ES2231880T3 - Procedimiento para tratar el asma con heparina o-desulfatada. - Google Patents

Abstract

PROCEDIMIENTO PARA REDUCIR LA RESPUESTA ASMATICA EN UN MAMIFERO. CONSISTE EN ADMINISTRAR UNA CANTIDAD DE HEPARINA O-DESULFATADA AL MAMIFERO QUE REDUCE LA RESPUESTA, CON LO QUE SE REDUCE LA RESPUESTA ASMATICA. LA CANTIDAD SE PUEDE ADMINISTRAR POR MEDIO DE UN AEROSOL. LA HEPARINA O-DESULFATADA POSEE UNA O-DESULFATACION AL MENOS EN LAS POSICIONES 2-O Y 3-O. SE MUESTRAN EN LA FIGURA LAS VIAS NEUROLOGICAS COLINERGICAS Y LOS SUBTIPOS DE RECEPTOR MUSCARINICO DE LOS MIEMBROS MOTORES SENSORES AFERENTES Y EFERENTES DE LA INERVACION DEL NERVIO VAGO DEL CONDUCTO AEREO PULMONAR.

Description

Procedimientos para tratar el asma con heparina O-desulfatada.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo del tratamiento y de la prevención de la respuesta asmática.

Antecedentes de la técnica

El asma es una enfermedad inflamatoria de las vías respiratorias pulmonares que hace que las vías respiratorias tiendan a estrecharse demasiado y muy fácilmente en respuesta a una amplia variedad de estímulos provocadores. En el pulmón, el principal sistema nervioso motor y sensitivo enervante está contenido en el nervio vago (Figura 1). La exposición de la vía respiratoria a agentes irritantes, tales como dióxido de azufre, prostaglandinas, histamina y aire frío, puede estimular a las fibras sensibles aferentes del nervio vago, desencadenando de ese modo la broncoconstricción, o el estrechamiento de las vías respiratorias, debido a la liberación refleja de acetilcolina por las ramas motoras eferentes colinérgicas del nervio vago. Aunque este reflejo está presente en personas normales, está enormemente exagerado en pacientes asmáticos. Este estrechamiento exagerado a menudo se denomina hiperreactividad de las vías respiratorias.

Se cree que la hiperreactividad de las vías respiratorias en pacientes asmáticos y en modelos de asma en animales surge de un aumento de la liberación del neurotransmisor endógeno acetilcolina a partir de los extremos del nervio vago motor eferente que enervan a la vía respiratoria (A.D. Fryer, et al., Journal of Clinical Investigation (1992) 90:2292-2298). En la vía respiratoria, la liberación de acetilcolina a partir de los nervios vagos está bajo el control local de autorreceptores muscarínicos inhibidores en los nervios postganglionares (Figura 1). Estos autorreceptores se denominan receptores muscarínicos M_{2}, mientras que los receptores muscarínicos en el músculo liso de las vías respiratorias son los receptores M_{3}. De este modo, la acetilcolina liberada a partir del nervio vago estimula tanto a los receptores muscarínicos M_{3} en el músculo liso de las vías respiratorias, provocando la broncoconstricción, como a los receptores muscarínicos M_{2} en los nervios, disminuyendo la liberación posterior de acetilcolina. En los asmáticos, los receptores muscarínicos M_{2} inhibidores funcionan mal, dando como resultado una liberación exagerada de acetilcolina y, por lo tanto, una broncoconstricción exagerada, o hiperreactividad de las vías respiratorias, en respuesta a un estímulo irritante dado de las vías respiratorias (A.D. Fryer, et al., Journal of Clinical Investigation (1992) 90:2292-2298; D.B. Jacoby, et al., Journal of Clinical Investigation (1993) 91:1314-1318).

El control de la autorregulación negativa de la liberación de acetilcolina proporcionado por el receptor muscarínico M_{2} se puede demostrar experimentalmente midiendo la broncoconstricción inducida por el nervio vago en presencia de agonistas o antagonistas muscarínicos selectivos. El bloqueo de receptores muscarínicos M_{2} neuronales con galamina potencia la broncoconstricción inducida por el nervio vago. Por el contrario, el antagonista selectivo del receptor muscarínico M_{2}, pilocarpina, inhibe la broncoconstricción refleja colinérgica inducida por agentes irritantes, en personas normales. Este mecanismo inhibidor no está presente en los asmáticos debido al mal funcionamiento de los receptores M_{2} (P.A. Minette, et al., Journal of Applied Physiology (1989) 67:2461-2465). Dicho defecto en los autorreceptores muscarínicos da como resultado reflejos colinérgicos exagerados en el asma, debido a que se pierde la inhibición de autorregulación normal de la liberación de acetilcolina.

Se cree que la disfunción del receptor M_{2}, y la hiperreactividad subsiguiente de las vías respiratorias en el asma, es debido al aumento de la susceptibilidad del receptor al daño por productos de la respuesta inflamatoria en la vía respiratoria. El asma da como resultado una entrada de células inflamatorias, especialmente eosinófilos, en la vía respiratoria. Los eosinófilos activados en asmáticos segregan un número de proteínas dañinas, incluyendo la principal proteína básica, la eosinofilperoxidasa, y la proteína catiónica eosinófila. Todas estas proteínas están fuertemente cargadas de forma positiva. Estas y otras proteínas cargadas positivamente pueden provocar la hiperrespuesta de las vías respiratorias (R.H. Gundel, et al., Journal of Clinical Investigation (1991) 87:1470-1473; A.J. Coyle, et al., American Review of Respiratory Diseases (1993) 147:896-900). Se ha demostrado que la principal proteína básica (D.B. Jacoby, et al., Journal of Clinical Investigation (1993) 91:1314-1318) y otras proteínas cargadas positivamente (J. Hu, et al., Molecular Pharmacology (1992) 42:311-324) funcionan como antagonistas del receptor muscarínico M_{2}. De este modo, la hiperreactividad de las vías respiratorias en el asma es una consecuencia del antagonismo directo de receptores inhibidores colinérgicos M_{2} por unos componentes de la inflamación de las vías respiratorias.

El tratamiento de la hiperreactividad de las vías respiratorias en el asma está dirigido actualmente contra la inhibición de la inflamación de las vías respiratorias, conduciendo a la liberación de productos que inhiban a los receptores M_{2}, o contra la inhibición directa de la broncoconstricción del músculo liso de las vías respiratorias. Los corticosteroides son el punto de apoyo de la terapia antiinflamatoria. Los agonistas beta-adrenérgicos, que actúan mediante la estimulación de receptores adrenérgicos beta_{2} sobre el músculo liso de las vías respiratorias, se usan como broncodilatadores para neutralizar directamente a las vías respiratorias constreñidas. Hay disponibles fármacos anticolinérgicos no selectivos, tales como atropina y bromuro de ipratropio, para su utilización como broncodilatadores, pero bloquean tanto a receptores M_{2} como a receptores M_{3} de la zona de preunión en el músculo liso con igual eficacia. Esto aumenta la liberación de acetilcolina, superando el bloqueo de la zona de postunión, y hace a estos agentes anticolinérgicos no selectivos ineficaces en la inhibición de la broncoconstricción mediada por el nervio vago. Un tratamiento más específico para inhibir el bloqueo de los receptores M_{2} sería de gran beneficio como tratamiento para la hiperreactividad de las vías respiratorias del asma.

Recientemente, se ha demostrado que el fármaco anticoagulante heparina inhibe la disfunción de receptores M_{2} inducida por antígenos en cobayas expuestas a antígenos (A.D. Fryer, et al., Journal of Clinical Investigation (1992) 90:2292-2298), e inhibe la unión del receptor M_{2} por la proteína básica principal in vitro (D.B. Jacoby, et al., Journal of Clinical Investigation (1993) 91:1314-1318). A lo largo de los años, se ha sugerido la heparina como un tratamiento para el asma (M.M. Hartman, California Medicine (1963) 98:27-32; D.A. Dolowitz, et al., Annals of Allergy (1965) 23:309-313; T. Ahmed, et al., American Review of Respiratory Diseases (1992) 145:566-570; T. Ahmed, et al., Journal of Applied Physiology (1993) 74:1492-1498; S. D. Bowler, et al., American Review of Respiratory Diseases (1993) 147:160-163; T. Ahmed, et al., New England Journal of Medicine; solicitud internacional PCT/US93/02880). Sin embargo, como tratamiento para la hiperreactividad de las vías respiratorias del asma, la heparina adolece de una gran desventaja: es un anticoagulante. Como tal, expondría al paciente tratado a un riesgo inaceptable de hemorragia, incluso si el tratamiento estuviera localizado por aplicación mediante aerosol de la heparina en la vía respiratoria pulmonar. La heparina en forma de aerosol se absorbe bien en la circulación sistémica, y la administración de heparina mediante aplicación en aerosol al pulmón se ha defendido como un procedimiento para anticoagular la sangre (L.B. Jaques, et al., Lancet (1976) ii:157-1161).

Para usar con seguridad la heparina como tratamiento para la hiperreactividad de las vías respiratorias del asma, sería necesario inactivarla primero como anticoagulante sin afectar a su eficacia para tratar el asma. Existen varios procedimientos químicos para inactivar a la heparina como anticoagulante. La mayoría se basan en técnicas de desulfatación química, puesto que es bien conocido que los grupos sulfato de la heparina son importantes para la actividad anticoagulante. Sin embargo, se ha dado a conocer previamente que la heparina N-desulfatada resulta ineficaz en la prevención de la broncoconstricción de tipo asmática a partir de un antígeno en forma de aerosol (T. Ahmed, et al., American Review of Respiratory Diseases (1992) 145:566-570, véase Figura 2). Adicionalmente, se ha dado a conocer previamente que la heparina N-desulfatada sólo es un 50% eficaz como heparina en la inhibición de complemento (J.M. Weiler et al., J. Immunol. (1992) 148:3210-3215; R.E. Edens et al. Complement Today (Cruse, J.M. y Lewis, R.E. Jr. eds): Complement Profiles (1993) 1:96-120).

La solicitud de patente internacional publicación nº WO 93/19734 describe la utilización de heparina comercial, de heparinas de bajo peso, o de fragmentos de heparina, y de heparinas parcialmente N-desulfatadas, para tratar el asma inducida por antígenos. Se describe la falta total de actividad anticoagulante de la heparina parcialmente N-desulfatada, lo que presenta un valor particular para el tratamiento del asma inducida por antígenos.

La patente US nº 5.380.716 describe derivados de hexasacáridos y octasacáridos muy sulfatados (fragmentos de heparina muy sulfatada) que presentan una mayor capacidad para inhibir la proliferación de células del músculo liso, y una menor capacidad para actuar como anticoagulante según se comparan con heparina comercial o fragmentos de heparina. También se describe que se requiere el 3-O-sulfato para antitrombina III y de este modo para la actividad anticoagulante.

