwiek związkiem, a trzecią grupę kontaktuje się z EGF, ale nie z potencjalnym czynnikiem. Następnie dokonuje się porównania w celu określenia stopnia wpływu EGF i potencjalnego czynnika na komórki.
Stosować można jakikolwiek model proliferacji komórek kubkowych in vitro. Dla przykładu, komórki tchawicy szczura można wyizolować i utrzymywać w hodowli w sposób opisany w Guzman i in. (1995) 217: 412-419. Krótko, komórki tchawicy szczura wysiewa się na opłaszczone żelem kolagenowym półprzepuszczalne membrany, początkowo hoduje zanurzone w podłożu, a następnie utrzymuje się na granicy powietrze/płyn. Przykłady komórek in vitro obejmują pierwotne hodowle ludzkich komórek oskrzeli (dostępne w Clonetics, San Diego), komórki NCI-H299 (ATCC CRL-1848) i komórki A431 (ATCC CRL-1555).
Hodowlę in vitro kontaktuje się z EGF i potencjalnym czynnikiem. Potencjalny czynnik można zetknąć z hodowlą przed, jednocześnie lub po dodaniu EGF, zależnie od celu oceny i charakteru potencjalnego czynnika. Hodowane komórki ocenia się pod kątem hamowania komórek kubkowych w stosunku do kontroli.
Do oceny proliferacji komórek kubkowych można stosować różne markery molekularne lub biochemiczne. Przykłady markerów molekularnych lub biochemicznych, które można stosować, obejmują, ale nie ograniczają się do ekspresji genów lub ekspresji białek charakterystycznych dla komórek kubkowych. Niektóre geny mucyn, np. MUC5B (Desseyn i in. (1997) J. Biol. Chem. 272: 3168-3178), ulegają ekspresji w drogach oddechowych, a ich produkty genowe w dużej ilości występują w śluzie. Ekspresja genów mucyn zapewnia odpowiedni marker do określania wytwarzania śluzu.
Ekspresję genów mucyn można oceniać konwencjonalnymi technikami, takimi jak jak analiza przez blotting typu Northern, reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), badanie promotora genu mucyny lub analiza in situ. Alternatywnie, białka mucyny ocenia się konwencjonalnymi technikami, takimi jak analiza przez blotting typu Western, ELISA, metody immunochemiczne i podobne, stosując wykrywalnie wyznakowane przeciwciała. Do określania obecności lub nieobecności komórek kubkowych w hodowli można również stosować kryteria morfologiczne, takie jak wybarwianie mucyn z zastosowaniem błękitu Alcian/PAS (Lou i in. (1998) Am. J. Resp. Crit. Care Med. 157: 1927-1934). Przeciwciała skierowane przeciw mucynom można testować stosując oznaczenia ELISA. Ponieważ stymulacja EGF-R przez ligand, np. EGF, TGF-α, indukuje fosforylację specyficznej kinazy receptora EGF i jej wynikiem jest tworzenie komórek kubkowych, fosforylację EGF-R można mierzyć jako odzwierciedlenie indukcji komórek kubkowych (Donato i in. (1984) J. Biol. Chem. 264: 20474-20481).
Zmniejszenie ilości molekularnych lub biochemicznych markerów związanych z proliferacją komórek kubkowych wskazuje na siłę terapeutyczną antagonisty.
PL 200 940 B1
Modele in vivo
W jeszcze innym rozwiązaniu wynalazku, do oceny siły terapeutycznej potencjalnych czynników do hamowania proliferacji komórek kubkowych stosuje się zwierzęce modele in vivo. Generalnie, oznaczenie obejmuje etapy: (i) tworzenia zwierzęcego modelu choroby płucnej związanej z nadmiernym wydzielaniem przez indukcję ekspresji EGF-R, (ii) stymulowanie indukowanego EGF-R do tworzenia wytwarzających mucynę komórek kubkowych, (iii) leczenia potencjanym czynnikiem oraz (iv) oceniania proliferacji komórek kubkowych lub wydzielania śluzu, gdzie hamowanie proliferacji komórek kubkowych lub wydzielania śluzu wskazuje na siłę terapeutyczną potencjalnego czynnika.
Można stosować jakikolwiek model in vivo choroby płucnej związanej z nadmiernym wydzielaniem. Przykładem jest mysi model astmy, opisany w Temann i in. (1997) Am. J. Respr. Cell. Biol. 16: 471-478, i przedstawiony w przykładach podanych w niniejszym opisie. Alternatywnie, można stosować model szczurzy opisany w Takeyama i in. (1998) Am. J. Physiol. Przykłady innych modeli zwierzęcych, które można stosować, obejmują, ale nie ograniczają się do świnek morskich (gatunek, u którego konstytutywnie występują komórki kubkowe) i szczurów.
Tkankę płuc i tkankę tchawicy modeli zwierzęcych można oceniać wykorzystując te same markery molekularne i biochemiczne, jak opisane dla modelu in vitro. Zmniejszenie proliferacji komórek kubkowych wskazuje na siłę terapeutyczną antagonisty EGF-R.
Poniższe przykłady przedstawiono, tak aby zapewnić specjalistom w tej dziedzinie pełne ujawnienie i opis, jak wykonać i stosować niniejszy wynalazek, i w zamierzeniu nie mają one ograniczać zakresu tego co autorzy wynalazku uważają za swój wynalazek, ani nie mają oznaczać, że poniższe doświadczenia są wszystkimi lub jedynymi przeprowadzonymi doświadczeniami. Starano się zachować dokładność pod względem podawanych wartości liczbowych (np. ilości, temperatury itd.), ale należy brać pod uwagę pewne błędy i odchylenia doświadczalne. 0 ile nie wskazano inaczej, części są częściami wagowymi, masa cząsteczkowa jest wagowo średnią masą cząsteczkową, temperatura podana jest w stopniach Celsjusza, a ciśnienie jest równe lub bliskie atmosferycznemu.
CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA
P r z y k ł a d 1
Układ EGF reguluje wytwarzania mucyny w drogach oddechowych
Zwiększenie liczby komórek kubkowych występuje w różnych chorobach dróg oddechowych związanych z nadmiernym wydzielaniem, ale ponieważ nie są znane mechanizmy leżące u jego podstaw, nie istnieje żadna skuteczna terapia. W zdrowych drogach oddechowych komórki kubkowe są nieliczne, ale w chorobach dróg oddechowych związanych z nadmiernym wydzielaniem występuje zwiększenie liczby komórek kubkowych. Badano ludzką linię komórek oskrzeli (NCI-H292). W komórkach tych zachodzi konstytutywna ekspresja EGF-R; ekspresję genu EGF-R stymulowano ponadto czynnikiem nekrozy nowotworów alfa (TNFa). Ligandy EGF-R zwiększają syntezę mucyn i ten wpływ zwiększano przez jednoczesną inkubację z TNFa.
W komórkach nabłonka dróg oddechowych wolnych od patogenów szczurów zachodzi ekspresja białka EGF-R, ale dotchawicze wkroplenie TNFa (200 ng) indukowało EGF-R w komórkach podstawnych, pre-kubkowych i kubkowych, ale nie komórkach rzęskowych; same TNFa, EGF lub TGFa nie indukują tworzenia komórek kubkowych. Jednakże, wynikiem wkroplenia TNFa, a następnie ligandów EGF-R była zwiększona liczba komórek kubkowych i pre-kubkowych oraz uderzający wzrost dodatniego wybarwiania błękitem Alcian/PAS (odzwierciedlającego glikokoniugaty śluzu) oraz ekspresji genu mucyny MUC5. Wynikiem uczulania szczurów owoalbuminą było wytwarzanie komórek kubkowych i ekspresja EGF-R w nabłonku dróg oddechowych. W komórkach NCI-H292, u szczurów stymulowanych TNFa, a następnie ligandami EGF-R oraz w modelu astmy u szczurów wstępne traktowanie inhibitorem kinazy tyrozynowej (BIBX1522) zapobiegało wytwarzaniu komórek kubkowych w drogach oddechowych. Odkrycia te wykazują rolę inhibitorów kaskady EGF-R w chorobach dróg oddechowych związanych z nadmiernym wydzielaniem.
METODY
BADANIA IN VITRO
Hodowle komórkowe. Ludzką linię komórek raka śluzowo-naskórkowego płuc, komórki NCI-H292, hodowano w podłożu RPMI zawierającym 10% płodową surowicę bydlęcą, penicylinę (100 U/ml), streptomycynę (100 μg/ml) w temperaturze 37°C w nawilżanym inkubatorze z płaszczem wodnym w atmosferze 5% CO2. Po uzyskaniu zwartej warstwy, komórki inkubowano z EGF (zrekombinowanym ludzkim EGF, 25 ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA), TGFa (zrekombinowany ludzki TGFa, 25 ng/ml, Genzyme), TNFa (zrekombinowany ludzki TNFa, 20 ng/ml, Genzyme), EGF (25 ng/ml) plus
PL 200 940 B1
TNFa (20 ng/ml) lub TGFa (25 ng/ml) plus TNFa (20 ng/ml) w ciągu 12 godzin, 24 godzin lub 48 godzin. W badaniach hamowania z zastosowaniem inhibitora kinazy tyrozynowej, BIBX1522 (10 μg/ml, dostarczonego dzięki uprzejmości Boehringer Ingelheim Inc., Ingelheim, Niemcy), komórki traktowano wstępnie BIBX1522 w ciągu 30 minut przed dodaniem czynników wzrostowych. Po inkubacji, komórki hodowane w kolbach T-75 stosowano do ekstrakcji całkowitego RNA lub ekstrakcji białka, a do wybarwiania błękitem Alcian/PAS w celu wizualizacji mucyn stosowano 8-komorowe szkiełka.
Blotting typu Western. Komórki hodowane w kolbach T-75 lizowano i zeskrobano stosując PBS zawierającą 1% Triton X, 1% deoksycholan sodowy i PMSF (10 mg/ml). Całkowitą ilość białka określano stosując odczynnik do oznaczania białka BCA (Pierce, Rockford, IL). Lizaty komórkowe gotowano z Tricynowym buforem do próbek i 2% eME w temperaturze 95°C. Białka rozdzielano przez SDS-PAGE w 8% żelach akryloamidowych. Otrzymywane w wyniku żele równoważono w buforze do przenoszenia: 25 mM Tris-HCl, 192 mM glicyna, 20% (v/v) metanol, pH 8,3. Białka przenoszono następnie elektroforetycznie na membrany nitrocelulozowe. Następnie membrany inkubowano w ciągu 1 godziny w 5% odtłuszczonym chudym mleku w PBS, zawierającym 0,05% Tween 20. Następnie membrany inkubowano przez noc z monoklonalnym mysim przeciwciałem skierowanym przeciw EGF-R (1:100) w temperaturze 4°C. Związane przeciwciało uwidaczniano zgodnie ze standardowymi protokołami metody dla kompleksu awidyna-biotyna-alkaliczna fosfataza (zestaw ABC, Vector Laboratories). Jako dodatnią kontrolę EGF-R stosowano lizaty komórkowe z komórek A431 (20).
Immunocytochemiczna lokalizacja EGF-R w komórkach NCI-H292. Komórki hodowane na 8-komorowych szkiełkach utrwalano 4% paraformaldehydem w ciągu 1 godziny. Do wybarwiania EGF-R jako rozcieńczalnik przeciwciała stosowano PBS zawierającą 0,05% Tween 20, 2% normalną surowicę kozią i 2 mM lewami zolem. Skrawki inkubowano przez noc z mysim przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciw EGF-R (1:250) w temperaturze 4°C, a następnie 3 razy przemywano PBS w celu usunięcia nadmiaru pierwszego przeciwciała. Następnie komórki inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej z biotynylowanym kozim przeciwciałem skierowanym przeciw immunoglobulinom myszy (Vector Laboratories, Burlingame, CA) w rozcieńczeniu 1:200. Związane przeciwciało uwidaczniano zgodnie ze standardowymi protokołami metody dla kompleksu awidyna-biotyna-alkaliczna fosfataza (zestaw ABC, Vector Laboratories, Burlingame, CA).
Sondy. Ekspresję mRNA EGF-R określano stosując przeprowadzoną w postać liniową wzorcową sondę pTRI-ludzki EGF-R (Ambion, Austin, TX). Sonda ta zawiera fragment cDNA ludzkiego genu EGF-R o długości 360 bp, który obejmuje eksony 12-14. Ekspresję genu MUC5 określano stosując sondę ludzkiego MUC5AC, która zawiera fragment cDNA ludzkiego genu MUC5AC o długości 298 bp (dostarczony dzięki uprzejmości dr Carol Basbaum).
Blotting typu Northern. Całkowity RNA ekstrahowano z komórek NCI-H292 hodowanych w kolbach do hodowli tkankowych T-75 stosując w każdym przypadku Tri-Reagent (Molecular Research Ctr, Cincinnati, OH). Całkowity RNA (10 μg) poddawano elektroforezie w 1% żelu agaroza/formalde hyd i przenoszono na nylonową membranę (Amersham, Arlington Heights, IL) przez blotting kapilarny. Sondy znakowano 32P stosując zestaw do znakowania DNA Random Primed (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN). Bioty prehybrydyzowano w temperaturze 42°C w ciągu 4 godzin, a następnie hybrydyzowano w temperaturze 420C w ciągu 16 godzin z wyznakowaną 32P specyficzną sondą cDNA. Roztwór do hybrydyzacji zawierał 250 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5% SDS, 1% BSA, 1% poliwinylopirolidon, 1% Ficoll i 0,5% pirofosforan sodowy. Po hybrydyzacji membrany dwukrotnie przemywano 2 x SSC z 0,1% SDS w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej, na następnie dwukrotnie 2 x SSC z 0,1% SDS w ciągu 30 minut w temperaturze 50°C i płukano w 0,1 x SSC z 0,1% SDS. Membrany stosowano do naświetlania błony rentgenowskiej.
BADANIA IN VIVO.
Protokół doświadczeń na zwierzętach został zatwierdzony przez Committee on Animal Research, University of California, San Francisco. Wolne od specyficznych patogenów samce szczurów F344 Fisher o wadze 230-250 g (Simonsen Laboratory, Gilroy, CA) trzymano w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (21°C) z dostępnymi bez ograniczeń standardową karmą laboratoryjną i wodą.
Szczury zdrowe. Szczury usypiano stosując metoheksytal sodowy (Brevital sodowy, 50 mg/kg, dootrzewnowo, Eli Lilly & Co., Indianapolis, IN) i umożliwiano samodzielne oddychanie. W celu określenia, czy TNFa zwiększa ekspresję EGF-R w drogach oddechowych, TNFa (200 ng, 100 μl wkraplano do tchawicy i 24 godziny później zwierzęta zabijano. W celu określenia, czy EGF lub TGFa indukuje komórki kubkowe w nabłonku dróg oddechowych, do tchawicy wkraplano albo sam EGF (600 ng, 100 μ) lub TGFa (syntetyczny TGFa szczura, 250 ng, 100 μ!; Sigma, St Louis, MI), albo 24 godziny
PL 200 940 B1 po wkropleniu TNFa (200 ng, 100 μθ i zwierzęta zabijano 48 godzin później. W każdym badaniu jako kontrolę do tchawicy wkraplano jałową PBS (100 μβ. Dla potwierdzenia, czy występowało wytwarzanie mucyny w wyniku aktywacji EGF-R, badaliśmy wpływ inhibitora kinazy tyrozynowej EGF-R, BIBX1522 (dawka oszacowana na podstawie badań stosowania inhibitora do zapobiegania wzrostu nowotworów). Szczury traktowano wstępnie BIBX1522 (3, 10 lub 30 mg/kg, dootrzewnowo) 1 godzinę przed i 24 godziny po wkropleniu TGFa. Tchawicę i płuca usuwano do badania 48 godzin po wkropleniu TGFa.
Szczury uczulane
Uczulanie. Szczury uczulano w dniach 0 i 10 przez dootrzewnowo iniekcje owoalbuminy (10 mg, stopień czystości V, Sigma, St. Louis, MO) skompleksowanej ze 100 mg wodorotlenku glinu w 0,5 ml jałowej soli fizjologicznej. Następnie szczury odpoczywały w ciągu 10 dni. W dniu 20 owoalbuminę podano bezpośrednio do tchawicy; zwierzęta prowokowano podając trzykrotnnie (dni 20, 22 i 24) przez wkroplenie dotchawicze 100 μl 0,1% owoalbuminy w soli fizjologicznej. Szczury zabijano albo nie przeprowadzając prowokacji (dzień 20), albo 48 godzin po trzeciej prowokacji (dzień 26). Procedura ta indukowała metaplazję komórek kubkowych. W celu zablokowania zwiększania się liczby komórek kubkowych, uczulane szczury traktowano wstępnie inhibitorem kinazy tyrozynowej EGF-R, BIBX1522. W dniach prowokacji owoalbuminą (dni 20, 22 i 24) uczulane szczury traktowano wstępnie BIBX1522 (10 mg/kg, dootrzewnowo, 1 godzina przed prowokacją), a następnie BIBX1522 również wkraplano do tchawicy razem z owoalbuminą (BIBX1522, 10-5 M, 100 μθ BIBX1522 wstrzykiwano również dootrzewnowo co 24 godziny, aż do dnia poprzedzającego zabicie szczurów. Po zabiciu zwierząt usuwano tchawice 48 godzin po trzeciej prowokacji.
