DE69731386T2 - Verfahren zur behandlung von asthma mit o-desulfatisiertem heparin - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Behandlung und Prävention einer asthmatischen Reaktion.
  • STAND DER TECHNIK
  • Asthma ist eine entzündliche Erkrankung der Luftwege der Lunge, aufgrund derer die Luftwege dazu neigen, sich zu sehr zu verengen und zu leicht auf eine große Vielzahl provozierender Stimuli zu reagieren. In der Lunge ist das hauptsächliche innervierende sensorische und motorische Nervensystem im Vagusnerv enthalten (1). Sind die Luftwege Reizstoffen wie Schwefeldioxid, Prostaglandinen, Histamin oder kalter Luft ausgesetzt, kann dies die afferenten sensorischen Fasern des Vagus stimulieren, wodurch eine Bronchkonstriktion bzw. Verengung der Luftwege infolge einer reflexartigen Freisetzung von Acetylcholin durch cholinerge efferente motorische Zweige des Vagus ausgelöst wird. Dieser Reflex ist zwar bei normalen Personen vorhanden, doch ist er bei asthmatischen Patienten stark übertrieben. Diese übertriebene Verengung wird oft als Hyperreaktivität der Luftwege bezeichnet.
  • Es wird angenommen, dass die Hyperreaktivität der Luftwege bei asthmatischen Patienten und bei Tiermodellen von Asthma auf eine verstärkte Freisetzung des endogenen Neurotransmitters Acetylcholin aus den die Luftwege innervierenden efferenten motorischen Vagusenden zurückzuführen ist (A. D. Fryer, et al., Journal of Clinical Investigation (1992) 90: 2292–2298). Im Luftweg unterliegt die Freisetzung von Acetylcholin aus den Vagusnerven der örtlichen Kontrolle der inhibitorischen Muskarin-Autorezeptoren auf den postganglionären Nerven (1). Diese Autorezeptoren werden als M2-Muskarinrezeptoren bezeichnet, während die Muskarinrezeptoren auf der glatten Muskulatur der Luftwege M3-Rezeptoren sind. Aus dem Vagus freigesetztes Acetylcholin stimuliert also sowohl M3-Muskarinrezeptoren auf der glatten Muskulatur der Luftwege, was zu Bronchokonstriktion führt, als auch M2-Muskarinrezeptoren auf den Nerven, was die weitere Freisetzung von Acetylcholin herabsetzt. Bei Asthmatikern sind die inhibitorischen M2-Muskarinrezeptoren gestört, was zu einer übertriebenen Freisetzung von Acetylcholin und daher einer übertriebenen Bronchokonstriktion bzw. Hyperreaktivität der Luftwege in Reaktion auf einen gegebenen, die Luftwege reizenden Stimulus führt (A. D. Fryer, et al, Journal of Clinical Investigation (1992) 90: 2292–2298; D. B. Jacoby, et al., Journal of Clinical Investigation (1993) 91: 1314–1318).
  • Die Steuerung der durch den M2-Muskarinrezeptor bereitgestellten Freisetzung von Acetylcholin durch negative Rückkopplung kann experimentell nachgewiesen werden durch Messen der vagusbedingten Bronchokonstriktion in Gegenwart selektiver Muskarinagonisten oder -antagonisten. Durch die Blockade neuronaler M2-Muskarinrezeptoren mit Gallamin wird die vagusbedingte Bronchokonstriktion noch verstärkt. Der selektive M2-Muskarinrezeptor-Antagonist Pilocarpin dagegen hemmt die durch Reizstoffe ausgelöste reflexartige cholinerge Bronchokonstriktion bei normalen Patienten. Dieser inhibitorische Mechanismus ist bei Asthmatikern wegen der gestörten M2-Rezeptoren nicht vorhanden (P. A. Minette, et al., Journal of Applied Physiology (1989) 67: 2461–2465). Eine solche Störung der Muskarin-Autorezeptoren führt zu übertriebenen cholinergen Reflexen bei Asthma, weil die normale Rückkopplungshemmung der Freisetzung von Acetylcholin verloren gegangen ist.
  • Die Dysfunktion der M2-Rezeptoren und die anschließende Hyperreaktivität der Luftwege bei Asthma werden auf eine erhöhte Anfälligkeit der Rezeptoren für eine Beschädigung durch Produkte der Entzündungsreaktion in den Luftwegen zurückgeführt. Asthma führt zu einem Zustrom von Entzündungszellen, insbesondere Eosinophilen, in die Luftwege. Bei Asthmatikern scheiden aktivierte Eosinophile eine Anzahl von schädlichen Proteinen ab, einschließlich das Hauptbasisproteins, der eosinophilen Peroxidase und des eosinophilen kationischen Proteins. Alle diese Proteine sind stark positiv geladen. Diese und andere positiv geladene Proteine können zu einer Überreaktionsfähigkeit der Luftwege führen (R. H. Gundel, et al., Journal of Clinical Investigation (1991) 87: 1470–1473; A. J. Coyle, et al., American Review of Respiratory Diseases (1993) 147: 896–900). Das Hauptbasisprotein (D. B. Jacoby, et al., Journal of Clinical Investigation (1993) 91: 1314–1318) und andere positiv geladene Proteine (J. Hu, et al., Molecular Pharmacology (1992) 42: 311–324) funktionieren nachweislich als M2-Muskarinrezeptor-Antagonisten. Die Hyperreaktivität der Luftwege bei Asthma ist also eine Folge des direkten Antagonismus der inhibitorischen cholinergen M2-Rezeptoren durch Komponenten einer Luftwegsentzündung.
  • Die Behandlung einer Hyperreaktivität der Luftwege bei Asthma zielt derzeit entweder auf die Hemmung einer Luftwegsentzündung ab, die zur Freisetzung von Produkten führt, die M2-Rezeptoren hemmen, oder auf die direkte Umkehr der Bronchokonstriktion der glatten Muskulatur der Luftwege. Die entzündungshemmende Therapie stützt sich dabei auf Corticosteroide. β-adrenerge Agonisten, die durch Stimulation von β2-adrenergen Rezeptoren auf der glatten Muskulatur der Luftwege wirken, dienen als Bronchodilatatoren, um verengte Luftwege direkt wieder zu erweitern. Nichtselektive anticholinerge Arzneimittel wie Atropin und Ipratropiumbromid stehen zur Verwendung als Bronchodilatatoren zur Verfügung, blockieren aber präjunktionale M2-Rezeptoren und M3-Rezeptoren auf glatter Muskulatur mit gleicher Wirksamkeit. Dies erhöht die Freisetzung von Acetylcholin, womit die postjunktionale Blockade überwunden wird, und macht diese nichtselektiven anti cholinergen Mittel unwirksam bei der Umkehr einer vagusbedingten Bronchokonstriktion. Eine spezifischere Behandlung zur Umkehr der M2-Rezeptorblockade wäre von großem Nutzen als Behandlung für die Hyperreaktivität der Luftwege bei Asthma.
  • Unlängst hat sich gezeigt, dass das gerinnungshemmende Arzneimittel Heparin eine antigenbedingte Dysfunktion des M2-Rezeptors bei Meerschweinchen unter Antigen-Challenge umkehrt (A. D. Fryer, et al., Journal of Clinical Investigation (1992) 90: 2292–2298) und die Bindung des M2-Rezeptors durch das Hauptbasisprotein in vitro umkehrt (D. B. Jacoby, et al., Journal of Clinical Investigation (1993) 91: 1314–1218). Heparin wurde über die Jahre als Behandlung für Asthma vorgeschlagen (M. M. Hartman, California Medicine (1963) 98: 27–32; D. A. Dolowitz, et al., Annals of Allergy (1965) 23: 309–313; T. Ahmed, et al., American Review of Respiratory Diseases (1992) 145: 566–570; T. Ahmed, et al., Journal of Applied Physiology (1993) 74: 1492–1498; S. D. Bowler, et al., American Review of Respiratory Diseases (1993) 147: 160–163; T. Ahmed, et al., New England Journal of Medicine; Internationale PCT-Anmeldung PCT/US93/02880). Als Behandlung für eine Hyperreaktivität der Luftwege bei Asthma hat Heparin jedoch einen großen Nachteil: es ist eine gerinnungshemmende Substanz. Als solche würde es den behandelten Patienten der inakzeptablen Gefahr einer Blutung aussetzen, selbst wenn die Behandlung durch Einsprühen von Heparin in die Luftwege der Lunge örtlich begrenzt wird. Aerosoliertes Heparin wird vom Körperkreislauf gut absorbiert, und die Verabreichung von Heparin durch Einsprühen in die Lunge wurde als Methode zum Antikoagulieren des Blutes empfohlen (L. B. Jaques, et al., Lancet (1976) ii: 157–1161).
  • Um Heparin gefahrlos als Behandlung für die Hyperreaktivität der Luftwege bei Asthma verwenden zu können, müsste es zunächst als Antikoagulans inaktiviert werden, ohne seine Wirksamkeit für die Behandlung von Asthma zu beeinträchtigen. Es gibt mehrere chemische Verfahren zum Inaktivieren von Heparin als Antikoagulans. Die meisten basieren auf Techniken der chemischen Desulfatierung, da feststeht, dass Sulfatgruppen von Heparin wichtig sind für die gerinnungshemmende Wirksamkeit. Unlängst wurde jedoch berichtet, dass N-desulfatiertes Heparin unwirksam ist beim Verhindern einer asthmaartigen Bronchokonstriktion mit Hilfe eines aerosolisierten Antigens (T. Ahmed, et al., American Review of Respirator Diseases (1992) 145: 566–570, siehe 2). Außerdem wurde unlängst berichtet, dass N-desulfatiertes Heparin bei der Komplementhemmung nur 50% so wirksam ist wie Heparin (J. M. Weiler et al., J. Immunol. (1992) 148: 3210–3215; R. E. Edens et al., Complement Today (Cruse, J. M. und Lewis, R. E. Jr., Hrsg.): Complement Profiles (1993) 1: 96–120).
  • Die Internationale Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 93/19734 offenbart die Verwendung von handelsüblichem Heparin, Heparinen oder Heparinfragmenten mit niedrigem Gewicht und teilweise N-desulfatierten Heparinen zur Behandlung von antigenbedingtem Asthma. Es wird der völlige Mangel an gerinnungshemmender Wirksamkeit von teilweise N-desulfatiertem Heparin offenbart, der für die Behandlung von antigenbedingtem Asthma besonders wertvoll ist.
  • Das US-Patent Nr. 5,380,716 offenbart stark sulfatierte Hexasaccharid- und Octasaccharidderivate (stark sulfatierte Heparinfragmente), die im Vergleich zu handelsüblichem Heparin oder handelsüblichen Heparinfragmenten eine erhöhte Fähigkeit haben, die Proliferation von glatten Muskelzellen zu hemmen, und eine verminderte Fähigkeit, als Antikoagulans zu wirken. Außerdem wird offenbart, dass 3-O-Sulfat für Antithrombin III und somit für eine gerinnungshemmende Wirksamkeit erforderlich ist.
  • In der Literatur wird somit gelehrt, dass eine chemische Desulfatierung keine wirksame Strategie wäre beim Modifizieren von Heparin zur Verwendung als wirksame Behandlung einer asthmatischen Hyperreaktivität der Luftwege. Im Gegensatz zu dem, was von der Literatur vorhergesagt wird, offenbart die vorliegende Erfindung, dass die selektive O-Desulfatierung von Heparin überraschenderweise die gerinnungshemmende Wirksamkeit von Heparin eliminiert, ohne die Fähigkeit von Heparin, eine M2-Muskarinrezeptor-Blockade bei Asthma umzukehren, zu zerstören.
  • Asthma wird in der medizinischen Literatur seit langem als episodische Erkrankung beschrieben, die gekennzeichnet ist durch eine reversible Blockierung der Luftwege. Dies steht im Gegensatz zu der chronischen obstruktiven Erkrankung der Luftwege aufgrund einer chronischen Bronchitis oder eines Emphysems, wo die physiologische Blockierung der Luftwege dauerhaft ist und langsam fortschreitet. Die Charakterisierung der Blockierung der Luftwege bei Asthma als episodisch und reversibel kann jedoch zu einfach sein. Klinische Lungenfachärzte haben unlängst damit begonnen, eine Population von Asthmatikern, normalerweise älteren Personen, zu untersuchen, die anscheinend eine nicht nachlassende Krankheit haben, wo sich die Lungenfunktion zwischen akuten bronchospastischen Episoden niemals normalisiert. Einige dieser Patienten scheinen eine feste Blockierung der Luftwege zu entwickeln, ohne dass andere bekannte Risikofaktoren wie aktives oder früheres Zigarettenrauchen vorhanden sind. Diese Population stellt eine schwierige klinische Aufgabe dar, da viele dieser Personen steroidabhängig oder sogar relativ resistent sind gegen eine Behandlung mit Steroiden und anderen entzündungshemmenden oder bronchodilatatorischen Medikamenten.