De este modo, la bibliografía enseña que la desulfatación química no sería una estrategia eficaz en la modificación de la heparina para su utilización como un tratamiento eficaz para la hiperreactividad de las vías respiratorias de los asmáticos. Por el contrario a lo que se predice por la bibliografía, la presente invención describe que, sorprendentemente, la O-desulfatación selectiva de la heparina elimina la actividad anticoagulante de la heparina sin destruir la capacidad de la heparina para inhibir el bloqueo de los receptores muscarínicos M_{2} en el asma.

Desde hace tiempo, el asma se ha descrito en la bibliografía médica como una enfermedad episódica caracterizada por la obstrucción reversible de las vías respiratorias. Esto contrasta con la enfermedad obstructiva crónica de las vías respiratorias de la bronquitis crónica y del enfisema, en la que la obstrucción fisiológica de las vías respiratorias es permanente y lentamente progresiva. Sin embargo, la caracterización de la obstrucción de las vías respiratorias en el asma como episódica y reversible puede ser simple. Los neumólogos han comenzado recientemente a observar una población de personas asmáticas, habitualmente personas ancianas, que parece estar afectado por una enfermedad implacable, con una función pulmonar que nunca se normaliza entre episodios broncoespasmódicos agudos. Algunos de estos pacientes parece que progresan hacia una obstrucción fija de las vías respiratorias sin la presencia de otros factores de riesgo conocidos tales como tabaquismo activo o pasado. Esta población representa un reto clínico difícil por cuanto muchas de estas personas dependen de esteroides o incluso son relativamente resistentes a la intervención con esteroides y otras medicaciones antiinflamatorias o broncodilatadoras.

Una posible explicación para esta población difícil de tratar es que los pacientes con asma crónica sufren una reestructuración de sus vías respiratorias, con un aumento sustancial en la cantidad de músculo liso en las paredes de las vías respiratorias (Heard, B.E., y S. Hossain. 1973. Hyperplasia of bronchial muscle in asthma. J. Path. 110:319-331; James, A.L., P.D. Pare, y J.C. Hogg. 1989. The mechanics of airway narrowing in asthma. Am. Rev. Respir. Dis. 139:424-246; Saetta, M., A. DiStefano, C. Rosina, G. Thiene, y L.M. Fabbri. 1991. Quantitative structural analysis of peripheral airways and arteries in sudden fatal asthma. Am. Rev. Respir. Dis. 143:138-143; Ollerenshaw, S.L., y A.J. Woolcock. 1992. Characteristics of the inflammation in biopsies from large airways of subjects with asthma and subjects with chronic airflow limitation. Am. Rev. Respir. Dis. 145:922-927). Los pacientes que mueren de asma presentan más del doble de la cantidad de músculo liso de las vías respiratorias que los pacientes no asmáticos (Saetta, M., A. DiStefano, C. Rosina, G. Thiene, y L.M. Fabbri. 1991. Quantitative structural analysis of peripheral airways and arteries in sudden fatal asthma. Am. Rev. Respir. Dis. 143:138-143), y se observa una hipertrofia del músculo liso de las vías respiratorias en ratas Brown-Norway sensibilizadas (Sapienza, S., T. Du, D.H. Eidelman, N.S. Wang, y J.G. Martin. 1991. Structural changes in the airways of sensitized Brown Norway rats after antigen challenge. Am. Rev. Respir. Dis. 144:432-427; Wang, C.G., T. Du, L.J. Xu, y J.G. Martin. 1993. Role of leukotriene D_{4} in allergen-induced increases in airway smooth muscle in the rat. Am. Rev. Respir. Dis. 148:413-417) y en gatos (Padrid, P., S. Snook, T. Finucane, P. Shiue, P. Cozzi, J. Solway, y A.R. Leff. 1995. Persistent airway hyperresponsiveness and histologic alterations after chronic antigen challenge in cats. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 151:194-193) tras la exposición a antígenos. Es de esperar que el aumento del músculo liso de las vías respiratorias modifique el equilibrio de fuerzas que tienden a dilatar o cerrar la luz de las vías respiratorias, alterando de ese modo la localización del punto de igual presión, cuando el aire es incapaz de circular (Pride, N.B., S. Permutt, R.L. Riley, y B. Bromberger-Barnea. 1967. Determinants of maximal expiratory flow from the lungs. J. Appl. Physiol. 23:646-662). El engrosamiento de la pared de las vías respiratorias también se ha propuesto como una explicación parcial para los cambios exagerados en el calibre de las vías respiratorias cuando el músculo liso de las vías respiratorias se acorta (James, A.L., P.D. Pare, y J.C. Hogg. 1989. The mechanics of airway narrowing in asthma. Am. Rev. Respir. Dis. 139:242-246). Incluso los cambios pequeños en el espesor de la pared de las vías respiratorias, que tienen muy poco efecto sobre la resistencia de la línea base a la circulación del aire, pueden producir un aumento en la sensibilidad máxima de las vías respiratorias a los agonistas, similar a lo observado en asmáticos (Moreno, R.H., J.C. Hogg, y P.D. Pare. 1985. Mechanisms of airway narrowing. Am. Rev. Respir. Dis. 133:1171-1180).

Los estímulos precisos para la hipertrofia del músculo liso de las vías respiratorias en el asma no están claros, pero se han demostrado varios posibles mitógenos para el músculo liso de las vías respiratorias, incluyendo endotelina, histamina, la enzima de mastocitos triptasa, y los leucotrienos (Wang, C.G., T. Du, L.J. Xu, y J.G. Martin. 1993. Role of leukotriene D_{4} in allergen-induced increases in airway smooth muscle in the rat. Am. Rev. Respir. Dis. 148:413-417; Vitori, E.N., M. Marini, A. Fasoli, R. De Franchia, y S. Mattoli. 1992. Increased expression of endothelin in bronchial epithelial cells of asthmatic patients and effect of corticosteroids. Am. Rev. Respir. Dis. 146:1320-1325; Noveral, J.P., S.M. Rosenberg, R.A. Anbar, N.A. Pawlowski, y M.M Grunstein. 1992. Role of endothelin-1 in regulating proliferation of cultured rabbit airway smooth muscle cells. Am. J. Physiol. 263 (Lung Cell. Mol. Physiol. 7):L317-L324; Glassberg, M.K.; A. Ergul, A. Wanner, y D. Puett. 1994. Endothelin-1 promotes mitogenesis in airway smooth muscle cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 316-321; Panettieri, R.A., P.A. Yadvish, A.M. Kelly, N.A Rubinstein, y M.I. Kotlikoff. 1990. Histamine stimulates proliferation of airway smooth muscle and induces c-fos expression. Am. J. Physiol. 259 (Lung Cell. Mol. Physiol. 3): L365-L371; Ruoss, S.J., T. Hartmann, y G. Caughey. 1992. Mast cell tryptase is a mitogen for cultured fibroblasts. J. Clin. Invest. 88:493-499). El policatión protamina es mitógeno para el músculo liso vascular cultivado (Edelman, E. R., L.A Pukac, y M.J. Karnovsky. 1993. Protamine and protamine-insulins exacerbate the vascular response to injury. J. Clin. Invest. 91:2308-2313). Por lo tanto, también es posible que los policationes cargados positivamente, derivados de eosinófilos, tales como la proteína básica principal, puedan estimular la proliferación de músculo liso de las vías respiratorias.

Tampoco está claro cómo se puede prevenir la reestructuración del músculo liso de las vías respiratorias en el asma. El broncodilatador salbutamol inhibe la proliferación de músculo liso de las vías respiratorias cultivado de seres humanos en respuesta a la trombina y al factor de crecimiento epidérmico (Tomlinson, P.R., J.W. Wilson, y A.G. Stewart. 1994. Inhibition by salbutamol of the proliferation of human airway smooth muscle cells grown in culture. Br. J. Pharmacol. 111:641-647). Sin embargo, en general, al evitar la desgranulación de los mastocitos, los broncodilatadores agonistas beta-adrenérgicos pueden privar a la vía respiratoria de los efectos antiproliferativos de la liberación de heparina por los mastocitos, exacerbando de ese modo la reestructuración del músculo liso (Page, C. P. 1991. One explanation of the asthma paradox: inhibition of natural anti-inflammatory mechanism by B_{2}-agonists. Lancet 337:717-720). En la rata Brown Norway, sensibilizada con ovoalbúmina, expuesta crónicamente a antígenos, el antagonista MK-571 del leucotrieno D_{4} reduce la proliferación del músculo liso de las vías respiratorias pequeñas, pero sólo fue parcialmente eficaz evitando la reestructuración de las vías respiratorias más grandes (Wang, C.G., T. Du, L.J. Xu, y J.G. Martin. 1993. Role of leukotriene D_{4} in allergen-induced increases in airway smooth muscle in the rat. Am. Rev. Respir. Dis. 148:413-417). Debido a que es probable que más de un mitógeno promueva la proliferación del músculo liso en pacientes asmáticos, no es sorprendente que el bloqueo específico de un mediador fracase en evitar el proceso de reestructuración. Para la terapia, es necesario un tratamiento que intervenga en un punto de control más focal en los sucesos reguladores del crecimiento.

Se ha propuesto que la heparina de mastocitos modula normalmente el crecimiento y la proliferación del músculo liso de las vías respiratorias (Page, C.P., 1991. One explanation of the asthma paradox: inhibition of natural anti-inflammatory mechanism by B_{2}-agonists. Lancet 337:717-720). Se ha demostrado que el polisacárido sulfatado estrechamente relacionado, el sulfato de heparano, inhibe la proliferación del músculo liso de la tráquea canina cultivado (Panettieri, R.A., P.A Yadvish, A.M. Kelly, N.A Rubinstein, y M.I. Kotlikoff. 1990. Histamine stimulates proliferation of airway smooth muscle and induces c-fos expression. Am. J. Physiol. 259 (Lung Cell. Mol. Physiol. 3):L365-L371). La heparina es un potente inhibidor de la proliferación del músculo liso vascular in vitro (Hoover, R.L., R. Rosenberg, W. Haering, y M.J. Karnovsky. 1980. Inhibition of rat arterial smooth muscle cell proliferation by heparin. Cir. Res. 47:578-583) e in vivo (Guyton, J.R., R.D. Rosenberg, A.W. Clowes, y Karnovsky. 1980. Inhibition of rat arterial smooth muscle cell proliferation by heparin. In vivo studies with anticoagulant and nonanticoagulant heparin. Cir. Res. 46:625-634; Clowes, A.W., y M.M Clowes. 1985. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury. II. Inhibition of smooth muscle growth by heparin. Lab. Invest. 42:611-616; Clowes, A. W., y M.M. Clowes. 1986. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury. IV. Heparin inhibits rat smooth muscle mitogenesis and migration. Circ. Res. 58:839-845).