Preparowanie tkanek. W uprzednio wybranych czasach podczas gdy szczury były uśpione, duże krążenie perfundowano 1% paraformaldehydem w PBS traktowanej DEPC pod ciśnieniem 120 mmHg. Następnie usuwano tchawice i umieszczano na 24 godziny w 4% paraformaldehydzie. Po utrwaleniu, tchawice i płuca zatapiano albo w JB-4 plus roztwór monomeru A do analizy komórek, albo w związku O.C.T. (Sakura Finetek U.S.A., Inc., Torrence, CA) do immunohistochemii i hybrydyzacji in situ. Zatopione tkanki cięto jako skrawki poprzeczne (grubości 4 mm) i umieszczano na szkiełkach.
Analiza komórek. Zliczaliśmy całkowitą liczbę komórek nabłonkowych przez zliczanie jąder komórek nabłonkowych na odcinku blaszki podstawnej o długości 2 mm stosując obiektyw imersyjny (powiększenie 1000 x). Liniową długość blaszki podstawnej pod każdym analizowanym regionem nabłonka określano przez obrysowując kontury zdigitalizowanego obrazu blaszki podstawnej. Po wkropleniu bodźców, tworzą się „rozwijające się komórki kubkowe. Komórki te posiadają ziarnistości wybarwiające się dodatnio błękitem Alcian/PAS, ale ziarnistości są małe, a liczba ziarnistości cytoplazmatycznych jest niska. Nazwaliśmy te „rozwijające się komórki komórkami „pre-kubkowymi, stan zanim komórki staną się dojrzałymi komórkami kubkowymi. Komórki kubkowe są wysokie, w kształcie prostopadłościanu, kielicha lub niskiej kolumny, z licznymi wybarwiającymi się błękitem Alcian/PAS ziarnistościami wypełniającymi większość cytoplazmy pomiędzy jądrem a powierzchnią światła. Komórki prekubkowe definiuje się jako komórki o mniejszych polach powierzchni wybarwionego śluzu (< 1/3 wysokości w nabłonku od błony podstawnej do powierzchni światła) lub z rzadko i słabo wybarwiającymi się błękitem Alcian/PAS, małymi ziarnistościami. Komórki rzęskowe rozpoznawane są dzięki ich urzęsionym brzegom, słabo wybarwionej cytoplazmie i dużym, okrągłym jądrom. Nieziarniste komórki wydzielnicze mają kształt kolumn i rozciągają się od światła do blaszki podstawnej. Cytoplazma wybarwia się na jasno różowo i w cytoplazmie obserwuje się nieliczne, drobne ziarnistości wybarwiające się dodatnio PAS i ujemnie błękitem Alcian. Komórki pod-stawne są małymi spłaszczonymi komórkami o dużych jądrach, położonymi tuż powyżej blaszki podstawnej, ale nie osiągające światła dróg oddechowych.
Ilościowe określanie tworzenia komórek kubkowych. Tworzenie komórek kubkowych określano na podstawie intensywności wybarwienia substancji śluzowych na powierzchni błony śluzowej nabłonka, wybarwianych błękitem Alcian/PAS, stosując opisany gdzie indziej (Weber i in. (1984) Science 224: 294-297) półautomatyczny system obrazowania. Mierzyliśmy dodatnio wybarwione błękitem Alcian/PAS pole powierzchni oraz całkowite pole powierzchni nabłonka i wyrażaliśmy jako procent całkowitego pola powierzchni wybarwianego błękitem Alcian-PAS. Analizę prowadzono stosując ogólnie dostępny program NIH Image (opracowany w U.S. National Institute of Health i dostępny anonimowo w Internecie przez FTP z zippy.nimh.gov. lub na dyskietce w National Technical Information Service, Springfield, VA, numer części PB95-500195GEI).
Immunohistochemiczna lokalizacja EGF-R w nabłonku szczura. Lokalizację EGF-R badano stosując immunohistochemiczne wybarwianie przeciwciałem skierowanym przeciw EGF-R (Calbiochem,
PL 200 940 B1
San Diego, CA) zamrożonych skrawków tchawicy szczura. Po perfuzji 1% paraformaldehydem w PBS, tkanki umieszczano na 1 godzinę w 4% paraformaldehydzie w PBS, a następnie przenoszono do 30% sacharozy na noc dla zapewnienia ochrony przed zamrażaniem. Tchawice zatapiano w związku O.C.T. (Sakura Finetek U.S.A., Inc., Torrance, CA) i zamrażano. Cięto zamrożone skrawki (5 μm) i umieszczano na szklanych szkiełkach (Superfrost Plus, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Immunowybarwianie prowadzono podobnie do badań in vitro.
Przygotowywanie sond. cDNA MUC5 szczura otrzymano dzięki uprzejmości dr Carol Basbaum. Fragment cDNA MUC5 o długości 320 bp zsubklonowano w miejscu Xba/HindIII wektora transkrypcyjnego, pBluescript-SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA). W celu przygotowania sond RNA do hybrydyzacji in situ, ten zrekombinowany plazmid zawierający fragment cDNA MUC5 szczura przeprowadzono w postać liniową i poddano transkrypcji in vitro z polimerazą T7 lub T3 w celu otrzymania odpowiednio sondy antysensownej i sensownej. Sondy do hybrydyzacji in situ tworzono w obecności [35S]UTP. Po transkrypcji matrycę cDNA strawiono DNazą, a wyznakowany promieniotwórczo RNA oczyszczono stosując Sephadex G-25 Quick SpinTM Column (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) i wytrącono w roztworze etanol/octan amonowy. Przed użyciem sondy RNA przemywano 70% etanolem i rozcieńczano w 10 mM DTT.
Hybrydyzacja in situ. Cięto zamrożone skrawki (5 μm) i umieszczano na dodatnio naładowanych szklanych szkiełkach (Superfrost Plus, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Skrawki cięte w bliskim sąsiedztwie stosowano do hybrydyzacji z sondami sensowną antysensowną. Kolejne skrawki stosowano do wybarwiania błękitem Alcian/PAS. Próbki ponownie utrwalano w 4% paraformaldehydzie, ponownie uwadniano w 0,5 x SSC, a następnie acetylowano w trietanoloaminie bezwodnikiem octowym. Hybrydyzację prowadzono stosując 2500-3000 cpm/il sondy sensownej lub antysensownej w 50% dejonizowanym formamidzie, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris, 5 mM EDTA, 1 x roztworze Denhardta, 20 mM ditiotreitolu 0,5 mg/ml tRNA drożdży i 0,5 mg/ml sonikowanego DNA spermy łososia, w temperaturze 55°C przez noc. Traktowaanie przed hybrydyzacją obejmowało płukania 2 x SSC, 1 mM EDTA, 10 mM β-merkaptoetanolem w temperaturze pokojowej, inkubację z roztworem RNazy (20 mg/ml) w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej oraz dalsze płukania 2 0,1 x SSC, 1 mM EDTA, 10 mM β-merkaptoetanolu w temperaturze 55°C w ciągu 2 godzin, a następnie w 0,5 x SSC w temperaturze pokojowej. Próbki odwadniano, suszono na powietrzu i pokrywano emulsją do śledzenia jąder atomowych Kodak NBT (Eastman Kodak, Rochester, NY) do autoradiografii. Po ekspozycji w ciągu od 7 do 21 dni w temperaturze 4°C, szkiełka wywoływano, utrwalano i wybarwiano hematoksyliną (21).
Statystyka. Wszystkie dane wyrażano jako średnie ± standardowy błąd średni. Do określenia statystycznie istotnych różnic pomiędzy grupami stosowano jednokierunkową analizę wariancji. Gdy w analizie wariancji zidentyfikowano istotności statystyczne, do wprowadzenia poprawek na porównania wielokrotne stosowano test F Schaffe'a. Jako wskazującą statystycznie istotną różnicę przyjmowano dla hipotezy zerowej prawdopodobieństwo niższe niż 0,05.
WYNIKI
TNFa stymuluje wytwarzanie EGF-R w komórkach NCI-H2929. Najpierw określano, czy w komórkach NCI-H292 występuje konstytutywna ekspresja EGF-R. Przez analizę immunoblotów typu Western zidentyfikowano obecność białka EGF-R w zwartych hodowlach komórek NCI-H292 (figura 1A, po prawej stronie). Komórki badano po uzyskaniu zwartej warstwy. Lizaty poddawano elektroforezie w 8% żelach akryloamidowych i poddawano blottingowi z przeciwciałem skierowanym przeciw EGF-R. Masy cząsteczkowe białek markerowych podano po prawej stronie. Dodatnią kontrolą EGF-R było białko z komórek A431 (figura 1A, po lewej stronie), w których zachodzi konstytutywna ekspresja EGF-R (Weber i in., supra). Immunocytochemiczne badania z zastosowaniem przeciwciała skierowanego przeciw EGF-R ujawniły dodatnie wybarwianie, najbardziej uderzające w komórkach ulegających podziałom (fig. 1B, immunocytochemiczna analiza z przeciwciałem skierowanym przeciw EGF-R w hodowlach komórek NCI-H292). W zwartej warstwie komórek widoczne było dodatnie wybarwianie, najsilniejsze w dzielących się komórkach (strzałki, prawa strona). W nieobecności pierwszego przeciwciała nie występowało wybarwianie (lewa strona). Blotting typu Northern wykazał, że TNFa (20 ng/ml) powodował zwiększenie ekspresji genu EGF-R, efekt, który pojawiał się po 12 godzinach i zwiększał się po 24 godzinach (fig. 1C, analiza typu Northern EGF-R w komórkach NCI-H292). Analizę prowadzono na ekstraktach całkowitego RNA ze zwartej warstwy komórek inkubowanych z TNFa (20 ng/μΠ w ciągu 12 lub 24 godzin. RNA poddawano elektroforezie w żelu formaldehyd-agaroza, przenoszono na membranę nylonową i hybrydyzowano z wyznakowaną 32P sondą cDNA EGF-R. Po hybrydyzacji membranę przemywano i poddawano autoradiografii.
PL 200 940 B1
Ligandy EGF-R stymulują ekspresję glikokoniugatów śluzu i ekspresję genu MUC5 w komórkach NCI-H292. EGF-R ulega konstytutywnej ekspresji w komórkach NCI-H292, dlatego ocenialiśmy zdolność ligandów EGF-R (EGF, TGFa) do indukcji wytwarzania glikokoniugatów śluzu (figura 2, górna kolumna, wybarwianie błękitem Alcian/PAS komórek NCI-H292 w celu identyfikacji glikoprotein mucyny). Górna kolumna = inkubacja komórek bez inhibitora, dolna kolumna = inkubacja w obecności inhibitora kinazy tyrozynowej EGF-R, BIBX1522 (10 μg/ml). Gdy komórki inkubowano same (kontrola), było widoczne pewne wybarwianie dodatnie PAS (strzałki, górna kolumna); inkubacja z samym TNFa (20 ng/ml) nie wpływała na wybarwianie; inkubacja z EGF (25 ng/ml) lub TGFa (25 ng/ml) zwiększała dodatnie wybarwianie PAS (strzałki); inkubacja z TNFa plus TGFa znacznie zwiększała wybarwianie (strzałka, górna kolumna).
Niektóre komórki kontrolne wykazywały wybarwianie; inkubacja z samym TNFa (20 ng/ml) nie wpływała na wybarwianie; inkubacja z albo EGF (25 ng/ml), albo TGFa (każdy w stężeniu 25 ng/ml) zwiększała dodatnie wybarwianie PAS (strzałki); inkubacja z TNFa plus TGFa wyraźnie zwiększała wybarwianie znacznie bardziej, niż każdy ligand sam. A zatem, ligandy EGF-R indukują glikokoniugaty śluzu w komórkach NCI-H292.
W celu sprawdzenia ekspresji genu MUC5 przeprowadzono blotting typu Northern (figura 3).
Z komórek wyekstrahowano całkowity RNA (10 μg), poddano go elektroforezie w żelu formalde32 hyd-agaroza, przeniesiono na membranę nylonową i hybrydyzowano z wyznakowaną 32P sondą cDNA MUC5. Po hybrydyzacji membranę przemywano i poddawano autoradiografii. Hodowle do sprawdzania ekspresji genu MUC5 otrzymywano stosując tylko samo podłoże (C), EGF lub TGFa (25 ng/ml), TNFa (20 ng/ml) lub kombinację TNFa plus albo EGF, albo TGFa w ciągu 12 (górna kolumna) lub 24 h (dolna kolumna). Otrzymano również hodowle stosując TNFa plus albo EGF, albo TGFa po preinkubacji z inhibitorem kinazy tyrozynowej EGF-R (BIBX1522, 10 μg/ml; dolna kolumna); inhibitor zapobiegał ekspresji genu MUC5.
Komórki NCI-H292 wykazywały pewną ekspresję w próbie kontrolnej (figura 3, dolna kolumna po lewej stronie); gdy komórki inkubowano z EGF lub TGFa, ekspresja genu MUC5 była ledwie zauważalna w 12 h, ale wyraźnie widoczna w 24 h. Sam TNFa nie wpływa na ekspresję genu MUC5, ale gdy TNFa dodaje się do komórek inkubowanych z ligandami EGF-R, ekspresja gnu MUC5 wzrasta znacznie powyżej poziomu powodowanego przez sam ligand EGF-R (figura 3).
Inhibitor kinazy tyrozynowej EGF-R (BIBX1522) zapobiega ekspresji glikokoniugatów śluzu i ekspresji genu MUC5 w komórkach NCI-H292. W celu sprawdzenia hipotezy, że aktywacja receptorów EGF-R indukuje ekspresję genu MUC5, komórki inkubowano z inhibitorem kinazy tyrozynowej EGF-R, BIBX1522. Gdy komórki NCI-H292 traktowano wstępnie BIBX1522 (10 μg/ml), dodatnie wybarwianie PAS było hamowane w próbie kontrolnej, a zwiększone wybarwianie, które występowało w obecności ligandów EGF-R było wyraźnie hamowane (figura 2, dolna kolumna). W analizie przez blotting typu Northern, ekspresja genu MUC5, którą znacznie zwiększała kombinacja TNFa plus EGF lub plus TGFa, była całkowicie hamowana przez wstępną inkubację z BIBX1522 (figura 3, dola kolumna). Wyniki te sugerują aktywację EGF-R w indukcji genu mucyny i glikoprotein śluzu w komórkach NCI-H292.
TNFa stymuluje wytwarzanie EGF-R u szczurów. Badano wolne od patogenów szczury (które posiadają konstytutywnie niewiele komórek kubkowych nabłonka dróg oddechowych), rozpoczynając od roli TNFa. W próbie kontrolnej, nabłonek tchawicy zawierał nieliczne komórki dodatnie pod względem EGF-R (figura 4A, po lewej stronie). Jednakże, dotchawicze wkraplanie TNFa (200 ng) indukowało białko EGF-R w różnych rodzajach komórek nabłonka tchawicy (figura 4A, po prawej stronie). Dodatnie wybarwianie EGF-R występowało w komórkach kubkowych (G), komórkach pre-kubkowych (P-G), nieziarnistych komórkach wydzielniczych (S) oraz komórkach podstawnych (Ba), ale nie w komórkach rzęskowych. A zatem, TNFa indukuje wytwarzanie białka EGF-R.
Rola ligandów EGF-R w wytwarzaniu glikokoniugatów śluzu i ekspresji genu MUC5 u szczurów.
W próbie kontrolnej nabłonek tchawicy zawiera niewiele komórek kubkowych i pre-kubkowych. Dotchawicze wkraplanie samych ligandów EGF-R, EGF (600 ng, dane nie przedstawione) lub TGFa (250 ng. tablica 1) nie wywierały wpływu na wytwarzanie glikokoniugatów śluzu przez nabłonek. Jednakże, gdy najpierw podawano TNFa (200 mg), a następnie w 24 h EGF lub TGFa (tablica 1) i zwierzęta zabijano 48 godzin później, znacznie wzrastało wybarwianie błękitem Alcian/PAS i znacznie wzrastała liczba komórek kubkowych i pre-kubkowych, bez zmiany całkowitej liczby komórek lub liczby komórek rzęskowych (tablica 1). Hybrydyzacja in situ pod kątem genu MUC5 nie wykazała ekspresji u zwierząt kontrolnych. Gdy dotchawiczo wkraplano TNFa, a następnie EGF lub TGFa, w nabłonku widoczna
PL 200 940 B1 była ekspresja MUC5. A zatem, sama indukcja EGF-R lub stymulacja EGF-R były niewystarczające do indukcji metaplazji komórek kubkowych lub wytwarzania glikokoniugatów śluzu. Jednakże, po indukcji EGF-R przez TNFa, wkraplanie ligandów EGF-R wyraźnie stymulowało metaplazję komórek kubkowych.