  • Eine mögliche Erklärung für diese schwierig zu behandelnde Population ist, dass Patienten mit chronischem Asthma eine Umgestaltung ihrer Luftwege erfahren, wobei es zu einer beachtlichen Zunahme der Menge an glatter Muskulatur in den Wänden der Luftwege kommt (Heard, B. E., und S. Hossain. 1973. Hyperplasia of bronchial muscle in astham. J. Path. 110: 319–331; James, A. L., P. D. Pare und J. C. Hogg. 1989. The mechanics of airway narrowing in asthma. Am. Rev. Respir. Dis. 139: 242–246; Saetta, M., A. DiStefano, C. Rosina, G. Thiene und L. M. Fabbri. 1991. Quantitative structural analysis of peripheral airways and arteries in sudden fatal asthma. Am. Rev. Respir. Dis. 143: 138–143; Ollerenshaw, S. L. und A. J. Woolcock. 1992. Characteristics of the inflammation in biopsies from large airways of subjects with asthma and subjects with chronic airflow limitation. Am. Rev. Respir. Dis. 145: 922–927). Patienten, die an Asthma sterben, haben mehr als die doppelte Menge an glatter Muskulatur der Luftwege wie nichtasthmatische Patienten (Saetta, M., A. DiStefano, C. Rosina, G. Thiene und L. M. Fabbri. 1991. Quantitative structural analysis of peripheral airways and arteries in sudden fatal asthma. Am. Rev. Respir. Dis. 143: 138–143), und eine Hypertrophie der glatten Muskulatur der Luftwege ist bei sensibilisierten Ratten der Rasse "Brown Norway" (Sapienza, S., T. Du, D. H. Eidelman, N. S. Wang und J. G. Martin. 1991. Structural changes in the airways of sensitized Brown Norway rats after antigen challenge. Am. Rev. Respir. Dis. 144: 423–427; Wang, C. G., T. Du, L. J. Xu und J. G. Martin. 1993. Role of leukotriene D4 in allergen-induced increases in airway smooth muscle in the rat. Am. Rev. Respir. Dis. 148: 413–417) und bei Katzen (Padrid, P., S. Snook, T. Finucane, P. Shiue, P. Cozzi, J. Solway und A. R. Leff. 1995. Persistent airway hyperresponsiveness and histologic alterations after chronic antigen challenge in cats. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 151: 184–193) nach einer Antigen-Challenge festzustellen. Man könnte erwarten, dass die vermehrte glatte Muskulatur der Luftwege den Ausgleich der Kräfte verändert, die das Lumen der Luftwege erweitern oder schließen wollen, wodurch die Lage des Punktes gleichen Drucks verändert wird, wenn Luft nicht mehr strömen kann (Pride, N. B., S. Permutt, R. L. Riley und B. Bromberger-Barnea. 1967. Determinants of maximal expiratory flow from the lungs. J. Appl. Physiol. 23: 646– 662). Eine Verdickung der Wände der Luftwege wurde ebenfalls als teilweise Erklärung für übertriebene Veränderungen im Durchmesser der Luftwege vorgeschlagen, wenn sich die glatte Muskulatur der Luftwege verkürzt (James, A. L., P. D. Pare und J. C. Hogg. 1989. The mechanics of airway narrowing in asthma. Am. Rev. Respir. Dis. 139: 242–246). Selbst geringe Änderungen in der Wanddicke der Luftwege, die wenig Auswirkung haben auf den Basiswiderstand gegen den Luftstrom, können zu einer Zunahme der maximalen Reaktionsfähigkeit der Luftwege auf Agonisten führen, ähnlich wie es bei Asthmatikern zu beobachten ist (Moreno, R. H., J. C. Hogg und P. D. Pare. 1985. Mechanisms of airway narrowing. Am. Rev. Respir. Dis. 133: 1171–1180).
  • Die genauen Stimuli für eine Hypertrophie der glatten Muskulatur der Luftwege bei Asthma sind unklar, aber es wurden mehrere mögliche Mitogene für die glatte Muskulatur der Luftwege nachgewiesen, einschließlich Endothelin, Histamin, das Mastzellenenzym Tryptase und Leukotriene (Wang, C. G., T. Du, L. J. Xu und J. G. Martin. 1993. Role of leukotriene D4 in allergen-induced increases in airway smooth muscle in the rat. Am. Rev. Respir. Dis. 148: 413–417; Vitori, E. N., M. Marini, A. Fasoli, R. De Franchia und S. Mattoli. 1992. Increased expression of endothelin in bronchial epithelial cells of asthmatic patients and effect of corticosteroids. Am. Rev. Respir. Dis. 146: 1320–1325; Noveral, J. P., S. M. Rosenberg, R. A. Anbar, N. A. Pawlowski und M. M. Grunstein. 1992. Role of endothelin-1 in regulating proliferation of cultured rabbit airway smooth muscle cells. Am. J. Physiol. 263 (Lung Cell. Mol. Physiol. 7): L317–L324; Glassberg, M. K., A. Ergul, A. Wanner und D. Puett. 1994. Endothelin-1 promotes mitogenesis in airway smooth muscle cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 10: 316–321; Panettieri, R. A., P. A. Yadvish, A. M. Kelly, N. A. Rubinstein und M. I. Kotlikoff. 1990. Histamine stimulates proliferation of airway smooth muscle and induces c-fos expression. Am. J. Physiol. 259 (Lung Cell. Mol. Physiol. 3): L365–L371; Ruoss, S. J., T. Hartmann und G. Caughey. 1992. Mast cell tryptase is a mitogen for cultured fibroblasts. J. Clin. Invest. 88: 493–499) The Polycation protamine is mitogenic for cultured vascular smooth muscle (Edelman, E. R., L. A. Pukac und M. J. Karnovsky. 1993. Protamine and protamine-insulins exacerbate the vascular response to injury. J. Clin. Invest. 91: 2308–2313). Daher ist es auch möglich, dass aus Eosinophilen gewonnene positive geladene Polykationen wie zum Beispiel das Hauptbasisprotein die Proliferation der glatten Muskulatur der Luftwege stimulieren könnten.
  • Ebenso unklar ist, wie eine Umgestaltung der glatten Muskulatur der Luftwege bei Asthma verhindert werden könnte. Der Bronchodilatator Salbutamol hemmt die Proliferation gezüchteter menschlicher glatter Muskelzellen der Luftwege in Reaktion auf Thrombin und epidermalen Wachstumsfaktor (Tomlinson, P. R., J. W. Wilson und A. G. Stewart. 1994. Inhibition by Salbutamol of the proliferation of human airway smooth muscle cells grown in culture. Br. J. Pharmacol. 111: 641–647). Indem man jedoch eine Mastzellendegranulation verhindert, können β-adrenerge Agonisten darstellende Bronchodilatatoren die proliferationshemmenden Wirkung der Freisetzung von Mastzellenheparin auf die Luftwege aufheben, wodurch die Umgestaltung der glatten Muskulatur verstärkt wird (Page, C. P. 1991. One explanation of the asthma paradox: inhibition of natural anti-inflammatory mechanism by B2-agonists. Lancet 337: 717–720). Bei der chronisch unter Antigen-Challenge stehenden, mit Ovalbumin sensibilisierten Ratte der Rasse "Brown Norway" reduzierte der Leukotrien-D4-Antagonist MK-571 die Proliferation der glatten Muskulatur in den kleinen Luftwegen, war aber nur teilweise wirksam beim Verhindern einer Luftwegsumgestaltung größerer Luftwege (Wang, C. G., T. Du, L. J. Xu und J. G. Martin. 1993. Role of leukotriene D4 in allergen-induced increases in airway smooth muscle in the rat. Am. Rev. Respir. Dis. 148: 413–417). Weil vermutlich mehr als ein Mitogen die Proliferation der glatten Muskulatur bei Asthmapati enten fördert, ist es nicht überraschend, dass die gezielte Blockade eines Mediators den Umgestaltungsprozess nicht verhindern kann. Als Therapie wird eine Behandlung gebraucht, die an einem konkreteren Kontrollpunkt bei den das Wachstum regelnden Vorgängen eingreift.
  • Es wurde vorgeschlagen, dass Mastzellenheparin normalerweise Wachstum und Proliferation der glatten Muskulatur der Luftwege moduliert (Page, C. P.. 1991. One explanation of the asthma paradox: inhibition of natural anti-inflammatory mechanism by B2-agonists. Lancet 337: 717-720). Das eng verwandte sulfatierte Polysaccharid Heparansulfat hemmt nachweislich die Proliferation gezüchteter glatter Muskelzellen der Luftröhre beim Hund (Panettieri, R. A., P. A. Yadvish, A. M. Kelly, N. A. Rubinstein und M. I. Kotlikoff. 1990. Histamine stimulates proliferation of airway smooth muscle and induces c-fos expression. Am. J. Physiol. 259 (Lung Cell. Mol. Physiol. 3): L365–L371). Heparin ist ein starker Inhibitor für die Proliferation der glatten Gefäßmuskulatur in vitro (Hoover, R. L., R. Rosenberg, W. Haering und M. J. Karnovsky. 1980. Inhibition of rat arterial smooth muscle cell proliferation by heparin. Cir. Res. 47: 578–583) und in vivo (Guyton, J. R., R. D. Rosenberg, A. W. Clowes und Karnovsky. 1980. Inhibition of rat arterial smooth muscle cell proliferation by heparin. In vivo studies with anticoagulant and nonanticoagulant heparin. Cir. Res. 46: 625–634; Clowes, A. W. und M. M. Clowes. 1985. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury. II. Inhibition of smooth muscle growth by heparin. Lab. Invest. 42: 611–616; Clowes, A. W. und M. M. Clowes. 1986. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury. IV. Heparin inhibits rat smooth muscle mitogenesis and migration. Circ. Res. 58: 839–845).
  • Unlängst wurde von Kilfeather et al. nachgewiesen, dass Heparin und Heparin mit niedrigem Molekulargewicht starke Inhibitoren sind für serumbedingte Proliferation kultivierter glat ter Muskelzellen der Luftröhre beim Rind (Kilfeather, S. A., S. Tagoe, A. C. Perez, K. Okona-Mensa, R. Martin und C. P. Page. 1995. Inhibition of serum-induced proliferation of bovine tracheal smooth muscle cells in culture by heparin and related glycosaminoglycans. Brit. J. Parmacol. 114: 1442–1446). Bei der Diskussion der Implikationen ihrer Erkenntnisse auf die Strukturwirksamkeit haben Kilfeather und seine Mitarbeiter angedeutet, dass die O-Sulfatierung für eine proliferationshemmende Wirksamkeit bei glatten Muskelzellen der Luftwege erforderlich ist. Früher hatten Wright et al. schon gezeigt, dass eine Erhöhung der Ladung inaktiver Tetrasaccharidfragmente durch O-Übersulfatierung bei diesen eine proliferationshemmende Wirkung gegenüber der glatten Gefäßmuskulatur hervorrief, während eine Reduzierung der Ladung aktiver größerer Fragmente dazu führte, dass diese ihre proliferationshemmende Wirksamkeit verlieren (Wright, T. C., Jr., J. J. Castello, Jr., M. Petitou, J.-C. Lormeau, J. Choay und M. J. Karnovsky. 1989. Structural determinants of heparin's growth inhibitory activity. Interdependence of oligosaccharide size and charge. J. Biol. Chem. 264: 1534–1542). Castellot et al. hatten angedeutet, dass 3-O-Sulfatierung absolut erforderlich ist als notwendige strukturelle Anforderung, damit Heparin die Proliferation der glatten Gefäßmuskulatur hemmt (Castellot, J. J., Jr., J. Choay, J.-C. Lormeau, M. Petitou, E. Sache und M. J. Karnovsky. 1986. Structural determinants of the capacity of heparin to inhibit the proliferation of vascular smooth muscle cells. II. Evidence for a pentasaccharide sequence that contains a 3-O-sulfate group. J. Cell. Biol. 102: 1979–1984). Maccarana et al. berichteten über die Bedeutung von 2-O-Sulfaten für die Heparinbindung des mitogenen grundlegenden Fibroblastenwachstumsfaktors (Maccarana, M., B. Casu und U. Lindahl. 1993. Minimal sequence in heparin/heparan sulfate required for binding of basic fibroblast growth factor. J. Biol. Chem. 268: 23898–23905).