Recientemente, Kilfeather et al. han demostrado que la heparina y la heparina de bajo peso molecular son inhibidores potentes de la proliferación, inducida por suero, de las células del músculo liso de la tráquea bovina en cultivo (Kilfeather, S.A., S. Tagoe, A.C. Perez, K. Okona-Mensa, R. Matin, y C.P. Page. 1995. Inhibition of serum-induced proliferation of bovine tracheal smooth muscle cells in culture by heparin and related glycosaminoglycans. Brit. J. Pharmacol. 114:1442-1446). Al discutir las implicaciones de la estructura y actividad de sus hallazgos, Kilfeather y colaboradores sugieren que se requiere la O-sulfatación para la actividad antiproliferativa en células del músculo liso de las vías respiratorias. Antes, Wright et al. han demostrado que al aumentar la carga de fragmentos de tetrasacáridos inactivos por O-sobresulfatación esto los hizo antiproliferativos frente al músculo liso vascular, mientras que la reducción de la carga de fragmentos más grandes activos provocó que perdieran su actividad antiproliferativa (Wright, T.C., Jr., J.J. Castello, Jr., M. Petitou, J.-C. Lormeau, J. Choay, y M.J. Karnovsky. 1989. Structural determinants of heparin's growth inhibitory activity. Interdependence of oligosaccharide size and charge. J. Biol. Chem. 264:1534-1542). Castellot et al. han sugerido un requisito absoluto de la 3-O-sulfatación como un requisito estructural necesario para que la heparina inhiba la proliferación del músculo liso vascular (Castellot, J.J., Jr., J. Choay, J.-C. Lormeau, M. Petitou, E. Sache, y M.J. Karnovsky. 1986. Structural determinants of the capacity of heparin to inhibit the proliferation of vascular smooth muscle cells. II. Evidence for a pentasaccharide sequence that contains a 3-O-sulfate group. J. Cell Biol. 102:1979-1984). Maccarana et al. dio a conocer la importancia de los 2-O-sulfatos para la unión a heparina del factor de crecimiento fibroblástico básico de mitógenos (Maccarana, M., B. Casu, y U. Lindahl. 1993. Minimal sequence in heparin/heparan sulfate required for binding of basic fibroblast growth factor. J. Biol. Chem. 268:23898-23905).

Por el contrario, la presente invención proporciona el descubrimiento sorprendente de que una heparina 2-O, 3-O-desulfatada selectivamente, producida mediante liofilización alcalina, es un inhibidor potente de la proliferación del músculo liso de las vías respiratorias estimulada por el suero fetal de ternera.

Se ha dado a conocer la obtención de la heparina 2-O-desulfatada (R. Rej et al., Thrombosis and Hemostasis (1989) 61:540; y M. Jaseja et al., Canadian Journal of Chemistry (1989) 67:1449-1456). Realmente, dichos autores no reconocieron que el compuesto que obtuvieron fue, de hecho, heparina 2-O así como 3-O-desulfatada. Brevemente, el procedimiento de Rej et al. y Jaseja et al. comprende partir de una disolución de heparina de pH ajustado con hidróxido sódico 0,1 N, que entonces se liofiliza para producir un resto de ácido alfa-L-idurónico 2-O-desulfatado (y un resto de glucosamina 3-O-desulfatado). Se estudió la actividad anticoagulante de la heparina; sin embargo, no hubo ninguna sugerencia de la inhibición de la reactividad de las vías respiratorias o del tratamiento de enfermedades asmáticas. Igualmente, Rej et al. y Jaseja et al. no describieron ninguna actividad para la heparina 2-O, 3-O-desulfatada, y además no describieron ninguna dosis eficaz para el compuesto para ningún fin.

Sumario de la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar la utilización de heparina O-desulfatada, que presenta una O-desulfatación en por lo menos las posiciones 2-O y 3-O, en la preparación de un medicamento para reducir o inhibir la hiperreactividad de las vías respiratorias de la respuesta asmática en mamíferos. Un objetivo de la invención es proporcionar la utilización de heparina O-desulfatada en la preparación de un medicamento para aumentar la actividad del receptor muscarínico M_{2} en un mamífero asmático. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar la utilización de heparina O-desulfatada en la preparación de un medicamento para reducir o prevenir la broncoconstricción en un mamífero. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar la utilización de heparina O-desulfatada en la preparación de un medicamento para inhibir la hemolisis, mediada por el complemento, en un mamífero. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar la utilización de heparina O-desulfatada, que tiene una O-desulfatación en por lo menos las posiciones 2-O y 3-O en la preparación de un medicamento para reducir o inhibir la proliferación del músculo liso de las vías respiratorias en un mamífero. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar dichas utilizaciones que no induzcan sustancialmente la actividad anticoagulante.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un dibujo esquemático de las rutas neurales colinérgicas y de los subtipos de receptores muscarínicos de las ramas sensoriales aferentes y motora eferente de la enervación del nervio vago de las vías respiratorias pulmonares. Las abreviaturas son las siguientes: Ach, acetilcolina; N, receptor nicotínico, M_{1}, receptor muscarínico M_{1}, M_{2}, receptor muscarínico M_{2}, M_{3}, receptor muscarínico M_{3}; las flechas indican neurotransmisión.

La Figura 2 muestra una fórmula química de la secuencia de unión del pentasacárido de la heparina de origen natural.

La Figura 3 muestra una gráfica de la inhibición de la broncoconstricción inducida por el nervio vago mediante la heparina y la heparina O-desulfatada en cobayas asmáticos sensibilizados expuestos a ovoalbúmina. Las columnas en blanco muestran broncoconstricción del nervio vago en ausencia de tratamiento. Las columnas en negro muestran el efecto del tratamiento con disolución salina, con heparina completamente anticoagulante (2.000 U/kg) o con heparina O-desulfatada (91,2 mg/kg) sobre la broncoconstricción inducida por el nervio vago. Los datos son la media con el error estándar de la media que se muestra mediante barras verticales, n = 5 para disolución salina, 4 para heparina, y 5 para heparina O-desulfatada.*P < 0,05, usando la prueba de la t de Student pareada.

La Figura 4 muestra la inhibición de la broncoconstricción inducida por el nervio vago mediante heparina O-desulfatada en cobayas sensibilizados expuestos a ovoalbúmina.

La Figura 5 muestra una gráfica del efecto de la heparina y de la heparina O-desulfatada sobre la respuesta a pilocarpina en cobayas expuestos a antígenos. Los resultados se expresan como la relación de la broncoconstricción inducida por el nervio vago después de la pilocarpina a la broncoconstricción inducida por el nervio vago antes de la pilocarpina. Cada punto es la media de 4 a 6 animales con el error estándar de la media mostrado mediante barras verticales. La pilocarpina (1-100 \mug/kg iv) inhibió significativamente la broncoconstricción inducida por el nervio vago en cobayas de control (cuadrados en blanco, P = 0,01). Tras la exposición a los antígenos, se suprimió el efecto de la pilocarpina sobre la broncoconstricción inducida por nervio vago (triángulos en blanco). El efecto de la pilocarpina sobre la broncoconstricción inducida por el nervio vago se restauró de manera dependiente de la dosis mediante la administración de heparina O-desulfatada (11,4 mg/kg, triángulos en negro; 22,8 mg/kg, círculos en negro; 57,0 mg/kg, diamantes en negro; 91,2 mg/kg, cuadrados en negro). * Significativamente diferente al control; + significativamente diferente del expuesto a antígenos (triángulos en blanco), usando análisis de varianza de dos vías para medidas repetidas.

La Figura 6 muestra una gráfica del efecto del suero sobre la proliferación de las células del músculo liso de las vías respiratorias. Las células se expusieron a suero, se realizaron recuentos celulares a intervalos de 24 horas, y los resultados se expresan como recuento de células en cada una de las cuatro concentraciones de suero en cada intervalo de 24 horas. Las concentraciones de suero fueron las siguientes: (A) 0,25% de FBS; (B) 2,5% de FBS; (C) 5,0% de FBS; y (D) 10,0% de FBS. Cada punto representa la media más el error estándar de recuentos celulares en por lo menos 5 pocillos.

La Figura 7 muestra una gráfica de barras del efecto de la heparina y de la heparina O-desulfatada sobre las células del músculo liso de las vías respiratorias. Las barras en blanco indican heparina, y las barras rayadas indican heparina O-desulfatada. Las concentraciones añadidas a las células son las siguientes: (1) 0 \mug/ml, (2) 2,0 \mug/ml, (3) 20 \mug/ml, (4) 200 \mug/ml. Los recuentos de células se realizaron después de 64 horas de incubación con el compuesto indicado. Cada barra representa la media más el error estándar en células en por lo menos 5 pocillos.

La Figura 8 muestra el espectro del material de partida sin modificar de heparina bovina.

La Figura 9 muestra el espectro de heparina bovina O-desulfatada de la invención.

La Figura 10 muestra el espectro del material de partida sin modificar de heparina porcina.

La Figura 11 muestra el espectro de heparina porcina O-desulfatada de la invención.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se puede comprender más fácilmente haciendo referencia a la siguiente descripción detallada de realizaciones específicas y de los Ejemplos y Figuras incluidos en ellas.

Como se usa en las reivindicaciones, "un" puede significar uno o más, dependiendo del contexto en el que se use.

La presente invención proporciona la utilización de heparina O-desulfatada, que tiene una O-desulfatación en por lo menos las posiciones 2-O y 3-O, en la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de reacciones asmáticas. Estas reacciones se pueden tratar y prevenir en pacientes que padecen asma intrínseca, es decir que tienen una inflamación crónica, de bajo nivel, en las vías respiratorias, que adicionalmente puede estallar en hiperreactividad de las vías respiratorias en respuesta a un agente irritante. Estas reacciones se pueden tratar y prevenir en pacientes que padecen asma extrínseca, es decir que tienen una inflamación crónica en las vías respiratorias, que responden posteriormente mediante hiperreactividad de las vías respiratorias a la exposición a un antígeno. Por "hiperreactividad de las vías respiratorias" o "hipersensibilidad de las vías respiratorias", como se usa en la presente memoria, se quiere decir una respuesta hiperaguda en las vías respiratorias que está por encima de la respuesta normal, no asmática, de la persona a cualquier estímulo, es decir, a un agente irritante o a un antígeno. Esta respuesta puede incluir el aumento de liberación de acetilcolina, la entrada de células inflamatorias, tales como eosinófilos, y la liberación concomitante de proteínas cargadas positivamente (incluyendo la proteína básica principal, eosinofilperoxidasa y la proteína catiónica eosinófila), la inflamación de las vías respiratorias, y la broncoconstricción.

La presente invención proporciona la utilización de heparina O-desulfatada, que tiene una O-desulfatación en por lo menos las posiciones 2-O y 3-O, en la preparación de un medicamento para reducir la respuesta asmática en un mamífero. Por "respuesta asmática" se incluye cualquier respuesta fisiológica en la vía respiratoria asociada con el asma, tal como la hiperreactividad de las vías respiratorias, broncoconstricción, desensibilización del receptor muscarínico M_{2}, y la proliferación de células del músculo liso de las vías respiratorias.

Específicamente, la presente invención proporciona la utilización de heparina O-desulfatada, que presenta una O-desulfatación en por lo menos las posiciones 2-O y 3-O, en la preparación de un medicamento para reducir la hiperreactividad de las vías respiratorias de una respuesta asmática en un mamífero.