T a b l i c a 1
Analiza komórek w nabłonku tchawicy
Uczulanie owoalbuminą
Rodzaj komórek kontrola TGFa TNFa/TGFa tylko dootrzewnowo dootrzewnowo + dotchawiczo
kubkowe 2,8 ± 0,7 5,8 ± 1,2 28,8 ± 3,4* 5,4 ± 1,5 38,2 ± 6,3*
pre-kubkowe 7,8 ± 1,3 12,8 ± 1,6 44,8 ± 3,6* 13,8 ± 1,4 36,0 ± 6,3*
wydzielnicze 82,0 ± 2,0 72,2 ± 4,0 40,8 ± 2,4 67,6 ± 7,0 49,8 ± 4,2
rzęskowe 49,6 ± 2,0 54,6 ± 2,3 53,2 ± 1,8 56,4 ± 3,8 52,4 ± 7,1
podstawne 57,8 ± 2,6 56,8 ± 2,3 43,0 ± 3,5 60,2 ± 3,4 59,8 ± 2,9
niezróżnicowane 1,4 ± 0,5 2,0 ± 0,4 0,8 ± 0,4 1,4 ± 0,2 2,6 ± 0,5
łącznie 201,4 ± 2,2 204,2 ± 3,3 211,4 ± 4,8 204,8 ± 6,6 238,8 ± 4,4*
% pola powierzchni wybarwionego B/PAS 2,4 ± 0,8 6,8 ± 1,9 35,8 ± 4,2* 7,8 ± 2,9 38,7 ± 6,2
Tablica 1. Wpływ mediatorów i uczulania owoalbuminą na komórki nabłonkowe tchawicy u szczurów. Komórki analizowano w sposób opisany w Metodach; pięć szczurów na grupę. Charakterystykę uzupełniono przez wybarwianie błękitem Alcian (AB)/PAS (które wybarwiają glikokoniugaty śluzu). Poza zliczaniem komórek, obliczono procent całkowitego pola powierzchni nabłonka wybarwionego AB/PAS. Kontrolne drogi oddechowe i drogi oddechowe stymulowane samym TGFa (250 ng) zawierały niewiele komórek kubkowych i pre-kubkowych; występowało nieznaczne wybarwienia AB/PAS. Wynikiem zastosowania TNFa (200 ng), a następnie TGFa, było zwiększenie liczby komórek kubkowych i pre-kubkowych oraz zwiększenie pola powierzchni zajętego przez komórki wybarwione AB/PAS. Uczulanie szczurów owoalbuminą (OVA) dootrzewnowo (ip) nie miało żadnego wpływu na rozkład komórek lub wybarwianie AB/PAS, ale gdy po dootrzewnowym podaniu OVA następowało dotchawicze wkraplanie OVA, stwierdzano uderzający przyrost komórek kubkowych i pre-kubkowych oraz procentu pola powierzchni zajętego przez komórki wybarwione AB/PAS.
Uczulanie owoalbuminą indukuje EGF-R i tworzenie komórek kubkowych u szczurów. Ponieważ zgon spowodowany ostrą astmą następuje w wyniku zatkania śluzem dróg oddechowych, utworzono model astmy u szczurów wolnych od patogenów. Iniekcje owoalbuminy (10 mg, dootrzewnowo) w dniach 0 i 10 nie stymulują zwiększania liczby komórek kubkowych (tablica 1). Jednakże, gdy następowały po nich trzy dotchawicze wkroplenia owoalbuminy (0,1% w objętości 100 μθ w dniach 20, 22 i 24, a zwierzęta zabijano w dniu 26, liczba komórek kubkowych i pre-kubkowych znacząco wzrastała; ilości komórek rzęskowych i podstawnych pozostawały niezmienione (tablica 1, po prawej stronie). Badania immunohistochemiczne z zastosowaniem przeciwciała skierowanego przeciw EGF-R nie wykazały wybarwiania w tchawicach kontrolnych. Zwierzęta uczulane zarówno dootrzewnowo, jak i dotchawiczo wykazywały selektywne wybarwianie EGF-R (figura 4B, po lewej stronie) w komórkach wybarwiających się dodatnio AB/PAS (figura 4B, po prawej stronie). Po trzech dotchawiczych wkropleniach owoalbuminy (0,1%, 100 ml), immunoreaktywność wobec EGF-R była silnie wyrażana w komórkach kubkowych i pre-kubkowych (na dole po lewej stronie). Te same komórki wybarwiały się dodatnio błękitem Alcian/PAS (na dole po prawej stronie). A zatem, w modelu astmy indukowanej owoalbuminą wykazano proliferację komórek kubkowych, dotyczącą komórek, które wytwarzały EGF-R.
Inhibitor kinazy tyrozynowej EGF-R (BIBX1522) zapobiega tworzeniu komórek kubkowych indukowanemu przez wkraplanie TNFa plus ligandy EGF-R oraz przez uczulanie owoalbuminą u szczurów. Ponieważ BIBX1522 zapobiegał wytwarzaniu mucyny w hodowanych komórkach, badano wpływ tego inhibitora u szczurów wolnych od patogenów. Wybarwianie błękitem Alcian/PAS, które było zwiększane przez dotchawicze wkraplanie TNFa, po którym następowało wkraplanie ligandu EGF-R, TGFa, hamowane było w sposób zależny od dawki przez wstępne traktowanie BIBX1522 (3-30 mg/kg,
PL 200 940 B1 dootrzewnowo; figura 5A). Wynikiem dotchawiczego wkraplania TNFa (w celu indukcji EGF-R), po którym następowało wkraplanie liganda EGF-R, TGFa, była uderzająca metaplazja komórek kubkowych.
U szczurów uczulanych owoalbuminą, wstępne traktowanie BIBX1522 (10 mg/kg, dootrzewnowo) całkowicie hamowało tworzenie komórek kubkowych (oszacowywane przez wybarwianie błękitem Alcian/PAS; Figura 5B). Zwierzęta, które otrzymywały owoalbuminę dootrzewnowo wykazywały tylko nieznaczne dodatnie wybarwiania AB/PAS w nabłonku oskrzeli. Zwierzęta uczulane owoalbuminą, najpierw podawaną dootrzewnowo, a następnie przez trzy wkroplenia dotchawicze, wykazywały znaczny wzrost dodatniego wybarwiania AB/PAS.
Badania te wskazują, że EGF-R, podlega stymulacji ligandami EGF-R, indukuje tworzenie komórek kubkowych in vitro i in vivo, które to wpływy spowodowane są aktywacją EGF-R, i które blokowane są przez inhibitor kinazy tyrozynowej EGF-R. Inhibitor skuteczny był również pod względem zapobiegania tworzenia komórek kubkowych w modelu astmy indukowanej owoalbuminą.
Poza opisem mechanizmu indukowania komórek kubkowych, niniejsze wyniki sugerują możliwą sekwencję ewolucyjną tworzenia komórek kubkowych opierającą się na ekspresji EGF-R. Stymulacja TNFa indukowała intensywne wybarwianie nieziarnistych komórek wydzielniczych; ich późniejsza aktywacja przez ligandy EGF-R powodowała postępujące wybarwianie glikokoniugatów śluzu w cytoplazmie i komórki stają się komórkami „pre-kubkowymi, a następnie „kubkowymi. Wkraplanie TNFa, po którym następuje wkraplanie ligandów EGF-R indukowało tworzenie komórek kubkowych bez zmiany całkowitej liczby komórek nabłonkowych, co sugeruje, że aktywacja EGF-R pobudza selektywne różnicowanie komórek (a nie proliferację). Odkrycia sugerują, że komórki kubkowe pochodzą z nieziarnistych komórek wydzielniczych, w których zachodzi ekspresja EGF-R, i ulegają stymulacji do wytwarzania mucyn przez ligandy EGF-R.
U pacjentów zmarłych z powodu ostrej astmy, ważnymi wynikami badań są zwiększenie liczby komórek kubkowych i zaczopowanie śluzem. W mysim modelu astmy występuje uczulanie dróg oddechowych po powtarzanym wkraplaniu owoalbuminy, czego wynikiem jest znaczne zwiększenie liczby komórek kubkowych dróg oddechowych. Wykazaliśmy, że EGF-R, który nie ulega ekspresji w kontrolnym nabłonku dróg oddechowych, ulega ekspresji u uczulanych zwierząt. Komórkami, które ulegały wybarwieniu, były komórki pre-kubkowe lub kubkowe, co sugeruje, że w tworzeniu komórek kubkowych zaangażone są EGF-R. Traktowanie wstępne inhibitorem kinazy tyrozynowej receptora EGF-R (BIBX1522) zapobiegało tworzeniu komórek kubkowych dróg oddechowych, co potwierdza rolę aktywacji EGF-R w tworzeniu komórek kubkowych w doświadczalnej astmie.
Niniejsze wyniki sugerują, że szlak EGF-R bierze udział w zwiększaniu liczby komórek kubkowych. Uprzednie badania wykazały, że różne bodźce, takie jak ozon, ditlenek siarki, wirusy, lipopolisacharyd, czynnik aktywujący płytki oraz interleukina 4 zwiększają ekspresję i wydzielanie mucyn. Niniejszy wynalazek zapewnia mechanizm do oceny współzależności tych bodźców zapalnych i układu EGF-R.
Astma służy jako przykład dla terapeutycznej strategii według wynalazku. Normalny nabłonek ludzkich dróg oddechowych posiada stosunek 3-10 komórek rzęskowych na każdą komórkę kubkową. W astmie liczba komórek kubkowych może być równa lub przekraczać liczbę komórek rzęskowych; u pacjentów zmarłych z powodu astmy występuje 30-krotny wzrost procentu pola powierzchni zajmowanej przez komórki kubkowe w porównaniu z wartością dla pacjentów zmarłych na choroby oddechowe inne niż astma. Zahamowanie tworzenia komórek kubkowych powinno wyeliminować źródło nadmiernego wydzielania. Ponieważ cykl życiowy komórek kubkowych jest nieznany, nie można dokładnie przewidzieć przebiegu czasowego rozkładu zwiększania liczby komórek kubkowych przy stosowaniu leczenia. Przy braku dalszej ekspozycji na alergen, zwiększanie liczby komórek kubkowych u uprzednio uczulanych myszy trwało pięćdziesiąt dni, wraz z innymi przejawami zapalenia alergicznego. Hamowanie aktywacji EGF-R może hamować zwiększanie liczby komórek kubkowych znacznie szybciej, zależnie od długości życia komórek kubkowych. Ostatnio doniesiono o wysoce selektywnych, współzawodniczących z ATP inhibitorach kinazy tyrozynowej. Inhibitory kinazy tyrozynowej EGF-R są oceniane jako przydatne do leczenia nowotworów złośliwych związanych z ekspresją EGF-R.
Nadmierne wydzielanie jest głównym objawem w wielu przewlekłych chorobach zapalnych dróg oddechowych. Obecnie brak jest skutecznej terapii do łagodzenia objawów oraz zatrzymywania postępu tych chorób. Niniejsze odkrycia zapewniają mechanizm i strategię terapii: przez hamowanie aktywacji EGF-R zapobiega się tworzeniu komórek kubkowych. Proponuje się inhibitory aktywacji EGF-R jako terapię chorób dróg oddechowych związanych z nadmiernym wydzielaniem.
PL 200 940 B1
P r z y k ł a d 2
Rola stresu oksydacyjnego w tworzeniu komórek kubkowych
Sugerowano, że u ludzi przedłużone palenie papierosów związane jest z postępującymi zmianami patologicznymi w obwodowych drogach oddechowych, włącznie ze zwiększeniem liczby komórek kubkowych. Podobnie, wykazano, że doświadczalne modele palenia papierosów u zwierząt powodują zwiększenie liczby komórek kubkowych w drogach oddechowych. Jednakże, mechanizm, poprzez który dym papierosowy może indukować syntezę mucyny, jest nieznany. Poniższe dane wykazują, że granulocyty obojętnochłonne aktywowane przez stymulujące stan zapalny cytokiny oraz dym papierosowy indukują syntezę mucyny MUC5AC w ludzkich komórkach nabłonka oskrzeli poprzez niezależną od ligandów aktywację EGF-R. Wyniki te sugerują, że granulocyty obojętnochłonne oraz dym papierosowy są regulatorami różnicowania komórek nabłonkowych i wynikiem ich działania może być nienormalna indukcja komórek wytwarzających mucynę w drogach oddechowych.
Metody
Izolowanie granulocytów obojętnochłonnych. Ludzkie granulocyty obojętnochłonne oczyszczano z krwi obwodowej otrzymanej od zdrowych dawców ludzkich. Izolowanie granulocytów obojętnochłonnych prowadzono zgodnie ze standardowymi technikami rozdziału w gradiencie Ficoll-Hypaque, sedymentacji z zastosowaniem dekstranu i lizy erytrocytów w warunkach hipotonicznych. Komórki były żywotne w > 95%, co sprawdzano przez barwienie błękitem tryptanowym. Dla zapobiegania zanieczyszczeniom endotoksynami, wszystkie roztwory przepuszczano przez sączek o średnicy porów 0,1 μ.
Hodowla komórek. Komórki NCIH292, linię komórek ludzkiego raka śluzowo-naskórkowego płuc, hodowano w podłożu RPMI zawierającym 10% płodową surowicę bydlęcą, penicylinę (100 U/ml), streptomycynę (100 μg/ml) i Hepes (25 mM) w temperaturze 37°C w nawilżanym inkubatorze z płaszczem wodnym w atmosferze 5% CO2. Do hodowli komórek stosowano albo 6-studzienkowe płytki do hodowli, albo 8-komorowe szkiełka. Po uzyskaniu zwartej warstwy komórek, komórki inkubowano w ciągu 1 godziny z samymi granulocytami obojętnochłonnymi (106 komórek/ml), samym TNFa (zrekombinowany ludzki TNFa, 20 ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA), samą IL-8 (zrekombinowana ludzka IL-8, 10-8 M, Genzyme), samym fMLP (10-8), Sigma, St. Louis, MO), TNFa + granulocyty obojętnochłonne, IL-8 plus granulocyty obojętnochłonne, fMLP plus granulocyty obojętnochłonne, nadtlenkiem wodoru, (H2O2, 200 μM), roztworem dymu papierosowego) lub TGFa (zrekombinowany ludzki TGFa, 0,1-25 ng/ml, Calbiochem, San Diego, CA). Następnie komórki przemywano i inkubowano z samym świeżym podłożem. Doświadczenia kończono we wcześniej wybranych czasach (dla mRNA 6 godzin i 12 godzin, dla białka 24 godziny). Jako kontrole, komórki inkubowano z samym podłożem w ciągu takich samych okresów. W innych badaniach z granulocytami obojętnochłonnymi, jako bodziec wybrano TNFa, ponieważ wywiera on najsilniejszy wpływ na syntezę MUC5AC. Komórki NCI-H292 inkubowano w ciągu 1 godziny albo z granulocytami obojętnochłonnymi, które wcześniej inkubowano z TNFa (20 ng/ml) w ciągu 1 godziny, a następnie przemywano jałową PBS dla uniknięcia zanieczyszczenia supernatantem (tj. cząsteczkami uwalnianymi z granulocytów obojętnochłonnych), albo komórki NCI-H292 inkubowano z samym supernatantem. W badaniach hamowania z zastosowaniem inhibitorów kinazy tyrozynowej EGF-R, komórki NCI-H292 traktowano wstępnie BIBX1522 (10 μg/ml, dostarczonego dzięki uprzejmości Boehringer Ingelheim Inc., Ingelheim, Niemcy) lub Tyrphostin AG1478 (10 μM, Calbiochem) w ciągu 30 minut przed dodaniem bodźca. Badano również wpływ selektywnego inhibitora kinazy tyrozynowej receptora płytkopochodnego czynnika wzrostowego (Tyrphostin AG1295, Calbiochem) oraz ujemnej kontroli dla Tyrphostin (Tyrphostin A1, 100 μM, Calbiochem). W badaniach hamowania z zastosowaniem blokujących przeciwciał skierowanych przeciw ligandom EGF-R, supernatanty traktowano wstępnie w ciągu 30 minut przeciwciałem skierowanym przeciw TGFa (Calbiochem) lub przeciwciałem skierowanym przeciw EGF, a następnie dodawano do komórek NCI-H292. Rolę wolnych rodników tlenowych badano stosując akceptory wolnych rodników tlenowych, DMSO (1%, Sigma), 1,3-dimetylo-2-tiomocznik (DMTU, 50 mM, Sigma) lub dysmutazę ponadtlenkową (SOD, 300 U/ml, Sigma).
Przygotowywanie roztworu dymu papierosowego. W badaniach stosowano papierosy do celów badawczych (kod 2R1, produkowane dla University of Kentucky Tobacco and Health Research Foundation). Roztwór dymu papierosowego przygotowywano w sposób opisany uprzednio (Dusser i in. (1989) J. Clin. Invest. 84: 900-906). Krótko, dym papierosowy zamykano w polipropylenowej strzykawce (35 ml) z szybkością jednego wdmuchnięcia/minutę (10 razy) i powoli wprowadzono do 20 ml RPMI1640 zawierającego 50 mM bufor Hepes. Roztwór dymu doprowadzano następnie do pH 7,4 i stosowano natychmiast po przygotowaniu.
PL 200 940 B1
Wizualizacja glikokoniugatów śluzu i białka MUC5AC w komórkach NCI-H292. Po zakończeniu doświadczeń, komórki hodowane na 8-komorowych szkiełkach utrwalano 4% paraformaldehydem w ciągu 1 godziny, a następnie albo wybarwiano błękitem Alcian/kwas nadjodowy-odczynnik Schiffa (PAS) w celu wizualizacji glikokoniugatów śluzu, albo stosowano do immunocytochemii MUC5AC. Do immunocytochemii MUC5AC, jako rozcieńczalnik przeciwciała stosowano PBS zawierającą 0,05% Tween-20, 2% normalną surowicę kozią i Lewamizol (2 mM).
Komórki inkubowano z mysim przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciw MUC5AC (klon 45 M1, 1:200, Neo Markers, Fremont, CA) w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie 3 razy przemywano PBS w celu usunięcia nadmiaru pierwszego przeciwciała. Następnie komórki inkubowano w ciągu jednej godziny w temperaturze pokojowej z biotynylowanym przeciwciałem końskim skierowanym przeciw mysim IgG (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) w rozcieńczeniu 1:200. Związane przeciwciało wizualizowano zgodnie ze standardowym protokołem dla metody stosowania kompleksu awidyna-biotyna-alkaliezna fosfataza.
Hybrydyzacja in situ pod kątem ludzkiego genu MUC5AC. Fragment cDNA ludzkiego MUC5AC o długości 298 bp wstawiono do wektora klonującego TA (Invitrogen, San Diego, CA). Przygotowywanie sond RNA i hybrydyzację in situ prowadzono w sposób opisany powyżej.