  • Die vorliegende Erfindung liefert dagegen die überraschende Entdeckung, dass ein durch alkalische Lyophilisierung produziertes, wahlweise 2-O-, 3-O-desulfatiertes Heparin ein starker Inhibitor für die durch fetales Kälberserum stimulierte Proliferation der glatten Muskulatur der Luftwege ist.
  • Von der Herstellung von 2-O-desulfatiertem Heparin wurde berichtet (R. Rej et al., Thrombosis and Hemostasis (1989) 61: 540; und M. Jaseja et al., Canadian Journal of Chemistry (1989) 67: 1449–1456). Tatsächlich haben diese Autoren nicht erkannt, dass die Verbindung, die sie hergestellt haben, in der Tat 2-O- sowie 3-O-desulfatiertes Heparin war. Kurz gesagt, bei dem Verfahren von Rej et al. und bei dem Verfahren von Jaseja et al. geht man zunächst von einer Heparinlösung aus, deren pH-Wert mit 0,1 N Natriumhydroxid eingestellt wurde und die dann lyophilisiert wird, um einen 2-O-desulfatierten α-L-Iduronsäurerest (und einen 3-O-desulfatierten Glucosaminrest) zu erhalten. Die gerinnungshemmende Wirksamkeit von Heparin wurde untersucht; es gab jedoch keinen Hinweis auf eine Hemmung der Reaktionsfähigkeit der Luftwege oder eine Behandlung asthmatischer Zustände. Ebenso haben Rej et al. und Jaseja et al. keine Wirksamkeit für 2-O-, 3-O-desulfatiertes Heparin offenbart, und sie haben ferner keine wirksamen Dosen für die Verbindung für irgendeinen Zweck offenbart.
  • INHALT DER ERFINDUNG
  • Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Verwendung von O-desulfatiertem Heparin mit O-Desulfatierung mindestens in der 2-O- und der 3-O-Stellung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verringerung bzw. Hemmung einer Hyperreaktivität der Luftwege in Form einer asthmatischen Reaktion bei Säugetieren bereitzustellen. Es ist eine Aufgabe der Erfindung, die Verwendung von O-desulfatiertem Heparin bei der Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Wirksamkeit des M2-Muskarinrezeptors bei einem asthmatischen Säugetier bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Verwendung von O-desulfatiertem Heparin bei der Herstellung eines Medikaments zur Reduktion bzw. Prävention der Bronchokonstriktion bei einem Säugetier bereitzustellen. Es ist noch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Verwendung von O-desulfatiertem Heparin bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der komplementvermittelten Hämolyse bei einem Säugetier bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Verwendung von O-desulfatiertem Heparin mit O-Desulfatierung mindestens in der 2-O- und der 3-O-Stellung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verringerung bzw. Hemmung der Proliferation der glatten Muskulatur der Luftwege bei einem Säugetier bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, solche Verwendungsmöglichkeiten bereitzustellen, die im Wesentlichen keine gerinnungshemmende Wirksamkeit herbeiführen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt eine schematische Darstellung cholinerger neuraler Bahnen und Muskarinrezeptor-Untertypen der afferenten sensorischen und efferenten motorischen Äste der Vagusinnervation der Lungenluftwege. Folgende Abkürzungen werden verwendet: ACh = Acetylcholin; N = Nikotinrezeptor; M1, M1 = Muskarinrezeptor; M2, M2 = Muskarinrezeptor; M3, M3 = Muskarinrezeptor; die Pfeile deuten die Neurotransmission an.
  • 2 zeigt eine chemische Formel der Pentasaccharidbindungssequenz von natürlich vorkommendem Heparin.
  • 3 zeigt eine graphische Darstellung der Hemmung einer vagusbedingten Bronchokonstriktion durch Heparin und O-desulfatiertes Heparin bei sensibilisierten asthmatischen Meerschweinchen unter Ovalbumin-Challenge. Die leeren Säulen zeigen eine vagusbedingte Bronchokonstriktion ohne Behandlung. Die ausgefüllten Säulen zeigen den Einfluss der Behandlung mit Kochsalzlösung, vollständig gerinnungshemmendem Heparin (2.000 E/kg) oder O-desulfatiertem Heparin (91,2 mg/kg) auf eine vagusbedingte Bronchokonstriktion. Die Daten sind Mittelwerte, wobei die Standardabweichung durch vertikale Balken dargestellt ist, n = 5 für Kochsalzlösung, n = 4 für Heparin und n = 5 für O-desulfatiertes Heparin. *P < 0,05, bei Verwendung des paarweisen Student-t-Tests.
  • 4 zeigt die Hemmung einer vagusbedingten Bronchokonstriktion durch O-desulfatiertes Heparin bei sensibilisierten Meerschweinchen unter Ovalbumin-Challenge.
  • 5 zeigt eine graphische Darstellung des Einflusses von Heparin und O-desulfatiertem Heparin auf die Reaktion auf Pilocarpin bei Meerschweinchen unter Antigen-Challenge. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als Verhältnis vagusbedingter Bronchokonstriktion nach Pilocarpin zu vagusbedingter Bronchokonstriktion vor Pilocarpin. Jeder Punkt ist der Mittelwert von 4–6 Tieren, wobei die Standardabweichung durch vertikale Balken dargestellt ist. Pilocarpin (1–100 μg/kg i. v.) hat bei Kontrollmeerschweinchen die vagusbedingte Bronchokonstriktion signifikant gehemmt (leere Quadrate, P = 0,01). Nach der Antigen-Challenge war der Einfluss von Pilocarpin auf vagusbedingte Bronchokonstriktion aufgehoben (leere Dreiecke). Der Einfluss von Pilocarpin auf vagusbedingte Bronchokonstriktion wurde dosisabhängig wiederhergestellt durch Verabreichen von O-desulfatiertem Heparin (11,4 mg/kg, ausgefüllte Dreiecke; 22,8 mg/kg, ausgefüllte Kreise; 57,0 mg/kg, ausgefüllte Rauten; 91,2 mg/kg, ausgefüllte Quadrate). * Signifikant verschieden von der Kontrollgruppe; + signifikant verschieden von der Gruppe unter Antigen-Challenge (leere Dreiecke), bei Verwendung der Doppelvarianzanalyse für wiederholte Maßnahmen.
  • 6 zeigt eine graphische Darstellung des Einflusses von Serum auf die Proliferation glatter Muskelzellen der Luftwege. Die Zellen wurden mit Serum in Kontakt gebracht, die Zellen wurden in Abständen von 24 Stunden gezählt, und die Ergebnisse sind ausgedrückt als Zellzahl in jeder von vier Serumkonzentrationen in jedem 24-Stunden-Intervall. Folgende Serumkonzentrationen wurden verwendet: (A) 0,25% FBS (FBS = fetales Rinderserum); (B) 2,5% FBS; (C) 5,0% FBS und (D) 10,0% FBS. Jeder Punkt stellt den Mittelwert plus die Standardabweichung der Zellzahlen in mindestens 5 Mulden dar.
  • 7 zeigt ein Balkendiagramm des Einflusses von Heparin und O-desulfatiertem Heparin auf die glatten Muskelzellen der Luftwege. Die mit durchgehenden Linien gezeichneten Balken geben Heparin an, und die schraffierten Balken geben O-desulfatiertes Heparin an. Den Zellen werden folgende Konzentrationen zugegeben: (1) 0 μg/ml, (2) 2,0 μg/ml, (3) 20 μg/ml, (4) 200 μg/ml. Nachdem 62 Stunden mit der angegebenen Verbindung inkubiert wurde, wurden die Zellen gezählt. Jeder Balken stellt den Mittelwert plus die Standardabweichung bei den Zellen in mindestens 5 Mulden dar.
  • 8 zeigt die Spektren von Rinderheparin als unmodifiziertem Ausgangsmaterial.
  • 9 zeigt die Spektren von erfindungsgemäßem O-desulfatiertem Rinderheparin.
  • 10 zeigt die Spektren von Schweineheparin als unmodifiziertem Ausgangsmaterial.
  • 11 zeigt die Spektren von erfindungsgemäßem O-desulfatiertem Schweineheparin.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung wird besser verständlich anhand der folgenden ausführlichen Beschreibung spezifischer Ausführungsformen und der darin enthaltenen Beispiele und Figuren.
  • Das in den Ansprüchen verwendete Wort "ein" kann ein oder mehr bedeuten, je nach dem Kontext, in dem es verwendet wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von O-desulfatiertem Heparin mit O-Desulfatierung mindestens in der 2-O- und der 3-O-Stellung bei der Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung asthmatischer Reaktionen bereit. Diese Reaktionen können bei Patienten mit Intrinsic-Asthma, d. h. mit einer chronischen leichten Entzündung in den Luftwegen, die sich darüber hinaus in Reaktion auf einen Reizstoff zu einer Hyperreaktivität der Luftwege ausweiten kann, behandelt bzw. verhindert werden. Diese Reaktionen können auch behandelt bzw. verhindert werden bei Patienten mit Extrinsic-Asthma, d. h. mit einer chronischen Entzündung in den Luftwegen, die weiter reagiert mit einer Hyperreaktivität der Luftwege infolge einer Antigenexposition. Mit dem hierin verwendeten Begriff "Hyperreaktivität der Luftwege" oder "Überreaktionsfähigkeit der Luftwege" ist eine hyperakute Reaktion in den Luftwegen gemeint, die über der normalen Reaktion einer nichtasthmatischen Person auf einen Stimulus, d. h. ein Antigen bzw. einen Reizstoff, liegt. Diese Reaktion kann die erhöhte Freisetzung von Acetylcholin, den Zustrom von Entzündungszellen wie Eosinophilen und die damit einhergehende Freisetzung von positiv geladenen Proteinen (einschließlich Hauptbasisprotein, eosinophiler Peroxidase und eosinophilem kationischem Protein), Entzündung der Luftwege und Bronchokonstriktion einschließen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von O-desulfatiertem Heparin mit O-Desulfatierung mindestens in der 2-O- und der 3-O-Stellung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verringerung der asthmatischen Reaktion bei einem Säugetier bereit. Der Begriff "asthmatische Reaktion" schließt jede in Verbindung mit Asthma auftretende physiologische Reaktion in den Luftwegen ein, einschließlich einer Hyperreaktivität der Luftwege, einer Bronchokonstriktion, einer Desensibilisierung des M2-Muskarinrezeptors und einer Proliferation der glatten Muskelzellen der Luftwege.
  • Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von O-desulfatiertem Heparin mit O-Desulfatierung mindestens in der 2-O- und der 3-O-Stellung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verringerung der Hyperreaktivität der Luftwege in Form einer asthmatischen Reaktion bei einem Säugetier bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner die Verwendung von O-desulfatiertem Heparin mit O-Desulfatierung mindestens in der 2-O- und der 3-O-Stellung bei der Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Wirksamkeit eines desensibilisierten M2-Muskarinrezeptors bei einem asthmatischen Säugetier bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem die Verwendung von O-desulfatiertem Heparin mit O-Desulfatierung mindestens in der 2-O- und der 3-O-Stellung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verringerung der Bronchokonstriktion bei einem Säugetier bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner die Verwendung von O-desulfatiertem Heparin mit O-Desulfatierung mindestens in der 2-O- und der 3-O-Stellung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verringerung einer Proliferation der glatten Muskelzellen der Luftwege bei einem Säugetier bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner die Verwendung von O-desulfatiertem Heparin mit O-Desulfatierung mindestens in der 2-O- und der 3-O-Stellung bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung einer komplementvermittelten Hämolyse bei einem Säugetier bereit. Die Hemmung der komplementvermittelten Hämolyse kann die Verringerung der komplementvermittelten Hämolyse gegenüber einer komplementvermittelten Hämolyse ohne einen Inhibitor der komplementvermittelten Hämolyse umfassen.