La presente invención proporciona además la utilización de heparina O-desulfatada, que presenta una O-desulfatación en por lo menos las posiciones 2-O y 3-O, en la preparación de un medicamento para aumentar la actividad de un receptor muscarínico M_{2} desensibilizado en un mamífero asmático.

La presente invención proporciona adicionalmente la utilización de heparina O-desulfatada, que presenta una O-desulfatación en por lo menos las posiciones 2-O y 3-O, en la preparación de un medicamento para reducir la broncoconstricción en un mamífero.

La presente invención proporciona además la utilización de heparina O-desulfatada, que presenta una O-desulfatación en por lo menos las posiciones 2-O y 3-O, en la preparación de un medicamento para reducir la proliferación de las células del músculo liso de las vías respiratorias en un mamífero.

La presente invención proporciona además la utilización de heparina O-desulfatada, que presenta una O-desulfatación en por lo menos las posiciones 2-O y 3-O, en la preparación de un medicamento para inhibir la hemolisis mediada por el complemento en un mamífero. La inhibición de la hemolisis mediada por el complemento puede comprender reducir la hemolisis mediada por el complemento con relación a la hemolisis mediada por el complemento en ausencia de un inhibidor de la hemolisis mediada por el complemento.

Por "heparina O-desulfatada" se quiere decir que la heparina está O-desulfatada suficientemente para que dé como resultado cualquier reducción de la actividad anticoagulante de la heparina. La heparina O-desulfatada incluye heparina preparada mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo I para que esté por lo menos parcialmente, y preferentemente de forma sustancial, desulfatada en por lo menos la posición 2-O y en la posición 3-O. Preferentemente, la heparina O-desulfatada es por lo menos aproximadamente 10%, más preferentemente por lo menos aproximadamente 25%, más preferentemente por lo menos 40% aproximadamente, más preferentemente por lo menos aproximadamente 50%, más preferentemente por lo menos aproximadamente 60%, más preferentemente por lo menos aproximadamente 75%, más preferentemente por lo menos aproximadamente 80%, más preferentemente por lo menos aproximadamente 90%, más preferentemente por lo menos aproximadamente 95%, más preferentemente por lo menos aproximadamente 97% y más preferentemente por lo menos aproximadamente 98%, o 100% desulfatada, independientemente, en cada una de la posición 2-O y la posición 3-O, según se determina mediante análisis de disacáridos. El grado de la desulfatación no necesita ser el mismo en cada posición O. El grado de O-desulfatación se puede determinar por procedimientos conocidos tales como análisis de disacáridos. La desulfatación en la posición 6-O no se puede determinar mediante las técnicas disponibles actualmente. En una realización preferida, la posición 6-O está sustancialmente sulfatada aunque no se puede determinar si algunos, particularmente una cantidad minoritaria, de los sulfatos se perdieron (se desulfataron) durante la preparación de los compuestos usados en la presente invención. No es de esperar que ocurra la desulfatación en la posición N en un grado apreciable bajo las condiciones descritas. En los ejemplos se explica un procedimiento para preparar heparina O-desulfatada. La heparina O-desulfatada es eficaz reduciendo el bloqueo del receptor muscarínico M_{2} que contribuye a la reactividad exagerada de las vías respiratorias del asma, pero no tiene las propiedades anticoagulantes de la heparina no tratada. La administración de heparina O-desulfatada también incluye que la heparina O-desulfatada está en un estado farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, que es suficientemente neutra en pH para ser administrada, como es conocido en la técnica. El experto en la materia sabrá cómo ajustar el pH para que esté en un intervalo aceptable, y conocerá un intervalo farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, el pH está comprendida entre aproximadamente 6 y aproximadamente 7 para una preparación en aerosol, y entre aproximadamente 7 hasta aproximadamente 7,5 para que la administración intravenosa se considere aceptable. Para neutralizar un pH alcalino, típicamente la disolución se ultrafiltra con grandes volúmenes de agua, el pH se lleva hasta pH neutro con cualquier ácido seleccionado, tal como ácido clorhídrico, y entonces la disolución se seca, se liofiliza o se destila a vacío.

La "heparina O-desulfatada" puede incluir heparina O-desulfatada que tiene modificaciones, tal como un peso molecular reducido, o una acetilación, desacetilación, una oxidación y una descarboxilación, en tanto retenga su capacidad para restaurar la función anormal del receptor M_{2} y para inhibir la reactividad exagerada de las vías respiratorias del asma. La heparina O-desulfatada modificada se puede evaluar fácilmente para estas actividades utilizando procedimientos conocidos, dadas las enseñanzas de este documento. Dichas modificaciones se pueden realizar antes o después de la desulfatación parcial, y los procedimientos para la modificación son estándares en la técnica. Se han desarrollado varias modificaciones de bajo peso molecular de la heparina (véase la página 581, Tabla 27.1, Heparin, Lane & Lindall). El peso molecular puede oscilar típicamente entre aproximadamente 2500 y aproximadamente 8100, y también se puede utilizar heparina O-desulfatada que presenta un peso molecular reducido que retiene la función reductora de la respuesta del asma. Las heparinas de bajo peso molecular también se pueden obtener enzimáticamente utilizando enzimas de heparinasa para romper a la heparina en fragmentos más pequeños. Dicha heparina O-desulfatada de peso molecular reducido puede presentar típicamente un peso molecular comprendido entre aproximadamente 1000 y aproximadamente 8000.

Por ejemplo, la oxidación con peryodato (patente U.S. 5.250.519, Conrad y Yuchuan) es un procedimiento de oxidación conocido que produce una heparina oxidada que tiene actividad anticoagulante reducida. Se pueden usar otros procedimientos de oxidación, también bien conocidos en la técnica. Adicionalmente, por ejemplo, también se sabe que la descarboxilación de la heparina disminuye la actividad anticoagulante, y tales procedimientos son estándares en la técnica. Además, es conocido en la técnica que las heparinas de bajo peso molecular presentan una actividad anticoagulante reducida, y que se producen mediante técnicas estándares. De este modo, la heparina O-desulfatada modificada, contemplada para su utilización en la presente invención, puede incluir, por ejemplo, heparina O-desulfatada oxidada con peryodato, heparina O-desulfatada descarboxilada, heparina O-desulfatada acetilada, heparina O-desulfatada desacetilada, heparina O-desulfatada desacetilada y oxidada, y heparina O-desulfatada de bajo peso molecular. Muchas otras modificaciones serán manifiestas para los expertos en la materia, dadas las enseñanzas proporcionadas en este documento.

Por "reducir" o "aumentar" una respuesta o actividad se quiere decir que la respuesta o actividad se reduce o se aumenta con relación al nivel de respuesta en el paciente antes de la administración de la heparina O-desulfatada. Típicamente, dicha reducción o aumento se puede averiguar fácilmente por el paciente al experimentar una reducción en los síntomas de la respuesta asmática, por ejemplo, alivio en la respiración. "Reducir" o "aumentar" una respuesta o actividad también significa reducir o aumentar una respuesta con relación a un nivel típico de respuesta para ese paciente en ausencia de tratamiento. Adicionalmente, el aumento o la reducción se puede determinar fácilmente según las enseñanzas de este documento y según procedimientos estándares en la técnica midiendo un parámetro pertinente antes de la administración, y después midiéndolo nuevamente después de la administración. Adicionalmente, las dosis estándares se pueden determinar inicialmente, incluso para un paciente particular, y después se pueden administrar rutinariamente durante un tratamiento normal.

Una cantidad de heparina O-desulfatada, reductora de la respuesta asmática, es una cantidad que provoca una reducción en cualquiera de las respuestas de un episodio asmático, tal como hiperreactividad de las vías respiratorias, broncoconstricción, y proliferación de células del músculo liso de las vías respiratorias. Una "cantidad reductora de la hiperreactividad de las vías respiratorias" es una cantidad que provoca una reducción en cualquiera de las manifestaciones de la hiperreactividad de las vías respiratorias, tal como una cantidad que provoca un aumento en la actividad defectuosa del receptor M_{2} en asmáticos, una cantidad que reduce la inflamación, y/o una cantidad que disminuye la broncoconstricción. Una "cantidad que aumenta la actividad" del receptor muscarínico M_{2} desensibilizado es una cantidad que provoca un aumento en la actividad de un receptor muscarínico M_{2} desensibilizado, en un asmático. Una "cantidad reductora de la broncoconstricción" es una cantidad que reduce la respuesta de la broncoconstricción en un asmático. Una "cantidad reductora de la proliferación de células del músculo liso de las vías respiratorias" es una cantidad que reduce la proliferación de células del músculo liso de las vías respiratorias, en una respuesta asmática. Una "cantidad inhibidora de la hemolisis mediada por el complemento" es una cantidad que reduce o inhibe en un paciente la hemolisis mediada por el complemento, particularmente en un paciente asmático. Cualquier dosis eficaz es una cantidad suficiente para unirse a, y de este modo neutralizar, la carga positiva en las proteínas cargadas positivamente liberadas en las vías respiratorias, en la hiperreactividad de las vías respiratorias. Una cantidad eficaz puede variar para la persona específica, y se puede adaptar según la gravedad de la reacción. Por ejemplo, se puede administrar una dosis más elevada para una reacción más grave, y una dosis más reducida para una reacción menos grave. Adicionalmente, la administración se puede repetir, con la misma o con una dosis ajustada, si no se obtiene un alivio suficiente a partir de la dosis inicial. De este modo, inicialmente se puede administrar una dosis conservadora, y, si no se obtiene un alivio, se puede administrar otra dosis u otras dosis, según sean necesarias para el alivio.

Por ejemplo, una dosis eficaz puede ser una dosis superior a aproximadamente 1 mg/kg, y preferentemente superior a aproximadamente 5 mg/kg, más preferentemente superior a aproximadamente 10 mg/kg, y adicionalmente la dosis eficaz es preferentemente inferior a aproximadamente 100 mg/kg, y preferentemente inferior a aproximadamente 70 mg/kg. Un intervalo de dosis preferida puede estar comprendido entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 70 mg/kg. Otro intervalo de dosis preferido puede estar comprendido entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 500 mg. De este modo, una dosis mínima típica puede comprender aproximadamente 50 mg, y una dosis máxima típica puede comprender aproximadamente 5,0 gramos de heparina O-desulfatada, para un adulto humano medio.

La presente invención proporciona además la utilización de heparina O-desulfatada, que presenta una O-desulfatación en por lo menos las posiciones 2-O y 3-O, en la preparación de un medicamento para evitar la hiperreactividad de las vías respiratorias en un mamífero. La invención proporciona adicionalmente la utilización de heparina O-desulfatada, que tiene una O-desulfatación en por lo menos las posiciones 2-O y 3-O, en la preparación de un medicamento para evitar la broncoconstricción en un mamífero. Adicionalmente, la invención proporciona la utilización de heparina O-desulfatada, que presenta una O-desulfatación en por lo menos las posiciones 2-O y 3-O, en la preparación de un medicamento para evitar la proliferación de células del músculo liso de las vías respiratorias, en un mamífero.