Immunologiczne oznaczenie białka MUC5AC. Białko MUC5AC mierzono w sposób opisany powyżej. Krótko, przygotowywano lizaty komórkowe w PBS o różnych rozcieńczeniach i 50 μl każdej próbki inkubowano w temperaturze 40°C z buforem wodorowęglan-węglan (50 μθ w 96-studzienkowej płytce (Maxisorp Nunc, Fisher Scientific, Santa Clara, CA) do wyschnięcia. Płytki przemywano trzy razy PBS i blokowano 2% BSA (frakcja V, Sigma) w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej. Płytki ponownie przemywano trzy razy PBS, a następnie inkubowano z 50 μl mysiego przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciw MUC5AC (1:100), które rozcieńczono PBS zawierającą 0,05% Tween 20. Po 1 godzinie studzienki przemywano trzy razy PBS i w każdej studzience umieszczano 100 μl koniugatu peroksydaza chrzanowa-kozie przeciwciało skierowane przeciw mysim IgG (1:10 000, Sigma). Po 1 godzinie płytki przemywano trzy razy PBS. Reakcję barwną wywoływano roztworem peroksydazy TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) i zatrzymywano 2 N H2SO4. Absorbancję odczytywano przy długości fali 450 nm.
Ilościowa analiza białka TGFa. Białko TGFa mierzono stosując komercjalnie dostępny zestaw do ELISA (Sigma), postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Supernatant pobrany po inkubacji granulocytów obojętnochłonnych plus TNFa (20 ng/ml) w ciągu 1 godziny mieszano z buforem do lizy PBS zawierającym 1% Triton X-100, 1% deoksycholan sodowy i kilka inhibitorów proteaz (Complete Mini, Boehringer Mannheim, Niemcy), a następnie stosowano do pomiaru TGFa.
Immunoprecypitacja białka EGF-R i immunoblotting pod kątem fosforylacji tyrozyn. Komórki głodzone w surowicy w ciągu 24 godzin, a następnie w ciągu 15 minut stymulowano THFa, H2O2 lub supernatantem aktywowanych granulocytów obojętnochłonnych. Po stymulacji komórki lizowano i inkubowano w ciągu 30 minut na wstrząsarce obrotowej w temperaturze 4°C. W celu rozpuszczenia materiału nierozpuszczalnego, lizaty komórkowe wirowano przy 14 000 obrotów na minutę w ciągu 5 minut w temperaturze 4°C. Próbki supernatantów, zawierające równe ilości białka, poddawano immunoprecypitacji z przeciwciałem skierowanym przeciw receptorowi EGF (poliklonalne, Ab4, Calbiochem) i 20 μl białko A-agarozy (Santa Cruz) w ciągu 2 godzin w temperaturze 4°C. Precypitaty przemywano trzy razy 0,5 ml buforu do lizy, zawieszano w buforze do próbek z SDS i gotowano w ciągu 5 minut. Białka rozdzielano przez SDS-PAGE w 8,0% żelu akryloamidowym. Uzyskany w wyniku żel równoważono w buforze do przenoszenia: 25 mM Tris-HCl, 192 mM glicyna, 20% (v/v) metanol, pH 8,3. następnie białka przenoszono elektroforetycznie na membrany nitrocelulozowe (średnica porów 0,22 nm), blokowano przez noc 5% odtłuszczonym chudym mlekiem w PBS zawierającej 0,05% Tween 20, a następnie inkubowano z monoklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciw fosfotyrozynie (1:100, Santa Cruz) w ciągu 1 godziny. Związane przeciwciało wizualizowano zgodnie ze standardowym protokołem dla metody stosowania kompleksu awidyna-biotyna-alkaliczna fosfataza (zestaw ABC, Vector Laboratories).
Statystyka. Wszystkie dane wyrażano jako średnie ± standardowy błąd średni. Do określenia statystycznie istotnych różnic pomiędzy grupami stosowano jednokierunkową analizę wariancji. Gdy w analizie wariancji zidentyfikowano istotności statystyczne, do wprowadzenia poprawek na porównania wielokrotne stosowano test F Scheffe'a. Jako wskazującą statystycznie istotną różnicę przyjmowano dla hipotezy zerowej prawdopodobieństwo niższe niż 0,05.
PL 200 940 B1
Wyniki
Aktywowane granulocyty obojętnochłonne powodują syntezę mucyny MUC5AC. Gdy z komórkami NCI-H292 inkubowano w ciągu 1 godziny granulocyty obojętnochłonne plus bodźce, które aktywują granulocyty obojętnochłonne (TL-8, fMLP, TNFa), synteza białka MUC5AC znacząco wzrastała w ciągu 24 godzin, podczas gdy niestymulowane granulocyty obojętnochłonne, (106/ml), sama IL-8 lub sam fMLP nie wykazywały wpływu na syntezę MUC5AC; inkubacja z samym TNFa powodowała mały, nieistotny wzrost syntezy MUC5AC. Gdy granulocyty preinkubowano w ciągu 1 godziny z TNFa, a następnie rozdzielano granulocyty i ich supernatant, kolejna inkubacja supernatantu w ciągu 1 godziny z komórkami NCI-H292 zwiększała ekspresję genu MUC5AC w ciągu 12 godzin oraz stymulowała zarówno wybarwianie błękitem Alcian/PAS, jak i wybarwianie przeciwciałem skierowanym przeciw białku MUC5AC w ciągu 24 godzin; komórki NCI-H292 nie poddawane aktywacji wykazywały niewielką ekspresję genu MUC5AC oraz niewielkie, w postaci łat, wybarwianie zarówno błękitem Alcian/PAS, jak i białka MUC5AC. Indukowana przez supernatant synteza białka MUC5AC wzrastała znacząco w stosunku do kontroli; granulocyty obojętnochłonne oddzielone po inkubacji od supernatantu pozostawały bez wpływu. Wywnioskowano, że aktywowane granulocyty obojętnochłonne szybko wydzielają aktywny produkt, który powoduje syntezę MUC5AC.
Inhibitory kinazy tyrozynowej EGF-R zapobiegają indukowanej przez supernatant aktywowanych granulocytów obojętnochłonnych syntezie MUC5AC. Ponieważ wiadomo, że ligandy EGF-R powodują syntezę MUC5AC w komórkach NCI-H292 poprzez aktywację kinazy tyrozynowej EGF-R, badano rolę aktywacji EGF-R w syntezie MUC5AC indukowanej przez supernatant aktywowanych granulocytów obojętnochłonnych. Wstępne traktowanie komórek NCI-H292 selektywnymi inhibitorami kinazy tyrozynowej EGF-R (BIBX1522, AG1476) zapobiegało syntezie białka MUC5AC, którą zazwyczaj indukował supernatant aktywowanych granulocytów obojętnochłonnych. Selektywny inhibitor kinazy receptora płytkopochodnego czynnika wzrostowego (AG1295) oraz negatywna kontrola dla Tyrphostin (A1) nie wywierały wpływu. Wyniki te wskazują na występowanie aktywacji kinazy tyrozynowej EGF-R w syntezie MUC5AC indukowanej supernatantem aktywowanych granulocytów obojętnochłonnych.
Rola ligandów EGF-R wydzielanych do supernatantu aktywowanych granulocytów obojętnochłonnych w syntezie MUC5AC. W celu określenia, czy aktywacja kinazy tyrozynowej EGF-R jest zależna od ligandów EGF-R (EGF i TGFa), preinkubowaliśmy supernatant aktywowanych granulocytów obojętnochłonnych z neutralizującymi przeciwciałami skierowanymi przeciw ligandom EGF-R. Wstępne traktowanie supernatantu albo przeciwciałem skierowanym przeciw TGFa, albo przeciwciałem skierowanym przeciw EGF, nie hamowało syntezy MUC5AC indukowanej przez supernatant aktywowanych granulocytów obojętnochłonnych. Ponadto, TGFa nie wykrywano w supernatancie. A zatem, fosforylację reszty tyrozyny EGF-R powodowaną przez supernatant aktywowanych granulocytów obojętnochłonnych indukował mechanizm niezależny od ligandów EGF-R, EGF i TGFa.
Dym papierosowy i wolne rodniki tlenowe powodują syntezę MUC 5AC. Dym papierosowy i wolny rodnik tlenowy, H2O2, zwiększają ekspresję genu MUC5AC w ciągu 12 godzin, tak jak TGFa. Podobnie, wszystkie bodźce zwiększały syntezę białka MUC5AC i wytwarzanie glikokoniugatów śluzu w ciągu 24 godzin, przy czym efekty te występowały w sposób zależny od dawki. Maksimum syntezy MUC5AC w odpowiedzi na H2O2 było znacząco niższe, niż w odpowiedzi na TGFa. Wstępne traktowanie AG1478 zapobiegało wzrostowi syntezy białka MUC5AC indukowanemu przez wszystkie bodźce, wskazując, że bodźce powodują syntezę mucyn poprzez aktywację kinazy tyrozynowej EGF-R. Syntezę MUC5AC pod wpływem supernatantu aktywowanych granulocytów obojętnochłonnych, dymu papierosowego i H2O2 znacząco hamowało wstępne traktowania akceptorami wolnych rodników (DMSO i DMTU) oraz SOD, ale DMSO lub SOD nie wpływały na syntezę białka MUC5AC pod wpływem TGFa.
Indukcja fosforylacji reszty tyrozyny EGF-R przez supernatant aktywowanych granulocytów obojętnochłonnych oraz przez H2O2. Rozkład występowania białka EGF-R był podobny w głodzonej w surowicy kontroli oraz we wszystkich stymulowanych próbach (supernatant aktywowanych granulocytów obojętnochłonnych, dym papierosowy, H2O2 lub TGFa). Fosforylacja reszt tyrozynowych białka całkowitego występowała w ciągu 15 minut od dodania supernatantu aktywowanych granulocytów obojętnochłonnych, dymu papierosowego, H2O2 lub TGFa; głodzona w surowicy kontrola nie wykazywała żadnego wpływu. Indukowana TGFa fosforylacja reszt tyrozynowych białka całkowitego była wyższa od wpływu aktywowanych granulocytów obojętnochłonnych, dymu papierosowego lub H2O2. W celu określenia, czy EGF-R ulegał fosforylacji, przeprowadzono immunoprecypitację z przeciwciałem skierowanym przeciw EGF-R: wszystkie spośród supernatantu aktywowanych rozpuszczalnych
PL 200 940 B1 produktów dymu papierosowego i H2O2 indukowały specyficzną dla EGF-R fosforylację tyrozyn w ciągu 15 minut, wpływ, który był podobny do tego powodowanego przez TGFa. Wstępne traktowanie komórek NCI-H292 AG1478 hamowało fosforylację reszt tyrozynowych EGF-R pod wpływem wszystkich bodźców. DMSO hamował fosforylację reszt tyrozynowych EGF-R indukowaną przez supernatant, dym papierosowy, i H2O2, ale DMSO nie miał żadnego wpływu na fosforylację reszt tyrozynowych EGF-R indukowaną przez TGFa.
Powyższe wyniki wykazują, że granulocyty obojętno-chłonne powodują syntezę mucyny MUC5AC w komórkach NCI-H292, gdy aktywuje się je IL-8, fMLP lub TNFa. Ponadto, syntezę MUC5AC powodował supernatant, który zebrano 1 godzinę po inkubacji granulocytow obojętnochłonnych z TNFa, wpływ, który był hamowany przez selektywne inhibitory kinazy tyrozynowej EGF-R. Zahamowanie kinazy tyrozynowej EGF-R całkowicie blokowało syntezę MUC5AC powodowaną przez supernatant aktywowanych granulocytow obojętnochłonnych; inhibitor kinazy tyrozynowej innej niż EGF-R, selektywny inhibitor kinazy receptora płytkopochodnego czynnika wzrostowego (AG1295) oraz kontrola ujemna dla Tyrphostin (A1 nie wywierały wpływu, sugerując, że fosforylacja tyrozyny EGF-R jest szlakiem przekazywania sygnału syntezy MUC5AC indukowanej przez supernatant aktywowanych granulocytow obójętnochłonnych.
W celu dalszej analizy mechanizmu, poprzez który supernatanty aktywowanych granulocytow obojętnochłonnych indukują fosforylację tyrozyny EGF-R, badano oba szlaki EGF-R, zależny od liganda i niezależny od liganda. Po pierwsze, mierzyliśmy TGFa w supernatancie aktywowanych granulocytow obojętnochłonnych i stwierdziliśmy, że supernatant nie zawiera mierzalnych ilości TGFa. Uprzednie doniesienia wykazały, że granulocyty obojętnochłonne zawierały tylko niskie stężenia (2,5 pg/106 komórek) TGFa. Wpływ supernatantu aktywowanych granulocytow obojętnochłonnych na syntezę MUC5AC był równie silny, jak wpływ 1 ng TGFa, co było 400-krotnie wyższe, niż ilość TGFa występująca w granulocytach obojętnochłonnych. Po drugie, przeprowadziliśmy badania blokowania z zastosowaniem neutralizujących przeciwciał skierowanych przeciw ligandom EGF-R: wstępne traktowanie neutralizującymi przeciwciałami skierowanymi przeciw EGF i TGFa osłabiać hamowanie syntezy MUC5AC powodowanej przez supernatant aktywowanych granulocytow obojętnochłonnych. Wyniki te sugerują, że synteza MUC5AC indukowana superna-tantem granulocytow obojętnochłonnych nie była powodowana przez wydzielanie ligandów EGF-R (TGFa i EGF) przez granulocyty obojętnochłonne. Następnie, badaliśmy szlak niezależny od ligandów: ponieważ wiadomo, że podczas aktywacji granulocyty obojętnochłonne uwalniają wolne rodniki tlenowe, oraz wiadomo, że powodują one transaktywację kinazy tyrozynowej EGF-R w różnych komórkach, wysunęliśmy hipotezę, że uwalnianie wolnych rodników tlenowych przez aktywowane granulocyty obojętnochłonne powodowało fosforylację reszt tyrozynowych EGF-R, czego wynikiem była synteza MUC5AC w komórkach NCI-H292. Akceptory wolnych rodników (DMSO i DMTU) oraz SOD hamowały syntezę MUC5AC pod wpływem supernatantu aktywowanych granulocytow obojętnochłonnych. Istnieją doniesienia, że TNFa powoduje wybuch oksydacyjny w granulocytach obojętnochłonnych w zawiesinie, z maksymalną odpowiedzią w ciągu 1 godziny; niniejsze wyniki pokazują podobny przebieg czasowy.
W obecnych badaniach, egzogenny H2O2, główny produkt uwalniany z granulocytow obojętnochłonnych podczas wybuchu oksydacyjnego, powodował syntezę MUC5AC w komórkach NCI-H292. Jednakże, maksymalna odpowiedź na H2O2 w postaci syntezy MUC5AC stanowiła tylko połowę odpowiedzi na TGFa. Znaczącym odkryciem w obecnych badaniach jest fakt, że sam dym papierosowy powodował syntezę MUC5AC. Sugeruje to, że dym papierosowy mógłby powodować syntezę MUC5AC in vivo zarówno poprzez bezpośrednią stymulację, jak i pośrednią stymulację powodowaną z udziałem granulocytow obojętnochłonnych. Ciągle nie jest jasne, które cząsteczki w dymie papierosowym powodują syntezę MUC5AC. Donoszono, że dym papierosowy zawiera wiele produktów (np. nikotynę, smołę, akroleinę i utleniacze). W naszych doświadczeniach DMSO i SOD częściowo hamowały indukowaną dymem papierosowym syntezę MUC5AC. A zatem, stres oksydacyjny mógłby być jednym z mechanizmów wywołujących tę odpowiedź. Fakt, że inhibitory kinazy tyrozynowej EGF-R całkowicie blokowały indukowaną dymem papierosowym syntezę MUC5AC wskazuje, że aktywacja EGF-R odgrywa zasadniczą rolę w syntezie MUC5AC indukowanej dymem papierosowym.
Zapalenie dróg oddechowych z udziałem granulocytow obojętnochłonnych jest powszechną cechą chorób dróg oddechowych, a granulocyty obojętnochłonne są mobilizowane i aktywowane przez cytokiny oraz przez dym papierosowy. Niniejsze badania wykazują, że zmobilizowane granulocyty obojętnochłonne i dym papierosowy działają jako regulatory różnicowania komórek nabłonkowych, którego wynikiem jest indukcja wytwarzających mucynę komórek w drogach oddechowych. Co najPL 200 940 B1 ważniejsze, hamowanie aktywacji EHF-R będzie użyteczne jako terapia w chorobach układu oddechowego związanych z nadmiernym wydzielaniem.
P r z y k ł a d 3
Zranienie nabłonka dróg oddechowych powoduje metaplazję komórek kubkowych
Postawiono hipotezę, że czopy agarozowe wkroplone do dróg oddechowych mogą przewlekle przebywać w oskrzelach bez ich obturacji oraz, że tkwiące czopy mogą powodować stan zapalny, czego wynikiem jest metaplazja komórek kubkowych. Wykazano, że czopy agarozowe indukują znaczne miejscowe tworzenie komórek kubkowych, jak wykazano przez dodatnie wybarwianie błękitem Alcian/PAS i ekspresję genu mucyny, związane z miejscową mobilizacją komórek zapalnych. Wyniki sugerują występowanie aktywacji EGF-R w indukowanej czopami metaplazji komórek kubkowych.
Metody
Zwierzęta. Protokół doświadczeń na zwierzętach został zatwierdzony przez Committee on Animal Research, University of California San Francisco. Stosowano wolne od specyficznych patogenów samce szczurów F344 (waga ciała od 230 do 250 g; Simonsen Lab., Gilroy, CA). Szczury mieszkały w wolnych od patogenów klatkach BioClean z kontrolowanym środowiskowo, laminarnym przepływem powietrza; zwierzęta posiadały wolny dostęp do jałowej karmy i wody.