  • Unter "O-desulfatiertem Heparin" ist zu verstehen, dass das Heparin soweit O-desulfatiert ist, dass es zu einer Verringerung der gerinnungshemmenden Wirksamkeit des Heparins gekommen ist. O-desulfatiertes Heparin schließt Heparin ein, das nach dem in Beispiel I beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, um wenigstens teilweise, vorzugsweise im Wesentlichen, in der 2-O- und der 3-O-Stellung desulfatiert zu sein. Vorzugsweise ist das O-desulfatierte Heparin mindestens etwa 10%, mehr bevorzugt mindestens etwa 25%, mehr bevorzugt mindestens etwa 40%, mehr bevorzugt mindestens etwa 50%, mehr bevorzugt mindestens etwa 60%, mehr bevorzugt mindestens etwa 75%, mehr bevorzugt mindestens etwa 80%, mehr bevorzugt mindestens etwa 90%, mehr bevorzugt mindestens etwa 95%, mehr bevorzugt mindestens etwa 97% und mehr bevorzugt mindestens etwa 98% oder 100% unabhängig voneinander jeweils in der 2-O- und der 3-O-Stellung desulfatiert, wie durch Disaccharidanalyse ermittelt wird. Der Grad der Desulfatierung muss nicht in jeder O-Stellung der gleiche sein. Der Grad der O-Desulfatierung kann nach bekannten Verfahren wie zum Beispiel der Disaccharidanalyse ermittelt werden. Die Desulfatierung in der 6-O-Stellung kann nach den derzeit zur Verfügung stehenden Verfahren nicht ermittelt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die 6-O-Stellung im Wesentlichen sulfatiert, wenngleich nicht festgestellt werden kann, ob ein Teil, insbesondere eine geringe Menge, der Sulfate während der Herstellung der bei der vorliegenden Erfindung verwende ten Verbindungen verloren gegangen ist (desulfatiert wurde). Es wird nicht erwartet, dass die Desulfatierung in der N-Stellung in nennenswertem Umfang unter den beschriebenen Bedingungen stattfindet. Ein Verfahren zur Herstellung von O-desulfatiertem Heparin wird in den Beispielen erläutert. O-desulfatiertes Heparin kann die Blockade des M2-Muskarinrezeptors, die zu einer übertriebenen Reaktionsfähigkeit der Luftwege in Form von Asthma beiträgt, wirksam reduzieren, aber ohne die gerinnungshemmenden Eigenschaften von unbehandeltem Heparin. Die Verabreichung von O-desulfatiertem Heparin beinhaltet auch, dass das O-desulfatierte Heparin sich in einem pharmazeutisch verwendbaren Zustand befindet, z. B. dass sein pH-Wert zum Verabreichen neutral genug ist, wie in der Technik bekannt ist. Ein Fachmann wird wissen, wie der pH-Wert einzustellen ist, um in einem akzeptablen Bereich zu liegen, und er wird einen pharmazeutisch verwendbaren Bereich kennen. Vorzugsweise liegt der pH-Wert zwischen etwa 6 und etwa 7 bei einem Aerosolpräparat und zwischen etwa 7 und etwa 7,5 für die intravenöse Verabreichung, um als akzeptabel zu gelten. Um einen alkalischen pH-Wert zu neutralisieren, wird die Lösung normalerweise mit großen Mengen Wasser ultrafiltriert, der pH-Wert wird mit einer ausgewählten Säure wie zum Beispiel Salzsäure wieder auf einen neutralen Wert gebracht, und die Lösung wird dann getrocknet, lyophilisiert oder vakuumdestilliert.
  • "O-desulfatiertes" Heparin kann O-desulfatiertes Heparin mit Modifikationen wie zum Beispiel einem verminderten Molekulargewicht oder einer Acetylierung, Deacetylierung, Oxidation und Decarboxylierung umfassen, solange es seine Fähigkeit behält, eine abnormale M2-Rezeptorfunktion wiederherzustellen und eine übertriebene Reaktivität der Luftwege in Form von Asthma zu hemmen. Das modifizierte O-desulfatierte Heparin kann angesichts der hier vorliegenden Lehre mit bekannten Verfahren problemlos auf diese Wirksamkeiten hin untersucht werden. Solche Modifikationen können entweder vor oder nach der teilweisen Desulfatierung vorgenommen werden, und Modifikationsverfahren sind in der Technik Standard. Es wurden mehrere Heparinmodifikationen mit niedrigem Molekulargewicht entwickelt (siehe Seite 581, Tabelle 27.1 in Heparin, Lane & Lindall). Das Molekulargewicht kann normalerweise im Bereich von etwa 2500 bis etwa 8100 liegen, und es kann auch O-desulfatiertes Heparin mit vermindertem Molekulargewicht verwendet werden, das seine die asthmatische Reaktion reduzierende Funktion beibehält. Heparinarten mit niedrigem Molekulargewicht können auch enzymatisch hergestellt werden, indem man Heparinase-Enzyme verwendet, um Heparin in kleinere Fragmente zu spalten. Ein solches O-desulfatiertes Heparin mit vermindertem Molekulargewicht kann normalerweise ein Molekulargewicht von etwa 1000 bis etwa 8000 haben.
  • Zum Beispiel ist die Periodatoxidation (US-Patent Nr. 5,250,519 von Conrad und Yuchuan) ein bekanntes Oxidationsverfahren, bei dem ein oxidiertes Heparin mit einer verminderten gerinnungshemmenden Wirksamkeit entsteht. Weitere Oxidationsverfahren, die in der Technik ebenfalls wohlbekannt sind, können verwendet werden. Außerdem ist zum Beispiel ebenfalls bekannt, dass die Decarboxylierung von Heparin die gerinnungshemmende Wirksamkeit herabsetzt, und solche Verfahren sind in der Technik Standard. Ferner ist es in der Technik bekannt, dass Heparinarten mit niedrigem Molekulargewicht eine verminderte gerinnungshemmende Wirksamkeit haben, und sie werden nach Standardverfahren hergestellt. Zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogenes modifiziertes O-desulfatiertes Heparin kann also zum Beispiel periodatoxidiertes O-desulfatiertes Heparin, decarboxyliertes O-desulfatiertes Heparin, acetyliertes O-desulfatiertes Heparin, deacetyliertes O-desulfatiertes Heparin, deacetyliertes und oxidiertes O-desulfatiertes Heparin, deacetyliertes O-desulfatiertes Heparin, deacetyliertes und oxidiertes O-desulfatiertes Heparin und O-desulfatiertes Heparin mit niedrigem Molekulargewicht umfassen. Viele andere Modifikationen werden angesichts der hier dargelegten Lehre für den Fachmann offensichtlich sein.
  • Unter dem "Verringern" oder "Verstärken" einer Reaktion oder Wirksamkeit ist zu verstehen, dass die Reaktion oder Wirksamkeit im Vergleich zu dem Grad der Reaktion in dem Patienten vor Verabreichung des O-desulfatierten Heparins verringert oder verstärkt ist. Normalerweise kann eine solche Verringerung oder Verstärkung von dem Patienten leicht festgestellt werden, indem er eine Verringerung der Symptome der asthmatischen Reaktion erfährt, z. B. eine Erleichterung der Atmung. Die "Verringerung" oder "Verstärkung" einer Reaktion oder Wirksamkeit bedeutet auch die Verringerung oder Verstärkung einer Reaktion im Vergleich zu einem typischen Grad der Reaktion für diesen Patienten ohne Behandlung. Außerdem kann eine Verstärkung oder Verringerung nach der hierin dargelegten Lehre und nach in der Technik üblichen Verfahren ohne weiteres festgestellt werden, indem ein relevanter Parameter vor der Verabreichung gemessen wird und dann nach der Verabreichung erneut gemessen wird. Außerdem können zunächst Standarddosen ermittelt werden, sogar für einen bestimmten Patienten, und können dann für eine Routinebehandlung routinemäßig verabreicht werden.
  • Eine die asthmatische Reaktion reduzierende Menge an O-desulfatiertem Heparin ist eine Menge, die bei jeder Reaktion einer asthmatischen Episode, wie zum Beispiel einer Hyperreaktivität der Luftwege, einer Bronchokonstriktion und einer Proliferation der glatten Muskelzellen der Luftwege eine Reduktion bewirkt. Eine "die Hyperreaktivität der Luftwege reduzierende Menge" ist eine Menge, die eine Reduktion jeglicher Manifestation einer Hyperreaktivität der Luftwege bewirkt, zum Beispiel eine Menge, die bei Asthmatikern eine Zunahme der beeinträchtigten M2-Rezeptorwirksamkeit bewirkt, eine Menge, die eine Entzündung abschwächt, und/oder eine Menge, die eine Bronchokonstriktion vermindert. Eine die Wirksamkeit eines desensibilisierten M2-Muskarinrezeptors erhöhende Menge ist eine Menge, die bei einem Asthmatiker eine Zunahme der Wirksamkeit eines desensibilisierten M2-Muskarinrezeptors bewirkt. Eine "die Bronchokonstriktion reduzierende Menge" ist eine Menge, die bei einem Asthmatiker die Bronchokonstriktionsreaktion vermindert. Eine "die Proliferation der glatten Muskelzellen der Luftwege reduzierende Menge" ist eine Menge, die bei einer asthmatischen Reaktion die Proliferation der glatten Muskelzellen der Luftwege reduziert. Eine "die komplementvermittelte Hämolyse hemmende Menge" ist eine Menge, die die komplementvermittelte Hämolyse bei einem Patienten, insbesondere bei einem Asthmapatienten, reduziert oder hemmt. Eine wirksame Dosis ist eine Menge, die ausreicht, um die positive Ladung auf den bei der Hyperreaktivität der Luftwege in die Luftwege freigesetzten positiv geladenen Proteinen zu binden und somit zu neutralisieren. Eine wirksame Menge kann bei jeder einzelnen Person verschieden sein und kann auf die Schwere der Reaktion zugeschnitten sein. Zum Beispiel kann man bei einer schwereren Reaktion eine höhere Dosis verabreichen und bei einer weniger schweren Reaktion eine niedrigere Dosis. Außerdem kann die Verabreichung mit derselben oder einer angepassten Menge wiederholt werden, wenn mit der Anfangsdosis noch nicht genügend Linderung erreicht wird. Es kann also zunächst eine vorsichtige Dosis verabreicht werden, und wenn dies zu keiner Linderung führt, kann eine weitere Dosis (bzw. weitere Dosen) nach Bedarf verabreicht werden, um Linderung zu erhalten.
  • Zum Beispiel kann eine wirksame Dosis eine Dosis sein, die größer ist als etwa 1 mg/kg, und vorzugsweise größer als etwa 5 mg/kg, mehr bevorzugt größer als etwa 10 mg/kg, und ferner beträgt die wirksame Dosis vorzugsweise weniger als etwa 100 mg/kg und vorzugsweise weniger als etwa 70 mg/kg. Ein bevorzugter Dosisbereich kann von etwa 1 mg/kg bis etwa 70 mg/kg reichen. Ein weiterer bevorzugter Dosisbereich kann von etwa 50 mg bis etwa 500 mg reichen. Für einen durchschnittlichen Erwachsenen kann also eine typische Minimaldosis kann etwa 50 mg und eine typische Maximaldosis etwa 5,0 g O-desulfatiertes Heparin umfassen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner die Verwendung von O-desulfatiertem Heparin mit O-Desulfatierung mindestens in der 2-O- und der 3-O-Stellung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung einer Hyperreaktivität der Luftwege bei einem Säugetier bereit. Die Erfindung stellt außerdem die Verwendung von O-desulfatiertem Heparin mit O-Desulfatierung mindestens in der 2-O- und der 3-O-Stellung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung der Bronchokonstriktion bei einem Säugetier bereit. Ferner stellt die Erfindung die Verwendung von O-desulfatiertem Heparin mit O-Desulfatierung mindestens in der 2-O- und der 3-O-Stellung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung einer Proliferation der glatten Muskelzellen der Luftwege bei einem Säugetier bereit.
  • Unter "Verhinderung" ist zu verstehen, dass die asthmatische Reaktion kein akutes Niveau erreicht und im Wesentlichen nicht nachweisbar ist. Zur Prävention kann das Medikament mit dem O-desulfatierten Heparin vor einer Antigenexposition verabreicht werden, beispielsweise vor einem vorhergesagten Kontakt mit einem bekannten Antigen. Außerdem kann das Medikament mit dem O-desulfatierten Heparin routinemäßig verabreicht werden, um eine Hyperreaktivität der Luftwege und/oder eine Proliferation der glatten Muskelzellen der Luftwege nachhaltig zu verhindern. Asthma eignet sich gut zur Prävention einer Hyperreaktivität der Luftwege und/oder einer Bronchokonstriktion wegen des konstant niedrigen Entzündungsgrades. Bei dieser Prävention werden positive Ladungen in den Luftwegen durch das negativ geladene O-desulfatierte Heparin nachhaltig gebunden.
  • Die Verwendungsmöglichkeiten dieser Erfindung zur Prävention umfassen vorzugsweise eine konstante Unterdrückung der asthmatischen Reaktion, was durch eine wiederholte, routinemäßige Verabreichung des Medikaments mit dem O-desulfatierten Heparin erreicht werden kann. Bei einer wiederholten, routinemäßigen Verabreichung kann eine optimale Dosis leicht festgestellt werden, indem man die Dosis verändert, bis die optimale Prävention erreicht ist. Vorzugsweise wird die Dosis etwa 2–4 mal pro Tag verabreicht.