Por "prevención" se quiere decir que la respuesta asmática no alcanza un nivel agudo, y sustancialmente no es detectable. Para la prevención, se puede administrar el medicamento de heparina O-desulfatada antes de la exposición a un antígeno, tal como antes de un contacto predecible con un antígeno conocido. También, el medicamento de heparina O-desulfatada se puede administrar periódicamente para evitar de forma continua la hiperreactividad de las vías respiratorias y/o la proliferación de células del músculo liso de las vías respiratorias. El asma es muy adecuada para la prevención de la hiperreactividad de las vías respiratorias y/o de la broncoconstricción debido al bajo nivel constante de inflamación. La prevención implica una unión continua de cargas positivas en las vías respiratorias con la heparina O-desulfatada cargada negativamente.

Preferentemente, la utilización de esta invención para la prevención comprende una supresión constante de la respuesta asmática, que se puede lograr mediante una administración repetida y periódica del medicamento de heparina O-desulfatada. Con la administración repetida y periódica, se puede averiguar fácilmente la dosis óptima variando la dosis hasta que se logre la prevención óptima, Preferentemente, la dosis se administra aproximadamente 2 a 4 veces al día.

Adicionalmente, con la exposición a grandes cantidades de un antígeno o de un agente irritante, si se produce eventualmente una respuesta, se puede administrar una dosis adicional de medicamento de heparina O-desulfatada. Adicionalmente, cuando se sabe a priori que se producirá una exposición a una gran cantidad de antígeno, se puede administrar una dosis adicional de medicamento de heparina O-desulfatada para evitar la respuesta. Debido a que la dosis del medicamento de heparina O-desulfatada necesaria para reducir o evitar una respuesta a un antígeno está directamente relacionada con la cantidad de carga positiva en la vía respiratoria, producida por la migración de células que tienen proteínas cargadas positivamente que resulta de la exposición al antígeno o al agente irritante, y que se ha de unir a la heparina cargada negativamente, se puede determinar fácilmente cuándo pueden ser necesarias dosis adicionales y se puede determinar una cantidad apropiada. Una dosis típica para la administración repetida y preventiva puede estar comprendida entre aproximadamente 0,5 mg/kg y aproximadamente 70 mg/kg, estando una dosis preferida comprendida entre aproximadamente 5 mg/kg y aproximadamente 7 mg/kg. Esta dosis preferida se puede administrar tan a menudo como sea necesario para evitar la respuesta.

La heparina O-desulfatada se puede obtener mediante un procedimiento que comprende alcalinizar una disolución que contiene heparina reducida, hasta un pH de 13 o superior, y permitir que suceda la desulfatación. La desulfatación se puede lograr de forma más rápida liofilizando, secando o destilando a vacío la disolución alcalina de heparina. El grado de desulfatación se puede determinar durante el procedimiento de desulfatación, retirando una muestra y determinando el grado de desulfatación de la muestra por medios estándares tales como análisis de disacáridos. La disolución alcalina se debe neutralizar antes de su administración, lo que se puede lograr mediante ultrafiltración con grandes volúmenes de agua, ajustando el pH hasta pH neutro mediante procedimientos estándares, tal como adición de ácido clorhídrico, seguido de la liofilización, del secado o de la destilación a vacío. En el Ejemplo I se proporciona un ejemplo del presente procedimiento, que demuestra el procedimiento más rápido de desulfatación logrado liofilizando la disolución alcalina de heparina. Como alternativa, la disolución alcalina de heparina se puede secar o se puede destilar a vacío o simplemente se deja reposar para que transcurra la desulfatación.

La disolución de heparina puede presentar una concentración de aproximadamente 1 a 10% de heparina. Si se desea, la heparina se puede tratar opcionalmente para el control del peso molecular (reduciendo la cantidad de fragmentación de la heparina) con un agente reductor, tal como, pero sin limitarse a, borohidruro de sodio, hidrógeno catalítico, e hidruro de litio y aluminio, que se puede añadir de manera convencional alcalinizando la disolución ligeramente hasta pH 8-9 con bicarbonato sódico (Conrad et al., patente U.S. nº 5.250.519 (5 de Octubre de 1993)), pero el agente reductor, si se usa, se puede añadir preferentemente sin alcalinizar ligeramente la disolución (es decir, sin bicarbonato de sodio). La disolución se puede incubar con el agente reductor durante un periodo comprendido entre aproximadamente 12 y 24 horas hasta aproximadamente 15 a 30ºC, o más preferentemente aproximadamente entre 20 y 25ºC. Es necesario que el tiempo de incubación sólo sea suficientemente prolongado para que suceda la reducción de la heparina, tal como aproximadamente 4 horas, y se puede prolongar hasta aproximadamente varios días, tal como más de 60 horas. Después de esta incubación, se añade una base, tal como hidróxido sódico, para elevar el pH hasta 13 o más, preferentemente hasta una concentración de aproximadamente 0,25 hasta 0,50 M. Esta disolución alcalina se puede entonces secar, liofilizar o destilar a vacío. Estos procedimientos pueden acelerar el proceso de O-desulfatación; como alternativa, se puede dejar que la disolución transcurra con la O-desulfatación sin utilizar ninguno de estos procedimientos. Independientemente del procedimiento específico usado, la heparina se neutraliza entonces antes de la administración, hasta un pH farmacéuticamente aceptable. Típicamente, la heparina O-desulfatada se neutraliza mediante ultrafiltración con grandes volúmenes de agua, y, si es necesario, el pH se ajusta por medios estándares tales como adición de ácido clorhídrico, y entonces la heparina O-desulfatada se seca, se liofiliza o se destila a vacío. En el documento WO 95/21198, publicado el 10 de Agosto de 1995, se describen procedimientos para la preparación de heparina O-desulfatada tal como se usa en este documento.

Los presentes medicamentos pueden comprender además la heparina O-desulfatada, una modificación de la misma, en un vehículo fisiológicamente aceptable para la administración. Se puede utilizar cualquier vehículo fisiológicamente aceptable, tal como disolución salina fisiológicamente tamponada, disolución salina normal, y agua destilada. Por "farmacéuticamente aceptable" se quiere decir un material que no es biológicamente indeseable ni de ningún otro modo, es decir, el material se puede administrar a un paciente junto con la heparina O-desulfatada sin provocar efectos biológicos indeseables o sin que interactúe de manera perjudicial con cualquiera de los otros componentes de la composición farmacéutica en la que está contenido.

El medicamento de heparina O-desulfatada se puede administrar en partículas de aerosol, mediante inhalación, mediante inyección intratraqueal, mediante inyección intravenosa (iv), mediante inyección peritoneal, u oralmente. Dichas administraciones pueden comprender un vehículo fisiológicamente aceptable y una cantidad eficaz de heparina O-desulfatada o un análogo de la misma. Las partículas de aerosol pueden constar esencialmente de partículas inferiores a 10 micrómetros, y preferentemente inferiores a 5 micrómetros. Dichos aerosoles se pueden proporcionar mediante sistemas de aerosoles a chorro o de nebulizadores ultrasónicos, disponibles y de uso habitual, o mediante sistemas de inhalación de polvo seco conocidos en la técnica.

Dependiendo del modo pretendido de administración, las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de dosis sólida, semisólida o líquida, tal como, por ejemplo, un polvo seco o un líquido para inhalación mediante aerosol. Las composiciones incluirán, según se ha señalado anteriormente, una cantidad eficaz del fármaco seleccionado, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y, además, pueden incluir otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, vehículos, coadyuvantes, diluyentes, etc. Los compuestos se pueden administrar, por ejemplo, como un complejo con liposomas catiónicos, o encapsulados en liposomas aniónicos.

Las composiciones líquidas farmacéuticamente administrables se pueden preparar, por ejemplo, disolviendo, dispersando, etc., un compuesto activo, como se describe en este documento, y coadyuvantes farmacéuticos opcionales en un excipiente, tal como, por ejemplo, agua, disolución salina, dextrosa acuosa, glicerol, etanol, y similar, para formar de ese modo una disolución o suspensión. Si se desea, la composición farmacéutica a administrar también puede contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH, y similares, por ejemplo acetato de sodio, monolaurato de sorbitán, acetato de sodio y trietanolamina, oleato de trietanolamina, etc. Las composiciones líquidas se pueden administrar como aerosol. Los procedimientos actuales para preparar dichas formas de dosificación son conocidos o resultarán evidentes para los expertos en la materia; por ejemplo, véase Remington's Pharmaceutical Sciences, E.W. Martin, (ed.), Mack Publishing Co., Easton, PA.

Si se usa, la administración parenteral se caracteriza generalmente por la inyección. Los compuestos inyectables se pueden preparar de maneras convencionales, ya sea como disoluciones o suspensiones líquidas, como formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en un líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Un enfoque más recientemente estudiado para la administración parenteral implica la utilización de un sistema de liberación lenta o un sistema de liberación sostenida, de forma que se mantenga una cantidad constante de dosificación. Véase, por ejemplo, la patente U.S. nº 3.710.795.

La presente invención se describe más particularmente en los siguientes ejemplos que se proporcionan únicamente a título ilustrativo, puesto que numerosas modificaciones y variaciones de los mismos resultarán evidentes para los expertos en la materia.

Ejemplos Ejemplo I O-desulfatación de la heparina

Se obtuvo una disolución acuosa al 5% de heparina sódica de la mucosa intestinal porcina (Scientific Protein Labs, Waunakee, WI) añadiendo 500 g de heparina a 10 l de agua desionizada. Se añadió borohidruro de sodio hasta una concentración final de 1%, y la mezcla se incubó toda la noche a 25ºC. Se añadió a continuación hidróxido sódico hasta una concentración final de 0,4 M (pH por lo menos 13), y la mezcla se congeló y se liofilizó hasta sequedad. El exceso de borohidruro de sodio y de hidróxido de sodio se eliminó mediante ultrafiltración. El producto final se ajustó hasta pH 7,0, se precipitó por adición de tres volúmenes de etanol frío, y se secó. La heparina O-desulfatada, producida mediante este procedimiento, fue un polvo ligeramente blanquecino, cristalino, fino, con una actividad anticoagulante de menos de 10 unidades de USP/mg y con una actividad anticoagulante anti-Xa de menos de 10 U/mg.

La síntesis de heparina O-desulfatada mediante la reducción de heparina en disolución, y el secado, liofilización o destilación a vacío de la disolución de heparina reducida, puede incluir las siguientes modificaciones. Por ejemplo, se puede colocar a la heparina de partida en agua o en otro disolvente, en tanto que la disolución no sea muy alcalina. Una concentración típica de la disolución de heparina puede ser de 1 a 10 por ciento de heparina. La heparina usada en la reacción se puede obtener a partir de numerosas fuentes, conocidas en la técnica, tales como el intestino porcino o el pulmón de vaca. Se puede utilizar heparina que se ha modificado de cualquiera de las numerosas formas conocidas por el experto en la materia, discutidas anteriormente.