Leki. Stosowano leki z następujących źródeł: cyklofosfamid (Sigma, St. Louis, MO), metoheksytal sodowy (Brevital, Jones Medical Industries, Inc., St. Louis, MO), pentobarbital sodowy (Nembutal, Abbot Lab., North Chicago, IL); BIBX1522, selektywny inhibitor kinazy tyrozynowej EGF-R (dostarczony dzięki uprzejmości Boehringer Ingelheim, Inc., Niemcy), rozpuszczano w następującym roztworze: 2 ml glikolu polietylenowego 400 (Sigma, St.Louis, MO), 1 ml 0,1 N HCl i 3 ml 2% roztworu mannitolu w wodzie (pH 7,0). NPC (inhibitor ruchliwości leukocytów) został dostarczony dzięki uprzejmości Scios Nova, Inc., Mountain Viev, CA.
Czopy agarozowe. Czopy agarozowe (średnica 0,7-0,8 mm) wykonano z podłoża EEO zawierającego 4% agarozę typu II (Sigma, St. Louis, MO) w jałowej soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanami (PBS). W celu wizualizacji czopów agarozowych w tkance, po stopieniu agarozy w temperaturze 50°C dodawano 3% zawiesinę błękitu Monastral B (Sigma, St. Louis, MO).
Protokół doświadczeń. Badaliśmy szczury wolne od patogenów, ponieważ normalnie posiadają one niewiele komórek kubkowych w drogach oddechowych. Zwierzęta usypiano metoheksytalem sodowym (Brevital, 25 mg/kg, dootrzewnowo). Tchawicę aseptycznie odsłonięto przez nacięcie szyi w linii środkowej i do oskrzela wkroplono czopy agarozowe przez Angiocath kaliber 20 (Becton Dikinson, Sandy, UT) połączony z polietylenową rurką (PE 90, średnica wewnętrzna 0,86 mm, a średnica zewnętrzna 1,27 mm, Clay Adams, Parsippany, NY) wprowadzoną do naciętej tchawicy. Rurkę polietylenową wygięto pod kątem 30° dla umożliwienia selektywnego wkraplania do prawego oskrzela. Po wkropleniu, nacięcie zamknięto szwem.
W celu oceny roli EGF-R w indukowanej czopami agarozowymi metaplazji komórek kubkowych, zwierzęta traktowano BIBX1522 (80 mg/kg, dootrzewnowo) 1 godzinę przed wkropleniem czopów agarozowych i powtarzano codziennie (40 mg/kg, dootrzewnowo, dwa razy dziennie). Zwierzęta zabijano 24, 48 lub 72 godziny po wkropleniu czopów agarozowych.
W celu oceny roli TNFa w indukowanej czopami agarozowymi metaplazji komórek kubkowych, zwierzęta traktowano przeciwciałem neutralizującym TNFa (Genzyme, Boston, MA). Pierwsze podanie (100 μl w 0,2 ml soli fizjologicznej, dootrzewnowo) miało miejsce 1 godzinę przed wkropleniem czopów agarozowych i dootrzewnowo iniekcje powtarzano codziennie. Ponadto, neutralizujące TNFa przeciwciało podawano przez infuzję (10 μl/godzinę) za pomocą wszczepionej podskórnie minipompy osmotycznej (Alzet 2ML1, Alza Corp., Palo Alto, CA).
W celu badania wpływu granulocytow obojętnochłonnych na indukowaną czopami agarozowymi metaplazję komórek kubkowych, szczury traktowano wstępnie cyklofosfamidem (inhibitorem leukocytów szpiku kostnego) lub kombinacją cyklofosfamid plus NPC 15669. Cyklofosfamid (100 mg/kg, dootrzewnowo) podawano 5 dni przed wkropleniem czopów agarozowych, a drugą iniekcję cyklofosfamidu (50 mg/kg, dootrzewnowo) podano 1 dzień przed wkropleniem czopów. W badaniach z zastosowaniem NPC 15669, lek (10 mg/kg, dootrzewnowo) wstrzyknięto 1 godzinę przed wkropleniem czopów agarozowych, a następnie w ciągu 3 dni po tym.
Wszystkie leki (BIBX1522, przeciwciało neutralizujące TNFa, cyklofosfamid i NPC 15669) podawano dootrzewnowo 1 godzinę przed wkraplaniem czopów agarozowych i dawki powtarzano codziennie w ciągu 3 dni.
PL 200 940 B1
Preparowanie tkanek. W różnych czasach po wkropleniu czopów agarozowych szczury usypiano pentobarbitalem sodowym (65 mg/kg, dootrzewnowo), duże krążenie perfundowano 1% - paraformaldehydem w PBS traktowanej pirowęganem dietylowym pod ciśnieniem 120 mmHg. Usuwano prawe płuco i prawy płat ogoniasty stosowano do badań histologicznych. W celu otrzymania zamrożonych skrawków, tkanki usuwano i umieszczano w 4% paraformaldehydzie na 1 godzinę, a następnie przenoszono na noc do 30% sacharozy dla zapewnienia ochrony przed zamrażaniem. Tkanki zatapiano w związku (Sakure Finetek U.S.A., Inc., Torrance, CA). W celu otrzymania skrawków metakrylanowych, tkanki umieszczano w 4% paraformaldehydzie w ciągu 24 godzin, a następnie odwadniano stopniowo wzrastającymi stężeniami etanolu i zatapiano w metakrylanie JB-4 (Polysciences, Inc., Warrington, PA). Skrawki tkankowe (grubość 4 μm) wybarwiano błękitem Alcian/PAS i dobarwiano hematoksyliną.
Morfometryczna analiza nabłonka oskrzelli. Procent wybarwionego błękitem Alcian/PAS pola powierzchni glikokoniugatów śluzu w nabłonku określano stosując układ półautomatycznej analizy obrazów zgodnie z metodami opublikowanymi uprzednio. Pole powierzchni nabłonka i wybarwionych błękitem Alcian/PAS koniugatów śluzu w nabłonku obrysowywano ręcznie i analizowano stosując program NIH Image (opracowany w U.S. National Institutes of Healt i dostępny anonimowo w internecie przez FTP lub na dyskietce w National Technical Information Service, Springfield, Wirginia; numer części PB95-500195GEI). Dane wyrażano jako procent całkowitego pola powierzchni nabłonka wybarwionego błękitem Alcian/PAS. Dla półilościowej oceny wydzielania śluzu, określano procent długości powierzchni nabłonka dodatnio wybarwionego błękitem Alcian/PAS przez obliczanie dodatnio wybarwionej długości w stosunku do długości całkowitej. Procent obnażonego nabłonka określano przez obliczanie stosunku obnażonego nabłonka do całkowitej długości nabłonka.
Identyfikacja rodzajów komórek w skrawkach metakrylanowych i analiza komórkowa. Całkowitą liczbę komórek nabłonkowych określano przez zliczanie jąder komórek nabłonkowych na odcinku blaszki podstawnej o długości 2 mm stosując obiektyw imersyjny (powiększenie 1000 x). Liniową długość blaszki podstawnej pod każdym analizowanym regionem nabłonka określano przez obrysowując kontury zdigitalizowanego obrazu blaszki podstawnej. Komórki nabłonkowe identyfikowano w sposób opisany uprzednio. Krótko, komórki podstawne identyfikowano jako małe spłaszczone komórki o dużych jądrach, położone tuż powyżej blaszki podstawnej, ale nie sięgające światła dróg oddechowych. Cytoplazma wybarwiała się na barwę ciemną i nie występowały ziarnistości dodatnie w barwieniu błękitem Alcian lub PAS. Komórki rzęskowe rozpoznawano dzięki ich urzęsionym brzegom, słabo wybarwionej cytoplazmie i dużym, okrągłym jądrom. Nieziarniste komórki wydzielnicze miały kształt kolumn i rozciągają się od światła do blaszki podstawnej. Po wkropleniu czopów agarozowych, tworzyły się „rozwijające się” komórki kubkowe (komórki pre-kubkowe). Komórki te wykazywały dodatnie wybarwianie błękitem Alcian/PAS, ziarnistości były małe i komórki nie były zapełnione ziarnistościami; zawierały one mniejsze pola powierzchni wybarwionego śluzu (< 1/3 wysokości nabłonka od błony podstawnej do powierzchni światła) lub rzadko i słabo wybarwione błękitem Alcian/PAS, małe ziarnistości. Komórki nieokreślonego rodzaju zdefiniowano jako komórki pozbawione wystarczających cech charakterystycznych do właściwego zakwalifikowania.
Immunohistochemiczna lokalizacja EGF-R. Obecność EGF-R określano przez lokalizację immunohistochemiczna, stosując mysie przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw EGF-R (Calbiochem, San Diego, CA). Wcześniej przygotowane zamrożone skrawki o grubości 4 μm utrwalano 4% paraformaldehydem i traktowano 0,3% H2O2/metanolu. Tkanki inkubowano z przeciwciałem skierowanym przeciw EGF-R (rozcieńczenie 1:250). Do wizualizacji wybarwianych tetrachloowodorkiem 3,3'-diaminobenzydyny (Sigma, St. Louis, MO) kompleksów antygen-przeciwciało stosowano biotynylowane końskie przeciwciało skierowane przeciw IgG myszy (1:200, Vector Lab., Burlingame, CA). Szkiełka kontroli ujemnych inkubowano z pominięciem pierwszego lub drugiego przeciwciała, zastępując je PBS.
Hybrydyzacja in situ. Wyznakowane [35S] sondy rybonukleinowe utworzono z plazmidu zawierającego fragment cDNA MUC5AC szczura o długości 320 bp dostarczony dzięki uprzejmości dr Carol Basbaum. Skrawki poddawano hybrydyzacji z sondami wyznakowanego [35S] RNA (2 500-3 000 cpm/Lil buforu do hybrydyzacji) i przemywano w surowych warunkach, obejmujących traktowanie RNazą A. Po autoradiografii w ciągu 7-21 dni wywoływano emulsję fotograficzną i skrawki wybarwiano hematoksyliną.
Zliczanie granulocytow obojętnochłonnych w nabłonku dróg oddechowych. Oszacowywanie liczby granulocytow obojętnochłonnych napływających do oskrzeli prowadzono przez ich wybarwianie
PL 200 940 B1 tetrachlorowodorkiem 3-3'-diaminobenzydyny i zliczanie w świetle oraz nabłonku dróg oddechowych;
wyniki wyrażano jako liczbę wybarwionych komórek na mm długości blaszki podstawnej.
Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL). W celu oszacowania liczby zróżnicowanych komórek w każdej grupie zwierząt, płuca płukano pięć razy jałową PBS o objętości 3 ml, popłuczyny łączono i mierzono objętość. Komórki w BAL zbierano przez wirowanie popłuczyn przy 1 000 obrotów na minutę w ciągu 10 minut. Następnie w hematocytometrze zliczano dziesięć mikrolitrów zawiesiny komórek w celu określenia liczby komórek w płynie BAL. Zliczanie zróżnicowanych komórek prowadzono w preparatach cytologicznych wybarwianych Diff-Quick (American Scientific Products, McGaw Park, IL). Liczbę komórek zróżnicowanych otrzymywano przez zliczenie co najmniej 200 komórek na każdym szkiełku cytologicznym.
Analiza statystyczna. Dane wyrażano jako średnie ± błąd standardowy. Do analiz statystycznych stosowano dwukierunkową lub jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA), a następnie, jeśli to było potrzebne, test t-Studenta. Prawdopodobieństwo poniżej 0,05 uważano za różnicę istotną statystycznie.
Wyniki
Wpływ na strukturę nabłonka dróg oddechowych: metaplazja komórek kubkowych. W celu określenia, czy czopy agarozowe wpływają na strukturę nabłonka dróg oddechowych, do prawego oskrzela 5 wolnych od patogenów szczurów wkroplono czopy agarozowe. U zwierząt kontrolnych nabłonek oskrzeli zawierał niewiele komórek kubkowych. Jednakże, po miejscowym wkropleniu czopów agarozowych, wybarwianie błękitem Alcian/PAS wykazywało zależny od czasu wzrost pola powierzchni komórek kubkowych, który wykrywalny był już po 24 godzinach, a był najwyższy po 72 godzinach od wkroplenia. Po 24 godzinach czopy agarozowe powodowały znaczący wzrost liczby komórek pre-kubkowych i kubkowych, a po 48 godzinach stwierdzano więcej dojrzałych komórek kubkowych (tablica 1). Po 72 godzinach czopy agarozowe zwiększały liczbę komórek kubkowych (P < 0,01); liczby komórek podstawnych i rzęskowych pozostrawały niezmienione (P > 0,05). Całkowita liczba komórek nabłonkowych na mm blaszki podstawnej była trochę, ale nieznacząco zwiększona (P > 0,05, tablica 1); wysokość nabłonka (mierzona od błony podstawnej nabłonka do powierzchni światła) ulegała zwiększeniu od 16,0 ± 1,2 nm w kontrolnych drogach oddechowych do 38,1 ± 9,1 nm 72 godziny po wkropleniu czopów (n = 5, P < 0,01).
W świetle dróg oddechowych zwierząt kontrolnych nie stwierdzono wybarwienia błękitem Alcian/PAS. Jednakże, w sąsiedztwie czopów agarozowych widoczne było dodatnie wybarwianie w świetle, wskazujące, że wystąpiło wydzielanie glikokoniugatów śluzu. W drogach oddechowych z czopami agarozowymi wybarwianie zwiększało się w sposób zależny od czasu. Procent całkowitej długości nabłonka zajętego przez dodatnio wybarwione błękitem Alcian/PAS w drogach oddechowych w sąsiedztwie czopów wzrastał z 0,1 ± 0,1% u zwierząt kontrolnych do 4,7 ± 1,4%, 13,3 ± 0,7% i 19,1 ± 0,7% po 24 godzinach, 48 godzinach i 72 godzinach (n = 5). Ponadto, czopy agarozowe obnażały nabłonek zatkanych oskrzeli o 13,5 ± 2,3%, 6,9 ± 2,4% i 5,1 ± 1,5% całkowitego pola powierzchni po odpowiednio 24, 48 i 72 godzinach (n = 5).
Wpływ czopów agarozowych na ekspresję genu mucyny. U szczurów kontrolnych nie występował wykrywalny sygnał dla antysensownej sondy MUC5AC w oskrzelach (n = 4 na grupę). W oskrzelach, do których wkroplono czopy agarozowe, występował sygnał dla MUC5AC, który wzrastał w sposób zależny od czasu od 24 do 72 godziny (n = 4). Ekspresję genu MUC5AC stwierdzano preferencyjnie w komórkach, które wybarwiały się dodatnio błękitem Alcian/PAS. Sygnału nie wykrywano w komórkach innych rodzajów (np. mięśni gładkich, tkanki łącznej). Skrawki sprawdzane sensowną sondą MUC5AC nie wykazywały ekspresji.
Wpływ czopów agarozowych na ekspresję EGF-R w nabłonku dróg oddechowych. U zwierząt kontrolnych w wyniku wybarwiania immunologicznego przeciwciałem skierowanym przeciw EGF-R stwierdzano rzadkie wybarwienia w nabłonku. Jednakże, po wkropleniu czopów agarozowych, nabłonek w sąsiedztwie czopów agarozowych wykazywał dodatnie pod względem EGF-R wybarwianie w komórkach, które wybarwiały się dodatnio błękitem Alcian/PAS. Wzór wybarwiania EGF-R korelował z wybarwianiem MUC5AC i AB/PAS. Immunododatnie pod względem EGF-R były komórki pre-kubkowe, kubkowe i nieziarniste komórki wydzielnicze. Komórki rzęskowe nie wykazywały reaktywności immunologicznej. W drogach oddechowych nie zatkanych przez czopy agarozowe, nabłonek wykazywał niewielkie wybarwianie EGF-R i wykazywał podobieństwo do wybarwiania u zwierząt kontrolnych.
PL 200 940 B1
Wpływ inhibitora kinazy tyrozynowej EGF-R na metaplazję komórek kubkowych oraz ekspresję genu mucyny. W obecnych badaniach wynikiem wkraplania czopów agarozowych była ekspresja EGF-R w komórkach wytwarzających mucyny. EGF-R jest przedstawicielem klasy receptorów posiadających aktywność kinazy tyrozynowej. A zatem, gdy z EGF-R wiążą się ligandy EGF-R (EGF lub TNFa), aktywowana jest specyficzna kinaza tyrozynowa EGF-R. Dlatego też, w celu przetestowania hipotezy, że aktywacja EGF-R indukuje ekspresję genu MUC5AC i glikokoniugatów śluzu po wkropleniu czopów agarozowych, szczurom wstrzyknięto dootrzewnowo inhibitor kinazy tyrozynowej EGF-R (BIBX1522). BIBX1522 znacznie hamował indukowany czopami agarozowymi obszar nabłonka wybarwionego błękitem Alcian /PAS po 24, 48 i 72 godzinach. Hamował on również całkowicie ekspresję genu MUC5AC po 72 godzinach od wkroplenia czopów.
Wpływ przeciwciała neutralizującego TNFa na metaplazję komórek kubkowych i ekspresję białka EGF-R. Postawiliśmy hipotezę, że podczas stanu zapalnego powodowanego przez czopy agarozowe uwalniany jest TNFa. Dlatego też, badaliśmy wpływ wstępnego traktowania szczurów przeciwciałem neutralizującym TNFa na indukowaną czopami agarozowymi metaplazję komórek kubkowych: u zwierząt traktowanych wstępnie przeciwciałem neutralizującym TNFa (n = 5) czopy agarozowe nie stymulowały dalej ekspresji białka EGF-R lub tworzenia dodatnio wybarwiających się błękitem Alcian/PAS komórek (kubkowych).