  • Außerdem kann nach einer Exposition durch große Mengen eines Antigens oder Reizstoffs, wenn es schließlich zu einer Reaktion kommt, eine zusätzliche Dosis des Medikaments mit O-desulfatiertem Heparin verabreicht werden. Wenn darüber hinaus eine Exposition durch eine große Antigenmenge im voraus bekannt ist, kann eine zusätzliche Dosis des Medikaments mit O-desulfatiertem Heparin verabreicht werden, um eine Reaktion zu verhindern. Weil die zur Reduktion oder Prävention einer Reaktion auf ein Antigen benötigte Dosis des Medikaments mit O-desulfatiertem Heparin in direktem Zusammenhang steht mit der Menge an positiver Ladung in den Luftwegen, die eingeschleust wurde durch die Migration von Zellen mit positiv geladenen Proteinen infolge der Exposition durch das Antigen oder den Reizstoff und durch das negativ geladene Heparin gebunden wird, kann man leicht feststellen, wann zusätzliche Dosen notwendig sein können, und eine entsprechende Menge bestimmen. Eine typische Dosis für eine wiederholte präventive Verabreichung kann im Bereich von etwa 0,5 mg/kg bis etwa 70 mg/kg liegen, wobei eine bevorzugte Dosis im Bereich von etwa 5 mg/kg bis etwa 7 mg/kg liegt. Diese bevorzugte Dosis kann so oft wie notwendig gegeben werden, um die Reaktion zu verhindern.
  • O-desulfatiertes Heparin kann nach einem Verfahren hergestellt werden, bei dem eine reduziertes Heparin enthaltende Lösung auf einen pH-Wert von 13 oder höher alkalisiert wird und man eine Desulfatierung stattfinden lässt. Die Desulfatierung kann schneller erreicht werden, wenn man die alkalische Heparinlösung lyophilisiert, trocknet oder vakuumdestilliert. Der Grad der Desulfatierung kann während des Desulfatierungsprozesses ermittelt werden, indem man eine Probe zieht und den Grad der Desulfatierung der Probe nach Standardverfahren wie zum Beispiel eine Disaccharidanalyse ermittelt. Die alkalische Lösung sollte vor Verabreichung neutralisiert werden, was erreicht werden kann durch Ultrafiltration mit großen Mengen Wasser, Einstellen des pH-Werts auf einen neutralen pH-Wert nach Standardverfahren, wie zum Beispiel Zugabe von Salzsäure, und durch anschließende Lyophilisierung, Trocknung oder Vakuumdestillation. Ein Beispiel des vorliegenden Verfahrens ist in Beispiel I angegeben, in dem der raschere Desulfatierungsprozess gezeigt wird, der durch Lyophilisieren der alkalischen Heparinlösung erreicht wird. Alternativ kann die alkalische Heparinlösung getrocknet oder vakuumdestilliert werden oder einfach stehengelassen werden, damit die Desulfatierung fortschreitet.
  • Die Heparinlösung kann eine etwa 1–10%ige Heparinkonzentration haben. Falls gewünscht, kann Heparin fakultativ zum Steuern des Molekulargewichts (zum Reduzieren des fragmentierten Anteils des Heparins) mit einem Reduktionsmittel wie zum Beispiel unter anderem Natriumborhydrid, katalytischem Wasserstoff und Lithiumaluminiumhydrid versetzt werden, das auf die herkömmliche Art des leichten Alkalisierens der Lösung auf pH 8–9 mit Natriumbicarbonat (Conrad et al., US-Patent Nr. 5,250,519 vom 5. Oktober 1993) zugesetzt werden kann, aber das Reduktionsmittel kann, falls es verwendet wird, vorzugsweise zugegeben werden, ohne die Lösung leicht zu alkalisieren (d. h. ohne Natriumbicarbonat). Die Lösung kann mit dem Reduktionsmittel für etwa 12–24 Stunden bei etwa 15–30°C, oder mehr bevorzugt bei 20–25°C inkubiert werden. Die Inkubationszeit muss nur so lang sein, dass die Reduktion von Heparin stattfinden kann, wie zum Beispiel von etwa 4 Stunden bis über mehrere Tage, wie zum Beispiel mehr als 60 Stunden. Nach dieser Inkubation wird eine Base wie zum Beispiel Natriumhydroxid zugegeben, um den pH-Wert auf 13 oder höher anzuheben, vorzugsweise auf eine Konzentration von etwa 0,25 bis 0,50 M. Diese alkalische Lösung kann dann getrocknet, lyophilisiert oder vakuumdestilliert werden. Diese Verfahren können den Prozess der O-Desulfatierung beschleunigen; alternativ kann man die O-Desulfatierung der Lösung ohne diese Verfahren fortschreiten lassen. Unabhängig von dem speziell verwendeten Verfahren wird das Heparin dann vor Verabreichung auf einen pharmazeutisch verwendbaren pH-Wert neutralisiert. Normalerweise wird das O-desulfatierte Heparin durch Ultrafiltration mit großen Mengen Wasser neutralisiert, und ggf. wird der pH-Wert durch Standardverfahren wie zum Beispiel die Zugabe von Salzsäure eingestellt, und das O-desulfatierte Heparin wird dann getrocknet, lyophilisiert oder vakuumdestilliert. Die hierin verwendeten Verfahren zur Herstellung von O-desulfatiertem Heparin werden offenbart in WO 95/21198, veröffentlicht am 10. August 1995.
  • Die vorliegenden Medikamente können ferner das O-desulfatierte Heparin oder eine Modifikation desselben zur Verabreichung in einem physiologisch verwendbaren Träger umfassen. Es kann jeder physiologisch verwendbare Träger verwendet werden, wie zum Beispiel physiologisch gepufferte Kochsalzlösung, normale Kochsalzlösung und destilliertes Wasser. Unter "pharmazeutisch verwendbar" ist ein Material zu verstehen, das nicht biologisch oder anderweitig unerwünscht ist, d. h. das Material kann einer Person zusammen mit dem O-desulfatierten Heparin verabreicht werden, ohne unerwünschte biologische Wirkungen zu verursachen oder auf schädliche Weise mit einem der anderen Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzung, in der es enthalten ist, in Wechselwirkung zu treten.
  • Das Medikament mit O-desulfatiertem Heparin kann in Aerosolteilchen, durch Inhalation, durch Injektion in die Luftröhre, durch intravenöse (i. v.) Injektion, durch peritoneale Injektion oder oral verabreicht werden. Solche Arten der Verabreichung können einen physiologisch verwendbaren Träger und eine wirksame Menge von O-desulfatiertem Heparin oder einem Analogon desselben umfassen. Aerosolteilchen können im Wesentlichen aus Teilchen von weniger als 10 μm und vorzugsweise weniger als 5 μm bestehen. Solche Aerosole können durch die erhältlichen allgemein üblichen Düsenaerosol- oder Ultraschallzerstäubersysteme oder durch die in der Technik bekannten Trockenpulverinhalationssysteme bereitgestellt werden.
  • Je nach der beabsichtigten Verabreichungsart können die pharmazeutischen Zusammensetzungen als feste, halbfeste oder flüssige Darreichungsformen vorliegen, zum Beispiel als trockenes Pulver oder als Flüssigkeit zur Aerosolinhalation. Die Zusammensetzungen werden, wie oben angegeben, eine wirksame Menge des ausgewählten Arzneimittels in Kombination mit einem pharmazeutisch verwendbaren Träger enthalten und können außerdem noch andere Heilmittel, Arzneimittel, Träger, Hilfsstoffe, Verdünnungsmittel etc. enthalten. Verbindungen können z. B. als Komplex mit kationischen Liposomen oder gekapselt in anionischen Liposomen verabreicht werden.
  • Flüssige pharmazeutisch verwendbare Zusammensetzungen können zum Beispiel hergestellt werden durch Lösen, Dispergieren etc. einer hierin beschriebenen wirksamen Verbindung und optionaler pharmazeutischer Hilfsstoffe in einem Träger wie zum Beispiel Wasser, Kochsalzlösung, wässrige Dextrose, Gylzerin, Ethanol und dergleichen, um dadurch eine Lösung oder Suspension zu bilden. Falls gewünscht kann die zu verabreichende pharmazeutische Zusammensetzung auch geringe Mengen nichttoxischer Hilfsstoffe wie Netzmittel oder Emulgatoren, pH-Puffer und dergleichen enthalten, zum Beispiel Natriumacetat, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminnatriumacetat, Triethanola minoleat, etc.. Flüssige Zusammensetzungen können zur Verabreichung aerosolisiert werden. Die eigentlichen Verfahren zur Herstellung solcher Darreichungsformen sind dem Fachmann bekannt oder werden für ihn offensichtlich sein; siehe zum Beispiel Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin (Hrsg.), Mack Publishing Co., Easton, PA.
  • Die ggf. verwendete parenterale Verabreichung ist allgemein gekennzeichnet durch Injektion. Injektionsmittel können in herkömmlichen Formen hergestellt werden, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, als feste Formen, die vor der Injektion in einer Flüssigkeit gelöst oder suspendiert werden können, oder als Emulsionen. Bei einer unlängst in Betracht gezogenen Methode der parenteralen Verabreichung wird ein System mit langsamer oder verzögerter Freisetzung verwendet, so dass eine konstante Höhe der Dosis aufrechterhalten wird. Siehe z. B. das US-Patent Nr. 3,710,795.
  • Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher beschrieben, die nur als Veranschaulichung gedacht sind, da zahlreiche darin enthaltene Modifikationen und Variationen für den Fachmann offensichtlich sein werden.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL I
  • O-Desulfatierung von Heparin
  • Eine 5%ige wässrige Lösung von Natriumheparin der Schweinedarmschleimhaut (Scientific Protein Labs, Waunakee, WI) wurde hergestellt durch Zugabe von 500 g Heparin zu 10 L deionisiertem Wasser. Natriumborhydrid wurde auf eine Endkonzentration von 1% zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei 25°C inkubiert. Natriumhydroxid wurde dann auf eine Endkonzentration von 0,4 M zugegeben (pH-Wert mindestens 13), und die Mischung wurde eingefroren und zur Trockne lyophilisiert. Überschüssiges Natriumborhydrid und Natriumhydroxid wurden durch Ultrafiltration entfernt. Das Endprodukt wurde auf pH 7,0 eingestellt, durch Zugabe von drei Volumenanteilen von kaltem Ethanol ausgefällt und getrocknet. Das nach diesem Verfahren hergestellte O-desulfatierte Heparin war ein feinkristallines, leicht gebrochen weißes Pulver mit weniger als 10 USP-Einheiten/mg gerinnungshemmender Wirksamkeit und weniger als 10 E/mg gerinnungshemmender Anti-Xa-Wirksamkeit.
  • Die Synthese von O-desulfatiertem Heparin durch Reduzieren von Heparin in Lösung und Trocknen, Lyophilisieren oder Vakuumdestillieren der reduzierten Heparinlösung kann die folgenden Modifikationen umfassen. Man kann das Ausgangsheparin zum Beispiel in Wasser oder ein sonstiges Lösemittel geben, solange die Lösung nicht stark alkalisch ist. Eine typische Konzentration der Heparinlösung kann von 1 bis 10 Prozent Heparin betragen. Das bei der Umsetzung verwendete Heparin kann man aus zahlreichen Quellen erhalten, die in der Technik bekannt sind, zum Beispiel aus Schweinedarm oder Rinderlunge. Man kann Heparin verwenden, das auf eine von vielen verschiedenen dem Fachmann bekannten Arten modifiziert wurde, wie sie oben erläutert wurden.