La disolución de heparina reducida se puede secar, liofilizar, o el disolvente se puede destilar a vacío. Se prefiere la liofilización o destilación a vacío del disolvente. Generalmente, se utiliza la liofilización. La heparina se puede reducir incubándola con un agente reductor, tal como borohidruro de sodio, hidrógeno catalítico, o hidruro de litio y aluminio. Una reducción preferida de la heparina se realiza incubando la heparina con borohidruro de sodio. Generalmente, se puede usar aproximadamente 10 gramos de NaBH_{4} por litro de disolución, pero esta cantidad se puede variar en tanto que se produzca la reducción de la heparina. Adicionalmente, se pueden utilizar otros agentes reductores conocidos, pero no son necesarios para producir una heparina O-desulfatada eficaz para el tratamiento. La incubación se puede lograr en un amplio intervalo de temperaturas, teniendo cuidado de que la temperatura no sea tan alta que la heparina se caramelice. Un intervalo de temperatura sugerido está comprendido entre aproximadamente 15 y 30ºC, o incluso entre aproximadamente 20 y 25ºC. La duración de la incubación también puede variar en un amplio intervalo, en tanto que sea suficiente para que suceda la reducción. Por ejemplo, pueden ser suficientes varias horas a toda la noche (es decir, aproximadamente 4 a 12 horas). Sin embargo, el tiempo se puede prolongar hasta aproximadamente varios días, por ejemplo superando aproximadamente 60 horas.

Adicionalmente, el procedimiento de síntesis se puede adaptar elevando el pH de la disolución reducida hasta 13 o más, mediante la adición de una base capaz de elevar el pH hasta 13 o más de la disolución de heparina reducida. El pH se puede elevar añadiendo cualquiera de los agentes que incluyen hidróxidos, tales como hidróxido de sodio, de potasio o de bario. Un agente preferido es hidróxido de sodio (NaOH). Incluso una vez que se ha logrado un pH de 13 o más, puede ser beneficioso aumentar adicionalmente la concentración de la base. Por ejemplo, es preferible añadir NaOH hasta una concentración de aproximadamente 0,25 M hasta aproximadamente 0,5 M de NaOH. Esta disolución alcalina se seca entonces, se liofiliza o se destila a vacío.

Ejemplo II Análisis del grado de 2-O- y 3-O-desulfatación de la heparina O-desulfatada

Se realizaron los siguientes dos conjuntos de análisis de disacáridos, sobre muestras bovinas y porcinas, se produjeron los espectros de HPLC de los análisis de disacáridos proporcionales, y se realizó la integración cuantitativa y la identificación de los picos de HPLC para determinar el grado de desulfatación de las cuatro muestras de heparina.

Se realizó un análisis de disacáridos mediante el procedimiento de Guo y Conrad (Guo, Y., y H.E. Conrad. 1988. Analysis of oligosaccharides from heparin by reversed-phase ion-pairing high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 178:54-62). En este procedimiento, los restos de L-acetil-D-glucosamina se desacetilan con hidrazina. La heparina se desamina entonces y se despolimeriza mediante exposición a ácido nitroso a pH 4 para romper los enlaces entre la D-glucosamina y los ácidos urónicos, y después a pH 1,5 para romper los enlaces entre el N-sulfato de D-glucosamina y los ácidos urónicos. Ambas reacciones dejan a los O-sulfatos intactos, y convierten a la glucosamina o al N-sulfato de glucosamina en anhidromanosa, que se marca radiactivamente con NaB[^{3}H_{4}], convirtiendo a la anhidromanosa en anhidromanitol. Los disacáridos marcados radiactivamente se separan a continuación mediante cromatografía de líquidos a alta presión con emparejamiento de iones, de fase inversa.

El primer conjunto de análisis se realizó sobre heparina de pulmón bovino comparando: a) el material de partida, heparina de pulmón bovino obtenida de Sigma Chemical Corp. (Figura 8), y b) el producto, heparina de pulmón bovino O-desulfatada, producida añadiendo 160 mg de heparina de pulmón bovino de partida a 40 ml de agua desionizada para obtener una disolución al 0,4%, ajustando la disolución a pH 13 o superior con hidróxido sódico, congelando y liofilizando el material como se presenta en el Ejemplo I (Figura 9).

Los resultados de la primera comparación muestran que el primer producto, heparina de pulmón bovino O-desulfatada, es aproximadamente de 97,6% 2-O desulfatada y aproximadamente 99% 3-O desulfatada, con relación al primer material de partida. La desulfatación en la posición 2-O se puede detectar debido a que, en el material de partida, el pico ISM a 10,7 min. presenta un área de 104.517 cpm, y el pico ISMS a 49,65 min. presenta un área de 207.919 cpm, mientras que el producto presenta un pico ISM insignificante y un pico ISMS a 49,75 min. de 7.461 cpm, que representa una reducción de aproximadamente 97,6% en los grupos 2-O-sulfato. La desulfatación en la posición 3-O se puede detectar debido a que, en el material de partida, el pico GMS_{2}, a 47,85 min., presenta un área de 10.461 cpm, mientras que el producto presenta un pico GMS_{2} insignificante, que representa una reducción de aproximadamente 99% en los grupos 3-O-sulfato. (Véanse la Figura 8 y Figura 9). El primer producto todavía estaba sustancialmente sulfatado en la posición 6-O con relación al material de partida, según se evidencia mediante un gran pico IMS en el primer producto.

El segundo conjunto de análisis se realizó sobre heparina de la mucosa porcina, comparando: a) el material de partida, heparina de la mucosa porcina obtenida de Sigma Chemical Corp. (Figura 10), y b) el producto, heparina de la mucosa porcina O-desulfatada, producida añadiendo 160 mg de la heparina de la mucosa porcina de partida a 40 ml de agua desionizada para obtener una disolución al 0,4%, ajustando la disolución hasta pH 13 o superior con hidróxido sódico, congelando y liofilizando el material según se presenta en el Ejemplo I (Figura 11).

Los resultados de la segunda comparación muestran que el segundo producto, heparina de la mucosa porcina O-desulfatada, es aproximadamente de 97,1% desulfatada en la posición 2-O, y aproximadamente de 99% desulfatada en la posición 3-O, con relación al segundo material de partida. La desulfatación en la posición 2-O se puede detectar debido a que, en el material de partida, el pico ISM a 14,85 min. presenta un área de 50.298 cpm, y el pico ISMS a 51,45 min. presenta un área de 249.088 cpm, mientras que el producto presnta un pico ISM insignificante, y un pico ISMS a 52,15 min. de 8.471 cpm, que representa una reducción de aproximadamente 97,1% en los grupos 2-O-sulfato. La desulfatación en la posición 3-O se puede detectar debido a que, en el material de partida, el pico GMS_{2} a 50,35 min. tiene un área de 17.082 cpm, mientras que el producto tiene un pico GMS_{2} insignificante, que representa una reducción de aproximadamente 99% en los grupos 3-O-sulfato. El segundo producto estaba todavía sustancialmente sulfatado en la posición 6-O con relación al material de partida, según se evidencia mediante un gran pico IMS en el segundo producto.

Ejemplo III Tratamiento de la hiperreactividad de las vías respiratorias asmáticas mediante heparina O-desulfatada

En los pulmones, la liberación de acetilcolina a partir del nervio vago está bajo el control local de autorreceptores muscarínicos inhibidores en los nervios postganglionares, según se muestra en la Figura 1. Estos autorreceptores M_{2} proporcionan un control de autorregulación negativa de la liberación de acetilcolina. Este control de autorregulación negativa se puede demostrar in vivo midiendo la broncoconstricción inducida por el nervio vago en presencia del agonista muscarínico M_{2} selectivo pilocarpina. La estimulación de los receptores M_{2} neuronales con pilocarpina disminuye la broncoconstricción inducida por el nervio vago tanto como un 70-80% (A.D. Fryer, et al., British Journal of Pharmacology (1984) 83:973-978). La pérdida de función de estos receptores M_{2} se caracteriza por hipersensibilidad de la vía respiratoria a la estimulación eléctrica del nervio vago, y por el fracaso de la pilocarpina para inhibir la broncoconstricción inducida por nervio vago. Por el contrario, la restauración de la función del receptor M_{2} está asociada con pérdida de hipersensibilidad de la vía respiratoria y con la restauración de la capacidad de la pilocarpina para inhibir la broncoconstricción inducida por el nervio vago. Esto se puede demostrar en un modelo de asma inducida por alérgeno en cobayas, en el que la pérdida de la función del receptor M_{2} se puede restaurar mediante la administración de heparina (A.D. Fryer, et al., Journal of Clinical Investigation (1992) 90:2290-2298).

Se inyectaron intraperitonealmente (ip) a cobayas (Dunkin Hartley; 200-250 g), libres de patógenos específicos, con disolución salina (control) o con 10 mg/kg de ovoalbúmina, cada dos días durante tres inyecciones. Tres semanas después de la primera inyección, los cobayas sensibilizados con ovoalbúmina (pero no a los que se les ha inyectado disolución salina) se expusieron a un aerosol de ovoalbúmina al 5% durante 5 minutos en cada uno de cuatro días consecutivos. En el primer día (cuando las respuestas agudas a la exposición a ovoalbúmina son las mayores) sólo se administró pirilamina (1 mg/kg iv) 60 minutos antes de la exposición. Los animales se alojaron en jaulas mantenidas con campanas de flujo laminar, durante todo este período de tiempo.

Veinticuatro horas después de la última exposición al aerosol, los animales se anestesiaron con uretano (1,5 g/kg ip). Se canularon a continuación ambas venas yugulares externas para la administración de fármaco. Se suministró guanetidina (10 mg/kg iv) al comienzo de cada experimento para evitar la liberación de norepinefrina a partir de los nervios simpáticos. Ambos nervios vagos fueron cortados en el cuello y se colocaron en electrodos protegidos sumergidos en una piscina de parafina líquida. Los electrodos se conectaron a un estimulador Grass SD9. Se usó una manta calefactora para mantener la temperatura corporal a 37ºC. Se canuló la tráquea, y los animales se paralizaron con suxametonio (infundido a 10 \mug/kg/min), y se ventilaron con un ventilador para animales Harvard de volumen constante y de presión positiva. La presión de insuflación de los pulmones (Ppi) se midió en la tráquea usando un transductor de presión Spectramed. El caudal se midió usando un neumotacómetro Fleish con un transductor de presión diferencial Grass, y esta señal se integró para medir el volumen corriente. Se canuló una arteria carótida para medir la tensión arterial con un transductor Spectramed, y se derivó la frecuencia cardíaca a partir de la tensión arterial usando un tacógrafo. Todas las señales se registraron en un polígrafo Grass. Se midieron las pO_{2} y pCO_{2} usando muestras de sangre arterial tomadas al comienzo y al final de cada experimento.

Fue necesaria una presión positiva entre 100 y 120 mm H_{2}O para la ventilación adecuada de los animales. Dado un caudal y un volumen constantes, la broncoconstricción se midió como el aumento de Ppi con respecto a la presión de insuflación de la línea base. La señal de Ppi se alimentó en la entrada del preamplificador de un segundo canal en el polígrafo, y la Ppi de la línea base se restó eléctricamente. De este modo, la Ppi se registró en un canal, y los aumentos de Ppi se registraron en un canal separado a una mayor sensibilidad, de forma que fue posible medir exactamente los aumentos de Ppi tan pequeños como 2 mm H_{2}O por encima de la línea base.