Mobilizacja komórek stanu zapalnego przez czopy agarozowe. Zauważono, że czopy agarozowe powodują uszkodzenia nabłonka i naciekanie komórek stanu zapalnego. Zarówno EGF-R, jak i jego ligandy, uczestniczą w kaskadzie EGF-R, która prowadzi do metaplazji komórek kubkowych. Określaliśmy role leukocytów i makrofagów we wpływach indukowanych czopami agarozowymi dwoma sposobami. Po pierwsze, badaliśmy komórki w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych: u szczurów kontrolnych dominującymi uzyskiwanymi komórkami były makrofagi (n = 5, fig. 4, kontrola). Po wkropleniu czopów agarozowych liczba makrofagów wzrastała (P < 0,05) i w popłuczynach pojawiały się znaczące ilości granulocytow obojętnochłonnych (P < 0,01). Liczba limfocytów pozostawała niezmieniona.
Naciekające komórki oceniano również w skrawkach tkankowych: drogi oddechowe bez czopów agarozowych zawierały nieliczne granulocyty obojętnochłonne, ale drogi oddechowe zawierające czopy wykazywały obecność granulocytow obojętnochłonnych, zarówno w nabłonku, jak i w świetle. Liczba granulocytow obojętnochłonnych wswietle dróg oddechowych wynosiła 0,2 ± 0,2, 42,4 ± 7,1, 40,7 ± 7,7 i 20,1 ± 7,2/mm blaszki podstawnej odpowiednio w kontrolnych drogach oddechowych oraz po 24, 48 i 72 godzinach od wkroplenia czopów (P < 0,01, n = 5).
Wpływ cyklofosfamidu na mobilizację granulocytow obojętnochłonnych, metaplazję komórek kubkowych oraz ekspresję białka EGF-R. U szczurów traktowanych cyklofosfamidem liczba granulocytow obojętnochłonnych krwi była obniżona (liczba granulocytow obojętnochłonnych w krwi żylnej po cyklofosfamidzie, 1,8 ± 0,5%, n = 5) oraz hamowana była indukowana czopami mobilizacja granulocytow obojętnochłonnych w BAL. Liczba granulocytow w świetle dróg oddechowych (2,6 ± 0,3/mm blaszki podstawnej) oraz w nabłonku (0,8 ± 0,2/mm) także obniżyła się znacząco po 24 godzinach. Cyklofosfamid hamował również indukowaną czopami agarozowymi metaplazję komórek kubkowych i ekspresję białka EGF-R. Gdy do cyklofosfamidu dodawano leumedin, NPC 15669, hamowanie indukowanej czopami agarozowymi metaplazji komórek kubkowych było podobne do wpływu samego cyklofosfamidu. Wyniki te wskazują na udział granulocytow obojętnochłonnych w indukowanej czopami metaplazji komórek kubkowych.
Dyskusja
W obecnych badaniach sprawdzaliśmy wpływ wkraplania czopów agarozowych na indukowaną czopami agarozowymi metaplazję komórek kubkowych w drogach oddechowych wolnych od patogenów szczurów, które w stanie kontrolnym posiadają bardzo nieliczne komórki kubkowe. Komórki nabłonkowe w oskrzelach zwierząt kontrolnych i oskrzelach bez czopów agarozowych (płuca kontrolne) jednolicie wybarwiały się ujemnie błękitem Alcian/PAS. Wynikiem wkraplania czopów agarozowych był silny, zależny od czasu, wzrost pola powierzchni komorek kubkowych nabłonka oskrzeli w sąsiedztwie wkroplonych czopów, który był wykrywalny po 24 godzinach, a najwyższy był po 72 godzinach od wkroplenia. Drogi oddechowe sąsiadujące z zatkanymi drogami oddechowymi również wybarwiały się dodatnio błękitem Alcian /PAS. Po wkropleniu czopów agarozowych całkowita liczba komórek oraz liczba komórek podstawnych i rzęskowych nie zmieniały się, ale w sposób zależny od czasu wzrastała liczba komórek kubkowych, a zmniejszała się liczba nieziarnistych komórek wydzielniczych (tablica 2).
PL 200 940 B1
Wyniki te sugerują, że metaplazja komórek kubkowych była wynikiem przekształcania nieziarnistych komórek kubkowych w komórki kubkowe.
T a b l i c a 2
Wpływ czopów agarozowych na rozkad komórek nabłonkowych oskrzeli u szczurów wolnych od patogenów*
Rodzaj komórek Kontrola 24 godziny 48 godzin 72 godziny
kubkowe 0,0 ± 0,0 13,1 ± 5,6 25,7 ± 15,0 51,5 ± 9,0
pre-kubkowe 0,0 ± 0,0 32,8 ± 2,9 25,7 ± 15,0 51,5 ± 9,0
wydzielnicze 43,5 ± 3,0 24,4 ± 3,3 18,4 ± 3,7 8,9 ± 2,3
rzęskowe 98,5 ± 4,0 83,8 ± 7,9 81,6 ± 5,0 84,0 ± 3,9
podstawne 18,4 ± 5,7 10,6 ± 0,8 11,6 ± 1,7 11,0 ± 2,3
niezróżnicowanet 1,3 ± 0,5 1,4 ± 0,8 1,1 ± 0,1 0,6 ± 0,4
łącznie 161 ± 7,2 166,1 ± 6,1 175,5 ± 6,2 180,9 ± 7,5
Komórki analizowano w sposób opisany w części Metody. Charakterystykę uzupełniono przez wybarwianie błękitem Alcian/ PAS (które wybarwia glikokoniugaty śluzu). Kontrolne drogi oddechowe zawierały nieliczne komórki pre-kubkowe i kubkowe. Po wkropleniu czopów agarozowych występował zależny od czasu (24, 48, 72 godziny) wzrost liczby komórek pre-kubkowych i kubkowych oraz zmniejszenie nieziarnistych komórek wydzielniczych w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi.
*Dane są średnimi ± błąd standardowy, liczba komórek/mm blaszki podstawnej.
T P < 0,05 w stosunku do kontroli.
§ P < 0,01 w stosunku do kontroli.
ΙΙ Komórki bez dostatecznych cech charakterystycznych cytoplazmy do zakwalifikowania.
Donoszono, że w komórkach kubkowych dróg oddechowych szczura zachodzi ekspresja genu MUC5AC. W obecnych badaniach w kontrolnych oskrzelach nie występowała ekspresja genu MUC5AC, ale ekspresja genu MUC5AC zachodziła w drogach oddechowych zatkanych czopami lub sąsiadujących z czopami, które dodatnio wybarwiały się błękitem Alcian/PAS, co sugeruje, że gen MUC5AC jest zaangażowany w indukowanej czopami agarozowymi ekspresji śluzu. Wyniki te wskazują, że czopy agarozowe indukują ekspresję genów mucyny i wytwarzanie glikokoniugatów śluzu w wybranych komórkach dróg oddechowych szczurów.
Badano mechanizm indukowanej czopami agarozowymi metaplazji komórek kubkowych. EGF-R normalnie nie ulega ekspresji w nabłonku dróg oddechowych szczurów wolnych od patogenów, ale jest indukowany przez TNFa. W obecności EGF-R w nabłonku, wynikiem wkroplenia ligandów EGF-R (EGF lub TGFa) jest zwiększenie ekspresji genu i białka mucyny. Selektywny inhibitor kinazy tyrozynowej EGF-R (BIBX1522) całkowicie hamuje te odpowiedzi, sugerując, że EGF-R daje sygnał do metaplazji komórek kubkowych. Określono wpływ BIBX1522 na indukowaną czopami agarozowymi metaplazję komórek kubkowych: BIBX1522 hamował indukowane czopami agarozowymi wytwarzanie glikokoniugatów śluzu i ekspresję genu MUC5AC. Wyniki te sugerują udział kaskady EGF-R w indukowanej czopami agarozowymi metaplazji komórek kubkowych.
Badano mechanizmy, poprzez które kaskada EGF-R powoduje metaplazję komórek kubkowych pod wpływem czopów agarozowych. Po pierwsze, badaliśmy ekspresję białka EGF-R w nabłonku oskrzeli. Kontrolne drogi oddechowe wybarwiały się jednolicie ujemnie pod względem EGF-R, ale drogi oddechowe zawierające agarozowe czopy wykazywały selektywne, zależne od czasu, dodatnie wybarwianie EGF-R. Dodatnio wybarwiane komórki obejmowały nieziarniste komórki wydzielnicze, komórki pre-kubkowe i komórki kubkowe. A zatem, czopy agarozowe indukowały ekspresję białka EGF-R. Szczury, które traktowano wstępnie neutralizującym przeciwciałem skierowanym przeciw TNFa nie rozwijały indukowanej czopami agarozowymi metaplazji komórek kubkowych, co wskazuje na udział TNFa w indukowanej czopami ekspresji EGF-R.
Cyklofosfamid, lek, który selektywnie obniża wytwarzanie leukocytów, zapobiegał mobilizacji granulocytow obojętnochłonnych do płynu dróg oddechowych oraz do nabłonka dróg oddechowych po wkropleniu czopów agarozowych, i zapobiegał także indukowanej czopami agarozowymi metaplazji komórek kubkowych. Po wprowadzeniu czopów agarozowych zwiększała się także liczba makrofagów, ale cyklofosfamid nie hamował mobilizacji makrofagów. Fakt, że cyklofosfamid obniżał również
PL 200 940 B1 ekspresję białka EGF-R po wprowadzeniu czopów agarozowych sugeruje, że granulocyty obojętnochłonne przyczyniają się, co najmniej częściowo, do ekspresji EGF-R w tym stanie zapalnym.
Granulocyty obojętnochłonne są również zdolne do wytwarzania ligandów EGF-R, EGF i TGFa. Ponadto, komórki nabłonkowe są źródłem ligandów EGF-R i w sąsiedztwie czopów agarozowych występują silne obnażenia nabłonka. Z zatem, nabłonek może być ważnym potencjalnym źródłem zarówno TNFa, jak i ligandów EGF-R.
Uzasadnione jest założenie, że skuteczność bodźca, czopa agarozowego, związana jest z ruchem czopów podczas oddychania, czego następstwem jest obtarcie nabłonka. Donoszono, że mechaniczne uszkodzenie nabłonka dróg oddechowych powoduje nadmierne wydzielanie. Te wcześniejsze badania prowadzą do potwierdzenia hipotezy, że mechaniczne uszkodzenia nabłonka dróg oddechowych prowadzą do nadmiernego wydzielania. Donoszono, że intubacja dotchawicza przez jamę ustną powoduje obfite wydzielanie śluzu u koni. Przewlekła intubacja u pacjentów może powodować nadmierne wydzielanie śluzu i może być odpowiedzialna za zatykanie śluzem. Inhibitory kinazy tyrozynowej EGF-R mogą służyć do zapobiegania nadmiernemu wydzielaniu śluzu po intubacji dotchawiczej.
Uszkodzenia nabłonka jest powszechnie stwierdzane w badaniach pacjentów z łagodną astmą i wzrost uszkodzenia koreluje z pogarszaniem się objawów klinicznych. Uszkodzenie nabłonka powstające w wyniku odpowiedzi alergicznej może indukować aktywację EGF-R, której wynikiem jest nienormalne tworzenie komórek kubkowych. Dane przedstawione powyżej sugerują udział aktywacji EGF-R w różnych odpowiedziach, szczególnie obejmujących metaplazję komórek kubkowych. Mechaniczne uszkodzenia nabłonka i uszkodzenia nabłonka w astmie mogą wywoływać podobną (EGF-R) kaskadę, której wynikiem jest nienormalny wzrost nabłonkowych komórek wydzielniczych. Dostarcza to mechanizm odpowiedzialny za nadmierne wydzielanie, które występuje w śmiertelnych przypadkach ostrej astmy.
P r z y k ł a d 4
Ponowna granulacja komórek kubkowych pod wpływem receptorów EGF
Degranulacja komórek kubkowych w nabłonku oddechowym nosa szczurów indukowano przez donosowe inhalacje fMLP. Znacząca degranulacja indukowana była w nabłonku przegrody nosowej po 4 godzinach od inhalacji donosowej fMLP (10-7 M). Ponowna granulacja komórek kubkowych występowała po 48 godzinach po inhalacji. W stanie kontrolnym w komórkach kubkowych ulegało ekspresji białko MUC5AC, ale nie ulegało ekspresji białko EGF-R. W kontrolnym nabłonku nieobecne były białko i gen zarówno EGF-R, jak mucyny MUC5AC, ale ulegały ekspresji po 48 godzinach od inhalacji. Wstępne traktowanie inhibitorem kinazy tyrozynowej EGF-R, BIBX1522, hamowało ekspresję genu i białka mucyny MUC5AC po indukowanej fMLP degranulacji komórek kubkowych. Wyniki te wskazują, że ekspresja i aktywacja EGF-R biorą udział w ponownej granulacji komórek kubkowych w nabłonku nosa szczura.
METODY
Zwierzęta. Protokół doświadczeń na zwierzętach został zatwierdzony przez Committee on Animal Research, University of California San Francisco. Stosowano wolne od specyficznych patogenów samce szczurów F344 (waga ciała od 200 do 230 g; Simonsen Lab., Gilroy, CA). Szczury mieszkały w wolnych od patogenów klatkach BioClean z kontrolowanym środowiskowo, laminarnym przepływem powietrza; zwierzęta posiadały wolny dostęp do jałowej karmy i wody.
Preparowanie tkanek nosa. W różnych czasach po inhalacji szczury usypiano pentobarbitalem sodowym (65 mg/kg, dootrzewnowo). Serce zwierzęcia odsłonięto, tępo zakończoną igłę wprowadzono koniuszek komory do aorty wstępującej i duże krążenie perfundowano 1% paraformaldehydem. Nacięcie w lewym przedsionku zapewniało wypływ utrwalacza. Usuwano oczy, żuchwy, skórę i muskulaturę, i głowę zanurzano w ciągu 24 godzin w dużej objętości tego samego utrwalacza. Po utrwaleniu głowę odwapniano Surgipath (Decalcifier II, Surgical Medical Industries, Inc., Richmond, IL) w ciągu 4-5 dni i przemywano zbuforowaną fosforanami solą fizjologiczną. Jamę nosową przecięto poprzecznie na poziomie brodawki przysiecznej podniebienia. W celu otrzymania zamrożonych skrawków blok tkanek czołowych zatapiano w metakrylanie glikolu (JB 4 Plus, Polysciences, Inc., Warrington, PA) lub w związku OCT (Sakura Finetek, U.S.A. Inc., Torrance, CA). Skrawki o grubości pięciu um cięto od przedniej powierzchni bloków zatopionych metakrylanie glikolu i wybarwiono albo błękitem Alcian (pH 2,5)/kwasem nadjodowym-odczynnikiem Schiffa (AB/PAS) w celu wykazania kwaśnych i obojętnych glikokoniugatów, albo 3,3'-diaminobenzydyną (Sigma Chemical, St. Louis, MO) w celu wizualizacji leukocytów, które migrują do nabłonka. Skrawki o grubości pięciu um cięto od przedniej powierzchPL 200 940 B1 ni zamrożonych zatopionych bloków i wybarwiano AB/PAS lub stosowano do immunologicznego wybarwiania EGF-R i MUC5AC.
Zliczanie granulocytów obojętnochłonnych w nabłonku nosa. Granulocyty obojętnochłonne zliczano w obszarach silnie wybarwionej 3,3'-diaminobenzydyną warstwy nabłonkowej przy powiększeniu 400x. Liczbę granulocytow obojętnochłonnych w nabłonku przegrody nosowej (od błony podstawnej do szczytów komórek) określano przez zliczanie liczby jąder na jednostkę długości blaszki podstawnej.
Ilościowe określanie degranulacji i ponownej granulacji komórek kubkowych. W celu oszacowania degranulacji i ponownej granulacji komórek kubkowych mierzyliśmy intensywność wybarwienia błękitem Alcian/PAS substancji śluzowych na powierzchni błony śluzowej nabłonka stosując półautomatyczny system obrazowania zgodnie z uprzednio opisaną metodą. Badaliśmy wybarwiane szkiełka stosując mikroskop Axio-plan (Zeiss, Inc.), który połączony był z jednostką kontrolną kamery wideo (DXC7550MD; Sony Corp. of America, Part Ridge, NJ). Obrazy nabłonka nosa rejestrowano w silnie wybarwionych obszarach stosując obiektyw fazo-kontrastowy o powiększeniu 400x, wykorzystując IMAXX Video System (PDI, Redmont, WA). Wewnątrzkomórkowa mucyna w powierzchniowych komórkach wydzielniczych nabłonka występowała w postaci owalnych ziarnistości o barwie purpurowej i różnych wielkościach. Mierzyliśmy pole powierzchni dodatnio wybarwionej błękitem Alcian/PAS i całkowite pole powierzchni nabłonka i wyrażaliśmy dane jako procent pola powierzchni wybarwionego błękitem Alcian/PAS wobec całkowitego pola powierzchni. Analizę prowadzono stosując komputer Macintosh 9500/120 (Apple Computer, Inc., Cupertino, CA) wykorzystując ogólnie dostępny program NIH Image.
Immunolokalizacja białka EGF-R i MUC5AC. Zamrożone skrawki z utrwalonych paraformaldehydem tkanek nosa traktowano 3% H2O2/metanolem w celu zablokowania endogennej peroksydazy i inkubowano z mysim przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciw EGF-R (Calbiochem, San Diego, CA) lub MUC5AC (NeoMarkers Inc., Fremont, CA) w ciągu 1 godziny przy rozcieńczeniu 1:100. Reaktywne immunologicznie EGF-R lub MUC5AC wizualizowano stosując zestaw Vectastain Elite ABC (Vector Lab., Inc., Burlingame, CA) z wykorzystaniem tetrachlorowodorku 3,3-diaminobenzydyny jako chromogenu. Kontrole obejmowały podstawienie pierwszego lub drugiego przeciwciała PBS.