  • Die reduzierte Heparinlösung kann getrocknet und lyophilisiert werden oder das Lösemittel kann vakuumdestilliert werden. Die Lyophilisierung oder Vakuumdestillation des Lösemittels wird bevorzugt. Im Allgemeinen wird die Lyophilisierung verwendet. Das Heparin kann reduziert werden, indem es mit einem Reduktionsmittel wie zum Beispiel Natriumborhydrid, katalytischem Wasserstoff oder Lithiumaluminiumhydrid inkubiert wird. Eine bevorzugte Reduktion von Heparin wird durchgeführt, indem das Heparin mit Natriumborhydrid inkubiert wird. Im Allgemeinen können etwa 10 Gramm NaBH4 pro Liter Lösung verwendet werden, aber diese Menge kann verändert werden, solange die Reduktion des Heparins stattfindet. Außerdem können andere bekannte Reduktionsmittel verwendet werden, sind aber nicht notwendig zum Erzeugen eines für die Behandlung wirksamen O-desulfatierten Heparins. Die Inkubation kann über einen weiten Temperaturbereich erfolgen, wobei darauf geachtet wird, dass die Temperatur nicht so hoch ist, dass das Heparin karamellisiert. Ein empfohlener Temperaturbereich ist etwa 15–30°C oder sogar etwa 20–25°C. Die Dauer der Inkubation kann ebenfalls über einen weiten Bereich schwanken, solange sie ausreicht, damit es zur Reduktion kommt. Zum Beispiel können mehrere Stunden bis über Nacht (d. h. etwa 4 bis 12 Stunden) ausreichend sein. Die Zeit kann jedoch auf mehrere Tage ausgedehnt werden, z. B. auf mehr als etwa 60 Stunden.
  • Außerdem kann das Syntheseverfahren angepasst werden, indem der pH-Wert der reduzierten Lösung auf 13 oder höher angehoben wird, indem der reduzierten Heparinlösung eine Base zugesetzt wird, die den pH-Wert auf 13 oder höher anheben kann. Der pH-Wert kann angehoben werden durch Zugabe einer Anzahl von Mitteln einschließlich Hydroxiden wie Natrium-, Kalium- oder Bariumhydroxid. Ein bevorzugtes Mittel ist Natriumhydroxid (NaOH). Selbst wenn ein pH-Wert von 13 oder höher erreicht wurde, kann es von Vorteil sein, die Konzentration der Base weiter zu erhöhen. Zum Beispiel sollte NaOH vorzugsweise auf eine Konzentration von etwa 0,25 M bis etwa 0,5 M NaOH zugesetzt werden. Diese alkalische Lösung wird dann getrocknet, lyophilisiert oder vakuumdestilliert.
  • BEISPIEL II
  • Analyse des Grades der 2-O- und 3-O-Desulfatierung von O-desulfatiertem Heparin
  • Die folgenden zwei Sätze von Disaccharidanalysen an Proben aus Rindern und aus Schweinen wurden durchgeführt, die entsprechenden HPLC-Spektren der Disaccharidanalyse wurden erzeugt und die quantitative Integration und Identifizierung der HPLC-Peaks wurde vorgenommen, um den Grad der Desulfatierung der vier Heparinproben zu ermitteln.
  • Die Disaccharidanalyse wurde durchgeführt nach dem Verfahren von Guo und Conrad (Guo, Y., und H. E. Conrad. 1988. Analysis of oligosaccharides from heparin by reversed-phase ionpairing high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 178: 54–62). Bei diesem Verfahren werden N-acetyl-D-glucosaminreste mit Hydrazin deacyliert. Das Heparin wird dann durch Kontakt mit salpetriger Säure bei pH 4 deaminiert und depolymerisiert, um die Bindungen zwischen D-Glucosamin und Uronsäuren zu spalten, und dann bei pH 1,5, um die Bindungen zwischen D-Glucosamin-N-sulfat und Uronsäuren zu spalten. Bei beiden Reaktionen bleiben die O-Sulfate intakt, und Glucosamin oder Glucosamin-N-sulfat werden zu Anhydromannose umgewandelt, die mit NaB[3H4] radioaktiv markiert wird, wobei Anhydromannose zu Anhydromannitol umgewandelt wird. Radioaktiv markierte Disaccharide werden dann durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie mit Ionenpaarbildung und umgekehrten Phasen getrennt.
  • Der erste Satz von Analysen wurde an Rinderlungenheparin durchgeführt, wobei Folgendes verglichen wurde: a) das Ausgangsmaterial, Rinderlungenheparin von der Sigma Chemical Corp. (8) und b) das Produkt, O-desulfatiertes Rinderlungenheparin, das hergestellt wurde durch Zugabe von 160 mg des Rinderlungenheparins vom Beginn zu 40 ml deionisiertem Wasser, so dass man eine 0,4%ige Lösung erhielt, Einstellen der Lösung auf pH 13 oder größer mit Natriumhydroxid, Einfrieren und Lyophilisieren des Materials gemäß Beispiel I (9).
  • Die Ergebnisse des ersten Vergleichs zeigen, dass das erste Produkt, O-desulfatiertes Rinderlungenheparin, verglichen mit dem ersten Ausgangsmaterial etwa 97,6% 2-O-desulfatiert und etwa 99% 3-O-desulfatiert ist. Die Desulfatierung in der 2-O- Stellung lässt sich nachweisen, weil bei dem Ausgangsmaterial der ISM-Peak bei 10,7 min eine Fläche von 104.517 cpm hat, und der ISMS-Peak bei 49,65 min eine Fläche von 207.919 cpm hat, während das Produkt einen vernachlässigbaren ISM-Peak und einen ISMS-Peak bei 49,75 min von 7.461 cpm hat, was eine etwa 97,6%ige Reduzierung der 2-O-Sulfatgruppen darstellt. Die Desulfatierung in der 3-O-Stellung kann nachgewiesen werden, weil bei dem Ausgangsmaterial der GMS2-Peak bei 47,85 min eine Fläche von 10.461 cpm hat, während das Produkt einen vernachlässigbaren GMS2-Peak hat, was eine etwa 99%ige Reduzierung der 3-O-Sulfatgruppen darstellt. (Siehe 8 und 9). Das erste Produkt wird immer noch im Vergleich zu dem Ausgangsmaterial in der 6-O-Stellung im Wesentlichen sulfatiert sein, wie aus einem großen IMS-Peak bei dem ersten Produkt hervorgeht.
  • Der zweite Satz von Analysen wurde an Heparin aus Schweineschleimhaut durchgeführt, wobei Folgendes verglichen wurde: a) das Ausgangsmaterial, Heparin aus Schweineschleimhaut von der Sigma Chemical Corp. (10) und b) das Produkt, O-desulfatiertes Heparin aus Schweineschleimhaut, das hergestellt wurde durch Zugabe von 160 mg des Heparins aus Schweineschleimhaut vom Beginn zu 40 ml deionisiertem Wasser, so dass man eine 0,4%ige Lösung erhielt; Einstellen der Lösung auf pH 13 oder größer mit Natriumhydroxid; Einfrieren und Lyophilisieren des Materials gemäß Beispiel I (11).
  • Die Ergebnisse des zweiten Vergleichs zeigen, dass das zweite Produkt, O-desulfatiertes Heparin aus Schweineschleimhaut, im Vergleich zu dem zweiten Ausgangsmaterial etwa 97,1% 2-O-desulfatiert und etwa 99% 3-O-desulfatiert ist. Die Desulfatierung in der 2-O-Stellung lässt sich nachweisen, weil bei dem Ausgangsmaterial der ISM-Peak bei 14,85 min eine Fläche von 50.298 cpm hat, und der ISMS-Peak bei 51,45 min eine Fläche von 249.088 cpm hat, während das Produkt einen vernachlässigbaren ISM-Peak und einen ISMS-Peak bei 52,15 min von 8.471 cpm hat, was eine etwa 97,1%ige Reduzierung der 2-O-Sulfatgruppen darstellt. Die Desulfatierung in der 3-O-Stellung kann nachgewiesen werden, weil bei dem Ausgangsmaterial der GMS2-Peak bei 50,35 min eine Fläche von 17.082 cpm hat, während das Produkt einen vernachlässigbaren GMS2-Peak hat, was eine etwa 99%ige Reduzierung der 3-O-Sulfatgruppen darstellt. Das zweite Produkt war immer noch im Vergleich zu dem Ausgangsmaterial in der 6-O-Stellung im Wesentlichen sulfatiert, wie aus einem großen IMS-Peak bei dem zweiten Produkt hervorgeht.
  • BEISPIEL III
  • Behandlung einer asthmatischen Hyperreaktivität der Luftwege mit O-desulfatiertem Heparin
  • In der Lunge wird die Freisetzung von Acetylcholin aus den Vagusnerven durch inhibitorische Muskarin-Autorezeptoren auf den postganglionischen Nerven gesteuert, wie in 1 gezeigt. Diese M2-Autorezeptoren steuern die Freisetzung von Acetylcholin durch negative Rückkopplung. Diese Steuerung durch negative Rückkopplung lässt sich in vivo nachweisen durch Messen der vagusbedingten Bronchokonstriktion in Gegenwart des selektiven M2-Muskarinagonisten Pilocarpin. Die Stimulation der neuronalen M2-Rezeptoren mit Pilocarpin vermindert die vagusbedingte Bronchokonstriktion sogar um 70–80% (A. D. Fryer, et al., British Journal of Pharmacology (1984) 83: 973–978). Der Funktionsverlust dieser M2-Rezeptoren ist gekennzeichnet durch eine Überreaktionsfähigkeit der Luftwege auf die elektrische Stimulation des Vagusnervs und durch die Tatsache, dass Pilocarpin die vagusbedingte Bronchokonstriktion nicht unterbinden kann. Die Wiederherstellung der M2-Rezeptorfunktion geht dagegen einher mit einem Verlust der Überreaktionsfähigkeit der Luftwege und einer Wiederherstellung der Fähigkeit von Pilocarpin, eine vagusbedingte Bronchokonstriktion zu unterbinden. Dies lässt sich bei einem Meerschweinchenmodell von allergenbedingtem Asthma nachweisen, wo der Verlust der M2-Rezeptorfunktion durch Verabreichen von Heparin wiederhergestellt werden kann (A. D. Fryer, et al., Journal of Clinical Investigation (1992) 90: 2290–2298).
  • Speziellen, von Pathogenen freien Meerschweinchen (Dunkin Hartley, 200–250 g) wurde intraperitoneal (ip) entweder Kochsalzlösung (Kontrolle) oder 10 mg/kg Ovalbumin jeden zweiten Tag für drei Injektionen injiziert. Drei Wochen nach der ersten Injektion wurden die mit Ovalbumin sensibilisierten Meerschweinchen (nicht aber die, denen Kochsalzlösung injiziert wurde) für 5 Minuten an jedem von vier aufeinander folgenden Tagen mit einem Aerosol mit 5% Ovalbumin behandelt. Nur am Tag 1 (als die akuten Reaktionen auf die Ovalbumin-Challenge am größten waren) wurde 60 Minuten vor der Challenge Pyrilamin (1 mg/kg i. v.) verabreicht. Die Tiere waren in Käfigen untergebracht, die während dieser ganzen Zeit unter Laminarströmungshauben gehalten wurden.
  • Vierundzwanzig Stunden nach der letzten Aerosol-Challenge wurden die Tiere mit Urethan (1,5 g/kg ip) narkotisiert. Zur Verabreichung der Arzneimittel wurde in beide äußeren Jugularvenen eine Kanüle gelegt. Am Beginn jedes Experiments wurde Guanethidin (10 mg/kg i. v.) gegeben, um die Freisetzung von Noradrenalin aus den Sympathikusnerven zu verhindern. Beide Vagusnerven wurden im Hals durchgeschnitten und auf isolierte Elektroden gelegt, die in flüssiges Paraffin eingetaucht waren. Die Elektroden waren mit einem Stimulator vom Typ Grass SD9 verbunden. Mit Hilfe einer Heizdecke wurde die Körpertemperatur auf 37°C gehalten. In die Luftröhre wurde eine Kanüle gelegt, und die Tiere wurden mit Suxamethonium (mit 10 μg/kg/min infundiert) paralysiert und mit einem Harvard-Tierbeatmungsgerät mit Überdruck und konstantem Volumen künstlich beatmet. Der Lungenaufblasdruck (Ppi) wurde an der Luftröhre mit einem Druckwandler der Marke Spectramed gemes sen. Der Durchsatz wurde mit einem Pneumotachometer der Marke Fleish mit einem Differenzdruckwandler der Marke Grass gemessen, und dieses Signal wurde integriert, um das Atemvolumen zu messen. In eine Halsschlagader wurde eine Kanüle gelegt, um den Blutdruck mit einem Wandler der Marke Spektramed zu messen, und die Herzfrequenz wurde mit einem Tachographen vom Blutdruck abgeleitet. Alle Signale wurden auf einem Polygraphen der Marke Grass aufgezeichnet. pO2 und pCO2 wurden mit Hilfe von Arterienblutproben gemessen, die am Beginn und Ende jedes Experiments gezogen wurden.