Para producir la broncoconstricción, ambos nervios vagos se estimularon simultáneamente a intervalos de 1 minuto (2 ó 15 Hz, duración del pulso 0,2 ms, 5-30 voltios, 45 pulsos por tren). Esto también provocó bradicardia. Después de establecer una respuesta de línea base estable a la estimulación del nervio vago a 15 Hz, se inyectó intravenosamente disolución salina, heparina o heparina O-desulfatada, y se continuó la estimulación eléctrica de los nervios vagos cada minuto durante la siguiente media hora. Treinta minutos después de que se inyectó la disolución salina, la heparina o la heparina O-desulfatada, y antes de la administración de pilocarpina, se obtuvieron respuestas a la estimulación eléctrica de los nervios vagos a 2 Hz. La broncoconstricción en respuesta a la estimulación de los nervios vagos (2 Hz, 0,2 ms, 45 pulsos por tren) se emparejó en los cobayas de control y en los cobayas sensibilizados, ajustando el voltaje (en un intervalo de 5-20 voltios). De este modo, se pudo comparar el efecto de la pilocarpina sobre la broncoconstricción inducida por el nervio vago entre grupos, sin preocuparse sobre las diferentes respuestas broncoconstrictoras iniciales. Una vez se ajustaron los parámetros para la broncoconstricción inducida por el nervio vago a 2 Hz, y se obtuvieron varias respuestas consistentes, se administró pilocarpina (1-100 \mug/kg iv) en dosis acumulativas, y se midieron los efectos sobre la broncoconstricción inducida por el nervio vago. Treinta-100 \mug/kg iv de pilocarpina produjeron una broncoconstricción transitoria. Por lo tanto, se midió el efecto de estas dosis de pilocarpina sobre la broncoconstricción inducida por el nervio vago después de que la Ppi haya vuelto a la línea base. En los estudios previos, se ha demostrado que 2.000 U/kg iv de heparina resultan eficaces restaurando la función del receptor M_{2} neuronal (A.D. Fryer, et al., Journal of Clinical Investigation (1992) 90:2290-2298). Al final de cada experimento, la atropina (1 mg/kg iv) bloqueó todas las respuestas a la estimulación por el nervio vago demostrando que la broncoconstricción inducida por el nervio vago y la bradicardia estaban mediadas vía los receptores muscarínicos.

Se compararon las respuestas de broncoconstricción de la línea base y de la bradicardia a la estimulación de los nervios vagos, entre cobayas de control, cobayas expuestos y cobayas tratados, usando un análisis de varianza de un factor. Se analizó el efecto inicial de la disolución salina, de la heparina o de la heparina O-desulfatada sobre la broncoconstricción inducida por el nervio vago y sobre la bradicardia, usando un análisis de varianza de un factor. Se compararon los efectos de la disolución salina, de la heparina y de la heparina O-desulfatada, sobre curvas de respuesta a la dosis, frente a pilocarpina, en cobayas expuestos a antígenos y en cobayas de control, usando un análisis de varianza de dos vías para medidas repetidas. Se evaluó el efecto de un bolo adicional de heparina sobre la respuesta a 100 \mug/kg de pilocarpina, usando pruebas de la t pareadas. Los valores de P iguales o menores que 0,05 se consideran significativos.

La Ppi, la frecuencia cardíaca y la tensión arterial de la línea base fueron los mismos en los animales de control y en los animales que se sensibilizaron y se expusieron a ovoalbúmina. El tratamiento con la disolución salina, con heparina o con heparina O-desulfatada no alteró ni el ritmo cardíaco, ni la presión de insuflación de los pulmones ni la tensión arterial de la línea base. La estimulación eléctrica de ambos nervios vagos (2 ó 15 Hz, duración de pulso de 0,2 ms, 5-20 voltios, 45 pulsos por tren) produjo broncoconstricción (medida mediante el aumento de la Ppi) y bradicardia. Estas dos respuestas a la estimulación por el nervio vago fueron transitorias y revertieron rápidamente después de que se detuvo la estimulación eléctrica. Al final de cada experimento, la broncoconstricción inducida por el nervio vago y la bradicardia fueron bloqueadas completamente por atropina (1 mg/kg), indicando que estaban mediadas vía la liberación de acetilcolina en los receptores muscarínicos.

En cobayas que no se sensibilizaron o se expusieron a ovoalbúmina, la administración de heparina no tuvo ningún efecto sobre la broncoconstricción inducida por el nervio vago (aumento de 27,6 \pm 5,4 mm H_{2}O antes de la heparina frente a 25,2\pm7,3 mm H_{2}O 20 minutos después de la heparina) ni sobre la bradicardia (caída de 74,3\pm15 latidos/minuto antes de la heparina, frente a 63,4 \pm24 latidos/minuto después de la heparina). En los animales que se expusieron a antígeno, la disolución salina no tuvo ningún efecto sobre la broncoconstricción inducida por el nervio vago (véanse las columnas 1-2, Figura 3) ni sobre la bradicardia (caída de 62,0 \pm 26 latidos/minuto antes de la disolución salina, frente a 50,0 \pm 27 latidos/minuto 20 minutos después de la disolución salina). Por el contrario, la heparina (2.000 U/kg) redujo la broncoconstricción inducida por el nervio vago en animales sensibilizados y expuestos, pasando a una meseta a una inhibición del 50% veinte minutos después de la administración de heparina (véanse las columnas 3-4, Figura 3). La heparina no tuvo ningún efecto sobre la bradicardia inducida por el nervio vago (caída de 82,5 \pm 6,3 latidos/minuto antes de la heparina, frente a 70,0\pm9,1 latidos/minuto 20 minutos después de la heparina). La administración de heparina O-desulfatada (91,2 mg/kg) disminuyó también la broncoconstricción inducida por el nervio vago, alcanzando una meseta 20 minutos después de la administración (véanse las columnas 5-6, Figura 3 y Figura 4). Al igual que la heparina, O-desulfatada no alteró la bradicardia inducida por el nervio vago.

En animales de control no sensibilizados, la pilocarpina (1-100 \mug/kg iv) inhibió la broncoconstricción estimulada por el nervio vago al estimular a los receptores muscarínicos M_{2} en los nervios parasimpáticos pulmonares (cuadrados en blanco, Figura 5). Esto se muestra mediante la reducción progresiva en la relación de la broncoconstricción después de la pilocarpina comparada con la broncoconstricción antes de la pilocarpina. Por el contrario, la pilocarpina no tuvo ningún efecto significativo sobre la respuesta a la estimulación del nervio vago en cobayas sensibilizados y expuestos (triángulos en blanco, Figura 5), demostrando que la actividad del receptor muscarínico M_{2} estaba deteriorada en estos animales. La respuesta a la pilocarpina se restauró de una manera dependiente de la dosis mediante el tratamiento con heparina O-desulfatada (Figura 5), indicando que la heparina O-desulfatada fue activa invirtiendo la desensibilización del receptor M_{2}, una causa de la hiperreactividad de las vías respiratorias en estos animales. Después de la dosis más elevada usada, la capacidad de la pilocarpina para inhibir la broncoconstricción inducida por el nervio vago, en cobayas expuestos, se restauró completamente. No se detectó ninguna diferencia significativa entre el efecto de pilocarpina sobre la broncoconstricción inducida por el nervio vago en animales de control (cuadrados en blanco, Figura 5) y en animales expuestos que habían recibido esta dosis de heparina O-desulfatada (cuadrados en negro, Figura 5).

Estos experimentos demuestran definitivamente que la heparina O-desulfatada restaura la desensibilización del receptor muscarínico M_{2} responsable de la hiperreactividad de las vías respiratorias en el asma. En los animales de control, la pilocarpina inhibió la broncoconstricción inducida por el nervio vago debido a la estimulación de los receptores muscarínicos M_{2} inhibidores en los nervios parasimpáticos del pulmón. La inhibición inducida por la pilocarpina, de la broncoconstricción inducida por el nervio vago, se atenuó notablemente tras la exposición al antígeno. De este modo, en los cobayas expuestos a antígeno, los receptores M_{2} neuronales ya no funcionan para inhibir la liberación de acetilcolina. Esta pérdida del control de la liberación de acetilcolina, mediado por el receptor M_{2} neuronal, provoca la hipersensibilidad a la estimulación eléctrica de los nervios vagos. La función del receptor M_{2} se restaura mediante la heparina O-desulfatada. Veinte minutos después de que se administró la heparina O-desulfatada, el receptor neuronal en cobayas expuestos a antígeno se pudo estimular una vez más mediante agonistas exógenos, puesto que la pilocarpina inhibió la broncoconstricción inducida por el nervio vago (Figura 5). La capacidad de la acetilcolina endógena para estimular a los receptores M_{2} neuronales también se restauró mediante la heparina O-desulfatada, como se refleja por la disminución de la respuesta broncoconstrictora a la estimulación del nervio vago en presencia de este análogo de heparina no anticoagulante.

Ejemplo IV Tratamiento de la hiperreactividad de las vías respiratorias en seres humanos

La heparina O-desulfatada se puede administrar a los pulmones mediante la inhalación de un aerosol a partir de un nebulizador ultrasónico o a chorro que genera partículas respirables de tamaño inferior a 5 micrómetros de diámetro aerodinámico medio másico (MMAD). Aunque el porcentaje exacto de aerosol que alcanza realmente a los pulmones varía según el tipo de nebulizador a chorro o ultrasónico usado, aproximadamente 10 por ciento de la dosis en el nebulizador alcanza realmente a los pulmones. Newman, S.P., "Therapeutic Aerosols, in Aerosols in the Lung", Clinical and Experimental Aspects, S.W. Clarke y D. Pavia, eds., Butterworths: Londres (1984) p. 197-224. Por lo tanto, un paciente necesitará ser tratado con una dosis de nebulizador que sea diez veces el fármaco realmente necesario para el aumento eficaz de la actividad del receptor M_{2}.

Para calcular la dosis única de extremo inferior en un paciente

	Objetivo:	de 0,1 a 0,2 mg/kg que alcance realmente al pulmón
	Adminístrese:	aproximadamente de 1,0 a 2,0 mg/kg inhalado del nebulizador

Para calcular la dosis media para un paciente

	Objetivo:	0,5 mg/kg que alcance realmente al pulmón
	Adminístrese:	aproximadamente 5,0 mg/kg inhalado del nebulizador

Para calcular la dosis final elevada para un paciente

	Objetivo:	0,7 mg/kg que alcance realmente al pulmón
	Adminístrese:	aproximadamente 7,0 mg/kg inhalado del nebulizador

Basándose en los cálculos anteriores, la heparina O-desulfatada se puede administrar a relaciones más bajas o más altas aumentando o disminuyendo las dosis. Adicionalmente, la dosis se puede modificar para pacientes individuales, basándose, por ejemplo, en la persona. Además, a medida que transcurre el tratamiento, la dosis se puede variar según los efectos terapéuticos observados con una dosis específica. Adicionalmente, la heparina se puede acumular en los pulmones hasta una meseta. Aproximadamente el 10% de la heparina administrada permanece unido a la matriz del pulmón, unido mediante proteínas de unión a heparina (por ejemplo, colágeno y fibronectina). De este modo, una estrategia de dosificación puede comenzar con una dosis de extremo inferior y planificar la acumulación de la heparina en los pulmones con el tiempo, particularmente para la prevención a largo plazo.