Metody. Badaliśmy wolne od patogenów szczury, które normalnie w nabłonku przegrody nosowej posiadają wiele komórek kubkowych. W celu określenia wpływu podawanego w postaci aerozolu fMLP na degranulację komórek kubkowych oraz na migrację granulocytow obojętnochłonnych do błony śluzowej nabłonka nosa, zwierzęta usypiano pentobarbitalem sodowym (65 mg/kg, dootrzewnowo) i podawano im N-formylometionylo-leucylo-fenyloalaninę (fMLP; 10-5 M, Sigma, St. Louis, MO) w wolnej od pirogenów soli fizjologicznej donosowo przez aerozol w ciągu 5 minut. Ekspozycję na aerozol prowadzono przez wentylowanie zwierząt za pomocą rozpylacza ultradźwiękowego (PulmoSonic, DeVilbiss Co., Somerset, PA), który tworzył mgłę aerozolu z szybkością 0,3 ml/minutę. W podobny sposób zwierzęta kontrolne otrzymywały donosowo samą sól fizjologiczną w postaci aerozolu.
W celu przeprowadzenia badań nad ponowną granulacją komórek kubkowych nosa po inhalacji fMLP w postaci aerozolu, szczury zabijano po 48 godzinach od donosowego podania fMLP.
W celu oceny wpływu aktywacji kinazy tyrozynowej na ponowną granulację komórek kubkowych, 30 minut przed inhalacją fMLP zwierzęta traktowano wstępnie inhibitorem kinazy tyrozynowej EGF-R podawanym dootrzewnowo (BIBX1522, 15 mg/kg, dostarczonym dzięki uprzejmości Boehringer Ingelheim Inc., Niemcy) i powtarzano to dwa razy dziennie.
Statystyka. Wszystkie dane wyrażano jako średnie ± błąd standardowy. Dla każdej grupy doświadczalnej przeprowadzano jednokierunkową analizę wariancji ANOVA lub test t-Studenta. Prawdopodobieństwo poniżej 0,05 uważano za różnicę istotną statystycznie.
Wyniki
Wpływ degranulacji komórek kubkowych przez fMLP na strukturę nabłonka nosa. W stanie kontrolnym nabłonek przegrody nosowej posiadał znaczące pole powierzchni wybarwionych błękitem Alcian/PAS komórek kubkowych, ale powierzchnia światła była niewybarwiona. Immunologiczne wybarwianie pod kątem białka mucyny AUC5AC odpowiadało powierzchni wybarwiania AB/PAS, ale hybrydyzacja in situ wykazywała niewielką lub brak ekspresji genu MUC5AC. Immunohistochemiczne wybarwianie EGF-R było ujemne. Wyniki te wskazują, że nabłonek nosa szczurów kontrolnych zawiera nienaruszone komórki kubkowe zawierające białko MUC5AC przy braku ekspresji genu mucyny. Brak wybarwiania światła sugeruje, że nie występowała degranulacja (wydzielanie) mucyn.
PL 200 940 B1
Postawiono hipotezę, że niestymulowany nabłonek nosa szczurów zawiera „stabilne, niezdegranulowane komórki zawierające białka mucyn. Wykazano, że chemoatraktanty granulocytow obojętnochłonnych (np. fMLP) mobilizują je do nabłonka dróg oddechowych, gdzie granulocyty obojętnochłonne powodują degranulację komórek kubkowych poprzez proces zależny od elastazy. Dla zbadania wpływu degranulacji komórek kubkowych, w ciągu 5 minut podawano donosowo w aerozolu chemoatraktant granulocytow obojętnochłonnych, fMLP (10-7 M). U szczurów zabitych 4 godziny po podaniu fMLP, pole powierzchni wybarwione AB/PAS oraz pole powierzchni dodatniego pod względem MUC5AC wybarwiania immunologicznego były znacznie obniżone i występowała mobilizacja granulocytow obojętnochłonnych do nabłonka nosa. Wybarwianie AB/PAS było znaczne na powierzchni światła dróg oddechowych nosa, co potwierdza wystąpienie degranulacji komórek kubkowych. Jednakże, w czwartej godzinie po podaniu fMLP, ekspresja genu MUC5AC pozostawała niezmieniona.
U szczurów zabitych 48 godzin po podaniu fMLP, immunohistochemiczne wybarwianie przeciwciałem skierowanym przeciw EGF-R wybarwiało dodatnio EGF-R w komórkach pre-kubkowych i kubkowych, przy czym pole powierzchni wybarwiania AB/PAS i immunododatniego wybarwiania MUC5AC powróciło do poziomu występującego w stanie kontrolnym, co wskazuje na występowanie ponownej granulacji komórek kubkowych. W tym czasie nie występowała już mobilizacja granulocytow obojętnochłonnych, ekspresja genu MUC5AC była widoczna w obszarach zajętych przez komórki kubkowe, co wskazuje, że ponowna granulacja komórek kubkowych była związana ze zwiększoną ekspresją genu mucyny.
Rola fosforylacji przez kinazę tyrozynową EGF-R w ponownej granulacji komórek kubkowych. W uprzednich badaniach na szczurach podawano, że aktywacja receptorów EGF (EGF-R) prowadzi do ekspresji genu i białka mucyny. Dla sprawdzenia hipotezy, że aktywacja EGF-R odgrywa rolę w ponownej granulacji komórek kubkowych po podaniu fMLP, szczury traktowano wstępnie (n = 5) selektywnym inhibitorem kinazy tyrozynowej EGF-R, BIBX1522; podanie fMLP w postaci aerozolu powodowało mobilizację granulocytow obojętnochłonnych do nabłonka nosa, ale 48 godzin później pola powierzchni wybarwiania AB/PAS i immunododatniego wybarwiania MUC5AC pozostawały obniżone. Wyniki te wskazują na udział aktywacji EGF-R w syntezie mucyny w komórkach kubkowych po degranulacji pod wpływem fMLP.
W obecnych badaniach sprawdzaliśmy regulację wytwarzania mucyny w nabłonku nosa szczura. Nabłonek kontrolny zawierał znaczącą liczbę komórek kubkowych i w komórkach tych obecne było białko MUC5AC. Jednakże, nie występowała ekspresja genu MUC5AC. Donoszono, że ekspresja mucyny MUC5AC w innych komórkach nabłonkowych dróg oddechowych zachodzi poprzez ekspresję EGF-R i ich aktywację. W kontrolnych komórkach nabłonkowych nosa szczurów nie stwierdziliśmy ekspresji genu lub białka EGF-R. Nie występowało wybarwianie światła AB/PAS lub białka MUC5AC, co sugeruje że nie występowała znacząca degranulacja (wydzielanie) komórek kubkowych. Ekspresja EGF-R może być zmniejszona w „stabilnych komórkach kubkowych, zapobiegając dalszej syntezie mucyny. Dlatego też, „sprowokowaliśmy komórki kubkowe nosa przez indukcję ich degranulacji i badaliśmy późniejsze zmiany w strukturze nabłonka dróg oddechowych.
Chemoatraktanty granulocytow obojętnochłonnych powodują zależną od granulocytow obojętnochłonnych degranulację komórek kubkowych w drogach oddechowych świnki morskiej i człowieka, która zachodzi za pośrednictwem elastazy granulocytow obojętnochłonnych, zapewniającej ścisły kontakt pomiędzy granulocytami obojętnochłonnymi a komórkami kubkowymi. W celu indukcji degranulacji komórek kubkowych normalnie obecnych w przegrodzie nosowej, podano donosowo przez inhalację chemoatraktant, fMLP. fMLP mobilizował granulocyty obojętnochłonne w nabłonku nosa, po czym następowała degranulacja komórek kubkowych; znacznie zmniejszało się pole powierzchni wybarwione błękitem Alcian/PAS.
Następnie badaliśmy co się dalej dzieje w nabłonku nosa po indukowanej fMLP degranulacji komórek kubkowych. W czwartej godzinie po podaniu fMLP, gdy występowała największa degranulacja komórek kubkowych nosa, nadal nie występowała ekspresja EGF-R i MUC5AC. Jednakże, 48 godzin po podaniu fMLP, EGF-R ulegał silnej ekspresji w komórkach pre-kubkowych i kubkowych. Ekspresja genu MUC5AC zachodziła teraz intensywnie w nabłonku i te wydarzenia związane były z ponowną granulacją komórek kubkowych (zwiększone wybarwianie AB/PAS i MUC5AC). W rzeczywistości, 48 godzin po podaniu fMLP, występowała ponowna granulacja na poziomie, w którym pole powierzchni komórek kubkowych było podobne do tego w stanie kontrolnym. Odkrycia te sugerują, że
PL 200 940 B1 degranulacja komórek kubkowych prowadzi do ekspresji i aktywacji EGF-R, w ten sposób indukując ekspresję mucyny MUC5AC.
W celu sprawdzenia roli aktywacji kinazy tyrozynowej EGF-R w ponownej granulacji komórek kubkowych, traktowaliśmy wstępnie zwierzęta selektywnym inhibitorem kinazy tyrozynowej, BIBX1522. U zwierząt traktowanych wstępnie BIBX1522, fMLP nadal powodowała degranulację komórek kubkowych. Jednakże, wstępne traktowanie BIBX1522 zapobiegało ponownej granulacji komórek kubkowych i ekspresji w nich białka MUC5AC. Wyniki te wskazują na udział aktywacji EGF-R w ponownej syntezie mucyn po degranulacji komórek kubkowych. U wolnych od patogenów szczurów komórki kubkowe są „nieaktywne (tj. nie ulegają degranulacji), a ekspresja EGF-R jest obniżona. Gdy stan zapalny (np. stymulacja naciekania granulocytow obojętnochłonnych) powoduje degranulację komórek kubkowych i wydzielanie mucyn, zwiększenie ekspresji i aktywacja EGF-R prowadzi do ponownego zaopatrzenia nabłonka dróg oddechowych w mucyny. Niniejsze odkrycia sugerują, że selektywne inhibitory kinazy tyrozynowej mogą być użyteczne w zapobieganiu nadmiernego wydzielania w chorobach nosa.
Chociaż niniejszy wynalazek opisano w odniesieniu do jego specyficznych rozwiązań, powinno być zrozumiałe dla specjalistów w tej dziedzinie, że bez odchodzenia od ducha i zakresu wynalazku można dokonywać różnych zmian i tworzyć równoważniki. Ponadto, zgodnie z celami, duchem lub zakresem wynalazku można dokonywać modyfikacji w celu dostosowania do określonej sytuacji, materiału, interesującej kompozycji, sposobu, etapu lub etapów sposobu. Wszystkie takie modyfikacje w zamierzeniu pozostają w zakresie dołączonych tu zastrzeżeń.

Claims (12)

1. Zastosowanie antagonisty receptora naskórkowego czynnika wzrostowego (EGF-R) do wytwarzania leku do leczenia nadmiernego wydzielania śluzu w płucach u pacjenta cierpiącego na nadmierne wydzielanie śluzu w drogach oddechowych podawanego w terapeutycznie skutecznej ilości, przy czym wspomniany antagonista EGF-R jest inhibitorem kinazy specyficznym wobec EGF-R.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że antagonistę podaje się przez iniekcję.
3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że antagonistę podaje się dożylnie z nośnikiem w postaci zwykłego roztworu soli.
4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że antagonistę podaje się przez inhalację.
5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że antagonistę dostarcza się w liposomach.
6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że wspomniane liposomy są przestrzennie stabilizowane i podaje się je dożylnie.
7. Postać farmaceutyczna do leczenia nadmiernego wydzielania śluzu dróg oddechowych, znamienna tym, że zawiera:
terapeutycznie skuteczną ilość antagonisty receptora naskórkowego czynnika wzrostowego (EGF-R) stanowiącą dawkę wystarczającą do zmniejszenia nadmiernego wydzielania śluzu dróg oddechowych; przy czym wspomnianym antagonistą EGF-R jest inhibitor kinazy specyficzny wobec EGF-R oraz odpowiedni do dostarczania przez inhalacje czynnik płynny.
8. Postać farmaceutyczna według zastrz. 7, znamienna tym, że antagonista wobec EGF-R jest opracowywany z nośnikiem płynnym i propelentem.
9. Postać farmaceutyczna według zastrz. 7, znamienna tym, że antagonista wobec EGF-R jest sporządzany w roztworze wodnym lub etanolowym.
10. Postać farmaceutyczna według zastrz. 7, znamienna tym, że antagonista wobec EGF-R jest w postaci suchego proszku.
11. Postać farmaceutyczna według zastrz. 10, znamienna tym, że wspomniana postać jest przetwarzana w areozol.
12. Postać farmaceutyczna według zastrz. 7, znamienna tym, że dodatkowo zawiera czynnik wybrany z grupy obejmującej czynniki mukolityczne, środki wykrztuśne i leki rozszerzające oskrzela.