  • Ein Überdruck von 100–120 mm H2O war für eine ausreichende Beatmung der Tiere notwendig. Bei konstantem Durchsatz und Volumen wurde die Bronchokonstriktion als Anstieg im Ppi über dem Basisaufblasdruck gemessen. Das Ppi-Signal wurde in den Eingang des Vorverstärkers eines zweiten Kanals auf dem Polygraphen eingespeist, und der Basis-Ppi wurde elektrisch subtrahiert. Ppi wurde also auf einem Kanal aufgezeichnet, und der Anstieg im Ppi wurde auf einem separaten Kanal mit einer höheren Empfindlichkeit aufgezeichnet, so dass es möglich war, einen Ppi-Anstieg von nur 2 mm H2O über dem Basisniveau genau zu messen.
  • Um eine Bronchokonstriktion zu erzeugen, wurden beide Vagusnerven gleichzeitig in Abständen von 1 Minute stimuliert (2 oder 15 Hz, 0,2 ms Impulsdauer, 5–30 Volt, 45 Impulse pro Serie). Dies führte außerdem zu einer Bradykardie. Nachdem eine stabile Basisreaktion auf die Vagusstimulation bei 15 Hz hergestellt war, wurde entweder Kochsalzlösung, Heparin oder O-desulfatiertes Heparin intravenös injiziert, und die elektrische Stimulation der Vagusnerven wurde minütlich über die nächste halbe Stunde fortgesetzt. Dreißig Minuten nach der Injektion von Kochsalzlösung, Heparin oder O-desulfatiertem Heparin und vor Verabreichung von Pilocarpin erhielt man Kontrollreaktionen auf die elektrische Stimulation der Vagusnerven bei 2 Hz. Die Bronchokonstriktion in Reaktion auf die Stimulation der Vagusnerven (2 Hz, 0,2 ms, 45 Impulse pro Serie) wurde bei Kontrollmeerschweinchen und bei sensibilisierten Meerschweinchen durch Einstellen der Spannung (in einem Bereich von 5–20 Volt) verglichen. Der Einfluss von Pilocarpin auf vagusbedingte Bronchokonstriktion konnte also zwischen den Gruppen ohne Rücksicht auf die verschiedenen bronchokonstriktiven Anfangsreaktionen verglichen werden. Sobald die Parameter für vagusbedingte Bronchokonstriktion bei 2 Hz eingestellt waren und mehrere konstante Reaktionen erhalten wurden, wurde Pilocarpin (1–100 μg/kg i. v.) in kumulierten Dosen gegeben, und die Wirkungen auf eine vagusbedingte Bronchokonstriktion wurden gemessen. 30–100 μg/kg i. v. Pilocarpin erzeugten eine vorübergehende Bronchokonstriktion. Der Einfluss dieser Pilocarpindosen auf eine vagusbedingte Bronchokonstriktion wurde daher gemessen, nachdem Ppi wieder zum Basisniveau zurückgekehrt war. In früheren Untersuchungen haben sich 2.000 E/kg i. v. Heparin als wirksam erwiesen, um die neuronale M2-Rezeptorfunktion wiederherzustellen (A. D. Fryer, et al., Journal of Clinical Investigation (1992) 90: 2290–2298). Am Ende jedes Experiments blockierte Atropin (1 mg/kg i. v.) alle Reaktionen auf eine Stimulation des Vagusnervs, womit bewiesen war, dass vagusbedingte Bronchokonstriktion und Bradykardie über Muskarinrezeptoren vermittelt wurden.
  • Die Basisreaktionen in Form von Bronchokonstriktion und Bradykardie auf die Stimulation der Vagusnerven wurden zwischen Kontrollmeerschweinchen und einer Challenge unterzogenen Meerschweinchen sowie behandelten Meerschweinchen mit einer Ein-Faktor-Varianzanalyse verglichen. Die anfängliche Wirkung von Kochsalzlösung, Heparin oder O-desulfatiertem Heparin auf vagusbedingte Bronchokonstriktion und Bradykardie wurde mittels einer Ein-Faktor-Varianzanalyse untersucht. Die Wirkungen von Kochsalzlösung, Heparin und O-desulfatiertem Heparin auf die Dosis-Wirkungs-Kurven für Pilocarpin bei Meerschweinchen unter Antigen-Challenge und Kontrollmeerschweinchen wurden mittels einer Doppelvarianzanalyse für wiederholte Maß nahmen verglichen. Der Einfluss eines zusätzlichen Bolus von Heparin auf die Reaktion auf 100 μg/kg Pilocarpin wurde mit einem paarweisen t-Test untersucht. P-Werte gleich oder kleiner als 0,05 wurden als signifikant erachtet.
  • Bei Kontrolltieren und bei Tieren, die sensibilisiert waren und einer Ovalbumin-Challenge unterzogen wurden, waren Basis-Ppi, Herzfrequenz und Blutdruck gleich. Die Behandlung mit Kochsalzlösung, Heparin oder O-desulfatiertem Heparin konnte Basisherzfrequenz, Lungenaufblasdruck oder Blutdruck nicht ändern. Die elektrische Stimulation beider Vagusnerven (2 oder 15 Hz, 0,2 ms Impulsdauer, 5–20 Volt, 45 Impulse pro Serie) erzeugte Bronchokonstriktion (gemessen durch einen Anstieg im Ppi) und Bradykardie. Diese beiden Reaktionen auf eine Stimulation der Vagusnerven waren vorübergehend und kehrten sich schnell um, nachdem die elektrische Stimulation unterbrochen wurde. Am Ende jedes Experiments wurden vagusbedingte Bronchokonstriktion und Bradykardie durch Atropin (1 mg/kg) vollständig unterbunden, was darauf hindeutet, dass sie über die Freisetzung von Acetylcholin auf Muskarinrezeptoren vermittelt wurden.
  • Bei Meerschweinchen, die nicht sensibilisiert waren oder einer Challenge mit Ovalbumin unterzogen wurden, hatte die Verabreichung von Heparin keinen Einfluss auf vagusbedingte Bronchokonstriktion (Anstieg von 27,6 ± 5,4 mm H2O vor Heparin vs. 25,2 ± 7,3 mm H2O 20 Minuten nach Heparin) oder Bradykardie (Abfall von 74,3 ± 15 Schläge/Minute vor Heparin vs. 63,4 ± 24 Schläge/Minute nach Heparin). Bei Tieren unter Antigen-Challenge hatte Kochsalzlösung keinen Einfluss auf eine vagusbedingte Bronchokonstriktkion (siehe die Säulen 1–2, 3) oder Bradykardie (Abfall von 62,0 ± 26 Schläge/Minute vor Kochsalzlösung vs. 50,0 ± 27 Schläge/Minute 20 Minuten nach Kochsalzlösung). Dagegen verringerte Heparin (2.000 E/kg) die vagusbedingte Bronchokonstriktion bei sensibilisierten, einer Challenge unterzogenen Tieren und erreichte ein Plateau bei einer Hemmung von 50% zwanzig Minuten nach Verabreichung von Heparin (siehe die Säulen 3–4, 3). Heparin hatte keinen Einfluss auf vagusbedingte Bradykardie (Abfall von 82,5 ± 6,3 Schläge/Minute vor Heparin vs. 70,0 ± 9,1 Schläge/Minute 20 Minuten nach Heparin). Die Verabreichung von O-desulfatiertem Heparin (91,2 mg/kg) verringerte ebenfalls die vagusbedingte Bronchokonstriktion und erreichte ein Plateau 20 Minuten nach Verabreichung (siehe die Säulen 5–6, 3 und 4). Wie Heparin konnte O-desulfatiertes Heparin eine vagusbedingte Bradykardie nicht ändern.
  • Bei nichtsensibilisierten Kontrolltieren hemmte Pilocarpin (1–100 μg/kg i. v.) eine vagusbedingte Bronchokonstriktion durch Stimulation der M2-Muskarinrezeptoren auf den parasympathischen Nerven der Lunge (leere Quadrate, 5). Dies zeigt sich in einer progressiven Verringerung im Verhältnis der Bronchokonstriktion nach Pilocarpin gegenüber der Bronchokonstriktion vor Pilocarpin. Pilocarpin hatte dagegen keinen signifikanten Einfluss auf die Reaktion auf eine Vagusstimulation bei sensibilisierten, einer Challenge unterzogenen Meerschweinchen (leere Dreiecke, 5), womit bewiesen war, dass die Wirksamkeit der M2-Muskarinrezeptoren bei diesen Tieren beeinträchtigt war. Die Reaktion auf Pilocarpin wurde auf dosisabhängige Weise wiederhergestellt durch Behandlung mit O-desulfatiertem Heparin (5), was darauf hindeutete, dass O-desulfatiertes Heparin wirksam war beim Umkehren der M2-Rezeptordesensibilisierung, ein Grund für die Hyperreaktivität der Luftwege bei diesen Tieren. Im Anschluss an die höchste verwendete Dosis war die Fähigkeit von Pilocarpin, eine vagusbedingte Bronchokonstriktion bei einer Challenge unterzogenen Meerschweinchen zu hemmen, vollständig wiederhergestellt. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen dem Einfluss von Pilocarpin auf vagusbedingte Bronchokonstriktion bei Kontrolltieren (leere Quadrate, 5) und bei einer Challenge unterzogenen Tieren, die diese Dosis von O-desulfatiertem Heparin erhalten hatten (ausgefüllte Quadrate, 5).
  • Diese Experimente zeigen definitiv, dass das O-desulfatierte Heparin die für eine Hyperreaktivität der Luftwege bei Asthma verantwortliche Desensibilisierung der M2-Muskarinrezeptoren wiederherstellt. Bei Kontrolltieren hemmte Pilocarpin eine vagusbedingte Bronchokonstriktion infolge einer Stimulation inhibitorischer M2-Muskarinrezeptoren auf den parasympathischen Nerven der Lunge. Die pilocarpinbedingte Hemmung einer vagusbedingten Bronchokonstriktion war im Anschluss an eine Antigen-Challenge merklich abgeschwächt. Bei Meerschweinchen unter Antigen-Challenge können also die neuronalen M2-Rezeptoren die Freisetzung von Acetylcholin nicht länger hemmen. Dieser Verlust einer durch neuronale M2-Rezeptoren vermittelten Steuerung der Freisetzung von Acetylcholin führt zu einer Überreaktionsfähigkeit auf die elektrische Stimulation der Vagusnerven. Die M2-Rezeptorfunktion wird durch O-desulfatiertes Heparin wiederhergestellt. Zwanzig Minuten nach Verabreichung von O-desulfatiertem Heparin konnte der neuronale Rezeptor bei Meerschweinchen unter Antigen-Challenge durch exogene Agonisten erneut stimuliert werden, da Pilocarpin die vagusbedingte Bronchokonstriktion unterband (5). Die Fähigkeit von endogenem Acetylcholin, die neuronalen M2-Rezeptoren zu stimulieren, wurde durch O-desulfatiertes Heparin ebenfalls wiederhergestellt, wie aus der Verminderung der bronchokonstriktiven Reaktion auf eine Vagusstimulation in Gegenwart dieses nichtgerinnungshemmenden Heparin-Analogons hervorgeht.
  • BEISPIEL IV
  • Behandlung einer Hyperreaktivität der Luftwege beim Menschen
  • O-desulfatiertes Heparin kann durch Inhalation eines Aerosols aus einem Ultraschall- oder Düsenzerstäuber, der zum Einatmen geeignete Partikel mit einem mittleren aerodynamischen Massendurchmesser (MMAD) von weniger als 5 μm erzeugt, in die Lunge verabreicht werden. Während der genaue Prozentsatz des die Lunge tatsächlich erreichenden Aerosols je nach Art des verwendeten Düsen- oder Ultraschallzerstäubers schwankt, erreichen etwa 10% der Dosis in dem Zerstäuber die Lunge tatsächlich. Newman, S. P., "Therapeutic Aerosols, in Aerosols in the Lung," Clinical and Experimental Aspects, S. W. Clarke und D. Pavia, Hrsg., Butterworths: London (1984) S. 197–224. Ein Patient wird daher mit einer Zerstäuberdosis behandelt werden müssen, die zehnmal so groß ist wie das für eine wirksame Erhöhung der M2-Rezeptorwirksamkeit tatsächlich benötigte Medikament. Berechnung der Akutdosis am unteren Ende bei einem Patienten
    Ziel: 0,1–0,2 mg/kg erreichen die Lunge tatsächlich
    Verabreichen: etwa 1,0–2,0 mg/kg inhaliert durch Zerstäuber
    Berechnung der mittleren Dosis für einen Patienten
    Ziel: 0,5 mg/kg erreichen die Lunge tatsächlich
    Verabreichen: etwa 5,0 mg/kg inhaliert durch Zerstäuber
    Berechnen der Dosis am oberen Ende für einen Patienten
    Ziel: 0,7 mg/kg erreichen die Lunge tatsächlich
    Verabreichen: etwa 7,0 mg/kg inhaliert durch Zerstäuber
  • Aufgrund der obigen Berechnungen kann O-desulfatiertes Heparin in niedrigeren oder höheren Anteilen durch Erhöhen oder Verringern der Dosis verabreicht werden. Außerdem kann die Dosis für einzelne Patienten der jeweiligen Person entsprechend modifiziert werden. Ferner kann die Dosis mit fortschreitender Behandlung entsprechend den bei einer spezifischen Dosis festgestellten therapeutischen Wirkungen verän dert werden. Ferner kann sich Heparin in der Lunge bis zu einem Plateau ansammeln. Ungefähr 10% des verabreichten Heparins bleiben durch heparinbindende Proteine (z. B. Kollagen und Fibronektin) an die Matrix der Lunge gebunden. Eine Dosisstrategie kann also mit einer Dosis am unteren Ende beginnen und auf die Ansammlung von Heparin in der Lunge im Verlauf der Zeit abzielen, vor allem zur langfristigen Prävention.