La cantidad exacta de dichos compuestos requeridos variará de una persona a otra, dependiendo de la especie, de la edad y del estado general de la persona, de la gravedad de la enfermedad que se está tratando, del compuesto particular usado, de su modo de administración, y similar. De este modo, no es posible especificar una cantidad exacta promotora de la actividad. Sin embargo, se puede determinar una cantidad apropiada, por la persona experta en la materia, usando solamente la experimentación normal dada en las enseñanzas de este documento.

Ejemplo V Efecto de la heparina O-desulfatada sobre la coagulación de la sangre:

Se estudió el potencial anticoagulante de la heparina O-desulfatada del Ejemplo I determinando su efecto sobre el tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT) in vitro. El ensayo se realizó de la manera habitual usada para monitorizar el efecto anticoagulante de la heparina clínicamente en pacientes. El ensayo usó 0,1 y 1,0 mg/ml de heparina o de heparina O-desulfatada según el Ejemplo I, añadida al suero de ensayo humano in vitro.

TABLA I

		Control	\hskip0.2cm Heparina	Heparina O-desulfatada
	Conc. (mg/ml)	0	1,0	0,1	\hskip0.5cm 1,0	\hskip0.5cm 0,1
	Tiempo para la formación del
	coágulo (s)	35-45	>150	80	\hskip0.5cm 42	\hskip0.5cm 38

También se estudió la heparina O-desulfatada, procedente del Ejemplo I, para determinar si las diluciones plasmáticas de 0,1 mg/ml de heparina, o de heparina desulfatada según el Ejemplo I, inhibieron el factor Xa, prolongando el tiempo de ensayo, en un ensayo para determinar la actividad de Xa utilizando plasma tratado con veneno de víbora de Russell.

TABLA II

	Dilución	\hskip1cm Actividad anti-factor Xa
		Plasma de control	Heparina	Heparina O-desulfatada
	1:2		> 8 min.	42 s
	1:10		> 7 min.	33 s
	1:100		42 s	32 s
	1:1000		32 s	32 s
	0	35 s

Contrariamente a la heparina, la heparina desulfatada según el Ejemplo I mostró muy poca capacidad para prolongar el APTT, y mostró poca actividad antifactor Xa. De este modo, la heparina O-desulfatada mostró una actividad anticoagulante muy reducida, cuando se compara con la heparina no desulfatada.

Ejemplo VI Cultivo de músculo liso de las vías respiratorias

Se sacrificaron ratas Sprague-Dawley macho adultas normales con sobredosis de pentobarbital. Se retiraron sus tráqueas, y se aisló la membrana posterior. La membrana posterior, que contiene músculo liso de la tráquea, se troceó y se digirió a continuación dos veces durante 30 minutos a 37ºC en disolución salina equilibrada de Hanks que contiene 0,2% de colagenasa tipo IV y 0,05% de elastasa tipo IV (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Las células se lavaron entonces, en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), con 10% de suero fetal bovino (FBS), y se sembraron en este medio en matraces de plástico de 25 cm^{2}, a 2 x 10^{5} células/matraz. Los cultivos de células del músculo liso muestran el aspecto morfológico típico de "montaña y valle" en la microscopía de contraste de fases, y se tiñeron específicamente para determinar la acción del músculo liso \alpha. Para la inmunotinción, las células se colocaron en placas toda la noche en portaobjetos (3 x 10^{4} células/portaobjeto), se lavaron con disolución salina tamponada con fosfato (PBS, sin calcio ni magnesio), y se fijaron dos veces durante 10 minutos cada vez con acetona enfriada con hielo. La inmunotinción se realizó usando un anticuerpo policlonal contra la acción del músculo liso \alpha humano, y se visualizó usando un kit de tinción de avidina-biotina-inmunoperoxidasa (Sigma, producto nº IMMH-2).

Ejemplo VII Efecto del suero sobre la proliferación del músculo liso de las vías respiratorias

Las células se colocaron en placas de 24 pocillos, a una densidad de 1,5 x 10^{4} células por pocillo, con DMEM que contiene concentraciones variables de FBS (0,25%, 2,5%, 5,0% y 10%). Comenzando 24 horas más tarde, se realizaron recuentos de células a intervalos de 24 horas. Los pocillos se lavaron dos veces con PBS, después las células se permeabilizaron mediante exposición durante 10 minutos a saponina (0,5 mg/ml en PBS). Tras lavar con PBS, las células se fijaron entonces con metanol durante 5 minutos, seguidamente se tiñeron durante 5 minutos con tintura de Wright modificada de Geimsa (Sigma), y se lavaron nuevamente con PBS. Los recuentos celulares de cada pocillo se obtuvieron a partir de una media de recuentos de 10 campos al azar realizados a 40 x con una rejilla ocular de 1 mm^{3}. La Tabla III proporciona los datos obtenidos.

TABLA III

1

La Figura 6 demuestra gráficamente los resultados de la Tabla III, y muestra que el FBS estimula la proliferación del músculo liso de las vías respiratorias de una manera dependiente de la dosis.

Ejemplo VIII Efecto de la heparina y de la heparina O-desulfatada sobre la proliferación del músculo liso de las vías respiratorias

Se cultivaron células del músculo liso de las vías respiratorias como antes, con 10% de FBS en presencia de concentraciones variables de heparina de la mucosa intestinal porcina o de heparina O-desulfatada (0, 2, 20 ó 200 \mug/ml) añadida al medio inmediatamente después de que las células se colocaran en placas. Los recuentos de células se realizaron después de 62 horas. Los datos se proporcionan en la siguiente Tabla IV.

TABLA IV

2

La Figura 7 demuestra gráficamente los datos de la Tabla IV, y muestra que la heparina y la heparina O-desulfatada inhibieron por igual la proliferación del músculo liso de las vías respiratorias, de manera dependiente de la dosis. La dosis más elevada de cualquiera de las heparinas (200 \mug/ml) inhibió el crecimiento celular en aproximadamente 50%.

Ejemplo IX Efecto de la heparina y de la heparina O-desulfatada sobre la lisis de glóbulos rojos mediada por el complemento

La hemolisis de glóbulos rojos mediada por el complemento se determinó mediante la modificación de una técnica descrita previamente (Friedrichs et al. (1994) Circ. Res. 75:701-710). Se recogió sangre humana y se centrifugó a 2000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. La capa de plasma se desechó, y los glóbulos rojos se lavaron tres veces con PBS. Se preparó una disolución de 10% de eritrocitos en tampón de ensayo (PBS que contiene 0,25% de seroalbúmina bovina, pH 7,4). El ensayo para la detección de la hemolisis se realizó midiendo la absorbancia de la disolución de ensayo a 540 nm, el pico principal para la hemoglobina. El plasma entero de conejo (500 \mul) y PBS (500 \mul) o las heparinas ensayadas (500 \mul en PBS, concentración final 1 mg/ml) se mezclaron en tubos con silicona. Se añadieron los glóbulos rojos humanos (concentración final de 0,5%), y los tubos se incubaron en un baño de agua agitador a 37ºC durante 30 minutos. Los tubos se centrifugaron a 1000 x g durante 10 minutos, y la absorbancia del sobrenadante se leyó inmediatamente a 540 nm y se comparó con un blanco que contiene plasma y PBS solos. El porcentaje de la hemolisis se determinó mediante la relación de A_{540} para los tubos tratados con heparina y del control no tratado. Los resultados se expresaron como porcentaje de inhibición (100 - % de hemolisis).

La heparina resultó ser un inhibidor eficaz de la hemolisis de glóbulos rojos mediada por el complemento (inhibición de 71 \pm 4% a 1 mg/ml (n = 3). La heparina ODS (O-desulfatada) fue igualmente un inhibidor potente de la lisis de glóbulos rojos inducida por el complemento, en este sistema, inhibiendo la hemolisis en un 73 \pm 2% (n = 3). Estos resultados confirman que la inhibición del complemento por la heparina no depende de la unión a antitrombina III ni de otras funciones anticoagulantes. Estos resultados demuestran adicionalmente que la heparina O-desulfatada tiene una eficacia equivalente que la heparina en la inhibición de la hemolisis de glóbulos rojos mediada por el complemento.

Aunque el presente procedimiento se ha descrito con referencia a detalles específicos de ciertas realizaciones del mismo, no se pretende que dichos detalles se consideren como limitaciones del alcance de la invención excepto que y en el grado en que se incluyen en las reivindicaciones que se acompañan.

Claims (14)

1. Utilización de heparina O-desulfatada, que presenta una O-desulfatación en por lo menos las posiciones 2-O y 3-O, en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de la hiperreactividad de las vías respiratorias de una respuesta asmática en un mamífero.

2. Utilización de heparina O-desulfatada, que presenta una O-desulfatación en por lo menos las posiciones 2-O y 3-O, en la fabricación de un medicamento para aumentar la actividad de un receptor muscarínico M_{2} desensibilizado, en un mamífero asmático.

3. Utilización de heparina O-desulfatada, que presenta una O-desulfatación en por lo menos las posiciones 2-O y 3-O, en la fabricación de un medicamento para evitar o reducir la broncoconstricción en un mamífero.

4. Utilización de heparina O-desulfatada, que presenta una O-desulfatación en por lo menos las posiciones 2-O y 3-O, en la fabricación de un medicamento para evitar o reducir la proliferación de células del músculo liso de las vías respiratorias, en un mamífero.

5. Utilización de heparina O-desulfatada, que presenta una O-desulfatación en por lo menos las posiciones 2-O y 3-O, en la fabricación de un medicamento para inhibir la hemolisis mediada por el complemento, en un mamífero.

6. Utilización de heparina O-desulfatada, que presenta una O-desulfatación en por lo menos las posiciones 2-O y 3-O, en la fabricación de un medicamento para reducir una respuesta asmática en un mamífero.

7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el medicamento está destinado a ser administrado mediante inhalación.

8. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el medicamento está destinado a ser administrado mediante inyección intravenosa.

9. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el medicamento está destinado a ser administrado con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el mamífero es un ser humano.

11. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el medicamento está destinado a ser administrado en una cantidad comprendida entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 100 mg/kg.

12. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la heparina O-desulfatada presenta por lo menos una desulfatación del 90% tanto en la posición 2-O como en la posición 3-O.

13. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el medicamento se obtiene mediante un procedimiento que comprende alcalinizar una disolución que contiene heparina en un valor de pH igual o superior a 13.

14. Utilización según la reivindicación 13, que comprende además liofilizar la disolución alcalina.