PL351765A 1998-08-18 1999-08-17 Zastosowanie antagonisty receptora naskórkowego czynnika wzrostowego (EGF-R) i postać farmaceutyczna do leczenia nadmiernego wydzielania śluzu dróg oddechowych PL200940B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US9702398P 1998-08-18 1998-08-18
PCT/US1999/018696 WO2000010588A2 (en) 1998-08-18 1999-08-17 Epidermal growth factor receptor antagonists for treating hypersecretion of mucus in the lungs

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL351765A1 PL351765A1 (en) 2003-06-16
PL200940B1 true PL200940B1 (pl) 2009-02-27

Family

ID=22260380

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL351765A PL200940B1 (pl) 1998-08-18 1999-08-17 Zastosowanie antagonisty receptora naskórkowego czynnika wzrostowego (EGF-R) i postać farmaceutyczna do leczenia nadmiernego wydzielania śluzu dróg oddechowych

Country Status (36)

Country Link
US (6) US6270747B1 (pl)
EP (2) EP1119349B1 (pl)
JP (2) JP2002539072A (pl)
KR (1) KR100609646B1 (pl)
CN (1) CN1184961C (pl)
AR (1) AR020220A1 (pl)
AT (1) ATE399541T1 (pl)
AU (1) AU760766B2 (pl)
BR (1) BR9912672A (pl)
CA (1) CA2337422C (pl)
CO (1) CO5130028A1 (pl)
CY (1) CY1110370T1 (pl)
CZ (1) CZ2001584A3 (pl)
DE (1) DE69939022D1 (pl)
DK (1) DK1119349T3 (pl)
EA (1) EA004316B1 (pl)
EE (1) EE200100097A (pl)
ES (1) ES2310047T3 (pl)
HK (1) HK1036219A1 (pl)
HR (1) HRP20010119B1 (pl)
HU (1) HUP0103894A3 (pl)
ID (1) ID27345A (pl)
IL (2) IL140855A0 (pl)
MY (1) MY126490A (pl)
NO (1) NO327000B1 (pl)
NZ (1) NZ509271A (pl)
PH (2) PH12010000215A1 (pl)
PL (1) PL200940B1 (pl)
PT (1) PT1119349E (pl)
RS (1) RS50273B (pl)
SI (1) SI1119349T1 (pl)
SK (1) SK287805B6 (pl)
TR (1) TR200100560T2 (pl)
TW (1) TWI250019B (pl)
UA (1) UA73722C2 (pl)
WO (1) WO2000010588A2 (pl)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7354894B2 (en) 1998-08-18 2008-04-08 The Regents Of The University Of California Preventing airway mucus production by administration of EGF-R antagonists
SK287805B6 (sk) 1998-08-18 2011-10-04 The Regents Of The University Of California Použitie antagonistu receptora epidermálneho rastového faktora (EGF-R) na výrobu lieku na liečenie nadmerného vylučovania hlienu v dýchacích cestách
US6846799B1 (en) 1998-08-18 2005-01-25 The Regents Of The University Of California Preventing airway mucus production by administration of EGF-R antagonists
US20030236300A1 (en) * 1999-10-27 2003-12-25 Yale University Conductance of improperly folded proteins through the secretory pathway and related methods for treating disease
US20030149113A1 (en) * 2001-10-12 2003-08-07 Caplan Michael J. Conductance of improperly folded proteins through the secretory pathway and related methods for treating disease
WO2002094318A1 (en) * 2001-05-18 2002-11-28 University Of Southern California Vector for targeted delivery to cells
US6818446B2 (en) 2001-11-21 2004-11-16 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for the analysis of mucin gene expression and identification of drugs having the ability to inhibit mucin gene expression
DE10204462A1 (de) * 2002-02-05 2003-08-07 Boehringer Ingelheim Pharma Verwendung von Tyrosinkinase-Inhibitoren zur Behandlung inflammatorischer Prozesse
US6924285B2 (en) * 2002-03-30 2005-08-02 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Bicyclic heterocyclic compounds, pharmaceutical compositions containing these compounds, their use and process for preparing them
JP2005529123A (ja) * 2002-04-24 2005-09-29 リサーチ　ディベロップメント　ファンデーション 核転写調節因子ＮＦ−κＢ抑制剤と抗腫瘍薬の相乗効果
AU2003253681B2 (en) * 2002-06-24 2008-05-01 Research Development Foundation Treatment of human multiple myeloma by Curcumin
US20060228355A1 (en) 2003-11-07 2006-10-12 Toon Laeremans Camelidae single domain antibodies vhh directed against epidermal growth factor receptor and uses therefor
EP1587482A4 (en) * 2003-01-31 2010-08-25 Technion Res & Dev Foundation ANTI-INFLAMMATORY COMPOSITIONS AND USES THEREOF
US7195899B1 (en) * 2003-03-14 2007-03-27 Florida State University Research Foundation, Inc. Cell-based biosensor for harmful airborne agents
US7462646B2 (en) 2003-08-26 2008-12-09 Research Development Foundation Osteoclastogenesis inhibitors and uses thereof
US20050181036A1 (en) * 2003-08-26 2005-08-18 Research Development Foundation Aerosol delivery of curcumin
US11324698B2 (en) 2003-08-28 2022-05-10 Vgsk Technologies, Inc. Sterically stabilized carrier for aerosol therapeutics, compositions and methods for treating the respiratory tract of a mammal
US8846079B1 (en) 2004-12-01 2014-09-30 Vgsk Technologies, Inc. Sterically stabilized carrier for aerosol therapeutics, compositions and methods for treating the respiratory tract of a mammal
US20060115523A1 (en) * 2004-12-01 2006-06-01 Konduri Kameswari S Sterically stabilized liposome and triamcinolone composition for treating the respiratory tract of a mammal
US20050096332A1 (en) * 2003-10-30 2005-05-05 Boehringer Ingelheim International Gmbh Use of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of inflammatory processes
US7968575B2 (en) * 2004-05-05 2011-06-28 Renopharm Ltd. Nitric oxide donors and uses thereof
US7498445B2 (en) * 2004-05-05 2009-03-03 Renopharm Ltd. Thiazole-based nitric oxide donors capable of releasing two or more nitric oxide molecules and uses thereof
WO2005105765A1 (en) * 2004-05-05 2005-11-10 Renopharm Ltd. Nitric oxide donors and uses thereof
US8134010B2 (en) * 2004-05-05 2012-03-13 Renopharm Ltd. Thiazole-based nitric oxide donors having aryl substituent(s) and uses thereof
US6998028B1 (en) * 2004-09-24 2006-02-14 Superpower, Inc. Methods for forming superconducting conductors
US7915223B2 (en) * 2004-09-27 2011-03-29 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antimicrobial agents
EP1793837A2 (en) * 2004-09-27 2007-06-13 Technion Research &amp; Development Foundation Limited Fatty acid modified polylysines as antimicrobial agents
JP4690158B2 (ja) * 2004-09-28 2011-06-01 スギ生物科学研究所株式会社 薬効評価用動物、薬効評価用動物の慢性閉塞性肺疾患発症方法及びその動物を用いた薬効評価方法
WO2006035706A1 (ja) * 2004-09-28 2006-04-06 Dainippon Ink And Chemicals, Inc. 薬効評価用動物、薬効評価用動物の慢性閉塞性肺疾患発症方法及びその動物を用いた薬効評価方法
JP2009511586A (ja) * 2005-10-11 2009-03-19 ワシントン・ユニバーシティ 気道分泌過多を治療するための組成物および方法
EP1921070A1 (de) * 2006-11-10 2008-05-14 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Bicyclische Heterocyclen, diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel, deren Verwendung und Verfahren zu ihrer Herstelllung
AU2008212999A1 (en) * 2007-02-06 2008-08-14 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bicyclic heterocycles, drugs containing said compounds, use thereof, and method for production thereof
US20080293740A1 (en) * 2007-04-03 2008-11-27 Parion Sciences, Inc. Method of treating acid-sensing ion channel mediated pain, cough suppression, and central nervous system disorders
EP2527008A3 (en) * 2007-04-30 2013-01-16 Technion Research & Development Foundation Ltd. Anticancerous polymeric agents
EP2152289A1 (en) * 2007-04-30 2010-02-17 Technion Research & Development Foundation Ltd. Novel antimicrobial agents
ES2392639T3 (es) 2008-02-07 2012-12-12 Boehringer Ingelheim International Gmbh Heterociclos espirocíclicos, medicamentos que contienen a estos compuestos, su uso y procedimiento para su preparación
WO2010015522A1 (de) * 2008-08-08 2010-02-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cyclohexyloxy-substituierte heterocyclen, diese verbindungen enthaltende arzneimittel, deren verwendung und verfahren zu ihrer herstellung
US8112365B2 (en) * 2008-12-19 2012-02-07 Foster Scott C System and method for online employment recruiting and evaluation
WO2010085665A2 (en) 2009-01-23 2010-07-29 Cedars-Sinai Medical Center Targeted delivery system
US8734859B1 (en) 2010-11-13 2014-05-27 Sirbal Ltd. Molecular combinations for cancer or other disease treatment
US9066974B1 (en) 2010-11-13 2015-06-30 Sirbal Ltd. Molecular and herbal combinations for treating psoriasis
US9095606B1 (en) 2010-11-13 2015-08-04 Sirbal Ltd. Molecular and herbal combinations for treating psoriasis
US8541382B2 (en) 2010-11-13 2013-09-24 Sirbal Ltd. Cardiac glycoside analogs in combination with emodin for cancer therapy
EP2665741B1 (en) * 2011-01-10 2019-03-06 Invion, Inc Use of beta-adrenergic inverse agonists for smoking cessation
MX366347B (es) 2012-08-03 2019-07-05 Cedars Sinai Medical Center Aislamiento de mutantes mejoradores del trafico de la proteina de administracion de farmaco.
WO2015082950A1 (en) 2013-12-02 2015-06-11 Sirbal Ltd. Herbal combinations for treatment of a skin condition
EP3328498B1 (en) 2015-07-29 2021-05-05 Sirbal Ltd. Medical kit comprising herbal combinations for treating psoriasis

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2932481A (en) * 1954-06-15 1960-04-12 Breer Bipod camera support
GB1242211A (en) * 1967-08-08 1971-08-11 Fisons Pharmaceuticals Ltd Pharmaceutical composition
FR2502627A1 (fr) * 1981-02-02 1982-10-01 Refarmed Sa Derives thioliques de l'erythromycine a activite therapeutique, procede de preparation et produits pharmaceutiques dans lesquels ils apparaissent
IT1173549B (it) * 1984-04-02 1987-06-24 Corvi Camillo Spa Estere dell'acido teofillin-7-acetico con il d,l-trans-sobrerolo avente attivita' mucosecretolitica-fluidificante e antibroncospastica, procedimento per la sua preparazione e sue composizioni farmaceutiche
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4904786A (en) * 1986-01-27 1990-02-27 American Home Products Corporation Quinoline compounds as antiallergic and antiinflammatory agents
US5089516A (en) * 1987-03-11 1992-02-18 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha 1-phenyl-3,5-pyrazolidinedione hydroxystyrene compounds which have tyrosine kinase inhibiting activity
US5217999A (en) 1987-12-24 1993-06-08 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Styryl compounds which inhibit EGF receptor protein tyrosine kinase
KR900701771A (ko) * 1988-09-28 1990-12-04 로버트 에이 아미테이지 리폭시게나아제 효소를 억제하는 1, 4-디히드로티오나프토퀴논 및 헤테로시클릭 협동 작용물
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
GB8904009D0 (en) 1989-02-22 1989-04-05 Celltech Ltd Vector
US5362755A (en) * 1990-01-05 1994-11-08 Sepracor, Inc. Method for treating asthma using optically pure (R)-albuterol
US5302606A (en) * 1990-04-16 1994-04-12 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Styryl-substituted pyridyl compounds which inhibit EGF receptor tyrosine kinase
US5165424A (en) 1990-08-09 1992-11-24 Silverman Harvey N Method and system for whitening teeth
US5404871A (en) 1991-03-05 1995-04-11 Aradigm Delivery of aerosol medications for inspiration
JP3854306B2 (ja) * 1991-03-06 2006-12-06 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング ヒト化及びキメラモノクローナル抗体
US5116616A (en) * 1991-04-29 1992-05-26 Bio-Technology General Corp. Use of intratracheal administration of SOD to protect humans from lung injury due to hyperoxia and hyperventilation
DE4117078A1 (de) * 1991-05-25 1992-11-26 Boehringer Ingelheim Kg Verfahren zur herstellung therapeutisch anwendbarer aerosole
KR100246082B1 (ko) 1991-07-02 2000-04-01 인헤일, 인코오포레이티드 에어로졸화된약제를전달하는방법및장치
PT100905A (pt) * 1991-09-30 1994-02-28 Eisai Co Ltd Compostos heterociclicos azotados biciclicos contendo aneis de benzeno, ciclo-hexano ou piridina e de pirimidina, piridina ou imidazol substituidos e composicoes farmaceuticas que os contem
DE4310051A1 (de) 1992-04-11 1993-10-14 Byk Gulden Lomberg Chem Fab Weitere Verwendung substituierter Pyridazine
US5785049A (en) 1994-09-21 1998-07-28 Inhale Therapeutic Systems Method and apparatus for dispersion of dry powder medicaments
AU4851393A (en) * 1992-09-11 1994-04-12 Regents Of The University Of Michigan, The Non-human animal with xenograft of on airway populated by human cells
IL108367A0 (en) * 1993-01-27 1994-04-12 Hektoen Inst For Medical Resea Antisense polynzcleotide inhibition of human growth factor-sensitive cancer cells
US5497763A (en) 1993-05-21 1996-03-12 Aradigm Corporation Disposable package for intrapulmonary delivery of aerosolized formulations
US5994341A (en) * 1993-07-19 1999-11-30 Angiogenesis Technologies, Inc. Anti-angiogenic Compositions and methods for the treatment of arthritis
GB9314893D0 (en) 1993-07-19 1993-09-01 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
GB9314884D0 (en) 1993-07-19 1993-09-01 Zeneca Ltd Tricyclic derivatives
AU7623194A (en) 1993-09-03 1995-03-22 Vpi Holdings Ltd. Oligonucleotides with rna cleavage activity
EP0719412B1 (en) * 1993-09-13 1998-11-04 Merck Frosst Canada Inc. Method for measuring metaplastic changes of mucus secreting epithelial cells
CA2261433A1 (en) * 1993-12-09 1995-06-10 Belinda Sanchez Ramirez Composition comprising autologous epidermal growth factor
EP0746614A1 (en) 1994-02-23 1996-12-11 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for inhibiting the expression of disease related genes
AU2096895A (en) 1994-03-07 1995-09-25 Sugen, Incorporated Receptor tyrosine kinase inhibitors for inhibiting cell proliferative disorders and compositions thereof
US20030114379A1 (en) * 1994-03-08 2003-06-19 Human Genome Sciences, Inc. Methods of treating or preventing cell, tissue, and organ damage using human myeloid progenitor inhibitory factor-1 (MPIF-1)
GB9510757D0 (en) * 1994-09-19 1995-07-19 Wellcome Found Therapeuticaly active compounds
ES2332984T3 (es) 1995-03-30 2010-02-16 Pfizer Products Inc. Derivados de quinazolinas.
EP0824525B1 (en) 1995-04-27 2001-06-13 AstraZeneca AB Quinazoline derivatives
GB9508565D0 (en) 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quiazoline derivative
GB9508538D0 (en) 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
US5747498A (en) * 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
GB9523675D0 (en) * 1995-11-20 1996-01-24 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
US5760041A (en) 1996-02-05 1998-06-02 American Cyanamid Company 4-aminoquinazoline EGFR Inhibitors
NZ332119A (en) 1996-04-12 2001-08-31 Warner Lambert Co Quinazoline compounds which are irreversible inhibitors of tyrosine kinases
US5990097A (en) * 1996-07-29 1999-11-23 Cavalier Pharmaceuticals Methods of treating asthma with o-desulfated heparin
SE9603725D0 (sv) 1996-10-11 1996-10-11 Astra Ab New teatment
UA73073C2 (uk) 1997-04-03 2005-06-15 Уайт Холдінгз Корпорейшн Заміщені 3-ціанохіноліни, спосіб їх одержання та фармацевтична композиція
ZA986732B (en) 1997-07-29 1999-02-02 Warner Lambert Co Irreversible inhibitiors of tyrosine kinases
ZA986729B (en) 1997-07-29 1999-02-02 Warner Lambert Co Irreversible inhibitors of tyrosine kinases
TW436485B (en) 1997-08-01 2001-05-28 American Cyanamid Co Substituted quinazoline derivatives
US6251912B1 (en) * 1997-08-01 2001-06-26 American Cyanamid Company Substituted quinazoline derivatives
AU1924699A (en) 1997-12-19 1999-07-12 Smithkline Beecham Corporation Compounds of heteroaryl substituted imidazole, their pharmaceutical compositionsand uses
AU756838B2 (en) * 1998-03-04 2003-01-23 Bristol-Myers Squibb Company Heterocyclo-substituted imidazopyrazine protein tyrosine kinase inhibitors
US5968748A (en) * 1998-03-26 1999-10-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of human HER-2 expression
SK287805B6 (sk) 1998-08-18 2011-10-04 The Regents Of The University Of California Použitie antagonistu receptora epidermálneho rastového faktora (EGF-R) na výrobu lieku na liečenie nadmerného vylučovania hlienu v dýchacích cestách
US6297258B1 (en) * 1998-09-29 2001-10-02 American Cyanamid Company Substituted 3-cyanoquinolines
US6288082B1 (en) * 1998-09-29 2001-09-11 American Cyanamid Company Substituted 3-cyanoquinolines
ID29800A (id) 1999-02-27 2001-10-11 Boehringer Ingelheim Pharma Turunan-turunan 4-amino-kinazolin dan kinolin yang mempunyai efek inhibitor pada transduksi signal yang dimediasi oleh tirosin kinase
BR0014843A (pt) * 1999-10-19 2002-06-11 Merck & Co Inc Composto, composição farmacêutica, métodos para tratar ou prevenir o câncer em um mamìfero, uma doença em que a angiogênese está implicada, a vascularização retinal, a retinipatia diabética, a degeneração macular relacionada com a idade, doença inflamatória, uma doença ou condição dependente de tirosina quinase e, patologias relacionadas com o osso, processo para fabricar uma composição farmacêutica, e, método para reduzir ou impedir o dano de tecido que segue um evento isquêmico
US6627634B2 (en) * 2000-04-08 2003-09-30 Boehringer Ingelheim Pharma Kg Bicyclic heterocycles, pharmaceutical compositions containing them, their use, and processes for preparing them
CA2403152C (en) 2000-04-08 2008-10-28 Boehringer Ingelheim Pharma Kg Bicyclic heterocycles, pharmaceutical compositions containing these compounds, their use and processes for preparing them

Also Published As

Publication number Publication date
NO327000B1 (no) 2009-03-30
CZ2001584A3 (cs) 2002-06-12
HUP0103894A3 (en) 2003-07-28
DK1119349T3 (da) 2008-10-13
US20010036919A1 (en) 2001-11-01
EA200100136A1 (ru) 2001-10-22
NO20010749D0 (no) 2001-02-14
US6270747B1 (en) 2001-08-07
EE200100097A (et) 2002-06-17
NZ509271A (en) 2003-10-31
TWI250019B (en) 2006-03-01
SK2162001A3 (en) 2002-08-06
AU760766B2 (en) 2003-05-22
YU13201A (sh) 2005-07-19
AU5676699A (en) 2000-03-14
US6551989B2 (en) 2003-04-22
JP2002539072A (ja) 2002-11-19
IL140855A0 (en) 2002-02-10
WO2000010588A2 (en) 2000-03-02
KR20010085412A (ko) 2001-09-07
MY126490A (en) 2006-10-31
ES2310047T3 (es) 2008-12-16
HRP20010119A2 (en) 2002-02-28
DE69939022D1 (de) 2008-08-14
HK1036219A1 (en) 2001-12-28
US6566324B2 (en) 2003-05-20
CN1354657A (zh) 2002-06-19
PT1119349E (pt) 2008-10-14
JP2009221212A (ja) 2009-10-01
NO20010749L (no) 2001-04-17
CN1184961C (zh) 2005-01-19
WO2000010588A9 (en) 2000-08-10
US20010041178A1 (en) 2001-11-15
EP1970058A1 (en) 2008-09-17
HRP20010119B1 (en) 2008-05-31
EA004316B1 (ru) 2004-02-26
KR100609646B1 (ko) 2006-08-04
US20030148990A1 (en) 2003-08-07
BR9912672A (pt) 2002-06-11
US20080175797A1 (en) 2008-07-24
ATE399541T1 (de) 2008-07-15
CY1110370T1 (el) 2015-04-29
EP1119349A2 (en) 2001-08-01
SK287805B6 (sk) 2011-10-04
CO5130028A1 (es) 2002-02-27
PL351765A1 (en) 2003-06-16
CA2337422A1 (en) 2000-03-02
US7358222B2 (en) 2008-04-15
CA2337422C (en) 2010-11-02
SI1119349T1 (sl) 2008-12-31
TR200100560T2 (tr) 2002-05-21
UA73722C2 (en) 2005-09-15
RS50273B (sr) 2009-07-15
HUP0103894A2 (hu) 2002-04-29
PH12010000216A1 (en) 2015-07-27
US8071074B2 (en) 2011-12-06
ID27345A (id) 2001-04-05
PH12010000215A1 (en) 2015-07-27
AR020220A1 (es) 2002-05-02
WO2000010588A3 (en) 2001-05-25
US8048844B1 (en) 2011-11-01
IL140855A (en) 2011-02-28
EP1119349B1 (en) 2008-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1119349B1 (en) Epidermal growth factor receptor antagonists for treating hypersecretion of mucus in the lungs
US7700547B2 (en) Preventing airway mucus production by administration of EGF-R antagonists
JP2010065053A (ja) Ｅｇｆ−ｒアンタゴニストの投与による気道粘液産生の防止方法
MXPA01001755A (en) Preventing airway mucus production by administration of egf-r antagonists
BG105158A (bg) Предотвратяване образуването на слузести покрития(мускус) върху летателни писти с прилагане на противодействащо средство egf-r

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20120817