  • Die genaue Menge solcher erforderlicher Verbindungen wird von Patient zu Patient verschieden sein, abhängig von Spezies, Alter und allgemeinem Zustand des Patienten, der Schwere der behandelten Krankheit, der speziell verwendeten Verbindung, ihrer Verabreichungsart und dergleichen. Es ist also nicht möglich, eine genaue, die Wirksamkeit fördernde Menge im Voraus anzugeben. Ein Fachmann kann jedoch angesichts der hierin dargelegten Lehre eine geeignete Menge nur durch routinemäßiges Experimentieren ermitteln.
  • BEISPIEL V
  • Einfluss von O-desulfatiertem Heparin auf die Blutgerinnung
  • Das gerinnungshemmende Potenzial des O-desulfatierten Heparins aus Beispiel I wurde untersucht, indem sein Einfluss auf die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APPT) in vitro ermittelt wurde. Der Test wurde auf die übliche Weise durchgeführt, wie sie zur klinischen Überwachung der gerinnungshemmenden Wirkung von Heparin bei Patienten verwendet wird. Bei dem Test wurden 0,1 und 1,0 mg/ml Heparin oder O-desulfatiertes Heparin gemäß Beispiel I verwendet, mit dem menschliches Testserum in vitro versetzt wurde.
  • TABELLE I
    Figure 00420001
  • Das O-desulfatierte Heparin aus Beispiel I wurde außerdem untersucht, um festzustellen, ob Plasmaverdünnungen von 0,1 mg/ml Heparin oder gemäß Beispiel I desulfatiertem Heparin den Faktor Xa hemmen konnten, wobei sich die Testzeit bei einer Untersuchung der Xa-Wirksamkeit unter Verwendung von Plasma, das mit Gift der Russell-Viper behandelt wurde, verlängerte.
  • TABELLE II
    Figure 00420002
  • Im Gegensatz zu Heparin zeigte das gemäß Beispiel I desulfatierte Heparin wenig Fähigkeit, APTT zu verlängern, und wenig Wirksamkeit gegen Faktor Xa. Das O-desulfatierte Heparin zeigte also eine wesentlich geringere gerinnungshemmende Wirksamkeit als nichtdesulfatiertes Heparin.
  • BEISPIEL VI
  • Kultur von glatter Muskulatur der Luftwege
  • Normale erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden mit einer Überdosis Pentobarbital geopfert. Es wurde ihnen die Luftröhre entnommen, und die hintere Membran wurde isoliert. Die hintere Membran, die glatte Luftröhrenmuskulatur enthält, wurde zerkleinert, dann zweimal für 30 min bei 37°C in Hanks' Balanced Salt Solution aufgeschlossen, die 0,2% Kollagenase Typ IV und 0,05% Elastase Typ IV (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) enthielt. Die Zellen wurden dann in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) gewaschen und in diesem Medium in Kunststoffkolben mit einer Fläche von 25 cm2 mit 2 × 105 Zellen/Kolben eingesät. Die Zellkulturen der glatten Muskulatur zeigen das typische "berg-und-tal-artige" morphologische Aussehen, wenn sie mit dem Phasenkontrastmikroskop untersucht und für eine α-Wirkung der glatten Muskulatur speziell angefärbt wurden. Zur Immunfärbung wurden die Zellen über Nacht auf Objektträger aus Glas ausgestrichen (3 × 104 Zellen/Objektträger), mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, ohne Calcium und Magnesium) gewaschen und zweimal jeweils 10 min mit eiskaltem Aceton fixiert. Die Immunfärbung wurde mit einem polyklonalen Antikörper gegen α-Wirkung glatter Muskulatur des Menschen durchgeführt und mit einem Avidin-Biotin-Immunperoxidase-Färbesatz sichtbar gemacht (Sigma, Produkt Nr. IMMH-2).
  • BEISPIEL VII
  • Einfluss von Serum auf die Proliferation glatter Muskelzellen der Luftwege
  • Die Zellen wurden in 24 Mikrotiterplatten in einer Dichte von 1,5 × 104 Zellen pro Mulde mit DMEM, das verschiedene Konzentrationen von FBS enthielt (0,25%, 2,5%, 5,0% und 10%), ausgestrichen. 24 Stunden später wurde damit begonnen, in Abständen von 24 Stunden Zellzählungen durchzuführen. Die Mulden wurden zweimal mit PBS gewaschen, dann wurden die Zellen durch 10-minütigen Kontakt mit Saponin (0,5 mg/ml in PBS) durchlässig gemacht. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen dann 5 Minuten mit Methanol fixiert, dann 5 Minuten mit Geimsa-modifizierter Wright's Farbe (Sigma) angefärbt und wieder mit PBS gewaschen. Die Zellzahlen jeder Mulde erhielt man aus einem Durchschnitt der Zählungen von 10 zufällig ausgewählten Feldern, die mit einem Okulargitter von 1 mm3 mit 40facher Vergrößerung durchgeführt wurden. In Tabelle III sind die erhaltenen Daten aufgeführt.
  • TABELLE III
    Figure 00440001
  • In 6 sind die in Tabelle III aufgeführten Ergebnisse graphisch dargestellt, und es wird gezeigt, dass FBS die Proliferation glatter Muskelzellen der Luftwege dosisabhängig stimuliert.
  • BEISPIEL VIII
  • Einfluss von Heparin und O-desulfatiertem Heparin auf die Proliferation glatter Muskelzellen der Luftwege
  • Glatte Muskelzellen der Luftwege wurden wie oben beschrieben gezüchtet mit 10% FBS in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Heparin oder O-desulfatiertem Heparin aus Schweinedarmschleimhaut (0, 2, 20 oder 200 μg/ml), die unmittelbar nach dem Ausstreichen der Zellen dem Medium zugegeben wurden. Zellzählungen wurden nach 62 Stunden durchgeführt. Die Daten sind in der folgenden Tabelle IV aufgeführt.
  • TABELLE IV
    Figure 00450001
  • In 7 sind die Daten von Tabelle IV graphisch dargestellt, und es wird gezeigt, dass Heparin und O-desulfatiertes Heparin die Proliferation glatter Muskelzellen der Luftwege dosisabhängig gleichermaßen hemmen konnten. Die höchste Dosis von jedem Heparin (200 μg/ml) hemmte das Zellwachstum um ungefähr 50%.
  • BEISPIEL IX
  • Einfluss von Heparin und O-desulfatiertem Heparin auf komplementvermittelte Auflösung roter Blutkörperchen
  • Die komplementvermittelte Hämolyse roter Blutkörperchen wurde untersucht durch Modifikation eines bereits beschriebenen Verfahrens (Friedrichs et al. (1994) Circ. Res. 75: 701–710). Menschliches Blut wurde entnommen und mit 2000 × g 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Plasmaschicht wurde entsorgt, und die roten Blutkörperchen wurden dreimal mit PBS gewaschen. Eine Lösung von 10% Erythrozyten wurde in Analysepuffer (PBS mit 0,25% Rinderserumalbumin, pH 7,4) hergestellt. Die Untersuchung zum Nachweis der Hämolyse wurde durchgeführt durch Messen der Extinktion der Testlösung bei 540 nm, dem Hauptpeak für Hämoglobin. Kaninchen-Vollblutplasma (500 μl) und PBS (500 μl) oder die untersuchten Heparine (500 μl in PBS, 1 mg/ml Endkonzentration) wurden in silikonisierten Röhrchen gemischt. Es wurden rote Blutkörperchen vom Menschen (0,5% Endkonzentration) zugegeben, und die Röhrchen wurden in einem Wasserbad mit Schüttler bei 37°C 30 Minuten inkubiert. Die Röhrchen wurden mit 1000 × g 10 Minuten zentrifugiert, und die Extinktion des Überstands wurde unverzüglich bei 540 nm abgelesen und mit einer Blindprobe, die Plasma und PBS allein enthielt, verglichen. Der Prozentsatz der Hämolyse wurde durch den Anteil von A540 für heparinbehandelte und unbehandelte Kontrollröhrchen ermittelt. Die Ergebnisse wurden ausgedrückt als Prozentsatz der Hemmung (100 Hämolyse).
  • Heparin war ein wirksamer Inhibitor einer komplementvermittelten Hämolyse roter Blutkörperchen (71 ± 4% Hemmung bei 1 mg/ml (n = 3)). O-desulfatiertes Heparin war ebenfalls ein starker Inhibitor einer komplementvermittelten Auflösung roter Blutkörperchen in diesem System und hemmte die Hämolyse mit 73 ± 2% (n = 3). Diese Ergebnisse bestätigen, dass die Hemmung des Komplements durch Heparin nicht abhängig ist von der Antithrombin-III-Bindung oder anderen gerinnungshemmenden Funktionen. Diese Ergebnisse zeigen außerdem, dass O-desulfatiertes Heparin eine gleichwertige Wirksamkeit hat wie Heparin bei der Hemmung einer komplementvermittelten Hämolyse roter Blutkörperchen.
  • Wenngleich das vorliegende Verfahren anhand spezieller Einzelheiten bestimmter Ausführungsformen desselben beschrieben wurde, sollen diese Einzelheiten nicht als Einschränkungen des Umfangs der Erfindung verstanden werden, abgesehen vom Umfang, in dem sie in den beigefügten Ansprüchen enthalten sind.

Claims (14)

  1. Verwendung von O-desulfatiertem Heparin mit O-Desulfatierung mindestens in der 2-O- und der 3-O-Stellung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Behandlung einer Hyperreaktivität der Luftwege in Form einer asthmatischen Reaktion bei einem Säugetier.
  2. Verwendung von O-desulfatiertem Heparin mit O-Desulfatierung mindestens in der 2-O- und der 3-O-Stellung bei der Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Wirksamkeit eines desensibilisierten M2-Muskarinrezeptors bei einem asthmatischen Säugetier.
  3. Verwendung von O-desulfatiertem Heparin mit O-Desulfatierung mindestens in der 2-O- und der 3-O-Stellung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Verringerung der Bronchokonstriktion bei einem Säugetier.
  4. Verwendung von O-desulfatiertem Heparin mit O-Desulfatierung mindestens in der 2-O- und der 3-O-Stellung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Verringerung der Proliferation von glatten Muskelzellen der Luftwege bei einem Säugetier.
  5. Verwendung von O-desulfatiertem Heparin mit O-Desulfatierung mindestens in der 2-O- und der 3-O-Stellung bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der komplementvermittelten Hämolyse bei einem Säugetier.
  6. Verwendung von O-desulfatiertem Heparin mit O-Desulfatierung mindestens in der 2-O- und der 3-O-Stellung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verringerung einer asthmatischen Reaktion bei einem Säugetier.
  7. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament durch Inhalation verabreicht werden soll.
  8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Medikament durch intravenöse Injektion verabreicht werden soll.
  9. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament mit einem pharmazeutisch verwendbaren Träger verabreicht werden soll.
  10. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Säugetier ein Mensch ist.
  11. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament in einer Menge von etwa 1 mg/kg bis etwa 100 mg/kg verabreicht werden soll.
  12. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das O-desulfatierte Heparin sowohl in der 2-O- als auch in der 3-O-Stellung mindestens 90% Desulfatierung aufweist.
  13. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament hergestellt wird durch ein Verfahren, bei dem eine heparinhaltige Lösung auf einen pH-Wert von 13 oder höher alkalisiert wird.
  14. Verwendung nach Anspruch 13, bei dem ferner die alkalische Lösung lyophilisiert wird.
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